Brevet FR2986538A1 — publié le 20130809

UTILISATION DU miR-199a-5p DE SES CIBLES ET/OU INHIBITEURS POUR LE DIAGNOSTIC, LE PRONOSTIC ET LE TRAITEMENT DES PATHOLOGIES FIBROPROLIFERATIVES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine des pathologies fibroprolifératives, notamment la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), et à l'implication des microARN (miARN) dans le processus de fibrose tissulaire. La présente invention se rapporte plus particulièrement à l'utilisation de microARN (miARN), en particulier du miR-199a-5p, de leurs cibles et/ou inhibiteurs pour le diagnostic, le pronostic et le traitement des pathologies fibroproliféatives, notamment la fibrose pulmonaire idiopathique. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. ETAT DE LA TECHNIQUE La fibrose tissulaire, définie comme la formation excessive et persistante de tissus conjonctif cicatriciel non fonctionnel en réponse à une lésion chronique d'un tissu, est une cause majeure de morbidité et de mortalité associées à la perte de fonction de l'organe lésé dans différentes pathologies telles que celles affectant l'interstitium du poumon [Wynn, J. Clin. Invest., 117 : 524-529, 007] [1]. Les pathologies fibroprolifératives représentent un problème majeur de santé publique. En effet rien qu'aux Etats-Unis, 45% des décès sont attribués aux maladies fibroprolifératives et leur prévalence est en augmentation constante [Wynn, Nat. Rev. Immunol., 4 : 583-594, 2004] [2]. Parmi les pathologies pulmonaires interstitielles d'étiologie inconnue, la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est la forme la plus fréquente et la plus létale avec une survie moyenne de 3 à 5 ans après diagnostic [Wilson et Wynn, Mucosal. Immunol., 2 : 103-121, 2009] [3]. La FPI est une maladie pulmonaire chronique et souvent mortelle caractérisée par une prolifération des fibroblastes et un dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire. La FPI est une pathologie rare dont la prévalence est de 13 à 20 cas pour 100 000 habitants et dont les causes demeurent mal connues, et pour laquelle aucun traitement efficace n'existe à ce jour. Des observations basées sur des modèles animaux de fibrose pulmonaire et de sections de poumons de patients avec une FIP suggèrent un processus biopathologique dynamique impliquant une cicatrisation excessive avec une inflammation chronique, une apoptose des cellules épithéliales et endothéliales, une prolifération et activation des cellules mésenchymateuses avec la formation de foyers de fibroblastes/myofibroblastes, et finalement le dépôt excessif de matrice extracellulaire résultant en la destruction de l'architecture pulmonaire et la perte des fonctions pulmonaires. Au point de vue physiopathologique, on considère actuellement qu'une agression répétée de l'épithélium alvéolaire serait responsable de lésions au niveau de l'épithélium pulmonaire favorisant la formation d'un exsudat plasmatique alvéolaire ainsi que l'activation des processus de coagulation, de la sécrétion de facteur de croissance comme le TGFP par les pneumocytes permettant le recrutement, la prolifération et l'activation de fibroblastes pulmonaires ainsi que le dépôt anormal et excessif de matrice extracellulaire [Wilson et Wynn, 2009, précité] [3]. Lors du processus de fibrose, les fibroblastes ont un phénotype de myofibroblastes et s'organisent en foyers fibroblastiques. D'autres mécanismes pourraient également participer au processus de fibrose comme la transition épithélium mésenchyme des cellules épithéliales, endothéliales ou mésothéliales ainsi que le recrutement pulmonaire de fibrocytes circulant d'origine médullaire [Wilson et Wynn, 2009, précité] [3]. Les miroARN (miARN) représentent une classe de petits ARN non-codants d'environ 22 bases et ayant un rôle clé 5 dans la régulation de divers phénomènes cellulaires tels que le développement, la différenciation, la survie, la réponse au stress, l'apoptose, la prolifération, l'homéostasie ou la différenciation [Ambros, Nature, 431 : 350-355, 2004] [4]. De récentes études ont identifié des profils d'expression de miARN 10 spécifiques associés à l'initiation et la progression de diverses pathologies incluant le cancer ainsi que les pathologies inflammatoires et autoimmunes. En outre des études de gain et perte de fonction miARN ont révélé des fonctions pathogènes des miARN accentuant leur rôle majeur in vivo. 15 Leur mécanisme d'action implique la formation d'un complexe entre plusieurs bases du miARN et la partie 3'-noncodante de l'ARNm cible [Brennecke et al., PLoS. Biol., 3 : e85, 2005] [5]. Cette interaction conduit à une déstabilisation de l'ARNm cible et/ou une inhibition de la synthèse protéique 20 [Brennecke et al., 2005, précité] [5]. La reconnaissance entre un miARN et sa cible est principalement contrôlée par une séquence d'environ 7 bases, située dans partie 5' du miARN (séquence de reconnaissance ou seed) [Brennecke et al., 2005, précité] [5]. De ce fait, chaque miARN aurait la capacité de 25 réguler la stabilité d'un large spectre d'ARNm distincts. Plus de 1500 miARN ont été identifiés à ce jour chez l'homme (miRBase release 18, novembre 2011 : http://www.mirbase.org) où ils réguleraient plus de 30% des transcrits. La régulation par les miARN apparaît donc comme une 30 régulation majeure de l'expression génique dont l'impact a été jusqu'à présent largement sous-estimé [Xie et al., nature, 434 : 338-345, 2005 ; Berezikov et al., Cell, 120 : 21-24, 2005] [6, 7]. Les miARN sont transcrits dans le noyau sous forme de longs précurseurs (pri-miARN) puis subissent une première étape de maturation dans le noyau pour donner le pré-miARN possédant une structure en épingle à cheveu de plus petite taille. Ce précurseur de miARN est ensuite exporté du noyau 5 vers le cytoplasme où il va subir une dernière étape de maturation par l'enzyme Dicer qui génère deux miARN simple brin (un brin 5p et un brin 3p) : le brin dit mature est pris en charge par un complexe multi-protéique (le complexe RISC, RNA Induced Silencing Complex) qui interagit avec la partie 3'-non10 codante des ARNm cibles, tandis que le brin complémentaire dit « star » va subir une dégradation (annotation : miR-xx*). D'un point de vue clinique, de nombreuses études suggèrent une possible utilisation des miARN comme outil diagnostique. En effet, les miARN présentent une bonne 15 stabilité dans les fluides biologiques comme le sérum [Mitchell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105 : 10513-10518, 2008] [8] ou l'urine [Weber et al., Clin. Chem., 56 : 1733-1741, 2010] [9]. De ce fait, l'étude de leur expression dans ces milieux biologiques offre de nouvelles perspectives non 20 invasives pour le développement de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ou pronostiques. Par ailleurs, les profils d'expression tissulaire des miARN pourraient aussi constituer de nouveaux outils pronostiques ou diagnostiques comme cela a déjà été démontré en cancérologie [Lu et al., Nature, 435 : 25 834-838, 2005] [10]. A titre d'exemple, le miR-199a-5p, l'une des deux espèces de miARN matures issus du précurseur miR199a, a été associé au caractère malin des carcinomes hépatocellulaires [Jiang et al., Clin. Cancer Res., 14(2) : 419-427, 2008] [11] mais également des tumeurs bronchiques 30 [Mascaux et al., Eur. Respir. J., 33(2) : 352-359 (Epub 2008), 2009 ; Puisségur et al., Cell death Differ., 18(3) : 465-478, 2011] [12, 13]. D'un point de vue thérapeutique, la modulation de l'expression de miARN pourrait également permettre le développement de nouveaux traitements [Krutzfeldt et al., Nature, 438 : 685-689, 2005] [14]. A titre d'exemple, l'utilisation d'inhibiteur de miR-122 dans le développement de nouveaux traitements de l'hépatite C a permis d'obtenir une diminution significative de la charge virale de ce virus [Lanford et al., Science, 327 : 198-201, 2010] [15]. Bien qu'il y ait de plus en plus d'évidences de l'implication des miARN dans le processus de fibrose tissulaire, leur(s) rôle(s) précis et leur(s) mécanisme(s) 10 d'action demeurent encore largement inexplorés [Jiang et al., FEBS J., 277 : 2015-2021, 2010] [16]. Même si l'étiologie de la FIP est inconnue, un rôle central des miARN a récemment été suggéré dans sa