Brevet FR2979909A1 — publié le 20130315

Procédé de traitement de composés aromatiques polluants La présente invention concerne le traitement de composés aromatiques polluants, en particulier d'hydrocarbures aromatiques polycycliques et d'alkylphénols, dans des stations d'épuration d'effluents d'origine urbaine ou industrielle. Les effets secondaires écologiques et sanitaires néfastes dus à la production, l'utilisation et l'élimination de nombreux composés chimiques, qui sont généralement utilisés pour améliorer la qualité de vie humaine et les activités économiques, sont désormais sources d'une inquiétude croissante. En effet, des composés chimiques ménagers ou pharmaceutiques sont par exemple libérés dans l'environnement après passage dans des procédés de traitement des eaux qui ne sont pas conçus pour les éliminer. Parmi ces substances, qui sont spécifiquement visées par la Directive Cadre Eau de l'Union Européenne (Directive 20001601C du Parlement Européen et du Conseil), on trouve en particulier les hydrocarbures aromatiques polycycliques, ou HAPs, et les alkylphénols. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont des polluants ubiquistes dont la présence dans les milieux naturels est liée à la combustion incomplète des ressources en carbone fossile : industries pétrochimiques, transports, chauffage... Les HAPs sont formés par condensation d'au moins deux noyaux aromatiques. Ils sont hydrophobes, ce qui limite leur contact avec les microorganismes autochtones, et empêche leur transformation. Ces composés sont donc des éléments persistants et récalcitrants à la dégradation. Cette persistance est d'autant plus problématique que les HAPs possèdent un potentiel génotoxique (Bispo et al. (1999) Organic Geochemistry 30:947-952). C'est pourquoi l'Agence Américaine de la Protection Environnementale a référencé seize HAPs, parmi lesquels l'anthracène, comme polluants à éliminer prioritairement des milieux naturels. L'anthracène est même plus particulièrement désigné par la Directive Cadre Eau comme substance dangereuse prioritaire, c'est-à-dire une substance pour laquelle les mesures à prendre doivent permettre d'arrêter ou de supprimer progressivement les rejets, les émissions et les pertes. Les composés alkylphénoliques, ou alkylphénols, proviennent de la dégradation partielle de détergents industriels et domestiques. Ils sont utilisés dans des procédés industriels, en particulier la production de résine, et entrent dans la composition de certains pesticides. Les alkylphénols majoritairement retrouvés dans les milieux naturels sont le nonylphénol et l'octylphénol, du fait de l'utilisation intensive d'éthoxylates de nonylphénol et d'éthoxylates d'octylphénol, ces éthoxylates étant des produits aux propriétés dispersantes, émulsifiantes et mouillantes, qui les rendent utiles, en combinaison avec d'autres produits au sein de formulations commerciales, dans une très vaste gamme d'applications dans différents secteurs industriels. Les alkylphénols sont des perturbateurs du système endocrinien, du fait de leur action comme hormones sur les récepteurs de certaines glandes endocrines. L'octylphénol et le nonylphénol sont en particulier connus pour présenter un caractère oestrogénique élevé. En effet, il a été montré qu'une population mâle de truites arc-en-ciel était féminisée lorsqu'elle était soumise à un effluent d'eaux usées urbaines présentant des concentrations élevées en alkylphénols. C'est pourquoi l'octylphénol a été désigné par la Directive Cadre Eau comme substance prioritaire et le nonylphénol comme substance dangereuse prioritaire. Il existe donc un besoin important de procédé de traitement d'effluents, utilisable en station d'épuration, permettant d'éliminer efficacement les HAPs, en particulier l'anthracène, et les alkylphénols, en particulier l'octylphénol et le nonylphénol, afin d'atteindre les objectifs visés par la Directive Cadre Eau. Les laccases (EC 1.10.3.2. Benzenediol: oxygen oxidoreductase) sont des oxydases bleues à cuivre qui constituent un système enzymatique principalement fongique très polymorphe, produites à la fois par les ascomycètes et les basidiomycètes : différentes isoformes de laccases peuvent en effet être produites selon les conditions environnementales et les espèces fongiques considérées (Baldrian (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30:215-242). Elles ont fait l'objet de nombreuses études qui ont montré leur capacité à oxyder des molécules aromatiques et phénoliques polluantes telles que les HAPs et les alkylphénols (Mester et Tien (2000) International Biodeterioration & Biodegradation 46:51-59; Torres et al. (2003) Applied Catalysis B. Environmental 46:1- 15). Néanmoins, l'emploi des laccases purifiées ou extraites n'est pas adapté à l'épuration d'effluents urbains ou industriels étant donné le volume important des effluents à traiter et donc les rendements qui doivent être atteints. La présente invention résulte de la découverte inattendue, par les inventeurs, que l'utilisation du champignon Pycnoporus cinnabarinus, un basidiomycète de la famille des champignons de la pourriture blanche, pour traiter des effluents et/ou des boues activées d'origine urbaine et/ou industrielle, permettait de transformer de manière efficace des hydrocarbures aromatiques polycycliques et des alkylphénols, en particulier l'anthracène et le nonylphénol, alors que d'autres champignons de cette même famille, exprimant également des laccases, tels que Marasmius quercophilus, ne le permettait pas. Ces résultats suggèrent donc que c'est bien la capacité de P. cinnabarinus à se développer dans un effluent associée à l'expression d'activités laccases par ce champignon dans ces conditions, et non la simple expression d'activités laccases par P. cinnabarinus, qui pourrait expliquer la dégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques et des alkylphénols par ce champignon dans des effluents urbains. La présente invention concerne donc un procédé de transformation d'au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique et/ou d'au moins un alkylphénol dans des effluents et/ou des boues activées d'origine urbaine et/ou industrielle comprenant une étape de traitement par le champignon Pycnoporus cinnabarinus desdits effluents et/ou desdites boues activées. Hydrocarbures polycycliques aromatiques et alkylphénols Dans le contexte de l'invention, l'expression "hydrocarbure polycyclique aromatique" ou "HAP" fait référence à une sous-famille des hydrocarbures aromatiques, la structure comprend au moins deux cycles aromatiques condensés. Selon le nombre de cycles, ils sont classés en HAP légers (jusqu'à trois cycles) ou lourds (au-delà de trois cycles). Ils peuvent également être alkyles. Les hydrocarbures polycycliques aromatiques sont bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier : - l'anthracène de formule (I) suivante : (I), - le chrysène de formule (II) suivante : - le corannulène de formule (III) suivante : - le naphtalène de formule (IV) suivante : - le phénanthrène de formule (V) suivante : (V), (VIII), (X), - le tétracène de formule (IX) suivante : 5 - le pentacène de formule (X) suivante : (XI), - le pyrène de formule (XI) suivante : (XII), (XIV), (X I II), (XV), 10 - le fluorène de formule (XV) suivante : - le tryphénylène de formule (VI) suivante : - le benzo[a]pyrène de formule (VII) suivante : - le coronène de formule (VIII) suivante : (VII), - l'ovalène de formule (XII) suivante : - l'acénaphtène de formule (XIII) suivante : - l'acénapthylène de formule (XIV) suivante : - le fluoranthène de formule (XVI) suivante : - le benzo[a]anthracène de formule (XVII) suivante : (XVII), (XVI), (XVI I I), - le benzo[b]fluoranthène de formule (XVIII) suivante : - le benzo[k]fluoranthène de formule (XIX) suivante : (XIX), - le dibenzo[a,h]anthracène de formule (XX) suivante : (XX), - l'indéno[c,d]pyrène de formule (XXI) suivante : - le benzo[g,h,i]pérylène de formule (XXII) suivante : - le benzo[e]pyrène de formule (XXIII) suivante : (XXI), (XXII), et (XXIII). De préférence, le au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique selon l'invention est sélectionné parmi le naphtalène, l'acénapthène, l'acénaphtylène, le phénanthrène, l'anthracène, le fluoranthène, le pyrène, le benzo[a]anthracène, le chrysène, le benzo[b]fluoranthène, le benzo[k]fluoranthène, le benzo[a]pyrène, l'indeno(1,2,3-cd)pyrène et le dibenzo(a,h)anthracène. De manière particulièrement préférée, le au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique selon l'invention est l'anthracène. Dans le contexte de l'invention, le terme "alkylphénol" fait référence à un composé organique obtenu par l'alkylation de phénols. Les alkylphénols sont bien connus de l'homme du métier et comprennent par exemple le propylphénol, l'amylphénol, l'heptylphénol, l'octylphénol, le nonylphénol et le dodécylphénol. De préférence, le au moins un alkylphénol est l'octylphénol ou le nonylphénol. De manière davantage préférée, le au moins un alkylphénol est le nonylphénol. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l'invention est un procédé de transformation d'au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique et d'au moins un alkylphénol, le au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique étant de préférence l'anthracène et le au moins un alkylphénol étant de préférence le nonylphénol. L'octyphénol a été classé comme substance dangereuse par la Directive Cadre Eau. L'anthracène et le nonylphénol ont été classés comme substances dangereuses prioritaires par la Directive Cadre Eau. Pycnoporus cinnabarinus Dans le contexte de l'invention, le terme "Pycnoporus cinnabarinus" désigne un champignon basidiomycète de la famille des Coriolaceae, aussi appelé polypore rouge cinabre ou tramète rouge cinabre. Il fait partie des champignons de la pourriture blanche, appartient à la division des Basidiomycota, à la classe des Homobasidiomycètes, à l'ordre des Polyporales et à la famille des Coriolaceae. Il est caractérisé par un chapeau de 3 à 10 cm de diamètre et 1 à 2 cm d'épaisseur. Sa surface, de couleur orange-rouge à rouge pâle, est typiquement bosselée, marquée par un ou deux sillons très légers en relief. Il ne présente pas de pied. Ses spores, ellipsoïdes-allongées, sont blanches. Procédé de transformation dans des effluents et/ou des boues activées d'origine urbaine et/ou industrielle Les inventeurs ont montré de manière surprenante que l'utilisation spécifique de Pycnoporus cinnabarinus permettait de transformer les hydrocarbures polycycliques aromatiques et/ou les alkylphénols présents dans les effluents et/ou les boues activées, en composés moins toxiques. Par "effluent" ou "eaux usées", on entend ici tout produit de déchet à l'état liquide ou gazeux sortant d'une installation, telle qu'une installation industrielle ou municipale. Par "boues activées", on entend ici les boues issues d'un procédé d'épuration favorisant, via une aération par brassage, la dégradation de la matière organique en suspension ou dissoute par mise en contact des eaux usées avec une liqueur riche en bactéries. Par "liqueur", on entend ici un mélange d'eaux usées à épurer et de microorganismes en suspension assurant l'épuration. Selon la présente invention, les "effluents et/ou boues activées d'origine urbaine et/ou industrielle" se réfèrent aux effluents et/ou boues activées issus des industries agroalimentaires, des papeteries, des industries chimiques, pharmaceutiques et pétrochimiques ainsi que les effluents et/ou boues activées urbains et mixtes industriels/urbains. De manière préférée, les effluents et/ou boues activées selon l'invention sont issus des industries chimiques, pharmaceutiques ou pétrochimiques ou sont des effluents et/ou boues activées urbains ou mixtes industriels/urbains. L'étape de traitement selon l'invention peut être réalisée dans n'importe quelle installation mise en oeuvre pour le traitement des effluents connue de l'homme du métier, pourvu que cette étape soit effectuée en condition aérobie. Sans être liés par la théorie, les inventeurs considèrent que l'activité de transformation obtenue avec P. cinnabarinus est principalement due à la production et la sécrétion de laccases par ces champignons. Comme il est bien connu de l'homme du métier, un grand nombre de basidiomycètes sont capables d'exprimer des laccases, tels que Trametes versicolor (Majcherczyk et al. (1998) Enzyme and Microbial Technology 22:335-341), Marasmius quercophilus (Farnet et al. (2009) Geoderma 149:267-271), Pleurotus ostreatus (Pozdnyakova et al. (2006) Enzyme and Microbial Technology 39:1242-1249) et Bjerkandera (Soares et al. (2004) Applied Microbiology Biotechnology 66:719-725). Néanmoins, de manière surprenante, des deux souches testées par les inventeurs, Marasmius quercophilus et P. cinnabarinus, seul P. cinnabarinus s'est révélé capable de transformer directement les hydrocarbures aromatiques polycycliques et les alkylphénols dans des effluents et/ou des boues activées, sans extraction ou purification préalable de ses laccases. Par ailleurs, alors que l'état de la technique antérieur suggérait que les co-cultures permettaient d'exacerber la production de laccases par ses champignons producteurs (Velasquez-Cedeno et al. (2008) Bioressource Technology 99:6966-6973), les inventeurs ont montré de manière surprenante que la transformation des hydrocarbures aromatiques polycycliques et des alkylphénols était obtenue de manière optimale en utilisant uniquement le champignon Pycnoporus cinnabarinus, sans intervention d'un autre microorganisme. Par "co-culture", on entend ici la culture simultanée de P. cinnabarinus et d'un autre micro-organisme, en particulier d'un autre champignon ou d'une bactérie. Par conséquent, dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le champignon P. cinnabarinus n'est pas ajouté sous forme de co-culture. En particulier, P. cinnabarinus n'est pas ajouté sous forme de co-culture avec un ascomycète, tel que Pichia fermentans, ou avec une bactérie telle que Pseudomonas aeruginosa. Afin d'obtenir des résultats optimaux, les inventeurs ont montré qu'il pouvait être nécessaire d'ensemencer à plusieurs reprises P. cinnabarinus dans les effluents et/ou les boues activées à traiter. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, P. cinnabarinus est ensemencé au moins une fois dans les effluents et/ou boues activées lors de l'étape de traitement. De préférence, P. cinnabarinus est ensemencé trois fois dans les effluents et/ou boues activées lors d'une étape de traitement de 15 jours. Etape d'amplification Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé de transformation selon l'invention comprend une étape préalable d'amplification de P. cinnabarinus sur un substrat, présent de préférence dans un milieu de culture, dans un bioréacteur de fermentation. Par "étape d'amplification", on entend ici une étape permettant aux champignons inoculés de se multiplier de telle sorte que les mycéliums se trouvent à un stade de développement approprié pour produire des activités laccases optimales au moment où ils sont utilisés dans l'étape de traitement. En effet, les inventeurs ont montré que l'utilisation de précultures de P. cinnabarinus ayant fait l'objet d'une étape d'amplification présentaient une biomasse fongique associée à des activités laccases supérieures permettant un meilleur maintien de l'expression de ces enzymes lors de l'étape de traitement des effluents et/ou des boues activées. Le milieu de culture de cette étape d'amplification est connu de l'homme du métier et dépend des champignons à amplifier. Typiquement, le milieu de culture de cette étape d'amplification est un milieu de culture à base d'extrait de malt. Il contient en particulier un substrat approprié pour la croissance de ces champignons. Ce substrat correspond en particulier à une source carbonée. De manière préférée, ce substrat est le maltose. On entend ici par "bioréacteur de fermentation" ou "fermenteur" un réacteur biologique permettant la culture en masse des champignons, dont le volume peut aller de quelque litres ou dizaines de litres à plusieurs centaines ou dizaines de milliers de litres, et dont la géométrie (hauteur, diamètre, agitation, sondes de régulation) est adaptée aux performances attendues. Les bioréacteurs selon l'invention comprennent les bioréacteurs en mode batch, en mode fed-batch (aussi appelé semi-continu) et en mode de culture continue. Le terme "batch" se réfère à un système de culture en milieu non renouvelé ou culture discontinue. Le terme "fed-batch" ou "semi-continu" se réfère à un système de culture assurant l'apport régulier ou exponentiel des substrats en fonction des besoins du ou des microorganismes cultivés grâce à une alimentation du milieu de culture. Le terme "culture continue" se réfère à un système de culture assurant l'alimentation de la cuve selon un débit F, et le pompage simultané du contenu du bioréacteur selon un même débit F, le volume du bioréacteur étant maintenu constant. De manière préférée, l'étape d'amplification est réalisée dans un bioréacteur en mode semi-continu. Le bioréacteur selon l'invention doit permettre d'assurer un environnement qui permet le contrôle d'une croissance et d'une production optimale des champignons. Le bioréacteur selon l'invention doit permettre d'assurer un environnement qui permet le contrôle d'une croissance et d'une production optimale des microorganismes. Selon un mode de réalisation préféré, le bioréacteur selon l'invention a un volume utile compris entre 100 et 2000 L. Préférablement, le bioréacteur est composé d'un matériau inerte, biocompatible et résistant à toute agression produite par les microorganismes. De manière préférée, le bioréacteur selon l'invention est composé d'un matériau plastique, plus particulièrement d'un matériau PEHD (polyéthylène haute densité). Selon un mode de réalisation préférée, le bioréacteur est équipé d'un système d'aération. En particulier, le bioréacteur selon l'invention peut être équipé d'un surpresseur et de diffuseurs permettant également le brassage et l'homogénéisation du milieu de culture. Selon un autre mode de réalisation préféré, le bioréacteur est équipé d'un système de chauffage. Selon un autre mode de réalisation préféré, le bioréacteur est équipé d'un système d'injection dans le bassin aéré. En particulier, le système d'injection est une pompe de transfert avec une sonde de niveau bas. Selon un autre mode de réalisation préféré, le bioréacteur est équipé d'un système d'injection de substrat. En particulier, le système d'injection est une pompe de transfert. Selon un autre mode de réalisation préféré, le bioréacteur est équipé d'un système de vidange. En particulier, le système de vidange du bioréacteur selon l'invention est un piquage en partie basse. Selon un autre mode de réalisation préféré, le bioréacteur est équipé d'un coffret électrique permettant la marche des différents équipements. Selon un autre mode de réalisation préféré, le bioréacteur est relié physiquement avec le bassin dans lequel a lieu l'étape de traitement. Typiquement, le bioréacteur selon l'invention est caractérisé par le fait qu'il possède un volume de 100 à 2000 L, il est composé d'un matériau plastique, plus particulièrement d'un matériau PEHD, et comprend une trappe de visite, un piquage en partie basse, un système d'aération, une pompe de transfert avec sonde de niveau bas, une pompe d'injection de substrat, un système de chauffage et un coffret électrique. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'étape d'amplification est réalisée pendant 1 à 10 jours, de préférence entre 3 et 9 jours, de manière davantage préférée pendant 8 jours. Les inventeurs ont en effet montré qu'utiliser un mycélium de P. cinnabarinus correspondant à un stade de développement de 8 jours de culture permettait d'obtenir les meilleurs résultats. L'étape d'amplification est de préférence réalisée à une température comprise entre 20 et 30°C, de manière particulièrement préférée à 25°C. Typiquement, le procédé de transformation d'au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique et/ou d'au moins un alkylphénol selon l'invention comprend les étapes consistant à : a) amplifier préalablement P. cinnabarinus sur un substrat, de préférence de l'extrait de malt ou du dextrose, dans un bioréacteur de fermentation, typiquement un bioréacteur ayant un volume de 100 L, comprenant de préférence une cuve en inox 316L, permettant en particulier la stérilisation du milieu de culture ou d'amplification, une sonde de température, une sonde pH et redox, un système d'agitation, des contre pâles, un système d'inoculation des microorganismes, un système d'alimentation en matières premières ou en tout produit en mode batch, fed batch ou continu pendant la fermentation, un système d'évacuation, un système de régulation automatique des paramètres de fermentation tels que la température, le pH, le potentiel redox, l'acidité, la basicité, le niveau d'oxygène dissous, le niveau d'alimentation et le niveau d'agitation, pendant une période de, de préférence 2 à 4 jours, typiquement à une température de 25-35°C, et b) traiter par P. cinnabarinus les effluents et/ou boues activées à traiter, P. cinnabarinus étant ensemencé au moins une fois, typiquement une à deux fois à une concentration d'au moins 1.102 à 1.103 unités formant colonies (UCF)/mL dans les effluents et/ou boues activées à traiter. La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci-dessous. Description des figures La Figure 1 présente un graphique représentant l'activité laccase (en U.mL-1) de Pycnoporus cinnabarinus sur milieu cristomalt liquide en culture pure (barres blanches) et en co-culture avec Pseudomonas aeruginosa (barres hachurées) et Pichia fermentans (barres pointillées) après 1, 3, 6, 8 et 10 jours de culture. Les densités optiques des suspensions utilisées sont de 0,1. Le test non-parametrique de Mann-Whitney a été utilisé pour séparer significativement les moyennes (P La Figure 2 présente un graphique représentant l'activité laccase (en U.mL-1) de Pycnoporus cinnabarinus en présence (barres hachurées) ou en absence (barres blanches) de Pseudomonas aeruginosa en culture liquide sur milieu cristomalt après 6, 8, 11 et 13 jours de culture. La densité optique de la suspension de Pseudomonas aeruginosa est de 0,5. La Figure 3 présente un graphique représentant l'activité laccase (en U.mL-1) de Pycnoporus cinnabarinus en culture dans un effluent urbain à pH 7-8 en culture pure (barres blanches) et en co-culture avec Pseudomonas aeruginosa (barres hachurées) et Pichia fermentans (barres pointillées) après 2, 6, 8, 10, 13 et 15 jours de culture. La Figure 4 présente un graphique représentant l'activité laccase (en U.mL-1) de Pycnoporus cinnabarinus au sein d'un effluent urbain ensemencé avec des pré-cultures de 10 jours, en présence (barres pointillées) et en absence (barres blanches) de Pichia fermentans et avec 50 mg d'anthracène après 4, 6, 9, 11, 13 et 15 jours de culture. La Figure 5 présente un graphique représentant l'activité laccase (en U.mL-1) de Pycnoporus cinnabarinus en culture dans un effluent urbain à pH 6-7 en culture pure (barres blanches) et en co-culture avec et Pichia fermentans (barres pointillées) avec 40 mg d'octylphénol après 0, 2, 4, 8, 10, 14, 16 et 18 jours de culture. La Figure 6 présente un schéma de la mini-station des exemples 5, 6 et 7. La Figure 7 est un graphique représentant l'évolution de la demande chimique en oxygène (DCO, ^, en mg/L) et de l'ammonium (NH4+, -, en mg/L) au cours du temps 15 dans l'effluent d'appoint du pilote de l'exemple 5. La Figure 8 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH (à) et de la teneur en oxygène (02, -, en mg/L) au cours du temps dans le bassin anoxie du pilote de l'exemple 5. 