Brevet FR2983871A1 — publié le 20130614

Biomarqueurs moléculaires sentinelles La présente invention concerne une méthode de détermination du degré de contamination et/ou de pollution d'un milieu environnemental et/ou d'un organisme vivant dans un milieu environnemental, comprenant la mesure du niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines "Multidrug resistance" (MDR), dans un échantillon biologique provenant d'un organisme vivant dans ledit milieu environnemental; et la détermination du rapport entre les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR. La pollution de l'environnement et son impact sur l'induction des maladies pernicieuses sont devenus une des problématiques majeures de la sante publique et du maintien de la biodiversité. En effet, une multitude de polluants, aux propriétés et aux structures très variées, circulent dans l'air, le sol et l'eau et contaminent ainsi notre environnement et tous les organismes vivant sur ces lieux. Au cours du temps, ces différents polluants s'accumulent dans ces organismes et se transfèrent ainsi à travers la chaine alimentaire, jusqu'à l'Homme. De cette manière, la pollution de l'environnement peut provoquer un véritable problème de toxicité chronique engendrant chez les individus contaminés un risque réel pour leur santé. La méthodologie mise en oeuvre actuellement pour la mesure et le contrôle de la pollution est principalement de nature physico-chimique, mais celle-ci n'apporte quasiment pas d'informations sur l'état de santé des organismes contaminés. Une nouvelle approche développée depuis ces dernières années utilise des biomarqueurs. La notion de biomarqueur peut être définie comme "un changement observable et/ou mesurable au niveau moléculaire, biochimique, cellulaire, et/ou physiologique, qui révèle l'exposition présente ou passée d'un individu à, au moins, une substance chimique à caractère polluant". Cette approche apporte des informations complémentaires et donne surtout une idée plus concrète de l'état de l'organisme contaminé. Cependant, à l'heure actuelle, il n'existe pas de test moléculaire prédictif sensible donnant des informations à la fois sur la pollution de l'environnement et sur la santé des organismes colonisant ces milieux. Les MDR protéines sont des glycoprotéines membranaires très ubiquitaires et très conservées au cours de l'évolution. Elles sont exprimées chez de nombreuses espèces animales ou végétales, eucaryotes ou procaryotes. Chez l'homme, les MDR glycoprotéines sont à l'origine de la notion de "Multidrug Resistance", appelée également "la résistance croisée des cellules tumorales vis-à-vis d'agents anticancéreux". Les MDR glycoprotéines sont des transporteurs membranaires de type ATPasique qui expulsent vers le milieu extracellulaire différents types de xénobiotiques. Dans des conditions de contamination du milieu, leur expression augmente afin de créer une barrière membranaire de défense à l'échelle cellulaire, vis-à-vis des xénobiotiques. La présente invention résulte du développement par les inventeurs de biomarqueurs moléculaires de type stress/santé intitulés "sentinelles" capables d'alerter (i) d'une part, sur la contamination du milieu environnant (air, sol, eau) et, (ii) d'autre part, sur l'état de santé des organismes colonisant ces différents milieux. Les inventeurs ont en effet montré de façon surprenante que l'évaluation de la réponse combinée de deux "Multidrug Resistance" (MDR) transporteurs cibles, notamment celle d'ABCB1-MDR1/P-gp et d'ABCG2/BCRP, permettait d'obtenir une double indication (i) du degré de contamination/pollution du milieu environnant et (ii) de l'état de santé de l'organisme au niveau cellulaire. En particulier, les inventeurs ont montré que certaines protéines MDR étaient exprimées par les cellules à un niveau basal quelle que soit l'importance de la contamination, tandis que d'autres protéines MDR étaient exprimées de manière dose-dépendante lorsque les cellules étaient mises en contact avec un xénobiotique. Ainsi, la mesure du niveau d'expression d'au moins deux protéines MDR et l'étude du rapport entre les niveaux d'expression de ces deux protéines MDR permet d'évaluer le degré de contamination et/ou de pollution, une des protéines MDR, la protéine MDR dite de garde, présentant un niveau d'expression relativement constant, tandis que le niveau d'expression de l'autre protéine MDR, la protéine MDR dite de défense, augmente de manière dose-dépendante en cas de contamination et/ou de pollution importante. La présente invention concerne ainsi une méthode de détermination du degré de contamination et/ou de pollution d'un milieu environnemental et/ou d'un organisme vivant dans un milieu environnemental, comprenant les étapes consistant à : a) mesurer le niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines "Multidrug resistance" (MDR), dans un échantillon biologique provenant d'un organisme vivant dans ledit milieu environnemental; b) déterminer le rapport entre les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR; c) éventuellement comparer les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR mesurés à l'étape a) avec une valeur de référence; et d) en déduire le degré de contamination et/ou de pollution dudit milieu environnemental et/ou dudit organisme vivant dans ledit milieu environnemental. Les protéines MDR impliquées dans les phénomènes d'expulsion de xénobiotiques étant les mêmes que celles impliquées dans les phénomènes de résistance aux médicaments, en particulier aux anticancéreux, la méthode définie ci-dessus pour déterminer le degré de contamination et/ou de pollution d'un milieu environnemental est également applicable à la détermination de la résistance de cellules cancéreuses à un traitement. La présente invention concerne donc également une méthode de détection in vitro de la résistance de cellules cancéreuses à un traitement comprenant les étapes consistant à: a) mesurer in vitro le niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines "Multidrug resistance" (MDR) dans lesdites cellules cancéreuses traitées; b) déterminer le rapport entre les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR; c) éventuellement comparer les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR mesurés à l'étape a) avec une valeur de référence; et d) en déduire si lesdites cellules cancéreuses sont résistantes audit traitement. 20 Description détaillée de l'invention Organismes et milieux environnementaux Dans le contexte de l'invention, le terme "milieu environnemental" fait référence à 25 tout matériau de l'environnement qui entoure ou qui est en contact avec des organismes et au travers duquel les substances chimiques ou les polluants peuvent se déplacer et atteindre les organismes. Le milieu environnemental selon l'invention peut ainsi être un milieu aquatique, un milieu terrestre ou un milieu atmosphérique. 30 Par "milieu aquatique", on entend ici tout milieu environnemental comprenant de l'eau douce ou de l'eau salée. Le milieu aquatique selon l'invention peut ainsi être un lac, un étang, un cours d'eau, une zone inondable ou humide telle qu'un marais ou une tourbière, une nappe souterraine ou le milieu marin. De préférence, le milieu aquatique selon l'invention est un lac, un étang ou un cours d'eau. De manière davantage préférée, 35 le milieu aquatique selon l'invention est un cours d'eau. Par "milieu environnemental contrôle non contaminé non pollué", on entend ici un milieu environnemental tel que défini ci-dessus dont la teneur en éléments traces et/ou xénobiotiques, tels que définis dans la section "Contamination et pollution" ci-dessous, n'est pas supérieure à une teneur ou une concentration donnée, et qui ne présente pas, ou dont l'usage ne présente pas, de perturbation par rapport à la normale. Dans le contexte de l'invention, le terme "organisme" désigne un être organisé de type procaryote ou eucaryote, du règne animal ou végétal, qui peut être unicellulaire ou multicellulaire. De préférence, l'organisme selon l'invention est un organisme multicellulaire. De manière davantage préférée, l'organisme selon l'invention est un métazoaire, de préférence un eumétazoaire. L'organisme selon l'invention peut en particulier être un bilatérien, de préférence un deutérostomien, tel qu'un échinoderme ou un chordé, en particulier un céphalochordé ou un vertébré. De manière particulièrement préférée, l'organisme selon l'invention est un vertébré choisi dans le groupe constitué des amphibiens, des oiseaux, des poissons cartilagineux, des mammifères, des reptiles, des agnathes et des poissons osseux. L'organisme selon l'invention peut également être un ecdysozoaire, tel qu'un nématode, un nématomorphe ou un arthropode. L'organisme selon l'invention peut aussi être un prostomien, tel qu'un lophotrochozoaire, en particulir un siponcle, un némerte, un mollusque ou un annélide. De préférence, l'organisme selon l'invention est un organisme non-humain. Dans un mode de réalisation préféré, en particulier lorsque le milieu environnemental est un milieu aquatique, l'organisme selon l'invention est un poisson, de préférence un poisson osseux, de manière davantage préférée un poisson de la famille des salmonidés. L'organisme selon l'invention peut en particulier être sélectionné dans le groupe constitué des saumons, des ombles, des ombres, des corégones et des truites. De préférence, l'organisme selon l'invention est une truite ou une ombre. De manière encore préférée, l'organisme selon l'invention est sélectionné dans le groupe constitué des truites fario, des truites arc-en-ciel et des ombres chevaliers. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'organisme selon l'invention est une truite fario. Contamination et pollution Par "contamination", on entend ici un apport de xénobiotiques et/ou d'éléments traces (c'est-à-dire d'éléments chimiques issus de synthèse ou issus des constituants de la croûte terrestre), issus de l'extérieur du milieu environnemental qui a pour conséquence une élévation de leur teneur ou concentration normale. Par "pollution", on entend ici une contamination qui a pour conséquence une perturbation du milieu environnemental ou de l'usage qui en est fait habituellement. Par "degré de contamination et/ou de pollution", on entend ici le niveau de contamination et/ou de pollution générale, telle que définie ci-dessus, d'un milieu environnemental et/ou d'un organisme vivant dans ledit milieu environnemental tel que défini dans la section "Organismes et milieux environnementaux" ci-dessus, indépendamment du contaminant et/ou du polluant impliqué. Certaines méthodes de détermination d'un degré de contamination et/ou de pollution d'un milieu environnementale sont déjà connues et mises en oeuvre par exemple par des associations de protection de l'environnement. Ces méthodes prennent en compte d'autres marqueurs que les marqueurs utilisés dans le cadre de la présente invention. Il peut donc être intéressant, pour caractériser plus précisément la contamination et/ou la pollution d'un milieu environnemental, de combiner la méthode de détermination du degré de contamination et/ou de pollution selon la présente invention, avec une autre méthode de détermination d'une contamination et/ou d'une pollution d'un milieu environnemental. Ainsi dans un mode de réalisation particulier, la méthode de détermination du degré de contamination et/ou de pollution d'un milieu environnemental et/ou d'un organisme vivant dans un milieu environnemental selon l'invention, comprend en outre la détermination parallèle d'un indice de contamination et/ou pollution conventionnel connu, de préférence normalisé. De tels indices de contamination et/ou pollution conventionnels sont bien connus de l'homme du métier et consistent généralement à évaluer le niveau d'altération des peuplements à partir de différentes caractéristiques des peuplements sensibles à l'intensité des perturbations anthropiques et qui rendent compte notamment de la composition taxonomique, de la structure trophique et de l'abondance des espèces. Ils incluent en particulier l'indice poissons rivière (IPR ou "Fish-Based Index") ou l'"Index of biological integrity' (I BI). L'Indice poissons rivière est un indice qui a été normalisé en 2004 sous la référence NF T90-344 et qui consiste globalement à mesurer l'écart entre la composition d'un peuplement sur un site donné, observée à partir d'un échantillonnage, et la composition du peuplement attendu en situation de référence, c'est-à-dire dans des conditions pas ou très peu modifiées par l'homme. Echantillon biologique Dans le contexte de l'invention, un "échantillon biologique" fait référence à une substance d'origine biologique. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon d'un fluide biologique ou d'un tissu biologique contenant des cellules. Des exemples d'échantillons biologiques comprennent, mais ne sont pas limités à, le sang et ses composants, l'hémolymphe, les muqueuses, ou le tissu hépatique. De préférence, l'échantillon biologique selon l'invention est un échantillon de sang, en particulier un échantillon de sang constitué de cellules sanguines, de préférence d'érythrocytes. Protéine "Multidrug resistance" (MDR) Par "protéine "Multidrug Resistance"" ou "protéine MDR", on entend ici des pompes d'efflux membranaires appartenant à la super-famille des ATP-binding cassette (ABC) protéines, extrêmement conservées au cours de l'évolution. Ces protéines sont exprimées à l'état naturel au niveau de la membrane cellulaire de pratiquement toutes les cellules de tous les organismes vivants du règne animal et végétal, de préférence des procaryotes aux mammifères. Elles possèdent au moins un domaine ABC spécifique, conservé, globulaire, constitué d'environ 200 à 250 acides aminés, qui peut lier et hydrolyser l'ATP. Ce domaine présente de préférence plusieurs motifs conservés : le motif "Walker A" qui est une séquence riche en glycines; une glutamine conservée; le motif signature de la famille des ABC (séquence LSGGQ (SEQ ID NO: 1)), le motif "Walker B" et une histidine conservée. Les protéines MDR contiennent également de préférence au moins un domaine transmembranaire. Chez l'homme, la super-famille des protéines ABC inclut à ce jour 49 gènes qui ont été répartis en 7 sous-familles, désignées respectivement ABCA (ou ABC1), ABCB (ou MDR/TAP), ABCC (ou CFTR/MRP), ABCD (ou ALD), ABCE (ou OABP), ABCF (ou GCN20) et ABCG (ou "White"). De préférence, lesdits au moins deux gènes codant des protéines MDR mesurés dans les méthodes selon l'invention, sont choisis dans le groupe constitué des membres de la sous-famille ABCB, de la sous-famille ABCC et de la sous-famille ABCG. La sous-famille ABCB comprend à ce jour, chez l'homme, 4 transporteurs complets (c'est-à-dire des protéines comprenant deux domaines ABC et deux domaines transmembranaires) et 7 demi-transporteurs (c'est-à-dire des protéines comprenant seulement un domaine ABC et un domaine transmembranaire). Elle inclut plus particulièrement la protéine ABCB1 (aussi appelée PGY1, MDR1, P-gp, CD243 ou GP170), la protéine ABCB2 (aussi appelée TAPI , PSF1, RING4, ABC17, APT1 ou D6S114E), la protéine ABCB3 (aussi appelée TAP2, PSF2, RING11, D6S217E ou ABC18), la protéine ABCB4 (aussi appelée PGY3, MDR2/3, MDR3, PFIC-3 ou ABC21), la protéine ABCB5, la protéine ABCB6 (aussi appelée ABC14, UMAT ou MTABC3), la protéine ABCB7 (aussi appelée ABC7, ATM1P ou ASAT), la protéine ABCB8 (aussi appelée M-ABC1), la protéine ABCB9 (aussi appelée TAPL), la protéine ABCB10 (aussi appelée M-ABC2 ou MTABC2) et la protéine ABCB111 (aussi appelée BSEP, SPGP, PFIC2, PGY4 ou ABC16). Par "ABCB1" ou "P-gp", on entend ici une glycoprotéine transmembranaire, typiquement d'environ 170 kDa chez l'homme, qui inclut de préférence environ 10-15 kDa de glycosylation N-terminale. La moitié N-terminale de la molécule comprend 6 domaines transmembranaires, suivis par un grand domaine cytoplasmique avec un site de liaison à l'ATP, puis une seconde section avec 6 domaines transmembranaires et un site de liaison à l'ATP qui présente près de 65% de similarité d'acides aminés avec la première moitié de la molécule. La séquence d'acides aminés de la protéine ABCB1 humaine est typiquement présentée sous la référence Swiss-Prot P08183. La séquence d'acides aminés de la protéine ABCB1 de truite arc-en-ciel est typiquement présentée sous la référence Swiss-Prot D1 KF95. Les protéines ABCB1 selon l'invention sont de préférence reconnues par l'anticorps monoclonal C219 (Référence SIG-38710, Covance) qui reconnaît une séquence d'acides aminés hautement conservée (VQEALD (SEQ ID NO: 2) et VQAALD (SEQ ID NO: 3)) trouvée à la fois dans les isoformes MDR1 et MDR3 de la P- gp. Par conséquence, des homologues, de séquence non encore déterminée, de la protéine ABCB1 dans d'autres espèces, peuvent être facilement identifiés par reconnaissance spécifique de la protéine par l'anticorps C219 et évaluation de leur poids moléculaire. La sous-famille ABCC comprend à ce jour, chez l'homme, 12 transporteurs complets. Elle inclut en particulier la protéine ABCC1 (aussi appelée MRP1, MRP, ABCC, GS-X ou ABC29), la protéine ABCC2 (aussi appelée MRP2 ou CMOAT), la protéine ABCC3 (aussi appelée MRP3), la protéine ABCC4 (aussi appelée MRP4), la protéine ABCC5 (aussi appelée MRP5), la protéine ABCC6 (aussi appelée MRP6), la protéine ABCC? (aussi appelée CFTR), la protéine ABCC8 (aussi appelée SURI ), la protéine ABCC9 (aussi appelée SUR2), la protéine ABCC10 (aussi appelée MRP7), la protéine ABCC11 (aussi appelée MRP8), la protéine ABCC12 et la protéine ABCC13. La sous-famille ABCG comprend à ce jour, chez l'homme, 6 demi-transporteurs. Elle inclut en particulier la protéine ABCG1 (aussi appelée ABC8 ou White), la protéine ABCG2 (aussi appelée BCRP, BCRP1, MXR1, CDw338 ou ABCP), la protéine ABCG3, la protéine ABCG4 (aussi appelée White 2), la protéine ABCG5 (aussi appelée White 3 ou Stéroline 1) et la protéine ABCG8 (aussi appelée White 4 ou Stéroline 2). Par "ABCG2" ou "ABCG2-like", on entend ici une glycoprotéine, typiquement de 655 acides aminés chez l'homme, comprenant 6 hélices transmembranaires et un domaine ABC conservé, mais dans un arrangement inverse par rapport aux membres des sous-familles ABCB ou ABCC. La séquence d'acides aminés de la protéine ABCG2 humaine est typiquement présentée sous la référence Swiss-Prot Q9UNQ0. La séquence d'acides aminés de la protéine ABCG2 de la truite arc-en-ciel est typiquement présentée sous la référence Swiss-prot A8IJF9. Les protéines ABCG2-like selon l'invention chez le modèle globules rouges de truite sont de préférence reconnues par l'anticorps monoclonal C219 (Référence SIG-38710, Covance) qui reconnaît les séquences d'acides aminés hautement conservées VQEALD (SEQ ID NO: 2) et VQAALD (SEQ ID NO: 3). Dans le contexte