Brevet FR2987055A1 — publié le 20130823

La présente invention concerne le domaine de la biologie en général, et en particulier les récepteurs de l'acide lysophosphatidique. Plus précisément, l'invention concerne notamment un procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi par la mesure de l'expression d'un ou de plusieurs marqueurs spécifiques, en particulier pour déterminer in vitro l'activité modulatrice in vitro ou in vivo d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, notamment dans le cadre du suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique ciblant spécifiquement le récepteur LPAi. L'acide lysophosphatidique (LPA) est un phospholipide naturel qui présente une activité de type facteur de croissance sur une très large variété de cellules, régulant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire in vitro (Fukushima et ai., 1998 ; Goetzl et a/.,1999). Les plaquettes sanguines constituent la source majeure, mais non-exclusive, de LPA dans l'organisme lors de l'agrégation plaquettaire (Gerrard et Robinson, 1989). La concentration de LPA passe de l'ordre de 0,1pM dans le plasma à 5-25pM dans le sérum. Les fibroblastes, les préadipocytes et certaines cellules tumorales peuvent produire elle-même du LPA. Le LPA est impliqué dans le contrôle de nombreuses fonctions physiopathologiques (fibrose pulmonaire, fibrose rénale, obésité, polyarthrite rhumatoïde, reproduction, maladies urinaires, cancer). L'action cellulaire du LPA passe par l'activation d'une série de récepteurs présents à la surface de nombreuses cellules dont les cellules cancéreuses (LPAi, LPA2, LPA3, LPA5, LPA6 et LPA,). Ces récepteurs sont très homologues entre-eux. Ils ont une structure à sept passages transrnenibranaires couplés aux protéines fixatrices du GTP (protéines G). On distingue cependant deux sous-classes de récepteurs en fonction de leur origine phylogénétique et de leur organisation génomique (LPA1_3 et LPA4_7). Il faut savoir que les ARN messagers codant pour ces récepteurs sont largement distribués au niveau tissulaire (Contas et ai., 2002) et que la plupart des cellules expriment plusieurs types de récepteurs en même temps. De nombreux laboratoires et sociétés développent actuellement des molécules à visée thérapeutique ciblant les récepteurs du LPA, notamment le récepteur de type 1 du LPA ou LPAi.. Or, il n'existe à l'heure actuelle aucun test permettant de valider 5 l'activation ou l'inhibition spécifique du récepteur LPAi dans des d'échantillons biologiques prélevés in vivo, ni in vitro dans des systèmes cellulaires complexes exprimant de multiples récepteurs du LPA, ce qui est largement majoritaire. A ce jour, il n'est donc pas possible de savoir si le récepteur LPA, 10 spécifiquement est effectivement activé ou inactivé. En particulier dans l'organisme (homme, souris...), aucun test ne permet de valider que ce récepteur LPA1 est effectivement activé ou inactivé sous l'action de ces différentes molécules thérapeutiques, ni de suivre l'efficacité de thérapies ciblées mises en place. 15 Actuellement, la validation de l'activation et de l'inhibition du récepteur LPAi est réalisée uniquement in vitro, et ceci dans des conditions très limitées à partir de cellules n'exprimant naturellement aucun récepteur du LPA et qui après manipulations génétiques expriment ce récepteur. Les tests consistent à mesurer soit l'intensité du flux calcique intracellulaire par 20 spectrophotométrie en présence de LPA, soit la fixation de gamrnaGTP* au niveau de protéines fixatrices du GTP, présentes au niveau de la face interne de la membrane plasmique, en mesurant la radioactivité associée aux membranes suite à la stimulation par le LPA. C'est dans ce contexte que la présente invention propose de pouvoir 25 détecter in vitro l'activation ou l'inhibition spécifique du récepteur LPAi grâce à l'utilisation d'une signature biologique particulière. La présente invention comble donc l'impossibilité actuelle de confirmer l'état d'activation ou d'inhibition spécifique du récepteur LPAi in vivo dans l'organisme, mais également in vitro dans des systèmes cellulaires complexes 30 qui expriment différents récepteurs du LPA. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi comprenant les étapes consistant à : - mesurer le niveau d'expression des marqueurs HBEGF (Heparin5 Binding EGF-like growth factor) et CXCL3 (Chemokine C-X-C motif Ligand 3) dans un échantillon, - conclure respectivement à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPAi spécifiquement, lorsqu'une augmentation ou une diminution significative du niveau d'expression de ces deux marqueurs est mise en 10 évidence par rapport à une valeur de référence. Les inventeurs ont en effet trouvé, de manière surprenante, que l'étude combinée de l'expression du gène codant HBEGF (Heparin-Binding EGF-like growth factor) et du gène codant CXCL3 (Chemokine C-X-C motif Ligand 3) constitue une signature de l'activation ou de l'inhibition du récepteur LPAi 15 spécifiquement. Ainsi, une augmentation de l'expression de HBEGF et une augmentation de l'expression de CXCL3 est associée à l'activation de LPAi spécifiquement, alors qu'une diminution de l'expression de HBEGF et une diminution de l'expression de CXCL3 est associée à l'inhibition de LPAi spécifiquement. Par conséquent, si l'expression respective des deux 20 marqueurs HBEGF et CXCL3 est modifiée en sens contraire, c'est-à-dire que l'expression d'un de ces deux marqueurs est augmentée alors que l'expression de l'autre de ces deux marqueurs est diminuée, il ne sera pas possible de conclure à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPAI spécifiquement. Ainsi, on ne pourra pas conclure que la modification de 25 l'expression de ces deux marqueurs est spécifique de la voie de signalisation du récepteur LPAi du LPA. Selon une première variante de mise en oeuvre, le procédé de l'invention permet la détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, par la mesure de 30 l'expression des deux marqueurs HBEGF et CXCL3 comme indiqué ci-dessus, et en utilisant comme valeur de référence le niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à 2 9 8 7055 4 déterminer. Selon une deuxième variante de mise en oeuvre, le procédé de l'invention permet également le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi, par la mesure de 5 l'expression des deux marqueurs HBEGF et CXCL3 comme indiqué ci-dessus, et en utilisant comme valeur de référence le niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur. Le récepteur de type 1 du LPA ou LPAi est également nommé parfois LPAR1 pour « lysophosphatidic acid receptor 1 », ou encore EDG2 « Endothelial 10 Differenciation Gene 2 », VZG1 « ventricular zone gene 1 », GPR26, « G protein-coupled receptor 26», Mrec1.3 (nomination d'après Macrae et al., 1996), Kdt2 (d'après le site internet Mouse Genome Informatix. http://www.informatics.jax.oro, nom : Lparl, ID : MGI:108429). Dans le cadre de l'invention, le récepteur LPAi correspond de 15 préférence au récepteur tel que décrit par An et al en 1997. Par ailleurs, selon l'invention, le mot « spécifique » ou « spécifiquement » utilisé en lien avec le récepteur LPAi ou son activité correspond à une activité du récepteur LPAi, et non à l'activité d'autres types de récepteurs du LPA, et notamment LPA2 à LPA7. 20 Dans le cadre de l'invention, le marqueur HBEGF (Heparin-Binding EGF- like growth factor), encore nommé HEGFL, DTR (Diphteria Toxin Receptor), correspond de préférence à celui décrit par Besner et al en 1990. En particulier, pour le marqueur HBEGF selon l'invention, la séquence nucléique de référence est de préférence la suivante : NM_001945.2 25 De même, la séquence protéique de référence pour le marqueur HBEGF selon l'invention est de préférence la suivante : EAW62069.1 Dans le cadre de l'invention, le marqueur CXCL3 (Chemokine C-X-C motif Ligand 3), encore nommé GROG, GRO-gamma (Growth Regulated Oncogene Gamma), SCYB3 (Small Inducible Cytokine Subfamily B Member 30 3), MIP2B, MIP2beta (Macrophage Inflammatory Protein-2-beta), correspond de préférence à celui décrit par Tekamp-Olson et al', en 1990. En particulier, pour le marqueur CXCL3 selon l'invention, la séquence nucléique de référence de préférence est la suivante : NM_002090.2. De même, la séquence protéique de référence pour le marqueur CXCL3 selon l'invention est de préférence la suivante : AAH16308.1. Le procédé selon l'invention permet en particulier de déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPA1 in vivo ou in vitro, et ce quelle que soit la variante du procédé selon l'invention. Selon l'invention, la valeur de référence est choisie en fonction de la variante de mise en oeuvre du procédé. Selon un deuxième aspect, la présente invention a également pour objet un procédé de détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPA1 tel que décrit ci-dessus, et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à déterminer. Dans le cadre de ce procédé, le composé dont l'activité modulatrice est à déterminer peut correspondre à un composé dont on souhaite déterminer l'activité en tant qu'agoniste ou antagoniste du récepteur LPA1. En particulier, le composé dont l'activité modulatrice est à déterminer est de préférence une molécule thérapeutique. Ce procédé permet ainsi de valider l'efficacité d'agonistes ou d'antagonistes dirigés spécifiquement contre le récepteur LPA1 dans des systèmes cellulaires complexes exprimant de multiples récepteurs