Brevet FR2980483A1 — publié le 20130329

SOUCHES DE LEVURE POUR LA PRODUCTION DE GLUTATHION DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de préparation de souches de levure permettant d'obtenir un rendement élevé de production de glutathion, ainsi que les levures obtenues par culture desdites souches, et l'utilisation de ces levures pour la production de glutathion et pour la production de compositions alimentaires, cosmétiques ou médicales. ARRIERE-PLAN TECHNIQUE Le glutathion (ou GSH) est un tripeptide formé par la condensation d'acide glutamique, de cystéine et de glycine. Il est impliqué dans de nombreux procédés physiologiques. Son rôle principal est dû à sa fonction thiol qui lui confère des capacités anti-oxydantes. La forte capacité de donneur d'électrons du GSH permet de maintenir un environnement réducteur et donc de protéger l'ADN, les protéines et les autres biomolécules contre le stress oxydatif. D'autre part, le GSH joue un rôle important dans le système immunitaire via la production de leucocytes et via des propriétés antivirales. La levure est susceptible de produire du GSH par intégration du soufre de l'environnement. Cette intégration s'effectue au niveau de l'homocystéine, unique métabolite pouvant incorporer les sulfures et précurseur de la méthionine et de la cystéine. Une série de réactions permet la conversion de l'homocystéine en GSH via la cystéine. En particulier, la cystéine est convertie en y-glutamylcystéine grâce à la y- glutamylcystéine synthétase, qui est codée par le gène GSH1. La yglutamylcystéine est convertie en GSH grâce à la glutathion synthétase, qui est codée par le gène GSH2. Dans l'état de la technique, de nombreuses souches de levure susceptibles de produire du GSH de façon accrue ont été décrites. Par exemple, le document EP0300168 décrit des souches de Saccharomyces cerevisiae dans lesquelles sont introduits des gènes GSH1 et GSH2 issus d'Escherichia coll. Ces souches génétiquement modifiées permettent d'obtenir jusqu'à 1,8 % de GSH en masse de matière sèche de levure. La revue de Li et al. intitulée Glutathione, a review on biotechnological production, dans Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:233-242 (2004), résume l'ensemble des développements intervenus dans la production biotechnologique du GSH en 30 ans. L'article de Sofyanovich et al. intitulé A new method for repeated "self- cloning" promoter replacement in Saccharomyces cerevisiae, dans Mol. Biotechnol. 48(3):218-227 (2011), s'intéresse à une méthode générale de remplacement multiple de promoteurs assistée par PCR chez Saccharomyces cerevisiae. Plus particulièrement, l'article décrit l'introduction du promoteur pADH1 devant les gènes GSH1 et GSH2. La technique utilisée est toutefois assez complexe, nécessitant notamment de partir de souches de levure génétiquement modifiées dépourvues du gène URA3, puis de réintroduire ce gène. De plus, l'obtention d'une souche de levure auxotrophe pour URA3 est particulièrement complexe dans le cas d'une souche de levure industrielle généralement polyploïde voire aneuploïde. Par ailleurs, l'efficacité de cette technique en termes de rendement de production de GSH reste inconnue. De manière générale, les levures génétiquement modifiées proposées dans l'état de la technique sont obtenues au moyen de constructions relativement complexes et/ou pouvant s'avérer instables ou difficiles à mettre en oeuvre, et ce d'autant plus que le GSH a tendance à être toxique pour la levure. Il existe par conséquent un besoin de mettre au point des souches de levure de construction simplifiée et fournissant des levures stables, faciles à mettre en oeuvre et susceptibles de synthétiser une quantité importante de GSH sans perturbation de leur croissance, et donc de leur rendement de production de biomasse. RESUME DE L'INVENTION L'invention concerne en premier lieu un procédé de préparation d'une souche de levure dans laquelle au moins une copie du gène GSH1 endogène et / ou au moins une copie du gène GSH2 endogène est placée sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, le procédé comprenant : la fourniture d'une souche de levure de départ prototrophe ; la fourniture d'au moins une cassette d'intégration comportant o la séquence d'acide nucléique d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, o encadrée de deux séquences de recombinaison homologue susceptibles d'induire l'intégration de la cassette d'intégration en amont du gène GSH1 ou GSH2, l'introduction de la cassette d'intégration dans la souche de levure de départ par transformation. Selon un mode de réalisation, la cassette d'intégration comporte également un marqueur de sélection, le procédé comprenant une étape ultérieure de sélection de clones ayant intégré la cassette d'intégration par application d'un traitement associé au marqueur de sélection. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend : la fourniture d'une première cassette d'intégration comportant la séquence d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, un premier marqueur de sélection et deux séquences de recombinaison homologue susceptibles d'induire l'intégration de la première cassette d'intégration en amont de l'un des gènes GSH1 ou GSH2 ; l'introduction de la première cassette d'intégration dans la souche de levure de départ par transformation; une première sélection de clones par application d'un traitement associé au premier marqueur de sélection ; la fourniture d'une deuxième cassette d'intégration comportant la séquence d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, un deuxième marqueur de sélection et deux séquences de recombinaison homologue susceptibles d'induire l'intégration de la deuxième cassette d'intégration en amont de l'autre des gènes GSH 1 ou GSH2 ; l'introduction de la deuxième cassette d'intégration dans les clones de la première sélection par transformation ; une deuxième sélection de clones par application d'un traitement associé au deuxième marqueur de sélection. Selon un mode de réalisation, le ou chaque marqueur de sélection est flanqué de séquences répétées directes, de préférence des séquences loxP (SEQ ID NO: 5), le procédé comprenant des étapes finales : d'élimination du ou des marqueurs de sélection par : o introduction dans les clones sélectionnés d'un plasmide portant une séquence codant pour une recombinase, par transformation ; o production de recombinase dans les clones sélectionnés ; o excision de l'acide nucléique situé entre les séquences répétées directes par la recombinase produite ; et - d'induction de la perte du plasmide. Selon un mode de réalisation, la souche de départ est une souche du genre Saccharomyces, et de préférence une souche de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. Selon un mode de réalisation, le promoteur est un promoteur endogène. Selon un mode de réalisation, le promoteur est un promoteur inductible par le glucose, de préférence le promoteur TDH3 ou ADH1, et de manière plus particulièrement préférée le promoteur TDH3. L'invention concerne également une souche de levure susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation, la souche de levure est essentiellement dépourvue d'acide nucléique exogène. Selon un mode de réalisation, au moins une copie du gène GSH1 endogène est placée sous le contrôle du promoteur TDH3 et / ou au moins une copie du gène GSH2 endogène est placée sous le contrôle du promoteur TDH3. Selon un mode de réalisation, la souche de levure est dépourvue de tout marqueur de sélection. Selon un mode de réalisation, la souche de levure est choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4413 le 8 décembre 2010, la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4414 le 8 décembre 2010 et la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4415 le 8 décembre 2010. Selon un mode de réalisation, la souche de levure est dérivée d'une souche choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4413 le 8 décembre 2010, la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4414 le 8 décembre 2010 et la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4415 le 8 décembre 2010, par croisement et / ou mutation. L'invention concerne également une levure susceptible d'être obtenue par culture d'une souche telle que décrite ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de production de levure, comprenant au moins une étape de culture d'une souche telle que décrite ci-dessus dans un milieu de culture en condition aérobie. Selon un mode de réalisation, le milieu de culture est aéré de sorte que la culture soit en condition aérobie et la culture est de type semi-continu. Selon un mode de réalisation, le milieu de culture est alimenté en cystéine et éventuellement