de l'invention, les références Swiss-prot citées ci-dessus sont celles qui étaient disponibles le 21 novembre 2011. De manière préférée, l'étape a) de la méthode de détermination du degré de contamination et/ou de pollution selon l'invention comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène codant une protéine MDR telle que définie ci-dessus qui est exprimé à un niveau basal dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental contrôle non contaminé et non pollué, tel que défini dans la section "Organismes et milieux environnementaux" ci-dessus. Sans être lié par la théorie, une telle protéine MDR peut être considérée comme une protéine dite de garde, exprimée à un niveau constant et mesurable, quelle que soit la dose de xénobiotique présente dans le milieu environnemental et/ou extracellulaire et ce dès que le xénobiotique est présent à une dose faible. Par "niveau basal", on entend ici la quantité ou la concentration d'ARNm codant la protéine MDR ou la quantité ou la concentration de protéine MDR dans l'échantillon biologique provenant d'un organisme sain, de préférence non traité, et vivant dans un milieu environnemental contrôle non contaminé et non pollué tel que défini dans la section "Organismes et milieux environnementaux" ci-dessus. Des techniques permettant d'identifier de telles protéines MDR sont bien connues de l'homme du métier et sont par exemple décrites dans l'exemple 1 ci-dessous. Elles incluent par exemple, en condition in vitro, la mise en contact avec des cellules en culture primaire ou de lignée cellulaire provenant de l'organisme étudié avec un agent polluant connu, tel qu'un hydrocarbure aromatique polycyclique, par exemple le benzo[a]pyrène, à une dose faible, par exemple à une dose de 10 pM, et à une dose forte, par exemple à une dose de 30 pM, pendant une période allant typiquement de 3 à 24 h, suivie de la mesure du niveau d'expression des différentes protéines MDR dans les cellules au cours du temps. Une protéine MDR, désignée dans le cadre de l'invention comme étant une protéine de garde sera alors typiquement identifiée comme une protéine surexprimée en présence de benzo[a]pyrène, de manière continue au cours du temps pour assurer une protection basale continue de la cellule contaminée, et atteignant un niveau d'expression seuil en présence de fortes concentrations de benzo[a]pyrène. Les inventeurs ont spécifiquement montré que la protéine ABCG2 présentait les caractéristiques d'expression d'une protéine dite "de garde" telle que définie ci-dessus. Par conséquent, de préférence, ledit au moins un gène codant une protéine MDR qui est exprimée à un niveau basal est un gène codant une protéine MDR de la sous-famille ABCG, en particulier le gène codant la protéine ABCG2/BCRP-like. De manière préférée, l'étape a) de la méthode de détermination du degré de contamination et/ou de pollution selon l'invention comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène codant une protéine MDR telle que définie ci-dessus qui est surexprimé à un niveau constant en présence de faibles concentrations de polluant et/ou xénobiotique en conditions de culture in vitro ou n'est pas exprimé en milieu naturel dans les cellules présentes dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental contrôle non contaminé et non pollué, tel que défini dans la section "Organismes et milieux environnementaux" ci-dessus. Sans être lié par la théorie, une telle protéine MDR peut être considérée comme une protéine dite de défense, exprimée uniquement lorsque la dose de xénobiotique présente dans le milieu environnemental et/ou extracellulaire atteint un niveau critique, expulsant le xénobiotique vers le milieu extracellulaire, en surplus de l'expulsion assurée de manière constante par une protéine MDR de garde telle que définie ci-dessus. Des techniques permettant d'identifier de telles protéines de défense sont bien connues de l'homme du métier et sont par exemple décrites dans l'exemple 1 ci-dessous. Elles incluent par exemple la mise en contact de lignées cellulaires en conditions in vitro, provenant de l'organisme étudié avec un agent polluant connu, tel qu'un hydrocarbure aromatique polycyclique, par exemple le benzo[a]pyrène, à une dose faible, par exemple à une dose de 10 pM, et à une dose forte, par exemple à une dose de 30 pM, pendant une période allant typiquement de 3 à 24 h, suivie de la mesure du niveau d'expression des différentes protéines MDR dans les cellules au cours du temps. Une protéine MDR de défense sera alors typiquement identifiée comme une protéine exprimée de manière dose-dépendante en présence de benzo[a]pyrène. Les inventeurs ont spécifiquement montré que la protéine ABCB1 était une protéine de défense telle que définie ci-dessus. Par conséquent, de préférence, ledit au moins un gène codant une protéine MDR qui n'est pas exprimée est un gène codant une protéine MDR de la sous-famille ABCB; en particulier le gène codant la protéine ABCB1/BDR1/P-gp. Mesure du niveau d'expression Par "niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines MDR", on entend ici la quantité ou la concentration, massique ou molaire, des ARNm codant lesdites protéines MDR ou desdites protéines MDR, ou l'activité desdites protéines MDR. De préférence, le niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines MDR correspond, dans le contexte de l'invention, à la quantité ou la concentration, massique ou molaire, des ARNm codant lesdites protéines MDR ou desdites protéines MDR. De manière davantage préférée, le niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines MDR correspond, dans le contexte de l'invention, à la quantité ou la concentration, massique ou molaire, desdites protéines MDR. Les techniques de mesure de tels niveaux d'expression dans un échantillon biologique sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples de techniques adaptées incluent la spectrométrie de masse, mais aussi les méthodes basées sur les ligands, telles que les tests immunologiques (simplex ou multiplex), en particulier les dosages immuno-enzymatiques (ELISA), les dosages immunofluorescents (IFA), les dosages radio-immunologiques (RIA), les Western Blot, les tests de liaison compétitive, etc. D'autres techniques appropriées incluent le "Multiple Reaction Monitoring" (MRM), les tests SISCAPA ("Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies", Anderson et al. (2004) J. Proteome Res. 3:235-244; Anderson et al. (2004) J. Proteome Res. 3:228-234) ou les technologies d'imagerie telles que l'immunomarquage sur des échantillons de tissue ou la microscopie confocale. En particulier, les niveaux des protéines MDR sont mesurés en utilisant des ligands spécifiques de ces protéines MDR. Un "ligand" se réfère à une molécule qui a une affinité de liaison envers une protéine MDR. En particulier, il est préféré que le ligand se lie à une protéine MDR de manière spécifique, c'est-à-dire que le ligand se lie de manière préférentielle à la protéine MDR dont il est spécifique par rapport à d'autres composants présents dans l'échantillon biologique. Les ligands spécifiques sont en particulier sélectionnés dans le groupe constitué des anticorps polyclonaux, monoclonaux et recombinants, ou de fragments de ceux-ci, tels que des fragments Fab, des fragments F(ab')2 et des fragments scFv, des anticorps de phage (PhAbs), des anticorps de lama et de chameau, des ligands peptidiques et des aptamères. De préférence, les ligands spécifiques sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, de manière davantage préférée des anticorps monoclonaux. De préférence, les ligands spécifiques sont des anticorps qui permettent de détecter les protéines MDR selon l'invention dans un échantillon biologique, en particulier un échantillon biologique liquide, de préférence un échantillon de sang. De tels ligands spécifiques sont par exemples des anticorps commerciaux, tels que l'anticorps monoclonal C219 (Référence SIG-38710, Covance), l'anticorps monoclonal anti-ABCB1 clone 1F11 (WH0005243M1, Sigma), l'anticorps monoclonal anti-P-gp clone 4E3 (ab10333, Abcam), l'anticorps monoclonal anti-P-gp clone JSB-1 (P08183, Thermo Scientific), l'anticorps monoclonal anti-ABCG2 clone MM0047-2J39 (ab72788, Abcam) ou l'anticorps monoclonal anti-ABCG2 clone BXP-34 (MAB5170, Abnova Corporation). De tels ligands spécifiques peuvent également être obtenus par des techniques conventionnelles connues de l'homme du métier, comprenant typiquement l'immunisation de souris avec la protéine MDR recombinante à détecter, la fusion lymphocytaire entre les cellules de rate des souris immunisées et des cellules SP2 de myélome, et le criblages des clones obtenus selon leur sensibilité et leur spécificité pour détecter les protéines MDR d'intérêt, en particulier dans des échantillons de sang. Le niveau d'expression d'un gène codant une protéine MDR selon l'invention peut également être mesuré en déterminant le niveau d'expression d'ARNm codant pour ladite protéine MDR. Des techniques appropriées pour mesurer le niveau de tels ARNm incluent par exemple la RT-PCR et la qRT-PCR (PCR quantitative). De préférence, l'étape de mesure du niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines MDR est mise en oeuvre par un test immunologique, Western Blot, spectrométrie de masse, MRM, SISCAPA, RT-PCR ou qRT-PCR. Comparaison des niveaux d'expression Les méthodes selon l'invention comprennent