20 La Figure 9 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH (à), de la teneur en oxygène (02, -, en mg/L) et des matières en suspension (MES, -, en g/L) au cours du temps dans le bassin aérobie du pilote de l'exemple 5. 25 La Figure 10 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH (à), de l'ammonium (NH4+, -, en mg/L), des matières en suspension (MES, -, en g/L) et de la demande chimique en oxygène (DCO, x, en mg/L) au cours du temps dans le rejet du pilote de l'exemple 5. 30 La Figure 11 est un graphique représentant l'évolution de la quantité de nonylphénol (en pg/L) au cours du temps dans le rejet (^), les boues (à) du pilote de l'exemple 3 et le nonylphénol introduit (-). La Figure 12 est un graphique représentant l'évolution de la demande chimique en 35 oxygène (DCO, ^, en mg/L) et de l'ammonium (NH4+, -, en mg/L) au cours du temps dans l'effluent d'appoint du pilote de l'exemple 6. 10 La Figure 13 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH (À) et de la teneur en oxygène (02, -, en mg/L) au cours du temps dans le bassin anoxie du pilote de l'exemple 6. La Figure 14 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH (À), de la teneur en oxygène (02, -, en mg/L) et des matières en suspension (MES, -, en g/L) au cours du temps dans le bassin aérobie du pilote de l'exemple 6. La Figure 15 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH ( À), de l'ammonium (NH4+, -, en mg/L), des matières en suspension (MES, -, en g/L) et de la demande chimique en oxygène (DCO, x, en mg/L) au cours du temps dans le rejet du pilote de l'exemple 6. La Figure 16 est un graphique représentant l'évolution de la quantité d'anthracène (en pg/L) au cours du temps dans le rejet (^), les boues ( À) du pilote de l'exemple 6 et l'anthracène introduit (-). La Figure 17 est un graphique représentant l'évolution de la demande chimique en oxygène (DCO, ^, en mg/L) et de l'ammonium (NH4+, -, en mg/L) au cours du temps dans l'effluent d'appoint du pilote de l'exemple 7. La Figure 18 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH (À) et de la teneur en oxygène (02, -, en mg/L) au cours du temps dans le bassin anoxie du pilote de l'exemple 7. La Figure 19 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH (À), de la teneur en oxygène (02, -, en mg/L) et des matières en suspension (MES, -, en g/L) au cours du temps dans le bassin aérobie du pilote de l'exemple 7. La Figure 20 est un graphique représentant l'évolution de la température (^, en °C), du pH ( À), de l'ammonium (NH4+, -, en mg/L), des matières en suspension (MES, -, en g/L) et de la demande chimique en oxygène (DCO, x, en mg/L) au cours du temps dans le rejet du pilote de l'exemple 7.35 La Figure 21 est un graphique représentant l'évolution de la quantité de nonylphénol (en pg/L) au cours du temps dans le rejet (^), les boues ( À) du pilote de l'exemple 7 et le nonylphénol introduit (-) ainsi que l'évolution de la quantité d'anthracène (en pg/L) au cours du temps dans le rejet (-), les boues (x) du pilote de l'exemple 7 et l'anthracène introduit (+). Exemples Exemple 1 L'exemple 1 ci-dessous montre la capacité de Pycnoporus cinnabarinus, cultivé seul, à exprimer des activités laccases lorsqu'il est cultivé dans des échantillons d'effluents urbains. Matériel et méthodes Microorganismes La souche de Pseudomonas aeruginosa a été isolée par l'équipe d'Ecologie Microbienne de l'IMEP (UMR CNRS 6116) par filtration à partir d'un échantillon d'eau prélevée dans le Canal de Provence (Bouches du Rhône) sur milieu cétrimide (Biomérieux, France). Les souches de Pichia fermentans et de Pycnoporus cinnabarinus proviennent de la collection de Naturatech. Pré-cultures en milieu liquide. Les pré-cultures de Pycnoporus cinnabarinus ont été réalisées en fiole de 250 mL contenant 50 mL de cristomalt à 20 g/L et du CuSO4 à 5 mg/L. 5 carrés de 0,5 cm de côté de gélose ont été déposés dans les fioles puis celles-ci ont été incubées à 25°C pendant 4 jours. Les pré-cultures de Pichia fermentans ont été réalisées, en tube à essai, dans 10 mL de milieu d'extrait de malt à 20 g/L. Les pré-cultures de Pseudomonas aeruginosa ont été réalisées, en tube à essai, dans 10 mL de milieu Tryptone à 20 g/L. L'incubation a été réalisée à 37°C pendant 1 jour. Induction des activités laccases de P. cinnabarinus avec ou sans co-culture avec P. aeruginosa et P. fermentans sur milieu de culture. Sur milieu solide. Un carré de 1 cm de côté de Pycnoporus cinnabarinus a été déposé sur milieu cristomalt à 20 g/L et agar 15 g/L en boite de Pétri. Les champignons ont été incubés à 30°C durant 4 jours pour obtenir une colonisation d'environ 1/3 de la boite. Une goutte de pré-culture de Pichia fermentans ou de Pseudomonas aeruginosa a ensuite été déposée sur la gélose à 2 mm du champignon et les boites ont été incubées à 30°C pendant 1 jour. La présence d'activités laccases exprimées par P. cinnabarinus, induites par P. fermentans ou P. aeruginosa, a été mise en évidence par le dépôt d'une goutte d'une solution de syringaldazine (N,N'-bis 3,5 diméthoxy-4-hydroxybenzylidène hydrazine) dans le méthanol (1%) à l'interface champignon/microorganisme. La syringaldazine est en effet oxydée en quinone, de couleur rose, en présence de laccases. La présence d'activités laccases produites par P. cinnabarinus, sans induction par Pichia fermentans ou Pseudomonas aeruginosa, a été mise en évidence par dépôt de la même solution sur une zone où seul le mycélium était présent. Sur milieu liquide. Les cultures de Pycnoporus cinnabarinus ont été réalisées, en fiole de 1 L, dans 200 mL de milieu cristomalt à 20 g/L et du cuivre à 5 mg/L. Neuf fioles ont été ensemencées avec un morceau de mycélium des pré-cultures et ont été placées sous agitation à 200 rpm à 25°C pendant quatre jours. L'activité laccase a alors été mesurée. 