Brevet FR2987054A1 — publié le 20130823

La présente invention concerne une méthode in vitro de détermination de l'activité potentielle d'un candidat médicament dans le traitement de l'ostéoporose. La présente invention concerne une méthode in vitro qui permet de déterminer si un candidat médicament, c'est-à-dire, par exemple, un composé ou un mélange de 5 composés, a un effet sur la régulation paracrine adipocyte-ostéoblaste impliquée dans la physiopathologie de l'ostéoporose. L'ostéoporose est une maladie caractérisée par une fragilité excessive du squelette, due à une diminution de la masse osseuse et à l'altération de la microarchitecture osseuse. L'ostéoporose est une maladie fréquente chez les femmes 10 après la ménopause (ostéoporose post-ménopausique) car la masse osseuse diminue avec l'âge et avec la carence en hormones féminines (oestrogènes). L'ostéoporose peut également survenir chez l'homme (ostéoporose masculine) ou être secondaire à une affection (ostéoporose secondaire) ce qui permet d'envisager la mise en place d'une prévention de cette perte osseuse. 15 Du fait de l'allongement de l'espérance de vie dans les pays dits développés, l'ostéoporose est reconnue comme un problème majeur de santé publique. En effet, on estime à 200 millions le nombre de personnes souffrant de cette pathologie dans le monde; et que 30% des femmes ménopausées en Europe et aux USA ont de l'ostéoporose. L'ostéoporose engendre un risque accru de fractures dans lesquelles le 20 pronostic vital est parfois engagé. Actuellement, peu de médicaments palliant cette perte osseuse sont disponibles sur le marché et leurs effets restent limités. Ainsi, les biphosphonates, molécules de référence dans le traitement de cette pathologie ne réduisent le risque de fracture que de l'ordre de 50%. D'autres pistes thérapeutiques ciblent le récepteur activateur du NF-KB ligand 25 (RANKL) qui intervient dans la maturation des ostéoclastes, ou la cathepsine K qui intervient dans la résorption ostéoclastique. Néanmoins, cette pathologie reste à ce jour insuffisamment traitée. Un but de la présente invention est de proposer une nouvelle méthode de détection et/ou de sélection de candidats médicaments pour le traitement de 30 l'ostéoporose. Ce but est atteint au moyen d'une méthode in vitro de criblage de candidats médicaments pour le traitement de l'ostéoporose qui comprend la détection de l'éventuelle activité inhibitrice du candidat médicament sur la régulation paracrine entre les ostéoblastes et les adipocytes, ladite régulation générant la dérive du phénotype 35 des ostéoblastes vers le phénotype des adipocytes. Il est connu (voir l'article intitulé « Human osteoblasts derived from mesenchymal stem cells express adipogenic markers upon coculture with bone marrow adipocytes" publié dans la revue "Differentiation" en 2010) que dans la moelle osseuse de patients atteints d'ostéoporose (provenant soit du vieillissement, soit d'une autre cause) le nombre d'adipocytes augmente au détriment des cellules ostéoblastiques, engendrant une fragilité osseuse. La publication précitée indique, en outre, qu'il existe une régulation paracrine entre les adipocytes et les cellules ostéoblastiques : il semblerait que les adipocytes provoquent la différenciation des cellules ostéoblastiques en adipocytes. Ces résultats sont mis en évidence par le dosage des ARN messagers de gène codant pour des marqueurs spécifiques de la différenciation des adipocytes (« Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma » (PPARg), et la leptine, notamment) et des cellules ostéoblastiques (l'ostéocalcine). Au bout d'un certain temps de coculture le niveau d'expression des gènes marqueurs adipocytaires augmente chez les cellules ostéoblastiques cocultivées avec des adipocytes : les cellules ostéoblastiques présentent donc un phénotype qui dérive vers celui des