Brevet FR2983872A1 — publié le 20130614

La présente invention a pour objet un procédé d'identification d'une population de palmipèdes, en particulier d'une population spécifique de canards Barbarie présentant des Yeux Rouges (BYR) à l'aide de la détection moléculaire de différentes formes du gène SLC45A2. Les palmipèdes appartiennent à l'ordre des Ansériformes et à la famille des Anatidés qui rassemble un grand nombre d'espèces, telles que les cygnes, les oies ou encore les canards. Ces deux dernières espèces, à savoir les oies et les canards, présentent un intérêt agronomique et économique. En effet, les canards et les oies sont domestiqués et élevés pour leur chair, la production de foie gras et la production de leurs oeufs. De nombreuses souches, maintenues en lignées, existent en élevage. Ces lignées sont obtenues au cours de processus de sélection et de croisement de différentes espèces domestiques. Par lignée, on entend une population animale, fermée depuis au moins deux reproductions généalogiques, sur laquelle certains critères sont mesurés et sélectionnés. Sélectionner consiste à choisir au sein d'une population fermée, les reproducteurs les plus aptes à faire évoluer ou à maintenir les caractères quantitatifs et qualitatifs de leur descendance, caractères évalués par des critères de sélection. Ces critères sont un ensemble de mesures et d'éléments objectifs recueillis sur les individus candidats ou sur leurs apparentés qui permettent de quantifier ou de définir les aptitudes d'un candidat. Au cours de cette sélection généalogique, différentes souches sont isolées et se caractérisent par différents critères, comme leur vitesse de croissance, leur facilité de consommation des aliments, leur indice de consommation, leur capacité de reproduction, leur potentiel de fertilité, leur mortalité embryonnaire, etc. Ainsi, des lignées nouvelles présentant des caractéristiques phénotypiques et génotypiques particulières sont obtenues en élevage. Les palmipèdes posent un problème technique d'identification du sexe à l'éclosion. Aucun signe morphologique ou phénotypique ne distingue, par exemple, un caneton mâle d'un caneton femelle. Or la valorisation économique des mâles et des femelles est différente dans les différentes activités mentionnées. Les mâles sont en effet privilégiés pour la production de la chair et du foie gras et les femelles pour celle des oeufs. Une solution consiste à déterminer manuellement juste après l'éclosion le sexe par retournement du cloaque afin d'identifier visuellement les organes génitaux des palmipèdes. Cette approche, maîtrisée par beaucoup de producteurs est actuellement mise en oeuvre et nécessite un savoir faire très particulier et une main d'oeuvre importante. Une autre solution est l'identification des palmipèdes par sexage 5 automatique comme mentionné dans la demande FR 2 921 542 qui décrit un procédé et une installation pour le sexage des volatiles vivants de la famille des Anatidés, en particuliers des canetons. Il existe, chez les palmipèdes, des souches colorées et des souches blanches notamment dans l'espèce de canard Pékin Anas platyrhynchos et 10 dans l'espèce Barbarie Cairina moschata, les deux espèces domestiques de canard les plus fréquemment rencontrées. De nombreuses souches de canard commun, appartenant à l'espèce Anas platyrhynchos sont également identifiées parmi lesquelles le canard Colvert sauvage, le canard de Rouen, le canard de Challans. Les oies, telles que les oies cendrées (Anser anser), 15 les oies cygnoïdes (Anser cygnoides) sont également des espèces sauvages et domestiques et il existe différentes souches colorées ou blanches d'oie. Les palmipèdes présentent des yeux dont la coloration apparait noire dès l'éclosion et ce phénotype Yeux Noirs (YN) est considéré comme le caractère de phénotype sauvage. Jusqu'à présent, il n'existe pas pour les 20 palmipèdes de publication, ni dans la littérature scientifique, ni dans la documentation de souches commerciales, d'autres phénotypes que cette couleur noire des yeux. La mise en place de la pigmentation de l'oeil en général s'effectue au cours du développement embryonnaire sous l'action conjuguée de 25 production de pigments, de leur transport et accumulation dans des types cellulaires bien particuliers, les cellules de la zone pigmentée. Chez les mammifères et les oiseaux, la pigmentation des yeux, des phanères et de la peau résulte de la synthèse de deux types de polymères, la mélanine/l'eumélanine de coloration noire-marron et la phéomélanine de 30 coloration jaune-rouge. La tyrosinase est l'enzyme responsable de la première étape de la synthèse de ce pigment dans les mélanosomes présents dans les mélanocytes. Dans ces différentes espèces animales et chez l'homme également, l'apparition d'un défaut de pigmentation des yeux est souvent associée au caractère albinos. Il existe deux formes majeures 35 d'albinisme, l'albinisme oculaire-cutané (OCA) et l'albinisme oculaire (OA) en général moins sévère. Des troubles de la vision plus ou moins importants sont souvent associés à ce phénotype. Des modèles de poulet sont même étudiés pour suivre la dégradation de la rétine souvent observée dans les cas d'albinisme. Dans la littérature, des altérations de séquences de gène ont été répertoriées comme associées au phénotype albinos dans différentes espèces dont le poulet. On peut citer par exemple les gènes CECR2, EDN3 et EDNRB (Nataf et al., 1998), GPR143 (Lopez et al., 2008), LRP6 (Hunter et al.,2004), MITF (Mochii et al., 1998), MLPH (Vaez et al., 2008), OCA2 (Sturm, 2009), PAX6 (Bhat et al., 2004), SLC45A2 (Gunnarsson et al., 2007), TBX5 (Golz et al., 2008), TYR (Chang et al., 2006) et TYRP1 (April et al., 1998). En conséquence, les défauts de pigmentation résultent à la fois chez les mammifères et les oiseaux d'altérations génétiques dans la voie de synthèse, de transport ou d'accumulation de la mélanine. Différents gènes ont été ainsi identifiés dans la littérature comme étant impliqués dans ces processus et sont donc directement susceptibles d'être responsables du caractère albinos avec des phénotypes plus ou moins sévères selon les espèces animales ou les individus, mais aucun ne traite le cas des Anatidés comme les canards Pékin, Barbarie ou les oies. Dans une lignée de l'espèce canard Barbarie sélectionnée par la Demanderesse sur des critères de chairs (poids vif, rendement viande, etc) depuis quinze générations en population fermée, il a été identifié lors d'une éclosion pédigrée, quelques canetons avec une couleur de duvet un