Brevet FR2988734A1 — publié le 20131004

Domaine de l'invention La présente invention se situe dans le domaine de la biologie du cheveu. Elle se rapporte à un procédé d'obtention d'un modèle cellulaire exprimant des kératines spécifiques du follicule pileux humain. Arrière-plan de l'invention Les cheveux sont des annexes kératiniques au même titre que les poils, les cils, les sourcils ou encore les ongles. Le cheveu prend naissance au sein du follicule pileux, une structure bulbaire qui traverse toutes les couches de la peau pour s'ouvrir sur le milieu extérieur. Le cycle du cheveu est essentiellement lié à l'activité du follicule pileux et se décompose en 3 phases : la phase anagène, ou phase de croissance du cheveu ; la phase catagène correspondant à l'arrêt de la croissance du cheveu ; et la phase télogène qui se termine par la chute du cheveu et qui va permettre à un nouveau bulbe de se former (Bernard B. A. ; Médecine/Sciences 2006 ; 22 : 138-43). Le follicule pileux est doté d'une organisation concentrique constituée de plusieurs couches de cellules, exprimant chacune des kératines différentes et spécifiques. La solidité d'une telle structure est en grande partie assurée par les kératines contenues dans les cellules qui la composent. Les kératines sont des protéines insolubles qui forment les filaments intermédiaires (FI) du cytosquelette des cellules épithéliales. Ces protéines sont impliquées dans le soutien structurel, la cyto-architecture, la réponse au stress, la migration et la régulation des voies de signalisation. Certaines kératines sont préférentiellement exprimées dans des régions particulières du cheveu, telles les kératines 33a, 33b, 34, 35 et 36 retrouvées dans le cortex cheveux, ou encore les kératines 71, 72 et 73 que l'on retrouve dans l'IRS ou Inner Root Sheath (Schweizer J, Langbein L, Rogers MA, Winter H. Hair follicle-specific keratins and their diseases. Exp Cell Res. (2007) 313: p2010-20.), Parmi ces kératines, la kératine K34 est exprimée spécifiquement dans le cortex du cheveu qui fournit la résistance mécanique et la résilience de la tige pilaire. La kératine K71 est, quant à elle, exprimée dans les 3 couches de la gaine interne (IRS ou limer Root Sheath) du follicule qui participent à la conformation et à l'orientation de la tige pilaire lors de la croissance du cheveu (Langbein L, Rogers MA, Praetzel S, Aoki N,Winter H, Schweizer J: A novel epithelial keratin, hK6irs1, is expressed differentially in all layers of -2- the inner root sheath, including specialized Huxley cells (Flugelzellen) of the human hair follicle, J Invest Dermatol 118:789-799, 2002). Le rôle de ces kératines spécifiques n'est pas entièrement élucidé. Toutefois, un des freins majeur à la recherche dans ce domaine est la disponibilité du matériel cellulaire nécessaire à la réalisation de tests. En effet, contrairement aux cellules humaines de l'ORS (Outer Root Sheath) dont la technique d'isolement a été décrite (M Detmar, FM Schaart, U Blume and CE Orfanos, Culture of hair matrix and follicular keratinocytes. J Invest Dermatol, 101 :130S-134S, 1993), les cellules humaines normales de la tige pilaire et de l'IRS ne sont pas faciles à isoler et à cultiver. De plus, ce type de cellules n'est pas disponible commercialement et d'autre part, il n'existe pas, à la connaissance de la Demanderesse, de lignées cellulaires établies présentant le phénotype de telles cellules. Or, la bonne santé des cheveux est une préoccupation importante d'un grand nombre d'individus, et de nombreux traitements cosmétiques et/ou médicamenteux ont été développés ces dernières années afin de prévenir et/ou de traiter la chute des cheveux. Toutefois, la cause majeure de perte des cheveux est liée à l'âge et s'avère difficile à circonscrire. C'est pourquoi il est d'un intérêt majeur dans le domaine de la cosmétique de disposer d'un modèle cellulaire reproduisant les caractéristiques des cellules du follicule pileux humain. Ainsi, il apparait nécessaire, pour mieux comprendre la biologie du cheveu, de disposer de modèles cellulaires permettant d'approfondir l'étude in vitro du rôle de ces kératines en particulier. Le problème qui se pose est de remédier à ce manque en fournissant un modèle cellulaire exprimant les kératines spécifiques du follicule pileux humain, telles que la 25 kératine K34 ou la kératine K71. Exposé