Brevet FR2980478A1 — publié le 20130329

B 10079FR 1 La présente invention concerne des composés organiques, utilisables comme ligands pour la préparation de complexes de lanthanides ou de certains métaux de transition solubles dans l'eau, un procédé pour leur préparation, ainsi que leur utilisation à titre de sonde fluorescente. Les complexes d'ions lanthanides possèdent des propriétés spectroscopiques très particulières qui permettent des applications dans le domaine de la détection par luminescence. Ces complexes possèdent un très large déplacement de Stokes, des raies d'émission très fines, de l'ordre de quelques nm, qui sont caractéristiques de l'ion lanthanide utilisé. Ils peuvent émettre dans le domaine visible ou proche infrarouge, et ils ont un temps de vie de l'état excité extrêmement long, pouvant atteindre la milliseconde. Cette dernière caractéristique est un atout essentiel : elle permet une détection en temps résolu (ce qui permet d'éliminer les signaux de fluorescence parasite) et elle provoque une très forte augmentation de la sensibilité de détection des complexes en microscopie de luminescence ou dans les analyses fluoroimmunologiques. Les complexes luminescents d'ions lanthanides ont par conséquent des applications dans la plupart des domaines de la fluorescence conventionnelle. Cependant, les complexes d'ions lanthanides sont généralement difficiles à obtenir. De nombreuses propriétés du complexe dépendent de la structure du ligand et de l'ion lanthanide, notamment l'efficacité d'excitation du complexe, le degré de stabilité de la complexation des lanthanides en milieu chimique compétitif et en milieu sérique (qui doit être élevé pour éviter le relargage des cations), le rendement quantique de luminescence et la possibilité de former des liaisons covalentes avec le matériel à marquer pour les applications biologiques des complexes. Une excitation adéquate des complexes peut être obtenue lorsque le ligand du complexe comprend des groupements hétéroaromatiques qui ont pour but de capter la lumière et de la transférer à l'ion lanthanide qui va réémettre. Ce phénomène est appelé effet d'antenne. Le choix de ces groupements hétéroaromatiques définit de nombreuses propriétés spectroscopiques du complexe B10079FR 2 final, notamment la gamme spectrale d'excitation et le rendement quantique de luminescence. CN-1811429-A décrit un complexe de Tb3+ et d'un ligand qui a un squelette 2,6-dipyrazolylpyridine dans lequel chacun des groupes pyrazolyle porte un groupement -CH2-N(CH2CO2H)2. Ledit complexe est utile pour la détection de l'oxygène singulet. Il est obtenu par un procédé consistant à fixer le groupe anthracène sur une dibromo-aminopyridine, puis à modifier le groupe pyridyle par réaction des atomes de brome avec les réactifs appropriés pour remplacer chaque Br par un groupe pyrazolyle portant un groupe -CH2-N(CH2CO2H)2.. EP-0 770 610 décrit des complexes d'ion lanthanide dans lesquels le ligand est un squelette 2,6-dipyrazolylpyridine dans lequel chacun des groupes pyrazolyle porte un groupement -CH2-N(CH2CO2H)2. Le procédé de préparation consiste à préparer d'abord un composé 2,6-dipyrazolylpyridine di bromé, puis on le modifie pour obtenir les deux groupes terminaux -CH2-N(CHG2CO2H)2. Ce procédé ne permet pas d'obtenir des composés dans lesquels le groupe pyridyle porte des substituants choisis pour ajuster les propriétés du complexe de lanthanide dans lesquels lesdits composés constituent le ligand. FR-2 935 973 décrit des ligands dérivés de 2,6-dipyrazolylpyridine dans lesquels chacun des groupes pyrazolyle porte un groupement -CH2-N(CHG2CO2R)2 dans lequel chacun des R représente H ou un métal alcalin ou un groupe ammonium quaternaire, les groupes pyrazolyle pouvant en outre porter un ou deux substituants choisis parmi un groupe alkyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ou bien ces deux substituants forment ensemble un biradical formant un cycle aromatique avec les deux atomes de carbone qui les portent. Ces ligands sont aptes à complexer les ions lanthanide et trouvent des applications pour le marquage et la microscopie biphotonique. Ils présentent cependant une faible solubilité dans l'eau et une grande instabilité en milieu purement aqueux, en milieu salin ou en milieu purement biologique. Le but de la présente invention est de fournir des composés utiles comme 30 ligands pour des complexes de lanthanide ou