Brevet FR2998174A1 — publié le 20140523

L'invention relève de l'utilisation d'un mélange de composés, issus du métabolisme de microorganismes, présentant une activité microbiocide ou microbiostatique, en cosmétique ou dermatologie. Plus précisément, elle concerne un procédé pour obtenir un principe actif destiné au traitement de diverses affections de la peau, des cheveux, des ongles, des muqueuses et des poils, ou de désagréments comme les odeurs corporelles et les pellicules, dont l'origine est liée à la présence d'un agent microbien, ledit principe actif étant issu d'une culture d'au moins un microorganisme, notamment bactérien. On connaît des compositions cosmétiques ou dermatologiques comprenant un principe actif d'origine bactérienne. Ainsi, W02010/013179A1 décrit une composition pour traiter les peaux grasses et les troubles associés comme l'acné, cette composition comprenant une bactérie lactique du genre Lactobacillus ou Bifidobacterium, ou un métabolite de cette bactérie ayant la même fonction. Les auteurs y décrivent son activité stimulatrice des mécanismes de défense de la peau, en favorisant la synthèse de protéines, telles que les enzymes, impliquées dans ces mécanismes. Selon W02011/073437A1, il est décrit une composition déodorante, anti-pelliculaire, de soin ou de nettoyage de la peau, dont les peaux grasses, notamment acnéiques, dont le principe actif est la combinaison d'une bactériocine et d'un ou plusieurs oligosaccharides ou polysaccharides prébiotiques. Les compositions ci-dessus contiennent un principe actif d'origine bactérienne, qui est soit le microorganisme en lui-même ou ses fractions jouant le même rôle, soit un ou plusieurs composés peptidiques synthétisés 25 naturellement par des bactéries et utilisés à l'état isolé. Les auteurs de la présente invention ont découvert que le mélange des produits extracellulaires du métabolisme d'un microorganisme, lorsque celui-ci est cultivé sur un milieu propice, possède une activité microbiocide ou microbiostatique directe vis-à-vis de certains microorganismes de la microflore 30 humaine cutanée transitoire ou permanente. Ce produit qui constitue un principe actif de l'invention présente de multiples avantages. D'abord, il ne comprend pas le microorganisme source vivant, c'est donc un produit stable ; puis, il ne nécessite aucune étape complexe de traitement et d'isolement d'un composé actif ; et enfin, il agit directement sur la population microbienne cible, 35 son effet est donc immédiat. L'invention a ainsi pour objet un procédé de préparation d'un principe actif cosmétique ou dermatologique à usage topique, à base de surnageant de culture d'au moins un microorganisme, comprenant les étapes suivantes : On dispose d'un microorganisme ; On cultive ledit microorganisme sur un milieu de culture tel qu'il favorise la formation extracellulaire dans le surnageant de culture d'un mélange de composés issus du métabolisme du microorganisme, ledit mélange possédant une activité directement microbiocide ou microbiostatique sur au moins un microorganisme de la microflore humaine cutanée responsable de désagréments tels qu'odeurs corporelles, pellicules et/ou d'affections de la peau, des ongles, des poils, des cheveux et/ou des muqueuses ; et On récupère ledit mélange pour obtenir ledit principe actif. Avant d'aborder plus en détail l'invention, certaines notions et 15 certains termes employés sont ci-après précisés ou définis. Dans la présente description, l'invention est plus orientée vers l'utilisation d'une bactérie, mais bien entendu sa portée n'y est pas restreinte, et, par microorganismes, on inclut les champignons, les levures, les microalgues, dont l'activité microbiocide ou microbiostatique peut être évaluée 20 de la même façon que celle d'une bactérie, puisque l'effet recherché est identique. L'activité directement microbiocide ou microbiostatique d'un composé ou d'un mélange de composés, telle qu'on l'entend selon l'invention, signifie une activité impliquant une action sur le développement des 25 microorganismes cibles, soit via un effet direct des composés sur les cellules microbiennes induisant une détérioration de leur intégrité et/ou l'inhibition de certains mécanismes moléculaires, soit via une détérioration de l'environnement microbien conduisant à la mort du microorganisme ou en empêchant sa multiplication, par exemple par modification du pH, par 30 appauvrissement du milieu en un constituant essentiel... Cette action est principalement dépendante de la concentration en mélange de composés. Par mélange de composés à activité microbiocide ou microbiostatique constituant le principe actif de l'invention, on comprend que cette activité est celle du mélange, et non nécessairement celle résultant de 35 l'addition de chacune des activités microbiocides ou microbiostatiques des composés. Ainsi, ce mélange peut