Brevet FR2978162A1 — publié le 20130125

La présente invention concerne le domaine de l'étude des moisissures et de leurs propriétés de développement dans des milieux divers. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de quantification de la germination de spores de moisissures permettant d'étudier l'effet d'une ou plusieurs substances biocides sur lesdites moisissures, voire de caractériser la résistance de souches de moisissures à une ou plusieurs substances biocides, et notamment de fongicides qui agissent sur la germination des spores et sur l'élongation du tube germinatif. Le procédé de l'invention est destiné à s'appliquer dans tous les domaines industriels pour lesquels l'utilisation ou la lutte contre les moisissures sont cruciaux et notamment la biotechnologie, l'agro-alimentaire, l'hygiène alimentaire, ou encore les milieux médicaux, hôpitaux en particulier. Les moisissures sont des champignons microscopiques qui se développent grâce à un appareil végétatif propre dans tout milieu ambiant relativement saturé en eau (hygrométrie de l'ordre de 70% au minimum), les substances nutritives (essentiellement carbone et azote) et les éléments minéraux (Potassium, Phosphore, Magnésium...) nécessaires à la synthèse de leur propre matière et à une température ambiante relativement élevée de l'ordre de 20°C à 25°C en moyenne. Les moisissures se développent généralement sur des matières diverses, essentiellement d'origines organiques telles qu'aliments, bois ou papier. Elles peuvent également dans certains cas se comporter et se développer de façon parasite sur des organismes vivants animaux ou végétaux dont les défenses immunitaires sont affaiblies. Les moisissures connaissent un développement en deux phases sensiblement simultanées. Dans une première phase végétative, les moisissures se nourrissent du milieu ambiant sur lequel elles se trouvent pour croître sous forme de filaments, appelés hyphes, et qui forment un réseau, souvent d'apparence duveteux lorsqu'observé à l'oeil nu, et appelé mycélium. Dans une seconde phase reproductive, les moisissures développent à l'extrémité des filaments de mycélium des spores qui permettent un essaimage et une dispersion de la moisissure sur de nouveaux supports. Les spores se forment à partir des hyphes du mycélium selon des processus très variés propres aux différentes souches de moisissures et, en pratique, l'identification des différentes moisissures s'effectue traditionnellement par l'étude de leurs spores, leur mode de formation et groupement sur le mycélium. L'identification des moisissures et de moyens de lutte contre leur développement constitue un challenge permanent dans les différentes industries précitées car leur développement, du fait de leur toxicité et/ou de la dégradation des matières sur lesquelles elles prospèrent, peut s'avérer gravement dangereux pour la santé humaine et animale. Il est donc essentiel de pouvoir rapidement déterminer si une souche de moisissure quelconque présente dans un milieu donné est sensible ou résistante à une substance biocide connue, afin de pouvoir limiter son développement par le choix d'une substance biocide adaptée puis d'empêcher si possible tout nouveau développement. Malheureusement, les fongicides connus présentent une efficacité sélective et il est donc très important avant d'utiliser l'un d'entre eux de déterminer en fonction de la moisissure présente quel fongicide peut être efficace. A ce jour, on connaît plusieurs techniques pour appréhender les phénomènes de résistance des moisissures vis-à-vis des fongicides. Toutes ces techniques reposent sur une mise en culture préalable de la moisissure étudiée afin de faciliter l'observation et l'expérimentation de différents fongicides le cas échéant. Une première technique consiste à observer visuellement sous microscope la germination et l'élongation des filaments mycéliens. Pour obtenir des résultats quantitatifs, il est nécessaire de faire des mesures manuelles directement avec le microscope. Cette technique est donc longue pour obtenir un nombre de données chiffrées représentatives et utilisables et totalement dépendante des compétences des techniciens réalisant l'observation. Une seconde technique consiste à mesurer la densité optique (DO) d'une 30 culture des spores dans un milieu liquide en présence ou non de fongicide. Après un temps d'incubation défini, une mesure de DO est réalisée et comparée avec une solution témoin. Cependant la culture en milieu liquide qui n'est pas représentative des conditions de culture des moisissures en général. De plus, le temps pour obtenir une croissance significative et quantifiable par DO peut être relativement long là encore. Une dernière technique consiste à réaliser un antifongigramme. Cette technique réalisée sur milieu solide permet de valider l'efficacité d'antifongiques par visualisation macroscopique de croissance. En pratique, on dépose sur un milieu de culture ensemencé de la souche de moisissure étudiée des gouttes de différents fongicides puis on laisse la moisissure se développer pendant un temps