Brevet FR2980213A1 — publié le 20130322

Procédé de caractérisation de bactéries, par détection de protéines non- structurales de bactériophages Le domaine technique de la présente invention est celui de la microbiologie. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de caractérisation de bactéries, par détection de protéines non-structurales de bactériophages. Il existe de nos jours de nombreuses méthodes pour détecter et identifier les microorganismes et en particulier les bactéries. Parmi ces méthodes, les méthodes classiques de détection et d'identification bactérienne sont basées sur l'utilisation de milieux de cultures. Elles nécessitent une culture de plusieurs heures (12 à 24 heures), afin d'obtenir une quantité de bactéries nécessaire pour pouvoir mettre en oeuvre les analyses complémentaires, généralement basées sur le métabolisme des bactéries. Les méthodes de biologie moléculaire, basées sur l'amplification des acides nucléiques bactériens, sont aujourd'hui largement utilisées. Elles sont plus rapides et peuvent fournir des résultats en moins de 5h sans culture préalable ; en revanche, elles induisent de nombreux faux-positifs et nécessitent alors une étape de culture pour confirmer les résultats. Des méthodes alternatives basées sur l'utilisation des bactériophages (ou phages) ont également été développées. Les bactériophages sont des virus bactériens qui présentent plusieurs intérêts pour la détection bactérienne tels que la spécificité de reconnaissance de leur cellule hôte, leur auto-réplication rapide, leur longue durée de conservation, leur faible coût, et leur potentiel à différencier les cellules viables des non viables (lié au fait qu'ils ne sont capables d'infecter que des bactéries métabolomiquement actives). Les bactériophages à queue (Caudoviridae, tel que le bactériophage T4), qui sont les plus fréquemment rencontrés, présentent un cycle qui aboutit à la lyse de la bactérie hôte infectée. Cependant certains bactériophages, tels que les bactériophages filamenteux (Inoviridae, tel que le bactériophage M13) sont relargués par la bactérie hôte infectée sans provoquer de lyse. À l'heure actuelle, la détection bactérienne peut être réalisée par différentes approches utilisant des bactériophages. Elles sont décrites dans une récente publication (Smartt and Ripp 2011 [1]) et présentées succinctement ci-dessous. La détection des bactéries peut être réalisée : - à l'aide d'un composant phagique capable de reconnaître et de se lier à une bactérie cible définie, tel qu'un domaine de liaison d'endolysines ou une protéine de fibre caudale. Des outils de détection sont commercialisés par la demanderesse sous la marque VIDAS® UP; - via l'ADN phagique marqué par un colorant fluorescent ; - à l'aide d'un bactériophage rapporteur, comportant un gène rapporteur codant pour une protéine bioluminescente (luciférase) ou fluorescente (GFP), une enzyme (bêta-galactosidase) ou une protéine de nucléation de la glace. (gène inaW) - qui n'est exprimé qu'au sein des bactéries hôtes infectées par le bactériophage rapporteur ; - à l'aide d'un bactériophage rapporteur marqué par un Quantum-Dot (QD) colloïdal, qui est une sonde fluorescente consistant en des nanocristaux inorganiques semi-conducteurs ; le marquage des bactériophages nécessitent de les modifier génétiquement afin qu'ils expriment une protéine de capside fusionnée à un peptide qui est biotinylé in vivo pour interagir avec un QD fonctionnalisé à l'aide de streptavidine (Edgar et al. 2006 [2] ; Yim et al. 2009 [3]) ; - via des signaux liés à la lyse de la bactérie hôte consécutive à l'infection phagique, tels que des constituants intracellulaires de l'hôte (enzyme adenylate kinase) ou des ions relargués au moment de la lyse ; - à l'aide d'une amplification phagique, tel que décrit de manière plus détaillée ci-dessous. Lorsque des bactériophages sont ajoutés à une culture de bactéries hôtes susceptibles aux bactériophages, l'infection conduit à la formation de nombreuses particules phagiques néoformées qui sont relarguées dans le milieu. Différentes méthodes sont utilisées pour détecter les particules phagiques néoformées. Parmi elles, la visualisation de plages de lyse sur milieux de culture en boite de Petri (phage amplification assay) passe par un protocole en 4 étapes : étape 1) ajout des bactériophages à l'échantillon et infection de bactéries hôtes si elles sont présentes, étape 2) avant lyse des bactéries hôtes consécutive à l'infection, ajout d'un virucide pour inactiver les bactériophages restés libres dans le milieu extracellulaire, étape 3) neutralisation du virucide et ajout d'une population de bactéries hôtes saines auxiliaires (helper ou sensor ou signal-amplifying cells) qui seront rapidement infectées par les bactériophages néoformés issus de la lyse des bactéries de l'échantillon, étape 4) amplification du processus par infection des bactéries auxiliaires et visualisation via la formation de plages de lyse sur un tapis bactérien. Cette méthode est utilisée par la société Biotec Laboratories (Ipswich, UK) qui commercialise des tests pour la détection (FastPlaqueTBTM diagnostic assay) ou la susceptibilité à la rifampicine (FastPlaque- ResponseTM diagnostic assay) de Mycobacterium tuberculosis [4,5,6]. Une alternative utilise une étape de séparation immuno-magnétique (billes magnétiques sensibilisées avec un anticorps anti-bactérie) des cellules cibles pour éviter l'emploi de virucides (étape 2), qui peuvent être problématiques à cause de leur efficacité non-universelle. La séparation immuno-magnétique permet de concentrer les cellules cibles avant leur infection par le bactériophage et de réaliser des lavages pour éliminer les bactériophages restés libres en solution après l'infection (Favrin et al. 2001 [7]). Comme alternative à la visualisation des plages de lyse (étape 4), les mêmes auteurs utilisent une lecture de densité optique (DO) de la culture liquide des bactéries auxiliaires (diminution de la DO en cas de lyse par les bactériophages). Ce nouveau type de test a été utilisé pour des matrices alimentaires artificiellement contaminées par des bactéries (Salmonella enteritidis ou Escherichia coli 0157:H7) (Favrin et al. 2003 [8]). D'autres adaptations des tests fondés sur l'amplification phagique ont été décrites en détectant non plus les particules phagiques entières, mais des constituants du bactériophage tels que l'ADN génomique ou les protéines structurales. Sergueev et al. (2010) [9] ont décrit le suivi de l'augmentation des particules phagiques néoformées par PCR quantitative en temps réel à l'aide d'amorces ciblant le génome du bactériophage. Madonna et al. (2003) [10] ont décrit l'identification de la protéine de capside du bactériophage MS2 par spectrométrie de masse MALDI-TOF pour la détection d'E. coll. De plus, Rees et Voorhees (2005) [11] ont décrit la détection simultanée par MALDI- TOF d'E. coli et Salmonella en suivant les signatures protéiques spécifiques (protéines de capside) de leurs bactériophages respectifs. MicroPhage Inc. [12,13,14] a également développé une série de tests pour l'identification et la susceptibilité aux antibiotiques de Staphylococcus aureus reposant sur la détection rapide par immunoessais (test bandelette) des protéines de bactériophages néoformés. Ces dernières techniques d'analyse présentent néanmoins des inconvénients. En effet, afin de ne pas induire de faux-positifs pour les méthodes de détection couplant l'amplification phagique et la spectrométrie de masse, il est nécessaire de pouvoir distinguer les bactériophages injectés pour initier l'infection bactérienne (bactériophages parents) de ceux qui sont produits (bactériophages néoformés) par l'infection de la bactérie cible. Ainsi, le document WO-A-03/087772 décrit l'utilisation de bactériophages taggués (protéine de capside biotinylée) pour la détection de bactéries. Ces bactériophages taggués induisent une différence de masse entre les bactériophages/marqueurs parents et les bactériophages/marqueurs néoformés. Ce marquage permet d'utiliser une quantité importante de bactériophages parents ce qui favorise l'infection