Brevet FR2980211A1 — publié le 20130322

METHODE D'ANALYSE D'ADN GENOMIQUE Domaine technique La présente invention se rapporte à une séquence d'acide nucléique, ainsi qu'à son utilisation pour une analyse d'ADN génomique humain, notamment en tant que calibreur interne universel. Elle se rapporte également à un procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité génomique d'un gène cible, et à l'utilisation de ce procédé pour diverses applications : évaluer la qualité d'un ADN humain, réaliser une analyse moléculaire de tumeur, déterminer l'effet d'une substance ou d'un traitement physique et/ou biologique sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon, rechercher dans un test de criblage de substances, celles qui régulent positivement ou négativement ce nombre de copies de gènes cibles, ou effectuer un test de criblage de tumeurs. La présente invention se rapporte également à un kit d'analyse d'ADN génomique humain. Elle trouve des applications dans le domaine des biotechnologies, par exemple pour le contrôle de la qualité d'ADNs distribués par des 2 0 biobanques, pour l'analyse moléculaire des tumeurs, pour tester la toxicité et la génotoxicité des molécules à usage cosmétologiques ou pharmacologiques, ou pour le criblage à la recherche de médicaments. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (11) renvoient à la liste des références présentées à la fin des exemples. 25 Etat de la technique La variabilité du nombre de copies d'un gène est une forme particulière du polymorphisme. Elle correspond au fait que le nombre de copies d'un même gène dans le génome est variable entre les individus 30 d'une même espèce. On estime à ce jour que plus de 12% du génome humain est concerné par ce type de polymorphisme (Redon et al. « Global 2 9 8 0 2 1 1 2 variation in copy number in the human genome », Nature, vol. 444, 2006, p. 444-454 [1]). Le nombre de copies d'un gène cible peut aussi varier de manière pathologique dans le cas de certaines tumeurs et peut leur donner, alors, 5 un « marquage » particulier. Pouvoir mesurer ce nombre, peut également servir d'outil de criblage de molécules, pour permettre de rechercher l'activité bénéfique ou néfaste d'une substance. Il permet aussi de cribler des tumeurs pour réaliser des corrélations entre le nombre de copie de gènes et des traitements thérapeutiques. Enfin, il permet aussi de mesurer 10 directement dans un ADN donné la dégradation naturelle ou artificielle de cet ADN. La variation du nombre de copies d'un gène cible peut être notamment un puissant marqueur génétique pour le diagnostic d'un grand nombre de maladies génétiques, telle que la trisomie, ou de cancers voir 15 de résistance à des cancers (cancer du sein et amplification de CerB2). La variation du nombre de copies d'un gène cible peut également permettre de mesurer la variation du nombre de mitochondries et donc la variation d'activité métabolique d'une cellule. Elle peut être ainsi un indicateur toxicologique. Elle peut également être un indicateur de chances de réponses à un traitement thérapeutique ou un indicateur de l'évolution d'une maladie, tel qu'un cancer, pendant un traitement thérapeutique. L'ordonnance de l'union européen REACH (« enRegistrement, Evaluation et Autorisation des substances Chimiques »), entrée en vigueur en juin 2007, obligent notamment les industries chimiques, cosmétiques et pharmacologiques, à fournir les données de sûreté sanitaire et environnementale sur toutes les substances qu'elles produisent. La fourniture de ces données peut notamment passer par l'utilisation de méthodes d'analyse d'ADN. Les méthodes actuellement utilisées pour quantifier un ADN sont la mesure de densité optique et l'électrophorèse en gel agarose. Ces méthodes sont grossières et ne permettent pas d'apprécier la qualité de l'ADN et en particulier ses dégradations minimes. Plus récemment, des essais ont été proposés pour quantifier l'ADN double brin par intercalage de Syber green (marque déposée). Toutefois les résultats obtenus sont très instables. Une autre méthode utilisée est la spectrométrie UV. Cependant cette méthode pose également des problèmes d'interprétation des résultats en raison de la différence d'absorption significative entre des ADN simples brins et doubles brins. Par ailleurs, pour analyser de l'ADN génomique, les méthodes actuellement utilisées sont le Fish (« hybridation in situ en fluorescence »), l'allélotypage, la CGH array (« puce d'hybridation génomique comparative ») et éventuellement le séquençage massif. Ces méthodes nécessitent l'utilisation d'équipement coûteux et de personnel hyperspécialisé pour l'interprétation des résultats. En outre, les résultats obtenus par ces méthodes ne sont pas quantitatifs. Il existe donc de réels besoins de mettre au point de nouveaux outils pour l'analyse d'ADN génomique, notamment de nouvelles méthodes, palliant les défauts, inconvénients et obstacles précités de l'art antérieur. En particulier, il est nécessaire de mettre au point un procédé facile à mettre en oeuvre, peu couteux, adapté au haut débit et ayant une bonne sensibilité ainsi qu'une bonne spécificité. Description de l'invention La présente invention répond précisément à ces besoins en fournissant un procédé qui permet de mesurer la quantité génomiques intactes, par exemple le nombre de copies, d'un gène cible quelconque par rapport à un calibreur interne universel, ainsi que les moyens nécessaires pour la mise en oeuvre de ce procédé. 2 9 8 0 2 1 1 4 Ainsi, la présente invention à notamment pour objet un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1. Elle a également pour objet l'utilisation de l'acide nucléique SEQ ID NO : 1 pour une analyse d'ADN génomique humain. 5 Selon l'invention, l'acide nucléique SEQ ID NO : 1 peut être utilisé par exemple comme calibreur pour une analyse d'ADN génomique humain. Dans la présente, on entend par « calibreur », toute séquence d'acide nucléique permettant de normaliser les résultats d'une analyse 10 d'ADN génomique. Le terme « calibrateur » peut également être utilisé. Les inventeurs de la présente sont les tous premiers à avoir identifié la séquence SEQ ID NO : 1 comme étant un acide nucléique très conservé chez l'homme, c'est-à-dire extrêmement stable, c'est-à-dire sans variation du nombre de copies, dans le génome humain. Cette séquence 15 est située dans la région RXRB dans le premier intron du Chromosome 6. Cette séquence a été désignée par les inventeurs comme « calibreur interne universel ». On entend par séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1, une séquence constitué par la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence 20 ayant la même fonction et présentant au moins 60 % d'homologie avec SEQ ID NO : 1, par exemple au moins 70%, par exemple au moins 80%, par exemple au moins 90%, par exemple au moins 95%, par exemple au moins 99%. Par ailleurs, les inventeurs ont constaté que le nombre de copies 25 de cette séquence dans le génome humain est constant, à savoir environ 330 copies haploïdes/ng d'ADN. Dans la présente, l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1 peut être également appelée « gène RXRB », « gène RXRbéta », « bétastan », « calibreur selon l'invention », « calibrateur interne, ou encore 30 « calibrateur interne universel ». 2 9 802 1 1 5 Dans la présente, on entend par « ADN génomique humain », l'ensemble comprenant le génome chromosomique humain et le génome mitochondrial humain. On entend par « génome chromosomique humain », l'ensemble du 5 matériel génétique contenu dans les chromosomes d'un être humain. On entend par « génome mitochondrial humain », l'ensemble du matériel génétique contenu dans les mitochondries d'un être humain. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro 10 d'analyse d'ADN génomique humain utilisant l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1. Le procédé selon l'invention peut être notamment un procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 comprenant l'utilisation d'un acide nucléique de séquence 15 SEQ ID NO : 1. Par exemple, le procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 comprendre une étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence. 20 Par exemple, l'étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence peut être réalisée en utilisant la méthode du AA de Ct. La méthode du AA de Ct est une méthode bien connue de l'homme 25 du métier (C A Heid, J Stevens, K J Livak, and P M Williams. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6: 986-994 [2]; Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR 30 experiments. Clin Chem. 2009, 55(4):611-22 [3]; Weglarz L, Molin I, Orchel A, Parfiniewicz B, Dzierzewicz Z. Quantitative analysis of the level of p53 and p21(WAF1) mRNA in human colon cancer HT-29 cells treated with inositol hexaphosphate. Acta Biochim Pol. 2006;53(2):349-56 [4] . Elle utilise la relation mathématique suivante : La méthode du AACt est bien connue de l'homme du métier pour mesurer la quantité d'un ADNc dans un échantillon donné relativement à un ADNc de référence. Nous avons adapté cette technologie pour mesurer le nombre de copies génomiques d'un gène cible donné par rapport au nombre de copies génomiques d'un gène calibreur qui a la particularité d'être très stable. La formule développée est la suivante ACt(échantillon à tester) = Ct(gène cible dans échantillon à tester) - Ct(gène calibreur dans échantillon à tester) et ACt(échantillon d'ADN contrôle) = Ct(gène cible dans échantillon d'ADN contrôle) - Ct(gène calibreur dans échantillon contrôle). Le principe de la qPCR, son protocole opératoire, les différents paramétrages du thermocycleur sont présentés par exemple dans le document « Relative Quantification: Data Management & Analysis Settings », Ray Meng, [5] (accessible en ligne sur http://genome.hku.hk/portal/files/GRC/Events/Seminars/2009/20090512/rel 20 ative°/020quantification_date/020managemenC/020`)/020analysis%20setting s.pdf). Les notions principales et particulières, applicables au procédé d'analyse de la variation du nombre de copies génomiques d'un gène cible quelconque dans un échantillon sont les suivantes : 25 Le Ct (« Cycle treshold » en anglais) est le point, le cycle, de la courbe d'amplification de l'échantillon de référence où la fluorescence détectée devient supérieure au bruit de fond. Le Ct est déterminé automatiquement par l'appareil de qPCR utilisé mais il doit, de temps en temps, être ajusté manuellement sur 30 certains thermocycleurs. Le seuil utilisé (« Treshold » en anglais) est fixé de manière à couper toutes les courbes de fluorescence au niveau de la phase exponentielle de la qPCR. Dans ce cas, la valeur de Ct représente bien la quantité initiale de matrice ADN présente dans l'échantillon. Le Ct moyen de référence, est calculé à l'aide d'une gamme de dilution d'ADN de référence et va servir ensuite