donné. On mesure ensuite sur le milieu de croissance le diamètre des zones d'inhibition de croissance produites par les différents fongicides pour mesurer leur efficacité. Cette technique éprouvée nécessite cependant un temps d'incubation suffisant pour que la croissance soit visible macroscopiquement ce qui est malheureusement parfois incompatible avec des besoins de traitement en urgence de certaines moisissures, comme notamment dans le milieu hospitalier. Les calculs des pourcentages de germination des spores et de la vitesse d'élongation sont chez les moisissures des étapes clé pour une étude de l'efficacité de fongicides. Ils se fondent sur la capacité des spores (ou conidies) à germer normalement (conidies résistantes) ou non (conidies sensibles) en présence des fongicides. Il faut donc estimer la fréquence des individus résistants aux différents fongicides dans une suspension de conidies issues de la moisissure testée (ex : la pourriture grise causée par Botrytis cinerea, l'aspergillose pulmonaire causée par Aspergillus fumigatus). Pour cette raison, la première technique évoquée précédemment est la plus complète et la plus utile, bien qu'également la plus délicate et longue. Les calculs de pourcentage de germination sont basés sur le dénombrement manuel ou automatique du nombre des spores germées et non germées dans une photo, ainsi que sur des mesures d'élongation mycélienne. Ce travail se fait en moyenne sur une vingtaine de photos par produit testé, chaque photo contenant entre 10 et 50 spores. Ce travail est donc lent, fatiguant et coûteux lorsqu'il est réalisé manuellement. Lorsque les calculs sont automatiques, une spore est considérée germée si et seulement si la longueur de son tube germinatif est supérieure à son diamètre. Cette condition est prévue pour éliminer les spores dites « fausses germées » qui développent un petit tube germinatif en se servant de leurs propres réserves et non de celles procurées dans le milieu de culture de la moisissure. Ces spores « fausses germées » peuvent perturber la fiabilité des calculs automatiques qui compte ces spores comme spores germés. D'autre part, la croissance des hyphes du mycélium se fait par nature de façon non directionnelle, avec des croisements multiples des tubes germinatifs entre eux, ce qui rend les mesures manuelles comme automatiques très difficiles. Par ailleurs, cette croissance non directionnelle du mycélium au cours du temps masque la présence des spores et empêche leur comptage. Enfin, dans certains cas de mesures automatiques, notamment lors de la croissance sur certains fongicides, il est possible qu'apparaissent des artefacts qui peuvent être considérés comme des spores par un logiciel comptant uniquement le nombre de spores. Ceci a pour conséquence de faire augmenter artificiellement le nombre de spores et donc de biaiser les rapports calculés par exemple pour déterminer une longueur moyenne de mycélium par spore. Vu les inconvénients des techniques actuelles, la présente invention a pour but de fournir une nouvelle méthode d'évaluation de l'effet d'un biocide sur une souche de moisissures donnée, qui facilite les calculs des pourcentages de germination et de vitesses d'élongation des tubes germinatifs de conidies et utilise des paramètres fiables et stables au cours du temps pour réaliser le test de germination. L'invention atteint ce but grâce à un procédé d'étude de l'effet d'au moins un biocide sur une souche de moisissure, dans lequel : - on réalise une première culture d'une souche de moisissure déterminée sur 30 au moins un milieu de culture pendant une durée déterminée T, - on réalise simultanément une seconde culture de la même souche de moisissure sur un même milieu de culture pendant une même durée T, en présence d'une quantité déterminée d'au moins un biocide et caractérisé en ce que - on réalise à l'échéance de la durée de culture T au moins une photographie d'une zone de même surface des première et seconde cultures, et - on calcule à partir de chaque photographie par l'intermédiaire de moyens d'analyse et de calcul informatisés la surface cumulée totale de spores et la longueur cumulée totale de mycélium de spores germées, et - on assimile la totalité des spores à une spore unique formant un disque de rayon virtuel r que l'on calcule à partir de la surface totale cumulée de spores calculée à l'étape précédente, et - on calcule un rapport R entre la longueur totale de mycélium et le rayon virtuel r pour chaque photographie, - on calcule le pourcentage d'élongation des tubes germinatifs de la seconde culture par rapport à la première culture à partir des rapports R obtenus pour chaque culture. Le procédé proposé par la présente invention fait abstraction du comptage du nombre des spores germées ou non et fait intervenir le rapport entre deux variables : la surface cumulée des spores dont on déduit un rayon r virtuel correspondant au rayon d'une spore circulaire unique représentant une surface égale à la surface cumulée des spores et la longueur totale du mycélium produit par les spores sur une photo. La