en glycine et / ou en acide glutamique, et le procédé comprend de préférence : une étape de culture d'une souche telle que décrite ci-dessus dans un milieu de culture dépourvu de cystéine, glycine et acide glutamique ; puis une étape d'alimentation du milieu de culture en cystéine et éventuellement en glycine et / ou en acide glutamique. Selon un mode de réalisation, de la vitamine C est ajoutée dans le milieu de culture et/ou l'aération du milieu de culture est réduite, lors de l'alimentation du milieu de culture en cystéine. Selon un mode de réalisation, la levure produite comprend au moins 2 % de glutathion, de préférence au moins 4 % de glutathion et de manière particulièrement préférée au moins 4,5 % de glutathion, par rapport à la masse sèche de levure. L'invention concerne également un procédé de production d'un extrait de levure ou d'un autolysat de levure, comprenant la fourniture de levure selon l'invention ou la production de levure par le procédé selon l'invention, suivie d'une étape d'hydrolyse ou d'autolyse de la levure. L'invention concerne également un procédé de production de glutathion, comprenant la fourniture de levure selon l'invention ou la production de levure par le procédé selon l'invention, suivie de l'extraction de glutathion de la levure ; ou comprenant la production d'un extrait de levure ou d'un autolysat de levure selon le procédé de l'invention suivie de l'extraction de glutathion de l'extrait de levure ou de l'autolysat de levure. L'invention concerne également l'utilisation d'une levure selon l'invention ou produite par le procédé selon l'invention pour la fabrication d'un produit contenant du glutathion. Selon un mode de réalisation, l'utilisation comprend la production de glutathion à partir de la levure selon le procédé décrit ci-dessus et la formulation du glutathion produit dans une composition thérapeutique, une composition cosmétique ou une composition alimentaire. Selon un mode de réalisation, l'utilisation comprend la formulation de la levure dans une composition thérapeutique, une composition cosmétique ou une composition alimentaire. La présente invention permet de surmonter les inconvénients de l'état de la technique. Elle fournit plus particulièrement des souches de levure de construction simplifiée et permettant d'obtenir des levures stables, faciles à mettre en oeuvre et susceptibles de synthétiser une quantité importante de GSH sans perturbation de leur croissance, et donc de leur rendement de production de biomasse. Ceci est accompli en plaçant les gènes GSH1 et / ou GSH2 endogènes de la levure sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, directement à partir d'une souche de départ prototrophe. Une souche de levure prototrophe est une souche capable de croître sur un milieu minimum. En particulier, une souche de levure prototrophe selon l'invention est capable de synthétiser tous les acides aminés et bases nécessaires à sa croissance. Un milieu minimum est un milieu comprenant une source de carbone, une source d'azote, une source de potassium, une source de phosphore, une source de soufre, une source de magnésium, une source de calcium, une source de fer, une source d'oligo-éléments et de l'eau. Un exemple de milieu minimum est le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base). Le milieu YNB comprend par litre : biotine 2 pg, pantothénate de calcium 400 pg, acide folique 2 pg, inositol 2000 pg, niacine 400 pg, acide p-aminobenzoïque 200 pg, hydrochlorure de pyridoxine 400 pg, riboflavine 200 pg, hydrochlorure de thiamine 400 pg, acid borique 500 pg, sulfate de cuivre 40 pg, iodure de potassium 100 pg, chlorure ferrique 200 pg, sulfate de manganèse 400 pg, molybdate de sodium 200 pg, sulfate de zinc 400 pg, phosphate de potassium monobasique 1 g, sulfate de magnésium 500 mg, chlorure de sodium 100 mg, chlorure de calcium 100 mg, sulfate d'ammonium 5g/I, pH final 5,4. De préférence, la souche de départ est une souche non génétiquement modifiée. Dans le cadre de la présente demande, par « souche non génétiquement modifiée », on entend une souche n'ayant pas été obtenue par un procédé comportant une étape d'insertion d'une séquence d'ADN dans le génome de la souche et/ou une étape de délétion d'une séquence d'ADN du génome de la souche. Ainsi, d'une part les souches selon l'invention ne comportent pas de gène GSH1 ou GSH2 exogène : la modification génétique proposée par l'invention est donc minimale et n'implique pas de risques de perturbations importantes du métabolisme de la levure ; et d'autre part, la technique utilisée selon l'invention nécessite un nombre minimal de modifications génétiques intermédiaires : elle est donc plus simple à mettre en oeuvre et plus efficace que la technique proposée dans l'article de Sofyanovich précité. Il faut également noter que les souches de levure présentent un polymorphisme relativement important des gènes GSH1 et GSH2 ; l'invention permet ainsi de conserver le polymorphisme de la souche de départ. Selon certains modes de réalisation particuliers, l'invention présente également une ou de préférence plusieurs des caractéristiques avantageuses énumérées ci-dessous. Lorsque le promoteur est un promoteur endogène, les souches de levure selon l'invention peuvent être essentiellement dépourvues de matériel génétique exogène et peuvent donc être considérées comme étant obtenues par auto-clonage. L'invention permet d'obtenir des levures produisant un rendement élevé en GSH, par exemple supérieur ou égal à 2 %, de préférence supérieur ou égal à 4%, plus préférentiellement encore supérieur ou égal à 4,5% (en masse de matière sèche de levure). L'invention permet d'obtenir des levures dont le rendement de production de biomasse est supérieur ou égal à 70%, de préférence supérieur ou égal à 74% dans un milieu de culture dont le substrat carboné est de la mélasse. L'invention permet d'obtenir des levures dont le rendement de production de biomasse est supérieur ou égal à 55% dans un milieu de culture synthétique dont le substrat carboné est du saccharose. L'invention propose également un procédé de production de levure particulièrement approprié pour obtenir un rendement élevé en GSH. L'utilisation de ce procédé de culture spécifiquement à partir des souches de levure de l'invention permet d'obtenir des performances particulièrement élevées. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente de manière schématique une cassette d'intégration utilisée pour préparer des souches selon l'invention. La figure 2 représente de manière schématique l'intégration de la cassette d'intégration dans le génome d'une souche de levure de départ. La figure 3 représente de manière schématique l'excision des marqueurs de sélection. La figure 4 représente le rendement de production de biomasse sur mélasse (en (Y0) des souches de levure 1 à 5. La figure 5 représente le rendement de production de glutathion sur mélasse (en g pour 100 g de matière sèche levure) des souches de levure 1 à 5, à 16h de culture (en gris) et à 17 h de culture (en blanc). TEXTE LIBRE DU LISTAGE DE SEQUENCES La séquence SEQ ID NO: 6 est une séquence artificielle comprenant la séquence loxP et des régions flanquantes (« loxP and flanking regions »). DESCRIPTION DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION L'invention est maintenant décrite plus en détails et de façon non limitative dans la description qui suit. Sauf mention contraire, tous les pourcentages sont des pourcentages massiques. Souches de levure selon l'invention Les souches de levure selon l'invention sont des souches comportant au moins une copie du gène GSH1 endogène et / ou au moins une copie du gène GSH2 endogène placée sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure. De préférence, à la fois au moins une copie du gène GSH1 et au moins une copie du gène GSH2 sont placées sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure. Par « gène GSH1 endogène » et « gène GSH2 endogène », on entend les gènes GSH1 et GSH2 natifs pour l'espèce de levure considérée. Le gène GSH1 endogène placé sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure possède une activité y-glutamylcystéine synthétase et sa séquence d'ADN présente de préférence au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1, de préférence au moins 85% d'identité, plus préférentiellement au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité. La séquence SEQ ID NO: 1 correspond au gène GSH1 de Saccharomyces cerevisiae de référence NCBI NC_001142.9 qui comprend 2037 nucléotides. L'activité y-glutamylcystéine synthétase du gène GSH1 peut être vérifiée en cultivant la souche de levure sur un milieu riche comprenant de la cystéine et en mesurant la quantité de y-glutamylcystéine