Brevet FR2986707A1 — publié le 20130816

La présente invention concerne une nouvelle composition comprenant un extrait de jus de pomme, utilisable en cosmétique, plus particulièrement une composition comprenant un cryoextrait de jus de pomme, pour assurer ou rétablir le confort de la peau. La peau comprend des couches superficielles, à savoir l'épiderme, et des couches plus profondes, le derme et l'hypoderme, et chacune possède des propriétés spécifiques permettant à l'ensemble de réagir et s'adapter aux conditions de son environnement. L'épiderme, qui est composé de trois types de cellules, à savoir des kératinocytes (90% des cellules épidermiques), des mélanocytes (2 à 3% des cellules épidermiques) et des cellules de Langerhans, constitue la couche externe et joue un rôle fondamental pour assurer la protection et le maintien d'une bonne trophicité. Le derme sert de support à l'épiderme et est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire essentiellement à base de collagène et d'élastine. Les fibres de collagène contribuent à la texture et la tonicité de la peau et l'élastine est responsable de son élasticité. D'autres cellules, comme les macrophages et les leucocytes, sont également présentes dans la couche du derme. L'hypoderme, qui est la couche la plus profonde de la peau, contient les adipocytes qui produisent des lipides pour que le tissu sous-cutané fabrique une couche grasse protégeant les muscles, les os et les organes internes contre les chocs. Ainsi la peau constitue un véritable organe dont la fonction principale est la fonction barrière anatomique isolant l'organisme de son environnement extérieur, tout en constituant une zone d'échange entre le corps et son environnement, et le protégeant contre les agressions externes. Une peau en bonne santé est généralement lisse, douce et souple, avec un teint clair. Il est souhaitable de préserver la santé de la peau et de maintenir son bien-être et son confort. A cet effet, un grand nombre d'extraits de plantes ont été proposés comme matières de compositions cosmétiques, y compris des extraits d'arbres fruitiers, par exemple l'écorce, les feuilles et les fruits, en fonction des effets recherchés, B1 0092FR 2 986 70 7 2 notamment de diverses plantes de la famille des Rosaceae, telles que poiriers et pommiers. Le pommier (Pyrus malus) est un des arbres fruitiers les plus cultivés dans le monde, en Chine, en Amérique du Nord et en Europe, dans des régions 5 généralement tempérées, produisant de nombreuses variétés de fruits. Le fruit du pommier a été utilisé depuis de nombreuses années en cosmétique, par exemple pour préparer des masques que l'on peut appliquer momentanément sur la peau, généralement en vue d'un effet d'hydratation de la peau, et aussi d'un effet légèrement astringent destiné à resserrer les pores de la 1 o peau. Diverses compositions cosmétiques contenant des extraits de pomme ont été proposées en cosmétique, et par exemple des extraits de fruit de Pyrus malus sont utilisés dans des shampooings et dans des crèmes de soins cosmétiques. La pomme contient aussi des pectines qui peuvent être utiles en raison de leur effet 15 hypocholestérolémiant. Ainsi, le brevet FR 2.719.473 décrit une composition cosmétique comprenant un extrait sec de jus de fruit de Rosaceae tel que poire, pomme, prune, abricot, etc, riche en acide malique, en acide citrique et en sorbitol présentant un effet antiradicalaire et un effet favorisant le renouvellement 20 cellulaire. Le brevet EP 1.338.270 décrit l'utilisation de fractions phénoliques d'extraits de fruits de la famille des Rosaceae, notamment la pomme et plus particulièrement l'espèce Malus sylvestris, dont la fraction polyphénolique est riche en dihydrochalcones permettant la préparation de compositions utiles en cosmétique et en nutraceutique