Brevet FR2979019A1 — publié le 20130215

Méthode de Diagnostic Sérologique Néonatal Domaine de l'Invention La présente invention concerne une méthode de détermination des allotypes d'immunoglobulines dans un échantillon sanguin permettant en particulier d'identifier et de quantifier de manière distincte les immunoglobulines de la mère et du nouveau-né. L'invention concerne également l'utilisation de cette méthode comme outil de diagnostic sérologique dans le domaine des maladies à transmission verticale. Contexte de l'Invention Le diagnostic biologique chez le nouveau-né de certaines maladies à transmission verticale est difficile lorsque les méthodes de détection de l'antigène ne sont pas fiables. En effet, les tests sérologiques ne sont pas réalisables chez les nourrissons en raison de la présence, jusqu'à 6 à 9 mois de vie, d'anticorps maternels transmis au cours de la grossesse (Simister et al., J. Reprod. Immun., 1997, 37: 1-23; Williams et al., Arch. Dis. Childhood, 1969, 44 : 511-514) qui empêche l'appréciation de la part des anticorps générés par l'enfant. Des traitements présomptifs, qui ne sont pas dénués de toxicité ou d'effets indésirables, sont donc administrés, dès la naissance, au nouveau-né suspecté de maladie congénitale. Ces traitements sont maintenus jusqu'à au moins 6 mois de vie de l'enfant et jusqu'à ce qu'il soit possible de réaliser un examen sérologique permettant de doser uniquement les anticorps de l'enfant, une fois les anticorps materno-transmis totalement éliminés. C'est par exemple le cas de la maladie de Chagas, également connue sous le nom de trypanosomiase américaine, une infection parasitaire causée par Trypanosoma cruzi, qui sévit dans les régions tropicales d'Amérique du Sud et d'Amérique Centrale. Chez certains nouveau-nés, la maladie de Chagas congénitale peut être diagnostiquée par examen microscopique du parasite dans un échantillon sanguin et/ou par amplification de portions de gènes parasitaires par PCR (Schijman et al., J. Antimicrob. Chemother., 2003, 52: 441-449). Or, ces techniques se heurtent à des obstacles qui empêchent d'apporter une conclusion diagnostique définitive. Il s'agit notamment de seuils trop élevés de sensibilité de la détection microscopique qui exposent au risque de diagnostic de faux-négatif, ou d'amplification par PCR d'ADN provenant de fragments de matériel génétique parasitaire soluble (et non de parasites viables) ayant traversé la barrière placentaire, et qui exposent au risque de diagnostic de faux-positif. Il est donc nécessaire d'effectuer un test sérologique 6 à 9 mois après la naissance pour exclure la présence d'une infection non-détectée (Chippaux et al., Tropical Med. International Health, 2010, 15 : 87-93). En raison des limitations des méthodes de diagnostic disponibles, un traitement à base de benznidazole est administré au nouveau-né dès la naissance à titre présomptif. Bien qu'une administration précoce favorise à la fois l'efficacité et la tolérance au benznidazole, cette substance est toxique, induit de nombreux effets secondaires, et ne peut être administrée sans surveillance médicale suivie. De plus, un tel traitement représente un coût important pour les familles concernées par cette maladie survenant dans des pays à faible puissance économique. On rencontre un problème semblable dans le cas de la toxoplasmose, une infection parasitaire causée par le protozoaire Toxoplasma gondii. Bien qu'elle soit observée dans toutes les régions du globe, l'infection par ce parasite est plus prévalente dans certaines parties d'Europe, des Caraïbes et d'Amérique du Sud qu'en Asie, aux Etats-Unis ou en Australie. L'infection congénitale peut être diagnostiquée par PCR, et un test qualitatif de Western blot est utilisé pour comparer les profils immunologiques des IgM et IgG de la mère et de l'enfant, sans aucune appréciation des quantités d'immunoglobulines (Pinon et al., J. Clin. Microbiol., 2001, 39 : 2267-2271). Cependant, ce test nécessite un plasma maternel recueilli très peu de temps après l'accouchement, et son utilisation est donc uniquement périnatale. A l'inverse, la mesure par dosage immunoenzymatique (EIA) des différences entre l'avidité des anticorps de la mère et ceux de l'enfant ne peut se faire qu'environ 6 mois après la naissance. Pour pallier à ces manquements, un traitement efficace mais agressif de pyriméthamine et de sulfonamides est administré au nouveau-né à titre présomptif. Mais ce traitement peut avoir des effets secondaires dramatiques sans surveillance médicale rapprochée. Le paludisme (ou malaria) est un autre exemple de maladie parasitaire où une compréhension des mécanismes d'acquisition de l'immunité naturelle spécifique par le nourrisson pourrait aider à proposer des interventions en santé publique pour protéger les groupes à risque et à mieux cibler les futures stratégies de vaccination antipaludique. Le paludisme est dû à un parasite du genre Plasmodium, dont l'espèce Plasmodium falciparum est la plus fréquente et la plus pathogène chez l'homme et celle qui est responsable des cas mortels. Le paludisme touche une centaine de pays dans le monde, particulièrement dans les zones tropicales défavorisées d'Afrique, d'Asie et d'Amérique latine. Il concerne majoritairement les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes, qui sont particulièrement vulnérables car le placenta constitue une cible où les parasites peuvent s'accumuler. Chez la femme enceinte, l'infection palustre peut provoquer toute une gamme d'effets dommageables: avortement spontané, accouchement prématuré, insuffisance pondérale à la naissance, transmission congénitale, et décès néonatal. Dans tous ces cas de maladies infectieuses à transmission verticale, il apparaît donc crucial de développer de nouvelles stratégies permettant un diagnostic précis et définitif de la maladie congénitale dans les premiers mois de vie du nouveau-né. Un diagnostic biologique précoce de ces infections permettrait d'apporter une aide précieuse à la décision d'instaurer ou d'écourter les traitements médicamenteux, avec un bénéfice en termes de santé de l'enfant, mais aussi de lutter contre ces maladies et leurs conséquences. Résumé de l'Invention De façon générale, la présente invention concerne une méthode permettant de distinguer les immunoglobulines de la mère et du nouveau-né dans un échantillon sanguin prélevé durant les premiers mois de la vie de l'enfant. Cette méthode est, en particulier, applicable au diagnostic des maladies à transmission verticale. Plus spécifiquement, les inventeurs ont montré qu'il était possible d'utiliser les allotypes d'immunoglobulines pour identifier et quantifier de manière distincte les immunoglobulines de la mère et du nourrisson. Ils ont développé une technique de détection et de dosage différentiel, dans le plasma du nouveau-né, des immunoglobulines G (IgG) de la mère et de l'enfant, par une approche protéomique utilisant les caractéristiques individuelles des IgG3, qui représentent la sous-classe d'IgG la plus polymorphe. Les inventeurs ont identifié, parmi les peptides obtenus par une série de digestions enzymatiques opérées sur le fragment Fc d'IgG3 purifiées, une liste des peptides signant l'identité allotypique G3m. La méthode a été validée, en particulier, sur des échantillons sanguins d'une mère béninoise et de son bébé et les résultats ont été confirmés par la détermination préalable du polymorphisme des allotypes des IgG par une méthode d'immunohématologie permettant la définition des allèles IgG3 de l'enfant à partir des déterminations faites chez l'enfant et chez ses parents biologiques (voir Exemples). En conséquence, un premier aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détection d'anticorps d'un nouveau-né comprenant des étapes consistant à : déterminer, par spectrométrie de masse, les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin du nouveau-né, l'échantillon sanguin du nouveau-né comprenant des IgG3 du nouveau-né et des IgG3 maternelles transmises pendant la grossesse ; comparer les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de l'enfant avec les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin de la mère ; et détecter, et éventuellement quantifier, les IgG3 du nouveau-né. Dans les méthodes de l'invention, l'échantillon sanguin du nouveau-né est un échantillon prélevé entre la naissance et le 9ème mois de vie du nouveau-né. Dans certains modes de réalisation, l'échantillon sanguin est un échantillon plasmatique. Préférablement, une méthode selon l'invention comprend en outre, des étapes consistant à : isoler les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né ; soumettre les IgG3 isolées à une protéolyse ou digestion enzymatique pour obtenir un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 ; et détecter, par spectrométrie de masse, parmi le mélange de peptides protéotypiques d'IgG3, la présence d'au moins un peptide discriminant d'allotype G3m afin de déterminer les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né. L'étape consistant à isoler les IgG3 présentes dans l'échantillon du nouveau-né peut être réalisée par n'importe quel procédé approprié. Dans certains modes de réalisation, les IgG3 sont isolées par chromatographie d'affinité (par exemple par une chromatographie d'affinité effectuée sur colonne de Protéine A suivie d'une chromatographie d'affinité effectuée sur colonne de Protéine G). Dans d'autres modes de réalisation, les IgG3 sont isolées par chromatographie liquide, notamment par chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC). L'étape consistant à soumettre les IgG3 isolées à une protéolyse ou digestion enzymatique peut être effectuée par n'importe quelle méthode appropriée 15 conduisant à un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3. Par exemple, dans certains modes préférés de réalisation, la digestion enzymatique comprend une digestion en présence d'endoprotéinase AspN et une digestion en présence de trypsine, ou encore une digestion en présence d'endoprotéinase AspN et de trypsine, et le ou les peptides discriminants 20 d'allotype G3m permettant de déterminer les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né appartiennent au groupe consistant en les peptides de séquences SEQ ID NO: 1 à 32 présentés dans le tableau 4. Dans une méthode selon l'invention, l'analyse par spectrométrie de masse est effectuée par une technique de spectrométrie de masse en tandem, notamment 25 MALDI-TOF/TOF ou ESI-LTQ Orbitrap. Les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de la mère peuvent être déterminés par n'importe quelle méthode appropriée. Dans certains modes de réalisation de l'invention, les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de la mère sont déterminés par une méthode d'immunohématologie, notamment une méthode d'inhibition de l'hémagglutination. Dans d'autres modes de réalisation, les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de la mère sont déterminés par une méthode