première culture de la souche de moisissure à étudier effectuée en l'absence de biocide joue le rôle de témoin et constitue une base de référence. Le procédé est de plus mis en oeuvre de façon automatique sans équipement particulier par la mise en oeuvre d'un simple logiciel d'analyse d'images permettant d'identifier de façon distincte les spores et les mycélium. Le calcul du pourcentage d'élongation se fait de plus, de préférence, sur une pluralité de photos par culture pour une étude statistique permettant un gain de temps et de fiabilité des résultats. Le procédé de l'invention est de plus applicable de façon avantageuse à toutes les moisissures qui ont des spores de formes rondes, ovales, ellipsoïdes ou sphériques. A titre d'exemple, on peut citer les moisissures espèces Aspergillus, Pen/a/Hum, Botrytis, Cercospora, Fusarium, Sphaerotheca, Ustilago dont Botrytis cinerea, Aspergillus sp., Pen/ci/Hum sp., C/adosporium (micro-conidies), Paeci/omyces, Scopu/anOpsis, Trichoderma... Le procédé selon l'invention permet également d'étudier tout type de biocides tels que notamment les fongicides. A titre d'exemple, on peut citer les biocides appartenant à la famille des imidazoles, des carboxamides comme le boscalid, des anilopyrimidines comme le pyriméthanil, des strobilurines, la famoxadone, les fongicides du domaine médical, le Bénomyl, le Tiophante-méthyl, le métalaxyl ... Selon une autre caractéristique du procédé de l'invention, on discrimine les spores et les mycéliums du milieu de culture dans la photographie par analyse colorimétrique de chaque pixel des photographies suivant un système colorimétrique RVB et attribution pour chaque pixel d'une valeur scalaire fixe, cette valeur scalaire étant donnée par un triplé de valeurs dans le système colorimétrique RVB utilisé. Dans un mode préféré de réalisation, on prend un nombre entier n de photographies de la première culture et un même nombre n de photographies de la seconde culture et on calcule pour chaque photographie le rapport R, noté Ri. On calcule ensuite pour chaque série de n photographies de chaque culture un rapport R' moyen tel que : E1.1 Ri R' _ n Le rapport entre les deux rapports R' de la 2eme culture avec biocide et R' de la iere culture sans biocide donne le pourcentage d'élongation d'une souche donnée en présence d'un biocide donné. De façon préférée selon l'invention, on réalise les photographies après une durée T de 4 à 48h en fonction du biocide testé et de la souche de moisissure cultivée. La croissance est, de préférence, réalisée avec un contrôle du temps d'incubation pour éviter une croissance trop importante et donc une impossibilité de mesurer les longueurs de mycélium. Pendant le début de la phase de croissance exponentielle, moins de chevauchements au niveau des mycéliums sont visibles et les spores peuvent bien être distinguées. Selon un mode de réalisation de l'invention, les première et seconde cultures sont réalisées à partir d'une solution calibrée de spores de la souche de moisissure considérée. De manière avantageuse, la concentration de la solution calibrée est choisie de manière à obtenir de 20 à 50 spores par photographie. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la concentration de la solution calibrée est de 2.105 spores par ml étalées de façon homogène sur des boîtes de pétri identiques. Il est ainsi possible d'obtenir des photographies exploitables de manière optimisée, avec un nombre de spores par photographies ni trop faible, ni trop important. De façon préférée selon l'invention, les photographies présentent une résolution d'au moins 72, de préférence 96, pixels par pouce de largeur d'image (PPP)- De façon préférée encore, les photographies sont réalisées sous microscopie optique avec un grossissement d'au moins 500%. Le procédé de l'invention permet notamment de façon automatique rapide et reproductible de : - Etudier la résistance aux biocides, et notamment fongicides et la détermination de leur seuil d'efficacité (calcul de la dose d'efficacité à 50%, DE50). - Remplacer les antifongigrammes dans le domaine médical pour gagner du temps dans la prédiction du traitement chez les patients. Le procédé selon l'invention peut également permettre de déterminer si une souche de moisissures étudiée est résistante ou non à un biocide. Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte une étape de comparaison du pourcentage de d'élongation des tubes germinatifs obtenu (pour la souche étudiée avec un biocide donné) avec une valeur seuil déterminée pour le biocide considéré avec des souches de référence de la même espèce que la souche de moisissures étudiée, permettant de classer la souche de moisissure étudiée en tant que résistante ou non résistante au biocide considéré. De manière préférée, les souches de référence comprennent au moins 3 souches de références connues pour être résistantes au biocide considéré et au moins une souche de référence connue pour être sensible au biocide considéré. Par exemple dans le cas de Botrytis cinerea, en tant que souches de référence résistantes aux molécules