Brevet FR2986537A1 — publié le 20130809

La présente invention concerne un procédé d'évaluation, in vitro, d'au moins un actif apte à préserver la fonctionnalité des cellules souches épithéliales, en particulier à maintenir ou stimuler la croissance et/ou la densité et/ou le renouvellement d'une matière kératinique, en particulier des cheveux et de la peau. En particulier, un tel procédé d'évaluation est utile pour sélectionner des candidats agissant pour maintenir ou augmenter la densité capillaire et/ou lutter contre l'anti-vieillissement cutané. Les matières kératiniques, et notamment la chevelure et la peau, comportent des cellules souches épithéliales qui, de manière générale, outre leur capacité de pluripotence, sont capables de se différencier en différentes cellules qui composent les tissus de l'organisme et de s'auto-renouveler. Ces fonctionnalités sont nécessaires pour régénérer les tissus, mais peuvent subir certaines altérations ou dysfonctionnement au fil du temps. En particulier, la chevelure humaine représente un ensemble d'environ 150 000 cheveux. Chacun d'entre eux est généré par une annexe spécialisée de la peau, véritable organe autonome, le follicule pileux. La croissance du cheveu et son renouvellement n'est pas un processus continu, étant déterminés par l'activité des follicules pileux et leur environnement matriciel. L'activité de tels follicules est cyclique et comporte essentiellement quatre phases. En effet, le follicule passe successivement d'une phase de pousse avec production de tige pilaire (phase anagène), à une rapide phase d'involution (phase catagène), puis à une phase de repos avec chute de cheveu (phase télogène) qui précède une phase de régénération (néogène) pour aboutir de nouveau à la phase anagène. La phase anagène, phase active ou de croissance au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs années. La phase catagène très courte dure quelques semaines. La phase télogène ou phase de repos qui dure quelques mois. A la fin de cette période de repos, les cheveux tombent et un autre cycle recommence. La chevelure se renouvelle donc en permanence et sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, 10% environ sont au repos et seront remplacés dans les mois qui viennent. La chute ou perte naturelle des cheveux peut être estimée, en moyenne, à quelques cent cheveux par jour pour un état physiologique normal. Ce processus de renouvellement physique permanent subit une évolution naturelle au cours du vieillissement, les cheveux deviennent plus fins et leurs cycles plus courts. Différentes causes peuvent toutefois entraîner une perte importante, temporaire ou définitive, des cheveux. La chute des cheveux, en particulier l'alopécie, est essentiellement due à des perturbations du renouvellement capillaire. Ces perturbations entraînent dans un premier temps un raccourcissement de la phase anagène et un affinement progressif du cheveu, puis une diminution de leur quantité. Il se produit une miniaturisation progressive des bulbes, avec conjointement, un isolement de ceux-ci par épaississement progressif de la matrice collagénique de la gaine conjonctive externe. La revascularisation autour du follicule pileux est donc rendue plus difficile cycle après cycle. Les cheveux régressent, se miniaturisant jusqu'à n'être plus qu'un duvet non pigmenté et ce phénomène entraîne un appauvrissement progressif de la chevelure. Des zones sont touchées préférentiellement, notamment les golfes temporaux ou frontaux chez l'homme, et chez les femmes, on constate une alopécie diffuse du vertex. Le terme alopécie recouvre aussi toute une famille d'atteintes du follicule pileux ayant pour conséquence finale la perte définitive, partielle ou générale des cheveux. Il s'agit plus particulièrement de l'alopécie androgénique. Dans un nombre important de cas, la chute précoce des cheveux survient chez des sujets prédisposés génétiquement, il s'agit alors d'alopécie andro-chrono-génétique ; cette forme d'alopécie concerne notamment les hommes. Il est connu, par ailleurs, que certains facteurs tels qu'un déséquilibre hormonal, un stress physiologique, la malnutrition, peuvent accentuer le phénomène. En outre, la chute ou l'altération des cheveux peut être en relation avec des phénomènes saisonniers. De façon générale, tout facteur influençant ces processus, à savoir l'accélération de la fréquence des cycles, la miniaturisation progressive des bulbes, l'épaississement progressif de la matrice collagénique péri-folliculaire, l'épaississement de la gaine conjonctive