Brevet FR2987056A1 — publié le 20130823

La présente invention concerne le domaine de la biologie en général, et en particulier les récepteurs de l'acide lysophosphatidique. Plus précisément, l'invention concerne notamment un procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPA2 par la mesure de l'expression d'un ou de plusieurs marqueurs spécifiques, en particulier pour déterminer in vitro l'activité modulatrice in vitro ou in vivo d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA2, notamment dans le cadre du suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique ciblant spécifiquement le récepteur LPA2. L'acide lysophosphatidique (LPA) est un phospholipide naturel qui présente une activité de type facteur de croissance sur une très large variété de cellules, régulant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire in vitro (Fukushima et al., 1998 ; Goetzl et a/.,1999). Les plaquettes sanguines constituent la source majeure, mais non-exclusive, de LPA dans l'organisme lors de l'agrégation plaquettaire (Gerrard et Robinson, 1989). La concentration de LPA passe de l'ordre de 0,1pM dans le plasma à 5-25pM dans le sérum. Les fibroblastes, les préadipocytes et certaines cellules tumorales peuvent produire elle-même du LPA. Le LPA est impliqué dans le contrôle de nombreuses fonctions physiopathologiques (fibrose pulmonaire, fibrose rénale, obésité, polyarthrite rhumatoïde, reproduction, maladies urinaires, cancer). L'action cellulaire du LPA passe par l'activation d'une série de récepteurs présents à la surface de nombreuses cellules dont les cellules cancéreuses (LPAi, LPA2, LPA3, LPA5, LPA6 et LPA7). Ces récepteurs sont très homologues entre-eux. Ils ont 25 une structure à sept passages transmembranaires couplés aux protéines fixatrices du GTP (protéines G). On distingue cependant deux sous-classes de récepteurs en fonction de leur origine phylogénétique et de leur organisation génomique (LPA1-3 et LPA4_7). Il faut savoir que les ARN messagers codant pour ces récepteurs sont largement distribués au niveau 30 tissulaire (Contas et e, 2002) et que la plupart des cellules expriment plusieurs types de récepteurs en même temps. De nombreux laboratoires et sociétés développent actuellement des molécules à visée thérapeutique ciblant les récepteurs du LPA, notamment le récepteur de type 2 du LPA ou LPA2. Or, il n'existe à l'heure actuelle aucun test permettant de valider l'activation ou l'inhibition spécifique du récepteur LPA2 dans des d'échantillons biologiques prélevés in vivo, ni in vitro dans des systèmes cellulaires complexes exprimant de multiples récepteurs du LPA, ce qui est largement majoritaire. A ce jour, il n'est donc pas possible de savoir si le récepteur LPA2 spécifiquement est effectivement activé ou inactivé. En particulier dans l'organisme (homme, souris...), aucun test ne permet de valider que ce récepteur LPA2 est effectivement activé ou inactivé sous l'action de ces différentes molécules thérapeutiques, ni de suivre l'efficacité de thérapies ciblées mises en place. Actuellement, la validation de l'activation et de l'inhibition du récepteur LPA2 est réalisée uniquement in vitro, et ceci dans des conditions très limitées à partir de cellules n'exprimant naturellement aucun récepteur du LPA et qui après manipulations génétiques expriment ce récepteur. Les tests consistent à mesurer soit l'intensité du flux calcique intracellulaire par spectrophotométrie en présence de LPA, soit la fixation de gammaGTP* au niveau de protéines fixatrices du GTP, présentes au niveau de la face interne de la membrane plasmique, en mesurant la radioactivité associée aux membranes suite à la stimulation par le LPA. C'est dans ce contexte que la présente invention propose de pouvoir détecter in vitro l'activation ou l'inhibition spécifique du récepteur LPA2 grâce à l'utilisation d'une signature biologique particulière. La présente invention comble donc l'impossibilité actuelle de confirmer l'état d'activation ou d'inhibition spécifique du récepteur LPA2 in vivo dans l'organisme, mais également in vitro dans des systèmes cellulaires complexes 30 qui expriment différents récepteurs du LPA. 2 9 8 7056 3 Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPA2 comprenant les étapes consistant à : - mesurer le niveau d'expression des marqueurs CCN1 (membre 1 de la 5 famille CCN [Connective tissue growth factor (CTGF), Cysteine rich protein (Cyr61), and Nephroblastoma overexpressed