Brevet FR2978149A1 — publié le 20130125

Nouveaux Agents Complexants et Complexes de Lanthanide correspondant, et leur utilisation comme marqueurs luminescents La présente invention a pour objet des agents complexants ou ligands, des complexes de lanthanides, leur utilisation pour marquer des molécules et les détecter par des techniques de fluorescence en temps résolu. Etat de la technique : Les complexes de lanthanide ont vu leur utilisation augmenter de manière très importante depuis une vingtaine d'années dans le domaine des sciences de la vie. Ces composés fluorescents présentent en effet des caractéristiques spectroscopiques intéressantes, qui en font des marqueurs de choix pour détecter des molécules biologiques. Ces composés fluorescents sont particulièrement appropriés pour être utilisés en conjonction avec des fluorophores compatibles pour effectuer des mesures de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Forster resonnance energy transfer »), dont l'application pour étudier les interactions entre biomolécules est exploitée de manière commerciale par plusieurs sociétés, dont Cisbio Bioassays et sa gamme de produits HTRF®. La durée de vie relativement longue des complexes de lanthanides permet également d'effectuer des mesures de fluorescence en temps résolu, c'est-à-dire avec un délai après excitation des fluorophores, ce qui permet de limiter les interférences de fluorescence dues au milieu de mesure. Cette dernière caractéristique est d'autant plus utile que le milieu de mesure se rapproche d'un milieu biologique, qui comprend de nombreuses protéines dont la fluorescence pourrait interférer avec celle des composés étudiés. De nombreux complexes de lanthanides ont été décrits. Latva et al par exemple, ont divulgué 41 complexes d'Eu(III) et de Tb(III), dont ils ont étudié la luminescence (Journal of Luminescence Volume 75, n° 2, Septembre 1997, Pages 149-169). Le composé 39 en particulier, est constitué d'un cycle 1,47-triazacyclononane (ci-après « TACN »), dont les atomes d'azote sont substitués par des chromophores dérivés de phényléthynylpyridine. Bien que le rendement quantique du complexe constitué de ce chromophore et d'Eu(III) soit considéré comme bon par les auteurs, ce complexe n'est pas adapté au couplage avec une biomolécule. Par ailleurs, l'utilisation de ce composé en milieu aqueux peut être problématique puisque il est très hydrophobe. Enfin, l'absorption de ce complexe est optimale à 315 nm, alors que les lampes laser souvent utilisées dans les dosages biologiques émettent à la longueur d'onde de 337 nm. D'Aléa et al ont décrit la synthèse de complexes de lanthanides constitués de trois ligands dérivés de l'acide dipicolonique (Ilibrb Chem.2008 Nov 17;47(22):10258-68). L'un de ces ligands (L1) est constitué d'une molécule d'acide dipicolinique substituée par un groupe phényléthynyl, lui-même portant un éther-oxyde de polyéthylèneglycol (ci-après « PEG ») sur le groupe phényle. D'après les auteurs, le groupe PEG confère à ce produit une bonne solubilité en milieux aqueux et dans les solvants organiques. Toutefois, ces complexes ne sont pas suffisamment stables en milieu aqueux et ne sont pas utilisables dans une réaction de bioconjuguaison. La demande internationale de brevet WO2005/058877 est relative à des complexes de lanthanides dont certains sont basés sur un cycle TACN dont trois atomes d'azote sont substitués par des chromophores constitués d'un dérivé de pyridine, notamment de phénylpyridine. Les inventeurs proposent par ailleurs d'inclure dans ces composés un groupe réactif pour pouvoir les conjuguer facilement avec des biomolécules. Il est ainsi proposé d'inclure ce groupe réactif via un bras d'espacement soit au niveau d'un carbone du cycle TACN, soit au niveau de la pyridine du chromophore. Plusieurs autres complexes de lanthanides ont été divulgués et certains sont exploités de manière commerciale : on peut citer en particulier les cryptates macropolycycliques de lanthanides (EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 , WO 2001/96877, WO2008/063721), les complexes de lanthanide comportant un motif dérivé de la coumarine lié à un motif diéthylène triamine penta acide (US 5,622,821), et ceux comprenant des dérivés de pyridine (US 4,920,195, US 4,761,481), de bipyridine (US 5,216,134), ou de terpyridine (US 4,859,777, US 5,202,423, US 5,324,825). La présente invention vise à pallier aux inconvénients des composés de l'art antérieur, et à fournir des complexes de lanthanides fluorescents présentant une meilleure brillance que les composés de l'art antérieur lorsqu'ils sont excités aux alentours de 337 nm, si possible une bonne solubilité en milieu aqueux, un spectre d'émission adapté à leur utilisation dans des expériences de FRET, ainsi qu'une bonne praticité pour le marquage de biomolécules. Description de l'invention : Les problèmes mentionnés précédemment ont été résolus grâce à des agents complexants constitués d'un macrocycle triazoté (1,4,7-triazacyclononane, ci-après 147TACN, 1,5,9-triazacyclododécane, ci-après 159TACD, 1,4,8-triazacyclodécane, ci-après 148TACD ou 1,4,8-triazacycloundécane, ci-après 148TACU) dont les atomes d'azote sont substitués par des chromophores de type phényléthynylpyridine, ces chromophores comprenant de un à trois groupes affectant la densité électronique de la molécule (ci-après groupe « 0-donneur », « S- donneur », « NHCO-donneur » ,« SCO-donneur », « NHCS-donneur », « SCS-donneur » ou alkyle inférieur) directement lié au groupe phényle, et de manière optionnelle au moins un groupement polyéthylène-glycol (PEG) qui va conférer à la molécule une bonne solubilité en milieu aqueux. Ces composés peuvent également comporter un groupe réactif permettant leur conjugaison avec une molécule à marquer. Les agents complexants selon l'invention forment des complexes stables avec les lanthanides, et peuvent être utilisés pour produire des conjugués fluorescents de molécules d'intérêt. Les complexes de lanthanides selon l'invention présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. La présence de trois chromophores augmente de façon significative le coefficient d'absorption molaire (epsilon) et par conséquent la brillance du complexe. La brillance (rendement quantique x coefficient d'absorption molaire) de ces complexes dans des milieux biologiques est également meilleure que celle des composés de l'art antérieur. AGENTS COMPLEXANTS Les agents complexants selon l'invention sont les composés de formule (1) : CHR4 Chrom1\ c ~ ~ /Chrome N N~\ a CHR3 Chroma (1) dans laquelle : - soit a=b=c=1 (1,5,9-triazacyclododécane), soit a=b=c=0 (1,4,7-triazacyclononane), soit a=1 et b=c=0 (1,4,8-triazacyclodécane), soit a=b=1 et c=0 (1,4,8-triazacycloundécane) ; - R3, R4 et R5 sont chacun choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H, -L-G ; - Chrom,, Chrome et Chroma sont des chromophores identiques ou différents de formule (II) : ^4 (R2)d 5 ,/. 3 62 N dans laquelle - d est un nombre entier allant de 1 à 3 ; - R, est choisi parmi les groupes suivants : -000H, -PO(OH)R6, R6 représentant un groupe choisi parmi : phényle, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle, les groupes phényle et méthyle étant préférés; - chaque R2 est choisi parmi les groupes suivants : - groupes alkyles linéaires ou ramifiés comprenant de 1 à 6 atomes de carbone éventuellement substitués par un groupe PEG ; - groupes 0-donneurs choisis parmi : -O-L-G ; -O-AIk; -O-PEG; le groupe de formule : PEG O PEG dans laquelle z est un nombre entier allant de 1 à 5 ; - groupes S-donneurs choisis parmi : -S-L-G ; -S-AIk; -S-PEG; le groupe de formule : dans laquelle z est un nombre entier allant de 1 à 5 ; - groupes NHCO-donneurs choisis parmi : -NHCO-L-G ; -NHCO(OAIk); - NHCO(NHAIk); -NHCO(NAIk,Alk2); -NHCO(SAIk); -NHCO(Alk); -NHCO-PEG; le groupe de formule : 15 - groupes SCO-donneurs choisis parmi : -SCO-L-G; -SCO(OAIk); -SCO(NHAIk); - SCO(NAIkiAlk2); -SCO(SAIk); -SCO(Alk) ; -SCO-PEG; - groupes NHCS-donneurs choisis parmi : -NHCS(OAIk); -NHCS(NHAIk); - NHCS(NAIkiAlk2); -NHCS(SAIk); -NHCS(Alk); -NHCS-PEG; -NHCS-L-G ; - groupes SCS-donneurs choisis parmi : -SCS(OAIk); -SCS(NHAIk); - 20 SCS(NAIkiAlk2); -SCS(SAIk); -SCS(Alk) ; -SCS-PEG; -SCS-L-G; - PEG est un groupe de formule -CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH3, y étant un nombre entier allant de 1 à 5; O 1 PEG 10 PEG O O 1 PEG PEG O O 1 PEG - Alk, AIk1 et AIk2 sont chacun un alkyle linéaire ou ramifié en C,-Cm éventuellement substitué par un groupe -O-PEG ; - L est un bras d'espacement; - G est un groupe réactif permettant la liaison du complexe ou de l'agent complexant à une molécule à marquer; étant entendu que - lorsque R2 comporte un groupe -L-G, R3= R4 = R5 = H ; - lorsque R2 ne comporte pas de groupe -L-G, soit l'un des groupes R3, R4 et R5 est un groupe -L-G, soit R3=R4=R5=H; et - lorsque plusieurs groupes R2 sont présents, au moins un est en position 4 du cycle benzénique. Une famille préférée de composés de formule (1) comprend les composés où : soit chrom,, chrome et chroma sont identiques et sont chacun substitués par un à trois groupes R2 ne comportant pas de groupe -L-G, et les groupes R3-R5 sont des atomes d'hydrogène ; soit chrom,, chrome et chroma sont identiques et sont substitués par un à trois groupes R2 ne comportant pas de groupe -L-G, et un des groupes R3-R5 est un groupe L-G, les autres étant des atomes d'hydrogène ; soit deux des groupes chrom,, chrome et chroma sont identiques et sont chacun substitués par un à trois groupes R2 ne comportant pas de groupe -L-G et le troisième chromophore est substitué par un groupe R2 comportant un groupe -L-G, les groupes R3-R5 sont des atomes d'hydrogène. Les sous-familles d'agents complexants suivants sont préférées : - composés de formule (1) caractérisés en ce que l'un des groupes R2 comporte un groupe -L-G ; - composés de formule (1) caractérisés en ce que l'un des groupes R3, R4 ou R5 comporte un groupe -L-G ; - composés de formule (1) caractérisés en ce qu'il ne comporte aucun groupe -L-G. Parmi les composés de formule (1) et ceux appartenant aux sous-familles précitées, les composés suivants sont préférés : - Ceux qui sont caractérisés en ce que a=b=c=1 (1,5,9-triazacyclododécane, 159TACD) ; - Ceux qui sont caractérisés en ce que a=b=c=0 (1,4,7-triazacyclononane, 147TACN) ; - Ceux qui sont caractérisés en ce que a=1 et b=c=0 (1,4,8-triazacyclodécane, 148TACD) ; - Ceux qui sont caractérisés en ce que a=b=1 et c=0 (1,4,8-triazacycloundécane, 148TAC U) . Parmi les composés de formule (1) et ceux appartenant aux sous-familles précitées, les composés ayant les caractéristiques suivantes sont également préférés : - Les composés caractérisés en ce que les groupes R, des chromophores chrom,, chrome et chroma sont des groupes -000H ; - Les composés caractérisés en ce que les groupes R, des chromophores chrom,, chrome et chroma sont des groupes -PO(OH)R6 ; - Les composés caractérisés en ce que le groupe R, du chromophore chrom, est un groupe -000H et les groupes R, des chromophores chrome et chroma sont des groupes -PO(OH)R6 ; - Les composés caractérisés en ce que le groupe R, du chromophore chrom, est un groupe -PO(OH)R6, et les groupes R, des chromophores chrome et chroma sont des groupes -000H. L'une des caractéristiques techniques essentielles des composés selon l'invention est la présence, sur les chromophores, de groupes R2 qui affectent la densité électronique de la molécule et contribuent aux bonnes propriétés spectroscopiques de ces composés. Ainsi, parmi les composés de formule (1) et ceux appartenant aux sous-familles précitées, les composés dont les groupes donneurs R2 sont les suivants sont préférés : - les composés caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes alkyles linéaires ou ramifiés comprenant de 1 à 6 atomes carbones éventuellement substitués par un groupe PEG ; - les composés caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes 0- donneurs choisis parmi : -O-L-G ; -O-AIk; -O-PEG; le groupe de formule : PEG - les composés caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes S-donneurs choisis parmi : -S-L-G ; -S-AIk; -S-PEG; le groupe de formule : PEG O O 1 PEG - les composés caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes NHCO-donneurs choisis parmi -NHCO-L-G ; -NHCO(OAIk); -NHCO(NHAIk); - NHCO(NAIk,Alk2); -NHCO(SAIk); -NHCO(Alk); -NHCO-PEG; le groupe de formule : PEG - les composés caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes SCO-donneurs choisis parmi : -SCO-L-G; -SCO(OAIk); -SCO(NHAIk); -SCO(NAIk,Alk2); -SCO(SAIk); - SCO(Alk) ; -SCO-PEG; - les composés caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes NHCS- donneurs choisis parmi : -NHCS(OAIk); -NHCS(NHAIk); -NHCS(NAIk,Alk2); - NHCS(SAIk); -NHCS(Alk); -NHCS-PEG; -NHCS-L-G ; - les composés caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes SCS-donneurs choisis parmi : -SCS(OAIk); -SCS(NHAIk); -SCS(NAIk,Alk2); -SCS(SAIk); -SCS(Alk) ; - SCS-PEG; -SCS-L-G. Les composés selon l'invention comportent de un à trois groupes R2 par chromophore, et de préférence comportent : - un groupe R2 en position 4 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 3 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 5 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 2 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 6 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4, un groupe R2 en position 3 et un groupe R2 en position 5 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4, un groupe R2 en position 2 et un groupe R2 en position 6 du groupe phényle. PEG O O 1 PEG PEG O O 1 PEG Lorsque plusieurs groupes R2 sont présents sur un chromophore, ils sont de préférence identiques. Enfin, les composés précédents caractérisés en ce qu'ils comportent au moins un groupe PEG sont également préférés. Le tableau 1 représente différentes familles de composés préférés selon l'invention : ces composés répondent à la formule générale (1) et certaines de leurs caractéristiques sont indiquées dans la première colonne (type de macrocycle triazoté) et la première ligne (nature des substituants R2 et R, des chromophores). Chaque signe « + » représente une famille de composés préférés. Ainsi, la case correspondant à l'intersection de la première colonne et de la première ligne désigne la famille de composés comportant un cycle 147TACN, dont les chromophores portent des groupes R2 qui sont des groupes alkyles donneurs et dont les trois groupes R, sont des groupes COOH. L'abréviation « R, : (COOH), 2(POOHR6) » signifie que un des groupes R, est un groupe COOH et les deux autres groupes R, sont des groupes POOHR6). R2 : Alkyle- R2 : Alkyle - R2 : Alkyle - R2 : Alkyle - R2 : 0-donneur R2 : 0-donneur R2 : 0-donneur R2 : 0-donneur donneur donneur donneur donneur R, : 3(0OOH) R, : 3(POOHR6) R, : (COOH) RI : 2(COOH) RI : 3(0OOH) RI : 3(POOHR6) RI : (COOH) RI : 2(0OOH) 2(POOHR6) (POOHR6) 2(POOHR6) (POOHR6) 147TACN + + + + + + + + 159TACD + + + + + + + + 148TACD + + + + + + + + 148TACU + + + + + + + + R2 : S-donneur R2 : S-donneur R2 : S-donneur R2 : S-donneur RI : 3(0OOH) RI : 3(POOHR6) RI : (COOH) RI : 2(0OOH) 2(POOHR6) (POOHR6) 147TACN + + + + 159TACD + + + + 148TACD + + + + 148TACU + + + + R2 : NHCO- R2 : NHCO- R2 : NHCO- R2 : NHCO- R2 : SCO- R2 : SCO- R2 : SCO- R2 : SCO- donneur donneur donneur donneur donneur donneur donneur donneur RI : 3(COOH) RI : 3(POOHR6) RI : (COOH) RI : 2(COOH) RI : 3(COOH) RI : 3(POOHR6) RI : (COOH) RI : 2(COOH) 2(POOHR6) (POOHR6) 2(POOHR6) (POOHR6) 147TACN + + + + + + + + 159TACD + + + + + + + + 148TACD + + + + + + + + 148TACU + + + + + + + + R2 : NHCS- R2 : NHCS- R2 : NHCS- R2 : NHCS- R2 : SCS- R2 : SCS- R2 : SCS- R2 : SCS- donneur donneur donneur donneur donneur donneur donneur donneur RI : 3(COOH) RI : 3(POOHR6) RI : (COOH) RI : 2(COOH) RI : 3(COOH) RI : 3(POOHR6) RI : (COOH) RI : 2(COOH) 2(POOHR6) (POOHR6) 2(POOHR6) (POOHR6) 147TACN + + + + + + + + 159TACD + + + + + + + + 148TACD + + + + + + + + 148TACU + + + + + + + + Tableau 1 Pour chacune des familles de composés du tableau 1, les sous-familles suivantes sont préférées : - composés caractérisés en ce que l'un des groupes R2 comporte un groupe -L-G ; - composés caractérisés en ce que l'un des groupes R6, R4 ou R5 comporte un groupe - L-G ; - composés caractérisés en ce qu'ils ne comportent aucun groupe -L-G. Par ailleurs, pour chacune des familles du tableau 1, les composés comportent de un à trois groupes R2 par chromophore, et de préférence comportent : - un groupe R2 en position 4 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 3 