Brevet FR2980210A1 — publié le 20130322

3S-RHAMNOSE-GLUCURONYL HYDROLASE, PROCEDE DE FABRICATION ET UTILISATIONS DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte notamment à des protéines, à des séquences d'acides nucléiques codant pour ces protéines, à des vecteurs comprenant ces séquences codantes, à un procédé de fabrication de ces protéines, ainsi qu'à un procédé d'hydrolyse d'oligosaccharides utilisant ces protéines. La présente invention trouve notamment des applications dans la valorisation des bio-ressources naturelles constituées par les organismes et les microorganismes comprenant des ulvanes, notamment les algues vertes. En particulier, elle trouve des applications en laboratoire, pour l'analyse de ces ulvanes, ainsi que dans l'agro-alimentaire, dans le domaine de la cosmétique et dans le domaine des médicaments et formulations pharmaceutiques ou les produits de dégradation des ulvanes sont valorisables. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Les algues vertes appartenant au genre Ulvales (Ulva sp. et Enteromorpha sp.) sont présentes partout sur le globe terrestre et sont très communément rencontrées sur les côtes. Ces algues sont fréquemment impliquées dans la prolifération algale favorisée par l'eutrophisation des eaux côtières donnant lieu aux « marées vertes ». Jusqu'à maintenant cette biomasse indésirable a une très faible valeur ajoutée et est utilisée essentiellement comme compost. Les polysaccharides anioniques complexes présents dans la paroi des ulves : les ulvanes, possèdent des structures originales et représentent une source de biopolymères dont les fonctionnalités sont encore peu explorées. Les ulvanes sont composés de différentes unités de répétition disaccharidiques construites avec des unités rhamnoses, acides glucuroniques, acides iduroniques, xyloses et de sulfates. Les deux principaux motifs de répétition sont appelés acide aldobiuronique, ou acides ulvanobiuroniques, ou respectivement A (A3s) et B (B3s), dont les formules sont les suivantes : A35 Le motif A (A3s) est l'acide béta-D-1,4-glucuronique (14) alpha-L1,4-rhamnose 3-sulfate. Le motif B (B3s) est l'acide alpha-L-1,4-iduronique (14) alpha-L-1,4-rhamnose 3-sulfate. Les acides uroniques sont parfois remplacés par des résidus xylose quelquefois sulfatés en O-2. Les ulvanes possèdent des propriétés physicochimiques uniques qui en font des candidats attractifs pour de nouvelles applications agroalimentaires, pharmaceutiques, et cosmétiques. Les ulvanes sont composés de sucres rares tels que le rhamnose et l'acide iduronique. Le rhamnose est un composé important des antigènes de surface de nombreux microorganismes reconnus spécifiquement par les lectines de mammifères. Il est également utilisé pour la synthèse d'arômes. L'acide iduronique est utilisé pour la synthèse des glycosaminoglycans (i.e. héparine). En plus des monomères, les ulvanes et oligo-ulvanes présentent des propriétés biologiques intéressantes. En effet, des travaux ont montré, par exemple, que les oligo-ulvanes ont des activités antitumorales, antivirales (antigrippales) et anticoagulantes. Une liste non-exhaustive d'applications potentielles des ulvanes a été proposée par M. Lahaye et A. Robic dans le document Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromolecules 2007, 8, 17651774 [1]. Dans ce contexte, une meilleure compréhension de la structure des ulvanes et le développement de procédés permettant de fragmenter les ulvanes sous forme oligomérique ou monomérique revêt un très grand intérêt. Dans ce contexte, lors d'une précédente invention, les inventeurs ont purifiés et clonés le gène d'une ulvane-lyase clivant spécifiquement la liaison glycosidique par un mécanisme d'élimination entre le rhamnose sulfaté et les acides uroniques. Les produits de dégradation ont été purifiés et les analyses de leurs structures ont révélés qu'ils étaient systématiquement terminés à leur extrémité non réductrice par un motif disaccharidique composé de l'acide glucuronyl et d'un rhamnose