intracellulaire, par exemple par HPLC après dérivatisation selon la méthode d'Ellman de dosage des thiols (Ellman, 1959, Arch. Biochem. Biophys., vol 82, p.70-77, Vairavamurthy et Mopper, Analytica Chimica Acta, 1990, vol 236, p.363-370). La présence de y-glutamylcystéine traduit alors une activité y-glutamylcystéine synthétase. Le gène GSH2 endogène placé sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure possède une activité glutathion synthétase et sa séquence d'ADN présente de préférence au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2, de préférence au moins 85% d'identité, plus préférentiellement au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité. La séquence SEQ ID NO: 2 correspond au gène GSH2 de Saccharomyces cerevisiae de référence NCBI NC_001147.6 comprenant 1476 nucléotides. L'activité glutathion synthétase du gène GSH2 peut être vérifiée en cultivant la souche de levure sur un milieu riche comprenant de la cystéine et en mesurant la quantité de y-glutamylcystéine intracellulaire et de GSH, par exemple par HPLC après dérivatisation selon la méthode d'Ellman de dosage des thiols (Ellman, 1959, Arch. Biochem. Biophys., vol 82, p.70-77, Vairavamurthy et Mopper, Analytica Chimica Acta, 1990, vol 236, p.363-370). La présence de GSH traduit alors une activité glutathion synthétase. En l'absence de GSH, la présence de yglutamylcystéine permet de vérifier que cette absence de GSH est liée au gène GSH2. Par « promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure », on entend un promoteur dont l'activité est susceptible d'être stimulée par un substrat de fermentation, c'est-à-dire par une substance consommée par la levure lors de sa fermentation. Le substrat de fermentation en question peut notamment être choisi parmi le sucre, le cuivre et le galactose. Le substrat de fermentation permettant d'induire le promoteur est de préférence le sucre, ledit sucre étant de préférence choisi parmi le glucose et le saccharose. Lorsque le sucre est le substrat carboné utilisé pour produire la levure, la synthèse des enzymes GSH1 et GSH2 par les souches selon l'invention est alors maximale lors de la production de biomasse. Le promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure est par exemple choisi parmi le promoteur du gène TDH3, le promoteur du gène ADH1, le promoteur du gène CUP1 et le promoteur du gène GAL. Par la suite, les expressions « promoteur du gène X» et « promoteur X» sont utilisées indifféremment. Les gènes TDH3 et ADH1 sont des gènes de la glycolyse qui sont fortement exprimés en présence de sucre dans le milieu par le biais de leur promoteur. Le gène TDH3 est le gène de la glycolyse codant la glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase. Le gène ADH1 code l'alcool déshydrogénase. Le promoteur CUP1 est activé en présence de cuivre dans le milieu. Le promoteur GAL est activé en présence de galactose dans le milieu. De préférence, le promoteur est un promoteur de levure, de manière plus particulièrement préférée un promoteur du même genre de levure que la souche considérée, et de manière tout particulièrement préférée un promoteur de la même espèce de levure que la souche considérée (promoteur endogène). Selon un mode de réalisation, le promoteur est le promoteur TDH3 ou le promoteur ADH 1. La séquence du promoteur TDH3 est par exemple la séquence SEQ ID NO: 3 ou une séquence codant pour un promoteur fonctionnel présentant au moins 85% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 3, de préférence au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95% d'identité. La séquence du promoteur ADH1 est par exemple la séquence SEQ ID NO: 4 ou une séquence codant pour un promoteur fonctionnel présentant au moins 85% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, de préférence au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95% d'identité. Un promoteur est fonctionnel s'il permet la transcription du gène situé en aval de celui-ci. Dans le cas du promoteur TDH3 ou ADH1, le promoteur est fonctionnel si on détecte l'ARNm du gène situé en aval du promoteur, la mesure de l'ARNm étant effectuée après culture en présence de sucre de la cellule contenant ledit promoteur et ledit gène en aval. Alternativement, le promoteur est fonctionnel si on détecte la présence de la protéine codée par le gène et qui est synthétisée à partir de cet ARNm, la mesure la quantité de protéine étant effectuée après culture en présence de sucre de la cellule contenant ledit promoteur et ledit gène en aval. L'utilisation du promoteur TDH3 est tout particulièrement susceptible de conduire à une levure présentant un rendement de production de GSH élevé. En effet, ce promoteur présente une force intermédiaire entre le promoteur natif de GSH1 / GSH2, et un promoteur très fort tel que ADH1. Le promoteur TDH3 offre un bon compromis et permet d'éviter une déstabilisation des cellules de levure du fait d'une expression excessive de GSH1 et GSH2. La souche de levure selon l'invention est de préférence du genre Saccharomyces, et de manière plus particulièrement préférée de l'espèce Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces kluyveromyces. Dans un autre mode de réalisation, la souche de levure selon l'invention est du genre Candida, et de préférence de l'espèce Candida utilis (appelée également torula). Selon un mode de réalisation particulier, la souche selon l'invention comporte de l'acide nucléique exogène (c'est-à-dire de l'acide nucléique non issu de l'espèce de la souche considérée), par exemple un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique. Mais selon un autre mode de réalisation, la souche est essentiellement dépourvue d'acide nucléique exogène (c'est-à-dire essentiellement dépourvue d'une séquence d'acide nucléique issue d'un autre organisme ou d'un microorganisme d'un autre genre, et éventuellement d'une autre espèce, que la souche de levure considérée). En particulier, dans ce mode de réalisation, la souche est dépourvue de tout marqueur de sélection. Lorsque de l'acide nucléique exogène est présent, il ne s'agit de préférence pas d'une séquence codante. L'acide nucléique exogène, lorsqu'il est présent, n'est de préférence pas traduit, en totalité ou partie, en un peptide, polypeptide ou protéine chimère. De manière générale, l'expression « essentiellement dépourvue d'acide nucléique exogène » signifie que la souche de levure comprend moins de 500 paires de base d'ADN exogène, de préférence moins de 200 paires de base d'ADN exogène, plus préférentiellement moins de 110 paires de base d'ADN exogène, par copie du promoteur inductible associé à un gène GSH1 ou GSH2. De préférence, la souche de levure comporte des séquences répétées directes (telles que des sites loxP) en tant que courtes séquences d'acide nucléique exogène. Ces sites de recombinaison peuvent être qualifiés de « cicatrices génétiques » et constituent un reliquat d'acide nucléique exogène ayant servi à mettre au point la souche de levure puis ayant été excisé. Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique de la souche de levure selon l'invention comprend au moins une séquence loxP, et par exemple une séquence loxP par copie du promoteur inductible associé à un gène GSH1 ou GSH2. La séquence loxP est la séquence de 34 paires de bases suivante : ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT (SEQ ID NO: 5). Une séquence d'ADN exogène préférée est la cicatrice loxP de 103 paires de base dont la séquence est : TGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTA TGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCG (SEQ ID NO: 6) La séquence SEQ ID NO: 6 comprend la séquence loxP de séquence SEQ ID NO: 5 (représentée en caractères gras) et de régions flanquantes. La souche selon l'invention peut être sous forme haploïde, diploïde, polyploïde ou aneuploïde. De préférence, la souche selon l'invention est une souche sous forme polyploïde ou aneuploïde, plus adaptée à une utilisation industrielle. La souche de Saccharomyces cerevisiae déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France) sous le numéro 1-4413 le 8 décembre 2010 est un exemple de souche selon l'invention. La souche de Saccharomyce cerevisiae déposée à la CNCM sous le numéro 1-4415 le 8 décembre 2010 est un autre exemple de souche selon l'invention. Chacune de ces deux souches comporte au moins une copie du gène GSH1 endogène et au moins une copie du gène GSH2 endogène sous le contrôle du promoteur TDH3. Elles sont par ailleurs essentiellement dépourvues d'acide nucléique exogène (à l'exception de cicatrices loxP) et sont en particulier dépourvues de tout marqueur de sélection. La souche de Saccharomyce cerevisiae déposée à la CNCM sous le numéro 1-4414 