Brevet FR2990954A1 — publié le 20131129

Milieu et procédé de culture et extraction des Archaea méthanogènes La présente invention concerne un nouveau milieu de culture et procédé de culture d'Archaea méthanogène. Les Archaea sont des procaryotes constituant un des quatre domaines de la vie au côté des eukarya, des bactéries et des virus géants à ADN [16]. En particulier, Les Archaea méthanogènes (ci-dessous désignées méthanogènes) sont des Archaea anaérobies stricts. Initialement isolées de l'environnement et en particulier des environnements extrêmes qui leur ont valu leur nom de extrêmophiles, les Archaea ont ensuite été détectées chez différents animaux invertébrés et vertébrés comprenant notamment les oiseaux et les mammifères. Chez les mammifères, ce sont les méthanogènes capables de détoxifier l'hydrogène avec synthèse du méthane qui ont été essentiellement détectées et les méthanogènes donc une importance considérable actuellement puisqu'il est considéré que l'émission de méthane par les bovins de rapport constitue la source essentielle de destruction de la couche d'ozone dans l'environnement. Chez l'homme également, les analyses métagénomiques ont montré la présence de signatures ADN spécifiques de plusieurs espèces d'Archaea qui appartiennent essentiellement aux deux phyla Euryarcheaota et aux Archaea halophiles ; plus particulièrement, les séquences détectées chez l'homme indiquent la présence de Methanosarcina, Thermoplasma, Crenarchaeaota, et des Archaea halophiles ainsi qu'un dernier ordre de méthanogènes [25-30]. Parmi toutes ces Archaea, seules quatre espèces d'Archaea ont été isolées chez l'homme : Methanobrevibacter srnithll [31], Methanosphaera stadtmaniae [32], Methanobrevibacter oralis [5] et Methanornassilicoccus /uminyensis et seuls M. srnithii, M. stadtmanae et M. /uminyensis ont été isolées à partir du tube digestif. Chez l'homme, ces Archaea méthanogènes participent à l'homéostasie de la flore digestive en détoxifiant l'hydrogène avec production de méthane et participent donc à la régulation du pH. Egalement, certaines Archaea sont impliquées en pathologie orale en infection polymicrobienne au cours des parodontopathies. Il a été montré que le portage digestif d'Archaea méthanogènes était constant chez tous les individus [11]. Les Archaea constituent des microorganismes d'intérêt médical et vétérinaire compte tenu de leur rôle en physiologie et éventuellement en pathologie . Le développement de nouvelles techniques de laboratoire pour la culture des anaérobies strictes, y compris la technique de Hungate [1, 2] était un progrès technologique important qui a permis l'isolement et la caractérisation de plusieurs nouvelles espèces de méthanogènes [38]. Cependant, les méthanogènes sont des microorganismes fastidieux dont l'isolement puis la culture exigent des conditions très spécifiques, en particulier une anaérobiose stricte [1, 2, 9]. Par ailleurs, chaque espèce méthanogène demande la préparation d'un milieu de culture spécifique ce qui est extrêmement consommateur de temps et n'est pas compatible avec l'utilisation de tels milieux en routine de laboratoire. Enfin, la croissance des méthogènes est lente (supérieure à 5 jours). La connaissance des conditions nutritives est un facteur important pour la culture des méthanogènes [10]. La présence d'une atmosphère se composant de 80% de H2 et de 20% CO2 est l'un des nombreux besoins on facteurs de croissance pour permettre la prolifération optimale de ces micro-organismes [11]. La croissance de Methanobrevibacter smithii [7] et Methanobrevibacter oralis [5] requièrent du fluide de rumen [10], en apportant peut-être l'acétate, les acides gras à chaînes branchées [12] et le coenzyme M (acide 2- mercaptoethanesulfonic) [13]. Methanosphaera stadtrnanae [8] a le métabolisme énergétique le plus restreint parmi tous les méthanogènes humains, ils produisent du méthane seulement par réduction de méthanol avec H2 et dépendent de l'acétate comme source de carbone [14]. Les inventeurs ont rapporté récemment qu'une solution de sélénite et/ou de tungstate était nécessaire pour la croissance de Methanornassilicoccus /uminyensis [4]. D'autres espèces exigent des acides aminés aromatiques comme le tryptophane, la vitamine thiamine, la pyridoxine, et l'acide p-aminobenzoic (PABA), les acides gras à chaînes branchées, l'acétate [15.16]. Les méthanogènes exigent également une série d'ions métalliques, notamment de nickel [17] qui sont des cofacteurs présents dans la déshydrogénase d'oxyde de carbone F430 [18.19]. La culture de ces micro-organismes est très fastidieuse. Plus précisément, pour isoler M. smithii, les auteurs [31] ont utilisé un échantillon de matières fécales inoculées dans du milieu 1 de Balch (composition indiquée dans le Tableau 2 ci-après) [33], sous une atmosphère de H2-0O2 (80 : 20) pressurisée à 2 atmosphères (202.6 kPa), sous agitation. Après 2 à 3 jours, des échantillons de 0.5 mL de l'atmosphère ont été analysés pour détecter la présence de méthane par chromatographie en phase gazeuse. Des isolats producteurs de méthane et fluorescents pour le facteur-420 (comme déterminé par microscopie en épifluorescence) ont été sous-cultivés sur le milieu 1 de Balch additionné de 2 % d'agar jusqu'à ce qu'une culture pure ait été obtenue; les critères de pureté étaient la morphologie uniforme des cellules, la production de méthane, la fluorescence factor-420 de toutes les cellules et l'absence de croissance dans un milieu complexe (SMS) contenant des hydrates de carbone sans substrat pour la méthanogenèse. Pour isoler M. stadtmanae, les auteurs (5) ont utilisé un milieu de culture El (tableau 3) modifié par l'addition de fluide de rumen à 30% (v/v), de clindamycine et de céphalothine, respectivement, de 0.4% méthanol et d'une atmosphère composée de N2, 80% et CO2, 20% . La culture a été maintenue par des transferts mensuels (10% vol.) dans le même milieu. Une morphologie sphérique brillante par fluorescence du facteur-420 était le morphotype dominant. Au jour 60, la culture a été sous-cultivé dans le milieu 1 de Balch modifié par ajout de fluide de rumen, NH4CI, cepthalothine et clindamycine (7) avec du méthanol sous une atmosphère de 80% H2 : et CO2, 20%. Une culture pure d'une Archaea méthanogène, a été obtenue. Pour isoler M. oralis, les auteurs ont utilisé sensiblement le même milieu de culture que celui utilisé pour isoler M. smithii (9). Pour isoler M. luminyensis, les inventeurs ont rapporté récemment qu'une supplémentation en méthanol du milieu de culture était nécessaire pour la croissance de l'Archaea Methanomassilicoccus luminyensis [4]. Mais, ces conditions n'étaient pas suffisantes pour permettre le dépôt de la souche dans une collection de dépôt. Dans la demande de brevet en France non publiée, n°11 56069, les inventeurs ont réussi à cultiver la bactérie M. /uminyensis en rajoutant des concentrations plus importantes de méthanol et d'une solution de sélénite/tungstate, ce qui a permis de déposer la souche M. luminyensis à la collection de dépôt de microorganisme DSMZ (Allemagne) sous le numéro DSM 24529. Le but de la présente invention était de fournir une nouvelle composition de milieu de culture avec pour objectif de mettre au point un même et unique milieu de culture permettant (1) la culture de tous les Archaea méthanogènes, et (2) de réduire sensiblement le délai de culture des Archaea méthanogènes. Pour ce faire, les inventeurs ont déterminé des milieux et conditions spécifiques d'isolement et culture de dites Archaea méthanogènes