Brevet FR2987371A1 — publié le 20130830

Domaine de l'invention La présente invention se situe dans le domaine des composés biologiques à action thérapeutique ou non thérapeutique ayant une action sur la différenciation cellulaire. L'invention concerne une méthode in vitro permettant d'identifier ou d'évaluer l'efficacité de composés modulateurs de la différenciation cellulaire. Cette méthode met en oeuvre la mesure de l'expression du micro-ARN miR-203 exprimé dans des kératinocytes en culture, en particulier lors de la différenciation kératinocytaire. Arrière-plan de l'invention L'épiderme, épithélium stratifié kératinisé auquel sont appendus des annexes, follicules pilosébacés et glandes sudorales, est constitué en majorité (90%) de cellules épithéliales d'origine ectodermique, les kératinocytes. C'est un tissu en renouvellement permanent, dans lequel le nombre de cellules reste relativement constant. L'équilibre entre prolifération et différenciation kératinocytaire est fondamental, pour assurer une architecture correcte à l'épiderme et lui conférer une fonction barrière protectrice en maintenant une hydratation satisfaisante de la peau. L'épiderme se régénère continuellement et ce renouvellement constant est réalisé à partir de cellules de la couche basale comprenant des cellules souches épidermiques qui présentent un haut potentiel prolifératif, une grande capacité à s'auto-renouveler et à générer des cellules filles ou cellules à amplification transitoire. Après quelques cycles de division, les cellules à amplification transitoire entament un processus de différenciation terminale, dénommé différenciation kératinocytaire. Les cellules à amplification transitoire arrêtent alors de se diviser pour se différencier progressivement en cornéocytes au cours de leur migration vers les couches externes de l'épiderme. Lors du processus normal de différenciation, les kératinocytes des couches épineuse et granuleuse ont perdu leur potentiel prolifératif mais sont encore vivants et fonctionnels. Le passage des kératinocytes de la couche basale à la couche épineuse est caractérisé par un changement d'expression des kératines de la couche basale (K5, K14, K15) vers celles de kératines épidermiques suprabasales, les kératines K1 et K10, et par la production de l'involucrine, marqueur précoce de la différenciation, et de granules lamellaires dans ses couches supérieures. La couche granuleuse est caractérisée par la présence des grains de kératohyaline et l'expression de marqueurs tardifs de différenciation, tels que la loricrine et la filaggrine. La différenciation des cellules granuleuses résulte dans la formation d'une zone de transition qui sépare les couches -2- épidermiques vivantes de celles dites « mortes » de la couche cornée. C'est dans cette zone que les constituants de la cellule granuleuse sont profondément remodelés, pour finalement aboutir à la formation des cornéocytes de la couche cornée. Cet équilibre est conditionné par un grand nombre de facteurs diffusibles (facteurs de croissance et de différenciation, calcium extracellulaire, cytokines, hormones, vitamine A, vitamines D, etc.) produits par les cellules épidermiques elles mêmes, mais aussi par les interactions entre kératinocytes et cellules dermiques, pouvant agir en synergie ou de manière antagoniste. L'étude de la différenciation des kératinocytes permet une meilleure compréhension du renouvellement de l'épiderme et des pathologies liées à la différenciation de ces cellules, telles que par exemple le psoriasis. Cette différenciation kératinocytaire peut ainsi être mise en évidence grâce au suivi de l'expression de marqueurs spécifiques de la différenciation tels que l'involucrine, la loricrine et la profilaggrine/filaggrine ou encore la transglutaminase. A cet effet, on peut utiliser des anticorps ou des tests enzymatiques sur coupe pour déterminer la présence de ces marqueurs lors de la différenciation (FM Watt, J Invest Dermatol. 