dans le cas où il y a peu de bactéries hôtes présentes dans l'échantillon biologique, et permet donc de diminuer la limite de détection. Par ailleurs, Pierce et al. (2011) [15] décrit l'utilisation d'une solution de bactériophages marqués à l'isotope stable 15N pour initier l'infection bactérienne (phages parents) ; le marquage de ces phages a été préalablement obtenu en les faisant croître dans un milieu ne contenant que l'isotope stable 15N. L'infection de la bactérie cible se fait dans un milieu de culture classique composé de 14N et chaque bactérie infectée produit des particules virales constituées de protéine comportant du 14N. Par conséquent, il est possible de distinguer les bactériophages parents, dont les protéines sont marquées au 15N, des bactériophages néoformés, dont les protéines contiennent du 14N. Si ces techniques permettent effectivement d'éviter les résultats faux-positifs du fait de la différentiation entre la population de bactériophages utilisée pour l'infection et celle de bactériophages néoformés, elles présentent pour autant des inconvénients liés à la nécessité de passer par cette étape de marquage préalable de la population de bactériophages servant à l'infection, qui est souvent lourde à mettre en oeuvre. Un autre moyen permettant d'éviter d'obtenir des résultats faussement positifs, consiste dans l'utilisation d'une quantité de bactériophages parents (destinés à l'infection des bactéries cibles) inférieure à la limite de détection de l'instrument de spectrométrie de masse. Ainsi, lors de l'analyse, les bactériophages détectés par spectrométrie de masse sont forcément les bactériophages néoformés lors de l'infection bactérienne. Une telle technique est décrite dans les publications Madonna et al. (2003) [10] et Rees et Voorhees (2005) [11]. Madonna et al. (2003) [10] décrit une méthode de détection basée sur l'amplification de bactériophages couplée à la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Leur méthodologie comprend trois étapes : 1) Concentration des bactéries par séparation immuno-magnétique, 2) Infection des bactéries isolées par un bactériophage lytique, 3) Détection de l'amplification du signal dû à l'amplification des bactériophages par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Le bactériophage utilisé dans cette étude est le virus MS2, dont le génome code pour seulement 4 protéines. Son cycle viral lytique génère entre 10000 et 20000 particules virales néoformées en 40 min. Le spectre MALDI-TOF de 1.109 UFP (Unité Format Plage) de bactériophage MS2 (solution stock) montre un signal correspondant à la protéine de capside du bactériophage MS2. Une série de dilution au 1:10 a permis de déterminer la limite de détection de ce marqueur à 1.106 UFP. Par conséquence, dans leur protocole d'infection les auteurs utilisent une quantité initiale de bactériophage parents de 1.105 UFP inférieure à la limite de détection du marqueur par le spectromètre de masse MALDI-TOF. Ainsi, le signal du marqueur ne devient détectable que si l'amplification du bactériophage a eu lieu suite à l'infection de la bactérie hôte. Rees et Voorhees (2005) [11] décrivent une méthode de détection basée également sur l'amplification de bactériophages couplée à la spectrométrie de masse MALDI-TOF. À la différence de Madonna et al. (2003) [10], cette méthode ne comprend pas de séparation immuno-magnétique des bactéries en amont de l'infection par le bactériophage et ne s'avère pas particulièrement sensible. En revanche, elle permet de détecter simultanément la présence de deux espèces bactériennes présentes dans un même échantillon grâce à l'amplification de deux bactériophages, chacun spécifique d'une des deux espèces. Les signaux correspondants aux protéines majoritaires de capsides des deux bactériophages sont détectés par MALDI-TOF. La présence de plusieurs espèces de bactéries et bactériophages n'induit pas d'effets particuliers sur la détection des marqueurs. Les modèles étudiés par cette équipe sont Escherichia coli/bactériophage MS2 et 5 Salmonella spp./bactériophage MPSS-1. 1.105 UFC (Unité formant colonie)/mL de chaque espèce bactérienne sont détectées par la méthode décrite. L'utilisation d'une quantité de bactériophages parents inférieure à la limite de détection de l'instrument présente comme inconvénient majeur d'allonger sensiblement la durée d'incubation. En effet, comme la quantité de bactériophages parents est 10 relativement faible, il est nécessaire de prolonger l'incubation afin d'obtenir un niveau d'infection des bactéries tel que la quantité de bactériophages néoformés soit supérieure à la limite de détection de l'instrument. Dans ce contexte, l'objectif de la présente invention est de proposer un procédé de 15 détection/caractérisation de bactéries basée sur une amplification phagique, facile à mettre en oeuvre et permettant d'obtenir des résultats d'analyse dans des temps compatibles avec les besoins des laboratoires d'analyse. Ainsi la présente invention concerne un procédé de caractérisation d'au moins une 20 bactérie, présente dans un échantillon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou des bactérie(s) à caractériser ; b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) 25 avec ladite ou lesdites bactérie(s) à caractériser et, éventuellement, au moins un antimicrobien ; c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ; d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non- 30 structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de caractériser ladite ou lesdites bactérie(s). Par caractérisation, on entend l'identification de ladite ou des bactérie(s) et/ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien. La présente invention concerne également un procédé d'identification d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou des bactérie(s) à identifier ; b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) à identifier ; c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ; d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non- structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de confirmer l'identification de ladite ou desdites bactérie(s). La présente invention concerne en outre un procédé de détermination des propriétés de résistance potentielle à un antimicrobien, d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou des bactérie(s) dont les propriétés de résistance potentielle à un antimicrobien doivent être déterminer; b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) et au moins un antimicrobien ; c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ; d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non-structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de confirmer la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) audit au moins un antimicrobien. Selon un mode particulier de l'invention, le procédé comporte une étape supplémentaire c') de lyse des bactéries. En effet, les bactériophages sont classés en deux populations : - Les bactériophages lytiques qui ont la capacité de lyser les cellules qu'ils ont infectées pour permettre la libération des particules virales néoformées, mais également des protéines non-structurales, dans l'environnement extérieur. - Les bactériophages tempérés qui n'engendrent pas de lyse des cellules hôtes, lors de la libération des particules virales néo-formées. Ces particules sortent par extrusion de la membrane bactérienne, et les protéines non-structurales du bactériophage sont conservées au sein de la cellule bactérienne. Dans le cas de cette seconde population, il est donc nécessaire de prévoir dans le procédé selon l'invention, une étape de lyse des bactéries hôtes après un temps nécessaire à l'infection et à la production des nouvelles particules virales, afin de libérer les protéines non-structurales dans l'environnement extérieur et permettre leur détection subséquente. De façon préférentielle, la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages est mise en oeuvre par spectrométrie de masse. La spectrométrie de masse utilisée est une spectrométrie de type MS, MS/MS ou MS suivie d'une spectrométrie de type MS/MS. Avantageusement, la spectrométrie de masse est une spectrométrie de type MRM. Selon un mode de réalisation alternatif, la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages peut être mise en oeuvre par une réaction ligand/antiligand. Par réaction ligand/anti-ligand, on entend un réaction entre deux partenaires de liaison spécifiques. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, la réaction ligand/anti-ligand est une réaction antigène/anticorps. L'antigène est ici constitué par une protéine non-structurale ou un ou plusieurs peptides issus de ladite protéine, contre lesquels auront été produits des anticorps. Avantageusement, l'anticorps est conjugué à un marqueur permettant de mettre en évidence la réaction antigène-anticorps. Ces techniques de détection dites immunoessais sont bien connus du biologiste et depuis de nombreuses années. La détection des protéines non-structurales peut par exemple être mise en oeuvre par un test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire c") de concentration ou de fractionnement des protéines non-structurales, avant l'étape de détection. Une telle étape de concentration permet d'augmenter la sensibilité de détection, dans la mesure où les protéines sont isolées du milieu complexe dans lequel a eu lieu la lyse. Avantageusement, la concentration est réalisée au moyen de billes magnétiques ajouté au milieu réactionnel. Des telles billes peuvent être à titre d'exemple, celles commercialisées par la société ADEMTECH sous la dénomination commerciale Carboxylic Adembeads. Le fractionnement peut être par exemple réalisé en insérant dans le milieu réactionnel des anticorps qui reconnaissent spécifiquement les bactériophages présents dans le milieu. Ces anticorps peuvent être fixés sur des particules magnétiques, de sorte qu'ils peuvent être éliminés du milieu réactionnel. Il est alors possible de récupérer directement dans le milieu réactionnel (surnageant), les protéines solubles dont font partie les protéines non-structurales. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comporte une étape supplémentaire b') de capture spécifique de la ou desdites bactéries préalablement à l'étape d'infection. Cette étape de capture spécifique a pour but de concentrer les bactéries cibles et éventuellement de les laver, améliorant ainsi la limite de détection. Une telle étape de capture spécifique peut ainsi être réalisée par séparation immuno-magnétique (IMS). Une telle technique de séparation est notamment décrite dans le document WO-A-03/087772. Un autre moyen permettant de capturer spécifiquement la ou lesdites bactéries consiste dans l'utilisation d'un composant phagique tel que décrit supra (cf page 2). Selon un autre mode particulier du procédé selon l'invention, les protéines non- structurales de bactériophages sont prises dans le groupe comprenant les protéines dll, motB du bactériophage T4. Néanmoins, toute protéine codée par le génome du bactériophage mais n'entrant pas dans la composition de la particule virale peut également être utilisée. Selon un autre mode particulier du procédé selon l'invention, l'identification de ladite ou des bactérie(s) et/ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien, met en oeuvre au moins un peptide de séquence SEQ ID N°2, 3, 5 ou 6. Avantageusement, la ou les bactérie(s) caractérisée(s) par le procédé selon l'invention, sont obtenues à partir d'un milieu de culture, préférentiellement liquide. Un autre objet de la présente invention concerne un peptide de séquence SEQ ID N°2, 3, 5 ou 6. Par détermination de la résistance à au moins un antimicrobien, on entend la détermination de la résistance d'un microorganisme à être détruit par un antimicrobien. Ainsi, si le microorganisme est une bactérie, l'antimicrobien contre lequel il peut développer une résistance est un antibiotique. Dans le procédé selon l'invention, la détection des protéines non-structurales de bactériophage constitue une détermination indirecte de la résistance de la bactérie cible du bactériophage à un antibiotique particulier. En effet, lorsque la bactérie possède les mécanismes de résistance audit antibiotique, la présence dudit antibiotique n'a aucune incidence sur la croissance bactérienne et n'entraîne pas la destruction des bactéries. Les bactériophagessont donc en mesure d'infecter ces dernières. Il s'ensuit donc une production des protéines non- structurales lors de la multiplication des bactériophages ; les dites protéines non- structurales pouvant alors être détectées par le procédé selon l'invention. A contrario, lorsque les bactéries sont sensibles à l'antibiotique, elles sont détruites par ce dernier, empêchant l'infection des bactéries par le bactériophage. L'échantillon sur lequel le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre est tout échantillon susceptible de contenir un microorganisme cible. L'échantillon peut être d'origine biologique, soit animale, végétale ou humaine. Il peut alors correspondre à un prélèvement de fluide biologique (sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo- rachidien, sécrétion organique, par exemple), un prélèvement tissulaire ou des cellules isolées. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel, ou peut subir préalablement à l'analyse, une préparation de type enrichissement, extraction, concentration, purification, culture, selon des méthodes connues de l'homme du métier. L'échantillon peut être d'origine industrielle, soit, selon une liste non exhaustive un prélèvement d'air, un prélèvement d'eau, un prélèvement effectué sur une surface, une pièce ou un produit manufacturé, un produit d'origine alimentaire. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produit lacté (yaourts, fromages), de viande, de poisson, d'oeuf, de fruit, de légume, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc). Ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats élaborés. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment des farines animales. En amont de la détection par spectrométrie de masse, l'échantillon à analyser est préférentiellement traité au préalable pour générer des peptides à partir de l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon pour fragmenter ces protéines en peptides, par exemple par digestion avec une enzyme protéolytique (protéase), ou par action d'un réactif chimique. En effet, le clivage des protéines peut être fait par un traitement physico-chimique, par un traitement biologique ou par une combinaison des deux traitements. Parmi les traitements utilisables, on peut citer le traitement par des radicaux hydroxyle, notamment avec de l'H202. Le traitement par les radicaux hydroxyle provoque une coupure des liaisons peptidiques qui se fait de manière aléatoire sur n'importe quelle liaison peptidique de la protéine. La concentration en radicaux hydroxyle conditionne le nombre de clivages opérés et donc la longueur des fragments peptidiques obtenus. D'autres traitements chimiques peuvent également être utilisés comme, par exemple, le traitement au bromure de cyanogène (CNBr) qui scinde spécifiquement les liaisons peptidiques au niveau du groupe carboxylique des résidus méthionyle. Il est également possible de réaliser un clivage acide partiel au niveau des résidus aspartyle par chauffage à 1000°C d'une solution de protéines dans de l'acide trifluoro ac étique . Le traitement des protéines par digestion enzymatique est néanmoins préféré par rapport au traitement physico-chimique car il préserve davantage la structure des protéines, et est plus facile à contrôler. Par « digestion enzymatique », on entend l'action simple ou combinée d'une ou de plusieurs enzymes dans des conditions de réaction appropriées. Les enzymes effectuant la protéolyse, appelées protéases, coupent les protéines à des endroits spécifiques. Chaque protéase reconnaît généralement une séquence d'acides aminés au sein desquels elle effectue toujours la même coupure. Certaines protéases reconnaissent un seul acide aminé ou une séquence de deux acides aminés entre lesquels elles opèrent un clivage, d'autres protéases ne reconnaissent que des séquences plus