Brevet FR2979635A1 — publié le 20130308

PROCEDE DE DOSAGE DU PLASMINOGENE EN MILIEU LIQUIDE, COMPOSITIONS ET KIT ASSOCIES. DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION [0001] L'invention se rapporte au domaine des procédés de dosage du plasminogène dans un échantillon, notamment au moyen de réactifs liquides, en particulier au moyen de réactifs prêts à l'emploi et stockables pendant une longue durée. [0002]0e type de dosage nécessite une activation du plasminogène de l'échantillon, qui se fait en général avec de la streptokinase. [0003] Dans ce contexte, une solution consiste à utiliser une streptokinase avec un activateur de streptokinase qui est le fibrinogène. Cependant le fibrinogène se conserve difficilement sous forme liquide, ce qui se traduit par des résultats de dosages modifiables en fonction du temps de conservation du fibrinogène. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE [0004]Ainsi, pour pallier à ces inconvénients, on connaît par le brevet US 5,789,923, une solution de plasmine stabilisée par des oligopeptides et des acides aminés déterminés. Cette solution ne s'avère pas suffisamment satisfaisante car elle se limite à la stabilisation de la solution de plasmine et n'est pas adaptable à la stabilisation de la solution d'activateur de plasminogène tel qu'un fibrinogène. En outre, cette solution n'est pas satisfaisante pour un dosage du plasminogène présent dans le sang d'un patient à partir de réactifs sous forme liquide prêts à l'emploi, préparés longtemps avant le prélèvement de sang du patient. EXPOSE DE L'INVENTION [0005] L'invention vise à remédier aux inconvénients de l'état de la technique et notamment à proposer un procédé de dosage du plasminogène dans un échantillon comprenant des étapes consistant à : a- faire réagir i- une streptokinase, et un activateur de streptokinase, ii- avec une solution témoin ou un échantillon de plasma dilué, b- suivre ladite réaction par un moyen de suivi (SPm) de ladite réaction, c- déterminer la quantité de plasminogène de la solution témoin ou de l'échantillon de plasma dilué, en fonction du résultat du suivi de ladite réaction. [0006]Selon un premier aspect de l'invention, l'activateur de streptokinase est stable sous forme liquide et est sélectionné dans le groupe comprenant un fragment DD de fibrine et/ou au moins un dérivé de fragment DD. [0007] De manière tout à fait intéressante et inattendue, la demanderesse s'est apperçue que ce type d'activateur de streptokinase présente une très bonne stabilité sous forme liquide et peut donc être conservé sous cette forme. Il résulte que lors de la réalisation du procédé, l'activateur de streptokinase est prêt à être utilisé, et ne nécessite pas de préparation préalable. [0008]Selon l'invention, on entend par fragment DD (ou D-dimère), un sous-fragment de la fibrine qui peut être obtenu par exemple par lyse enzymatique de cette dernière. Ainsi le fragment DD utilisé dans la présente invention peut provenir d'un caillot de fibrine ou de sang lysé. On peut encore utiliser un fragment DD recombinant. Un fragment DD non purifié peut également être utilisé, par exemple une fraction de dégradation de la fibrine. [0009] On entend par dérivé de fragment DD, une molécule comprenant au moins une partie du fragment DD tel que défini précédemment, notamment les acides aminés du fragment DD intervenant dans l'activation de la streptokinase. Ainsi, un dérivé de fragment DD peut comprendre par exemple plus d'acides aminés que le fragment DD. [0010] Le moyen de suivi (SPm) de la réaction peut être par exemple une molécule greffée soit sur un substrat, soit sur un produit de l'enzyme formée par streptokinase et l'activateur de streptokinase, soit sur ladite enzyme. Un tel greffage est réalisé par exemple par synthèse chimique. Le moyen de suivi (SPm) de la réaction peut aussi être une molécule susceptible de s'associer soit à un substrat, soit à un produit de ladite enzyme, soit à ladite enzyme. 