de l'invention. Les méthodes décrites ici permettant d'identifier et de quantifier de manière distincte les immunoglobulines de la mère et du nourrisson trouvent application dans le domaine du diagnostic des maladies à transmission verticale, comme les maladies infectieuses virales, bactériennes et parasitaires. En conséquence, dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic, chez un nouveau-né, d'une maladie infectieuse causée par un pathogène, la méthode comprenant des étapes consistant à : déterminer, par spectrométrie de masse, les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans un échantillon sanguin du nouveau-né, l'échantillon sanguin du nouveau-né comprenant des IgG3 du nouveau-né et des IgG3 maternelles transmises pendant la grossesse ; comparer les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans l'échantillon sanguin de l'enfant avec les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin de la mère ; et détecter, et éventuellement quantifier, les IgG3 spécifiques du pathogène du nouveau-né. Dans les méthodes de diagnostic de l'invention, l'échantillon sanguin du nouveau-né est un échantillon prélevé entre la naissance et le 9ème mois de vie du nouveau-né. Dans certains modes de réalisation, l'échantillon sanguin est un échantillon plasmatique. Préférablement, une méthode de diagnostic selon l'invention comprend en outre des étapes consistant à : isoler les IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né ; soumettre les IgG3 spécifiques du pathogène isolées à une protéolyse ou digestion enzymatique pour obtenir un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 ; et détecter, par spectrométrie de masse, parmi le mélange de peptides protéotypiques d'IgG3, la présence d'au moins un peptide discriminant d'allotype G3m afin de déterminer les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né. Préférablement, le ou les peptides discriminants d'allotype G3m permettant de déterminer les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène, présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né, appartiennent au groupe consistant en les peptides de séquences SEQ ID NO: 1-32 présentés dans le tableau 2, et la digestion enzymatique des IgG3 spécifiques du pathogène est effectuée en présence d'AspN et de trypsine. Dans certains modes de réalisation, la maladie infectieuse diagnostiquée par 10 une méthode selon l'invention est une maladie infectieuse virale, et les IgG3 isolées sont spécifiques du virus causant la maladie infectieuse. Dans d'autres modes de réalisation, la maladie infectieuse diagnostiquée par une méthode selon l'invention est une maladie infectieuse bactérienne, et les IgG3 isolées sont spécifiques de la bactérie causant la maladie infectieuse. 15 Dans encore d'autres modes de réalisation, la maladie infectieuse diagnostiquée par une méthode selon l'invention est une maladie infectieuse parasitaire, et les IgG3 isolées sont spécifiques du parasite causant la maladie infectieuse. Par exemple, lorsque la maladie infectieuse parasitaire est le paludisme ou malaria, les IgG3 isolées sont spécifiques du parasite Plasmodium 20 falciparum ; lorsque la maladie parasitaire est la maladie de Chagas, les IgG3 isolées sont spécifiques du parasite Trypanosoma cruzi ; ou lorsque la maladie parasitaire est la toxoplasmose, les IgG3 isolées sont spécifiques du parasite Toxoplasma gondii. L'étape consistant à isoler les IgG3 spécifiques du pathogène, présentes dans 25 l'échantillon du nouveau-né, peut être réalisée par n'importe quel procédé approprié. Dans certains modes de réalisation préférés, les IgG3 totales sont d'abord isolées de l'échantillon sanguin du nouveau-né, par exemple par chromatographie d'affinité ou par chromatographie liquide de protéine rapide ; et ensuite les IgG3 spécifiques du pathogène sont isolées des IgG3 totales. L'isolement des IgG3 spécifiques du pathogène peut être effectuée par n'importe quel procédé approprié, par exemple, via formation d'un complexe immun résultant du contact d'IgG3 totales avec une préparation antigénique spécifique du pathogène. Les autres étapes d'une méthode de diagnostic de l'invention peuvent être réalisées comme dans une méthode effectuée sur les IgG3 totales. En particulier, les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de la mère peuvent être déterminés par n'importe quelle méthode appropriée en utilisant soit les IgG3 totales soit les IgG3 spécifiques du pathogène. Dans certains modes de réalisation de l'invention, la détermination se fait par une méthode d'immunohématologie, notamment une méthode d'inhibition de l'hémagglutination. Dans d'autres modes de réalisation, la détermination se fait par une méthode de l'invention. En effet, comme le reconnaîtra l'homme du métier, une méthode selon l'invention peut être utilisée pour déterminer le polymorphisme des allotypes des IgG d'un individu à tout stade de la vie, c'est-à-dire en dehors de toute considération des problèmes liés au diagnostic des maladies à transmission verticale chez le nouveau-né. En conséquence, dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de détermination des allotypes des IgG d'un individu qui comprend une étape consistant à : déterminer, par spectrométrie de masse, les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin de l'individu. Dans certains modes préférés de réalisation, cette méthode comprend en outre des étapes consistant à : isoler les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de l'individu ; soumettre les IgG3 isolées à une digestion enzymatique pour obtenir un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 ; et détecter, par spectrométrie de masse, parmi le mélange de peptides protéotypiques d'IgG3, la présence d'au moins un peptide discriminant d'allotype G3m afin de déterminer les allotypes des IgG3 de l'individu. Préférablement, la digestion enzymatique comprend une digestion en présence d'endoprotéinase AspN et une digestion en présence de trypsine, ou encore une digestion en présence d'endoprotéinase AspN et de trypsine, et le ou les peptides discriminants d'allotype G3m permettant de déterminer les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de l'individu appartiennent au groupe consistant en les peptides de séquences SEQ ID NO: 1 à 32. Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m pour calibrer un spectromètre de masse utilisé dans une méthode de l'invention. Préférablement, la pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m est choisie dans le groupe consistant en les peptides de séquences SEQ ID NO: 1 à 32 et toute combinaison de ces peptides. Selon un aspect voisin, la présente invention concerne un kit pour la détermination du polymorphisme des allotypes d'IgG3 d'un individu, et un kit pour le diagnostic, chez le nouveau-né, d'une maladie infectieuse causée par un pathogène, chaque kit comprenant une pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m choisis dans le groupe consistant en les peptides de séquences SEQ ID NO: 1 à 32 et toute combinaison de ces peptides, où les peptides sont destinés à la calibration d'un spectromètre de masse utilisé dans une méthode de l'invention. Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous. Description Détaillée de l'Invention D'une manière générale, la présente invention concerne une méthode de détermination du polymorphisme des allotypes d'IgG chez un individu. Cette méthode permet en particulier de distinguer et/ou de quantifier les immunoglobulines de la mère et du nouveau-né dans un échantillon sanguin prélevé durant les premiers mois de la vie de l'enfant. La méthode trouve application dans le domaine du diagnostic des maladies à transmission verticale chez le nouveau-né. I - Méthodes de Détection d'Immunoglobulines de Nouveau-Nés Comme indiqué plus haut, la présence dans les plasmas de nouveau-nés d'anticorps maternels qui sont transmis par transport actif en période prénatale via le placenta, empêche le diagnostic sérologique chez le nourrisson. Le transport d'anticorps maternels durant la grossesse se limite aux immunoglobulines G (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4). Ces immunoglobulines persistent chez le nouveau-né durant les 6 à 9 premiers mois de vie. Les méthodes de l'invention reposent sur l'utilisation des allotypes d'immunoglobulines G pour identifier et quantifier de manière distincte les immunoglobulines de la mère et du nouveau-né dans un échantillon sanguin de l'enfant. Dans le contexte de la présente invention, les termes "nouveau-né" et "nourrisson" sont employés indifféremment. Par ces termes, on entend désigner un être humain durant les premiers mois de sa vie. Le terme "premiers mois de vie", tel qu'utilisé ici, désigne une période allant de la naissance au 9ème mois (inclus) après la naissance. Dans le contexte de la présente invention, les termes "allotype d'immunoglobuline" et "allotype Gm" sont utilisés indifféremment. Les allotypes Gm (Lefranc et Lefranc, "The Human IgG Subclasses: Molecular analysis of structure, function and regulation", Pergamon Press, Oxford, 1990, pp. 43-78) sont des determinants antigéniques localisés sur les chaînes lourdes de 3 des 4 sous-classes d'IgG (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4) qui permettent de distinguer des individus d'une même espèce. Ils correspondent au niveau moléculaire à la substitution d'un ou de plusieurs acides aminés dans la séquence polypeptidique des immunoglobulines. Les allotypes Gm polymorphiques sont codés par des allèles de gènes très proches et hérités par combinaisons particulières appelées haplotypes. Les 11 haplotypes Gm reconnus et leurs fréquences varient fortement d'une population à l'autre définissant ainsi quatre grands groupes : "africain", "asiatique", "européen" et "européen et asiatique" (voir Tableau 1). Tableau 1: Liste des haplotypes Gm rencontrés dans les populations humaines. Population Gm haplotypes européenne Gm 5,10,11,13,14,26,27;3;.. Gm 5,10,11,13,14, 26,27;3;23 européenne et asiatique Gm 21,26,27,28;1,17;.. Gm 21,26,27,28;1,2,17;.. africaine Gm 5,10,11,13,14,26,27;1,17;.. Gm 5,6,11,24,26;1,17;.. Gm 5,6,10,11,14,26,27;1,17;.. Gm 10,11,13,15,27;1,17;.. asiatique Gm 10,11,13,15,16,27;1,17;.. Gm 5,10,11,13,14,26,27;1,3;.. Gm 5,10,11,13,14,26,27;1,3;23 Les allotypes Gm des chaînes gamma 1, gamma 2, and gamma 3 sont inscrits dans l'ordre de la position des gènes des sous-classes sur le gène IGHG (G3, G1 et G2), avec des " ; " pour séparer les sous-classes et des " , " pour séparer les allotypes. Le signe " " signifie l'absence d'allotype G2m. Le système Gm se compose de 18 allotypes (voir Tableau 2). Les allotypes G3m (allotypes des IgG3) sont les plus polymorphiques et on les trouve sur les domaines CH2 (n=6) et CH3 (n=7) des chaînes lourdes gamma3. En conséquence, dans certains modes préférés de réalisation, une méthode selon l'invention comprend la détermination, par spectrométrie de masse, des allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin du nouveau-né. Cependant, comme le reconnaîtra l'homme du métier, il est également concevable de développer une méthode de détection selon l'invention comprenant la détermination, par spectrométrie de masse, des allotypes des IgGl ou des IgG2 présentes dans un échantillon sanguin du nouveau-né. Alternativement, il est également concevable de développer une méthode de détection selon l'invention comprenant la détermination, par spectrométrie de masse, des allotypes des IgG3 et des IgGl, ou des allotypes des IgG3 et des IgG2, ou encore des allotypes des IgGl, IgG2 et IgG3, présentes dans un échantillon sanguin du nouveau-né. Tableau 2: Localisation des allotypes G3 sur les trois sous-classes d'immunoglobulines G. Localisation Allotype Sous-classe d'IgG Domaine constant IgGl CH3 Glm (1) CH3 Glm(2) CH1 Glm(3) CH1 Glm(17) IgG2 CH2 G2m(23) IgG3 CH2 G3m(5) CH3 G3m(6) CH3 G3m(10) CH3 G3m(11) CH3 G3m(13) CH2 G3m(14) CH2 G3m(15) CH2 G3m(16) CH2 G3m(21) CH3 G3m(24) CH2 G3m(26) CH3 G3m(27) CH3 G3m(28) Peptides Discriminants d'Allotypes Les méthodes de l'invention reposent sur la détection, et éventuellement la quantification, dans l'échantillon du nouveau-né, de peptides discriminants d'allotype Gm. En particulier, dans certains modes préférés de réalisation, une méthode selon l'invention comprend la détection d'un ou de plusieurs peptides discriminants d'allotvae G3m. Les termes "peptide discriminant d'allotype G3m", "peptide marqueur d'allotype G3m" et "peptide spécifique d'allotype G3m" sont employés ici indifféremment. Ils font référence à un peptide protéotypique qui est indicatif (ou qui est une signature) de l'identité d'un allotype G3m. Un "peptide protéotypique" est un peptide généré par la digestion enzymatique d'une protéine donnée de façon reproductible et spécifique vis-à-vis de la protéine et qui peut être détecté par spectrométrie de masse. Comme décrit dans les Exemples, une liste de peptides discriminants d'allotype G3m a été établie par coupure théorique de la chaîne lourde des IgG3 par une combinaison de l'endoprotéinase AspN et de trypsine et identification des peptides protéotypiques spécifiques de IGHG3 et discriminatoires vis-à-vis des allèles. Ces peptides sont : TKPWEEQYNSTFR (SEQ ID NO: 1), TKPREEQYNSTFR (SEQ ID NO: 2), LREEQYNSTFR (SEQ ID NO: 3), DGVEVHNAKTKPWEEQYNSTFR (SEQ ID NO: 4), EEQYNSTFRVVSVLTVLHQ (SEQ ID NO: 5), EEQYNSTFRVVSVLTVVHQ (SEQ ID NO: 6), TKPWEEQYNSTFRVVSVLTVLHQ (SEQ ID NO: 7), GFYPSDIAVEWESSGQPENNYK (SEQ ID NO: 8), GFYPSDIAMEWESSGQPENNYK (SEQ ID NO: 9), GFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPML (SEQ ID NO: 10), GFYPSDIAVEWESSGQPNNNYNTTPPML (SEQ ID NO: 11), GFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPVL (SEQ ID NO: 12), GFYPSDIAVEWESNGQPENNYNTTPPML (SEQ ID NO: 13), DIAVEWESSGQPENNYK (SEQ ID NO: 14), DIAMEWESSGQPENNYK (SEQ ID NO: 15), DIAVEWESSGQPENNYNTTPPML (SEQ ID NO: 16), DIAVEWESSGQPNNNYNTTPPML (SEQ ID NO: 17), DIAVEWESSGQPENNYNTTPPVL (SEQ ID NO: 18), DIAVEWESNGQPENNYNTTPPML (SEQ ID NO: 19), SRWQQGNIFSC°SVMHEALHNHYTQK (SEQ ID NO: 20), SRWQQGNIFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 21), SRWQEGNVFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 22), SRWQEGNIFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 23), WQQGNIFSC°SVMHEALHNHYTQK (SEQ ID NO: 24), WQQGNIFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 25), WQEGNVFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 26), WQEGNIFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 27), WQQGNIFSC°SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 28), WQQGNIFSC°SVMHEALHNRFTQK (SEQ ID NO: 29), WQEGNVFSC°SVMHEALHNRFTQK (SEQ ID NO: 30), WQEGNIFSC°SVMHEALHNRFTQK (SEQ ID NO: 31), et WQQGNIFSC°SVMHEALHNRYTQK (SEQ ID NO: 32), où Cc représente une cystéine carbamidométhylée. La présente invention concerne donc une pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m choisis dans le groupe constitué des peptides listés ci-dessous ou toute combinaison de ces peptides. La présente invention concerne également l'utilisation de ces peptides dans une méthode selon l'invention. Comme le reconnaîtra l'homme du métier, une liste différente de peptides discriminants d'allotype d'IgG3 pourrait être établie par une méthode similaire à celle employée par les inventeurs mais basée sur une coupure enzymatique utilisant un enzyme ou une combinaison d'enzymes différents. Dans les modes de réalisation où une méthode selon l'invention est utilisée pour déterminer les allotypes d'IgGl ou les allotypes d'IgG2, une liste de peptides discriminants d'allotype d'IgGl ou d'allotype d'IgG2 pourrait être obtenue par un procédé similaire. Préparation de l'Echantillon Les méthodes de l'invention sont réalisées à partir d'un échantillon sanguin du nouveau-né. Généralement, un échantillon plasmatique est obtenu à partir de l'échantillon sanguin. Les méthodes d'obtention de plasma à partir de sang humain sont connues dans l'art. Comme indiqué plus haut, un échantillon sanguin (ou plasmatique) de nouveau-né comprend des IgG du nouveau-né et des IgG d'origine maternelle transmises in utero. Les "IgG du nouveau-né" incluent les IgG foetales (c'est-à-dire les IgG synthétisées par le foetus durant la grossesse) et les IgG synthétisées par le nouveau-né après la naissance. Dans certains modes de réalisation, les méthodes selon l'invention sont effectuées sur une seule sous-classe d'immunoglobulines parmi les IgGl, IgG2 et IgG3. Dans certains modes préférés de réalisation de l'invention, les méthodes sont effectuées sur les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin ou plasmatique du nouveau-né. D'une façon générale, avant l'analyse par spectrométrie de masse, les IgG3 5 présentes dans l'échantillon sanguin ou plasmatique sont isolées puis soumises à une digestion enzymatique. L'étape d'isolement des IgG3 peut se faire par n'importe quelle méthode appropriée, la méthode d'isolement utilisée n'étant pas un élément critique ou limitant. Par exemple, les IgG3 peuvent être isolées par chromatographie 10 d'affinité. Comme décrit dans les Exemples présentés plus bas, il est par exemple possible d'isoler les IgG3 d'un échantillon plasmatique en effectuant une chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine A suivie d'une chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine G. Les colonnes de Protéine A et de Protéine G sont disponibles commercialement, et l'homme du métier sait 15 sélectionner, ou sait comment sélectionner, les conditions d'élutions appropriées pour obtenir des IgG3 purifiées ou substantiellement purifiées. Alternativement ou additionnellement, les IgG3 peuvent être isolées par chromatographie liquide, par exemple par chromatographie liquide de protéine rapide. Le système de chromatographie liquide de protéine rapide ou FPLC 20 (Sheehan et al., Meth. Mol. Biol., 2004, 244: 253-258) a été développé par Pharmacia (aujourd'hui GE Healthcare) en 1982 pour séparer ou purifier des protéines ou autres macromolécules de mélanges complexes. Des appareils de FPLC (AKTAFPLCTM et BioLogic DuoflowTM) sont aujourd'hui commercialisés par GE Healthcare et Bio-Rad Laboratories. Les colonnes utilisées en FPLC 25 peuvent séparer les macromolécules en fonction de leur taille, de leur distribution de charge, de leur hydrophobicité, ou encore par affinité. Une méthode de séparation utilisant la technique de FPLC peut permettre une standardisation de la purification des IgG3 et une optimisation de la quantité d'IgG3 purifiées récupérées. Après isolement, les IgG3 sont soumises à un traitement dans le but d'obtenir un mélange de peptides protéolytiques d'IgG3 comprenant des peptides protéotypiques d'IgG3 (c'est-à-dire des peptides générés par digestion enzymatique de façon reproductible et spécifique vis-à-vis des immunoglobulines G3). Les termes "protéolyse" et "digestion enzymatique" sont ici utilisés indifféremment. Ils désignent une découpe d'une protéine en plusieurs morceaux (peptides) sous l'action d'un enzyme ou d'une combinaison d'enzymes. Comme le reconnaîtra l'homme du métier, le procédé de digestion enzymatique utilisé devra être calqué sur les conditions de coupure enzymatique théorique utilisées pour l'identification des peptides discriminants d'allotype d'IgG3. Dans certains modes préférés de réalisation, la protéolyse des IgG3 isolées de l'échantillon sanguin de nouveau-né se fera donc par digestion en présence d'endoprotéinase AspN et par digestion en présence de trypsine, ou encore par digestion en présence d' endoprotéinase AspN et de trypsine. Préférablement, avant digestion, les IgG3 sont soumises à une réduction, par exemple en présence de dithiothreitol (DTT) qui réduit les liaisons disulfides des immunoglobulines en thiols et sépare ainsi les chaînes lourdes des chaînes légères, puis à une protection des groupements thiols de la chaîne lourde d'IgG3, par exemple par alkylation en présence de chloroacétamide. Analyse par Spectrométrie de masse La détermination d'allotypes d'IgG selon une méthode de l'invention se fait par spectrométrie de masse. La spectrométrie de masse est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse, de caractériser leur structure chimique, et éventuellement de les quantifier. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge ( /z). Dans une méthode selon l'invention, l'analyse par spectrométrie de masse peut se faire par n'importe quelle technique de spectrométrie de masse appropriée, permettant la détection de peptides dans un mélange complexe et d'en déduire leur séquence. L'échantillon comprenant le mélange de peptides protéolytiques d'IgG3 peut être introduit directement dans le spectromètre de masse sous forme liquide ou solide (ex. dépôt sur plaque MALDI) ou encore par couplage à une méthode séparative (ex. chromatographie en phase liquide, électrophorèse capillaire). Après introduction dans le spectromètre de masse, les peptides du mélange sont vaporisés et ionisés (la source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs). Il existe diverses méthodes d'ionisation, les plus adaptées dans le contexte de l'invention étant l'électronébulisation ou électrospray (ESI), et la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI). Les ions sont ensuite séparés par un analyseur en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) Préférablement, l'analyseur est un analyseur haute résolution permettant de mesurer avec précision la masse mono-isotopique d'un ion et d'en déduire sa composition après fragmentation. Un analyseur haute résolution peut être un temps de vol (TOF), la résonnance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR), la trappe linéaire quadrupole Orbitrap (LTQ-Orbitrap) ou un filtre quadripolaire (QqQ). Ces analyseurs peuvent être couplés entre eux pour réaliser des expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Dans une spectrométrie de masse en tandem, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme le LTQ-Orbitrap, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement. Dans