Brevet FR2979543A1 — publié le 20130308

- 1 - L'invention concerne une composition, notamment pharmaceutique, nutraceutique ou alimentaire comprenant de la vitamine B6, de la vitamine B9 et/ou au moins un folate, de la vitamine B12, une huile contenant de l'acide docosahexaénoïque (DHA) et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et au moins un extrait de fruit rouge standardisé en anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines. L'invention porte également sur l'utilisation d'une telle composition pour retarder ou diminuer les troubles neurodégénératifs et les altérations cognitives liées à l'âge. Le vieillissement de la population s'accompagne d'une augmentation de troubles neurodégénératifs (maladie d'Alzheimer par exemple) ainsi que par des altérations cognitives fréquentes, notamment de la mémoire. Le trouble de la mémoire est en effet une des principales altérations cognitives ressenties par les sujets âgés et exprimées en consultations médicales (« plainte amnésique » du sujet âgé). Parmi les troubles de la mémoire, le vieillissement affecte principalement la mémoire déclarative ainsi que la mémoire de travail, alors que la mémoire sémantique reste plus stable et paraît moins affectée (Park and Reuter-Lorenz 2009). Mémoire déclarative et mémoire de travail requièrent une forte flexibilité cognitive qui repose principalement (mais non exclusivement) sur l'activité de deux structures cérébrales, l'hippocampe et le cortex préfrontal. De nombreuses études ont montré que le vieillissement induisait une altération de l'activité de ces deux structures cérébrales. On note d'une part l'émergence chez le sujet âgé d'une suractivité du cortex frontal qui s'accompagne d'une réduction de l'activité hippocampique (Sperling 2007). De nombreuses corrélations positives ont été établies entre la suractivité frontale et l'altération de la mémoire chez le sujet âgé (Davis et al. 2008). L'émergence progressive de l'atteinte de la mémoire chez le sujet âgé rend d'autant plus nécessaire le recours à des composés nutritionnels permettant de prévenir et/ou de ralentir l'apparition du déclin cognitif, voire de compenser l'altération de la mémoire en amont du recours aux composés pharmacologiques. - 2 - L'agence européenne de sécurité des aliments, dans le cadre du règlement 1924/2006 reconnait le rôle des acides gras oméga-3 et particulièrement de l'acide docosahexaénoïque (DHA), des vitamines B6, B9 (ou de folates) et B12 dans le maintien des fonctions cérébrales, psychologiques et neurologiques (European Food Safety Authority (EFSA) 2010a; European Food Safety Authority (EFSA) 2010b; European Food Safety Authority (EFSA) 2010c; European Food Safety Authority (EFSA) 2010d). De nombreuses études ont été menées pour démontrer un impact positif des vitamines B, des antioxydants tels que les polyphénols végétaux et plus particulièrement les anthocyanes, présents dans les fruits rouges, et des acides gras oméga-3 qui sont classés acides gras essentiels polyinsaturés et que l'on trouve en grandes quantités dans certains poissons gras, dans les graines de lin, la noix, ou le colza par exemple. Largement étudiés de façon isolée (Balk et al. 2006; Lavialle 2007; Yao and Vieira 2007; Jia et al. 2008), certains de ces composés ont aussi été étudiés en association : vitamines B (Lewerin et al. 2005 ; Stott et al. 2005), omégas 3 et vitamines B (Andreeva et al. 2011). Cependant, il ressort de ces études des résultats contradictoires. Les vitamines B combinées entre elles ou avec des omégas 3 ne semblent pas avoir un effet significatif systématique sur les fonctions cognitives (Andreeva et al. 2011; Balk et al. 2006 ; Lewerin et al. 2005). Il en est de même pour les extraits de fruits rouges étudiés de façon isolés (Balk et 2 0 al. 2006). La Société Demanderesse a elle-même pu démontrer qu'une association d'acide docosahexaénoïque (DHA), d'acide eicosapentaénoïque (EPA), de vitamines B6, B9 et B12 ou qu'un extrait de myrtille (Vaccinum myrtillus L) standardisé en anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines n'avaient aucun effet promnésique significatif chez la souris agée (cf. 2 5 section EXEMPLES). Il persiste donc toujours un besoin d'une association d'actifs permettant d'améliorer les fonctions cognitives, notamment chez les personnes agées. - 3 Un but de l'invention est donc de proposer une nouvelle composition ayant un effet promnésique et permettant ainsi de diminuer ou de retarder les troubles cognitifs liés à l'âge et d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de ces