Brevet FR2983870A1 — publié le 20130614

COMPOSITION EN METHIONINE DESTINEE A L'ALIMENTATION ANIMALE La présente invention concerne une nouvelle composition 5 de méthionine liquide issue des eaux mères de cristallisation de la méthionine produite par fermentation. La méthionine, comme d'autres acides aminés soufrés, est indispensable au métabolisme cellulaire. La méthionine n'est toutefois pas produite par les animaux, qui doivent alors en 10 trouver en quantités suffisantes dans leur alimentation. Elle est produite de manière industrielle pour être ajoutée comme complément alimentaire, en particulier en alimentation animale. La méthionine peut aussi être employée comme médicament dans le traitement ou la prévention de maladies 15 diverses comme les allergies ou les fièvres rhumatoïdes. Les sources usuelles de méthionine sont soit les protéines d'origine animale, soit la synthèse chimique. Toutefois, la diminution de l'utilisation des protéines animales suite au développement de l'encéphalopathie spongiforme bovine 20 (ESB), ou de la grippe aviaire, a conduit à une augmentation de la demande en méthionine de synthèse. La D,L-méthionine est généralement produite à partir de ressources fossiles et de dérivés de la pétrochimie, en particulier à partir d'acroléine, de méthyle mercaptan et de 25 cyanures. L'obtention de l'énantiomère L plus actif, nécessite des étapes supplémentaires de résolution de racémique qui en augmentent drastiquement les coûts de production. Aujourd'hui, la production de méthionine par biotransformation constitue une alternative avantageuse à la 30 pétrochimie du fait de la raréfaction des ressources fossiles et de l'augmentation du coût des matières premières. La mise en oeuvre de ces procédés nécessite toutefois de disposer de microorganismes appropriés pour produire de la méthionine par fermentation sur une source de carbone. Les premières solutions efficaces industriellement ont été publiées, et notamment décrites dans les demandes de brevet WO 2005/111202, WO 2007/017710, WO 2007/077041 et WO 2009/043803. D'autres microorganismes produisant de la méthionine sont 5 également décrits dans les demandes de brevet WO 2004/038013, WO 2006/001616, WO 2006/138689 et WO 2007/012078, notamment. La production à grande échelle de méthionine biosynthétique rencontre toutefois des problèmes propres à la récupération des molécules chimiques dans un fermenteur, 10 notamment pour la purification des produits finis. Dans ce cas, la qualité du mélange brut obtenu, la teneur en impuretés et leur nature revêtent une grande importance. La présente invention concerne donc une nouvelle composition liquide de méthionine dont la teneur en méthionine 15 la rend directement utilisable en alimentation animale. La composition de méthionine selon l'invention est issue des eaux mères de cristallisation de la méthionine produite par fermentation. Cette fermentation est réalisée classiquement par des 20 microorganismes cultivés sur un milieu de culture approprié comprenant une source de carbone. Les sources de carbone sont choisies parmi toutes les sources de carbone susceptibles d'être métabolisées par un microorganisme, et en particulier le glucose, le sucrose, les 25 monosaccharides ou oligosaccharides, l'amidon et ses dérivés et leurs mélanges. La composition selon l'invention peut se distinguer des compositions de méthionine obtenues par d'autres procédés par la nature et/ou la teneur des impuretés présentes. 30 La composition de méthionine selon l'invention, issue des eaux mères de cristallisation de la méthionine produite par fermentation, comprend de 30 % à 50 % en poids de méthionine et présente une matière sèche comprise entre 20 % et 75 % en poids. Sauf indication contraire, les pourcentages sont donnés ici en poids par rapport au poids total en résidus secs de la composition. La composition selon l'invention est une composition qui 5 comprend généralement d'autres résidus issus du procédé de fermentation de la méthionine et en particulier d'autres acides aminés. La composition de l'invention comprend ainsi moins de 0,5 % en poids d'isoleucine. 10 La teneur en acides aminés autres que la méthionine et l'isoleucine, est avantageusement comprise entre 7 et 10 % en poids. La teneur en N-acétyl-méthionine est comprise entre 0,9 et 1,3 % en poids. 