Brevet FR2990883A1 — publié le 20131129

Dispositif de broyage d'échantillons en micro plaque La présente invention concerne le broyage simultané d'échantillons, dans une pluralité de contenants rapprochés, de section pouvant être inférieure à un centimètre carré, avec un dispositif mécanique permettant de faire pivoter dans les deux sens, avec un couple de plusieurs milli newton mètres, une pluralité d'axes, au droit des contenants, tout en exerçant une force d'appui élevée sur chaque échantillon, le tout grâce à un nombre réduit d'actionneurs. Domaine d'application : Ce dispositif est en premier lieu, mais pas exclusivement, destiné à broyer simultanément des échantillons dans une pluralité de tubes de petit diamètre, proches les uns des autres, par exemple dans une microplaque, préalablement à l'extraction des acides nucléiques et des protéines de ces échantillons et d'une façon plus générale à leur analyse. Ledit système permettant de faire le broyage et les analyses dans la même microplaque. Une microplaque est formée d'un ensemble de tubes solidaires les uns des autres et qui peuvent dans certaines configurations être amovibles. Le modèle le plus classique comporte 12 x 8 tubes au pas de 9 mm. Les tubes peuvent être de section circulaire ou polygonale. Le fond des tubes peut être plat, conique ou hémisphérique. Par échantillons on entend en priorité, mais pas seulement, des organes végétaux, tels graines, feuilles ayant éventuellement subi un séchage, tiges, 25 fleurs, et plus généralement, tout élément solide ou pâteux. Dispositifs de l'art antérieur : Des broyeurs à billes sont utilisés dans les laboratoires. Une ou plusieurs billes en matériau dur sont introduites dans des tubes avec l'échantillon et 30 éventuellement un tampon liquide. Les tubes, obturés, sont agités violemment pendant un temps qui dépend de la dureté de l'échantillon et de la finesse souhaitée du broyat. Ce dispositif est efficace pour des matrices peu dures, de type feuilles fraiches ou séchées, de graines tendres. Il ne fonctionne qu'avec des billes lourdes, donc volumineuses, pour des graines dures, telles les graines de pois, de maïs, de soja, ou pour des lots de graines de blé, d'orge, de colza. La présence des billes mêlées à l'échantillon est parfois gênante. Un broyage à température négative est impossible, si l'échantillon à broyer n'est pas sec, ou si le tampon liquide n'a pas une température de congélation plus basse que la température de broyage. Si les tubes contenant les broyats ne sont pas disposés au format micro plaque, les broyats doivent être transférés dans des supports de type micro plaque, pour passer aux étapes suivantes d'analyses automatisées. Ce transfert d'échantillons, augmente largement le temps d'opération, le risque de contaminations croisées et de perte de traçabilité. io Le Terminator, de la société Elexa, Hollande, broie 96 échantillons simultanément, dans une micro plaque à puits peu profonds, à fond plat. Le dispositif de broyage est constitué de 96 pilons, qui martèlent sans tourner, les échantillons. Les échantillons sont de taille réduite et ne doivent pas être très durs, ni baigner dans un liquide. 15 Un laboratoire a fait fabriquer un broyeur, dont l'élément actif est une pluralité de pistons, qui frappent les échantillons. Les échantillons doivent être contenus dans des tubes très robustes, en général métalliques, pour éviter leur éclatement. Il est nécessaire, avec ce dispositif de l'art antérieur, de prélever tout ou partie des échantillons broyés et de les transférer dans des tubes vierges, en 20 général d'une microplaque en matière plastique, pour la poursuite des analyses. De plus, le broyat peut former une galette, qu'il faut effriter, pour permettre une digestion efficace et rapide par les réactifs, dans le processus aval. Enfin, le transfert manuel d'échantillons augmente fortement le temps d'opération, le risque de contamination croisée entre échantillons et rend problématique leur traçabilité. 25 Un système d'écrasement de graines est décrit dans la demande de brevet WO 2010/108082 de Pioneer. Ce système est composé de pilons qui écrasent des échantillons dans une plaque de 96 puits. Cette plaque est de taille supérieure aux microplaques standard et ce dispositif est associé a un dispositif de transfert du matériel écrasé vers une micro plaque standard. Ce n'est pas un 30 dispositif de broyage mais un dispositif d'écrasement ou d'éclatement des échantillons et il nécessite une seconde étape d'échantillonnage. Un autre dispositif de broyage de graines est décrit dans le brevet US 2006/0196369 Al délivré à la société Monsanto Company. Ce dispositif décrit un système où une tige presse une pièce intermédiaire en contact avec la graine à broyer. Les tiges n'ont pas la capacité de pivoter. La pièce intermédiaire doit être retirée pour accéder à l'échantillon. La société Genomic, France, a