le 8 décembre 2010 est un autre exemple de souche selon l'invention. Cette souche comporte au moins une copie du gène GSH1 endogène et au moins une copie du gène GSH2 endogène sous le contrôle du promoteur TDH3. Cette souche comporte également deux marqueurs de sélection (kanamycine et phléomycine). La présente invention a également pour objet une souche de levure obtenue à partir de la souche de levure 1-4414 par excision des deux marqueurs de sélection. Procédé de préparation de souches selon l'invention L'invention fournit un procédé de préparation d'une souche de levure telle que décrite ci-dessus, à partir d'une souche de levure de départ. Les souches de levure de départ peuvent être en particulier choisies parmi les souches permettant de produire de la levure de panification, de la levure de brasserie, de la levure d'oenologie ou de la levure pour production d'alcool. Comme indiqué ci-dessus, la souche de départ est une souche de levure prototrophe. La souche de départ est également de préférence une souche de levure non génétiquement modifiée. En particulier, la souche de départ n'a pas été obtenue par un procédé comprenant une étape d'insertion d'une séquence d'ADN dans son génome et/ou une étape de délétion d'une séquence d'ADN de son génome. Par exemple, si la souche de départ est de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, elle comporte notamment le gène URA3 natif. Le procédé de l'invention prévoit de préparer une première cassette d'intégration destinée à la transformation de la souche de levure de départ. Cette première cassette d'intégration est destinée à remplacer le promoteur de l'un des gènes GSH1 ou GSH2 de la souche de départ par un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure. En faisant référence à la figure 1, cette première cassette d'intégration est un fragment d'ADN qui comporte successivement : - de préférence, une séquence de recombinaison homologue d'une séquence du promoteur endogène du gène GSH1 (ou GSH2) de la souche de départ (indiquée A sur l'illustration) ; - de préférence, un marqueur de sélection (avec ses séquences promotrice et terminatrice), tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (indiqué M sur l'illustration) ; - la séquence du promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure (le promoteur TDH3 dans l'exemple illustré) ; de préférence, une séquence de recombinaison homologue de l'extrémité 5' de la partie codante du gène GSH1 (ou GSH2) et/ou d'une séquence du promoteur endogène du gène GSH1 (ou GSH2) de la souche de départ (indiquée B sur l'illustration), étant entendu que la séquence homologue à A est en amont de la séquence homologue à B ; de préférence, deux séquences répétées directes (par exemple des séquences loxP) encadrant le marqueur de sélection et situées en aval de la séquence de recombinaison homologue A et en amont du promoteur inductible. Les séquences de recombinaison homologue sont choisies de manière à intégrer le promoteur inductible en amont de la partie codante du gène GSH1 (ou GSH2) dans la souche de levure. Une séquence de recombinaison homologue comprend au moins 20 paires de base, de préférence au moins 30 paires de base, plus préférentiellement encore au moins 40 paires de base. Une séquence de recombinaison homologue préférée comprend au moins 50 paires de base. Les séquences de recombinaison homologue peuvent être choisies de manière à obtenir une délétion partielle ou totale du promoteur natif du gène GSH1 (ou GSH2). Dans un mode de réalisation préféré, le promoteur natif du gène GSH1 est laissé essentiellement intact, afin de modifier le moins possible le phénotype de la souche de levure. En effet, le promoteur du gène GSH1 est également promoteur d'un autre gène situé sur le brin opposé. L'expression « essentiellement intact » signifie que le promoteur GSH1 peut subir une délétion d'au plus 10 paires de base en amont de la séquence codant du gène GSH1, de préférence au plus 7 paires de base. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de recombinaison homologue B est homologue des 50 premières paires de bases de la partie codante du gène GSH1 (ou GSH2) et la séquence de recombinaison homologue A est homologue des 50 paires de bases du promoteur GSH1 (ou GSH2) situées en amont des 7 paires de base en amont de la séquence de la partie codante du gène GSH1 (ou GSH2). L'homme du métier sait quels marqueurs de sélection sont appropriés pour une utilisation chez la levure. Le marqueur de sélection est de préférence un gène de résistance à un antibiotique. Le marqueur de sélection est par exemple choisi parmi les gènes de résistance à la kanamycine, blasticidine, phléomycine, hygromycine et nourséothricine. Cette première cassette d'intégration est introduite dans la souche de levure de départ par transformation et comprend par exemple le gène Kan de résistance à la kanymcine. La transformation est effectuée par les techniques bien connues de l'homme du métier chez la levure, telles que l'électroporation (Hill, 1989, Nucleic Acids Research, vol 17, p 8011) ou la méthode de transformation à l'acétate de lithium (Schiestl et Gietz, 1989, Current Genetics, vol 16, p 339-346). La figure 2 illustre le mécanisme d'intégration de la première cassette d'intégration dans le génome de la souche de levure. Le génome de la souche de levure de départ est illustré en a) et comprend le gène GSH1 (ou GSH2), son promoteur et son terminateur ; le génome de la souche de levure après transformation est illustré en c), et le mécanisme de la recombinaison homologue est illustrée en b). Le sigle « M» désigne la séquence du marqueur de sélection, ainsi que des séquences promotrices et terminatrices permettant son expression. Avantageusement, on sélectionne les clones ayant correctement intégré le promoteur inductible par un substrat de fermentation grâce au marqueur de sélection, c'est-à-dire typiquement en soumettant l'ensemble des clones à un antibiotique auquel est associé le gène de résistance (dans l'exemple illustré, la généticine) et en conservant les clones insensibles à l'antibiotique. On peut également vérifier par PCR que la cassette d'intégration a été correctement intégrée. Si on le souhaite, on peut ensuite remplacer le promoteur de l'autre des gènes GSH1 ou GSH2 par un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure. Pour ce faire, on peut utiliser une deuxième cassette d'intégration analogue à la première, avec de préférence un deuxième marqueur de sélection distinct du premier (par exemple le gène ble de résistance à la phléomycine). La deuxième cassette d'intégration est alors introduite dans les clones sélectionnés par le premier marqueur de sélection par transformation. Avantageusement, on sélectionne les clones ayant correctement intégré les deux promoteurs grâce au deuxième marqueur de sélection, de manière analogue à ce qui est décrit ci-dessus. Afin d'éliminer essentiellement tout l'ADN exogène introduit dans la souche de levure, et notamment le ou les marqueurs de sélection, on peut prévoir une excision de la partie de la cassette intégrée ou des cassettes intégrées située(s) en amont du ou des promoteurs inductibles pour GSH1 ou GSH2. Lorsqu'on a utilisé des séquences répétées directes loxP, on peut par exemple utiliser la méthode cre-lox pour ce faire. La méthode cre-lox permet d'éliminer en une seule étape tous les marqueurs de sélection. Il est également possible d'intégrer la première cassette d'intégration et exciser le marqueur de sélection, avant d'intégrer la deuxième cassette d'intégration et d'exciser le marqueur de sélection de la deuxième cassette. Dans ce cas, les deux cassettes d'intégration peuvent comprendre le même marqueur de sélection. La partie supérieure de la figure 3 représente la séquence d'ADN de la souche de levure modifiée par les cassettes ci-dessus. La partie inférieure de la figure illustre l'excision des marqueurs de sélection dans cette séquence. Selon cette méthode, on prévoit dans chacune des cassettes d'intégration des séquences loxP (SEQ ID NO: 5) encadrant le marqueur de sélection, par exemple une séquence loxP en aval de la séquence A et une autre séquence loxP en amont du promoteur, lesdites séquences loxP encadrant le marqueur de sélection (voir la figure 1). L'excision du ou des marqueurs de sélection peut être effectuée par transformation de la souche de levure par la méthode de l'acétate de lithium (Schiestl et Gietz, 1989, Current Genetics, vol 16, p339-346), avec un plasmide comprenant le gène de la recombinase Cre et un marqueur de sélection différent du ou des marqueurs de sélection à exciser, par exemple le gène de résistance à la nourséothricine. L'expression de la recombinase Cre dans la souche de