comprendre un ou certains composés qui à l'état isolé ne présentent pas ou peu d'activité microbiocide ou microbiostatique, mais qui au sein du mélange, peuvent manifester une telle activité et/ou générer ou stimuler l'activité microbiocide ou microbiostatique d'autres composés du mélange. Ce mélange est le produit du métabolisme du microorganisme utilisé, c'est-à-dire de la transformation microbiologique des constituants du milieu de culture sélectionné en composés sécrétés dans le milieu de culture et participant à l'effet recherché. Il comprend donc des composés de faibles poids moléculaires et notamment des composés d'origine protéique, des acides organiques, des acides nucléiques, des acides aminés, des sucres, des peptides, des lipides, et d'une façon plus générale, des composés issus du métabolisme primaire et secondaire du microorganisme. Dans une mise en oeuvre avantageuse de l'invention, le microorganisme microbiocide ou microbiostatique est choisi parmi les microorganismes classés QPS (Qualified Presumption of Safety), le classement QPS étant une reconnaissance de l'inocuité des microorganismes QPS pour l'homme, par l'Autorité Européenne de la Sécurité Alimentaire (European Food Safety Authority Journal 2011 ; 9(12) : 2497 (1-81). Parmi les microorganismes QPS, on retiendra avantageusement les genres microbiens suivants : Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Pro pionibacterium, Streptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Saccharomyces, Hanseniaspora, Schizosaccharomyces, Xantophyllomyces. Mieux encore, on le sélectionne parmi les microorganismes classés QPS appartenant au groupe des bactéries dites lactiques qui rassemblent les genres suivants: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus et Streptococcus ainsi qu'aux genres bactériens Propionibacterium et Bifidobacterium. Parmi ceux-ci, les genres bactériens Lactobacillus, Lactococcus, Propionibacterium et Bifidobacterium sont encore préférés. Le principe actif de l'invention vise le traitement des affections de la peau et des désagréments trouvant directement ou indirectement une origine microbienne ; il peut aussi être efficace pour le traitement des troubles touchant les muqueuses et les phanères, notamment ongles, poils et cheveux. Ainsi, le ou les microorganismes cibles sont ceux appartenant à la 35 flore cutanée transitoire ou permanente. L'invention présente un intérêt particulier quand elle cible les espèces suivantes : - les espèces du genre Corynebacterium, notamment Corynebacterium xerosis et Corynebacterium jeikium, - I es es p è ce s du genre Brevibacterium, notamment Brevibacterium epidermidis, Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, - les espèces du genre Staphylococcus, notamment Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, - les espèces du genre Micrococcus, notamment Micrococcus luteus et Micrococcus lylae, - les espèces du genre Propionibacterium, notamment Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, - les espèces du genre Malassezia, et notamment Malassezia furfur, - ainsi que les espèces des genres Dermabacter, Streptococcus, Acinetobacter, Escherichia, Pseudomonas et Candida. L'effet microbiocide ou microbiostatique du mélange obtenu selon 20 l'invention résulte du métabolisme du microorganisme dans le milieu de culture dans lequel il est mis à développer. Les milieux de culture adaptés à la croissance d'un microorganisme, par exemple d'une bactérie, comprennent généralement des extraits de levure, des peptones, des sels, des sources inorganiques ou 25 organiques de phosphate, d'azote et de potassium, etc. ainsi que des sucres ; ces milieux, disponibles dans le commerce, ainsi que les conditions de croissance d'un microorganisme (pH, température, aération, agitation, potentiel redox, durée), et notamment d'une bactérie, sont des notions bien connues de l'homme du métier. Selon l'invention, un tel milieu peut être mis au point par 30 l'homme du métier, il peut être utilisé tel que disponible dans le commerce ou alors peut être modifié, le plus souvent par la modification de la concentration et/ou de la nature des ingrédients précités, pour obtenir un milieu qui favorisera la production par le microorganisme d'un mélange de composés microbiocide ou microbiostatique, secrété dans le milieu de la culture. 