Brevet FR2978150A1 — publié le 20130125

Nouvelle utilisation d'un composé comme matrice dans la détection spécifique, l'identification et/ou la quantification d'alcaloïdes par spectrométrie de masse MALDI-TOF DESCRIPTION Domaine technique La présente invention concerne (i) une méthode d'analyse de molécules de faible masse pouvant être Dans cette méthode, des impulsions de laser sont concentrées sur un échantillon plat contenant les molécules à analyser, incorporées dans une matrice. La matrice absorbe la majeure partie de l'énergie du laser et, consécutivement, par le transfert de protons, ionise et vaporise les molécules à analyser. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Un instrument de type MALDI-TOF-MS est un spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée par une matrice, abrégé MALDI selon l'acronyme anglais « Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation » avec un analyseur à temps de vol, abrégé TOF selon l'acronyme anglais «Time-Of-Flight ». II permet de réaliser des méthodes d'analyse définies ci-après. La méthode d'analyse MALDI-TOF-MS est connue pour trouver une utilisation accrue dans la détermination de la masse de macromolécules non- volatiles. En effet, la désorption-ionisation laser assistée par matrice est une technique d'ionisation douce utilisée en spectrométrie de masse, permettant 2 l'analyse de biomolécules, telles que des biopolymères comme les protéines, les peptides et les hydrates de carbone, et de molécules organiques comme les polymères, les dendrimères et autres macromolécules, qui tendent à devenir fragiles et à se fragmenter lorsqu'elles sont ionisées par des méthodes plus conventionnelles. La technique MALDI a ainsi permis d'étendre le champ d'application de la spectrométrie de masse. Traditionnellement, la méthode MALDI-TOF-MS n'est pas appropriée pour l'analyse de molécules de faibles masses, en particulier ayant une m/z Des explications supplémentaires liées à la méthode de MALDI-TOF-MS peuvent être trouvées dans les articles suivants : U.S. No. 6.104.028 ; « The Scientist» 13 [12] : 18, le 7 juin 1999 ; et « Biophotonics International», juin 2001, 42-47. En outre, la nature de la matrice s'avère très importante dans la méthode d'analyse MALDI-TOF-MS. La matrice est généralement une petite molécule organique qui peut absorber le rayonnement laser intense empêchant de ce fait la décomposition des molécules à analyser mais qui peut aussi doucement transférer l'énergie aux molécules à analyser et favoriser ainsi leur ionisation. La nature des molécules pour fabriquer une matrice efficace est déterminée par tâtonnement, mais reste basée sur des considérations spécifiques de « profils moléculaires ». Lesdites molécules : - doivent être de faible masse moléculaire afin de faciliter la vaporisation, mais suffisamment grosses avec une pression de vapeur assez grande afin de ne pas s'évaporer durant la préparation de l'échantillon ou lors de son introduction dans le spectromètre ; - doivent être acides, ou au moins agir comme source de proton(s) afin de favoriser l'ionisation des molécules à analyser ; - doivent avoir une forte absorption dans l'ultraviolet, leur permettant d'absorber efficacement et rapidement l'irradiation laser ; et - doivent être fonctionnalisées avec des groupes polaires, pour une utilisation en solutions aqueuses. Dans un premier temps, une matrice en solution dans un solvant ou dans l'eau est mélangée avec l'échantillon à analyser. Un solvant organique permet aux molécules hydrophobes de se dissoudre dans la solution, alors que l'eau permet aux molécules hydrophiles de faire de même. Une solution avec l'une de ces molécules est réalisée, parfois dans un mélange d'eau ultra-pure et de solvant organique, habituellement de l'acétonitrile, abrégé ACN, ou de l'éthanol, abrégé EtOH. L'acide trifluoroacétique, abrégé TFA, peut parfois être ajouté. Un bon exemple de solution-matrice est, par exemple, un mélange de 20 mg/mL d'acide sinapique dans un mélange ACN/eau/TFA (50/50/0,1 en volume). La solution ainsi obtenue est ensuite, dans un second temps, déposée sur une coupelle MALDI, habituellement en métal conçue pour cet usage. Ledit dépôt est réalisé selon différentes techniques de dépôt, manuelles ou automatisées, qui prennent aussi toute leur importance dans la qualité des spectres obtenus. Le solvant se vaporise à température ambiante et sous pression réduite, laissant la matrice recristallisée, mais avec maintenant des molécules à analyser réparties dans tout le cristal. La matrice et le ou les