Brevet FR2978455A1 — publié le 20130201

DISPOSITIF DE CULTURE DE CELLULES NEURONALES ET UTILISATIONS DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un support (1) de culture de cellules neuronales, à l'utilisation de ce support pour la culture de cellules, dans des procédés de criblage et dans des méthodes d'analyse qualitatives et/ou quantitatives de la croissance neuronale et de la synaptogénèse. La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication dudit support. La présente invention trouve une application, notamment dans le domaine de la recherche et de la pharmacie. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte. Etat de la technique Des procédés permettant de cultiver des cellules vivantes sur des substrats avec micro-motifs n'est pas nouvelle. Par un contrôle géométrique précis des zones adhésives déterminant les possibilités d'extension cellulaires, plusieurs études ont révélé que la forme des cellules en culture affecte considérablement la prolifération, la différenciation et la polarité cellulaires (Folkman, J. & Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature 273, 345-9 (1978). [1] Watt, F. M., Jordan, P. W. & O'Neill, C. H. Oeil shape controls terminal differentiation of human epidermal keratinocytes. Proc Nat/ Acad Sci U S A 85, 5576-80 (1988). [2] Thery, M., Racine, V., Pepin, A., Piel, M., Chen, Y., Sibarita, J. B. & Bornens, M. The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis. Nat Ce!! Bic)/ 7, 947-53 (2005). [3] Thery, M., Racine, V., Piel, M., Pepin, A., Dimitrov, A., Chen, Y., Sibarita, J. B. & Bornens, M. 2 Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internai organization and orientation of polarity. Proc Nat/ Acad Sci U S A 103, 19771-6 (2006).[4]). L'approche générale consiste à délimiter des zones adhésives dans un environnement recouvert d'un agent anti-adhésif (cytotophobe), sur lequel la cellule ne peut pas adhérer, confinant ainsi l'extension cellulaire. Un des premiers procédés décrits concerne un dispositif comprenant des îlots adhésifs circulaires de 400 à 2000 pm2 de diamètre réalisés par évaporation de palladium à travers un masque sur une surface sous- 1 0 jacente non-adhésive (Ireland, G. W., Dopping-Hepenstal, P. J., Jordan, P. W. & O'Neill, C. H. Limitation of substratum size alters cytoskeletal organization and behaviour of Swiss 3T3 fibroblasts. Cell Biol Int Rep 13, 781-90 (1989). [5]). Des techniques actuelles plus simples, par exemple des méthodes d'impression à jet d'encre, consistent à déposer des 15 gouttelettes microscopiques d'adhésif de type polylysine sur un substrat non-adhésif comme un revêtement de polyéthylène glycol, mais la résolution est faible, i.e. de l'ordre de 100-200 pm (Sanjana, N. E. & Fuller, S. B. A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture. J Neurosci Methods 136, 151-63 (2004). [6] Yamagata, 20 M., Weiner, J. A., Dulac, C., Roth, K. A. & Sanes, J. R. Labeled fines in the retinotectal system: markers for retinorecipient sublaminae and the retinal ganglion cell subsets that innervate them. Mol Cell Neurosci 33, 296-310 (2006). [7]). Pour définir des micro-structures plus petites, l'impression par 25 microcontact de monocouches auto-assemblées d'alkanethiolates sur un substrat métallique, a été utilisée (Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M. & Ingber, D. E. Micropatterned surfaces for control of cell shape, position, and function. Biotechnol Prog 14, 356-63 (1998). [8]). D'autres solutions micro-lithographiques permettant l'impression de 30 protéines d'adhésion sur des lamelles en verre silanisées ont été 3 développées, utilisant des tampons en élastomère micro-fabriqués à partir d'un masque de chrome (Rozkiewicz, D. I., Kraan, Y., Werten, M. W., de Wolf, F. A., Subramaniam, V., Ravoo, B. J. & Reinhoudt, D. N. Covalent microcontact printing of proteins for cell patterning. Chemistry 12, 6290-7 (2006). [9], Shi, P., Shen, K. & Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Dev Neurobiol 67, 1765-76 (2007). [10], Ladoux, B., Anon, E., Lambert, M., Rabodzey, A., Hersen, P., Buguin, A., Silberzan, P. & Mege, R. M. Strength dependence of cadherin-mediated adhesions. Biophys J 98, 534-42 (2010). [11]), ou une impression directe du substrat de verre ou de PDMS par rayons UV profonds passant à travers un masque en chrome (Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Thery, M. & Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs. Methods Cell Biol 97, 133-46 (2010).[12], Azioune, A., Carpi, N., Fink, J., Chehimi, M. M., Cuvelier, D. & Piel, M. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir 27, 7349-52 (2010). [13]). Une autre technique mise en oeuvre récemment consiste à réaliser un couplage covalent de protéines d'adhésion directement sur une surface via un agent chimique réticulant, activé par un faisceau UV (Fink, J., Thery, M., Azioune, A., Dupont, R., Chatelain, F., Bornens, M. & Piel, M. Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques. Lab Chip 7, 672-80 (2007). [14]). Une approche très récente appelée micro-photo-impression, utilisant un laser bi-photon commandé par ordinateur permettant de réaliser la photo-ablation à l'échelle micrométrique d'un film anti-adhésif de poly-vinyl-alcool, a été envisagée (Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K. & Yamada, K. M. Onedimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Biol 184, 481-90 (2009). [15]) afin de réaliser de nombreuses géométries différentes. 4 Toutefois, ces méthodes sont difficiles à mettre en oeuvre, et impliquent une expertise qui limite souvent leur utilisation à un nombre réduit de laboratoires de recherche fondamentale. Dans le domaine de la neurobiologie cellulaire, des îlots adhésifs assez étendus (50-100 pm) ont été utilisés afin d'isoler individuellement les neurones primaires en culture et de générer des synapses formées par le neurone sur lui-même (autapses) (Allen, T. G. Preparation and maintenance of single-cell micro-island cultures of basal forebrain neurons. Nat Protoc 1, 2543-50 (2006). [16], Wilson, N. R., Ty, M. T., Ingber, D. E., Sur, M. & Liu, G. Synaptic reorganization in scaled networks of controlled size. J Neurosci 27, 13581-9 (2007). [17]). Des systèmes micro-structurés comprenant des lignes adhésives parallèles séparées par des rainures non-adhésives ont aussi été utilisées pour susciter la croissance directionnelle des axones (Yamagata, M., Weiner, J. A., Dulac, C., Roth, K. A. & Sanes, J. R. Labeled lines in the retinotectal system: markers for retinorecipient sublaminae and the retinal ganglion cell subsets that innervate them. Mol Cell Neurosci 33, 296-310 (2006). [7], Wilson, N. R., Ty, M. T., Ingber, D. E., Sur, M. & Liu, G. Synaptic reorganization in scaled networks of controlled size. J Neurosci 27, 13581-9 (2007). [17], Ruardij, T. G., Goedbloed, M. H. & Rutten, W. L. Adhesion and patterning of cortical neurons on polyethylenimine- and fluorocarbon-coated surfaces. IEEE Trans Biomed Eng 47, 1593-9 (2000). [18]). Un article récent a utilisé une technique d'impression par micro-contact a base d'un microscope à force atomique pour créer des zones adhésives de 7-10 pm espacés de 10-20 pm et déposer des protéines de la matrice extracellulaire (fibronectine ou laminine) permettant de contrôler de façon différentielle la croissance des neurones (Fereol, S., Fodil, R., Barnat, M., Georget, V., Milbreta, U. & Nothias, F. Micropatterned ECM substrates reveal complementary contribution of low and high affinity ligands to neurite outgrowth. Cytoskeleton (Hoboken) (2011). [19]). Un autre groupe a utilisé la méthode de micro-impression par contact pour réaliser des îlots rectangulaires de 2- 5 pm séparés de 5-10 pm, et a déposé des protéines neuronales ephrines impliquées dans le guidage axonal et la réorientation du cône de croissance ( von Philipsborn, A. C., Lang, S., Bernard, A., Loeschinger, J., David, C., Lehnert, D., Bastmeyer, M. & Bonhoeffer, F. Microcontact 5 printing of axon guidance molecules for generation of graded patterns. Nat Protoc 1, 1322-8 (2006). [20], von Philipsborn, A. C., Lang, S., Loeschinger, J., Bernard, A., David, C., Lehnert, D., Bonhoeffer, F. & Bastmeyer, M. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development 133, 2487-95 (2006). [21]). 1 o D'autres approches ont également été utilisées, des dispositifs micro fluidiques associés à un substrat de culture permettant de séparer deux populations de neurones différents, de diriger la croissance axonale suivant des lignes pré-determinées et d'établir des contacts synaptiques entre les deux types de neurones (Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, 15 S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W. & Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods 2, 599-605 (2005). [22], Paul, D., Saias, L., Pedinotti, J. C., Chabert, M., Magnifico, S., Pallandre, A., De Lambert, B., Houdayer, C., Brugg, B., Peyrin, J. M. & Viovy, J. L. A "dry and wet hybrid" lithography technique for 20 multilevel replication templates: Applications to microfluidic neuron culture and two-phase global mixing. Biomicrofluidics 5, 24102 (2011). [23]). Ce système est commercialisé par la compagnie Millipore (AXIS device, ref. AX15010). Une amélioration de ce système initial avec un canal micro-fluidique perpendiculaire central permet des stimulations avec des agents 25 chimiques susceptibles d'engendrer une réponse physiologique des neurones (Taylor, A. M. & Jeon, N. L. Micro-scale and microfluidic devices for neurobiology. Curr Opin Neurobiol 20, 640-7 (2010). [24]). Toutefois, ces procédés sont délicats à mettre en oeuvre et ne permettent pas de créer des contacts adhésifs localisés dans l'espace 30 induits par des protéines d'adhérence spécifiquement neuronales, par exemple les molécules d'adhérence de type immunoglobulines (IgCAM) et 6 la N-cadhérine qui jouent un rôle critique dans la migration du cône de croissance et le guidage axonal (Bard, L., Boscher, C., Lambert, M., Mege, R. M., Choquet, D. & Thoumine, O. A molecular clutch between the actin flow and N-cadherin adhesions drives growth cone migration. J Neurosci 28, 5879-90 (2008). [25], Falk, J., Thoumine, O., Dequidt, C., Choquet, D. & Faivre-Sarrailh, C. NrCAM coupling to the cytoskeleton depends on multiple protein domains and partitioning into lipid rafts. Mol Biol Cell 15, 4695-709 (2004). [26]). Ceci est une limitation d'autant plus forte en ce qui concerne l'étude de la formation de contacts spécialisés permettant la communication entre neurones, les « synapses », ce qui constitue une question fondamentale de neurobiologie. La synaptogénèse est un processus multi-étapes complexe au niveau des contacts axone/dendrite, initiée par des protéines d'adhésion et suivi par le recrutement de molécules d'échafaudage et de récepteurs canaux fonctionnels (Bresler, T., Ramati, Y., Zamorano, P. L., Zhai, R., Garner, C. C. & Ziv, N. E. The dynamics of SAP90/PSD-95 recruitment to new synaptic junctions. Mol Cell Neurosci 18, 149-67 (2001). [27], Bresler, T., Shapira, M., Boeckers, T., Dresbach, T., Futter, M., Garner, C. C., Rosenblum, K., Gundelfinger, E. D. & Ziv, N. E. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. J Neurosci 24, 1507-20 (2004). [28], Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C. & Ziv, N. E. Assembly of new individuel excitatory synapses: time course and temporal order of synaptic molecule recruitment. Neuron 27, 57-69 (2000). [29], Zito, K., Scheuss, V., Knott, G., Hill, T. & Svoboda, K. Rapid functional maturation of nascent dendritic spines. Neuron 61, 247-58 (2009). [30]). Des études récentes ont notamment montré que le complexe d'adhérence neurexine/neuroligine ainsi que les protéines LRRTMs jouaient un rôle dans l'assemblage synaptique (Gerrow, K., Romorini, S., Nabi, S. M., Colicos, M. A., Sala, C. & El-Husseini, A. A preformed complex of postsynaptic proteins is involved in excitatory synapse development. Neuron 49, 547-62 (2006). [31], Graf, E. R., Kang, Y., Hauner, A. M. & 7 Craig, A. M. Structure function and splice site analysis of the synaptogenic activity of the neurexin-1 beta LNS domain. J Neurosci 26, 4256-65 (2006). [32], Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W. & Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Ce// 119, 1013-26 (2004). [33], Heine, M., Thoumine, O., Mondin, M., Tessier, B., Giannone, G. & Choquet, D. Activity-independent and subunit-specific recruitment of functional AMPA receptors at neurexin/neuroligin contacts. Proc Nat/ Acad Sci U S A 105, 20947-52 (2008). [34], Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R. & Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Ce// 101, 657-69. (2000). [35], Sudhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature 455, 903-11 (2008). [36], Ko, J., Zhang, C., Arac, D., Boucard, A. A., Brunger, A. T. & Sudhof, T. C. Neuroligin-1 performs neurexin- dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. Embo J 28, 3244-55 (2009). [37]) Linhoff, M. W., Lauren, J., Cassidy, R. M., Dobie, F. A., Takahashi, H., Nygaard, H. B., Airaksinen, M. S., Strittmatter, S. M. & Craig, A. M. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron 61, 734-49 (2009). [38], Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C. & Sudhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron 64, 791-798 (2009). [39], de Wit, J., Sylwestrak, E., O'Sullivan, M., Otto, S., Tiglio, K., Savas, J. N., Yates, J. R., Comoletti, D., Taylor, P. & Ghosh, A. LRRTM2 Interacts with Neurexinland Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron 64, 799-806 (2009). [40]). Du fait que les contacts spontanés entre neurones se forment d'une manière très imprévisible dans le temps et l'espace, et impliquent de nombreuses molécules d'adhésion dans des quantités stoechiométriques inconnues, l'étude de la synaptogénèse est une tache difficile. Ces limitations nécessitent le développement de nouveaux systèmes 8 permettant une induction robuste, ciblée et sélective de la formation des synapses, accompagnée d'une importante production de données statistiques. La culture de neurones sur des substrats micro-structurés recouverts de molécules d'adhésion neuronales permettrait de répondre à l'ensemble de ces questions. Toutefois, une difficulté est que les neurones, cellules fortement polarisés par nature, peuvent avoir des réactions très diverses à des schémas de polarisation, en fonction de la géométrie des zones d'adhérence et de non-adhérence ainsi qu'en fonction des molécules utilisées pour l'adhérence et la non-adhérence. Par exemple, les neurones peuvent ne pas se différencier correctement en réponse à de fortes limitations géométriques imposées par le micro-environnement adhésif, en n'étant pas capables d'étendre leur arborisation d'axones et de dendrites. D'où la nécessité de trouver les conditions de géométrie et de revêtement optimales pour cultiver des neurones primaires sur ces substrats, en essayant de rester le plus proche possible de leur environnement physiologique. Il existe donc un réel besoin de trouver un dispositif, un procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier un dispositif permettant de cultiver les cellules neuronales tout en conservant l'ensemble de leurs propriétés, un dispositif permettant de cultiver les cellules neuronales par exemple pour analyser les propriétés physiologiques des cellules neuronales, notamment leur développement axonal et dendritique ainsi que la formation de synapses, et de tester l'effet de composés sur ces processus. En outre, il existe un réel besoin de trouver un dispositif simple, pouvant être facilement mis en oeuvre et permettant ainsi de réduire les coûts et d'améliorer la culture des cellules neuronales et leurs utilisations. Description de l'invention 9 La présente invention a précisément pour but de répondre à ces besoins en fournissant un support (1) de culture de cellules neuronales (c) comprenant un substrat (3) sur une surface (5) duquel sont disposés des îlots (7) de protéines d'adhésion desdites cellules neuronales, lesdits îlots (7) ayant un diamètre de 100 nm à 3 microns et étant espacés entre eux de 1 à 10 microns. La présente invention se rapporte également à l'utilisation du support (1) pour la culture de cellules neuronales, dans une méthode d'analyse quantitative et/ou qualitative de cellules neuronales et dans une 1 o méthode de criblage. Dans la présente par cellules neuronales (c) on entend toutes cellules issues du système nerveux d'un mammifère, oiseau, batracien, ou mollusque, et/ou toute cellule issue d'une lignée cellulaire neuronale. Il peut s'agir par exemple de cellules neuronales isolées du système 15 nerveux, par exemple de cerveau ou moelle épinière, de rongeurs par exemple de rats ou souris, de poulets, de batraciens, par exemple de Xénope, de mollusques tels l'Aplysie, aux stades embryonnaires ou nouveau-nés, pouvant être situés dans l'hippocampe, le cortex, le striatum, les ganglions de la racine dorsale (DRG). Il peut également s'agir de 20 cellules choisies parmi la lignée neuroblastome SH-SY5Y, la lignée PC12, la lignée de cellules neuronales corticales (HCN-1), ou la lignée de neuroblastomes B104. Selon l'invention, le support (1) peut être de toute forme connue de l'homme du métier, il peut être par exemple carré, rectangulaire ou 25 circulaire. Selon l'invention, le substrat (3) peut être tout substrat solide connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un substrat transparent ou opaque. Il peut s'agir d'un substrat en verre, quartz, silicium, ou en matériau du type polymère, par exemple les plastiques par exemple du 30 polycarbonate, polystyrène, polyéthylène ou PTFE, recouvert ou non d'une couche mince d'un autre matériau polymère, métallique, par exemple l'or 10 ou des oxydes métalliques comme le SiO2, le TiO2, l'ITO « oxyde d'indium-étain », ou de gels réticulés, par exemple le polydiméthylsiloxane (PDMS) ou le polyacrylamide. Selon l'invention l'épaisseur du substrat (3) peut être comprise de 5 0,1 mm à 3 mm, de 0,110 mm à 0,290 mm, de 0,120 mm à 0,250 mm, de 0,150 mm à 0,170 mm. Avantageusement, lorsque l'épaisseur du substrat est comprise entre 150 pm et 170 pm, il peut être utilisé directement dans un dispositif de lecture optique, par exemple un microscope à épifluorescence utilisant 10 un objectif à immersion d'huile de grande ouverture numérique, permettant l'illumination en réflexion totale interne (ondes évanescentes) et ainsi la visualisation du contact adhésif avec une profondeur de champ d'une centaine de nanomètres. Selon l'invention la surface (5) peut être toute surface connue de 15 l'homme du métier sur laquelle des molécules, par exemple des substances chimiques et/ou des protéines peuvent être disposées. Il peut s'agir par exemple d'une surface plane, d'une surface rugueuse, d'une surface comprenant des creux, par exemple des puits ou des canaux. Selon l'invention, les îlots (7) peuvent être disposés sur la surface 20 de telle manière qu'ils forment un réseau, par exemple un réseau hexagonal ou carré. Selon l'invention, les îlots peuvent être situés à équidistance les uns des autres ou dans des intervalles variables. Selon l'invention, la surface entre les îlots (7) peut être une surface cytophobe (9). Selon l'invention, la surface peut être rendue cytophobe du 25 fait de la présence d'un composé choisi parmi le polyéthylène glycol, le polyéthylène oxyde, le poly(acétate de vinyle), le poly(2-hydroxyéthyl métacrylate, le polyacrylamide, le poly(N-vinyl-2-pyrrolidone), le poly(N-isopropyl acrylamide), les silicones par exemple le PDMS : polydimethylsiloxane (PDMS), les silanes, par exemple les silanes 3o perfluorés, les polymères anioniques, les polymères phosphoryl choline, l'albumine, la caséine, l'acide hyaluronique, les liposchaccarides, les glycoprotéines, les phospholipides ou une combinaison de ceux-ci. Selon l'invention, l'application des composés cytophobes peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple par dépôt en phase liquide, par exemple par tournette, trempage, aspersion, ou dépôt chimique en phase vapeur, par exemple par plasma ou sous atmosphère contrôlée ou une combinaison des deux. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document suivant Bhushan, Bharat Hansford, Derek Lee, Kang Kug « Surface modification of silicon and 1 o polydimethylsiloxane surfaces with vapor-phase-deposited ultrathin fluorosilane films for biomedical nanodevices », Journal of Vacuum Science & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films, Jul 2006, 24 (4), 1197 - 1202 [63]. Selon l'invention, par « protéines d'adhésion », on entend une 15 protéine d'adhésion issue d'une membrane de cellules neuronales ou d'une membrane physiologique supportant une cellule neuronale issues de cellules non-neuronales, par exemple de cellules non-neuronales choisies parmi les cellules gliales, les astrocytes, les oligodendrocytes, les épendymocytes, les cellules satellites, les cellules de Schwann, cellules 20 microgliales, ou les cellules souches embryonnaires desdites cellules. Il peut s'agir par exemple d'une protéine d'adhésion membranaire de cellules neuronales, par exemple les molécules d'adhérences de type immunoglobuline (IgCAM), par exemple les molécules L1, les molécules d'adhérence de type neural (NrCAM) ou la glycoprotéine transaxonal 1 25 (TAG-1), les cadhérines par exemple la N-cadhérine, et les protocadhérines, les neurexines par exemple les neurexines 1, 2, ou 3, les neurexines de formes a ou R, les neurexines avec ou sans sites d'épissage alternatif en position 4, les neuroligines par exemple les neuroligines 1, 2, 3, ou 4, avec ou sans site d'épissage alternatif en positions A ou B, et les 30 protéines transmembranaires à domaines riches en leucine (« Leucine- Rich Repeat Transmembrane protein ») par exemple les LRRTM 1, 2, 3 ou 4. Il peut s'agir d'une protéine recombinante, par exemple une protéine constituée d'un domaine extracellulaire N-terminal de protéines d'adhésion membranaires de cellules neuronales, par exemple les protéines précitées, fusionné, par exemple, en sa partie C-terminale à une étiquette. Selon l'invention, lorsque la protéine d'adhésion est une protéine recombinante comprenant une étiquette C-terminale, l'étiquette peut être choisie parmi les étiquettes suivantes : la protéine fluorescente verte (« green fluorescent protein (EGFP) »), la protéine fluorescente rouge (« red fluorescent protein (RFP) »), les séquences polyhistidines (6-10 His), l'étiquette hémaglutinine (HA), l'étiquette myc, la Glutathione S-transférase (GST), ou un fragment constant des anticorps (Fc). Les protéines recombinantes peuvent être obtenues par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple des procédés décrits dans le document Isabelle Collin cvc, Le génie génétique, « les animaux transgéniques », édition les Essentiels milans, 1999 [64], le Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Edition 2011-Editor(s): Roger L. Lundblad, Lundblad Biotechnology, Chape/ Hill, North Carolina, USA ; Fiona Macdonald, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA [65], ou le Practical handbook of biochemistry and molecular biology Gerald D. Fasman CRC Press, 1989 - 601 pages [66]; ou le Recombinant DNA Principles andMethodologies, Editor(s): James Greene, Catholic University, Washington D.C., USA CRC Press, 1998 [67]. De préférence, la protéine d'adhésion est choisie parmi les neurexines, les neuroligines, les IgCAMs, la N-cadhérine, les protéines transmembranaires à domaines riche en Leucine (« Leucine-Rich Repeat Transmembrane » (LRRTM)) ou un mélange de celles-ci. De préférence, la protéine d'adhésion est choisie parmi les neurexines, les neuroligines, la N-cadhérine et/ou ou un mélange de celles-ci. Avantageusement, selon l'invention la protéine d'adhésion utilisée dans le dispositif de l'invention induit une croissance des axones et/ou des dendrites et/ou la synaptogénèse. Selon l'invention, la protéine d'adhésion peut être fixée directement sur la surface (5) ou via un liant intermédiaire fixé sur ladite surface (5). Selon l'invention, la fixation directe de la protéine d'adhésion sur la surface (5) peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple par adsorption, par greffage chimique, électrochimique ou thermique. Selon l'invention, le liant intermédiaire peut être choisi parmi une espèce chimique réactive permettant d'établir une liaison covalente, par exemple la benzophénone, une fonction acide, amine ou thiol, les silanes, par exemple les alkyls trichlorosilanes, et/ou une liaison non covalente, par exemple le nickel-acide nitrîlotriacétique (NTA), une protéine, par exemple la biotine, la streptavidine, le glutathion, un anticorps par exemple anti-Fc, anti-GFP, anti-RFP, anti-HA, anti-myc, anti-His, anti-GST, une espèce chargée par exemple la poly-D-lysine ou la poly-ornithine, un polysaccharide. Selon l'invention, la fixation du liant sur la surface (5) peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple par trempage de la surface dans une solution comprenant ledit liant. Par exemple lorsque le liant est un anticorps, le procédé de fixation peut être par exemple un procédé comprenant une étape de trempage de la surface (5) dans une solution d'anticorps et rinçage en milieu liquide. Selon l'invention l'application des composés cytophobes peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple par dépôt en phase liquide, par exemple par tournette, trempage, aspersion, ou dépôt chimique en phase vapeur, par exemple par plasma ou sous atmosphère contrôlée) ou une combinaison des deux. Avantageusement lorsque le liant est la polylysine, celle-ci permet un attachement optimal des neurones et l'extension des neurites. 14 Avantageusement, lorsque la protéine d'adhésion est une protéine recombinante, celle-ci peut interagir avec la surface (5) et/ou avec un liant fixé sur la surface (5) permettant ainsi d'augmenter la quantité de protéines d'adhésion fixées. Par exemple, lorsque le liant est un anticorps, celui-ci peut être spécifique de la protéine d'adhésion. Par exemple, lorsque la protéine est une protéine recombinante telle que définie précédemment, l'anticorps peut être spécifique de l'étiquette de ladite protéine recombinante. Avantageusement, lorsque le liant est un anticorps, son site 1 o d'interaction avec la protéine adhésive peut être tel qu'il puisse permettre d'orienter l'ectodomaine de la protéine adhésive de telle façon que la partie réactive soit disponible pour l'adhésion cellulaire. Selon l'invention, les îlots (7) peuvent être déposés sur la surface (5) par une méthode choisie parmi la photolithographie, la dip-pen 15 nanolithographie, la lithographie par faisceau, l'impression par jet d'encre, l'impression par microcontact. Selon l'invention, les îlots (7) ont un diamètre de 0,2 à 2,5 pm, de 0,2 à 2 pm, de 0,3 à 150 pm. Selon l'invention, l'espacement entre les îlots est de 0,5 à 10 pm, 1 20 à9pm,3à7pm. Avantageusement, le diamètre des îlots permet la fixation des cellules neuronales et permet de former des points d'attachement entre, par exemple le corps cellulaire, les axones ou les dendrites et la protéine d'adhésion immobilisée sur les îlots. 25 La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un support (1) de culture de cellules neuronales comprenant une étape de dépôt sur une surface (5) d'un substrat d'îlots (7) d'adhésion de cellules neuronales, lesdits îlots (7) ayant un diamètre 0,2 à 2,5 pm, de 0,2 à 2 pm, de 0,3 à 150 pm et étant espacés entre eux de 0,5 à 10 pm, 1 30 à9pm,3à7pm. Les cellules neuronales sont telles que définies précédemment. 15 Le substrat utilisé dans le procédé de l'invention correspond au substrat défini précédemment. Les protéines d'adhésion utilisées dans le procédé de l'invention correspondent aux protéines définies précédemment. Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape de revêtement d'un composé cytophobe. Selon l'invention, l'étape de revêtement du composé cytophobe peut être réalisée préalablement à l'étape de dépôt des îlots d'adhésion. Selon l'invention, le composé cytophobe utilisé dans le procédé est 1 o tel que défini précédemment. Selon l'invention, le procédé peut comprendre une étape de revêtement de la surface (5) avec un liant. L'étape de revêtement de la surface (5) avec un liant peut être réalisée préalablement à l'étape de dépôt des îlots d'adhésion. 15 Selon l'invention, le liant utilisé dans le procédé est tel que défini précédemment. La présente invention a également pour objet l'utilisation du support (1) pour la culture de cellules neuronales. La présente invention a également pour objet l'utilisation du support 20 (1) dans une méthode d'analyse quantitative et/ou qualitative de cellules neuronales. En particulier, le support de la présente invention peut être avantageusement utilisé afin d'analyser les effets de molécules chimiques sur la croissance des neurites, par exemple sur le nombre, la taille, la 25 géométrie, les branchements. Le support de la présente invention peut être avantageusement utilisé afin d'étudier les effets de molécules chimiques sur la formation, la structure, le développement et la migration du cône de croissance axonal. En particulier, le support de la présente invention peut être 30 avantageusement utilisé pour analyser les effets de molécules chimiques 16 sur, par exemple, la formation, le nombre, la structure et/ou la fonction des hémisynapses pré-synaptiques ou post-synaptiques. La présente invention a également pour objet l'utilisation du support (1) dans une méthode d'analyse quantitative et/ou qualitative de la synaptogénèse de cellules neuronales. En particulier, le support de la présente invention peut être avantageusement utilisé pour étudier, par exemple, la formation, le nombre, la structure et/ou la fonction des hémisynapses pré-synaptiques ou post-synaptiques. 