de métal de transition qui aient une B 10079FR 3 solubilité améliorée dans l'eau et dans les milieux biologiques, ainsi qu'une excellente stabilité chimique, de très bonnes propriétés de luminescence et des temps de vie très longs. Ce but est atteint par les composés qui font l'objet de la présente invention et qui vont être décrits ci-après. Un composé selon la présente invention répond à la formule (I) suivante : (I) dans laquelle : - n, o, p, indépendamment les uns des autres, sont des nombres entiers variant de0à4; - Al représente une fonction -COOR1 dans laquelle R1 est un atome d'hydrogène ou un cation alcalin ; ou un groupement A2 ; - A2 représente un groupement -P(0)0CH2CH3)(0R2) ou -P(0)(0R2) dans lesquels R2 représente un atome d'hydrogène ou cation alcalin ; B10079FR 4 - chacun des YI, Y2 représente un atome d'hydrogène ou bien YI et Y2 forment ensemble un biradical formant un ou plusieurs cycles aromatiques ou hétéroaromatique avec les deux atomes de carbone qui les portent, lesdits cycles aromatiques portant éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupement amino et un groupement thiol, - Z est : * NH2, un halogène, un phosphate, * un groupe COOR3 dans lequel R3 est H, un cation alcalin, un groupe ammonium quaternaire N(R4)4+ dans lequel R4 est H ou une chaîne alkyle linéaire ayant de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe succinimide -N-(CO-CH2-CH2-CO)- ou un groupe pentafluorophényle -C6F5 ; * une fonction biotine (-03-(CH2)4-05H7N20S), un groupement polyhétéroaromatique ou un éther couronne, * un cluster organique ou inorganique silylé ; * un support macroscopique tel que par exemple une bille de silice, une bille de nanolatex ou tout autre support susceptible d'être fonctionnalisé. Parmi les cations alcalins mentionnés pour RI et R2, on peut en particulier citer K+, Na+ et Li+. Les composés de formule (I) dans lesquels les groupes YI et Y2 font partie d'un cycle aromatique ou hétéroaromatique sont particulièrement préférés. Un composé de formule (I) selon la présente invention peut être préparé à 25 partir d'un composé répondant à l'une des formules (V) et (V') suivantes : 2 9 804 7 8 B10079FR 5 dans lesquelles les groupements YI, Y2, ont la même signification que celle indiquée ci-dessus pour les composés de formule (I) et les groupements Y3 et Y4, 5 identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupement amino et un groupement thiol. Les composés de formule (V) et (V') peuvent être préparés selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR-2 935 973. De manière plus précise, et à titre d'exemple, les composés de formule (I), 10 peuvent être préparés selon un procédé comprenant les étapes suivantes : i) une première étape de substitution nucléophile des atomes de brome d'un composé de formule (V) ou (V'), dans un solvant anhydre tel que l'acétonitrile anhydre, en présence d'une base minérale choisie par exemple parmi K2CO3, Na2CO3 et Cs2CO3 et d'un composé choisi parmi les composés de formule (III) 15 suivante [NH(CH2COOR'1)(CH2P(0)(OR'2)2] et les composés de formule (IV) suivante [NH{CH2P(0)(OR'2)2}2] dans lesquelles R'1 et R'2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un radical alkyle linéaire ou ramifié en CI-C4, ladite substitution nucléophile étant réalisée à une température comprise entre environ 60°C et 80°C pour obtenir un composé de formule (VI), respectivement de formule 20 (VI') suivantes : B 1 0079FR 6 Br (VI') dans lesquelles R6 est choisi parmi les groupements de formule R6-a ou R6-b suivants : N ) 0,2 C P' 2 0 '0R. Il OR' 1 0 6 R -a N R'20,, 1 1 OR '2 R20 101 II P 2 0 011OR' R6-b dans lesquels : - R' 1 représente un radical alkyle linéaire ou ramifié en C,-C4 tel que par exemple un radical éthyle ou ter-butyle ; - R'2 représente un radical C,-C4 tel que par exemple un radical éthyle ; ii) une deuxième étape de préparation d'un composé 4 de formule suivante : Il Br 4 selon un procédé comprenant les sous-étapes suivantes : ii-a) la mise en réaction du paradiphénol avec du tosylate de 2-méthoxyéthanol, dans un solvant anhydre tel que l'acétonitrile anhydre en présence d'une base minérale choisie par exemple parmi K2CO3, Na2CO3 et Cs2CO3, à une température d'environ 80°C pendant 12 heures environ pour obtenir un composé 1 de formule suivante : / o, B10079FR 7 1 ii-b) une étape de bromation du composé 1 obtenu à l'étape précédente par du brome (Br2), dans un solvant