35 L'homme du métier est en mesure de déterminer si l'effet est obtenu, et donc en mesure de sélectionner un milieu de culture permettant de produire le surnageant recherché. Dans un des exemples qui suivront, il est décrit un protocole que l'homme du métier peut mettre en oeuvre pour évaluer l'action bactéricide d'un mélange présent dans un surnageant de culture d'une bactérie et issu du métabolisme de cette dernière, dans le milieu de culture. Bien entendu, l'homme du métier peut évaluer cette action par toute autre méthode. Pour une production optimale du mélange microbiocide ou microbiostatique, on cultive avantageusement le microorganisme, par exemple la bactérie, jusqu'à un stade avancé de la phase exponentielle de la croissance microbienne, de préférence en phase stationnaire, où l'efficacité du mélange est la plus forte, puis on récupère le mélange. L'étape de récupération du mélange est classiquement réalisée et les techniques de routine en microbiologie sont appropriées. Ainsi, on peut séparer le surnageant du milieu de culture par filtration ou centrifugation, après quoi le surnageant est traité pour obtenir le principe actif, par toutes techniques adaptées, mettant notamment en oeuvre des étapes de concentration, ultrafiltration, séchage, lyophilisation, atomisation, etc... L'invention a aussi pour objet un principe actif cosmétique ou dermatologique à usage topique, susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention tel que décrit précédemment, ainsi qu'une composition cosmétique ou dermatologique à usage topique, comprenant un tel principe actif ou plusieurs. Avantageusement, elle comprend un principe actif obtenu par culture de la souche Lactococcus lactis déposée le 15 novembre 2012 conformément au traité de Budapest auprès de la Collection nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), sous le numéro CNCM I-4693, et elle est déodorante ou prévient l'acné: comme cela est mis en évidence dans les exemples qui suivent, la culture de cette souche sur un milieu MRS ou M20, modifié ou non, produit un surnageant possédant un effet bactéricide vis-à-vis de Brevibacterium epidermis et casei, i m pliquées dans les odeurs désagréables qui se dégagent des pieds ainsi que vis à vis des espèces de Propionibacterium impliquées dans le développement de l'acné. Un autre objet de l'invention est une utilisation cosmétique ou dermatologique à usage topique d'un ou plusieurs de ces principes actifs. Comme cela est exposé en détails dans les exemples, les auteurs 35 ont identifié des souches, et notamment une souche de l'espèce Lactococcus lactis, et sélectionné un milieu de culture permettant de produire un mélange actif présentant un effet bactéricide vis-à-vis de bactéries de la microflore humaine cutanée, et plus précisément vis-à- vis de bactéries Brevibacterium responsables des odeurs corporelles et Propionibacterium impliquées dans le développement de l'acné. Cette souche de Lactococcus lactis a été déposée à La Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur, autorité de dépôt selon le traité de Budapest et sous le N° accès du dépôt CNCM 1-4693. Un milieu particulièrement adapté à l'obtention d'un principe actif efficace contre Brevibacterium et notamment Brevibacterium epidermidis est choisi parmi les milieux M20 et MRS, commercialisés ainsi que ces mêmes milieux dont le sucre, à savoir le glucose, a été remplacé par un autre sucre, ou dont la concentration a été augmentée. Un sucre de remplacement du glucose préféré est le saccharose. Un autre objet de l'invention est donc une composition déodorante 15 ou une composition de lutte ou de prévention de l'acné comprenant un principe actif obtenu par culture de la souche Lactococcus lactis CNCM 1-4693. Les compositions selon la présente invention peuvent être formulées sous toute forme galénique appropriée à leur administration. Les compositions selon la présente invention peuvent ainsi être formulées sous 20 forme de crème, gel, lotion, lait, émulsion huile dans eau ou eau dans huile, solution, onguent, pulvérisateur, huile corporelle, lotion après-rasage, savon, bâton protecteur des lèvres, bâton et crayon pour maquillage, aérosol, roll-on, stick, bille, poudre, lingette, incorporation dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, cyclodextrines, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, 25 nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules et aussi adsorbtion sur des polymères organiques poudreux, des talc, bentonites et autres supports minéraux. Les compositions selon la présente invention peuvent aussi contenir des additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologie, comme par 30 exemple d'autres agents antimicrobiens ou des parfums mais aussi des lipides d'extraction ou de synthèse, des polymères gélifiants et viscosifiants, des tensio-actifs et des émulsifiants, des principes actifs hydro- ou liposolubles, des extraits de plantes, des extraits tissulaires, des extraits marins, des actifs de synthèse. 