sulfaté. Ainsi l'ulvan-lyase a permis d'obtenir des olisaccharides spécifiques. Les oligosaccharides obtenus sont utilisables par exemple, dans le domaine cosmétique, médical etc.. Toutefois, la découvertes de nouvelles enzymes de dégradation ou de modification des ulvans et des oligo-ulvans devraient permettre de produire de nouvelles séries d'oligosaccharides de poids moléculaires et de structures bien calibrées élargissant ainsi les possibilités d'application et de valorisation des ulvans. Actuellement, faute de moyens permettant de les connaître mieux et de les dégrader efficacement, les algues, notamment les algues vertes, sont essentiellement compostées et aucune valorisation industrielle n'en est faite. Ceci est d'autant plus déplorable que la source est abondante et parfois gênante en termes de pollution de nos côtes maritimes. Leur élimination est actuellement réalisée par voie de compost. Il existe donc un réel besoin de trouver de nouveaux moyens de dégradation des ulvanes ainsi que des oligosaccharides après dégradation par des ulvanes lyases afin de pouvoir valoriser cette bio-ressource, issue notamment des algues vertes, en produisant des fragments oligo-ulvanes à façon dans la perspective d'applications cosmétiques, agro-alimentaires et médicales. Exposé de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin en fournissant des protéines qui hydrolysent très efficacement des oligosaccharides. L'étude des modalités de reconnaissance des enzymes de la présente invention réalisée par les inventeurs démontre leur activité 3S-rhamnoglucuronyl hydrolase. La présente invention a pour objet une protéine de séquence SEQ ID n°1 du listage de séquences annexé, à savoir le peptide de séquence : DTEKTPLEEKDVFNEDYIKTSMIKALEWQEAHPIFAIHPTDWTNGA YYTGVARAHHTTKNMMYMAALKNQAVANNWQPYTRLYHADDVAISYSY 20 LYVAENEKRRNFSDLEPTKKFLDTHLYEDNAWKAGTNRSKEDKTILWWW CDALFMAPPVINLYAKQSEQPEYLDEMHKYYMETYNRLYDKEEKLFARD SRFVWDGDDEDKKEPNGEKVFWSRGNGWVIGGLALLLEDMPEDYKHR DFYVNLYKEMASRILEIQPEDGLWRTSLLSPESYDHGEVSGSAFHTFALA WG I N KG L I DKKYTPAVKKAWKAMANCQH DDG RVGWVQN I GAFP EPASK 25 DSYQNFGTGAFLLAGSEILKMR (SEQ ID n°1) Selon l'invention la protéine objet de l'invention est une 3Srhamnoglucuronyl hydrolase. Selon l'invention, la protéine objet de l'invention peuvent comprendre en outre, à leur extrémité N-terminale, une séquence signal ou 30 séquence d'adressage. Cette séquence signal peut être une des séquences signal connues de l'homme du métier pour que la protéine, lorsqu'elle est synthétisée dans une cellule hôte, soit dirigée vers un organite ou une zone particulière de la cellule hôte. Il peut s'agir par exemple d'une séquence signal trouvée dans les sites spécialises dans la prédiction de peptides signaux par exemple http://www.cbs.dtu .d k/services/Sig nal P/ [2] ou encore http://bmbpcu36.1eeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html [3]. Il peut s'agir par exemple la séquence SEQ ID n°2 du listage de séquences annexé, à savoir la séquence MNKSILLLVTLLSLYSCT (SEQ ID n°2). Cette séquence signal peut être clivée après synthèse de la protéine ou non. Avantageusement, les inventeurs ont noté que les séquences signal ne gênent pas et que leurs clivages n'est pas nécessaire pour l'expression de protéine, par exemple la protéine est surexprimée sans son peptide signal. La présente invention se rapporte également aux acides nucléiques codant pour la protéine de la présente invention, notamment pour la protéine de séquence SEQ ID n°1. L'acide nucléique de la présente invention peut être toute séquence codant pour le peptide de séquence SEQ ID N° 1 compte tenu de la dégénérescence du code génétique. Il peut 2 0 s'agir par exemple d'un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID n°3 du listage de séquences annexé, à savoir l'acide nucléique de séquence : GATACTGAAAAAACACCATTAGAGGAGAAGGATGTTTTTAATGAAGAT TATATAAAAACTTCTATGATAAAAGCACTAGAGTGGCAAGAAGCACAC 25 CCTATTTTTGCTATACATCCTACAGACTGGACTAATGGTGCATACTATA CAGGTGTTGCAAGAGCACATCATACGACTAAAAACATGATGTATATGG