composé(s) à analyser sont dits alors co-cristallisés dans un spot MALDI. Une liste d'exemples de composés utilisables comme matrice en fonction des molécules à analyser est répertoriée dans le tableau 1 ci-dessous. Une matrice donnée peut s'avérer spécifique à certaines molécules que l'on cherche à détecter, identifier ou quantifier. Tableau 1 Composé Abréviation' Utilisation 9-nitroanthracène 9-NA Fullerènes Acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique Peptides de moins de 10 kDa Hydrates de carbone Protéines de plus de 10 kDa Fullerenes Acide 2-(4- hydroxyphénylazo)benzoique 2,4, 6-Tri hydroxyacétophénone Oligonucléotides de moins de 3,5 kDa Hydrates de carbone acide Acide nicotinique Oligonucléotides de plus de 3,5 kDa Dithranol Polymères synthétiques non DIT polaires Lipides Polymères synthétiques polaires Molécules organiques Hydrates de carbone Acide 2,5-dihydroxybenzoique 1-Isoquinolinol Oligosaccharides Oligonucléotides 2, 5-d i hydroxyacétophénone Protéines de plus de 10 kDa Acide sinapique Acide trans-3-indoleacrylique Polymères synthétiques non polaires La matrice consiste en des molécules cristallisées, qui sont, en général, choisies parmi les trois suivantes : l'acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique (acide sinapique/acide sinapinique), l'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (alpha-cyano ou alpha-matrice) et l'acide 2,5-dihydroxybenzoique abrégé DHB. En MALDI-TOF-MS, si la matrice joue un rôle essentiel lors du processus de désorption/ionisation, elle représente également un facteur limitant de la technique dans la mesure où elle génère très souvent et en quantités importantes des ions dans la gamme des bas rapports de masse sur charge (m/z). Ce phénomène rend ainsi la caractérisation des petites molécules, typiquement L'invention a donc pour objet l'utilisation du composé de formule (1) : m (1) dans laquelle m est égal à 1 ou 2, le groupement R1 est choisi parmi les groupements -S(CH2)"-Y avec n un nombre entier choisi parmi 1, 2, 3 et 4 et Y un groupe fonctionnel choisi parmi-CN, -CO2R3 et -OH, avec R3 un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle, tel que par exemple un groupement alkyle en C1-C6, et dans laquelle le groupement R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène, les groupements -Salkyle, tel que par exemple un groupement alkyle en C1-C6, tel que par exemple le groupe -SC2H5 ou le groupe -SCH3, les groupements - SCH2cycloalkyle, tel que par exemple le groupement -SCH2C6H' ou le groupement -SCH2C5H9, et les groupements -SCH2aryle, tel que par exemple le groupement -SCH2C6H5, comme matrice dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser, assistée par une matrice ou MALDI. L'invention a également pour objet un composé de formule (1) : (I) dans laquelle m est égal à 1 ou 2, le groupement R1 est choisi parmi les groupements -S(CH2)ri-Y avec n un nombre entier choisi parmi 1, 2, 3 et 4 et Y un groupe fonctionnel choisi parmi-CN, -CO2R3 et -OH, avec R3 un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle, tel que par exemple un groupement alkyle en C1-C6, et dans laquelle le groupement R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène, les groupements -Salkyle, tel que par exemple un groupement alkyle en C1-C6, tel que par exemple le groupe -SC2H5 ou le groupe -SCH3, les groupements - SCH2cycloalkyle, tel que par exemple le groupement -SCH2C6H' ou le groupement -SCH2C5H9, et les groupements -SCH2aryle, tel que par exemple le groupement -SCH2GH5, à l'exclusion du 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile abrégé MT3P. De plus, l'invention couvre aussi l'utilisation d'un composé tel que défini précédemment ou de 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile pour fabriquer une matrice destinée à être utilisée dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser assistée par matrice ou MALDI. En outre, l'invention concerne un procédé de fabrication d'une matrice destinée à être utilisée dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser assistée par matrice ou MALDI consistant à cristalliser un composé tel que défini précédemment ou le composé 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile. Enfin, l'invention est également relative à un procédé de caractérisation et/ou de quantification de molécules, ayant avantageusement une masse Brève description des figures La figure 1 représente le spectre de Masse (LDI) du MT3P (1) enregistré en mode linéaire (Biflex III Bruker) pour une intensité du laser de 10 %. Les ions majoritaires