Brevet FR2984108A1 — publié le 20130621

La présente invention se rapporte à l'observation des tissus biologiques, notamment les matières kératiniques comme la peau, par microscopie multiphoton. L'invention concerne également les mesures effectuées sur un tissu biologique, notamment celles réalisées par traitement d'images suite à une observation du tissu. L'invention concerne aussi les procédés visant à évaluer l'action d'un traitement cosmétique ou thérapeutique. La caractérisation de la peau est essentielle pour évaluer l'efficacité de produits cosmétiques, en particulier dans les applications anti-âge et anti- ou pro-pigmentation. Arrière-plan Aujourd'hui, l'observation des tissus biologiques peut être faite soit sous forme bidimensionnelle par imagerie en lumière blanche à partir des coupes histologiques colorées ou marquées spécifiquement, soit sous forme tridimensionnelle, notamment par imagerie multiphoton. Dans la présente demande, on utilise indifféremment les abréviations AF (autofluorescence) et 2PEF (two-photon excited fluorescence) pour désigner la fluorescence excitée à deux photons et l'abréviation SHG (second harmonie generation) pour désigner la génération de seconde harmonique. Au sens de la présente invention, le terme « tridimensionnel » et l'abréviation 3D ainsi que l'abréviation 2D et le terme « bidimensionnel » sont employées indifféremment. Dans la présente demande, le terme « segmentation » est utilisé pour « segmentation d'images », expression relative au domaine du traitement d'images et correspondant à la division d'une image en différentes zones afin de séparer les divers composants visibles et de les identifier. En outre, les termes « marqueur », « noeud » ou « sommet », « arêtes », « arête valuée », « poids » ou « valeur » (d'une arête), « granulométrie » sont utilisés dans leur sens habituel dans le cadre du traitement d'images et de la théorie des graphes. La particularité de l'imagerie multiphoton repose sur la capacité de sectionnement optique qu'elle procure du fait de la dépendance non-linéaire du signal avec la puissance d'excitation. La densité de puissance excitatrice étant très élevée au niveau du point focal, c'est seulement dans un volume focal limité que l'effet non-linéaire considéré a lieu de façon efficace. Cette propriété essentielle assure un confinement du signal obtenu dans l'échantillon et permet donc d'obtenir une résolution tridimensionnelle intrinsèque sub-micrométrique. La profondeur d'imagerie varie en fonction des tissus, elle peut être d'environ 130-200 ium pour la peau humaine imagée par microscopie multiphoton in vivo. La résolution peut être d'environ 0,4 ;lm dans un plan parallèle à la surface de la peau et d'environ 2 irm dans un plan perpendiculaire à la surface de la peau. Cependant cette anisotropie de résolution rend complexe l'exploitation des données tridimensionnelles. En outre, du fait de l'utilisation de sources endogènes de signal 2PEF et SHG, cette technique d'imagerie ne requiert pas le marquage des composants tissulaires. Les signaux de fluorescence sont créés par des chromophores endogènes. Outre la mélanine, on peut citer le NAD(P)H, les flavines, la kératine et l'élastine. Les signaux SHG sont créés notamment par le collagène fibrillaire, les microtubules, la myosine ou l'amidon. Les différents signaux qu'elle fournit permettent d'observer séparément les principaux composants de la peau, notamment les cellules et les fibres élastiques en 2PEF et les fibres de 10 collagène en SHG. Les travaux à partir de coupes bidimensionnelles dans le plan d'acquisition à une profondeur donnée ne tiennent pas compte de la forme des différentes couches constitutives du tissu. Par exemple, pour l'étude de la peau, l'index SAAID (SHG-to-AF aging index of dermis), qui correspond au ratio entre la différence des signaux SHG et AF et leur somme 15 (SHG-AF / SHG-FAF), a été utilisé et validé sur des biopsies cutanées (Lin 2005), dans des études ex vivo (Cicchi 2010) ou in vivo (Koelher 2006, 2008, 2009, Katz 2010, Sugata 2011). Dans ces études, l'index SAAID est calculé à une profondeur donnée, dans un seul plan et ne tient pas compte du volume 3D réel de derme imagé dont la segmentation est difficile du fait de la forme spécifique de la jonction dermo-épidermique. 20 D'autres mesures quantitatives ont été réalisées en 2D seulement pour évaluer l'orientation des fibres de collagène, leur diamètre ou leur espacement, en particulier par transformée de Fourrier (travaux de Zhu 2010) ou en utilisant l'Index ORICB (Lu 2009). Les représentations obtenues par microscopie multiphoton peuvent être exploitées de manière 3D. La demande FR 11 53383 décrit ainsi un procédé pour évaluer la néosynthèse 25 de collagène fibrillaire dans une peau reconstruite. US 2011/0178410 combine les signaux de génération de seconde harmonique (SHG), de fluorescence excitée à deux photons (AF, nommée également 2PEF) ou de génération de troisième harmonique (THG) obtenues par microscopie multiphoton pour caractériser en 2D à partir de coupes histologiques, ex vivo, le vieillissement de la peau ou 30 diagnostiquer certaines étapes pathologiques à l'aide du SAAID (Lin 2005) ou du STID, paramètre équivalent au SAAID mais mesuré en prenant les signaux SHG et THG. Cette demande ne décrit pas l'exploitation des données 3D ni l'utilisation du FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy ou imagerie de la durée de vie de fluorescence). Cette durée de vie de fluorescence peut être estimée à partir des images acquises par FLIM, technique décrite dans l'article de M.S. Roberts et al., « Non-invasive imaging of skin physiology and percutaneous penetration casing fluorescence spectral and lifetime imaging with multiphoton and confocal microscopy » (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics vol. 77 (2011), pp 469- 488), qui consiste à suivre la décroissance du signal de fluorescence avec le temps. La demande JP2009-142597 décrit une méthode de visualisation de la mélanine alliant microscopie multiphoton et FLIM. Cette dernière technique, pour offrir une bonne estimation de la durée de vie de fluorescence, nécessite d'intégrer le signal de fluorescence dans le temps et dans l'espace, opération coûteuse en temps, ce qui limite les possibilités d'application de cette technique, en particulier dans le cadre de l'imagerie tridimensionnelle. La demande FR 1.1 60172 décrit une méthode plus facile et plus rapide à mettre en oeuvre à partir d'un nombre réduit d'acquisitions ternporelles pour visualiser en 3D la mélanine avec une résolution équivalente à la résolution théorique du microscope. Résumé L'analyse des tissus biologiques peut nécessiter la mesure de nombreux paramètres différents, dont certains sont spécifiques à des zones prédéterminées du tissu observé. Il existe un besoin pour analyser un tissu biologique à partir de mesures de plusieurs paramètres, ces mesures étant réalisées à partir d'une seule observation dudit tissu. Il existe ainsi un besoin pour bénéficier d'un procédé sensible, facile à mettre en oeuvre, non invasif, pour observer de façon tridimensionnelle les tissus biologiques, en particulier la peau humaine, permettant de produire des mesures fiables, rapides et pertinentes. La présente invention a pour objectif de développer un procédé simple et rapide à mettre en oeuvre et donnant des résultats plus complets que les procédés de l'art antérieur, qui permette de caractériser les différents niveaux de la peau, en particulier l'épiderme et le derme. Il existe également un besoin pour permettre de mettre en évidence les effets d'un produit, par exemple à base d'actifs utilisés lors d'un traitement de la peau. De plus, dans le cadre de la recherche pour développer de nouvelles structures de tissu reconstruit ou synthétique, par exemple de peau reconstruite, il existe un besoin pour étudier les différents constituants du tissu. L'invention vise à répondre à tout ou partie de ces besoins. L'invention a ainsi pour objet, selon l'un de ses aspects, un procédé d'observation d'un tissu biologique, comportant les étapes consistant à : a) acquérir par excitation multiphoton au moins une image tridimensionnelle pour chacun des signaux 2PEF et SHG émis par ledit tissu, et b) déterminer par traitement d'images à partir de ces images tridimensionnelles une segmentation dudit tissu en au moins deux régions. Le procédé est non invasif et peut être utilisé dans un cadre cosmétique, non-thérapeutique. L'utilisation d'une segmentation 3D, au lieu des approches classiques 10 bidimensionnelles, permet de caractériser chaque couche constitutive du tissu et de définir également des régions d'intérêt spécifiques. Pour l'étude de la peau, on peut ainsi analyser séparément l'épiderme et le derme en prenant en compte les caractéristiques de la jonction derme- épiderme (JDE). A partir des images 3D acquises lors de l'étape a), on peut effectuer une segmentation 15 par traitement d'images qui peut être différente suivant le tissu ou les constituants que l'on cherche à délimiter et caractériser. Cette segmentation n'est pas triviale, car les acquisitions tridimensionnelles sont, par leur nature, complexes ; non seulement elles sont grandes, comportant typiquement 511 x 511 x 70 voxels, mais elles peuvent aussi être nombreuses, une étude pouvant demander plusieurs. 