troubles. D'autres buts et avantages apparaîtront à la lecture de la description non limitative qui va suivre. Il est du mérite des inventeurs d'avoir trouvé, après de longs et intenses travaux de recherche, qu'il était possible d'optimiser l'efficacité du DHA, des vitamines B6, B9 (ou de folates) et B12 grâce à l'ajout d'un extrait de fruit rouge contenant des anthocyanes, anthocyanines et / ou anthocyanidines. Un objet de l'invention est donc une composition, notamment pharmaceutique, nutraceutique, vétérinaire ou alimentaire comprenant - de la vitamine B6, - de la vitamine B9 et/ou au moins un folate, - de la vitamine B12, - une huile contenant de l'acide docosahexaénoïque (DHA) et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et - au moins un extrait de fruit rouge standardisé en anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines. Au sens de l'invention, on entend par le terme « standardisé » 2 0 ou« standardiser », la notion de contrôle d'un extrait, d'une huile ou tout autre ingrédient afin de le rendre conforme à une norme ou à une teneur minimale définie en certaines molécules comme par exemple les anthocyanes, anthocyanines et/ ou anthocyanidinesdans le cas de l'extrait de fruit rouge. Un extrait de fruit rouge standardisé en anthocyanes, anthocyanines et / ou anthocyanidines est donc un extrait de fruit rouge présentant une teneur minimale définie 2 5 en anthocyanes, anthocyanines et/ ou anthocyanidines. L'ajout d'un extrait de fruit rouge standardisé en anthocyanes, anthocyanines - 4 - et/ou anthocyanidines à une composition comprenant les vitamines B6, B9 (et/ou folate(s)) et B12, du DHA et de l'EPA permet d'obtenir une amélioration significative des fonctions cognitives chez des sujets présentant des troubles cognitifs liés à l'âge. Elle permet ainsi d'améliorer la qualité de vie des personnes impactées par la dégénérescence liée à l'âge. L'huile peut être choisie parmi les huiles de poissons. De préférence, on utilisera l'huile de sardines, d'anchois ou de thon ou un mélange de deux ou plus de ces huiles. De manière avantageuse, le rapport pondéral DHA/EPA de l'huile est compris entre 2,5 et 8, préférentiellement entre 3 et 7, plus préférentiellement entre 3,5 et 6, et encore plus préférentiellement d'environ 4. La teneur en huile de la composition selon l'invention est avantageusement de 74,00 à 89,80 %, préférentiellement de 76,00 à 85,00 %, plus préférentiellement 79,00 à 80,00 % et plus préférentiellement encore d'environ 79,70 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge. La teneur en extrait de fruit rouge de la composition selon l'invention est avantageusement de 1 0,00 à 25,98 %, préférentiellement de 14,85 à 23,95 %, plus préférentiellement 19,90 à 20,93 % et plus préférentiellement encore d'environ 20,22 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge. 2 0 De manière avantageuse, l'extrait de fruit rouge standardisé en anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines est utilisé sous forme d'une poudre. La teneur en eau est de préférence inférieure à 8 %, en poids, par rapport au poids total de l'extrait. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'extrait de fruit rouge contient au minimum 23 % d'anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines exprimés en équivalent cyanidine 3-0- 2 5 glucoside, avec, de préférence, un minimum de 2 % de cyanidine 3-0-glucoside, un minimum de 0,1 % de péonidine 3-0-galactoside et un minimum de 0,8 % de péonidine 3-0-glucoside. La capacité antioxydante de l'extrait de fruit rouge, déterminée en équivalent Trolox par la - 5 - méthode ORAC (Prior et al. 2005), est de préférence au minimum de 9000 jamol équivalent Trolox par gramme de poudre d'extrait. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'extrait de fruit rouge standardisé en anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines. Cet extrait de fruit rouge peut être choisi parmi les extraits de myrtille (Vaccinum myrtillus L) , de mûre, d'airelle, de fraise, de framboise, de cassis, de canneberge ; de très bons résultats ayant été obtenus avec de l'extrait de myrtille (Vaccinum myrtillus L) . La teneur en vitamines B (B6, B9 et/ou folate(s), B12) de la composition selon l'invention est avantageusement d'environ 0,02 % à 0,2 %, notamment de 0,02045 % à 0,1953 %, préférentiellement de 0,05 à 0,15 %, plus préférentiellement de 0,07 à 0,1 % et plus préférentiellement encore d'environ 0,08 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge. La teneur en vitamine B6 est avantageusement de 0,02 à 0,17 %, préférentiellement