peu plus clair et des yeux rouges (YR). Il s'est avéré que ces canetons à yeux rouges (YR) étaient uniquement des femelles. Le phénotype est qualifié d'Albinos, le terme se référant à un défaut de pigmentation. En effectuant plusieurs croisements en retour, des mâles homozygotes de phénotype Albinos ont été obtenus pour ensuite créer la lignée pure Barbarie Yeux Rouges (BYR) de phénotype albinos stable et pérenne pour les mâles et les femelles. Jusqu'à présent, aucune publication n'a fait état d'autres canards Barbarie à Yeux Rouges (BYR) pouvant exister, autre que ceux sélectionnés par la Demanderesse. Dans le processus de sélection de nouvelles lignées, il peut être 35 avantageux de réaliser des croisements entre des individus à yeux noirs (BYN) d'une souche donnée avec des individus de la lignée pure Barbarie Yeux Rouges (BYR), en particulier en utilisant les mâles BYR dont seules les femelles issues de ce croisement auront les yeux rouges et pourront ainsi être immédiatement reconnues phénotypiquement. Ce caractère autosexable pourra donc être utilisé au cours du processus de sélection. Par exemple, dans le processus de production de foie gras et de viande, le mulard est le résultat du croisement entre un mâle Barbarie et une femelle Pékin. Or en utilisant les mâles Barbarie YR croisés avec des femelles Pékin YN, il apparait que seules les femelles mulardes résultantes présentent le phénotype YR. Les mâles présentent le phénotype YN. Ce caractère récessif lié au sexe apparaît ainsi dans le schéma du croisement illustré sur la figure 1. Son utilisation à des fins de sélection et à des fins commerciales est ainsi particulièrement importante pour cribler les animaux issus du croisement et ainsi sélectionner les mulards mâles YN qui seront utilisés pour faire du foie gras. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d'identification permettant de certifier l'appartenance ou la non-appartenance à une population donnée d'un échantillon prélevé sur un palmipède, cette population donnée présentant le phénotype YR comme le canard Barbarie YR ou le mulard femelle YR. Ce procédé d'identification pouvant être réalisé en l'absence de la visualisation du phénotype YR. Un des aspects de la présente invention est de proposer un procédé d'identification d'un phénotype des canards et des canetons par une approche moléculaire à l'aide de la détection de différentes formes du gène SLC45A2. Un autre aspect de l'invention est d'identifier le sexe des canards et des canetons sur la base de cette identification des formes du gène SLC45A2. A cet effet, la présente invention concerne un procédé d'identification de populations de palmipèdes, ledit procédé étant effectué à partir d'un échantillon biologique prélevé sur l'animal, tel qu'une plume, un échantillon de sang ou des fèces, et permettant de vérifier, l'appartenance ou la non-appartenance de l'animal sur lequel a été prélevé ledit échantillon biologique à une population de palmipèdes, ce procédé comprend : - l'amplification de la région promotrice du gène SLC45A2 dudit 35 échantillon dans un milieu réactionnel comportant au moins un couple d'amorces par une PCR génomique, de sorte à obtenir ou non des produits d'amplifications, - la séparation des produits d'amplification par électrophorèse sur gel selon leur taille, et - la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus à partir de différentes populations de palmipèdes, telles que des canards Barbarie à Yeux Noirs (BYN), des canards Barbarie à Yeux Rouges (BYR), des canards Pékin ou encore des oies, aux fins d'identification de bandes dont le polymorphisme est génétiquement lié au locus du gène SLC45A2 qui participe à la coloration des yeux et permettant de retrouver, le cas échéant, l'origine de parenté dudit échantillon. Par l'origine de parenté, on entend qu'il est possible, le cas échéant, de retrouver la lignée parentale dont est issu l'échantillon. Par exemple, s'il s'agit d'un mulard mâle ou femelle, il est possible de savoir si le père était 15 de l'espèce canard Barbarie à yeux rouge (BYR). Par « population » de palmipède, on entend un groupe de palmipèdes d'une même espèce, à savoir canards Pékin, Barbarie ou oies Anser anser ou oies Anser cygnoides et présentant éventuellement en plus des caractéristiques phénotypiques particulières comme par exemple la 20 couleur des yeux : YR ou YN (une population peut correspondre à des canards Barbarie YR ou des canards Barbarie YN ou des canards Pékin). Pour la présente invention, une amorce est une courte séquence d'oligonucléotides qui, hybridée avec une matrice d'acide nucléique, permet à une polymérase de synthétiser un nouveau brin de l'ADN. Le brin produit 25 à partir de l'amorce est complémentaire au brin utilisé comme matrice. .En particulier une amorce sens est utilisée avec une amorce anti-sens afin d'amplifier un fragment d'acide nucléique (amplicon) par PCR. La présente invention découle de la mise en évidence par la Demanderesse de l'altération de la région promotrice d'un gène majeur de 30 la coloration des yeux chez les palmipèdes, à savoir le gène SLC45A2, et du fait que le polymorphisme de ce gène chez les palmipèdes et notamment chez les canards Barbarie est une caractéristique de l'appartenance à la lignée BYR ou BYN. Selon une première variante de réalisation, le au moins un couple d'amorces 5'-3' utilisé est défini de la manière suivante: - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce Olig-1000 représentée par la séquence SEQ ID NO : 50 suivante: 5' TTCAGCAGATAATCACTCTGACGAATTGC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 50, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 54 suivante: 5' CTCGTCCCCATTGAGGTACAAAGCC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1990 bp sur ledit profil électrophorétique. Selon une deuxième variante de réalisation, le au moins un couple d'amorces peut être également défini de la manière suivante: - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce Olig-800 représentée par la séquence SEQ ID NO : 51 suivante: 5' ACTTACTTTACAGCACACCCAGGTTTT 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 51, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 54 susmentionnée ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1790 bp sur ledit profil électrophorétique. De préférence, le milieu réactionnel comprend un couple d'amorces apte à permettre l'identification du sexe dudit palmipède. Selon une caractéristique de l'invention, ledit couple d'amorces apte 35 à permettre l'identification du sexe est défini