à homogénéiser des mesures faites éventuellement sur d'autres plaques de PCR. En effet et pour chaque nouvelle plaque de qPCR, les points 100, 50 et 25 ng d'une gamme ADN de référence du laboratoire sont toujours analysés en triplicatas pour un gène cible donné. Ces points servent à s'assurer de la bonne efficacité de la qPCR duplex concernée et permettent la normalisation et donc la comparaison des résultats obtenus de manipulation en manipulation pour des milliers d'échantillons. Le Ct moyen de référence obtenu avec une gamme initiale de dilution d'ADN adéquate seront, en effet, toujours repris pour toutes les manipulations ultérieures pour le gène cible concerné. Les ADN de référence contiennent idéalement, des quantités de gène cible et de gène calibreur normales soit environ, 330 copies de génome haploïdes/ng chacun. La quantité de gène cible pour la gamme des échantillons de référence du laboratoire est « rentrée » dans le logiciel d'un thermocycleur comme contenant 25, 50 ng et 100 ng de gène cible. Le calibreur a été indiqué comme « calibreur ». Les échantillons sont indiqués comme « standard » ou contrôle. Ces paramètres ont été choisis afin de pouvoir utiliser en l'état les logiciels de thermocycleur qui ne sont pas faits pour cela. On peut par exemple utiliser le logiciel CFX manager en utilisant la relation mathématique suivante : AACt = ACt(échantillon à tester) - ACt(échantillon 30 Standard/contrôle) Dans cette formule, ACt(échantillon à tester) = Ct(gène cible dans échantillon à tester) - Ct(gène calibreur dans échantillon à tester) et ACt(échantillon d'ADN Standard/contrôle) = Ct(gène cible dans échantillon d'ADN Standard/contrôle) - Ct(gène calibreur dans échantillon Standard/contrôle). Les valeurs obtenues sont transformées en logarithmes de la concentration d'ADN pour les comparer et les représenter sous forme graphique comme sur la figure 1 pour créer une gamme standard qui permet de lire le Ct moyen calculé par la machine, la pente de la courbe et donc l'efficacité de la qPCR duplex gène cible/calibreur universel. Des échantillons à analyser peuvent être ajoutés et seront analysés en même temps et sur la même plaque et les résultats obtenus seront calculés de la même façon en incluant si nécessaire un ADN contrôle positif voir négatif de l'expérience qui a généré les ADN. Les résultats obtenus seront transformés automatiquement en 2- mct pour comparaison et enfin exprimés en histogrammes automatisés. Les histogrammes indiquent en abscisses : le nom de l'échantillon et en ordonnées le nombre de fois [augmenté (amplification) ou diminué (délétion)] de copies du gène cible par rapport au nombre de copies du gène cible mesuré dans l'ADN contrôle spécifique de l'expérience. Les résultats sont normalisés par le calibreur. Usuellement, les logiciels de quantification des machines de qPCR sont adaptés pour mesurer des concentrations d'ADNc en utilisant la méthode du AACt et leur conversion en 2-'8"8c. Les résultats sont exprimés 2 5 relativement à un gène (ADNc) de référence dont l'expression ne varie pas. Le gène de référence est mesuré dans chaque échantillon par rapport à un échantillon contrôle dont la quantité d'ADNc est indiquée au logiciel. Une dilution en cascade de ce contrôle sert à s'assurer des paramètres d'efficacité de la qPCR. Les résultats sont des concentrations d'ADNc. 30 Pour utiliser ce logiciel en l'état pour mesure de l'ADN génomique, le gène de référence utilisé est le calibreur selon l'invention. L'échantillon contrôle, dont la concentration est connue, est l'ADN standard/contrôle. Par exemple, la fluorescence de la sonde du gène de référence, c'est-à-dire du gène calibreur est orange. Le calibreur permet de normaliser tous les résultats obtenus pour chaque gène cible. Par exemple, la fluorescence de la seconde sonde, qui s'hybride au gène cible, est jaune. Ces fluorescences seront mesurées à la fin de chaque cycle par le thermocycleur (mesure en temps réel) En utilisant la méthode du AACt décrite ci-dessus et la conversion en 2-'8"8c, le « rapport de fluorescence » (par exemple jaune sur orange), de la qPCR duplex, c'est-à-dire du gène cible sur le calibreur interne, est le plus souvent égal à 1 dans l'ADN de référence et dans toutes ses dilutions car c'est le rapport de l'intensité de fluorescence jaune sur orange qui est chiffré. Il l'est aussi dans les ADN contrôles. Ceci avec une tolérance de plus ou moins 5 % ; tous les échantillons avec Ct de calibreur supérieur à 28 sont éliminés et retestés. La méthode du AA de Ct est également présentée dans l'Exemple 1 ci-dessous. Selon l'invention, la quantité de gène est avantageusement un nombre de copie de gène. On entend par « nombre de copie d'un gène », la quantité relative ou absolue d'un gène dans le génome. Dans la présente, on entend par « échantillon », toute solution comprenant un ADN. Il peut s'agir par exemple d'une solution comprenant un ADN préalablement extrait d'un individu. On entend par « échantillon de référence », tout échantillon comprenant de l'ADN préalablement prélevé chez un individu de référence. On entend par « échantillon à tester » ou « échantillon à analyser », tout échantillon comprenant de l'ADN préalablement prélevé chez un individu à tester. On entend par « individu », une ou plusieurs cellules, un tissu, un organe ou un être vivant. Par exemple, l'individu peut être toute cellule comprenant de l'ADN. Par exemple, l'individu peut être une cellule HepG2, une cellule hépatique normale, une cellule cardiaque normale, une cellule tumorale, une cellule foetale, une cellule souche, une cellule modifiée par génie génétique. Il peut également s'agit d'un tissu reconstitué in vitro, par exemple, il peut s'agir d'un expiant cutané ou un expiant oculaire, d'un organe ou d'un fragment d'organe. On entend par « individu de référence », tout individu que l'on choisi comme référence ou contrôle. Il peut s'agir par exemple de tout individu dont on connait le nombre de copies d'un gène cible donné. En effet, un individu de référence pour un gène cible A n'est pas forcément un individu de référence pour un gène cible B. On entend par « individu à tester », tout individu dont on souhaite connaitre la variation du nombre de copies d'un gène cible donné. Dans la présente, on entend par « gène cible », toute séquence d'ADN comprise dans un génome. Un gène cible peut être déterminé par sa séquence ou par des séquences d'amorces sens et antisens qui permettent d'amplifier la séquence du gène cible. Selon l'invention, dans le procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1, l'échantillon de référence et l'échantillon à tester peuvent provenir d'un seul individu ou de deux individus, voire de plus de deux individus. Ainsi, selon la présente invention l'individu de référence et l'individu à tester peuvent être le même individu. Lorsque l'échantillon de référence et l'échantillon à tester proviennent de deux individus, la mise en oeuvre du procédé selon l'invention permet d'analyser à un instant donné la variation au cours du temps du nombre de copies intactes d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1. Lorsque l'échantillon de référence et l'échantillon à tester proviennent d'un seul individu, l'échantillon de référence et l'échantillon à tester peuvent par exemple avoir préalablement été prélevés sur un même individu et être analysés à deux, voire plusieurs, instants différents. L'échantillon de référence et l'échantillon à tester peuvent également avoir subit des traitements différents. Dans ce cas, la mise en oeuvre du procédé selon l'invention permet d'analyser la variation au cours du temps du nombre de copies d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 chez un même individu. Le procédé selon l'invention permet une quantification vraie du nombre de copies génomiques intactes de gènes cibles en utilisant des machines et des logiciels existants. Le procédé selon la présente invention peut par exemple être réalisé par qPCR (pour « quantitative polymerase chain reaction » en anglais), également appelée RT-PCR (pour « real time polymerase chain reaction » en anglais), PCR en temps réel ou PCR quantitative. La qPCR est une technique bien connue de l'homme du métier. 15 Elle nécessite l'utilisation d'amorces sens et antisens permettant d'amplifier une séquence, ainsi que l'utilisation d'une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons produits lors de la qPCR. Les amorces sens et antisens et la sonde fluorescentes sont des séquences d'acide nucléique qui sont avantageusement spécifiques de la 20 séquence à amplifier. Par ailleurs, la sonde fluorescente peut par exemple posséder un fluorochrome. Avantageusement, ce fluorochrome est stable, résistant au pH et aux variations de températures et ne modifie pas la température de demi-dénaturation (« Tm ») de la sonde. Le fluorochrome peut par 25 exemple être choisi pour ses propriétés d'absorbtion/émission d'énergie, en accordance avec les capacités de détection des machines de qPCR. Par exemple, le fluorochrome peut être choisi dans le groupe comprenant les cyanines, les rhodamines, les coumarines. Par exemple le fluorochrome peut être choisi dans le groupe comprenant le Texas red 30 (marque déposée), le Cascade Blue (marque déposée), Alexa Fluor (marque déposée), le VIC (marque déposée), le FAM (marque déposée), Yakima yellow (marque déposée) ), le TET, (marque déposée), le JOE (marque déposée), le HEX (marque déposée), le ATTO 550 (marque déposée), le Tamra (Tetramethylrhodamin) et le ROX (marque déposée). Un fluorochrome, également appelé fluorophore, est une molécule qui émet une fluorescence. Elle provient d'un groupe fonctionnel qui dans cette molécule absorbe l'énergie électromagnétique d'une longueur d'onde donnée et la réémet à une autre longueur d'onde spécifique. L'homme du métier est à même de déterminer quelle longueur d'onde appliquer en fonction du fluorochrome utilisé. La fluorescence émise est mesurée en ligne à la fin de chaque cycle de qPCR. La sonde fluorescente peut avantageusement posséder à la fois un fluorochrome et un inhibiteur de fluorescence, appelé également extincteur ou « quencher », l'un étant disposé en 5' de la séquence de la sonde fluorescente, l'autre étant disposé en 3' de cette même séquence. Un extincteur est une entité moléculaire, ou une espèce chimique, capable de désactiver un état excité créé dans une entité moléculaire par transfert d'énergie, d'électron ou par un mécanisme chimique. Ainsi un quencher est une molécule qui permet d'inhiber la fluorescence d'un fluorochrome. Le quencher peut par exemple être choisi dans le groupe comprenant le BHQ1 (« Black Hole Quencher 1 (marque déposée) », en anglais), le BHQ2 (« Black Hole Quencher 2 (marque déposée) », en anglais), le Dabsyl (dimethylaminoazosulfonic acid), les Dark Quencher Eclipse (marque déposée) avec le BBQ650 (marque déposée), le TAMRA (Tetramethylrhodamin), les Qxl quenchers (marque déposée), le iow black FQ Iowa (marque déposée) et le black RQ IRDye QC-1 (marque déposée). Par exemple, la sonde fluorescente peut être une sonde TaqMan (marque déposée). Avant la qPCR, lorsqu'aucune amplification n'a eu lieu et que la sonde fluorescente est intacte, le quencher inhibe la fluorescence du fluorochrome. Seule une fluorescence résiduelle peut être observée. Au cours de la qPCR, les sondes fluorescentes hybridées sur les amplicons synthétisés, sont hydrolysées lors de chaque étape d'élongation des amorces. Le fluorochrome est alors libéré loin de l'extincteur et sa fluorescence n'est plus inhibée par celui ci. L'émission de la fluorescence libérée peut alors être mesurée à la fin de chaque cycle de qPCR. Cette mesure permet de définir une valeur de « Ct » (« cycle threshold » en anglais ou « cycle seuil ») correspondant au nombre de cycles de qPCR nécessaires pour que la valeur de l'intensité de fluorescence soit alors significativement différente du bruit de fond, c'est-à-dire différente de la fluorescence initiale éventuelle. Le procédé de la présente invention peut être réalisé à toute température permettant d'analyser un ADN génomique. Lorsque le gène cible à analyser est le génome mitochondrial, voire un gène transfecté, il est possible d'améliorer le procédé de l'invention, par exemple en utilisant des températures réactionnelles plus défavorables pour ces gènes cibles parce qu'ils sont en excès par rapport au calibreur et saturent les possibilités de détection de la machine de qPCR. A titre d'exemple, on peut utiliser une température d'appariement des amorces comprise entre 58 et 64°C, par exemple de 63°C. La qPCR peut être réalisée en simplex, dans des tubes/puits différents c'est-à-dire qu'une seule cible est amplifiée par réaction de qPCR, ou en duplex, c'est-à-dire que deux cibles différentes sont amplifiées en une seule réaction qPCR. Elle peut également être réalisée en triplex ou en quadruplex, c'est-à-dire que respectivement deux ou trois cibles sont amplifiées en une seule réaction de qPCR en plus du calibreur universel. De préférence, les amorces et sondes utilisés sont conçues et validées pour donner, ensemble, des qPCR spécifiques et d'efficacités comparables. De préférence, la qPCR est réalisée en duplex. En effet, la réalisation de la qPCR en duplex permet notamment d'économiser les réactifs puisque les deux qPCR ont lieu simultanément dans le même tube. Cela permet également d'éliminer les variations dues aux erreurs de manipulation puisque les deux qPCR ont lieu simultanément dans le même tube. Lorsque la qPCR est réalisée en duplex, deux sondes fluorescentes marquées respectivement avec deux fluorochromes différents doivent être utilisées pour différencier les amplicons produits lors de la qPCR. Selon la présente invention, lorsque la qPCR est réalisée en duplexe, elle inclue toujours le même calibreur universel, à savoir la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1. Lorsque deux sondes fluorescentes sont marquées respectivement avec deux fluorochromes différents, il peut s'agir de tout polyplexe de fluorophores qui donne des détections bien séparées des fluorescences. Il peut s'agir par exemple des couples de fluorochromes choisis dans le groupe comprenant Texas red (marque déposée) /VIC (marque déposée), Texas red (marque déposée) /Yakima yellow (marque déposée), Texas red (marque déposée) /TET yellow (marque déposée), Texas red (marque déposée) /HEX (marque déposée), Texas red (marque déposée) /JOE (marque déposée). De préférence, on utilise deux fluorochromes ayant des rendements quantiques proches, par exemple le couple de fluorophores : Texas red (marque déposée) /Yakima yellow (marque déposée). Plusieurs applications industrielles sont possibles, notamment en fonction de la nature et des jeux du ou des gènes cibles choisis, le calibreur interne universel restant le même, à savoir la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1. Par exemple, des jeux de gènes cibles ont été identifiés par les inventeurs, parce qu'ils présentent, seuls ou ensembles, un intérêt en diagnostique et/ou en pronostique. En fonction des gènes cibles analysés, il est donc possible, par exemple : d'évaluer la dégradation d'un ADN. Cette application est dénommée « DNAqual » dans la présente. Elle permet par exemple de tester la qualité des ADNs tels des ADNs extraits d'individus, distribués par des biobanques ou de quantifier la dégradation d'un ADN causée par des phénomènes physiques, biologiques ou chimiques, directs ou indirects. Ainsi, on entend par « évaluation de la qualité d'un ADN », l'évaluation de l'intégralité d'un ADN, de son niveau de dégradation éventuel. DNAqual permet également de suivre les quantités de lésions causées par un traitement ou une substance ou par un déficit cellulaire en enzymes capables de réparer l'ADN génomique. de mesurer le nombre de copies de génome mitochondrial et donc le nombre de mitochondries présentes dans une cellule ou un tissu à un instant donné ou à des instants différents. Cette application est dénommée « MITOC » dans la présente. Elle permet également de montrer la toxicité d'une molécule donnée ou d'un traitement donné en montrant les variations du nombre de copies de génome mitochondrial dans le temps. de montrer la génotoxicité induite par une molécule déterminée ou un traitement donné lorsque les gènes cibles utilisés bordent des sites fragiles de l'ADN, et d'autres comme par exemple des sites choisis dans le groupe comprenant P16, GRID2, LRP1B, FHIT et ADAMTS18. Un gène cible choisi dans le groupe comprenant EGFR1 humain, TNFRSF10A (trail receptor 4) humain, TNFRSF1OB (TRAIL- R2 - CDC262) humain, TPBG humain, ERBB3 humain et ERBB4 humain peut être utilisé comme contrôle négatif. Cette application est dénommée « Genotox » dans la présente. Par exemple, l'application Genotox peut être réalisée sur des extraits de cellules ou tissus dans le but d'évaluer leurs niveaux d'intoxication. Genotox peut également être réalisé à partir de cellules ou de tissus modèles traités par un ou des phénomènes physiques, chimiques ou biologiques (comme par exemple une protéine) potentiellement toxiques afin d'apprécier l'éventuel effet mutagène du phénomène testé sur le génome des cellules. En effet, un effet mutagène se manifeste par une réplication infidèle de l'ADN lésé par le produit toxique et donc des variations de nombre de copies de ces gènes que ce soit des délétions ou des amplifications. En théorie, elles frappent plus volontiers l'ADN des sites fragiles. Par exemple, Genotox peut être utilisé dans un test de criblage de substances qui pourrait avoir un effet toxique sur un individu. Par exemple Genotox peut être utilisé dans un test de criblage de cellules ou tissus ayant été soumis à différents traitements pour évaluer la toxicité de ces traitements. Dans un autre exemple, Genotox peut être utilisé dans un test sur cellules ou tissus ayant été soumis à différents traitements pour classifier ces cellules ou tissus selon leur degré de résistance à ces traitements. de permettre une catégorisation moléculaire de pathologies, par exemples des tumeurs, dans le cadre de la médecine personnalisée, pour par exemple, mieux indiquer une thérapeutique en mesurant le nombre de copies de gènes cibles pour lesquels il existe une thérapeutique ciblant ces gènes, leurs protéines ou voies cellulaires correspondantes. Par exemple il existe des thérapies ciblant une ou plusieurs molécules, comme par exemple des récepteurs impliqués dans la maladie, par le biais d'anticorps monoclonaux ou de petites molécules chimiques. Pour prédire, suive ou comprendre la résistance des tumeurs aux thérapies comme par exemples des thérapies ciblées ou des chimiothérapies parce que ces tumeurs présentent des amplifications des gènes impliqués dans une telle résistance (par exemple : MDR, Topo 1 et 2) en mesurant le nombre de copies de ces gènes de résistance. Pour prédire, suivre ou comprendre le caractère agressif d'une pathologie, par exemple une tumeur, et les chances de réponses à un traitement en détectant les signatures d'agressivité de cette pathologie, par exemple une tumeur. Cette application est dénommée « Copycount » dans la présente. Copycount pourrait donc avoir une utilité dans le cadre de kit de diagnostics et/ou théranostics, afin d'aider à identifier le meilleur traitement et de suivre la maladie pendant le traitement (test compagnon de traitement). On entend par « théranostic », l'association d'un test diagnostique à une thérapie. Par exemple, Copycount pourrait être utilisé dans un test de criblage de tumeurs. Cribler les tumeurs avec Copycount permet, par exemple, d'évaluer le lien entre l'efficacité d'un traitement thérapeutique et les nombres de copies des gènes codant pour la cible biologique du traitement thérapeutique. - de quantifier les résultats des expériences de transfection d'un plasmide luciférase dans des cellules ou tissus modèles. Cette application est dénommée « Luciola » dans la présente. - de mesurer des signatures d'agressivité tumorale et d'ethnicité. Par ailleurs, les inventeurs ont mis au point des amorces sens et antisens, ainsi que des sondes fluorescentes spécifiques de chacun de ces gènes cibles. Ces gènes cibles, amorces sens et antisens et sondes fluorescentes sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Les séquences des amorces sens et antisens mises au point par les inventeurs pour amplifier le calibreur de séquence SEQ ID NO : 1 sont respectivement les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO: 3. La sonde fluorescente spécifique mise au point par les inventeurs pour détecter les amplicons produits de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1, a pour séquence SEQ ID NO : 4. Tableau 1 : Applications possibles en fonctions des gènes cibles analysés Application Gène cible visé Amorce sens Amorce Sonde antisens SEQ ID NO DNAqual EGFR1 humain 9 10 11 Copycount EGFR1 humain 9 10 11 humain CERB-B2 humain 12 13 14 ERBB3 humain 15 16 17 ERBB4 humain 18 19 20 TOP I humain 21 22 23 TOPO 2 ALPHA humain 24 25 26 MDR humain 27 28 29 MET humain 30 31 32 IGFR1 humain 33 34 35 SDMAD4 humain 36 37 38 TNFRSF10A (TRAIL R 39 40 41 4) humain TNFRSF1OB (TRAIL-R2 - CDC262) humain 42 43 44 TPBG humain 45 46 47 (trophoblast glycoprotein) VEGR2-KDR-FLK1 48 49 50 humain GENOTOX CDKN2-P16 humain 51 52 53 humain ADAMTS18 humain 54 55 56 LRP1B humain 57 58 59 GRID2 humain 60 61 62 FHIT humain 63 64 65 MITOC - 66 67 68 Humain La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour évaluer la qualité d'un ADN humain. Dans la présente on entend par « évaluer la qualité d'un ADN », le fait de quantifier la dégradation d'un ADN engendré par des phénomènes 10 physiques et/ou biologiques et/ou chimiques. Par exemple, les phénomènes physiques peuvent être une irradiation UV des ADNs, une lyophilisation préalable des tissus, un chauffage des ADNs, etc... Les phénomènes biologiques peuvent être par exemple une dégradation d'ADN causée par un microorganisme, par exemple une bactérie ou par une enzyme. Les phénomènes chimiques peuvent être par exemple tout phénomène causé par une substance, une molécule dans une cellule/tissus modèles, etc. Il peut s'agir également d'une combinaison de ces phénomènes. Il peut également s'agir d'une dégradation causée par une manipulation de l'ADN, par exemple lors de son extraction à partir d'une cellule. De préférence, pour évaluer la qualité d'un ADN humain, le gène cible utilisé est EGFR1 humain. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour déterminer l'effet d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour déterminer la toxicité d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. Dans la présente, on entend par « effet d'un traitement sur le nombre de copie d'un gène cible », l'effet provoqué par des phénomènes physiques et/ou biologiques et/ou chimiques sur le nombre de copie du gène cible. Par exemple, les phénomènes physiques peuvent être une irradiation UV des ADNs, une lyophilisation préalable des tissus, un chauffage des ADNs, etc. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus dans un test de criblage. Par exemple le test de criblage peut être un test de criblage d'une substance ou d'une tumeur. Un test de criblage peut permettre, par exemple, de détecter l'effet d'une substance ou d'un traitement sur le génome d'un individu. Le traitement peut être par exemple un traitement protecteur, positif, thérapeutique ou toxique. Par exemple, le traitement peut être choisi dans le groupe comprenant une exposition aux UV, une irradiation, l'application d'une molécule. Par exemple la molécule peut être choisie dans le groupe comprenant les anti-UV, les antioxydants, les antimutagènes, les antitoxiques et les protecteurs de l'ADN et de sa réplication. La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1 défini ci-dessus pour aider à déterminer et/ou adapter un traitement et/ou suivre l'évolution d'une maladie pendant son traitement. La présente invention a également pour objet un kit d'analyse d'ADN génomique humain comprenant des amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur, et une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1 produits. Par exemple, les amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur peuvent être respectivement de séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3. La sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1, produits peut être par exemple de séquence SEQ ID NO : 4. Cette sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1, produits peut être, par exemple, une sonde de séquence SEQ ID NO : 4. 2 9 8 0 2 1 1 21 Les inventeurs sont les premiers à avoir identifié que le gène EGFR1 humain (chr 7:55224226-55238906) peut être utilisé pour évaluer la qualité d'un ADN humain. Ils sont en outre les premiers à avoir identifié une méthode simple 5 et quantitative pour quantifier l'ADN génomique d'un gène impliqué dans des pathologies. Par exemple, les gènes impliqués dans des pathologies peuvent être choisis dans le groupe comprenant EGFR1 humain, EGFR2 humain, EGFR3 humain, EGFR4 humain, c-ERB-B2 humain, ERBB3 humain, ERBB4 humain, TOP I humain, TOPO 2 ALPHA humain, MDR 10 humain, MET humain, IGFR1 humain, SDMAD4 humain, TNFRSF10A (TRAIL R4) humain, TNFRSF1OB (TRAIL-R2 - CDC262), TPBG humain, VEGR2-KDR-FLK1 humain, MET humain et MDR humain. Cette méthode peut être utilisée pour mieux prédire et suivre l'efficacité d'un traitement utilisant par exemple un traitement ciblé, par exemple un anticorps 15 monoclonal, agissant sur l'un ou l'autre gène et pour évaluer l'éventuelle résistance aux thérapies, par exemple, les thérapies ciblées ou les chimiothérapies. Ils ont également identifié que l'utilisation d'une combinaison de ces gènes cibles peut être utilisée. Il peut par exemple s'agir de la 20 combinaison des gènes cibles choisis dans le groupe comprenant MITOC/Genotox présentés dans le tableau 1 ci-dessus, pour évaluer dans le temps les effets toxiques et mutagènes de substances administrées, notamment les substances administrées à très faibles doses, sur de longues périodes dans des systèmes modèles in vivo ou in vitro (explants 25 de tissus reconstitués, cellules modèles, modèles de tissus ou d'organes voire animaux modèles). Dans la présente, on entend par « gène MITOC », le gène amplifié par les séquences sens et antisens SEQ ID NO : 66 et SEQ ID NO : 67. Ils sont en outre les premiers à avoir identifié que les gènes cibles 30 choisis dans le groupe comprenant MITOC, CDKN2-P16 humain, ADAMTS18 humain, LRP1B humain, GRID2 humain et FHIT humain, 2 9 802 1 1 22 peuvent être utilisé pour montrer l'éventuelle toxicité chronique et/ou la génotoxicité induite par une substance déterminée, en examinant respectivement les variations du génome mitochondrial et les variations du génome chromosomique. De préférence, les variations du génome 5 mitochondrial et les variations du génome chromosomique sont observées à des endroits précis. Il s'agit par exemple des sites fragiles de l'ADN choisis dans le groupe comprenant LRP1B (chr 12:57,522,28257,543,841), FHIT (chr 3:59735421-61237133), P16 (chr 9:21,967,75221,975,038), ADAMTS18 (chr 16:77389837-77469011) et GRID2 10 (chr4:93225550-94693648). Un gène cible choisi par exemple dans le groupe comprenant EGFR1 humain, ERBB3 humain et ERBB4 humain peut être utilisé comme contrôle négatif. Les inventeurs ont également identifié une séquence d'acide 15 nucléique de séquence SEQ ID NO : 5. Cette séquence est, à l'instar de l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1 chez l'homme, très conservée chez la souris. L'acide nucléique SEQ ID NO : 5, peut être utilisée pour une analyse d'ADN génomique murin. 20 L'acide nucléique SEQ ID NO: 5, peut être utilisée comme calibreur pour une analyse d'ADN génomique murin Dans la présente, on entend par « ADN génomique murin », l'ensemble comprenant le génome chromosomique murin et le génome mitochondrial murin. 25 On entend par « génome chromosomique murin », l'ensemble du matériel chromosomique contenu dans les chromosomes d'une souris. On entend par « génome mitochondrial murin », l'ensemble du matériel chromosomique contenu dans les mitochondries d'une souris. La séquence SEQ ID NO : 5 peut être utilisée dans un procédé in vitro d'analyse d'ADN génomique, par exemple dans le procédé de l'invention ci-dessus dans lequel la séquence SEQ ID NO : 5 remplace la séquence SEQ ID NO : 1, et dans lequel le gène cible différent de SEQ ID NO : 5 remplace le gène cible différent de SEQ ID NO : 1. Cette séquence peut également être utilisée pour évaluer la qualité d'un ADN murin. Elle peut également être utilisée pour déterminer l'effet d'une substance ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. Elle peut également être utilisée pour déterminer la toxicité d'une substance ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. Elle peut également être utilisée dans un test de criblage. Ce criblage peut être par exemple un criblage de substances ou de tumeurs. Elle peut également être utilisée pour aider à déterminer et/ou adapter un traitement et/ou suivre l'évolution d'une maladie pendant son traitement. Les expressions « qualité d'ADN », « effet d'une substance sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon » et « test de criblage de substance » ont la même définition que celle présenté ci-dessus, mais rapportée à la souris. Les différents tissus de la souris peuvent être alors analysés avec méthodes DNAqual, MITOC et Genotox présentées ci-dessus. Un kit d'analyse d'ADN génomique murin comprenant des amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 5 du calibreur, et une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 5 produits, a également été mis au point par les inventeurs. Dans ce kit, les amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 5 du calibreur peuvent être, par exemple, respectivement de séquences SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7. La sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 5, produits peut être par exemple de séquence SEQ ID NO : 2 9 8 0 2 1 1 24 8. Cette sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 5, produits peut être par exemple une sonde de séquence SEQ ID NO : 8. Par ailleurs, les inventeurs ont mis au point des amorces sens et 5 antisens, ainsi que des sondes fluorescentes spécifiques de chacune de ces gènes cibles. Ces gènes cibles, amorces sens et antisens et sondes fluorescentes sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Dans ce tableau, figure également un exemple des séquences des amorces sens et antisens et d'une sonde fluorescente spécifique de l'acide nucléique de 10 séquence SEQ ID NO : 5. Tableau 2 : Applications possibles en fonctions des gènes cibles analysés Utilisations Gènes cibles Amorce sens Amorce Sonde antisens SEQ ID NO : DNAqual EGFR1 murin 69 70 71 GENOTOX CDKN2-P16 murin 72 73 74 Souris ADAMTS18 murin 75 76 77 LRP1B murin 78 79 80 GRID2 murin 81 82 83 FHIT murin 84 85 86 MITOC Souris - 87 88 89 15 Les inventeurs sont également les premiers à avoir identifié que le gène EGFR1 murin peut être utilisé pour évaluer la qualité d'un ADN murin. Ils sont en outre les premiers à avoir identifié qu'un gène cible choisi dans le groupe comprenant CDKN2-P16 murin, ADAMTS18 murin, 20 LRP1B murin, GRID2 murin et FHIT murin, peut être utilisé pour montrer la génotoxicité induite par une molécule déterminée. Le gène cible EGFR1 murin peut être utilisé comme contrôle négatif. En association avec la méthode MITOC, il devient aussi possible d'analyser les effets d'une intoxication chronique et/ou d'une génotoxicité d'un traitement ou d'une substance déterminée directement sur l'animal voir dans des cellules modèles. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, données à titre illustratif et non limitatif. Brève description des figures - La figure 1 représente une courbe de dilution standard d'ADN humain de référence du laboratoire générée par un thermocycleur CFX96 (Biorad) avec le logiciel CFX Manager Software. « A » représente la pente obtenu avec une sonde marquée par un fluorochrome Yakima yellow pour le gène cible EGFR1 avec les paramètres suivants : E=97,0`)/0, R2=0,994, pente (« slope » en anglais)=3,396. « B » représente la pente obtenue par le calibreur marqué avec un fluorochrome Texas Red avec les paramètres suivants : E=93,2%, R2=0,999, pente (« slope » en anglais)=3,497. « Ct » signifie « Cycle threshold », « Un » signifie « inconnu », « Std » signifie « standards » et « Log ADN (i) » signifie « logarithme de la quantité initiale d'ADN ». - La figure 2 représente un histogramme automatisé obtenu par un thermocycleur CFX96 (Biorad) avec le logiciel CFX Manager Software pour un test DNAqual qui permet de comparer des échantillons d'ADN avant et après irradiation aux UV. En abscisse figure le nom des échantillons d'ADNs. En ordonnée figure le nombre de copie du gène cible EGFR1 dans les différents échantillons. Ce nombre est exprimé « en nombre de fois » de la valeur obtenue pour l'ADN de référence du laboratoire (50 ng de chaque). Les résultats sont normalisés par le calibreur universel RXRbéta, et en comparant à chaque fois l'ADN brut (50ng) et le même ADN après irradiation aux UV (50 ng) représentés respectivement de gauche à droite : 05, 05UV, 06, 06UV, 07, 07UV, 08, 08UV, 09, 09UV, 11, 11UV, 12, 12UV, 13, 13UV, 14, 14UV, 16, 16UV, 18, 2 9 8 0 2 1 1 26 18UV, 19, 19UV, 20, 2OUV, 21, 21UV, 22, 22UV, 23, 23UV, 26, 26UV, 27, 27UV, 31, 31UV, 33, 33UV, 35, 35UV, 40, 40UV, 41, 41UV, 43, 43UV, 44, 44UV, 46, 46UV, 48, 48UV, 49, 49UV, 50, 50UV, 57, 57UV, 62, 62UV, 64, 64UV, STD100, STD50 et STD25. Chacun des numéros présentés dans 5 cette figure correspond à des échantillons traités ou non par des ultraviolets. « UV » est indiqué à coté de ce nombre lorsque l'échantillon d'ADN a été traité par des ultraviolets. STD100, STD50 et STD25 représentent respectivement les dilutions d'un ADN de référence du laboratoire (100 ng, 50 ng et 25 ng) qui servent pour cette expérience 10 d'ADN contrôle pour exprimer les résultats. Ils permettent de vérifier la bonne efficacité de chaque qPCR duplex utilisant RXRbéta comme calibreur de normalisation. - La figure 3A représente une photographie du résultat d'une électrophorèse d'ADNs humains (2 pl de chaque duplicata) sur gel 15 d'agarose 0,8% avant irradiation UV. Les numéros ont la même signification que pour la figure 2. La figure 3B représente une photographie du résultat d'une électrophorèse d'ADNs humain (2 pl de chaque duplicata) sur gel d'agarose 0,8% après irradiation UV de 120 mJoules/cm2 pendant 15 min dans l'appareil UV Stratalinker 1800 20 (Stratagene)(catalogue : N°400072). Les numéros ont la même signification que pour la figure 2. « M » signifie « marqueur de poids moléculaire ». - La figure 4 représente un histogramme obtenu par un thermocycleur CFX96 (Biorad) avec le logiciel CFX manager Software pour 25 un test DNAqual souris (50 ng) effectué sur des duplicatas d'ADN extraits de tissus lyophilisés par rapport à l'ADN extrait des mêmes tissus frais non lyophilisés. Cet histogramme représente en abscisse : le nom des échantillons et en ordonnée : le nombre de copies intactes du gène EGFR1, normalisé par le calibreur RXRbéta et par rapport au nombre de 30 copies intactes de l'EGFR1, mesuré dans l'ADN extrait de tissus frais. C2 représente l'ADN extrait de tissus frais, E1, E2, E3 et E4 représentent respectivement de l'ADN extrait 24 heures, 1 semaine, 1 mois et 3 mois après leur lyophilisation (duplicatas de C2). STD100, STD50 et STD25 représentent respectivement des dilutions d'ADN de référence de souris soit : 100 ng, 50 ng et 25 ng qui vérifient la bonne efficacité de la qPCR duplex. - La figure 5 représente une photographie du résultat d'une électrophorèse d'un échantillon dupliqué de 100 ng de ces mêmes ADNs de souris sur gel d'agarose. C2, El, E2, E3 et E4 ont la même signification que pour la figure 4. « M » signifie « marqueur de poids moléculaire », « C1 » signifie respectivement « contrôle 1 » soit un duplicata de C2, « A », « B » et « C » signifie respectivement « standards internes du laboratoire correspondants à des ADN murins non dégradés, de référence». - La figure 6 représente un histogramme obtenu avec un tableur Excel pour des tests : MTT, DNAqual et MITOC (représentés par les triplets de bâtons respectivement de gauche à droite). Le résultat MTT représente le pourcentage d'inhibition de la prolifération de cellules HEPG2 équipées enzymatiquement du cytochrome P450, en fonction de leur intoxication pendant 72 H par des substances numérotées 38, 133, 145, 158, 167, 170, 194, 198, 203, 211, 248 et 251 (toutes ont été diluées dans du DMSO puis dans du milieu de culture à la concentration finale de 15 pM). « DMSO » signifie « diméthylsulfoxyde » et « DMSO+ » correspond à des cellules traitées avec 0,01% de DMSO. Les tests MITOC et DNAqual, ont été réalisés sur l'ADN extraits des cellules traitées, après le test MTT, et leurs résultats ont été repris des histogrammes automatisés obtenus en suivant la même procédure que celle qui a été décrite précédemment. L'ADN contrôle est « DMSO+ ». - La figure 7 représente un histogramme obtenu avec un tableur Excel pour un test Copycount sur des couples de tissus tumoraux/sains prélevé chez 10 patients (représentés par les doublets de bâtons respectivement de gauche à droite). L'abscisse représente le numéro du 2 9 8 0 2 1 1 28 patient (1 à 10) avec le gène cible utilisé (EGFR1, IGFR1 ou ERBB3). L'ordonnée représente l'expression relative pour chaque gène cible normalisée par le gène calibreur. 5 EXEMPLES Exemple 1 : Matériel et méthode : Les expérimentations présentées dans les exemples ci-dessous ont été réalisées en utilisant le principe de la qPCR en duplex. 10 Elles ont été réalisées à l'aide d'un thermocycleur CFX96 (Biorad) utilisant un logiciel d'analyse CFX Manager software. L'extraction de l'ADN à partir de ces cellules a été réalisée selon le protocole décrit dans Sambrook J, Russel D. Molecular Cloning: A Laboratory Manuel. 3rd edition. Vol. 3. New York, NY, USA: Cold Spring 15 Harbor Laboratory Press; 2001 [6]. La qPCR a été réalisée sur des plaques 96 puits « hard-shell 96- Well Thin-Wall PCR Plates » de Biorad. Des mélanges réactionnels ont été préparés selon le tableau 3 ci- dessous. 20 Tableau 3 : Préparation du mix PCR Réactifs Volume Concentration (pour un finale puits) iQ supermix (marque de commerce) 7,5 pl 1X Biorad Amorce CALIBREUR Sens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Amorce CALIBREUR AntiSens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Sonde CALIBREUR (20 pM) 0,15 pl 200 nM Amorce GENE CIBLE Sens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Amorce GENE CIBLE AntiSens (10 pM) 0,45 pl 300 nM Sonde GENE CIBLE (20 pM) 0,15 pl 200 nM Echantillon ADN variable (pl) variable (ng) Eau variable (pl) - Volume final 15p1 - 2 9 8 0 2 1 1 29 Les amorces et sondes du gène cible sont précisées dans chacun des exemples ci-dessous. De même, la quantité d'échantillon d'ADN et d'eau utilisés dans le mélange réactionnel sont précisés ci-après. Des triplicatas ont été réalisés pour chacune des mesures. 5 Chacun des puits de la plaque à 96 puits pour la qPCR a été rempli avec un volume réactionnel final de 15 pL. Le thermocycleur a été programmé de manière à obtenir les étapes d'amplifications suivantes : - dénaturation initiale : 10 o 3 min à 95°C. - cycles PCR (x 40) : o 10 secondes à 95°C ; o 20 secondes à 63°C ; o 30 secondes à 72° C (+collecte et analyse des données à 15 cette étape du cycle). Le gène de référence, c'est-à-dire le calibreur selon l'invention, a été amplifié à l'aide d'amorces sens de séquence SEQ ID NO: 2 et antisens de séquence SEQ ID NO : 3. Les amplicons produits ont été quantifiés à l'aide d'une sonde de séquence SEQ ID NO : 4 comprenant un 20 fluorochrome 1, ici le Texas red (marque déposée). On indique au logiciel de qPCR que ce fluorochrome 1 est le calibreur (« cal »). Le gène cible a été amplifié à l'aide d'amorces sens et antisens spécifiques et définies dans chacun des exemples ci-après. Les amplicons produits ont ensuite été quantifiés à l'aide d'une sonde comprenant un 25 fluorochrome 2, ici le Yakima yellow (marque déposée). On indique au logiciel de qPCR que ce fluorochrome 2 est la cible (« cible »). Une gamme correspondant à une cascade de dilution d'un ADN de référence du laboratoire allant de 25 ng à 100 ng a été réalisée et a servi 30 aussi d'échantillon contrôle pour exprimer les résultats. Chaque point de cette gamme est réalisé en triplicata. Cette gamme a permis de contrôler les paramètres de la qPCR. Les ct seuils de chaque fluorophore ont été ajustés manuellement pour obtenir la meilleure courbe de dilution connue d'ADN de référence : présentant des paramètres d'efficacité PCR optimum (pente, efficacité et R2) et des différences d'efficacité d'amplification comprises entre 0 et 5 % pour le gène cible donné et pour le gène calibreur. Ces constantes de ct ont été reprises pour l'interprétation des résultats de toutes les autres expériences ultérieures concernant ce gène cible donné. Sans cette gamme de dilution, le logiciel de la qPCR ne nous montre pas l'efficacité des deux amplifications, ni leur pente, ni le coefficient de corrélation de Pearson R2. En effet, ce logiciel est fait pour mesurer une courbe standard de dilutions en cascade d'ADNc et fait du dosage relatif de copie d'ADNc cible par rapport à un ADNc de référence. La courbe standard de dilution d'ADN génomique a été générée par le thermocycleur à partir de la gamme de dilution d'ADN de référence avec le « Ct obtenu » en ordonnée et le « log de la concentration en ADN de l'échantillon de référence » en abscisse. Cette courbe standard est représentée sur la figure 1. Les résultats obtenus avec les échantillons à tester sont indiqués par des XXX. Ils sont positionnés par rapport aux références 25, 50 et 100 ng et sont censés contenir, chacun, 50 ng d'ADN. Le logiciel calculera combien d'ADN chaque échantillon à tester contient réellement. Nous l'interprétons alors comme un nombre de copies d'ADN génomique par rapport au nombre de copies de calibreur et de gène cible indiqués pour l'ADN contrôle de l'expérience qui est ici aussi l'ADN de référence. L'équation de la régression linéaire avec le coefficient de corrélation de Pearson R2 a permis de constater une très bonne corrélation entre les valeurs de Ct et la quantité d'ADN présent dans les échantillons de référence (gamme de dilution). La courbe standard obtenue en analysant les dilutions de l'ADN de référence a permis d'affirmer que toutes les conditions de qPCR choisies sont adéquates pour analyser la variation du nombre de copies d'un gène cible. Pour cela, les qPCR ont été réalisées sur des plaques à 96 puits et avec des mélanges réactionnels comprenant toujours la gamme d'ADN (de référence : 25 ng, 50 ng et 100 ng), en conservant les mêmes paramètres de Ct de plaque en plaque. Dans un ADN à tester, s'il y a amplification génique du gène cible, la sonde jaune sort avant l'orange (Ct précoce), c'est-à-dire qu'après application de la méthode du AACt et la conversion en 2-°°c, la valeur obtenue pour ce « rapport des fluorescences » est supérieure à 1 et supérieure à celle obtenue pour l'ADN de référence. Ce rapport peut atteindre 10 voir plus. C'est l'inverse s'il y a une délétion (Ct retardé). Dans les deux cas, le Ct du calibreur permet de « situer » correctement l'ADN sur la gamme de dilution des ADN de référence et de constater qu'il ne manque pas d'ADN matriciel de calibreur quand on le compare à l'ADN de référence (Ct Les mesures obtenues pour différents échantillons à tester peuvent figurer sur un histogramme automatisé comme un nombre de fois en plus ou en moins du nombre de copies (X) de gènes cibles observé pour l'échantillon testé par rapport au zéro. Une variante du logiciel permet de choisir, en plus, un échantillon d'ADN comme une référence interne et les résultats peuvent alors être sous la forme d'un histogramme différent, le zéro étant cet échantillon. 