pour limiter la surcharge pondérale en raison de 25 l'effet de diminution de l'absorption des sucres par les tissus cutanés résultant principalement de la présence de phloridzine dans les extraits. La pomme contient aussi des pectines qui peuvent être utiles en raison de leur effet hypocholestérolémiant, ainsi des polyphénols à action anti-oxydante. La demande WO 01/24806 décrit des extraits secs de branches de pommier susceptibles de procurer des effets amincissants. Par contre, les études réalisées par la demanderesse sur des kératinocytes humains en culture ont montré de manière inattendue qu'un cryoextrait de jus de pomme pouvait aussi présenter un effet positif sur la libération des bêta-endorphines. Les endorphines sont des peptides opioïdes endogènes, synthétisés par l'organisme, en particulier par l'hypothalamus, se comportant comme une neurohormone procurant des effets analgésiques et euphorisants en se fixant sur les mêmes récepteurs membranaires que la morphine. La sécrétion d'endorphines est donc susceptible de procurer une diminution de la sensation de stress et une amélioration du bien-être. La présente invention a donc pour objet une nouvelle composition cosmétique comprenant un cryoextrait de jus de pomme, en une concentration appropriée, favorisant l'amélioration du confort de la peau par un effet de libération d'endorphines au niveau des kératinocytes. L'invention a également pour objet l'utilisation de cryoextraits de pomme pour la préparation d'une composition cosmétique pour le rétablissement et l'amélioration du confort et du bien-être de la peau. L'invention a encore pour objet un procédé de traitement cosmétique de la peau par application d'une composition à base de cryoextrait de jus de pomme sur la zone de la peau nécessitant un tel traitement, notamment la face et le cou. Plus particulièrement, il a été démontré qu'un cryoextrait de jus de pomme selon l'invention - présente une parfaite innocuité vis-à-vis des kératinocytes humains en culture ; - induit un effet significatif sur la libération de bêta-endorphine au niveau des kératinocytes. Les extraits de jus de pomme suivant l'invention peuvent être obtenus à partir de fruits de pommiers de la famille des Rosaceae, de préférence des espèces Pyrus malus ou Malus sylvestris Mill., Malus domestica, Malus pumila, 2 986 70 7 4 Malus floribunda, Malus coronaria, etc, dont on connaît un grand nombre de variétés. Les extraits utilisés dans la présente invention sont obtenus à partir du jus de pomme, de préférence par cryobroyage. 5 La technique de cryobroyage utilisée dans la présente invention permet de préserver les composants essentiels du jus de pomme et leurs caractéristiques organoleptiques procurant les effets décrits ci-après. Dans le procédé utilisé dans l'invention, toutes les étapes, à partir de la récolte des fruits, sont réalisées à basse température, au contraire des procédés 1 o usuels. Le procédé de cryoextraction comporte essentiellement les étapes suivantes : congélation des pommes à une température comprise entre -10 et -40°C cryobroyage à une température comprise entre -10 et -40°C 15 tamisage à froid extraction dans une chambre de cryo-expression pour obtenir le jus de fruit concentré à froid, en opérant par pressage à une température de l'ordre de -5 à 5°C. séchage à froid entre -40 et -50°C 20 L'étape de congélation des pommes se fait de préférence sur le lieu de la récolte pour éviter tout risque de dégradation des fruits. La température de congélation est de préférence proche de -28°C, c'est-à-dire généralement comprise entre -26 et -30°C. Le cryobroyage permet d'obtenir des particules de dimension moyenne 25 généralement inférieure à 5 mm. Suivant une variante de mise en oeuvre, l'étape de cryobroyage ci-dessus est suivie d'un deuxième cryobroyage à une