Brevet FR2983214A1 — publié le 20130531

La présente invention concerne un milieu de culture pour la détection de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes comprenant au moins un agent chromogène substrat d'une acétyl-glucosaminidase, à un procédé de détection utilisant un tel milieu et à l'utilisation d'un tel milieu pour la détection de bactéries Yersinia enterolitica pathogènes. Les Yersinia sont des entérobactéries regroupant actuellement trois espèces contenant des souches pathogènes pour l'animal et l'homme: Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis, et des espèces habituellement non pathogènes, Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii, Yersinia intermedia, Yersinia aldovae, Yersinia mollaretii, Yersinia bercovieri et Yersinia rodhei. Yersinia enterocolitica est responsable des entérocolites. Elle est rapportée, le plus souvent chez l'enfant et se traduit par des diarrhées, de la fièvre, des douleurs abdominales et parfois des vomissements. La recherche des Yersinia a conduit au développement de nombreux milieux de culture. Ces milieux, généralement incubés à la température de 30°C, notamment pour conserver, exprimer et conserver le caractère pathogène, ont conduit à développer des méthodes pour caractériser des souches pathogènes, par exemple en repérant à la température plus élevée de 37°C, anormale pour cette espèce, une réduction de la croissance sur des milieux déficients en calcium et une coloration plus intense par le cristal violet. Parmi les milieux d'isolement de l'art antérieur, on peut citer le milieu CIN agar 25 (Schiemann DA, Synthesis of a selective agar medium for Yersinia enterocolitica, Can. J Microbiol., 1979) qui emploie pour détecter Yersinia le caractère mannitol révélé par un changement de pH et un indicateur coloré, le milieu CAL agar (Dudley et al., Medium for isolation of Yersinia enterocolitica, Journal of Clinical Biology, 1979) qui emploie le caractère cellobiose révélé par un changement de pH et un indicateur coloré. D'autre part, un milieu VYE agar qui emploie le caractère esculine pour distinguer les non pathogènes par un halo noir diffusant autour des colonies, a également été élaboré (Fukushima, New Selective Agar Medium for Isolation of Virulent Yersinia enterocolitica, Journal of Clinical Biology, 1987). Weagant a développé un milieu dérivé du CIN Agar en remplaçant le mannitol par du cellobiose et en ajoutant du X-glucoside (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-béta-D-glucopyranoside) (Weagant, A new chromogenic agar medium for detection of potentially virulent Yersinia enterocolitica, Elsevier, 2008). Garcia-Aguayo et al. ont développé en 1999 un milieu Xylose-Galactosidase au 5- bromo 6-chloro-3-indoxyl-beta-galactoside qui emploie le caractère beta-galactosidase (Garcia-Aguayo et al., Evaluation of Xylose-Galactosidase Medium, a new Plate for the Isolation of Salmonella, Shigella, Yersinia and Aeromonas Species, Eur J Clin Microbio Infect Dis., Volume 18, 1999). De tels milieux ne permettent cependant pas d'obtenir une sensibilité suffisante et donnent également lieu à de faux positifs ce qui limite la fiabilité des résultats. Il est donc important de disposer d'outils et de procédés de détection de ces bactéries qui combinent à la fois une bonne sensibilité et une bonne spécificité, et surtout une grande facilité d'usage de façon à pouvoir autant que possible simplifier les tests, les faire rapidement et en grand nombre, voire les automatiser, dans une perspective de contrôle de l'hygiène alimentaire et/ou hospitalière, tout en permettant de différencier rapidement différentes souches Yersinia enterocolitica pathogènes. Il existe donc un réel besoin de disposer d'une technique de détection plus simple, plus spécifique, plus directe et moins coûteuse et permettant de différencier différentes souches de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes, tout en évitant de combiner plusieurs tests générant un délai supplémentaire pour l'obtention des résultats et augmentant le risque de contaminations parasites ou d'erreur ainsi que le risque de la diffusion de la bactérie. Des milieux comprenant des indoxyl-beta-galactosides ont été testés. Une coloration des colonies de Yersinia enterocolitica a été observée, mais celle-ci apparaissait lentement. De plus, une coloration se développait également sur un très grand nombre de souches d'espèces non-Yersinia. De manière surprenante