de la manière suivante: - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce AWS03 S représentée par la séquence SEQ ID NO : 60 suivante : 5' ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 60, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce USP3 -C3 AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 61 suivante : 5' AGCTGGACTTCAGTGCATCTTCT 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 61, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides. La présente invention a également pour objet un kit d'identification d'individus ou de populations de palmipèdes par identification de la région promotrice du gène SLC45A2 mis en oeuvre par le procédé d'identification susmentionné, kit comprenant les réactifs appropriés pour l'amplification de la région promotrice du gène SLC45A2 à partir d'un échantillon prélevé dans l'environnement (fèces, plume, etc.) ou sur un animal issu d'une population choisie parmi les palmipèdes, caractérisé en ce que le kit comprend : - un couple d'amorce permettant d'amplifier un fragment de la région promotrice du gène SLC45A2, -des dNTPs et des polymérases présentes en large excès dans le milieu réactionnel - les composants (tampon, eau, sels, ...) nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification par PCR Selon une première variante de réalisation, le au moins un couple d'amorces 5'-3' utilisé est défini de la manière suivante: - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce Olig-1000 représentée par la séquence SEQ ID NO : 50 suivante : 5' TTCAGCAGATAATCACTCTGACGAATTGC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 50, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 54 suivante : 5' CTCGTCCCCATTGAGGTACAAAGCC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1990 bp sur ledit profil électrophorétique. Selon une seconde variante de réalisation, le kit comprend en outre un autre couple d'amorces défini de la manière suivante: - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce Olig-800 représentée par la 10 séquence SEQ ID NO : 51 suivante : 5' ACTTACTTTACAGCACACCCAGGTTTT 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 51, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, 15 - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 54 susmentionnée ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, 20 de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1790 bp sur ledit profil électrophorétique. De préférence, le kit comprend un couple d'amorces apte à permettre l'identification du sexe dudit palmipède. Préférentiellement, ledit couple d'amorces apte à permettre 25 l'identification du sexe est définie de la manière suivante : - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce AWS03 S représentée par la séquence SEQ ID NO : 60 suivante : 5' ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO :60, 30 notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce USP3 -C3 AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 61 suivante : 5' AGCTGGACTTCAGTGCATCTTCT 3' ou toute séquence 35 complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO :61, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 10 qui concernent respectivement, - La figure 1 représente le schéma de croisement entre un canard Barbarie mâle et une cane Pékin femelle ; - La figure 2 est un tableau représentant l'ensemble des gènes étudiés impliqués dans certaines formes d'albinisme dans différentes espèces ou impliqués dans la pigmentation des yeux et des phanères; - La figure 3 représente deux schémas montrant les profils d'expression des gènes de la figure 2 étudiés par PCR quantitative, le gène CECR2 du tableau de la figure 2 étant nommé gène CAT sur cette figure. En particulier, ces schémas indiquent la répartition par rapport à la moyenne de l'expression des gènes dans une cohorte de 11 échantillons prélevés sur des individus indépendants appartenant à la lignée Barbarie BYR (Figure 3a) et de 11 échantillons prélevés sur des individus indépendants appartenant à la lignée Barbarie BYN (Figure 3b) ; - La figure 4 est un graphique illustrant le ratio YN/YR de l'expression relative des différents gènes mentionnés entre les souches BYN et BYR, obtenus à partir de l'analyse de 23 échantillons prélevés sur des individus indépendants; - La figure 5 représente la séquence des amplicons obtenus à partir des Canards Pékin (4V), de deux individus (5N et 6N) de canards de la souche Barbarie BYN et de deux individus (4R et 12R) de canards de la souche Barbarie BYR; - La figure 6 représente le profil électrophorétique résultant de l'amplification par PCR semi-quantitative du niveau relatif d'expression du gène SLC45A2 dans les mRNAs obtenus à partir des yeux de deux embryons de canards de la souche Barbarie BYN (N1 et N2) et de deux embryons de canards de la souche Barbarie BYR (R1 et R2) et d'un canard Pékin (V1) en utilisant 4 couples d'amorces: Olig1S - 1AS, Olig2S - 2AS, Olig2S - 1AS et Olig1S - 2AS ; - La figure 7 représente des profils électrophorétiques résultant de l'amplification par PCR semi-quantitative du niveau relatif d'expression du gène SLC45A2 dans les mRNAs obtenus à partir des yeux de cinq embryons différents issus des souches Barbarie BYN (A), Barbarie BYR (C), de Mulards issus de père Barbarie BYN de phénotype YN (B) et de Mulards issus de père Barbarie BYR de phénotype YR (D) en utilisant l'amorce Olig 2S et Olig 2AS (bande sur le profil électrophorétique à 1556 bp); - La figure 8 représente le profil électrophorétique résultant de l'amplification par PCR génomique du promoteur du gène SLC45A2 à partir de l'ADN génomique de deux individus de la souche Barbarie BYN, de deux individus de la souche Barbarie BYR et d'un canard Pékin YN (P) en utilisant 4 couples d'amorces : Olig-1000 et Olig ADN 2AS ; Olig-800 et Olig ADN 2AS ; Olig-500 et Olig ADN 2AS, et Olig ADN 1S et Olig ADN 2AS - La figure 9 représente le profil électrophorétique résultant de l'amplification par PCR génomique de différents fragments du gène SLC45A2 à partir de l'ADN génomique de deux individus de la souche Barbarie BYN, de deux individus de la souche Barbarie BYR et d'un canard Pékin (YN) en utilisant 3 couples d'amorces : Olig ADN 1S et Olig ADN 4AS, Olig ADN 4S et Olig ADN 5AS, et Olig ADN 5S et Olig ADN 8AS ; - La figure 10 représente des profils électrophorétiques résultant de l'amplification par PCR génomique du promoteur du gène SLC45A2 en utilisant le couple d'amorce Olig-800 et Olig ADN 2AS à partir de l'ADN génomique de 16 échantillons (D1 à D16) issus d'individus