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 5 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 2 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4 et un groupe R2 en position 6 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4, un groupe R2 en position 3 et un groupe R2 en position 5 du groupe phényle, ou bien - un groupe R2 en position 4, un groupe R2 en position 2 et 1 groupe R2 en position 6 du groupe phényle. Les composés du tableau 1 caractérisés en ce qu'ils comportent au moins un groupe PEG sont également préférés. Enfin, lorsque les composés du tableau 1 comportent un groupe R6, celui-ci est préférentiellement un groupe méthyle ou phényle. Le groupe réactif G porté par un bras d'espacement L, permet de coupler les composés selon l'invention avec une espèce que l'on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molécule organique, un peptide ou une protéine. Les techniques de conjugaison de deux molécules organiques sont basées sur l'utilisation de groupes réactifs et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier. Ces techniques classiques sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, Second Edition 2008, p. 169-211. Typiquement, le groupe réactif est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe réactif et une molécule organique, un peptide ou une protéine portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif. De préférence, le groupement réactif G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier les groupes de formule : O l O l C II NHt(CH2) NCS ( 1 II NHt(CH2) NCO v w v w O O (Il NH)v CH2) w NH2 (Il NH (CH2) N3 v v w O O (Il NH)-(CH2) SH (II v w NH)v CH2) w S S Ar O (Il NH~(CH2) w NH-Ar O O (Il NH)-(CH2) w O-N Il O O NH)-(CH2) w =CH NCS S03- Cl N-(\ NH-v CH2) w NH~~ N N=( Cl dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. De manière préférée, le groupement réactif G est un acide carboxylique, une amine, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique. Ces groupes réactifs peuvent être directement liés à l'agent complexant par une liaison covalente ou bien via un bras d'espacement constitué de manière avantageuse par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylènes linéaires ou ramifiés en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; les groupes cycloalkylènes en C5-C8 et les groupes arylènes en C6-C14, lesdits groupes alkylènes, cycloalkylènes ou arylènes contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylènes, cycloalkylènes ou arylènes étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. En particulier, les bras d'espacement peuvent être choisis parmi les groupes divalents suivants : 1) -(CH2)n 0 0 Il II 2) -(CH2)n-NH-C-(CH2)m C 3) -(CH2)n-O-(CH2)m 0-(CH2)p 0 0 Il II 4) -(CH2)n-0-(CH2)m 0-(CH2)p-NH-C-(CH2)n C 0 I I 5) -(CH2)n-NH-C-(CH2)p O O 6) -(CH2)n-NH-C-(CH2)pN S-(CH2)r >r 030 0 7) -(CH2)n-NH-C-(CH2)pS 0 8) -(CHz)n-NH-C ~(CH2)p 0 0\ 9) -(CIZ)n-NH-C~ >(CH2)p N S-(Cl2)r O 10) -(CH2)n-NH 0 I I 11) -(CH2)n-NH-C-(CH2)p 12) -(CH2)n NH-(CH2)p O 13) I (CH2)p dans lesquels n, m, p, r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 15 De manière préférée, le groupe -LG est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, une amine, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique, et d'un bras d'espacement L constitué d'une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone. De manière encore plus préférée, le groupe -LG est une amine portée par une chaîne alkylène comprenant de 1 à 20 5 atomes de carbone. Une molécule organique, un peptide ou une protéine susceptible d'être marquée par un composé selon l'invention comprendra donc un groupe fonctionnel avec lequel réagira le groupe réactif du complexe de lanthanide ou de l'agent complexant. Par exemple, la molécule 25 organique, la protéine ou le peptide comporte un des groupes suivants : amine, amide, thiol, alcool, aldéhyde, cétone, hydrazine, hydroxylamine, amine secondaire, halogénure, époxyde, ester (carboxylate d'alkyle), acide carboxylique, des groupes comportant des doubles liaisons 10 ou une combinaison de ces groupes fonctionnels. Les groupes amines ou thiols présents naturellement sur les protéines sont souvent utilisés pour procéder au marquage de ces molécules. COMPLEXES L'invention concerne également les complexes de lanthanides constitués d'un sel de lanthanide complexé par un agent complexant tel que décrit ci-dessus, le lanthanide étant choisi parmi : Eu3+, Tb3+, Gd3+, Dy3+ Nd3+, Er3+. De préférence, le lanthanide est Tb3+ ou Eu3+ et de manière encore plus préférée Eu3+ Ces complexes sont préparés en mettant en contact les agents complexants selon l'invention et un sel de lanthanide. Ainsi la réaction entre un équivalent d'agent complexant et 1 à 5 équivalents de sel de lanthanide (europium ou terbium sous forme de chlorures ou d'acétates) dans un solvant (acétonitrile, méthanol ou autre solvant compatible avec ces sels) à reflux pendant plusieurs heures conduit au complexe correspondant. Comme indiqué précédemment, les complexes fluorescents obtenus présentent d'excellentes propriétés photophysiques, en particulier en ce qui concerne leur rendement quantique, la durée de vie de leur luminescence et leur spectre d'excitation qui est très bien adapté à une excitation laser à environ 337 nm. De plus la répartition des bandes du leurs spectres d'émission est centrée autour de 620 nm conférant ainsi aux complexes des propriétés exceptionnelles et très favorables dans une utilisation de FRET avec des accepteurs de type cyanine ou allophycocyanine (telle que la XL665 commercialisée par Cisbio Bioassays). Du fait de la grande stabilité de ces complexes dans les milieux biologiques contenant des cations divalents (Mn2+, Cal+, Mg2+...) ou de l'EDTA, leur luminescence reste excellente comparée aux complexes de l'art antérieur. CONJUGUES Les agents complexants et complexes selon l'invention comportant un groupe réactif sont particulièrement adaptés au marquage de molécules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Ainsi l'invention concerne aussi l'utilisation de complexes pour le marquage de molécules biologiques. L'invention concerne également les molécules marquées par un complexe selon l'invention. Toutes les molécules organiques ou biologiques peuvent être conjuguées avec un complexe selon l'invention si elles possèdent un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif. En particulier, les conjugués selon l'invention comportent un complexe selon l'invention et une molécule choisie parmi : un acide aminé, un peptide, une protéine, un anticorps, un sucre, une chaîne glucidique, un nucléoside, un nucléotide, un oligonucléotide, un substrat d'enzyme (en particulier un substrat d'enzyme suicide telle qu'une benzylguanine ou une benzylcytosine (substrats des enzymes commercialisées sous les dénominations Snaptag et Cliptag), un chloroalcane (substrat de l'enzyme commercialisée sous la dénomination Halotag), le coenzyme A (substrat de l'enzyme commecialisée sous le nom ACPtag ou MCPtag). SYNTHESE La préparation des agents complexants (ligands) et des complexes selon l'invention est décrite de manière schématique ci-après, et de manière plus détaillée dans la partie expérimentale. 10 triazacycloundécane (148TACU) Plusieurs procédés de synthèse des cycles 147TACN et 159TACD ont été décrits et les sels de trihydrochlorure de 147TACN et 159TACD sont disponibles commercialement. Les 15 azamacrocycles 148TACD et 148TACU peuvent être préparés en utilisant la procédure décrite par Anders et al (European Journal Inorganic Chemistry (2006) 1444-1455). Lorsque les 3 chromophores greffés sur le macrocycle ne sont pas identiques, c'est-à-dire lorsque l'un d'entre eux porte un groupe réactif -L-G pour permettre la conjugaison du produit 20 avec un composé à marquer, la synthèse des produits selon l'invention nécessite l'utilisation de macrocycles triazotés dont 1 ou 2 des amines secondaires sont protégées par des groupes protecteurs. Parker et al ont décrit la synthèse de composés TACN dont l'une des amines est protégée par un groupe benzoyle (Journal Chemical Society Perkin trans 1 (1990) 2567), cependant la déprotection de l'amine n'est pas compatible avec la synthèse des composés 25 selon l'invention. Les composés 147TACN, 159TACD, 148TACD et 148TACU monoprotégés selon l'invention possèdent une amine protégée par un groupement résistant à l'hydrogénation, par exemple par un groupe carbamate (Soc). Ces composés ne sont pas disponibles dans le commerce, les 30 éléments publiés dans la littérature ne permettent pas leur synthèse (absence de procédures expérimentales) et il est également impossible de les préparer de façon directe et avec un rendement convenable tant la formation des macrocycles di-et trisubstitués est favorisée (Kovacs et al Journal Chemical Society, Chemical Commmunication 36 (1995) 9269-9272). Au vu de ces problèmes techniques, une autre stratégie a été élaborée (SCHEMA 4). Elle s'appuie 35 sur la préférence des macrocycles triazotés (147TACN, 159TACD, 148TACD et 148TACU) pour la disubstitution en protégeant tout d'abord deux amines des macrocycles par un groupement protecteur P, orthogonal au groupement Boc ou à tout autre groupe résistant à l'hydrogénation, c'est-à-dire dont les conditions de déprotection sont différentes de celles du groupe Soc. Le choix du groupement P s'est porté sur le groupement protecteur Cbz comme le 40 propose la littérature en utilisant comme précurseur le Cbz-ON (2-benzyloxycarbonyloxyimino)- Synthèse des macrocycles 1,4,7-triazacyclononane (147TACN), 1,5,9- triazacyclododécane (TACD), 1,4,8-triazacyclodécane (1,4,8TACD) et 1,4,8- 2-phénylacétonitrile). Cependant, ce composé n'étant pas commercialisé, la synthèse a été élaborée en utilisant l'un de ses analogues, le Moz-ON ((2-(4-méthoxybenzyloxycarbonyloxy imino)-2-phénylacétonitrile) qui lui est disponible. Comme décrit avec le Cbz-ON, deux équivalents de Moz-ON ont été condensés sur le macrocycle triazoté pour donner les composés disubstitués avec des rendements convenables. La purification de ces produits s'est avérée délicate car le groupement Moz est sensible à l'acidité. Même celle de la silice est suffisante pour entraîner une dégradation des produits lors de la purification sur colonne de chromatographie. Pour éviter cette dégradation, les milieux réactionnels ont été purifiés sur colonne d'alumine neutre ce qui a permis de conduire par exemple aux composés 28a et 28b avec des rendements respectifs de 74% et 34%. Dans l'étape suivante, le groupement Boc est introduit à l'aide du N-(tertbutoxycarbonyloxy)succinimide pour donner par exemple les macrocycles triazotés trisubstitués 29a et 29b. Enfin les amines portant les groupements Moz sont déprotégées par hydrogénolyse. L'utilisation du Pd/C à 100/0 comme catalyseur n'a pas permis de déprotéger les amines lorsque le milieu réactionnel est hydrogéné pendant 48 h sous 3,45 bars de pression. En revanche, l'utilisation du catalyseur de Pearlman (Pd(OH)2/C) a permis l'obtention des macrocycles triazotés monoprotégés. Pour isoler facilement ces produits, les sels d'hydrochlorure ont été formés par addition d'une petite quantité d'acide chlorhydrique à froid, ces derniers étant recueillis par précipitation dans l'éther diéthylique. Cette méthodologie permet désormais de préparer à l'échelle de plusieurs grammes les composés (147TACN, 159TACD, 148TACD et 148TACU) monoprotégés avec un groupement Boc par exemple 30a et 30b. La méthode de synthèse des macrocycles triazotés monoprotégés selon l'invention comprend donc les étapes suivantes : (i) protection de deux des trois amines du macrocycle triazoté par un groupe protecteur Gp, sensible à l'hydrogénation ; (ii) purification des composés disubstitués sur colonne choisie parmi : une colonne d'alumine basique ; une colonne de silice ayant subi un traitement préalable avec de la triéthylamine ou de l'ammoniac; une colonne d'alumine basique ou neutre, cette dernière étant préférée ; (iii) protection de la troisième amine dudit macrocycle triazoté par un deuxième groupe protecteur Gp2 insensible à l'hydrogénation ; (iv) déprotection des amines protégées par les groupes protecteurs Gp, par hydrogénation, de préférence avec le catalyseur de Pearlman ; (v) purification des produits monoprotégés, par exemple par formation de sels de dihydrochlorure par ajout d'acide chlorhydrique à froid et précipitation dans l'éther diéthylique.40 Gp, et Gp2 sont choisis parmi les groupes protecteurs des amines, qui sont connus de l'homme du métier comme décrit dans Protecting Groups P. J. Kocienski, Corrected Edition (2000) 185-244: Carbobenzyloxy (Cbz), p-Méthoxybenzylcarbonyle (Moz) tert-Butyloxycarbonyle (Boc), 9-Fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), Acétyle (Ac), Benzoyle (Bz), Benzyle (Bn), p- Méthoxybenzyle (PMB), 3,4-Diméthoxybenzyle (DMPM), p-méthoxyphenyle (PMP), Tosyl (Ts), Nosyl (Ns), trifluoroacetamides, alkoxycarbonyles, allyloxycarbonyle (Aloc), 2- (triméthylsilyl)éthoxycarbonyle, 2,2,2-trichloroéthoxycarbonyle (Troc), 2-(triméthylsilyl)éthoxycarbonyle (Teoc), B-(triméthylsilyl)éthanesulfonyl (SES), benzhydryl, trityl, 9-phénylfluorényl et N-silyl imines. Gp, est préférentiellement un groupe Cbz ou Moz. En ce qui concerne Gp2, les groupes Fmoc, Tosyl, Nosyl, Boc(triméthylsilyloxy) sont préférés, le groupe Boc étant encore plus préféré. Le composé obtenu est un composé de formule suivante : "Ic /NH HN1 a dans laquelle a=b=c=0 ou a=b=c=1. Le composé dans lequel Gp2 est le groupe Boc est préféré. 20 La préparation des agents complexants de formule (1) dans laquelle R3, R4 ou R5 est un groupe -L-G nécessite l'utilisation de macrocycles particuliers dont le carbone 2 ou 3 est substitué par le groupe -L-G, ou par un précurseur de ce groupe, notamment un précurseur dans lequel le groupe réactif est sous forme protégée. La synthèse de certains de ces azamacrocycles est 25 décrite notamment dans la demande internationale de brevet WO 2005/058877, ainsi que par Hovinen et a1 (Tetrahedron Letters 46 (2005) 4387-4389). La méthodologie développée dans ces deux références est basée sur la condensation entre un dérivé trinosylé et un diol en utilisant une réaction de Mitsunobu. Cette méthode présente cependant l'inconvénient de générer beaucoup de sous-produits pas toujours facile à séparer du milieu réactionnel mais 30 surtout ne permet pas la synthèse d'azamacrocycles de type 147TACN fonctionnalisé comme décrit dans l'article de Honiven. Une autre stratégie dans des conditions moins douces a été publiée par le groupe de Wu et a1 (Synthetic Communications, 34 (2004) 845-851, Synthetic Communications 25 (1995) 1427-1437, Chinese Journal of Chemistry, 16 (1998) 538-541) permettant d'obtenir les azamacrocycles en condensant un dérivé tritosylé sur le diol 35 correspondant avec des rendements voisins de 50°/O. Un inconvénient majeur de cette 15 deuxième méthodologie réside en la déprotection des groupements tosyles qui est en général réalisée dans des conditions très dures (100°C, acide bromhydrique, dans l'acide acétique 330/0, ou bien à 100°C dans l'acide sulfurique concentré 96%). Les agents complexants dont le groupe -LG est lié au macrocycle ont donc ici été préparés selon une stratégie basée sur la condensation d'un dérivé trinosylé avec un dérivé dibromé en utilisant le carbonate de césium comme base dans de l'acétonitrile. Les conditions expérimentales utilisées sont proches de celles décrites par Fukuyama et al (Tetrahedron, 58 (2002) 6267-6276) et sont décrites dans le SCHEMA 4 et la partie expérimentale. Synthèse des chromophores Les chromophores peuvent être fabriqués selon une approche telle que présentée dans le schéma A, et dans laquelle les groupes R, et R2 seront éventuellement protégés, selon leur nature, en particulier s'ils sont des groupes carboxylates, phosphates ou des groupes réactifs. (R2) (/_ - OH OH GL X = Br, 1 GL = Groupement libérable Schéma A Cette approche a été employée pour la synthèse de chromophores similaires à ceux utilisables 20 pour la préparation des agents complexants selon l'invention, comme par exemple par : - Picot et al (Inorganic Chemistry 46 (2007), 2659-2665 : chromophore phényléthynylpyridine, groupe hexyloxy sur le groupement phényle ; - Picot et a1. (Journal of American Chemical Society 130 (2008) 1532-1533) : chromophore phényléthynylpyridine portant un groupe tris(triéthylèneglycol)phényl assurant la solubilité des 25 composés ; et - D'Aléa et a1 ( Sensitization of Eu(111) luminescence by donor-phenylethynyl-functionalized DTPA and DO3A macrocycles, C.R. Chimie 2010) : phényléthynylpyridine