CTGCGTTAAAAAATCAAGCAGTGGCTAATAATTGGCAACCATACACAC GTTTGTATCATGCTGATGATGTCGCTATTTCATATAGCTATTTGTATGT AGCTGAAAACGAAAAACGAAGGAATTTTTCAGATTTAGAGCCTACGAA 30 AAAGTTTTTAGATACACATTTGTATGAGGATAATGCTTGGAAAGCAGG AACTAATAGAAGTAAAGAAGACAAAACCATTTTATGGTGGTGGTGTGA TGCTTTATTTATGGCACCACCTGTAATTAATTTGTATGCAAAACAGTCA GAGCAACCTGAGTATCTAGACGAAATGCACAAATATTATATGGAAACC TATAACAGATTGTATGATAAAGAAGAAAAGTTATTTGCAAGAGATTCAA GATTTGTTTGGGACGGTGATGATGAAGACAAAAAAGAACCAAATGGTG AAAAAGTATTTTGGTCTAGAGGAAATGGATGGGTAATCGGCGGTTTAG CATTATTGCTAGAGGATATGCCAGAAGACTACAAGCATAGAGATTTCT ACGTGAACTTGTATAAAGAAATGGCTAGTAGAATATTAGAAATTCAACC AGAAGATGGTTTATGGAGAACAAGTTTGTTAAGTCCAGAATCTTACGA TCACGGTGAGGTTAGTGGTAGTGCTTTCCATACTTTTGCTTTGGCTTG G G GAATTAATAAAG G TTTAATAGATAAAAAATATACAC CT G C C GTTAAG AAAGCGTGGAAAGCTATGGCTAATTGTCAGCATGATGATGGTCGTGTA GGTTGGGTACAAAACATAGGTGCTTTTCCAGAGCCAGCTTCTAAGGAT AGTTATCAGAATTTTGGAACTGGAGCTTTTTTGTTAGCTGGAAGTGAA ATTCTAAAAATGAGATAA (SEQ ID n°3) Selon l'invention l'acide nucléique codant pour la protéine de la présente invention peut comprendre en outre, à son extrémité 5', la séquence SEQ ID n° 4 du listage de séquences annexé, à savoir un acide nucléique de séquence ATGAATAAATCAATCTTATTACTGGTTACTTTATTAAGCCTTTATAGTTG TACT (SEQ ID n°4). La présente invention se rapporte également à un vecteur comprenant un acide nucléique codant pour la protéine de la présente invention, par exemple un acide nucléique de séquence SEQ ID n°3 du listage de séquences annexé. Le vecteur peut être un des vecteurs connus de l'homme du métier pour fabriquer des protéines par recombinaison génétique. Il est choisi en général notamment en fonction de l'hôte cellulaire choisi. Le vecteur peut être par exemple choisi parmi les vecteurs listés dans le catalogue http://www.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm [4] ou http://www.q iagen .com/pendantview/q iagenes.aspx?gaw=PROTQlAgenes 0807&g kw=mammal ian+expression [5], ou encore http://www.scbt.com/chap_exp_vectors.php?type=pCruzTM°/020Expressio n%20Vectors [6] . Il peut s'agir par exemple du vecteur d'expression décrit dans le document WO 83/004261 [7]. Les acides nucléiques de la présente invention ou les vecteurs de la présente invention sont utilisables notamment pour la fabrication par recombinaison génétique de protéines de la présente invention. Aussi, la présente invention se rapporte également à une cellule hôte comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. La cellule hôte ou hôte cellulaire peut être tout hôte approprié pour la fabrication des ulvanes lyase de la présente invention à partir des acides nucléiques ou des vecteurs de l'invention. Il peut s'agir par exemple d'E. coli, de Pischia pastoris, de Saccharomyces cerevisiae, de cellules d'insectes, par exemple un système cellules d'insectes-baculovirus (par exemple cellules d'insecte SF9 utilisant un système d'expression de baculovirus), de mammifères. La cellule hôte peut être également le microorganisme déposé sous le numéro I-4324 à la CNCM en France. La présente invention se rapporte donc également à un procédé de fabrication de protéines de la présente invention comprenant la mise en culture une cellule hôte comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un vecteur ou le microorganisme déposé sous le numéro I4324 à la CNCM en France selon l'invention. Cette mise en culture se fait de préférence dans un milieu de culture permettant la croissance du microorganisme. Il peut s'agir par exemple milieu de culture liquide ZoBell, comme décrit dans le document ZoBell, CE 1941 Studies on marine bacteria. I. The cultural requirements of heterotrophic aerobes, J Mar Res 4, 41-75 [8]. Des conditions de culture utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention sont également décrites dans ce document. Le pH de culture est de préférence compris entre 7 et 9, de préférence pH 8. La température de culture est de préférence comprise entre 15 et 30°C, de préférence 25°C. La culture est de préférence réalisée avec une concentration NaCI de 20 à 30 gr, de préférence