500 1.11_ du milieu de culture complétés par 500 1.11_ de tampon acétate 0,1 M pH 4 auxquels ont été ajoutés 15 1.11_ de syringaldazine ont été utilisés pour doser l'activité laccase. Pour l'étude de l'induction des activités laccases avec co-inoculation, trois fioles ont été ensuite ensemencées avec une culture de Pichia fermentans dont la densité optique a été standardisée à 0,3 (3 mL pour chaque fiole) et la même opération a été réalisée avec une culture de Pseudomonas aeruginosa, les trois fioles restantes servant de témoins. Les 9 fioles ont été incubées sous agitation à 200 rpm à 25°C. Tous les deux jours, l'activité laccase a été mesurée comme décrit ci-dessus et des dénombrements de Pseudomonas aeruginosa et Pichia fermentans ont été respectivement effectués sur gélose au Cétrimide et sur gélose Sabouraud additionnée de chloramphénicol. Induction des activités laccases de P. cinnabarinus avec ou sans co-inoculation avec Pseudomonas aeruginosa et Pichia fermentans sur effluent urbain. Tests sans induction préalable des pré-cultures. Dans des fioles de 1 L, 150 mL d'effluent urbain additionnés d'anthracène à 250 mg/L ou d'octylphénol à 200 mg/L, ont été ensemencés avec une pré-culture de 50 mL de P. cinnabarinus. Neuf fioles ont été incubées sous agitation à 200 rpm pendant 4 jours à 25°C et l'activité laccase a été mesurée comme décrit ci-dessus. Après 4 jours d'incubation, trois fioles ont été ensemencées avec des pré-cultures de P. fermentans et trois autres avec celles de P. aeruginosa. Les fioles ont été à nouveau incubées sous agitation à 200 rpm à 25°C. Des dénombrements de P. fermentans et P. aeruginosa ont été effectués comme décrit ci-dessus sur milieu cétrimide ou Sabouraud additionné de chloramphénicol. Tests avec induction des pré-cultures par de l'anthracène. Le même protocole a été mis en oeuvre en utilisant des pré-cultures de P. cinnabarinus auxquelles de l'anthracène à 200 mg/L a été additionné. Analyses statistiques. Le test non-paramétrique de Mann-Whitney a été utilisé pour séparer significativement les moyennes des activités laccases (P Résultats Induction de la production d'activités laccases par Pycnoporus cinnabarinus en présence ou en absence de Pichia fermentans et Pseudomonas aeruginosa en milieu de culture. Induction de l'activité laccase sur milieu solide. La capacité de synthèse de laccases par P. cinnabarinus, en présence ou absence de Pichia fermentans et Pseudomonas aeruginosa a été étudiée sur gélose cristomalt. Une coloration n'a été observée qu'au niveau de l'interface des colonies microorganismes unicellulaires/champignon. Sur milieu solide, la production d'activités laccases par P. cinnabarinus semble donc être améliorée par la présence de Pichia fermentans et Pseudomonas aeruginosa. Induction de l'activité laccase sur milieu liquide. Des cultures en milieu liquide à base de cristomalt ont été réalisées sous agitation, de manière à permettre une croissance optimale du champignon et favoriser la synthèse d'enzymes. Quatre jours après la culture du champignon, des suspensions de Pichia fermentans et Pseudomonas aeruginosa ont été ajoutées. Les résultats des dénombrements effectués tous les 2 jours pendant 10 jours ont montré que, très rapidement, Pseudomonas aeruginosa disparaissait du milieu tandis que Pichia fermentans persistait. Simultanément à cette persistance, une augmentation de l'activité laccase a été observée dans les fioles de co-culture avec Pichia fermentans (activité de 0,68 U. m1-1 à 10 j de culture). Cette augmentation est significative (Figure 1) par rapport aux activités observées dans les cultures de P. cinnabarinus seul (activité de 0,16 U. m1-1 à 10 j de culture). En augmentant la densité optique des suspensions de Pseudomonas aeruginosa utilisées, les inventeurs ont pu obtenir une persistance de la bactérie pendant quelques jours et observer une très légère augmentation de l'activité laccase (Figure 2). Cette augmentation n'était cependant pas significative et les résultats obtenus tendent à montrer que la présence de Pseudomonas aeruginosa n'est pas déterminante pour induire l'expression d'activités laccases par P. cinnabarinus. Induction de la production de laccase par Pycnoporus cinnabarinus en présence ou en absence de Pichia fermentans et Pseudomonas aeruginosa dans un effluent urbain contenant de l'anthracène. Pycnoporus cinnabarinus a tout d'abord été co-cultivé avec Pseudomonas aeruginosa et Pichia fermentans sur l'effluent urbain, en fiole, à un pH 7-8, qui correspond au pH de l'effluent mais n'est pas une valeur optimale pour le développement des champignons. Les activités laccases ont été détectées jusqu'à 10 jours de culture. Les différences obtenues en fonction des conditions expérimentales n'étaient pas significatives. Les activités laccases étaient relativement peu élevées dans ces conditions et il n'a pas été observé d'augmentation de cette activité lorsque le champignon était incubé en co-culture avec Pichia fermentans et Pseudomonas aeruginosa (effluent à pH 7-8) (Figure 3). D'autres cultures ont été réalisées en fiole en acidifiant l'effluent urbain à un pH d'environ 4-5, pH plus adapté à la croissance des champignons. Après 6 jours de cultures, aucune activité laccase significative n'a été détectée. Pour essayer de favoriser la production de laccases, une pré-culture de 50 mL présentant une activité laccase élevée a été ajoutée dans chaque fiole. Une activité a ensuite été détectée dans certaines fioles mais en quantité trop faible pour être mesurée. Cette activité a donc été appréciée en fonction de l'intensité de la coloration rose due à la quinone (Tableau 1). Tableau 1 : Activité laccase exprimée par P. cinnabarinus en présence de P. aeruginosa ou P. fermentans ou en culture seule dans un effluent urbain à pH 4-5 en présence de 50 mg d'anthracène. Temps d'incubation P. cinnabarinus P. cinnabarinus P. cinnabarinus 4j 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ajout de - + Pichia fermentans + Pseudomonas aeruginosa 2j 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 j 0 2+ 0 2+ 0 0 0 0 2+ 6j 0 2+ 0 2+ 0 + 0 0 2+ 9j 0 - 0 3+ + + 2+ 0 2+ 11j 2+ 5+ 2+ + 3+ - 3+ 16j 0 - 0 + - 0 - 0 0 L'activité laccase a été appréciée en fonction de l'intensité de la coloration rose et du temps d'apparition (notation de 1 à 5) et les '-' correspondent aux activités qui n'ont été décelées que le lendemain. Afin de favoriser l'activité laccase de P. cinnabarinus dans les cultures en fiole sur effluents urbains, les inventeurs ont mis en oeuvre deux stratégies: i) induire des activités laccases dans les pré-cultures par addition de l'anthracène, ii) utiliser une pré-culture de 10 jours pour augmenter à la fois la quantité de laccase produite initialement dans les pré-cultures et la quantité de biomasse de manière à favoriser le développement du champignon dans la culture par rapport à des microorganismes compétiteurs de l'effluent. Des cultures ont ainsi été réalisées en induisant préalablement l'activité laccase dans les pré-cultures par ajout de 10 mg d'anthracène. Malgré une activité initiale assez élevée de certaines pré-cultures, les activités ont rapidement diminué lorsque le champignon a été mis en culture sur l'effluent urbain, en fiole. L'activité a donc été appréciée de manière identique aux tests précédents, c'est-à-dire en fonction de l'intensité de la coloration rose et du temps d'apparition de cette coloration. L'activité laccase a été détectée pendant 19 jours, mais aucune augmentation significative n'a été observée que se soit en présence ou en absence de Pichia fermentans ou Pseudomonas aeruginosa. (Tableau 2). Tableau 2 : Activité laccase exprimée par P. cinnabarinus en présence de Pseudomonas aeruginosa ou Pichia fermentans ou en culture pure dans un effluent urbain à pH 4-5 en présence de 50 mg d'anthracène à partir de pré-cultures induites par ajout d'anthracène. Temps d'incubation P. cinnabarinus P. cinnabarinus P. cinnabarinus 5j 0 - 0 4+ - - - 2+ 4+ Ajout de - + Pichia fermentans + Pseudomonas aeruginosa 7j + + 2+ 5+ + 2+ + 5+ 5+ 12j - + - 4+ - 2+ + 3+ 5+ 14j - + - 4+ - 2+ + 3+ 5+ 19j - + - 4+ - 2+ + 3+ 5+ L'activité laccase a été appréciée en fonction de l'intensité de la coloration rose et du temps d'apparition (notation de 1 à 5) et les '-' correspondent aux