1983 Jul; 81(1 Suppl):100s-3s Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation). Toutefois, de telles méthodes peuvent s'avérer peu sensibles et difficilement 20 quantifiables. On connaît également les micro-ARN qui sont des ARN non-codants de petite taille, qui régulent l'expression génique post-transcriptionnelle et qui jouent un rôle important dans divers processus biologiques normaux, y compris le développement de l'épiderme et la morphogenèse du follicule pileux (Aberdam et al.Trends in Biochemical Sciences Vol.33 25 No.12, 2008 ; Rui Yil et al. Nature Vol 452, 13 March 2008, A skin microRNA promotes differentiation by repressing `stemness'), et dans des pathologies spécifiques de la peau, telles que le psoriasis, le lupus érythémateux systémique, et la carcinogenèse de la peau (Lerman G et al. (2011) MiRNA Expression in Psoriatic Skin: Reciprocal Regulation of hsa-miR-99a and IGF-1R. PLoS ONE 6(6): e20916. ; Te JL et al. (2010) Identification of 30 Unique MicroRNA Signature Associated with Lupus Nephritis. PLoS ONE 5(5): e10344). MiR-203 est plus particulièrement décrit comme un micro-ARN spécifique de la peau et des kératinocytes, et peut être considéré comme un des acteurs clé dans le contrôle du basculement entre la prolifération et la différenciation au sein des kératinocytes Ainsi, des études in vitro sur des kératinocytes humains et de souris montrent que MiR203 n'est pas -3- exprimé dans des cellules souches épidermiques adultes, et que son expression signerait la sortie de l'état purement prolifératif (D. Aberdam et al.Trends in Biochemical Sciences Vol.33 No.12, 2008). D'autres études ont montré que l'expression de miR-203 est fortement induite au cours de la différenciation kératinocytaire induite par le calcium (Declan J McKenna et al.; Journal of virology; Volume: 84, 10644-10652. 2010 Oct; MicroRNA 203 expression in keratinocytes is dependent on regulation of p53 levels by E6). Le problème plus particulièrement visé par la présente invention est de disposer d'une méthode rapide et simple pour quantifier la différenciation kératinocytaire, et dont la mise en oeuvre permet d'identifier de nouveaux composés ou d'évaluer l'efficacité de composés modulateurs de la différenciation cellulaire. De tels composés peuvent jouer un rôle dans la prévention et/ou le traitement ultérieur des pathologies spécifiques de la peau, telles que par exemple le psoriasis, le lupus érythémateux systémique, et la carcinogenèse de la peau. Dans le domaine de la cosmétique, de tels composés peuvent également jouer un rôle dans le bon fonctionnement de la peau saine, et la lutte contre le vieillissement. Exposé de l'invention La présente invention a pour objet une méthode in vitro pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un composé sur la modulation de la différenciation cellulaire, comprenant les étapes suivantes: a) mettre en culture des kératinocytes ; b) mettre en contact ledit composé avec les kératinocytes obtenus à l'étape a) ; c) procéder en parallèle à des cultures de référence dans les mêmes conditions qu'aux étapes a) et b) sauf que ces kératinocytes ne sont pas mis en contact avec ledit composé ; d) mesurer les taux d'expression de miR-203 dans les kératinocytes respectivement obtenus aux étapes b) et c) ; et e) comparer le taux d'expression de miR-203 obtenu dans les kératinocytes de l'étape b) par rapport au taux d'expression obtenu à l'étape c). L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, au regard des figures annexées dans lesquelles : - la figure 1 est un graphique représentant le taux d'expression basal de miR-203 par réaction de polymérisation en chaine quantitative ou en temps réel (QPCR) dans différents types cellulaires ; -4- - la figure 2 est un graphique représentant l'activité pro-différenciation du calcium utilisé comme contrôle positif sur des kératinocytes ; - la figure 3 est un graphique représentant l'activité pro-différenciation d'un composé sur des kératinocytes traités ; - la figure 4 est un graphique représentant l'activité anti-différenciation d'un composé sur des kératinocytes traités dont la différenciation a été stimulée ou non par du calcium ; et - la figure 5 est un graphique représentant l'activité anti-différenciation d'un composé sur des kératinocytes enrichis en cellules souches adultes épidermiques (RA) traités. De façon avantageuse, l'évaluation de la différenciation cellulaire selon l'invention est ainsi réalisée par le dosage de miR-203. MiR-203 est un micro-ARN utilisé comme marqueur non