permettant d'isoler et établir en culture rapidement toutes les Archaea méthanogènes, notamment Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter oralis, Methanosphaera stadtmanae, Methanomassilficoccus luminyensis, Methanobacterium beijingense et Methanosaeta conclu, Methanosarcina acetivorans. Plus précisément, la présente invention a pour objet un milieu de culture stérilisé utile pour la culture des Archaea comprenant un milieu de base de culture d'Archaea méthanogène, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les composants suivants : a- sel de sélénite à une concentration de 5.10-3 mM à 0,5 mM, de préférence 5.10-2 à 0,5 mM, et b- sel de tungstate à une concentration de 5.10-3 mM à 0,5 mM, de préférence 5.10-2 à 0,5 mM, et c- sel de molybdate à une concentration de 10-3 à 10-2 mM, d- sel de nickel à une concentration de 10-3 à 10-2 mM, et e- méthanol à une concentration d'au moins 10 mM, de préférence de 10 à 100 mM. De préférence, ledit milieu de culture comprend une concentration de 10 à 50 mM de méthanol. Plus particulièrement, le milieu selon la présente invention comprend les composants suivants : a- sel de sélénite Na2Se03, à une concentration de 0,001 mg/I à 0,1 mg/I, de préférence 0,01 à 0,1 mg/I, de préférence encore 0,015 mg/I, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Se03.5H20, et b- sel de tungstate Na2W04, à une concentration de 0,001 mg/I à 0,1 mg/I, de préférence encore 0,02 mg/I, de préférence encore sous 20 forme d'hydrate Na2W04.2H20, c- sel de molybdate Na2Mo04, à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/I, de préférence 0,02 mg/I, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Mo04.2H20, et d- sel de NiCl2 à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/I, de 25 préférence 0,7 mg/I, de préférence sous forme d'hydrate NiCl2.6H20. Selon une autre caractéristique particulière, le milieu de culture selon l'invention comprend en outre le composant suivant : f- sel de formate, à une concentration molaire de 1 mM à 10 mM, de préférence 6 mM, plus particulièrement NaHCO2 à une concentration de 0,1 à 1 g/I, de préférence 0,4 g/1. De préférence, le milieu de culture comprend en outre des acides gras volatiles (ci-après abrégés "AGV") à une concentration molaire de 1 à 10 mM, de préférence de 5 à 7 mM pour chacun desdits acides gras volatiles. Plus particulièrement, les acides gras volatiles sont des acides gras à chaînes carbonées courtes, de moins de 6 atomes de carbone, plus particulièrement de 4 à 6 atomes de carbone, plus particulièrement encore les acides gras choisis parmi les acide valérique (C5H1002), acide isovalérique (C5H1002), acide 2- méthylbutyrique (C5H1002), acide isobutyrique (C4H802), acide 2- méthylvalérique (C6H1202). Dans les valeurs de concentration ci-dessus : 1 M = 1 mol/I Plus particulièrement, ledit milieu de base de culture d'Archaea comprend au moins : - plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisie parmi un extrait de levure, un sel d'acétate, un sel de formate et une peptone trypsique, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, - une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, - au moins un sel de chacun des métaux K, Mg, Na, Ca, de préférence NaCI, - une substance réductrice, plus particulièrement choisie parmi la cystéine-HCI et Na2S, - une substance tampon régulateur de pH de 7 à 7,5, de préférence KOH3 pour ajuster le pH à 7,5, - des oligoéléments, de préférence des sels choisis parmi des sels de Fe, Ni, W, Se, Mo, Mn, Cu, Zn, B, Co, de préférence encore des oligoéléments de Widdel, - des vitamines, de préférence les vitamines du milieu de Balch, - de préférence, un indicateur d'oxydoréduction pour contrôler l'anaérobie, de préférence la résazurine. Les oligoéléments de Balch sont listés au tableau 4 ci-après et comprennent NaCI, FeSO4, ZnSO4, MgSO4, MnSO4, CoSO4, H3B03, NiCl2, Na2MoO4, CaCl2. Les oligoéléments de Widdel sont listés au tableau 5 ci-après et 15 comprennent FeCl2, CoCl2, MnCl2, ZnCl2, H3B03, Na2MoO4, NiCl2 et CuC12. Les vitamines du milieu de Balch sont listées au tableau 6 ci-après et comprennent la biotine, acide folique, hydrochlorure de pyridoxine, hydrochlorure de thiamine, riboflavine, acide nicotinique, 20 pantothénate de DL-calcium, vitamine B12, Acide p-aminobenzoïque, acide lipoique. Plus particulièrement, ledit milieu de culture selon l'invention contient les espèces suivantes : KH2PO4, K2PO4, MgSO47H2O, NaCI, KCI, KOH, NH4CI, CaC12.2H20, KOH, NaCOOCH3 cystéine, extrait de levure, 25 trypticase peptone, NaOH, NaHCO2, CH3OH, Na2S, NaHCO3, NaHCO2, Na2Se03.5H20, Na2W04.2H20, Na2Mo04-21-120, NiC12-6H20, FeSO4.7H20, des oligoéléments de widdel, des vitamines de Balch et de préférence résazurine; le pH étant ajusté à 7,5. Plus particulièrement encore, le milieu selon la présente invention comprend les composants suivants aux concentrations suivantes : NiCl2 x 6H20 0,07 mg/I Na2MoO4 x 2H20 0,02mg/I FeSO4 x 7H20 0,2 mg/I MgSO4 x 7H20 0,01 g/I K2HPO4 0,5 g/I KH2PO4 0,5 g/I KCI 0,05 g/I CaCl2 0,05 g/I NaCI 1,5 g/I NH4CI 1 g/I Na-Acétate 1 g/I Extrait de levure 1 g/I Biotrypticase 1 g/I L-Cystéine, HCI 0,5 g/I Solution d'oligoéléments de 2 m1/1 Widdel Solution d'oligoéléments de 10 m1/1 Balch Résazurine 1 mg/I Na2Se2O3.5H20 0,015 mg/I Na2WO4.2H20 0,02 mg/I NiC12.6H20 0,07 mg/I NaHCO3 4 g/I Na2S 0,5 g/I Na-Formate 0,4 g/I Methanol 40 mM Solution de vitamines de 10 m1/1 milieu de Balch Acide valérique 0,6 g/I Acide isovalérique 0,6 g/I Acide 2-méthylbutyrique 0,6 g/I Acide isobutyrique 0,6 g/I Acide 2-méthylvalérique 0,6 g/I Le milieu de culture selon l'invention peut se trouver à l'état liquide auquel cas il comporte de l'eau distillée ou dans un état lyophilisé apte à être régénéré par ajout d'eau distillée ou encore à l'état solide, notamment sous forme gélosée, plus particulièrement par ajout d'agar, plus particulièrement agar à 2% final. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture stérilisé selon l'invention caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles: 1- on place un dit milieu de culture ne contenant pas les composants susceptibles d'être dégradé par chauffage comprenant ledit méthanol, desdites vitamines, des sels de sodium labiles comprenant Na HCO2, Na HCO3 et Na2S et, le cas échéant, lesdits acides gras volatiles (AGV), ci-après dénommé "milieu de culture incomplet", sous atmosphère d'anaérobie, de préférence sous un flux d'azote, dans au moins un tube étanche, et on scelle ledit tube, et 2- de préférence, l'atmosphère gazeuse dudit tube étanche est remplacée par un mélange N2/CO2 à 80/20%, et 3- on stérilise par chauffage ledit milieu de culture incomplet, de préférence dans un autoclave, une température supérieure à 100°C pendant au moins 15 mn, et 4- on refroidit ledit milieu de culture incomplet à température ambiante et on ajoute dans ledit milieu de culture incomplet, lesdits composants susceptibles d'être dégradés par stérilisation dans un autoclave comprenant le méthanol, lesdites vitamines, lesdits sels de sodium labiles comprenant Na HCO3, Na HCO2 et Na2S. Plus particulièrement, la température à l'étape 3 ci-dessus est de 120°C pendant au moins 20 minutes ou 110 °C pendant au moins 45 20 minutes. La présente invention a également pour objet un procédé de culture d'une Archaea avec un milieu de culture selon l'invention dans lequel on réalise les étapes successives suivantes : 1- on inocule un échantillon biologique susceptible de contenir 25 une dite Archaea dans ledit milieu de culture en anaérobie, de préférence