20 centaines d'acquisitions. Il est particulièrement avantageux de pouvoir, grâce au procédé selon l'invention, obtenir des mesures variées à partir d'une seule acquisition multiphoton. Cette méthode est particulièrement intéressante parce qu'elle permet d'estimer des paramètres scalaires ou vectoriels provenant de l'analyse des données tridimensionnelles et qui résument l'information 3D contenue dans les images. Ces paramètres quantitatifs 25 permettent de caractériser un tissu biologique, en particulier la peau, et ses différents constituants en termes de morphologie, quantité et organisation. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre in vivo, mais aussi sur des échantillons ex vivo et in vitro. Ce procédé peut être utilisé pour l'évaluation in vivo de l'efficacité de certains 30 actifs dans les tissus, par exemple dans un but anti-âge ou pour une action sur la pigmentation. Les images acquises peuvent correspondre aux signaux 2PEF, SHG et/ou à d'autres signaux observés par microscopie multiphoton. Le procédé peut permettre de générer des images combinées, par exemple 2PEF SHG. On peut obtenir à l'étape a) une seule image liée au signal 2PEF et une seule image liée au signal SHG. De préférence, on acquiert plusieurs images successives des signaux 2PEF et SHG. Les images tridimensionnelles successives peuvent être obtenues à l'étape a) par intégration du signal de fluorescence et du signal de seconde harmonique effectuée à intervalles réguliers. L'intégration des signaux peut en particulier être effectuée sur une durée comprise entre 1 et 3 ns qui dépend du taux de répétition du laser, par exemple égale à 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ou 3 ns. L'acquisition des images avec intégration peut être effectuée par une méthode 10 telle que celle décrite dans la demande FR 11 60172 pour le signal 2PEF. Pour chaque signal 2PEF et SHG, on peut acquérir un nombre limité d'images, par exemple compris entre trois et cinq, ce qui offre un bon compromis entre temps d'acquisition et précision. On peut ainsi obtenir pour chaque signal quatre images avec intégration sur intervalle régulier de 2 ns. L'acquisition simultanée des signaux temporels 2PEF 15 et SHG s'effectue avec un temps d'acquisition par pixel d'environ 0.28 us de façon à obtenir un rapport signal sur bruit suffisant. L'acquisition temporelle de plusieurs images 3D est particulièrement avantageuse pour le calcul de mesures très spécifiques, par exemple visant à quantifier la présence de mélanine à partir du signal 2PEF. 20 L'invention améliore la rapidité du procédé d'acquisition et du procédé de traitement des images. Grâce à l'invention, la caractérisation en 3D du tissu est possible. Le tissu biologique peut comporter la mélanine et/ou de l'élastine. Le tissu peut comporter des fibres de collagène. Le tissu peut être constitué de matières kératiniques humaines. Par « matières kératiniques », on entend les cheveux, les cils, les sourcils, la peau, 25 les ongles, les muqueuses, le cuir chevelu, entre autres. Le tissu biologique selon l'invention, en particulier les matières kératiniques, peut être naturel ou artificiel, ce peut être de la peau humaine, de la peau reconstruite ou artificielle. Segmentation et régions d'intérêt 30 La segmentation peut dans un premier temps partitionner le volume observé en au moins deux zones, notamment trois, correspondant aux principales régions d'intérêt. Dans le cas de la peau, il peut s'agir de l'extérieur de la peau, de l'épiderme et du derme. La segmentation peut définir d'autres régions d'intérêt comme les frontières entre ces zones, ou différentes couches à l'intérieur de ces zones, parallèles à ces frontières, d'épaisseur choisie par l'utilisateur. Les différentes régions d'intérêt peuvent être choisies pour créer un paramètre de quantification. En effet, toutes les mesures souhaitées peuvent être calculées à l'intérieur d'une région d'intérêt particulière, c'est-à-dire en ne prenant en compte que l'information contenue dans cette région d'intérêt. Un algorithme de segmentation permet d'obtenir les principales régions d'intérêt en prenant en compte deux images 3D à niveaux de gris correspondant aux deux canaux 2PEF et SHG et en utilisant toute l'information tridimensionnelle. Pour chaque voxel, le niveau de gris indique le nombre de photons détectés. La segmentation peut résulter de quatre étapes : (i) pré-filtrage optionnel, prenant en compte les différents pas d'échantillonnage des images 3D, pouvant être réalisé grâce à un filtre gaussien bidimensionnel; (ii) définition des marqueurs des régions principales à partir de l'intensité des signaux, de leur spécificité et de leur position; (iii) calcul d'une segmentation de bas niveau à l'aide de la méthode de ligne de partage des eaux et construction du graphe d'adjacence correspondant; et (iv) segmentation finale à l'aide de méthodes de coupes de graphes, à partir des marqueurs et du graphe d'adjacence. La segmentation peut comporter le calcul d'un marqueur pour chacune des régions, 20 puis la propagation des marqueurs à l'ensemble du volume observé. Les marqueurs peuvent être calculés à partir de seuils des signaux initiaux. Une fois les marqueurs calculés, on procède à leur propagation en utilisant la même méthode de propagation dans les différentes régions structurées en couches. Pour propager les marqueurs on peut appliquer un algorithme de ligne de partage des 25 eaux. La méthode dite de « ligne de partage des eaux » est rapide, mais n'est pas totalement satisfaisante dans les régions de l'image où l'on manque d'information, en particulier près des bords. Alternativement, ou en combinaison, on peut utiliser d'autres méthodes connues, à base de graphes, qui ne présentent pas cet inconvénient, mais sont coûteuses en temps de 30 calcul et en mémoire. La méthode de propagation préférée combine les avantages des deux approches. Elle repose en partie sur les travaux décrits par Li et al. dans l'article "Lazy snapping," in SIGGRAPH 2004 Proceedings, 2004, vol. 23, p. 303-308 et sur ceux de Stawiaski et Decencière, exposés dans "Region merging via graph cuts," Image Analysis and Stereology, vol. 27, no. 1, pp. 39-46,2008. On calcule le gradient morphologique du supremum des images des signaux 2PEF et SHG, puis on applique un algorithme de ligne de partage des eaux avec une connexité 2D, pour obtenir une segmentation dite de bas niveau de l'image. Le choix d'une connexité 2D pour cette étape est motivé par la forte anisotropie des pas d'échantillonnage décrite précédemment. On associe un graphe à la' segmentation de bas niveau. Un noeud du graphe correspond à chaque région. Deux noeuds correspondant à deux régions voisines (en considérant la 6-connexité en 3D) sont reliés par une arête. On rajoute deux noeuds supplémentaires, correspondant aux deux marqueurs. Ils sont reliés aux noeuds dont les régions associées touchent l'un ou l'autre marqueur. Puis on attribue une valeur ou poids à chaque arête du graphe. Il s'agit de façon connue d'une étape essentielle dans la conception de méthodes à base de coupes de graphes. Les arêtes reliant les noeuds des marqueurs à d'autres noeuds se voient attribuer une valeur infinie. Considérons une arête e reliant deux noeuds voisins, correspondant à deux régions A et B. Soit N(A,B) l'ensemble des couples de voxels (p,q) tels que p appartient à A, et q appartient à B, soient I(p) et I(q) les valeurs associées à ces voxels, le poids w(e) associé à cette arête est alors : w (e) = E (s(p,q)/(1+Li(I(p), I(q))) pour (p, q) E N(A, B) où s(p,q) est la surface séparant les voxels p et q, et Li(I(p), I(q)) est la distance associée à la norme L1 (par exemple, dans le cas où l'on travaille avec deux images correspondant aux signaux AF et SHG, cette distance est donnée par la somme, d'une part, de