de 0,025 à 0,125 %, plus préférentiellement de 0,045 à 0,075 % et plus préférentiellement encore d'environ 0,053 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge. La teneur en vitamine B9 et/ou d'au moins un folate est avantageusement de 0,0004 à 0,025 %, et préférentiellement d'environ 0,025 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de 2 0 fruit rouge. La teneur en vitamine B12 est avantageusement 0,00005 à 0,0003 %, et préférentiellement d'environ 0,0003 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition selon 2 5 l'invention comprend : - d'environ 0,02% à 0,2 %, notamment de 0,02045% à 0,1953 %, - 6 - préférentiellement de 0,05 à 0,15 %, plus préférentiellement 0,07 à 0,1 % et plus préférentiellement encore d'environ 0,08 % en poids de vitamines B (B6, B9 et/ou folate(s), B12) par rapport au poids total de l'ensemble d'huile de poissons, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge, - de 74,00 à 89,80 %, préférentiellement de 76,00 à 85,00 %, plus préférentiellement 79,00 à 80,00 % et plus préférentiellement encore d'environ 79,7 % en poids d'huile de poissons par rapport au poids total de l'ensemble d'huile de poissons, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge. - de 10,00 à 25,98 %, préférentiellement de 14,85 à 23,95 %, plus préférentiellement 19,90 à 20,93 % et plus préférentiellement encore d'environ 20,22 % en poids d'extrait de fruit rouge, de préférence de myrtille (Vaccinum myrtillus L) , par rapport au poids total de l'ensemble d'huile de poissons, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge. Dans une variante de ce mode de réalisation les différentes vitamines B sont présentes dans les teneurs suivantes : - de 0,02 à 0,17 %, préférentiellement de 0,025 à 0,125 %, plus préférentiellement 0,045 à 0,075 % et plus préférentiellement encore d'environ 0,053 % en poids de viatmine B6 par rapport au poids total de l'ensemble d'huile de poissons, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge; - de 0,0004 à 0,025 %, et plus préférentiellement encore d'environ 0,025 % en poids de vitamine B9 et/ou d'au moins un folate par rapport au poids total de l'ensemble d'huile de poissons, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge; - de 0,00005 à 0,0003 %, et plus préférentiellement encore d'environ 0,0003 % en poids de vitamine B12 par rapport au poids total de - 7 - l'ensemble d'huile de poissons, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12 et extrait de fruit rouge; La composition selon l'invention peut être sous différentes formes selon la manière dont elle sera administrée. Il peut par exemple s'agir d'un concentré constitué essentiellement des cinq composants définis ci-dessus. La composition selon l'invention peut se présenter sous forme d'une composition de type pharmaceutique, nutraceutique ou vétérinaire, où les cinq composants (huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate(s), vitamine B12, extrait de fruit rouge) sont associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, plus particulièrement pour une administration orale, sous des formes telles que les comprimés, les gélules dures ou molles (capsules molles), les poudres, les granules et les suspensions ou solutions orales. Lorsque l'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'association des cinq composants selon l'invention avec un véhicule tel que l'amidon, le stéarate de magnésium, le lactose, la gomme arabique, le talc ou analogues. On obtient une préparation en gélules en mélangeant les cinq composants selon l'invention avec les excipients adéquats et en versant le mélange obtenu dans des gélules dures ou molles (capsules molles). Une préparation sous forme de sirop ou de solution buvable peut contenir l'association des cinq composants selon l'invention conjointement avec un édulcorant, un conservateur, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'association des cinq composants selon l'invention en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs de goût ou des édulcorants. - 8 - Il peut s'agir aussi d'une composition de type alimentaire dans laquelle l'association des cinq composants selon l'invention est intégrée à une composition alimentaire usuelle, comme par exemple des barres de céréales, des boissons, des plats alimentaires et tout type de préparations alimentaires habituellement consommées. Comme déjà indiqué plus haut, la composition selon l'invention permet d'améliorer de façon significative les fonctions cognitves chez des sujets présentant des troubles cognitifs liés à l'âge. L'invention concerne