tel que le tétrachlorométhane au reflux pendant environ 12 heures pour obtenir un composé 2 de formule suivante : 2 ii-c) une étape de substitution d'un des deux atomes de brome du composé 2 obtenu à l'étape précédente, dans un solvant tel que le tetrahydrofurane (THF), en présence de di-isopropylamine, d'un réactif (CH3)2C(OH)CCH et d'un catalyseur au palladium tel qu'un complexe de palladium et de triphénylphosphine, en particulier Pd(PPh3)2C12, et de CuI, pour obtenir un composé 3 de formule suivante : 3 ii-d) une étape d'hydrolyse alcaline du composé 3 obtenu ci-dessus à l'étape précédente par une base forte anhydre telle que NaOH anhydre, dans un solvant 15 organique tel que le toluène à une température d'environ 130°C pendant 12 heures environ, pour obtenir ledit composé 4 ; B10079FR 8 iii) une troisième étape de couplage croisé entre le composé 4 obtenu ci-dessus à l'étape ii) et le composé de formule (VI), respectivement (VI') obtenu ci-dessus à l'étape i), dans un solvant organique en présence d'un catalyseur au palladium et de triphénylphosphine, en particulier Pd(PPh3)2C12, pour obtenir un composé de formule (VII), respectivement (VII'), suivantes : o or-1 (VII) -0 Y3 NN N N I IN N N N N dans lesquelles R6 a la même signification que dans les composés de formule (VI), respectivement (VI'), ci-dessus ; iv) une quatrième étape au cours de laquelle le brome du composé de formule (VII), respectivement (VII') est remplacé par un groupe de formule HCCH2-(CH2CH2)'-CH2-Z dans lequel n et Z ont la même signification que celle indiquée ci-dessus relativement aux composés de formule (I), par réaction avec un réactif approprié, en présence d'un catalyseur organométallique, dans un solvant organique ; v) une cinquième étape au cours de laquelle les groupes Rd et R'2 sont respectivement remplacés par des groupes RI et R2, lesdits groupements étant H ou un cation alcalin (pour RI) ou un cation alcalin (pour R2). Selon une forme de réalisation préférée du procédé de préparation des composés de formule (I), l'étape iv) de substitution de l'atome de brome par le groupement de formule HCCH2-(CH2CH2)'-CH2-Z est réalisée dans les conditions de couplage croisé de type Sonogashira ou de carboamidation catalysée par du palladium sous-ligandé. -0 (VII') B10079FR 9 Lors de la cinquième étape, le remplacement des groupes Rd et R'2 du type alkyle linéaire par un cation K+, Na+ ou Li+ peut être effectué avec KOH, NaOH ou LiOH respectivement dans un solvant polaire (par exemple un mélange CH3OH/H20), à une température entre 20 et 100°C, par exemple à 60°C, ou bien en utilisant du bromure de triméthylsilyle dans un solvant tel que le dichlorométhane à température ambiante suivi d'une hydrolyse basique. Le groupe COOK, COONa ou COOLi peut ensuite, si nécessaire, être modifié en groupe acide par réaction avec un acide tel que HC1 dans l'eau. Egalement lors de la cinquième étape, le remplacement par H de groupes Rd 10 ou R'2 du type alkyle ramifié peut être effectué par réaction avec l'acide trifluoroacétique (TFA) dans un solvant organique aprotique. Quelques exemples de ligands, auxquels l'invention n'est cependant pas limitée, sont donnés ci-après à titre purement illustratif. Des ligands similaires peuvent être obtenus en remplaçant Na par l'un des autres groupes RI ou R2 tels que 15 définis précédemment. (1-2) B10079FR 10 O /0 Na ONa 0- 0- 0- -N N Ni N --N N --N N -0 N-\ 0 P, ONa I ONa 0=1D O O pz-JO Na0 ) PONa 0 CH3 H3C H3C H3C N-\ 0 '1D, 0 ONa () ONa po Na0 )0 ONa CH3 H3C H3C H3C Un complexe de lanthanide ou d'un métal de transition selon l'invention comprend un ion lanthanide ou d'un métal de transition, complexé par un ligand de formule (I) tel que défini précédemment. L'ion lanthanide est choisi parmi les ions Gd+, Lu3+, Eu3+, Tb3+, Dy3+, Sm3+, Er3+, Yb3+, Pr3+ et Nd3+. L'ion d'un métal de transition peut être choisi parmi les métaux suivants Cu(II), Co(II), Mn(II ou IV), Ni(II), Fe(III), Pd(II) et Pt(II). Un complexe de lanthanide ou de métal de transition peut être obtenu par mélange de quantités équimoléculaires d'un composé de formule (I) (de préférence sous forme de sel de sodium) avec un sel de lanthanide, respectivement un sel de métal de transition, par chauffage du mélange, refroidissement et neutralisation à pH de 6 à 8, puis récupération du complexe à la température ambiante. Le sel de lanthanide peut être un nitrate, un chlorure, un perchlorate