activités qui n'ont été décelées que le lendemain. Alternativement, l'effluent a été incubé, en fiole, avec des pré-cultures de 10 jours de manière à obtenir une activité laccase initiale d'environ 0,1 U.mL-1 et une biomasse plus importante favorisant le développement du champignon et des microorganismes dans la culture. Malgré cette pré-culture plus longue, l'activité laccase mesurée dans l'effluent a diminué assez rapidement. Après 4 jours de culture dans l'effluent, les activités laccases mesurées étant assez faibles (0,012 U.mL-1 et 0,022 U.mL-1), du mycélium issu de pré-cultures de 10 jours (activités laccases égales ou supérieures à 0,1 U.mL-1) a été à nouveau ajouté dans chaque fiole en même temps que l'anthracène et 3 mL d'une suspension de Pichia fermentans (Figure 4). Dans ces conditions, les activités laccases ont été détectées dans le milieu pendant les 15 jours d'incubation. Cependant, l'augmentation observée des activités laccases était en moyenne faible et non significative, suggérant que la présence de Pichia fermentans n'était pas déterminante pour induire l'expression d'activités laccases par P. cinnabarinus dans des effluents urbains. Induction de la production de laccase par P. cinnabarinus en présence ou en absence de Pichia fermentans ou Pseudomonas aeruginosa dans un effluent urbain contenant de l'octylphénol. P. cinnabarinus a été cultivé en fiole sur l'effluent urbain à pH voisin de 7 qui est un pH plus proche des conditions observées en station d'épuration. Les données à TO représentent l'activité laccase détectée dans les pré-cultures avant l'ensemencement de l'effluent. Les données à T2 et T4 jours représentent les activités laccases exprimées par P. cinnabarinus avant l'ajout de Pichia fermentans après 4 jours de culture. La quantité de Pichia fermentans a commencé à diminuer à partir de T10 jours pour devenir nulle à T16 jours. Les inventeurs n'ont pas observé d'augmentation de l'activité laccase exprimée par P. cinnabarinus induite par la présence de Pichia fermentans (Figure 5). Les variations des niveaux d'activités détectés étaient directement liées à l'activité initialement mesurée dans les pré-cultures avec une activité maximale à T14 jours. Ces activités ont été détectées pendant 18 jours de culture. Les inventeurs ont donc ici démontré que, contrairement à ce qui est observé dans des conditions de culture en milieu de croissance (tel que le milieu cristomalt), P. cinnabarinus est, de manière surprenante, capable d'exprimer des laccases lorsqu'il est cultivé en effluent urbain, sans que cette expression soit induite par la présence de Pichia fermentans ou Pseudomonas aeruginosa. Exemple 2 L'exemple 2 ci-dessous montre la capacité de Pycnoporus cinnabarinus, cultivé seul en fioles, à dégrader l'anthracène et l'octylphénol présents dans des échantillons d'effluents urbains. Matériel et méthodes Microorganismes Les microorganismes utilisés sont identiques à ceux utilisées dans l'exemple 1. Pré-cultures en milieu liquide. Les pré-cultures réalisées ont été mises en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1. Transformation de l'anthracène à partir de cultures sur un effluent urbain. Tests sans induction préalable des pré-cultures. Les tests ont été mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1 Tests avec induction des pré-cultures par de l'anthracène. Les tests ont été mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1 Transformation de l'octylphénol à partir de cultures sur un effluent urbain. Les tests ont été mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1 Extraction de l'anthracène à partir des cultures sur un effluent urbain. Environ 2 g de NaCI ont été ajoutés au milieu de culture filtré qui a été mis à agiter pendant 15 min. Cette addition de NaCI permet de diminuer les émulsions provoquées par la présence d'une grande quantité de détergents dans l'effluent urbain, en favorisant le transfert de ces détergents dans la phase organique. Après entière dissolution du NaCI, environ 200 mL de dichlorométhane ont été ajoutés dans la fiole qui a été agitée environ 1 h pour favoriser l'extraction de l'anthracène. La phase organique a été récupérée et l'extraction a été répétée 3 fois comme décrit ci-dessus. Une observation aux UV a été effectuée pour vérifier l'absence d'anthracène sur les parois des fioles de culture. L'anthracène a en effet la propriété d'être fluorescent aux longueurs d'onde UV. En cas de présence d'anthracène de nouvelles extractions ont été réalisées. L'anthracène a ensuite été extrait du mycélium en utilisant le protocole décrit ci- dessus. La phase organique obtenue lors des extractions a été filtrée et évaporée à 50°C à l'aide d'un évaporateur rotatif. Une fois le dichlorométhane entièrement évaporé, l'anthracène a été solubilisé avec de l'acétone. La solubilisation totale de l'anthracène a été vérifiée aux UV. L'anthracène dissous dans l'acétone a ensuite été quantifié par chromatographie liquide haute performance (CLHP). Des témoins d'extraction ont été réalisés à TO jour, c'est à dire à partir de l'effluent sans incubation préalable, et après 15 jours d'incubation avec P. cinnabarinus, l'anthracène ayant été rajouté juste avant l'extraction. Des témoins comprenant l'anthracène seul ont également été réalisés afin de vérifier l'absence d'évaporation de l'anthracène au cours du temps. Le rendement d'extraction de l'anthracène obtenu avec ce protocole était de 28 mg ± 0,2 mg pour 50 mg d'anthracène. Extraction de l'octylphénol à partir des cultures sur un effluent urbain. L'extraction de l'octylphénol a été réalisée comme décrit ci-dessus en séparant le mycélium du milieu de culture et en procédant trois fois aux extractions avec le dichlorométhane sur les deux fractions. Evaluation de la dégradation de l'anthracène et de l'octylphénol par chromatographie liquide haute performance (CLHP). 30 jil_ de l'échantillon à analyser ont été injectés dans une colonne C18 Reverse Phase (Waters). Deux solutions ont été utilisées pour l'élution des molécules : la solution A constituée de 90% d'eau acidifiée (acide trifluoroacétique, 1%.) et de 10% d'acétonitrile, et la solution B constituée de 90% d'acétonitrile et 10% d'eau acidifiée (acide trifluoroacétique, 1%.). Ces solutions ont été filtrées sous vide avec des filtres GF-C (Whatman) puis soumises aux ultrasons pendant 30 min. Le gradient de solvants utilisé lors de l'analyse CLHP était : 0-5 min 100% de solvant A ; 5-15 min, gradient linéaire jusqu'à 100% de solvant B ; et de 15-25 min 100% de solvant B. Une gamme étalon pour l'anthracène (10, 20, 30, 40 et 50 jiM) et une gamme étalon pour l'octylphénol (0,1 ; 0,2 ; 0,4 ; 0,5 ; 0,1 et 1 mM) ont été réalisées par CLHP en corrélant l'aire des pics aux concentrations. Cette gamme étalon a permis de calculer les pourcentages de transformation des molécules après 15 ou 21 jours de culture. Résultats Transformation de l'anthracène à partir de cultures en fioles sur effluent urbain contenant de l'anthracène. Des témoins d'extraction ont été réalisés à TO, c'est à dire à partir de l'effluent urbain sans incubation préalable, et après 15 jours d'incubation avec P. cinnabarinus, l'anthracène ayant été ajouté juste avant l'extraction. Comme précisé ci-dessus, les résultats obtenus montrent qu'à partir d'une masse initiale de 50 mg d'anthracène, le protocole utilisé permet de récupérer à TO environ 50% ± 0,5% de l'anthracène (environ 25 mg). Les conditions permettant une mesure d'activité laccase au cours des 15 jours d'incubation (utilisation de pré-cultures de 10 jours et inoculation supplémentaire