externe, et la diminution de la vascularisation, aura un effet sur la croissance des follicules pileux. Le follicule pileux est structurellement composé de deux compartiments distincts : un compartiment épithélial et un compartiment dermique (mésenchymateux) et l'interaction de ces deux compartiments est essentiel pour la morphogenèse et la repousse des cheveux ainsi que pour le maintien du cycle folliculaire. Le maintien de la fonctionnalité du compartiment épithélial est dépendant de la présence et de l'activité de différents réservoirs de cellules souches. Un premier réservoir de cellules souches épithéliales était identifié dans une région appelée le « bulge » chez les rongeurs (Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. (1990) Cell 61: 1329-1337). Depuis cette première découverte, d'autres réservoirs de cellules souches kératinocytaires ont été identifiés toujours chez les rongeurs Ces cellules souches jouent un rôle essentiel dans la morphogenèse folliculaire mais elles sont également impliquées dans la réparation de l'épiderme dans des cas de blessures. Des études sur les follicules humains sont beaucoup plus rares mais révèlent au moins deux réservoirs de cellules souches épithéliales caractérisés par l'expression de la kératine 19, nichés dans la gaine externe (ORS pour « outer root sheath ») du follicule (tiers supérieur et tiers inférieur) (Commo S. Gaillard O, Bernard BA. (2000) Differentiation 66:157-164). Bien que ces réservoirs de cellules souches soient reconnus comme étant absolument essentiels pour maintenir et régénérer le follicule pileux, il y a, à ce jour, très peu de connaissance quant à la modification de ces populations cellulaires avec l'âge et/ou avec le début et l'évolution de l'alopécie (tous types d'alopécie confondus). Il a été récemment démontré que la chute de cheveux chez les hommes alopéciques s'accompagne d'une disparition non pas de cellules souches mais plutôt de certaines populations de cellules progénitrices (cellules plus actives, prolifératives). Ces résultats suggèrent que l'alopécie pourrait être liée à un problème d'activation de cellules souches folliculaires ou bien de l'expression de tout le potentiel régénératif des cellules progénitrices (LA Garza et al. (2011) J Clin Invest. 121: 613-622). L'identification de solutions techniques permettant une meilleure préservation de la fonctionnalité/activité des cellules souches épithéliales folliculaires seraient donc très importantes en vue de préserver la qualité, la densité et le forme de cheveu tout au long d'une vie d'un individu. Etant donné l'importance du microenvironnement (niche) dans la régulation de l'activité et de la fonctionnalité de cellules souches dans des tissus diverses et variés, les inventeurs ont engagé des études afin d'identifier des facteurs environnementaux qui pourraient réguler l'activité de cellules souches épithéliales. Pour ce faire, outre des investigations sur des cellules souches épithéliales folliculaires, les inventeurs ont par la même élargi leur investigation sur les cellules épithéliales cutanées. D'une façon surprenante et inattendue, les inventeurs ont ainsi découvert que certains réservoirs de cellules souches épithéliales, folliculaires ou cutanées, baignent dans un environnement hypoxique. Cette constatation a été révélée par l'anhydrase carbonique IX, protéine dont l'expression augmente dans des conditions hypoxiques (S Kaluz et al. (2010) Biochim Biophys Acta 1795 :162-172). En démontrant par des tests de double révélation immuno-fluorescente qu'un sous-ensemble de l'anhydrase carbonique IX exprime CD34, cela pris en combinaison avec la publication LA Garza et al. (2011) J Clin Invest. 121: 613-622 montrant que les cellules souches porteuses de CD34 sont en déplétion pour des sujets alopéciques, les inventeurs ont alors formulé l'hypothèse que l'induction d'un signal d'un état d'hypoxie est apte à maintenir la fonctionnalité des cellules souches épithéliales. La présente invention a donc pour objet selon un procédé d'évaluation in vitro d'au moins un actif apte à préserver la fonctionnalité des cellules souches épithéliales, en particulier à maintenir ou stimuler la croissance et/ou la densité et/ou le renouvellement d'une matière kératinique, consistant à déterminer la faculté de l' (des) actif(s) à mimer un état hypoxique dans la matière kératinique, préférentiellement en condition normoxique, le (les) actif(s) étant apte(s) à augmenter l'expression d'au moins l'anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de