1 o En outre, le support de la présente invention peut être avantageusement utilisé pour analyser et quantifier les effets de molécules chimiques sur, par exemple, la synaptogénèse de cellules neuronales. La présente invention a également pour objet l'utilisation du support (1) dans des méthodes de criblage. 15 Le dispositif de l'invention permet avantageusement de cultiver des cellules neuronales et de maintenir ces cellules en culture pendant un temps suffisant pour permettre leur développement. Par exemple le dispositif de l'invention permet le développement de synapses. En outre, durant la totalité du temps de culture, les protéines d'adhésion fixées sur 20 les îlots conservent avantageusement leurs fonctions adhésives, permettant, par exemple et avantageusement l'expression des contre-récepteurs endogènes dans les neurones, par exemple la N-cadhérine endogène dans les axones et dendrites, les neuroligines endogènes dans les dendrites, et les neurexines endogènes dans les axones. 25 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures 30 - La Figure 1 représente un support de culture (1) comprenant un substrat (3), une surface cytophobe (5), et des îlots adhésifs (7). 17 - La Figure 2 représente un support de culture comprenant un réseau hexagonal de micro-îlots recouverts de neurexine-1 R-Fc sur une surface partout ailleurs cytophobe. Le greffage de la neurexine-1 R-Fc sur les îlots initialement recouverts de polylysine a été assuré par un anticorps anti-Fc. Les neurones exprimant la neuroligine-1 développent des compartiments post-synaptiques spécifiquement sur ces îlots. Le schéma en coupe d'une post-synapse individuelle formé sur un îlot de recouvert de neurexine est indiqué sur la droite. - La Figure 3 représente des images de fluorescence de neurones hippocampiques dissociés, issus de rats embryonnaires, en culture sur des substrats à micro-îlots recouverts de neurexine-1 R-Fc. Les neurones ont été déposés sur ces substrats, transfectés au bout de 4 jours avec la neuroligine-1-HA ou l'EGFP, et cultivés au total pendant 8 jours. (a) Image d'un neurone exprimant la neuroligine-1-HA, immuno-marqué avec un anticorps anti-HA. (b) Image d'un neurone transfecté avec de la EGFP. Les îlots ont été revêtus d'un anticorps anti-huFc conjugué au fluorophore Cy5 (aHuFc-Cy5), pour une visualisation des îlots (images correspondantes à droite). Les images montrent clairement une arborescence géométrique régulière des neurones exprimant la neuroligine-1 et l'accumulation de neuroligine-1 sur les îlots recouverts de neurexine-1 R-Fc, et l'absence de ces réactions chez les neurones exprimant l'EGFP. (c) Images a plus fort grossissement de réseaux de dendrites issus de neurones transfectés avec la neuroligine-1, montrant le développement de structures filopodiales indiquées par des flèches blanches ressemblant à des épines dendritiques, dont l'extrémité forme des contacts spécifiques avec les îlots recouverts de neurexine-1 R-Fc (droite). - La Figure 4 représente des images de fluorescence d'axones et dendrites en fonction du support utilisé. La figure 4 (a) représente des photographies d'un neurone exprimant neuroligine-1-HA, en développement sur le substrat recouvert de neurexine-1 R-Fc. Le neurone 18 transfecté a été visualisé par immuno-coloration de l'épitope HA avec des anticorps primaires anti-HA et des anticorps secondaires conjugués au fluorophore Alexa488. En particulier, cette photographie représente la morphologie structurée des neurones hippocampiques de rat (DIV 8) cultivés sur des substrats à micro-îlots. La Figure 4 (b) représente des photographies d'un neurone exprimant l'EGFP, en développement sur un substrat recouvert de neurexine-1 R-Fc. Les panneaux de droite des figures 4 a et 4 b comprennent des agrandissements pris dans les zones axonales et dendritiques mettant en évidence la morphologie des neurites dans chaque état. La Figure 4 (c) est un diagramme en bâton représentant en ordonnée le pourcentage d'îlots occupés par les axones ou les dendrites sur-exprimant la neuroligine-1-HA, en développement sur les substrats recouvert de neurexine-1 R-Fc (Nrxl R-Fc + Nlgn-1, 9 cellules, Dendrite: n = 595 îlots; axone: n = 187 îlots) et pour les neurones exprimant l'EGFP, en développement sur les substrats recouvert de Nrxl R-Fc (contrôle; 8 cellules, dendrites: n = 202 îlots; axone: n = 148 îlots). - La Figure 5 représente des images de fluorescence d'axones et explicite la méthode de quantification des facteurs d'enrichissement des protéines synaptiques Neuroligine-1 et PSD-95 au niveau des micro- patterns. L'image en (a) représente une région dendritique d'un neurone exprimant la neuroligine-1-HA et la PSD-95:EGFP cultivé sur un substrat recouvert de Nrxl R-Fc. L'image correspondante en (b) représente les ilots recouverts au préalable d'anticorps fluorescents ahuFc-Cy5. L'image en (c) représente les îlots détectés (cercles en pointillés), qui sont ensuite transférés sur l'image de PSD-95:EGFP. Les îlots qui ne sont pas recouverts avec des dendrites (cercles pleins) ont été éliminés de la quantification. L'image en (d) représente les contours des îlots restants (cercles en pointillés), transférés sur l'image PSD-95:EGFP, où le contour du neurite est déterminé par une fonction de seuil (en gris). L'indice d'enrichissement est calculé en mesurant l'intensité de fluorescence dans chaque ilot (cercles), et divisé par l'intensité moyenne mesurée à partir de zones dendritiques situées à l'extérieur des micro-patterns (gris). - La Figure 6 représente les résultats de la quantification des facteurs d'enrichissement des protéines synaptiques au niveau des micro- patterns. Le panneau (a) représente des photographies de cellules montrant le recrutement de la Neuroligine-1 (haut) et de la PSD-95 : EGFP (milieu) au niveau de micro-patterns recouverts de neurexine-1 R-Fc (bas). Les panneaux (b) et (c) sont des graphiques représentant l'enrichissement de protéines post-synaptiques (neuroligines-1-HA; PSD-95 : EGFP ou PSD-95 endogène). L'abscisse correspond à l'index d'enrichissement qui est un nombre sans dimension normalisé à 1, en divisant par le niveau de fluorescence au niveau des îlots par un niveau de référence sur des régions témoins. L'enrichissement a été quantitativement déterminé sur les îlots en utilisant 3 cultures différentes de neurones d'hippocampe suivant la procédure décrite en Figure 5. La distribution cumulative de l'indice d'enrichissement des neuroligines-1-HA (en b) ou des PSD-95 : EGFP et PSD-95 endogène (en c) est indiquée sur les graphiques. L'indice d'enrichissement a été calculé pour chaque protéine dans les conditions suivantes: substrats recouvert de neurexine-1 R-Fc et neurones exprimant la neuroligine-1-HA (Nrx-Fc + Nlgn-1 (courbe trait plein); substrats recouvert de Fc humain et neurones exprimant la neuroligine-1-HA (huFc + Nlgn-1 (courbe traits espacés) ou substrats recouvert de neurexine-1 R-Fc et neurones sur-exprimant la EGFP (Nrx-Fc + EGFP (courbe en pointillés). Une valeur d'indice d'enrichissement de 1 indique qu'il n'y a pas de recrutement particulier de la protéine étudiée. - La Figure 7 représente des photographies prises au cours du temps de cellules neuronales exprimant la neuroligine-1 et la PSD-95:EGFP, en culture sur un substrat dont les îlots sont recouverts de neurexine-1 R-Fc. En particulier, cette figure représente les changements 3o de forme de filopodes dendritiques, visualisés par le signal de fluorescence de PSD-95:EGFP. Ces figures montrent les contacts entre la partie périphérique des filopodes dendritiques enrichie en PSD-95 (flèches), avec îlots recouverts de neurexine-1 R-Fc (cercles en pointillés), événements précurseurs de la formation d'hémi-post-synapses. - La Figure 8 représente des photographies des flux transitoires de calcium induits par le décageage de glutamate. Des neurones de rat hippocampiques (DIV 7) en développement sur le substrat recouvert de neurexine-18.-Fc (a) et exprimant la neuroligine-1-HA et la PSD-95:mCherry (b) ont été marqués avec l'indicateur calcique Fluo-4, pour observer des changements intracellulaires de calcium (c) et ont été incubés dans une solution contenant du glutamate cagé (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged I-glutamate). Le faisceau laser bi-photon permettant le décageage est focalisé au voisinage d'un îlot (flèche). Il est noté que l'augmentation du signal de Fluo-4 à partir de l'emplacement du décageage se propage dans les dendrites au cours du temps (Panneau c). Le panneau (d) représente un graphique montrant différentes réponses calciques, normalisées à un niveau de référence (ordonnée) en fonction du temps en secondes (abscisse). Ces réponses ont été mesurées au niveau de l'îlot le plus proche de l'emplacement du décageage de glutamate (courbe noire), ou sur les îlots voisins (courbes en pointillés), comme indiqué sur l'image PSD-95:mCherry (îlots notés 1, 2, et 3 respectivement). - La Figure 9 représente des images de fluorescence de neurones hippocampiques dissociés, issus de rats embryonnaires, en culture sur des substrats à micro-îlots recouverts de N-cadhérine-Fc (panneaux du haut : Substrat N-cadhérine-Fc) ou de la molécule témoin Fc (panneaux du bas : Substrat Hu -Fc). Les neurones ont été déposés sur ces substrats et cultivés pendant 8 jours. Les panneaux de gauche montrent des images de neurones marqués avec la molécule phalloidine-Bodipy, pour colorer les filaments d'actine. Les images correspondantes à droite (anti-humain Fc Cy5) montrent les îlots revêtus d'un anticorps anti- huFc conjugué au fluorophore Cy5 (aHuFc-Cy5). Ces images montrent clairement que la croissance des neurites et leur orientation suivent les lignes définies par les îlots recouverts de N-cadhérine-Fc, ce qui n'est pas le cas pour les neurones cultivés sur les micro-patterns recouverts de Fc, dont les neurites poussent mal et dans des directions aléatoires. La Figure 9c représente l'image à