correspondent à l'ion pseudomoléculaire [M+H]+ (m/z 297.018) d'une part et au fragment [(M+H)-C3HaN]+(m/z 243.009) d'autre part. La figure 2 représente le spectre MALDI-TOF d'un extrait brut (EtOH/H3O» de Senecio vulgaris (Asteraceae) avec le MT3P (1) pour matrice. La figure 3 représente l'abaque 1 = f(C) avec 1 : intensité de l'ion pseudomoléculaire et C : concentration nanomolaire de l'analyte, tracée à partir de spectres MALDI-TOF, avec le MT3P pour matrice, de la codéine (2). La figure 4 représente l'abaque 1 = f(C) avec 1 : intensité de l'ion pseudomoléculaire et C : concentration nanomolaire de l'analyte, tracée à partir de spectres MALDI-TOF, avec le MT3P pour matrice, de l'hyoscyamine (3). Description de l'invention Dans le cadre de l'invention, on entend par : - « extrait organique brut», tout extrait obtenu à partir de matières fraîches ou sèches issues d'êtres vivants tels que, par exemple, Archées, Bactéries, Protistes, Champignons, Plantes, Animaux et n'ayant fait l'objet d'aucune étape ultérieure de purification. On distingue, en particulier, les extraits végétaux bruts. - « liquide biologique », tous les liquides issus des êtres vivants tels que par exemple les êtres vivants d'origine humaine ou animale. On peut citer, par exemple, comme liquide biologique le sang, le plasma, l'urine, le sperme... - « solvant organique », tout composé hydrocarboné utilisé seul ou en association pour solubiliser un ou plusieurs produits. - « alcaloides », des molécules organiques hétérocycliques azotées basiques pouvant avoir une activité pharmacologique. Habituellement, les alcaloides sont des dérivés des acides aminés. On trouve des alcaloides, en tant que métabolites secondaires, principalement chez les végétaux, les champignons et quelques groupes animaux peu nombreux. Outre les alcaloides d'origine naturelle, il existe également des alcaloides synthétiques fabriqués par synthèse telle que la chloroquine, la chloroquinine ou par hémisynthèse. Il existe par exemple un type d'alcaloides contenant deux atomes d'azote dans le noyau aromatique et qui n'est pas d'origine naturelle, c'est le groupe des pyrazoles. Bien que beaucoup d'alcaloides soient toxiques (comme la strychnine ou l'aconitine), certains sont employés dans la médecine pour, par exemple, leurs propriétés analgésiques (comme la morphine, la codéine), dans le cadre de protocoles de sédation (anesthésie) souvent accompagnés d'hypnotiques, ou comme agent antipaludéen (quinine, chloroquinine) ou agent anticancéreux ( vinblastine, vincristine). - «groupement alkyle» un groupement hydrocarboné aliphatique, linéaire ou ramifié, comprenant par exemple un atome de carbone (abrégé Cl) à six atomes de carbone (abrégé C6). - « groupement cycloalkyle », un alkyle cyclique, c'est-à-dire un groupement hydrocarboné aliphatique et cyclique comprenant par exemple de trois atomes de carbone (abrégé C3) à six atomes de carbone (abrégé C6). ^ « groupement aryle » un groupement aromatique pouvant comprendre au moins un hétéroatome. L'invention a donc pour objet l'utilisation du composé de formule (1) : R2 m dans laquelle m est égal à 1 ou 2, le groupement R1 est choisi parmi les groupements -S(CH2)n-Y avec n un nombre entier choisi parmi 1, 2, 3 et 4 et Y un groupe fonctionnel choisi parmi-CN, -CO2R3 et -OH, avec R3 un atome d'hydrogène ou un groupement alkyl en C1-C6, et dans laquelle le groupement R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène, les groupements -S-alkyle, les groupements -SCH2cycloalkyle et les groupements -SCH2aryle, tels que par exemple, les groupements -SCH3, -SC2H5 et - SCH2CeHs, comme matrice dans un dispositif de spectrométrie de masse à 20 désorption/ionisation sous laser, assistée par une matrice ou MALDI. Le dispositif MALDI peut être couplé à un analyseur à temps de vol. Selon un mode de réalisation, R2 est le groupe -SCH3 et/ou n est égal à 2 et/ou Y est un groupe fonctionnel -CN et/ou m est égal à 1. 25 Avantageusement, il s'agit de composés de formule (1) dans laquelle : - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2CN et R2 un groupe -SCH3 ; - m= 1, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2CH3 et R2 est un groupe - SCH3 ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)3CN et R2 est un groupe -SCH3 ; (1) - m= 1, R1 est un groupement -S(CH2)2CN et R2 est un atome d'hydrogène ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2H et R2 est un groupe -SCH3 ; - m= 1, R1 est un groupement -S(CH2)2-CH2OH et R2 est un groupe - SCH3 ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2N3 et R2 est un groupe -SCH3 ; ou - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)CCH et R2 est un groupe -SCH3. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le composé de formule (1) est le 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2- ylthio)propanenitrile ou MT3P. Une telle utilisation est particulièrement avantageuse pour analyser qualitativement et quantitativement une molécule de masse Groupe des Tropanes : Atropine, Hyoscyamine, Cocaine, Ecgonine, Scopolamine. - Groupe des Quinoléines : Acridine, Acide bicinchoninique, Broxyquinoline, Chlorquinaldol, Cinchophen, Clioquinol, Dequalinium, Dihydroquinine, Dihydroquinidine, Hydroxychloroquine, 8-Hydroxyquinoline, lodoquinol, Acide Kynurenique, Mefloquine, Nitroxoline, Oxycinchophen, Primaquine, Quinine, Quinidine, TSQ, Topotecan, acide xanthurénique, Strychnine, Brucine, Veratrine, Cevadine, Echinopsine ; o Aminoquinoléines : Chloroquine, Hydroxychloroquine, Primaquine ; o 8-Aminoquinoléines :Tafenoquine, Rhodoquine, Pamaquine . - Groupe des Isoquinolines : Dimethisoquine, Quinapril, Quinapirilat, Debrisoquine, 2,2'-Hexadecaméthylènediisoquinolinium dichlorure, N- laurylisoquinolinium bromure, Narcéine, Hydrastine, Berbérine ; o Les alcaloides de l'opium : Naturels : Morphine, Codéine, Thébaine, Papavérine, Narcotine, Noscapine ; Semi-synthétiques : Hydromorphone, Hydrocodone, Héroine ; Synthétiques : Fentanyl, Pethidine, Methadone, Propoxyphène. - Groupe des Indoles : o Ergolines : Les alcaloides de l'ergot de seigle (Ergométrine, Ergotamine, Ergosine, Ergovaline, Ergokryptine, Ergocornine, Ergocristine, Acide lysergique, etc.), Ergine, LSD ... o Bêta-carbolines : Harmine, Yohimbine, Réserpine, Emétine. - Groupe des Terpénoides : o Les alcaloides de l'aconit napel : Aconitine ; o Solanidine, Solasodine, Batrachotoxine, Delphinine ; o Stéroides : Solanine, Samandarin. - Groupe des Bétaines (composés d'ammonium quaternaire, ce ne sont pas des alcaloides au sens propre, même si régulièrement classés comme tels) : Muscarine, Choline, Neurine. - Groupes des Pyrazoles. Le ou les molécules de masse Le liquide biologique peut être choisi parmi le sang, le plasma, les liquides des muqueuses génitales, le liquide séminale, le sperme, la glaire cervicale, les liquides de la peau telle que la sueur, les liquides des phanères, les liquides d'épanchement et des cavités closes, les liquides du système 5 digestif et urinaire. L'invention a également pour objet un composé de formule (1) : R2 m dans laquelle m est égal à 1 ou 2, le groupement R1 est choisi parmi les groupements -S(CH2).-Y avec n un nombre entier choisi parmi 1, 2, 3 et 4 et Y un groupe fonctionnel choisi parmi-CN, -CO2R3 et -OH, avec R3 un atome 15 d'hydrogène ou un groupement alkyl en C1-C6, et dans laquelle le groupement R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène, les groupements -Salkyle, les groupements -SCH2cycloalkyle, et les groupements -SCH2aryle ,tels que par exemple le groupement -SCH3, le groupement -SC2H5 et le groupement -SCH2GH5, 20 à l'exclusion du 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile. Avantageusement, R2 est le groupe -SCH3 et/ou n est égal à 2 et/ou Y est un groupe fonctionnel -CN et/ou m est égal à 1 dans ledit composé. Selon un mode de réalisation, il s'agit des composés, où : 25 - m=1, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2CH3 et R2 est un groupe SCH3 ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)3CN et R2 est un groupe -SCH3 ; - m= 1, R1 est un groupement -S(CH2)2CN et R2 est un atome d'hydrogène ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2H et R2 est un groupe -SCHs ; - m= 1, R1 est un groupement -S(CH2)2-CH20H et R2 est un groupe - SCHs ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2N3 et R2 est un groupe -SCHs ; ou - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)CCH et R2 est un groupe -SCHs. L'invention concerne aussi un procédé de fabrication d'une matrice destinée à être utilisée dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser assistée par matrice ou MALDI consistant à cristalliser un composé tel que défini précédemment ou le composé 3-(5-(5- (méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile. Ledit dispositif MALDI peut être un spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée par une matrice et un analyseur à temps de vol. Selon un mode de réalisation, ledit procédé est caractérisé en ce que ledit composé tel que défini précédemment, cristallisé, ou ledit composé de 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile, cristallisé, est