une étape optionnelle c) de comparaison des niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR mesurés à l'étape a) avec une valeur de référence. Par "valeur de référence", on entend ici une valeur seuil permettant de déterminer le degré de contamination et/ou de pollution absolu ou relatif du milieu environnemental étudié, autrement dit permettant de déterminer si le milieu environnemental étudié est contaminé et/ou pollué et/ou de déterminer si le milieu environnemental étudié est plus ou moins contaminé et/ou pollué qu'un autre milieu environnemental ou qu'un autre site d'un milieu environnemental. Dans un mode de réalisation particulier, la valeur de référence de l'étape c) est le niveau d'expression respectif desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental différent du milieu environnemental de l'organisme de l'étape a). Ledit milieu environnemental différent peut en particulier être un autre site du milieu environnemental étudié. L'étape c) permet alors en particulier de comparer la contamination et/ou la pollution entre deux sites d'un milieu environnemental, par exemple entre un site localisé en amont et un site localisé en aval d'un cours d'eau. Dans un autre mode de réalisation particulier, la valeur de référence de l'étape c) est le niveau d'expression respectif desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental contrôle non contaminé et non pollué, tel que défini dans la section "Organismes et milieux environnementaux" ci- dessus. Ce mode de réalisation permet ainsi de déterminer le degré de contamination et/ou de pollution du milieu environnemental étudié. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la valeur de référence dépend du type d'échantillon biologique et de la méthode utilisée pour mesurer le niveau d'expression des gènes codant les protéines MDR dans l'échantillon biologique. Par conséquent, la valeur de référence est de préférence obtenue en utilisant la même technique de dosage que celle utilisée pour mesurer les niveaux d'expression des au moins deux gènes codant des protéines MDR dans l'organisme vivant dans le milieu environnemental étudié, ceci afin d'éviter les erreurs de normalisation. De préférence, dans les méthodes selon l'invention, il est en outre déterminé si les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR sont respectivement supérieurs ou inférieurs à la valeur de référence telle que définie ci-dessus. De préférence, quand le niveau d'expression d'un gène codant une protéine MDR est supérieur à la valeur de référence, il est significativement supérieur à la valeur de référence. De préférence, quand le niveau d'expression d'un gène codant une protéine MDR est inférieur à la valeur de référence, il est significativement inférieur à la valeur de référence. De préférence, dans les méthodes de détermination du degré de contamination et/ou de pollution selon l'invention, il est en outre déterminé si le rapport entre les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR est supérieur ou inférieur à un rapport de valeurs de référence telles que définies ci-dessus. En particulier, il est de préférence en outre déterminé si le rapport entre le niveau d'expression du gène codant la protéine MDR de défense telle que définie dans la section "Protéine MDR" ci-dessus et le niveau d'expression du gène codant la protéine MDR de garde telle que définie dans la section "Protéine MDR" ci-dessus est supérieur ou inférieur à un rapport de valeurs de référence telles que définies ci-dessus. Ainsi, un rapport supérieur à un rapport de valeurs de référence telles que définies ci-dessus sera indicatif d'une contamination et/ou d'une pollution. Détection de la résistance de cellules cancéreuses La présente invention concerne également une méthode de détection in vitro de la résistance de cellules cancéreuses à un traitement comprenant les étapes consistant à: a) mesurer in vitro le niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines MDR dans lesdites cellules cancéreuses traitées; b) déterminer le rapport entre les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR; c) éventuellement comparer les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR mesurés à l'étape a) avec une valeur de référence; et d) en déduire si lesdites cellules cancéreuses sont résistantes audit traitement. Par "résistance des cellules cancéreuses à un traitement", on entend ici que le traitement n'affecte pas de manière significative la viabilité et/ou la prolifération des cellules cancéreuses auxquelles il est appliqué. Le terme "traitement" désigne ici toute méthode curative d'un cancer, et inclut en particulier la chimiothérapie. De préférence, l'étape de mesure a) est mise en oeuvre comme décrit dans la section " Mesure du niveau d'expression" ci-dessus. Par "valeur de référence", on entend ici une valeur seuil permettant de déterminer la résistance absolue ou relative des cellules cancéreuses étudiées à un traitement, autrement dit permettant de déterminer si les cellules cancéreuses étudiées sont résistantes à un traitement et/ou de déterminer si les cellules cancéreuses étudiées sont plus ou moins résistantes à un traitement qu'à un autre traitement et/ou plus ou moins résistantes à un traitement que d'autres types de cellules cancéreuses. Dans un mode de réalisation particulier, la valeur de référence de l'étape c) est le niveau d'expression respectif desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR dans des cellules cancéreuses non soumises au traitement. Lesdites cellules cancéreuses non soumises au traitement peuvent en particulier être des cellules cancéreuses prélevées chez le patient avant la mise en oeuvre du traitement. Lesdites cellules cancéreuses non soumises au traitement peuvent également être des cellules cancéreuses issues de lignées correspondant au même cancer que celui dont est atteint le patient dont provient les cellules cancéreuses étudiées. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la valeur de référence dépend du type d'échantillon biologique et de la méthode utilisée pour mesurer le niveau d'expression des gènes codant les protéines MDR dans l'échantillon biologique. Par conséquent, la valeur de référence est de préférence obtenue en utilisant la même technique de dosage que celle utilisée pour mesurer les niveaux d'expression des au moins deux gènes codant des protéines MDR dans les cellules cancéreuses étudiées, ceci afin d'éviter les erreurs de normalisation. De préférence, dans les méthodes selon l'invention, il est en outre déterminé si les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR sont respectivement supérieurs ou inférieurs à la valeur de référence telle que définie ci-dessus. De préférence, quand le niveau d'expression d'un gène codant une protéine MDR est supérieur à la valeur de référence, il est significativement supérieur à la valeur de référence. De préférence, quand le niveau d'expression d'un gène codant une protéine MDR est inférieur à la valeur de référence, il est significativement inférieur à la valeur de référence. De préférence, dans les méthodes de détection de la résistance de cellules cancéreuses selon l'invention, il est en outre déterminé si le rapport entre les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR est supérieur ou inférieur à un rapport de valeurs de référence telles que définies ci-dessus. En particulier, il est de préférence en outre déterminé si le rapport entre le niveau d'expression du gène codant la protéine MDR de défense telle que définie dans la section "Protéine MDR" ci- dessus et le niveau d'expression du gène codant la protéine MDR de garde telle que définie dans la section "Protéine MDR" ci-dessus est supérieur ou inférieur à un rapport de valeurs de référence telles que définies ci-dessus. Ainsi, un rapport supérieur à un rapport de valeurs de référence telles que définies ci-dessus sera indicatif d'une résistance au traitement. La présente invention sera illustrée plus en détails par les figures et exemples ci-dessous, qui n'en limitent pas la portée. 