température plus basse, par exemple de l'ordre de -40 à -100°C. Après cryobroyage on procède de préférence à un tamisage des fractions de produit obtenues. La granulométrie du tamis peut être de l'ordre de 100 à 1.000 pm. La cryo-expression des fragments broyés et tamisés se fait de préférence sous pression à une température comprise entre 5 et -5°C, suivie d'une nouvelle congélation entre -10 et -90°C, par exemple -80°C dans une enceinte refroidie à l'azote liquide. Après ce premier pressage suivie d'une congélation, les particules sont mises en suspension dans un volume d'eau sensiblement égal au volume de liquide extrait au pressage, et on procède ensuite à un nouveau pressage à une température comprise entre 5 et -5°C. Les étapes de cryoexpression, c'est-à-dire les opérations successives de congélation - mise en suspension - pressage, peuvent être répétées deux à six fois. Le liquide provenant du pressage est filtré avec un filtre de granulométrie 100 à 500 pm, et le filtrat est concentré à une température comprise entre 5 et -5°C, de préférence par osmose inverse. Le concentrat est ensuite congelé à une température de l'ordre de -10 à -40°C. Après récupération du jus de fruit congelé, et séchage à froid, on laisse revenir à température ambiante et on ajoute un stabilisant pour assurer la conservation, par exemple l'alcool benzylique et l'acide déhydroacétique. On peut par exemple recourir au mode opératoire décrit dans le brevet EP 425.391. Le cryoextrait peut être lyophilisé et la poudre recueillie broyée, ce qui facilite son incorporation ultérieure dans des compositions cosmétiques. Le procédé utilisé dans l'invention présente l'avantage de ne pas recourir à des solvants d'extraction, l'étape de cryoexpression se faisant sous courant d'eau sous pression. Les extraits de pomme utilisés dans les compositions suivant la présente invention sont de préférence sous forme d'extraits aqueux ou hydroglycoliques, du fruit broyé à froid, à une température inférieure à la température de congélation du jus de pomme. Suivant une forme avantageuse de réalisation, l'extrait utilisable dans la composition de l'invention est obtenu à partir des fruits réduits en poudre par cryobroyage, et dont le jus est extrait comme indiqué ci-dessus puis est stabilisé au moyen d'un conservateur approprié tel qu'alcool benzylique et acide déhydroacétique, permettant d'éviter toute action enzymatique ou oxydante susceptible de dénaturer le produit. Le cryoextrait aqueux de pomme utilisé dans la présente invention a été obtenu à partir de pommes biologiques de Provence (Pyrus malus) et se présente sous la forme d'un liquide de couleur jaune pâle à ambré, d'odeur caractéristique, soluble à 10% dans l'eau et partiellement soluble dans l'éthanol, se caractérisant par : io - pH 3,0 - 5,0 - indice de réfraction à 22°C 1,330 - 1,380 - densité à 20°C 0,950 - 1,050 - matières sèches 1,0 % - AHA (acide citrique) 0,54 - 0,64 g/l 15 - sucres totaux 21,3 - 22,3 g/l L'extrait est relativement riche en acides alpha-hydroxylés (AHA) notamment en acide citrique, qui représentent 3,2 % en matières sèches, et en sucres. Dans la composition selon l'invention, la teneur en cryoextrait de pomme 20 peut être comprise entre 0,5 et 25%, et de préférence entre 2 et 20% en poids par rapport au poids total de la composition, pour procurer les meilleurs effets cosmétiques. Les cryoextraits peuvent être utilisés avantageusement sous une forme encapsulée dans des liposomes. 