Brevet FR2985430A1 — publié le 20130712

La présente invention est relative au domaine des vaccins et plus particulièrement aux compositions vaccinales comprenant au moins un adjuvant. En particulier, l'invention concerne une composition vaccinale comprenant des nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium, en particulier de copolymère à blocs doubles hydrophiles (DHBC). Il est connu depuis très longtemps dans l'art antérieur que l'Aluminium est intéressant pour adjuver les vaccins. De nombreux vaccins commercialisés en contiennent, soit sous forme d'hydroxyde, soit sous forme de phosphates ; ces dénominations ne reflétant d'ailleurs pas exactement la composition chimique des produits correspondants : les hydroxydes d'Aluminium sont plutôt des oxyhydroxydes, et les phosphates d'Aluminium sont rarement des phosphates purs, mais contiennent très souvent d'autres ions, notamment des sulfates, ainsi que des hydroxydes. Pour les besoins de la présente invention, le terme d'hydroxydes d'Aluminium signifiera donc à la fois les hydroxydes ainsi que les oxyhydroxydes d'Aluminium. Si ces adjuvants à base d'Aluminium, encore appelés gels d'Aluminium ont montré tout leur intérêt pour augmenter la réponse immunitaire induite par un antigène, ils présentent cependant quelques inconvénients. D'un point de vue industriel, les suspensions traditionnelles d'hydroxyde ou de phosphate d'Aluminium ne permettent pas, à cause de la taille trop grande des particules, de procéder en fin de production, à une stérilisation par filtration et imposent donc de recourir à un procédé de production se déroulant dans des conditions aseptiques. D'autre part, dans le cas de certains modes d'administration, notamment la voie intradermique, il a été reproché à l'Aluminium de conduire à un effet tatouage au site d'administration. Il est donc souhaitable de pouvoir disposer de compositions vaccinales comprenant de l'Aluminium afin de bénéficier de ses pouvoirs adjuvant, tout en évitant ses inconvénients. A cette fin, la présente invention propose une composition vaccinale comprenant au moins un antigène et un adjuvant, caractérisée en ce que l'adjuvant comprend des nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium. La présente invention a également pour objet l'utilisation de nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium pour la préparation d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène. -2 La présente invention a encore pour objet un procédé de préparation d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène et un adjuvant, selon lequel : a) on prépare des nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium, b) on filtre lesdites nanoparticules au moyen d'un filtre stérilisant, c) et on ajoute auxdites nanoparticules au moins un antigène vaccinal. De façon alternative, on peut effectuer l'étape b) après l'étape c) au lieu de le faire avant ; ou bien encore réaliser une 2nde étape de filtration après l'étape c). Grâce à l'objet de l'invention, il est possible d'avoir un adjuvant vaccinal induisant moins de réaction de réactogénicité que les suspensions d'Aluminium utilisées classiquement et permettant d'effectuer en fin de procédé de fabrication, une stérilisation par filtration. D'autres avantages de l'invention apparaitront au cours de la description qui va suivre en référence aux figures qui illustrent les résultats des tests décrits dans les exemples. Aux termes de la présente invention, les nanoparticules sont des particules dont la taille permet leur passage à travers un filtre stérilisant, dont les pores ont un diamètre de 220 nm. Les particules ont donc une taille inférieure à 300 nm, car par déformation, de telles particules peuvent passer dans des pores de plus petite taille. Mais de façon préférée, les particules ont une taille inférieure à 220 nm, et même inférieure à 200 nm. Le diamètre des particules est un diamètre hydrodynamique qui peut être mesuré par différentes techniques ; par exemple on peut utiliser la diffusion quasi-élastique de la lumière au moyen d'un Malvern autosizer 4800 équipé d'un laser. De telles particules forment des suspensions colloïdales qui sont transparentes. Avantageusement, on utilise des suspensions dont la majorité des particules ont entre 30 et 200 nm de diamètre, ce qui permet de les filtrer sans trop de perte de matière, avec un filtre stérilisant dont le seuil de coupure est 220 nm. Selon l'invention, les nanoparticules sont des hybrides d'Aluminium et de copolymère. L'Aluminium présent dans ces particules hybrides est introduit sous forme d'un précurseur qui est un sel d'Aluminium, de préférence un polycation d'Aluminium. Parmi les sels qui conviennent, on peut citer A1137+, A13+ A124+, ou encore A13018+ . De façon particulièrement avantageuse pour l'invention, on choisit le polycation A1137+ dont la formule chimique complète est A104A112(OH)24(0H2)127+. Ce cation est constitué d'un atome d'Aluminium central en coordinence tetraédrique (site A104) entouré par douze atomes d'Aluminium en coordinence octaédrique (site Al(OH)6) répartis en 