2 9 8 0 2 1 1 32 Cette méthode permet donc d'évaluer la qualité/intégrité de l'ADN en évaluant le nombre de copies intactes matriciels présents dans les échantillons à tester par comparaison au nombre normal de copies matricielles présentes dans l'ADN de référence. 5 Dans les exemples ci-dessous, des efficacités d'amplification voisines pour les deux gènes (calibreur et cible), à savoir entre 90 et 110 %, associées à des corrélations linéaires (R2) > 0,9, ainsi qu'à une large amplitude de détection, ont permis de déterminer dans de 25 à 50 ng de 10 l'échantillon d'ADN à analyser (échantillon test), le nombre de copies du gène cible par la méthode du ,8.8, de Ct, également appelée « Méthode de Livak ». Exemple 2 : DNAqual - Quantification du gène EGFR1 humain selon 15 le procédé de l'invention sur des ADN ayant subit une dégradation artificielle par un traitement physique soit irradiation par les UV Dans cet exemple, l'ADN à analyser provenait de cellules de poumon (Centre de ressources Biologiques de Lyon). Des duplicatas de chaque échantillon ont subit, ou non, une irradiation UV de 120 20 mJoules/cm2 pendant 15 minutes à l'aide d'un appareil UV Stratalinker 1800 (Stratagene N° du catalogue : 400072) avant d'être analysés par DNAqual et aussi par électrophorèse en gel d'agarose. L'expérience a été réalisée sur 32 échantillons d'ADN à analyser, extraits des cellules précitées. Ils sont dénommés respectivement : 05, 06, 2 5 07, 08, 09, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 31, 33, 35, 40, 41, 43, 44, 46, 48, 49, 50, 57, 62 et 64, et correspondent à des extractions d'ADN de différents échantillons tissulaires. Les échantillons STD100, STD50 et STD25 correspondent à des dilutions de la gamme de l'ADN de référence du laboratoire 30 (respectivement 100 ng, 50 ng et 25 ng) n'ayant pas subit une irradiation 2 9 802 1 1 33 UV. L'ADN contrôle qui sert à exprimer les résultats est le même que l'ADN de référence (50 ng) Les échantillons nommés avec un suffixe « UV » correspondent aux échantillons irradiés. Quand ce suffixe n'est pas indiqué, il s'agit des 5 échantillons appariés contrôles, c'est-à-dire, n'ayant pas été irradié par UV. Pour chacun de ces échantillons, 50 ng a été analysés. Les réactifs utilisés pour la qPCR étaient les suivants : iQ supermix (marque de commerce) (référence 1708862, Biorad), 10 amorce sens du calibreur (SEQ ID NO : 2) à 10 pM, amorce antisens du calibreur (SEQ ID NO : 3) à 10 pM, sonde calibreur (SEQ ID NO : 4) possédant un fluorochrome Texas red (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ2 (marque déposée) en 3', à 20 pM 15 amorce sens d'EGFR1 (SEQ ID NO : 9) à 10 pM, amorce antisens D'EGFR1 (SEQ ID NO : 10) à 10 pM, sonde EGFR1 (SEQ ID NO : 11) possédant un fluorochrome Yakima yellow (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ1 (marque déposée) en 3', à 20 pM. 20 Toutes les amorces et les sonde ont été fournies par Eurogenetec. Dans cet exemple le nombre de copies d'un gène cible (l'EGFR1 humain) a été quantifié en comparaison avec le nombre de copies intactes du calibreur selon l'invention de séquence SEQ ID NO : 1 présent dans 25 n'importe quel échantillon d'ADN humain. Chez un individu à tester, l'échantillon été préalablement quantifié par mesure de densité optique d'échantillon soit 50 ng/pL d'ADN. La même mesure a été réalisée sur un échantillon d'ADN de référence qui contient un nombre réduit de copies d'EGFR1 humain et un 30 nombre réduit de copies du calibreur RXRbéta (SEQ ID NO :1) du fait de leur dégradation par les UV. Les deux gènes, RXRbéta (SEQ ID NO : 1) et EGFR1, ont été mesurés comme des amplicons synthétisés lors d'une qPCR en temps réel en duplex. La séquence du calibreur a été amplifiée à l'aide des amorces sens SEQ ID NO : 2 et antisens SEQ ID NO : 3. La séquence du gène EGFR1 a été amplifiée à l'aide des amorces sens SEQ ID NO : 9 et antisens SEQ ID NO : 10. Les amplicons produits ont été détectés par leur hybridation aux deux sondes spécifiques décrites ci-dessus mises en duplex. Le logiciel d'analyse a été programmé de manière à détecter la sonde calibreur marquée au Texas red (marque déposée) comme « calibreur », et la sonde EGFR1 comme « cible » et l'ADN de référence comme contrôle. Pour un ADN de référence pour le gène EGFR1 humain, le nombre de copies intactes du gène EGFR1 humain est identique à celui du gène RXRbéta, à savoir 660 copies diploïdes par ng d'ADN (soit 330 copies haploïdes). Ainsi, chez un individu de référence, le nombre de copies de l'EGFR1 et RXRbéta varie de à 1 +/- 5 %. Ainsi le nombre de copie du gène EGFR1 humain a théoriquement diminué. L'échantillon STD100 a été choisi comme échantillon de référence. Il a été noté indiqué comme « contrôle ou standard » dans le programme du thermocycleur. Tous les résultats ont été exprimés par rapport à l'ADN de référence STD100 (irradié par les UV) du laboratoire. L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 2 et sur le tableau ci-dessous. Tableau 4 : Résultats expérimentaux du test DNAqual chez l'homme Cible Calibreur humain EGFR1 humain Expression Ech. Moy C(t) C(t) SEM Moy C(t) C(t) SEM Exp. Exp. SEM 5 27,4 0,02318 26,24 0,01309 3,66924 0,06889 05 UV 27,36 0,07419 28,5 0,05694 0,72107 0,0476 6 26,98 0,03062 25,35 0,01895 5,15549 0,13094 06 UV 27,39 0,03225 28,63 0,02866 0,6741 0,02054 7 28,1 0,02744 26,49 0,02644 5,04394 0,13581 07 UV 28,54 0,086 29,78 0,05445 0,66341 0,04764 8 27,74 0,1467 25,5 0,09182 7,91913 0,96682 08 UV 28,07 0,04776 29,44 0,08605 0,60569 0,04221 9 28,35 0,04453 26,49 0,06748 6,03317 0,34523 09 UV 28,27 0,03126 29,64 0,0597 0,60653 0,02895 11 26,85 0,00843 25,01 0,01452 5,96881 0,07094 11 UV 27,43 0,07957 28,68 0,06745 0,66162 0,04874 12 27,76 0,05285 25,9 0,07374 6,05175 0,38848 12 UV 28,38 0,07031 29,73 0,12071 0,6192 0,06124 13 27,06 0,05981 25,55 0,03257 4,72951 0,22712 13 UV 27,92 0,0199 29,2 0,01981 0,64547 0,01281 14 27,87 0,04584 25,98 0,10219 6,16115 0,48888 14 UV 28,45 0,06608 29,85 0,07029 0,59274 0,04042 16 27,35 0,01609 25,82 0,01787 4,77717 0,08122 16 UV 28,05 0,06742 29,34 0,06433 0,64383 0,04239 18 27,3 0,04712 25,91 0,09067 4,34503 0,31444 18 UV 27,91 0,06075 29,16 0,03099 0,66374 0,03191 19 28,08 0,06157 25,96 0,05055 7,22236 0,40625 19 UV 28,54 0,04343 30,08 0,04173 0,53628 0,02282 20 27,41 0,04159 26,02 0,0769 4,33398 0,26833 20 UV 28,23 0,02581 29,63 0,05687 0,59377 0,02627 21 27,78 0,14984 25,88 0,26152 6,20689 1,32459 21 UV 27,98 0,04963 29,34 0,01098 0,61037 0,02184 22 27,3 0,07329 25,74 0,0705 4,88582 0,35103 22 UV 27,89 0,03789 29,12 0,03966 0,66954 0,02596 23 26,82 0,0946 25,39 0,09151 4,46986 0,41567 23 UV 27,71 0,06397 29,05 0,00393 0,62312 0,02811 26 26,05 0,12279 24,42 0,08825 5,19679 0,5546 26 UV 24,8 0,05276 25,92 0,05275 0,73952 0,03899 27 26,6 0,03057 25,04 0,04926 4,91212 0,20158 27 UV 25,97 0,05777 27,24 0,06443 0,66176 0,04048 31 26,25 0,05711 25,02 0,11391 3,8909 0,35118 31 UV 25,84 0,01954 27,08 0,01003 0,67491 0,01045 33 25,99 0,13808 24,46 0,04542 4,81953 0,49348 33 UV 25,39 0,09012 26,51 0,08633 0,73895 0,06515 35 26,34 0,13858 24,76 0,13886 5,00667 0,69406 35 UV 25,06 0,04449 25,97 0,01718 0,85625 0,02877 40 26,45 0,06492 25,11 0,06322 4,19974 0,2689 40 UV 25,16 0,01152 26,17 0,02433 0,80007 0,01526 41 26,45 0,06258 25,11 0,14908 4,21165 0,48252 41 UV 26,69 0,04885 27,87 0,09019 0,70053 0,05088 43 27,64 0,13903 26,33 0,0677 4,09253 0,44613 43 UV 26,9 0,05811 27,94 0,05533 0,7787 0,04414 44 27,78 0,14671 25,48 0,14336 8,24431 1,19486 44 UV 27,28 0,10618 28,48 0,05606 0,69179 0,05856 46 26,65 0,07212 25,41 0,01719 3,9091 0,20408 46 UV 26,84 0,03251 28,1 0,03454 0,66414 0,02226 48 26,16 0,01007 25,07 0,04093 3,5274 0,10544 48 UV 25,78 0,02089 27,03 0,06463 0,66811 0,03217 49 26,72 0,04256 24,77 0,07539 6,48324 0,39744 49 UV 27,03 0,05727 28,17 0,04712 0,72097 0,03775 50 25,21 0,04301 24,34 0,00644 3,0359 0,09294 50 UV 25,25 0,02312 26,33 0,01546 0,75892 0,01489 57 25,7 0,02297 25,24 0,06377 2,26053 0,10859 57 UV 25,38 0,04469 26,51 0,0644 0,73659 0,04086 62 27,44 0,05574 26,34 0,04313 3,51752 0,17501 62 UV 27,63 0,03988 28,95 0,10344 0,63199 0,04965 64 26,32 0,02564 25,3 0,00947 3,34445 0,0644 64 UV 27,42 0,06883 28,25 0,05031 0,89459 0,05383 STD100 23,62 0,0687 24,33 0,06883 1 0,06872 STD25 25,6 0,04084 26,29 0,03063 1,00333 0,03615 STD50 24,69 0,06741 25,4 0,05195 0,98873 0,0594 Dans ce tableau « Ech. » signifie « Echantillon » « Moy Ct » signifie « moyenne de Ct », « SEM » signifie « erreur type » et « Exp. » signifie « expression ». La valeur correspondant à l'échantillon STD100 est de 1 car il s'agit de l'échantillon de référence, marqué comme standard dans le programme de la qPCR. Les valeurs correspondant aux échantillons STD50 et STD25 sont quasiment égales à 1, ce qui est normal car la dilution ne change pas le rapport de fluorescence du calibreur et du gène EGFR1 humain. Les valeurs correspondant aux échantillons non irradié par UV (05, 06, 07, ...) sont toutes supérieures à 1 et toutes supérieures aux valeurs correspondant aux échantillons irradié par UV (respectivement 05UV, 06UV, 07UV, ...). Cela signifie que le nombre de copie du gène EGFR1 2 9 8 0 2 1 1 37 humain est supérieur avant le traitement UV. Il y a en général 3 fois plus d'ADN matriciel avant irradiation qu'après. Il est à noter que l'ADN standard est dégradé par les UV dans les mêmes proportions. Ces résultats montrent une dégradation nette des ADN exposés 5 aux UV qui atteint 60% des contrôles non irradiés en moyenne Le procédé selon l'invention permet de détecter et quantifier efficacement la variation du nombre de copies intactes et donc amplifiables par qPCR du gène EGFR1, causée par un traitement UV. 10 Une étude de la variation du nombre de copies du gène EGFR1 avec des ADN extraits des cellules précitées et dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites ci-dessus, a été réalisé avec une méthode d'analyse sur gel d'agarose. 