de l'invention La présente invention a donc pour premier objet un procédé d'obtention d'un modèle cellulaire eucaryote comprenant les étapes de culture d'une cellule de mammifère hôte et de 30 transfection de ladite cellule hôte avec un vecteur d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain. L'invention a pour deuxième objet une lignée cellulaire établie de cellules de mammifère transfectées par un vecteur d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain choisie parmi la kératine K34 ou la kératine K71. -3- Enfin, l'invention a pour troisième objet une méthode in vitro pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un composé sur la modulation de l'activité du follicule pileux humain en utilisant des cellules de la lignée cellulaire selon l'invention. L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent. Grâce au développement des biotechnologies et notamment à l'évolution des techniques d'ingénierie moléculaire et cellulaire, il est possible d'amener des cellules à exprimer de nouvelles protéines, par exemple des kératines spécifiques, et de fabriquer ainsi des modèles cellulaires permettant d'approfondir l'étude in vitro du rôle de ces kératines particulières au niveau du follicule pileux humain. La présente invention concerne donc un procédé d'obtention d'un modèle cellulaire de type eucaryote, comprenant les étapes de culture d'une cellule hôte de mammifère et de transfection de ladite cellule hôte avec un vecteur d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain. La cellule de mammifère hôte de départ selon l'invention est une cellule humaine normale, ou une lignée cellulaire établie. Avantageusement, dans un premier mode de réalisation de l'invention, les cellules hôtes de départ sont des cellules d'origine épithéliale normales ou provenant de lignées établies. Les cellules épithéliales expriment des kératines différentes des cellules de l'IRS ou de la tige pilaire mais représentent néanmoins de bons modèles cellulaires hôtes pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un composé sur la modulation de l'activité du follicule pileux humain. Préférentiellement, la cellule humaine normale d'origine épithéliale est un kératinocyte humain normal issu des zones interfolliculaires de l'épiderme. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule de mammifère hôte de départ selon l'invention est une lignée cellulaire établie d'origine non épithéliale. Préférentiellement, la lignée établie selon l'invention est choisie parmi les cellules HEK293 (human embryonary kidney, Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R, Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5, J Gen Virol. 1977 Jul;36(1):59-74) et les cellules COS7 (lignée cellulaire de rein de singe vert Africain, Gluzman Y, SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants Cell. 1981 Jan;23(1):175-82). Encore plus préférentiellement, la lignée établie est celle des cellules HEK293. -4- Le modèle cellulaire de type eucaryote selon l'invention est obtenu par transfection de la cellule hôte avec un vecteur d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain. Toutes les méthodes de transfection adaptées aux cellules selon l'invention peuvent être utilisées. Parmi ces méthodes, on peut par exemple citer la méthode au phosphate de calcium, la lipofection ou encore l'électroporation. De préférence, on utilisera la méthode LipofectamineTM 2000 d'InvitrogenTM. La transfection de la cellule hôte selon l'invention est réalisée avec un vecteur 10 d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain choisie parmi la kératine K34 ou la kératine K71. Avantageusement, à titre d'exemple, le vecteur d'expression selon l'invention est un plasmide comprenant l'ADNc obtenu par une technique classique de clonage (RT-PCR à partir de cellules humaines puis séquençage) et codant pour la kératine spécifique du 15 follicule pileux humain, à savoir K34 ou K71, positionné sous la dépendance d'un promoteur, préférentiellement un promoteur de type CMV (provenant du cytomegalovirus). Le vecteur d'expression utilisé selon l'invention comprend également un marqueur de sélection, c'est-à-dire un gène codant pour une protéine nécessaire à la survie ou à la croissance d'une cellule hôte transfectée avec le vecteur. Seules les cellules hôtes dans 20 lesquelles le gène marqueur a été