l'hypoxie, dans la matière kératinique traitée avec le (les) actif(s) comparativement à une matière kératinique non traitée par le (les) actif(s), préférentiellement en condition normoxique. Préférentiellement, ce procédé consiste à déterminer la faculté de l' (des) actif(s) à mimer un état hypoxique dans la matière kératinique, suite au traitement de la matière kératinique dans un état normoxique avec le (les) actif(s). Par « mimer », on entend que le (les) actifs sont apte(s) à augmenter l'expression (c'est-à-dire, exprimer ou surexprimer) d'un marqueur biologique de l'hypoxie, en l'occurrence au moins l'anhydrase carbonique IX, normalement non ou peu exprimée à l'état normoxique. Par « état normoxique », on entend un taux en dioxygène correspondant à celui de l'atmosphère terrestre ambiant, c'est-à-dire de 21%. Par « état hypoxique », on entend un taux en dioxygène strictement inférieur à celui de l'atmosphère terrestre ambiant, par exemple inférieur à 5%, par exemple égal à 3%. Ainsi, le (les) actifs a (ont) la faculté, à partir d'une matière kératinique à l'état normoxique, de faire passer ladite matière kératinique à un état de type hypoxique, pouvant ainsi provoquer des effets comparables à ceux d'un microenvironnement hypoxique pour les cellules souches épithéliales. L'expression d'au moins l'anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de l'hypoxie, peut être mise en évidence par marquage de l'anhydrase carbonique IX sous sa forme protéique, de préférence par marquage immuno-fluorescent ou Western Blotting de ladite protéine, et / ou par analyse transcriptomique de l'anhydrase carbonique IX. Un objet dépendant ou indépendant du procédé tel que précédemment défini peut consister, en variante ou de façon additionnelle, à observer l'expression d'un (de) marqueur(s) biologique(s) de l'hypoxie, tel que l'anhydrase carbonique IX, dans la couche basale de la région proximale de la gaine externe d'un follicule pileux. A la connaissance des inventeurs, aucun document de l'art antérieur n'enseigne ni ne suggère d'utiliser un tel procédé d'évaluation d'actif(s) sur leur capacité à mimer une hypoxie, en particulier par l'analyse de l'expression d'au moins l'anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de cette hypoxie, et ce notamment en vue d'étudier leur propriété de préservation de la fonctionnalité de cellules souches épithéliales, les études précédentes ayant pour l'heure essentiellement montré que des conditions hypoxiques impactent d'une façon importante la biologie de cellules souches embryonnaires (U Silvan et al (2009) Differentiation 78 :159-168) ainsi que la biologie des cellules souches issues des tissus adultes comme les cellules souches neuronales ou les cellules souches hématopoïétiques (P Eliasson et JI Jonsson (2010) J Cell Physiol 222 :17-22 ; DM Panchision (2009) J Cell Physiol 220 :562-568). Au niveau cellulaire, les conditions hypoxiques impactent notamment le contrôle du cycle cellulaire, le métabolisme et la capacité à répondre aux stress oxydatifs. La réponse cellulaire aux conditions hypoxiques est sous le contrôle des HIFs (hypoxia- inducible factors), et notamment HIF-1 qui est un facteur de transcription composé de 2 sous-unités, HIF1-a (alpha) et HIFI-p. (béta), et qui régule la transcription de plus de 100 gènes impliqués dans le cycle cellulaire, la viabilité, la différentiation, l'autophagie, etc. L'activation de HIFI est finement régulée en fonction de l'état d'oxygénation des cellules. En conditions d'oxygénation importante (« normoxie »), la sous-unité HIF1-alpha est hydroxylée par la prolyl 4-hydroxylase, ce qui permet son ubiquination et sa dégradation par le protéasome. Au contraire, Lorsque la pression en dioxygène diminue (hypoxie), cette sous-unité n'est plus dégradée et peut alors s'accumuler et migrer vers le noyau pour se lier à la sous-unité HIF1-béta et former ainsi le facteur de transcription HIFI. Une solution préférentielle dans le cadre de ce procédé d'évaluation peut consister ainsi à déterminer si le (les) actifs à tester, répondant au procédé d'évaluation selon l'invention, ont la capacité à agir comme inhibiteurs de prolyl hydroxylases en vue d'éviter sa dégradation de ce facteur de transcription, et en particulier la sous-unité a (alpha) de la protéine HIF-1, et ainsi maintenir un état d'hypoxie des cellules souches épithéliales. Bien entendu, cette voie d'action ne doit pas être considérée comme étant limitative, le (les) actif(s) pouvant être impliqué(s) dans une ou plusieurs autre(s) voie(s) d'action