obtenu un brevet Français pour « Procédé et dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de 5 prélèvements biologiques non liquides » délivré le 16.05.2003 sous le numéro d'enregistrement national 99 05795. Brevet USA N° US 6,695,236 B2 délivré le 24 février 2004. Brevet Européen N° 1177276 du 13 octobre 2004. Ce brevet récite un dispositif de broyage selon la technique du pilon et du mortier, mais ne précise pas de dispositif permettant d'actionner la rotation de l'ensemble des pilons sur 10 une surface aussi réduite que celle d'une microplaque, par exemple. Le broyeur commercialisé, mettant en oeuvre cette invention est le Grind-Ic. Aucun des moyens de l'art antérieur ne décrit de dispositif permettant de broyer des échantillons en microplaque, en combinant la pression ou les chocs sur les échantillons et la rotation des pilons. La difficulté dans la miniaturisation de 15 ce type d'appareil de broyage réside dans la conception d'un système permettant de mettre en rotation tous les axes broyeurs simultanément, avec un couple élevé et ceci dans un espace restreint. Le système proposé permet d'actionner tous les axes broyeurs de façon synchrone et de fait permet de positionner ces axes sur une surface réduite comme, par exemple un système ou 96 axes peuvent 20 permettre le broyage d'échantillons dans une microplaque standard, évitant potentiellement leur transfert dans une autre microplaque. En outre, le système proposé, du fait de sa capacité à faire pivoter les axes broyeurs est le seul à permettre de broyer efficacement, aussi bien, d'un seul grain par contenant que plusieurs grains, corne, par exemple, une quinzaine de grains de blé ou d'orge 25 dans chaque puits d'une microplaque. Description de l'invention : Les dispositifs décrits à titre d'exemple sont constitués des éléments suivants : Une pluralité d'axes broyeurs, pourvus sur une partie de leur longueur au moins, 30 d'un ou plusieurs filets, dont le pas est supérieur à leur diamètre. Le profil des filets des axes, doit correspondre à celui de leur écrou non pivotant respectif, qui provoque leur pivotement, par un déplacement alternatif le long des dits axes, dans tout ou partie de la zone filetée. Les axes broyeurs peuvent être formés de plusieurs matériaux, adaptés aux contraintes mécaniques qu'ils subissent. Ils sont préférentiellement formés à partir de matériaux dur. L'extrémité active des axes peut avoir différentes formes, pour optimiser l'efficacité du broyage en s'adaptant aux types d'échantillons et à la forme des contenants. Elle peut, par exemple, présenter des rainures pour faire éclater les grains ou des bossages qui s miment les molaires. Afin de limiter les frottements, il est avantageux de former le profil du/des filets des axes broyeurs afin de réaliser des écrous constitués d'au moins une bille par filet. Les billes sont captives dans des logements ménagés à la périphérie des alésages d'une pièce traversée par les axes. Ces logements sont fermés par une contre pièce comportant des alésages pour le passage des 10 dits axes. Des paliers peuvent équiper les alésages de cette contre pièce. Cet ensemble de deux pièces est le multi écrous. Dans le même but de limiter les frottements sur les axes broyeurs, leur extrémité captive est en appui sur la plaque d'appui par le truchement d'une bille en matériau dur. Une collerette sur les axes, ou une goupille traversant chaque axe, 15 prise entre la plaque d'appui et une contre pièce traversée par les axes, solidarisée avec la plaque d'appui, empêche les axes de sortir de leur logement et les guide. Des paliers peuvent équiper les alésages de cette contre pièce. Un déplacement alternatif du multi écrous, le long des axes broyeurs, les fait pivoter simultanément dans les deux sens. Ce mouvement peut avantageusement 20 être entrainé par un vérin à air comprimé, mais tout autre moyen de translation convient. L'ensemble plaque d'appui, axes broyeurs et multi écrous, constitue un module amovible, qui peut être facilement retiré de son support, afin de nettoyer et décontaminer les axes. Il est avantageux que l'actionneur du multi écrou ne soit 25 pas amovible, afin que le module amovible, plaque d'appui, axes broyeurs et multi écrous soit aisément manipulé. Le support du module amovible peut être fixe ou mobile. Dans ce premier exemple, le support est fixe et c'est la pluralité de contenants qui est mobile. Les contenants sont positionnés et maintenus sur un plateau porte contenants 30 d'échantillons. Une plaque couvercle des contenants, dotée de trous laissant passer les axes broyeurs, peut être mise en place. Le plateau porte contenants d'échantillons, est déplacé le long des axes broyeurs. Ce plateau porte contenants d'échantillons, est actionné par un dispositif, capable d'exercer une force appropriée sur l'extrémité active des axes broyeurs. Le dispositif qui actionne le mouvement du plateau