donc également une composition telle que définie ci-dessus pour utilisation comme médicament, plus particulièrement pour retarder ou diminuer les troubles neurodégénératifs et les altérations cognitives liées à l'âge. L'invention a également pour objet un complément alimentaire comprenant la composition selon l'invention. La quantité de chacun des cinq composants de la composition dans un médicament ou complément alimentaire selon l'invention dépendra du mode d'administration (1, 2 ou plusieurs prises) et de la quantité journalière. Dans la composition de l'invention, la quantité journalière d'huile administrée aux personnes est de 630 mg avec un minimum d'acide docosahexaénoïque (DHA) de 250 mg et une quantité d'acide eicosapentaénoïque (EPA) comprise entre 31 mg et 100 mg. Préférentiellement la quantité de DHA s'élève à 250 mg et la quantité d'EPA à 60 mg. Pour les vitamines B6, B9 (et/ou folate(s)) et B12 les quantités journalières 2 0 dans la composition de l'invention correspondent à un minimum de 15 % des apports journaliers recommandés (AJR - Directive 2008/100/CE), à savoir respectivement 210 ug, 30 ug et 0,375 ug. A titre préférentiel, la quantité journalière de vitamine B6 est de 420 ug, la quantité journalière de vitamine B9 est de 200 ug et la quantité journalière de vitamine B12 2 5 est de 2,5 jag. Dans la composition de l'invention, la quantité journalière d'extrait de fruit - 9 - rouge administrée aux personnes varie de 80 à 160 mg avec une quantité minimum d'anthocyanes, anthocyanines et/ ou anthocyanidines allant de 18,4 mg à 36,8 mg. Préférentiellement, la quantité d'extrait de fruit rouge s'élève à 160 mg avec un minimum d'anthocyanes, anthocyanines et/ ou anthocyanidines de 36,8 mg. L'invention est décrite plus en détail ci-après, à l'aide des exemples suivants qui ne sont nullement limitatifs mais sont donnés à titre d'exemple uniquement. EXEMPLES L'efficatité de la composition selon l'invention a été démontrée par une étude in vivo. Cette étude visait à déterminer et comparer le potentiel promnésiant sur la mémoire de travail. Des souris de la lignée C57B1/6 âgées de 4-5 mois (groupe «jeune adulte ») ou 17-18 mois (C. Rivers, France) ont été utilisées. Ce modèle « rongeur » représente un modèle validé de la mémoire de travail lors du vieillissement. En effet, les souris âgées (17-18 mois) présentent une sensibilité accrue aux interférences proactives délai-dépendantes dans une épreuve d'alternance spontanée par rapport à des souris jeunes (4-5 mois) (Vandesquille 2011). L'efficacité de la composition de l'invention a été vérifiée sur le modèle de souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois par une épreuve d'alternance séquentielle. L'épreuve d'alternance séquentielle est largement utilisée pour évaluer la mémoire de travail spatiale chez la souris (Grant 1981 ; Beracochea et al. 1987 ; Beracochea et al. 1995). L'alternance séquentielle est un protocole par lequel on évalue la sensibilité aux interférences, un des facteurs principaux de l'oubli. Dans cette épreuve, la souris est soumise à plusieurs essais successifs séparés par un intervalle temporel constant. L'augmentation quantitative du nombre d'essais (6 essais successifs) provoque une chute progressive des performances, du 2nd essai au 6ième essai. Au 6ième essai (essai N) par exemple, l'animal doit se référer au choix réalisé au 5ième essai (essai N-1), sans tenir compte des choix antérieurs (du ler au 4ième essai, essais N-2, N-3, etc.) lesquels exercent une interférence proactive forte (Roberts and Dale 1981). La souris doit donc en permanence ignorer les - 10 - informations devenues non pertinentes d'un essai à l'autre («resetting mechanisms» (Olton and Samuelson 1976)) (Figure 1). L'épreuve de mémoire a été réalisée dans un labyrinthe automatisé en forme de T construit en Plexiglas gris. L'allée centrale (35 cm de longueur X 15 cm de largeur X 10cm de hauteur) est reliée à un compartiment de départ et à deux compartiments d'arrivée (gauche ou droite) de dimensions comparables (15cm X 10cm). Un ordinateur pilote l'ouverture et la fermeture automatique des portes, en fonction des signaux émis par des cellules photoélectriques placées au début de chaque compartiment d'arrivée et du compartiment de départ. Le bruit de fond (30db) et l'éclairage (30 lux) de la pièce ont été maintenus constants. Le labyrinthe a été soigneusement nettoyé à l'alcool à 95% puis à l'eau entre chaque souris. Les pièces d'expérimentation sont climatisées et ventilées. Afin de déterminer sur la mémoire de travail lors du vieillissement