pathogénie. Cependant, le rôle des miARN dans les pathologies fibrotiques, en particulier dans les fibroses 15 pulmonaires, est pauvrement documenté et seuls quelques miARN comme miR-21 ou let7-d ont été étudiés à ce jour [Liu et al., J. Exp. Med., 20 : 1589-1597, 2010 ; Pandit et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 182 : 220-229, 2010] [17, 18]. Donc les miARN dont l'expression est associée aux fibroses 20 pulmonaires pourraient constituer des outils particulièrement prometteurs pour le développement de nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques de la FPI ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette pathologie toujours incurable et de mauvais pronostic [Pandit et al., Transl. Res., 25 157 : 191-199, 2011] [19]. DESCRIPTION DE L'INVENTION Les Inventeurs ont mis en évidence pour la première fois et de manière tout à fait inattendue le rôle des miARN, en 30 particulier du miR-199a-5p, et de leurs cibles dans le processus de fibrose pulmonaire, hépatique et rénale. Les Inventeurs ont plus particulièrement utilisé un modèle expérimental de fibrose pulmonaire afin d'identifier au niveau pulmonaire i) des miARN différentiellement exprimés uniquement chez les souris C57BL/6 sensibles à la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine et ii) des miARN corrélés durant la progression du processus fibrotique. Pour ce faire les Inventeurs ont utilisé différentes approches expérimentales conjuguant les biopuces miARN, l'hybridation in situ, ainsi que la RT-PCR quantitative. Ils ont ainsi identifié un profil d'expression de 22 miARN spécifiques de la réponse pulmonaire des souris C57BL/6 sensibles à la fibrose pulmonaire induite par la 10 bléomycine. Parmi les 22 miARN du profil d'expression identifié, ils ont montré pour la première fois le rôle unique du miR-199a-5p dans le processus de fibrose pulmonaire. Ils ont ainsi identifié une régulation à la hausse significative du 15 miR-199a-5p dans les poumons de souris avec une fibrose induite par la bléomycine. En effet, le miR-199a-5p apparait comme le miRNA le plus discriminant entre des souches de souris C57BL/6 sensibles et de souris Balb/c résistantes à la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine ; ce qui permet donc de 20 distinguer entre cas pathologique et normal. Une régulation à la hausse significative du miR199a-5p a également été identifiée dans les poumons de patients atteints d'une FIP. Plus précisément, les niveaux de miR-199a5p ont augmenté de manière sélective dans les myofibroblastes 25 des poumons endommagés. Par conséquent, les effets profibrotiques du miR199a-5p ont été étudiés plus avant dans les fibroblastes pulmonaires. Ils ont ainsi montré une activation des fibroblastes pulmonaires vers un phénotype pro-fibrotique après 30 surexpression du miR-199a-5p. Enfin, les Inventeurs ont montré que la surexpression de miR-199a-5p mimait partiellement la signature transcriptionnelle et les effets cellulaires du TGFP, un des principaux facteurs impliqués dans les mécanismes fibrotiques, et qui lui-même est capable d'augmenter l'expression de miR-199a-5p. Ils ont également mis en évidence que le rôle du miR-199a-5p est extrapolable à d'autres pathologies fibrotiques chez les mammifères car ce miARN est commun aux différentes fibroses pulmonaire, hépatique et rénale ; et pourrait donc en devenir un marqueur universel. En effet, ils ont mis en évidence une expression aberrante de miR-199a-5p dans des modèles murins de fibrose rénale et hépatique, montrant que la dérégulation du miR-199a-5p représente un mécanisme général contribuant au processus de fibrose. Les Inventeurs ont en outre combiné des approches in silico (logiciels bioinformatiques prédictifs de cibles) et des approches expérimentales (puces transcriptome, expression ectopique de miARN ainsi que des vecteurs rapporteur contenant la partie 3'-UTR d'un gène d'intérêt fusionné à la luciférase) afin de déterminer et caractériser les gènes cibles régulés spécifiquement par le miR-199a-5p. Il a notamment été constaté une variation de l'expression du gène codant pour la cavéoline1 (CAV1), un médiateur critique de la fibrose pulmonaire, en fonction du niveau d'expression du miR-199a-5p. Ils ont ainsi identifié CAV1 comme une véritable cible du miR-199a-5p. La présente invention a donc pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie fibroproliférative d'un sujet caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) de mesure quantitative du niveau d'expression des miARN dans un échantillon biologique dudit sujet ; (ii) d'établissement du profil d'expression des miARN dudit échantillon biologique dudit sujet ; (iii) de comparaison du profil d'expression des 30 miARN de l'échantillon biologique dudit sujet avec le même profil d'expression des miARN d'un échantillon biologique de référence, ledit profil d'expression étant constitué de mir-146b, miR-34a, miR-21, miR-449a, miR-449b, miR-20a, miR-18a, miR-223, miR-449c, miR-147b, miR-152, miR-l8lac, miR-451, miR- 351, miR-133ac, miR-214, miR-199a-5p, miR-132, miR-222, miR342-3p, miR-345-5p et miR-221 ; (iv) d'identification d'au moins un miARN dont le niveau d'expression par ledit échantillon biologique dudit 5 sujet diffère par rapport au niveau d'expression du même miARN par ledit échantillon de référence. Selon un mode de réalisation particulier, les 22 miARN du profil d'expression spécifiques de la réponse pulmonaire à la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine 10 sont représentés par les numéros d'accession suivants : Nom du miARN Numéro d'accession miRBase mir-146b MIMAT0003475 mir-34a MIMAT0000542 mir-21 MIMAT0000530 mir-449a MIMAT0001542 mir-449b MIMAT0005447 mir-20a MIMAT0000529 mir-18a MIMAT0000528 mir-223 MIMAT0000665 mir-449c MIMAT0003460 mir-147b MIMAT0004857 mir-152 MIMAT0000154 mir-l8lac MIMAT0000210 mir-451 MIMAT0001632 mir-351 MIMAT0000609 mir-133ac MIMAT0000145 mir-214 MIMAT0000661 mir-199a-5p MIMAT0000229 mir-132 MIMAT0000144 mir-222 MIMAT0000670 mir-342-3p MIMAT0000590 mir-345-5p MIMAT0000595 mir-221 MIMAT0000669 On entend par « pathologie fibroproliférative » au sens de la présente invention, les pathologies se caractérisant par une lésion du parenchyme d' un organe et de la fibrose. A titre d' exemple , il s'agit des fibroses pulmonaires, hépatiques et rénales, en particulier de la fibrose pulmonaire idiopathique ( FPI ) . On entend par « sujet » au sens de la présente invention, un individu vertébré, en particulier un mammifère, plus particulièrement un homme. On entend par « échantillon biologique » au sens de la présente invention, une biopsie bronchique, hépatique ou rénale. A titre d' exemple , il s'agit d' un tissu épithélial, en particulier de l'épithélium respiratoire, hépatique ou rénal. On entend par « échantillon biologique de ré férence » au sens de la présente invention, un échantillon biologique comme dé fini ci-dessus issu d' un sujet sain, à savoir ne présentant pas de fibrose, ou d' un sujet dont l'expression du miR-199a-5p est connue et associée à un stade clinique particulier. A titre d' exemple, il s'agit du niveau d' expression du miR-199a-5p obtenu après analyse d' échantillons de biopsies humaines ( cf . tableau 1 ci-après ) ou de poumons de souris ( cf . tableau 2 ci-après ) par biopuces de type « miARN » (Agilent technology) chez des sujets sains ( contrôle ) ou atteints de fibrose pulmonaire idiopathique ( FPI ) . Tableau 1 Sonde miARN Contrôleb FPIb Ratioc Valeur pd (IDa) (nom) A_25_P00010700 Hsa-miR-199a-5p 8,38 8,69 1,24 0,006 A_25_P00010701 Hsa-miR-199a-5p 6,31 6,69 1,30 0,005 A_25_P00010069 Hsa-miR-199a-3p 8,97 9,47 1,41 0,015 A_25_P00010068 Hsa-miR-199a-3p 7,89 8,19 1,23 0,045 a10 sonde puce agilent SurePrint G3 hsa bexpression log2 médiane cFP1 vs contrôle dtest de Wilcoxon Tableau 2 Modèle murin Sonde (IDa) MiARN Contrôleb Fibroseb Ratio Valeur pd expérimental (nom) Fibrose MIMAT0000229 mmu-miR- 3,23 4,61 2,89 4,10E-03 pulmonaire 199a-5p Fibrose MIMAT0000229 mmu-miR- 2,61 4,52 3,71 4,12E-07 rénale 199a-5p Fibrose MIMAT0000229 mmu-miR- 2,60 4,10 2,82 4,00E-03 hépatique 199a-5p aID miRBase (http://www.mirbase.org) bexpression log2 médiane cbléomycine vs contrôle PBS dtest de VVilcoxon Le niveau d'expression d'un miARN dans une