plus fort grossissement d'un cône de croissance coloré pour les filaments d'actine avec la molécule phalloidine-Bodipy, qui montre l'accumulation d'actine au niveau des adhésions avec les îlots recouverts de N-cadhérine-Fc (flèches et cercles). Le panneau de droite représente l'image correspondante des îlots de N-cadhérine-Fc. - La Figure 10 a et b représente des images de fluorescence de neurones hippocampiques dissociés, issus de rats embryonnaires, en culture sur des substrats à micro-îlots recouverts de N-cadhérine-Fc (Substrat N-cadhérine-Fc). Les neurones ont été déposés sur ces substrats, transfectés au bout de 4 jours avec la protéine fluorescente rouge (RFP) (a) ou la N-cadhérine-RFP (b), et cultivés au total pendant 8 jours. Les images correspondantes des îlots revêtus d'un anticorps antihuFc conjugué au fluorophore Cy5 (aHuFc-Cy5), sont présentées dans les panneaux de droite. Ces images montrent clairement l'enrichissement de la N-cadhérine-RFP, qui est le récepteur membranaire du ligand N- cadhérine-Fc, mais pas de la RFP, sur les îlots recouverts de N-cadhérine-Fc (flèches). La Figure 10 (c) est un diagramme en bâton représentant en ordonnée l'index d'enrichissement de la RFP et de la N-cadhérine-RFP sur les îlots recouverts de N-cadhérine-Fc. EXEMPLES Exemple 1 : Fabrication du support de culture cellulaire Les substrats à îlots Les matrices d'ilots hydrophiles de 0,5 à 2 pm et séparés de 3 à 6 pm dans un environnement cytophobe ont été obtenues de CYTOO sur lamelles de verre de 2x2cm2 et de 170pm d'épaisseur (Produits à façon, CYTOOchips Custom, référence catalogue 10-950-00). Les substrats ont été ensuite traités avec de la Poly(L-lysine) PLL (40 pg/ml ; Sigma P2636-1G) qui a été adsorbée sur les points hydrophiles. Les substrats ont été ensuite séchés et stockés à 4°C. Production et purification de la neurexine-1 R-Fc Le protocole de production de la neurexine-1 R-Fc a été publié précédemment (Heine, M., Thoumine, O., Mondin, M., Tessier, B., Giannone, G. & Choquet, D. Activity-independent and subunit-specific recruitment of functional AMPA receptors at neurexin/neuroligin contacts. Proc Nat/ Acad Sci U S A 105, 20947-52 (2008). [34]). Le plasmide pcDNA neomycin contenant le gène codant pour la protéine neurexine-1 R sans le site d'épissage alternatif S4, fusionné en C-terminal avec la séquence codant pour le fragment constant des IgG humain (Fc) (Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R. & Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Ce// 101, 657-69. (2000). [35]) fournit par P. Scheiffele (Biozentrum, Bâle, CH). Ce plasmide a été sous-cloné entre les sites Hindlll/Xhol dans le vecteur pcDNAhygro(+). Des cellules HEK293 (5106 cellules) ont été électroporées (Biorad Pulser Xcell) avec 30 à 50 pg de ce plasmide, puis cultivées dans du milieu DMEM High glucose (DMEMNA0500, Midimed) contenant 10% de sérum de veau foetal (SVFBRE500, Midimed), 1 mM pyruvate de Sodium MEM (11360039, Fisher Scientific), 1% de complément GlutaMAX (marque de commerce) I (35050038, Fisher Scientific) sans antibiotique pendant 36 h, puis supplémenté avec 0,5 mg/mL d'hygromycin B (10687-010, Fisher Scientific) pour sélectionner un clone stable exprimant la neurexine-1 R-Fc (10 jours). Les cellules ont été cultivées sur supports recouverts de Poly-L-lysine hydrobromide (1 mg/mi, P2636-1G, Sigma-Aldrich) pendant 3 mois dans du Milieu AIM V (marque déposée) (31035-025, Fisher Scientific) supplémenté avec 0,5 mg/mL d'hygromycine B. 60 mL de milieu conditionné étaient prélevés 2 fois par semaine, puis congelé à -20°C. L'ensemble des milieux collectés a été mélangé, filtré (0,2 pm), traité avec du DTT 10 mM (DL-dithiothreitol, D9779-10G, Sigma) et le pH a été ajusté à 7. Grâce à une pompe péristatique, ce mélange est passé sur une colonne de protéine G (HiTrap Protein G HP, 17-0407-03, GE Healthcare) préalablement équilibrée avec du phosphate de sodium 20 mM pH=7. L'élution de la protéine a été effectuée avec de la Glycine (Sigma G-8898) 0,1 M pH = 2,7, et l'éluât a été collecté par fractions de l ml dans des tubes contenant du tampon Tris (Trizma Base, Sigma T6066) 1 M, pH = 9 ajusté avec HCI. La quantification de la concentration en protéine dans ces fractions est réalisée par un dosage BCA (W9981 L, Fisher Scientific). La protéine est conservée à -80°C en aliquotes de 20-50 pl. De façon alternative, les protéines d'adhésion recombinantes sont achetées chez le fabricant R&D Systems : N-cadhérine-Fc (6626-NC-050), neurexinel a-Fc (4485-NX-050), neurexine-1 R-Fc (5268-NX-050), neuroligine-1-6His (4340-NL-050), neuroligine-2-6His (5645-NL-050), et LRRTM-1-6His (4897-LR-050), LRRTM-3-6His (4898-LR-050), LRRTM-4-6His (5377-LR-050). Recouvrement des substrats comprenant des îlots Un jour avant de déposer les cellules, les substrats ont été traités avec des anticorps de chèvre anti-Fc humain (Jackson ImmunoResearch, réf. 109-005-098) conjugués au fluorophore Cy5 grâce à un kit de couplage (PA25001 GE Healthcare) et dilués dans du tampon borate (acide borique Merck ; 1001650500 ; 0,2 M, pH = 8,5), à une concentration finale de 0,023 mg/ml. Avant l'incubation, les anticorps dilués ont été centrifugés pendant 10 min à 14'000 tours par minute, à 4°C. Chaque lamelle obtenue a été retournée sur 200 pl de cette solution d'anticorps sur du parafilm (Dutscher, 090998) préalablement stérilisé pendant 1 h avec une lampe UV (365 nm) sous une hotte à flux laminaire (TELSTAR, AV-100), et incubée pendant 4 à 5 h à 23°C pour assurer une répartition uniforme des anticorps sur les micro-patterns. Par la suite, les substrats ont été soigneusement lavés avec du tampon borate, puis ont été incubés à 4°C pendant la toute nuit avec 100 pl de solution de neurexine-1 R-Fc purifiée, de N-cadhérine-Fc purifiée (R&D systems, 1388-NC-050) ou de Fc humain (Jackson Immunoresearch, réf. 009-000-008) utilisé comme témoin, toutes les protéines étant diluées à 0,04 mg/mi dans le tampon borate. Ces solutions de protéines ont préalablement été centrifugées pendant 10 min à 14 000 tours par minute, à 4°C. Le jour suivant, les substrats ont été placés dans une plaque de 6 puits, lavés 3 fois avec 1 ml de tampon borate et une fois avec 1 ml de milieu minimum essentiel (MEM) (21430-020, Gibco/Invitrogen) complémenté avec 10% de sérum de cheval (16050-122, Gibco/Invitrogen) et laissé dans 2,5 ml de MEM complémenté avec 10% de sérum de cheval pendant 1 à 2 heures dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2 (Heraeus, HERACeII 150). Exemple 2 : Culture de cellules neuronales avec le support de l'invention et étude du développement des cellules cultivées Dans les exemples suivants, les procédés et matériaux utilisés sont ceux décrits ci-dessous Culture cellulaire et transfection Des neurones dissociés de l'hippocampe à partir d'embryons de rat E18 ont été étalés sur des substrats (100 000 cellules/substrat). Après 4 à 5 heures, les substrats ont été soigneusement lavés avec un milieu Neurobasal (NB) (Gibco, 12348-017) supplémenté avec du B27 (Gibco, 17504-044) et L-Glutamine (GIu200100, MidiMed) à 37°C pour éliminer les cellules non fixées, puis incubées dans 2,5 ml de ce même milieu pendant 8 à 10 jours. Au bout de trois jours Les neurones ont été transfectés avec les plasmides codant pour Neuroligine-1-HA (fournit par P. Scheiffele), PSD-95 :EGFP (fournit par S ; Okabe) ou du vecteur EGFP (Qiagen), en utilisant le kit Effectene (Qiagen, 301427), selon les instructions du fabricant, en utilisant un total de 2 µg d'ADN par puits. Pour les cotransfections de Neuroligine-1-HA et EGFP ou de Neuroligine-1-HA et PSD-95:EGFP, les plasmides ont été utilisés dans un rapport de 2:1. Immuno-marquage Pour visualiser le recrutement de neuroligine-1 à la surface des neurones, les cultures transfectées avec la Neuroligine-1-HA ont été fixées à 37°C dans une solution de tampon phosphate salin (PBS) (Euromedex ET330) complémenté avec 4% de paraformaldéhyde (VWR 28794.295,) et 4% de saccharose (Fluka 84097) pendant 10 min, et les sites restant actifs ont été saturés avec 1 ml d'une solution 50 mM de NH4CI dans du PBS pendant 15 min. Les liaisons non spécifiques ont été bloquées avec 1 ml de PBS contenant 1% de sérum albumine de bovin (Sigma ; A3059). Puis, les neurones ont été colorés avec un anticorps de rat anti-HA dilué 1 :400 dans du tampon phosphate salin (PBS) (Roche, 11867423001) suivi par un anticorps de chèvre anti-rat conjugué à Alexa568 (Invitrogen A11077 ; 2 mg/ml) dilué à 1:800 dans le PBS pendant 30 min à 23°C. Pour marquer les protéines PSD-95 endogènes, les cellules ont été fixées et perméabilisées dans 0,1% de Triton X 100 (T9284, Sigma) dans du PBS pendant 5 min. Les liaisons non spécifiques ont été bloquées avec 1 ml de PBS contenant 1% de BSA. Les neurones ont été marqués avec un anticorps de souris anti-PSD-95 (Neuromab 75-028, 1 :400) suivi par des anticorps de chèvre anti-souris conjugués au fluorophore Alexa568 (2 mg/ml dilution 1:800, Invitrogen A11004). Pour marquer les filaments d'actine, les cellules ont été fixées et perméabilisées dans 0,1% de Triton X 100 (T9284, Sigma) dans du PBS pendant 5 min. Les liaisons non spécifiques ont été bloquées avec 1 ml de PBS contenant 1% de BSA, 3o puis les neurones ont été traités avec la phallicidine-Bodipy (marque déposée) FL (Molecular Probes, Invitrogen, B607) diluée 1 :100 dans le PBS. Les lamelles ont été ensuite montées sur des lames de verre (Waldemar Knittel, Braunschweig, Allemagne) avec une goutte de Mowiol (Calbiochem) et scellées avec du vernis (Cochon). Analyse des imaqes Les immuno-marquages ont été visualisés sur un microscope à épifluorescence droit de type Leica DM R (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) équipé d'un objectif 63x/1,32 NA et un jeu de filtres Chroma Technology (Bellows Falls, VT, USA) pour l'EGFP: excitation : S490/20 nm, émission : S528/38 nm , dichroïque: 86100bs; le TRITC: excitation : S555/28 nm, émission : S617/73, dichroïque: 