25 Suivant une technique connue dans la fabrication des compositions cosmétiques, les liposomes sont constitués par des petites sphères creuses, de diamètre généralement inférieur à 500 nm, dont la paroi est formée d'une double couche de lipides tels que des glucolipides ou des phospholipides. Ils peuvent être obtenus par exemple par traitement aux ultrasons d'un mélange d'un soluté aqueux 30 et de lipides. Les lipides (phospholipides ou glucolipides) se réorganisent dans une configuration où l'énergie de l'ensemble est minimale, donc thermodynamiquement la plus stable. Les liposomes sont utilisés dans l'industrie cosmétique pour délivrer des composés à l'intérieur des cellules lorsque le vésicule fusionne avec la membrane plasmique. Suivant une forme de réalisation de l'invention, une partie au moins des cryoextraits est encapsulée dans des vésicules du type liposome. Les compositions conformes à la présente invention sont de préférence administrables par voie topique. Suivant la terminologie classique, l'administration par voie topique désigne toute méthode consistant à appliquer la substance ou la composition directement sur la peau, sur la zone nécessitant le traitement. Conformément à la présente invention, la composition administrable par voie topique peut avantageusement contenir, outre les composants de base décrits ci-dessus, une ou plusieurs autres substances connues pour exercer des effets complémentaires bénéfiques pour la peau, et plus particulièrement le tocophérol, la vitamine A (rétinol), l'acide rétinoïque, le bisabolol, un extrait de Bacopa monnieri, des agents bactéricides, du monométhylsilanol, de la proline, ou encore du beurre de Karité. On peut aussi ajouter à la composition des extraits ou composés connus pour faciliter la pénétration des principes actifs de la composition à travers l'épiderme, par exemple des saponosides du type hédéragénine. Les compositions cosmétiques conformes à la présente invention, sont destinées de préférence à une administration topique, et contiennent donc des supports et excipients couramment utilisés dans des compositions de ce type telles que des émulsions H/E ou E/H, des crèmes, des gels ou des lotions. Dans le cas des émulsions, la phase grasse peut représenter entre 10 et 60% environ du poids de la composition, la phase aqueuse entre 10 et 80% environ et l'agent émulsionnant entre 2 et 20%, le reste étant constitué par les composants de base indiqués ci-dessus et les autres composants mentionnés ci-après. La composition peut encore contenir diverses substances et excipients choisis en fonction de leurs propriétés connues et de la forme galénique envisagée. 2 986 707 8 Ainsi, on peut incorporer dans la composition des conservateurs, des agents émulsionnants, des agents viscosants, des épaississants, des gélifiants, des agents de chélation, des antioxydants, des agents hydratants, des tensioactifs, des parfums, des huiles, des lipides, un solvant spécifique ainsi que de l'eau et divers additifs 5 destinés à améliorer les propriétés physiques de la composition. On peut choisir l'agent émulsionnant parmi des polymères carboxyvinyliques à haut poids moléculaire, des polysorbates, des esters de sorbitan et en particulier un monostéarate tel que le Span 60®, un tristéarate, un monopalmitate, et un laurate de sorbitan. On peut encore utiliser d'autres agents émulsionnants tels que io divers dérivés d'acide stéarique ou palmitique, et par exemple le stéarate de PEG 100®, des mono- ou diglycérides d'acide stéarique ou palmitique, un stéarate de propylène glycol auto-émulsionnable, ou encore le polyglycéryl-2-sesquioléate, l'éther cétylique de polyoxyéthylène, un polyglucoside de siloxane, ou une silicone émulsionnable. 