la différence absolue entre les valeurs des pixels dans le canal AF et, d'autre part, la différence absolue entre les valeurs des pixels dans le canal SHG). Le graphe ainsi obtenu est coupé en deux parties, chacune contenant l'un des noeuds associés aux marqueurs, grâce à un algorithme de maximisation de flot. Pour une segmentation comportant plusieurs niveaux de séparation, cette détermination d'arêtes valuées peut être effectuée à plusieurs reprises, à chaque niveau de séparation de deux zones, cependant le calcul de la segmentation de bas niveau n'est réalisé qu'une seule fois. Le procédé peut comporter en outre l'étape consistant à : c) effectuer une mesure dans l'une au moins des régions issues de la segmentation. La mesure peut être définie à l'aide d'une nomenclature générique de paramètres de quantification. Mesures ou paramètres de quantification L'invention permet de calculer des paramètres de quantification scalaires ou vectoriels provenant de l'analyse de données tridimensionnelles et capables de synthétiser l'information 3D. A chaque paramètre de quantification tel que défini dans le cadre de l'invention 10 correspond une mesure proprement dite. De nombreuses mesures sont disponibles. Certaines sont classiques (moyenne des niveaux de gris, épaisseur moyenne, ..) ou sont déjà connues de l'homme du métier, tel que le SAAID. L'invention permet également de rendre accessibles des mesures qui n'ont jamais été décrites, tout particulièrement, de nouvelles mesures liées à l'organisation et à 15 l'orientation des réseaux de fibres de collagène ou de fibres élastiques. Les mesures quantifiables à l'aide d'un procédé selon l'invention peuvent être regroupées en différentes familles : - Mesures géométriques classiques, telles que l'épaisseur moyenne ou le volume des régions d'intérêt ; 20 - Mesures d'intensité de signal, telles que la moyenne dans une région d'intérêt ; - Mesures géodésiques qui permettent d'appréhender la forme et la taille des structures telles que les réseaux de fibres, à partir de la notion de diamètre géodésique ; - Mesures d'orientation qui déterminent la direction privilégiée d'un réseau de fibres par rapport à un référentiel donné (repère lié à l'image ou à la jonction der ino- 25 épidermique) ; - Granulométries, donnant une distribution des tailles des structures concernées ; - Mesures mixtes capables de prendre en compte conjointement les signaux 2PEF et SHG (SAAID, imbrication, imbrication normalisée, par exemple) ; - Mesures de densité, telles que la densité des cellules dans l'épiderme ou la densité 30 des fibres dans le derme; - Mesures de distribution qui décrivent de façon vectorielle une répartition en fonction d'une profondeur (par exemple, la distribution de la mélanine en fonction de la distance normalisée à la couche basale). Nomenclature Le procédé peut être fondé sur une nomenclature générique qui permet de définir un grand nombre de paramètres de quantification, et facilite la mise en oeuvre logicielle du procédé selon l'invention. L'expression « paramètre de quantification » relie la mesure proprement dite à la/aux image(s) à considérer, comme par exemple celles acquises à l'étape a) ou des images dérivées, et à la région d'intérêt sur laquelle porte la mesure. La nomenclature apporte une grande flexibilité dans la définition des paramètres de quantification. La nomenclature peut permettre d'introduire des méthodes de prétraitement, telle la méthode de filtrage par rehaussement des fibres décrite plus bas. La nomenclature décrite ci-dessous constitue un exemple de nomenclature pouvant être utilisée par un procédé selon l'invention. Dans une variante préférentielle, la nomenclature permet de définir, de façon conventionnelle, un paramètre de quantification, à partir de quatre descripteurs : - la modalité des données prise en compte, c'est-à-dire la ou les catégories de signaux considérées, - la présence ou non d'un prétraitement et type de prétraitement utilisé ; - la région d'intérêt sur laquelle porte la mesure (exemples : épiderme, derme, sous-parties du derme, jonction dermo-épidermique); et - la mesure proprement dite (par exemple : moyenne de l'intensité du signal, proportion de pixels dont la valeur dépasse un niveau donné, tortuosité des structures, volume ; représentation de la distribution d'un constituant de la peau ...). Cette approche analytique de la définition des paramètres de quantification apporte une grande souplesse. Pour la peau, le nombre de combinaisons possibles qui présentent a priori un intérêt est aujourd'hui de l'ordre de plusieurs centaines. Ces combinaisons permettent de caractériser les différentes structures de la peau en termes de morphologie, quantité et organisation de ses constituants. L'utilisation de cette nomenclature simplifie considérablement le traitement 30 informatique des paramètres de quantification ainsi que le développement du programme lui-même. L'utilisateur peut définir, préalablement à l'étape c), la mesure à effectuer en sélectionnant des descripteurs choisis parmi des listes de descripteurs prédéfinis. Les choix peuvent s'effectuer à l'aide d'une interface graphique. Les descripteurs peuvent correspondre aux quatre chanips définis dans la nomenclature. Les tableaux ci-dessous donnent les listes de différentes valeurs pour chacun des descripteurs, chaque valeur peut être identifiée par un code de quelques lettres. Le nom du 5 paramètre de quantification est alors donné par la concaténation de ces quatre codes, séparés par des Les combinaisons théoriquement possibles sont nombreuses, et certaines inintéressantes. Par exemple, les granulométries sont avantageusement calculées dans une région de l'image présentant une texture homogène (ED, DT et DU, essentiellement). Le 10 système peut être agencé pour interdire certaines combinaisons. Le tableau ci-dessous donne quelques exemples de codes. Nom du paramètre de Signification quantification AF _B MF Moy Moyenne (MOY) calculée sur les valeurs des pixels appartenant au masque des fibres (MF) prises dans le signal brut (B) d'autofiuorespence (AF) AF_B_DT_Sign Proortion de pixels bruts (B) d'AF significatifs ,S dans le derme (DT) AFSHQ,B_DT_SAAID (SFIC, B DT- SIGN AF....B DT_SIGN) (AF_B_DT_SIGN SHG 13=DT SIGN) AF_B I Et hart type du signal d'AF brut sur l'ensemble de l'image Segm_B_JDE_PosMoy Profondeur moyenne de la JDE Tableau 1 : Exemples de paramètres de quantification. 15 La plupart des mesures produisent des valeurs scalaires. Certaines cependant donnent des valeurs vectorielles. Dans le cas des mesures vectorielles, dans le tableau de sortie on a, en plus des colonnes de données, une colonne indiquant la longueur du vecteur (« _n »), une deuxième précisant l'indice de la première valeur (« _x0 »), et une troisième donnant le pas des indices 20 (« dx »). Le tableau ci-dessous donne quelques exemples de codes de modalités. Code Modalité Définition AF Autofluorescence Signal obtenu en additionnant les quatre valeurs temporelles données par le microscope pour chaque pixel pour le canal AF SHG Génération de seconde Signal obtenu en additionnant les quatre valeurs temporelles données par le microscope pour chaque pixel pour le canal SHG harmonique AFSHG Autofluorescence et Les deux signaux sont pris en compte génération de seconde conjointement harmonique AFcorr Autofluorescence après Correction de l'atténuation latérale et axiale du canal AF. La correction en profondeur se fait en calant un modèle de décroissance exponentielle sur le signal moyen, image par image. La correction latérale, pour un canal donné, se fait en calculant la moyenne de toutes les images d'une étude pour ce canal, soit en calant un modèle parabolique sur cette moyenne, soit en utilisant directement cette moyenne pour corriger les images. correction de l'atténuation SHGcorr Génération de seconde Correction de l'atténuation latérale et axiale du canal SHG. La correction se fait de la même façon que pour le canal AF. harmonique après correction de l'atténuation AFSHGcorr Autofluorescence et Correction de l'atténuation latérale et axiale des deux canaux génération de seconde harmonique après correction de l'atténuation AFpentes Pente de décroissance du Pente de la régression linéaire du logarithme des signal AF signaux temporels, pixel par pixel, en AF, Proportionnel à l'inverse de la durée de vie Segm Segmentation Les mesures effectuées partent directement de la segmentation de la peau Tableau 2 : Nomenclature - Codes des modalités. Le type de prétraitement indique l'éventuel traitement appliqué aux données initiales, identifiées par