de la famille des Anilino-pyrimidines, on pourra utiliser 3 à 4 souches du phénotype AniR connues pour être résistante et une souche sauvage sensible à ces biocides et en tant que souches de référence résistantes au carboxamide, 3 à 4 souches du phénotype H connues pour être résistante et une souche sauvage sensible à ce biocide. Dans ce mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, la concentration en biocide utilisée dans la deuxième culture pourra être ajustée en fonction des souches de référence. La concentration optimale en biocide à utiliser pourra être connue d'après la littérature ou déterminée en faisant des gammes étalon. La concentration choisie correspondra à une concentration, où il existe une différence marquée entre les souches de référence résistante et la(es) souche(s) de référence sensible(s). Par ailleurs, la détermination de la valeur seuil pourra être déterminée au moment de l'étude en appliquant le procédé selon l'invention aux souches de référence ou aura pu être déterminée au préalable et stockée, par exemple dans une base de données. Par exemple, la valeur seuil pourra correspondre à la valeur R minimale obtenue pour les souches de référence résistantes, à la concentration sélectionnée, par rapport à laquelle la valeur R pour la souche sensible de référence est bien inférieure. Sera alors considérée comme résistante, toute souche étudiée présentant une valeur R supérieure ou égale. Les autres seront considérées comme sensibles. Le procédé selon l'invention pourra également être utilisé pour classer différentes souches à étudier, dont la nature n'est pas connue. Dans ce cas, ces différentes souches pourront être étudiées simultanément et en parallèle, en réalisant des gammes de concentration en un biocide considéré et en calculant pour chaque concentration les rapports R. La comparaison des différents rapports R obtenus permet de classer relativement les souches étudiées, sur une échelle de sensibilité/résistance au biocide considéré. D'autres caractéristiques du procédé de la présente invention ressortiront à la lecture de la description détaillée d'un mode de réalisation particulier de ce 10 procédé et en référence aux figures annexées parmi lesquelles : - Les figures 1A à ID représentent des photographies d'un développement d'une même souche de moisissure de type Botrytis cinerea en présence respectivement de quatre fongicides différents pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention ; 15 - la figure 2 représente une copie d'écran du traitement d'une photographie de moisissure par un logiciel de traitement d'image informatique mettant en oeuvre de façon automatique le procédé de l'invention ; - la figure 3 représente est une copie d'écran analogue à celle de la figure 2 montrant le traitement d'une photographie de moisissure fortement développée ; 20 - la figure 4 représente un histogramme représentant les résultats de mesure obtenus par la mise en oeuvre du procédé de l'invention pour déterminer la résistance à quatre fongicides de différentes souches de moisissures de type Botrytis cinerea. La présente invention propose un nouveau procédé d'étude de l'effet d'au 25 moins un biocide sur une souche de moisissure dont une des applications est la caractérisation de la résistance d'une moisissure à une ou plusieurs substances biocides. Ce procédé défini comme nouveau paramètre de détermination de la résistance d'une souche de moisissure à une substance biocide déterminée le 30 rapport R entre la longueur totale cumulée L de mycélium des spores d'une culture et le rayon virtuel r d'une spore virtuelle unique circulaire d'une surface égale à la surface totale cumulée de toutes les spores germées d'une culture donnée. En d'autres termes, pour calculer le rapport R, on calcule dans un premier temps la surface totale cumulée S des spores germées pour une culture de moisissure considérée, surface cumulée S que l'on assimile à une spore unique de surface égale. A partir de cette surface, on calcule ensuite le rayon virtuel r de la spore unique virtuelle de surface égale à la surface cumulée S préalablement calculée. Il suffit ensuite de rapporter ce rayon r virtuel à la longueur totale de mycélium L calculée ou inversement. Afin de pouvoir déterminer ce rapport R, la souche de moisissure à étudier est mise en culture sur un milieu de culture, avec ou sans biocide. Le milieu de culture est adapté au biocide testé et est identique dans les deux cas (avec ou sans biocide). Il peut s'agir, par exemple, d'un milieu gélosé supplémenté avec des sels ou différents additifs tels que des tensio-actifs. Dans ce cas le biocide pourra être ajouté avant ou après le placement des moisissures sur le milieu de culture. Il existe également des milieux commerciaux disponibles avec ou sans fongicides. Pour la mise en culture, il est possible d'utiliser une culture jeune de la moisissure à tester. Il est également possible de travailler directement à partir d'échantillons sans phase de pré-culture si les échantillons sont propres et si la concentration de spores est suffisante. C'est