du LPA, et en particulier dans un contexte thérapeutique. Selon un troisième aspect, la présente invention a également pour objet un procédé de suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPA1 tel que décrit ci-dessus, et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur. 2 9 8 7055 6 Dans cette variante particulièrement préférée, la présente invention permet ainsi de valider l'efficacité de composés thérapeutiques ayant spécifiquement pour cible le récepteur LPA1 et de suivre leur efficacité dans le temps au cours de la mise en place du traitement. De manière préférée, le 5 prélèvement antérieur correspond à un stade antérieur au cours du traitement avec le composé thérapeutique dont on souhaite valider l'efficacité, et non à un stade antérieur avant la mise en place dudit traitement. Ce procédé de validation et de suivi de l'efficacité de composés 10 thérapeutiques ciblant spécifiquement le récepteur LPA1 trouve application dans de nombreuses pathologies, et notamment dans le traitement des cancers, de la polyarthrite rhumatoïde, de la fibrose rénale, et de la fibrose pulmonaire. En cancérologie par exemple, il a été récemment montré que les récepteurs du LPA sont impliqués dans la carcinogène et dans la 15 dissémination métastatique des cancers du sein (Boucharaba et al, 2004 et 2006 ; Liu et al., 2009). Plus particulièrement le récepteur LPAi est une cible dans le cas du traitement des métastases osseuses du cancer du sein (Boucharaba et al., 2006). En plus de l'expression de HBEGF et de CXCL3, le procédé de l'invention 20 peut en outre comprendre une étape de mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), notamment choisi(s) parmi CSF2/GMCSF (Colony Stimulating Factor 2), CXCL11Groa., (Chemokine C-X-C Motif Ligand 1), IL-6 (Interleukine 6) et IL-8 (Interleukine 8) comme décrit par Boucharaba et al. en 2006. Ce mode de réalisation particulier peut 25 s'appliquer quelle que soit la variante de mise en oeuvre du procédé, à savoir pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPA1, mais également pour déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, ou encore pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA1. 30 Au sens de la présente invention, les termes « mesure de l'expression » ou « mesurer l'expression » signifient une mesure in vitro ou ex-vivo de l'expression. Par ailleurs, dans ces termes, le mot « expression » entend désigner à la fois la mesure de l'expression au niveau nucléique ou au niveau protéique. A cet effet, toute méthode de mesure ou de quantification bien connue de l'homme du métier peut être utilisée pour la mise en oeuvre de l'invention. En particulier, lorsque la mesure de l'expression est réalisée au niveau nucléique, et en particulier à partir d'ARN ou d'ADNc, celle-ci peut notamment être réalisée par analyse PCR, en particulier PCR quantitative ou qPCR, par hybridation micro-arrays (biopuces) ou Northern-blot. Lorsque la mesure de l'expression est réalisée au niveau protéique, les 10 techniques standards telles que le Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, cytométrie de flux ou immunocytologie peuvent être utilisées. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la mesure de l'expression des marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et en particulier par une technique PCR. 15 Au sens de la présente invention, tout acte défini en relation avec le terme « in vitro » couvre également le même acte en relation avec les termes « ex vivo» ou « in cellulo» ou avec tout terme équivalent du moment qu'il exclut une application au corps humain ou animal. Par « augmentation ou diminution significative du niveau 20 d'expression », on entend une augmentation ou une diminution statistiquement significative du niveau d'expression, de préférence associée ou corrélée à un indice de confiance d'au moins 95 % (p Dans le cadre de la présente demande, les termes « cancer » et « tumeur » sont utilisés indifféremment pour désigner un cancer, c'est-à-dire qu'ici le terme « tumeur » s'entend désigner une tumeur maligne c'est-à-dire cancéreuse. Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet l'utilisation de la mesure in vitro du niveau d'expression des marqueurs HBEGF et CXCL3 en tant que signature de l'activité du récepteur spécifique LPA1 du LPA, c'est-à-dire d'une activation ou d'une inhibition de ce récepteur. En effet, dans le cadre de cette utilisation, la mise en évidence d'une 10 augmentation du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'activation du récepteur spécifique LPAi, alors qu'une diminution du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'inhibition du récepteur spécifique LPAi. L'utilisation selon l'invention permet ainsi de déterminer in vitro l'activité 15 spécifique du récepteur LPAi, mais également de déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, ou encore le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA1. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure 20 du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est utilisée en tant que signature de l'activité du récepteur spécifique LPAi du LPA pour le suivi de l'efficacité in vivo d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA1. Dans le cadre de cet aspect, l'invention concerne de préférence 25 l'utilisation de la mesure du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 dans un échantillon biologique issu d'un patient traité avec ledit composé thérapeutique. Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé constituent également des 30 modes de réalisation préférés s'agissant de l'utilisation. En particulier, outre la mesure du niveau d'expression à la fois de HBEGF et de CXCL3, l'utilisation selon l'invention peut également comprendre la mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCL1/Groct, IL-6 et IL-8. Selon encore un autre aspect, la présente invention a aussi pour objet un kit pour déterminer l'activité du récepteur spécifique LPA1 du LPA, et en particulier l'activité in vivo de ce récepteur, comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de HBEGF et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CXCL3. Préférentiellement, ce kit contient des oligonucléotides spécifiques en 10 tant que réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression des marqueur(s) choisi(s), en particulier par une technique PCR. Par exemple, de tels oligonucléotides spécifiques peuvent être : HBEGF-F : 5'-GGACCCATGTCTTCGGAAAT-3' (SEQ ID NO : 1); et/ou HBEGF-R : 5'-CCCATGACACCTCTCTCCAT-3' (SEQ ID NO : 2); et/ou 15 CXCL3-F : 5'-ATCCCCCATGGTTCAGAAA-3' (SEQ ID NO : 3); et/ou CXCL3-R : 5'-ACCCTGCAGGAAGTGTCAAT-3' (SEQ ID NO : 4). De même, le kit de l'invention peut également contenir un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de LPA1, et en particulier les oligonucléotiques suivants : 20 LPA1-F : 5'-TGGCATTAAAAATTTTACAAAAACA-3' (SEQ ID NO : 5); et/ou LPA1-R : 5'- AATAGTTAACAACATGGGAATGG-3' (SEQ ID NO : 6). De préférence, le kit comprend en outre un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, 25 CXCL1/Groa, IL-6 et IL-8. L'invention couvre également l'utilisation d'un kit selon l'invention pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, selon l'une quelconque de ses variantes énoncées ci-dessus, à savoir pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPA1, pour la déterminer in vitro de l'activité 30 modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPA1, ou pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPA1. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le kit selon l'invention est utilisé pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi. Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont 5 mentionnés ci-dessus concernant le procédé et l'utilisation constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant du kit et de son utilisation. En particulier, l'invention couvre de préférence l'utilisation d'un kit comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le 10 niveau d'expression de HBEGF et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CXCL3, et éventuellement celui d'un ou de plusieurs autre) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCL1/Groa, IL-6 et IL-8, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, et de manière particulièrement préférée l'utilisation 15 d'un tel kit pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous en référence aux figures annexées qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de la présente invention, et dans 20 lesquelles : - la figure 1 représente l'effet de l'antagoniste VPC12249 sur l'expression de HBEGF et CXCL3 dans des cellules PC3, - la figure 2 représente l'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 dans des cellules MDA-B02, SK-BR-3, et MDA-B02/ LPAi, SK-BR-3/ LPAi, 25 - la figure 3 représente l'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 dans une collection d'ARN provenant de tumeurs primaires du sein, - la figure 4 représente la corrélation d'expression de LPAi en fonction des niveaux d'expression combinés de CXCL3 et de HBEGF dans une collection d'ARN provenant de tumeurs primaires du sein, 30 - la figure 5 représente l'effet de l'antagoniste Ki16425 sur l'expression de HBEGF et CXCL3 dans des tumeurs PC3 induites chez la souris. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. EXEMPLES Méthodes Les groupes de gènes dont l'expression est stimulée de façon précoce par l'activation spécifique du récepteurs LPA1 en réponse à une stimulation par le LPA ont été identifiés de la manière suivante. Une analyse croisée des données de transcriptomique de lignées cellulaires stimulées ou non par le LPA pendant un temps cours a été réalisée. Afin d'éliminer de l'analyse tous les gènes qui sont spécifiques à une seule lignée cellulaire une série de trois lignées cellulaires tumorales naturelles, non modifiées génétiquement, différentes tant au niveau de leur genre (mâle pour les PC3 et femelles pour les MDA-MB-231 et MCF-7) que de leur origine cancéreuse (cancer de la prostate hormono-indépendant pour les PC3, cancer du sein hormono-indépendant pour les MDA-MB-231 et cancer du sein hormono-dépendant pour les MCF-7) ont été utilisées. Les cellules ont été cultivées en absence de sérum pendant 24h puis mises en présence ou non de LPA (1 pM) pendant 45 minutes. Les ARN totaux de six réplicats indépendants de chaque lignée cellulaire ont été extraits à l'aide du kit Nucleospin RNAII (Macherey-Nagel) et les ARNs ont été traités avec une DNAse RNAse-free afin d'enlever toute trace de contamination par l'ADN génomique. Deux réplicats pour chaque condition ont été analysés sur des biopuces Affimétrix U133 Plus2.0 (54677 sondes). Après hybridation, selon les conditions préconisées par le fournisseur (Affimetrix UK Ltd, Royaume Uni), la moyenne d'intensité du signal émis par les sondes correspondant à chaque duplicat a été calculée pour chaque des conditions. Les duplicats présentant une intensité moyenne d'expression inférieure à la valeur Médiane d'expression (valeur=63) de l'ensemble des 54677 sondes de la biopuce ont été éliminés de l'analyse en raison d'un niveau d'expression trop faible et donc non fiable. Ont également été éliminés de l'analyse les sondes désignées comme « Absent », en présence de LPA, par le logiciel Affimétrix d'analyse de la biopuce. 2 9 8 7055 12 En absence de stimulation par le LPA, l'analyse montre que chaque lignée cellulaire utilisée exprime un panel différent des récepteurs du LPA, comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Edg2 Edg4 Edg7. GPR23 GPR92 P2Y5 GPR87 LPAi LPÂ2 LPA3 LPA4 LPA3 LPA6 LPA7 P2Y9 PC3 ++++ ++ +++ 0 0 +++ ++ MCF-7 0 +-Fi- o 0 0 0 +++ MDA-MB-231 ++ ++ 0 0 0 0 0 5 En résumé, les récepteurs du LPA majoritaires chez les PC3 sont LPA1,2,3,6,7, chez les MCF7 LPA2,7 et chez les MDA-MB231 LPA1,2. Une analyse par biopuces a ensuite été effectuée sur la base de 10 l'hypothèse suivante : les gènes régulés de façon similaire (activation/inhibition) uniquement dans les cellules PC3 et MDA-MB-231 identifient l'activation spécifique de LPAi. Pour cela, les trois types cellulaires ont été cultivés dans un milieu ne contenant pas de sérum. Puis elles ont été mises en présence de LPA 1 pM 15 pendant 45 minutes. Les cellules ont ensuite été récoltées et leur contenu en ARN total a été préparé. Chaque condition expérimentale a été reproduite 6 fois (6 réplicats) de façon indépendante. L'analyse par biopuces est basée sur la comparaison des moyennes d'expression de deux réplicats pour chaque condition. 20 L'analyse a été effectuée en excluant l'ensemble des sondes de la biopuce correspondant à des EST et à des gènes codant pour des séquences identifiées « protéines hypothétiques ». Ainsi, un ensemble de 56 gènes, non activé par le LPA chez les MCF7 (fo/d change = = 1.3) par le 25 LPA, a été identifié dans les cellules PC3 et MDA-MB-231 . Selon l'hypothèse formulée, cette liste de gènes correspond à la signature d'activation du récepteur LPAl. 2 9 8 7055 13 L'expression des deux gènes HBEGF et CXCL3 a notamment été analysée pour étudier le lien potentiel avec l'activité du récepteur LPA1. Exemple 1 : Analyse par RT-QPCR de l'expression de HBEGF et CXCL3 à partir de lignées cellulaires in vitro 5 a) Des cellules humaines de carcinome de prostate hormonaux- indépendantes PC-3 (ATCC CRL-135TM) ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humide à 5% de CO2 dans du milieu F-12K (Invitrogen) en présence de sérum de voeu foetal (10 %) et les ARN totaux ont été extraits à l'aide du kit Nucleospin RNAII (Macherey-Nagel) au bout de 45 minutes ou 10 16 heures après traitement des cellules à l'aide d'un antagoniste du récepteur LPA1 (VPC12249, 5 ou 10pM, Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA). Les ARNs ont été traités avec une DNAse RNAse-free afin d'enlever toute trace de contamination par l'ADN génomique. N'existant pas d'antagoniste spécifique uniquement du récepteur LPA1 15 disponible de façon commerciale, un antagoniste non spécifique des récepteurs LPA1/LPA3 (VPC12249) a été utilisé pour cette étude. L'expression de HBEGF et CXCL3 en tant que marqueurs spécifiques de l'activation du récepteur LPA1 a été étudiée