Brevet FR2990106A1 — publié le 20131108

La présente invention a pour objet un procédé in vitro ou ex vivo pour la conservation et/ou la maintenance en survie de biopsies de peau de mammifère, de préférence humaine, permettant son transport et, le cas échéant sa culture. La présente invention comprend également une biopsie de peau ainsi conservée par un tel procédé et son utilisation comme modèle notamment dans un kit pour le criblage ou la sélection de composés cosmétiques ou thérapeutiques. La peau est constituée par la superposition de l'épiderme et du derme. L'épiderme est un épithélium pavimenteux pluristratifié et squameux. Il forme une barrière qui résiste aux ravages de la dessiccation, ainsi qu'aux agressions mécaniques, chimiques et microbiennes. Le type cellulaire principal constituant l'épiderme est le kératinocyte. Ce tissu comprend également d'autres populations cellulaires telles que les mélanocytes, les cellules de Langerhans, et les cellules de Merkel (voir annexe). L'épiderme est conventionnellement sous divisé en quatre strates distinctes comprenant des couches internes vers les couches les plus superficielles : la couche basale (une couche), la couche épineuse (4-15 couches), la couche granuleuse (1-3 couches) et la couche cornée (5-10 couches). L'épiderme repose sur le derme grâce une membrane basale constituée entre autres de molécules de collagène. Le derme contient des réseaux vasculaires et nerveux très denses ainsi que les annexes épidermiques, structures kératinisées prologeant l'épiderme et incluant les follicules pileux, les glandes sébacées, et les glandes sudoripares. La peau repose sur un tissus sous-cutanée, appelé hypoderme, principale constitué de cellules graisseuses et particpant, entre autres, à l'élasticité de la peau et à la thermorégulation de l'organisme. Les systèmes de culture in vitro ou ex vivo de peau sont depuis longtemps développés pour la recherche académique ou appliquée (Lebonvallet et al. The evolution and use of skin explants: potential and limitations for dermatological research. Eur J Dermatol 2010; 20 (6): 671-84). Désormais, le banissement de l'utilisation des animaux pour le développement des produits cosmétiques en Europe (Pauwel M and Rogiers V. Human health safety evaluation of cosmetics in the EU: a legally imposed challenge to science. Toxicol Appl Pharmacol. 2010 Mar 1;243(2):260-74), ainsi que l'importance prise par la règle des 3Rs (Réduire, Remplacer, Diminuer) concernant l'expérimentation animale lors du développement pharmaceutique (Wells DJ. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann N Y Acad Sci. 2011 Dec;1245:14-6), confèrent aux systèmes in vitro ou ex vivo de culture de peau, en particulier ceux permettant la culture de peau humaine, une importance stratégique pour les industries cosmétiques, chimiques et pharmaceutiques. Les systèmes de culture in vitro ou ex vivo de peau sont des modèles de choix pour l'étude de la biologie cutanée. Ils possèdent en effet tous les types cellulaires de la peau, organisés dans une structure en trois dimensions (3D). Ils reflètent directement les paramètres d'individus, comme l'âge, le sexe, l'état pathologique de la peau, ou l'exposition au soleil (Lebonvallet et al. ; 2010). Si les systèmes ou dispositifs de culture in vitro ou ex vivo de peau sont des modèles de choix pour la recherche, les systèmes ou dispositifs existants sont mal adaptés à leur transport et maintenance en survie. Plusieurs systèmes ou dispositifs de culture, plus ou moins perfectionnés existent (Lebonvallet et al. ;2010), cependant ces systèmes ou dispositifs, sont en général fragiles et ne permettent pas leur expédition par route ou par les airs, sans que cela puisse affecter leur intégrité. En effet, dans ces systèmes ou dispositifs, la biopsie de peau n'est pas fermement maintenue par un support physique. Elle peut être laissée flottante dans une solution de milieu de culture ou déposé sur un insert à membrane poreuse ou sur une grille en acier inoxydable. L'avantage des deux derniers procédés est de permettre de maintenir la partie superficielle de l'épiderme, la couche cornée, directement en contact avec l'air atmosphérique. Ceci permet l'étude de l'application topique de substances à la surface de la peau. On peut également citer ici les documents brevets publiés sous les numéros EP 2 019 316, US2011/045477, ou W02004/092354 qui décrivent des systèmes de culture in vitro ou ex vivo de peau, mais qui ne mentionnent aucun support ou dispositif pour le maintien et le transport des biopsies de peau. Plus récemment, un système de chambre en acier inoxydable a été développé pour maintenir fermement de larges biopsies de peau et permettre leur culture in vitro ou ex vivo jusqu'à 4 semaines (Lars Steinstraesser et al. A Human Full-Skin Culture System for Interventional Studies. Eplasty. 2009;9:e5.). Bien qu'intéressant, ce système est peu adapté à la culture cellulaire du fait même de ses dimensions et sa composition (acier inoxydable). De plus, ce système est basé sur une mise en tension importante de la peau, qui ne reflète pas les conditions physiologiques rencontrées pour cet organe in vivo. En ce qui concerne les biopsies de peau, l'etude de certains milieux de culture utilisés pour maintenir in vitro ou ex vivo ces biopsies de peau ont mis en évidence l'effet délétaire de la présence de sérum sur la structure de la peau, alors que la présence d'ions calcium à une concentration de 1,4 mM est importante pour la cohésion du tissue, via la stimulation de la production de matrice extracellulaire et de la différenciation épidermique (Lebonvallet et al.;2010). Depuis de nombreuses années, on recherche à mettre au point de nouveaux procédés visant à pouvoir conserver et/ou maintenir en survie des