certains modes préférés de réalisation de l'invention, le mélange de peptides protéolytiques d'IgG3 est analysé par une méthode de spectrométrie de masse en tandem, par exemple MALDI en mode MS/MS, notamment MALDI- TOF/TOF ou électronébulisation en mode MS/MS (ESI-LTQ-Orbitrap). Dans certain modes préférés de réalisation, le spectromètre de masse est couplé à un système de nanochromatographie liquide (nLC). Les mesures de masse des peptides et de leurs fragments respectifs permettent la détermination de la séquence de ceux-ci (manuellement ou au moyen de logiciels spécialisés). Comparaison avec les Allotypes des IgG maternelles L'analyse par spectrométrie de masse a pour but de détecter, parmi le mélange de peptides protéolytiques d'IgG3, un ou plusieurs peptides discriminants d'allotype G3m, et de déterminer ainsi les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né (voir Tableau 4). Or, comme l'échantillon du nouveau-né contient à la fois des IgG3 du nouveau-né et des IgG3 maternelles transmises pendant la grossesse, il est nécessaire de comparer les allotypes déterminées pour les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né avec les allotypes les IgG3 de la mère afin d'en déduire les allotypes des IgG3 du nouveau-né. Les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin de la mère peuvent être déterminés par n'importe quelle méthode appropriée. Dans certains modes de réalisation de l'invention, la détermination est effectuée à l'aide d'une méthode d'immunohématologie, notamment une méthode d'inhibition de l'hémagglutination (Lefranc et al., Acta Anthropogenetica, 1976, 1: 34-45; Dugoujon et al., Vox Sanguinis, 1989, 57: 133-136; Field and Dugoujon, Gen. Epidemiol., 1989, 6: 31-33). Dans d'autres modes de réalisation, les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de la mère sont déterminés par une méthode de l'invention (voir plus bas). II - Méthodes de Diagnostic de Maladies à Transmission Verticale Les méthodes de l'invention permettant de distinguer les IgG de la mère et du nouveau-né dans un échantillon sanguin prélevé durant les premiers mois de la vie de l'enfant trouvent application dans le domaine du diagnostic des maladies à transmission verticale. Par le terme "maladie à transmission verticale", on entend désigner toute maladie transmise de la mère à l'enfant lors de la grossesse, en particulier les maladies infectieuses. Les maladies infectieuses qui, a priori, peuvent être diagnostiquées par une méthode selon l'invention incluent les maladies infectieuses bactériennes, les maladies infectieuses virales, et les maladies infectieuses parasitaires. Les méthodes de diagnostic selon l'invention sont particulièrement intéressantes lorsque les méthodes de détection de l'antigène d'origine virale, parasitaire ou bactérienne ne sont pas fiables. Dans certains modes de réalisation, une méthode selon l'invention est utilisée pour diagnostiquer, chez un nouveau-né, une maladie infectieuse parasitaire, en particulier une maladie parasitaire provoquée par un protozoaire. Des exemples de maladies parasitaires qui peuvent être diagnostiquées par une méthode de l'invention incluent, sans limitation, le paludisme ou malaria, la toxoplasmose, la maladie de Chagas, la maladie du sommeil également appelée trypanosomiase africaine provoquée par un protozoaire flagellé, Trypanosoma brucei ssp. gambiense ou Trypanosoma brucei ssp. Rhodesiense, les babébioses qui sont des maladies rares, parentes de la malaria provoquée par un protozoaire du genre Babesia (B. divergens, B. microti), et les leishmanioses qui résultent d'une infection par des protozoaires flagellés appartenant au genre Leishmania. Dans certains modes préférés de réalisation, une méthode de l'invention est utilisée pour diagnostiquer le paludisme, la toxoplasmose, la maladie de Chagas ou la maladie du sommeil. Dans d'autres modes de réalisation, une méthode selon l'invention est utilisée pour diagnostiquer, chez un nouveau-né, une maladie infectieuse bactérienne. Des exemples de foetopathies congénitales d'ordre bactérien qui peuvent être diagnostiquées par une méthode de l'invention incluent, sans limitation, les infections à streptocoque B (streptococcose), Listeria monocytogenes (listériose), Treponema pallidum (syphilis), Chlamydia trachomatis (chlamydiose) ou encore les infections à mycoplasmes. Dans encore d'autres modes de réalisation, une méthode selon l'invention est utilisée pour diagnostiquer, chez un nouveau-né, une maladie infectieuse virale. Des exemples de foetopathies congénitales d'ordre viral qui peuvent être diagnostiquées par une méthode de l'invention incluent, sans limitation, la rubéole, la varicelle, et les infections à Parvovirus B19 (mégalérythème épidémique), cytomégalovirus (maladie des inclusions cytomégaliques), ou encore à herpes simplex virus. Lorsqu'une méthode de l'invention est utilisée pour diagnostiquer une maladie infectieuse, elle est réalisée, comme décrit précédemment, mais sur les IgG3 spécifiques du pathogène (parasite, virus ou bactérie) responsable de la maladie à diagnostiquer et non sur les IgG3 totales. Les termes "IgG3 spécifiques du parasite", "IgG3 spécifiques du virus" et "IgG3 spécifiques de la bactérie" désignent les immunoglobulines G3 qui ont été produites par le système immunitaire de l'organisme humain en réponse respectivement à l'agent pathogène parasitaire, viral et bactérien. Les méthodes de diagnostic selon l'invention nécessitent donc une étape d'isolement des IgG3 spécifiques de l'agent pathogène présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né à tester. L'isolement des IgG3 spécifiques de l'agent pathogène peut se faire par n'importe quelle méthode appropriée connue dans l'art. Par exemple, un tel isolement peut être réalisé via formation d'un complexe immun (c'est-à-dire d'un complexe antigène-anticorps) résultant du contact d'IgG3 purifiées avec une préparation antigénique spécifique. Après lavage pour éliminer toute IgG3 non liée à l'antigène (c'est-à-dire non complexée et donc non-spécifique du pathogène), une dissociation des complexes immuns peut être effectuée pour récupérer les IgG3 spécifiques du pathogène par exemple par application d'une solution tampon acide. Dans les méthodes de diagnostic de la maladie de Chagas selon l'invention, la préparation antigénique utilisée pour isoler les IgG3 spécifiques du pathogène peut être un extrait parasitaire de Trypanosoma cruzi obtenu par lyse d'une culture exponentielle d'épimastigotes dans du sérum de veau foetal (Flechas et al., BMC Infectious Diseases, 2009, 9: 186). Dans les méthodes de diagnostic de la toxoplasmose, la préparation 30 antigénique utilisée pour isoler les IgG3 spécifiques du pathogène peut être un extrait parasitaire soluble de Toxoplasma gondii obtenu d'une culture in vitro de tachyzoïtes en cellules murines (Fatoohi et al., Clin. Diag. Lab. Immunol., 2001, 9 : 704-707). Dans les méthodes de diagnostic du paludisme, la préparation antigénique utilisée pour isoler les IgG3 spécifiques du pathogène peut être une protéine recombinante AMAl (Apical Membrane Protein 1) des stades sanguins asexués de Plasmodium falciparum (Nebie et al., Infection and Immunity, 2008, 76: 759-766). Alternativement, la préparation antigénique peut être un extrait parasitaire de P. falciparum obtenu à partir d'une culture in vitro d'une lignée parasitaire enrichie à plus de 50% de schizontes (Fievet et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 1995, 53: 612-617). Une méthode de diagnostic selon l'invention se déroule donc comme décrit précédemment à l'exception du fait qu'elle est réalisée sur les IgG3 spécifiques du pathogène responsable de la maladie à diagnostiquer et non sur les IgG3 totales. Dans certains cas, en particulier lorsque des quantités faibles d'IgG3 spécifiques du pathogène sont obtenues, une technique sélective et sensible de spectrométrie de masse, la MRM (Multiple Reaction Monitoring), également appelée SRM (Selected Reaction Monitoring), peut être utilisée. Ce mode de fonctionnement de spectrométrie de masse présente une double sélectivité, au niveau des sélections de l'ion parent et de l'ion fragment produit. Les "IgG3 du nouveau-né spécifiques du pathogène" isolées de l'échantillon sanguin comprennent des IgG3 spécifiques du pathogène d'origine maternelle et transmises durant la grossesse et, s'il y a eu transmission congénitale, des IgG3 spécifiques du pathogène synthétisées par le foetus. Elles peuvent éventuellement contenir des IgG3 spécifiques du pathogène synthétisées par le nouveau-né en réponse à une exposition au pathogène après la naissance. Dans une méthode de diagnostic selon l'invention, les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène isolées d'un échantillon sanguin du nouveau-né et déterminés par spectrométrie de masse sont comparés aux allotypes des IgG3 de la mère. Comme décrit plus haut, la détermination des allotypes des IgG3 de la mère peut se faire par une méthode classique d'immunohématologie ou encore par une méthode de l'invention. La détermination des allotypes G3m de la mère peut être réalisée sur les IgG3 totales ou sur les IgG3 spécifiques du pathogène, les deux déterminations devant conduire aux mêmes résultats puisque les polymorphismes se trouvent sur les domaines constants des chaînes lourdes gamma3. Un diagnostic définitif de la maladie congénitale pourra être basé uniquement sur une méthode de diagnostic selon l'invention. Alternativement, un diagnostic clinique pourra être établi sur la base des résultats d'une méthode selon l'invention combinés aux résultats d'autres méthodes de diagnostic (comme, par exemple, l'observation microscopique du parasite dans un échantillon sanguin du nouveau-né ou l'amplification de portions de gènes du pathogène par PCR). Armé d'un diagnostic définitif, le médecin traitant pourra décider en connaissance de cause d'instaurer un traitement médicamenteux pour le nouveau-né, d'écourter un traitement médicamenteux administré à titre présomptif, ou de poursuivre un tel traitement. III - Méthodes de Détermination du Polymorphisme des Allotypes G3m Comme le reconnaîtra l'homme du métier, une méthode selon l'invention peut être utilisée pour déterminer le polymorphisme des allotypes des IgG d'un individu à tout stade de la vie, c'est-à-dire en dehors de toute considération des problèmes liés au diagnostic des maladies à transmission verticale chez le nouveau-né. Cela est d'autant plus important que la méthode classique de détermination des allotypes Gm, qui est une méthode sérologique d'inhibition de l'hémagglutination utilisant des érythrocytes du groupe sanguin O Rh+ couplés à des anticorps anti-Rh d'allotypes Gm connus et à des anticorps anti-allotype monospécifiques, ne sera prochainement plus disponible. En effet, les collections de sérums monospécifiques anti-allotypes et anti-RhD qui, dans le passé, ont été obtenues de femmes enceintes et de dons de sang, sont