4 sous-unités trimériques. Pour obtenir de telles - 3 - solutions de polycations, on effectue une hydrolyse basique de solutions peu concentrées en A13+, ce qui permet d'obtenir des rendements en A1137+ proches de 100%. On peut par exemple hydrolyser une solution de nitrate d'Aluminium Al(NO3)3,9H20 par une solution de soude NaOH sous forte agitation. Le taux d'hydrolyse h qui est le rapport OH/A1 est de façon particulièrement avantageuse choisi pour être 2.46. Le précipité blanc qui se forme quand la base est ajoutée se dissout immédiatement sous l'effet de l'agitation. A la fin de la réaction, la solution de polycations d'Aluminium est limpide. Les copolymères utilisés dans le cadre de l'invention sont des copolymères complexant de l'Aluminium formés de 2 monomères de nature différente qui possèdent la propriété d'être tous deux hydrophiles, et donc solubles en milieu aqueux. Il s'agit notamment de DHBC ou copolymères à bloc double hydrophiles. Ces copolymères peuvent être des polymères statistiques, des polymères séquencés, des polymères-étoile, des polymères greffés ou encore des polymères d'architecture mixte, par exemple des polymères séquencés avec une séquence de conformation peigne. Ces copolymères sont constitués par : - un bloc ionisable, par exemple une chaine de poly(acide acrylique) PAA, ou de poly(acide methacrylique) PMA, - un bloc neutre, par exemple, une chaîne de poly(acrylamide) PAM ou de poly(oxyde d'éthylène) POE. De préférence, le bloc ionisable présente une affinité pour l'Aluminium alors que le bloc neutre est uniquement soluble dans l'eau. Chaque copolymère est caractérisé par la masse molaire de chaque bloc ainsi que par son degré d'asymétrie qui est le rapport entre le nombre de monomères du bloc neutre et le nombre de monomères du bloc ionisable. On a pu remarquer que les particules préparées avec un copolymère asymétrique nécessitent moins de copolymère, en masse totale, pour être stabilisées que des particules préparées avec un copolymère symétrique. Aux fins de l'invention, les copolymères PMA3000-b-P0E8000 ou PMA2000-b-P0E7800, dans lesquels les nombres en indice correspondent aux masses molaires de chaque séquence, conviennent particulièrement bien. De tels copolymères sont disponibles commercialement auprès de la Société Polymer Source. Les nanoparticules sont formées par une méthode telle que celle décrite dans la publication C. Gerardin, N. Sanson, F. Bouyer, F. Fajula, J-L. Putaux, M. Joanicot, T. Chopin, Angewandte - 4 - Chemie, International Edition, 2003, 42, 3681-3685 ou encore dans N. Sanson, F. Bouyer, C. Gerardin, M. In, Phys. Chem. Chem. Phys., 2004, 6, 1463-1466. La préparation des nanoparticules se déroule en 2 étapes. Dans un 1er temps, on forme des micelles ou aggrégats complexes par mélange d'une solution de copolymère et d'une solution de cations d'Aluminium sous agitation. Les micelles sont formés par l'interaction entre les groupements C00- du copolymère et les polycations. Ces micelles sont les précurseurs moléculaires des particules. La 2nde étape consiste en la minéralisation des micelles par ajout, sous agitation, d'une base ( par exemple NaOH) dans le cas où on souhaite obtenir des particules d'hydroxyde d'Aluminium, ou d'une solution de phosphate de potassium (K+, H2PO4-) dans le cas où on souhaite obtenir des particules de phosphate d'Aluminium. La stabilité colloïdale des particules est alors obtenue grâce à la couronne de chaines de polymères neutres (blocs POE ou PAM) qui apporte une gêne stérique importante et évite les aggrégats. On obtient donc des particules facilement dispersables en milieu aqueux qui ne décantent pas au stockage. On a pu remarquer que, si on apprécie la stabilité au regard du diamètre hydrodynamique des particules ou de l'intensité diffusée de la lumière, les nanoparticules selon l'invention sont stables dans le temps lorsqu'on dilue la suspension ou lorqu'on fait varier la force ionique, par exemple au moyen d'une solution de NaCl. Selon l'invention, les nanoparticules ont une taille leur permettant de traverser un filtre stérilisant dont la taille des pores est de 0.22 lm ; les pertes observées lors d'une telle filtration sont compatibles avec des contraintes industrielles. En effet, des essais effectués sur des filtres PTFE 0.221.1m ont montré que l'on avait moins de 5% de perte en copolymère et en Aluminium, cette valeur de 5% pouvant correspondre à la marge d'erreur de la technique de dosage. Selon l'invention, la composition vaccinale comprend au moins un antigène. Aux fins de mise au point de la présente invention, on a utilisé un antigène modèle : la protéine tétanique purifiée. Cependant la composition vaccinale selon l'invention peut comprendre n'importe quel antigène pouvant être utilisé dans un vaccin, qu'il s'agisse d'un germe entier, d'un antigène sous-unitaire, naturel, recombinant, hybride,... peu important sa nature ; l'antigène peut en effet être un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un polysaccharide, un glycolipide, un lipopeptide,... Ces antigènes sont des antigènes utilisés