l'efficacité et la synergie des composés nutritionnels entrant dans la composition selon l'invention, plusieurs solutions ont été réalisées : - Soit une solution ci-dessous dénommée «Base» constituée d'un mélange en suspension des ingrédients suivants : huile de poissons standardisé en DHA et EPA + vitamine B9 + vitamine B6 + vitamine B12. - Soit la solution dénommée «Base» associée à 3 concentrations différentes (dose 1, dose 2, dose 3) d'extrait de myrtille standardisé en anthocyanes, anthocyanines et / ou 2 0 anthocyanidines. - Soit une solution d'extrait de myrtille seul à la concentration la plus forte (dose 3). COMPOSITION DES DIFFERENTES SOLUTIONS Pour préparer la solution « Base », 0,315 mg d'huile de poissons ayant un rapport DHA/EPA égal à 4, 0,000306 mg de vitamine B6, 0,00013 mg de vitamine B9 et 2 5 0,0015 mg d'une poudre contenant 0,1 % de vitamine B12 ont été mélangés. Les solutions « Base + dose 1 », « Base + dose 2 » et « Base + dose 3 » ont été obtenues en mélangeant 0,315 mg d'huile de poissons ayant un rapport DHA/EPA égal à 4, 0,000306 mg de vitamine B6, 0,00013 mg de vitamine B9 et 0,0015 mg d'une poudre contenant 0,1 % de vitamine B12 avec respectivement 0,08 mg, 0,80 mg, 0,160 mg d'extrait de myrtille, standardisé à 23 % au minimum d'anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines, pour les doses 1, 2 et3 La solution d'extrait de myrtille seul à la dose 3 a été obtenue en mélangeant 0,160 mg d'extrait de myrtille, standardisé à 23 % au minimum d'anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines, à 0,315 mg d'eau. Ces solutions ont été administrées quotidiennement per os par intubations gastriques (2 gavages par jour). Les concentrations administrées quotidiennement per os par intubations gastriques (2 gavages par jour) et le comparatif par rapport à l'homme sont précisés dans le tableau 1. - 12 - Tableau 1: Quantité de solution de base et d'extrait de fruit rouge administrées par intubation gastrique (2 gavages par jour) aux souris. Correspondance avec un exemple de quantité administrée chez l'Homme. Homme (70kg) Homme (70kg) Souris (35g) Souris (35g) Souris (35g) Solution de base mg/ jour mg/ jour mg/ jour mg/jour mg/jour (Exemple 1) (Exemple 2) Huile de poisson 630 630 0,315' 0,315' 0,315' Vitamine B9 0,26 0,26 0,000131 0,000131 0,000131 Vitamine B6 0,612 0,612 0,0003061 0,0003061 0,0003061 Vitamine B12 (Poudre à 0,1% de B12) 3 3 0,00151 0,0015 1 0,00151 Extrait de fruit rouge 160 80 / / / Dose 1 / 0,081 / / Dose 2 3 / / 0,8 3 / Dose 3 2 / / / 1,6 2 I Dose calculée sur la base de la relation masse de l'Homme (70kg) et masse de la souris (35g) 2 : Dose calculée sur la base des quantités de matière sèche ingérée par l'Homme (160 mg d'extrait de myrtille pour 500 g de matière sèche) et des quantités de matières sèches ingérées par la souris (5 g de matière sèche). 3 : Dose calculée sur la base des quantités de matière sèche ingérée par l'Homme (80 mg d'extrait de myrtille pour 500 g de matière sèche) et des quantités de matières sèches ingérées par la souris (5 g de matière sèche). - 13 - L'administration des solutions a été effectuée per os par intubations gastriques (gavage à raison de 2 gavages quotidiens) réalisés le matin et l'après-midi. Lors des sessions comportementales (épreuve d'alternance séquentielle), les solutions sont administrées 1 heure avant le début de la session. Le gavage s'effectue toujours dans une pièce différente de celle où a lieu le test comportemental. Les souris ont été réparties par groupes indépendants selon les traitements suivants: - Groupe 1: « Jeune adulte », souris C57B1/6 âgées de 4-5 mois (non gavé); N=12 - Groupe 2: « Agé », souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois (non gavé); N=12 - Groupe 3: « Agé-Base » : souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois gavées avec la solution dite Base (cf tableau 1); N=12 - Groupe 4: « Agé-Base + eau »: souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois gavées avec la solution dite Base et avec de l'eau (1 gavage « base » le matin + 1 gavage « eau » l'après midi); N=12 - Groupe 5: « Agé-Base + Dose 1 »: souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois gavées avec la solution dite Base associée à l'extrait de myrtille à la dose 1 (cf tableau 1); N=12 - Groupe 6: « Agé-Base + Dose 2 »: souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois gavées avec la solution dite Base associée à l'extrait de myrtille à la dose 2 (cf tableau 1) ; N=12 - Groupe 7: « Agé-Base + Dose 3 »: souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois gavées avec 2 0 la solution dite Base associée à l'extrait de myrtille à la dose 3 (cf tableau 1) ; N=12 - Groupe 8: « Agé-Dose 3 de Myrtille » uniquement; souris C57B1/6 âgées de 17-18 mois gavées avec la solution d'extrait de myrtille seul à la dose 3 (cf tableau 1), N=13 La comparaison des groupes 1 et 2 permet de mesurer l'effet délétère du vieillissement chez la souris non traitée. 