longues. Ces protéases peuvent être des endoprotéases ou des exoprotéases. Parmi les protéases connues on peut citer, comme décrit dans le document WO-A-2005/098071 : - les enzymes spécifiques comme la trypsine qui scinde la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus Arg et Lys, l'endolysine qui clive la liaison peptidique du groupe -CO des lysines, la chymotrypsine qui hydrolyse la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la pepsine qui coupe au niveau du groupe NH2 des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la protéase V8 de la souche V8 de Staphylococcus aureus qui clive la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique du résidu Glu ; - les enzymes non-spécifiques comme la thermolysine provenant de la bactérie Bacillus thermoproteolyticus qui hydrolyse la liaison peptidique du groupe NH2 des acides aminés hydrophobes (Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe), la subtilisine et la pronase qui sont des protéases bactériennes qui hydrolysent pratiquement toutes les liaisons et peuvent transformer les protéines en oligopeptides dans des conditions de réaction contrôlées (concentration en enzyme et durée de réaction). Plusieurs protéases peuvent être utilisées de façon simultanée, si leurs modes d'action sont compatibles, ou elles peuvent être utilisées de façon successive. Dans le cadre de l'invention, la digestion de l'échantillon est, de préférence, réalisée par action d'une enzyme protéase, par exemple la trypsine. La génération de peptides à l'aide d'un réactif chimique ou d'une protéase, peut être obtenu par simple réaction en solution. Elle peut également être mise en oeuvre avec un four à micro-ondes [16], ou sous pression [17], ou bien encore avec un dispositif à ultrasons [18]. Dans ces trois derniers cas, le protocole sera beaucoup plus rapide. Parmi les peptides ainsi obtenus, les peptides spécifiques de la protéine, sont nommés peptides protéotypiques. Ce sont eux qui seront dosés par spectrométrie de masse. De même, l'échantillon contenant des marqueurs de caractérisation d'origine protéique peut également être préalablement traité à des fins de purification. Lorsque les marqueurs sont d'origine protéique, ce traitement préalable de purification peut être mis en oeuvre avant ou après l'étape de génération de peptides tels que décrits précédemment. Le traitement préalable de purification d'échantillon est largement connu de l'homme du métier et pourra notamment mettre en oeuvre des techniques de centrifugation, de filtration, d'électrophorèse ou de chromatographie. Ces techniques séparatives peuvent être utilisées seules ou combinées entre elles pour obtenir une séparation multidimensionnelle. Par exemple, une chromatographie multidimensionnelle peut être utilisée en associant une séparation par chromatographie d'échange d'ions à une chromatographie en phase inverse, comme décrit par T. Fortin et al. [19], ou H. Keshishian et al. [20]. Dans ces publications, le milieu chromatographique peut être en colonne ou en cartouche (extraction en phase solide). La fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des peptides protéotypiques est caractéristique de chaque peptide et la mise en oeuvre de ces techniques permet donc de sélectionner le ou les peptides protéotypiques à doser. Un tel fractionnement des peptides générés permet d'accroître la spécificité et la sensibilité du dosage ultérieur par spectrométrie de masse. La spectrométrie de masse à mettre en oeuvre dans le procédé de l'invention est largement connue de l'homme du métier comme un outil puissant pour l'analyse et la détection de différents types de molécules. De façon générale, tout type de molécule pouvant être ionisée peut être détecté en fonction de sa masse moléculaire à l'aide d'un spectromètre de masse. Selon la nature de la molécule à détecter, d'origine protéique ou métabolique, certaines technologies de spectrométrie de masse peuvent être plus adaptées. Néanmoins, quelle que soit la méthode de spectrométrie de masse utilisée pour la détection, cette dernière comprend une étape d'ionisation de la molécule cible en ions dits moléculaires, dans le cas présent une étape d'ionisation des marqueurs de caractérisation, et une étape de séparation des ions moléculaires obtenus en fonction de leur masse. Tous les spectromètres de masse comportent donc : i) une source d'ionisation destinée à ioniser les marqueurs présents dans l'échantillon à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces marqueurs; ii) un analyseur de masse destiné à séparer les marqueurs ionisés, ou ions moléculaires, en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ; iii) un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci-après. L'étape d'ionisation nécessaire pour la mise en oeuvre d'une spectrométrie de masse peut être mise en oeuvre par tout procédé connu de l'homme du métier. La source d'ionisation permet d'amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer, notamment : - l'ionisation électronique (EI), l'ionisation chimique (CI) et la désorption-ionisation chimique (DCI) - le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS) - le couplage plasma inductif (ICP) - l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI) - l'électronébulisation ou électrospray (ESI) -la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une 30 surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS) - l'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART) Notamment, l'ionisation peut être mise en oeuvre comme suit : l'échantillon contenant les molécules cibles est introduit dans une source d'ionisation, où les molécules sont ionisées à l'état gazeux et ainsi transformées en ions moléculaires qui correspondent aux molécules initiales. Une source d'ionisation de type électrospray (ESI pour ElectroSpray Ionisation) permet d'ioniser une molécule tout en la faisant passer d'un état liquide à un état gazeux. Les ions moléculaires obtenus correspondent alors aux molécules présentes à l'état liquide, avec en mode positif un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Par exemple, lorsque la molécule cible est une protéine, une ionisation des peptides protéotypiques obtenus après fractionnement de la protéine cible, grâce à une source de type électrospray fonctionnant en mode positif, conduit à des ions multichargés à l'état gazeux, avec un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et qui sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus, et permet un passage d'un état liquide à un état gazeux [21]. Ce type de source est particulièrement bien adapté, lorsque les molécules cibles ou peptides protéotypiques obtenus sont préalablement séparées par chromatographie liquide en phase inverse. Néanmoins, le rendement d'ionisation des molécules présentes dans l'échantillon peut varier en fonction de la concentration et de la nature des différentes espèces en présence. Ce phénomène se traduit par un effet matrice bien connu de l'homme de l'art. Une source d'ionisation MALDI permettra d'ioniser des molécules, à partir d'un échantillon à l'état solide. L'analyseur de masse dans lequel est mis en oeuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupôle (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment un secteur magnétique (FT-ICR) un appareil à temps de vol (TOF) ou un Orbitrap. La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être 30 mise en oeuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS ou MS2. Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS/MS ou MS3 et plus généralement, lorsque n séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS'. Parmi les techniques mettant en oeuvre plusieurs séparations successives, les modes SRM (Selected Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage d'une seule molécule cible, ou bien MRM (Multiple Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage de plusieurs molécules cibles, sont des utilisations particulières de séparation MS2. De même le mode MRM3 est une utilisation particulière de séparation en MS/MS/MS. On parle alors de spectrométrie de masse ciblée. Dans le cas d'une détection en mode MS simple, c'est le rapport masse/charge des ions moléculaires obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter. Dans le cas d'une détection en mode MS/MS, essentiellement deux étapes sont ajoutées, par rapport à un dosage MS qui sont : i) une fragmentation des ions moléculaires, alors appelés ions précurseurs, pour donner des ions dit ions fragments de lere génération, et ii) une séparation des ions dit ions fragments de lere génération en fonction de leur masse (m/z)2, le rapport (m/z)i correspondant au rapport (m/z) des ions précurseurs. C'est alors le rapport masse/charge des ions fragments de lere génération ainsi obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter. Par ion fragment de première génération, on entend un ion issu de l'ion précurseur, suite à une étape de fragmentation et dont le rapport masse sur charge m/z est différent de l'ion précurseur. Les couples (m/z)i et (m/z)2 sont baptisés transitions et sont représentatifs des ions caractéristiques à détecter. Le choix des ions caractéristiques qui sont détectés pour être corrélés à la molécule cible est effectué par l'homme du métier selon les méthodes standards. Leur sélection conduira avantageusement aux dosages les plus sensibles, les plus spécifiques et les plus robustes possibles, en termes de reproductibilité et fiabilité. Dans les méthodes développées pour la sélection de peptides protéotypiques (m/z)i, et de fragment de première génération (m/z)2, le choix est essentiellement basé sur l'intensité de la réponse. Pour plus de détails, on pourra se référer à V. Fusaro et al. [22]. Des logiciels commerciaux, tels que les logiciels MIDAS et MRM Pilote d'Applied Biosytems ou encore MRMaid [23] pourront être utilisés par l'homme de l'art pour lui permettre de prédire tous les couples de transitions possibles. Il pourra également être fait appel à une base de données nommée PeptideAtlas, construite par F. Desiere et al. [24] pour compiler l'ensemble des transitions MRM de peptides décrites par la communauté scientifique. Cette base PeptideAtlas est disponible en accès libre sur internet. Pour des molécules non protéiques, il est également possible d'utiliser des bases de données, telles que par exemple celle accessible au travers du logiciel Cliquid de la société Applied Biosytems (Etats Unis d'Amérique). La fragmentation des ions précurseurs sélectionnés est mise en oeuvre dans une cellule de fragmentation telle que les modèles de type triple quadripôle [25], ou de type trappe ionique [26], ou encore de type temps de vol (TOF) [27], lesquels permettent également la séparation des ions. La ou les fragmentations seront classiquement réalisées par collision avec un gaz inerte tel que l'argon ou l'azote, au sein d'un champ électrique, par photo-excitation ou photodissociation à l'aide d'une source lumineuse intense, collision avec des électrons ou espèces radicalaires, par application d'une différence de potentiel, par exemple dans un tube de temps de vol, ou par tout autre mode d'activation. Les caractéristiques du champ électrique conditionnent l'intensité et la nature de la fragmentation Ainsi, le champ électrique appliqué en présence d'un gaz inerte, par exemple dans un quadripôle, conditionne l'énergie de collision apportée aux ions. Cette énergie de collision sera optimisée, par l'homme du métier, pour accroître la sensibilité de la transition à doser. A titre d'exemple, il est possible de faire varier l'énergie de collision entre 5 et 180 e-V en q2 dans un spectromètre de masse AB SCIEX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems (Foster City, Etats Unis d'Amérique). De même, la durée de l'étape de collision et l'énergie d'excitation au sein, par exemple, d'une trappe ionique seront optimisées, par l'homme du métier, pour conduire au dosage le plus sensible. A titre d'exemple, il est possible de faire varier cette durée, baptisée temps d'excitation, entre 0,010 et 50 ms et l'énergie d'excitation entre 0 et 1 (unité arbitraire) en Q3 dans un spectromètre de masse AB SCIEX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems. Enfin, la détection des ions caractéristiques sélectionnés se fait de façon 30 classique, notamment grâce à un détecteur et à un système de traitement. Le détecteur collecte les ions et produit un signal électrique dont l'intensité dépend de la quantité d'ions collectée. Le signal obtenu est ensuite amplifié pour qu'il puisse être traité informatiquement. Un ensemble informatique de traitement des données permet de transformer les informations reçues par le détecteur en spectre de masse. Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripôle ou des hybrides triple quadripôle à trappe ionique sont généralement utilisés. Dans le cas d'un dispositif triple quadripôle (Q1q2Q3) utilisé en mode MS2, en vue du dosage ou de la détection d'une protéine cible, le premier quadripôle (Q1) permet de filtrer les ions moléculaires, correspondant aux peptides protéotypiques caractéristiques de la protéine à doser et obtenus lors d'une étape antérieure de digestion, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Seuls les peptides ayant le ratio masse/charge du peptide protéotypique recherché, ratio appelé (m/z)i, sont transmis dans le deuxième quadripôle (q2) et jouent le rôle d'ions précurseurs pour la fragmentation ultérieure. L'analyseur q2 permet de fragmenter les peptides de ratio masse/charge (m/z)i en ions fragments de première génération. La fragmentation est généralement obtenue par collision des peptides précurseurs avec un gaz inerte, comme de l'azote ou de l'argon dans q2. Les ions fragments de première génération sont transmis dans un troisième quadripôle (Q3) qui filtre les ions fragments de première génération en fonction d'un ratio masse sur charge spécifique, ratio appelé (m/z)2. Seuls les ions fragments de première génération ayant le ratio masse/charge d'un fragment caractéristique du peptide protéotypique recherché (m/z)2 sont transmis dans le détecteur pour être détectés, voire quantifiés. Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, en relation avec la sélection de l'ion précurseur d'une part et de la sélection de l'ion fragment de première 25 génération d'autre part. La spectrométrie de masse en mode SRM ou MRM est donc avantageuse pour la quantification Lorsque la spectrométrie de masse mise en oeuvre dans le procédé de l'invention est une spectrométrie de masse en tandem (M52, MS3, MS4 ou MS5), plusieurs analyseurs de masse peuvent être couplés entre eux. Par exemple, un premier 30 analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement. L'identification peut être mise en oeuvre directement à partir de l'échantillon dans lequel on effectue l'identification, ou bien les microorganismes contenus dans l'échantillon peuvent être cultivés par des méthodes bien connues de l'homme du métier avec des milieux de culture et des conditions de culture optimales adaptées en fonction des espèces de microorganismes à rechercher, comme décrit par Murray P.R. et al. dans Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9' édition, Vol. I, Section III, chapitre 14, et en particulier dans le Vol. I, Section IV, chapitre 21 pour les bactéries, Vol. II, Section VI, chapitre 81 pour les virus, Vol. II, Section VIII, chapitre 117 pour les levures, et Vol. II, Section X, chapitre 134 pour les protozoaires. Au lieu de cultiver les microorganismes, ces derniers peuvent être concentrés par capture directement dans l'échantillon au moyen de surfaces actives. Un tel procédé a été décrit par W.