pratiquement épuisées. La présente invention concerne donc également une méthode de détermination des allotypes des IgG d'un individu comprenant une étape consistant à : déterminer, par spectrométrie de masse, les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin d'un individu. Préférablement, la méthode comprend : l'isolement des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin ; la protéolyse des IgG3 isolées pour obtenir un mélange de peptides protéolytiques d'IgG3 ; et la détection, par spectrométrie de masse, parmi le mélange de peptides protéolytiques d'IgG3, de la présence d'au moins un peptide discriminant d'allotype G3m afin de déterminer les allotypes des IgG3 de l'individu. Dans certains modes de réalisation préférés, les peptides discriminants d'allotype G3m appartiennent au groupe consistant en les peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 32; et la protéolyse des IgG3 est effectuée en présence d'endoprotéinase AspN et de trypsine. Le terme "individu", tel qu'utilisé dans le contexte de la présente invention, désigne un être humain ayant dépassé le stade de nourrisson, c'est-à-dire un être humain âgé de plus de 6 ou 9 mois (lorsque les immunoglobulines maternotransmises ont été totalement éliminées). Les étapes d'isolement et de protéolyse des IgG3 peuvent être réalisées comme décrit précédemment. La description de l'invention est focalisée sur la détermination des allotypes des IgG3, mais, comme indiqué plus haut, il est également concevable de développer une méthode selon l'invention comprenant la détermination, par spectrométrie de masse, des allotypes des IgGl ou des IgG2 d'un individu. Alternativement, il est également possible de développer une méthode selon l'invention comprenant la détermination, par spectrométrie de masse, des allotypes des IgG3 et des IgGl d'un individu, ou des allotypes des IgG3 et des IgG2 d'un individu, ou encore des allotypes des IgGl, des IgG2 et des IgG3 d'un individu. IV - Kits La présente invention vise également des kits comprenant du matériel utile pour la réalisation d'une méthode selon l'invention. En particulier, la présente invention concerne un kit pour la détermination du polymorphisme des allotypes des IgG3 d'un individu et un kit pour le diagnostic, chez un nouveau-né, d'une maladie à transmission verticale, en particulier une maladie parasitaire congénitale. En général, un kit comprend une pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m appartenant au groupe consistant en les peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 32 et toute combinaison de ces peptides. Ces peptides seront avantageusement utilisés pour la calibration de l'appareil de spectrométrie de masse utilisée. De façon optionnelle, le kit peut en outre comprendre des instructions pour réaliser la calibration. Par "calibration", on entend toute procédure de réglage ou d'étalonnage du spectromètre de masse utilisé dans une méthode selon l'invention. Dans certains modes de réalisation, le kit comprend tous les peptides discriminants d'allotype G3m (SEQ ID NO: 1-32) et peut donc être utilisé et commercialisé dans le monde entier. Dans d'autres modes de réalisation, le kit ne comprend que les peptides discriminants d'allotypes G3m nécessaires à la détermination d'un haplotype de type "africain" ou de type "asiatique" ou de type "européen" pour une utilisation et une commercialisation géographiques localisées. Les peptides discriminants d'allotypes G3m utiles à la détermination d'un haplotype de type "africain" sont les peptides de séquence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5-6, SEQ ID NO: 8-10, SEQ ID NO: 14-16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20-31, et toute combinaison de ces peptides. Les peptides discriminants d'allotypes G3m utiles à la détermination d'un haplotype de type "asiatique" sont les peptides de séquence SEQ ID NO: 1-10, SEQ ID NO: 12-16, SEQ ID NO: 19-21, SEQ ID NO: 24-25, SEQ ID NO: 28-29, SEQ ID NO: 32, et toute combinaison de ces peptides. Les peptides discriminants d'allotypes G3m utiles à la détermination d'un haplotype de type "européen" sont les peptides de séquence SEQ ID NO: 2-3, SEQ ID NO: 5-6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13-14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, et toute combinaison de ces peptides. Le kit peut comprendre des réactifs ou des solutions pour la préparation des échantillons de calibration. Les différents composants du kit peuvent être fournis sous forme solide (par exemple sous forme lyophilisée) ou sous forme liquide. Un kit peut éventuellement inclure un récipient contenant chacun des réactifs ou solutions, et/ou des récipients (tubes à essais, flacons, etc.) pour réaliser la préparation des échantillons de calibration. Le kit peut également comprendre des réactifs pour la préparation de l'échantillon sanguin à analyser (ex. des réactifs nécessaires à l'isolement des IgG3, et/ou des réactifs nécessaires à la digestion enzymatique des IgG3, etc...). Ces réactifs pourront être compris dans des récipients inclus dans le kit. Enfin, le kit peut comprendre une notice sous la forme prescrite par une agence gouvernementale régulant la vente et l'utilisation de produits à usage médical ou pharmaceutique. A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence. Les exemples suivants et les figures sont présentés pour illustrer certains 25 modes de réalisation des procédures décrites ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Exemples Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention. Méthodes Utilisées 1. Définition de la liste théorique des peptides discriminants d'allotype G3m La liste des peptides protéotypiques a été établie sur la base d'une comparaison des séquences peptidiques de quatre protéines IGHG. Les séquences ont été virtuellement coupées par l'endoprotéinase AspN et la trypsine avec ou sans une coupure enzymatique manquante. Tous les peptides obtenus par digestion enzymatique théorique ont été comparés pour déterminer ceux qui étaient spécifiques de IGHG3 et discriminatoires vis-à-vis des allèles. Une liste a été définie comprenant 32 peptides protéolytiques appropriés pour une analyse utilisant une technique MALDI-TOF/TOF ou une technique Orbitrap. 2. Echantillons de plasma utilisés dans les protocoles de purification et de digestion Les échantillons analysés dans cette étude proviennent de deux régions géographiques distinctes : l'Europe et l'Afrique. Les échantillons sanguins européens ont été obtenus chez des volontaires adultes en bonne santé d'origine française. Cinq (5) millilitres de sang ont été recueillis dans des tubes EDTA Vacutainer . Après centrifugation, 1 mL de plasma frais a été purifié et des fractions aliquotées ont été préparées à partir de la quantité restante de plasma et ont été congelées à -20°C pour des utilisations ultérieures. Les échantillons de plasma africain ont été obtenus au cours de deux études effectuées au Bénin par l'équipe des inventeurs. La première étude réalisée en 2006-2007 a porté sur 155 enfants appartenant principalement au groupe ethnique Fon (Migot-Nabias et al., J. Infect. Dis., 2008, 198: 1892-1895). Des échantillons sanguins ont été recueillis dans des tubes EDTA Vacutainer de 5 mL, et après centrifugation, des échantillons de plasma ont été préparés et congelés à -20°C. Dans la seconde étude, une cohorte de 627 nouveaux-nés d'une région semi-rurale du sud du Bénin et de leurs mères a été constituée et suivie de 2007 à 2010 (Le Port et al., en préparation). A la naissance, un échantillon sanguin de la mère ainsi que le sang de cordon ont été recueillis dans des tubes EDTA Vacutainer . Ensuite, un échantillon du sang de chaque enfant a été recueilli tous les trois mois jusqu'à l'âge de 18 mois. Les échantillons de plasma ont été conservés à -80°C. Dans la présente étude, des échantillons provenant de la mère au moment de la naissance et de son enfant (sang de cordon et échantillons de plasma obtenus à 3, 6 et 9 mois après la naissance) ont été utilisés. 3. Détermination sérologiques des allotypes Gm d'immunoglobulines Les allotypes Gm des spécimens de plasma ont été analysés par la méthode standard qualitative d'inhibition de l'hémagglutination (Dugoujon et al., Vox Sanguinis, 1989, 57: 133-136; Field and Dugoujon, Gen. Epidem., 1989, 6: 31-33). Brièvement, les érythrocytes de sang humain du groupe O Rh+ ont été enrobés avec des anticorps anti-Rh d'allotypes Gm connus, des échantillons de plasma, et des anticorps antiallotypes monospécifiques. Après sédimentation, les spécimens de plasma contenant des IgG d'un allotype particulier inhibent l'hémagglutination par l'anticorps anti-allotype tandis que les spécimens de plasma testés négatifs pour l'IgG pertinent ne causent pas d'inhibition. 4. Purification des IgG3 totales Le plasma issu d'échantillons de sang fraîchement recueilli a été directement purifié et les échantillons de plasma congelé ont été utilisés après centrifugation afin d'éliminer les agrégats de fibrine. Un volume de 250 gL de plasma est suffisant pour détecter et quantifier les peptides des IgG3 totales purifiées. Une colonne (HiTrap Protein A HP, GE Healthcare) de Protéine A a été utilisée pour la première étape de purification réalisée suivant les instructions du fournisseur. Cette colonne est utilisée pour retenir les immunoglobulines interférentes IgGl, IgG2 et IgG4 en laissant passer les immunoglobulines IgG3 dans le filtrat. La rétention des IgGl, IgG2 et IgG4 dans la colonne de Protéine A nécessite une force ionique faible, un pH 7. La fraction de filtrat résultant de la chromatographie sur colonne de Protéine A et comportant les IgG3 doit être débarrassée des autres protéines sériques. Elle est donc passée sur une colonne de Protéine G (Protein G Sepharose HP SpinTrap, GE Healthcare) qui présente une forte affinité pour les fragments Fc des immunoglobulines sans distinction de classe. Les autres protéines de sérum, non retenues, se retrouvent éliminées dans le filtrat (Figure 1). La rétention des IgG3 dans la colonne est réalisée à pH neutre et les IgG3 sont éluées en diminuant le pH. L'éluat est neutralisé pour préserver la qualité des immunoglobulines labiles en milieu acide. La qualité de la purification est évaluée par ELISA contre les différentes classes d'IgG. 5. Réduction, alkylation et digestion enzymatique Les réactions de réduction, alkylation et digestion enzymatique ont été réalisées soit en solution, soit sur les bandes de gel d'acrylamide 12% correspondant aux chaînes lourdes des IgG après migration électrophorétique des échantillons purifiés en conditions réductrices. Plusieurs enzymes ont été testés, seuls ou combinés, dont : papaïne, G1uC, PNGase, AspN et trypsine. L'objectif était de sélectionner le ou les enzymes permettant de circonscrire le plus grand nombre de séquences peptidiques discriminantes (c'est-à-dire spécifiques d'allotype) dans une fourchette de masses accessibles aux spectromètres de masse