biopsies de peau de mammifère, de préférence humaine ou de porc. Ceci d'autant plus si ces procédés permettent le transport et la culture de ces biopsies. Le développement de tels modèles est en effet très important en particulier pour la recherche dermatologique et pour les études nécessaires à l'élaboration de produits pharmaceutiques et/ou cosmétiques. Ainsi, il serait souhaitable de pouvoir disposer d'un système, dispositif et/ou procédé permettant d'obtenir de telles biopsies de peau et suffisamment robustes 30 pour permettre leur transport (que ce soit par voie aérienne et/ou terrestre). L'obtention d'un tel modèle permettrait de préserver l'organisation 3D et les fonctions de la peau à partir d'une biopsie, et ceci avantageusement par rapport aux cultures de peau reconstruite habituellement longues à développer et nécessitant des techniques complexes (les biopsies étant plus faciles à obtenir et ayant un plus grand potentiel à l'égard de la recherche dermatologique, en particulier pour les études portant sur la matrice extracellulaire, structure 3D ou les interactions entre les différents types de cellules cutanées). De tels modèles auraient comme avantages de pouvoir permettre la réalisation d'études nécessaires à une meilleure compréhension du rôle de la peau, notamment de son épiderme et du derme, tant dans le domaine mécanique que dans le domaine physiologique. De telles biopsies solidement maintenues grâce à un tel système, dispositif et/ou procédé robuste, permettraient également le prélèvement de couches cellulaires de la couche cornée de l'épiderme par des détachements superficiels successifs réalisés à l'aide d'un ruban autocollant (tape stripping). De telles biopsies ainsi préservées et transportables peuvent également être utilisés comme modèles de choix, comparés aux modèles de peau reconstruite et leurs inconvénients (voir Lebonvallet et al., 2010) pour la prédiction par des tests in vitro ou ex vivo, de l'activité de principe actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques ou encore des effets secondaires de composé topiques. Ceci est justement l'objet de la présente invention. De façon surprenante, la demanderesse a mis en évidence que la mise en oeuvre du procédé de l'invention et du dispositif qui en découle tel que décrit ci-après permettent d'obtenir des biopsies de peau aptes à être conservées et/ou 25 transportées, et pouvant servir, le cas échéant, de modèle d'expérimentation. L'invention a donc pour objet en un procédé pour la maintenance en survie in vitro ou ex vivo et le transport d'un fragment ou biopsie de peau, ledit fragment de peau ou biopsie ayant été préalablement prélevé chez un mammifère, ladite méthode 30 comprenant les étapes suivantes : a) Le dépôt dudit fragment ou biopsie de peau sur une matrice liquide de manière à ce que la partie superficielle dudit fragment ou biopsie correspondant au moins à 90 % , de préférence 95 % ou la totalité de l'épiderme reste émergée alors que le derme sous-jacent à cet épiderme est immergé à au moins 90 %, de préfrence 95 % ou totalement, ladite matrice liquide étant elle-même contenue dans un insert dont le fond est 5 constitué d'une membrane poreuse, et ledit insert étant disposé dans un container ou puits; et b) La solidification de ladite matrice, cette solidification ayant pour effet d'emprisonner la partie immergée dudit fragment ou biopsie de peau dans ladite matrice ainsi solidifiée, et de faire adhérer ladite matrice solidifiée aux parois 10 latérales et à ladite membrane poreuse de l'insert, et ladite partie superficielle épidermique de la biopsie, restant émergée, étant en contact avec l'air atmosphérique ou sous une atmosphère controlée comprenant en partie de l'air. De préférence, ledit insert est disposé dans un container ou un puits vide (type 15 cupule de microplaque ou plaque pouvant servir à la culture cellulaire, de préférence à fond plat). De préférence, àprès l'étape b), ledit container ou puits, est recouvert par un couvercle et, le cas échéant rendu étanche, et, le cas échéant, enveloppé dans une 20 enveloppe protectrice apte au transport. Selon un mode de réalisation du procédé selon l'invention, à l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est choisie parmi toute solution liquide, de préférence nutritive, capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions 25 particulières compatibles avec la survie et la culture de cellules de peau qui composent ledit fragment ou biopsie, de préférence choisie parmi le plasma sanguin ou une solution dérivée de plasma sanguin, notamment dilué en tampon physiologique à au maximum 10 %, de préférence à au moins 20 %, au moins 30 % et 40 %, une solution de fibrinogène, une solution de collagène, de la gélatine, les 30 gels polymériques synthétiques, naturels tels que les gels d'agarose, en particulier les gels d' agarose ou d'agar-agar à faible/bas points de fusion, les gels d'amidon ou de polysaccharides, ou un de leurs mélanges. Sous un aspect particulièrement préféré, la présente invention a pour objet un procédé ex vivo ou in vitro de conservation ou de maintenance en survie d'un fragment ou biopsie de peau, ledit fragment ou biopsie étant apte à être transporté, cedit fragment ou biopsie ayant été préalablement prélevé chez un mammifère, ou obtenu à partir d'une collection ou banque d'échantillon de peau, ou encore issu d'une peau en culture, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : i) la flottaison d'une biopsie de peau cylindrique dans une matrice liquide choisie parmi une solution dérivée de plasma sanguin, solution de fibrinogène ou de collagène, ou d'une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, ou un mélange de ces solutions, cette matrice liquide étént contenue dans ledit insert, cette