le code de modalité. L'absence de prétraitement est indiquée par le code de prétraitement « B » pour « données brutes ». La méthode de prétraitement, permettant de rehausser les fibres du derme est indiquée par le code de prétraitement «RF3D » pour « 10 rehaussement de fibres en 3D ». La région d'intérêt peut correspondre à l'ensemble de l'image. Lorsque la région d'intérêt correspond à une partie seulement de l'image, les calculs se font à l'intérieur de la région d'intérêt et les pixels se trouvant à l'extérieur ne sont pas pris en compte. Le tableau ci-dessous donne des exemples de codes de régions d'intérêt pour la peau. Code Région d'intérêt Définition I Ensemble de l'image On prend en compte tous les pixels de l'image Surf Interface couplantlépiderme Surface 2D de jonction entre le couplan et épiderme JDE Interface épiderme/derme Surface 2D de jonction entre l'épiderme et le derme A Couplant Ensemble du couplant, tel que donné par le résultat de la segmentation ED Epiderme Ensemble de l'épiderme, tel que donné par le résultat de la segmentation EDsansSC Epiderme sans stratum corneum Epiderme privé de sa couche superficielle (stratum corneum disjunctum et stratum compactum). L'épaisseur- de cette couche est donnée par la variable MEL_MARGE DT Derme total Ensemble du derme, tel que donné par le résultat de la segmentation XXXTr1, Première et deuxième tranche sous la JDE d'épaisseur )0(X, puis le reste de la région XXXTR1 : ensemble des pixels se trouvant sous la JDE à une distance inférieure à XXX prn de celle-ci. XXXTR2 : ensemble des pixels se trouvant sous TRI à une distance inférieure à )00( pm de celle-ci. XXXTR3 : ensemble des pixels du derme n'appartenant ni à )00(TR1 ni à XXXTR2. XXX peut prendre les valeurs 10 et 20 microns. XXXTr2 >00(Tr3 MFAF Masque des fibres en AF Région correspondant aux fibres élastiques dans le derme. Pour la calculer, on part de l'image AF rehaussée (RF3D), qu'on seuille. La valeur du seuil est donnée par la moyenne du signal AF rehaussé dans le derme, plus son écart type multiplié par la constante QUANTIF XSigma MF. MFSHG Masque des fibres en SHG Région correspondant aux fibres de collagène dans le derme. Pour la calculer, on part de l'image SHG rehaussée (RF3D), qu'on seuille. La valeur du seuil est donnée par la moyenne du signal SHG rehaussé dans le derme, plus son écart type multiplié par la constante QUANTIF XSigma_MF. DUAF Derme utile obtenu à partir du contraste AF Partie du derme en AF comportant des fibres élastiques pouvant être détectées. Elle est obtenue avec une fermeture morphologique du masque des fibres AF (MFAF) par un disque de diamètre QUANTIF DIAM CAPIL. DUSHG Derme utile obtenu à partir du contraste SHG Partie du derme en SHG comportant des fibres de collagène pouvant être détectées. Elle est obtenue avec une fermeture morphologique du masque des fibres SHG (MFSHG) par un disque de diamètre QUANTIF_DIAM_CAPIL. DUinter Derme utile commun Intersection de DUAF et DUSHG MMs Masque des pixels attribués à la mélanine par seuillage Ce masque est constitué des pixels de EDsansSC, tels que la valeur d'AF est supérieure au seuil MEL_SEUIL. Le traitement est suivi par un filtre surfacique de taille MEL FILTER AREA. MMp Masque des pixels attribués à la mélanine par la méthode des pentes Ce masque est constitué des pixels de EDsansSC, tels que la valeur d'AFpentes est supérieure au seuil MEL_SEUIL_PENTES. Le traitement est suivi par un filtre surfacique de taille MEL FILTER AREA. xMMs Masque inverse de MMs Complémentaire dans EDsansSC de MMs xMMp Masque inverse de MMp Complémentaire dans EDsansSC de MMp Tableau 3 : Nomenclature - Codes des régions d'intérêt. Les mesures peuvent être liées à l'intensité des signaux, par exemple donner la moyenne de l'intensité du signal dans la région d'intérêt (Moy), la médiane de l'intensité du signal dans la région d'intérêt (Med) ou l'écart-type, de l'intensité du signal dans la région d'intérêt (Et). Les tableaux suivants s'intéressent plus particulièrement aux mesures géométriques, aux mesures spécifiques à la quantification de l'épiderme et à celles spécifiques au derme. Les mesures géométriques portent sur la forme de la région d'intérêt uniquement : les 10 deux champs « modalité » et « prétraitement » n'ont pas d'influence sur la mesure. Code Mesure Définition EpMoy Moyenne de l'épaisseur de la Moyenne des épaisseurs de la couche en z (en pm) couche en z (en prn) obtenues en chaque point (x, y) de 'image EpEt Ecart-type de p i seur de la Ecart-type des épaisseurs de la couche en z (en pm) couche en z (en pm) obtenues en chaque point (x, y) de l'image EpMin Minimum de l'épaisseur de la Minimum des épaisseurs de la couche en z (en pm) couche en z (en pm) obtenues en chaque point (x, y) de l'image EpMax Maximum de l'épaisseur de la couche en z (en, pm) Maximum des épaisseurs de la couche en z (en pm) obtenues en chaque point (x, y) de l'image VoI3D Volume occupé par la couche (en pm Volume (en prri) des pixels de la couche PosMoy Moyenne de la position de Moyenne de la position en z de l'interfac (en pm) par l'interface (en pm) rapport au 0 (défini par la première image »y acquise) PosEt Ecart-type de la position de Ecart-type de la position en z de l'interface (en pm) par rapport au 0 (défini par la première image x-y acquise) l'interface (en pm) Amp Amplitude de variation de la (Max-Min) de la position en z de l'interface (en pm) position de l'interface (en pm) AireN Aire d'interface normalisée Aire de la JDE ou de la surface de la peau, normalisée par l'aire de la surface de la base de l'image (plan de référence : (x,y)). Cette valeur est supérieure à 1, sauf si une partie de la JDE disparaît sous la dernière coupe de l'image. AireFront Aire de la frontière de la région d'intérêt. Aire, en pm2, de la frontière de la région d'intérêt. Tableau 4 : Nomenclature - Codes des mesures géométriques. de Mesure DéfinitIon Dens:é. de p.-lel:11-r : - n-,e1T1-..: c..p:-_,71-_'..n des p r.e:s consideres 1-_..clrarne ccr'es:-.:::r::::.3nt a directe fa r-ie:a-t-re 7...7:r,:7, ,,_-; Pr.DI. -u-'.; : : :'_.--=:.. L:errs::e. :i=1 - r.e.r_r .-. _ - , .i7.1 c,:.--1.; p .,=:..s ___rsidere, :.enry,...... 1.:-:--...e!..e ,.:.u.:- ie-.:-... peres terri': c.-eles _ 1-, :r élan :,--le1:.: R.. 1n,_ :erée., CalcUleC _ - ces pren:e.,-' temr..crelles. '.1...e '-' -_ .I ' PE!.T,7:=; r.lel',1edDiF.,-. .1 Me.:-Inne ,..,hr 1-1 ce In Evoluti.:Dri ce ia .....p.lantize de m:éla.nine en fc:r.:-.:ir..n cle ia ne.''nr.:cle ir.éc>.e.,:, - ,._,':nrrde_IJr. r .al,_;ee («Jar, I épiderrne. .---..,1Cleil' .e sortie. . i,2_1:-....i e .:a ire..:--.11 - d:sfrU:ut:ç.n. ..-yr bre.de cl.mses r : Uer1ed1::1::;:r1 -. Iv1:,.-2,:ir.,!- n de la EVokitiûrr ce la. ,::::.,antlIe Ce. mélanine en f:-_:-D:-i de la Pentes n-lel.:::- Ir -... f,..-':', penteE,', :-.1--...n.-_:.ei.ir. nom- ,-..,.::,:ee o-r,..r --... ..n_--..iderme. r - r: sotie. re..gisTe :3 IleGii.71Pe. de r...eue. -_1'7,,-.rl....i Nombre de cla,.:,:-e-:. -- :- 1.--t'f,s - ._- : r.'e.I , Db-tr arr Ti..5:ia'.-11ne 7-1-.:qution ...-.:e. la quantite Ce mélanirie en fr:::-:clon c,E. la iTne:-- ,.::irec.:e; el i 1 -" - r :91...r, r,.....-_:.rm--,.!:,:i.,= ---,r .T.. -'err-ie, la pu:JI ncleur n:-.)rrn::::Ir...:. Dans ,,1..-...,, 1- .--,:',7-e. or, enr,.,..aist. ,-.1 : --_,Te '....aleuTs r'--T :7.e-_-..e -.-2..f-irikji_f-"-.,-:_.n. Nfprnbre de ,,--,,,-.7'.--_-,e le la ' '...r:::r: : ... -_ ' j -::". _....:' S.E-.'_-.'. DIs7,7...!_i - 'ne::: r _.:, utirin ce la .:-.R...antité ce mélanine er:. for.c.r.l-_, -I rie 0 f.: '..: fr-..1-11--:-', f f'_- "f f ::'--.4:r-_-:--.1.7, r:DFIY....',:i',.=.: Cr.-", I er..r.l.erme proi:::r - non' -. -.- - Dan: fohierde sortie. an enre:-.»;,;-, -2, !.st-- de .-'' ' e:,-J e 1-,7 -' l'':..11.:Dr.: Tableau 5 : Nomenclature - Codes des mesures quantitatives sur l'épiderme. Code Mesure Définition Sign Proportion des pixels Rapport entre les pixels significatifs (c.