ou un triflate Ln(CF3S03)3. Le sel de métal de transition peut par exemple être un chlorure, acétate, nitrate ou tout autre composé soluble dans l'eau ou les alcools. Dans un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) et le sel de lanthanide ou le sel de métal de transition sont mélangés en quantités B10079FR 11 équimolaires en solution dans l'eau ou dans un mélange MeOH/eau, la solution est chauffée pendant 2 à 3 heures à 60°C, refroidie à température ambiante puis neutralisée si nécessaire à pH 7 par addition de NaOH, d'un hydroxyde d'ammonium quaternaire ou de HC1 dilué dans l'eau. Les complexes formés sont ensuite isolés par concentration des eaux mères et précipitation dans un mélange H20/Me0H/THF/Et20. Les complexes selon l'invention ont des applications variées, selon la nature des substituants du groupement pyridyle du ligand. Leurs propriétés optiques de luminescence, les temps de vie de luminescence et les propriétés de brillance sont exceptionnelles avec des rendements quantiques autour de 35% pour le Tb, 16% pour l'Eu et des temps de vie des états excités supérieurs à 3 millisecondes dans la plupart du temps. Dans une configuration préférée de l'invention plusieurs tests de stabilité montrent l'absence de dégradation de la sonde fluorescente. Il a été démontré en particulier qu'aucune perte de luminescence des complexes de terbium à Xi. 490 et 543 nm et d'europium à 2',' 590 et 620 nm n'a été observée sur plusieurs jours lorsque ces complexes sont dissous en milieu aqueux à pH neutre ou en milieu salins à des concentration de 10-4 à 10-6 M. Les coûts de production et la purification de ces composés en font des candidats potentiels très intéressants pour l'analyse biomédicale et biologique en temps résolu pour quantifier des traces d'analytes en excitant spécifiquement le ligand qui est considéré comme l'antenne collectrice de photons. Les composés conformes à l'invention permettent d'accommoder l'ensemble des lanthanides et les propriétés d'absorption des ligands sont modulables en fonction de la décoration apportée par le dit ligand. En particulier, les complexes de l'invention sont utiles pour le marquage de composés qui portent un groupe amine, alcool, thiol, acide carboxylique ou ester activé. Ces composés peuvent être des molécules monomères ou des polymères éventuellement sous forme de billes. Pour cette utilisation, le groupe Z du ligand du complexe est de préférence un groupe -COOH, un groupe COONa, un ester activé de type ester de N-Hydroxysuccinimide ou ester de pentafluorophénol, un Br, un I, ou une amine. B10079FR 12 Lorsque le ligand d'un complexe luminescent possède un site de reconnaissance électroniquement relié à la structure de complexation du ligand, les propriétés de luminescence du complexe peuvent être perturbées par la présence d'un analyte qui se fixe sur le site de reconnaissance. En couplant électroniquement le site de reconnaissance à la pyridine centrale par des liaisons acétyléniques, l'interaction du site de reconnaissance avec ses substrats induit des perturbations électroniques qui se traduisent par des changements de luminescence des complexes d'ion lanthanide. La spectroscopie et la microscopie d'absorption à deux photons sont des techniques relativement récentes et qui ont pour intérêt, notamment en microscopie, de permettre une amélioration significative de la résolution spatiale en utilisant des photons de basses énergies. La quasi-totalité des marqueurs luminescents étudiés en absorption à deux photons sont des composés organiques fluorescents de type Rhodamine®. Ces composés organiques présentent de très faibles déplacements de Stokes et des bandes d'émission larges (correspondant à une largeur à mi-hauteur supérieure à 50 nm). Les complexes luminescents d'ions lanthanides selon la présente invention présentent des déplacements de Stokes très élevés et des bandes d'émission étroites. Ils constituent par conséquent des composés particulièrement intéressants pour le marquage et la microscopie biphotonique et des travaux très récents ont démontrés cette possibilité sur des complexes d'Eu et de Tb. [Cf. notamment a) Law, G.L.; et al. I Ain. Chem. Soc. 2008, 130, 3714 ; b) Picot, A.; et al., I Ain. Chem. Soc. 2008, 130, 1532.]