-J. Chen et al. [16] qui ont capturé différentes espèces bactériennes à l'aide de billes magnétiques avec une surface activée au Fe304/Ti02. Une capture par d'autres moyens est également possible, telle qu'une capture par des lectines [28], ou par des anticorps [29], ou encore par de la Vancomycine [30]. La capture permet de concentrer les microorganismes et ainsi de réduire ou même de supprimer l'étape de culture. Il s'en suit un gain de temps considérable. L'identification peut également être mise en oeuvre par spectrométrie de masse, selon les techniques décrites précédemment, de préférence par MS, par MS/MS, ou bien par MS suivie d'une spectrométrie de type MS/MS, ce qui constitue un mode de réalisation de l'invention. Dans ce cas également, l'échantillon peut être soumis préalablement à une étape de culture telle qu'un ensemencement sur gélose. L'utilisation d'un procédé d'identification par MS est avantageux car il peut être réalisé en quelques minutes et qu'il nécessite un spectromètre de masse avec un seul analyseur, c'est à dire un instrument moins complexe qu'un spectromètre de masse 30 en tandem utilisé en MS/MS. L'utilisation d'un procédé d'identification par MS suivi d'une spectrométrie de type MS/MS est également avantageuse. Elle permet de s'assurer de l'identité des ions observé en MS, ce qui augmente la spécificité de l'analyse. L'utilisation d'un procédé d'identification par MS/MS de type MRM présente l'avantage d'être plus sensible et plus simple que les approches MS puis MS/MS traditionnelle. Ce procédé ne nécessite ni logiciel performant pour traiter l'information entre l'acquisition du spectre MS et du spectre MS/MS, ni changement du réglage des paramètres machines pour enchaîner des spectres MS puis MS/MS. Le procédé d'identification par MS peut être mis en oeuvre avec une source électrospray sur échantillon brut, comme décrit par S. Vaidyanathan et al. [31] ou encore par R. Everley et al. [32] après séparation chromatographique. Différentes gammes de m/z permettent alors d'identifier les microorganismes. S. Vaidyanathan et al. ont utilisé une fenêtre entre 200 et 2000 Th et R. Everley et al. une fenêtre entre 620 et 2450 Th. Les spectres de masse peuvent également être déconvolués pour accéder à la masse des protéines indépendamment de leur état de charge. R. Everley et al. ont ainsi exploité les masses entre environ 5 000 et 50 000 Da. De façon alternative, le procédé d'identification par MS peut être également mis en oeuvre à l'aide d'un MALDI-TOF, comme décrit par Claydon et al [33] et T. Krishnamurthy et P. Ross [34]. L'analyse associe l'acquisition d'un spectre de masse et l'interprétation d'un logiciel expert. Elle est extrêmement simple et peut être effectuée en quelques minutes. Ce procédé d'identification se répand actuellement dans les laboratoires d'analyse médicale [35]. L'identification de bactéries par MS puis MS/MS via leurs protéines présentes dans l'échantillon, a été largement appliquée par de nombreuses équipes. A titre d'exemple, il est possible de citer les travaux récents de Manes N. et al. [36] qui ont étudié le peptidome de Salmonelle enterica, ou les travaux de R. Nandakumar et al. [37] ou de L. Hernychova et al. [38] qui ont étudié le protéome de bactéries après digestion des protéines avec de la trypsine. L'approche classique consiste à i) acquérir un spectre MS, ii) sélectionner successivement chaque ion précurseur observé sur le spectre MS avec un signal intense, iii) fragmenter successivement chaque ion précurseur et acquérir son spectre MS/MS, iv) interroger des bases de données protéiques telles que SWISSPROT ou NCBI, aux travers de logiciels tels que Mascot (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni), BioworksBrowser (Thermo Fisher Scientific) ou SEQUEST (Thermo Scientific, Waltham, Etats-Unis d'Amérique), pour identifier le peptide ayant une forte probabilité de correspondre au spectre MS/MS observé. Cette méthode peut conduire à l'identification d'un microorganisme si une protéine ou un peptide caractéristique de l'espèce est identifié. Un des avantages de l'utilisation de la spectrométrie de masse réside en ce qu'elle est particulièrement utile pour quantifier des molécules, dans le cas présent les marqueurs des propriétés de typage, résistance à au moins un antimicrobien. Pour ce faire, on utilise l'intensité de courant détectée, laquelle est proportionnelle à la quantité de molécule cible. L'intensité de courant ainsi mesurée pourra servir de mesure quantitative permettant de déterminer la quantité de molécule cible présente, laquelle est caractérisée par son expression en unités du Système International (SI) de type mol/m3 ou kg/m3, ou par les multiples ou sous-multiples de ces unités, ou par les dérivées usuelles des unités SI, y compris leurs multiples ou sous-multiples. A titre d'exemple non limitatif, les unités telles que ng/ml ou fmo1/1 sont des unités caractérisant une mesure quantitative. Un calibrage est néanmoins nécessaire pour pouvoir corréler l'aire du pic mesurée, correspondant à l'intensité de courant induit par les ions détectés, à la quantité de molécule cible à doser. Pour cela, les calibrages classiquement utilisés en spectrométrie de masse pourront être mis en oeuvre, dans le cadre de l'invention. Les dosages MRM sont classiquement calibrés à l'aide de standards externes ou, de préférence, à l'aide de standards internes tels que décrits par T. Fortin et al. [19]. Dans le cas où la molécule cible est un peptide protéotypique, permettant de doser une protéine d'intérêt, la corrélation entre la mesure quantitative et la quantité de peptide protéotypique cible, et par la suite de protéine d'intérêt, est obtenue en étalonnant le signal mesuré par rapport à un signal étalon pour lequel la quantité à doser est connue. L'étalonnage peut être réalisé au moyen d'une courbe d'étalonnage, par exemple obtenue par injections successives de peptide protéotypique étalon à différentes concentrations (étalonnage externe), ou de façon préférentielle, par étalonnage interne en utilisant un peptide lourd, comme standard interne, par exemple conformément aux méthodes AQUA, QconCAT ou PSAQ détaillées ci-après. Par « peptide lourd », on entend un peptide correspondant au peptide protéotypique, mais dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone 12 (12C) est (sont) remplacé(s) par du carbone 13 (13C), et/ou un ou plusieurs atomes d'azote 14 (14N) est (sont) remplacé(s) par de l'azote 15 (15N). L'utilisation de peptides lourds, comme standards internes (AQUA), a également été proposée dans la demande de brevet US 2004/0229283. Le principe est de synthétiser artificiellement des peptides protéotypiques avec des acides aminés comportant des isotopes plus lourds que les isotopes naturels usuels. De tels acides aminés sont obtenus, par exemple, en remplaçant certains des atomes de carbone 12 ('2C) par du carbone 13 (13C), ou en replaçant certains des atomes d'azote 14 (14N) par de l'azote 15 (15N). Le peptide artificiel (AQUA) ainsi synthétisé a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que le peptide naturel (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est généralement ajouté, à une concentration donnée, à l'échantillon, en amont du dosage par spectroscopie de masse, par exemple entre le traitement entrainant le clivage des protéines de l'échantillon d'intérêt et le fractionnement des peptides obtenus après l'étape de traitement. De ce fait, le peptide AQUA est co-purifié avec le peptide naturel à doser, lors du fractionnement des peptides. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour le dosage. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et AQUA, dont la concentration est connue, permet de calculer la concentration du peptide naturel et de remonter ainsi à la concentration de la protéine à doser. Une variante de la technique AQUA a été proposée par J.