protéique de la différenciation cellulaire dont la surexpression inhibe la prolifération et favorise la différenciation des kératinocytes. Le dosage de l'expression de miR-203 de kératinocytes traités avec des composés à tester dans la méthode selon l'invention permet d'identifier ou d'évaluer l'efficacité de composés modulateurs de la différenciation kératinocytaire, préférentiellement de nouveaux composés, de tels composés nouvellement identifiés pouvant jouer un rôle dans la prévention et/ou le traitement ultérieur des pathologies spécifiques de la peau, telles que par exemple le psoriasis, le lupus érythémateux systémique, et la carcinogenèse de la peau ou encore le bon fonctionnement de la peau saine, et la lutte contre le vieillissement. L'expression de miR-203 dans la méthode selon l'invention est avantageusement quantifiée et mesurée par la technique de PCR quantitative en temps réel ou QPCR, cette méthode étant sensible et précise et les ARN étant facilement quantifiables. Selon l'invention, les étapes a) et c), qui consistent à mettre en culture des kératinocytes dans les mêmes conditions, visent un ensemble de techniques utilisées, connues de l'homme du métier, pour faire proliférer des kératinocytes à l'état isolé (in vitro), dans un but d'expérimentation scientifique. Les kératinocytes en culture selon l'invention sont préférentiellement des kératinocytes humains normaux. Selon un mode avantageux de réalisation de la méthode selon l'invention, les kératinocytes sont cultivés dans un milieu de culture comprenant un agent favorisant la différenciation cellulaire, préférentiellement dans un milieu de culture comprenant entre 0,5 mM et 1 mM de CaC12 pendant 48 heures. -5- Les kératinocytes de l'étape b) selon l'invention sont cultivés et traités avec le composé à tester au moins une fois pendant un temps compris entre 1 minute et 5 jours, préférentiellement cultivés et traités 1 à 2 fois par jour avec le composé à tester pendant environ 48 heures. Les ARN totaux sont ensuite extraits par une méthode classiquement utilisée et servent de matrice pour la réaction de transcription inverse de miR-203. Un contrôle endogène de l'expression des ARN est réalisé en parallèle pour constituer une référence interne. Les taux d'expression de miR-203 ont enfin été mesurés par QPCR, à l'aide de sondes et d'amorces spécifiques permettant l'amplification de miR-203. Il s'agit d'une méthode comparative, dans laquelle la quantité du gène cible miR-203 est normalisée par rapport à un gène de référence. De préférence, c'est l'ARN 18S qui est choisi comme référence. Exemple 1 : mesure du taux d'expression basal de miR-203 dans différents types de cellules de peau Tel qu'illustré à la figure 1, le taux d'expression basal de miR-203 a été mesuré dans différents types de cellules présentes dans la peau normale par QPCR, et plus particulièrement dans des cellules NHK (kératinocytes humains normaux), Fibroblastes et NHEM (mélanocytes épidermiques humains normaux). Des cellules transformées ont également été testées dans les mêmes conditions : les cellules HaCat (kératinocytes humains transformés) et A431 (cellules de carcinome épidermoïde humain). Les cellules extraites de peau humaine ont respectivement également été cultivées dans des conditions standard. En particulier, les NHK ont été cultivées pendant 48 heures dans le milieu de culture Keratinocyte Serum Free Medium (KSFM) (17005-075, Gibco). Les ARN totaux ont ensuite été extraits à l'aide du kit d'extraction mirVanaTM (AM1560, Ambion) suivant les recommandations du fournisseur et ont servi de matrice pour la réaction de reverse transcription de miR-203 et du contrôle endogène en utilisant le kit TaqMane MicroRNA Reverse Transcription Kit (4366596, Applied Biosystems). Les taux d'expression de miR-203 ont enfin été mesurés par QPCR pour chaque lignée cellulaire. Les réactions de QPCR ont été réalisées à l'aide du TaqMane universal master mix (4369514, Applied Biosystems), de sondes ainsi que des amorces spécifiques de miR203 (Assay ID 000507, Applied Biosystems) et l'ARN 18S (Assay No. Hs99999901_s1, Applied Biosystems). Les quantités relatives d'ADNc dans les différents échantillons ont -6- été estimées en appliquant la technique du TaqMane