sous atmosphère d'azote, et 2- on place ledit milieu de culture sous une atmosphère d'anaérobiose et contenant au moins 50% d'hydrogène à une pression inférieure à 2 atm, et 3- on réalise une incubation à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C pour atteindre une phase exponentielle de croissance avec dégagement de méthane en au moins 1 jour, de préférence en pas plus de 15 jours, de préférence encore pas plus de 7 jours. De préférence, à l'étape 2, ledit milieu de culture est placé sous une atmosphère composée H2/CO2 dans une proportion volumique de 80/20% à une pression de 1 à 2 atm. Les milieux et procédé de culture ci-dessus ont permis d'établir en culture ladite Archaea c'est-à-dire que celle-ci peut ainsi être sous cultivée indéfiniment. Plus particulièrement, il est possible d'obtenir une culture en phase exponentielle de croissance en 1 à 10 jours, de préférence pas plus de 7 jours, cette phase de croissance se caractérisant par : (1) une production de méthane d'au moins 10 pM, tel que déterminé par chromatographie en phase gazeuse, et (2) une visualisation au microscope à fluorescence de microorganismes sphériques d'une taille de 0,5 à 1 pm, et auto fluorescents à 420 nm. Plus particulièrement, on réalisera les sous-cultures par repiquage à 1/10 de la culture en dite phase de croissance. Enfin, la présente invention a également un procédé de détermination de la présence d'une Archaea dans un échantillon biologique, de préférence dans un échantillon de selles animales ou humaines selon l'invention ou d'une Archaea cultivée selon le procédé de l'invention caractérisé en ce que l'on extrait l'ADN dudit échantillon biologique et on détecte et de préférence on quantifie spécifiquement l'ADN de ladite Archaea par amplification enzymatique du type PCR de - 12 préférence du type PCR en temps réel avec un couple d'amorces et de préférence une sonde de séquences tirées du gène 16S ADNr. Les inventeurs ont découvert que les méthodes d'extraction mises en oeuvre dans l'état de la technique pour extraire l'ADN des selles n'étaient pas suffisamment efficaces pour conduire à des résultats fiables en termes de quantification, en particulier lorsque l'on cherche à quantifier des procaryotes de type Archaea à parois épaisses. La présente invention fournit donc un protocole automatisé très performant d'extraction des ADN d'Archaea, performante, reproductible et facile à mettre en oeuvre en routine de laboratoire afin de faciliter l'analyse d'un grand nombre d'échantillon dans un but tant diagnostique qu'épidémiologique, permettant l'extraction de la totalité des ADN. Pour ce faire, les inventeurs ont mis au point une technique 15 d'extraction semi automatisée de l'ADN en alternant lyse mécanique et lyse enzymatique avec au moins deux lyses mécaniques. Les inventeurs ont optimisé toutes les étapes d'extraction de la lyse des bactéries jusqu'au choix de la méthode d'extraction qu'elle soit manuelle ou automatique, en tenant compte de l'efficacité et de la reproductibilité 20 de la méthode. Enfin, les inventeurs ont comparé la technique d'extraction retenue avec celle utilisée par les principaux auteurs qui ont publiés sur ce sujet, comme décrit dans l'exemple 2. Plus précisément, selon la présente invention, pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit échantillon de selles, on réalise 25 les étapes dans lesquelles : 1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, à une dilution de 0,01 à 1 g/I, de préférence à une dilution 0,2 g/ml, et 2) on réalise une lyse mécanique automatisée par mélange et 30 agitation de ladite suspension de l'étape 1) avec un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, dans un appareil réalisant une forte agitation, notamment par rotation multidirectionnelle. 3) de préférence encore, on chauffe la suspension obtenue à au moins 100°C pendant au moins 10 minutes, et 4) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et agitation du surnageant de la suspension obtenue à l'étape 2) ou 3) avec un ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatique, puis 5) on répète l'étape 2) de lyse mécanique mais avec le mélange obtenu à l'étape 4), et 6) de préférence, on répète l'étape 4) de lyse chimique et/ou enzymatique avec le mélange obtenu à l'étape 5). De façon connue, on sépare in fine l'ADN soit avec des méthodes connues telles que par fixation sur une colonne contenant du silicate puis lavage pour éluer ladite ADN en le séparant de la colonne ou par lavage et centrifugation pour récupérer lesdits fragments d'ADN. La réalisation de la première étape de lyse mécanique permet d'optimiser et de favoriser le travail d'agents chimiques ou enzymatiques de lyse à l'étape 2) en favorisant leur pénétration dans les micro-organismes procaryotes permettant de dégrader partiellement les parois épaisses des micro-organismes procaryotes à paroi épaisse, et la dégradation totale des parois épaisses est obtenue seulement par au moins une deuxième lyse mécanique après ladite première lyse chimique ou enzymatique. A l'étape 3), le chauffage permet de finaliser la dégradation des 25 composants des parois et membranes des microorganismes. Plus particulièrement, on réalise les étapes suivantes : a) 1 gramme de selles a été suspendu dans 5 ml d'une solution de Tris-HCL 0.05 M à pH 7,5, et b) des aliquots de la suspension ont été transférés dans un tube Eppendorf stérile contenant de la poudre de billes de verre lavées à l'acide et agités pour réaliser une lyse mécanique dans un dit appareil à rotation multidirectionnelle, tel qu'un appareil FastPrep-24 Instrumente (MP Biomédicale Europe Illkirch, France) à vitesse 6,5 m/s pendant 90 secondes, et c). Le surnageant a été incubé durant la nuit à 56°C avec un tampon de lyse chimique du kit d'extraction d'ADN d'EZ1® et un tampon de lyse enzymatique comprenant une Protéinase K, et d) Après un deuxième cycle de lyse mécanique comme décrit ci- dessus en b), le surnageant a été incubé pendant 10 minutes à 100°C et l'ADN total a été alors extrait en utilisant l'extracteur EZ1, et le kit d'extraction d'ADN d'EZ1® (Qiagen, Courtaboeuf, France) selon le procédé du fabricant. Enfin, la présente invention fournit un kit utile pour un procédé selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend : - des réactifs d'extraction d'ADN comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et des réactifs de lyse chimique et/ou enzymatique, notamment un tampon de lyse chimique du kit d'extraction d'ADN d'EZ1® et un tampon de lyse enzymatique comprenant une Protéinase K, - des réactifs d'amplification d'ADN comprenant des amorces et sonde de détection de dite Archaea méthanogène. De préférence, on met en oeuvre des réactions d'amplification et quantification par PCR en Temps Réel, à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques. La technique de PCR en Temps Réel, consiste en une PCR classique en utilisant des amorces de séquence directe et inverse, et comprend une détection du produit amplifié basée sur la mesure d'émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés avec une sonde dite « d'hydrolyse ». Pour cela, ladite sonde est marquée par un émetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant l'émission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence émise lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont séparés, l'émission de fluorescence n'est plus absorbée par l'agent bloquant. Lors de son passage, la Taq polymérase entraîne une hydrolyse de la sonde et donc une libération des nucléotides et du fluorophore en solution. L'émission de fluorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier, cette hydrolyse permettant l'émission de fluorescence, laquelle permet une quantification. Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec des fluorophores différents. De préférence encore, on met en oeuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries ou espèce procaryote dont les concentrations sont quantifiées. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur un même fragment nucléique permet de quantifier des cibles différentes dans un même échantillon et de les coquantifier de façon homogène, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'une détermination à l'autre au cours du temps et évite les biais liés au témoin positif. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'->3'. On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR. La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le 10 quantifier par comparaison de l'intensité du signal avec celui du standard de quantification. On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la 15 réaction de PCR. Dans les méthodes de quantification d'ADN pour PCR en Temps Réel, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination par le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pour résoudre ce problème, 20 un site de coupure par un enzyme de restriction est avantageusement introduit dans au moins une des cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séquence naturelle. Donc, par coupure enzymatique et analyse du fragment amplifié sur gel d'agarose, ou en utilisant une sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiquement le site de 25 restriction, on peut ainsi détecter la présence éventuelle du plasmide contaminant. Ainsi, on peut mettre en oeuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles : 1. on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type 30 PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents, dans l'ADN extrait desdits échantillons selon l'invention à tester et dans l'ADN de l'échantillon standard d'étalonnage, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ladite séquence spécifique modifiée; 2. on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et 3. on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de standard d'étalonnage, par l'une au moins des étapes suivantes : 3a. on réalise une digestion enzymatique du produit de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse 15 sur gel d'agarose du produit de digestion en comparaison avec le produit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction. Si le fragment digéré provient de l'amplification de la cible moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'une taille inférieure au fragment non digéré. 20 3b. on réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'une des cibles moléculaires, et une sonde spécifique de ladite séquence exogène contenant le site de restriction. Seul un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la 25 séquence exogène pourra être amplifié. Avantageusement encore, on réalise des réactions d'amplification et de quantification en mettant en oeuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hydrolyse spécifiques de chacune des différentes bactéries dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries à tester, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, telle que une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce dans une réaction d'amplification du type PCR desdites séquences spécifiques. Avantageusement encore, on met en oeuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées ou non de chacune desdites séquences spécifiques desdites bactéries avec le même grand fragment d'ADN synthétique étalon, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différentes dites bactéries et lesdites amorces pouvant être mises en oeuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le 15 même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic et suivi du taux d'Archaea méthanogène dans les prélèvements de selles selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend : 20 - des échantillons d'ADN standard d'étalonnage à une concentration connue comprenant desdites séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, et de préférence encore un dit grand fragment d'ADN synthétique 25 regroupant desdits séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, ainsi que - desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdites bactéries et de préférence 30 encore, desdites sondes tels que définis ci-dessus, et - des réactifs de mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation. La figure 1 représente un histogramme présentant les délais de culture en jours (en ordonnée) de neuf Archaea (en abscisse) dans un milieu de référence DSMZ (gris clair) et le milieu SAB (gris foncé). La figure 2 représente un histogramme présentant les délais de culture en jours (en ordonnée) de neuf Archaea (en abscisse) dans un milieu SAB de l'exemple 1 (gris foncé) et dans un milieu SAB-fat de l'exemple 2 (gris clair). Exemple 1. Développement d'un milieu SAB. Pour tester différentes compositions de milieu, les inventeurs ont 15 cultivé les méthanogènes suivants: M. smithii ATCC 35061T DSMZ 861, M. smithii DSMZ 2374, M. smithii DSMZ 2375, M. smithii DSMZ 11975, M. oralis DSMZ, M, stadtmanae ATCC 43021T DSMZ 3091, Methanobacterium beijingense DSMZ 15999 [6] et Methanosaeta conci/ii DSMZ 2139 [20], achetés auprès de la collection allemande de micro- 20 organismes et de cultures de cellules DSMZ (Brunswick, Allemagne). Le milieu liquide 119 (tableau 1A ci-après) a été employé pour cultiver M. smithii et de M. beijingense. La culture M. oralis a été réalisée sur milieu liquide 119 (http://www.dsmz.de) modifié par l'addition de 1g d'extrait de levure et sous une atmosphère de H2/CO2 25 (80%/20%) sous une pression de 2,5 bars. Le milieu 332 (tableau 1B ci-après) (http://www.dsmz.de) a été employé pour cultiver M. stadtmanae et le milieu 334c (tableau 1C ci-après) (http://www.dsmz.de) pour cultiver M. conci/ii à 37°C dans des tubes de Hungate (Dutscher, Issy-les-Moulineaux, France) sous une 30 atmosphère de 2 bars de H2/CO2 (80%-20%) avec agitation. M. /uminyensis (DSMZ 24529) a été cultivé en utilisant le milieu 119 modifié par l'addition de la solution de méthanol et de sélénite/tungstate avec agitation sous une atmosphère H2/CO2 (80%/20%) de 2 bars (tableau 1D ci-après). Le milieu de culture optimal dérivé du milieu 119 contenait en g/I: KH2PO4 (0,5), MgSO4 x 7H20 (0,4), NaCI (5), NH4CI (1), CaCl2 x 2 H20 (0,05), Na-acétate (1,6), cystéine-HCI (0,5), extrait de levure (1), trypticase peptone (1), solution d'oligo-éléments de Widdel (1 m1/1) (tableau 6), 2 m1/1 de solution de Sélénite-Tungstate NaOH (0,4 g/1), Na2Se03.5H20 (3 mg/1) (tableau 7), Na2W04.2H20 (4 mg/1), resazurine (0,001 g/1) et de l'eau distillée (qsp); le pH est ajusté à 7,5 avec du KOH (10 M) avant autoclavage. Le milieu est porté à ébullition sous N2 gaz pour éliminer le maximum d'oxygène et refroidit à température ambiante. Le milieu est distribué dans des tubes Hungate de 5 ml ou 15 dans des flacons en anaérobiose obtenue par le mélange N2/CO2 (80:20, v/v) à la pression atmosphérique. Le rajout d'un mélange N2+CO2 dans des cultures de microorganismes permet, de façon connue, d'établir l'anaérobiose et fournir le CO2 aux anaérobies qui le métabolisent comme source de carbone. Les tubes et/ou flacons sont 20 ensuite autoclaves pendant 45 minutes à 110 °C. Après autoclavage, le milieu est supplémenté par du NaHCO3 (4 g/1), du Na2S x 9H20 (0,5 g/1), du Na-formate (2 g/1) et de 10 m1/1 d'une solution de vitamines de Balch (tableau 6) (Balch et al., 1979). Enfin, le méthanol est rajouté (40 mM) avec un mélange gazeux composé de H2/CO2 (80/20) à une 25 pression de 1 bar seulement constituant l'atmosphère à la surface de la culture Le mélange gazeux composé par du H2/CO2 (80/20) à 1 bar de pression est introduit dans la culture en barbotage par une aiguille stérile jusqu'à disparition totale des bulles, le contenu du tube est alors à 1 bar de pression de H2/CO2 (80/20). 