additionnelle(s) ou différente(s) en vue de conduire à cet effet hypoxique. La présente invention a également pour objet une utilisation d'un procédé d'évaluation tel que précédemment défini afin de déterminer un (des) actif(s) apte(s) à maintenir ou augmenter la densité capillaire et/ou apte(s) à lutter contre le vieillissement cutané. D'autres caractéristiques, propriétés et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description et des exemples qui suivent. Matières kératiniques Le procédé d'évaluation selon la présente invention met en oeuvre des matières kératiniques. Par « matières kératiniques » on entend les fibres kératiniques et la peau. Les fibres kératiniques concernant en particulier les cheveux, les sourcils, les cils, et les poils. Préférentiellement, les fibres kératiniques renvoient aux cheveux. Une telle matière kératinique testée in vitro dans le sens où cette dernière est testée à l'état isolé de l'organisme auquel elle appartient. Pour ce faire, elle peut par exemple être issue de déchets opératoires, d'une biopsie, d'une culture de keratinocytes folliculaires ou cutanés ou d'une culture de cellules souches épithéliales, par exemple folliculaire ou cutanée. Actifs Le procédé d'évaluation selon la présente invention met en oeuvre au moins un actif à mettre en présence de la matière kératinique isolée telle que précédemment 20 définie. De préférence, le (les) actif(s) à tester sur la matière kératinique est (sont) apte(s) à mimer une hypoxie sur une matière kératinique testée en condition normoxique. Un actif conforme à la présente invention est testé sur sa capacité à augmenter l'expression (c'est-à-dire à exprimer ou surexprimer) au moins l'anhydrase 25 carbonique 9, en tant que marqueur biologique de l'hypoxie, au sein de ladite matière kératinique isolée. Un tel actif peut également être testé sur sa capacité à exprimer ou surexprimer un ou plusieurs autre(s) marqueur biologique de l'hypoxie. Par exemple, selon un mode de réalisation particulier, cet actif peut être testé 30 sur son aptitude à augmenter l'expression (c'est-à-dire exprimer ou surexprimer) le glucose transporter 1 (GLUT-1), en tant que marqueur(s) biologique(s) de l'hypoxie. Selon un mode de réalisation particulier, cet actif agit indirectement sur la protéine HIF-1. En particulier, cet actif agit sur une enzyme de dégradation de HIF-1. Plus précisément, cet actif agit préférentiellement comme inhibiteur de la prolyl hydroxylase. Préférentiellement, le (les) actif(s) est (sont) apte(s) à agir, indépendamment du niveau d'oxygénation cellulaire, sur la stabilisation du niveau d'expression de la protéine Hl F-1 . De préférence encore, cet actif ne conduit pas à une variation transcriptomique de HIF-1, en particulier ne conduit pas à une variation de l'expression génique de Hl F-1. En conséquence, ledit actif agit préférentiellement, seulement, et indirectement, sur la protéine Hl F-1 Procédé d'évaluation Le procédé d'évaluation selon l'invention vise à étudier les effets d'un ou plusieurs actif(s) sur la préservation des fonctionnalités des cellules souches épithéliales en observant leur capacité à mimer un état hypoxique sur une matière kératinique isolée, par l'observation de l'expression d'au moins l'anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de l'hypoxie, comparativement à une matière kératinique témoin, non traitée. Un premier procédé d'évaluation peut consister à réaliser un marquage, de préférence immunologique, par exemple par immuno-fluorescence ou Western Blotting, d'au moins la protéine anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de l'hypoxie. Plus particulièrement des analyses de matières kératiniques telles que de tissus issus de cuir chevelu humain, en particulier des follicules pileux, ou des cultures de kératinocytes folliculaires ou cutanés avec des anticorps spécifiques à l'anhydrase carbonique IX, marqueur biologique de l'hypoxie, peuvent être employées afin d'observer les variations d'expression respectivement en condition hypoxique et en condition normoxique en présence et en absence d'actif(s) afin d'étudier si le (les) actif(s) sont aptes à mimer un état hypoxique. Un deuxième procédé d'évaluation peut consister à réaliser une analyse transcriptomique de l'anhydrase carbonique IX dont l'expression du gêne correspondant est modifiée par un signal hypoxique, par la technique de RT-qPCR, sur des matières kératiniques, par exemple sur des cultures de keratinocytes in vitro ou des bulbes de cheveux isolés par microdissection et