15 La composition selon l'invention comprend également et avantageusement moins de 5 % en poids de sucre. La composition en méthionine selon l'invention est susceptible d'être préparée par un procédé comprenant les étapes suivantes à partir du milieu de fermentation d'un microorganisme 20 producteur de méthionine : 1) clarification du milieu de fermentation et élimination des impuretés organiques insolubles et solubles dudit milieu de fermentation 2) de manière optionnelle, déminéralisation du milieu de 25 fermentation clarifié afin d'éliminer les cations et anions dudit milieu de fermentation, 3) cristallisation de la méthionine à partir de la solution liquide ainsi obtenue, et récupération des eaux mères de cristallisation, 30 4) ajustement du pH des eaux mères de cristallisations de manière à se placer à une valeur de pH pKa2 de la méthionine, 5) filtration, de manière optionnelle, et concentration des eaux mères ainsi traitées, 35 6) récupération de la composition en méthionine obtenue. La société Demanderesse tient à préciser ici que les trois premières étapes de ce procédé sont communes à celles qu'elle a déjà décrites dans sa demande de brevet internationale WO 2011/045377. La première étape du procédé de préparation de la composition de méthionine conforme à l'invention consiste ainsi à clarifier le milieu de fermentation et à éliminer les impuretés organiques insolubles et solubles dudit milieu de fermentation. On entend au sens de l'invention par « impuretés organiques insolubles » la biomasse, les protéines et les 10 particules insolubles résiduelles. Par « impuretés organiques solubles », on entend toutes les particules solubles contaminant le milieu de fermentation, notamment les macromolécules du type protéines solubles et des polysaccharides. 15 La composition de méthionine selon l'invention peut être issue de tout procédé de fermentation de méthionine avec culture d'un microorganisme optimisé pour favoriser la synthèse de méthionine, qu'il s'agisse d'une bactérie, de levures ou de champignons (moisissures). 20 Avantageusement, le microorganisme est choisi parmi les Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae et Corynebacteriaceae. Plus particulièrement, le microorganisme est une espèce choisie parmi les espèces Escherichia, Klebsiella, Pantoea, 25 Salmonella ou Corynebacterium. Plus particulièrement encore, le microorganisme est choisi parmi les espèces Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, la 30 composition de méthionine selon l'invention provient de la culture des microorganismes décrits dans la demande de brevet WO 2009/043803, et plus particulièrement les microorganismes décrits dans les exemples de réalisation. La clarification du milieu est ensuite réalisée par toute méthode connue en tant que telle par l'Homme du métier, méthode choisie par exemple dans le groupe constitué de la floculation, de la décantation, des techniques membranaires (microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration et osmose inverse) et de la centrifugation. L'élimination des impuretés organiques solubles est réalisée par toute méthode connue en tant que telle par l'Homme du métier, méthode choisie par exemple dans le groupe constitué de l'ultrafiltration, du traitement thermique, du traitement à l'aide d'un adsorbant de type charbon actif et de l'hydrolyse enzymatique. La deuxième étape du procédé de préparation de la composition de méthionine conforme à l'invention, que l'on peut mettre en oeuvre ici de manière optionnelle, consiste ensuite à déminéraliser ledit milieu de fermentation clarifié afin d'éliminer les cations et anions dudit milieu de fermentation. Cette étape peut en ce cas être réalisée par électrodialyse conventionnelle ou EDC (EURODIA®) et/ou par traitement sur résine échangeuse de cations sous forme H' (PUROLITE® C120, PUROLITE® C150, PUROLITE® C160 ...) et/ou résine échangeuse d'anions (LEWATIT® 54228, LEWATIT® 54528, Rohm & Haas FPA91 ...). Le traitement par résines échangeuses d'ions sera préféré 25 à l'EDC pour des raisons de coût et d'efficacité d'abattement des sels. La troisième étape du procédé de préparation de la composition de méthionine conforme à l'invention consiste enfin à cristalliser la méthionine de manière à récupérer la 30 méthionine sous forme solide, mais surtout, au sens de l'invention, afin de récupérer et valoriser les eaux mères de cristallisation. Cette étape de cristallisation peut être réalisée par une technologie choisie dans le groupe constitué de la cristallisation par refroidissement, de la cristallisation par évapocristallisation et de la cristallisation adiabatique. La société demanderesse recommande d'utiliser