cellule 5 ou un tissu est déterminé par la mesure des miARN présent dans ladite cellule ou ledit tissu. La mesure du niveau d'expression d'un miARN peut être réalisée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, après extraction des ARN, le séquençage à haut débit des miARN, le 10 séquençage par NASBA (Nucleic Acid Strand Based Amplification), par extension d'amorces, les puces à ADN de type « miARN », les méthodes de RT-PCR quantitative appliquées aux miARN ou l'hybridation in situ. Le procédé de diagnostic in vitro selon l'invention 15 peut comprendre l'étape additionnelle (v) d'identification d'au moins un gène cible dont le niveau d'expression est régulé par le niveau d'expression du miR-199a-5p identifié à l'étape (iii). Le niveau d'expression d'un gène cible dans une 20 cellule ou un tissu est déterminé par la mesure du transcrit exprimé dans ladite cellule ou ledit tissu. La mesure du niveau d'expression du gène cible peut être réalisée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, elle peut être réalisée après extraction d'ARN par 25 RT-PCR quantitative, ou bien sur coupes de tissu par immunocytochimie ou immunocytologie. De préférence ledit au moins un miARN identifié à l'étape (iv) est le miR-199a-5p. De préférence ledit au moins un gène cible identifié à l'étape (v) code pour la cavéoline-1 (Gene ID: 857 / http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/857). La présente invention a également pour objet un procédé pour identifier un sujet susceptible de développer une pathologie fibroproliférative caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en les étapes suivantes : (i) de mesure quantitative du niveau d'expression du miR-199a-5p dans un échantillon biologique dudit sujet ; (ii) de comparaison du niveau d'expression du miR199a-5p dans ledit échantillon dudit sujet avec le niveau d'expression du miR-199a-5p dans un échantillon biologique de 15 référence ; (iii) de détection d'une augmentation du niveau d'expression du miR-199a-5p. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un inhibiteur du miR-199a-5p pour son 20 utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie fibroproliférative, de préférence de la fibrose pulmonaire idiopathique. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un inhibiteur du miR-199a-5p pour l'obtention 25 d'un médicament. A titre d'exemple, il s'agit de l'utilisation d'un inhibiteur du miR-199a-5p par voie aérosol pour bloquer la fibrogénèse au sein de l'épithélium respiratoire pathologique chez des sujets atteints de fibrose pulmonaire et restaurer ainsi l'intégrité du tissu pathologique afin qu'il retrouve 30 toute sa fonctionnalité. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit médicament est destiné à la prévention et/ou au traitement d'une pathologie fibroproliférative, de préférence de la fibrose pulmonaire idiopathique. Les exemples de mise en oeuvre de la présente invention qui suivent, ainsi que les figures annexées, permettent d'illustrer l'invention et sont donnés à titre non limitatif. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES - La figure 1 représente l'expression de miR-199a5p au cours d'une fibrose pulmonaire induite par la bléomycine (A) Clustering (ou arbre) hiérarchique représentant l'expression différentielle des miARN modulés de manière statistiquement significative (valeur p ajustée EXEMPLES EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES Lignées cellulaires, réactifs et anticorps Les fibroblastes pulmonaires humains normaux MRC-5 et hFL1 5CCL-153) et la lignée cellulaire de cancer du poumon humain A549 ont été acquis auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) et cultivés dans du milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal 10%, à 37°C avec du CO2 v/v 5%. Du TGFP recombinant a été acquis auprès de Sigma- Aldrich. Les anticorps monoclonaux et polyclonaux suivants 15 ont été utilisés pour les analyses en immunohistochimie et Western blot : anticorps polyclonal anti-CAV1 de lapin (sc-894, Santa Cruz Biotechnology Inc.), l'anticorps monoclonal anti-pactine de lapin (13E5, cell signalling), anticorps monoclonal anti-a-SMA de souris (1A4, Dako). 20 Modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, rénale et hépatique Modèle murin de fibrose pulmonaire Des souris mâles de souche C57BL/6 et BALB/c, âgées 25 de 9 à 12 semaines, ont été acquises auprès de Charles River, France. Pour induire les changements fibrotiques, les souris ont été instillées par voie intratrachéale avec de la bléomycine ou du PBS pour les témoins. Pour ce faire, les souris ont été anesthésiées par inhalation de sévorane (Abbott) 30 et placées en décubitus dorsal. L'insertion transtrachéale d'une aiguille d'alimentation 24-G a été utilisée pour l'instillation de bléomycine (0,75 unités/ml) ou de véhicule (PBS), dans un volume de 80 les souris ont été sacrifiées 7 et 14 jours après l'instillation et les poumons ont été retirées pour analyse ultérieure. Modèle murin de fibrose rénale Des souris mâles de souche C57BL/6 et BALB/c, âgées de 9 à 12 semaines, ont été acquises auprès de Charles River, 5 France. Les souris ont subi une anesthésie par injection intrapéritonéale de pentobarbital (50 mg/kg de poids du corps). Après une laparotomie standard, l'urètre proximale gauche a été exposée et ligaturée en deux points avec de la soie 4-0. L'opération « de simulation ou témoin » a consisté en une 10 identification similaire de l'urètre gauche, mais la ligature de l'urètre n'a pas été réalisée. Modèle murin de fibrose hépatique Des souris mâles de souche C57BL/6 et BALB/c, âgées de 6 à 8 semaines, ont été acquises auprès du laboratoire 15 Jackson (Bar Harbor). Pour induire la fibrose hépatique, les souris ont reçu 0,6 ml/kg de poids corporel de CC14 (Merck) mélangé à de l'huile de maïs (Sigma life science) par voie intrapéritonéale comme précédemment décrit [Roderbrug et al., Hepatol., 53 : 209-218, 2011] [24]. La ligature du canal 20 cholédoque a été réalisée en exposant le canal hépatique commun et en effectuant une double-ligature de celui-ci, puis en coupant à travers entre les ligatures comme décrit par Roderburg et al. [2011, précité] [24]. Pour faire régresser la fibrose, les souris ont été traitées pendant 6 semaines avec du 25 CC14 comme précédemment décrit et sacrifiées 2 ou 4 semaines, respectivement, après la fin du traitement. Isolement des cellules étoilées primaires Des cellules étoilées primaires ont été isolées de 30 souris C57BL/6 à l'âge de 40-55 semaines et stimulées avec 20 ng/ml de TGF-bl (Sigma Aldrich) pendant 48 heures comme précédemment décrit par Roderburg et al. [2011, précité ] [24]. Tissu pulmonaire humain Des tissus pulmonaires congelés de sujets avec une FIP ainsi que sans pathologie pulmonaire chronique ont été obtenus par le « Lung Tissue Research Consortium (LTRC) ». Ces diagnostics ont été réalisés en utilisant les directives 5 ATS/ERS [Demedts et Costabel, Eur. Respir. J., 19 : 794-796, 2002 ; Steele et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 172 : 1146-1152, 2005] [32, 33] à partir de l'histoire clinique, la pathologie et la radiologie. Toutes les expérimentations ont été approuvées par la Commission d'examen institutionnel local 10 de l'Université de Pittsburgh. Les données cliniques ont entièrement été mises à la disposition des enquêteurs pour l'examen. Des coupes pulmonaires paraffinées de patients avec une FIP ont été obtenues de l'hôpital de Lille. Les 15 expérimentations ont été approuvées par la Commission d'examen institutionnel de l'hôpital de Lille. Histopathologie Des reins et poumons de souris ont été fixés toute 20 une nuit avec du formol tamponné neutre et ensuite inclus dans la paraffine. Des coupes tissulaires d'une épaisseur de 5 gm ont été montées et colorées à l'hématoxyline et à l'éosine ainsi qu'au trichrome de Masson afin d'évaluer le degré de fibrose. Les coupes histologiques ont été examinées par un 25 pathologiste expérimenté. Extraction d'ARN totaux et contrôles qualité Les ARN totaux ont été extraits à partir d'échantillons cellulaire et tissulaire pulmonaire à l'aide de 30 Trizol Reagent (Invitrogen) d'après les recommandations du fabricant. La pureté et la concentration des échantillons d'ARN totaux ont