après 4 jours de cultures sur effluent) ont permis d'obtenir un pourcentage de dégradation de l'anthracène de 4% ± 2% en présence ou en absence de Pichia fermentans. Ce pourcentage correspond à 2 mg d'anthracène transformé dans 200 mL de culture. Transformation de l'octylphénol à partir de cultures en fioles sur effluent urbain contenant de l'octylphénol. Les témoins d'extraction réalisés à TO montrent un rendement d'extraction élevé : 84% ± 5%. Les rendements d'extraction à T15 jours sont du même ordre de grandeur (85% ± 4%). Les meilleurs résultats de rendements de transformation de l'octylphénol sont associés à des activités laccases élevées. En effet avec les plus hautes activités mesurées dans les cultures de P. cinnabarinus seul, des rendements de transformation de 87,9%, soit 12,1 % d'octylphénol résiduel ont été obtenus (Tableau 3) alors que, de manière surprenante, les cultures associant P. cinnabarinus et Pichia fermentans n'ont conduit qu'à 45% de dégradation, soit 55% d'octylphénol résiduel. Tableau 3 : Pourcentage de dégradation de l'octylphénol dans les cultures de P. cinnabarinus sur effluent urbain avec et sans P. fermentans. P. cinnabarinus P. cinnabarinus + Pichia fermentans Masse extraite d'octylphénol (mg) 4,86 mg ± 0,08 22 mg ± 0 Pourcentage d'octylphénol résiduel 12,1 %± 0,2% 55% ± 0% Les inventeurs ont donc ici démontré que, de manière surprenante, P. cinnabarinus est capable de dégrader l'octylphénol et l'anthracène présent dans un effluent urbain, sans avoir besoin d'être co-cultivé avec Pichia fermentans ou Pseudomonas aeruginosa. Exemple 3 L'exemple 3 ci-dessous montre que la capacité de P. cinnabarinus à dégrader l'anthracène et l'octyphénol dans un effluent urbain n'est pas partagée par tous les basidiomycètes qui produisent des laccases, comme le champignon Marasmius quercophilus. Matériel et méthodes Microorganismes La souche 19 de Marasmius quercophilus a été isolée sur le site de La Gardiole de Rians, Var (1 ha) en utilisant la forme rhizomorphique du champignon. Une culture du chapeau a été premièrement réalisée sur milieu à base d'extrait de malt et agar (MEA) : 20 g/L d'extrait de malt (Société Difal, France), 15 g/L d'agar (Bio Mérieux, France), et 50 mg/L de chloramphénicol (Sigma, France), ajouté après autoclavage. Puis la culture de mycélium pur ainsi obtenue a été utilisée pour inoculer un milieu solide contenant de la farine de blé entier (Bio Mérieux, France : 20 g/L) favorisant la production de rhizomorphe et incubé à 25°C. Le rhizomorphe a été utilisé pour inoculer un MEA afin d'obtenir une culture dicaryotique pure. Les souches de Pichia fermentans et Pseudomonas aeruginosa utilisées sont identiques à celles utilisées dans l'exemple 1. Pré-cultures en milieu liquide. Les pré-cultures réalisées ont été mises en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1 en remplaçant P. cinnabarinus par M. quercophilus. Induction des activités laccases de M. quercophilus avec ou sans co-inoculation avec Pseudomonas aeruginosa et Pichia fermentans sur milieu de culture. Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans l'exemple 1, M. quercophilus remplaçant P. cinnabarinus. Induction des activités laccases de M. quercophilus avec ou sans co-inoculation avec Pseudomonas aeruginosa et Pichia fermentans sur effluent urbain. Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans l'exemple 1, M. quercophilus remplaçant P. cinnabarinus. Transformation de l'anthracène à partir de cultures sur un effluent urbain. Tests sans induction préalable des pré-cultures. Les tests ont été mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1, M. quercophilus remplaçant P. cinnabarinus. Tests avec induction des pré-cultures par de l'anthracène. Les tests ont été mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1, M. quercophilus remplaçant P. cinnabarinus. Transformation de l'octylphénol à partir de cultures sur un effluent urbain. Les tests ont été mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1, M. quercophilus remplaçant P. cinnabarinus. Résultats Transformation de l'anthracène par Marasmius quercophilus. A partir des expériences préalablement conduites avec P. cinnabarinus, des tests de culture de M. quercophilus sur l'effluent urbain ont été mis en place. Les mêmes stratégies que celles précédemment évoquées ont été mises en oeuvre : induction de l'activité laccase par l'anthracène dans les pré-cultures, deuxième inoculation au cours de la culture sur l'effluent à partir de pré-cultures de 10 jours présentant de fortes activités. Ces expériences n'ont pas permis d'obtenir des activités laccases susceptibles de conduire à une transformation significative de l'anthracène. Exemple 4 L'exemple 4 ci-dessous montre la capacité de P. cinnabarinus à dégrader seul le nonylphénol, l'anthracène ou un mélange de nonylphénol et d'anthracène dans un effluent en fiole sans action de la boue. Ces composés ont été privilégiés dans cette expérience et dans les expériences à l'échelle industrielle décrites dans les exemples suivants, car il s'agit de composés déclarés comme dangereux prioritaires par la Directive Cadre Eau, pour lesquels il est donc important de réussir à obtenir une dégradation efficace. Matériel et méthodes Un effluent contenant une quantité définie d'anthracène ou de nonylphénol est mis en contact avec une culture de P. cinnabarinus, puis l'ensemble est incubé 15 jours à 25°C avec une agitation constante de 100 rpm et sous aération. Des ajouts de culture de champignons ont été réalisés au cours du test pour maintenir un niveau élevé de l'activité laccase. 900 ml d'effluent avec 104/L de la molécule à dégrader 100 ml de culture de P. cinnabarinus Puis 2 ajouts de 50 ml de champignons en cours d'incubation. Après 15 jours d'incubation la quantité résiduelle du polluant est déterminée. Résultats Nonylphénol Le tableau 4 présente la moyenne des résultats de la dégradation du nonylphénol et des nonylphénols éthoxylés (NPE) obtenue dans 3 fioles différentes. Tableau 4 : Dégradation du nonylphénol La valeur résiduelle moyenne de nonylphénol après 15 jours de traitement avec P. cinnabarinus est de 3,65 pg/L, soit une dégradation de 15% du nonylphénol introduit. De manière intéressante, le nonylphénol éthoxylé est dégradé de manière plus efficace. Effluent T 0 5,9 4,31 Matériel et méthodes L'étude réalisée simule le fonctionnement d'une station d'épuration à bassins biologiques. Pour cela il a été utilisé une micro-station composée de 2 bassins à boues activées (2 x 15 L) (un aéré et l'autre pour l'anoxie) et d'un décanteur (20 L). Les temps de séjour (volume d'effluent à traiter quotidiennement) et les vitesses de recirculations (recirculation du bassin aérobie vers le bassin anoxie et du décanteur vers le bassin anoxie) ont été calculés de façon à reproduire le plus possible le fonctionnement d'une station à taille réelle recevant un effluent semblable. La quantité d'effluent traité quotidiennement est de 24,8 L. La molécule à dégrader est le nonylphénol. Cette molécule a été introduite en quantité connue dans l'effluent à traiter à raison d'une concentration de 10 pg/L à partir du 4e" jour de fonctionnement du pilote. Les champignons ont été introduits dans la boue activée à une concentration de 1x104 ufc/ml à partir d'une culture à 1x108 ufc/ml. La température des bassins « aérobie » et « anoxie » a été régulée à 21 °C. La mini-station est schématisée sur la Figure 6. Paramètres suivis Les paramètres mesurés pendant le fonctionnement du pilote sont : La température (T°) Le pH - Le taux d'oxygène (02) - Les matières en suspension (MES) - La demande chimique en oxygène (DCO) des effluents d'entrée et de sortie - L'ammonium (NH4±) en entrée et en sortie - Le nonylphénol en entrée et en sortie Résultats Le tableau 7 présente les résultats du suivi du déroulement du pilote (Figures 7- 10). 