ou susceptibles d'être utilisés pour le traitement ou la prévention de diverses maladies susceptibles d'atteindre le monde animal et en particulier les - 5 - être humains, notamment : diphtérie, tétanos, polio, rage, coqueluche, hépatites A, B, C, fièvre jaune, fièvre typhoïde, varicelle, rougeole, oreillons, rubéole, encéphalite japonaise, grippe, méningites, choléra, infections à : Rotavirus, Norovirus, Rhinovirus, Respiratory Syncytial Virus, Herpes Simplex Virus, Papilloma Virus, Cytomegalovirus, West Nile Virus, Dengue Virus, Chykungunya Virus, HIV (SIDA), les affections bactériennes provoquées par : des streptocoques, Chlamydia trachomatis et pneumoniae, Neisseria gonorrheae et meningitidis, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus ou Haemophilus influenza type B, les listerioses, les shigelloses, les salmonelloses, la tuberculose, la maladie de Lyme, le cancer, les affections parasitaires telles que la malaria, les leshmanioses, etc... La composition pharmaceutique selon l'invention peut être une composition destinée à l'immunisation contre un seul pathogène ou cancer, c'est-à-dire qu'elle comprend un ou plusieurs antigènes d'un seul pathogène ou cancer, ou bien être une composition destinée à l'immunisation contre plusieurs pathogènes ou cancers (on parle alors de combinaison vaccinale). La composition selon l'invention peut également comprendre plusieurs antigènes spécifiques d'une seule maladie, mais appartenant à différentes catégories de l'agent de cette maladie (plusieurs souches ou sérotypes, ou clades, suivant la nature de l'agent). La composition vaccinale selon l'invention peut être administrée par toutes les voies habituellement utilisées pour l'administration des vaccins ; cependant, elle est d'un intérêt particulier pour la voie intra-dermique. En effet, la voie intra-dermique, si elle semble très efficace pour induire de bonnes réactions immunitaires, a pour inconvénient de conduire parfois à des réactions de réactogénicité locale, qui peuvent freiner son utilisation. Grâce aux nanoparticules selon l'invention, il a été possible de réaliser des immunisations par voie intradermique en n'ayant que très peu ou pas du tout de réaction de réactogénicité. Selon l'invention, on prépare la composition vaccinale par simple mélange d'une suspension comprenant les nanoparticules et une suspension d'antigènes. Cette opération peut se faire dans un sens comme dans l'autre. Selon les antigènes utilisés, on peut préférer utiliser des nanoparticules comprenant plutôt de l'hydroxyde d'Aluminium ou plutôt du phosphate d'Aluminium. D'autre part, dans le cas où on souhaite disposer de compositions vaccinales comprenant plusieurs types d'antigènes, il peut être préféré d'effectuer en priorité l'adsorption de certains antigènes par rapport à d'autres. Notamment, dans le cas où la composition vaccinale comprend un mélange d'antigènes dont certains, pour des raisons de stabilité ou d'immunogénicité, ne doivent pas être adsorbés, il peut être préférable de procéder de la manière suivante : on sature tout d'abord les particules d'Aluminium avec les antigènes - 6 - nécessitant une adsorption ou avec des ions ou excipients présents dans la substance tampon avant d'introduire les antigènes qui ne doivent pas être adsorbés. Lors de la préparation des nanoparticules selon l'invention, il est possible qu'il y ait du polymère en excès. Pour éliminer cet éventuel excès de polymère, il est possible de procéder à une étape supplémentaire, soit directement après la phase de préparation des nanoparticules, soit après la phase de mélange avec l'antigène. Cette phase d'élimination peut être réalisée par dialyse ou diafiltration contre de l'eau déminéralisée (Milli Q, Millipore) au travers d'une membrane de porosité adéquate (100kd par exemple). Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisation de l'invention. Exemple 1 : Synthèse du polycation d'Aluminium Les solutions de polycations A1137+ ont été obtenues par hydrolyse basique de solutions d'Al3+ avec un rendement proche de 100 %. 100 ml d'une solution de sel d'Aluminium Al(NO3)3, 9H20 de concentration 0.2M en Aluminium ont été versés dans un ballon bi-col de 250 ml muni d'un agitateur magnétique. Le ballon surmonté d'un réfrigérant était placé dans un bain d'huile maintenu à 85-90°C. 100 ml d'une solution de base de NaOH à 0.492 M ont alors été ajoutés goutte à goutte à la solution d'Aluminium pendant 3 heures sous agitation magnétique. Le mélange était thermostaté à 85- 90°c sous reflux. La solution de polycation Al13 7+ ainsi obtenue était limpide et possédait une concentration finale de 0.1M en Aluminium. Le pH final était compris entre 4.5 et 5. La solution a été refroidie à température ambiante et conservée au réfrigérateur à 4°C. Exemple 2 : Préparations de solutions-stock de polymères. On a préparé des solutions-stocks, à partir des copolymères fournis par Polymer Source. Dans le cas du PMA3000-b-P0E8000, le poids moléculaire des blocs de PMA et de POE étaient respectivement de 3000 et de 8000 g/mol, ce qui correspond à un degré de