gene (nov)]) et CCN2 (membre 2 de la famille CCN) [Connective tissue growth factor (CTGF), rysteine rich protein (Cyr61), and Nephroblastoma overexpressed gene (nov)]) dans un échantillon, 10 - conclure à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPA2 lorsqu'une augmentation ou une diminution significative du niveau d'expression de ces deux marqueurs est respectivement mise en évidence par rapport à une valeur de référence. Les inventeurs ont en effet trouvé, de manière surprenante, que l'étude 15 de l'expression combinée du gène codant CCN1 (membre 1 de la famille CCN telle que décrite par Perbal en 2001 [Connective tissue growth factor (CTGF), Cysteine rich protein (Cyr61), and Nephroblastoma overexpressed gene (nov)]) et du gène codant CCN2 (membre 2 de la famille CCN) constitue une signature de l'activation ou de l'inhibition du récepteur LPA2 20 spécifiquement. Ainsi, une augmentation de l'expression de CCN1 et de l'expression de CCN2 est associée à l'activation de LPA2 spécifiquement, alors qu'une diminution de l'expression de CCN1 et de CCN2 est associée à l'inhibition de LPA2 spécifiquement. Par conséquent, si l'expression respective des deux marqueurs CCN1 et CCN2 est modifiée en sens contraire, c'est-à- 25 dire que l'expression d'un de ces deux marqueurs est augmentée alors que l'expression de l'autre de ces deux marqueurs est diminuée, il ne sera pas possible de conclure à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPA2 spécifiquement. Ainsi, on ne pourra pas conclure que la modification de l'expression de ces deux marqueurs est spécifiquement due à la voie de signalisation spécifique du récepteur LPA2 du LPA. Selon une première variante de mise en oeuvre, le procédé de l'invention permet la détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un 2 9 8 7056 4 composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA2, par la mesure de l'expression des deux marqueurs CCN1 et CCN2 comme indiqué ci-dessus, et en utilisant comme valeur de référence le niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à 5 déterminer. Selon une deuxième variante de mise en oeuvre, le procédé de l'invention permet également le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2, par la mesure de l'expression des deux marqueurs CCN1 et CCN2 comme indiqué ci-dessus, et 10 en utilisant comme valeur de référence le niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur. Le récepteur de type 2 du LPA ou LPA2 est également nommé parfois LPAR2 pour « lysophosphatidic acid receptor 2 », ou encore EDG4 (Endothelial Differenciation Gene 4). Dans le cadre de l'invention, le 15 récepteur LPA2 correspond de préférence au récepteur tel que décrit par An et al., 1998. Par ailleurs, selon l'invention, le mot « spécifique » ou « spécifiquement » utilisé en lien avec le récepteur LPA2 ou son activité correspond à une activité du récepteur LPA2, et non à l'activité d'autres types de récepteurs du LPA, et notamment LPAi ou LPA3 à LPA7. 20 Dans le cadre de l'invention, le marqueur CCN1 encore nommé CYR61 (Cysteine-rich protein 61), IGFBP10 (Insulin-like Growth Factor-Binding Protein 10) correspond de préférence à celui décrit par Jay et aL, 1997. En particulier, pour le marqueur CCN1 selon l'invention, la séquence nucléique de référence est de préférence la suivante : NM_001554.4 25 De même, la séquence protéique de référence pour le marqueur CCN1 selon l'invention est de préférence la suivante : CAG38757.1 Dans le cadre de l'invention, le marqueur CCN2 ou encore nommé CTGF (Connective Tissue Growth Factor), NOV2 (Nephroblastoma Overexpressed gene 2), HCS24 (Hypertrophic Chondrocyte-Specific gene product 24), 30 IGFBP8 (Insulin-like Growth Factor-Binding Protein 8) correspond de préférence à celui décrit par Bradham et aL, 1991. En particulier, pour le marqueur CCN2 selon l'invention, la séquence nucléique de référence de préférence est la suivante : NM_001901.2 De même, la séquence protéique de référence pour le marqueur CCN2 selon l'invention est de préférence la suivante : ADL14512.1 Le procédé selon l'invention permet en particulier de déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPA2 in vivo ou in vitro, et ce quelle que soit la variante du procédé selon l'invention. Selon l'invention, la valeur de référence est choisie en fonction de la variante de mise en oeuvre du procédé. Selon un deuxième aspect, la présente invention a également pour objet un procédé de détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPA2 tel que décrit ci-dessus, et que la valeur de référence correspond aux niveaux d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à déterminer. Dans le cadre de ce procédé, le composé dont l'activité modulatrice est à déterminer peut correspondre à un composé dont on souhaite déterminer l'activité en tant qu'agoniste ou antagoniste du récepteur LPA2. En particulier, le composé dont l'activité modulatrice est à déterminer est de préférence une molécule thérapeutique. Ce procédé permet ainsi de valider l'efficacité d'agonistes ou d'antagonistes dirigés spécifiquement contre le récepteur LPA2 dans des systèmes cellulaires complexes exprimant de multiples récepteurs du LPA, et 25 en particulier dans un contexte thérapeutique. Selon un troisième aspect, la présente invention a également pour objet un procédé de suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé du procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du 30 récepteur LPA2 tel que décrit ci-dessus, et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur. 2 9 8 7056 6 Dans cette variante particulièrement préférée, la présente invention permet ainsi de valider l'efficacité de composés thérapeutiques ayant spécifiquement pour cible le récepteur LPA2 et de suivre leur efficacité dans le temps au cours de la mise en place du traitement. De manière préférée, le 5 prélèvement antérieur correspond à un stade antérieur au cours du traitement avec le composé thérapeutique dont on souhaite valider l'efficacité, et non à un stade antérieur avant la mise en place dudit traitement. Ce procédé de validation et de suivi de l'efficacité de composés 10 thérapeutiques ciblant spécifiquement le récepteur LPA2 trouve application dans de nombreuses pathologies, et notamment dans le traitement des cancers, de désordres nerveux ou de la reproduction. En cancérologie par exemple, il a été récemment montré que les récepteurs du LPA sont impliqués dans la carcinogène et dans la dissémination métastatique des 15 cancers du sein (Boucharaba et al., 2004 et 2006 ; Liu et al., 2009). Plus particulièrement, il a récemment été montré que les souris invalidées pour l'expression du récepteur LPA2 étaient moins susceptibles de développer des cancers du côlon que les souris exprimant LPA2 (Lin et aL, 2009). En plus de l'expression de CCN1 et de CCN2, le procédé de l'invention 20 peut en outre comprendre une étape de mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), notamment choisi(s) parmi l'IL-6 (Interleukine 6) et l'IL-8 (Interleukine 8) comme décrit par Fang et al., en 2004. Ce mode de réalisation particulier peut s'appliquer quelle que soit la variante de mise en oeuvre du procédé, à savoir pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPA2, mais également pour déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA2, ou encore pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2. Au sens de la présente invention, les termes « mesure de l'expression » 30 ou « mesurer l'expression » signifient une mesure in vitro ou ex-vivo de l'expression. Par ailleurs, dans ces termes, le mot « expression » entend désigner à la fois la mesure de l'expression au niveau nucléique ou au niveau protéique. A cet effet, toute méthode de mesure ou de quantification bien connue de l'homme du métier peut être utilisée pour la mise en oeuvre de l'invention. En particulier, lorsque la mesure de l'expression est réalisée au niveau 5 nucléique, et en particulier à partir d'ARN ou d'ADNc, celle-ci peut notamment être réalisée par analyse PCR, en particulier PCR quantitative ou qPCR, par hybridation micro-arrays (biopuces) ou Northern-blot. Lorsque la mesure de l'expression est réalisée au niveau protéique, les techniques standards telles que le Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, 10 CLIA, ECL, cytométrie de flux ou immunocytologie peuvent être utilisées. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la mesure de l'expression des marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et en particulier par une technique PCR. Au sens de la présente invention, tout acte défini en relation avec le 15 terme « in vitro» couvre également le même acte en relation avec les termes « ex vivo » ou « in cellulo » ou avec tout terme équivalent du moment qu'il exclut une application au corps humain ou animal. Par « augmentation ou diminution significative du niveau d'expression », on entend une augmentation ou une diminution 20 statistiquement significative du niveau d'expression, de préférence associée ou corrélée à un indice de confiance d'au moins 95 % (p Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le kit selon l'invention est utilisé pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2. Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont 5 mentionnés ci-dessus concernant le procédé et l'utilisation constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant du kit et de son utilisation. En particulier, l'invention couvre de préférence l'utilisation d'un kit comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le 10 niveau d'expression de CCN1 et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CCN2, et éventuellement celui d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi l'IL-6 et l'IL-8, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, et de manière particulièrement préférée l'utilisation d'un tel kit pour le suivi de 15 l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci- dessous en référence aux figures annexées qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de la présente invention, et dans 20 lesquelles : - la figure 1 représente l'expression de LPA2, CCN1 et CCN2 dans des cellules MDA-B02, SK-BR-3, et MDA-B021 LPA2, SK-BR-3/ LPA2, - la figure 2 représente l'expression de LPA2, CCN1 et CCN2 dans une collection d'ARN provenant de tumeurs primaires du sein, 25 - la figure 3 représente la corrélation d'expression de LPA2 en fonction des niveaux d'expression combinés de CCN1 et de CCN2 dans une collection d'ARN provenant de tumeurs primaires du sein. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. 30 EXEMPLES Méthodes Les groupes de gènes dont l'expression est stimulée de façon précoce par l'activation spécifique du récepteurs LPA2 en réponse à une stimulation par le LPA ont été identifiés de la manière suivante. Une analyse croisée des données de transcriptomique de lignées cellulaires stimulées ou non par le LPA pendant un temps cours a été réalisée. Afin d'éliminer de l'analyse tous les gènes qui sont spécifiques à une seule lignée cellulaire une série de trois lignées cellulaires tumorales naturelles, non modifiées génétiquement, différentes tant au niveau de leur genre (mâle pour les PC3 et femelles pour les MDA-MB-231. et MCF-7) que de leur origine cancéreuse (cancer de la prostate hormono-indépendant pour les PC3, cancer du sein hormono-indépendant pour les MDA-MB-231 et cancer du sein hormono-dépendant pour les MCF-7) ont été utilisées. Les cellules ont été cultivées en absence de sérum pendant 24h puis mises en présence ou non de LPA (1 pM) pendant 45 minutes. Les ARN totaux de six réplicats indépendants de chaque lignée cellulaire ont été extraits à l'aide du kit Nucleospin RNAII (Macherey-Nagel) et les ARNs ont été traités avec une DNAse RNAse-free afin d'enlever toute trace de contamination par l'ADN génomique. Deux réplicats pour chaque condition ont été analysés sur des biopuces Affimétrix U133 PIus2.0 (54677 sondes). Après hybridation selon les conditions préconisées par le fournisseur (Affimetrix UK Ltd, Royaume Uni), la moyenne d'intensité du signal émis par les sondes correspondant à chaque duplicat a été calculée pour chaque des conditions. Les duplicats présentant une intensité moyenne d'expression inférieure à la valeur Médiane d'expression (valeur=63) de l'ensemble des 54677 sondes de la biopuce ont été éliminés de l'analyse en raison d'un niveau d'expression trop faible et donc non fiable. Ont également été éliminés de l'analyse les sondes désignées comme « Absent », en présence de LPA, par le logiciel Affimétrix d'analyse de la biopuce. En absence de stimulation par le LPA, l'analyse montre que chaque lignée cellulaire utilisée exprime un panel différent des récepteurs du LPA, comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Edg2 Edg4 Edg7 GPR23 GPR92 P2Y5 GPR87 LPAI LPA2 LPA3 LPA1 LPA3 LPAs LPA7 P2Y9 PC3 ++++ ++ +++ 0 0 ++-I- ++ MCF-7 0 +++ 0 0 0 0 +++ MDA-MB-231 +4- ++ 0 0 0 0 0 En résumé, les récepteurs du LPA majoritaires chez les PC3 sont LPA1,2,3,6,7, chez les MCF7 LPA2,7 et chez les MDA-MB231 LPA1,2- Une analyse par biopuces a ensuite été effectuée sur la base de l'hypothèse suivante : les gènes régulés de façon similaire (activation/inhibition) et commune dans les trois lignées cellulaires PC3, MCF7 et MDA-MB-231 identifient l'activation spécifique de LPA2. Pour cela, les trois