Brevet FR2981661A1 — publié le 20130426

PROCEDE DE PREPARATION DU FACTEUR H HUMAIN La présente invention concerne un procédé de préparation de facteur H humain recombinant dans une lignée cellulaire humaine, avec un rendement amélioré. Le facteur H est une protéine plasmatique présente dans le plasma humain à un taux moyen de 500 mg/L. Il est produit principalement par les cellules du foie de façon constitutive, mais également produit localement par d'autres cellules, telles que les cellules épithéliales du pigment de la rétine, les cellules endothéliales, les plaquettes ou les cellules souches mésenchymateuses. La fonction principale du facteur H est la régulation de l'activation de la voie alterne du complément. Le facteur H est impliqué dans cette régulation par trois mécanismes: (i) la régulation de l'activité du facteur I, qui permet l'inactivation de la protéine C3b (iC3b); (ii) l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne par compétition avec le facteur B pour la liaison au C3b ; (iii) l'accélération de la dissociation de la C3 convertase de la voie alterne (C3bBb) (decay acceleration activity). Le facteur H peut agir soit dans la phase fluide sanguine pour maintenir un niveau bas de molécules C3 activées (C3b), soit au niveau des surfaces cellulaires présentant des polyanions, tels que des glycosaminoglycanes, le sulfate d'héparane ou l'acide sialique, pour protéger les cellules hôtes vis-à-vis de la lyse cellulaire induite par l'activation du complément. Le gène HF1 ayant 102,494 paires de bases (pb) et 23 exons (NCBI RefSeq: NG 007259.1), est localisé dans le cluster de gènes RCA (regulator of complement activation) sur le locus 1q32, Chrl. En raison de l'épissage alternatif, deux ARNm sont transcrits à partir du gène HF1, l'un ayant 3696 pb et codant la protéine FH et l'autre ayant 1347 pb et codant la protéine FHL-1 (FH-like 1 protein). La protéine facteur H (FH) (1213 aa, 155 kDa) est une glycoprotéine simple chaîne, constituée de 20 domaines répétés SCR (short consensus repeats) (également appelés CCP ou SHUSHI). La protéine FHL-1 (449 acides aminés, 42 kDa) possède les 7 premiers domaines SCR plus 4 acides aminés hydrophobes en C-terminal. Naturellement, le facteur H (FH) humain présente un polymorphisme en position 402 de sa séquence en acides- aminés, caractérisé par la substitution d'une tyrosine (Y) par une histidine (H). Cette substitution elle-même résulte d'un remplacement de nucléotide au niveau du gène HF1, où un nucléotide T est remplacé par un C. Les domaines SCR sont présents dans de nombreuses protéines, telles que des protéines de la famille du FH (FHR1, FHR2, FHR3, FHR4), des protéines de la famille RCA (CR1, CR2, C4BP, CD55, CD46) ou des protéines de pathogènes (vaccinia virus,...) Un domaine SCR est composé d'environ 60 acides aminés séparés par une courte séquence linker (3 - 8 acides aminés pour le FH humain). Les domaines SCR sont constitués principalement de brins beta et possèdent chacun deux ponts S-S répartis à chaque extrémité du domaine. Les analyses d'homologie de séquences montrent que 4 cystéines conservées sont impliquées dans la formation de deux ponts S-S intra-domaine et qu'un tryptophane (W) dans le domaine SCR est hautement conservé. En raison du fort intérêt thérapeutique pharmacologique, de nombreuses études ont été effectuées dans les différents systèmes de production in vitro de protéine dans le but d'améliorer la productivité de facteur H humain recombinant Le facteur H humain recombinant a été produit dans le système de baculovirus (Sharma et Pangburn, Gene 1994, June 10 : 143 (2) : 301-2) et dans les cellules COS. Plus récemment, le facteur H humain recombinant a été produit dans la mousse physcomitrella en photobioréacteur (Buttner-Mainik et al., Plant biotechnol. J. 2010 Aug 17) ainsi que dans la levure Pichia pastoris (Protein Expr. Purif. 2011 Apr. 76(2) 254-63). Malgré ces nombreux efforts, à ce jour, la productivité atteinte pour du facteur H 20 humain recombinant n'est toujours pas satisfaisante pour un usage thérapeutique chez l'homme.. Par conséquent, il existe toujours un grand besoin de développer une méthode de production de haute performance pour du facteur H humain. L'un des buts de la présente invention est de proposer l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la production de facteur H humain recombinant. 25 L'un des autres buts de la présente invention est de mettre à disposition un procédé de la préparation de facteur H humain recombinant La présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire. 30 Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou une séquence ayant au moins 99%, notamment 99,4%, notamment 99,7% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1. Un acide nucléique représenté par une telle séquence peut être le variant 402Y de facteur H humain ou un autre variant de facteur H humain, tel qu'un variant mentionné dans le site internet http://www.uniprotorgiuniprot/P08603. Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée 5 cellulaire humaine pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire. Cette lignée cellulaire peut être une lignée ne produisant pas de facteur H, une lignée produisant du facteur H en une quantité non détectable, ou une lignée produisant du facteur H 10 endogène. La quantité de facteur H endogène produite par une lignée cellulaire est déterminée par la méthode ELISA avec un couple d'Anticorps judicieusement choisi qui permet de détecter des concentrations minimales de 5 ng/ml de Facteur H dans le surnageant cellulaire. Des kits commerciaux de dosage sont également disponibles (ex : Kit HK342 Hycult). 15 Le facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 correspond au variant 402Y, dans lequel l'acide aminé à la position 402 est une tyrosine. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine produisant du facteur H endogène, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, 20 avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire. Par « une lignée produisant du facteur H », on entend une lignée cellulaire pour laquelle il est possible de détecter la présence de facteur H endogène dans le surnageant cellulaire par les méthodes classiques de détection de protéines tel que l'ELISA et le Western 25 Blot. Certaines lignées cellulaires humaines, telles que la lignée cellulaire PER.C6® ou la ligne HEK 293F, produisent du facteur H humain par voie endogène. Cependant, la productivité de facteur H endogène par ces cellules est relativement faible ; elle est d'environ 70 iLtg/L pour la lignée cellulaire PER.C6®, au bout de 48H de culture, et d'environ 11 iLtg/L 30 de facteur H secrété dans le milieu de culture pour la lignée cellulaire HEK 293F après 7 jour de culture. Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine, avec un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement supérieur à 20 mg/L, ou à 30 mg/L, ou à 40 mg/L, ou à 50 mg/L, plus particulièrement supérieur à 60 mg/L, ou à 70 mg/L, ou à 80 mg/L, ou à 90 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture. Avantageusement, l'acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, a fait l'objet d'une optimisation de codons. La présente invention est basée sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs que l'optimisation de codons de facteur H humain permet d'augmenter la productivité de facteur H humain recombinant dans plusieurs lignées cellulaires humaines. L'optimisation de codon a but de remplacer les codons naturels pour des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés à pour avantage majeur d'accroitre la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al Protein Expr Purif. (2007). L'optimisation de séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourrait ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demie-vie des ARNm et donc à leur potentiel d'être traduit (Chechetkin J. of theoretical biology 242, 2006 922-934). Nous vous remercions de préciser l'avantage de l'optimisation de codon d'une protéine humaine pour la production de ladite protéine chez une lignée cellulaire humaine. L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence. Dans un mode de réalisation plus avantageux, l'acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par : (i) la séquence ID NO : 2, (ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut être calculé selon la formule suivante : le nombre des résidus identiques x 100 le nombre des résidus de la séquence la plus courte La séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence d'acide nucléique naturel codant le facteur H humain. L'acide nucléique naturel codant le facteur H humain est représenté par la séquence SEQ ID NO : 8. Dans un autre mode de réalisation plus avantageux, dans lequel l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend en outre un acide nucléique choisi parmi : - un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et codant le peptide signal naturel du facteur H, (PS naturel non optimisé), - un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel optimisé) - un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou - un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID NO : 4 (PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4. Le peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H peut être un peptide signal choisi parmi les peptides signaux de toutes les protéines qui sont sécrétés chez les eucaryotes et notamment chez les mammifères et plus particulièrement chez l'homme comme ceux des immunoglobulines, de facteurs de croissance comme l'EPO, des hormones comme l'insuline, d'enzymes comme le trypsinogène, La séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence SEQ ID NO : 5. L'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4 code un peptide signal artificiel. La présence d'un peptide signal permet de conférer une meilleure sécrétion de protéine recombinante dans le milieu de culture. Dans un mode de réalisation, l'ensemble de l'acide nucléique codant le précurseur de facteur H humain, comprenant l'acide nucléique codant le peptide signal et l'acide nucléique codant le facteur H humain, fait l'objet de l'optimisation de codons. Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le précurseur du 5 facteur H comprend : - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et - un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, 10 ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. 15 Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2. Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 20 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6. La séquence SEQ ID NO: 6 correspond une optimisation de codons du précurseur du facteur H humain qui comprend son peptide signal naturel. 25 Dans un autre mode de réalisation, un acide nucléique codant un précurseur de facteur H humain recombinant comprend: - un acide nucléique codant le facteur H humain et ayant fait l'objet de l'optimisation de codons, et 30 - un acide nucléique codant un peptide signal artificiel, qui ne correspond pas au peptide signal naturel de facteur H humain, mais peut conférer une capacité de sécrétion meilleure ou similaire à celle du peptide signal naturel du facteur H humain. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend : - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant 5 choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. 10 Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2. Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 15 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7, ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7. 20 Un acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 8 peut être utilisé comme un contrôle de la productivité d'un acide nucléique optimisé tel que décrit dans la présente invention. 25 Plus particulièrement, cet acide nucléique de contrôle peut être l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 9. Dans un mode de réalisation avantageux de la présente invention, le facteur H tel que défini ci-dessus est produit dans la lignée cellulaire PER.C6® ou la lignée cellulaire HEK 30 293F. La lignée cellulaire PER.C6® est issue de cellules rétinales primaires humaines dans lesquelles un fragment d'ADN adénoviral Ad5 qui contient à la fois le gène ElA et le gène E 1B est inséré dans les cellules par un vecteur. Ce fragment d'ADN adénoviral permet de conférer l'immortalité aux cellules dans lesquelles il est inséré, par l'intermédiaire de la protéine ElB qui inhibe la p53. La protéine E lA quand à elle a un tropisme pour le promoteur viral hCMV et permet sa transactivation et la potentialisation de la séquence génique qui sera insérée en 3' de ce dernier et qui pourra être le Facteur H. La lignée cellulaire PER.C6® produit, par voie endogène, à la fois le variant 402H du facteur H humain et le variant 402Y. La présente invention concerne particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C6® pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C6® pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, 7 ou 9. La présente invention concerne aussi particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire HEK 293F pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire. La lignée cellulaire HEK 293F produit par voie endogène uniquement le variant 402Y de facteur H humain. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la lignée cellulaire HEK 293F pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide nucléique 25 codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou 7. La présente invention concerne également l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine, telle que la lignée cellulaire PER.C6® ou HEK 293F pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, dans laquelle l'acide nucléique codant le 30 précurseur du facteur H est un acide nucléique génomique comprenant des introns artificiels ou naturels de facteur H humain ou d'un autre gène humain et des exons naturels de facteur H humain. La présente invention concerne aussi un procédé de la préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans une lignée cellulaire humaine avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire, ledit procédé comprenant l'étape de culture de ladite lignée cellulaire transformée par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain. Le vecteur comprenant un tel acide nucléique peut être un quelconque vecteur d'expression pour les lignées cellulaires eucaryotes connues de l'homme du métier. La transformation de la lignée cellulaire peut être mise en oeuvre par des techniques d'électroporation, de nucléofection type AMAXA, un "pistolet à gène" (gène gun) ou encore à l'aide d'un agent de transfection connu de l'homme de métier, tel que des agents cationiques des liposomes ou des polymères tel que la fectine ou l'agent PEI. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes : (i) la transformation d'une lignée cellulaire par un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée, (ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée, pour obtenir l'expression du facteur H dans le milieu de culture. Ledit vecteur d'expression peut contenir un gène de résistance aux antibiotiques pour permettre la sélection des cellules transfectées lors de l'établissement de cellules produisant de façon stable la protéine d'intérêt. Dans un mode de réalisation plus particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes : (i) la transformation d'une lignée cellulaire, par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur de la protéine facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée, (ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée pour obtenir l'expression de facteur H dans le milieu de culture, (iii) la purification du facteur H humain à partir du milieu de culture, et (iv) éventuellement la séparation de la forme endogène et de la forme recombinante du facteur H purifié à l'étape (iii). La purification du facteur H humain est mise en oeuvre par des techniques de chromatographie sur colonne héparine suivi d'une diafiltration ou d'un gel filtration. Une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions peut-être ajoutée après l'étape sur colonne d'Héparine pour améliorer le rendement de purification ou la pureté du produit. La pureté d'un produit après une telle purification peut atteindre 99,7% de produit purifié. Plus particulièrement, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, représenté par la 5 séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique comprenant : (i) un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant 10 choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75 %, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou (ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi 15 parmi la séquence SEQ ID NO : 4 et une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la 20 séquence SEQ ID NO : 2. Dans un mode de réalisation avantageux, le vecteur pour la transformation de la lignée cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend : (i) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique 25 représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, ou (ii) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2. Dans un mode de réalisation plus avantageux, le vecteur pour la transformation de la 30 lignée cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend : (i) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, ou (ii) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H représenté par la séquence SEQ ID NO : 7. La lignée cellulaire utilisée dans le procédé selon la présente invention peut être la lignée cellulaire PER.C6® ou HEK 293F. La présente invention a également pour objectif de fournir un facteur H recombinant possédant une pureté supérieure à 90% de préférence supérieure à 95%. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement un variant de facteur H humain recombinant, ledit variant étant un variant mentionné dans le site internet http://www.uniprotorgluniprot/1308603. Particulièrement, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement le variant 402Y de facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, sans le variant 402H de facteur H humain. Le variant 402Y de facteur H humain recombinant peut être produit par la lignée 15 cellulaire HEK 293F qui produit par voie endogène uniquement le variant 402Y. La production du variant 402Y recombinant peut être également mise en oeuvre par la lignée cellulaire PER.C6® qui produit par voie endogène à la fois le variant 402Y et le variant 402H, suivie par une purification ou une séparation qui permet de séparer le variant 402Y du variant 402H. 20 La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant uniquement le variant 402H du facteur H humain, sans le variant 402 Y représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. Le variant 402H du facteur H humain recombinant peut être produire par la lignée cellulaire PER.C6® ou la lignée cellulaire HEK 293F. Une purification ou une séparation est 25 nécessaire afin de séparer le variant 402H du variant 402Y. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le variant H402 et le variant Y402. 30 La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant plus de 99,5% d'un variant de facteur H humain et moins d 0,5% d'un autre variant de facteur H humain. La présente invention est illustrée par les figures et les exemples ci-après. Ces figures et exemples ne visent en aucun cas la limitation de la portée de la présente invention. Figures Figure 1 signifie dosage de facteur H endogène dans les cellules PER.C6® et HEK 293F Figure 2 signifie génération de pools stables PER.C6® exprimant de façon stable le 5 facteur H recombinant (ici exemple pour le facteur H variant H402) Figure 3 signifie cinétique de la production de facteur H recombinant (H402) dans les pools stables PER.C6® en mode batch. Figure 4 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les cellules HEK 293F en mode batch pendant 7 jours. 