levure permet d'exciser le marqueur de sélection, en ne laissant qu'une séquence loxP, éventuellement avec ses régions flanquantes. Il est possible d'induire ensuite la perte du plasmide comprenant le gène Cre par culture en condition non sélective, c'est-à-dire sur milieu enrichi et en l'absence d'antibiotique (voir la figure 3). Les milieux YPG (Yeast Peptone Glucose) et YEG (Yeast extract Glucose) sont des exemples de milieux enrichis pouvant être utilisés. Lorsque les marqueurs de sélection sont des gènes de résistance à un antibiotique, on vérifie que la souche de levure a perdu toute résistance aux antibiotiques correspondants. De la sorte, on obtient des souches de levure essentiellement dépourvues d'ADN exogène, et notamment dépourvues de marqueur de sélection. Les seules séquences d'ADN exogènes restant dans le génome des souches sont les séquences loxP (SEQ ID NO: 5) ou les « cicatrices » loxP comprenant une séquence loxP et des régions flanquantes (par exemple la séquence SEQ ID NO: 6). Selon un mode de réalisation avantageux, les souches de levure selon l'invention sont susceptibles de produire du glutathion en une quantité supérieure ou égale à 2 %, de préférence 4 %, plus préférentiellement 4,5 %, par rapport à la masse sèche de levure. La mesure de la quantité de glutathion produite peut être effectuée après culture de la souche de levure selon l'invention dans un procédé en mode semi- continu, en condition aérobie, comprenant : - une première étape au cours de laquelle le milieu de culture est alimenté en substrat carboné, azote, phosphore, minéraux et vitamines, - une deuxième étape au cours de laquelle le milieu de culture est en outre alimenté en cystéine, glycine et acide glutamique et au cours de laquelle l'aération du milieu de culture est diminuée. Par exemple, la mesure de la quantité de glutathion produite peut être effectuée après culture de la souche de levure selon l'invention conformément au procédé décrit dans l'exemple 2. D'autres souches selon l'invention sont des souches dérivées à partir d'une ou plusieurs souches selon l'invention, par exemple à partir d'une souche ou plusieurs souches obtenues selon le procédé ci-dessus, et notamment à partir d'une ou plusieurs des souches déposées à la CNCM sous les numéros 1-4413, 1-4414 et 1-4415 le 8 décembre 2010. Par l'expression « souche dérivée », on désigne en particulier les souches dérivées par un ou plusieurs croisements et/ou par mutation et/ou par transformation génétique. Les souches dérivées par croisement peuvent être obtenues par croisement d'une souche selon l'invention avec la même souche, ou une autre souche selon l'invention, ou une autre souche quelconque. Les souches dérivées par mutation peuvent être des souches ayant subi au moins une mutation spontanée dans leur génome ou au moins une mutation induite par mutagenèse. La ou les mutations des souches dérivées peuvent être silencieuses ou non. Par l'expression « mutagenèse », on désigne à la fois la mutagenèse aléatoire obtenue par l'application d'un rayonnement (par exemple UV), ou par des agents chimiques mutagènes, et la mutagenèse insertionnelle ou dirigée, par transposition ou par intégration d'un fragment d'ADN exogène. Les souches dérivées entrant dans le cadre de l'invention sont celles comportant au moins une copie du gène GSH1 endogène et / ou au moins une copie du gène GSH2 endogène placée(s) sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, tout comme les souches initiales de l'invention. Selon un mode de réalisation, ces souches dérivées sont susceptibles de produire du glutathion en une quantité supérieure ou égale à 2 %, de préférence 4 %, plus préférentiellement 4,5 %, par rapport à la masse sèche de levure. La mesure du glutathion peut être effectuée après production de levures à partir de la souche dérivée, comme décrit ci-dessus. Procédé de production de levures par culture d'une souche selon l'invention La souche de levure selon l'invention est mise en présence du milieu de culture en condition aérobie. De préférence, la souche de levure selon l'invention est mise en présence du milieu de culture dans un fermenteur (ou réacteur) adapté à la production de levure. Le volume du fermenteur peut varier de quelques millilitres à plusieurs mètres cube. Le fermenteur est de préférence adapté pour une culture en condition aérobie. La souche de levure est de préférence mise en présence du milieu de culture dans le cadre d'une culture en mode semi-continu. Par l'expression « mode semi-continu », appelé également « fed-batch », on désigne ici une culture dans un fermenteur qui est alimenté progressivement par le milieu de culture, mais dont aucun volume de milieu n'est soutiré. Dans un tel procédé, le volume de culture est variable (et généralement croissant) dans le fermenteur. Le débit d'alimentation dans une culture en mode semi-continu est constant ou variable. Un exemple de culture semi-continue est une culture réalisée dans les conditions décrites dans le livre de référence « Yeast Technology», Chapitre 6, 2è" édition, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8. L'étape de culture peut être précédée d'une étape de pré-culture, dans un fermenteur de taille plus réduite, et par exemple selon un mode discontinu (en « batch »). De façon conventionnelle, les conditions de culture sont telles que le métabolisme de la souche de levure est essentiellement respiratoire. L'expression « le métabolisme de la souche de levure est essentiellement respiratoire » signifie que le carbone est majoritairement oxydé, et non fermenté, sur la durée totale de la culture, une partie du carbone pouvant toutefois être fermentée de manière transitoire. L'homme du métier sait comment régler les paramètres de culture d'une souche de levure donnée, afin que les conditions de culture soient telles que le métabolisme de ladite souche est essentiellement respiratoire. Le milieu de culture comprend au moins une source de carbone (notamment du sucre), et en particulier un substrat de fermentation susceptible d'induire le promoteur contrôlant le gène GSH 1 et / ou GSH2. Par exemple, le milieu de culture comprend du glucose et/ou du saccharose. Le milieu de culture comprend également les autres éléments nécessaires à la croissance des levures, à savoir généralement au moins une source d'azote, au moins une source de soufre, au moins une source de phosphore, au moins une source de vitamines et/ou au moins une source de minéraux. Ces autres éléments sont généralement apportés en quantités suffisantes pour ne pas constituer un facteur limitant de la croissance des levures et pour maintenir un métabolisme essentiellement respiratoire. La source d'azote est par exemple apportée sous la forme de sulfate d'ammonium, hydroxyde d'ammonium, di-ammonium phosphate, ammoniac, urée et/ou une combinaison de ceux-ci. La source de soufre est par exemple apportée sous la forme de sulfate d'ammonium, sulfate de magnésium, acide sulfurique et/ou une combinaison de ceux-ci. La source de phosphore est par exemple apportée sous la forme d'acide 5 phosphorique, phosphate de potassium, di-ammonium phosphate, mono-ammonium phosphate, et/ou une combinaison de ceux-ci. La source de vitamines est par exemple apportée sous la forme de mélasse, hydrolysat de levure, solution de vitamine pure ou d'un mélange de vitamines pures et/ou une combinaison de ceux-ci. 10 La source de vitamines apporte à la levure l'ensemble des vitamines dans des quantités au moins équivalentes à celles recommandées dans les ouvrages de référence. Plusieurs sources de vitamines peuvent être associées. La source de minéraux est par exemple apportée sous la forme de mélasse, un mélange de sels minéraux et/ou leur combinaison. 15 La source de minéraux apporte à la levure l'ensemble des macroéléments et oligoéléments dans des quantités au moins équivalentes à celles recommandées dans les ouvrages de référence. Plusieurs sources de minéraux peuvent être associées. Une même substance peut apporter plusieurs éléments différents. 20 De préférence, afin de permettre la synthèse de glutathion par la levure, le milieu de culture comprend par ailleurs de la cystéine et éventuellement de la glycine et/ou de l'acide glutamique (ou du glutamate). Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture est alimenté en cystéine et en glycine. 