à l'aide d'un StepOneplusTM (Applied Biosystems). Celle-ci est basée sur la méthode de calcul des AACt, la quantité du gène cible est normalisée par rapport à un gène de référence. L'expression de l'ARN 18S a constitué la référence pour toutes les analyses. Résultat : On observe que miR-203 est significativement exprimé dans les cellules NHK alors qu'il n'est pas exprimé dans les fibroblastes ou les NHEM. Ces résultats sont en accord avec la littérature (Mc Kenna et al, J. of Virol. Oct. 2010, p. 10644-10652 Vol. 84, No. 20). D'autre part, miR-203 est très faiblement exprimé dans les lignées transformées A431 et HaCaT. Si l'on prend comme référence les kératinocytes humains normaux, les résultats (quantification relative RQ) sont les suivants : NHK : 100%, HaCaT : 1,5%, A431 : 0,3%, Fibroblastes : 0%, Mélanocytes : 0%, tels qu'illustrés à la figure 1. Exemple 2 : préparation de fractions cellulaires et quantification de l'expression de miR-203 dans la fraction enrichie en cellules souches adultes Afin d'étudier l'expression de miR-203 dans les cellules souches adultes épidermiques, plusieurs fractions de cellules primaires d'épiderme humain sont préparées. Le fractionnement est basé sur le temps d'adhésion des cellules sur du Collagène IV : en moins de 20 minutes, adhésion rapide (fraction RA), en moins de 5 heures, adhésion lente n°1 (fraction SA1), en moins de 16 heures, adhésion lente n°2 (fraction SA2), et finalement les kératinocytes non adhérents (fractions NA). La fraction cellulaire RA est une fraction enrichie en cellules souches adultes épidermiques. Par contre, les fractions SA1, SA2 et NA sont celles qui contiennent respectivement de moins en moins de cellules souches. L'extraction des ARN totaux et le dosage du taux d'expression de miR-203 sont ensuite réalisés comme dans l'exemple 1. Résultat : A l'issue de cette caractérisation, on constate que miR-203 n'est que très peu exprimé dans la fraction RA des kératinocytes par rapport aux autres fractions cellulaires. Si l'on prend comme référence les kératinocytes humains normaux non fractionnés, les résultats sont les suivants (non représentés) : NHK : 100%, fraction RA 2 %, fraction SA1/SA2 164%. -7- Exemple 3: induction de l'expression de miR-203 lors de la différenciation kératinocytaire Des kératinocytes humains normaux (NHK) sont extraits de peau humaine par les techniques classiquement utilisées, ensemencés dans des boites 100 mm de diamètre puis 5 cultivés 48 heures dans un milieu de culture standard sans sérum et (KSFM) (17005-075, Gibco), contenant 0,09 mM de CaC12. Dans ces conditions de cultures, les kératinocytes prolifèrent sans stratifier ni différencier. Des cultures en présence de 0,5 mM CaCl2 et 1 mM de CaCl2 sont également réalisées. En effet le CaC12 est un inducteur de la différenciation kératinocytaire bien décrit dans la littérature (Pillai S et al. (1990) J Cell 10 Physiol 143:294-302). Lorsque la concentration calcique augmente brutalement, les NHK recouvrent leur aptitude à stratifier et à différencier. Ce phénotype de différenciation cellulaire est caractérisé par une augmentation de l'expression de miR-203. L'extraction des ARN totaux et le dosage du taux d'expression de miR-203 sont ensuite réalisés comme dans l'exemple 1. 15 Résultat On observe que l'induction de la différenciation kératinocytaire par une brusque augmentation de la concentration de calcium de 0,5 mM et 1 mM provoque une augmentation de l'expression de miR-203 respectivement de 210% et 300%, telle qu'illustrée à la figure 2. 20 Conclusion L'augmentation dose-dépendante de l'expression de miR-203 dans les kératinocytes normaux au cours de l'induction de la différenciation par le calcium confirme que miR-203 est un marqueur adapté pour identifier et évaluer l'efficacité de composés modulateurs de la différenciation cellulaire. 