30 Les inventeurs ont par ailleurs développé un milieu de culture original polyvalent, appelé ci-après milieu SAB ayant un effet sur la croissance des Archaea méthanogènes. Pour ce faire, les inventeurs ont découvert que le milieu 119, modifié par du méthanol et une solution de sélénite/tungstate (tableau 7), était avantageusement supplémenté par différents ingrédients, notamment des oligo-métaux Fe, Ni, Mo et Mg, Mn, Cu et Zn tels que décrits dans le tableau 1, permettant notamment d'obtenir des croissances plus rapides de toutes les Archaea méthanogènes Methanobrevibacter testées. Ce milieu SAB était préparé de la façon suivante. Le milieu de culture est bouilli sous flux d'azote, dans un récipient fermé avec un papier d'aluminium jusqu'à ce qu'il devienne transparent (l'indicateur d'oxydoréduction dans ce cas la résazurine, est de couleur rose, elle devient transparente après réduction par ébullition sous flux d'azote). Il est ensuite refroidi à température ambiante et rincé avec du N2 ou un mélange 80% N2/ 20% CO2. Toutes les solutions doivent être préparées sous une atmosphère strictement anaérobie, notamment sous un flux N2/CO2 (remplaçant l'oxygène) [9,21]. Le pH doit être ajusté avec du KOH 10 M pour obtenir un pH final de 7.5. Le milieu est réparti dans des tubes de Hungate, puis il est autoclavé à 120°C pendant 40 minutes sous une pression de 2 bar, puis refroidi à température ambiante. Le milieu de culture incomplet comprenait les éléments suivants du tableau 1 : Quantités par litre de H20 NiCl2 x 6H20 0,07 mg Na2Mo04 x 2H20 0,02mg FeSO4 x 7H20 0,2 mg MgSO4 x 7H20 0,01 g K2HPO4 0,5 g KH21304 0,5 g KCI 0,05 g CaCl2 0,05 g NaCI 1,5 g NH4CI 1 g Na-Acétate 1 g Extrait de levure 1 g Biotrypticase 1 g L-Cystéine, HCI 0,5 g Solution d'oligoéléments de 2 ml Widdel (cf. tableau 5) Solution d'oligoéléments de 10 ml Balch (cf. tableau 4) Résazurine 1 mg Na2Se203.5H20 0,015 mg Na2W04.2H20 0,02 mg NiCl2.6H20 0,07 mg Après autoclavage, le milieu est supplémenté par les éléments suivants : NaHCO3 4 g/I Na2S.9H20 0,5 g/I Na-Formate 0,4 g/I Méthanol 40 mM Vitamines tableau 6) de Balch(cf. 10 m1/1 La culture est incubée sous une atmosphère utilisant le mélange 80% de H2 + 20% de CO2 à 2 bars. La culture a été réalisée dans des tubes de Hungate (Dutscher, Issy-les-Moulineaux, France) incubés à 37°C sous agitation. La croissance des méthanogènes était vérifiée quotidiennement par observation au microscope optique et par la mesure parallèle de la production de méthane utilisant un chromatographe en phase gazeuse GC-8A (Shimadzu, Champs-sur-Marne, France) équipé d'un détecteur de conductivité thermique, d'un injecteur et d'une colonne de la maille SP100 de Chromosorb WAW 80/100 (Alltech, Carquefou, France). Le N2 à une pression du kPa 100 était employé comme gaz vecteur. La température du détecteur et de l'injecteur étaient 200°C et la température de la colonne de 150°C. Les inventeurs ont utilisé la croissance de chaque souche de méthanogène dans le milieu de culture DSMZ approprié comme témoin positif et des tubes contenant le même milieu de culture non-inoculé comme témoins négatifs. Ils ont comparé le délai de croissance de chaque souche de méthanogène dans les milieux de référence standards et dans le SAB-milieu. Les expériences ont été faites en triple. Les témoins négatifs sont tous restés stériles. Toutes les souches de méthanogènes testées ont cultivé dans leur milieu de référence sans exception. Toutes les souches de méthanogènes testées ont cultivé dans le milieu SAB sans exception. Les résultats obtenus sont présentés sur l'histogramme de la figure 1 et montrent que le délai de culture est toujours plus court dans le milieu SAB que dans le milieu de référence. Le délai de croissance pour arriver en phase de croissance exponentielle de M. smithii était différent selon le phylotype observé. En effet, M. smithii DSMZ 2374 et M. smithii DSMZ 2375 arrivent en phase exponentielle de croissance après 24 heures d'incubation dans le milieu SAB contre trois jours dans le milieu DSMZ 119. La souche M. smithii ATCC 35061T cultive après 3 jours d'incubation dans le milieu SAB contre 7 jours dans le milieu DSMZ 119. La souche M. smithii DSMZ 11975 cultive après 7 jours d'incubation dans le SAB-milieu contre 10 jours dans le milieu de 119 DSMZ. La souche M. oralis 7256 cultive après 5 jours d'incubation dans le milieu SAB contre 10 jours dans le milieu de 119 DSMZ modifié du tableau 1D. La souche de M. stadtmanae ATCC 43021T cultive après 24 heures d'incubation dans le 15 milieu SAB contre 3 jours dans le milieu 322 DSMZ. La souche M. /uminyensis DSMZ 24529 cultive après 5 jours d'incubation dans le milieu SAB contre 7 jours dans le milieu 119 DSMZ modifié. La souche M. beijingense DSMZ 15999 se développe après 24 heures d'incubation dans le milieu SAB contre 3 jours dans le milieu 119 DSMZ. La souche 20 M. conci/ii DSMZ 2139 cultive après 3 jours d'incubation dans le milieu SAB contre 7 jours dans le milieu 334c DSMZ. Ces résultats montrent que les inventeurs ont mis au point un milieu répondant aux deux objectifs qu'ils s'étaient fixés, à savoir un milieu de culture supportant la croissance de tous les méthanogènes et 25 par ailleurs, un milieu permettant de raccourcir le délai de culture de ces méthanogènes. Le temps de préparation d'un tel milieu étant plus court que le temps de préparation de chacun des milieux de référence séparément, un tel milieu peut être introduit pour la culture en routine des Archaea méthanogènes au laboratoire de microbiologie. 30 Les milieux 119, 332 et 334 sont décrits aux tableaux 1A, 1B et 1C ci-après. Exemple 2. Développement d'un milieu SAB+fat. Le milieu liquide SAB précédemment décrit dans l'exemple 1, (tableau 1) a été encore complété pour cultiver toutes les souches citées ci-dessus, en développant un milieu de culture original polyvalent, appelé ci-après milieu SAB+fat ayant un effet sur la croissance des Archaea méthanogènes. Les inventeurs ont, en effet, découvert que le milieu SAB du tableau 1 de l'exemple 1 était avantageusement supplémenté par un mélange d'acides gras volatiles tels que décrits dans le tableau 2 ci-après, permettant notamment d'obtenir des croissances plus rapides de toutes les Archaea méthanogènes Methanobrevibacter testées. Ce milieu SAB+fat était préparé de la façon suivante. Le milieu de culture est bouilli sous flux d'azote, dans un récipient fermé avec un papier d'aluminium jusqu'à ce qu'il devienne transparent (l'indicateur d'oxydoréduction dans ce cas la résazurine, est de couleur rose, elle devient transparente après réduction par ébullition sous flux d'azote). Il est ensuite refroidi à température ambiante et rincé avec du N2 ou un mélange 80% N2/ 20% CO2. Toutes les solutions doivent être préparées sous une atmosphère strictement anaérobie, notamment sous un flux N2/CO2 (remplaçant l'oxygène) [9,21]. Le pH doit être ajusté