d'abord été évaluées en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop. Les ratios 260/280 et 260/230 ont été vérifiés et doivent avoir une valeur proche de 2. Les ARN ont ensuite été chargés sur une puce nano chi et leur qualité (intégrité et niveau de dégradation des ARN) a été analysée à l'aide du Bioanalyzer System (Agilent Technologies, France). Biopuces Biopuces à miARN de poumons de souris Les séquences d'oligonucléotides correspondant à 2054 miARN matures trouvées dans le registre miARN sont disponibles sur http://www.microarray.fr:8080/merge/index (suivre le lien vers « microARN » : plateforme référencée sur la base de données GEO du NCBI sous GPL4718). Trois reproductions biologiques ont été réalisées pour chaque comparaison. Les données expérimentales et la conception des biopuces ont été déposées sur la base de données GEO du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sous la série GSE34812. La conception expérimentale a utilisée une approche « dye-swap », de sorte que chaque sonde murine, imprimée 8 fois sur la biopuce a été mesurée 16 fois de manière indépendante pour chaque échantillon. La préparation de la cible et l'hybridation de la biopuce ont été réalisées comme précédemment décrit [Pottier et al., PLoS. One, 4 : e6718, 2009 ; Triboulet et al., Science, 315 : 1579-1582, 2007 ; Puisségur et al., 2011, précité] [25, 26, 13]. Analyse de biopuces à miARN de poumons humains Une analyse par biopuce à miARN a été réalisée comme précédemment décrit [Pandit et al., 2010, précité] [18]. En bref, 100 ng d'ARN totaux ont été marqués et hybridés sur Agilent microRNA Microarray Release 16.0, 8x60K. Après lavage, les puces ont été scannées en utilisant un Scanner Agilent Microarray. Les images scannées ont été traitées par la version 9.5.3 du logiciel Agilent's Feature Extraction. L'analyse des données des biopuces à miARN a été réalisée e utilisant le GeneSpring v11.5 et BRB-ArrayTools v.1 développés par le Dr. Richard Simon et l'équipe de développement de BRB-ArrayTools. Les données ont été normalisées par quantile. Les données des biopuces à miARN sont disponibles au public via le site web du Consortium de Recherche génomique pulmonaire (LGCR) (lunggenomics.org). Biopuces d'expression Les échantillons d'ARN ont été marqués avec le colorant Cy3 en utilisant le kit low RNA input QuickAmp (Agilent) selon les recommandations du fabricant. 825 ng de sonde ARNc marquée ont été hybridés sur des biopuces Agilent 8x60K high density SurePrint G3 gene expression murine ou humaine. Deux (expérimentations humaines in vitro) ou cinq (échantillons dérivés du in vivo) reproductions biologiques ont été réalisées pour chaque comparaison. Les données expérimentales ont été déposées dans la base de données GEO du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sous la SuperSerie GSE34818 (séries GSE34812 et GSE34814 pour les réponses miRNA et mRNAs dans le modèle murin de bléomycine, respectivement ; série GSE34815 pour les expérimentations de transfection miARN/miARN dans les fibroblastes humains hFL1). Pour les puces d'expression génique humaine, les données ont été transformées en log2 et normalisées en utilisant un algorithme de Loess cyclique dans l'environnement de programmation R comme précédemment décrit [Wu et al., BMC. Bioinformatics, 6 : 309, 2005] [34]. Les données de biopuces humaines ont été mises à la disposition du public sur les sites web du LTRC (ltrcpublic.org) et du LGRC dans le cadre du protocole du LTRC. Analyse statistique et analyse thématique biologique La normalisation a été réalisée en utilisant le progiciel Limma disponible à partir de Bioconductor (http://www.bioconductor.org). La normalisation intra-puce (expériences dye-sawp deux couleurs seulement) et inter-puce a été réalisée en utilisant la méthode « PrintTip Loess » et la méthode des quantiles, respectivement. Les moyennes des ratios de toutes les comparaisons ont été calculées et une analyse du test B a été réalisée. Les gènes exprimés de manière différentielle ont été sélectionnés en utilisant la correction de Benjamini-Hochberg de la valeur p pour des tests multiples, basée sur une valeur p inférieur à 0,05. Les données des biopuces d'expression ont été analysées pour un enrichissement en thèmes biologiques (voies canonique et de la fonction moléculaire de l'ontologie génétique) et construire des réseaux biologiques construits en utilisant le logiciel Ingenuity Pathway Analysis (http://www.ingenuity.com/) et Mediante (http://www.microarray.fr:8080/merge/index) [Le et Barbry, Bioinformatics, 23 : 1304-1306, 2007] [27], un système d'information contenant des informations diverses à propos des sondes et jeux de données. Le logiciel Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) a été utilisé afin de déterminer si un jeu de gènes a priori défini peut caractériser des différences entre deux état biologiques [Subramanian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102 : 15545-15550, 2005] [28]. Des regroupements hiérarchiques ont été réalisés avec la version 4.3 du programme MultiExperiment Viewer (MeV), en utilisant la distance de Manhattan et le lien moyen. Analyse des cibles de miARN MiRonTop [Le et al., Bioinformatics, 26 : 31313132, 2010] [29] est un outil réseau pour java en ligne (disponible à http://www.microarray.fr:8080/miRonTop/index) qui 25 intègre les données de biopuces ADN afin d'identifier l'implication potentielle des miARN sur un système biologique spécifique. Brièvement, MiRonTop classe les transcrits en deux catégories (« régulés à la hausse » et « régulés à la baisse »), en fonction des seuils pour le niveau d'expression 30 et pour l'expression différentielle. Il calcule alors le nombre de cibles prédites pour chaque miARN, en fonction du logiciel de prédiction sélectionné (Targetscan, MiRBase, PicTar, recherche de progéniture exacte : 2-7 ou 1-8 premiers nucléotides du miARN, TarBase v1), dans chaque jeu de gènes. L'enrichissement en cibles de miARN dans chaque catégorie est alors testé en utilisant la fonction hypergéométrique. L'absence d'effet hors-cible des siARN a été vérifié dans des expérimentations de transcriptome si-CAV1 en utilisant l'outil Sylamer [Van et al., Nat. Methods, 5 : 1023-1025, 2008] [30]. Transfection et dosages luciférase Transfection de pre-miARN et siARN dans des fibroblastes pulmonaires Pre-miR-199-5p, pre-miR-21 et miARN de contrôle (miR-Neg#1) ont été acquis chez Ambion. Pour les expérimentations de knock-down de miR-199-5p, de l'anti-miR199-5p LNA et du contrôle négatif anti-miR-159s LNA (sonde knock-down miRCURY LNA) ont été commandés chez Exicion. Un siARN dirigé contre CAV1 et un siARN contrôle (Silencer Select validated siRNAs) ont été acquis chez Applied Biosystems. Des cellules MRC5/hFL1 ont été cultivées en milieu DMEM à 10% de SVF et transfectées à 30-40% de confluence dans des plaques à 6- ou 12-puits en utilisant la Lipofectamin RNAi MAXTM (Invitrogen) avec pre-miARN, siARN ou les inbibiteurs LNA à une concentration finale de 10 nM. Cotransfection de pre-miARN et de construction plasmidique psiCHECKTm-2 Des constructions moléculaires ont été réalisées dans le vecteur pSI-CHECKTM-2 (Promega) en clonant derrière la Renilla luciférase renilla dans les sites de restrictions XhoI et NotI, des oligonucléotides hybrides dérivés du 3'UTR CAV1 décrit ci-après. Des cellules HEK293 ont été cultivées dans un milieu DMEM à 10% de SVF jusqu'à confluence. Puis, les cellules ont été réparties dans des plaques à 96-puits et cotransfectées en utilisant la lipofectamin 2000TM (Invitrogen) avec 0,2 µg de construction plasmidique psiCHECKTM-2 et du pre-miR-199-5p ou du miARN contrôle à une concentration finale de 10, 30 et 50 nM. 48 heures après la transfection, les activités des luciférases renilla et firefly ont été évaluées avec le kit Dual Glo Luciferase Assay System (Promega) et mesurées à l'aide d'un luminomètre (Luminoskan Ascent, Thermolab system). hsa-CAV1: WT (sens) : TCGAGGACACTTTAATTACCAACCTGTTACCTACTTTGACTTTTTGCATTTAAAACAGACACT GGCATGGATATAGTTTTACTTTTAAACTGTGTACGC (SEQ ID NO : 1) hsa-CAV1: WT (inverse) : GGCCGCGTACACAGTTTAAAAGTAAAACTATATCCATGCCAGTGTCTGTTTTAAATGCAAAAA GTCAAAGTAGGTAACAGGTTGGTAATTAAAGTGTCC (SEQ ID NO : 2) hsa-CAV1: MUT (sens) : TCGAGGACACTTTAATTACCAACCTGTTACCTACTTTGACTTTTTGCATTTAAAACAGAGAGT CGCATGGATATAGTTTTACTTTTAAACTGTGTACGC (SEQ ID NO : 3) hsa-CAV1: MUT (inverse) : GGCCGCGTACACAGTTTAAAAGTAAAACTATATCCATGCGACTCTCTGTTTTAAATGCAAAAA 15 GTCAAAGTAGGTAACAGGTTGGTAATTAAAGTGTCC (SEQ ID NO : 4) RT-PCR quantitative Expression de miARN mature L'expression de miR-199a-5p a été évaluée en 20 utilisant le kit TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems) comme spécifié dans le protocole. La PCR en temps réel a été réalisée en utilisant le produit GeneAmp Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) et la machine PCR en temps réel ABI 7900HT. Les niveaux d'expression des miARN matures ont été 25 évalués en utilisant la méthode CT comparative (2-deltaCT). Expression de pri-miARN Les expressions de pri-miR-199a-5p et de pri-miR199a-2 ont été évaluées en utilisant le systèmes TaqMan primicroRNA Assay (Applied Biosystems) en suivant les 30 recommandations du fabricant. La PCR en temps réel a été réalisée en utilisant le produit TaqManTm Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) et la machine PCR en temps réel ABI 7099HT. Les niveaux d'expression des pri-miARN ont été évalués en utilisant la méthode CT comparative (2- deltaCT ) Expression génétique Les niveaux d'expression de la CAV1 humaine et murine ont été analysés en utilisant le système TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems) selon les recommandations du fabricant. La PCR en temps réel a été réalisée en utilisant le produit TaqManTm Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) et la machine PCR en temps réel ABI 7099HT. Les niveaux d'expression des CAV1 ont été évalués en utilisant la méthode CT comparative (2- deltaCT ) Extraction protéique et immunoblot Les cellules ou tissus ont été lysés dans un tampon de lyse (réactif d'extraction protéique M-PER pour cellules, réactif d'extraction protéique T-PER pour tissus) et un 15 cocktail d'inhibiteurs de protéase (Pierce). Les lysats ont été quantifiés pour les concentrations protéiques en utilisant le dosage de Bradford (Biorad). Les protéines (10 lag par échantillon) ont été soumis à une électrophorèse dans un gel SDS-polyacrylamide et transférées en milieu liquide sur une 20 membrane de nitrocellulose (HybondTM C Extra, Amersham Bioscience) pendant 1h30 dans un tampon de transfert (50 mM Tris base, 40 mM Glycine, 1,3 mM SDS et 10% éthanol). Après transfert, la membrane a été bloquée dans une solution de lait 5% TBS-Tween 0,1% pendant 1 heure à température ambiante sous 25 agitation. Elle a ensuite été incubée avec les anticorps primaires anti-CAV1 (Santa Cruz) dilué au 1/400, anti-beta actine (Cell Signaling Technology) au 1/1000 pendant une nuit à 4°C sur une plaque rotative. Après 3 lavages dans du TBS-Tween 0,1% pendant 30 minutes à température ambiante, la membrane a 30 été incubée pendant 1 heure en présence de l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à l'HRP (Horse Radish Peroxidase, Cell Signaling) dilué au 1/5000 dans du lait 5% TBS-Tween 0,1% sous agitation. Après plusieurs lavages, dans du TBS-Tween 0,1% pendant 30 minutes, les protéines d'intérêt ont été révélées par chimioluminescence (substrats ECL, Amersham). Immuno-histochimie Des coupes de poumon de souris inclues dans la paraffine d'une épaisseur de 5 Im ont été déparaffinées dans du xylène (2 fois 5 minutes) et réhydratées par incubation 2 fois 5 minutes dans de l'alcool éthylique à 100%, 2 fois 5 minutes dans de l'alcool éthylique à 95%, et 2 fois 5 minutes dans de l'alcool éthylique à 80%. Après lavage avec de l'eau, l'antigène a été démasqué par dénaturation thermique à l'aide d'un tampon citrate (pH=6.0, DAKO) pendant 20 minutes. Les coupes ont été refroidies à température ambiante et ont ensuite été lavées dans du TBS-Tween 0,1%, puis les peroxydases endogènes ont été inactivées par du peroxyde d'hydrogène à 3% dans du TBS pendant 10 minutes. Les coupes ont également été bloquées pour l'activité avidine/biotine, bloquées avec le réactif bloquant sans sérum, et incubées avec l'anticorps primaire anti-CAV1 ou anti alpha-SMA pendant 1 heure à température ambiante et une nuit à 4°C, respectivement. Les protéines d'intérêt ont ensuite été révélées par de la diaminobenzidine (DAB, DAKO) après incubation avec l'anticorps secondaire. Hybridation in situ La localisation tissulaire du miR-199a-5p a été effectuée à l'aide du système double DIG-labeled LNA probes (Exicion, Woburn, MA). Des tissus murins inclus dans la paraffine ont été déparaffinées dans du xylène (2 fois 5 minutes) et réhydratées par incubation 2 fois 5 minutes dans de l'alcool éthylique à 100%, 2 fois 5 minutes dans de l'alcool éthylique à 95%, et 2 fois 5 minutes dans de l'alcool éthylique à 80%. Les lames ont alors été lavées dans du PBS (pH 7,5) et perméabilisées par incubation pendant 15 minutes à 37°C dans la protéinase K (Ambion). Les lames ont encore été lavées dans du PBS, et pré-hybridées dans un tampon d'hybridation (50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween 20, 9,2 mM d'acide citrique, 50 µg/ml d'héparine, et 500 µg/ml d'ARN de levure, pH 6) dans une chambre humide. Les sondes doubles DIG-labeled LNA ont alors été ajoutées aux coupes à une concentration de 80 nM et incubées 2 heures à 50°C dans une chambre humide. Les lames ont été rincées dans des solutions 5xSSC, lx SSC et 0,2x SSC à la même température d'hybridation. Cela a été suivi par le blocage avec du sérum de mouton 2%, 2 mg/ml de BSA dans du PBS + 0,1% Tween 20 (PBST) et une incubation avec des fragments Fab antiDIG-AP (1:800) (Roche Applied Sciences) pendant 2 heures à température ambiante. Après lavage dans du PBST, la réaction colorée a été réalisée par incubation dans une solution de 5- bromo-4-chloro-3-indoly1 phosphate (BCIP)/bleu de nitro tétrazolium (NBT) (Roche Applied Sciences) avec 1 mM levamisole durant une nuit à température ambiante. La réaction colorée a été stoppée après l'observation du développement suffisant d'un précipité bleu par lavage avec du PBST. Les lames ont alors été contre-colorées avec du Fastred, montées et surmontées d'une lamelle. Etude de la prolifération cellulaire Les fibroblastes pulmonaires humains (MRC-5 ou hFL1) ont été répartis en plaque (150000 cellules par puits) 6- puits dans du milieu DMEM supplémenté avec du SVF 10%. Le lendemain, le milieu de culture a été remplacé par du milieu sans sérum et les cellules ont été transfectées avec le prémiR-199a-5p. La prolifération cellulaire a ensuite été évaluée 48 heures après transection par cytométrie de flux à l'aide du kit click-iTTM EdU Cell Proliferation Assay (Invitrogen) en suivant les recommandations de fabricant. Etude de la migration cellulaire : « scratch test » ou Test in vitro de la cicatrisation des plaies Les fibroblastes pulmonaires humains (MRC-5 ou hFL1) ont été mis en plaque (500000 cellules par puits) 12-puits. A confluence, le milieu de culture a été remplacé par du milieu sans sérum et les cellules ont été transfectées avec le pré- miR-199a-5p ou bien un inhibiteur anti-miR-199-5p (LNA antimiR-199-5p, Exicion). 