25 Exemple 4 : évaluation des propriétés pro-différenciantes d'un composé connu Le taux d'expression de miR-203 a été mesuré dans des kératinocytes humains normaux en culture et traités avec un composé à tester. Le taux d'expression de miR-203 obtenu à l'étape b) a ensuite été comparé avec celui obtenu dans des conditions de référence 30 selon l'étape c). Des kératinocytes extraits de peau humaine préalablement isolées ont été cultivés en présence d'une concentration de calcium de 0,09 mM, pendant 24 heures puis selon l'étape -8- b) de la méthode selon l'invention, traités deux fois par jour pendant 48 heures avec une dilution à 1% d'une solution mère à 10-4 M d'un peptide de synthèse (peptide divulgué dans la demande de brevet FR2949782 sous le numéro SEQ ID n°5, nommé ci après Peptide 1) ayant des propriétés pro-différenciantes, soit au final 10-6 M. Une culture de référence dans les mêmes conditions a été réalisée en parallèle selon l'étape c), dans laquelle des kératinocytes extraits et isolés identiques ne sont pas mis en contact avec le Peptide 1. Les ARN totaux obtenus aux étapes b) et c) ont ensuite été extraits, puis l'expression de miR-203 dosé, comme décrit dans l'exemple 1. Selon l'étape e), on compare le taux d'expression de miR-203 obtenu dans les kératinocytes traités de l'étape b) traités par rapport à celui obtenu dans des conditions de référence selon l'étape c). Enfin, on identifie ou on évalue l'efficacité du composé testé sur la modulation de la différenciation cellulaire en tenant compte du rapport du taux d'expression de miR-203 obtenu dans l'étape e). Selon l'invention, lorsque le rapport du taux d'expression de miR-203 obtenu dans l'étape e) est supérieur à 1, le composé testé présente une activité pro-différenciation. En revanche, lorsque le rapport du taux d'expression de miR-203 obtenu dans l'étape e) est inférieur à 1, le composé testé présente une activité anti-différenciation. Résultats On observe qu'un traitement des kératinocytes cultivés avec 1% de Peptide 1 (soit 10- 6 M) provoque une augmentation de l'expression de miR-203 de 46%. Ces résultats sont illustrés à la figure 3. Conclusion La méthode selon l'invention permet de mettre en évidence l'activité pro- différenciation du Peptide 1, à savoir une activité qui favorise la différenciation des kératinocytes. Le dosage comparatif de l'expression de miR-203 selon la méthode selon l'invention permet ainsi de mesurer l'efficacité de composés actifs sur la différenciation kératinocytaire, de tels composés nouvellement identifiés pouvant plus particulièrement jouer un rôle dans la prévention et/ou le traitement ultérieur des pathologies spécifiques de la peau, telles que par exemple le psoriasis, le lupus érythémateux systémique, et la -9- carcinogenèse de la peau, peau ou encore le bon fonctionnement de la peau saine, et la lutte contre le vieillissement cutané. Exemple 5 : évaluation des propriétés anti-différenciantes d'un composé connu Le taux d'expression de miR-203 a été mesuré dans des kératinocytes humains normaux en culture et traités avec un composé à tester, sous la forme d'un peptide de synthèse ayant des propriétés anti-différenciantes, peptide divulgué dans la demande de brevet FR2955112 sous le numéro SEQ ID n°2, nommé ci après Peptide 2. Le taux d'expression de miR-203 obtenu à l'étape b) a ensuite été comparé avec celui obtenu dans des conditions de référence selon l'étape c). Protocole 1 Des kératinocytes extraits de peau humaine préalablement isolés ont été cultivés en présence d'une concentration de calcium de 0,09 mM, pendant 24 heures puis selon l'étape b) de la méthode selon l'invention, traités deux fois par jour pendant 48 heures avec une dilution à 1% d'une solution mère à 104 M du Peptide 2, de façon à obtenir une concentration finale de 10-6 M. Des cultures de NHK en présence de 0,5 mM et 1 mM de calcium ont également été réalisées. Une culture de référence dans les mêmes conditions a été réalisée en parallèle selon l'étape c), dans laquelle des kératinocytes extraits et isolés identiques ne sont pas mis en contact avec le Peptide 2. Les ARN totaux obtenus aux étapes b) et c) ont ensuite été extraits, puis l'expression de miR-203 dosé, comme décrit dans l'exemple 1. Selon l'étape e), on compare le taux d'expression de miR-203 obtenu dans les kératinocytes traités de l'étape b) traités par rapport à celui obtenu dans des conditions de référence selon l'étape c). Enfin, on identifie ou on évalue l'efficacité du composé testé sur la modulation de la différenciation cellulaire en tenant compte du rapport du taux d'expression de miR-203 obtenu dans l'étape e). Résultats 1 