101848; le Cy5: excitation : S635/20, émission : S685/40 nm, dichroïque: 101848. Les images ont été acquises avec une caméra CCD (HQ Coolsnap, Roper Scientific, Evry, France), en utilisant le logiciel Metamorph (Universal Imaging Corp.) Les facteurs d'enrichissement de Neuroligine-1 et de PSD-95 ont été mesurés sur 3 régions dendritiques choisies au hasard sur chaque neurone et ont été calculés en utilisant un programme automatique écrit dans le logiciel Metamorph (Universal Imaging Corp), et une procédure explicitée dans la figure 5. Décaqeaqe de qlutamate Les neurones d'hippocampe dissociés transfectés avec la Neuroligine-1-HA et la PSD-95:mCherry, et qui ont poussé pendant 7 à 8 jours sur les substrats comprenant des îlots recouverts de neurexine-113- Fc, ont été marqués avec 2,5 pM de Fluo-4-AM (Invitrogen ; F23917) pendant 5 min dans un milieu de culture Neurobasal (NB) (Gibco, 12348-017) complété avec du B27 (Gibco, 17504-044) et L-Glutamine (GIu200100, MidiMed) puis placé dans 400 pl de Tyrode (30 mM de glucose, 120 mM NaCl, 5 mM de KCI, 0,1 mM MgCl2, 2 mM de CaCl2, 25 mM d'HEPES (Sigma; glucose : G6152, NaCl : S7653, KCI: P4504, MgCl2: M8266, CaCl2: C7902, HEPES: H4034) complémenté avec 5 mM de 4-méthoxy-7-nitroindolinyl-cage L-glutamate (MNI-glu) (Tocris, 1490), et 1 pM TTX (Ascent Scientific, ASC-055) pour éviter la génération d'éventuels potentiels d'action. La chambre d'observation a été placée sur un microscope confocal à balayage laser (TCS SP5; Leica) thermostatée à 37°C et équipé d'un laser pulsé bi-photon (Mai Tai; Spectra-Physics) réglé à 750 nm. Pour les enregistrements de fluorescence, une zone de 100 x 100 pm a été balayée à 700 Hz par un laser Argon à 488 nm et la fluorescence a été recueillie entre 500 et 530 nm par un photomultiplicateur, en utilisant un objectif à huile HCX PL APO CS 63X/1.32 NA et un iris ouvert à trois fois le disque d'Airy (180 µm). Après l'enregistrement d'une ligne de base, une impulsion de lumière bi-photon d'une durée de 10 ms correspondant à un balayage d'une zone restreinte de 2 pm de diamètre, à proximité d'un ilot, a été imposée pour décager le glutamate cagé. Les signaux de fluorescence de Fluo-4 ont alors été enregistrés pendant 1 minute. Pour représenter la réponse calcique obtenue lors du décageage de MNI-glu, les valeurs d'intensité de fluorescence du fluo-4 à un endroit donné ont été normalisées à l'intensité moyenne de fluorescence obtenue avant l'impulsion lumineuse bi-photon. Imaqerie de cellules vivantes Les neurones primaires hippocampiques (DIV7) cultivés sur la neurexine-1 R-Fc recouvrant les micro-motifs et exprimant Nlgn-1 WT et PSD-95:EGFP ont été placés dans une chambre ouverte contenant un mélange 1:1 d'une solution de Tyrode et de milieu conditionné NB. Les cellules ont ensuite été observées sur un microscope inversé Leica 6000 DMI (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne), équipé d'une caméra CCD (Coolsnap HQ2, Roper Scientific, Evry, France) et une boîte thermostatique (Life Imaging Services, Bâle, Suisse) fournissant 37°C et 5% de CO2. Des acquisitions sur des périodes de plusieurs heures ont été faites en utilisant un éclairage avec une lampe au mercure, un objectif HCX PL APO CS d'huile 63X 1,32 NA et des filtres interférentiels de la compagnie Chroma Technology (Bellows Falls, VT, USA), pour l'observation de la EGFP (excitation HQ 480/30 nm, dichroïque 86100bs, émission S528/38 nm) et de Cy5 (excitation HQ630/20 nm, dichroïque 101848, émission S685/40 nm). Des images de PSD-95:EGFP ont été enregistrées toutes les 10 min pendant 4 h, tandis que des images des motifs Cy5 ont été prises seulement deux fois, l'une avant et l'autre après l'acquisition. Résultats et discussion Les protéines d'adhésion transmembranaires, neurexines et neuroligines sont des acteurs clés dans la formation des synapses (Sudhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature 455, 903-11 (2008). [36]). Ces molécules forment un lien entre les membranes pré- et post-synaptiques par une reconnaissance de haute affinité entre leurs ectodomaines (Craig, A. M. & Kang, Y. Neurexinneuroligin signaling in synapse development. Curr Opin Neurobiol 17, 43-52 (2007). [41]). Lorsqu'on les présente à la surface de cellules hétérologues ou de microsphères, la neuroligine et la neurexine ont la capacité de générer respectivement des pré- et post-synapses fonctionnelles, lors de contacts avec des neurones primaires (Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W. & Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Ce// 119, 1013-26 (2004). [34], Heine, M., Thoumine, O., Mondin, M., Tessier, B., Giannone, G. & Choquet, D. Activity-independent and subunit-specific recruitment of functional AMPA receptors at neurexin/neuroligin contacts. Proc Nat/ Acad Sci U S A 105, 20947-52 (2008). [35], Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R. & Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Ce// 101, 657-69. (2000). [35], Sudhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature 455, 903-11 (2008). [36], Ko, J., Zhang, C., Arac, D., Boucard, A. A., Brunger, A. T. & Sudhof, T. C. Neuroligin-1 performs neurexindependent and neurexin-independent functions in synapse validation. Embo J 28, 3244-55 (2009). [37]). L'importance de la neurexine et de la neuroligine dans la fonction synaptique est encore soulignée par les phénotypes anormaux des modèles de souris « knock-out » (Chubykin, A. A., Atasoy, D., Etherton, M. R., Brose, N., Kavalali, E. T., Gibson, J. R. & Sudhof, T. C. Activity-Dependent Validation of Excitatory versus Inhibitory Synapses by Neuroligin-1 versus Neuroligin-2. Neuron 54, 919-31 (2007). [42] ; Missler, M., Zhang, W., Rohlmann, A., Kattenstroth, G., Hammer, R. E., Gottmann, K. & Sudhof, T. C. Alpha-neurexins couple Ca2+ channels to synaptic vesicle exocytosis. Nature 423, 939-48 (2003). [43] Varoqueaux, F., Aramuni, G., Rawson, R. L., Mohrmann, R., Missler, M., Gottmann, K., Zhang, W., Sudhof, T. C. & Brose, N. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron 51, 741-54 (2006). [44]) Le présent exemple via l'utilisation du support de culture de l'invention a permis avantageusement de cultiver des cellules neuronales et un contrôle spatial de la formation de synapses à une résolution micrométrique, de part les propriétés d'adhésion du complexe synaptogène neurexine/neuroligine (Figures 1 et 2). La culture de neurones hippocampiques de rat sur des substrats possédant des îlots revêtus de neurexine purifiée a été réalisée et les cellules obtenues sont représentées sur les Figures 3 et 4. Les substrats à îlots possèdent un réseau régulier d'îlots activés chimiquement (1,5 pm de diamètre, séparés par 5 pm), entouré d'un fond non-adhésif. Les îlots ont été revêtus d'une neurexine-1[3 recombinante fusionnée avec le fragment constant des IgG humain, Fc (Nrxl R-Fc), ou de Fc pur utilisé en tant que molécule témoin. Le couplage a été fait via un anticorps secondaire anti-Fc marqué avec le fluorophore Cy5, permettant avantageusement à la fois la 30 bonne orientation de l'ectodomaine adhésif et la visualisation de la fluorescence des micro-îlots. Des neurones d'hippocampe dissociés ont été placés sur ces substrats et ont permis leurs développements pendant 7 à 10 jours. Les neurones ont été transfectées après 4 jours avec de la neuroligine-1 (Nlgn- 1), ou de la protéine fluorescente verte (EGFP) comme témoin. La reconnaissance entre la Nrx1 8.-Fc immobilisée et la neuroligine-1 exprimé dans les neurones à fortement affecté la morphologie cellulaire et limité la croissance en fonction de la géométrie et du positionnement des îlots tel que représenté sur la Figure 3. De façon surprenante et avantageuse, les dendrites des neurones exprimant la neuroligine-1 se sont propagés de façon préférentielle le long des lignes d'îlots recouverts de neurexine-1 R-Fc et les ont envahis à un degré beaucoup plus élevé que les axones de ces mêmes cellules (Figure 4). Etude de la croissance des cellules neuronales et formation d'assemblaqes post-synaptiques Pour examiner la formation de post-synapses sur ces substrats, l'accumulation des protéines post-synaptiques neuroligine-1 et PSD-95, ou de la protéine témoin EFGP, sur des îlots recouverts de neurexine-1 R-Fc ou de Fc a été examinée pour chaque condition. Un indice d'enrichissement a été calculé en divisant l'intensité moyenne de fluorescence de la protéine donnée dans des zones dendritique de colocalisation avec des îlots revêtu de protéines, par l'intensité moyenne de fluorescence des zones dendritiques situé entre les îlots (Figure 5). Du fait que chaque neurone entre en contact avec des centaines de micro-îlots, les valeurs des échantillons statistiques permettant les comparaisons deviennent vite très élevées. La quantification présentée en Figure 6 montre que les deux protéines étaient significativement recrutées aux îlots recouverts de Nrx1 8.-Fc (Nlgn-1: 26 cellules, n=2608 îlots; NLGN-1 + PSD- 95:EGFP: 17 cellules, n=993 îlots). Le recrutement détecté était spécifique 31 de l'interaction neurexine/neuroligine (EGFP : 24 cellules, n = 1045 îlots; EGFP + PSD-95:mCherry : 7 cellules, n = 446 îlots) ou un revêtement des îlots avec du Fc au lieu de la Nrxl 8.