l'évapocristallisation. Si l'évapocristallisation est choisie, la société Demanderesse recommande de pré-concentrer la solution de méthionine par évaporation sous vide à l'aide d'un évaporateur à film tombant afin de s'approcher de la sursaturation. La solution pré-concentrée est alors transférée dans un 10 cristallisoir de type Draft tube, par exemple, pour y être concentrée davantage et pour cristalliser. La solubilité de la méthionine à 35°C est d'environ 70 g/l. En concentrant la solution à environ 250 g/1, sous un vide assurant une température de 35°C, le rendement de 15 récupération en méthionine est > 70%. Classiquement, dans les procédés de cristallisation, les eaux mères proprement dites sont concentrées et recyclées en tête dudit procédé de cristallisation, afin d'augmenter le rendement en cristallisation. 20 C'est ainsi qu'elle-même dans sa propre demande de brevet internationale WO 2011/045377, la société Demanderesse, constatant que les eaux mères de cristallisation contenaient encore près de 40 % en poids de méthionine par rapport au poids total en résidus secs, conseillait alors d'optimiser le 25 rendement global en méthionine cristallisé, en recyclant les eaux mères en amont du procédé, en totalité ou en partie, sous forme liquide ou après un second jet de cristallisation, avant ou après un traitement approprié. La société Demanderesse va donc à l'encontre de ce 30 préjugé technique en choisissant dorénavant de valoriser lesdites eaux mères, non pas comme coproduit à recycler, mais bien comme la source directe d'une composition de méthionine à valeur ajoutée. Le procédé de préparation de la composition de méthionine conforme à l'invention consiste donc à ajouter au procédé les trois dernières étapes complémentaires suivantes. La quatrième étape consiste à ajuster le pH des eaux 5 mères de cristallisation de manière à se placer à une valeur de pH pKa2 de la méthionine. Dans un premier mode préférentiel de réalisation du procédé conforme à l'invention, on ajuste le pH des eaux mères 10 de cristallisation de manière à se placer à une valeur de pH pKa2 de la méthionine par alcalinisation des eaux mères. La société Demanderesse recommande d'alcaliniser avec de la soude 50% jusqu'à une valeur de pH supérieure à 9,3 (pKa de la fonction amine de la méthionine). 25 La cinquième étape peut consister à filtrer la solution, afin de retirer un précipité composé notamment de xanthine, pour ensuite concentrer des eaux mères ainsi traitées. Suivant le premier mode préférentiel de réalisation, la solution acidifiée est ensuite filtrée sur membrane de porosité 30 5 pm, et concentrée jusqu'à obtenir un pourcentage en matière sèche compris entre 20% et 75 % en poids. Suivant le second mode préférentiel de réalisation, la solution alcalinisée est filtrée et concentrée jusqu'à obtenir un pourcentage en matière sèche compris entre 20% et 75% en 35 poids. La sixième étape consiste quant à elle à récupérer la composition de méthionine liquide conforme à l'invention. La composition selon l'invention peut avantageusement être employée directement dans l'alimentation animale comme complément ou additif alimentaire fourni aux animaux, mélangé au bol alimentaire fourni à chaque animal, en prémélange, sous la forme d'une composition prémélangée ou de manière extemporanée, ou de manière indépendante des autres aliments. L'invention concerne donc également un additif alimentaire l'invention. L'homme comprenant la composition de méthionine selon du métier connait bien les quantités en méthionine nécessaires à l'alimentation animale dans un régime alimentaire approprié à chaque animal et saura donc déterminer 15 comment employer la composition selon l'invention et en quelle quantité. En particulier, la composition selon l'invention est particulièrement adaptée pour son apport en oligoéléments et en eau pour faciliter le dosage, le mélange et l'hydratation des 20 aliments habituels de l'animal. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Ils ne sont toutefois donnés ici qu'à titre illustratif et non limitatif. 