adipocytes. La publication précitée suggère qu'une nouvelle piste thérapeutique pourrait s'attacher aux adipocytes de la moelle osseuse. En revanche, la publication précitée ne décrit pas de méthode in vitro de criblage semblable à celle de l'invention. Selon l'invention, le candidat médicament peut agir, sur les adipocytes et/ou sur les ostéoblastes et/ou sur les composés libérés par les ostéoblastes et/ou les adipocytes de manière à freiner ou empêcher la dérive du phénotype des ostéoblastes. Les candidats médicaments qui freineraient ou empêcheraient la transformation ostéoblastes-adipocytes pourraient être testés ensuite in vivo pour le traitement 25 préventif et/ou curatif de l'ostéoporose. Ces candidats médicaments permettraient notamment, de favoriser le maintien de la masse osseuse en conservant le nombre de cellules ostéoblastiques. Par « traitement », on entend au sens de la présente invention, le traitement curatif et/ou préventif. Le terme « traitement » concerne une amélioration d'au moins un 30 des symptômes de l'ostéoporose. Le candidat médicament peut être un composé chimique de synthèse ou une substance d'origine naturelle. Il peut être également un mélange de substances chimiques et/ou naturelles. Le candidat médicament peut, par exemple, être un nutriment ou un aliment. Au sens de l'invention, les termes « activité inhibitrice » signifient une inhibition complète ou partielle de la transformation (dérive) du phénotype des cellules précitées en adipocyte ou un simple ralentissement de cette dernière. Selon un mode de mise en oeuvre particulier de la méthode de criblage de l'invention, on cultive, pendant une durée de test donnée, des cellules ostéoblastiques dans un milieu provenant d'une culture d'adipocytes, et contenant éventuellement des adipocytes, et comprenant ledit candidat médicament ; on mesure ensuite le taux d'expression d'un gène codant pour un marqueur choisi parmi les marqueurs adipocytaires et les marqueurs ostéoblastiques ; et on compare le taux d'expression mesuré avec une valeur de référence qui est obtenue en mesurant le taux d'expression dudit gène marqueur dans des cellules ostéoblastiques cultivées pendant ladite durée de test donnée, dans un milieu provenant d'une culture d'adipocytes et comprenant un produit de référence, éventuellement connu pour son efficacité dans le traitement de l'ostéoporose. Si l'on dose le taux d'expression d'un gène codant pour un marqueur adipocytaire, le candidat médicament est considéré comme potentiellement actif s'il parvient à réduire le taux d'expression dudit gène au moins à ladite valeur de référence, lorsque le produit de référence est déjà connu pour son activité dans le traitement de l'ostéoporose. Si le produit de référence est connu pour n'avoir aucune efficacité dans le traitement de l'ostéoporose, le candidat médicament est considéré comme potentiellement actif s'il parvient à réduire le taux d'expression dudit gène en deçà de la valeur de référence, Si l'on dose le taux d'expression d'un gène codant pour un marqueur ostéoblastique, le composé candidat médicament est considéré comme potentiellement 25 actif si le taux d'expression dudit gène en présence dudit candidat médicament est au moins égal à ladite valeur de référence, lorsque le produit de référence est déjà connu pour son activité dans le traitement de l'ostéoporose. Si le produit de référence est connu pour n'avoir aucune efficacité dans le traitement de l'ostéoporose, le candidat médicament est considéré comme potentiellement actif, si le taux d'expression dudit 30 gène en présence dudit candidat médicament est supérieur à ladite valeur de référence. Cette méthode est simple à mettre en oeuvre, rapide et peu coûteuse en matériel. Le taux d'expression du gène codant pour le marqueur peut être mis en oeuvre par le dosage des ARNm spécifiques du gène codant