lignées cellulaires ont été cultivées dans un milieu ne contenant pas de sérum. Puis elles ont été mises en présence de LPA 1 pM pendant 45 minutes. Les cellules ont ensuite été récoltées et leur contenu en ARN total a été préparé. Chaque condition expérimentale a été reproduite 6 fois (6 réplicats) de façon indépendante. L'analyse par biopuces est basée sur la comparaison des moyennes d'expression de deux réplicats pour chaque condition. L'analyse a été effectuée en excluant l'ensemble des sondes de la biopuce correspondant à des EST et à des gènes codant pour des séquences identifiées « protéines hypothétiques ». Ainsi, un ensemble de 28 gènes est régulé de façon commune par le traitement au LPA dans les cellules PC3, MCF-7 et MDA-MB-231. Selon l'hypothèse formulée, cette liste de gènes correspond à la signature d'activation du récepteur LPA2. 2 9 8 7056 13 L'expression des deux gènes CCN1 et CCN2 a notamment été analysée pour étudier le lien potentiel avec l'activité du récepteur LPA2. Exemple 1 : Analvsepar RT-OPCR de l'expression de CCN1 et CCN2 partir de lignées cellulaires in vitro 5 A partir des lignées de cellules humaines de cancer du sein MDA-B02, un sous clone des cellules MDA-MB-231 (Peyruchaud et al., 2001) qui expriment l'ensemble des récepteurs du LPA décrits à ce jour (LPA1.6) et SKBR-3 (ATCC HTB-301") qui n'expriment pas ou peu les récepteurs du LPA, des lignées cellulaires MDA-B02/LPA2 qui surexpriment le récepteur LPA2 et 10 SK-BR-3/LPA2 qui expriment de novo LPA2 ont été construites par transfection comme décrit par Boucharaba et al., 2004 et Boucharaba et al., 2006. L'expression de LPA2, CCN1 et CCN2 a été étudiée par RT-PCR quantitative (QPCR) à partir des ARN totaux extraits de ces différentes 15 lignées cellulaires MDA-B02, SK-BR-3, MDA-B02/LPA2 et SK-BR-3/ LPA2 cultivées à 37°C dans du milieu DMEM (PAA) et McCoy's (Invitrogen) en présence de sérum de voeu foetal (10 %). Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du kit Nucleospin RNAII (Macherey-Nagel), puis ont été traités avec une DNAse RNAse-free afin 20 d'enlever toute trace de contamination par l'ADN génomique. Les ADNc ont été synthétisés à partir de 1 pg d'ARN en utilisant le kit iScript cDNA Synthesis kit (Biorad). Les ARNm ont été amplifiés en utilisant le kit SYBR Green (Finnzymes) à l'aide d'amorces spécifiques (CCN1-F : 5' GCTGGAATGCAACTTCGG -3' (SEQ ID NO : 1) ; CCN1-R : 5'- 25 CCCGTTTTGGTAGATTCTGG -3' (SEQ ID NO : 2) ; CCN2-F : 5'- GCAGGCTAGAGAAGCAGAGC-3' (SEQ ID NO : 3) ; CCN2-R : 5'- ATGTCTTCATGCTGGTGCAG -3' (SEQ ID NO : 4) ; LPA2-F : 5'- CGCTCAGCCTGGTCAAGACT -3' (SEQ ID NO : 5) ; LPA2-R : 5'- TTGCAGGACTCACAGCCTAAAC-3' (SEQ ID NO : 6) grâce à l'Eppendorf Mastercycler RealPlex (Invitrogen). Les ADN complémentaires ont été amplifiés par une PCR de 40 cycles et les produits de PCR analysés par électrophorèse dans un gel 2% agarose marqués au bromure d'éthidium. Les valeurs de CT (cycle seuil ou Cycle Threshold) obtenues ont été normalisées par l'expression de l'ARNm ribosomal L32 par la méthode des AACt (L32-F : 5'-CAAGGAGCTGGAAGTGCTGC-3' (SEQ ID NO : 7) ; L32-R : 5'- CAGCTCTTTCCACGATGGC-3' (SEQ ID NO : 8). Les résultats sont regroupés sur la figure 1, et montrent que les niveaux d'expression de CCN1 et de CCN2 sont directement corrélés à celui de LPA2 dans les lignées cellulaires humaines de cancers du sein MDAB02/LPA2 et SK-BR-3/LPA2. Ces résultats indiquent que la mesure de l'expression de CCN1 et de 10 CCN2 constitue une signature de l'activité du récepteur LPA2. Des résultats similaires ont été obtenus avec d'autres lignées cellulaires telles que des lignées de cancer du sein MDA-MB-231 et MCF-7 et de cancer de la prostate telle que PC3, et de mélanome telle que MDA-MB-435S. Exemple 2 : Analyse par RT-QPCR de l'expression de CCN1 et 15 CCN2 à partir d'une série d'ARN de tumeurs primaires de cancers du sein Une série de 254 échantillons d'ARN provenant de tumeurs primaires de patientes atteintes d'un cancer du sein a été analysé par QPCR pour les niveaux d'expression du gène codant LPA2, CCN1 et CCN2. 20 a) L'analyse des deux marqueurs CCN1 et CCN2 pris individuellement a tout d'abord été effectuée. Les résultats sont regroupés sur la figure 2. La population a été stratifiée en quatre sous-groupes de 63 ou 64 (cf. Tableau 3 ci-dessous) personnes chacun (Quartiles) correspondant (i) au 1/4 de la population qui a le niveau de LPA2 le plus faible (LPA2 très bas +), (ii) 25 au 1/4 de la population qui a le niveau atteignant la valeur médiane d'expression de LPA2 (LPA2 bas ++), (iii) au 1/4 de la population qui a un niveau d'expression de LPA2 supérieur à la médiane (LPA2 moyen +++), et (iv) au 1/4 de la population qui a le niveau de LPA2 le plus fort (LPA2 haut ++++) (figure 2). 