25 Exemple Une souche de Escherichia coli productrice de méthionine de génotype MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcv-THP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA 30 ApurU (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA- serC), décrite dans la demande de brevet WO 2009/043803, est cultivée dans des conditions de culture de fermentation selon la méthode décrite dans cette même demande de brevet. Le moût de fermentation issu de la mise en oeuvre de 35 ladite souche est purifié comme suit. A) Elimination des impuretés organiques insolubles (biomasse) L'élimination est réalisée par filtration tangentielle sur membrane présentant un diamètre de pore de 100 nm, entre 40 5 et 80°C (membrane de type céramique de 3,5 mm de diamètre de canal). La température est maintenue préférentiellement à 40°C avec une pression transmembranaire de 1 bar et une diafiltration avec 20 % d'eau déminéralisée. 10 Dans ces conditions, le flux moyen est de 30 1/h/m2 et le perméat obtenu est limpide et brillant. Le perméat, débarrassé de la biomasse et des particules insolubles, contient encore des impuretés organiques solubles, notamment des sucres et protéines solubles qu'il convient 15 d'éliminer avant cristallisation. B) Elimination des impuretés organiques solubles (sucres et macromolécules solubles) Cette étape a pour objectif d'éliminer les sucres (polysaccharides) et les macromolécules contenues dans le moût 20 de fermentation. Cette élimination est réalisée par ultrafiltration sur membrane céramique présentant un seuil de coupure de 5 kDa. A 40°C, le flux de filtration est en moyenne de 25 1/h/m2 et environ 70 % des macromolécules sont retenus dans le rétentat. 25 D) Cristallisation La solution précédente est pré-concentrée par évaporation de l'eau à 50°C sur un évaporateur sous vide à film tombant de type WIEGAND®. Le facteur de concentration est de l'ordre de 2 à 5 selon 30 la concentration initiale en L-méthionine. Il est ici égal à 3 pour se rapprocher de la sursaturation à 50°C (80 g/1). La solution pré-concentrée est alors transférée dans un évapocristallisoir à circulation forcée pour y être concentrée 35 davantage et cristalliser sous vide (50 mbars) à environ 35°C. Le facteur de concentration appliqué dans cet évapocristallisoir est d'environ 3, de façon à atteindre 240 g/l. Après séparation sur essoreuse ROUSSELET® avec une toile polypropylène (120 m3/m2/h) et lavage avec un volume d'eau 5 déminéralisée par volume de gâteau, les cristaux sont séchés sur un lit fluidisé à 45°C (type AEROMATIC®) Dans ces conditions le rendement de récupération de L-méthionine est > 80 % pour une pureté > 85 %/sec. Les eaux mères de cristallisation, quant à elles 10 présentent une composition décrite dans le Tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 G / 100 g de résidu sec Composition Eaux mères de cristallisation L-Méthionine (L-MET) 30 - 70 N-acétyl Méthionine 1,3 - 2 (NAM) Isoleucine REVENDICATIONS1. Composition de méthionine liquide, issue des eaux mères de la cristallisation de la méthionine produite par fermentation caractérisée, en ce qu'elle comprend de 30 % à 50 % en poids de méthionine, et qu'elle présente une matière sèche comprise entre 20 % et 75 % en poids. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en 10 ce qu'elle comprend moins de 0,5 % en poids d'isoleucine et entre 0,9 % et 1,3 % de N-acétyl-méthionine. 3. Composition selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la teneur en acides aminés autres 15 que la méthionine et l'isoleucine, est comprise entre 7 % et 10 % en poids. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la teneur en sucre est inférieure 20 à5 5. Procédé de préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes à partir du milieu de fermentation d'un 25 microorganisme producteur de méthionine : a. clarification du milieu de fermentation et élimination des impuretés organiques insolubles et solubles dudit milieu de fermentation, b. de manière optionnelle, déminéralisation du milieu de 30 fermentation clarifié afin d'éliminer les cations et anions dudit milieu de fermentation, c. cristallisation de la méthionine à partir de la solution liquide ainsi obtenue, et récupération des eaux mères de cristallisation,d. ajustement du pH des eaux mères de cristallisation de manière à se placer à une valeur de pH pKa2 de la méthionine, e. filtration, de manière optionnelle, et concentration de ladite solution, et f. récupération de la composition en méthionine ainsi obtenue. 6. Utilisation d'une composition selon l'une des 10 revendications 1 à 4, ou susceptible d'être préparée selon le procédé de la revendication 5, comme complément ou additif alimentaire pour l'alimentation animale. 7. Additif alimentaire pour l'alimentation animale, 15 caractérisé en ce qu'il comprend une composition selon l'une des revendications 1 à 4 ou susceptible d'être préparée selon le procédé de la revendication 5.