29 Tableau 7 : Résultats du suivi du déroulement du pilote Appoint Anoxie ' Aérobie Décanteur Rejet eau Observations , Jours DCO NH4+ T. pH 02 MES (g/L) T° pH 02 MES Boues MES DCO NH4+ MES T° pH (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (g/L) extraites Boues (mg/L) (mg/L) (mg/L) (L) extraites 0 724 100 15,1 6,95 - - , 15,2 7,29 - 3,37 - - - - - - - Ajout 3m1 P. cinnabarinus 1 - - 21,1 7,57 - - 21,7 7,76 - - 0,8 - - - - 18 7,83 débordement du bassin aéré (tuyau bouché par la boue) 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 - .. _ - - - . - - . - - 4 1077 110 21,2 7,7 - - 21,9 7,81 - 1,54 2,4 1,02 182 80 64 18,1 7,93 Début introduction nonylphénol Ajout 3m1 P. cinnabarinus 5 - - 20,9 7,57 0,20 - 21,5 7,97 5,5 - o - - - - 17,9 7,99 / 6 756 100 17,6 7,79 0,15 - 19,3 7,94 3,3 1,21 0,1 2,05 66 65 19 14,7 8,04 Nouveau fut d'effluent 7 - - 15,9 7,76 0,05 - 17,2 7,85 3 - 0 - - - - 12,6 7,95 / 8 1235 90 15,8 7,87 0,10 - 17,2 7,87 1,8 1,306 0,1 2,22 64 70 50 13,5 7 94 , Ajout 3m1 P. , cinnabarinus 9 - - - - - - - - - - - - - - - . - 10 - - - - - - - - - - - - - - - - 11 - - 20,6 7,86 0,05 2,13 21,2 7,77 3,5 - 0 - - - - 15,7 7,9 / . 12 2472 100 18,9 7,78 0,05 - 20,3 7,82 3,5 1,519 .. 1,09 77 60 36 12,6 7,88 / L'effluent rejeté a une DCO assez stable, le rendement épuratoire étant d'environ 92%. En ce qui concerne la dégradation de l'azote le rendement est très faible (32%) ce qui montre que les bactéries nitrifiantes ne sont pratiquement plus actives. Le tableau 8 présente les résultats de dégradation du nonylphénol (nonylphénol), et de nonyphénols éthoxylés (NPE) dans les effluents (Figure 11). Tableau 8 : Dosage du nonylphénol Appoint Aérobie Rejet eau Jours Nonylphénol (ug/L) NPE Nonylphénol (ug/L) NPE Nonylphénol NE (10 (10 (ug/L) (1 P0 µg/L) i.ig/L) i.ig/L) 0 1,13 11,44 1,67 Les mesures effectuées sur l'effluent de sortie (0,34 pg/L en moyenne) permettent de voir que la concentration de nonylphénol résiduel est de 8% par rapport à ce qui a été introduit, ce qui représente un rendement épuratoire pour le nonylphénol de 92%. Cet exemple montre donc que P. cinnabarinus permet de dégrader efficacement le nonylphénol présent dans des effluents. Exemple 6 L'exemple 6 ci-dessous montre que le traitement d'effluents avec P. cinnabarinus permet de dégrader de manière efficace l'anthracène présent dans ces effluents. Matériel et méthodes L'étude a été mise en oeuvre de la même manière que dans l'exemple 5 mais en introduisant l'anthracène à la place du nonylphénol. Résultats Le tableau 9 présente les résultats du suivi du déroulement du pilote (Figures 12- 15). 32 Tableau 9 : Résultats du suivi du déroulement du pilote Appoint Anoxie Aérobie Décanteur Rejet eau Observations Jours DCO NH4 T° pH 02 T° pH 02 MES es MES DCO NH4 MES T° pH (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (g/L) extraBouites Boues (mg/L) (mg/L) (mg/L) (L) extraites 0 702 90 20,8 7,4 0,15 21,3 7,53 2,6 3,23 - - - - - - Ajout 3m1 P. cinnabarinus 1 - - 21,1 7,83 0,20 22,1 7,71 2,5 - o - - - - 16 7,83 / 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - - - - - - - - 4 1363 80 20 7,62 0,10 21,1 7,73 1,2 1,59 0,8 3,88 160 65 62 13,6 7,96 Début introduction anthracène Ajout 3m1 P. cinnabarinus 5 - - 20,1 7,59 0,20 21,1 7,74 1,1 - 0 - - - - 14 7,94 / 6 1940 90 20,5 7,59 0,20 21,1 7,67 0,3 1,48 0,1 11,7 184 75 87 15,7 7,86 / 7 - - 21,5 7,8 0,20 21,5 7,88 2,6 - 0 - - - - 17 7,9 Nouveau fut d'effluent Ajout 3m1 P. cinnabarinus 8 736 115 21,1 7,75 0,05 21,5 7,85 3,2 1,32 0,1 10,5 112 70 61 17,1 7,87 - _ _ 10 - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 - 21 7,77 0,10 21,5 7,83 1,4 - 0 - - - - 16,8 7,86 / 12 1006 105 21,6 7,83 0,10 21,2 7,82 2,9 1,23 - 3,9 64 90 38 17,3 7,81 / Le rendement de dégradation de l'azote a diminué par rapport à l'essai précédent, celui-ci est tombé à 22%. Le rendement de dégradation globale a également un peu chuté, il est de 88%. Le tableau 10 présente les résultats de dégradation de l'anthracène dans les effluents (Figure 16). Tableau 10 : Dosage de l'anthracène Effluent appoint Boues aérobies Rejet eau Jours Anthracène (pg/L) Anthracène (pg/L) Anthracène (pg/L) 0 Exemple 7 L'exemple 7 ci-dessous montre que le traitement d'effluents avec P. cinnabarinus permet de dégrader de manière efficace à la fois le nonylphénol et l'anthracène présents simultanément dans ces effluents. Matériel et méthodes L'étude a été mise en oeuvre de la même manière que dans l'exemple 5 mais en introduisant à la fois de l'anthracène et du nonylphénol. Résultats Le tableau 11 présente les résultats du suivi du déroulement du pilote (Figures 17-20). Le rendement de dégradation de l'azote a diminué par rapport à l'essai précédent, celui-ci est tombé à 13%. Le rendement de dégradation global est de 93%. Le tableau 12 présente les résultats de dégradation du nonylphénol (NP), de nonyphénols éthoxylés (NPE) et d'anthracène (AT) dans les effluents (Figure 21). Tableau 12 : Dosage de l'anthracène et du nonylphénol Appoint Aérobie Rejet eau Jours NP (ug/L) NPE AT NP (ug/L) NPE AT NP (ug/L) NPE AT (10 µg/L) (pg/L) (10 µg/L) (pg/L) (10 µg/L) (pg/L) 0 5,46 Le rendement épuratoire pour le nonylphénol est donc de 94%. - Anthracène : Le rendement de l'extraction réalisée pour le dosage est de 43%. La quantité moyenne d'anthracène qui s'est adsorbée aux boues est de 0,13 pg/L de boues soit une quantité totale de 3,9 lig pour 30 L de boues, ce qui représente 0,4% de la quantité totale (965 pg) d'anthracène introduite au cours du test. L'anthracène ne s'est donc pas accumulé dans les boues au cours du test. Les mesures effectuées sur l'effluent de sortie (0,01 pg/L) permettent de voir que la concentration d'anthracène résiduel est inférieure à 0,23% par rapport à ce qui a été introduit, ce qui représente un rendement épuratoire pour l'anthracène supérieur à 99,36%. Cet exemple montre donc que P. cinnabarinus permet de dégrader efficacement l'anthracène et le nonylphénol présents simultanément dans des effluents.25 REVENDICATIONS1. Procédé de transformation d'au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique et/ou d'au moins un alkylphénol dans des effluents et/ou des boues activées d'origine urbaine et/ou industrielle comprenant une étape de traitement par le champignon Pycnoporus cinnabarinus desdits effluents et/ou desdites boues activées. 2. Procédé de transformation selon la revendication 1, dans lequel le au moins un alkyphénol est l'octylphénol ou le nonylphénol. 3. Procédé de transformation selon la revendication 1, dans lequel le au moins un hydrocarbure aromatique polycyclique est l'anthracène. 4. Procédé de transformation selon la revendication 1, dans lequel le au moins un hydrocarbure aromatique est l'anthracène et le au moins un alkylphénol est le nonylphénol. 5. Procédé de transformation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le champignon P. cinnabarinus n'est pas ajouté sous forme de co-culture. 6. Procédé de transformation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant une étape préalable d'amplification de P. cinnabarinus sur un substrat dans un bioréacteur de fermentation. 7. Procédé de transformation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel P. cinnabarinus est ensemencé au moins une fois dans les effluents et/ou boues activées lors de l'étape de traitement.