15 Les agents viscosants utilisés dans les compositions de l'invention peuvent être choisis parmi divers polymères d'acide acrylique, un copolymère d'acrylate et de laurate d'acryloyle, une gomme cellulose, une silice, des polymères carboxyvinyliques, un silicate d'aluminium et de magnésium, et on peut utiliser par exemple la silice colloïdale vendue sous la marque Aerosil 200® ou un acide 20 polyacrylique réticulé tel que le Carbopol 940®. Les gélifiants ou épaississants peuvent être choisis par exemple parmi les polyacrylamides, des acrylates comme le Pemulen®, les dérivés de cellulose comme l'hydroxypropyl cellulose, ou les gommes naturelles. Les agents de chélation permettent d'améliorer la stabilité des produits 25 dans le temps et peuvent être choisis par exemple parmi l'EDTA disodique ou tétrasodique, l'acide oxalique ou l'acide galactarique. Les agents hydratants utilisés peuvent être choisis par exemple parmi un polyol, le sorbitol, le maltitol, le xylitol, le pentaérythritol, le butylène glycol, l'alcool D-panthotényl (Panthenol), les polyacrylates et polyméthacrylates de 30 glycéryle, le glycérol ou des dérivés de glycérol ou une argile hydratante comme le Veegum HV (silicate de magnésium / aluminium) qui a aussi pour effet de stabiliser l'émulsion. On peut aussi ajouter des émollients tels qu'un malate d'alkyle, l'isohexadécane, des triglycérides d'acide caprique ou caprylique, etc. Les conservateurs usuels de la technique des compositions dermatologiques ou cosmétologiques peuvent être utilisés dans l'invention, et par exemple l'acide déhydroacétique et son sel de sodium, l'acide benzoïque et un p-hydroxybenzoate d'alkyle tel que le p-hydroxy-benzoate de méthyle (Méthylparaben), un alcool tel que le phénoxy-éthanol, l'alcool benzylique ou encore la chlorphénésine ou l'imidazolidinyl urée. Les constituants de la phase grasse, c'est-à-dire les huiles et lipides, peuvent être choisis parmi l'huile de jojoba, l'huile de maïs, l'huile de vaseline, l'huile d'amandes douces, l'huile de coco hydrogénée, l'huile de carthame, des glycérides d'acides gras saturés, l'acide stéarique, l'acide palmitique, le stéarate d'octyle, le palmitate de glycéryle, le palmitate d'octyle, un triglycéride d'acides caprique et caprylique, le 2-octyl-dodécanol, le polyéthylène glycol, l'adipate d'éthyl-2 hexyle, ou encore des huiles de silicones telles que le méthyl phényl polysiloxane, la diméthicone, la cyclométhicone et la phényl diméthicone. La composition peut aussi contenir un solvant choisi en fonction des composants utilisés et de la forme d'administration envisagée. Le solvant peut être par exemple de l'eau, et de préférence de l'eau déminéralisée, ou un solvant spécifique tel que le propylène glycol, le butylène glycol-1,3, le butylène glycol-1,4, un éther de diéthylène glycol, ou un alcool tel que l'éthanol. Des agents de protection contre les rayons ultraviolets peuvent aussi être avantageusement incorporés dans les compositions, et par exemple des filtres solaires UV-A et UV-B hydrophiles ou lipophiles. On peut aussi utiliser des pigments formant écran anti-ultraviolet, comme par exemple le dioxyde de titane, l'oxyde de zinc et l'oxyde de zirconium. Le pH de la composition est de préférence compris entre 5,3 et 7,5, et peut être ajusté, selon les compositions, par addition d'un acide tel que l'acide citrique ou d'une base telle que l'hydroxyde de sodium ou de potassium. 2 986 70 7 10 La composition conforme à la présente invention peut être présentée sous les formes classiquement utilisées pour une application topique, c'est-à-dire sous forme de gel, lotion, émulsion (en particulier crème ou lait), patchs transdermiques, masque ou pommade, contenant des excipients et supports usuels 5 compatibles et physiologiquementacceptables. Ces formes d'administration par voie topique sont préparées par les techniques connues, et par exemple, dans le cas d'une crème, par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse pour obtenir une émulsion huile dans eau, ou inversement pour préparer une émulsion eau dans huile. Dans le cas de crèmes, on préfère utiliser des émulsions à io structure lamellaire contenant peu de produits éthoxylés ou n'en contenant pas du tout. L'extrait de pomme