10 Figure 5 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les pools stables PER.C6® en mode batch pendant 7 jours. Figure 6 signifie Analyse du Facteur H recombinant produit dans les cellules PER.C6® et HEK 293F par SDS-PAGE et Western Blot. Figure 7 signifie Purification du Facteur H sur colonne Héparine suivi d'une étape de 15 diafiltration. Figure 8 signifie Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase du Facteur H recombinant produit dans les cellules PER.C6® et HEK 293F. 20 Exemples Exemple 1: Matériels et Méthodes 1.1 Optimisation de l'acide nucléique codant le facteur H humain L'optimisation de séquence à été faite par l'algorithme du fournisseur de gène de 25 synthèses avec optimisation pour Homo sapiens en évitant les sites de restrictions nécessaires au clonage moléculaire 1.2 Transfection des vecteurs pcDNA2001neo contenant les séquences du Facteur H dans les cellules PER.C6® pour générer des pools stables. 30 La transfection en pools stables est réalisée en parallèle avec le vecteur pcDNA200lneo vide (= sans séquence de Facteur H). Les transfections en pool stables sont effectuées selon le nouveau protocole décrit ci-dessous. L'électroporation sera effectuée avec les vecteurs suivants: Vecteur d'expression control pcDNA2001Neo Facteur H MD1 MD2 MD3 MD1 signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 9. MD2 signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ 5 ID NO : 6. MD3 signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 7. 10 - Pré-culture des cellules Les cellules pour la transfection en pool stable, issues de la culture en suspension à partir de cellules en suspension stockées en cryotube dans du milieu sans sérum, sont des cellules PER.C6 SF adaptées en milieu Permab (Hyclone, ThermoFisher Scientific) et sous agitation. Elles ont été cultivées durant 3 semaines sous agitation à 125rpm. 15 Deux jours avant électroporation, les cellules sont passées en suspension à 5E5 cv/mL par un changement complet du milieu Permab. Le volume est adapté au nombre de cuvettes planifié lors de l'électroporation. Le jour de l'électroporation, la concentration cellulaire et la viabilité sont déterminées. Les cellules doivent être en phase exponentielle de croissance et avoir une viabilité supérieure 20 à 90%. Avant l'électroporation, le milieu Permab (3 mM L-Glutamine) est préchauffé à température ambiante. - Electroporation 25 Les étapes suivantes sont effectuées dans 6 cuvettes : - Pré-aliquoter 60 mL dans un T150 et préchauffer à 37 °C (soit 10 mL par cuvette) Les étapes suivantes sont effectuées dans chaque cuvette : - Centrifuger 6E6 cv à 300g durant 5 minutes et jeter le surnageant - Re-suspendre les cellules en agitant le tube un dizaine de fois - Ajouter 400 lut de milieu Permab (3 mM L-Glutamine) à température ambiante, sans laisser les cellules plus de 15 minutes. - Ajouter 8 ug d'ADN dans un tube Eppendorf 1,5 mL stérile - Ajouter délicatement 400 lut de suspension cellulaire sur les 8 ug d'ADN - Transférer la suspension ADN/Cellules dans une cuvette d'électroporation 4mm. Vérifier l'absence de bulles au fond de la cuvette. - Après avoir transféré la cuvette dans la chambre à électroporation, appliquer le programme suivant de BioRad Gene Pulser Xcell : Voltage (v) 250 Durée de la pulsation (msec) 5 Nombre de pulsations 1 Intervalle de pulsations (sec) 0 Cuvette (mm) 4 - Ecarter les amas blancs flottant en surface (débris cellulaires) et prélever délicatement la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette de 1 mL.Ajouter les cellules directement dans les 60 mL de milieu préchauffé à 37°C. Ne pas le faire au goutte à goutte afin d'éviter la formation de précipités. - Recommencer les étapes suivantes jusqu'à l'obtention des 6 cuvettes pour la génération du pool stable PER.C6®. - Sélection et génération d'un pool stable 48 heures après la transfection, l'efficacité de transfection est évaluée. La culture cellulaire est resuspendue et un comptage sur 1 mL est effectué. La concentration en cellules viables divisée par celle de départ (6E5 cv/mL) permet d'obtenir le pourcentage de recouvrement de la viabilité. Un récipient à 5E5 cv/mL est ensemencé par changement total du milieu et ajout de Permab (3 mM L-Glutamine) et G418 à 125 µg/mL. La totalité des cellules est centrifugée à 300g pendant 5 min avant l'ajout du milieu de sélection. Les cellules sont passées deux fois par semaine (le lundi et le vendredi) par renouvellement complet du milieu de sélection. Le volume et le contenant sont adaptés de manière à obtenir une concentration de 3E5 cv/mL à chaque passage. Après 2-3 semaines la viabilité cellulaire s'améliore. Lorsque celle-ci atteint environ 50 %, des cultures en conditions agitées peuvent être initiées. Dans ce cas, la concentration de départ est de 5E5 cv/mL. Lorsque la culture atteint plus de 85 % de viabilité, une cryoconservation est effectuée à 5E6 cv/ampoule. Ensemencement de la culture en Batch pour production de Facteur H recombinant: Le volume du récipient utilisé pour le Batch est de 250 ml avec un volume initial de travail de 30 ml. Tout changement de volume de récipient entraine automatiquement une adaptation des volumes et valeurs énoncés dans ce protocole. Les cellules sont ensemencées à une concentration de 1E6 cv/ml par renouvellement complet du milieu de culture. Les cellules sont incubées pendant 7 jours à une température de 36.5°C en agitation 125 rpm sans renouvellement ou ajout de milieu. Un prélèvement est réalisé tous les jours entre le 3' et 7ème jour de culture afin de déterminer la viabilité, la densité cellulaire et la production de Facteur H recombinant. Le 7' jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H recombinant est filtré en 0.22 ium puis congelé à -20°C. 1.3: Transfection transitoire dans les cellules HEK 293F pour production transitoire de Facteur H recombinant. Pre-culture des cellules: La veille de la transfection transitoire, les cellules HEK 293F sont repiquées à une concentration cellulaire de 7E5 vc/ml. Transfection transitoire : La densité cellulaire et la viabilité des cellules HEK 293F sont déterminées le jour de la transfection. Le volume de culture correspondant à 30E6 cv/ml est centrifugé. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules est repris dans 28 ml de milieu de culture F17 (Invitrogen), transféré dans un erlen de 250 ml et incubé à 37 °C. Formation du complexe agent de transfectiion / ADN en rapport 2:1: L'agent de transfection (Fectine ou PEI) et l'ADN correspondant au vecteur pCEP4 contenant une des 30 séquences du Facteur H sont préparés dans du milieu OptiMEM (Invitrogen) de la façon suivante: - Ajout de 30ug d'ADN dans 1 ml d'OptiMEM - Ajout de 60 iul de Fectine ou 60 iul de PEI dans 1 ml d'OptiMEM. Ces deux préparations sont incubées séparément pendant 5 minutes à température ambiante puis la solution contenant l'agent de transfection est ajoutée délicatement à celle contenant l'ADN. Le mélange est incubé pendant 25 minutes à température ambiante avant d'être ajouté au 28 ml de cellules HEK 293F préalablement préparées. Les cellules sont alors incubées à 37°C en agitation à 125 rpm. Témoin positif de transfection: un vecteur exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein) est également transfecté dans les mêmes conditions. 