Brevet FR2990441A1 — publié le 20131115

Procédé de préparation d'un matériel infectieux contenant des prions La présente invention concerne un procédé in vitro de préparation d'un matériel infectieux contenant des protéines prions (« spike »), ainsi que l'utilisation dudit matériel infectieux, notamment pour l'évaluation et/ou le contrôle in vitro de l'efficacité d'une étape de sécurisation biologique applicable aux procédés d'obtention ou de purification d'un produit biologique. Etat de la technique : Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) sont des maladies dégénératives du système nerveux central (SNC) qui touchent aussi bien l'homme (par exemple la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ) et le kuru) que l'animal (notamment la tremblante du mouton et l'encéphalopathie spongiforme bovine). L'agent étiologique de ces maladies est classé dans la catégorie des "agents transmissibles non conventionnels" (ATNC). Le seul agent identifié à ce jour est la protéine du prion sous sa forme anormale, appelée PrPsc. La protéine normale (PrP, protéine du prion cellulaire) est une protéine extracellulaire, qui suite à une transformation post-translationnelle au cours de la maladie, acquière des propriétés physicochimiques différentes (comme par exemple l'insolubilité dans certains détergents et la résistance aux protéases). Cette protéine PrPsc présente une conformation différente par rapport à la protéine normale PrPc. De manière caractéristique, l'apparition des signes cliniques, et notamment les lésions histologiques, est précédée d'une longue période d'incubation cliniquement silencieuse, pendant laquelle la forme pathologique de la protéine prion PrPsc s'accumule dans le système nerveux central. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du gène codant pour la PrP, ni d'altération de sa traduction chez les sujets atteints d'EST (Prusiner, Biochemistry 1992 ; 31 :12277- 88). De nombreuses études visant à détecter la présence d'infectiosité sanguine dans les EST ont été menées ces dernières années (ref : Brown, P., Vox Sanguinis (2005) 89, 63-70). L'ensemble de ces travaux montre qu'une très faible infectiosité sanguine (10-30 Unités Infectieuses/m1) peut être mise en évidence expérimentalement dans certaines maladies à prions. Or, l'utilisation dans l'industrie pharmaceutique des dérivés sanguins, tels que les protéines plasmatiques de la coagulation, connait un essor croissant depuis de nombreuses années. Il est connu d'inclure des étapes de sécurisation dans les procédés de purifications telles que le traitement solvant/détergent Tween-TNBP (tri-n-butyl phosphate), afin d'éliminer / inactiver les agents pathogènes potentiellement présents. Les traitements inactivants se sont cependant révélés inefficaces contre les ATNC. On cherche donc aujourd'hui à évaluer l'efficacité des étapes d'élimination des ATNC au sein des procédés de purifications des produits biologiques d'intérêt. Pour cela, il est connu de charger (« spiker ») les produits biologiques que l'on cherche à évaluer et de titrer la PrPsc en amont et en aval de l'étape d'élimination des ATNC concernée, afin d'obtenir une valeur de réduction de l'agent pathogène pour l'étape étudiée. Les méthodes de titrage in vitro des agents infectieux des EST consistent généralement en une détection de la PrPsc par Western-Blot (Mac Gregor, Transfusion J. Medecine 2001 ; 11, 3-14) ou par ELISA. Ces techniques nécessitent généralement une digestion préalable de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des agents chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine normale (PrP). Une autre méthode de titrage a été développée basée sur l'utilisation des anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP (Korth et al, Nature 1997 Nov6, 390 (6655) : 74-7). Le procédé appelé « PMCA » (Protein misfolding cyclic amplification), décrit dans le document Saborio et al. (Nature ; 2001, 411, 810-3), prévoit la mise en contact de formes pathologiques provenant d'un tissu ou d'un fluide issu d'un animal contaminé avec une forme non pathologique de la protéine d'ATNC, afin de convertir cette dernière en une forme pathologique. La méthode de la PMCA, bien qu'encore en développement, s'avère au moins aussi sensible que le bioessai (méthode in vivo de titrage de l'infectiosité). Néanmoins elle ne fournit pas une mesure de l'infectiosité associée à la PrPsc détectée et s'avère difficile à mettre en oeuvre avec des matrices plasmatiques. En outre il a été rapporté une reproductibilité incertaine