2 9 79635 3 [0011] Le moyen de suivi est choisi de sorte à pouvoir suivre la réaction de ladite enzyme par exemple par génération ou disparition d'une couleur ou d'une fluorescence ou par modification de l'absorbance du milieu de réaction. [0012] De préférence, la réaction est réalisée en présence d'un anticoagulant, de 5 préférence de l'hirudine. [0013]Avantageusement, le procédé comprend préalablement à l'étape a) de réaction, une étape de stockage de l'activateur de streptokinase en solution prête à l'emploi. [0014] De façon particulièrement intéressante le réactif, en particulier l'activateur 10 de streptokinase n'évolue pas dans le temps. Sa durée de stabilité peut être de 30 mois voire davantage. [0015]Ainsi, la réalisation du procédé ne nécessite pas de préparation d'une solution d'activateur de streptokinase. En outre, les activateurs de streptokinase sont stables en solution et peuvent être conservés par exemple avec la 15 streptokinase, sans altérer ses propriétés physico-chimiques et son efficacité dans la réalisation du dosage du plasminogène. [0016]De préférence, l'étape de stockage de l'activateur de streptokinase est réalisée à une température comprise entre -20°C et 37°C. [0017]Selon une variante avantageuse, l'étape de stockage est réalisée pendant 20 une durée supérieure à 12 heures, de préférence comprise entre 24 heures et 30 mois, en particulier entre 2 jours et 30 mois. [0018]De préférence, l'activateur de streptokinase est stocké en présence de conservateurs et/ou d'antibiotiques tels que la ciprofloxacine. [0019]Avantageusement, le procédé comprend en outre une étape de 25 préincubation de la streptokinase (R1), et de l'activateur de streptokinase, à environ 37°C, étape réalisée avant ladite étape a) de réaction. [0020]Selon un mode de réalisation préféré, l'étape de a) de réaction est réalisée à environ 37°C, de préférence pendant environ 3 à 6 minutes. [0021]Selon une variante, l'étape a) de réaction est arrêtée (stoppée) par une étape d'acidification, de préférence par un ajout d'acide citrique. [0022]Un autre objet de l'invention concerne une composition pour doser du plasminogène présent dans un échantillon, ladite composition comprenant un activateur de streptokinase, caractérisée en ce que l'activateur de streptokinase est sélectionné dans le groupe comprenant un fragment DD de fibrine et/ou au moins un dérivé de fragment DD, et ladite composition peut être stockée sous forme liquide sans évolution dans le temps. [0023] De préférence, la composition décrite précédemment comprend en outre un anticoagulant, de préférence de l'hirudine. [0024]Selon une variante la composition décrite précédemment est en solution prête à l'emploi. [0025] L'invention concerne en outre un kit de dosage du plasminogène dans un échantillon comprenant une composition décrite précédemment. [0026]Avantageusement, le kit de dosage décrit précédemment est configuré pour mettre en oeuvre le procédé décrit ci-dessus. [0027] En particulier l'invention porte sur un kit de dosage du plasminogène dans un échantillon comprenant une streptokinase, un activateur de streptokinase, un moyen de suivi (SPm) d'une réaction entre la streptokinase, l'activateur de streptokinase et un échantillon de plasma dilué, dans lequel l'activateur de streptokinase est sélectionné dans le groupe comprenant un fragment DD de fibrine et/ou au moins un dérivé de fragment DD. [0028]De préférence, le kit de dosage se caractérise par au moins une composition calibrée en volume et en quantité pour être mise en réaction avec une solution témoin ou un échantillon de plasma dilué afin de déterminer rapidement la quantité de plasminogène de la solution témoin ou de l'échantillon de plasma dilué, sur la base d'un suivi de la réaction entre l'enzyme et le substrat. [0029] Par exemple les compositions du kit sont choisies de sorte qu'un volume de composition de streptokinase et d'activateur de streptokinase est mélangé à un volume d'une solution témoin ou d'un échantillon de plasma dilué. [0030] Un autre objet de l'invention consiste en une utilisation d'un activateur de streptokinase pour doser du plasminogène dans un échantillon, l'activateur de streptokinase étant sélectionné dans le groupe comprenant un fragment DD de fibrine et/ou au moins un dérivé de fragment DD, et étant stable sous forme liquide. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES [0031]D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées, qui illustrent : - la figure 1, un schéma général du procédé selon l'invention ; - la figure 2, une courbe de calibration lors d'essais de remplacement du fibrinogène ; - la figure 3, une courbe de calibration lors d'essais avec différentes concentrations en fragment DD de fibrine ; - la figure 4, des courbes de détermination de la quantité optimale de streptokinase. [0032] Pour plus de clarté, les éléments identiques ou similaires sont repérés par des signes de référence identiques sur l'ensemble des figures. DESCRIPTION DETAILLEE DES MODES DE REALISATION DE L'INVENTION [0033] En se référant à la figure 1, la réalisation du procédé selon un mode préféré est basée sur des compositions de réactifs R1 et R2 qui sont par exemple stockées sous forme liquide prêtes à l'emploi LRT. [0034] La première composition de réactifs R1 comprend du fragment DD à une concentration préférée d'environ 0,1 mg/ml ; une matrice de base comprenant du Tris, de Na2EDTA, du NaCI et du BSA est préférée mais d'autres matrices de bases peuvent être utilisées. Pour un dosage de qualité, on utilise de préférence un fragment DD dit « Plg-free » c'est-à-dire comprenant du plasminogène à l'état de traces, ou de préférence ne comprenant pas de plasminogène. [0035] La première composition de réactifs R1 comprend en outre au moins un conservateur, de préférence de la ciprofloxacine, de l'azide de sodium à 0,9g11 et de l'hirudine à 0,25 ATU/ml. [0036] Enfin la première composition de réactifs R1 comprend de la streptokinase et un activateur de streptokinase, qui est ici un D-dimère de fibrine. [0037] La deuxième composition de réactifs R2 comprend un substrat de synthèse SPm41 commercialisé par la société Hyphen Biomed qui relargue de la paranitroalanine en présence de plasminogène (plg), de streptokinase et de fibrinogène (ou de fragment DD). R2 peut aussi comprendre un autre substrat dont l'interaction avec l'enzyme (ici le complexe plasminogène-streptokinase) modifie l'absorbance ou la fluorescence du milieu de réaction. [0038] De préférence la deuxième composition de réactifs R2 est tamponnée à un pH acide, de préférence au moyen d'acide tartrique. [0039] Dans une étape (ai-aii), un volume de la première composition de réactifs R1 est mélangé à un volume de solution témoin (cal) ou d'échantillon de plasma dilué (Ech), et l'ensemble est incubé pendant 3 minutes, à 37°C. [0040] Dans une étape (aiii), on ajoute à ce mélange un volume de la deuxième 20 composition de réactifs R2 et l'ensemble est mélangé et incubé pendant 3 minutes à 37°C. [0041] Ensuite, dans une étape (b), l'évolution de la réaction est observée par la modification de l'absorbance ou densité optique (DO) corrélée à la consommation du substrat, ici le SPm41. Dans le cas du SPm41, l'absorbance est mesurée à 405 25 nm. [0042] La variation de l'absorbance (DO) permet de déterminer, dans une étape (c), la teneur en plasminogène (%plg), par exemple par le biais d'une courbe de calibration. [0043] La réaction est, de préférence, ensuite stoppée dans une étape (d) par exemple par l'ajout d'un volume d'acide citrique (H+) à 20 g/1. [0044] Des essais comparatifs de dosages du plasminogène ont été opérés avec du fibrinogène (+fbg) selon l'état de l'art, sans fibrinogène (-fbg), ou avec des substituts du fibrinogène par des dérivés de la fibrine conformément au tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 : Essais avec des substituts du fibrinogène : Méthode sans avec avec un avec un avec un avec un manuelle fibrinogène fibrinogène à 0,7 mg/mi (+fbg) fragment fragment FE à 0,05 mg/ml fragment fragment (WB) (-fbg) FFE à FD à DD à 0,05 0,10mg/m1 0,10mg/m1 mg/ml %Plg : DO (à 405 nm) C (dilution 1/20 = 150%) 0 743 1,577 0,755 0,729 0,825 1,977 ' C:2 0,298 0,742 0,291 0,271 0,304 0,991 C:4 0,113 0,333 0,115 0,114 0,121 0,473 C:8 0,047 0,152 0,049 0,047 0,053 0,210 0 0,003 0,010 0,001 0,005 0,005 0,006 r2 0'985 0,9976 0,9828 0,9792 0,9775 0,9995 (lin-lin) [0045] Dans le tableau 1, la ligne C correspond à un calibreur à une dilution 1/20 pour une concentration en plasminogène de 150%. La ligne C:2 à une dilution de moitié par rapport à la ligne C, et ainsi de suite jusqu'à la ligne C:8. La ligne 0 correspond à un calibreur à une concentration en plasminogène de 0%. La ligne r2 correspond au carré du coefficient de corrélation linéaire des courbes de calibration. [0046] Les courbes de calibration de la figure 2 correspondent aux résultats du tableau 1 ci-dessus. Les ordonnées correspondent