24h post-trasnfection l'efficacité de transfection est déterminée par microscopie à fluorescence (rapport nobre de cellules exprimant la GFP sur nombre total de cellules). Témoin de croissance: des cellules HEK 293F sont transfectées dans les mêmes conditions mais en l'absence de vecteur d'expression. Ce témoin permet de déterminer la viabilité post-transfection et si il y a une toxicité lié à la production transitoire de la protéine exogène (le facteur H recombinant). Production transitoire de facteur H: Les cellules sont maintenues en culture durant 7 jours sans ajout ou renouvellement de milieu de culture. La densité cellulaire et la viabilité est déterminé tous les jours entre le 5' et le 7' jour. Le 7' jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H recombinant est filtré en 0.22 ium puis congelé à -20°C. 1.4 Test de viabilité de cellules La densité cellulaire et la viabilité sont déterminées à l'aide d'un automate analyse de culture cellulaire (Cedex, Innovatis - Roche Applied Science). La mesure de la viabilité est basée sur le comptage des cellules ayant incorporées du bleu trypan. 1.5 Caractérisation du facteur H humain recombinant SDS-PAGE: - Préparation des échantillons: l'équivalent de litg de protéine est mélangé en vol/vol avec du tampon Laemli 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95°C afin de dénaturer les protéines. Les protéines sont alors déposées dans les puits d'un gel linéaire 10 % Bis-Tris /Hcl pH 6.4. La migration est réalisée en présence d'un tampon MOPS (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, pH 7.7).Les protéines sont séparées à un voltage constant de 200 volts pendant 60 minutes. Coloration au bleu de coomassie: Après migration, le gel est lavé 3 fois 5minutes avec de l'eau distillée puis coloré avec une solution de bleu de coomassie durant la nuit. L'excès est éliminé par des lavages successifs avec de l'eau ditsillée. Une photo du gel est alors prise à l'aide d'un imageur. Révélation par Western Blot: Après migration, le gel est transféré dans un tampon contenant 40mM d'acide Amino- 6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8. Sur un appareil de transfert semi-sec (TE77, Amersham Pharmacia), un sandwich est réalisé de l'anode vers la cathode de la façon suivante: - 6 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 0.3M pH 10.4 - 3 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 25mM pH 10.4 - 1 membrane de nitrocellulose (RPN 303E, GE Healtcare) pré-incubés dans du tampon Tris 25mM pH 10.4 - le gel pré-incubé dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8 - 9 papiers whatman pré-incubés dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8 Le transfert est réalisé à intensité constante de 0.8mA/cm2 de membrane pendant 60 minutes. Après transfert, la membrane est saturée sur la nuit à 4°c dans un tampon PBS contenant 1% de BSA et 0.1% de tween20. La membrane est ensuite lavée avec de l'eau physiologique contenant 0.1% de tween 20. Le facteur H est révélé à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-facteur H (MCA 508G, Serotec) à la concentration de 0.5µg/m1 incubé à température ambiante pendant 60 minutes, suivi d'un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la Peroxidase à la concentration de 8Ong/m1 incubé à température ambiante pendant 60 minutes. Les protéines marquées sont alors révélées à l'aide d'un kit enzymatique de chimiluminescence et détectées à l'aide d'un imageur équipé d'un détecteur photonique. 1.6 Dosage de facteur H humain dans le milieu de culture par ELISA TAMPON ET SOLUTIONS: 1- Tampon de coating : PBS Dissoudre le contenu d'un sachet de sels pour tampon PBS, pH 7.4 (Sigma : P-3813 ou sels de qualité équivalente) dans un litre d'eau PPI. 2- Anticorps de coating: Immunoglobulines de mouton anti-Facteur H humain (The Binding Site - Réf : PC030) Extemporanément, diluer l'anticorps dans le tampon de coating pour obtenir une concentration comprise entre 3,5 et 5,5 µg/ml. 3 - Tampon de saturation: Tampon PBS - BSA 1 % (p/vol) Pour une plaque, dissoudre 0,15 g de BSA (BSA : Sigma - Réf. : A7030 ou Jackson Immuno Research Laboratories, Réf. : 001-000-162 ou une BSA de qualité équivalente) dans 15 ml de tampon PBS. 4- Tampon de lavage: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol) Ajouter 1 ml de Tween 20 à 1 litre de PBS. 5 - Tampon de dilution: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol) - BSA 0,1 % (p/vol) Tampon pour la dilution du standard, des échantillons à doser et de l'anticorps de révélation. Dissoudre le tampon de saturation au 1/10ème en tampon de lavage. 6 - Solution standard: Calibrateur Facteur H humain NL (The Binding Site, Réf. : RP030) Reprendre le lyophilisat par le volume d'eau PPI indiqué par le fournisseur et attendre 30 min, puis répartir en fractions aliquotes de 200 et les congeler à -70°C. Diluer le standard au 1/7000ème (pour un std à 700 mg/L), pour obtenir une solution mère de 100 ng/ml, soit : lère prédilution au 1/70ème : 5it1 de Std + 345itl de tampon de dilution, 2ème prédilution au 1/100ème : 5it1 de la lère prédilution + 495it1 de tampon de dilution. Puis diluer de 1/2 en 1/2 dans le tampon de dilution sur 7 points, Le blanc est réalisé avec le tampon de dilution. 7 - Echantillons Les échantillons sont prédilués de façon à obtenir une concentration proche de celle du premier point de gamme. Puis diluer de Y2 en Y2 sur 8 points. 8- Anticorps monoclonal anti Facteur H: Immunoglobulines monoclonales de souris purifiées anti-Facteur H humain (SEROTEC - Réf : MCA508G). Extemporanément diluer l'anticorps dans le tampon de dilution au 1/5000', soit pour 1 plaque : 2 iLt1 dans 10 ml de tampon de dilution. 9 - Anticorps de révélation: Immunoglobulines de chèvre anti-IgG de souris marquées à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories, Réf. : 115-035-062). Extemporanément diluer les anticorps dans le tampon de dilution au 1/10000ème (1/50ème puis 1/200ème) soit pour une plaque : 1/50ème : 2 iLt1 dans 98 iLt1 de tampon dilution, puis 1/200ème : 50 iLt1 dans 10 ml de tampon dilution. 