et des résultats faussement positifs. Le document WO 2005/022148 décrit une méthode de titrage in vitro, appelée « TCIA » ("tissue culture infectivity assay"), d'un ATNC dans un produit biologique, au moyen de la mise en contact de cellules transgéniques supportant la réplication dudit ATNC avec le produit biologique, puis la culture de ces cellules pendant un ou plusieurs passages pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans le produit biologique par réplication de l'ATNC. Par ailleurs, le choix du matériel infectieux (« spike ») pouvant être utilisé pour de telles méthodes de titrage est actuellement très limité. On utilise généralement un homogénat de cerveau infecté provenant de rongeurs inoculés par voie intracérébrale avec du matériel infectieux. Par exemple, Miekka et al. (« Inactivation of viral and prion pathogens by y irradiation under conditions that maintain the integrity of human albumin » Vox Sanguinis Volume 84, issue 1, pages 36-44 January 2003) divulgue l'utilisation d'un homogénat de hamster infecté par la souche 263K (souche scrapie adaptée à l'hamster) dans l'évaluation de l'efficacité de l'irradiation gamma sur l'inactivation de la PrPsc de hamster dans une solution d'albumine à 25%, sans altérer l'intégrité de l'albumine humaine. Il est connu d'utiliser comme source humaine de matériel infectieux des préparations standards de cerveau et de rate provenant de sujets atteints du variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob (vCJD), disponibles auprès du National Institute for Biological Standard and Controls (NIBSC). Elles consistent en des homogénats de tissu à 10%, aliquotes et stockés. L'utilisation d'un homogénat de cerveau comme matériel infectieux pose cependant des problèmes techniques de compatibilité avec les produits à tester ou avec les méthodes d'élimination/inactivation. En effet, la richesse en lipides d'un extrait cérébral peut provoquer un phénomène d'absorption du produit biologique que l'on cherche à obtenir sur des agrégats de cerveau. Autrement, l'insolubilité qui en résulte peut augmenter artificiellement le facteur de réduction en PrPsc puisque le matériel infecté peut colmater un filtre ou sécher à la surface du matériel à décontaminer. Si on utilise une dilution d'homogénat de cerveau pour supprimer ces phénomènes, le titre infectieux est alors insuffisant, d'autant plus que l'homogénat est déjà préparé par une dilution à 10% poids de cerveau/volume de diluant. L'utilisation d'un homogénat de cerveau comme matériel infectieux pose également des problèmes en termes de coût en animaux et en main d'oeuvre qualifiée. Le matériel infectieux est par ailleurs difficile à standardiser. En effet, la dose infectieuse dans un cerveau d'animal infecté résulte de l'inoculation par voie intracérébrale d'un matériel infectieux, dont on ne connait pas forcément la charge infectieuse. Il s'avère en outre que la PrPsc d'un homogénat de cerveau ne constitue probablement pas un modèle très représentatif de la forme infectieuse potentielle retrouvée dans le sang, qui est présumée plus « soluble » et moins « agrégée ». Le document FR 2 885 369, lui, propose en tant que matériel infectieux de type prion, un lysat cellulaire et surnageant de culture cellulaire provenant de cellules transgéniques stables exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène PrPsc. Selon FR 2 885 369, le titre infectieux du matériel est avantageusement supérieur de 50% au moins au titre infectieux d'un homogénat de cerveaux d'animaux infectés par ladite PrPsc. Il n'existe cependant pas de procédé permettant d'obtenir de manière systématique et fiable un matériel infectieux concentré sans adjonction de détergent. Il existe donc un fort besoin d'obtenir un matériel infectieux suffisamment concentré et ayant un titre infectieux permettant son utilisation notamment dans des procédés de vérification de bonne sécurisation. Résumé de l'invention : L'invention propose un procédé in vitro de préparation d'une solution contenant des protéines prions pathogènes PrPsc, avantageusement sans détergent, pouvant être notamment utilisé comme matériel infectieux concentré. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir de manière reproductible et standardisée un matériel infectieux consistant en un lysat cellulaire et/ou surnageant de culture provenant de cellules exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène PrPsc de ladite protéine PrP. Pour cela, le procédé selon l'invention comporte les étapes consistant à : a. cultiver des cellules exprimant des protéines prions et supportant la réplication de la forme pathogène desdites protéines prions, jusqu'à ce que la croissance des cellules parvienne à une phase de plateau ; b. incuber ensuite les cellules sans apport nutritionnel, jusqu'à ce que les cellules meurent par apoptose, formant ainsi un lysat cellulaire; c. recueillir le lysat cellulaire et/ou le surnageant de culture obtenu constituant ledit matériel infectieux. Avantageusement, les cellules cultivées sont mises en contact au moins une fois lors de l'étape a) avec un matériel infectieux de protéines prions PrPsc. Selon le procédé de l'invention, l'étape de culture cellulaire peut comprendre au moins 5 passages, de préférence 9 passages et encore plus préférentiellement 7 passages. Avantageusement, une unique mise en contact des cellules avec l'agent infectieux PrPsc est réalisée avant le premier passage, lors de l'ensemencement des cellules, par exemple en mélangeant l'agent infectieux au milieu de culture. Il est également possible de prévoir une mise en contact avec l'agent infectieux PrPsc lors d'un ou plusieurs passages, en plus ou à la place de la mise en contact lors de 1 ' ensemencement. De manière avantageuse, le lysat cellulaire de l'étape b) peut être récolté avec le surnageant de culture, permettant ainsi de récupérer également les particules prion libérées dans le milieu de culture via les exosomes. Le matériel infectieux constitué par ces deux fractions est ainsi plus enrichi en particules prions qu'un lysat cellulaire ou surnageant de culture récolté seul. Avantageusement, le lysat cellulaire et/ou surnageant de culture sont concentrés par centrifugation et/ou filtration après l'étape c). Il est également possible de prévoir une étape de sonication du lysat cellulaire et/ou surnageant de culture, préférentiellement après l'étape c), afin de désagréger des agrégats potentiellement formés entre des protéines prions pathogènes PrPsc. Avantageusement, les étapes a) et b) sont réalisées dans un milieu de culture liquide, et l'étape a) est terminée, c'est-à-dire que la phase de plateau est obtenue, lorsque les cellules parviennent à sensiblement 100% de confluence. Selon un exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'étape b) menant à la mort cellulaire peut durer au moins 20 jours, de préférence au moins 30 jours, de préférence encore entre 30 et 60 jours (To correspondant par exemple à J+7 post dernier passage de l'étape a)). Les cellules exprimant des protéines prions utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent être des cellules transgéniques exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène PrPSc de la protéine PrP, et notamment des cellules de la lignée MovS6, ou un clone cellulaire issu de ladite lignée. L'invention a également pour objet un matériel concentré infectieux contenant des protéines prions, obtenu, ou susceptible d'être obtenu, par le procédé selon l'invention. L'invention a également pour objet l'utilisation de ce matériel infectieux obtenu selon le procédé de l'invention, pour évaluer et/ou contrôler l'efficacité des étapes de sécurisation biologique ainsi que de décontamination applicables aux procédés de purification d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC, et notamment un produit sanguin. Description détaillée de l'invention : Définitions Une « protéine prion PrP » est généralement une sialoglycoprotéine ancrée à la membrane plasmique par un phosphatidyl glycolipide (GPI), présente à l'état naturel dans les cellules et impliquée dans leur fonctionnement normal. La forme normale de la protéine, c'est-à-dire non pathologique, est généralement appelée PrPc. La forme « pathologique » PrPsc de la PrP désigne généralement une isoforme de la protéine non pathologique (incluant ses formes intermédiaires ou nucléiques). La PrPsc représente le marqueur des maladies à prions. Cette protéine est actuellement considérée comme l'élément porteur d'infectiosité retrouvé dans tous les cas d'infection par un ATNC, en particulier dans le cerveau. La PrPsc est capable de provoquer les symptômes des EST par inoculation intracérébrale chez un individu sain. En effet, l'agent responsable de la réplication ou propagation de la PrPsc serait la protéine prion pathologique elle-même car capable de se propager ou multiplier de façon exponentielle, en déformant les protéines prion saines en protéines prion pathologiques. La forme dite « pathologique » de la PrP, est donc la forme de la protéine dont la conformation est corrélée à