peut avantageusement être constitué de un ou plusieurs parallélogrammes déformables, de type cric élévateur, mobilisés par un système contrôlable, comme par exemple un moteur électrique et une vis sans fin. Il peut être utile de guider le mouvement du cric élévateur et donc du plateau. Ce plateau porte contenants d'échantillons est positionné précisément, de façon non rigide, par le truchement de pièces flexibles, telles que ressorts ou tiges de caoutchouc, de type « silent block » lorsqu'il n'est pas contraint en appui. Il est muni d'un vibreur/agitateur, qui permet de ramener le broyat au fond des contenants, tout en faisant remonter les plus gros fragments en surface, pour qu'un broyage efficace soit effectué en plusieurs cycles de rapprochement et d'éloignement du dit plateau de l'extrémité active des axes broyeurs. Lorsqu'il est contraint en appui, le plateau porte contenant d'échantillons se place en appui solide et précis, sur des pions d'indexage et de butée. Les contenants d'échantillons peuvent être positionnés sur le plateau, par le truchement d'une forme qui épouse leur profil extérieur et renforce leur paroi. Le pivotement des axes et le mouvement du plateau sont coordonnés, pour effectuer efficacement et rapidement le broyage de différentes matrices, sans contamination croisée des échantillons. Par exemple, la rotation des axes est stoppée lorsque leur extrémité active est hors des contenants. La vitesse de mouvement du plateau peut varier en fonction du type et de la quantité de matrice à broyer, compte tenu de la vitesse de rotation des axes, ainsi que de l'étape du broyage en cours. Cette coordination peut être contrôlée par un automate programmable. Une variante du dispositif décrit précédemment comporte au moins un plateau porte contenants d'échantillons, semblable à celui qui est décrit supra, mais qui est fixe. Elle consiste à utiliser les mêmes axes broyeurs et le même multi écrous et à réaliser le broyage au moyen d'un seul actionneur, qui déplace au moins un ensemble amovible modifié, constitué aussi d'une plaque d'appui, d'axes broyeurs et d'un multi écrous. Cet actionneur peut être du même type que celui qui actionne le plateau porte contenants d'échantillons, décrit dans la version précédente. La plaque d'appui et la pièce solidaire de l'actionneur sont reliées par un ou plusieurs éléments élastiques, tels des ressorts. Lorsque des axes broyeurs rencontrent une résistance qui empêche le déplacement de l'ensemble amovible, résistance qui peut être causée par des graines ou les fonds des contenants, c'est le multi écrou qui se déplace le long des axes broyeurs et les fait pivoter. Les éléments élastiques qui relient la plaque d'appui et la pièce solidaire de l'actionneur, rappellent le multi écrous en sens inverse, dès que la résistance exercée sur des axes broyeurs cesse ou diminue, faisant ainsi pivoter les axes en sens inverse. On comprendra mieux l'invention à l'aide de la description faite ci- après à titre purement explicatif, de deux modes de réalisation de l'invention, en référence aux figures annexées : La figure 1 est une vue d'ensemble du dispositif selon la première description. La figure 2 illustre le module amovible, avec (1) les axes broyeurs, dotés d'au moins (4) un filet dont le pas est supérieur au diamètre, (2) le multi écrous comportant au moins une bille captive par filet, qui est déplacé le long des axes broyeurs, selon un mouvement alternatif, (3) la plaque d'appui fixe, avec les billes dures qui appuient sur le sommet des axes broyeurs, lesquels sont maintenus dans la plaque d'appui par une collerette. La figure 3 illustre le plateau porte contenants d'échantillons, option plateau mobile et module fixe, avec (5) le plateau proprement dit, (6) les supports flexibles, (7) les pions d'indexage, (8) le vibreur/agitateur, (9) l'ensemble des contenants, (10) la plaque couvercle, (11) l'accroche de la plaque couvercle, (12) la forme de renfort des parois des contenants, (13) l'élévateur de type cric élévateur, (14) le guidage en translation du cric élévateur. La figure 4 est une vue d'ensemble du dispositif selon la variante décrite supra. Un seul actionneur (15) met en mouvement un module amovible modifié, par rapport au dispositif selon la première description. Dans cette variante, une pièce (17) est solidarisée à l'actionneur unique. Des (16) ressorts s'intercalent entre la pièce solidaire de l'actionneur et (3) la plaque d'appui. Lorsqu'il n'y pas de résistance au déplacement de ce module amovible, sur l'extrémité des axes broyeurs, le (2) multi écrous ne se déplace pas le long des (1) axes broyeurs et ces derniers ne pivotent pas. Lorsque (1) des axes broyeurs rencontrent une résistance, c'est (2) le multi écrous qui va se déplacer, entrainant la compression ou l'étirement des (16) ressorts et en même temps le pivotement des axes broyeurs. Le dégagement du module