25 Dans un autre mode de réalisation, le milieu de culture est alimenté en cystéine, glycine et acide glutamique. Chacun de ces acides aminés est par exemple apporté sous forme pure, en mélange, sous la forme de protéines de levure hydrolysées ou sous la forme 30 d'extrait de levure. Ces trois acides aminés peuvent être introduits ensemble ou séparément dans le fermenteur, dès le début de la culture ou ultérieurement, de manière prolongée ou pour une période réduite, par exemple une heure ou quelques heures. Ils peuvent être apportés de façon étalée dans le temps, par exemple l'un des 35 acides aminés étant introduit avant les deux autres ou après les deux autres, ou les trois acides aminés étant introduits à des moments différents. Il est possible de prévoir des séquences alternées d'alimentation / d'arrêt de l'alimentation en les différents acides aminés. Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape de culture est réalisée dans un premier temps en l'absence de cystéine. La cystéine présente en effet une certaine toxicité pour la levure (et tout particulièrement pour les souches selon l'invention) et est susceptible de réprimer sa croissance. Il est donc particulièrement avantageux de prévoir, dans un premier temps, une étape de culture sans cystéine, glycine et acide glutamique, afin de favoriser le développement de la biomasse, puis une étape d'alimentation du milieu de culture en cystéine, et éventuellement en glycine et/ou acide glutamique, afin de favoriser la synthèse de glutathion. Il peut également être avantageux de prévoir une étape ultérieure d'arrêt de l'alimentation du milieu de culture en cystéine, et le cas échéant en glycine et acide glutamique, afin d'assurer un taux de conversion en glutathion maximum par rapport aux acides aminés ajoutés. Il est également avantageux de prévoir des moyens permettant de limiter l'oxydation (et donc la dégradation) de la cystéine dans le milieu. Ainsi, on peut prévoir un ajout de vitamine C et/ou ou une réduction de l'aération. Lorsque de la vitamine C est utilisée pour limiter l'oxydation de la cystéine, elle est de préférence ajoutée pendant l'étape d'alimentation du milieu de culture en cystéine, par exemple dans un rapport d'au moins 1 mole de vitamine C pour 1 mole de cystéine. Lorsqu'une diminution de l'aération est utilisée pour limiter l'oxydation de la cystéine, cette diminution de l'aération a lieu de préférence pendant l'étape d'alimentation du milieu de culture en cystéine. L'aération est par exemple divisée par deux. De plus, l'aération est de préférence arrêtée lorsque l'alimentation du milieu de culture en la source de carbone est stoppée, et donc lorsque la croissance s'arrête. Au cours de la culture, la quantité de GSH intracellulaire accumulée peut être mesurée par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). A la fin de la culture, la levure est récoltée par centrifugation et la masse de levure récoltée est mesurée. La levure produite (en g de MS) est la différence entre la levure récoltée (en g de MS) et la levure de l'inoculum (en g de MS). L'abréviation MS signifie « matière sèche ». Le rendement de production de biomasse en pourcentage est alors obtenu en faisant le rapport levure produite (g de MS) / substrat carboné introduit en équivalent saccharose (g), et en multipliant par 100. L'équivalent saccharose est déterminé ici par rapport au métabolisme de la glycolyse, selon lequel une mole de saccharose est convertie en une mole de fructose et une mole de glucose qui sont elles-mêmes converties en quatre moles de pyruvate. Une mole de glucose est donc convertie en deux moles de pyruvate, et une mole de fructose en deux moles de pyruvate. Deux moles de glucose correspondent à une mole d'équivalent saccharose. Deux moles de fructose correspondent à une mole d'équivalent saccharose. Avantageusement, à l'issue de la culture la quantité de glutathion obtenue est supérieure ou égale à 2 %, de préférence supérieure ou égale à 3 %, de préférence supérieure ou égale à 4 %, de préférence supérieure ou égale à 4,5 % (en masse par rapport à la matière sèche de levure). De plus, à l'issue de la culture, le rendement de production de biomasse est supérieur à 70%, de préférence supérieur à 74%, dans un milieu de culture dont le substrat carboné est de la mélasse ou est supérieur à 55% dans un milieu de culture synthétique dont le substrat carboné est du saccharose. Les souches de levure selon l'invention présentent donc l'avantage de produire des quantités importantes de glutathion, tout en maintenant un bon rendement de production de biomasse, ce qui est essentiel pour une production de glutathion à partir d'une souche de levure à l'échelle industrielle. Utilisation de la levure selon l'invention La levure selon l'invention peut être utilisée pour fournir des produits contenant du glutathion : soit en intégrant la levure elle-même (riche en glutathion) dans des produits, sous forme vivante ou morte, et notamment sous forme déshydratée, lyophilisée ou encapsulée ; soit en préparant un extrait de levure ou un autolysat de levure et en intégrant ledit extrait ou autolysat de levure (riche en glutathion) dans des produits ; - soit en produisant du glutathion sous forme purifiée à partir de la levure, ou à partir d'un extrait de levure ou d'un autolysat de levure, et en intégrant le glutathion dans des produits. La production d'un extrait de levure ou d'un autolysat de levure à partir de la levure comprend une étape d'hydrolyse ou d'autolyse de la levure. Un extrait de levure est obtenu par hydrolyse thermique et/ou enzymatique et/ou chimique de la levure, suivie d'une séparation de la fraction soluble correspondant à l'extrait de levure. Un autolysat de levure est obtenu par autolyse de la levure par ses propres enzymes. L'autolysat de levure contient à la fois une partie soluble et insoluble. Le glutathion peut être extrait et purifié à partir de la levure ou à partir de l'extrait de levure ou de l'autolysat de levure, selon les étapes suivantes : - lyse cellulaire, lorsque le glutathion est extrait et purifié à partir de la levure cultivée, - ultrafiltration, - complexation du GSH, par exemple à l'oxyde de cuivre Cu2O ou au sulfate de cuivre, - régénération du GSH, par exemple ultrafiltration puis action de H2S, - une éventuelle étape de chromatographie. Les produits contenant du glutathion peuvent être par exemple formulés pour une administration orale (comprimés, gélules, poudres, boissons, aliments...), topique (lotions, crèmes, savons...) ou parentérale (préparation injectable...) selon les applications, avec des excipients et véhicules appropriés. Les produits contenant du glutathion peuvent notamment être des compléments alimentaires présentant des propriétés anti-oxydantes ou détoxifiantes. Ces compléments alimentaires peuvent notamment favoriser le bien-être et la forme en général, ou concerner plus spécifiquement le soin de la peau, le soin des cheveux, la santé des yeux, la santé du foie, l'amélioration de la digestion, la santé du coeur ou encore favoriser la perte de poids ou renforcer le système immunitaire. Ces produits peuvent notamment contenir, outre le glutathion, des vitamines, minéraux, enzymes, extraits végétaux... Ces produits peuvent également être des aliments, pour l'alimentation humaine ou animale. Ils contiennent dans ce cas des nutriments. Les produits contenant du glutathion peuvent également être des produits cosmétiques, notamment pour une application anti-âge ou pour le contrôle de la mélanine (éclaircissement de la peau). Les produits contenant du glutathion peuvent également être des médicaments, notamment pour la prévention ou le traitement du cancer ou des maladies hépatiques. Les produits contenant du glutathion peuvent également être des ingrédients alimentaires, par exemple des améliorants de panification ou des exhausteurs de goût. EXEMPLES Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. Exemple 1 - construction de souches sur-exprimant GSH1 et GSH2 a) Souche de départ La souche de départ est une souche de Saccharomyces cerevisiae de la collection de cultures du Demandeur. Il s'agit d'une souche de levure prototrophe et non génétiquement modifiée. b) Cassettes d'intégration La construction des souches fait appel à l'intégration dans le génome de la levure en amont du gène GSH1 ou GSH2 d'une cassette d'intégration comprenant le nouveau promoteur. Dans cet exemple, il s'agit du promoteur du gène TDH3. La première cassette d'intégration utilisée pour modifier le promoteur du gène GSH1 comprend : le promoteur de remplacement pTDH3 ; un marqueur de sélection, dans cet exemple la kanamycine, encadré de deux séquences loxP ; de part et d'autre de la cassette, deux séquences de recombinaison homologues spécifiques du locus au niveau duquel la cassette doit être intégrée : o à l'extrémité 5' de la cassette : la séquence A de 50 paires de base qui est homologue de la séquence du promoteur endogène de GSH1 et se terminant 8 paires de base en amont de la partie codante du gène GSH1 : après intégration de la cassette, il restera 7 paires de base