Mulards issus du croisement d'un mâle de la souche Barbarie BYR de phénotype YR et d'une femelle Pékin aux yeux noirs pris au hasard en suivant le procédé selon l'invention. L'amplification est observée ou est absente (figure 10 A) en parfaite corrélation avec le sexe des individus (figure 10 B). I) Identification de l'origine génétique du phénotype Yeux Rouges (YR) chez un palmipède et en particulier chez le canard Barbarie Dans une approche de recherche de gènes candidats, les profils 5 d'expression d'un nombre restreint de gènes ont été comparés entre les deux lignées BYR et BYN afin de déterminer d'éventuelles différences dans les niveaux d'expression pouvant résulter d'évènements génétiques comme des mutations ponctuelles, des délétions, des insertions virales ou des modifications de structure dans la phase codante. Le tableau de la figure 2 10 présente une liste restreinte de quelques candidats et dont les niveaux d'expression ont été analysés par RT-PCR pour la présente invention dans les yeux des embryons de différentes souches. 1.1 Les souches de palmipède utilisées Les souches utilisées sont des canards correspondant à des animaux 15 de génotypes Pékin à yeux noirs (PN), Barbarie à yeux noirs (BYN) et Barbarie à yeux rouges (BYR). Aucune souche de canard Pékin à yeux rouges n'a été actuellement référencée ou répertoriée. Des échantillons d'hybrides mulards résultants du croisement entre des mâles BYR avec des femelles Pékin YN ont également été utilisés et testés. Dans ces 20 croisements, les phénotypes YR et YN obtenus et observés sont strictement corrélés au sexe. Ainsi, comme résultat de la dominance observée du caractère noir sur le caractère rouge, les mulards mâles obtenus d'un père BYR ont les yeux noirs alors que les femelles ont les yeux rouges. A l'inverse, les mâles Mulards obtenus d'un père BYN ont les yeux noirs 25 comme les femelles qui présentent des yeux noirs. 1.2 Prélèvement Les prélèvements sont réalisés sur le lieu de production des oeufs et des embryons afin d'optimiser la qualité des embryons et des échantillons biologiques. Les yeux sont prélevés par dissection des embryons après 30 lavage dans du PBS (soluté physiologique avec tampon phosphate). Des prélèvements des yeux sont réalisés soit pour l'analyse de l'expression via une détection par réaction de polymérisation en chaîne PCR semiquantitative (Point II de la présente description) ou quantitative dite aussi PCR en temps réel (point I de la présente description) soit pour l'analyse 35 génomique par PCR génomique (point III de la description). Les embryons Pékin sont prélevés vers 12-13 jours, les embryons mulards vers 14 jours et les embryons Barbarie vers 15-16 jours d'incubation afin d'obtenir des stades de développement comparables. En effet, les durées totales d'incubation sont respectivement de 28, 31 et 35 jours pour les canards Pékin, Mulards et Barbarie. Pour l'ADN génomique, le sang est prélevé directement au niveau d'une veine de l'aile dans un tube à prélèvement contenant du citrate pour prévenir la coagulation. Pour chaque série, la moitié des prélèvements a été directement mise dans 0,5 mL de milieu de lyse pour l'acide ribonucléique : RNA (RNA- Bee® commercialisé par Amsbio ou Trizol® commercialisé par Invitrogen) et l'autre moitié dans 0,5 mL de milieu de lyse pour l'obtention d'acide désoxyribonucléique(DNA) décrit ci dessous. Ainsi pour chaque individu, l'analyse est possible à la fois au niveau expressionnelle et génomique. 1.3 Traitement des échantillons Les prélèvements sont maintenus au froid (4°C) et traités directement par série de 5 échantillons à la fois. L'extraction des RNA est réalisée selon le protocole d'extraction à base de guanidium/isothiocyanate et de phénol avec la solution RNA-Bee® (Amsbio) ou Trizol® (Invitrogen) avec une étape de dissociation du tissu, de déprotéinisation et de précipitation. Une étape de digestion du DNA génomique résiduel a été réalisée par la nucléase DNAse1, suivie d'une purification sur colonne d'affinité Rneasy® (Qiagen) afin d'obtenir la préparation la plus pure possible. La qualité des différents RNA obtenus pour les différents échantillons est satisfaisante comme l'indiquent le dosage réalisé par Nanodrop® avec un ratio des absorbances à 260 nm sur 280 nm compris entre 1,9 et 2,1 et le profil satisfaisant obtenu par dépôt sur gel d'agarose 1% avec la présence classique des bandes 28S et 18S correspondants aux ARNs ribosomaux majoritaires dans les cellules. Les échantillons de RNA sont conservés à -80°C sous la forme d'aliquots. L'ensemble des échantillons a donné des quantités de 15 à 30 dag de RNA total permettant l'approche envisagée de détection de certains gènes candidats. 1.4 Dessins des amorces La connaissance du génome du canard Pékin Anas platyrhynchos est récente par la mise ligne d'une première version d'assemblage de ce génome donnée par le site Ensembl (http://pre.ensembl.org/Anas platyrhynchos/Info/Index). Même si elle est incomplète et ne renseigne que l'espèce Pékin, cette pré-version permet néanmoins de dessiner des oligonucléotides dans le fond génétique canard Pékin, de les tester dans le fond génétique canard Barbarie afin d'identifier l'expression relative des différents gènes candidats de la figure 2 et leur 10 structure génomique dans les deux souches BYN et BYR des canards Barbarie comparativement au canard Pékin de référence. Le dessin des amorces est réalisé à l'aide du logiciel Primer 3. Afin de déterminer les amorces, les différentes séquences des cDNAs (ADN complémentaires) de l'espèce canard Pékin Anas platyrhynchos ont été 15 sélectionnées sur le site Ensembl (figure 1 et SEQ ID NO :1 à 15) et soumises pour le dessin des amorces Sens (S) et Anti-Sens (AS) avec les paramètres préférentiels d'une taille des amorces de 20 nucléotides, d'une taille de l'amplicon de 150 à 250 nucléotides environ, d'un TM de 60°C. Ces différents paramètres sont définis à partir des choix proposés par le site de 20 dessin et selon les recommandations d'une optimisation de la PCR quantitative (Applied). Les séquences des oligonucléotides (voir Tableau 1) ainsi dessinées permettent la synthèse des amorces spécifiques, synthèse réalisée par la suite par la société Eurogentec. Les amorces convenant pour la détection et la quantification des 25 niveaux d'expression des RNAs sont listées dans le tableau (Tableau 1) ci-dessous : PCR Quantitative Gène SEQ ID NO Amorce Sens 5' 3' SEQ NO Amorce Anti-Sens 5' 3' étudié ID ALDH 16 ACTGCCAGAACCACTCAAAGA 17 GTGATCCAAGCTCAAAAGCTG CAT 18 