l'apparition d'une EST chez l'animal humain ou non-humain infecté. La structure tridimensionnelle modifiée de la PrPsc par rapport à celle de la PrPc, lui confère des propriétés physico-chimiques atypiques, qui se traduisent par une plus grande résistance aux moyens de désinfection et de stérilisation habituels (chaleur, produits chimiques, enzymes, etc.). La protéine prion pathologique acquiert des capacités d'auto-agrégation et peut ainsi former des dépôts, notamment dans le cerveau, provoquant la mort neuronale. Les cellules exprimant des protéines prions et supportant la réplication de la forme pathogène sont des cellules qui ont été mises en contact avec l'agent infectieux PrPsc, de sorte que les protéines prions saines produites par lesdites cellules sont au moins partiellement déformées par les protéines prions pathogènes. La forme pathologique de la protéine prion produite est détectée dans le lysat cellulaire ou dans le surnageant de culture. Tout ou partie de cette forme pathologique cytosolique peut être récupérée dans le lysat cellulaire. Selon l'invention, les cellules cultivées exprimant les protéines prions peuvent avoir été mises en contact avec la forme pathogène PrPsc préalablement à l'étape a). Un "passage" est généralement le repiquage de tout ou partie des cellules d'une boîte de culture dans une autre boîte contenant du milieu de culture neuf. Chaque passage permet de contrôler l'effectif d'une population cellulaire et de lui fournir une quantité de substrat adaptée à son effectif Le «titre», exprimé en unité Western-blot, est une grandeur arbitraire déterminée par la dilution limite de l'échantillon à partir de laquelle plus aucune immunoréactivité n'est observée par western-blot. Par « Uwb» (Unité Western-blot) on désigne une quantité de PrPsc détectable par Western-blot. Généralement, il existe une différence de sensibilité entre les méthodes de titrage par Western-blot et par TCIA. Compte-tenu de cette différence, un titre en marqueur de l'infection supérieur ou égal à 2 logio unités Western Blot/million de cellules (Uwb/million de cellules), de préférence supérieur ou égal à 3 logio Uwb/million de cellules est équivalent à un titre en infectiosité supérieur ou égal 3.5 logio TCID50/ml, de préférence supérieur ou égal à 5 logio TCID50/ml. Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout agent transmissible non conventionnel, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ familiale ou sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ, ou bien encore ceux responsables chez les animaux d'EST naturelles, telles que la tremblante ovine, l'encéphalopathie spongiforme bovine ou féline, le dépérissement chronique des cervidés ou l'encéphalopathie spongiforme du vison, ou enfin de souches d'EST expérimentalement adaptées à l'animal de laboratoire. Dans le contexte de l'invention, l'ATNC est également désigné par le terme ((agent infectieux ». Par « phase de plateau », on entend l'arrêt de la multiplication cellulaire, les cellules entrant en phase stationnaire. Dans le cas où les cellules sont cultivées sur un support solide, on peut estimer que la phase de plateau est obtenue lorsque les cellules sont arrivées à sensiblement 100% de confluence. La confluence représente le degré d'écartement existant entre les cellules adhérentes cultivées en monocouches, 100% de confluence signifiant que les cellules forment un tapis cellulaire ne présentant aucun interstice entre cellules. Avantageusement, l'étape a) est conduite à une température comprise entre 30°C et 40°C, et préférentiellement environ 37°C. L'étape a) peut être conduite sur une période plus ou moins longue, selon la surface sur laquelle elle est conduite, le nombre de passages, la nature du milieu de culture etc. Préférentiellement, l'étape a) dure entre 20 jours et 60 jours, et de manière préférée environ 50 jours L'incubation des cellules à l'étape b) consiste en un maintien des cellules obtenues à la fin de l'étape a) dans le milieu de culture où elles se trouvent, à une température généralement comprise entre 30°C et 40°C, et de manière préférée environ 37°C, sans aucun apport nutritionnel extérieur. L'incubation peut durer pendant au moins 20 jours, et préférentiellement pendant un temps compris entre 40 et 60 jours, et de manière préférée environ 50 jours. La carence en nutriment déclenche l'apoptose, c'est-à-dire la mort cellulaire programmée. L'apoptose se traduit par une condensation du cytoplasme dans les cellules et par une fragmentation du noyau et du cytosquelette, entrainant