35 Les compositions selon la présente invention peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, par exemple pour l'effet amincissant, l'effet anti-cellulite, l'effet raffermissant, l'effet hydratant, l'effet anti-âge, l'activité antimicrobienne, l'activité antioxydante, l'activité anti-radicalaire, l'effet cicatrisant, l'effet tenseur, l'effet antiride, l'activité chélatante, l'activité complexante et séquestrante, l'effet apaisant, l'effet anti-cernes, l'effet anti-rougeurs, l'activité émolliente, l'effet démêlant capillaire, l'activité anti-pelliculaire, l'effet stimulant de la repousse du cheveu, l'effet inhibant la chute du cheveu, l'effet gainant capillaire, l'activité épilatoire, l'activité limitant la repousse du poil, l'activité participant au renouvellement cellulaire, l'activité modulant la réponse inflammatoire, l'activité participant au maintien de l'ovale du visage, mais également la protection solaire, l'activité anti-irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire, les traitements antiséborrhéiques, la tonicité cutanée, la protection du cheveu. Lorsque les compositions selon la présente invention contiennent des principes actifs complémentaires, ceux-ci sont généralement présents 15 dans la composition à une concentration suffisamment élevée pour qu'ils puissent exercer leur activité. Les compositions selon la présente invention sont de préférence utilisées quotidiennement et appliquées une ou plusieurs fois par jour. Les compositions selon la présente invention sont très bien 20 tolérées, elles ne présentent aucune toxicité et leur application sur la peau, pour des périodes de temps prolongées, n'implique aucun effet systémique. La présente invention est maintenant illustrée, de manière non limitative, par les exemples suivants à l'appui des figures 1-6, selon lesquelles : 25 Figure 1 correspond à des photographies représentatives du test overlay des souches de bactéries testées dont Brevibacterium casei est la cible. A désigne la boite contrôle sans strie de bactéries testées et ensemencée avec un inoculum de Brevibacterium casei ; 30 B désigne la boite avec des stries d'une souche de Bifidobacterium adolescentis et ensemencée avec un inoculum de Brevibacterium casei (catégorie -) ; C désigne la boite avec des stries d'une souche de Propionibacterium freudenreichii et ensemencée avec un 35 inoculum de Brevibacterium casei (catégorie +) ; D désigne la boite avec des stries d'une souche de Propionibacterium acidopropionici et ensemencée avec un inoculum de Brevibacterium casei (catégorie ++); E désigne la boite avec des stries d'une souche de Lactobacillus plantarum et ensemencée avec un inoculum de Brevibacterium casei (catégorie +++). Figure 2 correspond à des photographies représentatives du test de confrontation directe sur milieu TS dont Brevibacterium casei est la cible. A désigne la boîte ensemencée avec un inoculum de Brevibacterium casei avec stries de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 ; B désigne la boîte ensemencée avec un inoculum de Brevibacterium casei avec stries de la souche de Lactobacillus plantarum ci-dessus. Figure 3 correspond à des photographies représentatives du test d'inhibition de Brevibacterium casei avec les surnageants de cultures. A désigne la boîte ensemencée avec un inocolum de Brevibacterium casei avec un surnageant de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 ; B désigne la boîte ensemencée avec un inocolum de Brevibacterium casei avec un surnageant de la souche de Lactobacillus plantarum ci-dessus. Figure 4 représente la comparaison de la courbe de croissance de Lactococcus lactis CNCM I-4693 dans du milieu MRS avec le pouvoir inhibiteur de son surnageant sur Brevibacterium casei et Brevibacterium epidermidis, où - correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de 30 Lactococcus lactis CNCM 1-4693 sur Brevibacterium epidermidis, - correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de Lactococcus lactis CNCM I-4693 sur Brevibacterium casei, et * correspond à la courbe de croissance de Lactococcus lactis CNCM I-4693 sur milieu MRS. 35 Figure 5 représente l'évolution du pouvoir inhibiteur des surnageants de Lactococcus lactis CNCM I-4693 sur Brevibacterium epidermidis, pour différentes concentrations du milieu en glucose, avec - correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de Lactococcus lactis CNCM I-4693 cultivé dans du milieu M20 à 5 g/L de glucose initial, - correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de Lactococcus lactis CNCM I-4693 cultivé dans du milieu M20 à 20 g/L de glucose initial, et * correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 cultivé dans du milieu M20 à 40 g/L de glucose initial. L'activité inhibitrice est exprimée en % par rapport à une valeur référence. Celle-ci est le maximum d'inhibition obtenu avec les surnageants de la culture de Lactococcus lactis CNCM I-4693 dans du milieu M20 à 5 g/L de glucose (100 %). Figure 6 représente l'évolution du pouvoir inhibiteur des surnageants de Lactococcus lactis CNCM I-4693 sur Brevibacterium epidermidis, pour différents sucres ou concentrations en sucre, avec - correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de 25 Lactococcus lactis CNCM