GGTTCTCAACTGTTGCTGGAG 19 AAAGACTCAGGGCGAAGACTC EDN3 20 GCTGAAGCTCAGAAGCAAGAA 21 ATATTCCCTGCCAGGTTATGC EDNRB 22 CTGCACATCATCATCGACATC 23 ACTTTGGCACTCCAATTCCTT GPR143 24 GTCCCTGTCCAGTTGTGAAAA 25 TC C GTGTAAATC C CTTGTCTG LRP6 26 AGAAGCAAACTGCCAAGACAA 27 ATGG AG C CTATC GTGTTGTTG MLPH 28 AGGAAGCTGGATCTCTCCAAG 29 TGGGACTGATTTGTCAGGAAC OCA2 30 CCACTGCTGAAGGTCTCCTC 31 ACTTGGCATGAAGGTTGTCC PAX6 32 CACCACTTCCACAGGTCTCAT 33 TGTGTTACAGCATAGGGCACA RPS17 34 AACGACTTCCACACCAACAAG 35 CTCCTCCTCCTGGAGTTTGAT SLC45A2 36 CCAGAGGGAAAGAGAAGGCTA 37 GATCACTGGCTGAACCTACCA TBP 38 CCAGCTCTTCCACTCACAGAC 39 CTCATGATCACAGCAGCAAAA TBX5 40 AGGATCCCTTCTACAGGTCCA 41 AGGTGAAGTGGGCAGAGAAAT TYR 42 ACACAGGCCCATCCTAGAAGT 43 CCTGGAAAGAATCAAGTGCTG TYRP1 44 TGGAAACACACCACAGTTTGA 45 GCAAAGTTCCAGTAGGGAAGG 1.5 Détection de l'expression de différents gènes exprimés dans les yeux embryonnaires L'analyse de l'expression de 15 gènes dont les deux gènes de ménage RSP17 et TBP est réalisée sur 11 échantillons indépendants prélevés sur des individus différents par PCR quantitative respectivement dans les souches BYN et BYR. Le niveau d'expression est mesuré pour les gènes ALDH1, CECR2 (CAT), EDN3, EDNRB, GPR143, LRP6, MLPH, OCA2, PAX6, SLC45A2, TBX5, TYR, TYRP1 comparativement aux gènes de ménages RSP17 et TBP. A partir des acides ribonucléiques messagers (mRNAs) extraits dans les différents échantillons (étape 1.3), une réaction de PCR quantitative est réalisée après une étape de reverse transcription. 1 dag de mRNA sont reverse transcrits pendant 1 heure à 50°C dans un mélange contenant 0,5 mM dNTP, 250 ng d'un mélange d'héxanucléotides de séquence aléatoire (Random Primer, Proméga), 4pL de tampon 5X (First Strand Buffer, Invitrogen) composé de 250mM Tris-HCL pH 8.3, 375mM chlorure de potassium, 15mM chlorure de Magnesiumoride, 50mM DU, 40 unités d'inhibiteur de ribonucléase (RNaseOut®, Invitrogen), 200 unités de reverse transcriptase (Superscript IIIC)' Invitrogen) et de l'eau exempt de nucléase pour ajuster le volume à 20 pL, selon les indications du fournisseur (Invitrogen). A l'issue de cette étape, 2 pL de cette réaction diluée au Vierne sont utilisés comme matrice pour la réaction de PCR quantitative dans un mélange de 15 pL contenant 7,5 pL d'une solution d'intercalant fluorescent (Mix SyberGreen®, Qiagen® ou Fast Sybr Green Master Applied), permettant le suivi quantitatif de l'amplicon au cours de la réaction d'amplification, 1 pL d'enzyme Taq équivalent à 1 Unité (MPBio) et 5,35 pL d'H20 avec les amorces spécifiques susmentionnées dans le tableau 1 de chacun des gènes à 300 nM. La détection a lieu au cours d'une réaction de 40 cycles composés d'une phase de dénaturation à 95°c pendant 30 secondes, d'une phase d'appariement à 55°C pendant 30 secondes et d'une phase d'élongation à 72°C pendant 30 secondes. Les gènes RSP17 (SEQ ID NO : 10), gène ribosomal, et TBP (SEQ ID NO : 12), gène général de la machinerie de la traduction ont été utilisés comme gène dits « de ménage » ne présentant pas de variations entre les tissus et les échantillons. Ces gènes permettent de quantifier les expressions relatives entre les échantillons et entre les différents tissus. Les réactions de PCR quantitative sont effectuées en plaque de 96 puits dans un appareil MX3000P (Stratagène). Le calcul des expressions relatives est donné par la règle des AACt dans laquelle Ct est défini comme le seuil de détection de l'espèce amplifiée au cours des réactions de PCR. 1.6 Résultat de la PCR quantitative Le résultat de cette PCR quantitative est illustré sur la figure 3. Cette figure montre ainsi que les 11 individus présentant le phénotype YR (figure 3a) sont globalement homogènes entre eux, de même que les 11 individus présentant le phénotype YN (figure 3b). Il ne varie en effet pas plus de 1 à 2 fois. Par conséquent, il est possible de comparer le ratio YN/YR. La figure 4 est ainsi réalisée. Les données de cette figure indiquent un niveau d'expression du gène SLC45A2 environ 40 fois plus important dans la souche BYN que dans la souche BYR. Cette différence peut être obtenue avec les couples d'amorces Olig 1S-1AS pour la détection du gène SLC45A. Par conséquent, après avoir testé différents gènes, il apparait que le gène SLC45A2 présente un différentiel d'expression important entres les souches BYN et BYR à l'inverse de tous les autres gènes testés. Cette différence est observée quel que soit le gène de référence utilisé, RSP17 ou TBP. 1.7 Validation de la PCR quantitative La validation de l'amplification est faite par le sous clonage des séquences amplifiées par la PCR quantitative dans un vecteur de clonage des fragments de PCR (le vecteur pGEM-Teasy® commercialisé par Promega) et par le séquençage des inserts par la société BioFidal à l'issue du criblage des clones obtenus après transformation bactérienne des produits obtenus après la ligation de ces inserts avec le vecteur pGEMLTeasy ®. Le séquençage illustré sur la figure 5 montre que les fragments 35 obtenus sont quasiment homologues de la séquence connue de l'espèce canard Pékin mais avec quelques modifications, sans doute propres à l'espèce Barbarie. Une identité de 93% est observée entre les séquences Pékin et Barbarie. On notera une insertion de 15 nucléotides codant pour 5 acides aminés en phase de lecture détectée dans cette séquence du gène SLC45A2 entre Canard Pékin/Barbarie YR et YN et la séquence prédite de canard Pékin. Cette approche semble ainsi exclure la possibilité d'une mutation de la phase codante, au moins pour la première partie du gène entre les souches YR et YN. Ainsi, le différentiel d'expression trouve sans doute son origine dans une altération de la régulation et de la transcription du gène liée à une structure génomique altérée du promoteur ou de la région promotrice avec des altérations de certains éléments de régulation de ce gène dans la souche BYR. Par conséquent, la région promotrice du gène va être étudiée par la suite par PCR génomique (partir III de la présente demande). II) Profil électrophorétique de l'expression du gène SLC45A2 par PCR semi-quantitative 2.1 Dessins des amorces Le dessin des amorces est réalisé à l'aide du logiciel Primer 3. Afin de déterminer les amorces, la séquence cDNAs (ADN complémentaire) de l'espèce canard Pékin Anas platyrhynchos du gène SLC45A2 (SEQ. ID NO : 11) a été sélectionnée sur le site Ensembl et soumises pour le dessin des amorces Sens (S) et Anti-Sens (AS) avec les paramètres préférentiels d'une taille des amorces de 20 nucléotides, d'une taille de l'amplicon de 150 à 250 nucléotides environ, d'un TM de 60°C. Ces différents paramètres sont définis à partir des choix proposés par le site de dessin et selon les recommandations d'une optimisation de la PCR quantitative (Applied). Les séquences des oligonucléotides ainsi dessinées permettent la synthèse des amorces spécifiques, synthèse réalisée par la suite par la société Eurogentec. Les amorces convenant pour la détection et la quantification des niveaux d'expression des mRNAs pour la PCR semi-quantitative sont les suivantes : Barbarie Cairana moschata Olig 1S: 5' CCAGAGGGAAAGAGAAGGCTA 3' (SEQ ID NO:36) Olig 1AS: 5' GATCACTGGCTGAACCTACCA 3' (SEQ ID NO:37) Olig 2S: 5' ATGACCCGCGCTCCATGTCA 3' (SEQ ID N0:46) Olig2 AS: 5' CTACCCCACATATCGAACACAA 3' (SEQ ID N0:47) Ces amorces ont ensuite été testées sur la séquence du cDNA du gène SLC45A2 de la souche BYN qui a été clonée et séquencée par la 5 présente Demanderesse (SEQ ID NO: 48). 