-Fc (Nlgn-1 : 11 cellules, n = 608 îlots; Nlgn-1 + PSD-95:EGFP : 3 cellules, n = 158 îlots). La protéine endogène PSD-95 a également été significativement recrutée au niveau des îlots (15 cellules, n = 1482 îlots). Etude de la formation de synapses par les cellules neuronales en culture sur le substrat de l'invention 1 o Il a été observé des structures de type épines dendritiques montrant une accumulation de neuroligine-1 dans la partie périphérique des filopodes attachée au micro-pattern recouvert de neurexine-1 R-Fc (Figure 3c). Aussi, afin de mieux comprendre la dynamique de la formation des synapses, ce système a été combiné avec la vidéo-microscopie pour 15 imager en direct la fluorescence de la PSD-95 :EGFP. L'un des avantages de l'utilisation du substrat de culture de l'invention comprenant des îlots par rapport à des observations aléatoires de la formation des synapses est que l'on contrôle la position où la formation des synapses est attendue. Un point qui n'est pas encore clair dans la littérature est de savoir si les 20 synapses se forment entre les filopodes axonaux contactant les dendrites, ou entre les filopodes dendritiques contactant les axones. Cet exemple démontre clairement que les filopodes dendritiques, grâce un agrégat de la protéine d'échafaudage PSD-95 situé à l'extrémité du filopode, peuvent atteindre les micro-îlots de neurexine et établir un contact ferme dans les 3 25 heures (Figure 7). Ces complexes préformés contenant de la Neuroligine-1 et de la PSD-95, sont susceptibles de servir de précurseurs post-synaptiques prédéterminés pour l'établissement de nouvelles synapses excitatrices fonctionnelles. Cet exemple démontre clairement que le dispositif de l'invention 3o permet de cultiver et d'étudier les mécanismes physiologiques, par exemple du développement des synapses. 32 Dans un deuxième temps, il a été testé si les contacts neuronaux nouvellement formés sur les îlots de neurexine contenaient des récepteurs fonctionnels au glutamate, en utilisant la technique de décageage de glutamate et l'imagerie du calcium. Les neurones ont été transfectés avec la PSD-95:mCherry afin de visualiser les différenciations post-synaptiques et incubées avec un indicateur de calcium pénétrant dans les cellules (le Fluo-4). Lorsque le MNI-glutamate a été photo-libéré à proximité d'îlots de neurexine montrant une accumulation de PSD-95-mcherry, des flux 1 o calciques transitoires locaux et sélectifs ont été enregistrées (Figure 8), démontrant ainsi la présence de canaux fonctionnels des récepteurs du glutamate. Dans une étude précédente, en utilisant des billes recouvertes de neurexine-1 R-Fc, il a été montré que les flux calciques transitoires sont dus à canaux calciques voltage dépendants qui s'ouvrent grâce la 15 dépolarisation de la membrane induite par l'activation des récepteurs AMPA par le glutamate (Heine, M., Thoumine, O., Mondin, M., Tessier, B., Giannone, G. & Choquet, D. Activity-independent and subunit-specific recruitment of functional AMPA receptors at neurexin/neuroligin contacts. Proc Nat/ Acad Sci U S A 105, 20947-52 (2008). [34]). 20 Tel que démontré dans cet exemple, le dispositif de l'invention permet d'étudier la formation des synapses et la fonction synaptique avec une production élevée de données statistiques et reproductibles. En outre, le dispositif de l'invention peut être largement utilisé avec d'autres molécules synaptogènes, comme les neuroligines, par exemple pour 25 induire la formation de pré-synapses et/ou avec des protéines récemment identifiées comme les LRRTMs et les TrkC (Sudhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature 455, 903-11 (2008). [36], Linhoff, M. W., Lauren, J., Cassidy, R. M., Dobie, F. A., Takahashi, H., Nygaard, H. B., Airaksinen, M. S., Strittmatter, S. M. & 30 Craig, A. M. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron 61, 734-49 (2009). [38], Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C. & Sudhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron 64, 791-798 (2009). [39], de Wit, J., Sylwestrak, E., O'Sullivan, M., Otto, S., Tiglio, K., Savas, J. N., Yates, J. R., Comoletti, D., Taylor, P. & Ghosh, A. LRRTM2 Interacts with Neurexinl and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron 64, 799-806 (2009). [40], Takahashi, H., Arstikaitis, P., Prasad, T., Bartlett, T. E., Wang, Y. T., Murphy, T. H. & Craig, A. M. Postsynaptic TrkC and presynaptic PTPsigma function as a bidirectional excitatory synaptic organizing complex. Neuron 69, 287-303 (2011). [45]). En outre le dispositif de l'invention permet via l'utilisation de différentes protéines d'adhésion immobilisées au niveau des îlots, l'étude sélective de différents systèmes synaptiques, ou de protéines impliquées dans la croissance des axones et dendrites. Par exemple, lorsque la N- cadhérine-Fc a été déposée, une croissance importante des neurites a été observée dans des directions en relation avec la disposition des îlots, accompagnée d'une adhésion et d'une migration spécifique des cônes de croissance, ce qui n'était pas le cas pour des substrats recouverts de la molécule témoin Fc (Figure 9). De plus, les cellules transfectées avec N- cadhérine-RFP, mais pas les cellules transfectées avec la protéine témoin RFP, ont montré une accumulation locale de N-cadhérine-RFP sur les îlots recouverts de N-cadhérine-Fc (Figure 10). Ainsi, le dispositif de l'invention peut être utilisé dans des procédés dans lesquels des molécules sont criblées afin d'étudier leur effet sur la différenciation synaptique. II permet également de dépister de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies telles que l'autisme, la schizophrénie, et le retard mental lié au chromosome X chez l'homme, pathologies dans lesquelles des mutations des gènes codant pour les neuroligines et les neurexines semblent être impliquées ( Jamain, S., Quach, H., Betancur, C., Rastam, M., Colineaux, C., Gillberg, I. C., Soderstrom, H., Giros, B., Leboyer, M., Gillberg, C. & Bourgeron, T. 34 Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet 34, 27-9 (2003). [46], Talebizadeh, Z., Lam, D. Y., Theodoro, M. F., Bittel, D. C., Lushington, G. H. & Butler, M. G. Novel splice isoforms for NLGN3 and NLGN4 with possible implications in autism. J Med Genet 43, e21 (2006). [47], Rujescu, D., Ingason, A., Cichon, S., Pietilainen, O. P., Barnes, M. R., Toulopoulou, T., Picchioni, M., Vassos, E., Ettinger, U., Bramon, E., Murray, R., Ruggeri, M., Tosato, S., Bonetto, C., Steinberg, S., Sigurdsson, E., Sigmundsson, T., Petursson, H., Gylfason, A., Olason, P. I., Hardarsson, G., Jonsdottir, G. A., Gustafsson, O., Fossdal, R., Giegling, I., Moller, H. J., Hartmann, A. M., Hoffmann, P., Crombie, C., Fraser, G., Walker, N., Lonnqvist, J., Suvisaari, J., Tuulio-Henriksson, A., Djurovic, S., Melle, I., Andreassen, O. A., Hansen, T., Werge, T., Kiemeney, L. A., Franke, B., Veltman, J., Buizer-Voskamp, J. E., Sabatti, C., Ophoff, R. A., Rietschel, M., Nothen, M. M., Stefansson, K., Peltonen, L., St Clair, D., Stefansson, H. & Collier, D. A. Disruption of the neurexin 1 gene is associated with schizophrenia. Hum Mol Genet 18, 988-96 (2009). [48]). Exemple 3 : Procédé de criblage de molécule sur des cultures de cellules neuronales avec le support de l'invention Les cellules et les substrats de culture sont obtenus selon le procédé décrit dans les exemples 1 et 2 précités. Après 4 jours de culture, les cellules neuronales cultivées sur les substrats recouverts de N-cadhérine-Fc (BD Transduction Laboratories (marque de commerce), ref 610921) sont mis en présence de peptides compétiteurs des interactions cadhérines, par exemple contenant les séquences HAV (1 mM) (Williams, E. J., Williams, G., Gour, B., Blaschuk, O. & Doherty, P. INP, a novel N-cadherin antagonist targeted to the amino acids that flank the HAV motif. Mol Cell Neurosci 15, 456-64 (2000). [49], Williams, E., Williams, G., Gour, B. J., Blaschuk, O. W. & Doherty, P. A novel family of cyclic peptide antagonists suggests that N-cadherin 35 specificity is determined by amino acids that flank the HAV motif. J Biol Chem 275, 4007-12 (2000). [50]), de fragments protéiques adhésifs issus des cadhérines, par exemple les domaines EC1-EC2 (Perret, E., Benoliel, A. M., Nassoy, P., Pierres, A., Delmas, V., Thiery, J. P., Bongrand, P. & Feracci, H. Fast dissociation kinetics between individual E-cadherin fragments revealed by flow chamber analysis. Embo J 21, 2537-46 (2002). [51], Perret, E., Leung, A., Feracci, H. & Evans, E. Trans-bonded pairs of E-cadherin exhibit a remarkable hierarchy of mechanical strengths. Proc Nat/ Acad Sci U S A 101, 16472-7 (2004). [52]) ou transfectés avec des siRNA dirigés contre les cadhérines (Paradis, S., Harrar, D. B., Lin, Y., Koon, A. C., Hauser, J. L., Griffith, E. C., Zhu, L., Brass, L. F., Chen, C. & Greenberg, M. E. An RNAi-based approach identifies molecules required for glutamatergic and GABAergic synapse development. Neuron 53, 217-32 (2007). [53]) ou les caténines (Bard, L., Boscher, C., Lambert, M., Mege, R. M., Choquet, D. & Thoumine, O. A molecular clutch between the actin flow and N-cadherin adhesions drives growth cone migration. J Neurosci 28, 5879-90 (2008). [25]) ou des molécules de cadhérines mutées (dans les domaines extracellulaires pour empêcher les interactions avec les contre-récepteurs cadhérines, ou dans les domaines intracellulaires pour empêcher la liaison avec les partenaires intracellulaires). L'effet de ces composés sur le développement des neurites et des synapses au bout de 8 jours de culture sera examiné et quantifié comme cela a été expliqué dans les Figures n° 5 et 6. Après 4 jours de culture, les cellules neuronales cultivés sur les substrats micro-patternés recouverts de neurexine-1 R-Fc sont mis en présence de protéines neurexines recombinantes (Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R. & Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Ce// 101, 657-69. (2000). [35], Dean, C., Scholl, F. G., Choih, J., DeMaria, S., Berger, J., Isacoff, E. & Scheiffele, P. Neurexin mediates the assembly of presynaptic terminais. Nat Neurosci 6, 708-16. (2003). [54], Levinson, J. N., Chery, N., 36 Huang, K., Wong, T. P., Gerrow, K., Kang, R., Prange, O., Wang, Y. T. & El-Husseini, A. Neuroligins mediate excitatory and inhibitory synapse formation: involvement of PSD-95 and neurexin-1 beta in neuroligininduced synaptic specificity. J Biol Chem 280, 17312-9 (2005). [55]), de peptides cellule-perméants compétiteurs des interactions entre protéines au niveau post-synaptique (Sainlos, M., Tigaret, C., Poujol, C., Olivier, N. B., Bard, L., Breillat, C., Thiolon, K., Choquet, D. & Imperiali, B. Biomimetic divalent ligands for