Brevet FR2985182A1 — publié le 20130705

La présente invention concerne une composition inhibitrice de croissance bactérienne et l'utilisation de cette composition. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION Les infections gingivales et parodontales sont fréquentes dans la population. Elles sont la principale cause du déchaussement des dents. Des études récentes montrent que les parodontites seraient en plus, associées à d'autres pathologies telles que des endocardites infectieuses, des maladies coronariennes, des accouchements prématurés, des pathologies pulmonaires, voire même certains cancers... Une flore bactérienne est toujours présente dans la sphère buccale. Une alimentation équilibrée, une hygiène bucco-dentaire régulière et un bon état de santé général permettent à cette flore de rester stable. Dès lors que l'équilibre est rompu, suite, par exemple, à des modifications hormonales (adolescence, grossesse, ménopause...), à une détérioration de l'état de santé général, une baisse du système immunitaire ou à une mauvaise hygiène bucco-dentaire, certaines espèces bactériennes vont proliférer et provoquer des inflammations des gencives puis du parodonte. Elles vont également être responsables d'halitose (mauvaise haleine) et être associées à la présence d'aphtes. Socransky et al (1998, J. of Clinical Periodontology ; 25 : 134-144) ont démontré que la prolifération des espèces bactériennes du complexe orange et du complexe rouge, telles que Porphyromonas gingivalls (bactérie du complexe rouge) ou Fusobacterium nucleatum (bactérie du complexe orange), était systématiquement corrélée à la présence de parodontites chroniques. De plus, elles favorisent l'apparition et la prolifération des bactéries du complexe violet telles que Aggregatibacter actinomycetemcomitans, systématiquement impliquées dans les gingivites et parodontites aigües. Lorsque les recommandations d'hygiène (alimentation équilibrée, brossage dentaire et inter-dentaire régulier...) ne suffisent plus, les traitements qui sont alors proposés consistent en l'utilisation de bains de bouche antiseptiques, souvent à base d'alcool ou de chlorhexidine, et, dans certains cas, la prise d'antibiotiques. Cependant, les traitements prolongés à base d'antiseptiques et/ou d'antibiotiques, bien qu'efficaces, risquent de provoquer un déséquilibre profond de la flore bactérienne orale, ce qui génère d'autres problèmes comme des mycoses buccales ou l'apparition de lichen plan. Par ailleurs, les populations des pays industrialisés apparaissent comme les plus concernées par ces problèmes de gingivite et parodontite, de mauvaise haleine et d'aphtes, essentiellement dus à une hygiène de vie et une alimentation déséquilibrées. Ces populations sont de plus en plus réticentes à utiliser des produits chimiques ou des antibiotiques pour des problèmes souvent considérés comme mineurs. OBJET DE L'INVENTION Un but de l'invention est de proposer une composition bactériostatique, c'est-à-dire permettant de limiter la prolifération bactérienne, notamment celle de la sphère buccale, sans produits chimiques ni antibiotiques. RESUME DE L'INVENTION En vue de la réalisation de ce but, on propose selon l'invention une composition sans produits chimiques ni antibiotiques à base de décoction de feuilles de papayer utilisée comme agent bactériostatique. Il a en effet été découvert qu'une décoction de feuilles de papayer a un effet bactériostatique et équilibrant qui permet notamment de limiter la prolifération d'au moins une bactérie de la flore bactérienne buccale. La composition objet de l'invention peut en particulier être utilisée pour limiter la prolifération d'au moins une bactérie du complexe rouge ou du complexe orange. La composition, objet de l'invention, est particulièrement efficace pour limiter la prolifération de Porphyromonas gingivalls ou celle de Fusobacterium nucleatum. La composition peut être une solution aqueuse. En particulier, la composition peut être une solution composée exclusivement d'eau et d'extrait de feuille de papayer. L'invention concerne également l'utilisation de la composition objet de l'invention pour limiter la prolifération bactérienne de la sphère buccale. L'invention concerne l'utilisation de la composition pour prévenir ou limiter l'apparition de la mauvaise haleine. L'invention concerne aussi l'utilisation de la composition pour prévenir ou limiter l'apparition des aphtes ou en favoriser la disparition. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le papayer (Carica papaya L.) est une plante connue pour ces nombreux bienfaits nutritionnels et thérapeutiques apportés principalement par sa richesse en vitamines A et E et en enzymes protéolytiques. Ce sont les propriétés protéolytiques des enzymes, en particulier celles de la papaïne et de la chymopapaïne présentes dans le fruit et dans les feuilles fraîches de papayer qui sont utilisées dans les médecines traditionnelles. La composition selon l'invention est une décoction de feuilles de papayer utilisée comme agent bactériostatique. Les feuilles de papayer peuvent être fraîches, mais sont de manière préférentielle préalablement séchées. Les feuilles, qu'elles soient fraîches ou sèches sont broyées dans de l'eau. Une décoction à 95°C est ensuite réalisée, ce qui a pour effet de détruire les enzymes protéolytiques, les rendant ainsi inactives. On qualifie de « bactériostatique », une composition ou un agent capable d'inhiber la multiplication des bactéries sans les tuer. On définit l'effet bactériostatique d'une composition par la mesure de la concentration minimale inhibitrice (CMI), c'est-à-dire la concentration la plus basse d'une composition considérée requise pour inhiber la croissance d'une souche bactérienne in vitro. Les inventeurs ont découvert que l'utilisation d'une décoction de feuilles de papayer sur la flore bactérienne buccale avait pour effet de limiter la prolifération de certaines au moins des bactéries présentes. En effet, la sphère buccale abrite naturellement de nombreuses espèces de bactéries commensales. Des études récentes ont permis de dénombrer près de 700 espèces différentes. Ces bactéries forment une matrice très collante, le biofilm, qui peut notamment adhérer sur les dents ou les gencives. Ce biofilm va parfois se calcifier et former ce qui est appelé le tartre dentaire, mais ce biofilm va le plus souvent se coller sur les surfaces des dents et des gencives et former une sorte de réseau qui va permettre à de nouvelles espèces de bactéries de se développer. Ces bactéries pourront alors être responsables de maladies telles gingivites, parodontites, de manière plus fréquente d'halitose ou d'aphtes. Socransky et al (J Periodontal Res. 2011, Sep 5) a récemment établi que la colonisation bactérienne se faisait toujours dans un ordre identique et préétabli. Cette dernière étude conforte son modèle expliquant la succession des différentes étapes : de l'apparition du biofilm à l'apparition et à la prolifération des bactéries pathogènes, s'il n'y a pas d'hygiène bucco-dentaire suffisante. Ce modèle est représenté sous forme de pyramide colorée. La base de la pyramide est constituée des bactéries commensales non pathogènes du complexe ou groupe pourpre telles que par exemple Veillonela parvula, du complexe bleu telles que Actinomyces sp., du complexe vert telles que Capnocytophage sp. et du complexe jaune telles que Streptococcus sp.. Le milieu de la pyramide constitué par le complexe orange comprend des bactéries pouvant être impliquées dans certaines pathologies. Ainsi, les souches bactériennes du complexe orange sont parodontopathogènes lorsqu'elles atteignent une concentration élevée. Par exemple, pour Fusobacterium nucleatum, la pathogénicité a été établie à 107 CFU/mL. Si la colonisation par ces bactéries n'est pas interrompue par l'hygiène bucco-dentaire ou par un traitement, des bactéries du complexe rouge (représentant le sommet de la pyramide) se mettent à proliférer. Les bactéries du complexe rouge sont systématiquement associées aux gingivites et parodontites chroniques. Parmi celles-ci, on peut citer Porphyromonas gingivalls, qui devient pathogène dès que sa concentration dépasse 103 CFU/pL. Enfin l'extrême pointe du sommet de la pyramide, le complexe violet, comprend des bactéries telles que Aggregatibacter actinomycetemcomitans ou Bacteroides forsythus, systématiquement impliquées dans les gingivites et parodontites agressives. L'homme du métier connaît parfaitement les différentes souches bactériennes de la sphère buccale et saura les identifier (par exemple par analyse par PCR) et déterminer quel est leur complexe d'appartenance. La composition selon l'invention a pour effet de désorganiser la constitution du biofilm agressif et d'équilibrer la flore non agressive. Cet effet sur le biofilm a comme conséquence de limiter la prolifération de certaines espèces bactériennes et ainsi d'empêcher l'apparition des troubles liées tels que l'halitose, les aphtes, les gingivites ou les parodontites. La composition de l'invention est particulièrement efficace à l'encontre des bactéries des complexes orange et rouge. Ainsi, selon l'invention, la composition à base de décoction de feuilles de papayer est utilisée pour limiter la prolifération d'au moins une bactérie du complexe orange ou d'au moins une bactérie du complexe rouge. Porphyromonas gingivalls, souche bactérienne du complexe rouge est particulièrement sensible à la composition de l'invention. Ainsi, ladite composition est avantageusement utilisée pour limiter la prolifération de Porphyromonas gingivalls. Les inventeurs ont montré que la composition mise en suspension dans une solution aqueuse