ensuite éventuellement dissout dans un solvant organique ou de l'eau comprenant un échantillon à analyser ou directement dissout dans l'échantillon à analyser, ledit solvant ou l'eau étant ensuite, le cas échéant, vaporisé formant au final une matrice cristallisée tel que défini précédemment ou de composé de 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile comprenant l'échantillon à analyser. L'échantillon peut être choisi parmi les extraits organiques bruts et les liquides biologiques. Ce procédé peut avoir lieu avec un rapport molaire (molécules à analyser)/(molécules de matrice) compris entre 1/30 et 1/50, de préférence 1/39. Le MT3P (1) présente les caractéristiques suivantes et les confère à la matrice qu'elle forme ou dans la composition dans laquelle elle entre : - Le MT3P (1) nécessite une faible intensité d'irradiation du laser (5 à 10 %) pour le processus de désorption/ionisation, entraînant peu de fragmentations de l'analyte et de la matrice et l'obtention de spectres de masses MALDI-TOF caractérisés par des rapports signal sur bruit (S/N) élevés ; - Le MT3P (1) présente une très haute sélectivité, vis à vis en particulier des alcaloides, hétérocycles azotés généralement doués d'activités pharmacologiques marquées. L'utilisation du MT3P (1) ne conduit ainsi à aucun résultat probant dans le cas de dérivés tels que stéroides (prégnolone, digitoxine), coumarines (imperatorine, E-notopterol), polyphénols (rutine, amenthoflavone), caroténoides (tocotriénols), peptides (angiotensine II ou glycérides (1,3-diméthylglycérol, glycérol-1,3-distéarate)). A contrario les alcaloides, quelque soit leur squelette de base (indoles, (iso)quinoléines, quinolizidines, pyrrolizidines, tropanes...) sont, dans la très grande majorité des cas, aisément détectés dans les mêmes conditions, tel qu'illustré dans le tableau 2 ci-après. Les spectres obtenus présentent alors, au niveau des ions quasimoléculaires, des S/N équivalents ou supérieurs à ceux obtenus dans le cas de l'usage de matrices classiques telles l'acide 2-cyano-3-(4- hydroxyphenyl)propanoique (HCCA), le ditranol ou l'acide 2,5- dihydroxybenzoique (DHB). Cette excellente sensibilité de détection alliée à une grande spécificité vis à vis des analytes d'intérêt autorise ainsi, par exemple, la caractérisation directe, à partir d'un extrait organique brut de l'éthanol acide de Senecio vulgaris, de la sénécionine, dérivé de la rétronicine mutagène, tératogène et inducteur de tumeurs hépatiques tel que représenté sur le spectre de la figure 2. La présence de sénécionine doit être recherchée dans divers ingrédients alimentaires tels que l'huile de vipérine, Echium plantagineum [règlement (CE) n° 258/97 du Parlement Européen et du Conseil du 27 janvier 1997 ; Scientific Document: Opinion of the Panel on contaminants in the food chain [CONTAM] related to pyrrolizidine alkaloids as undesirable substances in animal feed, The EFSA Journal, 447, 1-51 (2007)]. De très nombreuses analyses (semi)quantitatives sont ainsi réalisables avec une matrice de ou comprenant le MT3P (1). Selon la qualité des abaques obtenues, il est en effet possible de développer des méthodes de dosages spécifiques des alcaloides exploitant la sensibilité très élevée des spectromètres de masse de type MALDI-TOF conduisant à des limites de détection (LOD) ou de quantification (LOQ) très basses telles que représentées sur les figures 3 et 4. C'est le cas de la codéine (2), opioide antalgique et antitussif ou bien de l'hyoscyamine (3), alcaloide mydriatique représentés sur le schéma 1 ci-après. Schéma 1 La matrice de 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2- 15 ylthio)propanenitrile selon l'invention a, en outre, l'avantage de pouvoir être préparée en 3 étapes simples avec un bon rendement de l'ordre de 80 % en poids à partir de produits commerciaux et donc pour un coût modique. Elle présente, en outre, une sélectivité unique vis à vis des alcaloides ce qui autorise leur caractérisation et leur (semi)quantification par MALDI-TOF-MS 20 à partir de mélanges complexes, sans préparations particulières des échantillons et avec d'excellents paramètres de limite de détection ou LOD et de limite de quantification ou LOQ. Le MT3P est constituée d'un chromophore organisé autour d'un système Tc-conjugué plan absorbant à la longueur d'onde (337 nm) des lasers N2 les plus 25 souvent utilisés en SM MALDI-TOF d'une part et pourvue, via un espaceur, d'une fonction nitrile, d'autre part, susceptible de développer des interactions dipolaires avec les fonctions amines ou imines des composés recherchés. II convient finalement de noter que l'emploi du MT3P, ne requiert que de faibles puissances d'irradiation laser et favorise la protonation des analytes. 