de 25 gr. Ce procédé de fabrication des protéines selon l'invention en utilisant le microorganisme déposé sous le numéro I-4324 à la CNCM en France ou tout autre cellule hôte transformée pour une fabrication par recombinaison génétique conformément à la présente invention, peut comprendre en outre une étape de récupération des protéines selon l'invention. Cette étape de récupération ou d'isolement peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une technique choisie parmi une électrophorèse, un tamisage moléculaire, une ultracentrifugation, une précipitation différentielle, par exemple au sulfate d'ammonium, par ultrafiltration, une filtration sur membrane ou sur gel, un échange d'ions, une élution sur hydroxyapatite, une séparation par interactions hydrophobes, ou tout autre moyen connu. Un exemple de procédé d'isolement de ces 3S Rhamnose glycuronyl hydrolase utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention est décrit ci-dessous. Le microorganisme précité ou toute autre cellule hôte transformée pour une fabrication par recombinaison génétique conformément à la présente invention peut également être utilisé directement pour dégrader des oligosaccharides, dans leur milieu naturel ou en culture. Lorsqu'il s'agit d'une culture, il peut s'agir d'un système discontinu ou continu. On peut utiliser par exemple un réacteur de culture contenant un milieu de culture approprié au développement du microorganisme. La présente invention a également pour objet un procédé d'hydrolyse d'oligosaccharides comprenant une étape de mise en contact des oligosaccharides avec une protéine de séquence de l'invention, par exemple une protéine de séquence SEQ ID n°1 ou avec une cellule hôte comprenant un vecteur avec un acide nucléique codant pour la protéine de l'invention, par exemple un acide nucléique de séquence SEQ ID n°3. dans des conditions permettant l'hydrolyse des oligosaccharides. Dans la présente par oligosaccharides on entend des oligomères formés d'un nombre n d'oses, c'est-à-dire des monosaccharides par liaison glycosidique alpha ou beta. Il peut s'agir par exemple de di, tri, tétra, d'oligosaccharides issus de la dégradation d'ulvane par l'ulvane-lyase clivant spécifiquement la liaison glycosidique par un mécanisme d'élimination entre le rhamnose sulfaté et les acides uroniques. Ces produits de dégradation peuvent comprendre à leur extrémité non réductrice un motif disaccharidique composé de l'acide glucuronyl et d'un rhamnose sulfaté en position 3. Il peut s'agir également d'oligosaccharides possédant au moins un acide glucuronyl lié à un rhamnose sulfaté, par exemple un acide glucuronyl lié à un rhamnose sulfaté lié lui-même à un acide uronique. Pour la digestion enzymatique, la détermination des constantes de Michaelis Menten (Km et Vmax) permet aisément à l'homme du métier de trouver les conditions optimales de concentration de la protéine de l'invention utilisée et de concentration de protéine de l'invention pour la dégradation de la protéine de l'invention dans le milieu où elle se trouve ou dans le milieu dans lequel elle a été placée. Le pH peut être également compris de préférence entre 7 et 8, de préférence égale à 7,7. Il s'agit en effet de la gamme de pH optimale. La température (optimale) est de préférence comprise entre 40°C et 45°C. La force ionique optimale peut être égale à 100 mM NaCI avec 100 mM Tris HCI ou 200 mM NaCI. L'invention permet avantageusement de mobiliser la très grande ressource d'algues actuellement inexploitée, notamment d'algues vertes. L'invention permet en outre de favoriser la biodégradation des algues, notamment des algues vertes, de produire des molécules originales, qui sont des fragments d'oligosaccharides, par exemple aussi des hydrocolloïdes pour des applications cosmétiques, agro-alimentaires et médicaments ou formulations pharmaceutiques et parapharmaceutiques. Les produits de dégradation des oligosaccharides tel que défini ci- dessus donnent accès à de nouveaux produits qui peuvent être des