flottaison laissant la surface épidermique de la biopsie émergée, tandis que le derme est immergé ; ii) l'induction rapide de la solidification de ladite entourant la biopsie de peau ; et, iii) La culture in vitro ou ex vivo, ou la maintenance en survie du fragment ou biopsie de peau dans ladite matrice ainsi solidifiée. De préférence, ladite matrice liquide ou solidifiée ne contient aucun facteur de 20 croissance, ni sérum. De préférence, à l'étape i) la flottaison d'une biopsie de peau cylindrique est effectuée dans une matrice liquide comprenant une première solution choisie parmi une solution dérivée de plasma sanguin, une solution de fibrinogène ou une solution de collagène, et une deuxième solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de 25 fusion. Lorsque la matrice liquide contient une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, cette deuxième solution est préalablement chauffée pendant une durée et à une température suffisante pour être liquide et pour rester liquide à environ 37°C pendant le temps suffisant pour être mélangée à la première solution 30 dans ledit insert et jusqu'au dépôt dudit fragment ou biopsie de peau. De préférence, ladite deuxième solution est préalablement chauffée à sa température de fusion, ou légèrement supérieure, de préférence entre 65°C et 70 °C. De préférence de l'agar-agar ou agarose à bas point de fusion est un agar-agar ou 5 agarose dont la température maximale de gélification est comprise entre 24°C et 28°C, et la température de fusion est supérieure à 65,5°C en solution à 1,5 %. De préférence et comme exemple, mais sans limitation, cet agarose est l'agarose nommé LMP Agarose Low melting point (GIBCOBRL, Life Technologies) 10 De préférence, ladite deuxième solution est une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, dont la concentration en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion est comprise entre 1% et 5% (de préférence dans une solution physiologique), de manière plus préférée comprise entre 2% et 5% , entre 3% et 15 4,5%, entre 3,5% et 4, 5% ou encore entre 3,8% et 4,2% ou entre 3,9% et 4,1%, 4% étant la concentration la plus préférée. Cette deuxième solution en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion à ladite concentration et une fois chauffée à sa température de fusion, ou légèrement supérieure, permet d'être conservée sous forme liquide pendant au moins 1 heure 20 et, de préférence pendant au moins 4heures, 10 heures ou 16 heures à 37 °C. De préférence, dans ladite matrice liquide comprenant ladite première et ladite deuxième solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, la concentration finale en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion est comprise entre 1% et 2%, 25 de préfrence entre 1, 25% et 1, 75%, de préférence entre 1, 4% et 1, 6%, 1,5% étant la concentration la plus préférée. Une telle concentration permettant d'obtenir non seulement une matrice qui une fois solidifiée permet de conserver la structure 3D et de maintenir en survie ledit fragment ou biopsie de peau, mais également d'obtenir une matrice solide mais suffisamment souple pour être non cassante et résistante à 30 des chocs ponctuels. La solidification de cette matrice liquide se faisant après dépôt du fragment ou biopsie de peau en laissant le dispositif ainsi obtenu à température comprises entre 37 ° C et la température ambiante (de préférence à 20 °C). De préférence, le volume de ladite matrice liquide est de 1/3 à 2/3 du volume total de l'insert, de préférence de 2/5 à 3/5 du volume total, La moitié du volume total de l'insert étant le volume préféré. De préférence, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient en outre des cellules autres que les cellules qui composent ledit fragment ou biopsie de peau, de préférence choisies dans le groupe de cellules constitué par les fibroblastes, des cellules endothéliales ou des cellules nerveuses. Dans un mode de réalisation encore plus préfére, lesdites cellules sont des fibroblastes, de préférence des fibroblastes primaires (par opposition à des lignéees de fibroblastes) de préférence encore des fibroblastes dermiqueset/ou obtenus à partir de prépuce humain. Ces fibroblastes primaires, notamment dermiques, peuvent être préparés et obtenus à partir de méthodes standards bien connues de l'homme de l'art (voir par exemple le document Howard BV et al., A new method for the establishment of diploid fibroblast cell cultures from human foreskins. Proc Soc Exp Biol Med. 1976 Nov;153(2):280-3). De préférence, lesdites cellules, notamment les fibroblastes sont contenues dans la matrice à une concentration entre 5.10 3 et 5.10 5 par ml, de préférence encore entre 10 4 et 10 5 par ml, entre 3.10 4 et 5.10 4 par ml étant la concentration la plus préférée. Le procédé selon l'invention tel qu'il est décrit permet à la fois la culture et un transport sécurisé des biopsies de peau (par voie terrestre, maritime ou par les airs). En effet, le fragment ou la biopsie de peau est non seulement emprisonné et donc maintenu fermement par la matrice solide dans l'insert à membrane poreuse, mais également nourri, pouvant ainsi voyager sans milieu de culture lors de son transport tout en étant maintenu en survie. Par culture, on entend désigner ici en particulier la maintenance de l'état physiologique et, le cas échéant, morphologique de l'explant de peau, et donc desdites cellules qui le compose. Ce procédé a pour avantage de pouvoir effectuer le dépôt du fragment ou de la biopsie de peau dans une première étape sur une phase liquide (au moyen notamment d'un insert contenant ladite matrice sous forme liquide, matrice liquide dont on peut induire la solidification), et, dans une seconde étape, provoquer la solidification de cette matrice liquide, cette