haute résolution. Une combinaison d'AspN et de trypsine à une concentration finale de 10 ng/µL a fourni le meilleur résultat. Utilisation des échantillons d'IgG sur gels SDS-PAGE. Quinze (15) µL d'un mélange (volume/volume) 2X (3-mercapthoéthanol/tampon de Laemmli ont été ajoutés aux 15 µL des échantillons purifiés. Après avoir été portés à ébullition à 100°C pendant 5 minutes, les échantillons ont été migrés sur un gel de 12% SDS-PAGE coloré au Bleu de Coomassie. Les bandes de 60 kDa correspondant à la chaîne lourde de l'IgG ont été découpées. Les échantillons de gels ont été décolorés avec de l'acétonitrile à 50%, soumis à une réduction en présence de 20 mM de DTT pendant 30 minutes à 56°C, et à une alkylation en présence de 25 mM de chloroacétamide pendant 30 minutes à température ambiante pour protéger les groupements thiols des protéines. Après addition de 1 volume d'acétonitrile pour déshydrater le gel et élimination du surnageant, 1 gL d'AspN (10 ng/mL, Roche) a été ajouté sur le gel. Les échantillons ont été incubés pendant une nuit à 30°C ou pendant 3 heures à 37°C. Une digestion supplémentaire a été effectuée avec 2 gL de trypsine fraichement activée (10 ng/mL, Modified Sequencing Grade from Promega). Les surnageants ont été recueillis et remplacés par 10 gL d'acide formique (4%) pendant 5 minutes à température ambiante. Après une étape de sonication de 30 secondes, le surnageant a été recueilli et remplacé par de l'acétonitrile à 50% pour déshydrater le gel et extraire les peptides du gel. A chaque étape, les surnageants ont été recueillis, et entièrement déshydratés sous vide. Les échantillons ont été remis en suspension dans un mélange d'acétonitrile à 10% et d'acide trifluoroacétique (TFA) 0,1%. Utilisation des échantillons d'IgG en solution. Du DTT a été ajouté à une concentration finale de 10 mM dans 37 gL d'échantillon purifié en solution pour réduire les liaisons disulfides pendant 30 minutes à 56°C. Du chloroacétamide a été ajouté à une concentration de 25 mM. De l'AspN (1 µL, 10 ng/mL) a été ajouté au mélange réactionnel et incubé pendant 3 heures à 37°C ou pendant une nuit à 30°C. De la trypsine (2 µL, 10 ng/µL), fraîchement activée, a ensuite été ajoutée dans les mêmes conditions d'incubation. Après réaction, de l'acide trifluoroacétique (TFA, 20%, 1 µL) a été ajouté pour stopper la digestion enzymatique. 6 Analyses par spectrométrie de masse MALDI (MALDI-MS) Nanochromatographie. Les peptides des échantillons obtenus après digestion enzymatique ont été concentrés et séparés par HPLC (Ultimate3000, Dionex). Brièvement, 10 gL d'éluat ont été injectés dans une pré-colonne C18 (Acclaim pepmapl00 C18, particules de 5 µm, pores de 100 À, diamètre interne de 300 µm, et 5 mm de longueur). Les peptides ont ensuite été élués (300 nL/min) vers la colonne analytique (Cl8pepmapl00, particules de 3 µm, pores de 100 À, diamètre interne de 75 µm et 15 cm de longueur) avec un gradient allant de 7% de solvant B (80% d'acétonitrile, 20% de solvant A) au moment de l'introduction des peptides dans la colonne analytique à 20% de solvant B en 7 minutes et de 20% de solvant B à 60% de solvant B en 58 minutes. Les fractions ont été mélangées en un rapport 1:9 avec 3 mg/mL d'HCCA (Laser Biolabs) dans 70% d'acétonitrile (Carlo Erba), 0,1% de TFA (Pierce) et du Glu-fibrinopeptide à 3 fmoles/spot. Un total de 192 fractions ont été recueillies et analysées en utilisant un analyseur 4800 MALDI TOF/TOF (ABI). Spectrométrie MALDL L'acquisition et le traitement des spectres de masse ont été effectués avec le logiciel 4000 series explorer (ABSciex, version 3.5.28193 build 1011) en mode réflectron positif à une fluence laser constante avec un filtrage des ions de faible masse, et une extraction retardée. Une calibration externe de la plaque a été réalisée en utilisant 4 points de calibration répartis sur la plaque. De plus, une calibration interne utilisant le Glufibrinopeptide a permis une exactitude de mesure inférieure à 10 ppm. Pour chaque fraction, 10 séries de 50 spectres ont été enregistrées dans le domaine de 700 à 4000 kDa à une fréquence LASER de 200 Hz. Pour chaque échantillon, les 500 spectres bruts additionnés ont été traités pour obtenir des valeurs monoisotopiques à partir de massifs isotopiques de rapports signal/bruit de minimum 20. Spectrométrie MALDI-MS/MS Dans chaque spectre de masse, les 8 pics les plus abondants ont été sélectionnés pour fragmentation en commençant par le moins abondant. Les précurseurs voisins dans une résolution de 200 ont été exclus. Pour chaque précurseur, 1000 spectres MS/MS ont été additionnés par incréments de 50. Les spectres ont été traités comme suit : soustraction de la ligne de base, lissage de Stavitsky Golay avec 3 points sur le pic et un ordre polynomial de 4. Les listes de pics reflètent les valeurs monoisotopiques des clusters d'isotopes avec un rapport signaUbruit minimum de 22. Les listes de pics générés en MS/MS ont ensuite été ensuite soumises à un moteur de recherche Mascot (Matrix science) interne, version 2.2 pour identifier les peptides (voir ci-dessous). Spectrométries LTQ-ORBITRAP MS et MS/MS. Les analyses ont été réalisées par un système de chromatographie liquide à séparation rapide (Ultimate 3000 RSLC, Dionex) couplé à un spectromètre de masse (LTQ-Orbitrap Velos, Thermo Fisher Scientific). Brièvement, les peptides obtenus par digestion enzymatique ont été chargés sur une pré-colonne en phase inverse (C18, particules de 3 µm, pores de 100 À, diamètre interne de 75 µm, et 2 cm de longueur) avec un solvant de chargement contenant 98% d'eau, 2% d'acétonitrile et 0,1% d'acide trifluoroacétique à 5 µL/minute. Les peptides ont été séparés sur une colonne analytique en phase inverse (C18, particules de 2 µm, pores de 100 À, diamètre interne de 75 µm, et 15 cm de longueur) avec un gradient de 45 minutes allant de 100% de solvant A (5% d'acétonitrile, 0,1% d'AF et 95% d'eau) à 40% de solvant B (80% d'acétonitrile, 0,085% d'acide formique et 20% d'eau). Le spectromètre de masse (LTQ-Orbitrap) acquiert les données tout au long du procédé d'élution et fonctionne comme suit : les scans MS ont été acquis avec l'Orbitrap, suivi par jusqu'à 10 spectres de LTQ MS/MS CID sur les précurseurs les plus abondants détectés dans les scans MS. L'exclusion de latence a été fixée à 24 secondes pour les précurseurs préalablement fragmentés. Les réglages du spectromètre de masse utilisés sont comme suit: MS (AGC: 1x106, résolution: 3x104, m/z de 400-2000, temps d'injection d'ions maximal: 1000 ms) ; MS/MS (AGC: 1x104, temps d'injection d'ions maximal: 200 ms, seuil minimal de signal: 2000, largeur d'isolement: 2 Da). La fragmentation a été permise pour des précurseurs avec un état de charge de 2 ou 3. Traitement des Spectres. Le logiciel utilisé pour extraire les listes de pics et générer les fichiers mgf (mascot generic file) est Proteome discoverer 1.2 avec une valeur seuil de signal sur bruit de 3. Recherche dans Base de Données. Les spectres MS/MS obtenus par les deux spectromètres de masse ont été soumis à un moteur de recherche Mascot (Matrix science) interne, version 2.2 pour identifier les peptides. La base de données recherchée est une base de données "Parasitoswissprot" développée en interne (résultant de la concaténation de la base de données IgHG Immunoglobulin-variants database d'IMGT avec la base de données Plasmodium fasta "plasmoDB" et la base de données SwissProt fasta, soit au total 529942 séquences, 189364547 résidus). La tolérance de masse pour les précurseurs a été fixée à 20 ppm au MALDI et 3 ppm en Orbitrap. Pour les fragments, elle a été fixée à 0,45 Da, l'oxydation des méthionines était partiellement permise et la carbamidométhylation était considérée complète. La recherche effectuée n'était pas restreinte à une espèce. Les spécificités de clivage enzymatique définies étaient la combinaison de celles de la trypsine et de l'AspN. Un filtre a été appliqué à la recherche de façon à réduire la probabilité de faux positifs à moins de 5% (valeur minimale de score Mascot de 25 pour les peptides). Information semi-quantitative sans marquage. Le logiciel Progenesis (Version 3.0; Nonlinear Dynamics Ltd) a été utilisé pour quantifier la variation des peptides discrimants sur la base du temps de rétention, le rapport m/z et l'intensité du pic (surface du pic) des échantillons. Le logiciel Progenesis traite les fichiers de données brutes issues de l'Orbitrap en deux étapes : alignement suivi par une normalisation. Le fichier de données qui a conduit au plus grand nombre de caractéristiques (rapport 1:1) a été utilisé comme référence, pour aligner le temps de rétention avec les autres mesures. Les variations expérimentales ont été corrigées par calcul de la distribution robuste de tous les rapports (log(ratio)). Les pics chromatographiques (les évènements) ont été convertis en une liste d'intensités et de temps de rétention en utilisant les fichiers des données brutes. Les données ont été filtrées en conservant les évènements selon les critères suivants: rapport masse/charge entre 300-1700, temps de rétention de 8-25 minutes, et état de charge de 2 à 4. Une matrice de tous les échantillons, constituée de toutes les masses correspondant aux intensités des pics de chaque échantillon, a été générée. Des fichiers mgf (mascot generic files) ont été exportés de Progenesis et importés dans un logiciel Mascot; et une interrogation a été effectuée sur la base de données Parasitoswissprot (taxonomie: mammifères, enzyme: AspN+trypsine, modification fixée: carbamidométhylation, modification variable: oxydation, nombre de coupures manquantes permises: jusqu'à 2, tolérance peptide: +/- 5 ppm, tolérance MS/MS: +/- 0,45 Da, charge du peptide: 2+ 3+ ou 4+). Les fichiers XML résultants ont été importés dans Progenesis pour assigner un peptide aux évènements. Les abondances normalisées des peptides ont été analysées en utilisant le logiciel excel. Légendes des Figures Figure 1 montre la migration sur gel d'acrylamide des fractions de purification issues du passage d'un échantillon plasmatique sur colonne de Protéine A puis de Protéine G. AF: Fractions de filtrat successives provenant de la purification sur colonne de Protéine A contenant des IgG3 et des protéines plasmatiques; AE: Fractions d'élution provenant de la purification sur colonne de Protéine A contenant des IgGl, IgG2, IgG4; GE: Fractions d'élution provenant de la purification sur colonne de Protéine G contenant des IgG3; GW: Fractions de lavages provenant de la purification sur colonne de Protéine G contenant des protéines plasmatiques. Figure 2 est une liste des 32 peptides discriminants d'allèles IGHG3 observables après coupure théorique par une combinaison AspN/trypsine de la chaîne lourde des IgG3 et dont la masse a été déterminée pour une mesure au MALDI et à l'ESI-ORBITRAP. Les acides aminés en gras sont impliqués dans la discrimination entre les allèles IGHG3 entrant dans la composition des allèles G3m. Les