avec une concentration finale de 10% avait un effet inhibiteur sur la prolifération de cette bactérie. La plus petite concentration de la composition conduisant à une totale inhibition de croissance (ou CMI) est de 1% (soit lg de composition pour 100 mL de milieu gélosé). Les inventeurs ont également montré en particulier que la prolifération de Fusobacterium nucleatum, bactérie du complexe orange, était stoppée par la composition. La CMI de la composition, mise en solution aqueuse à 10%, pour cette souche bactérienne est de 1%. La composition objet de l'invention est une décoction de feuilles de papayer fraîches ou sèches. Elle peut prendre différents aspects, de telle sorte qu'elle soit en contact avec la zone à traiter, ici la sphère buccale. A titre d'exemple, la composition à base de décoction de feuilles de papayer peut se présenter sous forme de poudre. Par exemple, après l'étape de décoction à 95°C, il est possible de concentrer et atomiser la décoction afin d'obtenir une poudre. Cette poudre peut ensuite être mise en gélule ou compactée pour former des comprimés. De manière préférée, la poudre pourra être compactée pour réaliser des comprimés dispersibles (hydrodispersibles ou orodispersibles), ce qui facilitera la mise en contact de la composition avec les bactéries de la sphère buccale. L'homme du métier sera à même de choisir l'agent désintégrant le plus adapté. A titre d'exemple, il pourra choisir parmi le glycolat d'amidon sodique, l'amidon de blé ou de maïs, l'amidon prégélatinisé_ La poudre pourra également être conditionnée sous forme de spray, nébullisateur ou aérosol pour une meilleure application et répartition dans la bouche ou la gorge. De manière préférée, la composition prendra la forme de poudre mise en suspension dans une solution liquide. La solution peut être constituée d'eau ou d'alcool ou d'un mélange des deux. L'homme du métier saura parfaitement adapter les concentrations relatives de poudre de feuilles de papayer, d'eau et d'alcool ou ajouter d'autres composés, telles que des arômes ou des colorants. Toutefois, de manière préférée, la composition est une suspension de poudre dans une solution aqueuse. L'homme du métier saura adapter la concentration à l'utilisation et à l'environnement à stabiliser. De manière tout à fait préférée, la solution comprend exclusivement de l'eau et de l'extrait de feuilles de papayer. La concentration qui peut être utilisée de façon standard est de 0,1 gramme de poudre pour 5 cL d'eau environ. Cette solution pourra ensuite être utilisée, par exemple comme bain de bouche ou gargarisme. De manière non limitative, la composition pourra également se présenter sous forme de pastille à sucer ou de gomme à mâcher ou de gel à appliquer sur les gencives. L'invention concerne également l'utilisation de la composition objet de l'invention pour limiter la prolifération bactérienne de la sphère buccale. 35 L'utilisation de la composition de l'invention en désorganisant le biofilm, rendra les dents lisses et nettes et assainira la gencive. L'invention concerne l'utilisation de la composition objet de l'invention pour prévenir et traiter la mauvaise haleine. L'invention concerne l'utilisation de la composition objet de l'invention pour prévenir l'apparition d'aphtes ou les traiter. EXEMPLES 1-Obtention de la composition à base de décoction de feuilles de papayer utilisée comme agent bactériostatique. On fait tremper 5 kg de feuilles de papayer séchées et broyées dans 150 L d'eau. Cette solution est ensuite chauffée pendant 1 heure à 95°C puis filtrée à 100 pm. Le filtrat ainsi obtenu est concentré afin d'obtenir une teneur en matière sèche comprise entre 25 et 30% puis atomisé dans un évaporateur à buses avec comme température d'entrée 300°C et comme température de sortie 105°C. On obtient un peu plus d'un kilogramme de la composition de l'invention sous forme de poudre. 2- Mesure de l'activité bactériostatique in vitro La composition sous forme de poudre obtenue à l'exemple 1 est remise en suspension en solution aqueuse à 10% (10g de poudre pour 100 ml d'eau). Une gamme de dilutions en cascade au est réalisée et chaque dilution est incorporée à hauteur de 1/10ème dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Pétri. La surface de la gélose est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier, selon les indications du NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institue) et du CASFM (Comité de l'antibiogramme de la Société Française de Microbiologie) (2010). a- Souches à étudier Porphyromonas gingivalls Souche AIP bactérie du complexe rouge 103683 Fusobacterium nucleatum Souche CIP 101130T bactérie du complexe orange Actinomyces naeslundii Souche CIP 103128T bactérie du complexe bleu Veillonella sp. Souche AIP 4468 bactérie du complexe pourpre Streptococcus mutans Souche CIP 103220T