portant un groupe OPeg). La préparation des réactifs nécessaires à cette synthèse relève des connaissances générales de l'homme du métier, lorsque ces réactifs ne sont pas disponibles dans le commerce. La synthèse des alcynes substitués est décrite dans les SCHEMA 1 et 13, ainsi que dans la partie expérimentale. La synthèse des chromophores « carboxylates » est décrite dans le SCHEMA 2 et dans la partie expérimentale. La synthèse des chromophores « phosphinates » est décrite dans le SCHEMA 3 et dans la partie expérimentale. Greffage des chromophores sur le macrocycle La synthèse des agents complexants de formule (1) ne comportant pas de groupe réactif -L-G peut être réalisée par alkylation d'un macrocycle triazoté avec un dérivé du chromophore souhaité (Schéma B) comportant un groupement libérable, tel qu'un groupe mésylate (-OMs), triflate (-OTf), Tosylate (-OTs), ou encore un atome de chlore, brome ou iode. 11 peut être nécessaire de protéger les groupes R, susceptibles de réagir lors de l'alkylation, de poser des problèmes de solubilité ou bien encore de polarité. Par exemple lorsque R, est un groupe carboxylate ou phosphinate, des dérivés estérifiés correspondants peuvent être utilisés. ( r NH HN,(, ) a H b GL = Groupe libérable Schéma B Cette synthèse est décrite de manière plus détaillée dans le SCHEMA 5 et la partie expérimentale. GL Alkylation La même approche est utilisée lorsque le groupe -L-G est directement lié au macrocycle, par exemple pour les agents complexants de formule (1) dans lesquels l'un des groupes R3, R4 ou R5 est un groupe -L-G. La préparation de complexes dont l'un des chromophores comprend un groupe réactif -L-G peut être réalisée de la même façon, par alkylation d'un macrocycle triazoté comportant une fonction amine protégée, préparé par exemple selon un procédé tel que celui décrit plus haut. Une fois les deux chromophores greffés sur le macrocycle, le troisième chromophore portant le groupe -L-G (compris dans le groupe R2,) pourra être à son tour greffé après déprotection de l'amine protégée (schéma C). GP = Groupe protecteur GL = Groupe libérable GL Alkylation GP GP (R'2 est tel que défini pour R2 ci-dessus). Schéma C Cette synthèse est décrite de manière plus détaillée dans les SCHEMAS 6, 7, 8, 9 et la partie expérimentale. Une stratégie inverse peut être envisagée dans laquelle on introduit d'abord sur un azamacrocycle diprotégé un chromophore comprenant un groupe réactif L-G masqué en utilisant une réaction d'alkylation. Les deux groupements protecteurs du macrocycle orthogonaux au groupe protégeant la fonction réactive L-G sont éliminés et les deux autres chromophores sont ensuite introduits par simple alkylation conduisant au squelette de l'agent complexant (Schéma D). GP ( GL Alkylation GP GP = Groupe protecteur GL = Groupe libérable (R'2 est tel que défini pour R2 ci-dessus). Schéma D La synthèse des composés selon l'invention est détaillée de manière précise dans la partie expérimentale suivante. Description des Fiqures 10 La Figure 1 représente la luminescence des composés de l'invention en présence de cations divalents ou d'EDTA. La Figure 2 représente le spectre d'excitation des composés de l'invention dans du tampon HEPES. 15 Abréviations utilisées : Ms : Mésyl Boc : tert-Butyloxycarbonyle Peg : polyéthylène glycol NHS : N-hydroxysuccinimide 20 RMN : résonance magnétique nucléaire CCM : chromatographie en couche mince DMF : diméthylformamide THF : tétrahydrofurane DCM : dichlorométhane 25 HPLC : chromatographie liquide à haute performance HRMS : spectroscopie de masse à haute résolution TEA: triéthylamine5 DIPEA: diisopropyléthylamine NBS: N-bromosuccinimide NIS : N-iodosuccinimide TsCI : chlorure de tosyle McCN : acétonitrile McOH : méthanol SM : spectrométrie de masse ESI : ionisation par électronébulisation m-CPBA : acide métachloroperbenzoïque EtOH : éthanol Moz-ON : ((2-(4-méthoxybenzyloxycarbonyloxy imino)-2-phénylacétonitrile) Boc-OSu: N-(tert-butoxycarbonyloxy)succinimide TFA : trifluoro acetic acid Ph: phényl TMS = triméthylsilyl TSTU: tétrCfluoroborate de O-(N-Succinim dy)-1,1,3,3-tétramét yluroniurn DCC: dicyclohexylurée PtF: point de fusion â: déplacement chimique ppm : partie par million Hz : Hertz min : minute h : heure cAMP : adénosyl monophosphate cyclique Mops : 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid HTRF: Fluorescence Homogène en Temps Résolu SCHEMA 1 : SYNTHESE DES ALCYNES SUBSTITUES TsCI, NaOH, THF, H2O ~OOOOTs 1 2 HBr. H2NBr Boc20, Et3N, DCM BocHN~\Br 3 4 OH OR OH 2: CH3(OCH2CH2)30Ts K2CO3, DMF I4: Br(CH2)3NHBoc Cs2CO3, Nal, McCN 6a, R= -(CH2CH2O)3CH3 6b, R= -(CH2)3NHBoc = SiMe3 Pd(PPh3)Cl2, Cul Et3N, THF OR OR K2CO3, McOH 5 H 8a, R= -(CH2CH2O)3CH3 8b, R= -(CH2)3NHBoc SiMe3 7a, R= -(CH2CH2O)3CH3 713, R= -(CH2)3NHBoc 5 La stratégie générale pour synthétiser les chromophores implique un couplage de Sonogashira qui a largement était décrit dans la littérature (Sonogashira et al Tetrahedron Letters, 50 (1975) 4467-4470, Rossi et al Organic Preparation and Procedure International 27 (1995) 129-160. Cette réaction permet de coupler un alcyne vrai avec un halogénure aromatique (de préférence un dérivé iodé ou bromé). Les alcynes vrais (8a et 8b) ne sont pas disponibles commercialement. Ils ont été préparés selon la synthèse décrite dans le schéma 1 et détaillés dans la partie expérimentale. Ainsi le dérivé polyéthylène glycol 1 a été activé sous forme de composé tosylé. La protection par un groupement protecteur Boc de l'amine 3 a été nécessaire pour éviter la polyalkylation. Les deux alkylations de l'iodophénol ont conduits aux deux éthers phénoliques 6a et 6b avec des rendements convenables de 51 et 750/0 respectivement. Les couplages de Sonogashira en utilisant le triméthylsilylacétylène suivis de la déprotection du groupement TMS aux deux alcynes vrais souhaités 8a et 8b. SCHEMA 2 : SYNTHESE DES CHROMOPHORES « CARBOXYLATES » 1) Niai, McCN ultrasons 2) AcCI, ultrasons H02C^ N ^CO2H 9 Me02C^ N^CO2Me 10 I McO2C~N~CO2Me 11 OH Cl 1) SOC12, DMF 2) McOH NaBH4 McOH/DCM MsCI, THF Et3 N Alcyne 8a ou 8b Pd(PPh3)4 / Cul Et3N ,THF I HOC I N^CO2Me 12 OR CO2Me CO2Me Ms0 OR HO 14a, R= -(CH2CH2O)3CH3 14b, R= -(CH2)3NHBoc 13a, R= -(CH2CH2O)3CH3 13b, R= -(CH2)3NHBoc La synthèse des chromophores « carboxylates » est décrite dans le schéma 2. L'acide chélidamique 9 est converti en diester chloré 10 comme il a été décrit par Maury et al (Inorganic Chemistry 50 (2011) 4987-4999). L'échange chlore-iode est réalisé en présence d'iodure de sodium sous ultrasons permettant de conduire au composé 11. L'étape clé de cette synthèse consiste à réduire sélectivement le diester 11 en présence de borohydrure de sodium à 0°C pour obtenir le monoalcool monoester avec un rendement de 60%. Finalement le squelette du chromophore est obtenu en utilisant une deuxième réaction de Sonogashira conduisant ainsi aux composés 13a et 13b. Enfin l'activation des alcools a été réalisée via une réaction de mésylation. SCHEMA 3 : SYNTHESE DES CHROMOPHORES « PHOSPHINATES » m-CPBA CHCI3 ~2 ~~N^Br H2SO4 H NO3 PBr3 CHCI3 15 16 i ~O ~N MçOEt 19b Pd(PPh3)4, Et3N EtOH, PhMe micro-ondes Opu, H'ÔEPh 17 NBS, CCI4 18 OEt P-Ph o OR Br ~N^ ,OEt P~Ph O Br m-CPBA \ CHCI3 ~N+^ ,OEt P~Ph O- O 22a 21 Br Alcyne 8a ou 8b ou 4-ethynylanisol \ Pd(PPh3)4 / Cul OEt Et3N ,THF AcO~~NEAcO F1-Ph O 23O 1NO2 Br /\\ ~N^ ,OEt P~Ph O O 20 19a OR Br CH(OEt)3 ~N^ OH P~Ph HO EtOH EtONa OEt P-Ph 011 24a, R= -(CH2CH2O)3CH3 2413, R= -(CH2)3NHBoc 24c, R= Me 25a, R= -(CH2CH2O)3CH3 2513, R= -(CH2)3NHBoc 25c, R= Me 26d, R= -(CH2CH2O)3CH3 26e, R= -(CH2)3NHBoc MsO OEt P -Ph Ô OR PBr3, DCM OR 26a, R= -(CH2CH2O)3CH3 26b, R= -(CH2)3NHBoc 26c, R= Me OEt P -Ph 0 La préparation des chromophores « phosphinates » est décrite dans le schéma 3. L'objectif de la synthèse consiste à disposer d'un dérivé de la pyridine trisubstitué orthogonalement. Ainsi la 2-bromo-6-méthylpyridine disponible commercialement est oxydé en analogue N-oxyde 16 simplement par oxydation en présence d'acide métachloroperbenzoïque (m-CPBA). L'activation de cet hétérocycle azoté permet d'introduire facilement le groupement nitro en position 4, correspondant au troisième groupement fonctionnel. Le N-oxyde est alors supprimé en utilisant le tribromure de phosphore conduisant au dérivé pyridinyle libre. L'introduction du groupement phosphinate a été réalisée en utilisant un couplage au palladium en présence d'acide phényl phosphinique commercial. La mise au point de ce couplage s'est avérée particulièrement difficile et finalement a permis d'obtenir le composé souhaité 19a en utilisant les micro-ondes comme source d'énergie. Lorsque le groupement phosphinate comporte un méthyle, le groupement phosphinate est introduit en utilisant des sels de nickel conduisant ainsi au composé 19b. La suite de la description de la synthèse a été réalisée par exemple sur la série des phosphinates phényle mais les résultats sont extrapolables aux phosphinates méthyle. La substitution du groupement nitro par un atome de brome a été réalisée en présence de bromure d'acétyle. Bien que ce réactif soit efficace dans cette réaction, il engendre la formation d'acide bromhydrique qui hydrolyse le groupement phosphinate. Celui-ci est réintroduit immédiatement après en utilisant l'orthoformiate d'éthyle. La fonctionnalisation du méthyle en position 6 de la pyridine est réalisée en utilisant un réarrangement décrit par Ginsburg et al (Journal American Chemical Society 79 (1957) 481-485). La pyridine est oxydée une seconde fois en utilisant les mêmes conditions décrites précédemment. Cette fonction N-oxyde est suffisamment nucléophile pour réagir avec l'anhydride acétique qui subit intermédiairement un réarrangement permettant ainsi d'introduire un groupement acétate en position 6 conduisant à l'intermédiaire clé de la synthèse 23. Le squelette du chromophore phosphinate est élaboré en utilisant la réaction de Sonogashira en présence des alcynes vrais décrits précédemment. L'ester (acétate) est hydrolysé en alcool correspondant qui est converti en dérivé bromé conduisant aux chromophores activés phosphinate 26a-c. Alternativement il est également possible de préparer les dérivés mésylés correspondants comme décrit précédemment pour les chromophores « carboxylates » conduisant ainsi aux dérivés 26d-e.30 SCHEMA 4 : SYNTHESE DES MACROCYCLES MONOBoc ET AZAMACROCYCLES DISSYMETRIQUES hn ~NH HN~ n( )N~X)n 27a, n = 0 27b,n=1 Dioxane Moz, H2O, E13N ~N N Moz Moz-ON n)n 28a, n = 0 28b,n=1 Boc-OSu CH2Cl2 n 1) H2, Pd(OH)2/C ~NH HNk McOH nn 1 N () n Boc 30a, n = 0 30b,n=1 Moz, 2) HCI, EtOH ~N N /IMoz n~ 1 N~X~ n Boc 29a, n = 0 29b,n=1 PhSH, K2CO3 ,N N~ NNs NHNs + n 'Vrri HX NHNs Cs2003, McCN Bu4N+I_ ~N N~ *N Ns Nss 1--1 Ns 31 32 33 34 X= H, OH n=0, 1 En ce qui concerne les azamacrocycles (série 34) dissymétriques portant ou non un groupe fonctionnel X, ils ont été préparés par condensation du dérivé dihalogéné (bromé de préférence) avec un composé dinosylé 31 en utilisant le carbonate de césium comme base. La déprotection des groupements nosyles est effectuée classiquement en présence de thiophénol et de carbonate de potassium. Cette séquence réactionnelle permet d'obtenir par exemple toute les déclinaisons des azamacrocycles (147TACN, 159TACD, 148TACD et 148TACU).15 SCHEMA 5 : SYNTHESE DES COMPLEXES DE LANTHANIDES NON FONCTIONNALISES DE TYPE « PHOSPHINATE » R \ O Br~~N^P OEt Ph K2CO3, McCN ~NH HN~ n(N) n 27a, n = 0 27b,n=1 35a, n = 0 35b,n=1 R= MeO-( NaOH Eu(OAc)3 N O=P OH ~P~O Ph nn/N~X) n Phi OH HO \ Ph -P O 37a, n = 0 3713, n = 1 36a, n = 0 36b, n = 1 Un premier exemple de complexe phosphinate non fonctionnalisé est décrit dans le schéma 5. L'azamacrocycle est condensé sur le chromophore bromé phosphinate en présence de carbonate de potassium. Les esters de phosphinate sont hydrolysés avec de l'hydroxyde de potassium ou de lithium conduisant aux ligands qui sont ensuite utilisés pour former les complexes d'europium 37a-b. SCHEMA 6 : SYNTHESE DES COMPLEXES DE LANTHANIDES FONCTIONNALISES DE TYPE « CARBOXYLATE » N COzMe NH HN~ 14a-b Me02C >- n KZCO3 McCN 30a, n = 0 30b, n = 1 hn Ms0 n(LN Boc Boc 39a, n = 0 39b, n = 1 38a, n = 0 38b, n = 1 fV, N> N~ n(I N i) n CO2H EuC13 McOH Ms0 COzMe 1) LiOH 2) TFA 42a, n = 0 42b, n = 1 41a,n=0 41b,n=1 40a, n = 0 40b, n = 1 Les complexes d'europium sont préparés selon les schémas 6 et 7. A partir des macrocycles mono-substitués 147TACN et 159TACD, deux unités « chromophores carboxylates ou phosphinate « OPEG» sont condensés conduisant aux dérivés 42a-b ou 47a-b. Le groupement protecteur Boc est déprotégé en présence d'acide trifluoroacétique suivi de l'alkylation du troisième chromophore comportant un groupement NH2 masqué, utile pour la conjugaison à une biomolécule. Les trois fonctions esters (carboxylate ou phosphinate) sont ensuite hydrolysées et le groupement Boc est éliminé en milieu acide. La formation du complexe de lanthanide est réalisée en faisant réagir les ligands 41 et 46 avec les sels de lanthanides correspondants et en l'occurrence le chlorure ou l'acétate d'europium.15 SCHEMA 7 : SYNTHESE DES COMPLEXES DE LANTHANIDES FONCTIONNALISES TYPE « PHOSPHINATE » n gr~ O N P,-OEt p NH HN Ph EtO--P n KZCO3 McCN Ph Boc 30a, n = 0 30b, n = 1 Boc 44a, n = 0 44b, n = 1 43a, n = 0 43b, n = 1 ~O P, O Et Ph 1) LiOH 2) TFA 47a, n = 0 47b, n = 1 46a, n = 0 46b, n = 1 45a, n = 0 45b, n = 15 SCHEMA 8 : SYNTHESE DES COMPLEXES DE LANTHANIDES FONCTIONNALISES HYBRIDE DE TYPE « BI- PHOSPHINATE MONO-CARBOXYLATE » R2 MsO~I N^CO2Me 48a, n = 0 48b, n = 1 44a, n = 0 44b, n = 1 BocHN~ , R= H2N0 / \ - R'= 50a, n = 0 50b,n=1 49a, n = 0 49b,n=15 SCHEMA 9 : SYNTHESE DES COMPLEXES DE LANTHANIDES FONCTIONNALISES HYBRIDE DE TYPE « BI- CARBOXYLATE MONO-PHOSPHINATE » R' MsO~INPh Et6 Me02C 39a, n = 0 3913, n = 1 R R'= BocHN~~O _ H2N~~~0 _ 51a,n=0 51b,n=1 O 52a, n = 0 53a, n = 0 5313, n = 1 52b,n=1 La méthodologie pour préparer les complexes hybrides est décrite sur les deux schémas 9 et 10. Elle consiste à utiliser des synthons préparés précédemment dans le cadre de la synthèse des complexes phosphinates ou carboxylates. 10 A partir des dérivés dialkylés (dicarboxylate -OPEG ou diphosphinate -OPEG) sont condensés les dérivés mésylés phosphinates (pour les dicarboxylates) ou bien les dérivés mésylés carboxylates (pour les diphosphinates). Ces réactions conduisent aux ligands hybrides qui sont ensuite hydrolysés et complexés avec la terre rare et en particulier avec l'europium en utilisant le chlorure ou l'acétate d'europium. 15 SCHEMA 10 : FONCTIONNALISATION DES COMPLEXES DE LANTHANIDES POUR UNE REACTION DE BIOCONJUGAISON 54a, n = 0, Xi = X2 = CO 54b,n=1, Xi =X2=CO 55a, n = 0, Xi = X2 = P(0)Ph 55b, n = 1, Xi = X2 = P(0)Ph 56a, n = 0, Xi = P(0)Ph, X2 = CO 56b, n = 1, Xi = P(0)Ph, X2 = CO 57a, n = 0, Xi = CO, X2 = P(0)Ph 57b, n = 1, Xi =CO, X2 = P(0)Ph O O H N O 58a, n = 0, Xi = X2 = CO 58b,n=1,Xi=X2=CO 59a, n = 0, Xi = X2 = P(0)Ph 59b, n = 1, Xi = X2 = P(0)Ph 60a, n = 0, Xi = P(0)Ph, X2 = CO 60b, n = 1, Xi = P(0)Ph, X2 = CO 61a, n = 0, Xi = CO, X2 = P(0)Ph 61b, n = 1, Xi =CO, X2 = P(0)Ph NH2 42a,n=0, Xi =X2=CO 42b, n=1, Xi =X2=CO 47a, n = 0, Xi = X2 = P(0)Ph 47b, n = 1, Xi = X2 = P(0)Ph 50a, n = 0, Xi = P(0)Ph, X2 = CO 50b, n = 1, Xi = P(0)Ph, X2 = CO 53a, n = 0, Xi = CO, X2 = P(0)Ph 53b, n = 1, Xi =CO, X2 = P(0)Ph 2) TSTU R= Le complexe fonctionnalisé NH2 n'est pas utilisable en l'état pour être bioconjugué à une biomolécule : protéines, anticorps, peptides, sucres... Pour réaliser ces bioconjugaisons, il est nécessaire de convertir ce groupement NH2 en un groupe fonctionnel biocompatible. Ci-dessous est décrite la méthodologie : Pour les complexes maléimides, ils sont directement préparés en utilisant un réactif commercial bifonctionnel : le N-[[3-maléimidopropyloxy] succinimidyle, ce qui conduit à la fonctionnalisation souhaitée. En ce qui concerne l'obtention des complexes fonctionnalisés sous forme d'ester de 5 NHS, il est nécessaire de convertir préalablement la fonction amine en dérivé d'acide carboxylique (condensation de l'anhydride glutarique sur le groupement amino), puis d'activer cette fonction sous forme d'ester de NHS en utilisant soit du TSTU, soit les conditions classiques DCC, NHS. SCHEMA 11 : COUPLAGE DES COMPLEXES DE LANTHANIDES SUR UN DERIVE DE LA BENZYLGUANINE ~O ~O HN" v v ~O.N 42a, n = 0, XI = X2 = CO 4213, n = 1, XI = X2 = CO 47a, n = 0, XI = X2 = P(0)Ph 4713, n = 1, XI = X2 = P(0)Ph 50a, n = 0, XI = P(0)Ph, X2 = CO 50b, n = 1, XI = P(0)Ph, X2 = CO 53a, n = 0, XI = CO, X2 = P(0)Ph 53b, n = 1, XI =CO, X2 = P(0)Ph 62a,n=0, XI =X2=CO 6213,n=1,XI=X2=CO 63a, n = 0, XI = X2 = P(0)Ph 6313, n = 1, XI = X2 = P(0)Ph 64a, n = 0, XI = P(0)Ph, X2 = CO 6413, n = 1, XI = P(0)Ph, X2 = CO 65a, n = 0, XI = CO, X2 = P(0)Ph 65b, n = 1, XI =CO, X2 = P(0)Ph R= 10 La condensation des complexes sur le dérivé M2BG-Glu-NHS dont la synthèse est décrite dans la demande de brevet W02010034931, conduit aux complexes conjugués qui peuvent être utilisés dans une réaction de marquage de la protéine Snap.5 SCHEMA 12 : COUPLAGE DES COMPLEXES DE LANTHANIDES SUR UN DERIVE DE L'AMP CYCLIQUE 42a, n = 0, XI = X2 = CO 66a, n = 0, XI = X2 = CO 42b, n = 1, XI = X2 = CO 66b, n = 1, XI = X2 = CO 47a, n = 0, XI = X2 = P(0)Ph 67a, n = 0, XI = X2 = P(0)Ph 47b, n = 1, XI = X2 = P(0)Ph 67b, n = 1, XI = X2 = P(0)Ph 50a, n = 0, XI = P(0)Ph, X2 = CO 68a, n = 0, XI = P(0)Ph, X2 = CO 50b, n = 1, XI = P(0)Ph, X2 = CO 68b, n = 1, XI = P(0)Ph, X2 = CO 53a, n = 0, XI = CO, X2 = P(0)Ph 69a, n = 0, XI = CO, X2 = P(0)Ph 53b, n = 1, XI =CO, X2 = P(0)Ph 69b, n = 1, XI =CO, X2 = P(0)Ph R = La condensation des complexes sur le dérivé cAMP permet d'obtenir toute une série de complexes conjugués au cAMP. Ces complexes présentent tous les mêmes propriétés photophysiques et peuvent être utilisés dans les tests HTRF développés par Cisbio Bioassays. 