peptides sont représentés en montrant les sites de coupure enzymatique par un point (" . ") et les acides aminés avant et après les coupures enzymatiques. Un seul défaut de coupure est toléré. Les cystéines carbamidométhylées sont présentées par " C° ". Les masses m/z (Mox) sont les masses calculées en prenant en compte la possibilité d'oxydation de la méthionine (M). Les masses m/z déterminées à l'ESI-ORBITRAP sont les masses des peptides bi- / tri- / et quadri- chargés. Figure 3 est un spectre MALDI-TOF d'une digestion trypsique de chaîne lourde d'IgG3 purifiée d'un échantillon plasmatique d'un individu d'origine européenne. Les peptides trypsiques assignés correspondant aux masses étiquetées (*) sont indiqués en rouge (vert* pour les cystéines propionamidées). Le précurseur sélectionné avec une m/z de 2314,06 a été soumis à une fragmentation CID dans le MALDI en mode MS/MS. Le spectre de fragmentation donne un résultat Mascot qui confirme sans ambigüité la présence du peptide d'IGHG3 347-365 : R.WQQGNIFSCSMHEALHNR.F dont la masse permet de discriminer les variations d'acides aminés (en rouge). Figure 4 est un graphe montrant l'abondance relative de peptides discriminants de deux allèles G3m en fonction de différents rapports volumiques des deux iso formes. Figure 5 est un graphe montrant l'abondance relative du peptide WQQGNIFSCSVMHEALHNR dans des échantillons de terrain. CI = sang de la mère, CO = sang de cordon ombilical, M = sang de l'enfant à 3, 6 et 9 mois ; trois répétitions techniques de l'expérience Résultats 1. Détermination sérologique des allotypes Gm des immunoglobulines des échantillons de plasma L'individu français a un phénotype Gm5,10,11,13,14,26,27;3 comprenant les allèles G3m5,10,11,13,14,26,27 et Glm3 qui sont communément associés avec les haplotypes Gm des individus d'origine européenne. Deux enfants du Bénin issus d'une étude précédente (Migot-Nabias et al., J. Infect. Dis., 2008, 198: 1892-1895), homozygotes pour les allèles G3m5,10,11,13,14,26,27 (individu AS20, phénotype Gm5,10,11,13,14,26,27;1,17) et G3m5,6,11,24,26 (individu NP47, phénotype Gm5,6,11,24,26;1,17) qui sont communément exprimés dans les populations sub-Sahariennes ont été sélectionnés. Les échantillons de plasma d'une mère et de son enfant ont été sélectionnés d'une étude multidisciplinaire sur le paludisme effectuée au Bénin en 2007-2010. La détermination sérologique a conclut à un phénotype Gm5,6,10,11,13,14,24,26,27,28;1,17 pour la mère (individu A170M) et à un phénotype Gm5,10,11,13,14,26,27;1,17 pour l'enfant (détermination sérologique effectuée sur le plasma de A170M15 recueilli à l'âge de 15 mois). La détermination sérologique du père (individu A170P, Gm5,10,11,13,14,15,26,27,28;1,17) a permis de déduire que la mère était G3m hérérozygote (G3m5,10,11,13,14,26,27 / G3m5,6,11,24,26,28) et son enfant, homozygote pour G3m5,10,11,13,14,26,27. 2. Purification des IgG3 d'un échantillon de plasma issu d'un individu français Toutes les fractions résultant d'une chromatographie d'affinité sur des colonnes de Protéine A et de Protéine G ont été migrées sur un gel de 12% SDS- PAGE (Figure 1) et puis testées par ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) pour mesurer les quantités de chaque sous-classe d'immunoglobulines tout au long du procédé de purification. Sur le gel non-réduit, la fraction AF (3 puits) est constituée d'IgG3 avec une bande à environ 160 kDa et de plusieurs autres protéines plasmatiques qui sont représentées par les autres bandes. Dans la fraction AE, les IgGl, IgG2 et IgG4 et d'autres protéines plasmatiques sont éluées. La fraction GE (2 puits) contient une contamination par les protéines de plasma. Un lavage de ces fractions (3 puits) élimine la plupart des protéines contaminantes. Sur le gel réduit, le premier éluat GE 1 de la colonne de Protéine G est contaminé par des protéines plasmatiques mais les IgG sont présentes de façon prédominante. Les fractions de lavage (3 puits) présentent une bande de 60 kDa. Il est possible que certaines immunoglobulines soient perdues durant les étapes de lavage. L'application d'un essai ELISA à toutes les fractions a confirmé ces 30 observations (Tableau 3): les IgG3 sont libérées dans les fractions AE et GF; une contamination par d'autres sous-classes d'IgG a eu lieu dans les fractions GE; les éluats GEl et GE2 sont composés d'IgGl (22,7%), IgG2 (2%), IgG3 (29%) et IgG4 (46,3%). La purification par chromatographie sur colonne de Protéine A élue 95% d'IgG3. Tableau 3: Dosage par ELISA des sous-classes d'IgG contenues dans les fractions de purification issues du passage d'un échantillon plasmatique sur colonnes de Protéine-A puis de Protéine-G. Fractions IgGl (AU) IgG2 (AU) IgG3 (AU) IgG4 (AU) AE1 91,3 103,8 89,5 0 AE2 133,0 106,6 214,8 972,6 AE3 113,3 106,5 152,7 640,3 AE4 90,9 64,8 0 0 AE5 74,9 31,2 0 0 GF1 65,8 57,0 101,1 0 GF2 0 0 93,7 0 GF3 0 0 100,5 0 GF4 0 57,8 99,2 0 GF5 0 0 90,4 0 GF6 0 99,5 30,9 0 GF7 0 0 0 0 GE1 135,8 0 0 0 GE2 0 11,8 173,5 276,5 GE3 0 22,6 100 0 GE4 0 0 0 0 Résultats exprimés en Unités Arbitraires (UA); AE: Fractions d'élution provenant de la purification sur colonne de Protéine A contenant des IgGl, IgG2, IgG4; GF: Fractions de filtrat provenant de la purification sur colonne de Protéine G contenant des protéines plasmatiques; GE: Fractions d'élution provenant de la purification sur colonne de Protéine G contenant des IgG3. En conclusion, les colonnes de Protéine A et de Protéine G permettent de purifier la majorité des IgG3. Les résultats de spectrométrie de masse montrent que la contamination par des sous-classes d'IgG gêne la mesure des peptides d'IgG3. Néanmoins, la liste de peptides discriminants présentés dans le tableau 4 ci-dessous est spécifiquement représentative d'IgG3 parmi d'autres sous-classes d'IgG et contrebalance ce handicap. Tableau 4 : Liste des 32 peptides spécifiques d'allèles IGHG3 observables après coupure théorique par une combinaison AspN / trypsine de la chaîne lourde des IgG3. Peptides protéotypiques Allèles IGHG3 Région CH2 TKPWEEQYNSTFR *18, *19 TKPREEQYNSTFR LREEQYNSTFR DGVEVHNAKTKPWEEQYNSTFR EEQYNSTFRVVSVLTVLHQ EEQYNSTFRVVSVLTVVHQ TKPWEEQYNSTFRVVSVLTVLHQ *01 à *Io, *13, *17 *14 à *16 *13 à *17 *18, *19 *01 à *08, *10, *09 *18, *19 Région CH3 GFYPSDIAVEWESSGQPENNYK *06, *07 *09 à *13 GFYPSDIAMEWESSGQPENNYK * 17, *18, *19 GFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPML *01, *04, *05, GFYPSDIAVEWESSGQPNNNYNTTPPML *02 GFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPVL GFYPSDIAVEWESNGQPENNYNTTPPML *03 *08, *14 à *16 DIAVEWESSGQPENNYK *06, *07 *09 à *13 DIAMEWESSGQPENNYK *17, *18, *19 DIAVEWESSGQPENNYNTTPPML *01, *04, *05, DIAVEWESSGQPNNNYNTTPPML *02 DIAVEWESSGQPENNYNTTPPVL DIAVEWESNGQPENNYNTTPPML *03 *08, *14 à *16 SRWQQGNIFSC°SVMHEALHNHYTQK *17 à *19 *12, *14 à *16 SRWQQGNIFSC°SVMHEALHNR *01, *02, *06 à SRWQEGNVFSC°SVMHEALHNR *03 SRWQEGNIFSC°SVMHEALHNR *13 WQQGNIFSC°SVMHEALHNHYTQK *17 à *19 *12, *14 à *16 WQQGNIFSC°SVMHEALHNR *01, *02, *06 à WQEGNVFSC°SVMHEALHNR *03 WQEGNIFSC°SVMHEALHNR *13 WQQGNIFSC°SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK *17 à *19 *12 WQQGNIFSC°SVMHEALHNRFTQK *01, *02, *06 à WQEGNVFSC°SVMHEALHNRFTQK *03 WQEGNIFSC°SVMHEALHNRFTQK *13 WQQGNIFSC°SVMHEALHNRYTQK *14 à *16 Dans le tableau 4, les acides aminés en gras sont impliqués dans la discrimination entre les allèles IGHG3 entrant dans la composition des allèles G3m ; et Cc représente une cystéine carbamidométhylée. 3. Liste des peptides discriminants d'allotypes G3m Les 32 peptides protéolytiques appropriés pour une analyse utilisant une technique MALDI-TOF/TOF ou Orbitrap identifiés théoriquement comme décrit ci-dessus sont présentés dans le Tableau 4 avec les allèles IGHG3 dont ils sont discriminants, et le Tableau 5 présente une correspondance entre les allèles IGHG3 et les allèles G3m. Tableau 5 : Correspondance entre les allèles IGHG3 et les allèles G3m. Allèles IGHG3 Allèles G3m Nomenclature Nomenclature complète simplifiée IGHG3*01, IGHG3*05, G3m5,10,11,13,14,26,27 G3m5* IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3 *09, IGHG3 *10, IGHG3 * 11, IGHG3 *12 IGHG3 * 13 G3m5,6,10,11,14,26,27 G3m6* IGHG3*03 G3m5,6,11,24,26 G3m24* IGHG3 * 17 G3m10, l 1,13,15,27 G3m15* IGHG3 *18, IGHG3 *19 G3m10,11,13,15,16,27 G3m16* IGHG3 * 14, IGHG3 *15, G3m21,26,27,28 G3m21 * IGHG3 *16 La Figure 2 présente les 32 peptides, montrant en plus les sites de coupure enzymatique ainsi que les acides aminés précédant et suivant les coupures enzymatiques. La Figure 2 liste également les masses correspondantes de ces peptides déterminées pour une mesure au MALDI-MS et à l'ESI-MS. 4. Spectre MALDI-TOF/TOF de la chaîne lourde digérée d'IgG3 purifiées d'un échantillon plasmatique provenant d'un individu d'origine française Comme indiqué ci-dessus, la détermination sérologique a conclu que l'individu français est homozygote pour l'allèle G3m5,10,11,13,14,26,27. Les IgG3 totales d'un échantillon sanguin de cet individu ont été isolées et la chaîne lourde des IgG3 a été soumise à une digestion enzymatique en présence de trypsine et d'AspN. Une analyse MALDI-TOF/TOF selon l'invention a permis de détecter le peptide WQQGNIFSCSVMHEALHNR avec un rapport m/z = 2314,06 (Figure 3). En plus de ce dernier, un autre peptide discriminant de l'allèle G3m5,10,11,13,14,26,27 a pu être identifié par ESI-LTQ-Orbitrap : DIAVEWESSGQPENNYNTTPPML (avec oxydation de la méthionine) à m/z-870.05. Les mêmes spectres ont été obtenus que l'échantillon ait été préparé à partir de plasma obtenu de sang total fraîchement recueilli ou après congélation et décongélation. 5. Sensibilité de la méthode de détermination des allotypes G3m par spectrométrie de masse Les expériences ont été effectuées sur une série de mélanges contrôlés d'échantillons de plasma de deux individus du Bénin dont il a été déterminé par une méthode sérologique qu'ils étaient homozygotes pour les allèles G3m5,10,11,13,14,26,27 et G3m5,6,11,24,26, respectivement. Les résultats de la détermination par spectrométrie de masse selon l'invention montrent la présence de la séquence peptidique WQQGNIFSCSVMHEALHNR pour le premier individu et de la séquence peptidique WQEGNVFSCSVMHEALHNR pour le second individu. Les mélanges de rapports volume/volume comme indiqués sur la Figure 4 ont été réalisés avant réduction, alkylation et digestion enzymatique. Il y a une tendance à une diminution progressive du peptide discriminatoire 1 représentatif de l'allèle G3m5,10,11,13,14,26,27 et inversement une augmentation progressive du peptide discriminatoire 2 représentatif de l'allèle G3m5,6,11,24,26. Dans les mélanges 1:0 et 0:1, le peptide «manquant» est mesuré alors qu'il n'est pas attendu, ce qui s'explique par le fait que le signal background est mesuré par le logiciel. De plus, la quantité résultante de peptides pour ces deux rapports volumétriques est inférieure à celle attendue. En fait, ce résultat est basé sur seulement un répliquat technique tenant compte d'une seule forme (+3) des peptides pertinents, les deux autres formes (+2, et M-oxydés 2+ et 3+) n'ayant pas été considérées. Néanmoins, les peptides sont détectés au moins au rapport volumétrique de 1:16, indiquant une bonne sensibilité de la méthode de détection. 