10 rio r (2) (3) Il faut également souligner que les protocoles de caractérisation ou de dosage des alcaloides ainsi élaborés ne nécessitent aucune modification des spectromètres MALDI-TOF dont la plupart des plateformes analytiques sont aujourd'hui équipées. Dans le cadre des nouvelles réglementations REACH, l'utilisation de cette matrice peut représenter ainsi une aide précieuse au diagnostic lors des études de pharmacovigilance ou de toxicologie. D'autres avantages tels que l'exploitation du MT3P en imagerie MALDI, pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci- dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. EXEMPLES Exemple 1 : Préparation de la matrice MT3P (1) Le composé 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile (1) ou MT3P (1) ci-après est préparé à partir du 2-bromothiophène, en 3 étapes et avec un rendement global de 80 % tel que représenté selon le Schéma 2 ci-après. Les conditions réactionnelles de cette synthèse sont: - pour l'étape i) Magnésium, NidpppClz, Et2O, reflux; - pour l'étape ii) nBuLi, Soufre et 2-bromopropionitrile, THF, température ambiante ; - pour l'étape iii) Hydroxyde de césium et iodométhane, DMF/MeOH, température ambiante. Le détail de ces étapes de cette synthèse est décrit dans le document « Mass Spectrom. », 2006; 41: 830-833. III Schéma 2 Exemple 2 : Préparation de l'échantillon à analyser On solubilise l'analyte dans un solvant organique adapté (e.g. CH2Cl2, McOH, ...) à une concentration de 2,57 mmol/L. La solution préparée est stockée à une température de - 20°C. Avant chaque expérience réalisée en MALDI/TOF (Préparation de la matrice co-cristallisée avec l'échantillon comme expliqué dans la paragraphe suivant), cette solution est portée à température ambiante puis diluée au 1:3 dans McOH. Exemple 3: Préparation de la matrice co-cristallisée avec l'échantillon à analyser On réalise la préparation de la matrice co-cristallisée destinée à être utilisée dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser assistée par matrice ou MALDI pour un seul analyte de la façon suivante : Un équivalent de solution d'analyte à une concentration de 0,861 mmol est mélangé avec deux équivalents de solution de matrice (MT3P) à une concentration de 33,67 mmol. Les concentrations finales sont 0,287 mmol/L pour l'analyte et 11.22 mmol/L pour la matrice. Pour un extrait brut, on peut, par exemple, mélanger un équivalent d'extrait brut (22 mg/mL) avec deux équivalents de matrice concentrée (30 mg/mL = 0,1 mmol/m L). J N^ (1) Exemple 4: Tests de caractérisation d'alcaloïdes par SM MALDI-TOF avec le MT3P (1) pour matrice. Méthode de calibration du spectromètre La calibration du spectromètre est réalisée avec 20 microlitres d'un mélange de PEG400/MeOH dans des proportions en volume de 1/3. Cette solution est mélangée avec 20 microlitres de Ditranol à une concentration de 1010 mg/mL). 0.7 microlitres de cette solution sont déposés sur une coupelle MALDI. L'échantillon est irradié par un laser à un niveau d'énergie entre 35-40%. Les signaux du PEG-Na observés sont utilisés pour la calibration automatisée. On observe une concordance entre les signaux observés et les données de masse de PEG-Na en haute résolution. Les alcaloides testés sont regroupés dans le tableau 3 ci-dessous. Paramètres d'analyse du spectromètre : Les paramètres expérimentaux du MALDI-TOF-MS: Source d'ion 1 : 19.00 kV, Source d'ion 2 : 17.35 kV, Lentilles : 9.60 kV, Pulse pour l'extraction des ions : 200 ns, Fréquence du laser : 5 ns, Offset en tension du gain du détecteur : 1300 V, Gain électronique : 100 mV, Fenêtre d'acquisition : 20-2000 Da Tableau 3 Alcaloide Formule Masse Détection 12- C37H40N20~ monoisotopique + Déméthylthalrugosidine 624,28 Aconitine C34H47NO' 645,31 + + Atropine G7H23NO3 289,17 + + Berbérine C20H,sNO4 336,12 + + + Boldine C,9H2,N04 327,14 + + Cholchicine C22H25NO6 399,17 + + Clavuline C18H19NO4 313,13 + + + Codéine C78H21NO3 299,15 + + Émétine C29H40N2O4 480,30 + + + Fumaritine C20H21 N05 355,14 + + + Harmine C13H12N2O 212,09 + + + L-Hyoscyamine C17H23NO3 289,17 + + Limogine C20H17NO5 351,11 + + + Morphine C17H19NO3 285,14 + + Nicotine ClOH14N2 162.12 - Pilocarpine C'H,6N2O2 208,13 + + Quinidine C20H24N2O2 324,18 + + + Sénécionine C18H25NO5 335,17 + + Spartéine G5H26N2 234,21 + + + Strychnine C21H22N2O2 334,16 + + Stylopine C79H17NO4 323,12 + + + Thalfoétidine C38H42N2O7 638,30 + Thalibérine C37H40N2O6 608,29 + + + Thaliglucinone C21H19NOs 365,13 - Yohimbine C21H26N2O3 354,19 + + 22 Listes des références U.S. No. 6.104.028 ; « The Scientist » 13 [12] : 18, le 7 juin 1999 ; « Biophotonics International», juin 2001, 42-47. CN 101644694 ; « Journal of mass spectrometry », 2007 ; 42 :58-69 ; « Analytica Chimica Acta, 649 (2009), 230-235 ; REVENDICATIONS1. Utilisation du composé de formule (1) : R2 m (1) dans laquelle m est égal à 1 ou 2, le groupement R1 est choisi parmi les groupements -S(CH2).,-Y avec n un nombre entier choisi parmi 1, 2, 3 et 4 et Y un groupe fonctionnel choisi parmi-CN, -CO2R3 et -OH, avec R3 un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle, et dans laquelle le groupement R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène, les groupements -Salkyle, les groupements -SCH2cycloalkyle et les groupements - SCH2aryle, comme matrice dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser, assistée par une matrice ou MALDI. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle R2 est le groupe -SCH3 et/ou n est égal à 2 et/ou Y est un groupe fonctionnel -CN et/ou m est égal à 1. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle : - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2CN et R2 un groupe -SCH3 ; - m=l, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2CH3 et R2 est un groupe - SCH3 ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)3CN et R2 est un groupe -SCH3 ; - m=1, R1 est un groupement -S(CH2)2CN et R2 est un atome d'hydrogène ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2H et R2 est un groupe -SCH3 ; - m=l, R1 est un groupement -S(CH2)2-CH2OH et R2 est un groupe - SCH3 ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2N3 et R2 est un groupe -SCH3 ; ou - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)CCH et R2 est un groupe -SCH3. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 dans laquelle le composé de formule (1) est le 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2- ylthio)propanenitrile. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle ledit dispositif MALDI est couplé à un analyseur à temps de vol. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour analyser qualitativement et quantitativement un mélange de molécules comprenant au moins une molécule de masse 7. Utilisation selon la revendication précédente, dans lequel ladite molécule de masse 8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle les alcaloides sont choisis parmi : 20 - Le groupe des Azolidines ; - Le groupe des Azines ; - Le groupe des Tropanes ; - Le groupe des Quinoléines ; - Le groupe des Isoquinolines ; 25 - Le groupe des Indoles ; - Le groupe des Terpénoides ; - Le groupe des Bétaines ; - Le groupe des Pyrazoles. 30 9. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle les alcaloides sont choisis parmi (i) l'Aniracetam, la Anisomycin, le CX614, le Dextromoramide, le Diphenyl prolinol, l'Acide Domoique, la Histapyrrodine, l'Acide Kainique, la10 Methdilazine, l'Oxaceprol, le Prolintane, la Pyrrobutamine, l'Hygrine, la Cuscohygrine ; (ii) la Pipéridine, la Conicine, la Trigonelline, l'Arecaidine, la Guvacine, la Pilocarpine, la Cytisine, la Nicotine, la Spartéine, la Pelletierine ; (iii), l'atropine, la L-Hyoscyamine, la Cocaine, l'Ecgonine, la Scopolamine ; (iv) l'Acridine, l'Acide bicinchoninique, la Broxyquinoline, le Chlorquinaldol, le Cinchophen, le Clioquinol, le Dequalinium, la Dihydroquinine, la Dihydroquinidine, l'Hydroxychloroquine, la 8-Hydroxyquinoline, l'lodoquinol, l'Acide Kynurenique, la Mefloquine, la Nitroxoline, l'Oxycinchophen, la Primaquine, la Quinine, la Quinidine, le TSQ, le Topotecan, l'Acide Xanthurenique, la Strychnine, la Brucine, la Veratrine, la Cevadine, l'Echinopsine, les Aminoquinoléines tels que la Chloroquine, l'Hydroxychloroquine, la Primaquine, les 8-Aminoquinoléines tels que la Tafenoquine, la Rhodoquine, la Pamaquine ; (v) la Dimethisoquine, le Quinapril, le Quinapirilat, le Debrisoquine, le 2,2'- Hexadecaméthylènediisoquinolinium dichlorure, le N-Laurylisoquinolinium bromure, le Narcéine, l'Hydrastine, la Berbérine, les alcaloides de l'opium naturels tels que la Morphine, la Codéine, la Thébaine, la Papavérine, la Narcotine, la Noscapine, les alcaloides de l'opium semi-synthétiques tels que l'Hydromorphone, l'Hydrocodone, l'Héroine, les alcaloides de l'opium synthétiques tels que le Fentanyl, la Pethidine, la Methadone, le Propoxyphène ; (vi) les Ergolines tels que les alcaloides de l'ergot de seigle tels que l'Ergométrine, l'Ergotamine, l'Ergosine, l'Ergovaline, l'Ergokryptine, l'Ergocornine, l'Ergocristine, l'Acide lysergique, l'Ergine, le LSD, (vii) les Bétacarbolines tels que l'Harmine, la Yohimbine, la Réserpine, l'Emétine ; (viii) les alcaloides de l'aconit napel tel que l'Aconitine, la Solanidine, (ix) la Solasodine, la Batrachotoxine, la Delphinine, (x) les stéroides tels que la Solanine, la Samandarin ; (xi) la Muscarine, la Choline, la Neurine. 10. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 7, dans laquelle ledit mélange est un mélange choisi parmi des extraits organiques bruts , ou toute fraction obtenue à partir desdits extraits organiques bruts, et des liquides biologiques, d'origine humaine ou animale 5 11. Utilisation selon la revendication 10 dans laquelle le liquide biologique est choisi parmi le sang et le plasma, les liquides des muqueuses génitales, les liquides de la peau, les liquides des phanères, les liquides d'épanchement et des cavités closes, les liquides du système digestif et urinaire. 12. Composé de formule (1) : R2 m (1) 10 dans laquelle m est égal à 1 ou 2, le groupement R1 est choisi parmi les groupements -S(CH2)n-Y avec n un nombre entier choisi parmi 1, 2, 3 et 4 et Y un groupe fonctionnel choisi parmi-CN, -0O2R3 et -OH, avec R3 un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle, et dans laquelle le groupement R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène, les 15 groupements -SCH2alkyle, les groupements -SCH2cycloalkyle et les groupements -SCHzaryle, à l'exclusion du 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2- ylthio)propanenitrile. 20 13. Composé selon la revendication 12, où R2 est le groupe -SCH3 et/ou n est égal à 2 et/ou Y est un groupe fonctionnel -CN et/ou m est égal à 1. 14. Composé selon la revendication 12 ou 13, où : - m= 1, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2CH3 et R2 est un groupe 25 SCH3 ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)3CN et R2 est un groupe -SCH3 ; - m= 1, R1 est un groupement -S(CH2)2CN et R2 est un atome d'hydrogène ;- m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2CO2H et R2 est un groupe -SCH3 ; - m=l, R1 est un groupement -S(CH2)2-CH20H et R2 est un groupe - SCH3 ; - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)2N3 et R2 est un groupe -SCH3 ; ou - m =1, R1 est un groupement -S(CH2)CCH et R2 est un groupe -SCH3. 15. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 ou de 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile pour fabriquer une matrice destinée à être utilisée dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser assistée par matrice ou MALDI. 16. Procédé de fabrication d'une matrice destinée à être utilisée dans un dispositif de spectrométrie de masse à désorption/ionisation sous laser assistée par matrice ou MALDI consistant à cristalliser un composé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 ou le composé 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile. 17. Procédé selon la revendication précédente dans lequel ledit dispositif MALDI est un spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée par une matrice et un analyseur à temps de vol. 18. Procédé selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que ledit composé, selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, cristallisé ou ledit composé de 3-(5-(5-(méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile cristallisé est ensuite dissout dans un solvant organique ou de l'eau comprenant un échantillon à analyser, ledit solvant ou l'eau étant ensuite vaporisé formant au final une matrice cristallisée de composé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 ou de composé de 3-(5-(5- (méthylthio)thiophén-2-yl)thiophén-2-ylthio)propanenitrile comprenant l'échantillon à analyser. 19. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'échantillon est choisi parmi les extraits organiques bruts et les liquides biologiques. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, dans lequel le rapport molaire (molécules à analyser)/(molécules de matrice) est compris entre 1/30 et 1/50, de préférence 1/39. 21. Procédé de caractérisation et/ou de quantification de molécules, ayant avantageusement une masse 22. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'échantillon est un liquide biologique choisi parmi le sang, le plasma, les liquides des muqueuses génitales, les liquides de la peau, les liquides des phanères, les liquides d'épanchement et des cavités closes, les liquides du système digestif et urinaire.30