solidification permettant de fixer ou figer la structure 3D dudit fragment ou biopsie, ceci permettant d'obtenir la conservation ou la maintenance en survie d'un tel explant et son transport possible tout en maintenant également sa structure 3D. Ce procédé se révèle avantageux par le fait qu'il permet d'obtenir un fragment ou 15 biopsie de peau qui peut être conservé ou maintenu en survie de manière prolongée sans dégradation notable, en outre apte à être transporté, que ce soit par voie terrestre, maritime ou aérienne. Ledit fragment ou biopsie de peau comprendra de préférence au moins l'épiderme, 20 le derme et les annexes épidermiques. De préférence, ledit épiderme comprend l'ensemble de ses couches cellulaires ainsi que les annexes épidermiques dans leur totalité. Par « ensemble de ses couches cellulaires » pour un épiderme, on entend désigner ici la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse et la couche cornée. 25 Par « annexes épidermiques dans leur totalité», on entend désigner ici les follicules pileux, les glandes sébacées et les glandes sudoripares. Ce fragment ou biopsie de peau pourra comprendre également une partie du tissu sous-cutané appelé encore hypoderme.. 30 De préférence aussi, ledit fragment ou biopsie de peau est un fragment ou biopsie de mammifère choisi parmi l'homme ou le porc. De préférence aussi, ledit fragment ou biopsie de peau est fraîchement prélevé pour permettre sa survie in vitro ou ex vivo. Par fraichement prélevé, on entend ici désigné un prélèvement effectué depuis moins de 1 heure, de préférence moins de 24 heures Les fragments ou biopsies de peau sont préparés de préférence à partir de peau saine, provenant de n'importe quelle localisation du corps du mammifère comme par exemple mais sans s'y limiter de l'abdomen, poitrine, sein (ou mamelles), cuir chevelu, postérieur etc...). Les fragments ou biopsies de peau sont préparés de préférence également à partir de peau de mammifère présentant une pathologie, comme par exemple mais sans s'y limiter à partir de tissus pathologiques issus d'exérèse, et provenant par exemple de patient ou animal présentant un cancer cutané (mélanome, cancers baso- ou spinocellulaires, autre type de cancer cutané), une plaque de psoriasis, lésion d'eczéma ou une dermatite atopique ou tout autre type de pathologie cutanée. Sous un aspect particulier, ledit fragment ou biopsie de peau utilisé dans ce procédé est un fragment ou biopsie de peau issu d'une collection ou obtenu après une culture de peau. De préférence, les fragments ou biopsies de peau sont de forme cylindrique. De préférence, les fragments ou biopsies de peau sont de forme cylindrique dont le diamètre peut varier entre 1 mm et 50 mm, de manière plus préférée entre 1 et 20 mm de diamètre, de préférence encore entre let 10 mm. Selon un mode de réalisation également préféré, ledit fragment préalablement prélevé est un fragment de forme cylindrique dont l'épaisseur est comprise entre 1 et 20 mm, de préférence entre 2 et 15 mm d'épaisseur, de préférence encore entre 2 et 10 mm. Dans un mode de réalisation préféré, ledit insert dont le fond est constitué d'une membrane poreuse est un insert en forme de nacelle, de préférence dont le diamètre est compris entre 5 et 40 mm, de manière plus préférée entre 9,5 et 30 mm. De préférence encore, ledit insert et un insert suspendu ou sur pilotis, de préférence suspendu. De préférence encore, ladite membrane poreuse est une membrane d'une porosité 5 permettant d'éviter à la matrice liquide de couler au travers de la membrane avant sa solidification, de préférence encore choisie entre 0,4 à 8 pm, de manière préférée encore entre 0,4 et 1, 5 pm, entre 0,8 iam et 1,2 iam étant la porosité préférée. De préférence encore, ladite membrane poreuse est une membrane choisie en polyéthylène téréphtalate (PET), nitrocellulose ou polycarbonate. 10 Parmi ces inserts, on peut citer ceux fournis en particulier par la société Nunc (Roskilde, Danemark), BD Falcon (Becton Dickinson France SAS, 38801 Le PontDe-Claix, France, Millicelle (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) ou Costare (Grosseron SAS, 44819 Saint-Herblain France), par exemple les inserts avec membrane en polycarbonate, en PET ou nitrocellulose pré-emballés dans des 15 plaques multi-puits pour boîtes de Pétri 6, 8,12 et 24 puits et dont la porosité de la membrane peut varier entre 0,4 et 8p.m, les boites de 8 puits et/ou avec une porosité de membrane de 0,8 iam à 1 iam et/ou en PET tétant les plus préférées. Dans un mode de réalisation préféré, ledit container dans lequel est déposé ledit 20 insert est un puits d'une plaque de culture cellulaire de 6, 8, 12, 24, ou 48 puits. Parmi ces plaques de cultures on peut citer celles fournies en particulier par la société Nunc, BD Falcon, ou sous les références Millicelle ou Costare. De préférence, le fond de l'insert est situé à une distance comprise entrelmm et 2,5 25 mm du fond du container contenant ledit insert, notamment du fond du puits de la plaque de culture (ou du fond de la boite de Pétri selon l'appellation) Dans un autre mode de réalisation préféré, à l'étape a), ladite matrice liquide contient entre 1 mM et 2 mM de Ca2+ , de préférence entre 1,2 mM et 1,4 mM de 30 Ca2+. De préférence également, ladite matrice liquide contient entre 5 et 500 mg/mL d'acide ascorbique, de préférence entre 25 et 75 mg/mL, 50 mg/mL d'acide ascorbique étant la concentration la plus préférée. Dans un mode de réalisation préféré, ladite matrice liquide contenue dans l'insert à l'étape a), est une matrice liquide, dont la première solution du mélange (la deuxième solution étant la solution d'agar-agar ou d'agarose) est de préférence nutritive, et également apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation ou d'une