aux valeurs de densité optique (DO) à 405 nm, et les abscisses correspondent à la teneur en plasminogène (%plg) Ces courbes ont des références relatives à la présence (+fbg) ou à l'absence (-fbg) de fibrinogène, ou aux différents substituts testés (FFE, FE, FD, DD) aux concentrations mentionnées dans le tableau 1. [0047]Comme on peut le voir sur la figure 2, la courbe de calibration correspondant au test sans fibrinogène (-fbg) est sensiblement superposée à 5 celles des essais de remplacement du fibrinogène par les fragments FFE, FE, FD, de fibrine. [0048] De manière surprenante, il ressort de la figure 2 et du tableau 1 que la courbe (+DD) correspondant au fragment DD de fibrine apparaît de meilleure qualité que la courbe correspondant au fibrinogène entier (+fbg). En effet, le 10 coefficient r2 est de 0,9995 pour DD contre 0,9976 pour l'échantillon (+fbg) ce qui traduit une meilleure linéarité. En outre, la courbe DD est au dessus de la courbe + fbg ce qui traduit une DO supérieure et donc une quantification plus exacte de la teneur en plasminogène. [0049] Des tests de détermination de la teneur optimale en fragment DD ont en 15 outre été opérés conformément au tableau 2 ci-dessous : Tableau 2 : Essais avec différentes teneurs en fragment DD : Méthode manuelle (WB) DDà DDà DDà 100pg/m1 DDà 50pg/m1 DD à 25pg/ml 500pg/m1 200pg/ml %Plg : DO (à 405 nm) C (dilution 2.246 2.125 2.003 1,723 1,433 1/20 = 150%) C:2 1,185 1,132 0,998 0,822 0,640 C:4 0,592 0,560 0,467 0,368 0,257 C:8 0,284 0,264 0,209 0,156 0,112 0 0,001 0,002 0,000 0,000 0,000 r2 (lin-lin) 0,9991 0,9987 0,9995 0,9983 0,9941 [0050] Les courbes de calibration de la figure 3 correspondent aux résultats du tableau 2 ci-dessus. Les ordonnées correspondent aux valeurs de densité optique 20 (DO) à 405 nm, et les abscisses correspondent à la teneur en plasminogène (%plg). Les courbes correspondant au tableau 2 ont ainsi des références relatives à la concentration, en pg/ml, de fragment DD de fibrine dans les différents essais. [0051 ]Comme on peut le voir sur la figure 3 et le tableau 2, une teneur en fragment DD de 100 pg/ml est suffisante pour optimiser le dosage du plasminogène. En effet, avec un r2 à 0,9995, la linéarité est satisfaisante et la courbe est dans une position intermédiaire par rapport à celles correspondant aux autres concentrations en fragment DD. [0052] Par ailleurs, des tests ont été réalisés pour déterminer la teneur optimale en streptokinase dans les deux échantillons de R1 suivant : l'un avec du fibrinogène à 0,7mg/ml dont les résultats sont illustrés au tableau 3 ; et l'autre avec 100 pg/ml de fragment de DD dont les résultats sont illustrés au tableau 4 Tableau 3 : optimum de streptokinase avec 0,7mg/ml de fibrinogène : R1 avec 0,7 mg/ml de fibrinogène / R2 [streptokinase] Ul/m1 % plasminogène r2 (lin/lin) ADO (150- 0%) 150 75 37,5 18,75 0 0 0,044 0,024 0,015 0,010 0,002 0,9944 0,042 5000 1,357 0,597 0,273 0,125 0,023 0,9933 1,334 7500 1,581 0,720 0,333 0,157 0,017 0,9963 1,564 10000 1,697 0,788 0,360 0,175 0,012 0,9974 1,685 12500 1,771 0,843 0,400 0,195 0,016 0,9986 1,755 20000 1,860 0,926 0,455 0,208 0,012 0,9997 1,848 30000 1,877 0,94 0,470 0,234 0,015 0,9999 1,862 [0053]Après analyse de la courbe d'évolution de l'absorbance en fonction de la concentration en streptokinase (non représentée) correspondant au tableau 3, on remarque que dans l'échantillon R1 avec 0,7mg/m1 de fibrinogène, un plateau est observable à partir d'une concentration en streptokinase d'environ 20 000 Ul/ml. Dans le tableau 3, on observe en effet un ADO (150-0%) de 1,848 pour la ligne (2000 Ul/m1) et 1,862 pour la ligne (30 000 Ul/m1). La concentration optimale en streptokinase est ainsi estimée à 20000 Ul/ml, valeur à laquelle la DO n'augmente plus significativement. Tableau 4 : optimum de streptokinase avec 100pg/m1de fragment DD : R1 avec 100pg/m1de fragment DD / R2 [streptokinase] Ul/m1 % plasminogène r2 (lin/lin) ÈDO (150- 0%) 150 75 37,5 18,75 0 0 0,037 0,014 0,006 0,008 0 0,9552 0,037 5000 1,846 0,868 0,386 0,157 0 0,9977 1,846 7500 1,891 0,915 0,418 0,179 0 0,9991 1,891 10000 1,956 0,959 0,444 0,194 0,002 0,9992 1,954 12500 1,986 0,971 0,462 0,207 0 0,9995 1,986 20000 1,979 0,982 0,467 0,222 0 0,9998 1,979 30000 1,961 0,967 0,47 0,219 0 0,9998 1,961 [0054] Comme on peut