35 Brève description des figures La Figure 1 montre un graphique représentant l'évolution du taux de croissance croissance des érythrocytes de truite au cours du temps dans le milieu de culture IMDM (pointillés), MEM (tirets), ou L-15 (trait plein). Les cellules sanguines ont été ensemencées à raison d'un million de cellules/mL dans trois milieux différents : le milieu L-15, le milieu MEM et le milieu IMDM. Chaque milieu est supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 1% de Fungizone et 1% de L-glutamine (Gibco). Des comptages en cellules de Malassez ont été effectués à différents temps permettant ainsi le calcul du taux de croissance, c'est-à-dire le rapport entre le nombre de cellules au temps T sur le nombre de cellules au temps TO. La Figure 2 montre des histogrammes représentant l'expression d'ABCG2 au cours du temps, à 3 h (barres blanches), 6 h (barres pointillées) ou 24 h (barres hachurées), en milieu contrôle (SVF), en milieu témoin DMSO (DMSO) ou en présence de différentes concentrations de benzo[a]pyrène (10, 20 et 30 1..1M). Les cellules sanguines ont été ensemencées à raison de un million de cellules/mL dans du milieu L-15 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 1% de Fungizone et 1% de L-glutamine (Gibco), en présence de 10, 20 ou 30 1..1M de benzo[a]pyrène. Aux temps 3 h, 6 h et 24 h, les cellules ont été récupérées et une extraction protéique a été réalisée. Suite à cette extraction, un western blot a été effectué et l'expression des protéines a été quantifiée selon le logiciel Quantity One. La Figure 3 montre des histogrammes représentant l'expression de la P-gp au cours du temps, à 3 h (barres blanches), 6 h (barres pointillées) ou 24 h (barres hachurées), en milieu contrôle (SVF), en milieu témoin DMSO (DMSO) ou en présence de différentes concentrations de benzo[a]pyrène (10, 20 et 30 1..1M). Les cellules sanguines ont été ensemencées à raison de un million de cellules/mL dans du milieu L-15 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 1% de fungizone et 1% de L- glutamine (Gibco), en présence de 10, 20 ou 30 1..1M de benzo[a]pyrène. Aux temps 3 h, 6 h et 24 h, les cellules ont été récupérées et une extraction protéique a été réalisée. Suite à cette extraction, un western blot a été effectué et l'expression des protéines a été quantifiée selon le logiciel Quantity One. Exemples Les inventeurs ont choisi de développer leurs biomarqueurs à partir de la truite fario, pour les raisons suivantes : (i) la truite est un poisson intégrateur des conditions de son milieu dans la mesure où elle est située dans les niveaux supérieurs des réseaux trophiques aquatiques. (ii) la truite Salmo trutta fario, appelée plus communément truite fario est un poisson de la famille des salmonidés. Il s'agit d'un modèle très ubiquitaire et représentatif car il est présent sur la majorité des cours d'eau d'Auvergne. (iii) elle peut également être élevée en pisciculture, ce qui la rend disponible pour des expériences en laboratoire. Le choix du modèle "globules rouges" est justifié par le fait que le tissu sanguin représente un modèle extrêmement original et très adapté pour le développement des biomarqueurs utilisés dans le cadre de l'invention pour les raisons suivantes : (i) le système sanguin représente un carrefour d'échange et de transport d'une variété de molécules physiologiques (oxygène, substances nutritives, hormones et déchets entre autres), mais également un lieu de passage et d'accumulation de xénobiotiques (médicaments, polluants). (ii) quel que soit le type de pollution (aigüe ou chronique), les différents polluants se retrouvent directement dans le sang et/ou s'accumulent dans les organes, les tissus et les cellules de l'organisme et sont progressivement relargués dans le système sanguin. (iii) les globules rouges ou érythrocytes de poisson sont des cellules nucléées et extrêmement abondantes dans le tissu sanguin. (iv) il s'agit d'un modèle très original et non exploité dans ce domaine. Exemple 1 - Etude des modalités de l'induction d'ABCG2-like et de la P-gp des érythrocytes de truite, par un contaminant modèle, par modélisation in vitro 1. Développement de cultures cellulaires primaires d'érythrocytes de truite A l'heure actuelle, très peu de données sont disponibles sur les érythrocytes de poisson, et notamment ceux de la truite et aucun modèle de culture n'a été développé à partir de ce type de cellules. Les inventeurs ont ici développé des cultures primaires d'érythrocytes de truite comme modèle pour le développement de biomarqueurs de pollution/contamination. Pour les expériences d'induction, un polluant modèle, le benzo-a-pyrène (B[a]P), de la famille des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et présentant des propriétés cytotoxiques, génotoxiques et cancérigènes a été utilisé. Technique Les cellules sanguines ont été ensemencées à raison de 1x106 cellules / mL dans trois milieux de culture différents : le milieu de Leibovitz L-15, le milieu MEM (Minimum Essential Medium) ou le milieu IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) (Gibco). Tous ces milieux ont été supplémentés avec 10% de sérum de veau foetal (SVF), 1% de pénicilline/streptomycine, 1% de fungizone et 1% de L-glutamine (Gibco). Toutes les cultures ont été réalisées dans une chambre thermostatée à une température de 20°C sous agitation de 45 rpm. Un dénombrement cellulaire a été réalisé au cours du temps, à court terme toutes les heures et à plus long terme, tous les jours. Toutes les expériences de culture ont été réalisées en triplicats, et deux comptages par temps ont été réalisés à l'aide d'un compteur Z-2 (Beckman CoulterTM) Résultats Le profil de croissance cellulaire à court terme a été déterminé. Le taux de multiplication au cours du temps a été évalué par le nombre de cellules au temps T sur le nombre de cellules au temps TO. Les résultats concernant le taux de croissance des cellules à court terme montrent un taux de croissance relativement stable dans les trois milieux pendant 5 h (Figure 1). A plus long terme (de 1 à 5 jours), seul le taux de croissance des érythrocytes dans le milieu L-15 est resté voisin de 1, alors que dans les deux autres milieux (IMDM et MEM), ce taux a baissé légèrement. De ce fait, le milieu L15 a été sélectionné pour la réalisation des cultures in vitro d'érythrocytes de truite. 2. Etude de l'expression de la P-gp et d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite en culture primaire en présence ou en absence de B[a]P A l'heure actuelle, aucune donnée n'existe sur l'expression basale (absence et/ou présence et taux d'expression) de la P-gp et d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite. Dans ce contexte, les inventeurs ont étudié l'expression de la P-gp et d'ABCG2-like en conditions de culture primaire, in vitro, dans les globules rouges témoins en comparaison avec ceux traités avec des concentrations croissantes de 10, 20 et 301..1M de B[a]P après un temps d'exposition de 3, 6 et 24 h avec ce polluant. Cette analyse a été réalisée par la recherche de l'expression au niveau protéique. Cette dernière a été analysée par la technique du Western Blot et la quantification d'ABCG2-like et de la P-gp a été effectuée avec le logiciel Quantity One (BioRad). Techniques Préparation et solubilisation de Blay Le benzo[a]pyrène, hydrocarbure aromatique polycyclique de formule brute C201-112, est insoluble dans l'eau. De ce fait, il a été solubilisé avec un solvant organique, le diméthyl sulfoxyde (DMSO; Sigma), couramment utilisé comme solvant à des fins d'utilisation dans des cultures cellulaires. Une solution mère à 1 mg/mL a été réalisée et conservée sous forme d'aliquote de 100 !IL à 20°C. Pour chaque série d'expériences, la solution mère a été décongelée à température ambiante et les différentes concentrations (10, 20 et 30 pM) ont été réalisées extemporanément. Quelles que soient les expériences avec les cultures témoins de DMSO ou celles traitées avec le B[a]P, la concentration finale en DMSO dans les milieux de culture était toujours de 0,1%. Préparation des cultures cellulaires et conditions expérimentales Les cellules sanguines de truite fario ont été ensemencées à raison d'1x106 cellules / mL dans 10 mL de milieu de Leibovitz L-15 (Gibco) supplémenté avec 10% de SVF, 1% de pénicilline/streptomycine, 1% de Fungizone et 1% de L-glutamine (Gibco) dans une chambre thermostatée à une température de 20°C sous agitation de 45 rpm. Les cultures d'érythrocytes de truite ont été préparées dans les conditions suivantes : - flasque 1 : cellules témoins : Milieu L-15 10% SVF, comme témoin de croissance cellulaire sans qu'aucun traitement ne soit appliqué. - flasque 2 : cellules témoins DMSO : Milieu L-15 10% SVF + 0,1% DMSO, pour s'assurer que les éventuelles différences observées entre les cellules traitées au B[a]P et les cellules témoins ne sont pas dues au DMSO. - flasque 3 : Milieu L-15 10% SVF + 10 ptM de B[a]P - flasque 4 : Milieu L-15 10% SVF + 20 pM de B[a]P - flasque 5 : Milieu L-15 10% SVF + 30 ptM de B[a]P Toutes les expériences de cultures ont été réalisées en triplicats, et deux comptages aux temps 0, 3 h, 6 h et 24 h ont été réalisés par un compteur Z-2 (Beckman Coulter).35 Extraction et dosage des protéines et Western Blot Les protéines ont été extraites à partir des cellules sanguines mises en culture en présence ou absence de B[a]P ou directement à partir de cellules sanguines de l'échantillon sanguin. Toutes les étapes d'extraction ont été réalisées à 4°C. Les cellules sanguines ont été incubées dans un tampon de lyse contenant 0,1% d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases et soniquées 5 fois pendant 5 sec dans la glace, à l'aide d'un Ultrason Vibra Cell®. La concentration protéique de chaque échantillon a ensuite été déterminée par la méthode de dosage des protéines de Bradford (Pierce). Pour ces expériences, deux types de témoins ont été réalisés : un témoin de culture d'érythrocytes dans le milieu de Leibovitz + 10% SVF et un témoin de culture en présence de DMSO à 0,1%. Le taux d'expression de la P-gp et d'ABCG2-like a été quantifié par le rapport de la quantité de protéines dans les cellules induites par le B[a]P sur la quantité de protéines dans les cellules témoins DMSO. Résultats Quantification du taux d'expression de la P-gp et d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite en conditions in vitro en présence de 0,1% de DMSO La cinétique du taux d'expression de la P-gp et d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite, in vitro, en présence de 0,1% DMSO a montré un taux relativement constant durant 24 h présentant une moyenne d'environ 0,19 ± 0,04 UA pour la P-gp et 0,15 ± 0,04 UA pour l'ABCG2-like. Ces résultats démontrent