10 SCHEMA 13 : PREPARATION DES ALCYNES O X~ Ac2O 70a, X = NH 70b,X=S 71a, X=NH 71 b, X = S K2CO3 McOH 1 72 73 TMS 74 75 En ce qui concerne les dérivés acétylénique acétylé 71, ils ont été obtenus par simple réaction d'acétylation en présence d'anhydride acétique en utilisant le précurseur correspondant commercial. Lorsque les dérivés acétyléniques 70 ne sont pas commerciaux, ils sont préparés simplement en trois étapes : halogénation du dérivé aromatique commercial suivi d'un couplage de Sonogashira avec le triméthylsilylacétylène et enfin déprotection du groupement protecteur triméthylsilyle. SCHEMA 14 : SYNTHESE DES COMPLEXES COMPORTANT DIVERS GROUPES DONNEURS X30 X2 HOC I r\1 Pd(PPh3)Cl2, Cul Et3N, THF 71a, RI = R3 = H, R2 = NHAc X 7613, RI = R2 = OMe, R3 = H i = COzMe, POEt(0)Ph 76c, RI = R2 = R3 = OMe X2 = Br, 1 71b, R~ = R3 = H, R2 = SAc 76e, RI = R3 = H, R2 = CH2-OMe 76f, R~ = R3 =H, R2 = Me 76g, RI = R3 = H, R2 = OCH2(CH2OCH2)2CH2OMe TACN, K2CO3 McCN N X~ 77a-g, X3 = H 78a-g, X3 = Ms MsC1, Et3N THF R2 1) LiOH 2) EuCl3 O, 80a-g X4= CO, P(0)Ph, P(0)Me La méthodologie générale pour l'obtention de complexes symétriques est décrite dans le schéma 14. Cette approche permet rapidement de discriminer un certain nombre de complexes présentant les propriétés photophysiques recherchées et évite la préparation plus fastidieuse de complexes dissymétriques fonctionnalisés. PARTIE EXPERIMENTALE Informations générales Chromatographie Les chromatographies sur couches minces ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck 60 F254 sur feuille d'aluminium ou sur des plaques d'oxyde d'aluminium neutre Merck 60 F254 (type E) sur feuille d'aluminium. Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils : - HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge C18, 3.5 pm, 4.6 x 100 mm. - HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. C18, 5 pm: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm. Les chromatographies sur colonne de silice ont été réalisées sur gel de silice Merck 60 (0.040-0.063 mm). Les chromatographies sur colonne d'alumine ont été réalisées sur oxyde d'aluminium Sigma-Aldrich, neutre, activé, Brochmann I. 20 Spectroscopie a. Résonance magnétique nucléaire Les spectres RMN (1 H, 13C et 31 P) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance 400 MHz NanoBay (aimant de 9,4 Teslas), muni d'une sonde de mesure BBFO, multi noyaux 25 de diamètre de 5 mm, de gradient Z et de lock 2H. Les déplacements chimiques (b) sont exprimés en partie par million (ppm). Les abréviations suivantes sont utilisées : s : singulet, se : singulet élargi, d : doublet, t : triplet, q : quadruplet, m : multiplet, dd : doublet dédoublé, td : triplet dédoublé, qd : quadruplet dédoublé, ddd : doublet de doublet dédoublé. 30 b. Spectrométrie de masse Les spectres de masse (LC-MS) ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre Waters ZQ 2000 simple quadipôle à source multimode ESI/APCI équipé de colonne Waters XBridge C18, 3.5pm, 4.6 x 100 mm. c. Spectrométrie de masse haute résolution 35 Les analyses ont été effectuées avec un spectromètre de masse QStar Elite (Applied Biosystems SCIEX) équipé d'une source d'ionisation à pression atmosphérique (API) assistée pneumatiquement. L'échantillon a été ionisé en mode electrospray positif dans les conditions suivantes : tension electrospray (ISV) : 5500 V ; tension d'orifice (OR) : 20 V ; pression du gaz de nébulisation (air) : 20 psi. Le spectre de masse haute résolution (MS) a été obtenu avec un 15 analyseur temps de vol (TOF). La mesure de masse exacte a été effectuée en triplicat avec un double étalonnage interne. Divers Appareil à point de fusion : les points de fusion ont été réalisés en utilisant un appareil BUCHI melting point B-540. Composé (2) NaOH, TsCI THF/H20 i0~~0~i0~~~OTs 1 2 A une solution de triéthylèneglycolmonométhyléther 1 (33,2 g, 0,2 mol) dans du tétrahydrofurane (50 mL) a été ajoutée au goutte à goutte une solution d'hydroxyde de sodium (14,56 g d'hydroxyde de sodium dans 60 mL d'eau, 0,36 mol). Le milieu réactionnel a été refroidi à 0°C et une solution de chlorure de toluène-4-sulfonyle dans du tétrahydrofurane (38,5 g dans 60 mL, 0,2 mol) a été ajoutée au goutte à goutte. A la fin de l'ajout, le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été extrait avec de l'éther diéthylique (3 x 100 mL). Les phases organiques ont été regroupées, séchées sur sulfate de sodium et filtrées. Le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé 2 sous forme d'une huile légèrement jaune. Le composé était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (57,22 g, 89%). RMN 'H (200 MHz, CDC13): b: 7,77 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,31 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 4,13 (m, 2H), 3,57 (m, 10H), 3,33 (s, 3H), 2,41 (s, 3H). Composé (4) BrNH2 .HBr Boc2O BrNHBoc 3 4 A une solution d'hydrobromure de 3-bromopropylamine 3 (3,72 g, 16,9 mmol) dans du dichlorométhane (100 mL) ont été ajoutés du dicarbonate de di-tert-butyle (3,71 g, 16,9 mmol) et de la triéthylamine (10 mL). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. A ce résidu a été additionnée une solution saturée de chlorure de sodium (100 mL) et le mélange a été extrait avec de l'éther diéthylique (2 x 50 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées par une solution saturée de chlorure de sodium (3 x 50 mL) et séchées sur sulfate de sodium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé 4 sous forme d'un solide légèrement brun. Le composé était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la Et3N, CH2C12 synthèse sans purification supplémentaire (3,50 g, 870/0). RMN 1H (200 MHz, CDC13) ô: 4,63 (s, 1H), 3,42 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,26 (td, J = 6,5; 6,5 Hz, 2H), 2,03 (m, J = 6,5 Hz, 2H), 1,43 (s, 9H). HMRS (ESI) calculée pour C$H16NO2Br [M+H+], m/z255,0703, trouvée: 255,0695. Composé (6a) OH 1) K2CO3, DMF O0 c) OMe 5 A une suspension de 4-iodophénol 5 (4,0 g, 18 mmol) et de carbonate de potassium (12,4 g, 90 mmol) dans du diméthylformamide (50 mL) a été ajouté le dérivé tosylé 2 (8,7 g, 27 mmol). Le mélange réactionnel a été chauffé à reflux pendant 36 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et a été filtré sur fritté. Le filtrat a été concentré sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (cyclohexane / acétate d'éthyle 95/5 jusqu'à 50/50 par incrément de 5°/O) pour conduire au composé 6a sous forme d'une huile jaune (3,38 g, 51 °/O). RMN 1 H (200 MHz, CDC13) ô: 7,52 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 6,68 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 4,07 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,82 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,62 (m, 6H), 3,54 (m, 2H), 3,36 (s, 3H). RMN 13C (50 MHz, CDC13) b: 158,7; 138,2; 117,1; 82,9; 71,9; 70,9; 70,7; 70,6; 69,6; 67,6; 50,1. HMRS (ESI) calculée pour C13H19O41 [M+H+], m/z384,0666, trouvée: 384,0668. Composé (6b) NHBoc J 1) K2CO3, McCN OH 2) 2 1 6a 2) 4 1 5 6b A une solution de 4-iodophénol 5 (3,00 g, 13,6 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (100 mL) a été ajouté le carbonate de sodium (5,65 g, 40,9 mmol). La réaction a été chauffée à reflux pendant 1 h puis à cette suspension a été ajouté le dérivé bromé 4 (2,60 g, 10,9 mmol). Le mélange réactionnel a été chauffé à reflux pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. A ce résidu a été additionnée de l'eau (100 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 50 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de sodium et filtrées. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane) pour conduire au composé 6b sous forme d'un solide blanc (3,10 g, 75%). PtF : 79-80°C. RMN 1H (500 MHz, CDC13) b: 7,52 (d, J= 8,9 Hz, 2H), 6,64 (d, J= 8,9 Hz, 2H), 4,69 (s, 1H), 3,95 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,29 (td, J = 6,2; 6,2 Hz, 2H), 1,94 (m, J = 6,2 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H), RMN 13C (125 MHz, CDC13) b: 158,7; 155,9; 138,2; 116,9; 82,9; 65,9; 37,9. HMRS (ESI) calculée pour C14H2ONO31 [M+H+], m/z378,0561, trouvée: 378,0559. Composé (7a) () O() OMe Oi~O~~O~~OMe Et3N / THF Cul PdCl2(PPh3)2 TMS 6a 7a Une solution de composé iodé 6a (1,00 g, 2,7 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane (20 mL) et de triéthylamine (20 mL) a été dégazée sous agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du triméthylsilylacétylène (0,8 g, 8,2 mmol) suivi par du bis-chlorure bistriphénylphosphine de palladium (II) (19 mg, 0,02 mmol) et de l'iodure de cuivre (1) (10 mg, 0,054 mmol). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionnée une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 25 mL). Les phases organiques ont été réunies et lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) puis par une solution de chlorure de sodium (2 x 50 mL) et ont été enfin séchées sur sulfate de sodium. Après filtration le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur silice (dichlorométhane/acétate d'éthyle 95/5 90/10) pour conduire au composé 7a sous forme d'une huile légèrement jaune (0,64 g, 70%). RMN 1 H (200 MHz, CDC13) b: 7,36 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,82 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,11 (t, J= 5,8Hz, 2H), 3,83 (t, J= 5,1 Hz, 2H), 3,64 (m, 6H), 3,53 (m, 2H), 3,34 (s, 3H), 0,24 (s, 9H). RMN 13C (50 MHz, CDC13) b: 159,0; 133,3; 115,4; 114,4; 105,2; 92,3; 71,9; 70,8; 70,6; 70,5; 69,6; 67,4; 58,9; 0,1. HMRS (ESI) calculée pour C18H28O4Si [M+H+], m/z 337,1830, trouvée: 337,1828. 42 Composé (7b) ONHBoc ONHBoc TMS Et3N / THF Cul PdCl2(PPh3)2 613 TMS 713 Une solution de dérivé iodé 613 (2,50 g, 6,6 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane (20 mL) et de triéthylamine (20 mL) a été dégazée sous agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du triméthylsilylacétylène (1,95 g, 19,8 mmol) suivi du bis-chlorure bistriphénylphosphine de palladium (II) (46 mg, 0,06 mmol) et de l'iodure de cuivre (1) (25 mg, 0,13 mmol). La réaction a été agitée à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionnée une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 25 mL). Les phases organiques ont été réunies et lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) puis par une solution de saturée de chlorure de sodium (2 x 50 mL) et ensuite séchées sur sulfate de sodium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / pentane 1/1 puis dichlorométhane) pour conduire au composé 713 sous forme d'un solide blanc (1,50 g, 65%). PtF : 92-93°C. RMN 1H (200 MHz, CDC13) b: 7,37 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 6,78 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 4,69 (s, 1H), 3,99 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,29 (td, J = 6,2 Hz et J = 6,2 Hz, 2H), 1,95 (m, J = 6,2 Hz, 2H), 1,42 (s, 9H), 0,22 (s, 9H). RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 159,08; 156,13; 133,61; 115,54; 114,44; 105,28; 92,63; 79,41; 65,92; 38,06; 29,66; 28,54; 0,20. HMRS (ESI) calculée pour C19H29NO3Si [M+H+], m/z348,1989, trouvée: 348,1993. Composé (8a) O~~O~~O~~OMe K2CO3 McOH/THF TMS 7a 8a A une solution de dérivé silylé 7a (5,7 g, 17 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane (60 25 mL) et de méthanol (60 mL) a été ajouté du carbonate de potassium (7,0 g, 58 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été filtré et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / acétate d'éthyle 95/5 puis 90/10) pour conduire au composé 8a sous forme d'une huile jaune (3,9 g, 87%). RMN 1H (200 MHz, CDC13) b: 7,40 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,84 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 4,12 (t, J= 5,1 Hz, 2H), 3,84 (t, J= 4,5 Hz, 2H), 3,64 (m, 6H), 3,54 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 2,98 (s, 1H). RMN 13C (50 MHz, CDC13) b: 159,4; 133,7; 114,8; 114,5; 83,9; 76,5; 72,1; 71,0; 70,8; 70,7; 69,8; 67,7; 59,1. Composé (8b) ONHBoc ONHBoc K2CO3 McOH/THF TMS 7b 8b A une solution de dérivé silylé 7b (1,27 g, 3,7 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane (30 mL) et de méthanol (30 mL) a été ajouté du carbonate de potassium (1,52 g, 11,0 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été filtré et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (pentane / dichlorométhane 50/50 jusqu'à 1000/0 par incréments de 10%) pour conduire au composé 8b sous forme d'un solide blanc (0,86 g, 85%). RMN 1 H (200 MHz, CDC13) b: 7,39 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,69 (s, 1H), 3,99 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,29 (td, J = 6,2 Hz et J = 6,2 Hz, 2H), 2,97 (s, 1H), 1,95 (m, J = 6,2 Hz, 2H), 1,42 (s, 9H). Composé (10) CI ^^ McO2C N CO2Me 1) SOC12, DMF HO2C^N^CO2H 2) McOH 9 10 A une solution d'acide chélidamique 9 (17 g, 93 mmol) dans du chlorure de thionyle (95 mL) ont été additionnées quelques gouttes de diméthylformamide. Cette solution a été chauffée à 100°C pendant 48 h. Le chlorure de thionyle a été éliminé sous pression réduite. A ce résidu a été additionné du dichlorométhane (50 mL) et le mélange a été refroidi à 0°C. A ce mélange, est additionné goutte à goutte sur une période de 10 min du méthanol anhydre (40 mL) et le mélange a été laissé revenir à température ambiante pendant une nuit. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite et à ce résidu a été additionnée une solution saturée de bicarbonate de sodium (100 mL). Le mélange a été filtré et le filtrat a été extrait avec du dichlorométhane (3 x 50 mL), les phases organiques ont été regroupées, séchées sur sultate de sodium, filtrées et évaporées sous pression réduite pour donner un solide blanc identifié comme le composé 10. Le produit était suffisament pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (13,3 g, 630/0). RMN 1H (300 MHz, CDC13) ô: 8,32 (s, 2H), 4,06 (s, 6H). Composé (11) Cl McO2C^N^CO2Me McO2C^N^CO2Me 10 11 A une solution du composé 10 (6,0 g, 26,2 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (140 mL) a été additionné de l'iodure de sodium (39 g, 262 mmol) et le mélange a été ultrasonifié pendant 20 min. A ce mélange a été additionné du chlorure d'acétyle (5,55 mL, 78,6 mmol) et le mélange a été ultrasonifié pendant 5 h. A cette solution refroidie à 0°C a été additionnée une solution saturée de bicarbonate de sodium (75 mL) suivie par une addition d'eau (100 mL). Le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 50 mL), et les phases organiques ont été réunies, lavées avec une solution de thiosufalte 0,2 M, et enfin séchées sur sulfate de sodium, filtrées puis concentrées sous pression réduite. A ce résidu a été additionné du méthanol (40 mL), le mélange a été agité pendant 20 min puis a été filtré pour donner un solide blanc identifié comme le composé 11. Le produit était suffisament pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (6,9 g, 820/0). RMN 1H (300 MHz, CDC13) ô: 8,68 (s, 2 H), 4,05 (s, 6H). Composé (12) I 1 1 NaBH4, DCM 1 M e0 H HO McO2C N CO2Me CO2Me 11 12 A une solution de diester 11 (7,0 g, 21,8 mmol) dans du dichlorométhane (50 mL) refroidie à 0°C a été additionné du méthanol (35 mL) suivie de l'addition de borohydrure de sodium (540 mg, 14,2 mmol). Le mélange a été agité pendant 2 h à 0°C puis a été additionnée une solution d'acide chlorhydrique 1 M (20 mL). Le solvant a été éliminé sous pression réduite et au résidu a été additionnée une solution saturée de bicarbonate de sodium (100 mL), puis le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (4 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées 1) Nal, McCN ultrasons 2) AcCI, ultrasons sur sulfate de sodium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (cyclohexane / acétate d'éthyle 60/40 jusqu'à 0/100 par incrément de 100/0) pour donner le composé 12 comme un solide blanc (3.8 g, 600/0). RMN 1H (300 MHz, CDC13) b: 8,41 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 4,85 (s, 2H), 4,02 (s, 3H). RMN 13C (75 MHz, CDC13) b: 164,44; 161,44; 147,31; 133,34; 133,06; 106,97; 64,31; 53,29. Composé (13a) O~i0 c) OMe HO~I N^CO2Me Oi\Oc) OMe Et3N / THF Cul PdCl2(PPh3)2 + HO 1 12 8a 13a Une solution de dérivé acétylènique 8a (3,9 g, 15 mmol) et de dérivé iodé 12 (2,8 g, 9,6 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane (20 mL) et de triéthylamine (20 mL) a été dégazée sous agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du bis-chlorure bistriphénylphosphine de palladium (II) (104 mg, 0,15 mmol) et de l'iodure de cuivre (1) (56 mg, 0,29 mmol). La réaction a été agitée à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionné une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 25 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) puis par une solution de chlorure de sodium saturée (2 x 50 mL) et ensuite séchées sur sulfate de sodium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 1/1) pour conduire au produit 13a sous forme d'un solide jaune (3,2 g, 780/0). PtF : 47°C. RMN 1 H (500 MHz, CDC13) b: 8,04 (s, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,45 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,89 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,82 (s, 2H), 4,13 (m, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,84 (m, 3H), 3,71 (m, 2H), 3,64 (m, 4H), 3,52 (m, 2H), 3,35 (s, 3H), 1,89 (s, 1H). RMN 13C (50 MHz, CDC13) b: 165,4; 160,7; 160,1; 147,3; 134,1; 133,8; 125,8; 125,5; 115,1; 114,1; 95,9; 85,4; 72,1. HMRS (ESI) calculée pour C23H27NO7 [M+H+], m/z430,1860, trouvée: 430,1858. 46 Composé (13b) ONHBoc 1 HOC I N^CO2Me NHBoc Et3N / THF Cul + PdCl2(PPh3)2 HO 12 8b 13b Une solution de dérivé acétylénique 8b (0,864 g, 3,1 mmol) et de dérivé iodé 12 (0,735 g, 2,5 mmol) dans un mélange de tétrahydrofurane (20 mL) et de triéthylamine (20 mL) a été dégazée sous agitation pendant 20 min. A cette solution ont été additionnés du bis-chlorure bistriphénylphosphine de palladium (II) (22 mg, 0,031 mmol) et de l'iodure de cuivre (1) (12 mg, 0,063 mmol). La réaction a été agitée à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu a été additionnée une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) et le mélange a été extrait à l'aide de dichlorométhane (2 x 25 mL). Les phases organiques ont été réunies, lavées par une solution de chlorure d'ammonium saturée (50 mL) puis avec une solution saturée de chlorure de sodium (2 x 50 mL) et ensuite séchées sur sulfate de sodium. Après filtration le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane/méthanol 98/2) pour conduire au composé 13b sous forme d'un solide blanc (0,910 g, 82°/O). PtF : 143-144°C. RMN 1H (500 MHz, CDC13) ô: 8,04 (s, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,45 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 6,86 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 4,83 (d, J= 5,4 Hz, 2H), 4,75 (s, 1H), 4,01 (t, J= 6,1 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,31 (td, J = 6,1; 6,1 Hz, 2H), 1,96 (m, J = 6,1 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). RMN 13C (125 MHz, CDC13) b: 165,4; 160,8; 160,1; 156,2; 147,3; 134,1; 133,8; 125,8; 125,4; 114,9; 113,9; 95,9; 85,4; 66,1; 64,8; 53,2; 38,1; 29,7; 28,6. HMRS (ESI) calculée pour C24H28N2O6 [M+H+], m/z 441.2020, trouvée: 441.2021. 47 Composé (14a) OOOOMe HO CO2Me Ms0 N CO2Me MsCI Et3 N THF 13a 14a A une solution refroidie à 5°C d'alcool 13a (300 mg, 0,7 mmol) dans du tétrahydrofurane (20 mL) ont été ajoutés de la triéthylamine (212 mg, 0,21 mmol) puis du chlorure de mésyle (88 mg, 0,77 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à 0°C pendant 30 min puis à température ambiante pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau (30 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été regroupées, lavées avec de l'eau (30 mL) et séchées sur sulfate de sodium. Après filtration le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / acétate d'éthyle 8/2) pour conduire au composé 14a sous forme d'un solide légèrement jaune (330 mg, 93°/O). RMN 1H (500 MHz, CDC13) b: 8,09 (s, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,45 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 6,88 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 5,37 (s, 2H), 4,12 (m, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,83 (m, 2H), 3,69 (m, 2H), 3,62 (m, 4H), 3,51 (m, 2H), 3,33 (s, 3H), 3,13 (s, 3H), RMN 13C (50 MHz, CDC13) b: 164,9; 160,1; 154,6; 147,8; 134,6; 133,7; 126,6; 126,3; 114,9; 113,6; 96,8; 84,9; 71,9; 70,9; 70,7; 70,6; 69,6; 67,6; 59,1; 53,1; 38,1. HMRS (ESI) calculée pour C24H29NO9S [M+H+], m/z508,1636, trouvée: 508,1637. Composé (14b) ONHBoc ONHBoc HO CO2Me CO2Me MsCI Et3N THF MsO 13b 14b A une solution d'alcool 13b (21,9 mg, 50 µmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (1 mL), a été ajoutée goutte à goutte de la triéthylamine (18,1 mg, 150 µmol) sous atmosphère inerte. A ce mélange refroidi à 4°C, a été ajoutée goutte à goutte une solution de chlorure de mésyle (6 µL, 75 µmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (0,2 mL). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 20 min, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (4 mL) et cette solution a été lavée avec de l'eau (3 x 5 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à une huile de couleur jaune-verte (26,9 mg, quantitatif). Le produit 14b était suffisamment pur pour être utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. Composé (16) m-CPBA CHC13 , ~N^Br ~N+^Br 0- 16 A une solution de 2-bromo-6-méthylpyridine 15 (30 g, 174 mmol) dans du chloroforme (300 mL) 15 a été additionné à température ambiante de l'acide m-chloroperbenzoïque (62 g, 261 mmol). Le mélange a été chauffé à 65°C pendant 20 h puis a été refroidi à 0°C pendant 3 h. Après filtration du précipité, le filtrat a été concentré sous pression reduite. A ce résidu a été additionnée une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (2N, 75 mL) et cette solution a été extraite avec du dicloromethane (3 x 100 mL). Les phases organiques ont été regroupées, séchées sur sulfate de sodium, filtrées et concentrées sous pression reduite pour conduire au composé 16 sous forme d'un solide jaune utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire (15 g, 67°/O); PtF: 48-55 °C; RMN 1H (400 MHz, CDC13) ô: 7,55 (dd, J= 7,9 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 7,9 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 2,57 (s, 3H); RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 151,2; 133,5; 128,7; 125,3; 125,2; 19,3. HMRS (ESI) calculée pour C61-17NOBr [M+H+], m/z 187,9711, trouvée: 187,9698. Composé (17) H2SO4 HNO3 ~N+^Br ~ ~N+^Br 0- 0- 16 17 A une solution de composé 16 (10 g, 53 mmol) dans de l'acide sulfurique concentré (14,1 mL, 30 265 mmol) refroidie à 0°C a été additionné goutte à goutte de l'acide nitrique fumant (10,4 mL, 252 mmol). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 min puis a été chauffé NO2 à 85°C pendant 16 h. La solution a été ensuite refroidie à température ambiante et a été versée dans de la glace pilée (60 g). Après 15 min d'agitation, le précipité a été filtré et a été lavé avec de l'eau. Le solide jaune a été dissous dans du dichlorométhane et la solution a été séchée sur sulfate de sodium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire au composé 17 sous forme d'un solide jaune qui a été utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. PtF: 137-138°C. Composé (18) PBr3 CHC13 NO2 17 18 A une solution de composé N-oxyde 17 (11,7 g, 50 mmol) dans le chloroforme (300 mL), a été additionné du tribromure de phosphore (14,2 mL, 150 mmol) et le mélange a été chauffé à 60°C sous argon pendant 16 h. La solution a été refroidie à température ambiante et a été concentrée sous pression réduite puis a été versée dans une solution glacée d'hydroxyde de sodium 2M (260 mL). Le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (3 x 100 mL), les phases organiques ont été regroupées, séchées sur du sulfate de sodium et concentrées sous pression réduite. L'huile résultante a été purifiée par chromatographie sur colonne de silice en utilisant le dichlorométhane comme éluant conduisant ainsi au composé 18 sous forme d'un solide jaune (8,4 g, 78°/O). PtF 51-52°C. Composé (19a) 18 Pd(PPh3)4, Et3N EtOH, PhMe micro-ondes 19a A une solution de 2-bromo-6-méthyl-4-nitropyridine 18 (1,01 g, 4,68 mmol) dans du toluène anhydre (10 mL), ont été additionnés du phénylphosphinate d'éthyle (0,95 g, 5,60 mmol) et de la triéthylamine (2,6 mL, 19,0 mmol). Le mélange a été dégazé par trois cycles de congélation- décongélation. A cette solution a été ajouté du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (83 mg, 0,07 mmole) et le mélange a été à nouveau dégazé trois fois avant d'être agité à reflux pendant 16 h sous argon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie et a été diluée avec du dichlorométhane (20 mL). Le mélange a été lavé avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique (1M, 2 x 15 mL) suivi d'un lavage avec de l'eau (3 x 15 mL). La phase organique a été séchée sur du carbonate de potassium, filtrée et le solvant a été éliminé sous pression réduite pour obtenir un résidu sombre qui a été purifié par chromatographie sur colonne sur silice (dichlorométhane / méthanol 0,50/0) conduisant ainsi au composé 19a sous la forme d'une huile jaune (645 mg, 45 %). RMN 1 H (400 MHz, CDC13) ô: 8,55 (dd, J = 5,6 Hz, J = 1,4 Hz, 1H), 7,97 (ddd, J = 11,2 Hz, 7,7 Hz, 1,4 Hz, 2H), 7,90 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,55 (td, J = 7,7 Hz, 1,4 Hz, 1H), 7,46 (td, J =7,7 Hz, 3,5 Hz, 2H), 4,15 (qd, J = 7,0 Hz, 4,2 Hz, 2H), 2,72 (s, 3H), 1,38 (t, J = 7,0 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 163,0 (d, J = 21 Hz), 158,1 (d, J = 167 Hz), 154,0 (d, J =13 Hz), 132,9 (d, J = 3 Hz), 132,5 (d, J = 10 Hz), 129,1 (d, J = 140 Hz), 128,5 (d, J = 13 Hz), 117,6 (d, J = 24 Hz), 117,5 (d, J = 3 Hz), 62,2 (d, J = 6 Hz), 24,9, 16,4; RMN 31 P (162 MHz, CDC13) b: 23,7. HMRS (ESI) calculée pour C14H16N2O4P [M+H+], m/z307,0848, trouvée: 307,0851. Composé (20) Br ~N^ ,OH F1-Ph O 19a 20 Au dérivé nitré 19a (2,00 g, 6,54 mmol) a été ajouté du bromure d'acétyle (15 mL, 0,2 mol) et le mélange a été agité à 70 C pendant 16 h sous argon. Au cours de cette période un précipité brun pâle s'était formé. Le précipité et la solution ont été ajoutés goutte à goutte avec précaution dans du méthanol (100 mL) refroidi à 0°C. Le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé souhaité sous la forme d'un solide brun pâle qui a été utilisé directement dans la suite de la synthèse sans purification (1,81 g, 90 %) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) b: 8,33 (dd, J = 7,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,95 (ddd, J =13,2 Hz, 7,6 Hz, 1,6 Hz, 2H), 7,63 (1H, td, J = 7,6 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,55 (2H, td, J = 7,6 Hz, 3,6 Hz), 2,77 (3H, s) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD): b 159,4 (d, J= 20 Hz), 151,7 (d, J= 160 Hz), 145,1 (d, J = 10 Hz), 134,8 (d, J = 3 Hz), 133,3 (d, J = 10 Hz), 131,0 (d, J = 24 Hz), 130,6 (d, J = 3 Hz), 130,2 (d, J= 140 Hz), 129,6 (d, J= 12 Hz), 20,4 ; RMN 31P (162 MHz, CD3OD) b: 14,3. HMRS (ESI) calculée pour C12H10NO2P [M+H+], m/z309,9633, trouvée: 309,9648. 51 Composé (21) CH(OEt)3 Br 21 A l'acide phosphinique 20 (1,80 g, 5,80 mmol) a été ajouté de l'orthoformiate d'éthyle (50 mL) et le mélange a été agité à 140°C pendant 72 h sous argon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne sur silice (dichlorométhane/ méthanol 0,5 °/O) pour conduire au composé 21 sous la forme d'une huile jaune (1,08 g, 55 °/O) ; RMN 1 H (400 MHz, CDC13) ô: 8,04 (dd, J = 6,3 Hz, 1,4 Hz, 1H), 7,95 (ddd, J = 11,2 Hz, 7,0 Hz, 1,4 Hz, 2H), 7,51 (1H, td, 7,0 Hz, 1,4 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 7,0 Hz, 3,5 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 4,11 (qd, J = 7,0 Hz, 4,2 Hz, 2H), 2,52 (s, 3H), 1,34 (t, J = 7,0 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 161,2 (d, J = 22 Hz), 155,7 (d, J = 165 Hz), 133,5 (d, J = 15 Hz), 132,7 (d, J = 3 Hz), 132,6 (d, J = 10 Hz), 130,0 (d, J= 139 Hz), 128,5 (d, J= 3 Hz), 128,4 (d, J= 23 Hz), 128,3 (d, J= 13 Hz), 62,1 (d, J= 6 Hz), 24,5, 16,7 ; RMN 31P (162 MHz, CDC13) b: 25,5. HMRS (ESI) calculée pour C14H16NO2BrP [M+H+], m/z340,0102, trouvée: 340,0102. Composé (22a) Br m-C P BA CHCI3 O- O 22a A une solution de dérivé pyridinyle 21 (1,25 g, 3,68 mmol) dans du chloroforme (20 mL) a été ajouté de l'acide méta-chloroperbenzoïque (1,27 g, 7,35 mmol). La solution résultante a été agitée à 65°C pendant 16 h sous argon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite pour obtenir une huile jaune. Cette huile a été dissoute dans du dichlorométhane et a été lavée avec une solution de bicarbonate de sodium (0,5 M, 50 mL). Les phases ont été séparées et la phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (3 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, ont été séchées sur sulfate de magnésium et le solvant a été éliminé sous pression réduite. L'huile jaune résultante a été purifiée par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 2 °/O par incréments de 0,1 °/O) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 22a (1,11 g, 75 %). RMN 1H (400 MHz, CDC13) ô: 8,05 (dd, J = 7,7 Hz, 2,1 Hz, 1H), 7,98 (dd, J = 7,7 Hz, 13,3 Hz, 2H), 7,50 (t, 7,7 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,41 (td, J = 7,7 Hz, 4,2 Hz, 2H), 4,13 (qd, J = 5,6 Hz, 4,9 Hz, 2H), 2,32 (s, 3H), 1,34 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 151,0 (d, J = 4 Hz), 144,2 (d, J = 149 Hz), 133,2 (d, J = 11 Hz), 133,1 (d, J = 4 Hz), 133,0 (d, J = 11 Hz), 132,2 (d, J = 4 Hz), 129,0 (d, J = 152 Hz), 128,4 (d, J = 14 Hz), 117,4 (d, J = 12 Hz), 62,3 (d, J = 6 Hz), 17,5, 16,7 ; RMN 31 P (162 MHz, CDC13) b: +21,2. HMRS (ESI) calculée pour C14H16O3BrNP [M+H+], m/z356,0051, trouvée: 356,0061. Composé (22b) Br NBS, CC14 ^ ,OEt N^ ,OEt rN ÿ~Ph ~~Ph Br O O 21 22b A une solution de derivé méthylpyridinyle 21 (1,18 g, 3,47 mmol) dans du tétrachlorure de carbone (50 mL) ont été additionnés de la N-bromosuccinimide (0,92 g, 5,21 mmol) puis du péroxyde de benzoyle (30 mg, 1,2 mmol). Le mélange a été chauffé à reflux sous atmosphère inerte et sous irradiation en utilisant une lampe de 100 W pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par RMN 1H. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été solubilisé dans du dichlorométhane (30 mL) puis a été lavé avec une solution de carbonate de potassium (25 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (cyclohexane / acétate d'éthyle de 0°/O jusqu'à 300/0 par incrément de 2°/O) pour conduire au composé 22b sous forme d'une huile incolore (466 mg, 32 %). RMN 1 H (400 MHz, CDC13) ô: 8,16 (dd, J = 6,0 Hz, J = 1,6 Hz, 1H), 7.96 (ddd, J = 12,4 Hz, J = 6,8 Hz, J = 1,6 Hz, 2H), 7,69 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,53 (td, J = 6,8 Hz, J = 1,6 Hz, 1H), 7,44 (td, J= 6,8 Hz J= 3,6 Hz, 2H), 4,49 (s, 2H), 4,12 (qd, J= 6,8 Hz, J= 4,2 Hz, 2H), 1,36 (t, J = 6,8 Hz, 3H); RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 159,2 (J= 21 Hz), 156,1 (d, J= 163 Hz), 134,5 (J = 14 Hz), 133,0 (J = 3 Hz), 132,7 (J = 10 Hz), 130,8 (J = 23 Hz), 129,4 (J = 139 Hz), 128,7 (J = 3 Hz), 128,6 (J = 13 Hz), 62,4 (d, J = 6 Hz), 32,5, 16,7; RMN 31 P (162 MHz, CDC13) b: 24,9; HMRS (ESI) calculée pour C14H15NO2PBr2 [M+H+], m/z417,9207, trouvée: 417,9212. Br 53 Composé (23) Br AcO~ I N~ ,OEt F1-Ph O 23 Br Ac2O 22a Au dérivé pyridinyl N-Oxyde 22 a (1,8 g, 5,1 mmol) a été ajouté de l'anhydride acétique (35 mL) et la solution a été chauffée à 120°C pendant 3 h sous agitation. L'avancement de la réaction a été suivi par RMN 31 P. Après cette période, la réaction était totale. La solution a été refroidie à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol de 0 à 1 °/O par incréments de 0,1 °/O) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 23 (0,66 g, 33 °/O) ; RMN 1H (400 MHz, CDC13) ô: 8,16 (dd, J = 7,7 Hz, 2,1 Hz, 1H), 7,93 (dd, J = 7,7 Hz, 13,3 Hz, 2H), 7,55 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 7,7 Hz, 4,2 Hz, 2H), 5,18 (s, 2H), 4,09 (qd, J = 5,6 Hz, 4,9 Hz, 2H), 2,12 (s, 3H), 1,33 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 170,5, 158,6 (d, J = 4 Hz), 156,0 (d, J = 149 Hz), 134,3 (d, J = 25 Hz), 132,9 (d, J = 5 Hz), 132,7 (d, J = 10 Hz), 130,5 (d, J = 23 Hz), 129,5 (d, J = 139 Hz), 128,6 (d, J = 13 Hz), 126,6 (d, J = 3 Hz), 66,0, 62,2 (d, J = 6 Hz), 21,0, 16,7 ; RMN 31 P (162 MHz, CDC13) b: +25,0 . HMRS (ESI) calculée pour C16H18O4BrNP [M+H+], m/z398,0151, trouvée: 398,0157. Composé (24a) 23 24a Au dérivé bromé 23 (540 mg, 1,36 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (8 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution a été ajouté du dérivé acétylénique 8a (456 mg, 1,36 mmol) suivi par de la triéthylamine (4 mL) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (156 mg, 0,136 mmol) et de l'iodure de cuivre (26 mg, 0,136 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée sous argon et immédiatement après, à ce mélange a été additionné une solution de fluorure de Br OEt Pd(PPh3)4 / Cul 01 Et3N, THF Ac0 TMS Bu4NF AcO O tétrabutylammonium (1 M dans du tétrahydrofurane, 1,9 mL, 2,04 mmol). Un changement de couleur du jaune au bleu foncé était observé et le mélange a été agité à 65 °C sous argon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 3 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi et le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 1,5 °/O par incréments de 0,1 °/O) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 24a (575 mg, 73 %). RMN 1 H (400 MHz, CDC13) ô: 8,05 (dd, J = 6,0 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,96 (dd, J = 8,4 Hz, 12,4 Hz, 2H), 7,50 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,43 (2H, td, J = 8,4 Hz, 4,2 Hz, 2H), 7,42 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5,21 (s, 2H), 4,12 (qd, J = 5,6 Hz, 4,8 Hz, 2H), 4,11 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,83 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,71 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,65 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,63 (2H, t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,61 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,34 (s, 3H), 2,13 (s, 3H), 1,34 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 170,6; 160,1; 157,3 (d, J = 20 Hz); 154,7 (d, J = 165 Hz), 133,8; 133,2 (d, J =12 Hz), 132,7 (d, J = 5 Hz), 132,6 (d, J = 10 Hz), 130,1 (d, J = 139 Hz), 128,8 (d, J = 22 Hz), 128,6 (d, J = 12 Hz), 124,6 (d, J = 3 Hz), 115,1; 114,1; 96,2; 85,5 (d, J = 2 Hz), 72,2; 71,1; 70,9; 70,8; 69,8; 67,8; 66,5; 62,1 (d, J= 6 Hz), 59,3; 21,1; 16,7; RMN 31P (162 MHz, CDC13) Ô:+26,0 . HMRS (ESI) calculée pour C31H37O8NP [M+H+], m/z582,2257, trouvée: 582,2260. Composé (24b) 0N H Boc Br Ac0 Pd(PPh3)4 / Cul 0 Et3N, THF 23 ON H Boc AcO TMS Bu4NF OEt ~ Au dérivé bromé 23 (170 mg, 0,43 mmol) a été ajouté du tétrahydrofurane anhydre (3 mL) et la solution a été dégazée par trois cycles de congélation-décongélation. A cette solution ont été ajoutés du dérivé acétylénique 8b (148 mg, 0,43 mmol) et de la triéthylamine (1,5 mL) et la solution a été à nouveau dégazée. A cette solution ont été ajoutés du tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) (49 mg, 0,043 mmol) et de l'iodure de cuivre (8 mg, 0,043 mmol). Cette nouvelle solution a été à nouveau dégazée trois fois puis a été agitée sous argon et immédiatement après, à ce mélange, a été additionnée une solution de fluorure de tétrabutylammonium (1 M dans du THF, 0,6 mL, 0,64 mmol). Un changement de couleur du jaune au bleu foncé était observé et le mélange a été agité à 65 °C sous argon. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 3 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 1,5 % par incréments de 0,1 %) pour obtenir une huile jaune correspondant au composé 24b (174 mg, 69 %) ; RMN 1 H (400 MHz, CDC13) b: 8,09 (dd, J = 6,0 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,99 (dd, J = 8,4 Hz J = 12,4 Hz, 2H), 7,54 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,47 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,45 (td, J = 8,4 Hz, 4,2 Hz, 2H), 7,45 (d, J 2,0 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,24 (s, 2H), 4,75 (se, 1H), 4,14 (qd, J = 5,6 Hz; 4,8 Hz, 2H), 4,05 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,33 (m, 2H), 2,17 (s, 3H), 1,92 (q, J = 6 Hz, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,38 (t, J= 5,6 Hz, 3H); RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 170,7; 160,0; 157,3 (d, J = 20,3 Hz), 156,2; 154,6 (d, J = 167 Hz), 133,9; 133,2 (d, J = 12 Hz), 132,7 (d, J = 5 Hz), 132,6 (d, J = 10 Hz), 130,1 (d, J = 138 Hz), 129,1 (d, J = 23 Hz), 128,6 (d, J = 13 Hz), 124,6 (d, J = 3 Hz), 114,9; 114,1; 96,2; 85,5 (d, J = 2 Hz), 79,5; 66,5; 66,1; 62,1 (d, J = 6 Hz), 38,1; 29,7; 28,6; 21,1; 16,7; RMN 31P (162 MHz, CDC13) b: +26,1. HMRS (ESI) calculée pour C32H3307N2P [M+H+], m/z 593,2417 trouvée: 593,2435. Ac0 OEt I / OEt N P-Ph HO N FI-Ph O O 24a 25a A une solution du dérivé acétylé 24a (50 mg, 0,086 mmol) dans de l'éthanol absolu (2,5 mL) a été additionnée une quantité catalytique de sodium métal (-2 mg) et la solution a été chauffée sous agitation pendant 40 min sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. A ce mélange a été additionné du dichlorométhane (25 mL) et les sels de sodium ont été ensuite filtrés sur silice. La silice a été rincée avec du dichlorométhane / éthanol à 100/0 (300 mL). Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 2,4 % par incréments de 0,2 %) pour obtenir une huile incolore correspondant au composé 25a (40 mg, 87 %). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b: 8,06 (dd, J = 6,0 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,95 (dd, J = 8,4 Hz; 12,4 Hz, 2H), 7,53 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,43 (td, J = 8,4 Hz; 4,2 Hz, 2H), 7,39 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 8,8 Hz), 4,75 Composé (25a) O~iOc) C) (s, 2H), 4,14 (qd, J = 5,6 Hz 4,8 Hz, 2H), 4,11 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,86 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,73 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,66 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,63 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,37 (s, 3H), 1,37 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 160,4 (d, J = 19 Hz), 159,9; 154,0 (d, J = 165 Hz), 133,6, 133,0 (d, J = 12 Hz), 132,6 (d, J = 5 Hz), 132,3 (d, J = 10 Hz), 129,7 (d, J = 128 Hz), 128,6 (d, J = 22 Hz), 128,4 (d, J = 12 Hz), 123,8 (d, J = 3 Hz), 114,9, 113,8, 96,0, 85,3 (d, J = 2 Hz), 71,9, 70,9, 70,7, 70,6, 69,6, 67,5, 63,9, 61,8 (d, J = 6 Hz), 59,1, 16,5 ; RMN 31P (162 MHz, CDC13) b: +26,6. HMRS (ESI) calculée pour C24H29NO9S [M+H+], m/z 540,2151 trouvée: 540,2142. Composé (25b) ONHBoc ONHBoc O O O Et 1 pl-Ph i EtOH, Na OEt I pl-Ph i HO AcO 24b 25b A une solution du dérivé acétylé 24b (32 mg, 0,054 mmol) dans de l'éthanol absolu (2,5 mL) a été additionnée une quantité catalytique de sodium métal (-2 mg) et la solution a été chauffée sous agitation pendant 40 min sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. A ce mélange a été additionné du dichlorométhane (25 mL) et les sels de sodium ont été ensuite filtrés sur silice. La silice a été rincée avec du dichlorométhane / éthanol à 100/0 (300 mL). Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 2 °/O par incréments de 0,2 °/O) pour obtenir une huile incolore correspondant au composé 25b (24 mg, 80 °/O). RMN 1H (400 MHz, CDC13) ô: 8,01 (dd, J = 6,4 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 8,4 Hz, 12,4 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,39 (td, J = 8,4 Hz, 4,2 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,73 (s, 1H), 4,69 (s, 2H), 4,08 (qd, J = 5,6 Hz, 4,8 Hz, 2H), 3,97 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,26 (m, 2H), 1,92 (q, J = 6 Hz, 2H), 1,37 (s, 9H, 1,31 (t, J = 5,6 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 160,3 (d, J = 18 Hz), 159,8; 156,0; 153,2 (d, J = 164 Hz); 133,7; 133,0 (d, J = 11 Hz); 132,6 (d, J = 5 Hz); 132,3 (d, J = 10 Hz); 129,6 (d, J = 138 Hz); 128,6 (d, J = 18 Hz); 128,5 (d, J = 9 Hz); 123,8 (d, J = 3 Hz); 114,7; 113,8; 96,0; 85,3 (d, J = 2 Hz); 79,3; 65,9; 63,8; 61,9 (d, J = 6 Hz); 37,9; 29,5; 28,4; 16,6; RMN 31P (162 MHz, CDC13) b: +25,6. HMRS (ESI) calculée pour C30H36O6N2P [M+H+], m/z 551,2311 trouvée: 551,2290. Composé (26a) OEt I pl-Ph i O O OEt I pl-Ph i PBr3, DCM HO 25a 26a A une solution de l'alcool 25a (116 mg, 0,22 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (5 mL) refroidie à 0°C, a été additionné du tribromure de phosphore (30 pl, 0,33 mmol). La solution a été agitée pendant 1 h à 0 °C puis a été laissée revenir à température ambiante. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 1 h la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été immédiatement purifié par chromatographie sur colonne de silice, (dichlorométhane / méthanol, 1%) pour conduire au composé souhaité 26a sous la forme d'une huile jaune (95 mg, 73 %) ; RMN 1 H (400 MHz, CDC13) b: 8,00 (dd, J = 6,0 Hz, 1,2 Hz, 1H), 7,94 (dd, J = 8,8 Hz, 12,4 Hz, 2H), 7,51 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,40 (td, J = 8,8 Hz, 4,2 Hz, 2H), 6,85 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,48 (s, 2H), 4,09 (bd, J = 7,2 Hz, 4,8 Hz, 2H), 4,08 (t, J 4,8 Hz, 2H), 3,81 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,67 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,63 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,59 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,49 (t, J = 4,8 Hz), 3,31 (s, 3H), 1,32 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 160,1 (d, J = 19 Hz); 159,9; 154,3 (d, J = 165 Hz); 133,6; 133,3 (d, J = 12 Hz); 132,4 (d, J= 5 Hz); 132,3 (d, J= 10 Hz); 129,7 (d, J= 128 Hz); 128,6 (d, J= 22 Hz); 128,4 (d, J = 13 H); 126,7 (d, J = 3 Hz); 114,9; 113,8; 96,3; 84,9 (d, J = 2 Hz); 71,9; 70,9; 70,7; 70,6; 69,6; 67,5; 61,0 (d, J = 5 Hz); 59,1; 33,1; 16,6; RMN 31P (162 MHz, CDC13) b: +24,8 ; HMRS (ESI) calculée pour C29H34O6NPBr [M+H+], m/z 602,1302, trouvée: 602,1302. 58 Composé (2613) ONHBoc PBr3, DCM ONHBoc 26b HO A une solution d'alcool 25b (25 mg, 0,045 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (3 mL) refroidie à 0°C, a été additionné du tribromure de phosphore (30 pl, 0,33 mmol). La solution a été agitée pendant 45 min à 0 °C puis a été laissée revenir à température ambiante. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 30 min la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été immédiatement purifié par chromatographie sur colonne de silice, (dichlorométhane / méthanol 1%) pour conduire au composé souhaité 26b sous la forme d'une huile jaune (13 mg, 47 %) ; RMN 1 H (400 MHz, CDC13) b: 8,07 (dd, J = 6,0 Hz, 1,2 Hz, 1H), 8,01 (dd, J = 8,4 Hz J = 12 Hz, 2H), 7,58 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,55 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,47 (td, J = 8,4 Hz, 4,2 Hz, 2H), 7,46 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,89 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,72 (s, 1H), 4,55 (s, 2H), 4,15 (qd, J = 6,0 Hz, 4,8 Hz, 2H), 4,05 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,33 (m, 2H), 2,00 (q, J = 6 Hz, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,38 (t, J = 6,0 Hz, 3H) ; RMN 31 P (162 MHz, CDC13) b:+25,8 . HMRS (ESI) calculée pour C30H34O5N2PBr [M+H+], m/z 613,1462, trouvée: 613,1462. Composé (26d) O~iOc) C) OEt pl-Ph i O MsO O OEt 1 FI-Ph Et3N / THF HO MsCI 25a 26d A une solution d'alcool 25a (360 mg 0,66 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (4 mL) 20 refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (0,3 mL, 1,98 mmol) puis du chlorure de mésyle (77 pL, 0,99 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau saturée en chlorure de sodium (30 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à une huile jaunâtre correspondant au composé 26d (430 mg, 99%) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. Composé (26e) NHBoc Et3N / THF ONHBoc MsCI HO MsO A une solution d'alcool 25b (118 mg 0,21 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (7 mL) refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (87 pL, 0,64 mmol) puis du chlorure de mésyle (24 pL, 0,32 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau saturée en chlorure de sodium (30 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à un solide marron correspondant au composé 26e (125 mg, 95%) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. Composé (28a) H -N\ l-H 3HCI 27a 28a Me0 Me0 0,N OMe Et3N, Dioxane/H20 A une solution d'hydrochlorure de 1,4,7-triazacyclononane 27a (188 mg, 0,78 mmol) dans un 25 mélange dioxane/eau (10 mL, 8:2), a été ajouté le 2-(4-méthoxybenzyloxycarbonyloxyimino)-2- phénylacétonitrile (477 mg, 1,5 mmol). Le mélange réactionnel a été homogénéisé par une agitation vigoureuse puis a été ajoutée une solution de triéthylamine (540 pL, 3,8 mmol) dans un mélange dioxane/eau (10 mL, 8:2). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 24 h, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane. Cette solution a été lavée avec de l'eau saturée en chlorure de sodium (3 x 10 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie sur colonne d'alumine (dichlorométane / méthanol 98:2 jusqu'à 90:10 par incrément de 1°/O) pour conduire au composé souhaité 28a sous la forme d'une huile (266 mg, 74 %). RMN 1H (400 MHz, CDC13) b: 7,32-7,25 (m, 4H), 6,88-6,85 (m, 4H), 5,09 (m, 4H), 3,80 (s, 6H), 3,56-3,47 (m, 4H), 3,31-3,25 (m, 4H), 2,87 (m, 4H). RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 159,68; 156,76; 130,05; 128,92; 114,03; 67,15; 55,41 ; 52,20; 51,98; 51,26; 50,31; 50,07; 49,19; 48,18; 47,73; 47,66. Composé (28b) OMe N ^/ i H 3HCI 27b N MeO MeO Dioxane A une solution de 1,4,7-triazacyclododecane 27b (1 g, 5,84 mmol) dans du dioxane (50 mL), a été ajouté le 2-(4-méthoxybenzyloxycarbonyloxyimino)-2-phénylacétonitrile (3,62 g, 11,7 mmol). Le mélange réactionnel a été homogénéisé par une agitation vigoureuse puis a été agité à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (50 mL). Cette solution a été lavée avec de l'eau saturée en chlorure de sodium (2 x 20 mL). Les phases aqueuses ont été réunies et ont été extraites par du dichlorométhane (25 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie sur colonne d'alumine (dichlorométane / méthanol 100 : 0 jusqu'à 97:3 par incrément de 0,5°/O) pour conduire au composé souhaité 28b sous la forme d'une huile (980 mg, 34 °/O). HMRS (ESI) calculée pour C27H37N306 [M+H+], m/z 500,2761, trouvée: 500,2758.30 Composé (29a) A une solution de macrocycle diprotégé 28a (50 mg, 0,1 mmol) dans du dichlorométhane (7 mL), a été ajouté le N-(tert-butoxycarbonyloxy)succinimide (36 mg, 0,15 mmol). La solution a été agitée à température ambiante sous atmosphère inerte. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 24 h, la réaction était totale. La solution a été directement lavée avec de l'eau saturée en chlorure de sodium (3 x 10 mL). La phase organique a été séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie sur colonne d'alumine (dichlorométhane/méthanol 90:10 jusqu'à 70:30 par incrément de 50/0) pour conduire au composé souhaité 29a sous la forme d'une huile de couleur brune (44 mg, 720/0). RMN 1H (400 MHz, CDC13) ô: 7,30-7,19 (m, 4H), 6,88-6,83 (m, 4H), 5,06-4,92 (m, 4H), 3,77 (s, 6H), 3,46-3,39 (m, 12H), 1,55 (s, 9H). RMN 13C (100 MHz, CDC13) ô: 159,65; 156,56; 155,76; 130,04; 128,98; 114,00; 80,01; 67,15; 55,38; 49,74; 49,64; 49,47;49,37; 49,12; 48,92; 48,80; 28,53; 27,75; 25,60. HMRS (ESI) calculée pour C29H39N308 [M+H+], m/z 558,2815, trouvée: 558,2808. Composé (2913) 61 OMe CH 2012, MeO OMe MeO 29b A une solution de macrocycle diMOZ 28b (980 mg, 1,96 mmol) dans du dichlorométhane (40 mL), a été ajouté le N-(tert-butoxycarbonyloxy)succinimide (630 mg, 2,93 mmol). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 24 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Cette solution a été lavée avec de l'eau saturée en chlorure de sodium (2 x 20 mL). Les phases aqueuses ont été réunies et ont été extraites par du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie sur colonne d'alumine (cyclohexane/acétate d'éthyle 100:0 jusqu'à 70:30 par incrément de 5 %) pour conduire au composé souhaité 29b sous la forme d'une huile (507 mg, 42 %). Composé (30a) Me0 1) H2, Pd(OH)2/C, CH30H 2)HCI 1M, Et20 OMe CN-) Boc-N Ni y 0 29a A une solution de macrocycle diMOZ-monoBoc 29a (300 mg, 0,5 mmol) dans le méthanol (25 mL) a été ajouté de l'hydroxyde de palladium absorbé sur charbon (environ 100 mg). Le milieu réactionnel a été placé dans un hydrogénateur et a été maintenu sous une vive agitation et sous atmosphère d'hydrogène (3,45 bars - 50 PSI). L'avancement de la réaction a été suivi par CCM d'alumine. Après une nuit, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été filtré sur Celite puis concentré sous pression réduite. L'huile incolore obtenue a été dissoute dans du méthanol (3 mL). A cette solution a été ajoutée une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 1M (pH 2-3). Le mélange a été concentré sous pression réduite et a été redissous dans un minimum de méthanol (2 mL). A cette solution, a été ajouté de l'éther diéthylique (35 mL). Le précipité blanc obtenu a été recueilli par filtration pour donner un solide blanc correspondant à l'hydrochlorure 30a (102 mg, 62%). PtF: 172-174°C. RMN 1H (500 MHz, D20) b: 3,74 (t, J= 4,5 Hz, 4H), 3,63 (s, 4H), 3,48 (t, J = 4,5 Hz, 4H), 1,47 (s, 9H). RMN 13C (125 MHz, CDC13) Ô:136,0 ; 62,9 ; 25,9 ; 22,2 ; 21,7 ; 6,7. HMRS (ESI) calculée pour C11H23N302 [M+H+], m/z 230,1869, trouvée: 230,1863. Composé (30b) 1) H2, Pd(OH)2/C, CH30H 2)HCI 1M, Et2O n''''"-,NH N~ O H 2 HCI 30b A une solution de macrocycle diMOZ-monoBoc 29b (507 mg, 0,846 mmol) dans le méthanol (25 mL) a été ajouté de l'hydroxyde de palladium absorbé sur charbon (environ 100 mg). Le milieu réactionnel a été placé dans un hydrogénateur et a été maintenu sous une vive agitation et sous atmosphère d'hydrogène (3,45 bars - 50 PSI). L'avancement de la réaction a été suivi par LC-MS. Après une nuit, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été filtré sur Celite puis concentré sous pression réduite. L'huile incolore obtenue a été dissoute dans du méthanol (2 mL). A cette solution a été ajoutée une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à lm (pH 2-3). Le mélange a été concentré sous pression réduite et a été redissous dans un minimum de méthanol (1 mL). A cette solution, a été ajouté de l'éther diéthylique (150 mL). Le précipité blanc obtenu a été recueilli par filtration sur fritté pour donner un solide blanc correspondant à l'hydrochlorure 30b (125 mg, 43%). PtF: 149-168°C. Composé (35a) OMe Cin NH HN L/ TACN K2CO3 , CH3CN MeO OMe OMe 26c 35a 15 A une solution de dérivé bromé 26c (110 mg, 0,234 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (5 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (32 mg, 0,234 mmol) et du 1,4,7-triazacyclononane (10 mg, 0,078 mmol). Le milieu réactionnel a été chauffé à reflux pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction 20 était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau (10 mL) et le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 20 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice 25 (dichlorométhane/méthanol, 0 jusqu'à 300/0 par incrément de 1%) pour conduire au composé 35a sous forme d'une huile jaunâtre (23 mg, 23%). RMN 'H (400 MHz, CDC13) b: 8,03 (dd, J =6,0 Hz, 3H), 7,94 (dd, J = 12,4 Hz, J = 6,8 Hz, 6H), 7,58 (s, 3H), 7,45 (d, J = 8,8 Hz, 6H), 7,42 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 7,37 (td, J = 6,8 Hz J = 3,6 Hz, 6H), 6,87 (d, J = 8,8 Hz, 6H), 4,10 (qd, J = 7,2 Hz, J = 4,2 Hz, 6H), 3,83 (s, 6H), 3,82 (s, 9H), 2,74 (s, 12H), 1,33 (t, J = 7,2 Hz, 9H); RMN 31P (162 MHz, CDC13) b: +26.6; HMRS (ESI) calculée pour C75H76N609P3 [M+H+], m/z 1297,4860, trouvée: 1297,4860. Composé (37a) OMe OMe O~ .O -N---_C_Eû~N~ Ph i 1 `J`` Ô, Ph' PÔ MeO MeO OMe 35a 37a A une solution du ligand 35a (10 mg, 7,7 umol) dans le méthanol (3 mL) a été additionnée une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (1 mL, 0,1 M). La solution a été chauffée à 60°C pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par RMN 1 H. Après cette période la réaction était totale. Le pH de la solution a été ajusté à 7 par addition d'acide chlorhydrique (1M). A cette solution a été additionné de l'acétate d'europium (3,4 mg, 8,5 umol) dissous préalablement dans une solution H2O:CH30H (0,5 mL, 1:1 v/v). Le mélange réactionnel a été chauffé à 50°C pendant 24 h. Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 5°/O) pour donner le composé désiré 37a sous la forme d'un solide blanc (2,5 mg, 240/0). RMN 31P (162 MHz, CDC13) ô: +17.5. HMRS (ESI) calculée pour C69H61 N609P3Eu [M+H+], m/z 1361,2910, trouvée: 1361,2830. 65 Composé (38a) OPEG OPEG Me02C N Me02C 14a OMs Boc N % -H 30a 2HCI NazCO3, Nal McCN OPEG A une solution d'hydrochlorure de TACN monoBoc 30a (20,2 mg, 67 µmol) dans l'acétonitrile anhydre (20 mL), a été ajouté du carbonate de potassium (55,5 mg, 0,40 mmol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore OPEG mésylé 14a (70 mg, 0,14 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC analytique. Après agitation et chauffage à 60°C pendant 2h, le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le brut réactionnel a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 98 :2 jusqu'à 80 :20 par incréments de 2%) pour conduire au composé 38a sous forme d'une huile (52.8 mg, 75%). HMRS (ESI) calculée pour C57H73N5014 [M+H+], m/z 1052,5232, trouvée: 1052,5256. Composé (39a) OPEG OPEG Meo2C 38a OPEG OPEG A une solution de TACN monoBoc-dibras OPEG 38a (1,47 mg, 1,4 µmol) dans du dichlorométhane (950 pL) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (50 pL). L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après agitation à température ambiante pendant une nuit, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le milieu a été repris dans du méthanol (1 mL) et 5 du toluène (3 mL) puis a été évaporé afin d'éliminer les traces d'acide trifluoroacétique. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC sur colonne préparative conduisant au composé 39a sous la forme d'une huile jaunâtre (0,75 mg, 560/0). HMRS (ESI) calculée pour C52H65N5012 [M+H+], m/z 952,4708, trouvée: 952,4714. Composé (40a) NH-Boc OPEG Me02C SNI Me02C 14b OMs OPEG A une solution de TACN dibras OPEG 39a (4,25 mg, 4,4 µmol) dans l'acétonitrile anhydre (4 10 mL), a été ajouté du carbonate de sodium (1,4 mg, 1,34 µmol) sous atmosphère inerte. A cette suspension, a été ajoutée une solution de chromophore NH-Boc mésylé 14b (3,5 mg, 6,7 µmol) dans l'acétonitrile anhydre (2 mL). L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après agitation et chauffage à 50°C pendant 22 h, le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le milieu réactionnel a été purifié par 15 HPLC sur colonne préparative. Le composé 40a a été obtenu sous la forme d'une huile jaunâtre (1,25 mg, 210/0). 67 Composé (41a) OPEG OPEG 1) H20/THF, LiOH 2) DCM / TFA OPEG 40a OPEG 41a A une solution de ligand triester méthylique 40a (1 mg, 727 nmol) dans du THF (150 pL), ont été ajoutés de l'hydroxyde de lithium à 1 M (50 µmol) et de l'eau pure (100 pL). A cette suspension blanchâtre, a été ajouté du THF (1 mL) pour parfaire la solubilisation. Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le milieu réactionnel a été alors repris dans de l'eau pure (500 pL) et a été acidifié par l'addition d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1M pour obtenir le pH du mélange compris entre 2-3. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC préparative conduisant au produit souhaité sous la forme d'une huile (312 nmol, 43°/O). A l'huile obtenue précédemment et d'un deuxième lot (1 'mol) dans du dichlorométhane (500 pL) ont été ajoutés de l'acide trifluoroacétique (150 pL) puis un volume supplémentaire de dichlorométhane (2500 pL). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 10 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire au composé 41a sous la forme d'une huile (530 nmol, 53°/O) qui a été utilisé dans l'étape suivante sans autre purification. 68 Composé (42a) OPEG OPEG Na2CO3,EuC13.6H20 McOH H2N N~ N-, ,-N ; ; Eû-N N O OPEG 41a OPEG 42a A une solution de TACN tribras asymétrique acides carboxyliques -NH2 41a (16,4 µmol) dans du méthanol (5 mL) et de l'eau (2 mL), ont été ajoutés du carbonate de sodium (10,4 mg, 98,4 'mol) et du chlorure d'europium hexahydraté (16,6 mg, 32,8 µmol). Le mélange réactionnel a été chauffé à 50°C pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC analytique. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par HPLC préparative conduisant au complexe 42a sous la forme d'une huile incolore (9,15 µmol, 56%). Composé (43a) OPEG OPEG A une solution de 1,4,7-triazacyclononane-mono Boc 30a (22 mg, 0,096 mmole) dans de l'acétonitrile (5 mL) ont été ajoutés le composé 26a (95 mg, 0,16 mmole) et du carbonate de potassium (27 mg, 0,19 mmole). Le mélange a été agité sous argon à 50 °C pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. OPEG H K2CO3 McCN Le mélange réactionnel a été refroidi à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 5 °/O par incréments de 0,5 °/O) pour obtenir le composé souhaité 43a sous la forme d'une huile jaune (58 mg, 59 %) : RMN 1H (400 MHz, CDC13) ô: 8,01 (m, 2H), 7,95 (m, 4H), 7,56 (s, 2H), 7,45 (m, 2H), 7,41 (d, J = 8,8 Hz, 4H), 7,40 (m, 4H), 6,87 (d, J= 8,8 Hz, 4H), 4,13 (t, J= 4,8 Hz, 4H), 4,10 (m, 4H), 3,85 (s, 4H), 3,84 (t, J= 4,8 Hz, 4H), 3,72 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,66 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,63 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,53 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,35 (s, 6H), 3,24 (m, 4H), 2,97 (m, 4H), 2,53 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,33 (m, 6H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 161,6; 161,4 (d, J = 19 Hz); 159,7; 159,6; 155,5; 153,8; 153,7 (d, J = 165 Hz); 133,6; 133,5; 133,3; 132,4; 132,3; 130,1 (d, J = 145 Hz); 128,1; 128,0; 126,2; 125,9 (d, J = 3 Hz); 114,9; 114,7; 114,1; 114,0; 95,4; 95,1; 85,7; 85,5; 71,9; 70,8; 70,6; 70,5; 69,6; 67,5; 63,0; 49,1; 61,6; 59,0; 53,4; 28,7; 28,6; 16,5; RMN 31 P (162 MHz, CDC13) b: +26,6, +26,5 HMRS (ESI) calculée pour C69H88N5014P2 [M+H+], m/z 1272,5840, trouvée: 1272,5800. Composé (44a) A une solution de 43a (47 mg, 0,037 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (1 mL) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (0,5 mL). La solution a été agitée sous argon à 23 °C pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été redissous dans du dichlorométhane (1 mL), qui a été à nouveau éliminé sous pression réduite. Cette procédure a été répétée 5 fois pour éliminer l'acide trifluoroacétique en excès. Le résidu a été utilisé dans la suite de la synthèse sans purification supplémentaire. HMRS (ESI) calculée pour C64H80N5012P2 [M+H+], m/z 1172,5270, trouvée: 1172,5280. OPEG OPEG OPEG 70 Composé (45a) OPEG OPEG OPEG Au résidu 44a obtenu dans l'étape précédente dissous dans de l'acétonitrile (4 mL) ont été ajoutés le dérivé bromé 26b (18 mg, 0,029 mmol) et du carbonate de potassium (15 mg, 0,11 mmol). La suspension a été agitée à 50 °C pendant 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0 à 10 % par incréments de 0,5 %) pour obtenir le composé souhaité 45a sous la forme d'une huile jaune (25 mg, 50 %). RMN 1 H (400 MHz, CDC13) b: 8,07 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 7,85 (dd, J = 8,4, J = 12 Hz, 6H), 7,48 (m, 3H), 7,47 (m, 3H), 7,46 (d, J = 8,8 Hz, 6H), 7,39 (m, 6H), 6,90 (d, J= 8,8 Hz, 6H), 4,76 (s, 1H), 4,14 (m, 6H), 4,11 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 4,04 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,94 (s, 6H), 3,87 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,73 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,68 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,65 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,54 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,37 (s, 6H), 3,34 (m, 2H), 2,81 (m, 12H), 1,99 (q, J = 6 Hz, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,34 (t, J= 7,2 Hz, 9H) ; RMN 13C (100 MHz, CDC13) b: 160,8 (d, J= 19 Hz), 160,2; 156,2; 154,6 (d, J = 165 Hz); 134,0; 133,9; 132,9; 132,5 (d, J= 10 Hz); 130,2 (d, J= 138 Hz); 128,8; 128,7; 127,5; 115,1; 113,9; 97,0; 85,3; 79,6; 72,1; 71,1; 70,9; 70,8; 69,8; 67,8; 65,9; 62,0 (d, J = 6 Hz); 59,3; 52,3; 53,0 à 46,0; 37,9; 29,7; 28,6; 16,8; RMN 31P (162 MHz, CDC13) b: +26,4. HMRS (ESI) calculée pour C94H113N7017P3 [M+H+], m/z 1704,7400, trouvée: 1704,7410. 71 Composé (46a) 1) THF, LiOH 2) DCM, TFA OPEG OPEG OPEG Au ligand 45a (52 mg, 30,5 µmol) ont été additionnés du tétrahydrofurane (6 mL) et une solution aqueuse d'hydroxyde de lithium (4 mL, 1 M). La solution a été agitée à température ambiante pendant 24 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite et utilisé dans la suite de la synthèse sans purification complémentaire. MS (ESI) calculée pour C88H103N7017P3 [M+3H+], m/z 1622. A une solution du composé obtenu précédemment dans du dichlorométhane (6 mL) a été ajouté de l'acide trifluoroacétique (3 mL). La solution a été agitée à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été redissous dans du dichlorométhane (6 mL). Le solvant a été à nouveau éliminé sous pression réduite. Cette procédure a été répétée 5 fois pour éliminer l'acide trifluoroacétique en excès. Le produit brut a été purifié par HPLC préparative pour conduire à une huile qui a été utilisée directement dans l'étape de complexation. MS (ESI) calculée pour C83H97N7015P3 [M+3H+], m/z 1622. 72 Composé (47a) OPEG OPEG OPEG McOH Eu(OAc)3 H2N 47a A une solution de composé 46a (0,016 mmol) dans du méthanol (1 mL) a été ajouté une solution d'acétate d'europium (7 mg, 0,016 mmole) dissous dans un mélange eau : méthanol (0,5 mL, 1:1 v/v). La solution a été agitée à 50 °C pendant 14 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été refroidi et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice (CH2C12 / CH30H, 100/0 : NH3 0 à 1 °/O par incréments de 0,1 °/O) pour obtenir le complexe d'europium sous la forme d'un solide blanc 47a (9,1 mg, 34 %) ; RMN 31 P (162 MHz, CD30D) ô: +17,5. HMRS (ESI) calculée pour C83H90N7015P3Eu [MCF3CO2j+, m/z 1668,4900, trouvée: 1668,4980. Composé (54a) 42a 54a PEG-0 OPEG 10 A une solution de complexe d'europium NH2 42a (200 nmol) dans du tampon MOPS pH 7 (200 pL) a été ajoutée une solution d'ester de (N-[[3-maléimidopropyloxy] succinimidyle (41 pL, 300 nmol) dans du diméthylformamide préparée à partir d'une solution stock (1,92 mg N-[[3-maléimidopropyloxy] succinimidyle dans 1000 pL de diméthylformamide). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC préparative pour conduire au composé 54a sous la forme d'une huile (105 nmol, 52%). Composé (58a) 10N_o) 0 0 v v NH O O OPEG 2) TSTU, DIPEA DMF REG-0 OPEG OPEG A une solution de complexe d'europium NH2 42a (200 nmol) dans du DMF anhydre (100 pL) a 15 été ajoutée de la triéthylamine (1 pL). A ce mélange a été additionnée une solution d'anhydride glutarique (236 nmol) dans du diméthylformamide (27,4 pL). Le mélange a été agité à température ambiante pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC préparative pour conduire au composé souhaité sous la forme d'une huile (62,7 nmol, 31%). 20 ESI- MS m/z calculée pour C73H80N7018Eu+H+ = 1382,45. A une solution de complexe acide (550 nmol) dans du diméthylformamide anhydre (200 pL) ont été additionnés de la diisopropyléthylamine (0,8 pL) puis du 0-(N-SuccinirTridyl)-1,1;3.3-tétrarnéthylur_niurn tétrafluoroborCte 0,3 mg, 1 p.mol). Le mélange réactionnel ra été agité é température ambiante perdant. 15 mir:. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après mette pérlo, e, la 25 réaction était totale. Le milieu ré ctionnel ra été purihe directement par HPLC préparative pots conduire au composé NHS 58a (370 nmol, 740/x). ESI- MS m/z calculée pour C73H80N7018Eu+H+= 1382,45. 74 Composé (62a) IxOI ^ I00 HN" v v NH OPEG 42a H2N OPEG A une solution de complexe d'europium NH2 42a (100 nmol) dans du diméthylformamide (50 pL) ont été ajoutée de la triéthylamine (1,5 pL) et une solution de M2BG-glu-NHS (100 nmol) dans du diméthylformamide (50 pL). La réaction est agitée à température ambiante pendant 2 h. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après cette période un deuxième ajout équivalent au premier a été réalisé (triéthylamine et une solution de M2BG-glu-NHS dans le diméthylformamide). La réaction a été agitée à température ambiante pendant une nuit. Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été purifié par HPLC préparative pour conduire au composé 62a sous forme d'une huile (68 nmoles, 68°/O). ESI- MS m/z calculée pour C68H74N7015Eu+H+= 1382,45. 