actifs alimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques et parapharmaceutiques utilisables dans les domaines agro-alimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques et parapharmaceutiques. Ces nouveaux produits peuvent également être des produits non actifs mais présentant une neutralité et/ou une stabilité qui est très intéressante pour une utilisation dans chacun de ces domaines. L'utilisation des protéines de la présente invention donne en outre accès à des oligosaccharides rares utilisables comme synthons en glycochimie. La dégradation des oligosaccharides peut donner accès à l'acide iduronique (sucre rare) utilisé pour la synthèse des glycoaminoglycans de synthèse. La présente invention ouvre également de nouvelles perspectives d'utilisation de ces algues pour des applications en bioénergie et en chimie. La production de fragments oligosaccharides peut donner de molécules de base pour la fabrication d'autres molécules. D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées. Brève description des figures - La figure 1 est un schéma de l'environnement génomique du gène de la 3S-rhamnose-glucuronyl hydrolase de Percisivirga ulvanivorans. La partie sombre représente le gène codant la protéine de l'invention. - La figure 2 représente la séquence protéique (SEQ ID n°1) de la protéine de la présente invention avec en gras le peptide ou séquence signal (SEQ ID n°2). - La figure 3 représente le gel d'électrophorèse SDS-PAGE de la protéine de l'invention obtenu après surexpression dans E. coli et purification sur colonne d'affinité. La colonne de gauche représente les marqueurs de poids moléculaire. - La figure 4 représente les résultats obtenus d'expériences de chromatographie de perméation de gel représentant la cinétique de modification des oligo-ulvans par la protéine de l'invention. Sur ce graphique, l'axe des abscisses représente le temps de rétention en minute (min). et l'axe des ordonnées représente l'index de réfraction. La figure 5 représente les résultats obtenus d'expériences de chromatographie échangeuse d'ions conduites avec les produits de dégradation majoritaire de l'ulvan par l'ulvane lyase de P. ulvanivorans: (A) A-Rha3S; (B) A-Rha3S-GluA-Rha3S; (C) A-Rha3S-IduA-Rha3S; (D) A- Rha3S-Xyl-Rha3S avec la protéine de la présente invention. Sur ces graphiques, l'axe des abscisses représente le temps d'élution en minute (min) et l'axe des ordonnées représente la conductimétrie en micro-siemens (pS). - La figure 6 représente des schémas de réactions enzymatiques catalysées par la protéine de la présente invention. Après coupure de la liaison glycosidique, le monosaccharide insaturé produit se réarrange spontanément en acide 4-deoxy-1-threo-5-hexosulose-uronique. - La figure 7 représente les résultats de vitesse de coupure de la liaison glycosidique entre le résidu glucuronyl et le rhamnose sulfaté en fonction de la structure des oligo-ulvans. Sur ces graphiques, l'axe des abscisses représente le temps en minute (min) et l'axe des ordonnées représente l'absorbance (265 nm). - La figure 8 est un schéma représentant l'organisation en sous-site du site actif de l'enzyme de la présente invention déduite des expériences présentées figure 7. Les signes + indiquent la présence de potentiels acides aminés cationiques nécessaires à la reconnaissance du Rhamnose sulfaté (sous-site +1) et des uroniques (sous-site +2). - La figure 9 représente les résultats de spectres RMN du proton des trisaccharides obtenus après incubation des oligo-ulvans tétrasaccharides. A) mélange d'oligo-ulvans riche en glucuronique (R3S- GIcA-R3S > R3S-IduA-R3S) ou en B) iduronique (R3S-GIcA-R3S Ces oligosaccharides ont été ainsi incubés dans ces mêmes conditions avec la protéine de l'invention à la concentration finale habituelle de dégradation de 0,05 pg/mL et aucune diminution de l'absorbance à 235 nm n'a été observée. De manière surprenante, la protéine de l'invention ne semblait pas éliminer le résidu galacturonyl (= glucuronyl) comme les GH105 étudiées