mise en culture ex vivo, en condition hypoxique, et en condition normoxique en présence et en absence d'actif(s) à tester, afin d'étudier si le (les) actif(s) sont aptes à mimer un état hypoxique. A ces deux procédés d'évaluation peut éventuellement s'ajouter un procédé visant à avérer l'impact du (des) actif(s) apte(s) à mimer une hypoxie sur la qualité des cellules souches épithéliales. Pour ce faire peut être réalisé un test d'efficacité clonogénique ou « Test CFE » (Colony-forming efficiency) de kératinocytes (incluant des cellules souches épithéliales), consistant à observer respectivement, en condition hypoxique et en condition normoxique en présence et en absence d'actif(s) l'impact de la présence de l' (des) actif(s) sur la fréquence des cellules capables de générer un clone cellulaire au sein d'une population donnée, ainsi que sur la morphologie clonale obtenue, de façon à ainsi avérer leur participation à la préservation de la fonctionnalité des cellules souches épithéliales traitées avec le (les) actif(s). Selon un mode de réalisation illustratif, et non limitatif, au moins l'un de ces procédés ou l'ensemble de ces procédés d'évaluation peut (peuvent) être mis en oeuvre afin d'avérer l'effet d'un ou plusieurs actif(s) sur l'expression d'au moins l'anhydrase carbonique en tant que marqueur biologique de l'hypoxie. EXEMPLES Plusieurs exemples de procédés d'évaluation selon l'invention ont été donnés ci-dessous à titre illustratif de la présente invention. De tels exemples ne sauraient limiter la portée de l'invention, l'homme du métier pouvant utiliser d'autres procédés connus en soi afin de mettre en évidence la stimulation de l'anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de l'hypoxie sur des matières kératiniques. I- Protocole et résultats A titre illustratif d'actifs répondant au procédé d'évaluation selon l'invention peuvent être mentionnés les acides pyridine-dicarboxyliques et certains dérivés, notamment des esters et des amides. A titre d'exemple a été mis en oeuvre un composé connu comme étant adapté à inhiber la prolyl hydroxylase, en l'occurrence un composé choisi parmi les dérivés d'acide pyridine-dicarboxylique de formule générale (I) ou de l'un de leurs sels : COR2 /4 6 N COR1 (I) Formule (I) dans laquelle : - R1 et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre OH, OR', -NH2, -NHR', -NR'R", avec R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre, un radical alkyle en Cl-C18, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, ou un radical aryle, ce radical aryle ou alkyle étant éventuellement substitué par au moins un groupe OH, alkoxy, acyloxy, amino, ou alkylamino, ou R' et R" représentent ensemble un hétérocycle, tels que cités dans la demande EP1352629, et en particulier a été utilisé la pyridine-2,4-dicarboxylate de diéthyle. 1/ Premier exemple de procédé d'évaluation Ce premier procédé a consisté à observer par microscope optique à fluorescence un follicule pileux après marquage immuno-fluorescent, grâce à des anticorps spécifiques à l'anhydrase carbonique IX, marqueur biologique de l'hypoxie, en absence et en présence de pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle. Grâce à ce procédé on peut observer une expression de la protéine anhydrase carbonique IX, qui plus est, localisée dans la couche basale de la région proximale de la gaine externe du follicule pileux renfermant les cellules souches épithéliales folliculaires. 2/ Deuxième exemple de procédé d'évaluation Ce deuxième procédé a consisté à réaliser une analyse transcriptomique du gène codant pour l'anhydrase carbonique IX dont l'expression est modifiée par un signal hypoxique, par la technique de RT-qPCR, sur des bulbes de cheveux isolés par microdissection au niveau de l'hypoderme de scalp humain et mise en culture ex vivo durant 4 heures soit dans des conditions hypoxiques (3% de dioxygène) soit à 21% de dioxygène, en absence (témoin) ou en présence de pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle. Après 4 heures d'incubation des bulbes entiers en condition hypoxique ou en condition normoxique en présence de pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle, on observe une expression commune de l'anhydrase carbonique 9, indiquant que le traitement avec la pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle induit un profil moléculaire similaire à celui induit par l'hypoxie. Evaluation de la préservation de la fonctionnalité des cellules souches épithéliales Cette évaluation de la qualité des cellules souches épithéliales