24h après transfection, les cellules ont été blessées avec une pointe de pipette puis traitées ou non avec du TGFP (20 ng/ml). Le mécanisme de cicatrisation "in vitro" a ensuite été filmé pendant 24 heures après la blessure par vidéomicroscopie à l'aide d'un microscope inversé Axiovert 200 M (Carl Zeiss) équipé avec un insert de régulation à 5% CO2 et 37°C (Pecon GmbH). Ds images à fond clair ont été prises toutes les 30 minutes à travers un objectif à contraste de phase 10x avec une caméra CoolSNAPHQ CCD gérée par le logiciel Metamorph (Roper Scientific). La motilité cellulaire a été calculée en évaluant le pourcentage de la zone réparée à l'aide du logiciel d'analyse d'image ImageJ. Analyse statistiques Les résultats ont été donnés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le test de Student comme fourni par Microsoft ExcelTM EXEMPLE 2 : RESULTATS Des souris résistantes et sensibles à la fibrose pulmonaire présentent un profil d'expression miARN distinct en réponse à la bléomycine La bléomycine est l'outil expérimental de choix pour induire une fibrose pulmonaire sur différents modèles animaux, dont la souris. Ainsi les souris de type C57BL/6 sont considérées comme sensibles à la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine alors que les souris de type BALB/c sont résistantes. Pour identifier les miARN pouvant être impliqués dans le processus de fibrose pulmonaire, le profil d'expression des miARN au niveau pulmonaire en réponse à la bléomycine chez des souris sensibles et résistantes à la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine (n=3 souris par groupe) a été étudié en utilisant une plateforme basée sur des biopuces (jeu de données 1, numéro d'accession GSE34812) décrite ailleurs [25, 26, 13]. En particulier, l'étude du profil d'expression a focalisé sur la phase fibrotique du processus de fibrose, à savoir 7 jours et 14 jours après administration de bléomycine. Le profil d'expression ainsi identifié est composé de 22 miARN différentiellement exprimés de manière significative entre les poumons des animaux contrôle et traités par la bléomycine dans au moins un type, la majorité d'entre eux étant régulés à la hausse dans les poumons instillés par la bléomycine (figure LA). De manière intéressante, le miR-199a-5p a présenté une expression augmentée en réponse à la blémomycine au cours de la progression de la fibrose pulmonaire uniquement chez les souris de type C57BL/6 (figure 1B). L'augmentation du niveau d'expression du miR-199a-5p 14 jours après l'administration de la bléomycine a été confirmée de manière indépendante par PCR en temps réel sur un plus grand nombre d'animaux (n=5 souris par groupe) (figure 2A). Par conséquent, ces résultats ont montré que le miR-199a-5p joue a priori un rôle important au cours du procédé de fibrose pulmonaire. Afin d'étudier les mécanismes de régulation sous-jacents la production de miR-199a-5p, le statut d'expression de deux gènes murins a été évalué, miR-199a-1 (sur le chromosome 9) et miR-199a-2 (sur le chromosome 1), en réponse à la bléomycine en utilisant le dosage Taqman conçu pour discriminer entre pri-miR-199a-1 et pri-miR-199a-2. Les résultats ont montré que, 14 jours après l'instillation de bléomycine, les deux transcrits pri-miR-199a ont été régulés à la hausse dans les poumons des souris C57BL/6J (figure 2B) et donc, contribuent à la production de miR-199a-5p. En outre, des expérimentations d'hybridation in situ réalisées sur des coupes histologiques de poumons obtenus chez les souris de type C57BL/6, 14 jours après l'administration de bléomycine (poumons fibrosés) ou de PBS (poumons sains), ont mis en évidence une expression sélective de miR-199a-5p dans les myofibroblastes au niveau des poumons pathologiques dans les zones pulmonaires lésées correspondant aux foyers fibroblastiques (figure 1C). Fait à noter, cohérent avec de précédentes études, une régulation à la hausse de miR2l a également été mise en évidence en réponse à la bléomycine (figures lA et 3). Néanmoins, l'expression de miR2l a été significativement augmentée dans les deux types de souris suite à l'administration de bléomycine. Etant donné que miR2l a été précédemment clairement associé avec le développement des pathologies fibrotiques y compris la fibrose pulmonaire, ces résultats suggèrent que BALB/c pourrait avoir des mécanismes compensatoires qui pourraient contrecarrer les effets délétères de miR2l. Identification des cibles spécifiques de miR-199a-5p dans les fibroblastes pulmonaires Un des enjeux majeurs dans la biologie des miARN est de pouvoir identifier et caractériser expérimentalement les ARNm cibles qu'ils régulent. Dans cette perspective, des approches in silico (logiciels bioinformatiques prédictifs de cibles) et des approches expérimentales (puces transcriptomes, expression ectopique de miARN ainsi que de vecteurs rapporteur contenant la partie 3'-UTR d'un gène d'intérêt fusionné à la luciférase ont été combinées, comme précédemment décrit [25, 13]. Plusieurs algorithmes de prédiction de cibles ont été proposés. Ils sont basés généralement sur i) la complémentarité entre le miARN et le 3'-UTR de l'ARNm cible au niveau de la région 5' du miARN (appelée « seed »), et ii) la conservation phylogénétique de cette séquence dans le 3'-UTR de l'ARNm cible. Afin de déterminer les gènes cibles régulés par miR-199a-5p, un profilage des ARNm par puce d'expression Agilent® (Agilent Technology) a été réalisé après manipulation du niveau d'expression de miR-199a-5p par transfection dans les fibroblastes pulmonaires. L'influence de miR-199a-5p sur le transcriptome des fibroblastes hFL1 pulmonaires humains a été comparé avec celui de miR21 (jeu de données 2, numéro d'accession GEO GSE34815). L'expression ectopique de chaque miARN a induit de grandes modifications du transcriptome 48 heures après la transfection avec les gènes modulés 1261 et 753 dans des contextes miR-199a-5p et miR21, respectivement. Alors que ces deux miARN ont induit des profils très différents de modulations (figure 4A), une annotation fonctionnelle de ces deux profils de signature avec le logiciel Ingenuity PathwayTM a indiqué un chevauchement pour les « voies canoniques » y compris « Régulation du cycle cellulaire » et « Signalisation du TGFp » (figure 5). De manière cohérente avec de précédentes études, des voies très significatives associées avec miR21 ont été liées à « Régulation du cycle cellulaire et des cyclines » ainsi qu'à « Contrôle du cycle cellulaire de la réplication chromosomique », « Réparation des mésappariements dans les eucaryotes » et « Signalisation ATM ». Alors que la voie de plus haut score pour miR-199a-5p a correspondu aux voies métaboliques « Biosynthèse des stéroïdes », un enrichissement a également été noté pour les voies associées à « Signalisation de l'intégrine » et « Signalisation de l'endocytose médiée par les cavéolines ». Des cibles putatives directes ont ensuite été recherchées dans la population des transcrits régulés à la baisse en utilisant l'outil informatique MiRonTop. Cela a indiqué une surreprésentation spécifique de cibles prédites dans la population de transcrits régulés à la baisse après expression hétérologue de miR-199a-5p ou miR2l, en utilisant plusieurs outils de prédiction y compris une recherche directe de progéniture complémentaire ou un TargetScan (figure 4B). L'analyse a ensuite été focalisée sur un sous- ensemble de transcrits contenant des hexamères complémentaires de miR-199a-5p dans leur 3'UTR qui présentent la plus grande inhibition d'expression. Trois différents outils de prédiction, TargetScan, PicTar et miRanda, ont fourni des résultats contrastés, comme visualisé dans les diagrammes de Venn représentés dans la figure 4C. Alors qu'un total de 92 transcrit a été prédit par au moins l'un de ces algorithmes, seulement 21 transcrits ont été prédits par les trois algorithmes différents (TargetScan, Pictar, MiRanda) en utilisant l'outil informatique MiRonTop (http://www.microarray.fr:8080/miRonTop/index) (cf. tableau 3 ci-après). Tableau 3 Nom N° accession Description AveExpra LogFCb ARHGAP12 NM_018287 Rho GTPase activating protein 12 11,12 -1,96 C17orf63 NM _018182 - 11,90 -1,58 CAV1 NM_001753 Caveolin 1, caveolae protein, 22kDa (CAV1) 15,28 -1,78 DDR1 NM_013993 Discoidin domain receptor tyrosine kinase 1 9,57 -2,31 EPB41L1 NM_012156 Erythrocyte membrane protein band 4.1-like 1 12,88 -1,94 EXTL3 NM_001440 Exostoses (multiple)-like 3 13,66 -1,20 FZD6 NM_003506 Frizzled homolog 6 11,62 -2,07 IP08 NM_006390 Importin 8 12,00 -2,09 KLHL3 NM_017415 Kelch-like 3 8,44 -1,32 KPNA4 NM_002268 Karyopherin alpha 4 13,44 -1,11 MAP3K11 NM_002419 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11 13,11 -2,77 MPP5 NM_022474 Membrane protein, palmitoylated 5 11,76 -1,99 NLK NM_016231 Nemo-like kinase 11,36 -1,63 PODXL NM_001018111 Podocalyxin-like (PODXL) 11,21 -2,59 Nom N° accession Description AveExpra LogFCb Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) PPP1R2 NM_006241 subunit 2 11,29 -2,50 PXN NM_002859 Paxillin 14,99 -1,41 RNF11 NM_014372 Ring finger protein 11 14,30 -1,09 ST6 beta-galactosamide alpha-2,6- ST6GAL1 NM 173216 _ sialyltranferase 1 10,67 -1,70 TAF9B RNA polymerase II, TATA box TAF9B NM_015975 binding protein (TBP)-associated factor, 31kDa 9,77 -2,25 VPS26A NM _004896 Vacuolar protein sorting 26 homolog A 12,37 -1,60 ZNF706 NM _001042510 Zinc finger protein 706 8,15 -1,10 'log en base de l'intensité