avec du KOH 10 M pour obtenir un pH final de 7.5. Le milieu est réparti dans des tubes de Hungate, puis il est autoclavé à 120°C pendant 40 minutes sous une pression de 2 bar, puis refroidi à température ambiante. Le milieu de culture incomplet SAB+fat comprenait les éléments suivants du tableau 2 : Quantités par litre de H20 NiCl2 x 6H20 0,07 mg Na2Mo04 x 2H20 0,02mg FeSO4 x 7H20 0,2 mg MgSO4 x 7H20 0,01 g K2HPO4 0,5 g KH2PO4 0,5 g KCI 0,05 g CaCl2 0,05 g NaCI 1,5 g NH4CI 1 g Na-Acétate 1 g Extrait de levure 1 g Biotrypticase 1 g L-Cystéine, HCI 0,5 g Solution d'oligoéléments de 2 ml Widdel (cf. tableau 5) Solution d'oligoéléments de 10 ml Balch (cf. tableau 4) Résazurine 1 mg Na2Se203.5H20 0,015mg Na2WO4.2H20 0,02mg NiCl2.6H20 0,07mg Après autoclavage, le milieu est supplémenté par les éléments suivants : NaHCO3 4 g/I Na2S.9H20 0,5 g/I Na-Formate 0,4 g/I Methanol 40 mM Vitamines (cf. tableau 6) 10 m1/1 Acide valérique 5,88 mM (0,6 g/1) Acide isovalérique 5,88 mM (0,6 g/1) Acide 2- Méthylbutyrique 5,88 mM (0,6 g/1) Acide isobutyrique 6,81 mM (0,6 g/1) Acide 2- Méthylvalérique 5,16 mM (0,6 g/1) La culture est incubée sous une atmosphère utilisant le mélange 80% de H2 + 20% de CO2 à 2 bars. La culture a été réalisée dans des tubes de Hungate (Dutscher, Issy-les-Moulineaux, France) incubés à 37°C sous agitation. La croissance des méthanogènes était vérifiée quotidiennement par observation au microscope optique et par la mesure parallèle de la production de méthane utilisant un chromatographe en phase gazeuse GC-8A (Shimadzu, Champs-sur-Marne, France) équipé d'un détecteur de conductivité thermique, d'un injecteur et d'une colonne de la maille SP100 de Chromosorb WAW 80/100 (Alltech, Carquefou, France). Le N2 à une pression du kPa 100 était employé comme gaz vecteur. La température du détecteur et de l'injecteur étaient 200°C et la température de la colonne de 150°C. Les inventeurs ont utilisé la croissance de chaque souche de méthanogène dans le milieu de culture SAB-milieu et des tubes contenant le même milieu de culture non-inoculé comme témoins négatifs. Ils ont comparé le délai de croissance de chaque souche de méthanogène dans les milieux de référence standards et dans le SAB+fat-milieu. Les expériences ont été faites en triple. Les témoins négatifs sont tous restés stériles. Toutes les souches de méthanogènes testées ont cultivé dans le milieu SAB sans exception. Toutes les souches de méthanogènes testées ont cultivé dans le milieu SAB+fat sans exception. Les résultats obtenus sont présentés sur l'histogramme de la figure 2 et montrent que le délai de culture est comparable ou plus court dans le milieu SAB+fat que dans le milieu SAB. Le délai de croissance pour arriver en phase de croissance exponentielle de M. smithii était différent selon le phylotype observé. En effet, M. smithii DSMZ 2374 et M. smithii DSMZ 2375 arrivent en phase exponentielle de croissance après 24 heures d'incubation dans les deux millieux testés. La souche M. smithii ATCC 35061T cultive après 2 jours d'incubation dans le milieu SAB+fat contre 3 jours dans le milieu SAB. La souche M. smithii DSMZ 11975 cultive après 5 jours d'incubation dans le SAB-fat contre 7 jours dans le milieu SAB. La souche M. oralis 7256 cultive après 4 jours d'incubation dans le milieu SAB+fat contre 5 jours dans le milieu SAB. La souche de M. stadtmanae ATCC 43021T cultive après 24 heures d'incubation dans les deux milieux de cultures testés. La souche M. /uminyensis DSMZ 24529 cultive après 3 jours d'incubation dans le milieu SAB-fat contre 5 jours dans le milieu SAB. La souche M. beifingenseDSMZ 15999 se développe après 24 heures d'incubation dans les deux milieux de cultures testés. La souche M. conci/ii DSMZ 2139 cultive après 3 jours d'incubation dans les deux milieux de cultures testés. Ces résultats montrent que les inventeurs ont mis au point un milieu répondant aux deux objectifs qu'ils s'étaient fixés, à savoir un milieu de culture supportant la croissance de tous les méthanogènes et par ailleurs, un milieu permettant de raccourcir le délai de culture de ces méthanogènes. De surcroît, le temps de préparation d'un tel milieu étant plus court que le temps de préparation de chacun des milieux de référence séparément, un tel milieu peut être introduit pour la culture en routine des Archaea méthanogènes au laboratoire de microbiologie. Exemple 3. Extraction semi-automatisée de l'ADN des méthanogènes. Les inventeurs ont précédemment mis au point une technique d'extraction de l'ADN des méthanogènes à partir de prélèvements cliniques, en particulier de prélèvements de selles (34), 2009). Cependant, ce protocole repose uniquement sur des étapes manuelles, rendant ce protocole difficilement utilisable en routine de laboratoire. Ici, les inventeurs ont tenté d'automatiser tout ou partie de ce protocole afin de réduire le temps de travail et de mettre en place un protocole compatible avec une utilisation en routine. Dans ce but, les inventeurs comparé des protocoles automatisés, semi-automatisés et manuels pour l'extraction d'ADN d'Archaea. Dans ce travail prospectif, les inventeurs ont inclus 110 échantillons de selles prélevés chez 110 individus, Marseille, France, entre juillet et août 2011. Cette étude a été approuvée par le Comité d'Ethique local de l'IFR48. Trois protocoles différents d'extraction d'ADN ont été réalisés en parallèle. Un protocole manuel utilisant kit NucleoSpin® (Macherey Nagel, Hoerdt, France) a été réalisé comme précédemment décrit [34]. Un protocole automatisé a utilisé la technique d'extraction d'ADN en utilisant l'extracteur EZ1, et le kit d'extraction d'ADN d'EZ1C) (Qiagen, Courtaboeuf, France) selon le procédé du fabricant. Un protocole semi-automatisé a été réalisé de la façon suivante : approximativement 1 gramme de selles a été suspendu dans 5 ml d'une solution de Tris-HCL 0.05 M, pH 7,5. Des aliquots de 250 pl de la suspension ont été transférés dans un tube Eppendorf stérile contenant 0,3 g de billes de verre lavées à l'acide 106 millimètres ; Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) et agités pour réaliser une lyse mécanique dans un appareil FastPrep-24 Instrumente, (MP Biomédicale Europe Illkirch, France) à vitesse 6,5 m/s pendant 90 secondes. Cet appareil opère une agitation par rotation multidirectionnelle. Le surnageant a été incubé durant la nuit à 56°C avec 180 ml de tampon de lyse (kit ADN tissue, Qiagen EZ1®) et 25 pl de Protéinase K (20 mg/ml). Après un deuxième cycle de lyse mécanique comme décrit ci-dessus, le surnageant a été incubé pendant 10 minutes à 100°C et l'ADN total a été alors extrait en utilisant le kit ADN tissue, Qiagen EZ1® dans l'extracteur EZ1, Qiagen. Des témoins négatifs se composant d'eau stérile sans ADN ont été introduits dans toutes les manipulations et ont subi le même processus d'extraction que les échantillons de selles. L'ADN extrait par les trois protocoles d'extraction, ont été incorporés dans une détection du 165 des méthanogènes M. smithii par 15 PCR en temps réel. Les amorces de PCR Smit.16S-740F: 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC-3 et Smit.16S-862R : 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3 et la sonde Smit.16S FAM : 5'- CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG-3 ont été adaptées d'un protocole précédemment décrit [14]. Les produits de PCR ont été purifiés puis 20 séquences en utilisant le kit de séquençage BigDye terminator 1.1 et le séquenceur 3130 (Applied Biosystems). Des témoins négatifs ont été incorporés à chaque