par RT-PCR quantitative (QPCR) à partir des ARN totaux de 3 réplicats. Les ADNc ont été synthétisés 20 à partir de 1pg d'ARN en utilisant le kit 'Script cDNA Synthesis kit (Biorad). Les ARNm ont été amplifiés en utilisant le kit SYBR Green (Finnzymes) à l'aide d'amorces spécifiques (HBEGF-F : 5'-GGACCCATGTCTTCGGAAAT3' (SEQ ID NO : 1); HBEGF-R : 5'-CCCATGACACCTCTCTCCAT-3' (SEQ ID NO : 2); CXCL3-F : 5'-ATCCCCCATGGTTCAGAAA-3' (SEQ ID NO : 3); CXCL3- 25 R : 5'-ACCCTGCAGGAAGTGTCAAT-3' (SEQ ID NO : 4) grâce à l'Eppendorf Mastercycler RealPlex (Invitrogen). Les ADN complémentaires ont été amplifiés par une PCR de 40 cycles et les produits de PCR analysés par électrophorèse dans un gel 2% agarose marqués au bromure d'éthidium. Les valeurs de CF (cycle seuil ou Cycle Threshold obtenues ont été normalisées 30 par l'expression de l'ARNm ribosomal L32 par la méthode des hieiCt (L32-F : 5'-CAAGGAGCTGGAAGTGCTGC-3'(SEQ ID NO : 7); L32-R : 5'- CAGCTCTTTCCACGATGGC-3' (SEQ ID NO : 8). Les résultats sont regroupés sur la figure 1 et montrent que l'expression des gènes cibles de LPAi HBEGF et CXCL3 est inhibée par un antagoniste des récepteurs LPA1/LPA3. b) A partir des lignées de cellules humaines de cancer du sein MDA5 B02, un sous clone des cellules MDA-MB-231 (Peyruchaud et al., 2001) qui expriment l'ensemble des récepteurs du LPA décrits à ce jour (LPA1,6) et SKBR-3 (ATCC HTB-30Tm) qui n'expriment pas ou peu les récepteurs du LPA, des lignées cellulaires MDA-B02/LPAi qui surexpriment le récepteur LPAi et SK-BR-3/LPA1 qui expriment de novo LPA ont été construites par 10 transfection comme décrit par Boucharaba et al, 2004 et Boucharaba et al., 2006. L'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 a été étudiée par RT-PCR quantitative (QPCR) à partir des ARN totaux extraits de ces différentes lignées cellulaires MDA-B02, SK-BR-3, MDA-B02/LPAi et SK-BR-3/ LPAi 15 cultivées à 37°C dans du milieu DMEM (PAA) et McCoy's (Invitrogen) en présence de sérum de voeu foetal (10 %). Pour la mesure de l'expression de LPA1, les ARNm ont été amplifiés à l'aide d'amorces spécifiques suivantes : LPA1-F : 5'-TGGCATTAAAAATITTACAAAAACA-3'(SEQ ID NO : 5); LPA1-R : 5'- AATAGTTAACAACATGGGAATGG-3' (SEQ ID NO : 6). 20 Les résultats sont regroupés sur la figure 2, et montrent que les niveaux d'expression de HBEGF et de CXCL3 sont directement corrélés à celui de LPAi dans les lignées cellulaires humaines de cancers du sein MDAB02/LPAi et SK-BR-3/LPAi. c) Le niveau d'expression de LPAi, HBEGF et CXCL3 a également été 25 mesuré dans une série de lignées cellulaires provenant de différents cancers et cultivées en présence de 10% SVF (sérum de veau foetal), telles que PC3, LnCap (cancer de la prostate) ; MDA-MB231, T47D, MCF7 (cancer du sein) ; MG63, KHOS, Mnng/HOS (ostéosarcome) ; et MDA-MB435S (mélanome). Les résultats montrent que les lignées cellulaires ayant le niveau le plus 30 élevé de LPAi expriment le plus fortement HBEGF et CXCL3. Inversement, les lignées cellulaires ayant le niveau le plus bas de LPAi expriment le plus faiblement HBEGF et CXCL3. Ces résultats indiquent que la mesure de l'expression de HBEGF et de CXCL3 constitue une signature de l'activité du récepteur LPAi, que ce soit d'une activation ou d'une inhibition de ce récepteur. Exemple 2 : Analyse par RT-QPCR de l'expression de HBEGF et CXCL3 à partir d'une série d'ARN de tumeurs primaires de cancers du sein Une série de 260 échantillons d'ARN provenant de tumeurs primaires de patientes atteintes d'un cancer du sein a été analysé par QPCR pour les niveaux d'expression du gène codant LPAi, CXCL3 et HBEGF. a) L'analyse des deux marqueurs HBEGF et CXCL3 pris individuellement a tout d'abord été effectuée. Les résultats sont regroupés sur la figure 3. La population a été stratifiée en quatre sous-groupes de 65 personnes chacun (Quartiles) correspondant (i) au 1/4 de la population qui a le niveau de LPAi le plus faible (LPAi très bas +), (ii) au 1/4 de la population qui a le niveau atteignant la valeur médiane d'expression de LPA1 (LPAi bas ++), (iii) au 1/4 de la population qui a un niveau d'expression de LPA1 supérieur à la médiane (LPA1 moyen +++), et (iv) au 1/4 de la population qui a le niveau de LPA1 le plus fort (LPA1 haut ++++) (figure 3). L'analyse de différentes populations de tumeurs montre une corrélation 20 directe entre le niveau d'expression de LPAi et de HBEGF. Ceci est observé par le test-t série non appariées pour les deux populations ayant un niveau d'expression de LPA1 inférieur à la médiane (LPA1 très bas et LPAi bas) par rapport à la population ayant le niveau d'expression le plus élevé de LPAi (LPA1 haut), p=0,0215 et p=0,0219, respectivement (Tableaux 2 et 3 ci- 25 dessous). Le lien direct entre LPA1 et