. Les complexes de l'invention peuvent être utilisés comme marqueur luminescent pour l'absorption à deux photons. Pour cette application particulière, les ligands I-1, I-2, I-3 et I-4 seront préférentiellement utilisés. Les complexes de l'invention dans lesquels le groupe terminal Z du ligand est un groupe biotine sont utiles pour la reconnaissance de l'avidine, de la streptavidine et de la neuravidine. La présente invention est illustrée par les exemples suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée. B10079FR 13 EXEMPLE 1 : Synthèse du composé de formule (I-1) Un composé de formule (I-1) a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant : Br N B10079FR 18 Analyse élémentaire pour C54H77N7016P2 C H N Calculé 56,78 6,80 8,58 Trouvé 56,53 6,52 8,33 2) Deuxième étape : Synthèse du composé 12 A une solution de 134,8 mg du composé 11 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (0,118 mmol) dans 10 ml d'acétonitrile anhydre, on a ajouté 1,154 g de 5 bromure de triméthylsilyle distillé (7,540 mmol) et 0,807 g de 2,6-lutidine anhydre (7,540 mmol). La solution résultante a été agitée à température ambiante durant 48 h sous argon. Après avoir évaporé le solvant, le résidu a été dissous dans l'eau et le pH ajusté à 7,0 avec une solution aqueuse de soude (0,1M à 0,01M). Le composé 12 attendu a été obtenu par précipitation d'une solution de méthanol avec du 10 diéthyléther. On a ainsi obtenu le composé 12 avec un rendement de 83 %. 1H RMN (200 MHz, Me0D) Ô (ppm) : 8,75 (s, 2 H) ; 7,78 (s, 2 H) ; 6,82 (s, 1H) ; 6,77 (s, 2 H) ; 6,71 (s, 1H) ; 4,68 (s, 4 H) ; 4,13 (m, 4H) ; 4,20 - 4,35 (m, 10 H) ; 3,82 (m, 4H) ; 3,27 (t, 4H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,42 (s, 2 H) ; 2,58 (t, J = 7,0 Hz, 2 H) ; 2,42 (t, J = 7,0 Hz, 2 H) ; 1,60 - 1,92 (m, 4 H) ; 1,16 - 1,38 (m, 9 H). 15 31P {1il} RMN (CD30D+D20, 161 MHz) : Ô 8,56. SM-ESI 1029,3 (100). Analyse élémentaire pour C46H6 11\170 16P2 C H N Calculé 53,64 5,97 9,52 Trouvé 53,64 5,66 9,21 3) Troisième étape : Synthèse du composé 13 A une solution de 131,1 mg du composé 12 obtenu ci-dessus à l'étape 20 précédente (0,127 mmol) dans 4 ml d'eau, on a ajouté 60,4 mg de soude (0,151 mmol). La solution résultante a été agitée à température ambiante durant 12 h. Après évaporation à sec, le composé a été précipité à l'éther à partir d'une solution de méthanol. On a ainsi obtenu le composé 13 attendu avec un rendement de 72 %. B10079FR 19 1H RMN (200 MHz, D20) S (ppm) : 8,47 (s, 2H); 7,45 (s, 2H) ; 6,82 (s, 1H) ; 6,73 (s, 1H) ; 6,65 (s, 2H) ; 4,11 (m, 4H) ; 3,90 (s, 4H) ; 3,80 (m, 4H) ; 3,33 (s, 4 H) ; 3,26 (s, 6H) ; 2,41 - 2,78 (m, 6H) ; 2,16 - 2,40 (m, 2H) ; 1,49 - 1,88 (m, 4H). 31P {1H} RMN (CD3OD+D20, 161 MHz) : 8 17,09. SM-ESI (méthanol + 2% TfA) 473,1 ([M2+] , 100), 946,2 ([M+] , 55). Analyse élémentaire pour C40H42N7Na7016P2, 2 H2O C H Calculé 42,30 4.08 8.63 Trouvé 42,09 3,84 8,43 EXEMPLE 3 : Synthèse du composé de formule (I-4) Un composé I-4 a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant : Br N N potPita.)°)'`IP-2> 15 pc(oEt), [ho OP Br N N (Et PC(OEtCl 0)20P :k. rEt0),CIP PO(Et)2 14 20 ONa o PO( PC(ONaix (Na0)20P 18 N N PO(OH), (H0)20P-J) 11-10)20P PO(OH)2 17 N N PC(OEt>°eP 16 B10079FR 20 1) Première étape : Synthèse du composé 14 A une solution de 256,4 mg du composé 5 tel qu'utilisé ci-dessus à la première étape de l'exemple 1 (0,539 mmol) dans 10 ml d'acétonitrile anhydre, on a ajouté 512,7 mg de dérivé amino-di(méthylènediéthylphosphite) (1,616 mmol) et 297,8 mg de K2CO3 anhydre (2,155 mmol). La suspension résultante a été chauffée à 60°C pendant 12 h sous argon. Le composé a été purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant un mélange de solvants (de 0/10 à 4/6 (v/v) Me0H/CH2C12) et a donné le composé 14 attendu sous forme d'un solide blanc avec un rendement de 65%. lil RMN (300 MHz, CDC13) Ô (ppm) : 8,36 (d, J = 2,6 Hz, 2 H) ; 7,87 (s, 2 H) ; 6,48 (d, J = 2,6 Hz, 2 H) ; 4,01 - 4,14 (m, 20 H) ; 3,16 (s, 4 H) ; 3,12 (s, 4 H) ; 1,25 (t, J = 7,0 Hz, 24 H). 