la formation de corps apoptotiques rejetés dans le milieu extérieur, c'est-à-dire le milieu de culture. Avantageusement, le lysat cellulaire est donc obtenu en l'absence de détergent, en particulier le lysat cellulaire ne subit pas de traitement à la benzonase, qui est une endonucléase couramment utilisée pour éliminer les acides nucléiques présents dans un échantillon. Le lysat cellulaire selon l'invention ne subit pas non plus de traitement à la protéinase K, enzyme permettant la discrimination entre la forme native PrP non pathologique et la forme PrPsc associée à l'apparition des EST. L'absence de traitement par détergent permet entre autre d'éviter toute dénaturation de la protéine prion et d'obtenir ainsi un matériel infectieux plus représentatif de la forme naturelle du prion. Avantageusement, l'ensemble des cellules mortes et des corps apoptiques forme le matériel infectieux recueilli à l'étape c), par exemple par filtration du milieu de culture. Le lysat cellulaire et/ou surnageant de culture obtenu à la fin de l'étape c) constituent le matériel infectieux qui peut être stabilisé par congélation, séchage, lyophilisation, atomisation, en présence éventuellement de substances connues de l'homme du métier et destinées à éviter une perte du titre infectieux selon le mode de stabilisation mis en oeuvre. On observe toutefois que le matériel infectieux de l'étape c) selon le procédé de l'invention présente une stabilité dans le temps d'au moins 8 semaines, même à des températures comprises entre 30°C et 40°C, et notamment à 37°C, sans qu'aucune des étapes de stabilisation précitées ne soit nécessaire. Dans le cadre de la présente invention, on entend par « matériel infectieux purifié » le matériel infectieux issu de l'étape c) qui a subit plusieurs étapes de clarification et/ou centrifugation et/ou filtration. Les cellules exprimant des protéines prions cultivées à l'étape a) sont avantageusement des cellules transgéniques stables supportant la réplication de la forme pathogène PrPsc de la protéine PrP, c'est-à-dire au sein desquelles on constate une accumulation de la PrPsc. Vilette et al (PNAS, Mars 2001, 98(7), 4055-4059) ont montré que des cellules épithéliales de lapin, transgéniques et stables, exprimant la PrP ovine (transgène), sont capables de répliquer la PrPsc ovine après infection par des extraits contenant de la PrPsc ovine. Le modèle cellulaire qu'ils ont construit, la lignée Rov9, exprime de façon inductible la PrP exogène, ce qui garantit son maintien lors de la période d'incubation nécessaire à l'accumulation de la PrPsc dans ces cellules mises en contact avec un matériel infectieux. De telles cellules transgéniques stables, supportant la réplication d'une PrPsc, sont susceptibles d'être utilisées dans le procédé selon l'invention. Notamment, les cellules utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent avantageusement provenir de cellules épithéliales de lapin de la lignée Rov9. Archer et al. (Journal of Virology, Jan. 2004, p 482-490) ont construit un autre type de lignée cellulaire stable supportant la réplication d'une Prpsc. Leur modèle consiste en des cellules gliales murines exprimant la PrP ovine et supportant la réplication de la PrPsc ovine, les cellules MovS. De telles cellules transgéniques stables, supportant la réplication d'une PrPsc, peuvent également être utilisées dans le procédé selon l'invention. Notamment, les cellules utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent avantageusement être des cellules gliales murines de la « lignée MovS6 », et préférentiellement un clone cellulaire issue de la lignée MovS6 » appelé « MovS6- 4 ». Par « lignée MovS6 », on désigne une lignée cellulaire exprimant la protéine prion PrP, provenant d'un isolement de cellules réalisé à partir d'un ganglion de racine dorsale de souris transgénique sur-exprimant le gène de la PrP ovine. La souris transgénique sur-exprimant le gène de la PrP ovine dont provient la lignée cellulaire MovS6 est issue d'un croisement entre une souris tg301 sur-exprimant le gène de la PrP ovine (Vilotte et al. (2001), J. Virol. Vol. 75, p5977-5984) et une souris prp0/0 exprimant l'antigène T (Tag) du SV40 (Schwarz et al. (1991), Bio Cell vol. 73 :714). La fabrication de la lignée cellulaire MovS6 est décrite dans le document Archer et al. (2004), J. Virol., p. 482-490. La lignée cellulaire MovS6 est une population hétérogène de cellules, non seulement en termes de propriétés fonctionnelles, mais aussi de propriétés biologiques. En effet, le ganglion