polymérisation de 35 et de 182 respectivement. Pour le PMA2000-b-P0E7800, le poids moléculaire des blocs de PMA et de POE était respectivement de 2000 et 7800 g/mol, correspondant respectivement à un degré de polymérisation de 23 et de 177. - 7 - Le PMA3000-b-P0E8000 a été dissous dans de l'eau déionisée Ultrapure (MilliQ, 18MS2.cm-1, Millipore, France) pour obtenir une concentration finale de 7.5% (p/p). Le PMA2000-b-P0E7800 a été dissous dans de l'eau déionisée Ultrapure pour atteindre une concentration finale de 7.5% (p/p). Le pH des solutions polymériques a ensuite été ajusté à 5.5. Pour la suite de la description, il sera fait référence à ces solutions sous la référence de solution-stock de PMA3000-b-P0E8000 et de PMA2000-b-P0E7800 respectivement. Exemple 3 : Préparation des nanoparticules. 3.1 Préparation de nanoparticules hybrides Hydroxyde d'Aluminium/ PMA3000-b-P0E8000 A 2m1 de solution d'Al13 7+ (concentration initiale : 0.1 M en Aluminium) introduits dans un flacon Lyo ont été ajoutés sous forte agitation magnétique (1100 rpm) 467 pl de solution stock de copolymère (ajusté à pH= 5.5 par ajout de NaOH) à 7.5% p/p. Le mélange a été vortexé pendant 1 min. La minéralisation a ensuite été effectuée par l'ajout de 70 pl de NaOH à 1 M (par tranche de 141) pour atteindre un pH de 7.4. Une méthode alternative a été d'ajouter 1.33 mg de solution stock de PMA3000-b-P0E8000 à 7.4 ml de solution d'Al13 7+ à 0.1M. Ce mélange a été agité vigoureusement et on a ajouté ensuite, par tranche de 1041, 7441 de NaOH 0.4M en vortexant 1 minute entre chaque ajout, puis on a ajouté 5341 d'eau. Le pH final était à 7.0 et la concentration en Aluminium, mesurée au spectromètre d'absorption atomique (Varian spectra AA20) de 1.98mg/ml. Après filtration sur filtre 0.21.1m, la concentration en Aluminium était de 1.87mg/m1; soit une perte de 3% uniquement. On a mesuré la taille des particules sur Malvern Autosizer 4800, par analyse de l'intensité de la lumière diffusée; on a remarqué qu'on était en présence de 2 populations, l'une avec une taille de 58nm (responsable de 43% de l'intensité diffusée) et l'autre de 160nm (responsable de 57% de l'intensité diffusée). 3.2 Préparation de nanoparticules hybrides Phosphate d'Aluminium/ PMAz000-b-PE07800 A 2m1 de solution d'Al137+ (concentration initiale : 0.1 M en Aluminium) introduits dans un flacon Lyo ont été ajoutés sous forte agitation magnétique (110Orpm) 682 pl de solution mère de copolymère (ajusté à pH= 5.5 par ajout de NaOH) à 7.5% p/p. Le mélange a été vortexé pendant 1 min. La minéralisation des « micelles » a ensuite été effectuée par l'ajout de 159 pl - 8 - d'une solution de phosphate de potassium (H2PO4-, K+) à 13.6 % en masse ajusté à pH 7. La solution finale a été agitée pendant 1 minute également et son pH a alors été ajusté à 7.4 avec un volume suffisant (environ 40 11E) de NaOH 2M, par tranche de 141. La concentration finale en Aluminium a été estimée à 1.93 mg/ml. La solution a été filtrée à 0.24m sur filtre en PVDF. Après filtration, la taille des particules a été mesurée par diffusion dynamique de la lumière et montrait que l'on avait obtenu une population homogène de particules ayant une taille de 150nm de diamètre. Exemple 4 : Préparation d'une composition vaccinale comprenant des nanoparticules hybrides de copolymère et d'hydroxyde d'Aluminium et de la protéine tétanique purifiée, et test de filtration. On a préparé 3m1 de composition vaccinale en ajoutant successivement : - 601.11 d'une préparation de protéines tétaniques purifiées dosée à une concentration de 1000 unités de floculation/ml ( soit une concentration en protéines de 2.8mg/m1), - 3001.11 de tampon PB S 10C, - 7501.11 d'eau, - 1890111 de la suspension de nanoparticules hybrides d'hydroxyde d'Aluminium et de copolymère préparée selon la méthode alternative décrite à l'exemple 3.1 Le mélange est vortexé brièvement puis maintenu sous agitation modérée pendant 2h à température ambiante. La concentration finale théorique de cette formulation en protéine tétanique est de 20 Lf/ml, et la concentration en Aluminium de 1.2 mg/ml. Une mesure de la taille des nanoparticules a été réalisée à la fois avant, et après l'addition de protéine tétanique, par analyse de la lumière diffusée. Que ce soit avant ou après addition, les nanoparticules se répartissent en 2 populations telles qu'indiqué ci-après, où les pourcentages entre parenthèses indiquent les fractions de l'intensité diffusée par les différentes populations : - 58 nm (43%) et 160 nm (57%) avant addition, - 56 nm (42%) et 190 nm (58%) après addition. Cette composition a ensuite été passée au travers d'un filtre de 0.24m en PVDF (Millipore) monté sur seringue plastique ; elle a été testée 3 fois ( échantillons A, B et C) en ce qui - 9 - concerne son contenu en Aluminium et en protéine tétanique. Le dosage de la protéine tétanique a été réalisé au moyen d'un test protéique microBCA (Pierce). La valeur retenue est la concentration de protéines calculée à l'aide d'une courbe étalon préparée en utilisant l'albumine comme référence. La concentration en