30 L'analyse de différentes populations de tumeurs montre une corrélation directe entre le niveau d'expression de LPA2 et de CCN1. Ceci est observé par le test-t série non appariées pour la population ayant le niveau de LPA2 le plus faible (LPA2 très bas) par rapport à la population ayant le niveau d'expression le plus élevé de LPA2 (LPA2 haut), p Tableau 10 : Test-t séries non appariées pour LPA2 Ecart moyen DDL t p 1B2B, 1B2H -0,003 125 -1,559 0,1214 1B2B, 1H2B -0,001 128 -0,418 0,6765 1B2B, 1H2H -0,005 203 -4,689 Références bibliographiques, - An S, Bleu T, Hallmark OG, Goetzl E]. Characterization of a novel subtype of human G protein-coupled receptor for lysophosphatidic acid. J Biol Chem. 1998 Apr 3;273(14):7906-10. -Boucharaba A, Serre CM, Grès S, Saulnier-Blache 3S, Bordet JC, Guglielmi J, Clézardin P, Peyruchaud 0. Platelet-derived lysophosphatidic acid supports the progression of osteolytic bone metastases in breast cancer. J Clin Invest. 2004 Dec;114(12):1714-25. -Boucharaba A, Serre CM, Guglielmi J, Bordet JC, Clézardin P, Peyruchaud 0. 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Procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPA2 comprenant les étapes consistant à : - mesurer le niveau d'expression des marqueurs CCN1 (membre 1 de la famille CCN) et CCN2 (membre 2 de la famille CCN) dans un échantillon, - conclure respectivement à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPA2 spécifiquement lorsqu'une augmentation ou une diminution significative du niveau d'expression de ces deux marqueurs est mise en évidence par rapport à une valeur de référence. 2. Procédé de détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé selon la revendication 1 et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à déterminer. 3. Procédé de suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé selon la revendication 1 ou 2 et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-6 et l'IL-8. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mesure du niveau d'expression des marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et de préférence par une technique PCR. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon est d'origine biologique, et de préférence humaine. 7. Utilisation de la mesure in vitro du niveau d'expression des marqueurs CCN1 et CCN2 en tant que signature de l'activité du récepteur spécifique LPA2 du LPA, c'est-à-dire d'une activation ou d'une inhibition de ce récepteur. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'une augmentation du niveau d'expression de CCN1 et de CCN2 est une signature de l'activation du récepteur spécifique LPA2, alors qu'une diminution du niveau d'expression de CCN1 et de CCN2 est une signature de l'inhibition du récepteur spécifique LPA2. 9. Utilisation selon la revendication 7 ou la revendication 8 pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPA2, pour déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA2, ou pour le suivi de l'efficacité in vivo d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2. 10.Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 comprenant également la mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi l'IL-6 et l'IL-8. 11.Kit pour déterminer l'activité du récepteur spécifique LPA2 du LPA, en particulier l'activité in vivo de ce récepteur, comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CCN1 et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CCN2. 12. Kit selon la revendication 11, caractérisé en qu'il comprend en outre un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi l'IL-6 et VIL-8. 13. Utilisation du kit tel que défini à l'une quelconque des revendications 11 et 12, pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6. 14. Utilisation du kit selon la revendication 13, pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA2. 15.Utilisation du kit selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que ledit kit comprend un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CCN1 et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CCN2, et éventuellement celui d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi IIL-6 et l'IL-8.10