qu'en présence de 0,1% de DMSO, le taux d'expression des deux protéines MDR reste relativement constant. Par conséquent, le DMSO à cette concentration a pu être utilisé comme vecteur pour la suite des expériences. Induction de la P-gp dans les érythrocytes de truite en réponse à des concentrations croissantes de Blay en culture in vitro Les résultats du taux d'expression de la P-gp dans les érythrocytes de truite en présence de 10 1..1M de B[a]P montrent une expression plus importante après 3 h d'exposition (0,24 UA) par rapport aux témoins DMSO (0,14 UA), soit un rapport 2 fois supérieur (Figure 3). Le taux d'expression de la P-gp a ensuite diminué sensiblement au cours du temps avec 0,12 UA après 6 h puis est remonté à 24 h à 0,41 UA contre respectivement 0,13 UA et 0,19 UA pour les témoins DMSO, soit un rapport de 2 fois supérieur pour 24 h. En présence de 20 1..1M de B[a]P, l'expression de la P-gp a augmenté nettement après 3 h, 6 h et 24 h, respectivement 0,44 UA, 0,55 UA et 0,70 UA. En présence de 30 1..1M de B[a]P, le taux d'expression de la P-gp présentait un rapport d'environ 4 après 3 h de traitement. Ces résultats montrent que la P-gp dans les érythrocytes de truite, en conditions in vitro, est clairement inductible par le B[a]P. La comparaison des rapports d'expression montre une induction de type dose-dépendante par le B[a]P. D'après les résultats obtenus, le temps de contact de 3 h avec le B[a]P est optimal pour visualiser une induction nette. Induction d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite en réponse à des concentrations croissantes de Blay en culture in vitro L'étude de cinétique du taux d'expression d'ABCG2-like montrait une nette induction de cette protéine par le B[a]P avec un rapport environ 2 fois supérieur pour 10 1..1M de B[a]P par rapport aux cellules témoins, et un rapport environ 3 fois supérieur pour les concentrations de 20 et 30 1..1M de B[a]P après 3 h de contact. Par la suite, pour les trois concentrations de B[a]P testées, ce rapport est resté relativement constant pendant les 24 h (Figure 2). Ces résultats suggèrent que l'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite, en conditions in vitro, est nettement inductible par le B[a]P. Cependant, le taux d'induction reste relativement constant au cours du temps. Comparaison de la modalité d'expression d'ABCG2-like et de la P-gp suite à une induction par le Bbay La comparaison des modalités d'expression de la P-gp et d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite fario en présence de concentrations croissantes de B[a]P montre que ce polluant à des concentrations relativement faibles (10 1..1M) induit rapidement une nette augmentation d'expression de ces deux protéines MDR. En effet, après 3 h de contact avec cette concentration de B[a]P, le taux d'expression de la P-gp et d'ABCG2- like semble augmenter de la même manière (2 fois supérieur par rapport aux cellules témoins DMSO). Ensuite, en présence de concentrations plus élevées de B[a]P (20 et 30 1..1M), le taux d'expression d'ABCG2-like reste environ 3,5 fois plus élevé que le témoin alors que la P-gp répond plus efficacement avec une nette induction de type dose-dépendante. Par ailleurs, le comptage cellulaire, au cours du temps et avant chaque extraction, ne montre aucune toxicité en présence de ces concentrations de B[a]P. Pourtant celui-ci, en raison de ses propriétés cytotoxiques, génotoxiques et cancérigènes, présente une toxicité très importante pour les cellules de mammifère. Ce constat laisse suggérer l'efficacité des deux pompes de détoxification membranaire dans des conditions de contamination par ce polluant. L'ensemble de ces résultats montre que ces deux protéines MDR sont directement impliquées dans les mécanismes de défense cellulaire à l'encontre des xénobiotiques de type HAP. L'implication d'ABCG2-like dans les mécanismes de défense à l'encontre des HAP est totalement originale et non encore décrite dans la littérature. Ces résultats suggèrent que les érythrocytes de truite contaminés d'une manière chronique et en continu par de faibles concentrations de B[a]P répondraient par une augmentation d'expression constante d'ABCG2-like et de P-gp afin d'expulser le xénobiotique vers le milieu extracellulaire. En revanche, en présence de concentrations plus fortes de B[a]P, les érythrocytes de truite assureraient leur défense via la P-gp par une nette augmentation de son expression, tout en maintenant le niveau de défense basal via l'ABCG2-like. Exemple 2 - Recherche de l'expression basale de la P-gp et d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite provenant d'élevage en pisciculture A l'heure actuelle, aucune donnée n'existe sur l'expression basale (absence et/ou présence) de la P-gp et d'ABCG2-like dans les érythrocytes de truite à l'état sauvage ou en élevage. Dans ce contexte, les inventeurs ont étudié l'expression de la P-gp et d'ABCG2-like dans les globules rouges de truite provenant de l'élevage/pisciculture (dans des conditions un peu plus limitées que l'état sauvage). Matériel et méthodes Anesthésie, prélèvement sanguin et des organes chez les truites fario Les truites fario provenant de la pisciculture ont été transportées vivantes au laboratoire et ensuite anesthésiées avec un mélange d'alcool à 70% et d'huile essentielle de giroflier (anesthésique naturel). Les truites provenant du milieu naturel ont été capturées par la pêche électrique. 1 à 2,5 mL de sang ont ensuite été prélevés par ponction intracardiaque dans un tube contenant un anticoagulant, l'héparinate de lithium. Ensuite, très rapidement, les autres organes tels que le foie, le coeur, les branchies, la peau, la chair, la rate, le rein et l'estomac, ont été prélevés à 4°C et conservés dans un tampon de lyse à -20°C. Pour les cultures cellulaires, 500 pl_ de l'échantillon ont été prélevés et le reste de l'échantillon a été conservé à -20°C. Pour les échantillons de terrain, 100 pl_ ont été prélevés et le reste a également été stocké à -20°C. Détection de la P-gp dans les érythrocytes de la truite fario par la technique du Western Blot Les inventeurs ont adapté la technique du Western Blot au modèle "globules rouges de poisson" afin de pouvoir détecter les protéines MDR. Pour le témoin positif, un extrait de foie de la truite a été utilisé (Strum et al. (2001) Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 281:R1119-R1126; Zaja et al. (2007) Aquat. Toxicol. 81 :365- 376). Les étapes suivantes ont été mises en oeuvre. - Extraction et dosage des protéines Les protéines ont été extraites à partir de cellules sanguines de l'échantillon sanguin préalablement congelé. Toutes les étapes d'extraction ont été réalisées à 4°C. Les cellules sanguines ont été mises dans un tampon de lyse (Tris HCI 20 mM, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 6 1..1M 3-mercaptoéthanol, pH 7,5) contenant 0,1% d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Sigma Aldrich) et soniques 5 fois pendant 5 s dans la glace, à l'aide d'un Ultrason Vibra Cell®. La concentration en protéines de chaque échantillon a ensuite été déterminée par la méthode de dosage des protéines de Bradford (Pierce). - Western Blot, révélation et quantification 100 pg d'extraits protéiques ont été déposés sur un gel de polyacrylamide (SDS- PAGE) à 7,5%. La migration a été effectuée à voltage constant (120 V) pendant 1h30. Sur ce gel a aussi été déposée une échelle de poids moléculaires (Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers 250 pl_ Amersham). L'efficacité de l'électrophorèse a été validée par une coloration au bleu de Coomassie. Après migration, les protéines présentes sur le gel ont été transférées sur une membrane PVDF (ImmobilionTm-P, Millipore) en utilisant un appareil de transfert (TE70X, Hoefer). La membrane a été sensibilisée dans du méthanol puis équilibrée dans du tampon de transfert. Le transfert a été réalisé pendant 1 h30 à raison de 0,8 mA par cm2. Avant d'effectuer l'immunodétection, une étape de saturation a été réalisée grâce à un mélange de PBS-Triton 0,1%-lait 5% pendant 30 minutes. L'incubation a été réalisée durant une nuit à 4°C sous agitation avec les deux anticorps primaires :(i) l'anticorps monoclonal de souris C219 dirigé contre la P-gp (anti-P- glycoprotein mouse mAb (C219), Calbiochem), dilué au 1/500è" dans du PBS-Triton 0,1%; (ii) l'anticorps monoclonal de souris anti-a-tubuline (Monoclonal anti-a-tubulin Clone DM1A, Sigma), dilué au 1/10000è" dans du PBS-Triton 0,1%. Trois lavages dans du PBS-Triton 0,1% de 10 min ont été réalisés. La membrane a ensuite été incubée une heure, à température ambiante, dans une solution de PBS- Triton 0,1% contenant l'anticorps secondaire anti-horse radish peroxydase (HRP) (anti- mouse IgG (H+L), HRP conjugate, Promega), dilué au 1/4000è" dans du PBS-Triton (3/0 . Trois lavages dans du PBS-Triton 0,1% ont ensuite été réalisés avant que la révélation ne soit effectuée avec le kit ECL+ (Enhanced Chimio Luminescence TM, GE Healthcare). Après un temps de contact déterminé, les films photos ont été trempés dans une solution de révélation (G139 DeveloperTM, Agfa Healthcare), d'arrêt et de fixation (G338 FixerTM, Agfa Healthcare) puis ont été rincés à l'eau et séchés. La quantification des bandes exprimées a été réalisée avec le logiciel Quantity One (Biorad) utilisant le principe de densitométrie. Les résultats ont été exprimés en unités arbitraires (UA). Résultats Modalité d'expression de la P-gp dans les globules rouges de truites en provenance de pisciculture Les truites fario sur lesquelles les inventeurs ont réalisé cette étude provenaient de la pisciculture "Le Moulin de Pagnat" situé à Saint-Saturnin (63, France). Le contrôle interne de la protéine a-tubuline, marquée par l'anticorps anti-a-tubuline, présentait une bande de 50 kDa dans tous les échantillons analysés (cellules sanguines et foie). Comme il est bien connu de l'homme du métier, la protéine P-gp reconnue par l'anticorps utilisé dans la présente étude peut présenter, selon les espèces, un poids moléculaire variant du simple au double. A titre d'exemple, le même anticorps monoclonal anti-P-gp C219 reconnaît une P-gp de poids moléculaire de 170 kDa chez l'homme, de 140 kDa chez la drosophile et de 55 kDa chez le boeuf (Bamdad et al. (1997) Cytometry 28:170-175; Vaché et al. (2006) Environ. Toxicol. & Chem 25:572-580; Vaché et al. (2007) Environ. Toxicol. & Chem 26:1418-1424; Beaulieu et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1233:27-32). Chez le protozoaire cilié d'eau douce Tetrahymena pyriformis, un autre anticorps anti-P-gp Ab1 reconnaît deux P-gp de 66 et 96 kDa (Bamdad et al. (1999) FEBS Lett. 456:389-393). Dans le cas présent, le même anticorps anti-P-gp marquait d'une manière constante et systématique, dans les différents échantillons de globules rouges analysés, une protéine de 75 kDa et occasionnellement dans quelques échantillons, une protéine de 140 kDa. Dans l'échantillon du foie de la truite (témoin positif), seule une bande de 140 kDa a été détectée (Strum et al. (2001); Zaja et al. (2007)). Or, chez l'homme, le poids moléculaire de la protéine ABCG2 est de 75 kDa. Néanmoins, l'anticorps anti-ABCG2 humain, ainsi que les autres anticorps trouvés sur le marché, ne croisent pas avec les protéines de globules rouges de truite. Par ailleurs, la recherche d'analogie de séquence entre la séquence protéique de la P-gp humaine et de la truite arc-en-ciel montre une importante homologie de séquence. De plus, l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal C219 (Anti-P-Glycoprotein Mouse mAb (C219), Calbiochem) utilisé au cours des expériences ci-dessus est présent sur la séquence protéique de la protéine ABCG2 de la truite. Dans les présentes conditions expérimentales, la bande de 140 kDa a par conséquent été intitulée P-gp et la bande de 75 kDa, ABCG2-like. Etude de la stabilité d'expression d'ABCG2-like et de la P-gp dans les globules rouges de truites en provenance de pisciculture au cours de différentes saisons. Afin de vérifier la stabilité de l'expression des deux protéines MDR au cours des saisons, le taux d'expression d'ABCG2-like et de la P-gp a été recherché : - dans les globules rouges de truites fario, sur une période de 6 mois, d'octobre 2009 à février 2010, provenant de la pisciculture "Le Moulin de Pagnat" (Saint Saturnin, 63, France) alimenté par la Veyre; - dans les globules rouges de truites fario, en mars 2011, provenant de la pisciculture "La Ville Tour" de Besse (63, France) alimentée par la Couze Pavin; - dans les globules rouges de truites Arc-en-ciel, en mars 2011, provenant de la pisciculture "La Ville Tour" de Besse (63, France), alimentée par la Couze Pavin; - dans les globules rouges d'ombres Chevaliers, en mars 2011, provenant de la pisciculture "La Ville Tour" de Besse (63, France), alimentée par l'eau de source de la Couze Pavin. Ces expériences ont été réalisées à partir de culots secs de sang prélevé par ponction intracardiaque au cours de ces périodes, en utilisant la technique du Western Blot. Chaque résultat représente une valeur moyenne obtenue à partir des globules rouges de truite d'au moins trois poissons. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous, suivant l'espèce de poisson étudiée.35 Tableau 1: Expression des protéines ABCG2-like et P-gp dans les globules rouges de poisson au cours des différentes saisons, provenant de différents piscicultures. Date/Période ABCG2 P-gp P-gp/ABCG2 Pisciculture - Rivière La Veyre - "Le Moulin de Pagnat" situé à Saint-Saturnin (63, France) Truites Fario Octobre 06/10/09 0,8 ± 0,31 0,87 ± 0,19 1,09 Novembre 10/11/09 0,92 ± 0,28 0,98 ± 0,04 1,07 Décembre 17/12/09 0,86 ± 0,21 0,89 ± 0,73 1,03 Janvier 19/01/10 0,90 ± 0,17 0,79 ± 0,45 0,88 Janvier 21/01/10 0,84 ± 0,26 0,86 ± 0,69 1,02 Janvier 28/01/10 0,87 ± 0,18 0,86 ± 0,37 0,99 Février 02/02/10 0,85 ± 0,26 0,83 ± 0,48 0,98 Février 18/02/10 0,86 ± 0,15 0,87 ± 0,17 1,01 Moyenne ± écart-type 0,86 ± 0,04 0,87 ± 0,05 1,01 ± 0,06 Rivière Couze Pavin - Pisciculture "La Ville tour" (reflux d'égout 1 semaine à 15 jours avant) Truites Fario Site 36 03/03/11 0,63 ± 0,09 0,52 ± 0,05 0,83 (témoin) Truites Arc-en-ciel Site 35 03/03/11 0,36 ± 0,26 ± 0,15 0,72 0,13 Ombres chevaliers Site 37 03/03/11 0,5 ± 0,13 0,76 ± 0,34 1,52 - Modèle truite fario (i) Truites fario, provenant de la Pisciculture "Le Moulin de Pagnat" (Saint-Saturnin, 63, France) alimenté par La Veyre sur la période d'octobre 2009 à février 2010. Les truites fario de la pisciculture "Le Moulin de Pagnat" sont localisées dans l'eau provenant de La Veyre. Pour ces expériences, sont uniquement présentés les résultats issus des globules rouges des truites qui exprimaient les deux ABC transporteurs. Chez ces dernières, le taux d'expression d'ABCG2-like et de la P-gp était relativement stable au cours des saisons (de septembre 2009 à février 2010) avec une moyenne de 0,86 ± 0,03 UA pour ABCG2-like et de 0,87 ± 0,05 UA pour la P-gp. La moyenne du rapport Pgp/ABCG2-like était de 1,01 ± 0,06. (ii) Truites fario, provenant de la Pisciculture "La Ville tour" de Besse (63, France), alimentée par la Couze Pavin, en mars 2011. Les truites fario de la pisciculture de Besse sont localisées dans l'eau provenant de la Couze Pavin (site n°36), en principe moins contaminée. Les résultats montrent un taux d'expression de 0,63 ± 0,09 pour l'ABCG2-like et de 0,52 ± 0,09 pour la P-gp. La moyenne du rapport P-gp/ABCG2-like était de 0,83. Le taux d'expression basale des deux protéines MDR était donc de moitié chez les truites fario de la Couze Pavin par rapport à celui des truites fario de la pisciculture de Saint-Saturnin. Le rapport P-gp/ABCG2-like était également moins important, confirmant une contamination moindre de l'eau de la Couze Pavin par rapport à celle de la Veyre. - Modèle truite Arc-en-ciel Les truites Arc-en-ciel, provenant de la pisciculture de Besse, sont localisées dans l'eau provenant de La Couze Pavin (site n°35). Les résultats du taux d'expression d'ABCG2-like et de la P-gp étaient respectivement de 0,36 ± 0,09 et de 0,52 ± 0,09. La moyenne du rapport P-gp/ABCG2-like était de 0,72. Les truites Arc-en-ciel étaient exposées aux mêmes conditions environnementales que les truites fario dans la pisciculture de Besse. Le taux d'expression des deux protéines MDR était moins important chez les truites fario. Ceci est probablement dû à une variabilité d'expression inter-espèce. En revanche, le rapport d'expression P-gp/ABCG2- like était sensiblement identique à celui obtenu pour les truites fario dans les mêmes conditions expérimentales. - Modèle Ombre Chevalier Les ombres Chevaliers vivent dans l'eau de source, c'est-à-dire un environnement relativement sain et non contaminé. Dans ces conditions expérimentales, le taux d'expression des deux protéines MDR était de 0,5 ± 0,13 pour l'ABCG2-like et de 0,76 ± 0,34 pour les poissons de la pisciculture, avec un rapport P-gp/ABCG2-like de 1,52. Interprétation des résultats sur les poissons provenant de piscicultures Les résultats obtenus pour les différentes espèces de poisson provenant de différentes piscicultures montrent que : - chez les poissons en élevage dans des piscicultures, la protéine ABCG2-like et la protéine P-gp sont exprimées d'une manière continue et constante au cours des saisons. - le rapport P-gp/ABCG2-like est adapté à différentes espèces de poisson provenant de pisciculture avec une variabilité interespèce. - à partir de ces résultats, une valeur seuil peut être établie pour chaque espèce. - la comparaison du taux d'expression des protéines P-gp et ABCG2-like ainsi que leurs rapports montre des valeurs plus faibles ainsi qu'un rapport plus faible pour les truites fario de la pisciculture de Ville tour baignant dans l'eau de la Couze Pavin que ceux de la pisciculture de Saint-Saturnin baignant dans l'eau de la Veyre.35 Exemple 3 - Validation des biomarqueurs à partir d'échantillons provenant du terrain Afin de valider les biomarqueurs, des essais ont été réalisés à partir de truites fario provenant de cours d'eau de la Région d'Auvergne. Pour ce faire, les inventeurs ont travaillé avec la Fédération Départementale de la pêche et de la protection du milieu aquatique du Puy de Dôme. Ils ont accompagné la Fédération de la pêche sur le terrain, lors de leur campagne d'étude de la qualité et de la répartition des poissons dans les eaux d'Auvergne. Les résultats présentés ici correspondent donc aux sites sur lesquels la Fédération de la pêche a également réalisé ses analyses. Dans ce contexte, depuis mi-juillet 2010, des prélèvements sanguins ont été réalisés in situ sur des truites fario localisées dans différents cours d'eau du département du Puy de Dôme. Puis ces mêmes truites ont été rapportées au laboratoire où les différents organes cibles (foie, intestin, rein...) ont