the acute disruption of synaptic AMPAR stabilization. Nat Chem Biol 7, 81-91 (2010). [56], Bard, L., Sainlos, M., Bouchet, D., Cousins, S., Mikasova, L., Breillat, C., Stephenson, F. A., Imperiali, B., Choquet, D. & Groc, L. Dynamic and specific interaction between synaptic NR2-NMDA receptor and PDZ proteins. Proc Nat/ Acad Sci U S A 107, 19561-6 (2010). [57]) ou transfectées avec des siRNA dirigés contre les neuroligines (Chih, B., Engelman, H. & Scheiffele, P. Control of excitatory and inhibitory synapse formation by neuroligins. Science 307, 1324-8 (2005). [58]) ou les LRRTMs, ou des molécules de neuroligines ou LRRTMs mutées (dans leurs domaines extracellulaires pour empêcher les interactions avec la neurexine, ou dans les domaines intracellulaires pour empêcher la liaison avec les partenaires post-synaptiques). L'effet de ces composés sur le développement des neurites, des cônes de croissance, et des synapses au bout de 8 jours de culture est examiné et quantifié comme cela est décrit dans les Figures n° 5 et 6. Après 4 jours de culture, les cellules neuronales cultivés sur les substrats recouverts de neuroligines ou de LRRTMs sont mis en présence de protéines neuroligines ou de LRRTMs recombinantes (Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R. & Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Ce// 101, 657-69. (2000). [35], Dean, C., Scholl, F. G., Choih, J., DeMaria, S., Berger, J., Isacoff, E. & Scheiffele, P. Neurexin mediates the assembly of presynaptic terminais. Nat Neurosci 6, 708-16. (2003). [54], Levinson, J. N., Chery, N., Huang, K., Wong, T. P., Gerrow, K., Kang, R., Prange, O., 37 Wang, Y. T. & El-Husseini, A. Neuroligins mediate excitatory and inhibitory synapse formation: involvement of PSD-95 and neurexin-1 beta in neuroligin-induced synaptic specificity. J Biol Chem 280, 17312-9 (2005). [55]), de peptides cellule-perméants compétiteurs des interactions entre protéines au niveau pré-synaptique, ou transfectées avec des siRNA dirigés contre les neurexines ou des molécules de neurexines mutées (dans leurs domaines extracellulaires pour empêcher les interactions avec les neuroligines ou LRRTMs, ou dans les domaines intracellulaires pour empêcher la liaison avec les partenaires pré-synaptiques). L'effet de ces 1 o composés sur le développement des neurites et des synapses au bout de 8 jours de culture est examiné et quantifié comme cela est décrit dans les Figures n° 5 et 6. Les peptides et protéines sont utilisés à des concentrations 10 fois supérieures aux constantes de dissociation des interactions visées, c'est à 15 dire typiquement 1 pM pour les interactions cadhérines, 10 nM pour les interactions neurexines/neuroligines, et 5 pM pour les interactions intracellulaires au niveau des échafaudages pré- et post-synaptiques. Les siRNA sont utilisés à des concentrations de 0,5-2 pg/support en utilisant l'agent de transfection Lipofectamine 2000, suivant les recommandations 20 du fournisseur (Invitrogen). Alternativement, les substrats sont ensemencés avec des neurones issus de souris knock-out pour certains gènes, par exemple, les neurexines (Missler, M., Zhang, W., Rohlmann, A., Kattenstroth, G., Hammer, R. E., Gottmann, K. & Sudhof, T. C. Alpha-neurexins couple 25 Ca2+ channels to synaptic vesicle exocytosis. Nature 423, 939-48 (2003). [43]), les neuroligines (Varoqueaux, F., Aramuni, G., Rawson, R. L., Mohrmann, R., Missler, M., Gottmann, K., Zhang, W., Sudhof, T. C. & Brose, N. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron 51, 741-54 (2006). [44]), les IgCAMs (Kamiguchi, H., Hlavin, M. L. & 30 Lemmon, V. Role of L1 in neural development: what the knockouts tell us. Mol Cell Neurosci 12, 48-55 (1998). [59]) ou les cadhérines (Suzuki, S. C., Furue, H., Koga, K., Jiang, N., Nohmi, M., Shimazaki, Y., Katoh-Fukui, Y., Yokoyama, M., Yoshimura, M. & Takeichi, M. Cadherin-8 is required for the first relay synapses to receive functional inputs from primary sensory afferents for cold sensation. J Neurosci 27, 3466-76 (2007). [60]), ou de souris mutée (« knock-in ») exprimant des protéines d'adhérence portant des mutations impliquées dans certaines pathologies telles l'autisme, la schizophrénie, ou le retard mental (Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J. & Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. Embo J 30, 2908-19. [61], Tabuchi, K., Blundell, J., Etherton, M. R., Hammer, R. E., Liu, X., Powell, C. M. & Sudhof, T. C. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science 318, 71-6 (2007). [62]), et le développement d'hémi-synapses est étudié tel que décrit dans les Figures n° 5 et 6. 39 Listes des références 1. Folkman, J. & Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature 273, 345-9 (1978). 2. Watt, F. M., Jordan, P. W. & O'Neill, C. H. Oeil shape controls terminal differentiation of human epidermal keratinocytes. Proc Nat/ Acad Sci U S A 85, 5576-80 (1988). 3. Thery, M., Racine, V., Pepin, A., Piel, M., Chen, Y., Sibarita, J. B. & Bornens, M. The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis. Nat Cell Biol7, 947-53 (2005). 4. Thery, M., Racine, V., Piel, M., Pepin, A., Dimitrov, A., Chen, Y., Sibarita, J. B. & Bornens, M. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internai organization and orientation of polarity. Proc Nat/ Acad Sci USA 103, 19771-6 (2006). 5. Ireland, G. W., Dopping-Hepenstal, P. J., Jordan, P. W. & O'Neill, C. H. 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REVENDICATIONS1. Support (1) de culture de cellules neuronales (c) comprenant un substrat (3) sur une surface (5) duquel sont disposés des îlots (7) de protéines d'adhésion desdites cellules neuronales choisies parmi les molécules d'adhérences de type immunoglobuline (IgCAM), les cadhérines, les neurexines, les neuroligines, et les protéines transmembranaires à domaine riche en leucine ou un mélange de celles-ci, lesdits îlots (7) ayant un diamètre de 0,2 à 2,5 pm et étant espacés entre eux de 0,500 à 10 pm. 2. Support selon la revendication 1, dans lequel la surface (5) entre les îlots (7) est une surface cytophobe (9). 3. Support selon la revendication 1 ou 2, dans lequel lesdites protéines d'adhésions sont fixées par liaison chimique, soit directement sur la surface (5), ou via un liant intermédiaire fixé sur ladite surface (5), ledit liant étant choisi parmi une espèce chimique réactive, une protéine, un polysaccharide, un anticorps, un polymère, une espèce chargée. 4. Support selon l'une quelconque selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la protéine d'adhésion des cellules neuronales est une protéine d'adhésion issue d'une membrane de cellules neuronales ou d'une membrane physiologique de cellules non-neuronales supportant une cellule neuronale. 5. Support selon l'une quelconque selon l'une quelconque des 3o revendications 1 à 4 dans lequel la surface (5) est rendue cytophobe du fait d'un composé choisi parmi le polyéthylène 49 glycol, le poly(acétate de vinyle), le poly(2-hydroxyéthyl métacrylate, le polyacrylamide, le poly(N-vinyl-2-pyrrolidone), le poly(N-isopropyl acrylamide), les polymères anionique, les polymères phosphoryl choline, l'albumine, la caséine, l'acide hyaluronique, les liposchaccarides, les glycoprotéines, les phospholipides ou un mélange de ceux-ci. 6. Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les îlots (7) sont déposés sur la surface (5) par une 1 o méthode choisie parmi la photolithographie, la dip-pen nanolithographie, la lithographie par faisceau, l'impression par jet d'encre, l'impression par microcontact. 7. Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 15 comprenant des cellules neuronales sur les îlots (7). 8. Support selon la revendication 7 dans lequel lesdites des cellules neuronales sont choisies dans le groupe comprenant des cellules neuronales issues du système nerveux d'un mammifère, oiseau, 20 batracien, ou mollusque, et/ou toute cellule issue d'une lignée cellulaire neuronale. 9. Support selon la revendication 7 ou 8 dans lequel les cellules neuronales sont isolées du système nerveux de rongeurs, de 25 poulets, de batraciens, de mollusques. 1O.Support selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 dans lequel les cellules neuronales sont choisies parmi la lignée neuroblastome SH-SY5Y, la lignée PC12, la lignée de cellules 3o neuronales corticales (HCN-1), ou la lignée de neuroblastomes B104. 50 11. Procédé de fabrication d'un support selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant une étape de dépôt sur une surface (5) d'un substrat d'îlots (7) de protéines d'adhésion de cellules neuronales choisie parmi les molécules de type immunoglobulines (IgCAM), les cadhérines, les neurexines, les neuroligines, et les protéines transmembranaires à domaines riche en leucine ou un mélange de celles-ci, lesdits d'îlots (7) ayant un diamètre de 0,2 à 2,5 pm et étant espacés entre eux de 0,500 à 10 pm. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le procédé comprend en outre une étape de revêtement un composé cytophobe choisi parmi le polyéthylène glycol, le poly(acétate de vinyle) le poly(2-hydroxyéthyl métacrylate, le polyacrylamide, le poly(N-vinyl-2-pyrrolidone), le poly(N-isopropyl acrylamide), les polymères anionique, les polymères phosphoryl choline, l'albumine, la caséine, l'acide hyaluronique, les liposchaccarides, les glycoprotéines, les phospholipides ou un mélange de ceux-ci, ladite étape de revêtement étant préalable à l'étape de dépôt des îlots de protéines d'adhésion. 13. Utilisation d'un support selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la culture de cellules neuronales. 14. Utilisation d'un support selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 dans une méthode d'analyse qualitative et/ou quantitative de la croissance des neurites et de la synaptogénèse desdites cellules neuronales. 3015. Utilisation d'un support selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 dans une méthode de criblage.