I-4693 cultivé dans du milieu M20 à 5 g/L de glucose initial, - correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de Lactococcus lactis CNCM I-4693 cultivé dans du milieu M20 à 20 g/L de glucose initial, et 30 * correspond à l'évolution du pouvoir inhibiteur du surnageant de Lactococcus lactis CNCM I-4693 cultivé dans du milieu M20 à 20 g/L de saccharose initial. L'activité inhibitrice est exprimée en % par rapport à une valeur 35 référence. Celle-ci est le maximum d'inhibition obtenu avec les surnageants de la culture de Lactococcus lactis CNCM I-4693 dans du milieu M20 à 5 g/L de glucose (100 %). Dans les exemples ci-après, les milieux de culture suivants, 5 disponibles dans le commerce ont été utilisés : MRS : Peptone 10 g/L Extrait de viande 10 g/L Extrait de levure 5g/L 10 Glucose 20g/L Tween 80 1.08 g/L Phosphate dipotassique 2g/L Acétate de sodium 5g/L Citrate d'ammonium 2g/L 15 Sulfate de magnesium 0.2g/L Sulfate de manganese 0.05 g/L M20 : Tryptone USP 30 g/L 20 Extrait de levure 20 g/L Glucose 5 g/L C'est à partir de ces milieux de culture utilisés en l'état ou modifiés que des surnageants bactéricides/bactériostatiques ont été obtenus, dans les exemples qui suivent. 25 Exemple 1: Protocoles d'évaluation de l'action bactéricide/bactériostatique d'un mélange de l'invention L'activité minimum d'inhibition est une mesure de référence pour évaluer l'efficacité d'un agent antimicrobien. 30 Dans des tubes stériles, 3 mL de milieu de culture contenant 105 CFU/mL de la bactérie cible sont mis au contact de 1 mL d'une solution tampon PBS, contenant différentes concentrations de surnageant de microorganismes potentiellement bactéricide ou bactériostatique. Des contrôles sont effectués en présence de PBS sans ajout de surnageant de culture. Ces 35 contrôles négatifs permettent de démontrer que les conditions utilisées pour le test permettent la croissance de la bactérie cible. Les tubes sont ensuite mis à incubés à une température adaptée à la croissance de la bactérie cible jusqu'à ce que les tubes contrôles se troublent puis l'absorbance à 600 nm est mesurée afin de détecter ou non le développement de la bactérie cible. Si le milieu de culture des tubes contenant du surnageant de microorganismes potentiellement bactéricide ou bactériostatique ne se trouble pas et que la D0600 est inchangée entre T=0 et la fin de l'essai, il est conclu qu'il y a eu inhibition de croissance de la bactérie cible et donc action bactéricide ou bactériostatique des surnageants testés. La méthode ci-dessus est ci-après appliquée à l'évaluation bactéricide de surnageants issus de culture de Lactococcus lactis CNCM I4693 sur milieu M20 à 20 g/L de saccharose vis à vis de Brevibacterium epidermidis. Le milieu de culture utilisé pour Brevibacterium epidermidis était le milieu TS, les tubes étaient placés 72h à 37°C. L'activité minimum d'inhibition du surnageant est de 0,4-0,6 % vis-à-vis de Brevibacterium epidermidis. Ce surnageant est aussi actif contre d'autres microorganismes nuisibles de la peau, identifiés dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1 : Activité minimum d'inhibition du surnageant de culture de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 vis-à-vis de différentes espèces 20 microbiennes à l'origine de désagréments cutanés Bactérie cible Désagrément/Affection Action bactéricide Brevibacterium epidermidis Odeur désagréable des pieds 0,4 - 0,6 % Propionibacterium acnes Acné vulgaire 0,2 - 0,4 % Staphylococcus aureus Infection 6 % Exemple 2 : Criblage des souches de bactéries testées pour leur activité antibactérienne 25 2.1. Inhibition par contact direct entre Brevibacterium casei et les souches criblées La méthode overlay utilisée pour ce criblage est une des nombreuses méthodes d'évaluation des activités inhibitrices décrites dans la littérature (Toure, Kheadr, Lacroix, MoroniFliss: Production of antibacterial 30 substances by bifidobacterial isolates from infant stool active against Listeria monocytogenes. Journal of Applied Microbiology, 95, p.1058-1069. 2003). Quatorze souches bactériennes listées dans le tableau 2 suivant et classées QPS ont été criblées suivant cette méthode par rapport à leur activité antibactérienne contre Brevibacterium casei, microorganisme cible. Tableau 2 : Récapitulatif des microorganismes criblés. Genre Espèce Lactobacillus Plantarum Acidophilus Johnsonii Rhamnosus Lactococcus Lactis Propionibacterium Acidipropionici Freudenreichii Bifidobacterium Breve Longum Bifidum Adolescentis Deux stries parallèles de souches testées sont réalisées sur un milieu adapté gélosé. Après croissance des bactéries en anaérobiose, cette gélose est recouverte d'un deuxième milieu inoculé avec Brevibacterium casei. Les boites de Pétri sont alors incubées en aérobiose pour permettre la croissance du microorganisme cible puis examinées pour évaluer la présence