traitées ou non par le (les) actif(s) peut par exemple être avérée par un test d'efficacité clonogénique ou « Test CFE » (Colony-forming efficiency) de kératinocytes (incluant des cellules souches épithéliales), consistant à observer respectivement, en condition hypoxique et en absence ou en présence de pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle, l'impact de cet actif sur la fréquence des cellules capables de générer un clone cellulaire au sein d'une population donnée ainsi que sur la morphologie clonale obtenue. Pour ce faire, des follicules capillaires entiers isolés du cuir chevelu par chirurgie esthétique ont été découpée en pièces de 1cm2 puis traitées avec 2.4 U/ml dilué dans un milieu William E et incubée toute une nuit à 4°C. Le lendemain, les échantillons sont rincés à l'aide de PBS, l'épiderme retiré à l'aide d'une pince à épiler (tweezers), et chaque follicule capillaire est extrait et placé dans du PBS, sur glace. Après avoir éliminé le PBS les follicules sont placées pendant 5 minutes dans 0.5 ml de trypsine-EDTA 1X à 37°C afin d'uniquement dissocier les kératinocytes de la région inférieure de la gaine externe du follicule capillaire. Le processus enzymatique est stoppé en ajoutant 1mL de milieu contenant 10% de sérum et le surnageant contenant les cellules dissociées ensuite filtré en utilisant un tamis à cellules (70 pm). Les cellules récupérées sont alors centrifugées à 1000 tours / minute pendant 15 minutes à 4°C and le précipité de cellule remis en suspension dans un milieu DMEM (Cambrex) - Hams F12 (mélange 3 : 1) contenant 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium, additionné de sérum de veau fétal 10 (HyClone), d'acides aminés non essentiels, de 5pg/m1 d'insuline, de 0.18 mM d'adénine, de 0.4 pg/ml d'hydrocortisone, de 2 nM de tri-iodothyronine, de 1Ong/mL de facteur de croissance épidermique, de 1 pM d'isoprotenerol, de 5 pg/ml de transférine, de 4mM de glutamine et 50 U/ml de pénicilline/streptomycine. Ensuite, les cellules de la gaine épithéliale externe ainsi extraites des follicules pileux et disséqués, sont ensuite ensemencées à raison de 1000 cellules / boîte de culture en condition CFE, sur couche de fibroblastes 3T3 irradiés. Puis, les cellules sont cultivées soit à 3% de dioxygène (conditions hypoxiques) soit à 21% de dioxygène en présence de pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle (dans des concentrations variant de 50 à 500 pM). Un témoin non traité et cultivée à 21% de dioxygène sert comme une référence. Le milieu est changé au 3ème jour et au 8ème jour et la culture stoppée au 10ème jour. A la fin de la culture clonogénique et après fixation (via éthanol à 70%) et coloration (incubation avec éosine, rinçage puis incubation avec BIueRAL 555) des clones cellulaires obtenus, la morphologie des clones et des cellules composant ces clones est analysée. La culture de ces cellules en condition hypoxique (3% de dioxygène) a très clairement un effet sur la morphologie clonale. Les clones obtenus présentent une morphologie plus compacte et moins diffuse (bords de clones bien délimités) que ceux obtenus dans des conditions de culture classique à 21% de dioxygène. Les clones sont composés de cellules de petite taille, très jointives et plus homogènes, qui rappellent les holoclones décrits par Y.Barrandon et H.Green (Proc.Natl.Acad.Sci. 1987, 84:23022306). Ces résultats ont été observés de façon très reproductible et suggèrent un meilleur maintien de l'immaturité des cellules en culture. Les clones obtenus suite à un traitement avec de la pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle sont également moins diffus et moins denses que les témoins incubés en présence de 21% de dioxygène. En général, les clones obtenus sont composés de cellules de très belle qualité. Le nombre de clones ne diminue pas significativement par rapport aux conditions témoins 21% de dioxygène. En résumé le traitement par la pyridine-2,4 dicarboxylate de diéthyle en condition normoxique génère des clones similaires à ceux obtenus en conditions hypoxiques. III- Interprétation Les inventeurs ont pu observer la co-localisation des cellules souches épithéliales et de l'anhydrase carbonique IX, les cellules souches baignant dans un environnement hypoxique. En particulier, l'expression du marqueur biologique de l'hypoxie peut être observée dans la couche basale de la région proximale de la gaine externe d'un follicule pileux, encore appelée réservoir inférieur de la gaine externe du follicule pileux. Les inventeurs ont montré, de