2 5 La comparaison des groupes 2, 3 et 4 permet de déterminer si le stress éventuel induit par la procédure d'intubation gastrique interfère avec les performances des souris âgées et si l'administration de la Base induit un effet promnésiant selon la quantité administrée quotidiennement (1 dose versus 2 doses). - 14 - La comparaison des groupes 3,5,6 et 7 permet de déterminer - si l'extrait de myrtille, associé à la solution dite Base induit un effet promnésiant par rapport à la solution dite Base seule (comparaison avec le groupe 3) et - à quelle concentration cet extrait de myrtille est efficace (comparaison entre les groupes 5,6 et 7). Le groupe 8 permet de déterminer si la dose efficace de l'extrait de myrtille en combinaison avec le produit « Base » est pourvue ou non d'un effet promnésiant en administration seule (i .e sans la solution dite Base). Pour chaque groupe de souris, l'administration des différentes solutions dure 30 jours consécutivement. Le test comportemental est réalisé de façon répétée sur les mêmes groupes d'animaux soit après 1 jour, 15 jours ou 30 jours de traitement. Chaque souris est donc évaluée avec 3 durées différentes de traitement, ce qui permet d'apprécier l'évolution des performances en fonction de la durée du traitement sur le même animal. DEROULEMENT DES EPREUVES - Habituation. Les souris ont été manipulées plusieurs jours avant le début des épreuves comportementales, afin de les familiariser à la manipulation et réduire le stress au contact de l'expérimentateur. - Exploration libre. Les souris ont été placées quotidiennement 10 minutes dans le labyrinthe en T pendant 2 jours successifs, pour une exploration libre de l'appareil (i.e. sans fermeture des portes). Au cours de chaque séance, l'animal était donc libre de parcourir l'ensemble du labyrinthe, afin de se familiariser avec l'appareil et surtout, de constituer la « carte spatiale et environnementale » (repères spatiaux) indispensable pour alterner. - Phase de « training » : Les souris ont été soumises le lendemain à une - 15 - session constituée de 7 essais successifs séparés par un intervalle entre essais de 30 secondes. Cette session permet à l'animal de se familiariser avec l'ouverture et la fermeture des portes dans le labyrinthe. Chaque essai s'est déroulé de la façon suivante. L'animal était tout d'abord placé dans le compartiment de départ pour un délai de 30 secondes. Au terme de ce délai de confinement, la porte a été ouverte et l'animal pouvait choisir d'entrer dans le compartiment d'arrivée (gauche ou droite) de son choix. Dès que l'animal est entré dans le compartiment d'arrivée, la porte de ce compartiment a été fermée, la souris demeurant 30 secondes dans le bras d'arrivée. Puis au terme de cette période de confinement, la souris a été manuellement replacée dans le compartiment de départ pour un nouvel essai, identique au premier. A chaque essai, l'animal avait le libre choix d'entrer dans chacun des deux compartiments d'arrivée. Durant la période de confinement dans le compartiment de départ, l'allée centrale et les bras d'arrivée ont été nettoyés. - Phase Test. 1 heure avant le test, les souris ont reçu le traitement per os, dans une pièce différente de celle où a eu lieu l'épreuve comportementale. Chaque souris a été ensuite soumise à 7 essais successifs séparés chacun par un intervalle de 90 secondes. Nous avons en effet montré dans nos études précédentes, que cet intervalle temporel provoquait une chute progressive et significative de l'alternance chez la souris âgée. La procédure est identique à celle de la phase de « training », excepté l'augmentation du délai entre essais. STATISTIQUES La comparaison des groupes a été effectuée par analyse de variance (Fisher PLSD ANOVA) à un ou plusieurs facteurs, suivie selon les cas par un test post-hoc de Bonferroni-Dunn. Les comparaisons intra-groupes ont été réalisées par un test t de Student. Le seuil de signification statistique est fixé à p EFFET APRES 15 JOURS DE TRAITEMENT (Figure 3) Les solutions « Base + Myrtille dose 2 » et « Base + Myrtille dose 3 » permettent aux souris âgées de récupérer après 15 jours de supplémentation une mémoire de travail équivalente (non différente significativement) à celle mesurée chez les jeunes adultes. Les groupes recevant le produit « Base » et « Base + eau » ne présentent aucune amélioration des performances par rapport aux souris âgées sans supplémentation. Les groupes recevant le produit « Base » et « Base + eau » ne présentent aucune amélioration des performances par rapport aux souris âgées « Base + extrait de myrtille - Dose 1 ». 