utilisé dans l'invention est introduit dans la phase aqueuse ou alcoolique. A titre d'exemple, on peut préparer des compositions topiques conformes à l'invention sous forme de crèmes, de lotions ou de gels, utilisables en une ou 15 plusieurs applications quotidiennes, la durée du traitement pouvant être généra- lement de l'ordre de un à trois mois ou davantage, les compositions pouvant être utilisées sans inconvénient de manière continuelle. Les exemples de compositions donnés ci-après illustrent l'invention sans en limiter la portée. Sauf indication contraire, les parties et pourcentages sont 20 indiqués en poids. Exemple 1 Une lotion tonique à base de cryoextrait de pomme ayant la composition indiquée ci-après est préparée suivant les techniques usuelles : Cryoextrait de pomme 15,00 25 Eau de tilleul 5,00 Eau de camomille romaine 5,00 Eau de laitue 5,00 Panthenol 5,00 Butylène glycol-1,3 5,00 2986 707 11 Aspartate de lysine 0,50 Acide pyrrolidone carboxylique 0,20 Parfum hydrosoluble 0,20 Acide galactarique 0,10 5 Dehydroacétate de sodium 0,10 Eau déminéralisée q.s.p. 100,00 Ces ingrédients sont mélangés à température ambiante et la solution est ensuite filtrée pour obtenir une lotion tonique. Les pommes utilisées pour préparer le cryoextrait incorporé dans cette composition sont des pommes biologiques de 10 Provence. Cette lotion est utilisée en application topique, une à deux fois par jour sur les zones de la peau à traiter, par exemple sur le visage et le cou, pendant une période de 1 à 3 mois selon l'effet recherché. Exemple 2 15 Une crème à base de cryoextrait de pomme biologique de Provence ayant la composition indiquée ci-après est préparée suivant les techniques usuelles : Phase A Eau déminéralisée q.s.p. 100,00 Gomme de cellulose et cellulose microcristalline 1,50 20 Gel d'Aloes lyophilisé 0,10 Butylène glycol-1,3 4,00 Glycérine 4,50 Sclerotium gum et gomme xanthane 0,30 Acide galactarique 0,10 25 Hyaluronate de sodium 0,10 Phase B Glycéryl stéarate + alcool béhénylique + Lécithine + Stérols de soja + Tocophérol 4,00 Glycéryl stéarate citrate 1,00 2 986 707 12 Acacia decurrens / Jojoba / Cire de tournesol Polyglyceryl-3 esters 0,60 Triglycérides caprique / caprylique 4,50 Coco caprylate 1,50 5 Tocophérol 0,10 Phase C Dehydroacétate de sodium 0,15 Alcool benzylique 0,30 Eau déminéralisée 5,00 10 Phase D Cryoextrait aqueux de pomme 10,00 Eau de mélisse 5,00 Phase E Parfum 0,30 15 La phase aqueuse A est chauffée à 70°C pour former un gel tandis que la phase grasse B est chauffée à environ 70°C pour faire fondre les composants, puis les deux phases sont mélangées soigneusement sous agitation. La phase C, après homogénéisation, est ajoutée au mélange à la température d'environ 60°C, puis la phase D à 50°C environ. L'ensemble est mélangé et refroidi progressivement. 20 Cette crème peut être utilisée par application sur les zones de la peau à traiter, une à deux fois par jour, pendant une période de un à trois mois. Exemple 3 Une crème de nuit à base de cryoextrait de pomme biologique de Provence ayant la composition indiquée ci-après est préparée suivant les techniques 25 usuelles : Phase A Eau déminéralisée q.s.p. 100,00 Chlorphénésine 0,25 EDTA disodique 0,10 Butylène glycol-1,3 4,00 Glycérine 3,00 Gomme Xanthane 0,30 Veegum HV 0,20 Phase B Tocophérol 0,70 PEG 100 stéarate et Glycéryl stéarate 4,00 Alcool béhénylique 2,50 Triglycérides caprique / caprylique 2,00 io Propyl heptyl caprylate (and) Tocophérol 1,50 Phase C Starch octenyl succinate 1,50 Phase D Hyaluronate de sodium 1,00 15 Eau déminéralisée 10,00 Phase E Bisabolol 0,05 Phase F Dehydroacétate de sodium 0,15 20 Alcool benzylique 0,20 Eau déminéralisée 5,00 Phase G Cryoextrait aqueux de pomme 10,00 Extrait de Bacopa monnieri 1,00 25 Phase H Parfum 0,20 Les phases A et B sont chauffées à 80°C puis mélangées soigneusement. La phase C est chauffée et ajoutée au mélange précédent à 65°C, puis les phases D à G sont ajoutées successivement à 50°C. La parfum est ajouté à 40°C environ. 