par exemple, le cas des prélèvements de populations de Botrytis sur baies. Dans tous les cas, une solution de spores, par exemple dans de l'eau stérile, avec éventuellement des additifs tels que des sels, des tensio-actifs, de la Tryptone, est répartie de manière homogène sur le milieu de culture, par exemple par pulvérisation. La culture est réalisée dans des conditions de culture (temps et température notamment selon l'espèce de moisissure étudiée) qui seront adaptés par l'homme du métier. Le calcul s'effectue à partir d'au moins une photographie d'au moins une première culture et d'au moins une seconde culture d'une souche de moisissure déterminée sur au moins un milieu de culture pendant une durée déterminée T, la seconde culture ayant reçu une quantité déterminée d'au moins un biocide alors que la première culture constitue un témoin de référence. Ces cultures sont réalisées de façon avantageuse de telle sorte que l'on obtienne en moyenne lors du passage de la boîte de pétri sous microscope pour l'analyse de 10 à 50 spores de moisissure (germées et non germées) par photographie. Ces photographies sont prises après une durée de 4h à 48h d'incubation selon le biocide testé et l'espèce de moisissures étudiée en conditions contrôlées d'obscurité et de température entre 17 et 45°C (selon le couple fongicide/moisissure étudié). Pour chaque échantillon testé (ainsi que pour chaque souche de moisissure référence) correspond une boite témoin dont le milieu n'est pas amendé en fongicide. Le temps d'incubation est un facteur déterminant qui est lié à la vitesse de croissance du témoin (boite sans fongicide). Il faut donc connaître précisément le temps d'incubation pour chaque espèce pour avoir des photos exploitables. Conformément à l'invention, le calcul du rapport R est représentatif du taux d'élongation des tubes germinatifs des spores, pour la première et la seconde culture réalisées, ce taux d'élongation étant lui-même représentatif du taux de germination des spores. Ce rapport R permet ensuite de calculer le pourcentage d'élongation de la seconde culture par rapport à la première culture et ainsi de qualifier l'efficacité du biocide mis en oeuvre sur cette souche de moisissure Le calcul du rapport R rend également possible pour chaque culture d'une souche de moisissure de caractériser sa résistance pour un biocide considéré par comparaison du pourcentage d'élongation calculée à une valeur seuil déterminée pour le biocide considéré. Selon une forme de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, le calcul du rapport R se fait sur un nombre n de photographies prises au microscope, avec un grossissement de 500% (x5). On obtient ainsi pour une culture considérée, et par photographie, un rapport R individuel noté par exemple Ri... pour chaque photographie considérée. On moyenne ensuite ces rapports R pour obtenir un rapport R' moyen et déterminer le pourcentage d'élongation de la culture amendée de fongicide par rapport à une culture témoin. Le rapport moyen R' peut ainsi être défini tel que : R'_r_ Ri n En pratique, on considère en général six boites de pétri, trois contenant chacune une reproduction d'une première culture de moisissure sans biocide et trois contenant chacune une seconde culture de la même moisissure, mais avec une dose connue de biocide. On prend ensuite un nombre n de photographies, en général de 6 à 8 photographies, de chaque boîte de pétri pour chacune des cultures et on calcule tout d'abord pour chaque photographie le rapport Ri correspondant à la croissance de la moisissure observée sur cette photographie puis le rapport R' moyen correspondant à la somme de tous les rapports R individuels calculés pour chaque photographie de chaque culture (pour les trois boîtes de pétri) divisé par le nombre n total de photographies. Le procédé de l'invention est de façon préférée mis en oeuvre par un logiciel informatique de traitement d'images qui analyse des photographies numériques d'une zone de même surface des cultures de moisissure réalisées et qui calcule par une analyse colorimétrique numérique des photographies la surface totale de spores germées et non germées) et la longueur totale de mycélium dans la surface photographiée. Pour réaliser cette analyse, le logiciel assimile avantageusement les spores de moisissures à des sphères (ou des disques) et calcule la surface de chaque spore puis la surface totale des spores dans chaque photo. Le logiciel assimile ensuite cette surface totale cumulée S à celle d'une spore unique en forme de disque de rayon r, en pm, rayon r qui est alors calculé à partir de la surface totale cumulée S. Le logiciel mesure également la longueur de chaque ramification de mycélium et donne la longueur totale L du mycélium en pm présent par photo. L'analyse numérique des photographies de cultures repose sur une analyse colorimétrique codée sur 24 bits de chaque pixel des photographies, dont la résolution et le format sont reconnues par le logiciel, dans un modèle colorimétrique RVB (Rouge-Vert-Bleu), bien connu de l'homme de l'art dans le domaine