moyenne blog en base 2 du ratio miR-199a-5p/miR-Neg (logFC) Seuils pour sélection égaux à 7,0 pour le log2 (signal), à -1,5 pour le log2 (ratio), et à 0,01 pour la valeur p ajustée. Une analyse de réseaux génétiques a alors été focalisée sur ces 21 cibles, et une liste plus restreinte de gènes candidats associés aux voies canoniques les plus significatives décrites ci-dessus a été identifiée. Finalement les niveaux d'expression de ces gènes candidat ont été comparés avec leur orthologues murins dans un modèle de bléomycine en utilisant des biopuces génome entier (souris C57BL/6J 14 jours après instillation de bléomycine ou de PBS, jeu de données 3, numéro d'accession GEO GSE34814, figure 21). Il a été constaté que 4 des 21 meilleures cibles putatives du miR-199a-5p ont également été régulées à la baisse dans les tissus fibrotiques pulmonaires : ARHGAP12, CAV1, MAP3K11 et MPP5 (tableau 3). Parmi celles-ci, la cavéoline-1 (CAV1) représente a priori une cible clé du miR-199a-5p, sur la base de précédentes études qui ont démontré un lien significatif entre la régulation à la baisse de CAV1 dans les fibroblastes pulmonaires et les effets délétères médiés par le TGFP [Wang et al., J. Exp. Med., 203 : 2895-2906, 2006 ; Xia et al., Am. J. Pathol., 176: 2626-2637, 2010] [23, 31]. Validation de la cavéoline-1 (CAV1) comme cible du miR-199a-5p La cavéoline-1 (CAV1) est une protéine membranaire de 22 kDa essentielle à la formation de petites invaginations de la membrane plasmique appelées caveolae. Les cavéoles sont présentes dans la plupart des types cellulaires, en quantité variable selon les tissus. Elles sont retrouvées de façon particulièrement abondantes dans les cellules différenciées comme les adipocytes, les cellules endothéliales, les pneumocytes de type I, les fibroblastes et les cellules musculaires lisses et striées. Les cavéoles représentent une sous catégorie de radeaux lipidiques, morphologiquement identifiables de part leur forme invaginée ou circulaire, et caractérisées par la présence de protéines structurantes nommées cavéoline-1, cavéoline-2 et cavéoline-3. Les cavéolines-1 et -2 ont une distribution relativement ubiquitaire et sont co-exprimés dans la plupart des cellules différenciées à l'exception des fibres musculaires squelettiques et des myocytes cardiaques [Scherer et al., J. Cell Biol., 127 : 1233-1243, 1994] [20]. L'expression de la cavéoline-3 se limite aux muscles squelettiques, le diaphragme et le coeur [Tang et al., J. Biol. Chem., 271 ; 2255-2261, 1996] [21]. De manière intéressante, des études ont récemment montré que les souris transgéniques dont le gène de la cavéoline-1 a été délété présentent diverses anomalies, notamment au niveau 25 pulmonaire [Park et al., Biochemistry, 42 : 15124-15131, 2003] [22]. Ces souris développent notamment une fibrose pulmonaire ainsi qu'une prolifération des cellules endothéliales. Des études in vitro ont également permis de montrer que la diminution de l'expression de cavéoline-1 au niveau des 30 cellules fibroblastiques pulmonaires favorise les effets profibrotiques exercés par le TGFP sur ce type cellulaire, notamment l'activation, la prolifération et la différentiation du fibroblaste en myofibroblaste [Wang et al., 2006, précité] [23]. A l'aide de l'algorithme MicroCible, un site potentiel de fixation pour miR-199a-5p a été identifié dans la séquence 3'UTR de CAV1 (figure 6A). Afin d'évaluer si miR-199a5p altère l'expression de CAV1, le 3'UTR de la CAV1 humaine a été cloné dans le vecteur psiCHEKTM-2 en aval de la séquence codant pour la luciférase, puis cotransfecté dans les cellules A549 en présence de miR-199a-5p ou d'un miARN contrôle négatif (figure 6B). Après la normalisation du signal luciférase Renilla au signal luciférase Firefly, le pre-miRl99a-5p humain a induit une diminution significative de l'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle, indiquant que CAV1 est la cible directe de miR-199a-5p (figure 6C). En outre, la transfection de pre-miRl99a-5p dans les fibroblastes pulmonaires MRC5 et hFL1 a conduit à une diminution significative et spécifique de CAV1 aux niveaux ARNm et protéique (figures 6C-6E et 7). TGFp régule l'expression de miR-199a-5p et de CAV1 dans les fibroblastes pulmonaires Il a été étudié si la diminution de l'expression de CAV1 suite à une stimulation par le TGFP est associée avec une augmentation de l'expression de miR-199a-5p. Afin de tester cette hypothèse, la lignée cellulaire MRC5 a été exposée au TGFP, et les niveaux d'expression de CAV1 et mir-199a-5p ont été analysés. Comme détecté par RT-PCR Taqman, le traitement au TGFP des fibroblastes humains pendant 24 à 48 heures a conduit à une baisse marquée en ARNm de CAV1, alors que l'expression de miR-199a-5p a été significativement régulée à la hausse (figures 8A et 8B). Finalement, une diminution des niveaux protéiques de CAV1 a également été observée après traitement par le TGFb d'une manière dépendante du temps (figure 8C). L'ensemble de ces résultats montre que le miR-199a-5p peut a priori contribuer à la régulation à la baisse dépendante du TGFP de l'expression de CAV1 dans les fibroblastes humains. Expression altérée de CAV1 dans des poumons de souris souffrant de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine L'expression de CAV1 a été étudiée dans des poumons 5 fibrotiques de souris. De manière cohérente avec de précédentes études, les données révèlent une diminution significative des niveaux d'expression protéique et en ARNm de CAV1 chez des souris C57BL/6J, 14 jours après l'administration de bléomycine (figures 9A, 9B et 9C). En outre, une coloration 10 immunohistochimique de CAV1 sur des coupes tissulaires de poumon issues de souris C57BL/6J 14 jours après un traitement par la bléomycine, a montré une réduction marquée de CAV1 dans l'aire fibrotique des poumons (figure 9D). Collectivement, ces résultats ont montré que, dans les fibroblastes pulmonaires, la 15 régulation à la hausse de l'expression de miR-199a-5p dans des poumons fibrotiques de souris corrèle avec la régulation à la baisse de CAV1. Fait à noter, les souris BALS/c, pour lesquelles l'expression de miR-199a-5p n'est pas régulée à la hausse en 20 réponse à la bléomycine, n'a pas affiché de diminution significative du niveau d'expression en ARNm de CAV1 14 jours après un traitement pas la bléomycine (figure 10). Expression altérée de CAV1 et de miR-199a-5p dans des poumons 25 de patients atteints d'une FIP Il a été étudié si l'expression de miR-199a-5p est également dérégulée dans des poumons de patients atteints d'une FIP, à l'aide d'un jeu de données récemment publié (numéro d'accession GEO GSE13316) constitué de 10 échantillons FIP et 30 10 échantillons contrôle. De manière intéressante, par rapport au contrôle, l'expression de miR-199a-5p dans les échantillons FIP a été très significativement augmentée (p=0,005, p=0,006, tableau 1). Puis, ces résultats ont ensuite été étudiés sur une plus large cohorte de patients FIP (FIP n=94 et contrôle n=83) où la relation inverse entre CAV1 et miR-199a-5p observée dans les souris a été confirmée chez les humains (figures 12A et 12B). Ainsi les poumons de patients avec une FIP ont montré une expression significativement augmentée de miR-199a-5p de même qu'une expression significativement diminuée de CAV1 par rapport aux poumons sains. Le ratio linéaire pour CAV1 entre FIP et contrôle a été de 0,54 (FDR Finalement, l'examen de coupes de poumons atteints de FIP a révélé l'expression de miR-199a-5p dans les fibroblastes pulmonaires de même qu'une expression diminuée de CAV1 (figures 12C et 12D). Activation fibrogénique médiée par miR-199a-5p des fibroblastes pulmonaires Etant donné que le niveau d'expression de CAV1 est un facteur critique impliqué dans l'activation fibrogénique des fibroblastes pulmonaires, il a été étudié si la surexpression de miR-199a-5p dans les fibroblastes pulmonaires est suffisante pour récapituler les effets profibrotiques connus associés avec une diminution de l'expression de CAV1 (i.e. prolifération des fibroblastes, migration et différenciation en myofibroblastes). Comme représenté dans la figure 13, augmenter les niveaux de miR-199a-5p par transfection de précurseurs de miR-199a-5p a conduit à une induction