et connues dans l'état de la technique. Une production d'oligo-ulvane a été réalisée par dégradation de l'ulvane par l'ulvan lyase de « 01-PN-2010 » jusqu'à la complétion suivi par une étape d'ultrafiltration sur 5000 kD membrane afin d'éliminer la fraction résistante. Le mélange obtenu avait une concentration de 12,5 mM d'oligosaccharides, majoritairement des di- et tétra-saccharides mais la présence de héxa-, octa- et déca-saccharides a été également observée. Le mélange d'oligo-ulvans obtenu après dégradation de l'ulvane par l'ulvane-lyase de « 01-PN-2010 » a été incubé avec la protéine de l'invention à une concentration finale de 0,05 pg/mL à température ambiante (20°C). La cinétique de dégradation des oligo-ulvanes a été suivie par perméation de gel sur une colonne Superdex 200 couplée en séries avec une colonne peptide HR (GE Healthcare). L'élution a été réalisée dans 50 mM carbonate d'ammonium à un débit de 0,5 mL min-1 sur un système HPLC Ultimate 3000 (Dionex) équipé d'un détecteur UV (Dionex) à 235 nm et un refractomètre RI (Wyatt). Le volume injecté était 100 pl. Avant incubation avec la protéine de l'invention GH105, les pics ont été attribués aux oligo-ulvanes qui présentent la propriété d'être détecté à la fois en UV (265 nm) et selon leur indice de réfraction Au cours de la dégradation, l'absorbance à 235 nm diminue indiquant que l'acide glucuronyl de l'extrémité non réductrice est éliminé. Les pics détectés par leur indice de réfraction ont diminués puis ont disparut au profit de nouveaux signaux tel que représenté. 2 9802 10 18 La dégradation systématique des oligo-ulvanes par la 3S-rhamnoseglucuronyl hydrolase a été confirmée par chromatographie échangeuse d'ions haute performance (HPAEC) sur un appareil de chromatographie Dionex ICS 3000 équipé d'une loupe d'injection de 20 pL, d'un système 5 d'injection automatisé AS100XR (Thermo Separation Products) et d'une colonne échangeuse d'ions AS11 (4 mm x 250 mm, Dionex IonPac) associée à une pré-colonne guard AG11 (4 mm x 50 mm, Dionex IonPac). Le système a opéré en mode conductivité avec un détecteur ED40 (Dionex) et un suppresseur ASRS ultra-4mm (Dionex) à 300 mA. Les 10 phases mobiles étaient de l'eau ultra pure (solution A) et 290 mM NaOH (solution B). L'élution a été réalisée à un débit de 0,5 mL min-1 et le gradient utilisé était 0 min: 3% Sol. B; 1,5 min: 1% Sol. B; 4,1 min: 5% Sol. B; 6,5min: 10% Sol. B; 10.0 min: 18% Sol. B; 26 min: 22% Sol. B; 28 min; 40% Sol. B; 30 min: 100% Sol. B; 30,1 min: 3% B Sol. B; 37 min: 3% Sol. 15 B. L'acquisition et l'analyse des données ont été réalisées avec le logiciel Chromeleon-peak Net software (Dionex). Les quatre oligo-ulvanes majoritaires ont été purifiés puis incubés avec la protéine de l'invention. Le milieu réactionnel était composé de 100 mM Tris HCI pH 7,7, 100 mM NaCI avec 125 pM d'oligosaccharides 20 purifiés et une concentration finale de protéine de 0.05 pg/mL. La réaction était réalisée à 30°C et suivi avec un spectrophotomètre à 235 nm. Le poids moléculaire de ces quatre oligosaccharides a diminué et les molécules ont perdues leurs propriétés d'absorber l'UV à 265 nm. Les oligosaccharides obtenus après incubation de la protéine de 25 l'invention, ont été analysés par 1H RMN du proton et du carbone. Des spectres ont été obtenus avec un spectrophotomètre Bruker Avance DRX 500 (Service de RMN de l'Université de Bretagne Occidentale) à 20°C. Avant l'analyse, les échantillons ont été transférée dans du D20 (99,97 atom% D20). 