-M. Pratt et al. [39] sous le nom de QconCat. Cette variante est également décrite dans la demande de brevet WO 2006/128492. Elle consiste à concaténer différents peptides AQUA et à produire le polypeptide artificiel sous forme de protéine recombinante lourde. La protéine recombinante est synthétisée avec des acides aminés comportant des isotopes lourds. De cette façon, il est possible d'obtenir un standard pour calibrer le dosage simultané de plusieurs protéines à moindre coût. Le standard QconCAT est ajouté dès le début, en amont du traitement entrainant le clivage des protéines et avant les étapes de fractionnement des protéines, de dénaturation, de réduction puis de blocage des fonctions thiols des protéines, si celles-ci sont présentes. Le standard QconCAT subit donc le même cycle de traitement entrainant le clivage des protéines que la protéine naturelle, ce qui permet de tenir compte du rendement de l'étape de traitement entrainant le clivage des protéines. En effet, le traitement, notamment par digestion, de la protéine naturelle peut ne pas être complet. Dans ce cas l'utilisation d'un standard AQUA conduirait à sous-estimer la quantité de protéine naturelle. Pour un dosage absolu, il peut donc être important de tenir compte des rendements de traitement entrainant le clivage des protéines. Cependant, V. Brun et al. [40] ont montré que, parfois, les standards QconQAT ne reproduisaient pas exactement le rendement de traitement notamment par digestion de la protéine naturelle, sans doute du fait d'une conformation tridimensionnelle différente de la protéine QconCAT. V. Brun et al. [40] ont alors proposé d'utiliser une méthode baptisée PSAQ et décrite dans la demande de brevet WO 2008/145763. Dans ce cas, le standard interne est une protéine recombinante, ayant la même séquence que la protéine naturelle mais synthétisée avec des acides aminés lourds. La synthèse est réalisée ex-vivo avec des acides aminés lourds. Ce standard a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que la protéine naturelle (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est ajouté dès le début, avant l'étape de fractionnement des protéines, lorsque cette dernière est présente. Il est donc co-purifié avec la protéine native, lors de l'étape de fractionnement des protéines. Il présente le même rendement de traitement, notamment par digestion, que la protéine native. Le peptide lourd obtenu après clivage est également co-purifié avec le peptide naturel, si une étape de fractionnement des peptides est réalisée. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour être dosé quantitativement. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et des peptides de référence dans la méthode PSAQ permet de calculer la concentration de la protéine à doser en tenant compte de la totalité des étapes du procédé de dosage. L'ensemble de ces techniques, à savoir AQUA, QconCAT ou PSAQ ou toute autre technique de calibrage, utilisée dans des dosages par spectrométrie de masse et en particulier dans les dosages MRM ou MS, pourront être mises en oeuvre pour effectuer le calibrage, dans le cadre de l'invention.30 Selon l'invention, le procédé de caractérisation des bactéries met en oeuvre au moins un bactériophage spécifique de la bactérie à caractériser (identification et/ou propriétés de résistance potentielle à un ou plusieurs antimicrobiens). Par exemple, la caractérisation d'Escherichia coli B peut être mise en oeuvre au 5 moyen du bactériophage T4. En particulier, la caractérisation d'Escherichia coli B peut être mise en oeuvre par détection des protéines MI et motB du phage T4, qui sont des protéines non-structurales. Pour la protéine dII, la caractérisation d'Escherichia coli B peut mettre en oeuvre 10 la protéine complète de séquence SEQ ID N° 1 suivante : MIKQLQHALELQRAWNNGHENYGASIDVEAEALEILRYFKHLNPAQTAL AAELQEKDELKYAKPLASAARKAVRHFVVTLK 15 Elle peut également mettre en oeuvre au moins un peptide appartenant à la protéine dII de SEQ ID N° 2 et 3, tels que définis dans le tableau 2, ci-après : Peptide SEQ ID Séquence d'acides aminés Localisation dans SEQ ID N° N°1 2 QLQHALELQR 4-13 3 HLNPAQTALAAELQEK 42-57 Tableau 2 20 Pour la protéine motB, la caractérisation d'Escherichia coli B peut mettre en oeuvre la protéine complète de séquence SEQ ID N° 4 suivante : MIINIGELARVSDKSRSKAAGKLVEVVSIQLKHGVKDEDSEVKVRIIPKDG KSKPQFGYVRAKFLESAFLKAVPAKGIETIDTSHVGVDFKWKLGQAIKFIA 25 PCEFNFIKDDGRVVYTRAMCGYITDQWVEDGVKLYNVVFLGTYKVIPES WIKHYSNALYA Elle peut mettre en oeuvre au moins un peptide appartenant à la protéine motB de SEQ ID N° 5 et 6, tels que définis dans le tableau 3, ci-après : Peptide SEQ ID Séquence d'acides aminés Localisation dans SEQ ID N° N°4 MIINIGELAR 1-10 6 LYNVVFLGTYK 136-146 5 Tableau 3 Bien entendu, par au moins un peptide, on entend au moins un, au moins deux, au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins 6 ou plus peptides 10 représentatifs du marqueur qu'on veut détecter. De préférence, on utilisera au moins deux, voire au moins trois, voire au moins quatre peptides par caractéristique. Les peptides utiles aux fins de l'invention, de séquence SEQ ID N°2, 3, 5, 6, sont nouveaux et constituent un autre objet de l'invention. Le procédé de l'invention et ses avantages ressortiront de la suite de la présente 15 description relatant divers exemples non limitatifs de mise en oeuvre du procédé de l'invention. Exemple 1 : Identification de protéines non-structurales du bactériophage T4 comme marqueurs de l'infection bactérienne 20 Les marqueurs protéiques de l'infection ont été identifiés en centrifugeant les bactéries infectées non encore lysées. En effet, lors des étapes du cycle viral qui précèdent la lyse, les protéines phagiques sont toutes concentrées au sein de la bactérie hôte. Le culot bactérien est alors lysé chimiquement (protocole éthanol /acide formique, adapté de 25 Freiwald et Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc 4, 2009). Après une analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) haute-résolution (type Orbitrap), des protéines marqueurs de l'infection d'E. coli B par le bactériophage T4 ont pu être identifiées : protéines structurales et non-structurales. Paramètres de la chromatographie liquide : - Chaîne chromatographique Accela (Thermo Fisher Scientific) - Colonne Zorbax C18-300SB, 2.lmm de diamètre interne, 150mm de long, taille des particules 5itm (Agilent Technologies) - Solvant A : H2O - 0.1% acide formique - Solvant B : ACN - 0.1% acide formique - Gradient HPLC défini en tableau 4 ci-après : Temps (min) Débit (µL/min) Solvant A (%) Solvant B (%) 0 200 95 5 40 200 40 60 45 200 5 95 48 200 5 95 50 200 95 5 60 200 95 5 Tableau 4 L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans la source d'ionisation electrospray (ESI) du spectromètre de masse de type LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Fisher Scientific). Les paramètres machine utilisés sont les suivants : Polarité : positive Source électrospray (ESI) Tension de cône : 4000V Gas de nébulisation : 35 (unité arbitraire) Gas rideau : 10 (unite arbitraire) Gas auxiliaire : 20 (unite arbitraire)- Type de balayage : Balayage dépendant des données d'acquisition - Evènement de balayage 1 Gamme dynamique (m/z) : 200-2000 Résolution : 30000 Polarité : positive - Evènement de balayage 2: Balayage intelligent avec MS/MS des ions les plus intenses (répété pour les trois plus intenses)) Type de collision : CID Minimum de signal requis: 500 Energie de collision : 35 Etat de charge par défaut : 2 Cette analyse a permis d'identifier un nombre important de protéines de bactériophages. Parmi celles-ci, plusieurs sont des protéines non-structurales. La première identifiée comme potentiellement intéressante pour être utilisée dans la caractérisation de E. coli B est la protéine motB, une protéine de régulation de la transcription. Elle est une des premières protéines non-structurales identifiées par le logiciel Bioworks Browser (V3.3.1 SP1, Thermo Fisher Scientific). La deuxième est la protéine dll, de faible poids moléculaire ( Concentration : Par la suite, ces protéines non-structurales sont concentrées sur des billes magnétiques carboxyliques (Carboxyl-Adembeads, Ademtech). Une première étape de conditionnement des billes est réalisée afin de déprotoner les groupements carboxyliques, et ainsi obtenir des groupements C00- pour procéder à l'échange de cations, plus précisément de protéines chargées positivement. Suite à ce conditionnement, l'échantillon est chargé sur les billes échangeuses de cations. Les protéines chargées positivement sont captées, puis lavées, et enfin éluées à pH acide (pH pour reprotoner les groupements carboxyliques). Digestion : Une digestion enzymatique à la trypsine (Promega) permet de générer les peptides protéotypiques. La neutralisation de l'éluat des billes magnétiques est nécessaire car l'activité enzymatique de la trypsine est optimale dans un tampon