à,d. des pixels dont la valeur ciépasse la valeur de SIGN SEUIL) et le nombre total de pixels contenus dans la région d'intérêt. Cette mesure est par conséquent sans unité. significatifs SAAID « SHG--to-AF aging index of Ratio entre, d'une part, la différence entre proportions de derm is » pixels SHG et AF et d'autre part, la somme des proportions de pixels AF et SHG. Comme pour la mesure Sign, il faut définir une valeur de seuillage, donnée aussi par SIGN SEUIL. Il découle de cette définition que cette mesure ne peut être calculée que sur les deux modalités prises conjointement. SHGtoAF R ' S G AF Ratio entre les intégrales des signaux SHG et AF, au sein de la région d'intérêt. Il découle de cette définition que cette mesure ne peut être calculée que sur les deux modalités prises conjointement lmbr Imbrication entre les deux Volume de l'intersection des deux signaux AF et SHG, divisé par le volume de l'union. réseaux de fibres AF et SHG Le résultat est forcément compris entre 0 et I et est sans unité. IrnlorN Imbrication normalisée entre les deux réseaux de fibres AF et SHG Volume de l'intersection des deux signaux AF et SHG, divisé par le volume de l'union. Les signaux AF et SHG sont normalisés de façon à ce que leur intégrale soit égale. Le résultat est forcément compris entre O et I et est sans unité, ' AnisXYZ Indice d'anisotropie Dans le repère x-y-z : Indice indiquant si l'orientation des fibres est anisotrope ou non : valeurs comprises entre 0 et 1 : 0= isotrope (pas d'orientation privilégiée) 1= anisotrope (il existe une orientation privilégiée) ThetaXYZ Angle privilégié Theta (en Dans le repère x-y-z : angle privilégié theta (azimut) du 1 er vecteur propre degrés) PhiXYZ Angle privi égié Phi (en degrés) Dans le repère x-y-z : angle privilégié Phi (élév ion) du 1er vecteur propre, par rapport au pian (xy). AnisJDE Indice d'anisotropie Dans le repère local normal à la JDE : indice indiquant si l'orientation des fibres est anisotrope ou non : valeurs comprises entre 0 et 1 : 0= isotrope (pas d'orientation privilégiée) 1= anisotrope (il existe une orientation privilégiée) Phi DE Perpendicularité à la JDE Dans le repère local normal à la JDE ; valeur d'angle entre 0 (parallèle à la JDE) et 90° (perpendiculaire à la JDE) Decr Décroissance du signal en Pente de la droite obtenue par régression linéaire sur le profondeur neuvième central du volume 3D (partie centrale de l'image) à partir de la dernière partie de la courbe de profil du logarithme de l'intensité. Al2D \ndicad'eUongement2D le volume du disque correspondant au diamètre géodésique de chaque objet, et le volume de l'objet. Le résultat est sans unité et supérieur à I. Ceci est fait coupe 2d par coupe 2d. La valeur globale est obtenue en moyennant les valeu , pixel par pixel, dans les objets (le fond n'est pas pris en compte), Code Mesure Définition Ak3D Indice d'allongement 3D Rapport entre le volume de la sphère correspondant au diamètre géodésique de chaque objet, et le volume de l'objet. Le résultat est sans unité et supérieur à 1. La valeur globale est obtenue en moyennant les valeurs, pixel par pixel, dans les objets (le fond n'est pas pris en compte). , Tort2D Tortuosité 2D Tortuosité 2d des fibres. Pour binariser le signal, on utilise un seuil de valeur : Moyenne + écart-type * QUANT1F XSigma_Tort2d Tort3D Tortuosité 3D Tortuosité 3D des fibres. Pour binariser le signal, on utilise un seuil de valeur : Moyenne(z) + écart-type(z)* QUANT1F XSigma_Tort3d DiamG2D Diamètre géodésique 2D Diamètre géodésique des fibres en 2d. Pour binariser le signal, on utilise un seuil de valeur : Moyenne(z) + écart-type(z) . QUANT1F XSigma_DiamG2D DiamG3D Diamètregéodésique 3D Diamètre géodésique moyen des fibres en 34 Pour binariser le signal, on utilise un seuil de valeur : Moyenne(z) + écart-type(z) . QUANTIF XSigma_DiamG3D SkelBranch Nombre de branches du Nombre de branches après déconnexion (suppression des points triples) à partir du squelette des fibres en 3D. Pour binariser le signal, on utilise un seuil de valeur : squelette Moyenne(z) + écart-type(z) * QUANTIF XSigma SkelBranch SkelLongBr Nombre de branches Nombre de branches « longues » après déconnexion des « longues » du squelette. branches (suppression des points triples) à partir du , squelette des fibres en 3D, Une branche est considérée comme longue si sa longueur est supérieure à la valeur de la variable QUANT1F THRESH SKELLENGTH. Pour binariser le signal, on utilise un seuil de valeur : Moyenne(z) + écart-type(z) . QUANT1F XSigma_SkelLongBr SkelLorigMoy - Longueur moyenne des Longueur moyenne des branches du squelette. Pour binariser le signal, on utilise un seuil de valeur : branches Moy(z) + écart-type(z) QUANT1F X.Sigma_SkelLongMoy ^ aGValfi] l--z2,3,4 Valeurs de la courbe anti- Trois valeurs (à GRANU 1, GRANU 2 et GRANU 3, en granulométrique microns) de l'antigranulométrie des fibres, La valeur maximale de la courbe est GRANU MAX. Calculées en 3D à partir du masque des fibres. Tableau 6 : Nomenclature - Codes des mesures quantitatives sur le derme Voici quelques exemples de paramètres parmi les nombreuses combinaisons possibles : - Exemple 1 : Modalité : SEGM Prétraitement : aucun Région d'intérêt: épiderme Mesure : épaisseur moyenne Code d'après la nomenclature :SEGM B_EDEpMoy Ce paramètre calcule l'épaisseur moyenne de l'épiderme, à partir de la segmentation 3D. - Exemple 2 Modalité : SEGM Prétraitement : aucun Région d'intérêt : JDE Mesure : aire normalisée Code d'après la nomenclature :SEGM B JDE AireN _ Ce paramètre calcule l'aire normalisée (généralisation 3D de l'index d'interdigitation) de la jonction dermo-épidermique à partir de la segmentation 3D. - Exemple 3 Modalité : SHG Prétraitement : rehaussement des fibres en 3D Région d'intérêt : derme Mesure : diamètre géodésique DCode d'après la nomenclature :SHG RF3 DT DiamG3D Ce paramètre permet de calculer le diamètre géodésique des fibres de collagène (signal SHG) dans le derme, après rehaussement des fibres en 3D. - Exemple 4 : Modalité : AF Prétraitement : rehaussement des fibres en 3D Région d'intérêt : première couche de derme de 10µm sous la JDE Mesure : angle des fibres par rapport à la JDE Code d'après la nomenclature : AF_RF3D_10TRlPhiJDE Ce paramètre calcule l'orientation des fibres élastiques (AF) par rapport à la JDE (mesure d'un angle dans un repère tournant) à partir des fibres rehaussées dans la première tranche de derme de 10 !AM sous la JDE. - Exemple 5 Modalité : AFpentes Prétraitement : aucun Région d'intérêt : épiderme Mesure : Distribution en z de la mélanine estimée par la méthode des Pentes Code d'après la nomenclature : AFpentes_B_EDMelDistribZPentes. Ce paramètre restitue un vecteur représentant la distribution de la mélanine en fonction de la distance z (de la couche basale vers la surface de la peau) en prenant comme critère de détection de la mélanine la décroissance du signal d'autofluorescence analysé par la méthode des pentes. - Exemple 6 : Modalité : AFSHG Prétraitement : rehaussement des fibres en 3D Région d'intérêt : sous région du derme où les fibres sont nettement visibles Mesure : imbrication des deux réseaux de fibres Code d'après la nomenclature : AFSHGRF3DDUinterImbrNSD Ce paramètre permet d'avoir une idée de l'imbrication des deux réseaux de fibres entre eux calculé à partir des fibres rehaussées dans la région du derme appelée DUinter. Selon un autre de ses aspects l'invention a pour objet un procédé pour évaluer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement, notamment anti-âge, antioxydant, photo-15 protecteur, anti-pigmentant, pro-pigmentant ou dépigmentant, sur un tissu biologique, comportant les étapes consistant à : - effectuer une mesure suivant l'étape c) d'un procédé tel que décrit précédemment sur une première partie du tissu n'ayant pas subi d'action du stimulus et/ou du traitement et obtenir un premier résultat, 20 - effectuer une mesure suivant l'étape c) d'un procédé tel que décrit précédemment sur une deuxième partie du tissu ayant subi une action du stimulus et/ou du traitement et obtenir un deuxième résultat, - comparer les premier et deuxième résultats, et évaluer l'action du stimulus et/ou du traitement à partir au moins de cette 25 comparaison. Les première et deuxième mesures peuvent être effectuées sur des parties identiques ou non. Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour évaluer les effets sur la pigmentation de certains produits, par exemple les dermocorticoïdes. 30 Le traitement peut être non thérapeutique, notamment cosmétique. Le traitement peut correspondre à la prise de compléments alimentaires et/ou dé médicaments. Le traitement peut être choisi parmi : l'application, Pinjectfon, l'ingestion, l'inhalation d'un produit, notamment d'un produit cosmétique. Par « produit cosmétique », on entend un produit tel que défini dans la Directive 93/35/CEE du 14 juin 1993, modifiant la Directive 76/768/CEE. Le produit peut avoir un effet anti-âge, antioxydant, photo-protecteur, dépigmentant, anti-pigmentant, ou pro-pigmentant. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé pour évaluer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement, notamment anti-âge, antioxydant, photo-protecteur, anti-pigmentant, pro-pigmentant ou dépigmentant, sur un tissu biologique, dans lequel au moins deux régions du tissu sont exposées différemment au stimulus et/ou traitées différemment, et dans lequel on compare lesdites régions, à l'aide d'un procédé tel que précédemment décrit, avant et après exposition audit stimulus ou audit traitement. Pour tester l'action d'un produit on peut comparer une évaluation faite après traitement avec un placébo du produit et une évaluation faite après traitement avec ce produit. Le placébo est par exemple le même milieu cosmétique que celui du produit utilisé pour le traitement mais sans le ou les actifs correspondants. Le traitement peut correspondre à l'application d'un produit, notamment cosmétique. Le produit peut par exemple être sous la forme d'une crème, une lotion, une pommade, une huile, une poudre, cette liste n'étant pas limitative. Le produit peut également être contenu dans un support à appliquer sur les tissus biologiques, notamment la peau humaine, reconstruite ou artificielle, par exemple un patch, 20 un pansement, un bandage ou un masque. Le produit peut être destiné par exemple au maquillage, à l'hydratation, à la protection des tissus biologiques, notamment la protection solaire, ou à la réparation des tissus biologiques. Le produit peut comporter un actif, par exemple un actif anti-âge, antioxydant, 25 photo-protecteur, dépigmentant, anti-pigmentant, ou pro-pigmentant. L'actif peut être à visée thérapeutique comme par exemple l'hydroquinone ou es rétinoïdes, et/ou cosmétique. L'invention pourra être mieux comprise à la lecture qui va suivre, de la description d'exemples non limitatifs de mise en oeuvre de celle-ci, et à l'examen des figures 30 du dessin annexé, sur lequel : la figure 1 représente, de façon schématique et partielle, un exemple de dispositif multiphoton pouvant être mis en oeuvre dans un procédé selon l'invention, - la figure 2 illustre différentes étapes d'un procédé conforme à l'invention, - les figures 3a à 3b représentent de façon tridimensionnelle l'observation des signaux AF, respectivement SHG, - les figures 4a à 4d illustrent un exemple d'acquisition d'une image selon l'invention, les figures 5a et 5b montrent respectivement les données brutes 2PEF et SHG et la segmentation tridimensionnelle correspondante pour une pile d'images multiphoton acquise in vivo sur la peau humaine. les figures 6a et 6b représentent schématiquement la segmentation de la peau (A - couplant, S - surface couplant-épiderme, B - épiderme, J- jonction dermo-épidermique, 10 C - derme) les figures 7a à 7d représentent des images de la peau acquises à différentes profondeurs par rapport à la surface, les figures 8a à 8f illustrent à une profondeur donnée différentes modalités définies par la nomenclature selon l'invention, 15 les figures 9a à 9c illustrent un exemple de procédé avec filtrage, et les figures 10 à 13 illustrent des résultats de mesure obtenus par un procédé selon l'invention. Pour mettre en oeuvre un procédé selon l'invention, tout système connu de microscopie multiphoton, combiné ou non à un module FLIM pour la détection spécifique de 20 la mélanine, est utilisable. La longueur d'onde d'excitation utilisée peut être comprise entre 700 et 1000 nm, de préférence voisine de 760 nm. Cette gamme de longueur d'onde permet une imagerie satisfaisante pour les signaux 2PEF et SHG de la plupart des tissus, en particulier de la peau. Chaque acquisition produit deux images de 511 x 511 x 70 voxels avec une 25 résolution de 0,255 pm dans le plan (x,y) perpendiculaire à l'axe optique et de 2,346 pm dans la troisième direction (z). On a représenté sur la figure 1, de façon schématique et partielle, un exemple de dispositif multiphoton 100 pouvant être mis en oeuvre dans un procédé selon l'invention. Le dispositif multiphoton 100 est par exemple du type DermaInspecte 30 commercialisé par la société Jenlab. Le dispositif 100 comporte un laser femtoseconde 10, par exemple un laser Titane-Saphir (Ti : Sa), accordable dans une gamme des longueurs d'onde infrarouge et pouvant fournir des impulsions de l'ordre de 100 femtosecondes à un taux de répétition de l'ordre de 80 MHz. Le laser 10 émet un faisceau infrarouge 11, qui est dirigé vers un dispositif de balayage 12 du faisceau laser sous la forme d'un « scanner XY ». Un balayage du faisceau laser peut être obtenu en déplaçant angulairement deux miroirs galvanométriques du dispositif de balayage 12. Le faisceau est ensuite réfléchi par un miroir dichroïque 14 et il est focalisé sur les matières kératiniques 13 à l'aide de l'objectif 15. Ainsi, les deux miroirs galvanométriques permettent un balayage du point de focalisation dans le plan (x, y) perpendiculaire à la direction de propagation du faisceau (axe z). Un dispositif piézo-électrique permet de translater l'objectif 15 et de changer ainsi le plan de focalisation dans les matières kératiniques 13. De la sorte, il est possible de reconstituer la distribution tridimensionnelle de la mélanine dans les matières kératiniques par superposition des images acquises. Pour ce faire, les signaux créés au point focal peuvent alors être détectés soit en épicollection à travers l'objectif d'excitation 15. Le premier miroir dichroïque 14 permet de sélectionner les signaux multiphoton créés, notamment l'autofluorescence (AF) provenant des matières kératiniques 13. Puis, un deuxième miroir dichroïque 16 permet de séparer les signaux d'autofluorescence (AF) des autres signaux multiphoton, correspondant par exemple à la génération de seconde harmonique (SHG). Dans tous les cas, les signaux passent au travers de filtres spectraux 17 et arrivent sur des détecteurs standard ou sur des détecteurs en comptage de photons (TCSPC° : Time-correlated single photon counting) pour l'imagerie FLIM 18, 19 qui génèrent des signaux 18a et 19a qui sont transmis .à un dispositif électronique 20 d'acquisition et de traitement des signaux. Avec les détecteurs de comptage de photons le dispositif comporte un module d'imagerie FLIM pour la détection spécifique de la mélanine. On peut obtenir de cette façon des images combinées, par exemple AF/SHG et / ou des images FLIM, et traiter ces images afin d'obtenir les mesures recherchées. L'étape 1 d'un procédé tel qu'illustré figure 2 peut consister à acquérir par microscopie multiphoton des images tridimensionnelles comportant des séries d'images bidimensionnelles et/ ou temporelles à différentes profondeurs d'un échantillon de tissu biologique. Dans le cas de l'imagerie FLIM, chaque image peut être obtenue par intégration au 30 cours d'un intervalle de temps des signaux 2PEF et SHG par exemple en utilisant un dispositif en comptage de photons TCSPC (Time-correlated single photon counting). Une image tridimensionnelle ou temporelle tridimensionnelle peut être formée à partir d'une mosaïque d'images bidimensionnelle ou temporelles bidimensionnelles à différentes profondeurs. Chaque image 3D peut comporter plusieurs dizaines d'images, par exemple entre 50 et 100 images, notamment entre 65 et 80 images. Ainsi les figures 3a et 3b représentent une image 3D sous forme d'une 'mosaïque d'images 2D du signal 2PEF intégré dans le temps, respectivement du signal SHG intégré dans le temps, à différentes profondeurs. Les images multiphoton acquises en profondeur contiennent du bruit lié à l'acquisition : d'une part, la diffusion de l'excitation et de signaux multiphoton par le tissu conduit à une atténuation du signal en profondeur; et d'autre part, l'augmentation de la 10 puissance d'excitation avec la profondeur augmente le bruit, car l'intensité d'excitation en surface de l'échantillon devient suffisamment intense pour créer un signal multiphoton. Ceci peut conduire à un brouillage des images et ainsi perturber les mesures réalisées par la suite à partir de ces images. Ce bruit peut être réduit à l'aide d'un filtrage spécifique, notamment dans le cas 15 du derme. Prétraitement des images 3D - rehaussement 3D des fibres Comme le montre la figure 2, le procédé peut comporter une étape 2 correspondant à un filtrage. Le filtrage décrit ci-dessous, et utilisé éventuellement dans le derme, appelé rehaussement 3D des fibres, est particulièrement utile pour améliorer la 20 caractérisation des réseaux de fibres de collagène et de fibres élastiques. Ce rehaussement est réalisé en trois dimensions, malgré la difficulté que peut poser une différence importante de pas d'échantillonnage entre les différentes dimensions des images, le pas d'échantillonnage dans le plan parallèle à la peau pouvant être dix fois plus petit que celui de la direction orthogonale