ou non de zones d'inhibition de croissance de Brevibacterium casei autour des stries. Après 72 h d'incubation des boites contrôles sans strie de souches testées, on observe un développement homogène de Brevibacterium casei dans l'ensemble du milieu gélosé (figure 1A). Certaines boites contenant des stries montrent aussi un développement homogène de la souche cible indiquant une absence d'activité inhibitrice (figure 1B). Les boites contenant les stries de Lactobacillus plantarum ne montrent aucun développement de B. casei. Cette souche semble inhiber totalement la croissance du microorganisme cible (figure 1 E). Sur les autres boites, des zones d'inhibition de Brevibacterium casei centrées sur les deux stries parallèles étaient observées. Ces zones sont plus ou moins étendues, indiquant un pouvoir d'inhibition des souches testées différent. Une note de pouvoir inhibiteur en fonction de la taille de la zone de non croissance a donc été attribuée (fig. 1). Des photographies des boites représentatives des différentes catégories d'inhibition sont présentées aux figures 1 B à 1 E. Le tableau 3 synthétise l'ensemble des résultats obtenus. Tableau 3 : Inhibitions de Brevibacterium casei avec le test overlay. Nom de la souche Intensité de l'inhibition Lactobacillus planta rum ++ Lactobacillus acidophilus + Lactobacillus johnsonii ++ Lactobacillus planta rum +++ Lactobacillus rhamnosus +++ Lactococcus lactis + Lactococcus lactis 8270 ++ Lactococcus lactis ++ Bifidobacterium breve ++ Bifidobacterium longum ++ Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium adolescentis Propionibacterium freudenreichii + Propionibacterium acidipropionici ++ Afin d'affiner la sélection, des essais de confrontation sur même milieu entre microorganismes cible et inhibiteur sont effectués. Pour ces essais, les deux souches sont cultivées simultanément sur le même milieu, il y a donc une compétition directe entre les deux organismes pour leur croissance. Ce test est effectué sur milieu TS inoculé avec une culture de Brevibacterium casei et sur lequel deux stries d'une culture de souche QPS ont été réalisées. Ce test n'était pas possible avec les souches de Bifidobacterium puisqu'elles sont anaérobies strictes, condition qui ne permet pas la croissance de Brevibacterium casei. Ce test s'est révélé beaucoup plus sélectif que le test overlay puisque seule la souche Lactococcus lactis CNCM I-4693 présentait une zone d'inhibition autour des deux stries (figure 2A). Sur les autres boites, le développement de Brevibacterium casei est comparable à la boite contrôle sans strie et aucune croissance des souches testées n'est observée (figure 2B). 2.2 Inhibition par les surnageants de culture Afin d'évaluer l'efficacité des surnageants de culture des souches inhibitrices sélectionnées lors du premier criblage, la méthode de diffusion à partir des puits a été utilisée. Pour cet essai, les surnageants de culture en phase stationnaire de souches testées sont placés dans des puits réalisés dans une gélose inoculée avec B. casei. Après incubation dans des conditions adaptées à la croissance de B. casei, les diamètres d'inhibition autour des puits sont mesurés. Les essais sont effectués quatre fois à partir du même surnageant. Cet essai s'est avéré très sélectif puisqu'une zone de non croissance de Brevibacterium casei n'a été observée qu'autour des puits contenant les surnageants de Lactococcus lactis CNCM 1-4693. Cet halo d'inhibition est d'un diamètre de 1,1 cm (figure 3). Ces résultats confirment ceux obtenus avec les tests overlay et de confrontation sur milieu TS. Les autres surnageants testés n'induisaient aucun halo d'inhibition. Le fait qu'un halo d'inhibition autour des puits contenant le surnageant de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 soit observé, semble indiquer que cette souche synthétise et sécrète un ou plusieurs composés antimicrobiens spécifiques. Exemple 3 : Optimisation des conditions de culture de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 3.1 Choix du milieu standard de culture Le milieu de culture et la phase de croissance peuvent avoir une influence importante sur la quantité de composés antibactériens synthétisés par une souche. Aussi, l'activité antimicrobienne de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 durant sa croissance sur milieu MRS a été mesurée et l'impact des milieux MRS, M20, M17 et TBSY sur cette même activité a été évaluée. Plusieurs espèces de Brevibacterium sont à l'origine des mauvaises odeurs ; aussi, il a été décidé de vérifier, en parallèle de ces essais d'optimisation, que le surnageant de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 inhibe une autre espèce de Brevibacterium dominante au niveau de la peau. Le pouvoir d'inhibition des surnageants de culture a été testé contre Brevibacterium casei et Brevibacterium epidermidis. Comme