pour le marqueur qui sont présents dans les ARN totaux des cellules ostéoblastiques. Avantageusement, ledit milieu provenant d'une culture d'adipocytes ne comprend pas d'adipocytes. En effet, c'est le mérite de la Demanderesse que d'avoir mis en évidence que, en utilisant un milieu provenant d'une culture d'adipocytes ne contenant pas d'adipocytes, les ostéoblastes dérivent vers un phénotype adipocytaire. Il n'était pas évident que la régulation paracrine entre les ostéoblastes et les adipocytes puisse être due à des molécules qui sont secrétées par les adipocytes et qui ont une durée de vie longue dans le milieu de culture. La méthode utilisant un milieu sans adipocytes, elle est simple à mettre en oeuvre et facilement automatisable. Avantageusement, lesdites cellules ostéoblastiques et/ou les adipocytes sont obtenus par culture de cellules mésenchymateuses dans un milieu de culture favorisant leur différenciation respectivement en cellules ostéoblastiques ou en adipocytes. Les cellules proviennent de l'espèce pour laquelle le candidat médicament doit être actif. Dans le cas de l'ostéoporose humaine, les cellules mésenchymateuses sont des cellules humaines. Avantageusement, les cellules mésenchymateuses utilisées pour l'obtention des cellules ostéoblastiques et pour l'obtention des adipocytes proviennent du même donneur. Ceci permet d'éviter des perturbations de la régulation entre adipocytes et ostéoblastes qui pourraient provenir de la différence entre les donneurs même issus d'une même espèce. Avantageusement, ledit gène codant pour un marqueur est choisi parmi le gène codant pour la leptine, le gène PPARg et le gène codant pour l'ostéocalcine. La durée de test est supérieure ou égale 24 heures, de préférence sensiblement égale à 48 heures. La méthode de l'invention est donc rapide à mettre en oeuvre. Selon un mode de mise en oeuvre, le milieu favorisant la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes contient de 0,5% à 1,5% en volume d'un mélange streptomycine/pénicilline (1 :1 VN) de préférence 1%, de 0,5 à 1,5% et de préférence 1% de Glutamine à 200 mM, de 1, 5% à 2,5% de préférence 2 % du (3-glycérophosphate à 10 mM , de 0,05% à 0,15% de préférence 0,1% de la vitamine D à 10 nM, de 0,0025% à 0,0075% de préférence 0,005% de la vitamine C à 50 pM et 10% de sérum de veau foetal en mélange dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium contenant 4,5 g/I de glucose (DMEM 10%). Selon un mode de mise en oeuvre qui peut être combiné avec le précédent, le milieu favorisant la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en 35 adipocytes contient de 0,5% à 1,5% et de préférence 1% d'un mélange streptomycine/pénicilline(1 : 1 VN) ,de 0,5% à 1,5% et de préférence 1% de Glutamine à 200 mM, de 0,025% à 0,075% de préférence 0,05% de 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMx) à 0,5 mM, de 0,025% à 0,075% de préférence 0,05% de la dexaméthasone à 0,5 pM, de 0,05% à 0,15% de préférence 0,1% de l'indométhacine à 50 pM et 10% de sérum de veau foetal en mélange dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenant 4, 5 g/I de glucose (DMEM 10%). Selon un autre mode de mise en oeuvre, combinable avec l'un et/ou l'autre des modes de mise en oeuvre précités, ledit milieu de prolifération contient 1% de streptomycine/Pénicilline, 1% de Glutamine à 200 mM et 10% de sérum de veau foetal en mélange dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium contenant 4,5 g/I de glucose (DMEM 10%). Tous les % précités sont en volume. La présente invention, ses caractéristiques et les avantages qu'elle procure apparaitront mieux à la lecture de la description qui suit d'un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, cité à titre d'exemple non limitatif. Résultats expérimentaux Les cellules cultivées sont des cellules souches mésenchymateuses (CSMs) humaines commerciales (Lonza Walkersville, Inc). Toutes les manipulations (changement de milieu, prolifération et mise en différenciation) sont réalisées dans un environnement stérile sous hôte à flux laminaire. Les milieux de culture et les solutions utilisés lors de cette expérience sont préalablement chauffés à 37°C. Ensemencement et prolifération Décongélation des cellules Une ampoule contenant 700 000 cellules est décongelée (3min au bain-marie à 37°C). Pour cela, la suspension cellulaire est rapidement placée après décongélation dans 9 mL de milieu de prolifération. La solution est ensuite centrifugée pendant 5 min à 1000 rpm pour éliminer le milieu de congélation. Suite à la centrifugation, les cellules forment un culot et ainsi le milieu peut- être éliminé. Ensuite, le culot cellulaire est resuspendu dans 15 mL de milieu de prolifération. Enfin, les 15 mL de la suspension cellulaire sont placés dans une flasque de 75 cm2. La flasque est placée dans une étuve à 37°C avec une atmosphère enrichie à 5% de CO2. Le milieu de prolifération est changé 24h après l'ensemencement des cellules. Milieu de prolifération des CSMs (Milieu DMEM complet) - 500 ml de milieu DMEM - 1% de Glutamine à 200 mM - 1% de Pénicilline (10000 U) et Streptomycine (10 mg.mL-1) > 10% de sérum de veau foetal Prolifération Après décongélation, une première étape dite de prolifération est réalisée pour augmenter le nombre de cellules contenues dans l'ampoule. Comptage et remise en prolifération des cellules Le milieu de culture est éliminé, puis les cellules sont rincées avec du Phosphate Buffer Saline (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, ph= 7.4) pour éliminer d'éventuelles traces de milieu de culture. Ensuite, 1 mL de trypsine est ajouté par T75. La trypsine est une enzyme digestive du suc pancréatique qui permet de détacher les cellules du fond de la flasque. Pour favoriser l'action de l'enzyme, la flasque est placée à l'étuve à 37°C. Après 5 min d'incubation, 3 mL de milieu de prolifération pour 1 ml de trypsine sont ajoutés pour neutraliser l'action de celle-ci. Les 6 mL contenus dans chaque flasque sont ensuite prélevés puis placés dans un tube stérile de 15 mL. Une étape de centrifugation (5 min, 1000 rpm) permet d'éliminer le milieu contenant la trypsine. Enfin, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de prolifération puis ensemencées dans des plaques de 6 ou 12 puits. Mise en différenciation Après 4 jours de culture, les cellules sont placées en milieu de différenciation adipocytaire pour les adipocytes et en milieu de différenciation ostéoblastique pour les ostéoblastes. Ces milieux diffèrent par la présence de facteurs favorisant la différenciation des CSMs en adipocytes ou en ostéoblastes. Durant 14 jours de culture 4 changements de milieu sont effectués soit un changement tous les 3 à 4 jours.20 Milieu de différenciation ostéoblastique > Milieu de prolifération (DMEM 10%) - [3-Glycérophosphate à 10 mM - Vitamine D à 10 nM - Vitamine C à 50 pM Milieu de différenciation adipocytaire > Milieu de prolifération (DMEM 10 %) - Dexaméthasone à 0,5 pM - 3-isobuty1-1-methylxanthine à 0,5 mM > Indométhacine à 50 pM La plaque est placée dans une étuve à 37°C avec une atmosphère enrichie à 5% de CO2. Mise en coculture Le milieu de différenciation adipocytaire est éliminé et remplacé par un milieu de prolifération sans SVF. 48h plus tard, le milieu de culture présent sur les adipocytes est prélevé puis disposé dans les puits contenant les cellules ostéoblastiques et le candidat médicament à tester. La culture est ainsi prolongée pendant 48h. Il est également possible d'ajouter le candidat médicament à tester au milieu présent sur les adipocytes et de disposer ce mélange sur les ostéoblastes. Il est également possible d'ajouter séparément sur les cellules ostéoblastiques le candidat médicament à tester, éventuellement