10- Solution de révélation: TMB Kit Mélanger extemporanément volume à volume la solution de substrat de la peroxydase (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) et la solution de peroxyde. 11- Solution d'arrêt: Acide sulfurique 4 N ou 2 M (Fisher Scientific, Ref : 0379D). MODE OPERATOIRE - Sensibilisation de la phase solide Dans une plaque de microtitration, distribuer 100 pl par puits d'anticorps de coating dilué Recouvrir d'une feuille adhésive. Incuber une nuit à + 4° C et vider la plaque par retournement. - Saturation de la phase solide Distribuer 120 pl par puits de solution de saturation. Recouvrir d'une feuille adhésive. Incuber lh à 20° C. Laver 3 fois en tampon de lavage. - Capture de l'antigène Distribuer 100 pl par puits de tampon de dilution (blanc), de chaque dilution du standard et des échantillons. Recouvrir d'une feuille adhésive. Incuber 1 heure 30 à 20° C. Laver 5 fois en tampon de lavage. - Reconnaissance de l'antigène par l'anticorps monoclonal Distribuer 100 pl par puits de l'anticorps monoclonal. Recouvrir d'une feuille adhésive. Incuber 1 heure 30 à 20° C. Laver 5 fois en tampon de lavage. - Marquage par le conjugué HRP (HorseRadish Peroxidase) Distribuer 100 pl par puits de l'anticorps de révélation. Recouvrir d'une feuille adhésive. Incuber 1 heure à 20° C. Laver 5 fois en tampon de lavage. - Réaction enzymatique Distribuer 100 pl par puits de TMB contenant le substrat à intervalle de temps régulier et loin de toute lumière intense. Incuber à température ambiante entre 5 - 15 minutes.. Ce temps doit être identique pour tous les points de dosage. - Arrêt de la réaction Distribuer 100 pl d'H2SO4 4N par puits à intervalle de temps régulier. Lire les densités optiques (DO) à 450 nm. EXPLOITATION DES RESULTATS La droite de régression linéaire de la courbe standard est définie par les couples (Log (DO à 450 nm-DO blanc), Log de la concentration de Facteur H en ng/ml). Le résultat est la moyenne de tous les résultats obtenus pour un même échantillon dans la zone linéaire de la droite obtenu pour la gamme du standard 1.7 Caractérisation de l'activité biologique du facteur H humain recombinant (C3 convertase Decav-accelerating activity) TAMPONS ET SOLUTIONS - Tampon de recouvrement Tampon carbonate 0.1M - pH 9.6 Na2CO3 : 5.3 g dans 500 ml d'eau PPI (pour préparations injectables) 0.1 M NaHCO3 : 4.2 g dans 500 ml d'eau PPI 0.1 M Ajouter 30 ml de la solution Na2CO3 à 70 ml de la solution NaHCO3 et ajuster éventuellement le pH à 9.6. Conserver à 4° C pendant 2 mois. - Tampons de lavage a) Tampon PBS pH 7.4 (Sigma) + Tween 20 0.1 % (= Tampon A) Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml de tampon PBS pH 7.4. Conserver à + 4° C (2 jours maximum). b) Tampon phosphate de Sodium 10 mM , NaC125 mM , pH 7.2 ± 0.05 (= Tampon B) Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 1.56 g de NaH2PO4, 2H20. Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 3.58 g de Na2HPO4,12 H2O. Ajouter environ 66 ml de la solution de Na2HPO4 à 34 ml de la solution de NaH2PO4. Ajuster le pH à 7.30. Ajouter le NaC1 nécessaire pour obtenir une concentration finale à 25 mM. Ce tampon peut être conservé à 4°C pendant 1 mois. Ce tampon sert de base pour les tampons de saturation, de dilution et de lavage. Pour obtenir le tampon de lavage (= Tampon C) : Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml du tampon B. Conserver à + 4° C (2 jours maximum). - Tampon de saturation Préparer un volume suffisant à partir du tampon B. Ajouter 1 % de BSA (m/v). Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. - Tampon de dilution D Préparer le volume nécessaire avec du tampon B auquel on ajoute du Tween 20 à la concentration de 0.05 % et de la BSA à la concentration de 4 % (m/v) . Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. - Tampon de dilution E Préparer le tampon de dilution E à partir de PBS pH 7.4 auquel on ajoute 0.1 % de BSA (m/v). Conservation maximum de 2 jours à + 4° C. - Solution de NiC12 20 mM, NaC125 mM Peser 0.475 g de NiC12 qsp 100m1 d'une solution de NaC1 25 mM (conservation maximum de 3 mois à + 4° C). - Tampon substrat Tampon citrate 0.1M + H202 30%. Tampon citrate : Dissoudre dans un litre d'eau PPI 29 g de citrate de sodium et 4.1 g d'acide citrique. Ajuster si besoin le pH à 5.5. Conserver à + 4° C pendant 3 mois maximum. Ajouter extemporanément 10 pl de H202 30 % à 10 ml de tampon citrate le jour de son utilisation et conserver à l'abri de la lumière. - Solution d'arrêt. Solution d'acide sulfurique 4N (2M) a préparer ou prête à l'emploi. Préparer un litre : 100 ml H2SO4 18M + 900 ml d'eau PPI. Stocker à température ambiante pendant 6 mois maximum. MODE OPERATOIRE - Recouvrement des plaques Diluer le C3b dans le volume nécessaire à l'essai dans le tampon de recouvrement pour avoir une concentration finale à 2.5 pg/m1 (10 ml pour une plaque de 96 puits). Ex : pour le lot D28449 à 1 mg/ml, diluer 25 pl dans 10 ml de tampon de tampon de recouvrement. Distribuer 100 pl de la solution préparée dans chaque puits. Recouvrir la plaque d'un adhésif. Incuber la plaque 1 H à 1 H 15 à + 34° C puis une nuit à + 4° C. - Lavages Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280 pl de tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération. Vider par retournement. - Saturation Distribuer 300 pl de tampon de saturation par puits. Incuber 1 H à 1 H 15 à + 34° C. Vider par retournement. - Etape de la génération de la convertase. Préparer la solution suivante (10 ml pour une plaque de 96 puits) : - Solution de NiC12 20 mM, NaC1 25 mM : 750 pl (concentration finale NiC12 : 1.5 mM) - Facteur B Calbiochem (1 mg/ml) : 40 pl (concentration finale : 4 pg/m1) - Facteur D Calbiochem (0.1 mg/ml) : 30 pl (concentration finale : 0.3 pg/m1) - Tampon de dilution D : 9180 pl. Déposer 100 pl / puits et incuber 2 heures à + 34° C. - Lavages. Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 pl de 20 tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération. Vider par retournement. - Préparation des gammes de facteur H. Les gammes de facteur H sont faites à partir d'un pool plasma (ECQ 1) et d'un lot de référence ou de tout échantillon contenant du facteur H à doser. La concentration antigénique 25 Elisa ou la DO 280 sert de base à l'établissement des gammes par des dilutions successives non indépendantes. Le choix de la méthode de dosage est la suivante : - Technique en Elisa pour le Pool Plasma et les échantillons de pureté intermédiaire. - Mesure de la DO 280 pour le lot de référence, un PV ou un produit final réhydraté. - Incuber 32 à 34 minutes maximum à + 34° C. 30 - Lavages Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 pl de tampon de lavage 3.3.2 b). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération. Vider par retournement. - Incubation de l'anticorps anti-facteur B humain Pour 10 ml de tampon de dilution E, ajouter 5 pl de l'anticorps anti-facteur B humain (Calbiochem réf. 341272) puis distribuer 100 pl/puits (dilution au 1/2000). Incuber 1 Hàl H 15 à34°C - Lavages Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280 pl de tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération. Vider par retournement. - Incubation de l'anticorps anti-IgG (H+L) de chèvre marquée à la péroxydase. Les dilutions s'effectuent avec le tampon de dilution E : - prédilution au 1/40 (10 pl d'anticorps + 390 pl de tampon) - dilution au 1/500 (20 pl de la prédilution + 9980 pl de tampon). Distribuer 100 pl/puits et incuber à température ambiante pendant 25-30 mn à l'abri de la lumière. - Lavages. Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280 pl de tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette opération. Vider par retournement. - Réaction enzymatique. Distribuer 100 pl de TMB par puits avec une pipette multicanaux, à intervalle régulier. Incuber la plaque 5 à 15 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. - Arrêt de la réaction. Distribuer 100 pl de la solution d'arrêt dans chaque puits, à intervalle régulier. - Lecture. Lire extemporanément la plaque à 450 nm sur un lecteur de microplaque après une légère agitation. EXPLOITATION DES RESULTATS. - Elimination des points aberrants. Les valeurs d'absorbance obtenues en double pour chaque concentration de la gamme de facteur H pour la substance de référence, l'ECQ ou pour tout autre échantillon sont moyennées après élimination des valeurs aberrantes. Par exemple, pour les valeurs en duplicate des échantillons, de la substance de référence ou de l'ECQ, on accepte l'élimination d'un point par gamme et par niveau de concentration. Le choix du ou des points à éliminer permet d'améliorer la valeur du coefficient de corrélation (R2) et la précision de l'intervalle de confiance à 95 % de l'EC 50 obtenu. - Utilisation du logiciel Prism (Logi Labo). Ce logiciel permet de déterminer la valeur de l'EC50 de chaque échantillon dans un système modélisé non linéaire (sigmoïde à pente variable). L'équation de calcul de ce modèle est la suivante : Y : Bottom + ( Top -Bottom)/(1+10^((Log EC50-X)* Hillslope) X est le logarithme de la concentration (µg/m1). Y est la réponse (D.0). Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme sigmoïdale. Hillslope est la pente. La valeur moyenne d'absorbance de chaque dilution obtenue pour l'ECQ ou échantillon (gamme en double) est entrée dans la base de données pour chaque concentration 15 correspondante. L'analyse des données est agrémentée de la fonction « Runs test » qui permet d'estimer la déviation de l'essai par rapport au modèle choisi. L'écart-type de l'EC50 est donné pour un intervalle de confiance de 95 %. L'étude des courbes permet de visualiser l'ensemble des échantillons entre eux et de 20 les comparer à l'ECQ. - Critères d'acceptation du dosage. Le AD.O de la gamme de tous les échantillons (référence et ECQ compris) doit être au minimum de 0.35. Toute valeur inférieure entraîne automatiquement le rejet de l'essai. L'acceptation de cette condition permet ensuite de déterminer la valeur respective de 25 leur EC50. La valeur moyenne de l'EC50 du pool plasma est de 0.0581.1g/uni. Le dosage est valide avec une tolérance de deux écart-type ce qui donne une valeur moyenne de 0.058 ± 0.0301.1g/uni. Tout nouvel ECQ doit être testé en parallèle de l'ancien sur au moins dix dosages afin d'en déterminer ses caractéristiques. 30 La moyenne des EC 50 de la substance de référence et l'intervalle de confiance sont déterminés après la validation. La valeur du coefficient de corrélation doit être au minimum de 0.99 pour chaque échantillon. Exemple 2: Construction de vecteur comprenant pCDNA2001néo-MD1 Le vecteur pCDNA200lnéo-MD1 comporte l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8, qui correspond à la séquence naturelle de ce facteur H humain. Le vecteur pUC57-MD1 envoyé par Genscript contient le gène de synthèse correspondant à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8 (MD1, séquence naturelle du facteur H humain). La digestion du vecteur pUC57-MD1 par les enzymes de restriction NotI et BamHI produit 2 fragments de 3000pb et 3700pb. Ces deux fragments sont séparés par purification sur gel et extraction nucléospin. Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restriction NotI et BamHI, 10 qui produit 2 fragments de 25pb et de 5533pb. Après extraction par nucléospin et déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8 (MD1) est inséré dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré. Après ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries TOP10. L'insertion du fragment d'ADN correspondant à MD1 est vérifiée par PCR de 15 Screening, en utilisant les amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5'- CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3') et MD1-lrev (SEQ ID NO : 11 5'- GGTAAACACTTCACAACTTCACATATAG-3'), qui donne une bande de 758pb. Les clones bactériens positifs en PCR de criblage sont ensuite séquencés pour vérifier l'unité de transcription du facteur H contenue au sein du vecteur d'expression. 20 Exemple 3: Construction des vecteurs pCDNA2001néo-MD2 et pCDNA2001néoMD3 comprenant les séquences d'acides nucléiques du facteur H optimisé MD2 et MD3 Les vecteurs p CDNA2001néo -MD2 et p CDNA2001néo -MD3 comportent respectivement l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 et la SEQ ID NO: 25 3, qui correspondent à la séquence optimisée de facteur H humain et la séquence optimisée du facteur H humain avec le peptide signal optimisé MB7. Les vecteurs pUC57-MD2 et pUC57-MD3 envoyés par Genscript contiennent les gènes de synthèses correspondant respectivement à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 (MD2) et la SEQ ID NO: 3 (MD3). Ils sont digérés par les enzymes 30 de restrictions NotI et BamHI, ce qui génère 2 fragments d'acide nucléique de 3000 et de 3700pb. Pour chaque vecteur, ces deux fragments sont séparés par purification sur gel et extraction nucléospin. Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restrictions NotI et BamHI, ce qui génère 2 fragments de 25 et de 5533pb. Après l'extraction par nucléospin et la déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à la séquence codante MD2 ou MD3 est insérée dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré. Après la ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries TOP10. L'insertion de fragment de MD1 est vérifiée par PCR de Screening, en utilisant les 5 amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3')/MD2-lrev (SEQ ID NO : 12 5'-TGTCACACTCGCGGTAGTTG-3'), qui donne une bande de 706pb. Exemple 4: Génération de pools stables PER.C6® transfectés par pCDNA2001néo-MD1 ou pCDNA2001néo-MD2 ou pCDNA2001néo-MD3. (figure 2). 