diminution de la température et/ou par l'addition d'un composé ou d'une composition spécifique. De préférence ladite matrice liquide ne contient aucun facteur de croissance ni sérum animal ou humain. De préférence, à l'étape a), ladite matrice liquide ne recouvre pas la face supérieure de l'épiderme avant que cette matrice ne soit solidifiée à l'étape b). Selon un autre mode de réalisation également préféré, à l'étape a) dudit procédé, le fragment ou biopsie de peau est ensuite placé sur une matrice liquide apte à pouvoir se solidifier, notamment comme ci-dessus indiqué, et laquelle matrice liquide est choisie parmi toute solution liquide apportant tous les ingrédients nutritifs et/ou nécessaires à sa culture, en particulier à la maintenance de l'état de physiologie initiale des cellules qui le constituent. Cette solution est capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture de fragment ou de la biopsie de la peau. De préférence, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles mélangées à une solution d'agar-agar ou d'agarose.30 De préférence, ladite matrice liquide contient un plasma sanguin, du fibrinogène, ou du collagène, mélangé à une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, a l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution dérivée de plasma sanguin contenant de 25 % à 60 %, de préférence entre 35 % et 45 % (v/v) de plasma sanguin, de 70 % à 35 % d'une solution physiologique, telle qu'une solution de NaC1 à 0,9 %, de 5 % à 12 %, de préférence 8 %, d'une solution saline de CaC12 à 1 %, d'un agent anti-fibrinolytique en concentration suffisante pour obtenir l'activité anti-fribrinolytique recherchée, de préférence entre 5 % et 2 %, de préférence l'agent anti-fibrinolytique étant choisi parmi l'acide tranaxémique ou de l'aprotinine, et d'une solution d'agarose à bas point de fusion entre 0,5% et 4%, de préférence entre 1 % et 2 %. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, a l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide de fibrinogène et de thrombine, ou de collagène ou de plasma sanguin, mélangée à une solution de gélatine, comprenant des gels polymériques synthétiques, naturels tels que les gels d'agarose, en particulier les gels d'agarose ou d'agar-agar à faible/bas points de fusion, les gels d'amidon ou de polysaccharides et pour laquelle l'incubation à 37°C permet sa solidification. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, a l'étape a) : - ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles, de préférence par du citrate de sodium ; et - la solidification de ladite matrice à l'étape b) pour cette solution pouvant être obtenue en présence d'ions calcium, de préférence également en présence de 30 thrombine. Lorsque la matrice liquide est une matrice liquide contenant une solution de plasma sanguin, une solution de fibrinogène ou de collagène, la solidification de ladite matrice à l'étape b) peut être réalisée pour cette solution par ajout de thrombine ou par augmentation de la température, ou encore à l'aide des facteurs secrétés par des cellules apportées à la matrice, telles que les fibroblastes primaires. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, l'étape b), ladite matrice liquide est solidifiée après au maximum de 8 heures, de préférence moins de 2 heures ou moins d'une heure, une durée de moins de 30 min, de préférence de moins de 10 min étant la durée la plus préférée pour engager la phase de solidification de la matrice liquide après dépôt du fragment ou biopsie de peau sur cette matrice liquide à l'étape a). Sous un autre aspect, l'invention porte sur l'utilisation d'un tel fragment ou biopsie de peau obtenu par un tel procédé selon la présente invention à des fins de modèle ex vivo ou in vivo, en particulier pour des analyses toxicologiques, en particulier des analyses d'absorption percutanée, de métabolisme, de sensibilisation, corrosion ou d'irritation, ou à des fins de recherche, en particulier certains paramètres exogènes comme les UV, le stress, les médicaments ou principe actifs à effet cosmétique, ou encore certaines protéines de signalisation comme les cytokines pourraient être appliquées sur de tels modèles pour étudier les réponses des cellules et des tissus qui composent la peau ou qui y sont associés. De préférence, lesdites analyses toxicologiques sont choisies parmi les tests de sensibilisation, d'absorption, de métabolisme, de corrosion, ou d'irritation se la 25 peau. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé ex vivo ou in vitro de conservation ou de maintenance en survie d'un fragment ou biopsie de peau apte à être transporté, ledit procédé comprend les étapes suivantes : 30 A) la conservation ou maintenance en survie d'un fragment ou biopsie de peau préalablement prélevé et apte à être transporté, par un procédé selon la présente invention; B) le transport dudit fragment ou biopsie de peau ainsi obtenue à l'étape A) ; et C) la culture dudit fragment ou biopsie de peau ainsi obtenue après transport l'étape B) dans des conditions de cultures adéquates et/ou présence du ou des composés que l'on souhaite tester, l'épiderme dudit fragment ou biopsie de peau 5 étant au contact de l'air. De préférence, à l'étape C), la culture dudit fragment ou biopsie de peau ainsi obtenue après transport à l'étape B) dans des conditions de cultures adéquates et/ou présence du ou des composés que l'on souhaite tester, peut être réalisée au moyen de milieu de culture additionnel, pouvant contenir lesdits composés, et ajouté dans 10 le container ou puits, ce milieu additionnel pouvant diffusé au travers de la membrane poreuse de l'insert. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, a 15 l'étape C), ledit fragment ou biopsie de peau ainsi disposé est cultivé pendant une période entre 1 et 15 jours et de manière préférentielle entre 1 et 7 jours, et à une température comprise entre 4°C et 37°C. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un fragment ou biopsie de 20 peau susceptible d'être obtenu ou directement obtenu par le procédé selon la présente invention, comme modèle. Selon cet aspect de l'invention, a également pour objet un kit comprenant un tel fragment ou biopsie de peau comme modèle, ce kit notamment reposant sur la présence d'une matrice solide, cette matrice solide étant adaptée par sa composition 25 à la conservation et/ou la maintenance en survie et de la structure, en particulier 3D, dudit fragment ou biopsie de peau et à son transport. Ainsi, selon cet aspect, l'invention a pour objet également un kit, en particulier pour l'évaluation ou pour la sélection de composé cosmétique, dermatologique ou thérapeutique pour la peau comprenant un tel fragment ou biopsie de peau comme 30 modèle de peau et obtenu selon le procédé de l'invention. Un autre objet de la présente invention se rapporte à une méthode de screening in vitro de composés candidats pour le traitement cosmétique ou thérapeutique de la peau, cette méthode comprenant les étapes suivantes: a) l'obtention d'un fragment ou biopsie de peau comme modèle selon la présente 5 invention; b) la mise en contact dudit modèle avec le composé candidat ; et c) la mise en évidence d'une modification physiologique; et d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. 10 Un autre objet de la présente invention se rapporte à une méthode permettant de réaliser des prélèvements successifs de couches cellulaires superficielles à l'aide d'adhésifs (méthode de « tape-stripping), caractérisée en ce que ces prélèvements sont réalisés sur un modèle de biopsie ou fragment de peau obtenu par le procédé de 15 l'invention. Ces couches cellulaires ainsi obtenues pouvant être analysées de façon indépendante de la biopsie entière. Ainsi le fragment ou biopsie de peau comme modèle selon l'invention peut aussi être utilisé dans tout procédé, notamment automatisé, pour le criblage ou 20 l'identification de nouveaux composés cosmétiques, dermatologiques ou pharmaceutiques destinés en particulier à être appliqués sur la peau. Les procédés de criblage en vue d'identifier de nouveaux composés efficace comprennent en général une de mise en contact dudit composé à tester avec un 25 modèle de peau obtenu selon l'invention puis une étape de lecture de l'effet du composé sur ledit modèle, notamment en comparant cet effet avec un modèle contrôle ou témoin selon l'invention n'ayant pas été mis en contact avec le composé à tester. Cette dernière étape de lecture pourra également être réalisée par la détermination ou l'analyse de marqueurs épidermiques et/ou de cellules associées et 30 incluses dans la matrice solidifiée, tels que des protéines associées à ces structures. Par exemple si ces cellules associées sont des cellules du système immunitaire, ledit procédé de criblage sera par exemple destiné à identifier ou sélectionner des composés tests susceptibles d'induire des effets secondaires non recherchés tels que des réactions allergiques ou de sensibilisation. Les produits testés pourront également être des vecteurs d'expression de gènes, ou encore des acides nucléiques, tels que des acides nucléiques antisens, microRNA, 5 siRNA aptes à modifier l'expression d'un gène constitutif de cellules présentes dans ledit modèle de l'invention. D'autres effets tels que l'expression de certains médiateurs ou la cytotoxicité intrinsèque des composés tests vis à vis de certaines cellules de la peau pourront être également recherchés comme effet secondaire, ou vis à vis de certaines cellules 10 associées qui auront pu être insérées en outre avec la biopsie de peau dans la matrice avant sa solidification. Ces modèles témoins seront bien entendus mis en oeuvre dans les mêmes conditions que le modèle de l'invention ayant reçu le produit à tester. 15 Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre ou pathologie de la peau, notamment de l'épiderme ou du derme, ce procédé comprenant les étapes suivantes : a) à partir d'un fragment de peau prélevé chez ledit patient, l'obtention d'un modèle 20 selon la présente invention; b) la mise en contact dudit modèle avec un composé candidat pour ledit traitement ; c) la mise en évidence de modification physiologique ou morphogénique de la peau, notamment de l'épiderme ou du derme, associée à l'efficacité du traitement des pour ledit désordre ou ladite pathologie; et 25 d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre de la 30 peau, notamment de l'épiderme ou du derme, selon la présente invention, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le fragment ou biopsie de peau utilisé est un fragment issu d'une collection ou de culture de peau. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un modèle selon la présente invention, pour déterminer pour un produit les effets secondaires sur la peau tels que par exemple : - sa toxicité ; - son adsorption ou absorption ; - sa distribution, son métabolisme, son excrétion ; - son pouvoir irritant ou corrosif ; - son pouvoir sensibilisant. Un tel modèle pourra être en effet selon la présente invention être utilisé ou mis en oeuvre dans tout procédé ou test in vitro ou ex vivo nécessitant des expérimentations animales ou humaines, comme par exemple l'étude de libération ou de pénétration de principes actifs, et/ou de leur biodisponibilité cutanée, l'étude de leur efficacité, ou encore de leur tolérance, de leur compatibilité, ces principes actifs étant à visée cosmétiques, dermatologiques et/ou pharmaceutiques. Selon un mode de réalisation préféré, ledit produit testé est un produit cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique. L'utilisation comme modèle concernera également sa mise en oeuvre pour l'étude de toute pathologie se traduisant par des anomalies de la peau, notamment de l'épiderme et/ou du derme, en particulier également pour toutes les cellules situées sous l'épiderme pour lesquelles l'épiderme constitue une barrière naturelle et pour lesquelles une thérapie par voie topique est envisageable. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec l'exemple et la figure. La figure dont les légendes sont ci-après, ainsi que l'exemple qui suit sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant en limiter la portée. LEGENDES DE LA FIGURE Figure : Schéma décrivant le procédé - Etape 1 : Une biopsie cylindrique de peau est réalisée ; - Etape 2: La biopsie est placée en flottaison dans un container/insert à membrane poreuse contenant une solution préparée avec un mélange de plasma sanguin et d'agarose fondu, ledit insert étant lui-même disposé (suspendu) dans un puits de plaque de culture cellulaire non pré-rempli de milieu nutritif; - Etape 3 : La solution de plasma sanguin est solidifiée par coagulation; et la biopsie disposée sur le plasma coagulé est maintenu en culture grâce à la diffusion du milieu de culture au travers de la membrane poreuse de l'insert. EXEMPLE : Différentes étapes du procédé (voir figure) 1. Une biopsie de peau cylindrique (diamètre 8 mm, épaisseur 5 mm) est tout d'abord réalisée sur un fragment de peau fraîchement prélevé pour faciliter sa survie ex vivo ou in vitro. 2. La biopsie est délicatement déposée sur un insert (cupule MillicellTM 8 puits) disposant au fond d'une membrane poreuse (en PET, porosité 1 pm), cet insert contenant une solution dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles en présence d'ions calcium (citrate de sodium). Cette solution contient 42 % de plasma sanguin, 50 % d'une solution de NaC1 à 0,9 %, 8 % d'une solution saline de CaC12 à 1%, un agent antifibrinolytique (acide tranaxémique ou aprotinine), et de l'agarose fondue à bas point de fusion à 1,5% (Agarose LMP GIBCOBRL, Life Technologies)(fondu à l'étuve à 65,5 °C). 3. En coagulant, le plasma fait office de support dermique sur lequel adhère l'explant de peau. La coagulation consiste essentiellement en la transformation, en présence d'ions calcium et de thrombine, du fibrinogène présent dans le plasma en un échafaudage de molécules de fibrine reliées entre elles par des liaisons covalentes. L'agent anti-fibrinolytique a pour fonction d'inhiber les enzymes susceptibles de dégrader la matrice de plasma, ces enzymes étant sécrétées par l'explant de peau, et ainsi de maintenir l'intégrité de l'explant. De la même façon la solution de plasma peut être substituée par une solution de fibrinogène ou de collagène. Pour cette dernière, l'incubation à 37°C seule permet la solidification. 4. La solution d'agarose à 1,5% contenue dans la solution de plasma gélifie progressivement à 37°C permettant ainsi le maintien ferme de la biopsie de peau dans l'insert. 5. L'ensemble constitué par l'explant de peau (ou encore appelé ici 10 fragment ou biopsie de peau) est maintenu en culture avec l'épiderme au contact de l'air et le milieu nutritif contenu dans l'insert disposé (suspendu) sur le puits de la plaque de culture cellulaire. REVENDICATIONS1. Procédé ex vivo ou in vitro pour la maintenance en survie in vitro ou ex vivo et le transport d'un fragment ou biopsie de peau ledit fragment de peau ou biopsie ayant été préalablement prélevé chez un mammifère, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) Le dépôt dudit fragment ou biopsie de peau sur une matrice liquide de manière à ce que la partie superficielle dudit fragment ou biopsie correspondant la totalité de l'épiderme reste émergée alors que le derme sous-jacent à cet épiderme est immergé totalement, ladite matrice liquide étant elle-même contenue dans un insert dont le fond est constitué d'une membrane poreuse, et ledit insert étant disposé dans un container ou puits; et b) La solidification de ladite matrice, cette solidification ayant pour effet d'emprisonner la partie immergée dudit fragment ou biopsie de peau dans ladite matrice ainsi solidifiée, et de faire adhérer ladite matrice solidifiée aux parois latérales et à ladite membrane poreuse de l'insert, et ladite partie superficielle épidermique de la biopsie, restant émergée, étant en contact avec l'air atmosphérique ou sous une atmosphère controlée comprenant en partie de l'air. 2. Procédé ex vivo ou in vitro selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : i) la flottaison d'une biopsie de peau cylindrique dans une matrice liquide choisie parmi une solution dérivée de plasma sanguin, solution de fibrinogène ou de collagène, ou d'une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, de préférence un mélange de ces solutions, cette matrice liquide étént contenue dans ledit insert, cette flottaison laissant la surface épidermique de la biopsie émergée, tandis que le derme est immergé ; ii) l'induction rapide de la solidification de ladite entourant la biopsie de peau ; et, iii) La culture in vitro ou ex vivo, ou la maintenance en survie du fragment ou biopsie de peau dans ladite matrice ainsi solidifiée. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les fragments ou biopsies de peau sont de forme cylindrique.. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit insert dont le fond est constitué d'une membrane poreuse est un insert en forme de nacelle dont le diamètre est compris entre 5 et 40 mm. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite membrane poreuse est une membrane d'une porosité choisie entre 0,4 à 8 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit container dans lequel est déposé ledit insert est un puits d'une plaque de culture cellulaire de 6,8, 12, 24, ou 48 puits. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'a l'étape a), ladite matrice liquide est un milieu contenant entre 1 mM et 2 mM de Ca2 mM de Ca2+ , et entre 5 et 500 mg/mL d'acide ascorbique.. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape a), ladite matrice liquide contenue dans l'insert est une matrice liquide, de préférence nutritive, apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation ou d'une diminution de la température et/ou par l'addition d'un composé ou d'une composition spécifique, et en ce que à l'étape b), la solidification de ladite matrice est réalisée par augmentation ou diminution de la température de ladite matrice et/ou par l'ajout dudit composé ou composition spécifique, cette solidification permettant de maintenir fermement la partie immergée du fragment ou biopsie de peau. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'à l'étape a) ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation de la température ou par l'addition d'un composé ou composition spécifique est choisie parmi toute solution liquide, de préférence nutritive, capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture du fragment ou de la biopsie de peau. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'à l'étape a) : - ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversible mélangée à une solution d' agar-agar ou d' agarose.. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'à l'étape a), ladite solution liquide dérivée de plasma est une solution liquide dérivée de plasma sanguin contenant de 25 % à 60 %, de 70 % à 35 % d'une solution physiologique, de 5 % à 12 %, d'une solution saline de CaC12 à 1 % et, le cas échéant, d'un agent anti-fibrinolytique. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'à l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution de fibrinogène et de thrombine, de collagène, de plasma sanguin mélangée à une solution de gélatine, comprenant des gels polymériques synthétiques, naturels tels que les gels d'agarose, en particulier les gels d'agarose ou d'agar-agar à faible/bas points de fusion, les gels d'amidon ou de polysaccharides. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'à l'étape b), ladite matrice liquide est solidifiée après au maximum de 8 heures après le dépôt du fragment ou biopsie de peau sur la matrice liquide à l'étape a). 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'à l'étape a) ou à l'étape b) ladite matrice liquide contenue dans l'insert ne comprend aucun facteur de croissance ni de sérum animal ou humain. 15. Procédé ex vivo ou in vitro de conservation ou de maintenance en survie d'un fragment ou biopsie de peau apte à être transporté, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : A) la conservation ou maintenance en survie d'un fragment ou biopsie de peau préalablement prélevé et apte à être transporté, par un procédé selon l'une des revendications 1 à 14; B) le transport dudit fragment ou biopsie de peau ainsi obtenue à l'étape A) ; et C) la culture dudit fragment ou biopsie de peau ainsi obtenue après transport à l'étape B) dans des conditions de cultures adéquates et/ou en présence du ou des composés que l'on souhaite tester, l' épiderme dudit fragment ou biopsie de peau étant au contact de l'air. 16. Fragment ou biopsie de peau dont la partie superficielle correspondant au moins à 90% de l'épiderme est émergée alors que le derme sous-jacent à cet épiderme est immergé à au moins 90% dans une matrice liquide solidifiée, utilisable comme modèle de peau et susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 15.. Méthode de screening in vitro de composés candidats pour le traitement cosmétique ou thérapeutique de la peau, cette méthode comprenant les étapes suivantes: a) l'obtention d'un fragment ou biopsie de peau dont la partie superficielle correspondant au moins à 90% de l'épiderme est émergée alors que le derme sous-jacent à cet épiderme est immergé à au moins 90% dans une matrice liquide solidifiée, comme modèle par un procédé selon l'une des revendications 1 à 15 ou selon la revendication 16; b) la mise en contact dudit modèle avec le composé candidat ; c) la mise en évidence d'une modification physiologique ou morphologique, et d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. 18. Procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre de la peau, ce procédé comprenant les étapes suivantes : a) à partir d'un modèle de peau obtenu d'un fragment ou biopsie de peau dont la partie superficielle correspondant au moins à 90% de l'épiderme est émergée alors que le derme sous-jacent à cet épiderme est immergé à au moins 90% dans une matrice liquide solidifiée, prélevé chez ledit patient, par un procédé selon l'une des revendications 1 à 15 ou selon la revendication 16; b) la mise en contact dudit modèle avec un composé candidat pour ledit traitement ; c) la mise en évidence de modification physiologique ou morphogénique associée à l'efficacité du traitement sur les cellules ou tissus de la biopsie de peau pour ledit désordre; et d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement dudit désordre. 19. Utilisation d'un procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit composé testé est destiné à être utilisé pour une application cosmétique ou pharmaceutique. 20. Kit comprenant un fragment ou biopsie de peau dont la partie superficielle correspondant au moins à 90% de l'épiderme est émergée alors que le derme sous-jacent à cet épiderme est immergé à au moins 90% dans une matrice liquide solidifiée, obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 15.. Kit selon la revendication 20 pour l'évaluation de composé cosmétique, dermatologique ou thérapeutique destiné à être utilisé pour la peau.