dissout ou diluée dans un solvant, et le milieu provenant de la culture d'adipocytes. Analyse de l'effet des molécules sur le modèle cellulaire Analyse de l'expression génique de la population ostéoblastique en PCR quantitative Au terme de la coculture, nous avons éliminé le milieu de culture et extrait les ARN des cellules ostéoblastiques (et adipocytaires) qui se trouvent dans les puits. Préparation des ARN Les ARN totaux sont extraits en utilisant un réactif d'origine commerciale. Les cellules sont lysées directement dans le puits, après avoir éliminé le milieu de culture, par addition de 1,5 mL d'Extract'All pour les plaques 6 puits et 0, 700 ml pour les plaques 12 puits. Un puits de culture est utilisé pour chaque condition de culture ce qui correspond à 1 tube de 1.5 ml. Dans chaque tube sont ajoutés pour un 1 ml d' Extract'All, 0,3 mL de chloroforme puis une agitation vigoureuse au vortex est effectuée pendant 15 secondes. La phase aqueuse est transférée dans un tube propre et 0,750 mL d'isopropanol sont ajoutés pour permettre la précipitation des ARN totaux. Cette précipitation se fait après mélange et centrifugation à 12 000 g pendant 10 minutes, les ARN forment alors un culot blanc au fond du tube. Le surnageant est éliminé et le culot d'ARN lavé par addition d'1 mL d'éthanol à 75%, vortexé puis centrifugation à 7 500 g pendant 5 minutes. Le culot d'ARN est ensuite séché 10 minutes à 40°C puis resuspendu dans 20 pL d'eau ultra-pure. Les ARN totaux sont quantifiés par lecture d'absorbance à 260 nm. Pour cela 1 pL d'ARN est dilué au 1/200 en eau ultra-pure et placé en micro-cuve à quartz pour une lecture au spectrophotomètre. Les éventuelles contaminations en Acides Désoxyribonucléiques (ADN) sont ensuite éliminées par un traitement à la DNase I. 2 pg d'ARN sont dilués dans un volume final de 17 pL d'eau ultra-pure auxquels sont ajoutés 2 pL de tampon 10X de l'enzyme et 1 pL de DNase I diluée au 1/4. La digestion s'est faite pendant 30 minutes à 37°C puis la réaction est stoppée par ajout de 0,8 pL d'EDTA 0,2 M et incubation à 75°C pendant 10 minutes. Synthèse des ADN complémentaires La synthèse des ADN complémentaires est faite sur 12,5 pL d'ARN préalablement traités à la DNase. Les ARN sont dénaturés à 75°C pendant 5 minutes puis placés dans la glace. Le mélange réactionnel est ensuite ajouté. Il se compose de 30 4 pL de tampon de l'enzyme 5X (50 mM Tris-HCI pH8,3 , 75 mM KCI et 3 mM MgCl2), 1 pL d'amorces aléatoires pdN6 à 100 pM, 1 pL de dNTPs à 10 mM, 1 pL de dithiothreitol à 100 mM et de 0,5 pL d'enzyme Superscript reverse transcriptase soit 100 unités. Une incubation de 10 minutes à 20°C permet l'hybridation des amorces puis les échantillons sont placés sur le thermocycleur pour une incubation de 30 minutes à 42°C suivie de 5 35 minutes à 99°C. Ensuite, 30 pl d'eau sont ajoutés (vf=50 pl) et les échantillons sont conservés au congélateur. Pour vérifier l'absence d'ADN, une synthèse similaire mais sans ajout d'enzyme est effectuée. Dosage par RT-PCR Quantitative Les réactions de PCR sont réalisées dans un volume de 10 pL avec 1 pL d'ADNc, 4 mM MgCl2, 0,3 pM de chaque amorce et 1 pL du mélange commercial FastStart DNA Master SYBR Green I contenant l'enzyme, le SYBR Green et les dNTPs. Les échantillons sont analysés et comparés à l'aide du logiciel RelQuant 1.01 qui est le logiciel de quantification relative du LightCycler. Les profils d'expression des marqueurs adipocytaires et ostéoblastiques sont analysés. Le Tableau 1 représente le niveau d'expression du gène codant pour la leptine obtenu par utilisation de la méthode de criblage selon la présente invention pour un composé (l'alendronate) connu pour son utilisation dans le traitement de l'ostéoporose et testé selon la méthode de la présente invention. Tableau 1 : Alendronate Niveau d'expression de la leptine rapport +/- écart-type Contrôle (0 pM) 1 1 pM 0,14 +/- 0,09 L'éthanol est utilisé comme contrôle et comme solvant de l'alendronate.20 REVENDICATIONS1. Méthode in vitro de criblage de candidats médicaments pour le traitement de l'ostéoporose comprenant la détection d'une activité inhibitrice du candidat médicament sur la régulation paracrine entre les ostéoblastes et les adipocytes, ladite régulation générant la dérive du phénotype des ostéoblastes vers le phénotype des adipocytes. 