amovible, de la résistance rencontrée par les axes broyeurs, permet aux ressorts de reprendre leur forme initiale et ainsi de faire déplacer le multi écrous en sens inverse, provoquant le pivotement des axes broyeurs en sens inverse. Le mouvement alternatif du module amovible, peut être exécuté plusieurs fois pour obtenir le résultat attendu. Le guidage éventuel du multi écrous et les éléments de support ne sont pas décrits pour les deux exemples de variantes de l'invention. Cela n'entrave pas sa compréhension par l'homme de l'art. Il n'y a pas de figure illustrant la partie active des axes broyeurs, ni de la forme de renfort des parois des contenants, car ces éléments sont adaptés principalement aux formes des contenants, qui sont multiples. io Les avantages de la présente invention, qui concerne le broyage d'échantillons par le pivotement de multiples axes rapprochés et l'application d'une force importante sur les échantillons, sont : - Broyer simultanément une pluralité de matrices diverses, telles que un grain de maïs, de soja ou de pois, un ou plusieurs grains de blé, d'orge 15 ou de colza, un fragment de feuille, par exemple, dans une micro plaque en matière plastique, sans la briser. La microplaque peut ainsi être directement placée sur un autre automate pour extraire les ADN, les ARN et les protéines des broyats, ou tout autre type d'analyses, sans transfert obligatoire de prélèvement de parties d'échantillons. 20 - Former un système simple et efficace, avec un nombre d'actionneurs réduit, soit l'un pour faire pivoter les axes broyeurs et l'autre pour appliquer une force sur chaque échantillon, par l'extrémité active des axes broyeurs. La variante décrite, ne comporte qu'un seul actionneur, pour le même résultat. 25 - Donner un broyat non compacté et non mélangé à d'autres corps, comme par exemple des billes. - Eliminer le risque de contamination croisée des échantillons, car il n'y a pas obligatoirement de transfert manuel à effectuer vers d'autres contenants, ce qui, de plus, fait gagner beaucoup de temps. 30 - Permettre une décontamination poussée des axes, dans la mesure où le module amovible peut être facilement mis en place et ôté du dispositif. - Permettre aussi des broyages en milieu liquide, ou à très basse température. Un tel dispositif s'avère particulièrement utile aux laboratoires qui effectuent de la sélection variétale végétale par marqueurs moléculaires et qui contrôlent la pureté des semences. REVENDICATIONS1. Dispositif pour le broyage simultané d'une pluralité d'échantillons, dans des contenants faiblement espacés et de section pouvant être inférieure à un centimètre carré, caractérisé en ce qu'il comporte une pluralité d'axes broyeurs pivotants, dotés au moins d'un filet, dont le pas est supérieur au diamètre des axes broyeurs, qui sont mis en rotation par le mouvement alternatif de leur écrou respectif non pivotant le long des axes broyeurs, ces derniers exerçant une force importante sur les échantillons. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le/les filets des axes broyeurs ont un profil qui permet de former les écrous avec au moins une bille captive par filet. 3. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'appui de la plaque d'appui sur chaque axe broyeur se fait par le truchement d'une bille et la tenue des axes sur la plaque d'appui est réalisée par une collerette de l'axe broyeur ou par une goupille traversant l'axe et une contre pièce solidarisée à la plaque d'appui. 4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le module constitué principalement de la plaque d'appui, des axes broyeurs et du multi écrous est amovible. 5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le plateau porte contenants d'échantillons est doté d'un vibreur/agitateur. 6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la vitesse de variation de la distance entre le plateau porte contenants d'échantillons et l'extrémité active des axes broyeurs, d'une part et le pivotement des dits axes, d'autre part, sont coordonnés. 7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les axes broyeurs sont formés d'une ou plusieurs sortes de matériaux durs et leur extrémité active comporte des rainures ou des bossages. 8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le plateau porte contenants d'échantillons ou le module constitué de la plaque d'appui, des axes broyeurs et du multi écrous sont déplacés par un système de type cric élévateur à vis, à parallélogrammes déformables. 9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la rotation des axes broyeurs et l'appui des axes broyeurs sur les échantillons sont réalisés par deux actionneurs au plus. 10. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le plateau porte contenant d'échantillons est doté sur la face qui supporte les contenants, d'une forme adaptée au profil externe des parois des contenants des échantillons.