à ce plan. 25 Il s'agit d'un filtre linéaire, orientable et très anisotrope pour rehausser les fibres et éliminer toutes les autres structures. Soit h la réponse impulsionnelle du filtre et H sa réponse fréquentielle, H liée à h par la transformée de Fourier H = Le filtre est conçu en adaptant sa réponse impulsionnelle à la forme des structures à rehausser. Pour des fibres, la forme de h sera un 30 ellipsoïde allongé, symétrique par rotation autour de l'axe principal z. Les deux axes secondaires sont notées x et y. Soit lu, hy et h, les sections centrées de h le long des axes x, y et z. Grâce à la symétrie de h par rotation autour de z, nous avons h, = hy. La section de h perpendiculaire à l'axe z et centrée forme un profil laplacien, obtenu par soustraction de deux gaussiennes, , avec a l'écart-type. Ce paramètre a est ajusté au rayon des fibres. a est par exemple fixé à 0,765 mn. La section centrée le long de l'axe principal z forme un profil gaussien G,, avec 6 fixé à 2,5 mn. Les fibres ont une courbure limitée, et en première approximation, elles peuvent être considérées comme linéaires sur au moins une longueur de 5 11111. Le gain du filtre est ensuite normalisé à 1, en posant H = On utilise l'approche proposée par W. T. Freeman, E. H. Adelson dans "The Design and Use of Steerable Filters", IEEE Trans. On Pattern Analysis and Machine Intelligence, vol. 10 13, No. 9, Septembre 1991 Ce procédé se base sur le principe suivant. Pour rehausser les fibres orientées selon l'angle iv, on prend le , une copie de h ayant subi une rotation de v, w=(0, Il), où 0 et (I) désignent l'azimut et l'élévation. Ensuite, h'1' est discrétisé en Z3 avec les mêmes pas d'échantillonnage que l'image, dx=dy=0,255208 gm et d z =2,346 gm. 15 Pour rehausser toutes les fibres quelle que soit leur orientation, on procède par échantillonnage 'angulaire. Soit t- un ensemble d'orientations discrètes, et soit le le banc de filtres orientés selon toutes les orientations tif,. La discrétisation angulaire dy est fixée avec un pas de de = 30° et d(1) = 45°. Le filtrage de l'image f par la banque de filtres le s'effectue de la manière suivante : 20 avec 4 `-1, la transformée de Fourier inverse. Le filtre le donne une réponse maximale pour un objet ayant des propriétés géométriques similaires à h et orienté selon y. Ainsi, l'image filtrée, f ' , contient les fibres rehaussées ; toutes les autres structures ont été atténuées. Dans une étape 3, on segmente le volume observé. Dans le cas de la peau séparée en 25 trois zones, on utilise les valeurs basses de 2PEF pour le milieu de couplage; les valeurs hautes de 2PEF pour l'épiderme ; et les valeurs hautes de SHG pour le derme. On ne garde que les composantes connexes des images binaires ainsi obtenues qui touchent des plans de référence, choisis par exemple tels que z-0 pour le milieu de couplage; z=15 pour l'épiderme, et tel que l'intégrale du signal SHG soit maximal pour le derme. Des conflits (c'est à dire une intersection non vide) entre les marqueurs de l'épiderme et du derme peuvent apparaître. Dans ce cas, on donne la priorité au marqueur du derme, car le SHG est un signal plus discriminant que le 2PEF. Ceci veut dire, en pratique, que si un voxel appartient en même temps aux marqueurs du derme et de l'épiderme, il est alors supprimé du marqueur de l'épiderme. On calcule d'abord la frontière entre le milieu de couplage et l'épiderme, puis la frontière entre l'épiderme et le derme, en utilisant l'algorithme préférentiel précédemment défini. Il faut cependant noter que le calcul de la segmentation de bas niveau n'est réalisé qu'une seule fois. L'étape 4 de la figure 2 correspond à la mesure proprement dite par traitement d'images fondé sur une nomenclature telle que définie précédemment. Les Figures 4a à 4d illustrent une séquence temporelle d'images tridimensionnelles (0-2ns ; 2-4 ns ; 4-6 ns; 6-8ns) dont on ne montre que quatre images temporelles bidimensionnelles acquises in vivo sur la peau de l'avant-bras d'un volontaire sain, près de la couche basale de l'épiderme à une profondeur de 50 ltm par rapport à la surface de la peau. En chaque pixel représentatif de chaque signal, on dispose de quatre valeurs, acquises consécutivement dans le temps. Pour chaque image temporelle, le signal de fluorescence a été intégré sur une durée de 2 ns. Cette information est utilisée pour la détection spécifique de la mélanine. La segmentation permet de définir des régions d'intérêt spécifiques à l'intérieur de l'épiderme ou du derme. Ces régions d'intérêt peuvent correspondre à des constituants de la peau tels que les fibres du derme comme les fibres élastiques ou les fibres de collagène, les cellules de l'épiderme ou la mélanine. Les mesures particulières réalisées grâce à l'invention peuvent porter sur une région. La figure 5a illustre de façon tridimensionnelle les signaux 2PEF et SHG dans trois régions principales (couplant, épiderme et derme) et la figure 5b représente les mêmes régions après segmentation. Dans cet exemple, l'image 3D est segmentée en. 3 zones (couplant, épiderme, derme) codées avec trois valeurs : une valeur à 6 est attribuée au couplant, une valeur à 9 à l'épiderme et 12 au derme. Les figures 6a et 6b donnent différents exemples de segmentation de la peau en plusieurs régions d'intérêt. Le milieu de couplage A est ici de l'eau, mais peut changer en fonction des objectifs utilisés (à sec, immersion à huile ou autre milieu). Alors que la figure 6a montre que le procédé selon l'invention permet de définir des tranches dans l'épiderme B, par exemple trois tranches équidistances entre la surface de la peau S et la JDE J , l'utilisateur a également la possibilité de définir dans le derme C des tranches dont les frontières sont normales à la JDE J et d'épaisseur définie comme illustré figure 6b. Les tranches tl et t2 représentées sont d'épaisseur fixe, par exemple 10 ou 20 µm. Les figures 7a à 7d représentent des images multiphoton de dimensions 130x130 pm2 de peau humaine observée in vivo. La peau observée ici, est normale et ne présente aucune pathologie. Sur les images observées, le signal 2PEF révèle les coméocytes dans le stratum corneum observé figure 7a, les kératinocytes dans le stratum granulosum illustré figure 7b, et le stratum basale représenté figure 7c. Dans le demie, comme illustré figure 7d, le signal 2PEF révèle les fibres élastiques alors que le signal SHG, est caractéristique de la distribution des fibres de collagène. Les images brutes telles qu'illustrées par exemple sur les figures 3a, 3b, 4a à 4d sont traitées afin de créer d'autres images dites images calculées qui constituent autant de modalités pouvant servir comme point de départ pour la détermination des régions d'intérêt, l'éventuel prétraitement et le calcul des mesures. Le procédé manipule des images 3D, mais les exemples donnés sur les figures 8a à 8f sont illustrés en 2D pour plus de clarté. Les figures 8a à 8f correspondent à des images bidimensionnelles de peau humaine extraites à une profondeur de 50 pm d'une image 3D. Les figures 8a et 8b montrent deux images, représentés en niveaux de gris, obtenues par intégration, en chaque pixel, des quatre valeurs temporelles et correspondant aux deux canaux 2PEF et SHG Les figures 8c et 8d illustrent deux images, représentés en niveaux de gris, dites corrigées, correspondant aux deux signaux 2PEF et SHG, dans lesquelles l'atténuation du signal, aussi bien due à la profondeur qu'à l'éloignement du centre du champ de vue (phénomène de vignetage), a été compensée. La figure 8e montre une image paramétrique, obtenue à partir de l'image 2PEF, et qui représente, en chaque pixel, la vitesse de décroissance du signal de fluorescence, obtenue grâce aux quatre valeurs temporelles précédemment mentionnées, liées à la durée de vie de fluorescence; et la figure 8f montre une segmentation de l'image en trois régions, correspondant au couplant, à l'épiderme et au demie. Les figures 9a à 9c illustrent l'effet du filtrage spécifique « rehaussement des fibres ». La figure 9a représente le signal SHG dans le derme par une coupe 2D extraite de la représentation 3D, la figure 9b représente la coupe correspondante après filtrage (image rehaussée). La figure 9c donne une image 3D du volume des fibres après rehaussement. ESSAIS REALISES Ce procédé a été utilisé pour analyser plusieurs bases de données. A. Etude Photovieillissement La base « Photovieillissement » est constituée de données provenant de 15 sujets 10 jeunes (18-25 ans) et 15 sujets âgés (70-75 ans) ; Pour chaque sujet, les faces ventrale et dorsale de l'avant-bras ont été étudiées. 