Aluminium a été determinée par spectrométrie d'absorption atomique sur spectromètre Varian spectra AA 220. Les résultats obtenus sont repris dans le Tableau 1 ci-après : Tableau 1 : [Aluminium] en mg/mi [Protéine tétanique] en µg/ml avant filtration après filtration difference avant filtration après filtration difference composition vaccinale selon invention A 1.22 1.202 - 1.50% 59.25 59.53 + 0.47% B 1.15 1.147 - 0.30% 62.77 61.09 - 2.68% C 1.137 1.142 + 0.40% 64.46 62.65 - 2.79% Les différences observées en ce qui concerne les concentrations en Aluminium et en protéines, avant et après filtration, sont de l'ordre des marges d'erreur des techniques de dosage. On peut donc en conclure que les compositions vaccinales selon l'invention peuvent être filtrées sans perte de matière sur un filtre stérilisant de 0.221.1m. Exemple 5 : Test d'immunogénicité sur souris d'une composition vaccinale comprenant des nanoparticules d'hydroxyde d'Aluminium et de la protéine tétanique purifiée. On a voulu tester, sur souris OF1 femelles âgées de 6 à 8 semaines, l'immunogénicité de compositions vaccinales comprenant selon l'invention, des nanoparticules d'Aluminium et au moins un antigène, comparativement à des compositions comprenant l'hydroxyde d'Aluminium standard A100H. L'antigène est un antigène modèle : la protéine tétanique purifiée, disponible sous forme d'une suspension-mère à 950Lf/ml en milieu NaC1 0.05M. Cette étude comprenait - 10 - également, un groupe de souris immunisées uniquement avec de l'antigène et du copolymère pour estimer l'effet potentiellement adjuvant du copolymère seul. Préparation des compositions qui ont été administrées aux souris : Groupe A : PTP ou Protéine Tétanique Purifié seule. On a préparé 5 ml d'une composition immunisante en ajoutant successivement : - 225 mg de la suspension-mère de Protéine Tétanique Purifiée à 950 Lf/ml en milieu NaC10.05M, - 500 11.1 de NaC19%, - 4280 11.1 d'eau. Le mélange a été vortexé brièvement et filtré sur membrane PVDF 0.2 p.m. La concentration finale en PTP a été déterminée par dosage microBCA (Pierce) , ce qui a conduit, après conversion à la valeur de 40 Lf/ml (contre 43 Lf/ml avant filtration) Groupe B : PTP + AlOOH On a préparé 5 ml d'une composition immunisante en ajoutant successivement : - 117 mg de la suspension-mère de protéine tétanique purifiée à 950 Lf/ml en milieu NaC10.05M, - 500 11.1 de NaC19%, - 3630 11.1 d'eau - 750 11.1 d'une suspension commerciale d'Alhydrogel®, qui est de l'AlOOH à 8.01mg/m1 d'Aluminium fourni par Superfos Le mélange obtenu a été maintenu sous agitation modérée pendant 2 heures à température ambiante. Groupe C : PTP + nanoparticules d'Al (Hydroxyde) On a préparé 5 ml d'une composition immunisante en ajoutant successivment : - 117 mg de la suspension-mère de Protéine Tétanique Purifiée à 950 Lf/ml en milieu NaC10.05M, - 500 11.1 de NaC19%, - 1050 11.1 d'eau, - 3330 1.11 de la suspension de nanoparticules hybrides d'hydroxyde d'Aluminium et de copolymère préparée selon la méthode alternative décrite à l'exemple 3.1. Le mélange obtenu a été vortexé puis agité modérément pendant 2 heures et filtré sur membrane PVDF 0.2p.m. La concentration finale dans le produit filtré en Aluminium était de 1.18 mg/ml (contre 1.23 avant filtration) et en PTP de 21.5 Lf/ml (contre 22.3 avant filtration) Groupe D : PTP + copolymère seul On a préparé 4 ml d'une composition immunisante en ajoutant successivement : - 92 mg de la suspension-mère de Protéine Tétanique Purifiée à 950 Lf/ml en milieu NaC1 0.05M, - 400 1.11 de NaC1 9%, - 2870 1.11 d'eau, - 640 1.11 d'une solution à 3.5% de PMA3000-b-P0E8000 Le mélange obtenu a été vortexé puis agité modérément pendant 2 heures et filtré sur membrane PVDF 0.2ùm. La concentration finale dans le produit filtré en copolymère a été estimée à 0.53% (p/p) et en PTP à 20.5 Lf/ml (6% de matière perdu lors de la filtration) Pour le test, les souris ont été réparties par groupes de 8. Chacune des souris a reçu en sous-cutané 1 dose de 50111 de l'une des compositions préparées à J1 puis une dose identique de rappel à J21. Chaque dose comprenait donc 1 Lf de protéine tétanique et 601.1g d'Aluminium pour les souris des groupes B et C. Aucune réaction de réactogénicité anormale n'a été observée. On a prélevé des échantillons sanguins à J21 (avant la dose de rappel), et à J35 (soit 2 semaines après le rappel) afin d'effectuer un dosage des IgG1 et IgG2a spécifiques de la PTP. Le dosage a été réalisé par ELISA qui est un test standard où les titres sont exprimés en log d'unité ELISA. Les résultats obtenus sont reproduits dans le tableau 2 ci-après, qui indique les moyennes (avec entre parenthèses les écarts-type) par groupe de souris. -12- Tableau 2 : Composition J21-log(IgG1) Moyenne J21-log(IgG2a) Moyenne J35-log(IgG1) Moyenne J35-log(IgG2a) Moyenne Groupe A PTP seule 3.46 (0.43) 2.39 (0.36) 5.13 (0.26) 4.36 (0.30) Groupe B 4.51 (0.27) 2.75 (0.73) 5.25 (0.19) 3.53 (0.93) PTP + AlOOH Groupe C 3.80 (0.72) 3.44 (0.57) 4.90 (0.43) 4.56 (0.43) PTP + nano particules d'Al (Hydroxyde) Groupe D 3.65 (0.47) 2.45 (0.46) 