2.2 Traitement des échantillons L'analyse de l'expression du gène SLC45A2 dans les souches BYN et BYR peut être réalisée et visualisée par PCR semi-quantitative à partir des 10 échantillons prélevés sur les embryons (obtenus à l'étape 1.3). Après une étape préalable de reverse transcription (identique à celle décrite dans le paragraphe 1.5), la réaction de PCR est réalisée dans 20 pL composé de 2 pL de tampon 10x, de 0,4 pL de la solution de dNTP à 0,5 mM, de 250 nM de chaque amorces Sens (Olig 1S et Olig 2S) et Anti-Sens 15 (Olig 1AS et Olig 2AS) et de 1 U d'enzyme Taq (MPBio) selon les recommandations du fabricant. A l'issue de 35 cycles composés d'une phase de dénaturation à 95°C pendant 30 secondes, d'une phase d'appariement à 55°C pendant 30 secondes et d'une phase d'élongation à 72°C de 30 secondes pour les petits 20 fragments (bandes A et C de la figure 6) à 4 minutes pour les plus grands fragments (bande B et D de la figure 6), les produits d'amplification sont déposés sur gel d'agarose 1%. 2.3 Détection du profil électrophorétique résultant de l'amplification par PCR semi-quantitative du niveau relatif 25 d'expression du gène SLC45A2 (figures 6 et 7) Les fragments ont été amplifiés à l'aide de différents couples d'amorces (Olig 1S- Olig 1AS et Olig 2S -Olig 2AS) comme illustré sur la Figure 6 à partir du matériel génétique de deux individus différents pour la population BYR et BYN. Le profil du canard Pékin (V1) de référence est 30 indiqué. Les différents appariements comme mentionnés permettent de détecter le fragment amplifié ou son absence relative. En effet, les deux individus de la souche Barbarie BYR ne présentent pas la bande B à 1556 bp (paire de bases). Par conséquent, il est possible 35 de déterminer à partir d'un échantillon des yeux embryonnaires si un palmipède et notamment un canard présente les yeux rouges ou non, à savoir respectivement s'il y a absence de la bande B à 1556 bp, le canard présentera le phénotype YR et si il y a une bande B, il présentera le phénotype YN. De même, s'il y a absence de bande D, l'individu Barbarie présente le phénotype YR, dans le cas contraire, il est de phénotype YN. Les bandes A et C sont détectables dans les différents individus et attestent de la qualité et de la bonne réalisation de la réaction de PCR avec différents couples d'oligonucléotides. En utilisant les couples d'oligonucléotides Olig 2S-Olig 2AS et Olig 1S-Olig 2AS, il est ainsi possible de discriminer l'origine de l'échantillon selon son origine YN ou YR par la variation de niveau d'expression. Cette 10 détection peut servir de test à l'identification de ces souches. La figure 7 illustre des profils électrophorétiques résultant de l'amplification par PCR semi-quantitative du niveau relatif d'expression du gène SLC45A2 en utilisant le couple d'amorce Olig 2S-Olig 2AS. Les échantillons sont obtenus à partir d'individus de souches Barbarie BYN (A), 15 Barbarie BYR (C) et de mulards obtenus soit de père BYN (B), soit de père BYR (D). Les individus pour lesquels on peut détecter par amplification une bande à 1556 bp (flèches) dans leur mARN ont un phénotype YN. Ainsi, les individus A2, A8, All, A15, A19, C2, Cl, C7, C3, C10 et D6 présentent le 20 phénotype YN. En effet, A2, A8, All, A15 et A19 sont des échantillons issus de canards de la souche Barbarie YN et C2, Cl, C7, C3 et C10 sont des échantillons provenant de mulards issus de père Barbarie YN et de cane de Pékin YN et qui donc, présentent bien un phénotype YN. Pour l'individu D6, il s'agit d'un mulard issu d'un père Barbarie BYR avec une cane Pékin YN 25 (voir figure 1). Par conséquent, comme cet individu D6 à les YN (la bande est détectée), alors on peut en déduire qu'il s'agit d'un mulard mâle. D10, D7 et D3 sont au contraire des mulards femelles à YR. Leur profil électrophorétique ne présente pas de bande à 1556 bp. De même, B3, B5, B6, B9et B14 sont des individus présentant un phénotype YR car leur profil 30 électrophorétique ne présente pas de bande à 1557 bp. Il s'agit en effet d'échantillons issus de la souche Barbarie BYR. Ainsi, il apparaît que les souches peuvent être discriminées par l'absence de bande amplifiée à 1556 bp par les amorces Olig 2S-Olig 2AS et Olig 1S-Olig 2AS dans les individus YR. Cette approche peut également 35 identifier les individus mâles et femelles dans les croisements mulards issus d'un père YR (figure 1), mais pas dans les croisements mulards issus d'un père YN. III) Profil électrophorétique du gène SLC45A2 par PCR génomique Pour étudier le profil électrophorétique du gène SLC45A2 par PCR génomique, on part du même matériel de départ, à savoir les souches de 5 palmipèdes du point 1.1 susmentionné et on utilise la même méthode de prélèvement qui figure au point 1.2. 