30 Les spectres indiquent clairement la disparition de l'unité acide glucuronyl et que les oligosaccharides sont terminés à leur extrémité non- 2 9802 10 19 réductrice par un rhamnose sulfaté. La structure des oligosaccharides démontrent que la protéine de l'invention est une 3S-rhamnose glucuronyl hydrolase qui catalyse l'hydrolyse de la liaison glycosidique entre l'acide glucuronyl et le rhamnose sulfaté. Cette enzymes catalysent notamment 5 les réactions présentée Figure 6. L'étude de la cinétique de dégradation des oligosaccharides purifiés par la protéine de l'invention a été réalisée dans un milieu réactionnel composé de 100 mM NaCI, 100 mM, Tris HCI (pH 7,7) et oligosaccharides d'ulvane (dp 2-8) à 30°C dans une cuvette de quartz 1 mL. La 10 concentration maximale des oligo-ulvans utilisée correspond à une absorbance de 0,5 à 235 nm. 10 pL de GH105 pure (19 pg/mL) a été ajoutée au milieu réactionnel. La dégradation des oligosaccharides de l'ulvane (ou plutôt la disparition de l'acide glucuronyl non réducteur) a été suivie par la diminution de l'absorbance à 235 nm pendant 5 min. 15 Ceci a permis d'affiner les modalités de reconnaissance. Les inventeurs ont démontré que les tétra-saccharides de structures .8,-Rha3SGluA-Rha3S et .8,-Rha3S-IduA-Rha3S sont dégradés plus rapidement. Une baisse de vitesse de dégradation observée pour l'oligo-ulvane .8,-Rha3SXyl-Rha3S indiquant que la présence de la fonction uronique en +2 du site 20 actif est importante. Cette observation suggère une organisation du site actif en 3 sous-sites qui est confirmée par la vitesse de dégradation de disaccharide .8,-Rha3S. La présence du sulfate sur le rhamnose est critique pour obtenir la reconnaissance du substrat car le disaccharide obtenu avec le rhamnogalacturonane n'est pas dégradé. 25 2 9802 10 20 Listes des références [1] Marc Lahaye et Audrey Robic, Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromolecules 5 2007, Vol. 8, 1765-1774. [2] http://www.cbs.dtu .d k/services/Sig nal P/ [3] http://bmbpcu36.1eeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.htmL [4] http://www.promeg a .com/vectors/mam mal ian_express_vectors.htm [5] http://www.qiagen.com/pendantview/qiagenes.aspx?gaw=PROTQIAg 10 enes0807&gkw=mammalian+expression [6] http://www.scbt.com/chap_exp_vectors.php?type=pCruzTM(Y020Expr ession%20Vectors [7] WO 83/004261 [8] ZoBell, CE 1941 Studies on marine bacteria. I. The cultural 15 requirements of heterotrophic aerobes, J Mar Res 4, 41-75 [9] Liu YG, Mitsukawa N, Oosumi T and Whittier RF (1995) Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR. Plant J. 8: 457-463 [10] Korf U, Kohl T, vand der Zandt H Zahn R, Schleeger S Ueberle B, 20 Wandschneider S Bechtel S, Schôler M, Ottleben H, Wiemann S and Poutska A 2005 Large scale protein expression for proteome research. Proteomics 2005, 5, 3571-3580, DOI 10.1002/pm ic.200401195 [11] Cohen, SN, Chang ACY, Hsu L (1972) Nonchromosomal antibiotic 25 resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli par R-factor DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114 [12] Groisillier A, Hervé C, Jeudy A, Rebuffet E, Pluchon PF, Chevolot Y, Flament D, Geslin C, Morgado IM, Power D, Branno M, Moreau H, Michel G, Boyen C, Czjzek M 2010. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact. 9, 45. REVENDICATIONS1. Protéine de séquence SEQ ID n°1 du listage de séquences 5 annexé. 2. Protéine selon la revendication 1 comprenant en outre, à son extrémité N-terminale, une séquence signal. 10 3. Protéine selon la revendication 2, dans laquelle la séquence signal est la séquence SEQ ID n°2 du listage de séquences annexé. 4. Acide nucléique de séquence SEQ ID n°3 du listage de séquences annexée. 15 5. Acide nucléique selon la revendication 4 comprenant en outre, à son extrémité 5', la séquence SEQ ID n°4 du listage de séquences annexé. 20 6. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5. 7. Cellule hôte comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 4 ou 5 ou un vecteur selon la revendication 6. 25 8. Procédé de fabrication d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 par recombinaison génétique utilisant un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5 ou un vecteur selon la revendication 6. 30 9. Procédé d'hydrolyse d'oligosaccharides comprenant une étape de mise en contact des oligosaccharides avec une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou avec une cellule hôte selon la revendication 7 dans des conditions permettant l'hydrolyse des 5 oligosaccharides.