du promoteur endogène de GSH1 entre la séquence du promoteur TDH3 et l'ATG de la séquence du gène endogène GSH1, o à l'extrémité 3' de la cassette : la séquence B de 50 paires de base qui est homologue de l'extrémité 5' de la partie codante du gène GSH1. La deuxième cassette d'intégration utilisée pour modifier le promoteur du gène GSH2 comprend : le promoteur de remplacement pTDH3 ; un marqueur de sélection, dans cet exemple le gène ble conférant la résistance à la phléomycine, encadré de deux séquences loxP ; de part et d'autre de la cassette, deux séquences de recombinaison homologues spécifiques du locus au niveau duquel la cassette doit être intégrée : o à l'extrémité 5' de la cassette : la séquence A' de 50 paires de base qui est homologue de la séquence du promoteur endogène de GSH2 et se terminant 8 paires de base en amont de la partie codante du gène GSH2: après intégration de la cassette, il restera 7 paires de base du promoteur endogène de GSH2 entre la séquence du promoteur TDH3 et l'ATG de la séquence du gène endogène GSH2, o à l'extrémité 3' de la cassette : la séquence B' de 50 paires de base qui est homologue de l'extrémité 5' de la partie codante du gène GSH2. c) Intégration des deux cassettes d'intégration La première cassette d'intégration est introduite dans les cellules de la souche de départ par transformation selon la méthode à l'acétate de lithium. Les clones ayant intégré la première cassette d'intégration sont sélectionnés grâce au phénotype de résistance à la kanamycine apporté par la cassette : les clones sont étalés sur boîte de milieu YEG (20 g/L glucose, 5 g/L d'extrait de levure, 30 g/I agar) contenant une concentration appropriée de l'antibiotique. La deuxième cassette d'intégration est introduite dans les cellules des clones ayant intégré la première cassette d'intégration, par transformation selon la méthode à l'acétate de lithium. Les clones ayant également intégré la deuxième cassette d'intégration sont sélectionnés grâce au phénotype de résistance à la phléomycine apporté par la cassette : les clones sont étalés sur boîte de milieu YEG (20 g/L glucose, 5 g/L d'extrait de levure, 30 g/I agar) contenant une concentration appropriée de l'antibiotique. Parmi les clones sélectionnés ayant intégré les deux cassettes d'intégration figure la souche de levure déposée à la CNCM sous le numéro 1-4414. d) Elimination des marqueurs de sélection Le clone sélectionné ayant intégré les deux cassettes d'intégration et dont on souhaite éliminer les marqueurs de sélection est transformé avec un plasmide comprenant le gène de résistance à la nourseothricine et le gène de la recombinase Cre, par la méthode de l'acétate de lithium. Des clones transformants devenus résistants à la nourséothricine sont sélectionnés et cultivés sur une nuit en présence d'un milieu YE contenant 20 g/I de galactose, afin d'induire l'expression de la recombinase Cre présente sur le plasmide. 10 pl de cette culture sont ensemencés dans un milieu YEG frais. Après 24h de culture en condition non sélective en vue de favoriser la perte du plasmide, un étalement sur boite gélosée YEG est réalisé. Les clones obtenus sont analysés pour vérifier la perte effective de la résistance aux 2 marqueurs antibiotiques des cassettes d'intégration (kanamycine et phléomycine) et de la résistance à la nourseothricine apportée par le plasmide comprenant la recombinase. Les clones qui ont perdu toute résistance à ces antibiotiques sont analysés afin de vérifier que cette étape particulière n'a pas affecté la croissance et le rendement de production de levures à partir des clones sélectionnés. Parmi les clones ayant perdu toute résistance à un antibiotique figurent la souche de levure déposée à la CNCM sous le numéro 1-4413 et la souche de levure déposée à la CNCM sous le numéro 1-4415. Exemple 2 - culture des levures et production de glutathion La production de glutathion est réalisée par culture d'une souche de levure selon l'invention dans un fermenteur de 20L selon un mode semi-continu. Pré-culture et préfermentation La souche de levure à produire est conservée sur gélose inclinée (milieu YEG : 0,5 % d'extrait de levure, 2 % de glucose, 3 % d'agar) à 4°C pendant 1 mois au plus. Une colonie de la souche de levure est prélevée et transférée dans une fiole à ergots de 250mL contenant 50mL de milieu de culture YPG (1% d'extrait de levure, 2% de peptone, 3% (v/v) de glycérol et 2% d'agar) : la fiole est incubée à 30°C pendant 24h sous une agitation de 120 rpm. Cette pré-culture est suivie d'une étape de préfermentation : un milieu de culture composé de 12,5% de mélasse brute à une teneur en sucre de 500 g/kg en équivalent saccharose, 0,025% de MgSO4 et 0,25% de DAP (phosphate de diammonium) est ensemencé avec 0,5% de la pré-culture. Après une incubation de 24h à 30°C, le moût levuré est centrifugé. La levure récupérée est ensuite lavée et une crème de levure à environ 13% de MS est reconstituée. Culture en fed-batch La crème de levure obtenue à l'issue de la préfermentation est utilisée pour inoculer les réacteurs de 20L pour la production de levures enrichies en GSH selon un procédé de type fed-batch. Les cuves de 20L sont équipées d'une alimentation pour le substrat carboné, pour l'azote et pour le phosphore, afin d'apporter de manière continue et optimum les substrats nécessaires à la croissance. Une quatrième alimentation est dédiée aux acides aminés précurseurs du GSH (sous la forme d'un mélange équimolaire par rapport à la cystéine ajoutée, c'est-à-dire 12 mmoles/L de milieu de culture). Les acides aminés peuvent être ajoutés en continu, en particulier sous forme de coulée, ou de manière ponctuelle. Le substrat carboné est apporté sous la forme de saccharose ou sous la forme de mélasse. Lorsque le substrat carboné est apporté sous la forme de saccharose, on parle de milieu synthétique. Des complémentations en minéraux et vitamines appropriés sont apportées directement dans le réacteur, avant ensemencement. Le schéma de culture appliqué est un schéma de 17 h suivi d'une phase de refroidissement de la cuve de 30 min. De façon conventionnelle, les conditions de culture sont telles que le métabolisme de la souche de levure est essentiellement respiratoire. Les paramètres du schéma de culture sont les suivants : agitation fixée à 650 rpm avec p02 libre jusqu'à 13h, puis p02 régulée à 10% avec une agitation variant entre 300/800 rpm jusqu'à 17h et enfin agitation fixée 300 rpm jusqu'à 17,5h ; aération : entre 3,5 et 2,8 VVM (Volume d'air (L) par Volume de milieu (L) par Minute) jusqu'à 13h, puis entre 1,5 et 1,2 VVM jusqu'à 17h, 0 VVM entre 17h et 17,5h ; pH régulé à 6,0 ± 0,25 par H2SO4 jusqu'à 13h, puis à 5,2 ± 0,25 par NaOH et enfin retour à 6,0 ± 0,25 à partir de 16h ; température de fermentation : 33°C ; mélange d'acides aminés : apport en continu ou en pulse, mélange équimolaire par rapport à la cystéine ajoutée, à raison de 12 mmoles/L ; substrat carboné : 55g/I en équivalent saccharose ; urée : 3g/I d'azote ; H3PO4 : 1g/I de P2O5. Indifféremment, le pH peut être fixé à 5,2 ± 0,25 pendant toute la durée de la culture. Entre T=0 (début de l'alimentation en substrat carboné) et T=13h, seules les alimentations en substrat carboné, azote et phosphore sont assurées. Ainsi, la croissance de la souche selon l'invention est favorisée et la synthèse des enzymes GSH1 et GSH2 est activée. Entre T=13h et T=16h, le milieu de culture est également alimenté en cystéine, glycine et acide glutamique. Les enzymes synthétisées au cours des premières heures de fermentation permettent d'optimiser la conversion des acides aminés en GSH. Durant cette deuxième phase, l'aération du milieu de culture est diminuée pour limiter l'oxydation de la cystéine et donc favoriser sa disponibilité. La cystéine est en effet un acide aminé relativement instable et qui s'oxyde très facilement en cystine ou se complexe avec des molécules du milieu. Entre T=16h et T=17h, seules les alimentations en substrat carboné, azote et phosphore sont assurées. Ceci permet de d'assurer un taux conversion en glutathion maximum par rapport aux acides aminés ajoutés. De T=17h à T=17,5h, la température du milieu de culture est abaissée. Le moût levuré est ensuite récolté, puis centrifugé. Le culot de levures obtenu est lavé. La masse de levure récoltée est alors mesurée. Différents bilans matières et l'analyse par HPLC des molécules soufrées d'intérêt (GSH, y-Glu-Cys et cystéine) sont effectués. La quantité de GSH intracellulaire accumulée est également mesurée par HPLC au cours de la culture. Résultats i) Production de biomasse L'alimentation en substrat carboné mélasse permet de multiplier la biomasse initiale par environ 16 en 17h de culture, et l'alimentation