3.1 Traitement des échantillons Les prélèvements sont maintenus au froid (4°C) et traités directement par série de 5 échantillons à la fois. L'extraction des DNA des 10 échantillons est effectuée selon le protocole SDS Proteinase K. Les échantillons sont directement mis dans le tampon de lyse qui contient 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 10 mM Tris HCI pH 7,5 et 0,2% SDS. La protéinase K (Invitrogen) est ajoutée à la concentration finale de 1 pg/mL et les échantillons incubés pendant 12h à 45°c. De la ribonucléase A (RNAseA, 15 Promega) à 1pg/mL finale est ajoutée pendant 1 heure à 37°C avant l'extraction phénolique par addition de Phénol/Chloroforme/Isoamyl (25 :25 :1 vol/vol) saturé avec 10nM Tris pH 8, 1mM EDTA. La phase aqueuse est précipitée par addition de 2,5 volumes d'éthanol absolu et 0,3M NaAcétate pH 5,3, puis rincée par de l'éthanol 70%. Le dosage et la qualité 20 de l'ADN génomique ainsi extrait sont vérifiés par dosage au Nanodrop® et par dépôt sur gel. 3.2 Dessins des amorces Pour les amorces utilisées pour la détection des fragments génomiques, la séquence génomique du gène SLC45A2 25 (ENSAPLG000000003346, SEQ ID NO :49) est obtenue de la pre-version du génome donnée par le site Ensembl (http://pre.ensembl.org/Anas platyrhynchos/Info/Index). La séquence est directement copiée dans un fichier et analysée à l'aide du logiciel NTi (Invitrogen) permettant une visualisation de l'ensemble des nucléotides 30 dans ce fragment. Le positionnement théorique des introns et des exons est proposé par Ensembl suite à l'annotation automatique réalisée (figures 7 et 8). Cette carte théorique permet de proposer des amplifications de différents fragments comme indiqué. Les amorces suivantes ont été trouvées : Olig-1000 S: 5' TTCAGCAGATAATCACTCTGACGAATTGC 3' (SEQ ID N0:50) Olig-800 S: 5' ACTTACTTTACAGCACACCCAGGTTTT 3' (SEQ ID N0:51) Olig-500 S: 5' AAATAATCAGTTTATCGAGGGTGGCACAG 3' Olig ADN 1S:5' TGTGAGTCCCTCCCCCACTGC 3' (SEQ ID N0:53) Olig ADN 2AS: 5' CTCGTCCCCATTGAGGTACAAAGCC 3' (SEQ ID N0:54) Olig ADN 4S: 5' AGGAGCCCTGGGTTACCTGACA 3' (SEQ ID N0:55) Olig ADN 4AS: 5'ATACTTCCTGGGGTCAGTCACTTCCA 3' (SEQ ID N0:56) Olig ADN 5S: 5' AGACTCAAAGGCGGATGACCCT 3' (SEQ ID N0:57) Olig ADN 5 AS: 5'CCTGTCCCATGAAATCCGTGAAGAA 3' (SEQ ID N0:58) Olig ADN 8 AS: 5'CTACCCCACATATCGAACACAAAAACA 3' (SEQ ID N0:59). 3.3 Détection de la structure génomique du locus SLC45A2 chez le canard (figures 8 et 9) Les ADN génomiques des canards Pékin et des canards Barbarie YN et YR sont analysés au niveau du locus SLC4522. Comme illustré sur la Figure 8 avec le profil obtenu pour deux individus différents, on remarque une absence d'amplification dans les mêmes conditions des fragments qui couvrent la région promotrice. Les couples d'amorces Olig-1000 S- Olig ADN 2AS (absence bande A) et Olig800 S-Olig ADN 2AS (absence bande B) ne permettent pas d'amplification à partir du matériel génétique de la souche Barbarie BYR contrairement à la souche Barbarie BYN (pistes A et B). Des bouleversements de structure sont donc présents (piste C). Pour la souche Pékin (P), une amplification est également possible et donne un profil similaire à BYN, mais différent par les tailles des amplicons amplifiés (les bandes A à B de canard Pékin n'ont pas la même taille que les bandes A et B de canard BYN). Ainsi, grâce au couple d'amorces Olig-1000 S- Olig ADN 2AS (absence bande A) ou Olig800 S-Olig ADN 2AS (absence bande B), il est possible de distinguer une population de canard Pékin d'une population de canard Barbarie. Comme illustré sur la Figure 9, la structure prédite du gène SLC45A2 donnée par la version de Pre-Ensembl indique la présence de 8 exons codants séparés par des introns de taille variable. Les différents fragments amplifiables entre ces éléments indiquent que la structure du gène est conservée entre les souches BYN et BYR et très similaire au profil obtenu pour le Canard Pékin. En particulier, les pistes A, B et C donnent respectivement des amplifications de 5196 bp environ avec les amorces olig ADN 1S (cf supra) et Olig ADN 4AS, de 4267 bp environ avec les amorces Olig ADN 4S et Olig ADN 5AS et de 5282 bp avec les amorces Olig ADN 5S et Olig ADN 8AS. La structure du gène n'est donc pas modifiée sensiblement dans les différentes souches et espèces testées. La différence phénotypique n'est 5 donc pas liée à une modification majeure de la structure du locus dans sa partie codante. Ainsi, les différents couples d'amorces utilisés permettent de conclure à la conservation de la structure globale du gène dans sa partie codante (figure 9), mais à des modifications structurelles importantes dans 10 la région promotrice de ce gène pour la souche BYR. En effet, les produits de la PCR génomique ne sont pas identiques entre les souches YN et YR. 3.4 Identification du phénotype et du sexe des animaux par analyse moléculaire génomique du gène SLC45A2 dans des échantillons issus de croisements Mulards (figure 10) 15 Les échantillons d'ADN génomique obtenus de 16 individus issus du croisement Mulards entre un mâle Barbarie YR et femelle Pékin YN sont analysés par PCR génomique pour détecter la structure du promoteur du gène SLC45A2 à l'aide des amorces Olig-800 et Olig ADN 2AS qui permet de détecter la présence ou l'absence d'un amplicon de 1790 bp (figure 10A). 20 En parallèle, le sexe de ces mêmes individus est analysé par la détection de l'amplicon AWS03/UPS3 comme décrit dans Itoh et al., 2011. Cette détection est réalisée à l'aide des oligonucléotides AWS03 S et USP3- C3 AS permettant d'amplifier une bande de 190 nucléotides pour les seuls individus femelles. Le contrôle interne de l'amplification et de la présence du 25 matériel est réalisé par l'amplification d'un fragment de 250 nucléotides du gène Int obtenus avec les oligonucléotides INT-F et INT-R (figure 10B). La séquence des oligonucléotides est celle donnée dans la référence bibliographique Itoh et al., 2011. La liste des amorces permettant le sexage des animaux est la 30 suivante: AWS03 S (amorce sens): ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA (SEQ ID NO :60); USP3-CJ AS (amorce anti sens) : AGCTGGACTTCAGTGCATCTTCT (SEQ ID NO :61); 35 INT-F (amorce sens) : ATAGAAACAATGTGGGAC (SEQ ID NO :62) et, INT-R(amorce anti-sens) : CTCTGTCTGGAAGGACTT (SEQ ID NO :63). Ainsi, il apparaît une parfaite corrélation entre la détection de l'amplicon du gène SLC45A2 de 1500 nucléotide, spécifique des individus YN 5 et l'absence d'amplicon à 190 nucléotides (individus D1, D2, D6, D7, D8, D11, D12 D13 et D15). Ces individus sont mâles. A l'inverse, l'absence d'amplicon pour le gène SLC45A2 pour les individus D3, D4, D5, D9, D10, D14, D16, spécifique des individus YR corrèle parfaitement avec la détection de la bande de 190 nucléotides, 10 spécifiques des individus femelles. Ainsi, par une double PCR sur de l'ADN, il est possible de déterminer le caractère YR et YN des individus testés parfaitement corrélé avec leur sexe. 15 Bien que l'invention ait été décrite en relation avec plusieurs modes de réalisation particuliers, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention. 20 Références bibliographiques April CS, Jackson IJ, Kidson SH. (1998). The cloning and sequencing of a cDNA coding for chick tyrosinase-related protein-1. Biochim Biophys Acta. 1395: 7-12. Bhat SP, Rayner SA, Chau SC, Ariyasu RG. (2004). 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Sturm RA. (2009) Molecular genetics of human pigmentation diversity. Hum Mol Genet. 