façon surprenante et inattendue, qu'un actif, et plus précisément un inhibiteur des prolyl-hydroxylases, qui agit indépendamment du niveau d'oxygénation cellulaire sur la stabilisation du niveau d'expression de la protéine HIF1-alpha, mime en partie un effet hypoxique. En effet, le traitement en condition normoxique des follicules pileux en survie avec un tel actif inhibiteur des prolylhydroxylases induit un profil transcriptomique similaire à celui induit par des conditions hypoxiques. Par ailleurs, la clonogénicité des populations cellulaires fraîchement isolées de la gaine externe des follicules pileux humains est impactée d'une façon similaire que ce soit par un traitement avec de tels inhibiteurs des prolyl-hydroxylases ou par la mise en culture en conditions hypoxiques. Ces travaux démontrent ainsi que ces actifs ont la capacité de reproduire les effets d'une des caractéristiques physiologiques (à savoir l'hypoxie) de la niche du réservoir inférieur des cellules souches folliculaires. Bien entendu, le (les) actif(s) évalué(s) par le (les) procédé(s) d'évaluation selon la présente invention peut (peuvent) agir via une ou plusieurs voie(s) biologique(s) additionnelle(s) ou différente(s) pour mimer l'effet hypoxique observé. Bien entendu, l'homme du métier veillera à apporter des éventuels modifications ou compléments de telle manière que les propriétés avantageuses du procédé d'évaluation selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées par l'adjonction envisagée. Dans toute la demande, le libellé « comprenant un » ou « comportant un » signifie « comprenant au moins » ou « comportant au moins un » sauf si le contraire est spécifié. 20 REVENDICATIONS1. Procédé d'évaluation in vitro d'au moins un actif apte à préserver la fonctionnalité des cellules souches épithéliales, en particulier à maintenir ou stimuler la croissance et/ou la densité et/ou le renouvellement d'une matière kératinique, consistant à déterminer la faculté de l' (des) actif(s) à mimer un état hypoxique dans la matière kératinique, le (les) actif(s) étant apte(s) à augmenter l'expression d'au moins l'anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de l'hypoxie, dans la matière kératinique traitée avec le (les) actif(s) comparativement à la matière kératinique non traité par le (les) actif(s). 2. Procédé d'évaluation selon la revendication 1, consistant à déterminer la faculté de l' (des) actif(s) à mimer un état hypoxique dans la matière kératinique, suite au traitement de la matière kératinique dans un état normoxique avec le (les) actif(s). 3. Procédé d'évaluation selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le (les) actif(s) est (sont) apte(s) à agir indépendamment du niveau d'oxygénation cellulaire sur la stabilisation du niveau d'expression de la protéine Hl F-1. 4. Procédé d'évaluation selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel le (les) actif(s) est (sont) apte(s) à agir indirectement sur la protéine HIF-1, et en particulier à inhiber la prolyl-hydroxylase en vue d'éviter la dégradation de la sous-unité a (alpha) de la protéine Hl F-1. 5. Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le (les) actif(s) est (sont) inapte(s) à engendrer une variation transcriptomique de Hl F-1. 6. Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel outre l'expression de l'anhydrase carbonique IX, le (les) actif(s) est (sont) apte(s) à augmenter l'expression du glucose transporter I (GLUT-1) en tant que marqueur biologique de l'hypoxie, dans la matière kératinique traitée avec le (les) actif(s) comparativement à la matière kératinique non traité par le (les) actif(s). 2 986 5 3 7 15 7. Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'expression d'au moins l'anhydrase carbonique IX en tant que marqueur biologique de l'hypoxie, est mise en évidence par marquage de l'anhydrase 5 carbonique IX sous sa forme protéique, de préférence par marquage immuno-fluorescent ou Western Blotting de ladite protéine, et / ou par analyse transcriptomique de l'anhydrase carbonique IX. 8. Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications 10 précédentes, consistant à observer l'expression du (des) marqueur(s) biologique(s) de l'hypoxie dans la couche basale de la région proximale de la gaine externe d'un follicule pileux. 9. Utilisation d'un procédé d'évaluation selon l'une quelconque des 15 revendications précédentes afin de déterminer un (des) actif(s) apte(s) à maintenir ou augmenter la densité capillaire et/ou apte(s) à lutter contre le vieillissement cutané. 20