484 paramètres de quantification ont été définis à partir de la nomenclature analytique selon l'invention parmi lesquels l'analyse des données obtenues a permis d'identifier 62 paramètres mettant en évidence des différences soit en fonction de l'âge, soit en fonction de la zone, soit 15 les deux. Par exemple, un premier paramètre défini par : Code d'après la nomenclature : AF_RF3D_DT_SkelLongMoy Modalité : AF Prétraitement : rehaussement des fibres en 3D 20 Région d'intérêt : Derme total Mesure : SkelLongMoy- longueur moyenne des branches du squelette de fibres élastiques Le paramètre de quantification « AF RF3D DT_ SkelLongMoy », caractérisant la longueur moyenne des branches du squelette de fibres élastiques, permet de mettre en évidence un effet 25 âge sur les fibres élastiques comme le montre la Figure 10. Par ailleurs, le paramètre défini par : Code d'après la nomenclature : SHG B DT Sign_SD Modalité : SHG Prétraitement : non 30 Région d'intérêt : Derme total Mesure : Sign - densité de pixels seuillés permet de mettre en évidence une différences de quantité de fibres de collagène entre les faces dorsale D et ventrale V de l'avant bras comme illustré Figure 11. Un dernier exemple de paramètre de quantification défini tel que ci-dessous : Code d'après la nomenclature : AFSHG RF3D DUinter ImbrN SD (Correspondant à l'exemple 6) Modalité : AFSHG Prétraitement : rehaussement des fibres en 3D Région d'intérêt : sous région du derme où les fibres sont nettement visibles Mesure : ImbrN - imbrication des deux réseaux de fibres Ce paramètre met, en évidence un double effet, âge et zone sur les fibres élastiques et les fibres de collagène comme le montre la Figure 12. 10 B. Etude pigmentation constitutive Code d'après la nomenclature : AFpentes_B_EDIVIelDistribZPentes (Correspondant à l'exemple 5) Modalité : AFpentes - images de pentes du signal AF Prétraitement : non 15 Région d'intérêt : épiderme Mesure : MelDistribZPentes - distribution normalisée de la mélanine, obtenue à partir des pentes de décroissance du signal AF Une autre base de données, issue de l'étude « pigmentation constitutive » est constituée d'images provenant de sujets appartenant à des groupes typologiques de couleur de 20 peau variant de I (peau claire) à VI (peau très foncée). La Figure '13 montre, pour deux sujets ayant des phototypes différents, la variation de la densité de la mélanine exprimée en % en fonction de la distance normalisée de la couche basale vers la surface exprimée en nombre des tranches normalisées définies au sein de l'épiderme. 25 La courbe (a) ainsi obtenue correspond au groupe I (peau très claire) alors que la courbe (b) correspond au groupe III (peau intermédiaire). On ,observe que le paramètre mesuré met bien en évidence la différence de phototype, la distinction est particulièrement marquée au niveau de la couche basale de l'épiderme (abscisse 1 sur le graphique). 30 L'invention n'est pas limitée aux exemples illustrés. Compte tenu de la vitesse des calculs, un procédé selon l'invention peut être utilisé dans une méthode de screening. Un procédé selon l'invention, peut être utilisé pour la caractérisation des modèles de peaux reconstruites. Un procédé selon l'invention peut être utilisé pour étudier tout effet impactant la peau (pharmacologique, physique, pathologique,...) Un procédé selon l'invention peut être utilisé pour analyser tout type de tissu contenant de la mélanine, des cellules, du collagène ou de l'élastine. En particulier le procédé selon l'invention n'est pas limité à la peau, il peut être appliqué à tout type de tissu dont les constituants sont imagés en utilisant des sources endogènes de signal ou des sources exogènes. L'expression « comportant un » doit être comprise comme étant synonyme de « comportant au moins un », sauf si le contraire est spécifié. 10 REVENDICATIONS1. Procédé d'observation d'un tissu biologique, comportant les étapes consistant à a) acquérir par excitation multiphoton au moins une image tridimensionnelle pour chacun des signaux 2PEF et SHG émis par ledit tissu, et b) déterminer par traitement d'images à partir de ces images tridimensionnelles une segmentation dudit tissu en au moins deux régions. 2. Procédé selon la revendication précédente, la segmentation permettant de délimiter au moins trois régions. 3. Procédé selon l'une quelconque, des revendications précédentes, le tissu 15 comportant de la mélanine. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le tissu comportant de l'élastine. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le tissu comportant du collagène. 20 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, l'étape b) comportant le calcul de marqueurs correspondant à chaque région et la propagation des marqueurs. 7. Procédé selon la revendication précédente, la propagation des marqueurs comportant l'application d'un algorithme de ligne de partage des eaux. 25 8. Procédé selon l'une des deux revendications précédentes, la propagation des marqueurs comprenant la génération d'un graphe comportant des noeuds reliés par des arêtes, et à chaque arête (e) reliant deux noeuds voisins correspondant à deux régions A et B est attribué un poids 0) (e) tel que : 30 o (e) E (s(p,q)/(1+Li(l(p), 1(q))) pour (p, q) E N(A, B) où s(p,q) est la surface séparant les voxels p et q, et 1,1(I(p), I(q) est la distance associée à la norme L1. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le tissu étant la peau, comportant une étape de filtrage par rehaussement de fibres. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, les images tridimensionnelles étant obtenues par intégration du signal de fluorescence et du signal de génération de seconde harmonique effectuée à différents intervalles de temps successifs, notamment de durée comprise entre 1 et 3 ns. 11. Procédé selon la revendication précédente, l'étape a) comportant l'acquisition d'entre trois et cinq images temporelles tridimensionnelles pour chacun des signaux 2PEF et SHG. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant en outre l'étape consistant à : 10 c) effectuer une mesure dans l'une au moins des régions issues de la segmentation. 13. Procédé selon la revendication précédente rattachée à la revendication 10 ou 11 de détection, de quantification et/ou de visualisation d'un constituant fluorescent, au sein d'un tissu biologique, l'étape c) comportant: 15 la détermination, en effectuant une régression linéaire du logarithme des signaux de fluorescence, de la distribution spatiale dans l'échantillon des pentes de ladite régression linéaire, et la génération d'au moins une information sur la présence et/ou la densité volumique ou surfacique dudit constituant au sein du tissu au moins à partir de 20 cette distribution spatiale. 14. Procédé selon la revendication 12, selon laquelle préalablement à l'étape c) l'utilisateur définit la mesure à effectuer en sélectionnant des descripteurs choisis parmi des listes de descripteurs prédéfinis. 15. Procédé selon la revendication précédente, les descripteurs indiquant 25 respectivement : - la ou les catégories de signaux considérées, - la présence ou non d'un prétraitement et le type de prétraitement utilisé ; - la région d'intérêt, sur laquelle porte la mesure; et - la nature de la mesure proprement dite. 30 16. Procédé selon l'une des deux revendications précédentes, un code représentatif de la mesure étant généré à partir de valeurs choisies par l'utilisateur. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, étant mis en oeuvre in vivo sur un tissu biologique. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le tissu étant de la peau humaine, de la peau reconstruite ou artificielle, ou des cellules en culture. 19. Procédé pour évaluer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement, notamment anti-âge, antioxydant, photo-protecteur, pro pigmentant ou dépigmentant, sur un tissu 5 biologique, comportant les étapes consistant à - effectuer une mesure suivant l'étape c) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 18 sur une partie du tissu n'ayant pas subi d'actiôn du stimulus et/ou du traitement et obtenir un premier résultat, effectuer une mesure suivant l'étape c) d'un procédé selon l'une quelconque 10 des revendications 12 à 18 sur une partie du tissu ayant subi une action du stimulus et/ou du traitement et obtenir un deuxième résultat, comparer les premier et deuxième résultats, et évaluer l'action du stimulus et/ou du traitement à partir au moins de cette comparaison, 15 les mesures étant effectuées sur des parties identiques ou non.