18(R1):R9-17. Review. Vaez M, Follett SA, Bed'hom B, Gourichon D, Tixier-Boichard M, Burke T. (2008). A single point-mutation within the melanophilin gene causes the lavender plumage colour dilution phenotype in the chicken. BMC Genet. 9: 10 7. REVENDICATIONS1. Procédé d'identification de populations de palmipèdes, ledit procédé étant effectué à partir d'un échantillon biologique prélevé sur l'animal, notamment à partir d'une plume, d'un échantillon de sang ou des fèces, et permettant de vérifier l'appartenance ou la non-appartenance de l'animal sur lequel a été prélevé ledit échantillon biologique à une population de palmipèdes, ce procédé comprend : - l'amplification de la région promotrice du gène SLC45A2 dudit échantillon dans un milieu réactionnel comportant au moins un couple d'amorces par une PCR 10 génomique, de sorte à obtenir ou non des produits d'amplifications, - la séparation des produits d'amplification par électrophorèse sur gel selon leur taille, et - la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus à partir de différentes populations de palmipèdes, telles que des canards Barbarie à Yeux Noirs (BYN), des 15 canards Barbarie à Yeux Rouges (BYR), des canards Pékin à Yeux Noirs (PYN) ou encore des oies, aux fins d'identification de bandes dont le polymorphisme est génétiquement lié au locus du gène SLC45A2 qui participe à ta coloration des yeux et permettant de retrouver, le cas échéant, l'origine de parenté dudit échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le au moins un couple 20 d'amorces 5'-3' utilisé est défini de la manière suivante: - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce Olig-1000 représentée par la séquence SEQ ID NO :50 suivante : 5' TTCAGCAGATAATCACTCTGACGAATTGC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 50, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, 25 - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 54 suivante : 5' CTCGTCCCCATTGAGGTACAAAGCC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1990 bp sur ledit profil 30 électrophorétique. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel te au moins un couple d'amorces 5'-3' présent dans le milieu réactionnel est également défini de la manière suivante:- l'amorce 5' est choisie parmi t'amorce Olig-800 représentée par la séquence SEQ ID NO : 51 suivante : 5' ACTTACTTTACAGCACACCCAGGTTTT 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 51, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - t'amorce 3' est choisie parmi l'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 54 susmentionnée ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1790 bp sur ledit profil 10 électrophorétique. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, dans lequel le milieu réactionnel comprend un autre couple d'amorces apte à permettre l'identification du sexe dudit palmipède. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ledit couple d'amorces apte à 15 permettre l'identification du sexe est défini de la manière suivante : - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce AWS03 S représentée par la séquence SEQ ID NO : 60 suivante : 5' ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 60, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, 20 - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce USP3 -CJ AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 61 suivante : 5'AGCTGGACTTCAGTGCATCTTCT 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 61, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides. 6. Kit d'identification d'individus ou de populations de palmipèdes par 25 identification de la région promotrice du gène SLC45A2 mis en oeuvre par le procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant les réactifs appropriés pour l'amplification de la région promotrice du gène SLC45A2 d'un échantillon environnementale ou animal issu d'une population choisie parmi les palmipèdes, caractérisé en ce que le kit comprend : 30 - un couple d'amorce permettant d'amplifier un fragment de la région promotrice du gène SLC45A2, - des dNTPs et des polymérases présentes en large excès dans le milieu réactionnel. 7.Kit d'identification selon la revendication 6, dans lequel le au moins un 35 couple d'amorces 5'-3' utilisé est défini de la manière suivante:- l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce Olig-1000 représentée par la séquence SEQ ID NO : 50 suivante : 5' TTCAGCAGATAATCACTCTGACGAATTGC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 50, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - l'amorce 3' est choisie parmi t'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO :54 suivante : 5' CTCGTCCCCATTGAGGTACAAAGCC 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1990 bp sur ledit profil 10 électrophorétique. 8. Kit d'identification selon l'une des revendications 6 et 7, dans lequel le kit comprend en outre un autre couple d'amorces défini de la manière suivante: - l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce Olig-800 représentée par la séquence SEQ ID NO : 51 suivante : 5' ACTTACTTTACAGCACACCCAGGTTTT 3' ou toute 15 séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 51, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, - l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce Olig ADN 2AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 54 susmentionnée ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 54, notamment par suppression et/ou 20 substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de sorte à obtenir, ou non, une bande de 1790 bp sur ledit profil électrophorétique. 9. Kit d'identification selon l'une des revendications 6 et 8, comprenant un couple d'amorces apte à permettre l'identification du sexe dudit palmipède. 25 10. Kit d'identification selon la revendication 9, ledit couple d'amorces apte à permettre l'identification du sexe est défini de la manière suivante : l'amorce 5' est choisie parmi l'amorce AWS03 S représentée par la séquence SEQ ID NO : 60 suivante : 5' ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA 3' ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 60, notamment 30 par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou de plusieurs nucléotides, l'amorce 3' est choisie parmi l'amorce USP3 -CJ AS représentée par la séquence SEQ ID NO : 61 suivante : AGCTGGACTTCAGTGCATCTTCT ou toute séquence complémentaire ou dérivée de cette séquence SEQ ID NO : 61, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides. 35