analyse. Après la première étape, (digestion de protéinase K et amortisseur durant la nuit de lyse), le protocole semi-automatisé prend 25 15 à 30 minutes selon l'opérateur, contre 2,5 à 3 heures pour la technique manuelle. Le protocole automatisé est exécuté dans deux étapes, digestion de la protéinase K à 70°C pour 10 minutes et l'étape automatisée pendant 15 mn. Résultats et discussion : 30 Les témoins négatifs introduits dans toutes les expériences sont demeurés négatifs et aucun ADN d'Archaea n'a été extrait dans ces témoins négatifs. Le protocole automatisé a rapporté 35/110 (32%) d'échantillons positifs avec une valeur moyenne de Ct (nombre de cycles de PCR temps réel pour obtenir un signal positif) de 36.1. Le protocole semi-automatisé a rapporté 90/110 (87%) d'échantillons positifs avec une valeur moyenne de Ct de 27.4. En comparaison avec le protocole automatisé, ce protocole semi-automatisé a rapporté un nombre significativement plus élevé d'échantillons positifs (P Dans les tableaux ci-après, les concentrations pondérales des sels sous forme d'hydrates, ne tiennent pas compte du poids des molécules d'eau impliquées dans les hydrates. Tableau 1 : milieu SAB Quantités par litre de H2O NiCl2 x 6H20 0,07 mg Na2MoO4 x 2H20 0,02mg FeSO4 x 7H20 0,2 mg MgSO4 x 7H20 0,01 g K2HPO4 0,5 g KH2R04 0,5 g KCI 0,05 g CaCl2 0,05 g NaCI 1,5 g NH4CI 1 g Na-Acétate 1 g Extrait de levure 1 g Biotrypcase 1 g L-Cystéine, HCI 0,5 g Oligo-éléments (tableau 5) de Widdel 2 ml Olig-éléments (tableau 4) de Balch 10 ml Résazurine 1 mg solution de 5 ml Sélénite/tungstate du tableau 7 Après autoclave : NaHCO3 4 g/I Na2S.9F-120 0.5 g/I Na-Formate 0.4 g/I Methanol 40 mM 6) Vitamines de Balch (tableau 10 m1/1 Tableau 1A : Milieu 119 Quantité par litre de H2O KH21304 0,5 g MgSO4 x 7H20 0,4 g NaCI 5 g NH4CI 1 g CaCl2 x 2H20 0,05 g Na-acétate 1,6 g Cystéine-HCI 0,5 g Extrait de levure 1 g Trypticase peptone 1 g Résazurine 0,001 g Oligo-éléments de Widdel 1 ml (cf. tableau 5) NaHCO3 4 g Na2S x 9H20 0,5 g Na-formate 2 g Vitamines de Balch (cf. 10 ml tableau 6) Tableau 1B : Milieu 332 Quantité par litre de H2O Résazurine 1 mg Rumen fluide, clarifié 100 ml Trypticase 2 g Extrait de levure 2 g Na-acétate 0,5 g Na-formate 0,5 g 6) Vitamine de Balch (tableau 1 ml Oligo-éléments de Balch (tableau 4) 10 ml Na2Se04 1,9 mg NiCl2 x 6H20 0,7 mg FeSO4 x 7H20 3 mg K2HPO4 0,6 g KH2PO4 2,8 g (NH4)2504 0,3 g NH4CI 1 g NaCI 0,6 g MgSO4 x 7H20 0,15 g CaCl2 x 2H20 0,076 g Méthanol 5 ml Cystéine-HCI x H2O 0,875 g Na2S x 9H20 0,375 g Tableau 1C : milieu 334 Quantité par litre de H2O KH2PO4 0,3 g NaCI 0,6 g MgC12 x 6H20 0,1 g CaCl2 x 2H20 0,08 g KHCO3 0,4 g Na2S x 9H20 0,3 g NH4CI 1 g Résazurine 1 mg Cystéine-HCI x H2O 0,3 g Vitamine de Balch (cf. 10 ml tableau 6) Oligoéléments de Balch (cf. 10 ml tableau 4) Tableau 1D : Quantité par litre de H2O KH2R04 0,5 g MgSO4 x 7H20 0,4 g NaCI 5 g NH4CI 1 g CaCl2 x 2H20 0,05 g Na-acétate 1,6 g Cystéine-HCI 0,5 g Extrait de levure 1 g Trypticase peptone 1 g Résazurine 0,001 g Oligo-éléments de Widdel 1 ml (cf. tableau 5) Solution de 2 ml sélénite/tungstate (tableau 7) Après autoclave : Quantité par litre de H2O NaHCO3 4 g Na2S x 9H20 0,5 g Na-formate 2 g Vitamines tableau 6) de Balch ( 10 ml Méthanol 40 mM Tableau 2 : Composition du milieu 1 de Balch (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (k) (I) 50 50 10 10 0,002 5 g 2,5 2,5 2 g 2 g 0,5 0,5 ml ml ml ml g g g g g Les ingrédients sont rajoutés à de l'eau distillée pour avoir un volume final de 1 litre. La cystéine et le Na2S sont rajoutés après barbotage du milieu avec un mélange gazeux 80%N2-20%CO2, la phase 5 gazeuse finale du tube est composée d'un mélange 80%H2-20%CO2. (a) : Contient 6 g de KH2PO4 par litre d'eau distillée. (b) : Contient en gramme par litre d'eau distillée: KH2PO4 (6), (NH4)2504 (6), NaCI (12), MgSO4.7H20 (2,6), CaCl2.2H20 (0,16). (c) : Contient en gramme par litre d'eau distillée (pH ajusté à 7 10 avec KOH) : acide nitriloacétique (1,5), MgSO4.7H20 (3), MnSO4.2H20 (0,5), NaCI (1), FeSO4.7H20 (0,1), CoSO4 ou CaCl2 (0,1), CaCl2.H20 (0,1), ZnSO4 (0,1), CuSO4.5H20 (0,01), Na2Mo04.2H20 (0,01) ; dissoudre l'acide nitriloacétique avec du KOH (pH 6,5) puis rajouter les autres minéraux. 15 (d) : Contient en milligramme par litre d'eau distillée les vitamines suivantes : biotine (2), acide folique (2), hydrochloride de pyridoxine (10), hydrochloride de thiamine (5), riboflavine (5), acide nicotinique (5), pantothénate de DL-calcium (5), vitamine B12 (0,1), Acide p-aminobenzoïque (5), acide lipoique (5). 20 (e) : FeSO4 7H20; (f) : NaHCO3; (g) : Na acétate; (h) : Na formate; (i) : extrait de levure DIFCO; (j) : trypticase BBL; (k) : hydrochlorure de L-cystéine; (I) : Na2S, 9H20. Tableau 3 : Milieu El Quantité par litre de H2O KH2PO4 0,3 g K2HPO4 0,3 g NaCI 1 g NH4CI 1 g CaCl2 x 2H20 0,1 g KCI 0,1 g MgC12 x 6H20 0,5 g Extrait de levure 1 g Cystéine-HCI 0,1 g résazurine 0,001 g Oligo-éléments de Balch (tableau 4) 2,5 ml NaHCO3 4 g Na2S x 9H20 0,5 g Na-formate 2 g Vitamines de Balch 10 ml (tableau 6) Méthanol 40 mM Tableau 4: Solution d'oligo-éléments de Balch Quantité par litre de H2O Nitrilotriacetic acid 1,5 g MgSO4 x 7H20 3 g MnSO4 x H2O 0,5 g NaCI 1,g FeSO4 x 7H20 0,1 g CoSO4 x 7H20 0,18 g CaCl2 x 2H20 0,1 g ZnSO4 x 7H20 0,18 g KAI(SO4)2 x 12H20 0,02 g H3B03 0,01 g Na2MoO4 x 2H20 0,01 g NiCl2 x 6H20 0,03 g Na2Se03 x 5H20 0,3 mg Tableau 5 : Solution d'oligo-éléments de Widdel Quantité pour 1 litre d'eau distillée HCI 25% 10 ml FeCl2 x 4H20 1,5 g CoCl2 x 6H20 190 mg MnCl2 x 4H20 100 mg ZnCl2 70 mg H3B03 62 mg Na2MoO4 x 2H20 36 mg NiCl2 x 6H20 24 mg CuCl2 x 2H20 17 mg Tableau 6 : Solution de vitamines de Balch Quantité par litre de H2O Biotine 2 mg Acide folique 2 mg Pyridoxine -HCI 10 mg Thiamine-HCI x 2H20 5 mg Riboflavine 5 mg Acide nicotinique 5 mg D-Ca-pantothénate 5 mg Vitamine B12 0,1 mg Acide p-Aminobenzoïque 5 mg Acide lipoique 5 mg Tableau 7 : Solution de Sélenite/tungstate Quantité par litre de H2O NaOH 0,5 g Na2Se03 x 5H20 3 mg Na2WO4 x 2H20 4 mg Tableau 8 : Organisme(a) Cible Séquence (5'-3') des amorces et sondes SEQ. ID. n° M. smithii 16S rDNA Smit.16S-740F, 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTC-3' 4 Smit.16S-862R, 5'-CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' 5 Smit.16S FAM, 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG-3' 6 FAM (MGB) M. stadtmanae 16S rDNA Stadt_16SF, 5'-AGGAGCGACAGCAGAATGAT-3' 7 Stadt_16SR, 5'-CAGGACGCTTCACAGTACGA-3' 8 Stadt_16SFAM, 5'-TGAGAGGAGGTGCATGGCCG-3' 9 FAM (Taqman) M. /uminyensis 16S rDNA B10-dir, 5'-GTTCGTAGCCGGTCTGGTAA-3' 1 B10-rev, 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3' 2 B10-VIC, 5'-TCGGGAAGCTTAACTTTCCGACTTCC-3' 3 VIC (Taqman) Références bibliographiques [1] Hungate R.E: Roll-tube method for the cultivation of strict anaerobes. Methods in microbiology 1969, 3B: 117-132. [2] Miller T.L.and Wolin M.J.: A serum bottle modification of Hungate technique for cultiving obligate anaerobes. Applied microbiology 1974, 27: 985-987. [3] Dermoumi HL, Ansorg RAM: Isolation and Antimicrobial Susceptibility Testing of Fecal Strains of the Archaeon Methanobrevibacter srnithii. Chemotherapy 2001, 47: 177-183. 