et inattendue, l'Inventeur a montré que l'utilisation de substrats chromogènes de l'hexosaminidase, en particulier de l'acétyl-glucosaminidase, permet d'isoler rapidement les bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes de façon sensible et spécifique. En particulier, lorsqu'il est mis en oeuvre sur un milieu solide gélose, le procédé de détection développé par l'Inventeur est réalisable directement, par exemple à partir d'un échantillon alimentaire ou issu d'un patient, sans nécessiter d'étape d'isolement préalable des différentes souches présentes dans cet échantillon. Un objet de la présente invention consiste donc en un milieu de culture pour la détection de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes, comprenant: - les nutriments nécessaires à la croissance desdites bactéries à détecter, et - au moins un agent chromogène substrat d'une acétyl-glucosaminidase. Par « milieu de culture », on entend un milieu permettant la croissance desdites bactéries à détecter. Ledit milieu de culture comprend en effet les nutriments nécessaires à la croissance desdites bactéries à détecter. Par « bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes » on entend des bactéries Yersinia enterocolitica présentant un biotype choisi dans le groupe constitué par les biotypes 1B, 2, 3, 4 et 5. En effet, le biotype lA de Yersinia enterocolitica est fréquent et n'est pas reconnu comme pathogène pour l'homme et les animaux. Par « nutriments nécessaires à la croissance desdites bactéries à détecter », on entend la composition d'un milieu de base nécessaire à ladite croissance. L'homme du métier connaît parfaitement la composition de tels milieux et est à même de l'adapter si nécessaire en fonction de la spécificité de certains microorganismes ou de contraintes qui pourraient être liées à certains cas de la présente invention (transparence du milieu par exemple). Ces nutriments sont notamment choisis dans le groupe comprenant du carbone, de l'azote, du soufre, du phosphore, des vitamines, des inducteurs de croissance, des hydrates de carbone, des sels (par exemple calcium, magnésium, manganèse, sodium, potassium), des complexes nutritifs (par exemple des acides aminés, du sang, du sérum, de l'albumine) ainsi que des peptones et des extraits de tissus animaux et végétaux. Le milieu de culture utilisé dans le cadre de la présente invention peut être sous forme solide, semi-solide, liquide ou lyophilisée. De préférence, ledit milieu de culture est un milieu gélosé, lequel milieu de culture est, à titre d'exemple, à base d'agar. Parmi les présentations des milieux de culture utilisables, on peut ainsi citer les boîtes de Pétri sur lesquelles se développent des microorganismes. Par « agent chromogène » ou « substrat chromogène », on entend un composé portant un chromophore libéré après une hydrolyse par une enzyme spécifique. Le chromophore ainsi libéré donne sa couleur aux colonies comprenant ladite enzyme. De préférence, ledit substrat chromophore est un chromophore précipitant. Au sens de la présente invention, on entend par acétyl-glucosaminidase une enzyme capable de libérer par hydrolyse un résidu N-acétyl-D-glucosamine. Le substrat chromogène est de préférence utilisé à une concentration comprise entre 0,01 et 0,5 g/1, préférentiellement entre 0,05 et 0,2 g/l. Une concentration particulièrement préférée se situe à 0,1 g/1 environ. De façon préférée, ledit chromophore est choisi dans le groupe constitué par les dérivés indoxyle, halogéno-indoxyle (bromo-indoxyle, chloro-indoxyle, fluoro-indoxyle, iodo- indoxyle, dichloro-indoxyle, chloro-bromo-indoxyle, tri-chloro-indoxyle), le méthylindoxyle, et hydroxy-quinoline. Des dérivés particulièrement préférés sont choisi dans le groupe constitué par les dérivés suivants : 6-chloro-indoxyle, 5-bromo-indoxyle, 3- bromo-indoxyle, 6-fluoro-indoxyle, 5-iodo-indoxyle, 4,6-dichloro-indoxyle, 6,7- dichloro-indoxyle, 5-bromo-4-chloro-indoxyle, 5-bromo-6-chloro-indoxyle, 4,6,7- trichloro-indoxyle, N-méthyl-indoxyle et 8-hydroxy-quinoline. Avantageusement, ladite acétyl-glucosaminidase a pour substrat chromogène un indoxyl-beta-glucosaminide, de préférence choisi dans le groupe constitué par le 5- bromo-6-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide, le 6-chloro-3-indolyl-N- acétyl-beta-D-glucosaminide et le 6-fluoro-indoxyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide, de manière particulièrement préférée le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-beta-Dglucosaminide. Alternativement, ladite acétyl-glucosaminidase a pour substrat chromogène un indolyl5 beta-glucosaminide, de préférence le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-N-acétyl-beta-Dglucosaminide. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le milieu selon la présente invention comprend en outre un agent chromogène substrat de la beta-glucosidase, de préférence ledit agent chromogène libérant après hydrolyse un chromophore de couleur 10 distincte du chromophore susceptible d'être libéré après hydrolyse de l' agent chromogène substrat d'une acétyl-glucosaminidase. De préférence ledit agent chromogène substrat de la beta-glucosidase est le 5-Bromo-4- chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside (également dénommé X-glucoside) lorsque l'agent chromogène substrat de l'acétyl-glucosaminidase du milieu selon l'invention est choisi 15 dans le groupe constitué par : le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-beta-D- glucosaminide, le 6-chloro-3-indolyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide et le 6-fluoroindoxyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide. De préférence, ledit agent chromogène substrat de la beta-glucosidase est la 8-hydroxyquinoline-beta-D-glucoside (également dénommé X-glucoside) lorsque l'agent 20 chromogène substrat de l'acétyl glucosaminidase du milieu selon l'invention est le 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide. Ledit agent chromogène substrat de la beta-glucosidase est de préférence utilisé à une concentration allant de 0,01 à 0,5 g/1, préférentiellement de 0,05 à 0,2 g/l. Une concentration particulièrement préférée se situe à 0,1 g/1 environ. 25 Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le milieu selon la présente invention comprend du 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide et du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside. La quantité efficace de chromogène(s) dans le milieu selon la présente invention pourra être simplement ajustée par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales et des résultats décrits dans les exemples ci-après. Les milieux de culture selon la présente invention peuvent éventuellement contenir un ou plusieurs agents antimicrobiens, en particulier un ou plusieurs antibiotiques et/ou un ou plusieurs antifongiques. Le ou lesdits agents antimicrobiens permettent de limiter la croissance de microorganismes autres que ledit au moins un microorganisme spécifique à détecter. La quantité efficace d'agent antimicrobien à utiliser peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. Avantageusement, le milieu selon la présente invention comprend en outre de l'Irgasan. Au sens de la présente invention, on entend par Irgasan un composé de formule : 5- chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol (Numéro CAS: 3380-34-5). De préférence, le milieu selon la présente invention comprend du 5-chloro-2-(2,4- dichlorophenoxy)phenol à une concentration comprise entre 0,0005 et 0,01 g/1, de préférence comprise entre 0,001 et 0,005 g/1, préférentiellement comprise entre 0,001 et 0,003 g/1, et encore préférentiellement d'environ 0,002 g/l. Un autre objet selon la présente invention se rapporte à un procédé de détection directe de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes dans un échantillon biologique comprenant les étapes successives: a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture tel que défini précédemment, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes, et c) de détection des colonies formées sur ledit milieu de culture correspondant aux bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes. Avantageusement, le procédé selon la présente invention comprend en outre une étape d) permettant de conclure à la présence ou non d'une souche particulière de bactéries en fonction de la couleur des colonies formées. Il s'agit par conséquent d'une étape d) d'identification de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes, dans ledit échantillon. Par « échantillon biologique», on entend tout type de prélèvement microbiologique, tel que par exemple un prélèvement de matières alimentaires (produits laitiers, viande, etc.), un prélèvement de sol, un prélèvement sur un mammifère (peau, muqueuses, etc.), de préférence l'homme, ou l'un de ses dérivés comme une préculture issue d'un tel prélèvement. Avantageusement, ledit