3113 {1il} RMN (CDC13, 161 MHz) : Ô 24,76. SM-ESI 949,1 (100), 947,1 (90). Analyse élémentaire pour C33H58N7012P4Br : C H N Calculé 41,78 6,16 10,34 Trouvé 41,34 6,00 10,09 2) Deuxième étape : Synthèse du composé 15 A une solution dégazée de 100 mg du composé 14 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (0,105 mmol) dans un mélange benzène/triéthylamine (5 m1/1 ml) a été additionné 41,6 mg de composé 4 (0,126 mmol) et 10 mg de [Pd(PPh3)4]. La solution a été chauffée à 60°C durant la nuit et le composé 15 attendu a été isolé par chromatographie sur silice. Le composé pur a été obtenu avec un rendement de 83% sous forme d'un solide blanc cristallin. lil RMN (300 MHz, CDC13) Ô (ppm) : 8,42 (d, J = 2,7 Hz, 2H) ; 7,96 (s, 2H) ; 6,80 (s, 1H) ; 6,74 (s, 1H) ; 6,53 (d, J = 2,7 Hz, 2H) ; 4,13 (m, 4H) ; 4,01 - 4,14 (m, 20H) ; 3,80 (m, 4H) ; 3,27 (s, 6H) ; 3,17 (s, 4H) ; 3,12 (s, 4H) ; 1.27 (t, J = 7,0 Hz, 24H). B10079FR 21 31P {1H} RMN (CDC13, 161 MHz) : Ô 24,87. SM-ESI 1197,2 (100), 1195,2 (90). Analyse élémentaire pour C47H74N7016P4Br : C H N Calculé 47,16 6,23 8,19 Trouvé 46,87 6,02 7,76 3) Troisième étape : Synthèse du composé 16 A une solution de 122,2 mg du composé 15 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (0,102 mmol) dans un mélange de 6 ml de tétrahydrofurane et de 2 ml de triéthylamine, on a ajouté 9,0 mg de Pd(PPh3)2C12 (0,013 mmol) et 2,5 mg de CuI (0,013 mmol) ainsi que 39,7 mg d'éthyle-hept-6-ynoate (0,258 mmol). La solution résultante a été chauffée à 50°C pendant 36 h sous argon. Le produit a été purifié par chromatographie sur gel de silice avec un éluant comprenant (de 0/10 à 6/4 (v/v) Me0H/CH2C12) pour conduite au composé 16 attendu sous forme d'un solide blanc avec un rendement chimique de 75%. 1H RMN (400 MHz, CDC13) Ô (ppm) : 8,42 (d, J = 2,6 Hz, 2 H) ; 7,70 (s, 2 H) ; 6,80 (s, 1H) ; 6,75 (s, 1H) ; 6,50 (d, J = 2,6 Hz, 2 H) ; 4,14 (m, 4H) ; 3,85 (m, 4H) ; 4,06 - 4,16 (m, 22 H) ; 3,25 (s, 6H) ; 3,20 (s, 4 H) ; 3,18 (s, 4 H) ; 2,46 (t, J = 7,0 Hz, 2 H) ; 2,33 (t, J = 7,2 Hz, 2 H) ; 1,72 - 1,82 (m, 2 H) ; 1,60 - 1,70 (m, 2 H) ; 1,29 (t, J= 7,0 Hz, 24 H) ; 1,22 (t, J= 7,0 Hz, 3 H). 31P {1H} RMN (CDC13, 161 MHz) : Ô 24,89. SM-ESI 1269,4 (100). Analyse élémentaire pour C56H87N7018P4 : C H N Calculé 52,95 6,90 7,72 Trouvé 52,67 6,53 7,45 4) Quatrième étape : Synthèse du composé 17 A une solution de 99,0 mg du composé 16 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (0,078 mmol) dans 10 ml d'acetonitrile anhydre, on a ajouté 1,483 g de bromure de triméthylsilyle fraîchement distillé (9,687 mmol) et 1,038 g de B10079FR 22 2,6-lutidine anhydre (9,687 mmol). La solution résultante a été agitée à température ambiante durant 48 h sous argon. Après ce délai, la solution a été évaporée à sec, le résidu a été dissous dans de l'eau et le pH de la solution a été ajusté à 7 avec une solution de soude (0,1M à 0,01M). Le composé 17 attendu a été obtenu avec un rendement chimique de 68%. lil RMN (200 MHz, D20) Ô (ppm) : 8,44 (s, 2 H) ; 7,38 (s, 2 H) ; 6,86 (s, 2 H) ; 6,80 (s, 1H) ; 6,76 (s, 1H) ; 4,20 - 4,38 (m, 2 H) ; 4,16 (m, 4H) ; 3,87 (m, 4H) ; 4,09 (t, 4H) ; 3,76 (t, 4H) ; 3,46 - 3,78 (s, 12H) ; 3,26 (s, 6H) ; 2,48 2,70 (m, 4 H) ; 1,62 - 2,00 (m, 4 H) ; 1,28 - 1,48 (m, 3 H). 3113 {111} RMN (CD30D+D20, 161 MHz) : Ô 8,44. SM-ESI 1045,1 (100). Analyse élémentaire pour C40I-155N7018P4 C H N Calculé 45,94 5,30 9,38 Trouvé 45,65 5,08 9,12 5) Cinquième étape : Synthèse du composé 18 A une solution de 94,3 mg du composé 17 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (0,090 mmol) dans 4 ml d'eau, on a ajouté 31,0 mg de soude (0,775 mmol). La solution a été agitée sous argon à température ambiante durant 24 heures. Après évaporation du solvant, le résidu a été dissous dans du méthanol et le composé a été précipité avec de l'éther. On a récupéré 95 % du composé 18 attendu analytiquement pur. 111 RMN (200 MHz, D20) Ô (ppm) : 8,68 (s, 2 H) ; 7,70 (s, 2 H) ; 6,87 (s, 2 H) ; 6,80 (s, 1H) ; 6,75 (s, 1H) ; 4,17 (s, 4 H) ; 4,12 (m, 4H) ; 3,76 (m, 4H) ; 3,26 (s, 6H) ; 2,84 (s, 4 H) ; 2,78 (s, 4 H) ; 2,54 - 2,70 (m, 2 H) ; 2,28 - 2,42 (m, 2 H) ; 1,60 - 1,94 (m, 4 H). 3113 {1il} RMN (CD30D+D20, 161 MHz) : Ô 16,53. SM-ESI (méthanol + 2% TfA) 509,5 ([M2+] , 100), 1018,1 ([M+] , 35). B 10079FR 23 Analyse élémentaire pour C38H42N7Na9018P4, 2 H20 : C H Calculé 36,47 3,70 7,83 Trouvé 36,14 3,43 7,58 EXEMPLE 4 : Synthèse du composé de formule (I-3) Un composé de formule (I-3) a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant : 1) Première étape : Synthèse du composé 19 15 A une solution de 115,0 mg du composé 15 obtenu ci-dessus à l'étape 2) de l'exemple 3 (0,096 mmol) dans un mélange de 8 ml de toluène et de 8 ml de triéthylamine, on a ajouté 51,7 mg de chlorhydrate de 4-éthylaminobutyrate (0,308 mmol) et 9,8 mg de Pd(PPh3)2C12 (0,014 mmol). La solution résultante a été chauffée à 70°C durant 12 h sous un flux continu de CO. A la fin de la réaction, le 20 solvant a été