de l'imagerie numérique. Le modèle RVB repose sur trois couleurs primaires (rouge, vert et bleu) qui par leurs mélanges vont restituer toutes les autres, le blanc étant donné par l'addition des trois couleurs primaires. Ainsi, lors de l'analyse des photographies, chaque pixel se voit attribuer une valeur scalaire calculée en fonction du mélange des couleurs rouge, vert et bleu. La couleur des spores est différente de celle du mycélium qui elle-même est différente de celle du milieu de culture. Ces différences se traduisent par des valeurs scalaires différentes de pixels selon que ces pixels correspondent à une zone d'image reproduisant une spore, un mycélium ou le milieu de culture. Lorsque tous les pixels d'une photographie ont été analysés, le logiciel compare chaque pixel avec ceux qui l'entourent. Les pixels qui ont la même valeur scalaire et sont situés côte à côte (connexes) dans l'image photographique représentent ainsi un même « objet » dans l'image, c'est-à-dire une spore, le mycélium ou le milieu de culture. Il est ainsi très facile ensuite de calculer la surface. Ces surfaces sont additionnées pour donner une valeur unique S pour chaque image. En considérant la surface totale S comme celle d'une spore unique, il est possible de calculer le rayon r virtuel de cette spore unique virtuelle. Pour calculer la longueur de mycélium, le logiciel procède à une addition de l'ensemble de pixels qui ont la même valeur dans une seule direction ou dimension. Une fois ces calculs réalisés, spores et mycélium sont colorisés par une couleur propre unique pour les faire ressortir sur l'image traitée qui s'affiche sur le moniteur d'un opérateur réalisant l'analyse comme représenté sur les figures 1 et 2. Cette coloration permet à l'opérateur d'effectuer une vérification manuelle du comptage réalisé par le logiciel de façon automatisée. La qualité des photographies réalisées pour chaque analyse d'une souche donnée de moisissure est un facteur primordial et décisif à la bonne mise en oeuvre du procédé de l'invention sous la forme d'un logiciel informatique. En effet, tous les calculs de surface cumulée de spores, de rayon des spores, de longueur de mycélium et du rapport R qui en découle selon l'invention sont basés sur l'analyse numérique des photographies de cultures. Ces calculs dépendent donc directement de la qualité des photos fournies. Aussi ces photographies doivent être prises à temps, avec une bonne mise au point du microscope et un appareil photo de bonne qualité qui doit être bien réglé par l'opérateur. Toutefois ces conditions expérimentales de mise au point sont tout à fait triviales pour les opérateurs. Le choix de la résolution des photographies, c'est-à-dire de la densité de pixels par unité de surface des images, est libre et reste à la discrétion de l'opérateur mais revêt bien entendu une grande importance pour la qualité de traitement des photographies. De façon préférée dans le cadre du procédé de l'invention on choisira une résolution d'au minimum 72 pixels par pouce (ppp) et de préférence de 96 ppp. Il est bien entendu possible d'augmenter cette résolution pour affiner la qualité des photographies sans que cela ne perturbe l'analyse. La variation de la résolution a pour conséquence de modifier le nombre de photos à réaliser pour traiter un nombre constant de spores (de 20 à 50 par photos). Comme la résolution, la taille de l'image (Hauteur et Largeur) n'influence pas le traitement par le logiciel. Il est préférable de laisser ces deux paramètres par défaut en fonction de l'appareil photo pour un gain du temps. Afin de permettre le calcul de la surface totale S des spores et le rayon r virtuel correspondant ainsi que la longueur L du mycélium en pm alors que l'analyse des photographies se fait pixel par pixel, le logiciel de traitement mettant en oeuvre le procédé de l'invention effectue automatiquement la conversion en pm à partir des valeurs de résolution des photographies et de l'objectif et du grossissement du microscope. Ces paramètres doivent être enregistrés dans le logiciel avant le traitement des photographies pour le calcul du rapport R. Le calcul du rapport R, ainsi que du rapport moyens R' éventuel, est automatique une fois les images traitées. On portera cependant de préférence une attention toute particulière aux valeurs de rapport moyens R' qui permettent d'estomper les effets éventuels d'artefact dans l'analyse individuelle de chacune des photos réalisées. En effet, en fonction de la résistance ou la sensibilité de la souche traitée au biocide utilisé, les spores germent à des vitesses variables et par conséquent la taille du mycélium diffère. Pour le même temps d'incubation, le mycélium du témoin (boite sans biocide) chevauche et masque la présence des spores. Le logiciel parfois considère les zones d'intersection de plusieurs mycéliums comme des surfaces et ainsi il les compte comme des spores. Ce problème constitue un artefact pour le logiciel ce qui rend le nombre des spores calculé pas toujours exploitable. Cet artefact rend aussi le calcul à l'oeil nu parfois