échantillon biologique est un échantillon biologique liquide, comme de la salive, du sang ou de l'urine, un échantillon biologique solide, comme des fèces ou un produit alimentaire, ou encore un dérivé d'un échantillon biologique liquide ou solide tel qu'une pré-culture d'un tel échantillon biologique liquide ou solide. Avantageusement encore, ledit échantillon biologique comprend différents microorganismes, lesquels peuvent appartenir à des espèces voire à des genres distincts. À titre d'exemple, ledit échantillon biologique comprend au moins deux microorganismes différents, de préférence d'au moins cinq microorganismes différents et, de manière particulièrement préférée, d'au moins dix microorganismes différents. Par « inoculation», on entend la mise en culture dudit milieu de culture par tout ou partie de l'échantillon biologique et incubation dudit milieu de culture inoculé. L'homme du métier adaptera les conditions d'incubation en fonction du milieu de culture, de l'échantillon biologique et du microorganisme spécifique à détecter en fonction de ses connaissances générales. L'étape d'incubation peut être réalisée à une température comprise entre 0°C à 44°C, de préférence comprise entre 20°C à 43°C, préférentiellement comprise entre 28 et 32°C, et encore préférentiellement à 30°C. De préférence, l'étape d'incubation est réalisée pendant une durée comprise entre 16 et 36 heures, de préférence entre 18 et 24 heures. Cependant, en fonction des moyens dont il disposera, l'homme du métier pourra adapter la température et la durée de cette étape d'incubation au regard de ses connaissances générales. Par « procédé de détection directe », on entend un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon, de préférence un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement de chacune des souches bactériennes présentes dans l'échantillon. En effet, le procédé selon l'invention permet d'éviter l'étape d'isolement de colonies de bactéries candidates pouvant ensuite être soumises à un test plus précis de confirmation. Il s'applique donc à un échantillon brut susceptible de comprendre un mélange de bactéries. De préférence, le procédé selon la présente invention ne comprend pas d'étape 15 préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon. Par rapport aux procédés antérieurs, le procédé développé par l'Inventeur permet une détection directe et rapide des bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes. Un autre objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'un milieu de 20 culture tel que défini ci-dessus, pour la détection et la différenciation directes de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes. Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention. 25 EXEMPLE Exemple 1 : Comparaison du milieu selon la présente invention avec un milieu CIN agar Le milieu CIN agar de Becton Dickinson utilisé, comprend les éléments suivants en g/L : Peptone 17,0, Peptone de protéose 3,0, Extrait de levure 2,0, D-Mannitol 20,0, Désoxycholate de sodium 0,5, Cholate de sodium 0,5, Pyruvate de sodium 2,0, Sulfate de magnésium heptahydré 0,01, Chlorure de sodium 1,0, Rouge neutre 0,03, Cristal Violet 0,001, Irgasan 0,004, Gélose 13,5, Cefsulodine 0,015, Novobiocine 0,0025. Le milieu selon la présente invention comprend les éléments suivants en g/L: Peptone 20 ; Sodium Chloride 5 ; Agar 15 ; 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside 0,1 ; 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl-N-acétyl-P-D-glucosaminide 0,1 ; Irgasan 0,002 ; Tween 80 0,5. Diverses souches bactériennes sont isolées sur le milieu de l'invention et le milieu CIN Agar. Les boites sont incubées 24h à 30°C. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau I suivant : CIN Agar Milieu selon l'invention Couleur Détection Couleur Détection Y. enterocolitica ROUGE + MAUVE + AR5580 Y. enterocolitica 2B154 ROUGE + BLEU - non-pathogène Y. enterocolitica ROUGE + BLEU - AR5685 non-pathogène Citrobacter ROUGE + BLEU - AR 3378 Citrobacter ROUGE + BLEU - AR 3870 Citrobacter AR 3871 ROUGE + BLEU - Citrobacter AR 3030 ROUGE + BLEU - Serratia AR 5568 ROUGE + BLEU - E.coli AR 3741 NC - NC - Hafnia AR 3862 NC - NC - Enterobacter AR 3412 NC - NC - Morganella AR4080 incolore - incolore - Pseudomonas AR5196 incolore - incolore - Tableau I NC : Non croissance des bactéries. Le tableau I montre que les deux milieux permettent de détecter les Yersinia enterocolitica pathogènes