l'illustre la figure 4, les essais avec les surnageants de 35 culture montrent que la taille des zones d'inhibition de Brevibacterium casei et Brevibacterium epidermidis augmente durant la phase exponentielle de croissance de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 et reste constante durant la phase stationnaire. Ceci indique que la ou les molécule(s) inhibitrice(s) sont synthétisées durant la phase exponentielle. Pour comparer l'effet des différents milieux, les surnageants de 5 culture doivent être récupérés en phase stationnaire puisque l'activité inhibitrice est maximale et stable à ce stade. Pour l'inhibition de Brevibacterium casei, à T=11 h, les surnageants des cultures en milieu M17 et TBSY induisent des halos d'inhibition de 0,77 et 1,08 cm qui sont plus petits que ceux observés avec des surnageants de 10 culture en milieu M20 et MRS (1,17 et 1,13 cm respectivement). La différence de taille des zones d'inhibition en fonction du milieu de culture était confirmée lors d'une deuxième série d'essai réalisée avec Brevibacterium epidermidis comme microorganisme cible. Deux milieux semblent plus adaptés à l'expression de l'activité inhibitrice : les milieux M20 et MRS. Le milieu M20 15 montre toujours une activité inhibitrice plus importante. Tableau 4 : Inhibition des Brevibacteria (diamètre du halo d'inhibition en cm) due à des surnageants de Lactococcus lactis CNCM I-4693 obtenus après croissance de la souche dans différents milieux au bout de 11 heures de 20 culture. Milieu MRS M20 M17 TBSY Brevibacterium casei 1,13 1,17 0,77 1,08 Brevibacterium epidermidis 1,45 1,47 1,12 1,42 3.2. Influence de la nature et de la concentration des sucres dans le milieu de culture 25 Afin d'augmenter davantage l'expression de l'activité antibactérienne de cette souche, les impacts de la concentration et de la nature des sucres sur cette activité ont été évalués. - Influence de la concentration des sucres Dans cette partie, trois concentrations de glucose dans le milieu de 30 culture ont été testées. Le premier essai est le test de référence : il s'agit de la culture de Lactococcus lactis CNCM I-4693 en fiole Erlenmeyer dans du milieu M20 à 5 g/L de glucose. Les deux autres expériences sont réalisées en fermenteur avec du milieu M20 à 20 ou 40 g/L de glucose. Des prélèvements ont été effectués régulièrement afin de mesurer l'absorbance à 600 nm, la matière sèche, la concentration en sucre et d'évaluer l'activité antibactérienne vis-à-vis de Brevibacterium epidermidis. Les surnageants ont servi à réaliser le test d'inhibition sur boite de Pétri (figure 5). Pour comparer les échantillons entre eux (et évaluer notre gain en activité durant les étapes d'optimisation), il a été choisi d'exprimer l'activité inhibitrice en % par rapport à une valeur référence. Celle-ci est le maximum d'inhibition obtenu avec les surnageants de la culture de Lactococcus lactis CNCM 1-4693 dans du milieu M20 à 5 g/L de glucose (100 %). Les surnageants de la culture à 20 g/L de glucose prélevés à T= 6 h 30 et T= 8 h 30 (phase stationnaire) ont des activités de 125,8 et 127,3 %. Des valeurs similaires (128,8 et 125,8 %) ont été obtenues avec les surnageants prélevés au même temps dans le fermenteur contenant initialement 40 g/L de glucose. L'ajout de 20 g/L de glucose et la conduite de la culture en fermenteur augmentent significativement l'activité inhibitrice présente dans les surnageants alors qu'une augmentation supplémentaire de la teneur en sucre (40 g/L) n'a plus d'effet sur la production d'activité inhibitrice ni sur la biomasse. - Influence de la nature des sucres Ces essais ont été réalisés en fioles Erlenmeyer dans du milieu M20 dont la nature du sucre a été modifiée. Les sucres testés sont le mannose, le saccharose, le lactose, le lactulose et le glucose à une concentration de 5 g/L. Les résultats obtenus sont fournis dans le tableau 5. Tableau 5 : Influence de la nature du sucre dans les milieux de culture de Lactococcus lactis CNCM I-4693 sur le % d'inhibition de Brevibacterium epidermidis. Sucre Glucose Mannose Saccharose Lactose Lactulose % d'inhibition 100,0 102,2 102,2 90,3 95,7 Les surnageants qui permettent une inhibition de Brevibacterium epidermidis la plus importante sont ceux obtenus après une culture de Lactococcus lactis CNCM I-4693 dans du milieu M20 à 5 g/L de mannose (102,5 %) et à 5 g/L de saccharose (102,2 %). Les surnageants obtenus après une culture de Lactococcus lactis CNCM I-4693 dans du milieu M20 à 5 g/L de lactulose ou de lactose, fournissent des inhibitions inférieures aux autres sucres (95,7 et 90,3 % respectivement). Le mannose, le glucose et le saccharose se révèlent être des sucres de choix pour obtenir l'activité recherchée.5 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un principe actif cosmétique ou dermatologique à usage topique, à base de surnageant