6 pl de chaque échantillon d'ADN, avant et après irradiation, ont été déposés sur un gel d'agarose 0,8%. Le marqueur de poids moléculaire utilisé était du Smart Ladder : MW-1700-10 d'Eurogenetec. Les résultats obtenus et présentés aux figures 3A et 3B démontrent bien que cette méthode ne permet pas de quantifier le nombre de copies intactes du gène EGFR1 avant et après traitement UV. Exemple 3 : DNAqual - Kit de quantification du gène EGFR1 humain Un kit pour la quantification du gène EGFR1 a été réalisé en et comprend les composants suivants décrits dans l'exemple 2 ci-dessus : 10p1 d'ADN de référence pour EGFR1 à 100 ng/pl, 10p1 d'ADN de référence pour EGFR1 à 50 ng/pl, 10p1 d'ADN de référence pour EGFR1 à 25 ng/pl, 770 pl de iQ supermix (marque de commerce) (référence 1708862, Biorad), 50 pl d'amorce sens du calibreur (SEQ ID NO : 2) à 10pM, 50 pl d'amorce antisens du calibreur (SEQ ID NO : 3) à 10pM, 2 9 802 1 1 38 16,5 pl de sonde calibreur (SEQ ID NO: 4) possédant un fluorochrome Texas red (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ2 (marque déposée) en 3', à 20pM, 50 pl d'amorce sens d'EGFR1 (SEQ ID NO : 9) à 1 OpM, 5 50 pl d'amorce antisens D'EGFR1 (SEQ ID NO : 10) à 1 OpM, 16,5 pl de sonde EGFR1 (SEQ ID NO : 11) possédant un fluorochrome Yakima yellow (marque déposé) en 5' et un quencher BHQ1 (marque déposée) en 3', à 20pM. 10 Chacun de ces composants est conditionné séparément dans un tube plastique de 1,5 ml (Dutscher, réf catalogue : 045401). Exemple 4 : DNAqual - Quantification du gène EGFR1 murin selon le procédé de l'invention sur tissus de souris ayant subit ou non une 15 lyophilisation avant la purification de leurs ADNs L'expérience décrite dans l'exemple 2 a été réalisée sur des ADN provenant de cellules/tissus de souris présentés dans le tableau 5 ci-dessous. Cet exemple a été réalisé en utilisant les séquences SEQ ID NO : 20 6 et 7 comme amorce sens et antisens, et la séquence SEQ ID NO : 8 comme sonde pour amplifier et détecter le calibreur universel chez la souris. Les séquences SEQ ID NO : 69 et 70 comme amorce sens et antisens, et la séquence SEQ ID NO : 71 comme sonde pour amplifier et 25 détecter le gène cible EGFR1 murin. Tableau 5 : Cellules/tissus utilisées Numéro de Caractéristique de l'échantillon I 'échantil on C2 ADN extrait de foie de souris au temps 3 mois mais congelé au temps TO = témoin positif El ADN extrait de foie de souris, lyophilisé 2 9 802 1 1 39 au temps TO, mais purifié 24 heures après la lyophilisation E2 ADN extrait de foie de souris, lyophilisé au temps TO, mais purifié 1 semaine après la lyophilisation E3 ADN extrait de foie de souris, lyophilisé au temps TO, mais purifié 1 mois après lyophilisation E4 ADN extrait de foie de souris, lyophilisé au temps TO, mais purifié 3 mois après lyophilisation STD100 ADN de référence souris à 100 ng (non lyophilisé) STD25 ADN de référence souris à 50 ng (non lyophilisé) STD50 ADN de référence souris à 25 ng (non lyophilisé) La lyophilisation des tissus E1, E2, E3 et E4 a été réalisée à l'aide d'un lyophilisateur de paillasse MARTIN CHRIS de 2.5 kg, - 55 °C I ALPHA 1-2 / LDplus. 5 L'ADN des tissus lyophilisés E1, E2, E3 et E4 a été extrait respectivement 24 heures, 1 semaine, 1 mois et 3 mois après lyophilisation de ces tissus. L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 4 et sur le 10 tableau 6 ci-dessous. Tableau 6 : Résultats expérimentaux du test DNAqual chez la souris Cible Calibreur murin EGFR1 murin Expression Ech. Moy C(t) C(t) SEM Moy C(t) C(t) SEM Exp. Exp. SEM STD100ng 32,66 0,05033 28,12 0,10642 1 0,07928 STD5Ong 33,82 0,01249 29,2 0,00911 1,04647 0,01083 STD25ng 34,74 0,29665 30,18 0,0459 1 0,20002 C2 32,42 0,12151 27,81 0,03445 1,05392 0,08876 El 29,13 0,06761 26,23 0,02212 0,34259 0,01626 E2 27,94 0,07898 25,1 0,00575 0,33135 0,01748 E3 28,77 0,10697 25,9 0,03635 0,33665 0,02537 E4 29,92 0,3524 26,66 0,11727 0,43142 0,10688 Dans ce tableau « Ech. » « Moy Ct », « SEM » et « Exp. » ont la même signification que précédemment. La valeur correspondant à l'échantillon STD100 est de 1 car il s'agit de l'échantillon de référence, marqué comme standard dans le programme de la qPCR. Les valeurs correspondant aux échantillons STD50 et STD25 sont quasiment égales à 1, ce qui est normal car la dilution ne change pas le rapport de fluorescence du calibreur murin et du gène EGFR1 murin. La valeur correspondant à l'échantillon C2 est proche de 1, ce qui signifie que le nombre de copie du gène EGFR1 murin est quasiment identique à celui de l'échantillon de référence. Les valeurs correspondant aux échantillons lyophilisés (E1, E2, E3 et E4 sont toutes inférieures à 1 et inférieures à la valeur correspondant à l'échantillon non lyophilisé. Cela signifie que le nombre de copie du gène EGFR1 murin est inférieur après lyophilisation. Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet de détecter et quantifier efficacement la variation du nombre de copies du gène EGFR1 murin, causée par une lyophilisation. Une étude de la variation du nombre de copies du gène EGFR1 avec des ADN extraits des cellules/tissus précités et dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites ci-dessus, a été réalisée avec une méthode d'analyse sur gel d'agarose. 6 pl de chaque échantillon d'ADN, ont été déposés sur un gel d'agarose 0,8%. Le marqueur de poids moléculaire utilisé était du Smart Ladder : MW-1700-10 d'Eurogenetec. Les résultats obtenus et présenté à la figure 5 démontrent bien que cette méthode ne permet pas de détecter les dégradations de l'ADN engendrées par une lyophilisation préalable des tissus. Exemple 5: MITOC - Vérification de la toxicité potentielle de candidats médicaments - Comparaison avec le test standard d'évaluation de la prolifération cellulaire « MTT » Dans cet exemple l'ADN de référence et l'ADN à analyser provenait de cellules modèles HEPG2 équipées enzymatiquement du cytochrome P450 (« CYP 450 »). L'ADN à analyser a été déterminé comme appartenant à des cellules intoxiquées avec une substance donnée pendant 72 heures. L'ADN de référence a été déterminé comme appartenant à des cellules non intoxiquées cultivées pendant 72 h en présence de 0,01 % de DMSO. Dans cet exemple, trois tests ont été réalisés : un test MTT afin de quantifier la viabilité des cellules traitées par des substances éventuellement anti prolifératives, un test DNAqual pour vérifier la qualité des ADN et un test MITOC pour quantifier le nombre de génome mitochondrial ou mitochondries contenues dans les cellules HEPG2 traitées ou non par des substances dont on cherche à déterminer, en plus de leur activité anti proliférative, leur éventuelle toxicité. Les informations obtenues sont comparées aux résultats obtenus avec le test MTT. La figure 6 présente les résultats de cet exemple 5. Chaque triplet représente les résultats des tests MTT, DNAqual et MITOC respectivement pour chaque traitement. Par exemple, le ler triplet représente les résultats des tests MTT, DNAqual et MITOC pour le traitement au DMSO. Pour comparaison, toutes les valeurs obtenues avec le test MTT ont été converties en pourcentage par rapport au contrôle indiqué « DMSO+ » dont le pourcentage a été fixé à 0% (pour zéro % d'inhibition de la prolifération cellulaire). Ainsi, dans la figure 6, dans le 1 er triplet représentant les résultats avec le traitement au DMSO (« DMSO+ »), le 1 er bâton, qui représente le résultat du test MTT, est à zéro, pour « zéro % d'inhibition de la prolifération cellulaire ». 2 9 802 1 1 42 12 substances différentes, diluées dans le DMSO, ont été testées. Elles ont été ajoutées dans le milieu de culture des cellules HEPG2 qui ont étaient ainsi maintenues pendant 72 h avant analyse. 5 Pour cet exemple, les 12 substances testées sont numérotées 38, 133, 145, 158, 167, 170, 194, 198, 203, 211, 248, 251. Ce sont des analogues de nucléosides provenant de la chimiothèque de l'institut de chimie de Nice, Université de Nice Sophia Antipolis, France. Chacune de ces substances a été testées à une concentration de 15 pM. 10 Le contrôle a été réalisé avec du diméthylsulfoxyde (« DMSO ») sans substance à tester, à une concentration de 0,01%. Le test MTT a été réalisé selon le protocole décrit dans Hussain et al. (Hussain et al. « A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay », J Immunol Methods. 1993 Mar 15;160(1):89-96 [7]). 15 Le sel de tetrazoline MTT (« bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5- diphenyl tetrazolium »), inclus dans le kit Cell Titer 96 Non Radioactive Cell proliferation assay (catalogue Part#G4001 ; PROMEGA, France). Le test MTT a été réalisé, en plaques à 96 puits (Orange scientific : N° de catalogue 5530 100) avec le kit Cell Titer 96 Non Radioactive Cell 20 proliferation assay (catalogue Part#G4001), selon les indications du fabricant avec, au départ, 7500 cellules/puits. A la fin du test MTT, les plaques ont été vidées de leur liquide et les ADN ont été extraits des cellules des tripliquas de puits et mélangés avant d'être analysés par DNAqual et MITOC. Leurs résultats sont 25 exprimés en % par rapport aux résultats obtenus avec l'ADN contrôle « DMSO+ », fixé à 100 %. Pour le test DNAqual, le même protocole que celui décrit dans l'exemple 2 a été mis en oeuvre. 30 2 9 8 0 2 1 1 43 Pour le test MITOC, la variation du nombre de copies d'un gène cible mitochondrial a été mesurée selon le protocole décrit ci-dessus avec les amorces sens et antisens de séquences respectives SEQ ID NO : 66 et 67, et avec une sonde fluorescente de séquence SEQ ID 68. 5 Les cellules HEPG2 ont été choisies pour réaliser le test MITOC. Ce sont des cellules hépatiques équipées enzymatiquement du cytochrome P450 (« CYP 450 ») permettant la gestion des toxines. Les HEPG2 sont fréquemment utilisées pour vérifier la toxicité de substances dans les tests in vitro. 10 L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 6 et sur le tableau 7 ci-dessous. Les tests de qPCR sont exprimés comme des % du contrôle. 15 Tableau 7 : Résultats expérimentaux des tests MITOC et DNAqual chez l'homme MTT DNA QUAL MITOC Ech. Prol. °A Inhibition Exp. Exp. °/0 Exp. Exp. SEM SEM DMSO+ 100 0 0,8856 0,0423 100 2,2535 0,0927 100 38 76 24 0,8179 0,0241 92 4,4904 0,3099 199 133 49 51 0,8028 0,0352 91 0,1192 0,0833 5 145 72 28 0,9061 0,0116 102 4,1596 0,2009 185 158 77 23 0,8790 0,0000 99 1,4499 0,0233 64 167 55 45 0,7642 0,0202 86 3,8378 0,1363 170 170 75 25 0,7022 0,0371 79 1,3742 0,0667 61 194 79 21 0,9172 0,0471 104 4,8860 0,4441 217 198 72 28 0,9871 0,0597 111 4,4231 0,1279 196 203 72 28 1,0528 0,0412 119 4,7148 0,0407 209 211 80 20 0,4054 0,0122 46 4,0350 0,0445 179 248 67 33 0,7909 0,0317 89 3,1334 0,0818 139 251 72 28 0,7855 0,0126 89 2,0017 0,0487 89 Dans ce tableau « Ech. » sianifie « Echantillon ». « Prol. » sianif « prolifération », « Inh. » signifie « inhibition », « SEM » signifie « erreur type » et « Exp. » signifie « expression ». , ie 20 2 9 8 0 2 1 1 44 Concernant le test MTT, les résultats montrent que les 12 substances testées possèdent un pouvoir antiprolifératif qui varie par rapport au contrôle (DMSO seul « DMSO+ »). Cet exemple 5 révèle que la substance 251 est la seule à ne pas 5 présenter de pouvoir de dégradation de l'ADN cellulaire des cellules traitées (bâton du milieu proche de 1) et, en même temps, à ne pas présenter de variation du nombre de copies de génome mitochondrial (bâton de droite également proche de 1) alors qu'elle inhibe la prolifération cellulaire de 25 % (bâton de gauche proche de 25%). 