30 Le pH est ajusté à 6,2 par addition de lessive de soude au 1/10. Exemple 4 Évaluation de la cytotoxicité La cytotoxicité des cryoextraits de pomme suivant l'invention a été étudiée vis-à-vis de kératinocytes humains en culture. la méthode utilisée est celle de la digestion enzymatique permettant d'obtenir des primocultures de kératinocytes à partir d'une biopsie de peau humaine. Les essais sont effectués sur des kératinocytes entre le 2ème et le 4ème passage afin d'assurer une bonne reproductibilité entre les différents essais. Quatre lots ont été constitués : Lot n° 1 : témoin ne recevant aucun produit. Lot n° 2 : traité avec le cryoextrait aqueux à 0,1 % Lot n° 3 : traité avec le cryoextrait aqueux à 0,5 % Lot n° 4 : traité avec le cryoextrait aqueux à 1,0 % Chaque lot a été maintenu au contact des kératinocytes humains en culture pendant 24 heures. La viabilité cellulaire a été déterminée par le test de réduction au bleu de Formazan (test MTT) après 24 heures d'incubation des cellules de kératinocytes. Après incubation des cellules avec le produit à l'étude aux différentes concentrations indiquées ci-dessus, les puits contenant les cellules sont vidés par retournement doux et le tapis cellulaire est rincé avec le milieu de culture. On distribue dans tous les puits 200 pl d'une solution de MTT (bromure de 3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) diluée au moment de l'emploi (1/10), puis les plaques sont incubées à 37°C pendant 3 heures. Les puits sont à nouveau vidés par retournement doux et remplacés pendant 1 minutes par 200 pl d'une solution de formo-calcium pour fixer le tapis cellulaire. On observe alors la formation de cristaux de bleu de Formazan. Les cellules sont ensuite lysées et les cristaux de bleu de Formazan sont dissous par addition de 200 pl de diméthylsulfoxyde (DMSO). Après homogénéisation de la coloration par agitation, la densité optique (DO) des plaques est lue, au moyen d'un spectro- photomètre à 570 nm, ce qui permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. Les valeurs de la densité optique (DO) après 24 heures de contact sont regroupées dans le tableau ci-dessous. Substance Densité optique DO 570 nm % Lot n°1 (témoin) 0,459 ± 0,03 - Lot n°2 (0,1 %) 0,462 ± 0,03 ns Lot n°3 (0,5 %) 0,455 ± 0,02 ns Lot n°4 (1,0 %) 0,460 ± 0,04 ns Ces résultats montrent que les cryoextraits de pomme utilisés dans l'invention ne présentent aucune cytotoxicité vis-à-vis des kératinocytes humains en culture aux concentrations étudiées. Exemple 5 io L'étude de l'effet des cryoextraits utilisés dans l'invention sur la libération de la bêta-endorphine a été effectuée comme indiqué ci-après. L'évaluation de l'effet des cryoextraits a été faite sur les mêmes kératinocytes humains en culture que ceux de l'Exemple 4. Les lots témoin et cryoextrait à concentration variant de 0,1 à 1,0 % ont été 15 constitués comme dans l'Exemple 4. L'essai a été réalisé en triplicate après 24 heures de contact des cellules avec chaque lot. Le dosage de la bêta-endorphine libérée a été effectué au moyen d'un kit de dosage ELISA de Kamiya Biomedical Company. Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous. Substance Concentration de bêta-endorphine % (pg/ml) Lot n°1 (témoin) 29,8 ± 1,1 - Lot n°2 (0,1 %) 31,4 ± 2,1 ns Lot n°3 (0,5 %) 33,0 ± 1,6 + 11 Lot n°4 (1,0 %) 34,1 ± 1,0 + 14 Ces résultats montrent que le cryoextrait de l'invention, aux concentrations de 0,5 % et 1,0 %, induit une augmentation significative de la libération de bêta-endorphine au niveau des kératinocytes humains en culture, l'augmentation étant de 11 % et 14 % respectivement.