évaporé, le résidu a été traité à l'eau et extrait avec du dichlorométhane sec. Le solide blanc a été séché et dissous dans de l'acétonitrile anhydre (10 ml). On y a ajouté 740 mg de bromure de triméthylsilyle fraîchement distillé (4,84 mmol) et 519 mg de 2,6-lutidine anhydre (4,843 mmol). La solution résultante a été agitée à température ambiante durant 48 h sous argon. La solution a 25 été évaporée à sec, le résidu a été dissous dans de l'eau et le pH de la solution a été o ria H ri -/ ° o Br -- N N Analyse élémentaire pour C38H54N8019P4 C H N Calculé 43,44 5,18 10,66 Trouvé 43,09 4,76 10,23 2) Deuxième étape : Synthèse du composé 20 A une solution de 94,3 mg du composé 19 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (0,090 mmol) dans 4 ml d'eau, on a ajouté 31,0 mg de soude (0,775 mmol). La solution a été agitée sous argon à température ambiante durant 24 heures. Après évaporation du solvant le résidu a été dissous dans du méthanol et le composé a été précipité avec de l'éther. On a récupéré 95 % du composé 20 attendu analytiquement pur. lil RMN (200 MHz, D20) Ô (ppm) : 8,62 (s, 2 H) ; 7,53 (s, 2 H) ; 6,83 (s, 2 H) ; 6,78 (s, 1H) ; 6,77 (s, 1H) ; 4,20 (t, 4 H) ; 4,11 (m, 4H) ; 3,74 (m, 4H) ; 3,32 (s, 6H) ; 2,52 - 2,83 (m, 4 H) ; 3,71 (s, 4 H) ; 3,31 (s, 2 H) ; 3,19 (s, 2 H) ; 1,41 - 1,61 (m, 3 H). 3113 {1il} RMN (D20, 161 MHz) : Ô 15,97. SM-ESI (méthanol + 2% TfA) 509,5 ([M2+] , 100), 1018,1 ([M+] , 35). Analyse élémentaire pour C36H411\18Na9019P4, 2 H2O : C H N Calculé 34,41 3,61 8,92 Trouvé 34,17 3,21 8,78 REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) suivante : dans laquelle : - n, o, p, indépendamment les uns des autres, sont des nombres entiers variant de 0 à 4 ; - Al représente une fonction -COOR1 dans laquelle R1 est un atome d'hydrogène ou un cation alcalin ; ou un groupement A2 ; - A2 représente un groupement -P(0)0CH2CH3)(0R2) ou -P(0)(0R2) dans lesquels R2 représente un atome d'hydrogène ou cation alcalin ; - chacun des Y1, Y2 représente un atome d'hydrogène ou bien Y1 et Y2 forment ensemble un biradical formant un ou plusieurs cycles aromatiques ou hétéroaromatique avec les deux atomes de carbone qui les portent, lesdits cycles aromatiques portant éventuellement un ou plusieurs substituants choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupement amino et un groupement thiol ; ?ri A2 A2 pkr 1 (I)B10079FR 26 - Z est : * NH2, un halogène, un phosphate, * un groupe COOR3 dans lequel R3 est H, un cation alcalin, un groupe ammonium quaternaire N(R4)4+ dans lequel R4 est H ou une chaîne alkyle linéaire ayant de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe succinimide -N-(CO-CH2-CH2-CO)- ou un groupe pentafluorophényle -C6F5 ; * une fonction biotine (-03-(CH2)4-05H7N20S), un groupement polyhétéroaromatique ou un éther couronne, * un cluster organique ou inorganique silylé ; * un support macroscopique. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que RI et R2 sont choisis parmi K+, Na+ et Li+. 3. Composé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les 15 groupes YI et Y2 font partie d'un cycle aromatique ou hétéroaromatique. 4. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules (I-1) à (I-4) suivantes : ONa ONa (1-2)B10079FR 27 O ONa 0- NH ONa 0- -0 0- 0 P, ONa I ONa 0=P O O pz:z0 NaO )0 ONa CH3 H3C H3C H3C 0 P, 01 ONa () ONa Na0 )0 ONa CH3 H3C H3C H3C 5. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 1) une première étape de substitution nucléophile des atomes de brome d'un composé de formules (V) ou (V') suivantes : Br Br ./' Y2 N N N N N N (V) (V') dans lesquelles - les groupements YI, Y2, ont la même signification que celle indiquée à la 10 revendication 1 pour les composés de formule (I) ; - les groupements Y3 et Y4, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupement amino et un groupement thiol ;B10079FR 28 ladite substitution nucléophile étant réalisée dans un solvant anhydre et à une température comprise entre environ 60°C et 80°C , en présence d'une base minérale et d'un composé choisi parmi les composés de formule (III) suivante [NH(CH2COOR'1)(CH2P(0)(OR'2)2] et les composés de formule (IV) suivante [NH{CH2P(0)(OR'2)2}2] dans lesquelles R'1 et R'2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un radical alkyle linéaire ou ramifié en CI-C4, pour obtenir un composé de formule (VI), respectivement de formule (VI'), suivantes : Br (VI') dans lesquelles R6 est