10 Les substances 145, 194, 198, 203 et 248 ont des pouvoirs antiprolifératifs voisins, d'environ 25 %, mais entrainent une augmentation du nombre de copies de génome mitochondrial (crise mitochondriale, bâtons de droite) indiquant ainsi, une forte activité métabolique des cellules ou une souffrance cellulaire quand ce chiffre diminue. 15 La substance 133 qui a le pouvoir antiprolifératif le plus important, de 50 %, a des effets toxiques prononcés puisque le nombre de mitochondries ou copie de génome mitochondrial diminue fortement (bâton de droite), faisant craindre l'apparition d'un effet toxique délétère en cas d'administration prolongée de cette substance. La substance 211 entraine, 20 à cette dose, une forte dégradation de l'ADN génomique et aussi une crise mitochondriale. Cet exemple 5 montre que les tests DNAqual et MITOC affinent les résultats d'un test MTT classique qui indique uniquement un nombre de cellules survivantes à l'intoxication par des substances sans donner 25 d'indication supplémentaire sur l'éventuelle toxicité mitochondriale ou sur un effet clastique sur l'ADN. Le test MITOC conforme au procédé de la présente invention, affine les résultats du test MTT en mettant en évidence l'effet toxique d'une substance donnée sur les mitochondries cellulaires. 30 Exemple 6 : Copycount - Criblage de tumeurs de colon humain Dans cet exemple, l'ADN de référence provient du laboratoire, il est aussi l'ADN contrôle (50 ng). L'ADN à analyser provient d'échantillons de tissus de patients opérés de cancer recto coliques. Ils sont à chaque fois appariés : tissus sains prélevés à distance de la tumeur sur la pièce de résection opératoire et les tissus tumoraux. Ils ont été fournis par la tumorothèque du Centre hospitalier régional de REIMS, (Patient 1-10, dans le tableau 8 ci-dessous et dans la figure 7). Les ADN ont été extraits comme dans les exemples précédant et des échantillons de 50 ng d'ADN ont été analysés en triplicatas pour mesurer le nombre de copies génomiques de EGFR1 humain, IGFR1 (« Insuline growth factor recepteur 1 ») humain et ERBB3 (« epidermal receptor 3 ») humain en comparant à chaque fois les tissus sains et les tissus tumoraux appariés pour chaque patient. Les séquences d'amorces sens et antisens et les séquences de la sonde fluorescente utilisées pour amplifier et quantifier les gènes EGFR1, IGFR1 et ERBB3 étaient respectivement les suivantes : - EGFR1 : SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 11, - IGFR1 : SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, et - ERBB3 : SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17. Les séquences d'amorces sens et antisens et la séquence de la sonde fluorescente utilisées pour amplifier et quantifier le calibreur selon l'invention (SEQ ID NO : 1) étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus. Les fluorochromes utilisés pour quantifier le calibreur (fluorochrome 1) et pour quantifier les gènes cibles (EGFR1, IGFR1 et ERBB3) (fluorochrome 2) étaient les mêmes que ceux décrits dans l'exemple 1. Dans cet exemple, la méthode « Copycount » a été utilisée pour cribler des tumeurs de colon humain en comparant à chaque fois des échantillons tumoraux appariés avec leurs tissus non tumoraux (tissus sains), selon le protocole décrit dans l'exemple 1. L'ensemble des résultats est représenté sur la figure 7 et sur le tableau 8 ci-dessous. i aoieau b : Kesu itats expenmentaux au test uopycount cnez rnomme Côlon tumoral Côlon sain Moyenne Sain Ech. Nom Exp. Exp. Expr. Exp. Expr. Exp. SEM SEM SEM EGFR1 1 Patient 1 2,1631 0,148 1,4606 0,0234 1,0734 0,0419 EGFR1 2 Patient 2 2,2238 0,1008 1,0557 0,0337 EGFR1 3 Patient 3 2,5032 0,0518 1,0134 0,0399 EGFR1 4 Patient 4 2,477 0,1036 1,072 0,0421 EGFR1 5 Patient 5 1,9792 0,1288 1 0,0631 EGFR1 6 Patient 6 2,3394 0,1152 1,1046 0,0226 EGFR1 7 Patient 7 2,21 0,0276 1,0446 0,0428 EGFR1 8 Patient 8 2,9304 0,1455 1,144 0,0559 EGFR1 9 Patient 9 2,9933 0,0758 0,8637 0,0318 EGFR1 10 Patient 10 1,8494 0,058 0,9757 0,0638 IGFRI 1 Patient 1 1,717 0,1665 1,3597 0,0713 1,023 0,0835 IGFRI 2 Patient 2 1,6022 0,0599 0,9354 0,0456 IGFRI 3 Patient 3 2,4781 0,0836 0,9036 0,0322 IGFRI 4 Patient 4 1,5032 0,1235 1,2716 0,052 IGFRI 5 Patient 5 1,7025 0,1315 1,0476 0,1246 IGFRI 6 Patient 6 1,7928 0,1231 1,1332 0,0778 IGFRI 7 Patient 7 1,5396 0,08 0,9095 0,0648 IGFRI 8 Patient 8 2,2002 0,2057 1,0312 0,2639 IGFRI 9 Patient 9 2,338 0,1707 0,7756 0,0171 IGFRI 10 Patient 10 1,3551 0,1196 0,863 0,0854 ERB3 1 Patient 1 1,625 0,6319 0,7878 0,0406 0,9815 0,0472 ERB3 2 Patient 2 4,495 0,5035 1,0027 0,0508 ERB3 3 Patient 3 0,2434 0,0171 0,9952 0,0685 ERB3 4 Patient 4 0,2664 0,0139 1,003 0,0505 ERB3 5 Patient 5 0,2095 0,0082 1 0,0864 ERB3 6 Patient 6 0,6471 0,0979 1,0162 0,016 ERB3 7 Patient 7 0,3828 0,0355 0,8575 0,0303 ERB3 8 Patient 8 1,5162 0,1087 0,8682 0,0348 ERB3 9 Patient 9 4,8464 0,2504 1,0366 0,0389 ERB3 10 Patient 10 0,7775 0,1419 1,2475 0,0549 Dans ce tableau « Ech. » signifie « Echantillon », « Moy Ct » signifie « moyenne de Ct », « SEM » signifie « erreur type » et « Exp. » signifie « expression ». On constate que tous les tissus sains présentent un nombre de copies normales de chacun de ces récepteurs (quasiment égal à 1) et que les tissus tumoraux présentent bien tous des amplifications du gène EGFR1. On peut l'affirmer quand on compare les tissus sains et les tissus tumoraux. En ce qui concerne l'IGFR1, les mêmes observations sont possibles. Dans les tumeurs, il s'agit d'amplifications géniques qui ne sont pas présentes dans les tissus sains appariés des mêmes sujets. Par contre en ce qui concerne ERBB3, seuls les patients 1, 2, 8 et 9 ont des amplifications géniques de ERBB3, les autres présentent des délétions. Cet exemple démontre bien l'efficacité de la technologie pour identifier les variations du nombre de copies de gènes dans des tumeurs coliques. Ce test Copycount permet d'indiquer quels sont les thérapies spécifiques les mieux adaptées et aussi d'évaluer le niveau d'agressivité d'une tumeur. En effet, les variations géniques peuvent moduler l'agressivité d'une tumeur (croissance plus ou moins rapide, résistance aux traitements plus ou moins importante). Elles peuvent également affecter la réponse à une thérapie. Par exemple, une amplification génique suggère une augmentation de l'expression de la protéine correspondante. Cette protéine constitue alors une bonne cible thérapeutique. Le traitement thérapeutique ciblant spécifiquement cette protéine sera potentiellement le plus efficace. Par exemple, un anticorps monoclonal contre l'EGFR1 devrait donner une bonne réponse pour traiter un cancer exprimant fortement EGFR1. Cependant, si ERBB2 est également fortement exprimé, il est possible que la cellule cancéreuse utilise la voie de signalisation par ERBB2 pour compenser l'absence d'EGFR1, rendant alors le traitement anti-EGFR1 inefficace. Dans le cas de cette double amplification des gènes codant pour EGFR1 et ERBB2, un autre traitement, ciblant une tout autre voie de signalisation cellulaire, devrait alors être privilégiée. L'universalité du calibreur permet la comparaison de toutes les mesures. L'essai peut être automatisé et réalisé à haut débit : toutes les mesures se font avec le même programme de qPCR. D'autres gènes que ceux utilisés dans cet exemple peuvent être criblés. 2 9 8 0 2 1 1 [1] 5 [2] [3] 10 [4] [5] [6] [7] 49 Listes des références Redon et al. « Global variation in copy number in the human genome », Nature, vol. 444, 2006, p. 444-454. C A Heid, J Stevens, K J Livak, and P M Williams. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6: 986-994 Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009, 55(4):611-22. Weglarz L, Molin I, Orchel A, Parfiniewicz B, Dzierzewicz Z. Quantitative analysis of the level of p53 and p21(WAF1) mRNA in human colon cancer HT-29 cells treated with inositol hexaphosphate. Acta Biochim Pol. 2006;53(2):349-56. « Relative Quantification: Data Management & Analysis Settings », Ray Meng, (accessible en ligne sur http://genome.hku.hk/portal/files/GRC/Events/Seminars/2009/20090 512/relative°/020quantification_date/020managemenC/020`)/020analys is°/020settings.pdf). Sambrook J, Russel D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition. Vol. 3. New York, NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. Hussain et al. «A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay », J Immunol Methods. 1993 Mar 15;160(1):89-96.30 REVENDICATIONS1. Acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1. 2. Utilisation de l'acide nucléique SEQ ID NO: 1 pour une analyse d'ADN génomique humain. 3. Utilisation de l'acide nucléique SEQ ID NO: 1 selon la revendication 2, comme calibreur pour une analyse d'ADN génomique humain. 4. Procédé in vitro d'analyse de la variation de la quantité d'un gène cible différent de SEQ ID NO : 1, comprenant l'utilisation d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:1, et une étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'étape de comparaison de la quantité du gène cible dans un échantillon à tester avec la quantité du gène cible dans un échantillon de référence est réalisée en utilisant la méthode du AA de Ct. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel l'échantillon de référence et l'échantillon à tester proviennent d'un seul individu ou de deux individus. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, dans lequel la quantité du gène est un nombre de copie du gène. 8. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour évaluer la qualité d'un ADN humain. 9. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour déterminer l'effet d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. 10. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour déterminer la toxicité d'une substance et/ou d'un traitement sur le nombre de copies d'un gène cible dans un échantillon. 11. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, dans un test de criblage. 12. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, pour aider à déterminer et/ou adapter un traitement et/ou suivre l'évolution d'une maladie pendant son traitement. 13. Kit d'analyse d'ADN génomique humain comprenant des amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur, et une sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1 produits. 14. Kit selon la revendication 13, dans lequel les amorces sens et antisens permettant d'amplifier la séquence SEQ ID NO : 1 du calibreur sont respectivement de séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3, et la sonde fluorescente permettant de quantifier les amplicons de SEQ ID NO : 1 produits est de séquence SEQ ID NO : 4.