difficile (confusion entre la spore et les mycéliums). La taille et la forme de ses zones sont similaires de celle de spores donc donne une valeur de surface proche de celles de spores. La multiplication des photographies sur trois champs distincts pour chaque culture de moisissure étudiée et chaque culture témoin permet de lisser et pondérer ce risque d'artefact par le calcul de valeurs moyennes R'. Un exemple d'application particulier du procédé de l'invention va maintenant être décrit pour une souche déterminée de moisissure qu'est Botrytis cinerea. Botrytis cinerea (forme imparfaite du télémorphe Botryotinia fucke/fana) est l'agent responsable de la pourriture grise sur plus de 200 plantes-hôtes. Qualifié de polyphage, Botrytis cinerea est en fait un complexe d'espèces dans lequel des populations distinctes pourraient être adaptées à différents hôtes. Il s'agit d'un des principaux champignons pathogène de la vigne conduisant à des importantes pertes pour l'agriculture au niveau de la France et de l'Europe. Les spores ou les conidies de Botrytis cinerea sont sub-ovales et sont un bon exemple de la mise en oeuvre pratique du procédé de l'invention. Les souches à tester sont mises en culture sur un milieu MEAc qui contient 20g de malt, 1g de peptone, 20g de glucose et 0,5 g de chloramphénicol, pendant une durée de 7 jours (préculture). Le milieu de culture pour les tests avec fongicide est préparé comme suit : Extrait de levure (20,0 f 0,1) g Bactopeptone (20,0 t 0,1) g Acétate de sodium (2,0 t 0,1) g Agar (12,5 f 0,1) g Eau distillée QSP (1,00 t 0,01) L Agiter à l'aide d'un barreau aimanté puis autoclaver (30 t 1) min à (110 ±1) °C Après autoclavage, laisser le milieu refroidir jusqu'à environ 50°C au bain marie puis ajouter stérilement le biocide - Milieu coulé en boite 55 : (4 t 0,1) ml par boite La suspension de spores à 2.105 UFC/ml est étalée de façon homogène sur les boites d'essais et témoin, cette suspension est obtenue à partir de la préculture. Les spores sont suspendues dans un diluant (Tryptone ig/I, NaCI 0,5 g/I, Tween 80 iml/I et Eau 1 litre)). La pulvérisation des spores est réalisée sous un poste de sécurité microbiologique (PSM). Les milieux sont autoclavés à 110°C pendant 30 min puis placés dans un bain marie à 50°C pour les amener à cette température avant d'ajouter le biocide correspondant. Les biocides présentés dans le Tableau 1 ci-dessous sont ajoutés. Tableau 1 Biocides Abréviations Concentration à tester Préparation de solution mère Pyriméthanil Pyr 1 mg/I 504 pl dans 100 ml d'eau. 37,4 On ajoute 250 pl de cette solution à % v/v de MA 500 ml de milieu de culture Tebuconazole Teb 0,7 mg/I 193 mg dans 100 ml d'eau. 25,9% m/m de On ajoute 700 pL de cette solution à MA 500 ml de milieu de culture Fluodioxonil Flu 0,125 mg/I 30 mg dans 100 ml d'eau. 50% m/m de MA On ajoute 416 pl de cette solution à 500 ml de milieu de culture Boscalid Bos 3 mg/I 200 mg dans 100 ml d'eau. 50% m/m de MA On ajoute 1,5 ml de cette solution à 500 ml de milieu de culture Avec MA = matière active Au bout de 24 h d'incubation, on réalise au moins trois photographies numériques, de préférence 6 photographies au moins sous microscope, grossissement x5, des cultures réalisées pour le biocide Boscalid (Bos). On enregistre alors les fichiers correspondant sur un support physique quelconque tel que disque dur ou disque optique. Au bout de 48H, on fait de même pour les autres biocides: Pyriméthanil (Pyr), Tebuconazole (Teb), Fluodioxonil (Flu) et Tolnaftate (Toi). On enregistre également ces fichiers. Les photographies obtenues sont analogues aux figures 1A à ID. Comme il ressort de ces figures, on peut constater une croissance différente des spores de moisissures sur chaque photographie, caractéristique d'une résistance différente de Botrytis cinerea aux différents fongicides testés. Les photos préalablement enregistrées sont ensuite chargées dans le logiciel informatique de traitement mettant en oeuvre le procédé de l'invention. On renseigne ensuite dans le logiciel, l'objectif et le grossissement du microscope utilisés pour la prise d'images. Une fois ces paramètres enregistrés on lance le traitement d'image pour le calcul de la surface S et la longueur L. Un fichier texte est généré et affiche les résultats sous forme de la surface S et de la longueur L pour chaque photo. Le calcul de R pour chacune des photos prises pour chaque culture se fait avec toute application informatique de calcul (tableur par exemple), puis le calcul du rapport R' moyen obtenus à partir des photos prises pour chacune des cultures est calculé. Le pourcentage par rapport à la culture témoin sans biocide est alors calculé à partir de ces données. Les résultats sont affichés sous forme d'un histogramme tel que représenté à la figure 4. L'interprétation des résultats se fait directement par une simple lecture de l'histogramme pour identifier les souches sauvages et les souches résistantes aux différents biocides en tenant compte des seuils prédéfinis en avance. Des souches référencées en tant que résistantes aux fongicides étudiés