On observe que lorsque les NHK sont cultivés dans des conditions standard de 0,09 mM de CaC12 ou des conditions différenciantes de 0,5 mM et 1 mM de CaC12, la diminution de l'expression de miR-203 dans des kératinocytes cultivés avec 1% de Peptide -10- 2 (soit 10-6 M) est respectivement de 10 %, 7% et de 18 %. Ces résultats sont illustrés à la figure 4. Protocole 2 La fraction RA (kératinocytes enrichis en cellules souches adultes épidermiques) extraite de peau humaine a été isolée selon le protocole de l'exemple 2. Les cellules RA attachées au support recouvert de collagène IV sont ensuite cultivées 1 à 2 jours puis ensemencées en boite 100 mm, et traitées 2 fois par jour pendant 48 heures avec une dilution à 1% et 3 % d'une solution mère à 104 M de Peptide 2, de façon à obtenir une concentration finale respectivement de 10-6 M et 3 * 10-6 M). Une culture de référence dans les mêmes conditions a été réalisée en parallèle dans chaque cas selon l'étape c), dans laquelle les kératinocytes ainsi extrait et isolés ne sont pas mis en contact avec le Peptide 2. Les ARN obtenus aux étapes b) et c) ont ensuite été extraits et mesurés, comme indiqués dans l'exemple 1 l'étape d). Enfin, selon l'étape e), on compare le taux d'expression de miR-203 obtenu dans les kératinocytes traités de l'étape b) traités par rapport à celui obtenu dans des conditions de référence selon l'étape c). Résultats 2 On observe qu'un traitement des kératinocytes enrichis en cellules souches adultes épidermiques ainsi cultivés avec 1% et 3% (10-6 M et 3 * 10-6 M) de Peptide 2 provoquent 20 une diminution de l'expression de miR-203 de respectivement 37,1% et 48,6%, tel qu'illustré à la figure 5. Conclusion La méthode selon l'invention permet de mettre en évidence l'activité antidifférenciation du Peptide 2; à savoir une activité qui inhibe ou retarde la différenciation 25 des kératinocytes. Cette inhibition de la différenciation est mise en évidence par la méthode selon l'invention à la fois sur des kératinocytes différenciés et sur des kératinocytes enrichis en cellules souches adultes épidermiques. REVENDICATIONS1. Méthode in vitro pour identifier ou évaluer l'efficacité d'un composé sur la modulation de la différenciation cellulaire, comprenant les étapes suivantes: a) mettre en culture des kératinocytes ; b) mettre en contact ledit composé avec les kératinocytes obtenus à l'étape a) ; c) procéder en parallèle à des cultures de référence dans les mêmes conditions qu'aux étapes a) et b) sauf que ces kératinocytes ne sont pas mis en contact avec ledit composé ; d) mesurer les taux d'expression de miR-203 dans les kératinocytes respectivement obtenus aux étapes b) et c) ; et e) comparer le taux d'expression de miR-203 obtenu dans les kératinocytes de l'étape b) par rapport au taux d'expression obtenu à l'étape c). 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle les kératinocytes en culture sont des kératinocytes humains normaux. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle les kératinocytes sont cultivés dans un milieu de culture comprenant un agent favorisant la différenciation 20 cellulaire. 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle les kératinocytes sont cultivés dans un milieu de culture comprenant entre 0,5 mM et 1 mM de CaC12 pendant 48 heures. 25 5. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les kératinocytes de l'étape b) sont cultivés et traités avec le composé à tester pendant un temps compris entre 1 minute et 5 jours. 6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle les kératinocytes de l'étape b) sont 30 traités 1 ou 2 fois par jour avec le composé à tester et cultivés pendant 48 heures. 7. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les taux d'expression de miR-203 sont mesurés à l'étape d) par réaction de polymérisation en chaine quantitative (QPCR).-12- 8. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le rapport du taux d'expression de miR-203 obtenu dans l'étape e) est supérieur à 1 pour un composé présentant une activité pro-différenciation. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le rapport du taux d'expression de miR-203 obtenu dans l'étape e) est inférieur à 1 pour un composé présentant une activité anti-différenciation.