HBEGF a également été montré lorsque les 4 groupes sont comparés entre eux par le test Kruskal-Wallis, p=0.0027 (Tableaux 4 et 5 ci-dessous). Tableau 2 : Test-t série non-appariées pour HBEGF : Ecart moyen DDL t p LPA1 très bas, LPAI bas 8,312E-6 128 0,012 0,9906 LPAI très bas, LPAI moyen -0,001 128 -1,023 0,3084 LPAI très bas, LPAI haut -0,002 128 -2,328 0,0215 LPAI bas, LPAI moyen -0,001 128 -1,024 0,3079 LPAI bas, LPAI haut -0,002 128 -2,320 0,0219 LPAI moyen, LPAI haut -0,001 128 -1,290 0,1995 Tableau 3 : Effectifs pour Test-t série non-appariées pour HBEGF : nombre Moy. Variance Dév Std Erreur Std LPAI très bas 65 0,003 1,564E-5 0,004 4,905E-4 LPAI bas 65 0,003 1,639E-5 0,004 0,001 LPAI moyen 65 0,004 2,518E-5 0,004 0,001 LPAI haut 65 0,005 3,468E-5 0,004 0,001 Tableau 4 : Kruskal-Wallis pour HBEGF : DDL 3 # Groupes 4 # ex-aequo 48 H 14,139 Valeur de p 0,0027 H corrigé pour ex-aequo 14,139 p corrigé pour ex-aequo 0,0027 Tableau 5 : Effectifs pour Kruskal-Wallis pour HBEGF : nombre Somme des rangs Moy. Des rangs LPAI très bas 65 7360,500 113,238 LPAI bas 65 7760,500 119,392 LPAI moyen 65 8478,000 130,431 LPAI haut 65 10331,000 158,93810 De façon surprenant, aucune corrélation significative n'a été retrouvée pour les niveaux d'expression de LPAI et de CXCL3 pris individuellement (Tableaux 6 à 9 ci dessous). Tableau 6 : Test-t série non-appariées pour CXCL3 : Ecart moyen DDL t p LPAI très bas, LPAI bas -2,387E-4 128 -0,378 0,7063 LPAI très bas, LPAI moyen 4,685E-4 128 1,096 0,2753 LPAI très bas, LPAI haut 7,136E-5 128 0,158 0,8747 LPAI bas, LPAI moyen 0,001 128 1,371 0,1726 LPAI bas, LPAI haut 3,101E-4 128 0,579 0,5636 LPAI moyen, LPAI haut -3,971E-4 128 -1,499 0,1364 Tableau 7 : Effectifs pour Test-t série non-appariées pour CXCL3 : nombre Moy. Variance Dév Std Erreur Std LPAI très bas 65 0,002 1,028E-5 0,003 3,978E-4 LPAI bas 65 0,002 1,568E-5 0,004 4,912E-4 LPAI moyen 65 0,001 1,602E-6 0,001 1,570E-4 LPAI haut 65 0,001 2,962E-6 0,002 2,135E-4 Tableau 8 : Kruskai-Wallis pour CXCL3 : DDL 3 # Groupes 4 # ex-aequo 34 H 3,568 Valeur de p 0,3121 H corrigé pour ex-aequo 3,568 p corrigé pour ex-aequo 0,3121 2 9 8 7055 18 Tableau 9 : Effectifs pour Kruskal-Wallis pour CXCL3 : nombre Somme des rangs Moy. Des rangs LPIli très bas 65 7755,500 119,315 LPAi bas 65 8338,500 128,285 LPAi moyen 65 8480,500 130,469 LPAi haut 65 9855,500 143,931 b) Une deuxième analyse a ensuite été effectuée en combinant les deux marqueurs HBEGF et CXCL3. Les résultats sont regroupés sur la figure 5 4. La valeur médiane d'expression de chaque marqueur a été définie comme valeur seuil. La population a ainsi pu être stratifiée en quatre sous-groupes correspondant (i) à la population ayant CXCL3 inférieur à la médiane et HBEGF inférieur à la médiane (3BHB, 79 patients), (ii) à la population ayant CXCL3 inférieur à la médiane et HBEGF supérieur à la médiane (3BHH, 51 patients), (iii) à la population ayant CXCL3 supérieur à la médiane et HBEGF inférieur à la médiane (3HHB, 51 patients) et (iv) à la population ayant CXCL3 supérieur à la médiane et HBEGF supérieur à la médiane (3HHH, 79 patients). Pour chaque groupe, le niveau d'expression de LPAi a été calculé (figure 4). L'analyse par le test-t série non appariées montre que la combinaison du niveau d'expression de CXCL3 à celui de HBEGF présente une puissance statistique de corrélation beaucoup plus forte que HBEGF seul avec l'expression de LPAi : p=0,0070 (3HHB-3HHH) versus p=0,0215 (LPAi très bas-LPAi haut) (Tableaux 10 et 11 ci-dessous et Tableaux 2 et 3 ci-dessus). Cette analyse a été confirmée par l'analyse par le test Kruskal-Wallis en comparant l'ensemble des quatre populations (p=0,0144) (Tableaux 12 et 13 ci-dessous).25 Tableau 10 : Test-t série non-appariées pour LPA1 : Ecart moyen DDL t p 3BHB, 3BHH -0,001 128 -1,492 0,1383 3BHB, 3HHB 3021E-5 128 0,069 0,9451 3BHB, 3HHH -0,002 128 -3,172 0,0018 3BHH, 3HHB -0,001 128 1,412 0,1612 3BHH, 3HHH -0,001 128 -1,578 0,1170 3HHB, 3HHH -0,002 128 -2,740 0,0070 Tableau 11 . Effectifs pour Test-t série non-appariées pour LPAi : nombre Moy. Variance Dév Std Erreur Std 3BHB 79 0,003 5,934E-6 0,002 2,743E-4 3BHH 51 0,003 6,325E-6 0,003 3,522E-4 3HHB 51 0,003 5,915E-6 0,002 3,405E-4 3HHH 79 0,004 1,458E-5 0,004 4,296E-4 Tableau 12 : Kruskal-Wallis pour LPAI. : DDL 3 # Groupes 4 # ex-aequo 26 H 10,550 Valeur de p 0,0144 H corrigé pour ex-aequo 10,550 p corrigé pour ex-aequo 0,0144 Tableau 13 : Effectifs pour Kruskal-Wallis pour LPAi : nombre Somme des rangs Moy. Des rangs 3BHB 79 9200,200 116,456 3BHH 51 7164,500 140,480 3HHB 51 5831,500 114,343 3HHH 79 11734,000 148,532 2 9 8 7055 20 Exem le : Effet d'un anta e LPA LPA sur l'ex n de HBEGF et CXCL3 dans des tumeurs induites chez la souris L'expression