bactérie du complexe jaune Les suspensions d'inoculation sont à une concentration de 108 bactéries/mL. b- Méthode Les dilutions de la solution ont été préparées extemporanément, selon les indications du NCCLS. Le produit a été testé à partir de la concentration de 10% (P/V), après remise en suspension en solution aqueuse contenant 0,1% de Tween 80. Quinze concentrations à tester (10x) sont directement incluses, sous un volume de 2 mL à 18 mL de milieu gélosé test maintenu en surfusion (gélose Brucella supplémenté en hémine, vitamine K1 et sang laqué). Après solidification, les géloses sont inoculées. Dans ces conditions, la concentration maximale testée est de 1% (P/V). Les suspensions bactériennes sont préparées 20 extemporanément à environ 108 bactéries/mL. Des dénombrements sont réalisés en parallèle. L'inoculation est réalisée à l'aide d'un ensemenceur multipoint sous forme de spots de 1 à 3 pL (soit environ 106 bactéries/spot). Les géloses sont incubées sous anaérobiose à 37 ± 2°C. Des témoins en absence de produit sont réalisés en début et en fin de test et sont incubés en anaérobiose et aérobiose (témoin permettant de vérifier l'absence de contamination) à 37 ± 2°C. Les CMI sont déterminées visuellement comme la plus petite concentration avec absence de croissance visible, par comparaison aux témoins. c- Résultats Les valeurs des CMI sont indiquées dans le tableau ci-dessous en pourcentage poids/volume. Par définition (O.M.S.), la CMI est la plus faible concentration d'un produit donné capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d'une bactérie donnée, appréciable à l'oeil nu, après une période d'incubation donnée. Souches bactériennes Dénombrement des suspensions test (UFC/mL) CMI de la composition testée Porphyromonas gingivalls 2,8 x 108 1% Fusobacterium nucleatum 1,1 x 108 1% Actinomyces naeslundii 1,7 x 108 >1% Veillonella sp. 3,0 x 108 >1% Streptococcus mutans 2,8 x 108 >1% Les croissances de Porphyromonas gingivalis et de Fusobacterium nucleatum sont totalement inhibées en présence de la composition à 1% (1 g pour 100 ml de milieu gélosé). De fait, la CMI de la composition vis-à-vis de ces deux souches est de 1 %. A cette même concentration, les inhibitions de croissance de Actinomyces naeslundii, de Veillonella sp. et de Streptococcus mutans ne sont que partielles, la CMI de la composition vis-à-vis de ces souches est supérieure à 1 % . 3- Mesure de l'activité bactériostatique in vivo a- Effet sur le biofilm et la gingivite Une personne présentant un biofilm très collant et agressif, c'est-à-dire un biofilm visible à l'oeil nu sur la surface dentaire et provoquant une inflammation de la gencive (gencives rouges) utilise pendant 1 mois en bain de bouche et solution dentaire, la composition de l'invention telle qu'obtenue à l'exemple 1 diluée dans de l'eau à raison de 0,1 gramme de poudre dans 5 cL d'eau. Au bout de 15 jours, la surface des dents couvertes par le biofilm a visiblement diminué, l'inflammation des gencives est également en nette diminution : la gencive est moins rouge. Au bout d'un mois, la surface des dents apparait lisse et nette. L'inflammation de la gencive a complètement disparu. b- Effet sur les aphtes et la mauvaise haleine. Une personne se plaignant régulièrement d'aphtes et de mauvaise haleine malgré une hygiène buccale biquotidienne par brossage et bain de bouche est traitée avec la composition de l'invention. Un bactériogramme réalisé sur un échantillon de biofilm montre la présence de Porphyromonas gingivalls à une concentration supérieure à 103 CFU/pL. La poudre obtenue dans l'exemple 1 est diluée à raison de 0,1 gramme de poudre dans 5cL d'eau et utilisée comme solution dentaire et bain de bouche. Après 15 jours d'utilisation biquotidienne, la 35 personne voit disparaître la gêne occasionnée par la présence d'aphtes et la mauvaise haleine. Une nouvelle analyse bactériologique révèle une diminution significative de la quantité de Porphyromonas gingivalls en dessous du seuil de pathogénicité. L'utilisation de la composition à base de décoction de feuilles de papayer perturbe l'organisation du biofilm agressif selon le schéma de Socransky par inhibition du développement de Fusobacterium nucleatum et par conséquent, celui de Porphyromonas gingivalls. Le développement de cette dernière souche bactérienne étant non seulement limité par la faible concentration de Fusobacterium nucleatum mais aussi directement par la préparation objet de l'invention. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à ce qui vient d'être décrit, mais au contraire englobe toute variante entrant dans le cadre défini par les revendications. Bien que l'invention ait été décrite en relation avec la sphère buccale, l'invention est applicable à 20 d'autre partie du corps pour prévenir d'éventuels déséquilibres de la flore commensale.