de la racine dorsale à partir duquel elle a été isolée réunit des populations cellulaires différentes, notamment des cellules gliales, différents types de neurones, etc. Dans le cadre de l'invention, l'expression « clone cellulaire issu de la lignée MovS6 » représente l'ensemble des cellules filles dérivées par divisions cellulaires d'une cellule mère unique appartenant à la lignée MovS6, et possédant un patrimoine génétique identique à celui de la cellule mère. L'isolement des clones peut se faire au moyen d'une technique connue de l'homme du métier, par exemple par dilution limite ou en cytomètre en flux, cette liste n'étant pas limitative. Le clone cellulaire « MovS6-4 » correspond au clone décrit dans le document 25 FR0855985 et déposé le 22 février 2008 sous le numéro CNCM 1-3922 à la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, FRANCE). D'une manière générale, la PrPsc infectieuse présente dans le matériel infectieux selon l'invention est d'origine ovine, bovine ou humaine. De préférence, elle représente la protéine prion ovine de la tremblante du mouton ou la protéine prion humaine du variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob. Culture des cellules : Les cellules utilisées dans le procédé selon l'invention sont par exemple cultivées dans des flacons ou des boites de Pétri, avec un milieu de culture renouvelé régulièrement, et par exemple tous les sept jours, afin de garantir un apport nutritionnel optimal aux cellules. Le milieu de culture utilisé est un milieu adapté à la croissance des cellules mises en oeuvre. Dans un exemple de réalisation, l'étape de culture cellulaire est réalisée en milieu DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium) + Ham-F12 (Life Technologies, Cergy Pontoise, France) (4 :1) complémenté en Pénicilline/Streptomycine (Pen/Strep 1% final) et sérum de veau foetal (5% final). Les cellules sont incubées à 37°C sous 5% de CO2. Un passage des cellules (avec un taux de réensemencement (split ratio) de 1 pour 10, soit 1 cellule sur 10 remise en culture) est réalisé chaque semaine. A chaque passage le milieu de culture appauvri est retiré, par exemple à l'aide d'une pipette. Les cellules sont lavées avec un tampon tel qu'un tampon phosphate. Afin de décoller les cellules accrochées au support, on peut prévoir par exemple un traitement à la trypsine. Dans ce cas, on ajoute avantageusement un inhibiteur de la trypsine à la solution dans laquelle les cellules vont être resuspendues. L'ensemble est homogénéisé, et on prélève un volume déterminé de cette solution, par exemple 10% du volume total, que l'on dépose sur un nouveau support de culture cellulaire stérile, auquel on ajoute du milieu de culture neuf. Lors de chacune des phases de croissance cellulaire, les cellules sont maintenues à une température généralement comprise entre 30°C et 40°C et de préférence à 37°C, avantageusement sans agitation. L'étape de culture cellulaire, lors de laquelle la croissance des cellules est favorisée peut durer entre 20 et 60 jours, et notamment environ 50 jours. Les cellules peuvent être mises en contact avec un agent infectieux, tel qu'une protéine PrPsc de Scrapie, à tout moment lors de l'étape de culture cellulaire. Préférentiellement, la première mise en contact avec l'agent infectieux a lieu lors de l'ensemencement, en mélangeant l'agent infectieux au milieu de culture. On peut également prévoir plusieurs mises en contact successives, notamment lors de chaque passage, en ajoutant l'agent infectieux au milieu de culture utilisé. L'agent infectieux en question peut être sous la forme d'un homogénat de cerveaux d'animaux d'une espèce donnée infectés par une PrPsc. Dans un exemple particulier on utilise un homogénat à 20% (poids/volume) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/mi par la souche de Scrapie PG127. Dans un autre exemple, on utilise une fraction microsomale produite à partir d'un tel homogénat à 20%. Le produit résultant de la mise en culture des cellules contient la PrP sous sa forme pathologique, dont la quantité est supérieure à la quantité initialement présente dans l'échantillon biologique, si celui-ci en contient. La PrP sous sa forme pathologique s'accumule au sein des cellules infectées, puis est excrétée dans le milieu de culture ou exposée à la surface des cellules. La phase d'incubation devant aboutir à la mort cellulaire est conduite simplement en cessant de renouveler le milieu de culture des cellules. Le matériel infectieux récupéré au terme de l'étape b) présente un titre d'infectiosité