6. Application de l'approche protéomique à des échantillons plasmatiques d'une mère et de son enfant Les expériences ont été effectuées sur les IgG3 totales purifiées d'échantillons de plasma obtenus d'une mère béninoise (individu A170) et de son bébé de la naissance à l'âge de 9 mois (Figure 5). Comme indiqué ci-dessus, la détermination sérologique a indiqué que la mère était hétérozygote (G3m5,10,11,13,14,26,27 / G3m5,6,11,24,26,28) et que l'enfant était homozygote pour G3m5,10,11,13,14,26,27. Les résultats de la détermination par spectrométrie de masse selon l'invention montrent la présence de la séquence peptidique WQQGNIFSCSVMHEALHNR chez la mère et chez l'enfant. Les résultats obtenus présentés sur la Figure 5 montrent une augmentation de la quantité du peptide WQQGNIFSCSVMHEALHNR entre la naissance (échantillon CO) et l'âge de 3 mois (échantillon M3) de l'enfant. Cette augmentation peut s'expliquer par une apparition des IgG3 néo-synthétisées. Une diminution de la quantité de ce peptide à l'âge de 6 mois (échantillon M6) correspond à la perte d'IgG3 maternelles transmises pendant la grossesse et comprenant, de façon partielle, ce peptide. A 9 mois (échantillon M9), seules les IgG3 néo-synthétisées par l'enfant sont observées. 7. Peptides discriminants d'allèles G3m observés par spectrométrie de 20 masse L'analyse par spectrométrie de masse des échantillons de plasma obtenus de l'individu d'origine française, des deux enfants Béninois et de la mère et de son enfant béninois ont permis d'observer trois peptides, à savoir : DIAVEWESSGQPENNYNTTPPML, WQQGNIFSC°SVMHEALHNR et 25 WQEGNVFSC°SVMHEALHNR, qui sont tous inclus dans la liste des peptides théoriques présentée dans le Tableau 4. Les allèles IGHG3 qu'ils permettent de distinguer correspondent aux allèles G3m comme suit (Lefranc et al., "Human Gm, Km and Am allotypes and their molecular characterization: a remarkable demonstration of polymorphism", In: 30 Methods in Molecular Biology, Eds. B. Trait and F. Christiansen, in press): DIAVEWESSGQPENNYNTTPPML (SEQ ID NO: 16) est discriminant des allèles IGHG3*01, *04, *05, *09 à *13. WQQGNIFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 25) est discriminant des allèles IGHG3*01, *02, *06 à *12, *14 à *16 ; et WQEGNVFSC°SVMHEALHNR (SEQ ID NO: 26) est discriminant de l'allèle IGHG3 *03, où IGHG3*01, *05, *06, *07, *09, *10, *11, *12 correspond à l'allèle G3m5,10,11,13,14,26,27; IGHG3*13 correspond à l'allèle G3m5,6,10,11,14,26,27; IGHG3*3 correspond à l'allèle G3m5,6,11,24,26 et IGHG3 * 14, *15, *16 correspond à l'allèle G3m21,26,27,28. Des restrictions à l'utilisation de cette méthode pourraient être rencontrées dans les rares cas où la mère et l'enfant sont soit homozygotes soit hétérozygotes pour les mêmes allèles G3m. Le polymorphisme G3m n'est pas aussi étendu dans certains groupes de populations distribués dans le monde (Dugoujon et al., Am. J. Phys. Anthrop., 2004, 125: 175-192). Dans ces cas, le recours au polymorphisme Glm (4 allèles IGHG1) sera nécessaire pour s'assurer de la capacité à distinguer les allèles IGHG de la mère et de l'enfant. REVENDICATIONS1. Méthode in vitro de détermination des allotypes des immunoglobulines G3 (IgG3) d'un individu comprenant une étape consistant à : déterminer, par spectrométrie de masse, les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin de l'individu. 2. Méthode selon la revendication 1 comprenant en outre les étapes consistant à : isoler les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de l'individu; soumettre les IgG3 isolées à une digestion enzymatique pour obtenir un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 ; et détecter par spectrométrie de masse, parmi le mélange de peptides protéotypiques d'IgG3, la présence d'au moins un peptide discriminant d'allotype G3m afin de déterminer les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de l'individu. 3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le ou les peptides discriminants d'allotype G3m appartient/appartiennent au groupe consistant en les peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 32. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'analyse par spectrométrie de masse est effectuée par un technique de spectrométrie de masse en tandem, notamment MALDI-TOF/TOF ou ESI-LTQ Orbitrap. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que l'étape d'isoler les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de l'individu comprend une chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine A suivie d'une chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine G. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que l'étape de soumettre les IgG3 isolées à une digestion enzymatique pour obtenir un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 comprend une digestion enzymatique en présence d' endoprotéinase AspN et de trysine. 7. Méthode in vitro de détection d'anticorps d'un nouveau-né comprenant des étapes consistant à : déterminer, par spectrométrie de masse, les allotypes des immunoglobulines G3 (IgG3) présentes dans un échantillon sanguin du nouveau-né, l'échantillon sanguin du nouveau-né comprenant des IgG3 du nouveau-né et des IgG3 maternelles transmises au nouveau-né pendant la grossesse; comparer les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de l'enfant avec les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin de la mère ; et détecter, et éventuellement quantifier, les IgG3 du nouveau-né. 8. Méthode selon la revendication 7 comprenant en outre les étapes consistant à : isoler les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né; soumettre les IgG3 isolées à une digestion enzymatique pour obtenir 20 un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 ; et détecter par spectrométrie de masse, parmi le mélange de peptides protéotypiques d'IgG3, la présence d'au moins un peptide discriminant d'allotype G3m afin de déterminer les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né. 25 9. Méthode in vitro de diagnostic, chez un nouveau-né, d'une maladie infectieuse causée par un pathogène, la méthode comprenant des étapes consistant à : déterminer, par spectrométrie de masse, les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans un échantillon sanguin dunouveau-né, l'échantillon sanguin du nouveau-né comprenant des IgG3 spécifiques du pathogène du nouveau-né et des IgG3 maternelles spécifiques du pathogène transmises au nouveau-né pendant la grossesse ; comparer les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans l'échantillon sanguin de l'enfant avec les allotypes des IgG3 présentes dans un échantillon sanguin de la mère ; et détecter, et éventuellement quantifier, les IgG3 spécifiques du pathogène du nouveau-né. 10. Méthode selon la revendication 9 comprenant en outre les étapes consistant à : isoler les IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né; soumettre les IgG3 spécifiques du pathogène isolées à une digestion enzymatique pour obtenir un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 ; et détecter, par spectrométrie de masse, parmi le mélange de peptides protéotypiques d'IgG3, la présence d'au moins un peptide discriminant d'allotype G3m afin de déterminer les allotypes des IgG3 spécifiques du pathogène présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que le ou les peptides discriminants d'allotype G3m appartient/appartiennent au groupe consistant en les peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 32. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 1l, caractérisée en ce que l'analyse par spectrométrie de masse est effectuée par un technique de spectrométrie de masse en tandem, notamment MALDI-TOF/TOF ou ESI-LTQ Orbitrap. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisée en ce que l'échantillon sanguin du nouveau-né est un échantillon sanguin prélevé entre la naissance et le 9ème mois de vie du nouveau-né. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisée en ce que l'échantillon sanguin du nouveau-né est un échantillon plasmatique. 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, caractérisée en ce que les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de la mère sont déterminées par une méthode d'immunohématologie, notamment une méthode d'inhibition de l'hémagglutination. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, caractérisée en ce que les allotypes des IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin de la mère sont déterminés par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisée en ce que l'étape d'isoler les IgG3 présentes dans l'échantillon sanguin du nouveau-né comprend une chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine A suivie d'une chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine G. 18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 17, caractérisée en ce que l'étape de soumettre les IgG3 isolées à une digestion enzymatique pour obtenir un mélange de peptides protéotypiques d'IgG3 comprend une digestion enzymatique en présence d' endoprotéinase AspN et de trysine. 19. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 18, caractérisée en ce que la maladie infectieuse est une infection virale, une infection bactérienne ou une infection parasitaire. 20. Méthode selon l'une quelconque des revendications 19, caractérisée en ce que la maladie infectieuse parasitaire est le paludisme ou malaria causéepar le pathogène Plasmodium falciparum ou la maladie de Chagas causée par le parasite Trypanosoma cruzi ou la toxoplasmose causée par le pathogène Toxoplasma gondii. 21. Kit pour la détermination des allotypes des IgG3 d'un individu par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou d'un nouveau-né par une méthode selon l'une quelconque des revendications 7-8 et 11-18, le kit comprenant une pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m appartenant au groupe consistant en les peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 32, où les peptides sont destiné(s) à être utilisés pour calibrer un spectromètre de masse. 22. Kit pour le diagnostic d'une maladie infectieuse à transmission verticale chez un nouveau-né par une méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, le kit comprenant une pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m appartenant au groupe consistant en les peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 32, où les peptides sont destiné(s) à être utilisés pour calibrer un spectromètre de masse 23. Utilisation d'une pluralité de peptides discriminants d'allotype G3m appartenant au groupe consistant en les peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 32 pour calibrer un spectromètre de masse utilisé dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.