introduit survivront et/ou se développeront dans des conditions choisies de sélection. Les gènes de sélection typiques codent pour des protéines qui confèrent une résistance aux antibiotiques ou à d'autres substances toxiques, complètent les déficiences auxotrophes ou fournissent des nutriments essentiels non disponibles dans les milieux complexes. Le choix du marqueur de sélection approprié dépendra de la cellule 25 hôte. Préférentiellement, le vecteur d'expression utilisé selon l'invention comprend un gène de résistance à la néomycine ou l'hygromycine pour la sélection des cellules hôtes transfectées. Encore plus préférentiellement, le vecteur d'expression utilisé selon l'invention 30 comprend en outre une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique afin de permettre l'amplification et la sélection bactérienne, ainsi qu'un site multiple de clonage où est inséré le matériel génétique, par exemple l'ADNc, codant pour la kératine spécifique du follicule pileux humain. -5- Les cellules hôtes recombinantes, dans le présent contexte, sont celles qui ont intégrées un tel matériel génétique. Par matériel génétique ou gène selon l'invention, on désigne les molécules d'ADN, d'ADNc ou encore d'ARN. Les cellules de mammifère hôte selon l'invention peuvent être transfectées de façon stable ou transitoire. Après la transfection selon l'invention, le vecteur d'expression s'intègre au hasard, après linéarisation, dans un des chromosomes de la cellule de mammifère hôte dans le cadre d'une transfection stable, ou reste circulaire en cas de transfection transitoire. Dans la plupart des applications de la transfection, il suffit que le gène transfecté ne le soit que de manière transitoire. A cet effet, lorsque le matériel génétique introduit n'est pas intégré dans le génome cellulaire, il est normalement perdu au cours des divisions cellulaires successives à l'introduction du plasmide. Lorsque l'on souhaite que ce gène demeure dans le génome des cellules-mères transfectées ainsi que dans le génome des cellules-filles, il faut réaliser une transfection stable. Pour ce faire, il est essentiel que le vecteur d'expression comprenne un marqueur de sélection, ce gène marqueur étant co-tranfecté avec le gène codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain selon l'invention. Ce gène de résistance confère à la cellule un avantage sélectif, comme la résistance à un composé normalement toxique pour les cellules d'origine. Bien que le rendement soit très faible, certaines cellules incorporent le matériel génétique exogène et l'intègrent à leur génome; lorsque l'on ajoute le composé normalement toxique au milieu de culture cellulaire, seules les cellules transfectées sont capables de proliférer, tandis que les autres meurent. Après application de cette pression de sélection pendant quelques passages en culture, seules les cellules transfectées de façon stable résistent et peuvent continuer à être cultivées. Ainsi, selon un premier mode de réalisation du procédé selon l'invention, lorsque des cellules épithéliales humaines normales, préférentiellement des kératinocytes humain normaux issus des zones interfolliculaires de l'épiderme, sont utilisées, elles sont préférentiellement transfectées de façon transitoire avec un plasmide comprenant un gène qui code pour la kératine spécifique du follicule pileux humain choisie parmi K34 ou K71, positionné sous la dépendance d'un promoteur, car leur capacité de multiplication est limitée à 4 ou 5 passages en culture et il n'est donc pas possible de sélectionner des transfectants stables par clonage. Alternativement, selon un second mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, les cellules de lignée de mammifère établie selon l'invention sont transfectées -6- de façon stable avec un vecteur d'expression comprenant un gène qui code pour une kératine spécifique du follicule pileux humain choisie parmi K34 ou K71, positionné sous la dépendance d'un promoteur et comprenant en outre un gène codant pour la sélection des cellules hôtes transfectées, par exemple un gène de résistance à la néomycine ou l'hygromycine. Elles sont ensuite sélectionnées par culture en condition clonale de façon à isoler des clones cellulaires exprimant la kératine spécifique de façon homogène. Un agent habituellement utilisé pour réaliser une transfection stable est le