dont le pH est compris entre 7 et 9. Fractionnement : Le digestat obtenu est fractionné sur une membrane de 10kDa par centrifugation (Nanosep 10kDa, Pall Corporation). Le filtrat, contenant les peptides protéotypiques, est ensuite analysé par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en mode MRM.30 Exemple 3 : Détection des marqueurs dans le surnageant de lyse (modèle phage T4) Chaque échantillon est traité selon l'exemple 2, puis un volume de 20gt de protéines digérées est injecté et analysé selon les conditions suivantes : Chaîne chromatographique Agilent 1100 (Agilent Technologies, Massy, France) Colonne Zorbax C18-300SB, 2.1mm de diamètre interne, 150mm de long, Taille des particules 5itm (Agilent Technologies) Solvant A : H2O - 0.1% acide formique Solvant B : ACN - 0.1% acide formique Gradient HPLC défini en tableau 5 ci-après : Temps (min) Débit (µL/min) Solvant A (%) Solvant B (%) 0 200 95 5 2 200 95 5 13 200 30 70 14 200 10 90 200 10 90 16 200 95 5 22 200 95 5 15 Tableau 5 Des peptides synthétiques de séquences identiques aux séquences SEQ ID NO 2, 3, 5 et 6 , marqués aux isotopes stables 13C et 15N sur les lysine ou arginine terminales (la digestion trypsique induisant une coupure en R/K terminale), sont ajoutés à l'échantillon. Ces standards internes permettent de normaliser les variations analytiques de la chromatographie liquide et du processus d'ionisation, mais également de s'assurer de l'identification des peptides protéotypiques. L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans la source 25 d'ionisation du spectromètre de masse de type TSQ Quantum Ultra (Thermo Fisher Scientific). Les peptides, issus de la digestion des protéines préalablement isolées sur billes magnétiques, sont ensuite analysés par le spectromètre de masse en mode MRM. Seuls les peptides indiqués dans le tableau suivant sont détectés. Pour cela, les fragments (issus d'une collision de type CID) indiqués dans le tableau 6 ci-après, sont détectés. Transition Protéine Peptide Position Ions fragments n° 1 dII QLQHALELQR 4-13 y4 monochargé 2 dII QLQHALELQR 4-13 y5 monochargé 3 dII HLNPAQTALAAELQEK 42-57 y6 monochargé 4 dII HLNPAQTALAAELQEK 42-57 y7 monochargé 5 motB MIINIGELAR 1-10 y5 monochargé 6 motB MIINIGELAR 1-10 y8 monochargé 7 motB LYNVVFLGTYK 136-146 y7 monochargé 8 motB LYNVVFLGTYK 136-146 y9 monochargé Tableau 6 L'état de charge du peptide précurseur, son temps de rétention et les transitions, c'est-à- 1 0 dire les rapports (m/z) en Q1 et (m/z) en Q3, sont indiqués dans le tableau 7. L'énergie de collision utilisée pour fragmenter l'ion précurseur et la valeur du « tube lens » pour transférer les ions fragments sont également indiqués. Transition n° Temps de fil filtré en Energie de collision Tube Etat , rétention filtré en Q3 lens charge d du Q1 précurseur 1 3 8.2 412.8 545.1 16 68 2 3 8.2 412.8 658.2 18 78 3 3 9.1 578.8 717.2 17 73 4 3 9.1 578.8 788.3 20 70 5 2 10.2 565.5 545.1 23 78 6 2 10.2 565.5 885.2 23 87 7 2 10.3 659.0 827.3 21 75 8 2 10.3 659.0 1040.5 22 80 15 Tableau 7 Les autres paramètres machine utilisés sont les suivants : Type de balayage : MRM Polarité : positive Source d'ionisation : - Electrospray ionization (ESI) 5 - Tension de cône : 4000 V - Gaz de nébulisation : 60 (unité arbitraire) - Gaz rideau : 2 (unité arbitraire) - Gaz auxiliaire : 15 (unité arbitraire) - Température de source : 350°C 10 - Energie de collision source : 5V Résolution Ql/Q3 : 0.7 (fwhm) Temps de cycle total =ls Les aires obtenues pour chacune des transitions ont été mesurées. Toutes les transitions 15 dont l'aire est supérieure à 1000 (unité arbitraire) sont considérées comme positives et sont notées « 1 » dans le tableau 8 infra. Toutes les transitions dont l'aire est inférieure à 1000 sont considérées comme négatives et sont notées « 0 » dans le tableau 8 infra. Exemple 4 : Préparation de la solution stock de bactériophage T4 20 La solution stock de bactériophages T4 utilisés comme parents est préparée selon le protocole décrit ci-après : 1- A partir d'une culture liquide d'E. coli B en phase croissance exponentielle, ajouter les bactériophages T4 avec une multiplicité d'infection égale à 0.01 en 25 présence d'un inhibiteur de protéase (pefabloc à 0.25mM final). 2- Incuber 2h à 37°C sous agitation à 22Orpm. 3- Centrifuger 20min à 12000g à 4°C. 4- Récupérer le surnageant de lyse. 5- Centrifuger le surnageant de lyse à 12000g et 4°C toute la nuit. 30 6- Reprendre le culot avec un tampon TSG (Tris-HC1 0.01M pH7.5 / NaC1 150mM / gelatine 0.03%). 7- Conserver la solution stock de bactériophages à 4°C. Lorsque le protocole de capture de protéines non-structurales décrit dans l'exemple 1 est appliqué sur cette solution stock de bactériophages (temps de conservation à 4°C supérieur à 1 an), aucun signal n'est détecté pour les protéines MI et motB (transitions n°1 à 8), comme indiqué dans le tableau 8. Par conséquent, la détection de marqueurs non-structuraux (absents de la solution stock de bactériophages) permet d'utiliser des concentrations de bactériophages parents qui peuvent être supérieures à la limite de détection de l'instrument. Transition n° Protéine Surnageant de lyse stock Solution 1 dII 1 0 2 dII 1 0 3 dII 1 0 4 dII 1 0 5 motB 1 0 6 motB 1 0 7 motB 1 0 8 motB 1 0 Tableau 8 Bibliographie [1] Smartt, A.E. & Ripp, S. Anal Bioanal Chem 400, 991-1007 (2011). [2] Edgar, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 103, 4841-4845 (2006). [3] Yim, P.B. et al. Biotechnol. Bioeng 104, 1059-1067 (2009). 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Procédé de caractérisation d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon, comprenant l'identification de ladite ou des bactérie(s) ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou desdites bactérie(s) à caractériser ; b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) à caractériser et, éventuellement, au moins un antimicrobien ; c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ; d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non-structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de confirmer l'identification de ladite ou des bactérie(s) ou de confirmer la résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien. 2. Procédé selon la revendication 1, comportant une étape supplémentaire c') de lyse des bactéries. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages est mise en oeuvre par spectrométrie de masse. 4. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la spectrométrie de masse est une spectrométrie de type MS, MS/MS ou MS suivie d'une spectrométrie de type MS/MS. 5. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la spectrométrie de masse est une spectrométrie de type MRM. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages est mise en oeuvre par une réaction ligand/anti-ligand. 7. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la réaction ligand/anti-ligand est une réaction antigène/anticorps. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comportant une étape supplémentaire c") de concentration des protéines non-structurales, avant l'étape de détection. 9. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'étape de concentration est réalisée au moyen de billes magnétiques. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comportant une étape supplémentaire b') de capture spécifique de la ou desdites bactéries préalablement à l'étape d' infection. 11. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la capture spécifique est réalisée par séparation immuno-magnétique (IMS). 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les protéines non-structurales de bactériophages sont prises dans le groupe comprenant les protéines dut motB du bactériophage T4. 13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'identification de ladite ou des bactérie(s) et/ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien, met en oeuvre au moins un peptide de séquence SEQ ID N°2, 3, 5 ou 6. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite ou lesdites bactérie(s) sont obtenues à partir d'un milieu de culture. 15. Peptide de séquence SEQ ID N°2, 3, 5 ou 6. 10