75 Composé (66a) OyO H N--lk,...".')". NH H J o o OPEG OPEG A une solution de complexe d'europium -NH2 42a (200 nmol) dans du diméthylformamide (100 pL) a été ajouté de la triéthylamine (5 pL). Une solution stock d'AMPc-NHS a été préparée contenant AMPc-NHS (200 nmol) dans du diméthylformamide (200 pL). Cette solution stock a été ajoutée à la solution du complexe. Le milieu réactionnel a été agité pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Le milieu réactionnel a été purifié par HPLC préparative pour conduire au composé 66a sous la forme d'une huile (62 nmol, 31°/o). Composé (71a) NH2 Ac2O CH2Cl2o HN-JÇ 70a 71a A une solution de 4-éthynylaniline 70a (2,34 g, 20 mmol) dans du dichlorométhane (30 mL) a été ajouté de l'anhydride acétique (2,5 mL, 40 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 16 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu couleur noir a été ajoutée une solution saturée de bicarbonate de sodium (15 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 15 mL). Les phases organiques ont été rassemblées puis séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice (acétate d'éthyle / cyclohexane 98/2 jusqu'à 60/40 par incrément de 5%) pour conduire au composé 71a sous forme d'un solide légèrement rosâtre (2,05 g, 64 %). PtF:118,4-125,3°C. 76 Composé (77a) I HOC I N^CO2Me 12 Pd(PPh3)Cl2, Cul Et3N, THF o HN) HO N CO2Me 71a 77a A une solution de dérivé acétylénique 71a (174 mg, 1,1 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (20 mL) et de la triéthylamine anhydre (10 mL) a été additionné du dérivé iodé 12 (296 mg, 1 mmol). Le mélange a été dégazé sous agitation pendant 1 h. A cette solution ont été additionnés du bis-chlorure bis-triphénylphosphine de palladium (II) (70 mg, 0,2 mmol) et de l'iodure de cuivre (1) (38 mg, 0,4 mmol). Le milieu réactionnel a été agité à 50 °C pendant 18 h à l'abri de la lumière. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période la réaction était totale. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. Au résidu noir a été additionnée de l'eau (10 mL) et le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 x 20 mL). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice (dichlorométhane / méthanol 0,50/0 jusqu'à 20 °/O par incrément de 1°/O) pour conduire au composé 77a sous forme d'un solide marron (200 mg, 610/0). Composé (78a) HO Ms0 N CO2Me N CO2Me MsC1 Et3N / THF 77a 78a A une solution d'alcool 77a (195 mg 0,6 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (14 mL) refroidie à 5°C ont été ajoutés de la triéthylamine (0,3 mL, 1,8 mmol) puis du chlorure de mésyle (70 pL, 1,8 mmol) sous atmosphère inerte. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 15 min. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau saturée en chlorure de sodium (30 mL) et le mélange a été extrait avec du dichlorométhane (2 x 30 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite pour conduire à un solide marron correspondant au composé 78a (231 mg, 95°/O) qui était suffisamment pur pour être utilisé dans l'étape suivante sans purification complémentaire. Composé (79a) O HN-JL 78a Ms0 CO2Me A une solution de dérivé mésylé 78a (120 mg, 0,3 mmol) dans de l'acétonitrile anhydre (4 mL), ont été ajoutés sous atmosphère inerte du carbonate de potassium (82 mg, 0,6 mmol) et du 1,4,7-triazacyclononane (12,9 mg, 0,1 mmol). Le milieu réactionnel a été chauffé à reflux pendant 24 h. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après cette période, la réaction était totale. Le milieu réactionnel a été refroidi à température ambiante et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Au résidu a été additionnée de l'eau (10 mL) et le mélange a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 20 mL). Les phases organiques ont été regroupées et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration, le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut obtenu a été purifié par HPLC préparative pour conduire au composé 79a sous forme d'un solide blanc (12 mg, 120/0). Exemple 1 : Stabilité d'intensité de luminescence des composés de l'invention La stabilité de la luminescence de différents composés selon l'invention (37a, 47a, 53a, 62a, 66a, 67a, 69a, 80a (X4=C0), 80g (X4=C0)), ainsi que celle d'un composé de l'art antérieur (composé 39 décrit par Latva et al dans Journal of Luminescence, Volume 75, n°2, Septembre 1997, Pages 149-169, de formule ci-dessous) ont été mesurées dans différent milieux. Des solutions de chacun de ces composés à la concentration de 100 à 500 pM ont été préparées dans un tampon HEPES à 50 mM à pH 7,4 avec 0,10/0 d'albumine sérique bovine (BSA). 501.1I de chaque solution ont été déposés dans des puits de plaques 96 puits (Corning Costar 3915), auxquels ont été ajoutés 45 pl de tampon HEPES ou 50 pl de SVNN (« serum de veau de nouveau-né » (fournisseur : Bayer)) . Les puits ont été finalement complétés par soit 5µI d'eau (pour obtenir un signal basal, « base » dans la figure 1), soit 5µI d'une solution à 400 mM de CaCl2, MgCl2, MnCl2 ou d'EDTA. Ces solutions sont connues pour leur effet sur les complexes de terres rares : les ions Ça++ et Mg++ peuvent rentrer en compétition avec l'europium pour la liaison avec l'agent complexant et l'EDTA peut avoir pour effet de chélater l'Europium. L'ion Mn++ est également connu pour sa capacité à provoquer une extinction de luminescence. Après 10 min, la luminescence a été mesurée sur un lecteur Rubystar à 620 nm avec un délai de mesure de 50 ps et un temps d'intégration de 400 ps. Les signaux mesurés ont été normalisés par le signal de « base » de chaque composé et les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 1. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur trois puits. La figure 1 montre que la présence de 20 mM de CaCl2, MgCl2, ou d'EDTA n'affecte pas de manière significative la luminescence des composés selon l'invention, ce que l'on peut corréler à la stabilité de ces complexes. On remarque que les complexes avec des bras « phosphinate » comme 37a, 47a et 67a montrent une excellente stabilité de luminescence en présence de MnCl2 par rapport aux autres complexes, y compris celui de l'art antérieur (Latva). Enfin, la luminescence de tous les complexes selon l'invention est significativement plus stable que celle du complexe de l'art antérieur en présence de SVNN, ce qui est particulièrement avantageux pour utiliser ces composés par exemple pour l'analyse d'échantillons sanguins dans le domaine du diagnostic. Exemple 2 : Spectres d'excitation des composés de l'invention Les solutions de composés en tampon HEPES (pH 7,4, 0,10/0 BSA) de l'exemple précédent ont été utilisées pour obtenir les spectres d'excitation de ces composés. Pour cela, ces solutions ont été placées dans des cuves de quartz dans un spectrophotometre de fluorescence « Cary Eclipse » (Varian). On a vérifié que l'absorption à 337 nm de ces solutions était inférieure à 0,05 unités dans une cuve de 1 cm. Les spectres d'excitation ont été obtenus dans le mode « phosphorescence » en mesurant l'émission à 615 nm après excitation à différentes longueurs d'onde. Les mesures ont été effectuées avec un délai de 0,1 ms et un temps d'intégration de 10 ms. La fente d'excitation était de 5 nm, la fente d'émission de 2,5 nm et le voltage du photomultiplicateur de 800 V. La Figure 2 montre les spectres d'excitation obtenus après normalisation du signal mesuré par le signal maximum pour chaque composé. Les spectres d'excitation des composés selon l'invention présentent un déplacement bathochrome par rapport à celui du composé de l'art antérieur (composé Latva), les rendant particulièrement sensibles à une excitation à 337nm, qui correspond à la longueur d'onde de la lumière émise par les lasers à azote, largement utilisés dans les lecteurs de plaque. Ces spectres montrent également que les composés de l'invention peuvent également être excités à des longueurs d'onde plus élevées, par exemple 365 nm ou 380 nm. Il est particulièrement avantageux d'utiliser ces dernières longueurs d'onde pour des applications en microscopie, puisque elles limitent l'absorption de lumière par les matériels biologiques présents dans le milieu de mesure et par la verrerie présente dans les microscopes. REVENDICATIONS1 Agents complexants de formule (1) : CHR4 Chrom1\ ~ /Chrome c ~N N~ \ a Chroma dans laquelle : - soit a=b=c=1, soit a=b=c=0, soit a=1 et b=c=0, soit a=b=1 et c=0 ; - R2, R4 et R5 sont chacun choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H, -L-G 10 - Chrom,, Chrome et Chroma sont des chromophores identiques ou différents de formule (II) : 4 (R2)d û 3 1 N dans laquelle - d est un nombre entier allant de 1 à 3 15 - R, est choisi parmi les groupes suivants : -000H, -PO(OH)R6, R6 représentant un groupe choisi parmi : phényle, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle; - chaque R2 est choisi parmi les groupes suivants : - groupes alkyles linéaires ou ramifiés comprenant de 1 à 6 atomes carbones 20 éventuellement substitués par un groupe PEG ; - groupes 0-donneurs choisis parmi :-O-L-G ; -O-AIk; -O-PEG; le groupe de formule : (1)~O dans laquelle z est un nombre entier allant de 1 à 5 ; - groupes S-donneurs choisis parmi : -S-L-G ; -S-AIk; -S-PEG; le groupe de formule : PEG O PEG dans laquelle z est un nombre entier compris entre 1 et 5 ; - groupes NHCO-donneurs choisis parmi : -NHCO-L-G ; -NHCO(OAIk); - NHCO(NHAIk); -NHCO(NAIk1Alk2); -NHCO(SAIk); -NHCO(Alk); -NHCO-PEG; le groupe de formule : - groupes SCO-donneurs choisis parmi : -SCO-L-G; -SCO(OAIk); -SCO(NHAIk); - SCO(NAIk1Alk2); -SCO(SAIk); -SCO(Alk) ; -SCO-PEG; - groupes NHCS-donneurs choisis parmi : -NHCS(OAIk); -NHCS(NHAIk); - NHCS(NAIk1Alk2); -NHCS(SAIk); -NHCS(Alk); -NHCS-PEG; -NHCS-L-G; 15 - groupes SCS-donneurs choisis parmi : -SCS(OAIk); -SCS(NHAIk); - SCS(NAIk1Alk2); -SCS(SAIk); -SCS(Alk) ; -SCS-PEG; -SCS-L-G; - PEG est un groupe de formule-CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH3, y étant un nombre entier allant de 1 à 5; - AIk, AIk1 et AIk2 sont chacun un alkyle linéaire ou ramifié en C1-C10 éventuellement 20 substitué par un groupe -O-PEG ; - L est un bras d'espacement; - G est un groupe réactif permettant la liaison du complexe ou de l'agent complexant à une molécule à marquer; étant entendu que PEG O O 1 PEG PEG O 1 PEG 10 PEG O O 1 PEG - lorsque R2 comporte un groupe -L-G, R3= R4 = R5 = H ; - lorsque R2 ne comporte pas de groupe -L-G, soit l'un des groupes R3, R4 et R5 est un groupe -L-G soit R3=R4=R5=H; et - lorsque plusieurs groupes R2 sont présents, au moins un est en position 4 du cycle benzénique. 2. Agents complexants selon la revendication 1, caractérisés en ce que soit deux des groupes chrom,, chrome et chroma sont identiques et sont chacun substitués par 1 à 3 groupes R2 ne comportant pas de groupe -L-G et le troisième chromophore est substitué par un groupe R2 comportant un groupe -L-G, les groupes R3-R5 sont des atomes d'hydrogène ; soit chrom,, chrome et chroma sont identiques et sont chacun substitués par 1 à 3 groupes R2 ne comportant pas de groupe -L-G, et les groupes R3-R5 sont des atomes d'hydrogène ; soit chrom,, chrome et chroma sont identiques et sont substitués par 1 à 3 groupes R2 ne comportant pas de groupe -L-G, et un des groupes R3-R5 est un groupe L-G, les autres étant des atomes d'hydrogène. 3. Agents complexants selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce que l'un des groupes R2 comporte un groupe -L-G. 4. Agents complexants selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce que l'un des groupes R3, R4 ou R5 comporte un groupe -L-G. 5. Agents complexants selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils ne comportent aucun groupe -L-G. 6. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que a=b=c=0 (1,4,7 triazacyclononane). 7. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que les groupes R, des chromophores chrom,, chrome et chroma sont des groupes -000H. 8. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en 35 ce que les groupes R, des chromophores chrom,, chrome et chroma sont des groupes - PO(OH)R6. 9. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que le groupe R, du chromophore chrom, est un groupe -000H et les groupes R, des 40 chromophores chrome et chroma sont des groupes -PO(OH)R6 .30 10. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que le groupe R, du chromophore chrom, est un groupe -PO(OH)R6 et les groupes R, des chromophores chrome et chroma sont des groupes -000H. 11. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes 0-donneurs choisis parmi : -O-L-G ; -O-AIk; -O-PEG; le groupe de formule : PEG 12. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisés en ce que les groupes R2 sont des groupes NHCO-donneurs choisis parmi : -NHCO-L-G ; - NHCO(OAIk); -NHCO(NHAIk); -NHCO(NAIk,Alk2); -NHCO(SAIk); -NHCO(Alk); -NHCO-PEG; le groupe de formule : 13. Agent complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins un groupe PEG 20 14. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisés en ce que le groupe réactif G, lorsqu'il est présent, est choisi parmi : un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure 25 de sulfonyle, un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et un groupe de formule : 10 15 PEG O O 1 PEG PEG O O 1 PEG O O ( Il NH)-(CH2) NCS (II NH)-(CH2) NCO v w v w O O (II NH)v CH2) w NH2 (Il NH (CH2) N3 v v w O O (II NH)-(CH2) SH v w (Il NH)v CH2) w S S Ar O (Il NH~(CH2) w NH-Ar S03- NCS O NH )(CH2) w =CH O 0 NH)-(CH2) w O-N Il O 0 NHt(CH2) w Cl Cl dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. 15. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisés en ce que le bras d'espacement L, lorsqu'il est présent, est choisi parmi : - une liaison covalente; - un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; 10- un groupe cycloalkylène en C5-C$ ; un groupe arylène en C6-C14; lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-C6, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. - les groupes divalents suivants : 1) -(CH2)n 0 0 Il II 2) -(CH2)n-NH-C-(CH2), C 3) -(CH2)n-O-(CH2)m 0-(CH2)p 0-(CH2)p 4) -(CH2)n-0-(CH2)m 0 0 NH-C-(CH2)n C 15 0 I I 5) -(CH2)n-NH-C-(CH2)p O 6) -(CH2)n-NH-C-(CH2)p 0 7) -(CH2)n-NH-C-(CH2)pS S-(CH2)r 8) 0 -(CHz)n-NH-« (CH2)p 20FR1156519 86 0 0\ 9) -(CH -NH-C z)n ~ >(CH2)17-N~ S-(CH2), O 10) -(CH2)n-NH 0 Il 11) -(CH2)n---NH-C-(CH2)P 12) -(CH2)p NH -(CH2)p O 13) () (CH2)p dans lesquels n, m, p, r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. 10 16. Agents complexants selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisés en ce que le groupe -L-G, lorsqu'il est présent, est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, une amine, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une amine aliphatique, et d'un bras 15 d'espacement L constitué d'une chaine alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbones. 17. Complexes de lanthanides comprenant un agent complexant selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 et un lanthanide. 20 18. Complexes de lanthanides selon la revendication 17, caractérisés en ce que le lanthanide est choisi parmi : Eu3+, Te, Gd3+, Dy3+, Nd3+, Er3+'de préférence le lanthanide est Eu3+ 19. Conjugués fluorescents d'une molécule d'intérêt obtenus par la mise en contact d'un 25 complexe de lanthanide selon l'une des revendications 17 à 18, ledit complexe comprenant un groupe -L-G, avec une molécule d'intérêt. 20. Méthode de synthèse de macrocycles triazotés monoprotégés caractérisée en ce qu'elle comprend donc les étapes suivantes : 30 (i) protection de deux des trois amines du macrocycle triazoté par un groupe protecteur Gp, sensible à l'hydrogénation ; (ii) purification des composés disubstitués sur colonne choisie parmi : une colonne d'alumine basique ; une colonne de silice ayant subi un traitement le 5/12/115 préalable avec de la triéthylamine ou de l'ammoniac; une colonne d'alumine neutre, cette dernière étant préférée ; (iii) protection de la troisième amine dudit macrocycle triazoté par un deuxième groupe protecteur Gp2 insensible à l'hydrogénation ; (iv) déprotection des amines protégées par les groupes protecteurs Gp, par hydrogénation, de préférence avec le catalyseur de Pearlman ; (v) purification des produits monoprotégés, par exemple par formation de sels de dihydrochlorure par ajout d'acide chlorhydrique à froid et précipitation dans l'éther diéthylique. 21. Composé de formule : _ le /NH HN~ a dans laquelle Gp2 est un groupement protecteur Gp2 insensible à l'hydrogénation, 15 a, b et c ont les mêmes valeurs que dans la revendication 1.