de culture d'au moins un microorganisme, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : On dispose d'un microorganisme choisi parmi les bactéries, les champignons, les levures et les microalgues ; On cultive ledit microorganisme sur un milieu de culture tel qu'il favorise la formation extracellulaire dans le surnageant de culture d'un mélange de composés issus du métabolisme du microorganisme, ledit mélange possédant une activité directement microbiocide ou microbiostatique vis-à-vis d'au moins un microorganisme de la microflore humaine cutanée responsable de désagréments tels qu'odeurs corporelles, pellicules et/ou d'affections de la peau, des ongles, des poils, des cheveux et/ou des muqueuses ; et On récupère ledit mélange pour obtenir ledit principe actif. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme microbiocide ou microbiostatique est choisi parmi les espèces microbiennes classées QPS (Qualified Presumption of Safety). 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme microbiocide ou microbiostatique est choisi parmi les espèces 20 des genres Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Pro pionibacterium, Streptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Saccharomyces, Hanseniaspora, Schizosaccharomyces, Xantophyllomyces. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le 25 microorganisme microbiocide ou microbiostatique est choisi parmi les.espèces des genres Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Propionibacterium et Bifidobacterium. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le microorganisme microbiocide ou microbiostatique est choisi parmi les espèces 30 des genres Lactobacillus, Lactococcus, Propionibacterium et Bifidobacterium. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on cultive le microorganisme jusqu'à la phase stationnaire puis on récupère le mélange. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 35 caractérisé en ce que les microorganismes de la microflore humaine cutanée sont choisis parmi :- les espèces du genre Corynebacterium, notamment Corynebacterium xerosis et Corynebacterium jeikium, - les espèces du genre Brevibacterium, notamment 10 15 Brevibacterium epidermidis, Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, - les espèces du genre Staphylococcus, notamment Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, - les espèces du genre Micrococcus, notamment Micrococcus luteus et Micrococcus lylae, - les espèces du genre Propionibacterium, notamment Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, - les espèces du genre Malassezia, et notamment Malassezia furfur - ainsi que les espèces du genre Dermabacter, Streptococcus, Acinetobacter, Escherichia, Pseudomonas et Candida. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 20 caractérisé en ce que les microorganismes de la microflore humaine cutanée sont choisis parmi : - les espèces du genre Corynebacterium, notamment Corynebacterium xerosis et Corynebacterium jeikium, - les espèces de Brevibacterium, notamment Brevibacterium 25 epidermidis, Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, - les espèces du genre Staphylococcus, notamment Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, - les espèces du genre Propionibacterium, notamment 30 Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, - les espèces du genre Malassezia, et notamment Malassezia furfur, 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 35 caractérisé en ce que les microorganismes de la microflore humaine cutanée sont choisis parmi :les espèces du genre Brevibacterium, notamment Brevibacterium epidermidis, Brevibacterium casei, Brevibacterium linons, les espèces du genre Propionibacterium, notamment Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la bactérie est une souche Lactococcus lactis CNCM I10 4693. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend des peptones de soja (30 g/L), de l'extrait de levure (20 g/L) et du saccharose (20 g/L) 12. Principe actif cosmétique ou dermatologique à usage topique, 15 susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Composition cosmétique ou dermatologique à usage topique, comprenant un ou plusieurs principes actifs selon la revendication 12. 14. Composition selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'elle 20 comprend un principe actif obtenu par culture de la souche Lactococcus lactis CNCM 1-4693, et en ce qu'elle est déodorante en inhibant la croissance des espèces du genre Brevibacterium. 15. Composition selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'elle comprend un principe actif obtenu par culture de la souche Lactococcus lactis 25 CNCM 1-4693, et en ce qu'elle lutte ou prévient l'acné en inhibant la croissance des espèces du genre Propionibacterium. 16. Utilisation cosmétique d'un ou plusieurs principes actifs selon la revendication 12.