de HBEGF et CXCL3 a été analysée par RT-QPCR à partir de xénogreffes de cellules PC3 générées par injection sous-cutanée chez la 5 souris Balb/c nulle. Pour ce faire, des cellules humaines de carcinome de prostate hormonaux-indépendantes PC-3 (ATCC CRL-135Tm) ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humide à 5% de CO2 dans du milieu F-12K (Invitrogen) en présence de sérum de voeu foetal (10 %). Une injection avec 106 cellules PC3 a été réalisée par voie sous-cutanée chez les souris (n=16). Lorsque les tumeurs ont atteint 1mm3, certains des animaux (n=9) ont reçu un traitement avec l'antagoniste non spécifique des récepteurs LPA1 et LPA3 (Ki16425, Cayman) à raison d'une injection quotidienne (20mg/kg/jour) par injection sous-cutanée pendant 5 jours. Les tumeurs ont été récoltées au moment du sacrifice. Les ARN totaux ont été préparés et analysés pour les niveaux d'expression de HBEGF et CXCL3, comme décrit ci-dessus. Les résultats sont regroupés sur la figure 5 et montrent que l'expression de HBEGF et de CXCL3 est significativement diminuée (p REVENDICATIONS1. Procédé de détermination in vitro de l'activité spécifique du récepteur LPAi comprenant les étapes consistant à : - mesurer le niveau d'expression des marqueurs HBEGF (Heparin-Binding EGF-like growth factor) et CXCL3 (Chemokine C-X-C motif Ligand 3) dans unéchantillon, et - conclure respectivement à l'activation ou à l'inhibition du récepteur LPAi spécifiquement lorsqu'une augmentation ou une diminution significative du niveau d'expression de ces deux marqueurs est mise en évidence par rapport à une valeur de référence. 2. Procédé de détermination in vitro de l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé selon la revendication 1 et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs avant l'ajout dudit composé dont l'activité modulatrice est à déterminer. 3. Procédé de suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes du procédé selon la revendication 1 ou 2 et que la valeur de référence correspond au niveau d'expression desdits marqueurs dans un prélèvement antérieur. 4. Procédé selon rune quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que qu'il comprend en outre une étape de mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s) choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCL1/Groa, IL-6 et IL-8. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mesure du niveau d'expression des marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et de préférence par une technique PCR. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon est d'origine biologique, et de préférence humaine. 7. Utilisation de la mesure in vitro du niveau d'expression des marqueurs HBEGF et CXCL3 en tant que signature de l'activité du récepteur spécifique LPA1 du LPA, c'est-à-dire d'une activation ou d'une inhibition de ce récepteur. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'une augmentation du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'activation du récepteur spécifique LPA1, alors qu'une diminution du niveau d'expression de HBEGF et de CXCL3 est une signature de l'inhibition du récepteur spécifique LPA1. 9. Utilisation selon la revendication 7 ou la revendication 8 pour déterminer in vitro l'activité spécifique du récepteur LPAI, pour déterminer in vitro l'activité modulatrice d'un composé vis-à-vis spécifiquement du récepteur LPAi, ou pour le suivi de l'efficacité in vivo d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi. 10.Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 comprenant également la mesure du niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCL1/Groa, IL-6 et IL-8. 11. Kit pour déterminer l'activité du récepteur spécifique LPA1 du LPA, en particulier l'activité in vivo de ce récepteur, comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de HBEGF et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CXCL3. 12.Kit selon la revendication 11, caractérisé en qu'il comprend en outre un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCL1/Groa, IL-6 et IL-8. 13. Utilisation du kit tel que défini à l'une quelconque des revendications 11 et 12, pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6. 14. Utilisation du kit selon la revendication 13, pour le suivi de l'efficacité d'un composé thérapeutique pour cibler spécifiquement le récepteur LPAi. 15.Utilisation du kit selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que ledit kit comprend un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de HBEGF et un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression de CXCL3, et éventuellement celui d'un ou de plusieurs autre(s) marqueur(s), de préférence choisi(s) parmi CSF2/GMCSF, CXCL1/Groa, IL-6 et IL-8.