G418 (généticine), un composé toxique pouvant être neutralisé par le produit du gène de résistance à la néomycine. Avantageusement, ce second mode de réalisation par transfection stable permet d'obtenir une expression reproductible de la kératine spécifique sur une longue période. Ainsi, préférentiellement, à titre d'exemple tel qu'illustré ci-dessous, les cellules HEK293 transfectées, sont cultivées en condition clonale et les clones sont testés pour leur capacité à exprimer la kératine K34 ou K71 par immunofluorescence. Exemple : Sélection de clones de cellules HEK293 transfectées, par immunomarquage des kératines K34 et K71 Afin de disposer de lignées cellulaires établies selon l'invention exprimant la K34 ou la K71 de manière stable et homogène, il est nécessaire de pratiquer une sélection clonale des cellules après l'étape de transfection. Le but de cette étude est également de démontrer que les cellules transfectées expriment les K34 ou K71 de façon intense, en comparant avec les cellules non transfectées (contrôle). Protocole : Les cellules HEK 293 sont cultivées dans le milieu DMEM 4,5 g/1 de glucose contenant 10% de sérum de veau foetal et de la Primocine (Invivogen, ref: ant-pm-2) à 100 mg/mL) Pour la sélection clonale, on rajoute de la généticine (G418) sulfate (Santa Cruz, ref : sc-29065A) à une concentration de 800 iig/mL. Les cellules HEK293 transfectées et cultivées sur des lames multipuits LabteKTM sont lavées 3 fois avec du PBS, fixées à l'aide de 3,7% paraformaldéhyde pendant 10 minutes, et de nouveau lavées 3 fois avec du PBS. Les sites non spécifiques sont ensuite saturés par une solution de BSA à 5% pendant 20 min. Les cellules sont incubées en présence de l'anticorps primaire (anti-keratine 34 Progen, réf. GP-hHa4, dilué au 1/200 ; ou antikeratine 71 Progen, réf. GP-K6irs 1, dilué au 1/200), pendant 2h, à température ambiante et -7- sous agitation,. Après 3 rinçages à l'aide de PBS, les cellules sont incubées en présence d'un anticorps secondaire couplé à un marqueur fluorescent (Goat anti-guinea pig - Alexa 488, Molecular Probes réf. A11073, dilué au 1/1000), pendant 1h à température ambiante et sous agitation. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS et incubées 5 minutes avec 0,3 1.1,M du DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole, une molécule fluorescente capable de se lier fortement à l'ADN) puis lavées 3 fois avec du PBS. Les lames sont ensuite montées avec du FluoromountTM. Les cellules sont alors examinées à l'aide d'un microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope). Résultats : Après la transfection par le vecteur d'expression de la kératine K34, plus de 30 clones ont pu être isolés et l'immunomarquage pour la kératine K34 a permis de sélectionner 2 clones montrant un immunomarquage spécifique de la K34, alors que les cellules contrôles non transfectées ne présentent pas de marquage. Après la transfection par le vecteur d'expression de la kératine K71, 64 clônes ont pu être isolés et l'immunomarquage pour la kératine K71 a permis de sélectionner 10 clônes montrant un immunomarquage spécifique de la K71, alors que les cellules contrôles non transfectées ne présentent pas de marquage. La présente invention a ainsi pour deuxième objet une lignée cellulaire établie de cellules de mammifère, transfectées par un vecteur d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain choisie parmi la kératine K34 ou la kératine K71, préférentiellement la lignée des cellules HEK293 ou des cellules COS7, encore plus préférentiellement la lignée des cellules HEK293. La lignée cellulaire selon l'invention est transfectée de façon stable avec un vecteur d'expression codant pour la kératine K34 ou la kératine K71 et expriment une de ces kératines sur une longue période et de façon reproductible. La caractérisation des lignées de cellules transfectées selon l'invention a ensuite été réalisée en s'appuyant sur le fait que le follicule pileux humain et les cellules exprimant une des kératines spécifiques du follicule pileux humain devraient être plus résistantes aux stress affectant l'intégrité structurale des cellules. Les stress de référence pratiqués sont le stress osmotique et le stress par détergent SDS SDS (M. Garmyn et al, Human -8- keratinocytes respond to osmotic stress by p38 Map kinase regulated induction of HSP70 and HSP27, J