2 0 Les groupes recevant le produit « Base » et « Base + eau » ne présentent aucune amélioration des performances par rapport aux souris âgées « Base + extrait de myrtille - Dose 2 ». Le groupe recevant uniquement le produit « Extrait de myrtille seul - Dose 3 » ne présente aucune amélioration des performances par rapport aux souris âgées sans 2 5 supplémentation. Le groupe recevant uniquement le produit « Extrait de myrtille seul - Dose - 17 - 3 » ne présente aucune amélioration des performances par rapport aux souris âgées « Base + eau », « Base », « Base + extrait de myrtille - Dose 1 » et « Base + extrait de myrtille - Dose 2 », Le groupe recevant le produit « Base + Myrtille dose 3 » possède une mémoire de travail significativement augmentée par rapport aux souris âgées sans supplémentation (p Le groupe recevant le produit « Base + Myrtille dose 3 » possède une mémoire de travail significativement augmentée par rapport aux souris âgées « Base » (p Le groupe recevant le produit « Base + Myrtille dose 3 » possède une mémoire de travail qui a tendance à être augmentée (p= 0,07) par rapport aux souris âgées « Base ». Le groupe recevant le produit « Base + Myrtille dose 3 » possède une mémoire de travail augmentée de façon significative par rapport aux souris âgées « Base + Myrtille dose 1 » (p EVOLUTION DE L'EFFICACITE EN FONCTION DU TEMPS (Figure 5) Après 15 jours, l'évolution la plus importante concerne le groupe « Base + myrtille dose 3 » dont les performances évoluent de 50 ± 2,9 % en J1 à 73,6 ± 4,3 %; t=5,45 ; p=0,0002 puis le groupe « Base + myrtille dose 2 » dont le % d'alternance évolue de 47,2 ± 3.4 % en J1 à 62,5 ± 5.8 % après 15 jours ; t=1,95 ; p=0,07. Les autres groupes « Agés » traités ou non traités présentent des % d'alternance proches du hasard (50 %) et très comparables en J1 et J15. Après 30 jours, seuls deux groupes présentent une amélioration significative de leur performance : le groupe âgé « Base + myrtille dose 2 » qui évolue de 47,2 ± 3,4 % en J1 à 76,3 ± 3,2 %; t=8,04 ; p Balk, E., et al. (2006). "B vitamins and berries and age-related neurodegenerative disorders." Evid Rep Technol Assess (Full Rep).(134): 1-161. Beracochea, D., et al. (1995). "b-CCM reverses the memory deficits induced by a chronic ethanol administration and mammillary bodies lesions in mice." Psychobiology 23: 52-58. Beracochea, D., et al. (1987). "Build-up and release from proactive interference during chronic ethanol consumption in mice: a behavioral and neuroanatomical study." Behav Brain Res 25(1): 63-74. Davis, S. W., et al. (2008). "Que PASA? The posterior-anterior shift in aging." Cereb Cortex 18(5): 1201-9. European Food Safety Authority (EFSA) (2010a). "Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to docosahexaenoic acid (DHA) and maintenance of normal (fasting) blood concentrations of triglycerides (ID 533, 691, 3150), protection of blood lipids from oxidative damage (ID 630), contribution to the maintenance or achievement of a normal body weight (ID 629), brain, eye and nerve development (ID 627, 689, 704, 742, 3148, 3151), maintenance of normal brain function (ID 565, 626, 631, 689, 690, 704, 742, 3148, 3151), maintenance of normal vision (ID 627, 632, 743, 3149) and maintenance of normal spermatozoa motility (ID 628) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006 "EFSA Journal 8(10): 1734. European Food Safety Authority (EFSA) (2010b). "Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to folate and contribution to normal psychological functions (ID 81, 85, 86, 88), maintenance of normal vision (ID 83, 87), reduction of tiredness and fatigue (ID 84), cell division (ID 195, 2881) and contribution to normal amino acid synthesis (ID 195, 2881) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006." EFSA Journal 8(10): 1760. - 23 - European Food Safety Authority (EFSA) (2010c). "Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to vitamin B6 and contribution to normal homocysteine metabolism (ID 73, 76, 199), maintenance of normal bone (ID 74), maintenance of normal teeth (ID 74), maintenance of normal hair (ID 74), maintenance of normal skin (ID 74), maintenance