5.23 (0.40) 4.25 (0.36) PTP + copolymer L'analyse statistique a montré que dans ce test, les seules différences qui soient significatives sont relatives : - pour J21, aux plus forts résultats obtenus avec l'hydroxyde d'Aluminium classique (groupe B) en regard de la réponse en IgG1 et aux plus forts résultats obtenus avec les nanoparticules selon l'invention (groupe C) en regard de la réponse en IgG2a, - pour J35, aux plus faibles résultats obtenus avec l'hydroxyde d'Aluminium classique (groupe B) en regard de la réponse en IgG2a. Ce test permet donc de conclure que les nanoparticules selon l'invention peuvent se substituer sans inconvénient à la suspension d'Aluminium utilisée classiquement comme adjuvant vaccinal. Exemple 6 : Test de réactogénicité sur souris d'une composition selon l'invention comprenant des nanoparticules et des antigènes de la grippe, administrée par voie intradermique. - 13 - On a utilisé comme modèle-animal pour ce test, des souris BALB/c femelles afin d'évaluer la réactogénicité locale de compositions selon l'invention, comparativement aux suspensions d'Aluminium classiques. Dans ce test, l'antigène est constitué par un vaccin grippe trivalent appelé Flu ID stock comprenant les souches fragmentées inactivées A/Solomon/3/2006 (H1N1), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), et B/Malaysia/2506/2004 à raison de 1501.1g/m1 de HA par souche. 5 groupes de 10 souris ont reçu à 3 semaines d'intervalle, par voie intradermique, dans la face interne de l'oreille, une dose de 30 pl sub-optimale (soit 0.31.1g de HA/ souche) de vaccin en présence ou non d'un adjuvant. Les compositions administrées ont été préparées de la manière suivante : - Groupe A : Flu ID seul ; on a dilué 54 pl de Flu ID stock dans 756 pl de tampon PBS. 15 - Groupe B : Flu ID + AlOOH ; on a ajouté successivement : o 54 pl de Flu ID stock o 604 pl de tampon PBS o 152 pl d'une suspension commerciale d' AlOOH à 8.01mg/m1 d'Aluminium 20 (Alhydrogel®) Le mélange a été agité modérément pendant 2 heures. - Groupe C : Flu ID + A1PO4 ; on a ajouté successivement : o 54 pl de Flu ID stock 25 o 463 pl de tampon PBS o 293 pl d'une suspension commerciale d' A1PO4 à 4.15mg/m1 d'Aluminium (AdjuPhos®) Le mélange a été agité modérément pendant 2 heures. 30 - Groupe D : Flu ID + nanoparticules d'Al (Hydroxyde); on a ajouté successivement : o 54 pl de Flu ID stock o 123 pl d'eau o 76 pl de tampon PBS concentré 10 fois -14- o 557 pl d'une suspension de nanoparticules hybrides d'hydroxyde d'Aluminium et de copolymère à 2.18mg/m1 d'Aluminium préparée selon la méthode décrite à l'exemple 3.1, mais en utilisant une solution stock de PMA2000-b-P0E7800 à 7.5% , ce qui a conduit à des nanoparticules dont la taille mesurée en lumière diffusée était centrée à 58 nm avec un index de polydispersité de 0.25. Le mélange a été vortexé puis agité modérément pendant 2 heures à température ambiante. - Groupe E : Flu ID + nanoparticules d'Al (Phosphate); on a ajouté successivement : o 54 pl de Flu ID stock o 51 pl d'eau o 76 pl de tampon PBS concentré 10 fois o 630 pl d'une suspension de nanoparticules hybrides de phosphate d'Aluminium et de copolymère à 1.93mg/m1 d'Aluminium préparée selon la méthode décrite à l'exemple 3.2. Le mélange a été vortexé puis agité modérément pendant 2 heures à température ambiante. Les souris ont été surveillées chaque jour, et on a noté sur une échelle non-officielle les oedèmes, les érythèmes et les lésions apparaissant à l'oreille, pendant 2 semaines après chaque injection. Quelle que soit la formulation testée, aucun érythème significatif n'a été observé. De même, on n'a signalé aucun oedème. Par contre, on a noté au point d'injection des nodules blancs/rougeâtres apparaissant chez les souris ayant reçu les compositions comprenant de l'Aluminium classique, que ce soit avec l'hydroxyde d'Aluminium, ou avec le phosphate d'Aluminium. Mais, de manière surprenante et très intéressante, aucun nodule n'est visible sur les souris ayant reçu une composition selon l'invention. Les résultats relatifs aux nombres de souris présentant des nodules après administration des adjuvants comprenant l'Aluminium de l'art antérieur, sont illustrés sur le tableau 3 dessous : -15- Tableau 3 Après la 1ère injection (JO) Adjuvan t J1 J2 J3 J4 J7 J8 J9 J10 J11 J15 AlOOH 0/10 0/10 0/10 0/10 6/10 10/10 10/10 10/10 10/10 8/10 A1PO4 0/10 1/10 2/10 3/10 6/10 9/10 9/10 9/10 10/10 9/10 Après le rappel (D21) Adjuvan t J22 J23 J24 J25 J28 J29 J30 J31 J32 J35 J39 AlOOH 5/10 9/10 10/10 9/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 8/10 9/10 A1PO4 9/10 9/10 8/10 7/10 9/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 Il est particulièrement intéressant de constater que, malgré le fait que les quantités d'Aluminium soient les mêmes (451.1g) dans tous les groupes, le fait de le formuler en nanoparticules hybrides selon l'invention, rend cet Aluminium bien mieux toléré. Exemple 7 : Test d'immunogénicité sur souris d'une composition selon l'invention comprenant des nanoparticules et des antigènes de la grippe, administrée par voie