en substrat carboné saccharose par environ 11 en 17h de culture. La concentration en biomasse finale est comprise entre 2 et 7% et la teneur en azote de cette biomasse entre 7 et 10%. (ii) Résultats sur milieu mélasse Quatre souches de levure selon l'invention ont été cultivées sur le substrat carboné mélasse. Les souches selon l'invention ont un rendement de production de biomasse supérieur à 70%, ce qui constitue un excellent rendement (figure 4). La teneur en glutathion mesurée à 17h est supérieure à 4,8% pour toutes les souches de levure testées, le pourcentage étant exprimé en g de glutathion pour 100 g de matière sèche levure (figure 5). La souche de levure n°1 correspond à la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4413 et la souche de levure n°2 à la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4415. Les souches de levure 3 à 5 sont des souches de Saccharomyces cerevisiae obtenues en remplaçant au moins une copie du gène GSH1 et au moins une copie du gène GSH2 par le promoteur TDH3. (iii) Résultats sur milieu synthétique (avec saccharose comme substrat carboné) La souche de levure n°1 est produite sur le substrat carboné saccharose. Le rendement obtenu est de 56,1%. La teneur en glutathion mesurée à 16h et à 17h est égale à 4,8%, le pourcentage étant exprimé en g de glutathion pour 100 g de matière sèche levure. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'une souche de levure dans laquelle au moins une copie du gène GSH1 endogène et / ou au moins une copie du gène GSH2 endogène est placée sous le contrôle d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, le procédé comprenant : la fourniture d'une souche de levure de départ prototrophe ; la fourniture d'au moins une cassette d'intégration comportant o la séquence d'acide nucléique d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, o encadrée de deux séquences de recombinaison homologue susceptibles d'induire l'intégration de la cassette d'intégration en amont du gène GSH1 ou GSH2, l'introduction de la cassette d'intégration dans la souche de levure de départ par transformation. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cassette d'intégration comporte également un marqueur de sélection, le procédé comprenant une étape ultérieure de sélection de clones ayant intégré la cassette d'intégration par application d'un traitement associé au marqueur de sélection. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant : la fourniture d'une première cassette d'intégration comportant la séquence d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation de la levure, un premier marqueur de sélection et deux séquences de recombinaison homologue susceptibles d'induire l'intégration de la première cassette d'intégration en amont de l'un des gènes GSH1 ou GSH2 ; l'introduction de la première cassette d'intégration dans la souche de levure de départ par transformation; une première sélection de clones par application d'un traitement associé au premier marqueur de sélection ; la fourniture d'une deuxième cassette d'intégration comportant la séquence d'un promoteur inductible par un substrat de fermentation 10 4. 15 20 5. 256. 7. 30 8. 35 de la levure, un deuxième marqueur de sélection et deux séquences de recombinaison homologue susceptibles d'induire l'intégration de la deuxième cassette d'intégration en amont de l'autre des gènes GSH 1 ou GSH2 ; l'introduction de la deuxième cassette d'intégration dans les clones de la première sélection par transformation ; une deuxième sélection de clones par application d'un traitement associé au deuxième marqueur de sélection. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel le ou chaque marqueur de sélection est flanqué de séquences répétées directes, de préférence des séquences loxP (SEQ ID NO: 5), le procédé comprenant des étapes finales : d'élimination du ou des marqueurs de sélection par : o introduction dans les clones sélectionnés d'un plasmide portant une séquence codant pour une recombinase, par transformation ; o production de recombinase dans les clones sélectionnés ; o excision de l'acide nucléique situé entre les séquences répétées directes par la recombinase produite ; et d'induction de la perte du plasmide. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la souche de départ est une souche du genre Saccharomyces, et de préférence une souche de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le promoteur est un promoteur endogène. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel le promoteur est un promoteur inductible par le glucose, de préférence le promoteur TDH3 ou ADH1, et de manière plus particulièrement préférée le promoteur TDH3. Souche de levure susceptible d'être obtenue par le procédé de préparation selon l'une des revendications 1 à 7. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 32 Souche de levure selon la revendication 8, essentiellement dépourvue d'acide nucléique exogène. Souche de levure selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle au moins une copie du gène GSH1 endogène est placée sous le contrôle du promoteur TDH3 et / ou au moins une copie du gène GSH2 endogène est placée sous le contrôle du promoteur TDH3. Souche de levure selon l'une des revendications 8 à 10, dépourvue de tout marqueur de sélection. Souche de levure selon l'une des revendications 8 à 10, qui est choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4413 le 8 décembre 2010, la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4414 le 8 décembre 2010 et la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4415 le 8 décembre 2010. Souche de levure selon l'une des revendications 8 à 12, dérivée d'une souche choisie parmi la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4413 le 8 décembre 2010, la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4414 le 8 décembre 2010 et la souche déposée à la CNCM sous le numéro I4415 le 8 décembre 2010, par croisement et / ou mutation. Levure susceptible d'être obtenue par culture d'une souche selon l'une des revendications 8 à 13. Procédé de production de levure, comprenant au moins une étape de culture d'une souche selon l'une des revendications 8 à 13 dans un milieu de culture en condition aérobie. Procédé selon la revendication 15, dans lequel le milieu de culture est aéré de sorte que la culture soit en condition aérobie et dans lequel la culture est de type semi-continu.Procédé selon la revendication 15 ou 16, dans lequel le milieu de culture est alimenté en cystéine et éventuellement en glycine et / ou en acide glutamique, et comprenant de préférence : une étape de culture d'une souche selon l'une des revendications 8 à 13 dans un milieu de culture dépourvu de cystéine, glycine et acide glutamique ; puis une étape d'alimentation du milieu de culture en cystéine et éventuellement en glycine et / ou en acide glutamique. Procédé selon la revendication 17, dans lequel de la vitamine C est ajoutée dans le milieu de culture et/ou dans lequel l'aération du milieu de culture est réduite, lors de l'alimentation du milieu de culture en cystéine. Procédé selon l'une des revendications 15 à 18, dans lequel la levure produite comprend au moins 2 % de glutathion, de préférence au moins 4 % de glutathion et de manière particulièrement préférée au moins 4,5 % de glutathion, par rapport à la masse sèche de levure. Procédé de production d'un extrait de levure ou d'un autolysat de levure, comprenant la fourniture de levure selon la revendication 14 ou la production de levure par le procédé selon l'une des revendications 15 à 19, suivie d'une étape d'hydrolyse ou d'autolyse de la levure. Procédé de production de glutathion, comprenant la fourniture de levure 25 selon la revendication 14 ou la production de levure par le procédé selon l'une des revendications 15 à 19, suivie de l'extraction de glutathion de la levure ; ou comprenant la production d'un extrait de levure ou d'un autolysat de levure selon le procédé de la revendication 20 suivie de l'extraction de glutathion de l'extrait de levure ou de l'autolysat de levure. 30 22. Utilisation d'une levure selon la revendication 14 ou produite par le procédé selon l'une des revendications 15 à 19 pour la fabrication d'un produit contenant du glutathion. 35 23. Utilisation selon la revendication 22, comprenant la production de glutathion à partir de la levure selon le procédé de la revendication 21 et la 17. 18. 19. 20. 21.formulation du glutathion produit dans une composition thérapeutique, une composition cosmétique ou une composition alimentaire. 24. Utilisation selon la revendication 22, comprenant la formulation de la levure dans une composition thérapeutique, une composition cosmétique ou une composition alimentaire.