2. Méthode selon la revendication 1, selon laquelle - on cultive, pendant une durée de test donnée, des cellules ostéoblastiques dans un milieu provenant d'une culture d'adipocytes, et contenant éventuellement des 10 adipocytes, et comprenant ledit candidat médicament ; et - on mesure ensuite le taux d'expression d'un gène codant pour un marqueur choisi parmi les marqueurs adipocytaires et les marqueurs ostéoblastiques ; et - on compare le taux d'expression mesuré avec une valeur de référence qui est obtenue en mesurant le taux d'expression dudit gène marqueur dans des cellules 15 ostéoblastiques cultivées pendant ladite durée de test donnée dans un milieu provenant d'une culture d'adipocytes et comprenant un produit de référence, éventuellement connu pour son efficacité dans le traitement de l'ostéoporose. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit milieu provenant d'une culture d'adipocytes ne comprend pas d'adipocytes. 20 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisée en ce que lesdites cellules ostéoblastiques et/ou les adipocytes sont obtenu(e)s par culture de cellules mésenchymateuses dans un milieu de culture favorisant leur différenciation respectivement en cellules ostéoblastiques ou en adipocytes. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdites cellules 25 mésenchymateuses sont cultivées pendant 14 jours pour l'obtention d'adipocytes ou de cellules ostéoblastiques. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisée en ce que lesdites cellules mésenchymateuses sont des cellules humaines. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce 30 que les cellules mésenchymateuses utilisées pour l'obtention des cellules ostéoblastiques et pour l'obtention des adipocytes proviennent du même donneur. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que ledit gène codant pour un marqueur est choisi parmi le gène codant pour la leptine, le gène PPARg et le gène codant pour l'ostéocalcine. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que ladite durée de test est supérieure ou égale à 24 heures, de préférence sensiblement égale à 48 heures. 10. " Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisée en ce que ledit milieu favorisant la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes contient de 0,5% à 1,5% en volume d'un mélange streptomycine/pénicilline (1 :1 VN) de préférence 1%, de 0,5 à 1,5% et de préférence 1% de Glutamine à 200 mM, de 1, 5% à 2,5% de préférence 2 % du (3-glycérophosphate à 10 mM , de 0,05% à 0,15% de préférence 0,1% de la vitamine D à 10 nM, de 0,0025% à 0,0075% de préférence 0,005%, de la vitamine C à 50 pM et 10% de sérum de veau foetal en mélange dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium contenant 4,5 g/I de glucose (DMEM 10%) et en ce que ledit milieu favorisant la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en adipocytes contient de 0,5% à 1,5% et de préférence 1% d'un mélange streptomycine/pénicilline(1 : 1 VN) ,de 0,5% à 1,5% et de préférence 1% de Glutamine à 200 mM, de 0,025% à 0,075% de préférence 0,05% de 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMx) à 0,5 mM, de 0,025% à 0,075% de préférence 0,05% de la dexaméthasone à 0,5 pM, de 0,05% à 0,15% de préférence 0,1% de l'indométhacine à 50 pM et 10% de sérum de veau foetal en mélange dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenant 4, 5 g/I de glucose (DMEM 10%).