choisi parmi les groupements de formule R6-a ou R6-b suivants : N r ) 0,2 C P' 2 0 '0R. Il OR' 1 0 R6-a N R'20,, 1 1 OR'2 R II 2 20 -- 0 011OR' R6-b dans lesquels : - R'l représente un radical alkyle linéaire ou ramifié en CI-C4 ; - R'2 représente un radical CI-C4 ; ii) une deuxième étape de préparation d'un composé 4 de formule suivante : 4 / o, selon un procédé comprenant les sous-étapes suivantes :B10079FR 29 ii-a) la mise en réaction du paradiphénol avec du tosylate de 2-méthoxyéthanol, dans un solvant anhydre en présence d'une base minérale, à une température d'environ 80°C pendant 12 heures environ pour obtenir un composé 1 de formule suivante : 1 ii-b) une étape de bromation du composé 1 obtenu à l'étape précédente par du brome (Br2), dans un solvant au reflux pendant environ 12 heures pour obtenir un composé 2 de formule suivante : 2 ii-c) une étape de substitution d'un des deux atomes de brome du composé 2 obtenu à l'étape précédente, dans un solvant, en présence de di-isopropylamine, d'un réactif (CH3)2C(OH)CCH, d'un catalyseur au palladium, et de Cul, pour obtenir un composé 3 de formule suivante : 3 ii-d) une étape d'hydrolyse alcaline du composé 3 obtenu ci-dessus à l'étape précédente par une base forte anhydre, dans un solvant organique à une température d'environ 130°C pendant 12 heures environ, pour obtenir ledit composé 4 ;B10079FR 30 iii) une troisième étape de couplage croisé entre le composé 4 obtenu ci-dessus à l'étape ii) et le composé de formule (VI), respectivement (VI') obtenu ci-dessus à l'étape i), dans un solvant organique en présence d'un catalyseur au palladium et de triphénylphosphine, pour obtenir un composé de formule (VII), respectivement (VII'), suivantes : (VII') dans lesquelles R6 a la même signification que dans les composés de formule (VI), respectivement (VI'), ci-dessus ; iv) une quatrième étape au cours de laquelle le brome du composé de formule (VII), respectivement (VII') est remplacé par un groupe de formule HCCH2-(CH2CH2)'-CH2-Z dans lequel n et Z ont la même signification que celle indiquée à la revendication 1 relativement aux composés de formule (I), par réaction avec un réactif approprié, en présence d'un catalyseur organométallique, dans un solvant organique ; v) une cinquième étape au cours de laquelle les groupes Rd et R'2 sont respectivement remplacés par des groupes RI et R2, lesdits groupements étant H ou un cation alcalin (pour RI) ou un cation alcalin (pour R2). 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lors de la cinquième étape, le remplacement des groupes Rd et R'2 du type alkyle linéaire par 20 un cation K+, Na+ ou Li+ est effectué avec KOH, NaOH ou LiOH respectivement dans un solvant polaire, à une température entre 20 et 100°C, ou bien en utilisantB10079FR 31 du bromure de triméthylsilyle dans un solvant à température ambiante suivi d'une hydrolyse basique. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lors de la cinquième étape, le remplacement par H de groupes R'1 ou R'2 du type alkyle ramifié est effectué par réaction avec l'acide trifluoroacétique dans un solvant organique aprotique. 8. Complexe de lanthanide ou d'un métal de transition, caractérisé en ce qu'il comprend un ion lanthanide ou d'un métal de transition complexé par un ligand de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4. 9. Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'ion lanthanide est choisi parmi les ions Gd3+, Lu3+, Eu3+, Tb3+, Dy3+, Sm3+, Er3+, Yb3+, Pr3+ et Nd3+. 10. Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'ion d'un métal de transition est choisi parmi les ions Cu(II), Co(II), Mn(II ou IV), Ni(II), Fe(III), Pd(II) et Pt(II). 11. Utilisation d'un complexe tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel le groupe Z du ligand du complexe est un groupe -COOH, un groupe COONa, un ester activé de type ester de N-hydroxysuccinimide ou ester de pentafluorophénol, un Br, un I, ou une amine, pour le marquage de composés qui portent un groupe amine, alcool, thiol, acide carboxylique ou ester activé. 12. Utilisation d'un complexe tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 10, comme marqueur luminescent pour l'absorption à deux photons. 13. Utilisation d'un complexe tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lesquels le groupe terminal Z du ligand est un groupe biotine, pour la reconnaissance de l'avidine, de la streptavidine et de la neuravidine.