10 Les cellules PER.C6® sont transfectées par le vecteur pCDNA200lnéo-MD1 ou le vecteur pCDNA200lnéo-MD2 ou pCDNA200lnéo-MD3 pour générer des pools stables selon le protocole décrit dans la partie ci-dessus (Exemple 1.2) Il n'y pas de différence significative de viabilité entre les cellules transformées par différents vecteurs. 15 Exemple 5: Dosage par ELISA du Facteur H recombinant (variants Y402 et H402) produits dans le surnageant de culture des cellules PER.C6® et HEK 293F (figures 3, 4 et 5). Le surnageant de culture est préalablement dilué au 1/500', point à partir duquel une 20 gamme de dilution est réalisée de 1/2 en 1/2 sur 8 points. Chaque point de la gamme et des échantillons à doser sont réalisés en duplicate. Le dosage est réalisé selon le protocole décrit dans la partie ci-dessus (exemple 1.6). Exemple 6: Caractérisation par SDS-PAGE et Western blot du facteur H 25 recombinant présent dans le surnageant de culture ou purifié (variants Y402 et H402) (figures 6A, 6B et 7). A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), un volume correspondant à litg de facteur H recombinant est dilué au 1/2 dans du tampon Laemmli 2x, chauffé à 95°C pendant 5 minutes 30 puis déposé sur un gel linéaire de 10% polyacrylamide. Après migration, le gel est traité soit pour une coloration des protéines au bleu de coomassie soit pour un transfert sur membrane de nitrocellulose suivi d'un immunomarquage (Western Blot) tel que décrit dans ci-dessus (exemple 1.5). Exemple 7: Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase du facteur H recombinant (variants Y402 et H402). A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), le facteur H recombinant est dilué à une concentration finale de 20 µg/ml. A partir de ce tube une gamme est réalisée par les dilutions successives suivantes: 1/2; 1/10; 1/4; 1/4; 1/4; 1/4; 1/40. Cette gamme de concentration décroissante de facteur H est ajouté au complexe C3 convertase formé dans les puits d'une plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à +34°C. Après plusieurs lavages, le facteur B restant complexé avec la molécule C3 immobilisée au fond du puits est alors dosé par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA. Les valeurs d'absorbances obtenues en fonction de la concentration de facteur H ajoutée sont alors traitées tel qu'indiqué dans le protocole décrit ci-dessus (exemple 1.7). REVENDICATIONS1. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire dans lequel ladite lignée cellulaire est la lignée cellulaire PER.C6 ou la lignée cellulaire HEK 293F. 2. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine produisant le facteur H endogène selon la revendication 1 pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO: 1, ou un variant possédant un pourcentage d'homologie d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire. 3. Utilisation d'une lignée cellulaire selon la revendication 1 ou 2, avec un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement à 30 mg/L, plus particulièrement à 50 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle les codons de facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 sont optimisés par rapport aux codons naturels de facteur H humain. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par : la séquence SEQ ID NO : 2, (ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2. 6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend en outre un acide nucléique choisi parmi : - un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et codant le peptide signal naturel du facteur H,- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et codant le peptide signal du facteur H, - un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou - un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID NO : 4 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4. 7. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend : (i) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou (ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. 8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H comprend : (i) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, ou(ii) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2. 9. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par : (i) la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, ou (ii) la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7, ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. 10. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6, ou la séquence SEQ ID NO : 7. 11. Procédé de la préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans une lignée cellulaire humaine avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire, ledit procédé comprenant l'étape de : (i) culture de ladite lignée cellulaire transformée par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, dans lequel ladite lignée cellulaire est la lignée cellulaire PER.C6 ou la lignée cellulaire HEK 293F. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel ledit procédé comprend les étapes suivantes : (i) la transformation d'une lignée cellulaire par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée, (ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée, pour obtenir l'expression du facteur H dans le milieu de culture.. Procédé selon la revendication 11 ou 12, dans lequel ledit procédé comprend les étapes suivantes : (i) la transformation d'une lignée cellulaire, par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur de la protéine facteur H humain, pour obtenir une lignée cellulaire transformée, (ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée pour obtenir l'expression de facteur H dans le milieu de culture, (iii) la purification du facteur H humain à partir du milieu de culture, et (iv) éventuellement la séparation de la forme endogène et de la forme recombinante du facteur H purifié à l'étape (iii). 14. Procédé selon les revendications 11-13, dans lequel le vecteur comprend un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique comprenant : (i) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou (ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étht choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 4 et une séquence ayant d'au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et - un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant d'au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2. 15. Facteur H recombinant obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il possède une pureté supérieure à 90% de préférence supérieure à 95%.