ont été utilisées comme référence dans des laboratoires spécialisés. Une base de données des rapports R obtenus conformément au procédé de l'invention a été ensuite créée pour sélectionner le seuil en pourcentage d'élongation dans chaque cas. Chaque biocide a un seuil en pourcentage de taux d'élongation des tubes germinatifs à partir duquel la souche est déclarée résistante Pour Bos, seuil = 50%, Pour Pyr, seuil = 85% Pour Teb, seuil = 70% Pour Flu, seuil = 60% Dans l'exemple représenté sur la figure 4, les souches 607 et 621 sont résistantes au Pyriméthanil, la souche T263 est résistante au Fludioxonil et au Tebuconazole. Les souches 607 et 621 sont résistantes au Pyriméthanil, la souche T263 est résistante au Fludioxonil, les souches 614 et 626 sont résistantes au Tebuconazole et les souches 619 et 626 sont résistantes au Boscalid. Les souches 604, 605, 606, 608, 613, 617, 618, 622, 623, 624, 625 et 628 sont sensibles aux 4 biocides, c'est-à-dire sont limitées dans leur croissance en présence de ces biocides. Le procédé de l'invention permet donc la qualification rapide et automatique de la résistance d'une souche de moisissure à un ou plusieurs biocides sans requérir d'expérimentation complexe ni une durée excessive d'analyse additionnelle à la culture des souches de moisissures. REVENDICATIONS1 - Procédé d'étude de l'effet d'au moins un biocide sur une souche de moisissure, dans lequel : - on réalise une première culture d'une souche de moisissure déterminée sur au moins un milieu de culture pendant une durée déterminée T, - on réalise simultanément une seconde culture de la même souche de moisissure sur un même milieu de culture pendant une même durée T, en présence d'une quantité déterminée d'au moins un biocide et caractérisé en ce que : - on réalise à l'échéance de la durée de culture T au moins une photographie d'une zone de même surface des première et seconde cultures, et - on calcule à partir de chaque photographie par l'intermédiaire de moyens d'analyse et de calcul informatisés la surface cumulée totale de spores et la longueur cumulée totale de mycélium de spores germées, et - on assimile la totalité des spores à une spore unique formant un disque de rayon virtuel r que l'on calcule à partir de la surface totale cumulée de spores calculée à l'étape précédente, et - on calcule un rapport R entre la longueur totale de mycélium et le rayon virtuel r pour chaque photographie, représentatif du taux d'élongation pour la première et la seconde culture réalisées, - on calcule le pourcentage d'élongation de la seconde culture par rapport à la première culture à partir des rapports R obtenus pour chaque culture. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on discrimine les spores et les mycéliums du milieu de culture dans la photographie, par analyse colorimétrique de chaque pixel des photographies suivant un système colorimétrique RVB et attribution pour chaque pixel d'une valeur scalaire fixe, cette valeur scalaire étant donnée par un triplé de valeurs RVB dans le système colorimétrique RVB utilisé. 19 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 à ou 2, caractérisé en ce que l'on prend un nombre entier n de photographies de la première culture et un même nombre entier de photographies de la seconde culture et on calcule pour chaque photographie le rapport R, noté Ri, avant de calculer, pour chaque série de n photographies de chaque culture un rapport R' moyen tel que : R' = ~n xt n 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on réalise les photographies après une durée T comprise entre 4 et 48h en fonction du biocide testé et de la souche de moisissure cultivée. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les photographies présentent une résolution d'au moins 72 pixels par unité de largeur d'image (ppp). 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les photographies sont réalisées sous microscopie optique avec un grossissement d'au moins 500%. 20 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les première et seconde cultures sont réalisées à partir d'une solution calibrée de spores de la souche de moisissures considérées. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration de 25 la solution calibrée est choisie de manière à obtenir de 20 à 50 spores par photographie. 9 - Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la concentration de la solution calibrée est de 2.105 spores par ml étalées de façon homogène sur des boîtes de pétri identiques. 30 10 - Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pourcentage d'élongation obtenue est comparée à une valeur seuil déterminée pour le biocide considéré avec des souches de référence de la même espèce, ce qui permet de classer la souche de moisissure étudiée en tant que résistante ou non résistante au biocide considéré. 11 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que les souches de référence comprennent au moins 3 souches de références connues pour être résistantes au biocide considéré et au moins une souche de référence connue pour être sensible au biocide considéré.15