Invest Dermatol, 117: 1290-1295, 2001 ; N. M. Chung et al, Sodium Dodecyl Sulfate Induces Plasminogen Activator Inhibitor Type 2 Expression in Epidermal Keratinocytes In Vivo and In Vitro, J Invest Dermatol, 117: 647-653, 2001). Le stress osmotique a été créé par la mise en présence des cellules avec une solution de Sorbitol à 250 mM pendant 2 à 6 heures, puis rinçage des cellules et enfin immunomarquage de la kératine K71 et des protéines de stress HSP70. Les cellules transfectées répondent au stress osmotique en exprimant HSP70, à un niveau comparable à celui des cellules non transfectées. Alternativement, le stress par détergeant SDS a été réalisé par incubation des cellules avec une solution de SDS à 0,01%, 0,05% ou 0,1% pendant lh ou 24h. D'autre part, compte tenu de la proximité physique et de la co-dépendance entre les filaments intermédiaires de kératines et les autres composants du cytosquelette, un comarquage a été réalisé pour la vimentine et la F-actine (à l'aide de la phalloïdine). Ces résultats nous ont permis d'observer une co-localisation de la K71 avec la vimentine, mais pas avec l'actine. Les résultats montrent que, dans des conditions de stress osmotique, la K71 et le réseau de vimentine forment des agrégats dans la lignée de cellules transfectées selon l'invention, tandis que l'intensité de la coloration de la F-actine a été augmentée. Les réseaux de vimentine et d'actine semblent donc interagir de manière différente avec la K71 en présence du stress. Ainsi, les lignées cellulaires objets de l'invention représentent un modèle cellulaire des cellules du follicule pileux humain en ce sens qu'elles reproduisent les caractéristiques des cellules de l'IRS et de la tige pilaire, en exprimant respectivement les kératines K34 et K71. Les cellules provenant des clones étudiés constituent un modèle de cellules qui se rapprochent des cellules de l'IRS et de la tige pilaire. L'invention a enfin pour troisième objet une méthode in vitro pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un composé sur la modulation de l'activité du follicule pileux humain en utilisant des cellules de la lignée cellulaire selon l'invention qui reproduisent les caractéristiques des cellules de l'IRS et de la tige pilaire. La mise en oeuvre de la méthode in vitro selon l'invention a pour objectif d'identifier ou de sélectionner de nouveaux agents actifs, de sorte à améliorer les traitements cosmétiques et/ou médicamenteux existants. -9- De tels agents modulateurs peuvent avoir un intérêt pour prévenir ou lutter contre la perte des cheveux, favoriser la pousse du cheveu, améliorer la solidité, la taille ou la résistance de la tige pilaire, ou assurer une meilleure résistance au cheveu ou au follicule pileux dans des conditions de stress.5 REVENDICATIONS1. Procédé d'obtention d'un modèle cellulaire de type eucaryote, comprenant les étapes de culture d'une cellule hôte de mammifère et de transfection de ladite cellule hôte avec un 5 vecteur d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule hôte est un kératinocyte humain normal issu des zones interfolliculaires de l'épiderme. 10 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule hôte est une lignée cellulaire établie. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la lignée établie de mammifère est choisie parmi les cellules HEK293 et les cellules COS7. 15 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le vecteur d'expression est transfecté de façon transitoire. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le vecteur 20 d'expression est transfecté de façon stable. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur d'expression code pour une kératine spécifique du follicule pileux humain choisie parmi la kératine K34 ou la kératine K71. 25 8. Lignée cellulaire établie de cellules de mammifère, transfectées par un vecteur d'expression codant pour une kératine spécifique du follicule pileux humain choisie parmi la kératine K34 ou la kératine K71. 30 9. Lignée cellulaire selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit de la lignée des cellules HEK293 ou des cellules COS7. 10. Méthode in vitro pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un composé sur la modulation de l'activité du follicule pileux humain en utilisant des cellules de la lignée cellulaire selon 35 l'une des revendications 8 ou 9.