intradermique. Dans ce test, on a évalué l'immunogénicité des compositions selon l'invention, comparativement à des compositions comprenant de l'Aluminium classique, que ce soit AlOOH ou A1PO4, mais également vis-à-vis de compositions ne comprenant pas d'Aluminium mais uniquement du copolymère. Dans ce test, comme dans l'exemple précédent, l'antigène était constitué par un vaccin grippe trivalent appelé Flu ID stock comprenant les souches fragmentées inactivées A/Solomon/3/2006 (H1N1), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), et B/Malaysia/2506/2004 à raison de 150 pg/m1 de HA par souche. Le lot de vaccin Flu ID stock utilisé pour ce test était le même que celui utilisé dans l'exemple précédent. Le test a été réalisé sur des souris BALB/c femelles réparties en 6 groupes de 9. Chaque souris a reçu, à 3 semaines d'intervalle, par voie intradermique, dans la face interne de l'oreille, une dose de 30 pl sub-optimale (soit 0.31.1g de HA/ souche) d'une composition telle que décrite ci-après, en fonction de son groupe d'appartenance. - 16 - Les compositions administrées ont été préparées de la manière suivante : - Groupe A : Flu ID seul On a dilué 54 n1 de Flu ID stock dans 756 n1 de tampon PBS. - Groupe B : Flu ID + nanoparticules d'Al (Phosphate) On a ajouté successivement : o 54 n1 de Flu ID stock o 51 n1 d'eau o 76 n1 de tampon PBS concentré 10 fois o 630 n1 d'une suspension de nanoparticules hybrides de phosphate d'Aluminium et de copolymère à 1.93mg/m1 d'Aluminium préparée selon la méthode décrite à l'exemple 3.2. Le mélange a été vortexé pendant 10 secondes. - Groupe C : Flu ID + nanoparticules d' Al (Hydroxyde) On a ajouté successivement : o 54 n1 de Flu ID stock o 123 n1 d'eau o 76 n1 de tampon PBS concentré 10 fois o 557 n1 d'une suspension de nanoparticules hybrides d'hydroxyde d'Aluminium et de copolymère à 2.18mg/m1 d'Aluminium préparée selon la méthode décrite à l' exemple 3.1. Le mélange a été vortexé pendant 10 secondes. - Groupe D : Flu PMA h POF . + __8000 On a ajouté successivement : o 54 n1 de Flu ID stock, o 50 n1 d'eau, o 76 n1 de tampon PBS concentré 10 fois, o 630 n1 d'une suspension stock de PMA3000-b-P0E8000 à 7% Le mélange a été vortexé pendant 10 secondes. -17- - Groupe E : Flu ID + A1PO4 On a ajouté successivement : o 54 pl de Flu ID stock o 463 pl de tampon PBS o 293 pl d'une suspension commerciale d' A1PO4 à 4.15mg/m1 d'Aluminium (AdjuPhos®) Le mélange a été vortexé pendant 10 secondes. - Groupe F : Flu ID + AlOOH On a ajouté successivement : o 54 pl de Flu ID stock o 595 pl de tampon PBS o 161 pl d'une suspension commerciale d' AlOOH à 7.53mg/ml d'Aluminium (Alhydrogel®) Le mélange a été vortexé pendant 10 secondes. On a surveillé les souris durant tout le test; les animaux de chaque groupe ont été pesés à J-1, J20 et J41. Des échantillons sanguins de chaque souris ont été prélevés à J42 par section de la carotide. Les échantillons ont été traités afin d'isoler le sérum pour effectuer les tests de réponse humorale. On a en outre prélevé les rates de 6 souris par groupe afin d'effectuer les tests de réponse cellulaire. Les tests qui ont été réalisés sont des dosages ELISA, des tests d'inhibition de l'hémagglutination, ainsi que des ELISPOT. Les dosages ELISA ont été réalisés de façon classique, afin de déterminer les quantités d'IgG1 et d' IgG2a sériques spécifiques de la souche A/H1N1. Le seuil de détection des anticorps est de 20 (1.3log10) unités ELISA. Tous les titres sont exprimés en log10 d'unités ELISA. Pour chaque groupe d'animaux, on a calculé la moyenne géométrique ainsi que l'intervalle de confiance 95% correspondant. Le test d'inhibition de l'hémagglutination permet d'apprécier les anticorps fonctionnels présents dans le sérum des animaux immunisés. Il mesure la capacité des anticorps induits à inhiber l'hémagglutination de globules rouges de poulet par le virus grippal étudié. Le titre -18- d'inhibition de l'hémagglutination ou HI (Haemagglutination Inhibition) est l'inverse de la dernière dilution pour laquelle on n'observe pas d'hémagglutination. Pour chaque groupe d'animaux, on a calculé la moyenne géométrique ainsi que l'intervalle de confiance à 95% correspondant. Ceci vis-à-vis de chacune des 3 souches présentes dans la composition administrée. Les dosages ELISPOT sont réalisés à partir des cellules spléniques fraichement isolées, mises à incuber la nuit et restimulées avec un mélange des 3 souches de la composition vaccinale ou par un peptide 9-mer correspondant à un épitope de classe I (épitope CD8) de la protéine NP. Les réponses cellulaires sont exprimées en nombres de cellules sécrétant de l'IL-5 ou de l'IFN- y spécifiques de la grippe, pour 106 splénocytes. Lors de la restimulation avec le peptide spécifique de la grippe, on n'a pas détecté de réponse ELISPOT, que ce soit pour l'IL-5 ou pour l'IFN-y ; ceci, quel que soit le groupe de souris considéré. En ce qui concerne la restimulation in-vitro par les antigènes de la grippe, les résultats obtenus sont représentés dans le tableau 4 ci-après, où les intervalles de confiance 95% sont indiqués