le voir sur les courbes d'évolution de l'absorbance (DO) en fonction de la concentration en streptokinase ([Strept] en UI/ml) illustrées sur la figure 4, et correspondant au tableau 4, un début de saturation des courbes est observable à partir d'une concentration en streptokinase de 5 000 Ul/ml. Un plateau est observable de manière plus nette sur la figure 4 entre 12500/15000 Ul/ml. Parallèlement, dans le tableau 4, on remarque un ÈDO (150-0%) de 1,954 et 1,986 pour les lignes (12500 et 15000 Ul/m1) et 1,961 pour la ligne (30 000 Ul/m1). La concentration optimale en streptokinase est ainsi estimée entre 12500 et 15000 Ul/ml, de préférence à 15000 Ul/ml. [0055]De manière surprenante, il ressort du tableau 4 et de la figure 4 que lorsqu'on utilise le fragment DD, on a besoin de moins de streptokinase (12500 à 15000 Ul/m1 pour l'échantillon +DD contre 20000 pour l'échantillon +fbg) et on obtient de meilleurs résultats qu'avec le fibrinogène entier. En effet, la saturation de la DO commence à de plus faibles concentrations en streptokinase (5000 Ul/m1). [0056]Sans sortir du cadre de l'invention, l'homme de métier peut adapter le procédé selon l'invention à un dosage basé sur l'urokinase en lieu et place de la streptokinase, avec un activateur correspondant, de préférence un activateur d'urokinase choisi parmi des fragments de fibrine. REVENDICATIONS1 Procédé de dosage du plasminogène dans un échantillon comprenant des étapes consistant à : a- faire réagir i- une streptokinase (R1), et un activateur de streptokinase, ii- avec une solution témoin ou un échantillon de plasma dilué, b- suivre ladite réaction par un moyen de suivi (SPm) de la réaction, c- déterminer la quantité de plasminogène de la solution témoin ou de l'échantillon de plasma dilué, en fonction du résultat du suivi de ladite réaction, le procédé étant caractérisé en ce que l'activateur de streptokinase est stable sous forme liquide et est sélectionné dans le groupe comprenant un fragment DD de fibrine et/ou au moins un dérivé de fragment DD. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a) de réaction est réalisée en présence d'un anticoagulant, de préférence de l'hirudine. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant préalablement à l'étape a) de réaction, une étape de stockage de l'activateur de streptokinase en solution prête à l'emploi. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape de stockage est réalisée à une température comprise entre -20°C et 37°C. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que l'étape de stockage est réalisée pendant une durée supérieure à 12 heures, de préférence comprise entre 24 heures et 30 mois. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de préincubation de la streptokinase (R1), et de l'activateur de streptokinase, à environ 37°C avant ladite étape a) de réaction. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape a) de réaction est réalisée à environ 37°C, de préférence pendant environ 3 à 6 minutes. 10 152. 3. 20 4. 5. 25 6. 7. 30 2 9 79635 12 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'étape a) de réaction est arrêtée par une étape d'acidification, de préférence par ajout d'acide citrique. 9. Composition pour doser du plasminogène présent dans un échantillon, ladite 5 composition comprenant un activateur de streptokinase, caractérisée en ce que l'activateur de streptokinase est sélectionné dans le groupe comprenant un fragment DD de fibrine et/ou au moins un dérivé de fragment DD, et en ce qu'elle peut être stockée sous forme liquide sans évolution dans le temps. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un anticoagulant, de préférence de l'hirudine. 11. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle est en solution prête à l'emploi. 12. Kit de dosage du plasminogène dans un échantillon comprenant une composition selon l'une des revendications 9 à 11. 13. Kit de dosage selon la revendication 12, configure pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 8. 14. Utilisation d'un activateur de streptokinase pour doser du plasminogène dans un échantillon, caractérisée en ce que l'activateur de streptokinase est sélectionné dans le groupe comprenant un fragment DD de fibrine et/ou au moins un dérivé de fragment DD, et en ce qu'il est stable sous forme liquide.