également été prélevés. En parallèle, la Fédération de la pêche a mis en place un "indice propre à la population de la truite, prenant en compte la correspondance topologique et l'estimation de la structure de la population". Cet indice est compris entre 0 et 8. La valeur 0 correspond à un très bon indice et la valeur 8 à un indice très délétère. Les résultats obtenus avec les protéines MDR ont été comparés à ceux obtenus avec l'indice propre de la population de la truite. Un exemple des résultats obtenus en utilisant les protéines MDR, issus des échantillons sanguins des truites fario vivant dans le milieu naturel est présenté dans le Tableau 2. Chaque résultat correspond à une moyenne et un écart-type de prélèvements réalisés sur au moins trois truites, chaque prélèvement contenant des millions d'érythrocytes. Tableau 2 : Exemple du taux d'expression de la protéine P-gp et de la protéine ABCG2- like dans les globules rouges de la truite fario sur des échantillons provenant de différents sites de différents cours d'eau. ABCG2-like P-gp Indice topologie/structure Couze Chaudefour 0,36 ± 0,06 0,00 ± 0,00 1 Couze Chambon à Coudes 0,28 ± 0,13 0,69 ± 0,40 5 Couze Pavin Amont Plaine du Gelat 0,41 ± 0,15 0,66 ± 0,38 1 Aval Lomprat 0,21 ± 0,11 0,23 ± 0,13 0 Chidrac 0,57 ± 0,60 0,99 ± 0,71 4 Issoire 0,84 ± 0,51 0,32 ± 0,21 1 Gandrif Amont Amont Chadeyrnolle 0,36 ± 0,16 0,36 ± 0,21 0 Aval STEP-Chadeyrnolle 1,16 ± 1,10 1,11 ± 1,20 1 Dore Amont Aval Amont Poyet 0,28 ± 0,02 0,18 ± 0,14 2 Aval Poyet 0,41 ± 0,13 0,25 ± 0,08 4 La première partie du tableau représente deux sites avec des niveaux de pollution extrêmes. Le site de la Couze Chaudefour est relativement sain en termes de pollution alors que le site de la Couze Chambon à Coudes est relativement pollué. Les trois autres parties du tableau représentent différents sites prélevés sur trois cours d'eau. Le sens Amont-Aval de la rivière est indiqué. Les valeurs sont exprimées en unité arbitraire (UA) représentant la moyenne et l'écart-type des quantifications des deux protéines. Réponse du biomarqueur selon l'invention chez les truites prélevées dans la Couze Chaudefour et dans la Couze Chambon Au niveau de la Couze Chaudefour, seule la protéine ABCG2-like est présente chez les truites analysées, alors que le taux d'expression de la P-gp est nul. Le biomarqueur constitué de la combinaison des niveaux d'expression de ces deux protéines montre donc une zone peu ou pas contaminée. L'indice de la population des truites montre également un indice de 1 et une faible contamination. Ces résultats sont donc en accord avec le statut relativement sain de cette zone. Au niveau de la Couze Chambon, la protéine ABCG2-like est exprimée à un taux identique à précédemment, alors que la P-gp présente une expression relativement importante. Le biomarqueur selon l'invention indique donc un problème de pollution au niveau de la Couze Chambon. L'indice topologie/structure établi par la Fédération de la pêche montre également un indice de 5, en corrélation avec le biomarqueur selon l'invention. Réponse du biomarqueur selon l'invention chez les truites prélevées sur un gradient (amont et aval) de la Couze Pavin Les inventeurs ont ensuite étudié l'expression des protéines ABCG2-like et P-gp sur le gradient d'une rivière, la Couze Pavin. Pour cela, plusieurs prélèvements sanguins ont été effectués sur des truites provenant de l'amont et de l'aval de la Couze Pavin. L'expression de la protéine ABCG2-like évolue au cours de la rivière. En effet, l'expression est de 0,41 ±0,15 à la plaine de Gelat, de 0,21 ± 0,11 à Lomprat, de 0,57 ± 0,6 à Chidrac et enfin de 0,84 ± 0,51 à Issoire. Ces résultats montrent que l'expression d'ABCG2-like augmente au cours du gradient amont-aval de la rivière. Le niveau d'ABCG2-like semble indiquer un problème de toxicité chronique qui persiste et varie tout le long de cette zone. Concernant la P-gp, son expression évolue également au cours du gradient amont-aval de la rivière mais d'une manière plus "désordonnée". L'expression de la P-gp est de 0,66 ± 0,38 à la plaine du Gelat, 0,23 ± 0,13 à Lomprat, 0,99 ± 0,71 à Chidrac et de 0,32 ± 0,23 à Issoire. Ces résultats indiquent un problème de toxicité plus importante sur cette zone de l'amont vers aval, mise en évidence par la persistance de l'expression de la P-gp, avec l'identification de deux sites présentant une pollution plus importante du fait d'un problème de pollution ponctuelle. En effet, selon les informations de la Fédération de la pêche, la plaine du Gelat est régulièrement source d'une pollution, les résultats des inventeurs semblant concorder avec ce phénomène. La zone du parcours No Kill de Chidrac est source d'une pollution due aux rejets d'une station d'épuration et de vidange directe d'égout dans la rivière. Les résultats du biomarqueur selon l'invention montrent que, sur ces deux sites, l'expression de la P-gp est augmentée, et concorde avec les indices topologie/structure établis par la Fédération de la pêche. Réponse du biomarqueur selon l'invention chez les truites prélevées sur la rivière Grandrif L'intérêt de cette étude réside dans le fait qu'entre les deux sites d'analyse, une pollution au chlore a eu lieu quelques jours avant la campagne de pêche. De plus, le site aval est proche d'une station d'épuration. Les inventeurs ont mis en évidence une augmentation du taux d'expression de la protéine ABCG2-like et de la protéine P-gp de l'amont (site Chadeyrnolle) en aval (STEP- Chadeyrnolle) de la rivière Grandrif, ce dernier site ayant été exposé à une pollution au chlore quelques jours seulement avant les prélèvements des inventeurs. Cependant, l'indice topologie/structure établi par la Fédération de la pêche montre une toxicité peu importante. Les résultats du biomarqueur selon l'invention se distinguent donc de l'indice de la Fédération de la pêche par son importance. Ceci peut être expliqué par la nature de la pollution et la sensibilité du test moléculaire en réponse à ce type de pollution non détectable par l'indice de la Fédération de la pêche. REVENDICATIONS1. Méthode de détermination du degré de contamination et/ou de pollution d'un milieu environnemental et/ou d'un organisme vivant dans un milieu environnemental, comprenant les étapes consistant à : a) mesurer le niveau d'expression d'au moins deux gènes codant des protéines "Multidrug resistance" (MDR), dans un échantillon biologique provenant d'un organisme vivant dans ledit milieu environnemental; b) déterminer le rapport entre les niveaux d'expression desdits au moins deux 10 gènes codant des protéines MDR; c) éventuellement comparer les niveaux d'expression desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR mesurés à l'étape a) avec une valeur de référence; et d) en déduire le degré de contamination et/ou de pollution dudit milieu environnemental et/ou dudit organisme vivant dans ledit milieu environnemental. 15 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle lesdits au moins deux gènes codant des protéines MDR sont choisis dans le groupe constitué des membres de la sous-famille ABCB, de la sous-famille ABCC et de la sous-famille ABCG. 20 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'étape a) comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène codant une protéine MDR qui est exprimée à un niveau basal dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental contrôle non contaminé et non pollué. 25 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit au moins un gène codant une protéine MDR qui est exprimée à un niveau basal est un gène codant une protéine MDR de la sous-famille ABCG, en particulier le gène codant la protéine ABCG2/BCRP-like. 30 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l'étape a) comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène codant une protéine MDR qui n'est pas exprimée dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental contrôle non contaminé et non pollué. 35 6. Méthode selon la revendication 5 dans laquelle ledit au moins un gène codant une protéine MDR qui n'est pas exprimée est un gène codant une protéine MDR de la sous-famille ABCB; en particulier le gène codant la protéine ABCB1/BDR1/P-gp. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la valeur de référence de l'étape c) est le niveau d'expression respectif desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental différent du milieu environnemental de l'organisme de l'étape a). 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la valeur de référence de l'étape c) est le niveau d'expression respectif desdits au moins deux gènes codant des protéines MDR dans un échantillon biologique provenant d'un organisme de la même espèce que l'organisme de l'étape a) vivant dans un milieu environnemental contrôle non contaminé et non pollué. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de sang, en particulier un échantillon de sang constitué d'érythrocytes. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle ledit milieu environnemental est un milieu aquatique, en particulier un cours d'eau. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle ledit organisme est un organisme non-humain, en particulier un poisson, de préférence une truite fario. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant en outre la détermination parallèle d'un indice de contamination et/ou pollution conventionnel connu, de préférence normalisé.