entre crochets : Tableau 4 : Groupe considéré Nbre de cellules sécrétrices d'IL-5 /106 splénocytes Nbre de cellules sécrétrices d'IFN-y/106 splénocytes A : Flu ID seul 24 [12 - 48] 2 [0 - 17] B : Flu ID + nanoparticules d'Al (Phosphate) 222 [112 - 440] 23 [1 - 395] C : Flu ID + nanoparticules d'Al (Hydroxyde) 81 [37 - 177] 38[20 - 74] D : Flu ID + 87 [29 - 261] 6 [1 - 54] PMA3000-b-P0E8000 E : Flu ID + AIN/1 17 [6 - 45] 2 [0 - 32] F : Flu ID + AlOOH 46 [19 - 115] 13 [5 - 38] - 19 - Ces résultats montrent que, de façon surprenante, grâce aux nanoparticules selon l'invention, il est possible d'obtenir une réponse cellulaire, notamment une stimulation des cellules sécrétrices d'IL-5 ainsi que des cellules sécrétrices d'IFN-y. D'un point de vue statistique, selon un modèle mixte avec ajustement de Dunnett, les nanoparticules d'Aluminium et de copolymère sont considérées avoir augmenté significativement le nombre de cellules sécrétrices d'IL-5 et d'IFN-y, de 3 à 9 fois (p=0.026 à p Les résultats relatifs aux tests de réponse humorale sont repris dans le tableau 5 ci-après où, à chaque fois, les intervalles de confiance 95% sont mis entre crochets. Tableau 5 : Groupe considéré HI contre H1N1 HI contre H3N2 HI contre B IgG1 contre IgG2a contre H1N1 (log10) H1N1 (log10) A : Flu ID seul 101 127 17 4.8 4.3 [52-194] [66-244] [6-46] [4.4-5.2] [3.9-4.6] B : Flu ID + 1097 1016 640 6.2 4.8 nanoparticules d'Al [578-2082] [529-1951] [316-1295] [6.0-6.4] [4.4-5.2] (Phosphate) C : Flu ID + 1382 941 274 6.2 5.3 nanoparticules d'Al [743-2574] [462-1914] [99-764] [6.0-6.4] [5.0-5.5] (Hydroxyde) D : Flu ID + 160 118 16 5.2 3.9 PMA3000-b-P0E8000 [88-290] [50-274] [5-55] [5.0-5.4] [3.4-4.3] E : Flu ID + A1PO4 1881 1097 593 6.4 4.4 [1096-3229] [654-1842] [301-1165] [6.2-6.7] [3.9-4.9] F : Flu ID + AlOOH 1185 1185 640 6.4 4.1 [637-2207] [603-2331] [353-1161] 6.1-6.61 [3.4-4.8] -20- Ces résultats montrent la capacité des nanoparticules selon l'invention à induire une réponse humorale après 2 immunisations par voie intradermique. On peut remarquer que le polymère seul n'a pas ce pouvoir adjuvant. D'un point de vue statistique, l'augmentation des titres HI et des titres en IgG1 obtenus avec les nanoparticules de phosphate d'Aluminium a été considérée significative vis-à-vis des titres obtenus avec le vaccin seul selon un modèle mixte avec ajustement de Dunnet ( 10.9 fois pour titre HI anti-H1N1 avec p De même, l'augmentation des titres HI et des titres en IgG1 et en IgG2a obtenus avec les nanoparticules d'hydroxyde d'Aluminium a été considérée significative vis-à-vis des titres obtenus avec le vaccin seul ( 13.7 fois pour titre HI anti-H1N1 avec p REVENDICATIONS1. Composition vaccinale comprenant au moins un antigène et un adjuvant, caractérisée en ce que l'adjuvant comprend des nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium. 2. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le copolymère hydrosoluble est un copolymère à blocs doubles hydrophiles (DHBC) 3. Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'Aluminium est sous forme d'hydroxyde ou d'oxyhydroxyde. 4. Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'Aluminium est sous forme de phosphate ou d'hydroxyphosphate. 5. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium comprend un bloc ionisable constitué par une chaine de poly(acide méthacrylique) ainsi qu'un bloc neutre constitué par une chaine de poly(oxyde d'éthylène). 6. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la taille des nanoparticules est inférieure à 300 nm, avantageusement inférieure à 220 nm. 25 7. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène de la grippe. 8. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une protéine tétanique. 30 9. Utilisation de nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium pour la préparation d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène. 35 10. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la composition vaccinale est destinée à être administrée par voie intradermique. 20-22- 11. Utilisation selon une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que la composition vaccinale comprend au moins un antigène de la grippe. 12. Utilisation selon une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que lesdites nanoparticules permettent d'augmenter la réponse immunitaire induite lors de l'administration de ladite composition vaccinale. 13. Procédé de préparation d'une composition vaccinale selon une des revendications 1 à 8, selon lequel : o on prépare des nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium, o on filtre lesdites nanoparticules au moyen d'un filtre stérilisant, o et on ajoute auxdites nanoparticules au moins un antigène vaccinal. 14. Procédé de préparation d'une composition vaccinale selon une des revendications 1 à 8, selon lequel : o on prépare des nanoparticules hybrides d'Aluminium et de copolymère hydrosoluble complexant de l'Aluminium, o on ajoute auxdites nanoparticules au moins un antigène vaccinal, o et on filtre lesdites nanoparticules au moyen d'un filtre stérilisant.