of normal nails (ID 74), contribution to normal energy-yielding metabolism (ID 75, 214), contribution to normal psychological functions (ID 77), reduction of tiredness and fatigue (ID 78), and contribution to normal cysteine synthesis (ID 4283) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006 "EFSA Journal 8(10): 1759. European Food Safety Authority (EFSA) (2010d). "Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to vitamin B12 and contribution to normal neurological and psychological functions (ID 95, 97, 98, 100, 102, 109), contribution to normal homocysteine metabolism (ID 96, 103, 106), maintenance of normal bone (ID 104), maintenance of normal teeth (ID 104), maintenance of normal hair (ID 104), maintenance of normal skin (ID 104), maintenance of normal nails (ID 104), reduction of tiredness and fatigue (ID 108), and cell division (ID 212) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006 " EFSA Journal 8(10): 1756. Grant, D. (1981). "Intertrial interference in rat's short term memory." Journal of 2 0 Experimental Psychology 7: 217-227. Jia, X., et al. (2008). "Does taking vitamin, minerai and fatty acid supplements prevent cognitive decline? A systematic review of randomized controlled trials." J Hum Nutr Diet 21(4): 317-36. Lavialle, M. (2007). "Le DHA dans la neurotransmission." Oléagineux, Corps Gras, 25 Lipides. 14(1): 11-15. Lewerin, C., et al. (2005). "Significant correlations of plasma homocysteine and serum methylmalonic acid with movement and cognitive performance in elderly subjects but no improvement from short-term vitamin therapy: a placebo-controlled randomized study." Am J Clin Nutr. 81(5): 1155-62. 3 0 Olton, D. and R. Samuelson (1976). "Remembrance of places passed: spatial memory in rats." J Exp Psychol Anim Behav Processes 2: 97-116. - 24 - Park, D. C. and P. Reuter-Lorenz (2009). "The adaptive brain: aging and neurocognitive scaffolding." Annu Rev Psychol 60: 173-96. Prior, R., et al. (2005). "Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements." J Agric Food Chem 53(10): 4290-302. Roberts, A. and R. Dale (1981). "Remembrance of places lasts : proactive inhibition and patterns of choice in rats spatial memory." Learning and motivation 12: 261-281. Sperling, R. (2007). "Functional MRI studies of associative encoding in normal aging, mild cognitive impairment, and Alzheimer's disease." Ann N Y Acad Sci 1097: 146-155. Stott, D., et al. (2005). "Randomized controlled trial of homocysteine-lowering vitamin treatment in elderly patients with vascular disease." Am J Clin Nutr. 82(6): 13206. Vandesquille, M. (2011) Implication du système cholinergique dans l'alteration de la mémoire de travail au cours du vieillissement chez la souris. Université de Bordeaux 1. Bordeaux. Yao, Y. and A. Vieira (2007). "Protective activities of Vaccinium antioxidants with potential relevance to mitochondrial dysfunction and neurotoxicity." Neurotoxicolo gy 28(1): 93-100.20 REVENDICATIONS1 Composition comprenant - de la vitamine B6, - de la vitamine B9 et/ou au moins un folate, - de la vitamine B12, - une huile contenant de l'acide docosahexanoïque (DHA) et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et - un extrait de fruit rouge standardisé en anthocyanes, anthocyanines et/ou anthocyanidines. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'huile est une huile de poissons. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'extrait de fruit rouge est un extrait de myrtille. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la teneur en huile est de 74 à 89,80 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate, vitamine B12 et extrait végétal. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la teneur en extrait végétal est de 10 à 25,98 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate, vitamine B12 et extrait végétal. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la teneur en vitamines B est de 0,02 à 0,2 % en poids par rapport au poids total de l'ensemble de huile, vitamine B6, vitamine B9 et/ou folate, vitamine B12 et extrait 25 végétal. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée- 26 - en ce que le rapport pondéral acide docosahexanoïque (DHA) / acide eicosapentaénoïque (EPA) est de 2,5 à 8. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes pour utilisation comme médicament. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes pour retarder ou diminuer les troubles neurodégénératifs et les altérations cognitives liées à l'âge. 10. Complément alimentaire ou aliment comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.