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High prevalence of Methanobrevibacter srnithil and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PLoS One. 2009;4(:e7063). REVENDICATIONS1. Milieu de culture stérilisé utile pour la culture d'une Archaea méthanogène comprenant un milieu de base de culture d'Archaea méthanogène caractérisé en ce qu'il comporte en outre les composants 5 suivants: a-sel de sélénite à une concentration de 5.10-3 mM à 0,5 mM, et b- sel de tungstate à une concentration de 5.10-3 mM à 0,5 mM, et c- sel de molybdate à une concentration de 10-3 à 10-2 mM, et d- sel de nickel à une concentration de 10-3 à 10-2 mM, et 10 e- méthanol à une concentration d'au moins 5 mM, de préférence de 10 à 100 mM. 2 Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une concentration de 10 à 50 mM de méthanol. 3. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 ou 2, 15 caractérisé en ce qu'il comprend en outre les composants suivants : a- sel de sélénite Na2Se03, à une concentration de 0,001 mg/I à 0,1 mg/I, de préférence 0,015 mg/I, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Se03.5H20, et b- sel de tungstate Na2W04, à une concentration de 0,001 mg/I à 20 0,1 mg/I, de préférence 0,02 mg/I, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2W04.2H20, c- sel de molybdate Na2Mo04, à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/I, de préférence 0,02 mg/I, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Mo04.2H20, et 25 e- sel de nickel NiCl2 à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/I, de préférence 0,7 mg/I, de préférence sous forme d'hydrate NiCl2.6H20.4. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : f- sel de formate, à une concentration molaire de 1 mM à 10 mM, de préférence 6 mM. 5. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend un sel de formate NaHCO2, à une concentration de0,1 à 1 g/I, de préférence 0,4 g/I. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des acides gras volatiles, comprenant une chaîne carbonée courte de moins de 6 atomes de carbone, à une concentration de 1 à 10 mM, de préférence de 5 à 7 mM pour chacun desdits acides gras volatiles. 7. Milieu de culture selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdits acides gras volatiles comprennent les acides suivants : acide 15 valérique, acide isovalérique, acide 2-méthylbutyrique, acide isobutyrique et acide 2-méthylvalérique. 8. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit milieu de base comprend au moins : - plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisies 20 parmi un extrait de levure, un sel d'acétate et une peptone trypsique, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, - une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, - au moins un sel de chacun des métaux K, Mg, Na et Ca, de préférence NaCI, 25 - une substance réductrice, plus particulièrement choisie parmi la cystéine-HCI et Na2S,- une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 8, de préférence NaHCO3 pour ajuster le pH à 7,5, - des oligoéléments, de préférence des sels choisis parmi des sels de B, Fe, Cu, Zn, W, Se, Cu, Mn, Co, Ni et Mo, de préférence encore des oligoéléments du milieu de Widdel, - des vitamines, de préférence les vitamines du milieu de Balch, et - de préférence, un indicateur d'oxydoréduction de contrôle de l'anaérobie, de préférence la résazurine. 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit milieu comporte les espèces suivantes : KH2PO4, K2PO4, MgSO4.7H20, NaCI, KCI, KOH, NH4CI, CaCIZ.2H20, KOH, NaCOOCH3 cystéine, extrait de levure, trypticase peptone, NaOH, NaHCO2, CH3OH, Na2S, NaHCO3, NaHCO2, Na2Se035H20, Na2W042H20, Na2Mo04.2H20, NiC12.6H20, FeSO4.7H20, des oligoéléments de widdel, des vitamines de Balch et de préférence résazurine; le pH étant ajusté à 7,5. 10. Procédé de préparation d'un milieu de culture stérilisé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles : 1- on place un milieu de culture ne contenant pas les composants susceptibles d'être dégradés par chauffage comprenant ledit méthanol, desdites vitamines, des sels de sodium labiles comprenant Na HCO2, Na HCO3 et Na2S et, le cas échéant, lesdits acides gras volatiles (AGV), ci-après dénommé "milieu de culture incomplet", sous atmosphère d'anaérobie, de préférence sous un flux d'azote dans au moins un tube étanche, et on scelle ledit tube, et 2- de préférence, l'atmosphère gazeuse dudit tube étanche est remplacée par un mélange N2/CO2 à 80/20%, et 3- on stérilise par chauffage ledit milieu de culture incomplet, de préférence dans un autoclave, à une température supérieure à 100°C pendant au moins 15 mn, et 4- on refroidit ledit milieu de culture incomplet à température ambiante et on ajoute dans ledit milieu de culture incomplet, lesdits composants susceptibles d'être dégradés par stérilisation dans un autoclave comprenant le méthanol, lesdites vitamines, lesdits sels de sodium labiles comprenant Na HCO3, Na HCO2 et Na2S. 11. Procédé de culture d'une Archaea avec un milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel on réalise les étapes successives suivantes : 1- on inocule un échantillon biologique susceptible de contenir une dite Archaea dans ledit milieu de culture en anaérobie, et 2- on place ledit milieu de culture sous une atmosphère 15 d'anaérobiose contenant au moins 50% d'hydrogène à une pression inférieure ou égale à 2 atm, et 3- on réalise une incubation à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C, pour atteindre une phase de croissance exponentielle avec dégagement de méthane en au moins 1 jour, de préférence pas 20 plus de 15 jours, de préférence encore pas plus de 7 jours. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on réalise une culture d'une Archaea méthanogène choisie parmi Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter oralis, Methanobrevibacter stadtmanae, Methanobrevibacter luminyensis, 25 Methanobrevibacter. beijingense et Methanobrevibacter. concilii, Methanosarcina acetivorans. 13. Procédé de détermination de la présence d'une Archaea dans un échantillon biologique, de préférence dans un échantillon de selles animales ou humaines, ladite Archaea étant cultivée selon leprocédé de l'une des revendications 11 à 12, caractérisé en ce que l'on extrait l'ADN dudit échantillon biologique et on détecte et, de préférence, on quantifie spécifiquement l'ADN de ladite Archaea par amplification enzymatique du type PCR, de préférence du type PCR en temps réel, avec un couple d'amorces et de préférence une sonde, de séquences tirées du gène 16S ADNr. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles : 1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, à une dilution de 0,01 à 1 g/I, de préférence à une dilution de 0,2 g/I, et 2) on réalise une lyse mécanique automatisée par mélange et agitation de ladite suspension de l'étape 1) avec un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, dans un appareil du type réalisant une agitation forte, de préférence par rotation multidirectionnelle, et, 3) de préférence encore, on chauffe la suspension obtenue à au moins 100°C pendant au moins 10 minutes, et 4) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et agitation du surnageant de la suspension obtenue à l'étape 2) ou 3) avec un ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatique, puis 5) on répète l'étape 2) de lyse mécanique mais avec le mélange obtenu à l'étape 4), et 6) de préférence, on répète l'étape 4) de lyse chimique et/ou enzymatique avec le mélange obtenu à l'étape 5). 15. Kit utile pour un procédé selon l'une des revendications 13 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend :- des réactifs d'extraction d'ADN comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou enzymatique, et - des réactifs d'amplification d'ADN comprenant des amorces d'amplification et sonde de détection de dite Archaea méthanogène.