mais que de nombreuses espèces détectées à l'aide du milieu traditionel CIN Agar, sont en réalité des faux positifs, c'est-à-dire soit des souches Yersinia enterocolitica non pathogènes ou des non-Yersinia enterocolitica, ce qui n'est pas le cas avec le milieu selon la présente invention. De manière surprenante, un milieu semblable à celui de la présente invention, mais dans 10 lequel l'indoxyl-béta-glucosaminide a été remplacée par l'indoxyl-bétagalactosaminide, autre substrat d'hexosaminidase, ne permet pas d' obtenir une coloration des souches Yersinia enterocolitica pathogènes. Ainsi, un tel milieu ne permet pas de différencier Yersinia enterocolitica pathogènes des autres bactéries, démontrant ainsi, de manière surprenante, que seul un substrat du type glucosaminidine permet de détecter les souches Yersinia enterocolitica pathogènes avec une bonne spécificité et une bonne sensibilité. Exemple 2 : Comparaison du caractère de l'invention et du caractère beta-galactosidase Formules : en g/L Milieu A selon l'invention : Peptone 20 ; Sodium Chloride 5 : Agar 15 ; 5-bromo-6- chloro-3-indoxyl-N-acétyl-P-D-glucosaminide 0,1. Milieu B : Peptone 20 ; Sodium Chloride 5 : Agar 15 ; IPTG 0,04 ; 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl-beta-galactoside 0,1. Les boites sont incubées 24h à 30°C. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II suivant : Milieu A Milieu B Couleur Détection Couleur Détection Y enterocolitica MAUVE + MAUVE + AR5580 Citrobacter AR incolore - MAUVE + 3030 Klebsiella K3875 incolore - MAUVE + E.coli AR 3740 incolore - MAUVE + E.coli ATCC25922 incolore - MAUVE + Tableau II Les résultats présentés dans le tableau II montrent que, contrairement au milieu de l'invention, le milieu B ne permet pas d'éliminer des faux positifs. Ainsi, le milieu selon la présente invention présente une sensibilité et une spécificité supérieures, permettant ainsi une détection plus facile, en une seule étape de culture sans nécessité d'une étape préalable d'isolement ni étape ultérieure de différenciation. Ceci a pour conséquence de diminuer des coûts associés et également d'obtenir un rendement amélioré. REVENDICATIONS1. Milieu de culture pour la détection de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes comprenant: - les nutriments nécessaires à la croissance desdites bactéries à détecter, et - au moins un agent chromogène substrat d'une acétyl-glucosaminidase. 2. Milieu selon la revendication 1, dans lequel ledit agent chromogène substrat d'une acétyl-glucosaminidase est une indoxyl-beta-glucosaminide. 3. Milieu selon la revendication 2, dans lequel l'indoxyl-beta-glucosaminide est choisie dans le groupe constitué par le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-beta-D- glucosaminide et le 6-chloro-3-indolyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide et 6-fluoro- indoxyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide, de préférence est le 5-bromo-6-chloro-3- indoxyl-N-acétyl-beta-D-glucosaminide. 4. Milieu selon l'une quelconques des revendications précédentes, comprenant en outre un agent chromogène substrat de la beta-glucosidase. 5. Milieu selon la revendication 4, dans lequel ledit agent chromogène substrat de la beta-glucosidase est le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside. 6. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est un milieu de culture gélose. 7. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend ledit agent chromogène substrat d'une acétyl-glucosaminidase à une concentration comprise entre 0,01 à 0,5 g/1, préférentiellement de 0,05 à 0,2 g/l. 8. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend ledit agent chromogène substrat de la beta-glucosidase à une concentration comprise entre 0,01 à 0,5 g/1, préférentiellement de 0,05 à 0,2 g/l. 9. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre du 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol. 10. Procédé de détection directe de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes dans un échantillon comprenant les étapes successives: a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes, et c) de détection des colonies formées sur ledit milieu de culture correspondant aux bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes. 11. Utilisation d'un milieu de culture tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la détection et la différenciation directes de bactéries Yersinia enterocolitica pathogènes.