significative de migration, invasion (figures 13A et 13B) et prolifération (figure 13C) des fibroblastes pulmonaires. En outre, la surexpression de miR199a-5p a également conduit à une augmentation de l'expression d'ACTA2 (marque de la différenciation des myofibroblastes), de même qu'à une diminution significative de l'expression de PPARG (inhibiteur connu de la différenciation des myofibroblastes) (figure 13D). Puis, il a été étudié si miR-199a-5p exerce d'autres effets profibrotiques indépendamment de la régulation de CAV1. Pour ce faire, le profil d'expression génétique obtenu dans des fibroblastes pulmonaires transfectés ave des précurseurs de miR-199a-5p a été comparé avec celui obtenu après transfection avec un siARN dirigé spécifiquement contre CAV1. De manière intéressante, un certain chevauchement a été mis en évidence entre les deux signatures, principalement parmi les transcrits régulés à la baisse (figure 14A, groupe 2), avec 34% des transcrits régulés à la baisse par miR-199a-5p également réprimés par un si-CAV1 (figure 14B). Pour se familiariser avec les voies modulées par miR-199a-5p, les vois canoniques d'Ingenuity PathwaysTM associées au miR-199a-5p ont été analysées et comparées à celles de contextes miR2l et si-CAV1. Comme visualisé sur la l'arbre décisionnel de la figure 15A, des regroupements hiérarchiques confortent la proximité entre les voies régulées par miR-199a-5p et si-CAV1. Des voies spécifiques au miR-199a5p ont également été mises en évidence, notamment certaines liées à l'inflammation, telles que « Signalisation IL-1 », « Signalisation de la résponse de phase aigüe » et « Signalisation de P38 MAPK », toutes typiques de processus fibrotiques. Parmi les gènes régulés spécifiquement par miR199a-5p, plusieurs gènes profibrotiques connus avec des activités biologiques distinctes ont été mis en évidence, et pour lesquels une expression aberrante a été confirmée in vivo (figures 11 et 16). Cela confirme que miR-199a-5p régule de multiples voies de signalisation différentes impliquées dans la fibrogenèse pulmonaire. En particulier, par rapport aux cellules transfectées avec siCAV1, la surexpression de miR- 199a-5p a augmenté de manière significative l'expression de CCL2, TGFBRI et MMP3 et a diminué de manière significative l'expression de CAV2 et PLAU (figure 17). Fait à noter, ces deux gènes régulés à la baisse sont supposés être des cibles directes de miR-199a-5p d'après l'algorithme Pictar. Finalement, il a été démontré que miR-199a-5p est impliqué dans la signalisation du TGFP. Pour cela, une signature de la signalisation du TGFb a été définie expérimentalement dans les fibroblastes pulmonaires et comparée à la signature de miR-199a-5p en utilisant la méthode GSEA. Cette analyse a révélé un chevauchement significatif entre ces deux signatures, comme évalué par des scores d'enrichissement normalisés au dessus de 1 (1,4 et 2,17 pour des gènes régulés à la hausse et à la baisse, respectivement, avec une valeur p nominale et une valeur q FDR étant Tableau 4 miARN Séquence miARN Changement d'expression mmu-miR-193 AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU (SEQ ID NO: 5) Baisse mmu-miR-29c UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA (SEQ ID NO: 6) Baisse mmu-miR-30b UGUAAACAUCCUACACUCAGCU (SEQ ID NO: 7) Baisse mmu-miR-199a-3p ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA (SEQ ID NO: 8) Hausse mmu-miR-199a-5p CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC (SEQ ID NO: 9) hausse L'augmentation de l'expression de miR-199a-5p a été confirmée dans deux modèles expérimentaux indépendants de fibrose hépatique (figures 19A, 19B et 19C) et a été corrélée avec la sévérité de la fibrose hépatique, du fait que les souris BALB/c ont une fibrose hépatique plus prononcée que les souris C57BL/6, suite à l'administration de CC14 (figures 19A et 19B). En outre, l'expression de miR-199a-5p a été significativement diminuée au cours de la régression de la fibrose hépatique expérimentale induite par le CC14 (figure 19D). De plus, il a été montré que l'exposition des cellules étoilées au TGFP a été associée avec une augmentation de l'expression de miR-199a-5p et une diminution du niveau d'expression de CAV1 (figures 19E et 19F). De manière similaire, les données obtenues à partir du modèle d'obstruction urétral unilatéral de fibrose rénale ont montré une augmentation de l'expression du miR-199a-5p dans des reins endommagés par rapport à des souris opérées fictivement (figure 20A). De manière intéressante, comme dans le cas de fibrose pulmonaire, l'expression rénale du miR-199a- 5p a été corrélée avec une progression de la pathologie (figure 20A). Comme représenté dans la figure 20B, une hybridation in situ réalisée 28 jours après l'opération (i.e. lorsque la fibrose est établie) n'a montré aucun signal détectable pour miR-199a-5p dans les reins normaux, alors que le signal d'hybridation a été grandement augmentée à travers les reins endommagés dans l'aire compatible avec les myofibroblastes. De plus, une immunohistochimie de CAV1 réalisée sur des reins fibrotiques de souris 28 jours après l'opération a montré une réduction marquée de l'expression de CAV1 dans l'aire fibrotique des reins (figure 20C). LISTE DE REFERENCES 1. Wynn, J. Clin. Invest., 117 : 524-529, 2007 2. Wynn, Nat. Rev. Immunol., 4 : 583-594, 2004 3. Wilson et Wynn, Mucosal. Immunol., 2 : 103-121, 2009 4. Ambras, Nature, 431 : 350-355, 2004 5. Brennecke et al., PLoS. Biol., 3 : e85, 2005 6. Xie et al., Nature, 434 : 338-345, 2005 7. Berezikov et al., Cell, 120 : 21-24, 2005 8. Mitchell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105 : 10513-10518, 2008 9. 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Bioinformatics, 6 : 309, 2005 REVENDICATIONS1) Procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie fibroproliférative d'un sujet caractérisé en ce qu'il comprend 5 les étapes suivantes : (i) de mesure quantitative du niveau d'expression des miARN dans un échantillon biologique dudit sujet ; (ii) d'établissement du profil d'expression des miARN dudit échantillon biologique dudit sujet ; 10 (iii) de comparaison du profil d'expression des miARN de l'échantillon biologique dudit sujet avec le même profil d'expression des miARN d'un échantillon biologique de référence, ledit profil d'expression étant constitué de mir-146b, miR-34a, miR-21, miR-449a, miR-449b, miR-20a, miR-18a, 15 miR-223, miR-449c, miR-147b, miR-152, miR-l8lac, miR-451, miR351, miR-133ac, miR-214, miR-199a-5p, miR-132, miR-222, miR342-3p, miR-345-5p et miR-221. (iv) d'identification d'au moins un miARN dont le niveau d'expression par ledit échantillon biologique dudit 20 sujet diffère par rapport au niveau d'expression du même miARN par ledit échantillon de référence. 2) Procédé de diagnostic in vitro selon la revendication 1, ledit procédé comprenant en outre l'étape 25 suivante : (v) d'identification d'au moins un gène cible dont le niveau d'expression est régulé par le niveau d'expression dudit au moins un miARN identifié à l'étape (iv) ; 30 3) Procédé de diagnostic in vitro selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel ledit au moins un miARN identifié à l'étape (iv) est le miR-199a-5p. 4) Procédé de diagnostic in vitro selon la revendication 2 ou 3, dans lequel ledit au moins un gène cible identifié à l'étape (v) code pour la cavéoline-1. 5) Procédé pour identifier un sujet susceptible de développer une pathologie fibroproliférative caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) de mesure quantitative du niveau d'expression du miR-199a-5p dans un échantillon biologique dudit sujet ; (ii) de comparaison du niveau d'expression du miR- 199a-5p dans ledit échantillon dudit sujet avec le niveau d'expression du miR-199a-5p dans un échantillon biologique de référence ; (iii) de détection d'une augmentation du niveau d'expression du miR-199a-5p. 6) Procédé selon la revendication 5, ledit procédé comprenant en outre l'étape suivante : (iv) d'identification d'au moins un gène cible dont le niveau d'expression est régulé par le niveau d'expression du miR-199a-5p identifié à l'étape (iii) ; 7) Procédé selon la revendication 6, dans lequel ledit au moins un gène cible identifié à l'étape (iv) code pour 25 la cavéoline-1.