déjà élevé, puisqu'on mesure dans le lysat cellulaire et/ou surnageant de culture un titre supérieur à 4 LogUwb/ml. Désagrégation : Si nécessaire, de nombreuses méthodes peuvent être utilisées pour désagréger les agrégats. On peut citer à titre d'exemple le traitement avec un solvant (comme le dodecyl sulfate de sodium, le dimethylsulfoxide, l'acétonitrile, la guanidine, l'urée, le trifluoroéthanol, l'acide trifuroacétique dilué, l'acide formique dilué, cette liste n'étant pas limitative), la modification des caractéristiques physico-chimiques de la solution, telles que le pH, la température, la force ionique, la constante diélectrique, ainsi que les méthodes physiques, comme la sonication, l'irradiation au laser, la congélation/décongélation, l'incubation en autoclave, la haute pression, l'homogénéisation douce, ou encore d'autres sources d'irradiation, cette liste n'étant pas limitative. Préférentiellement, on utilise la sonication. La sonication est une méthode connue de l'homme du métier, et souvent mise en oeuvre dans les méthodes de purification de la PrP', en permettant d'augmenter la solubilité des agrégats. Afin de détruire au moins partiellement les agrégats formés par les PrPsc dans l'échantillon récupéré à l'étape c) du procédé selon l'invention, on peut donc avantageusement prévoir une étape de sonication, par exemple à l'aide d'un sonicateur à 0.1min/ml. Concentration du matériel infectieux : Une étape de clarification de l'échantillon par clarification peut être prévue après sonication, par exemple à 250g pendant 5 minutes. Il est également possible de filtrer le matériel infectieux de l'étape c) sur un filtre tel qu'un filtre AMICON 3K, 10K ou 100K. Préférentiellement, le filtre utilisé ne sera pas supérieur à 50K, afin d'éviter toute perte de matériel infectieux lors de la filtration. Avantageusement, le filtre utilisé est un filtre AMICON 3K. L'utilisation de différents filtres permet l'obtention d'un matériel infectieux calibré selon la perméabilité des cassettes de filtration. Au moins une étape de centrifugation peut être conduite de préférence de manière concomitante à l'étape de filtration. De préférence la centrifugation est menée à 4500g pendant 1 heure à température ambiante. Au terme de la centrifugation, le filtrat est évacué. Une nanofiltration du concentrât issu de la filtration sur filtre AMICON et centrifugation peut être réalisée. On utilise par exemple un nanofiltre 0.11.1m. Au moins une étape de centrifugation peut être conduite de préférence de manière concomitante à l'étape de nanofiltration. De préférence la centrifugation est menée à 250g pendant 5 minutes à température ambiante. Le filtrat récupéré au terme de tout ou partie de ces étapes de concentration, composé de protéines prions purifiées, forme un matériel infectieux particulièrement 10 concentré. D'une manière générale, le titre infectieux mesuré par Western Blot dans les matériels infectieux utilisés jusqu'à présent est au plus de 3 LogUwb/ml. Le titre infectieux mesuré par Western Blot dans le matériel infectieux purifié obtenu selon l'invention sans l'utilisation de détergents est lui au moins de 4 LogUwb/ml, et 15 généralement au moins égal à 5 LogUwb/ml. Titrage des ATNC : Le matériel infectieux obtenu par le procédé de l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre dans une méthode in vitro de détection et/ou de titrage dans un échantillon de l'infectiosité d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC), 20 dont le marqueur est une protéine de conformation pathologique. De manière avantageuse, avant titrage, le matériel infectieux peut être soumis à plusieurs dilutions, tout particulièrement avec des dilutions sériées ou successives. Ces dilutions permettent d'affiner la quantification de l'infectiosité. Par exemple, le matériel infectieux obtenu à l'étape c), traité ou non par sonication et/ou filtration 25 et/ou centrifugation, est dilué dans du tampon de charge selon une progression géométrique, également appelée « pas de dilution ». Le pas de dilution est de préférence de 3. Chaque point de dilution est alors soumis à un test de détection des protéines de l'ATNC. A des fins de comparaison, on peut mener le même titrage sur un échantillon à tester. Le titrage peut être effectué au moyen de toute méthode de titrage connue de l'homme du métier. En particulier il peut être effectué sur le modèle des méthodes appelées « TCIA » décrites dans les documents W02005022148 et W02006117483 (notamment les exemples de référence A et B). De manière avantageuse, le matériel infectieux selon l'invention présente un titre infectieux TCIA > 4, de préférence > 5, de manière plus préférée > 6, de manière particulièrement préférée > 7 log TCID50/ml. L'ensemble des résultats de Western-blot pour les différentes dilutions et les différents réplicas peut être analysé par une méthode statistique connue de l'homme du métier permettant d'établir un titre infectieux, comme par exemple la méthode de Spearman Karber (Schmidt N.J., Emmous R.W., Diagnostic Procedures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection, 1989, 6ème Edition). Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode de calcul du titre est la méthode de Spearman - Karber. Cette méthode suppose la dilution de l'échantillon à tester selon une progression géométrique, c'est-à-dire de raison constante entre les dilutions successives, et un ensemencement d'un volume constant (en général 0,150 ml) de chaque dilution dans cinq puits au moins. Le facteur de dilution le plus couramment utilisé est le facteur décimal. Cette méthode est décrite en détails dans la demande de brevet W02010/026346. On peut ainsi quantifier l'infectiosité liée aux ATNC sur une gamme de 4 log, c'est-à-dire de 10000 unités infectieuses in vitro. Ceci peut, par exemple, permettre de satisfaire aux critères de validation de l'efficacité des procédés d'obtention de produits biologiques vis-à-vis de l'élimination des ATNC. De manière avantageuse, le matériel infectieux selon l'invention présente un titre Western-blot > 4, de préférence > 4,3, de manière encore plus préférée > 4,6 LogUwb/m1 Utilisation du matériel infectieux de l'invention comme inoculum standardisé : Le matériel infectieux purifié produit selon l'invention peut être standardisé en unités infectieuses par dose par des méthodes connues de l'homme du métier. Des stocks de lysats cellulaires infectés peuvent par exemple être préparés pour contenir 3 ou 4 logi0 TCID50 par millilitre. La disponibilité de stocks standardisés permet alors la stricte comparaison de résultats d'essais distincts. En outre, il peut être stabilisé par congélation, séchage, lyophilisation, atomisation, en présence éventuellement de substances connues de l'homme du métier et destinées à éviter une perte du titre infectieux selon le mode de stabilisation mis en oeuvre. Avantageusement, ce matériel infectieux purifié peut être utilisé en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit susceptible d'être contaminé par un ATNC, en particulier un procédé de purification de dérivés du plasma sanguin. De manière générale, le produit susceptible d'être contaminé peut être un liquide, un produit alimentaire, une boisson, un produit cosmétique ou un produit issu du génie génétique, une molécule susceptible de moduler l'infectiosité d'un ATNC, cette liste n'étant pas limitative. De préférence il s'agit d'un échantillon biologique, par exemple un liquide biologique ou un tissu ou extrait de tissu. Un tel tissu peut être un tissu du cerveau, de colonne vertébrale, ou tissu tonscillaire, cette liste n'étant pas limitative. L'échantillon peut également être une composition dérivée d'une source humaine ou animale, comme les hormones de croissance ou les extraits cellulaires, comme les extraits pituitaires. Une telle composition peut en effet être contaminée par un ATNC. Dans le cas d'un liquide biologique, celui-ci peut être le sang, la lymphe, l'urine ou le lait, cette liste n'étant pas limitative. De manière préférentielle, le produit biologique à tester est un produit sanguin ou un dérivé, par exemple un dérivé plasmatique ou un concentré de protéine plasmatique. Avantageusement, le matériel infectieux permet de s'affranchir de l'utilisation de collections de cerveaux ovins ou bovins infectés par la Tremblante du Mouton ou l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine. L'invention concerne ainsi l'utilisation du matériel infectieux selon l'invention en tant qu'inoculum infectant dans une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit, de préférence un produit biologique, susceptible d'être contaminé par un agent transmissible non conventionnel (ATNC). Cette méthode d'évaluation et/ou de contrôle est caractérisée en ce qu'on inocule le matériel infectieux selon l'invention au produit pour mimer une infection, et en ce qu'on applique au produit infecté artificiellement par le matériel infectieux selon l'invention, en amont et en aval dudit procédé, une méthode de titrage et en ce que l'on compare les deux valeurs de titre infectieux en PrPsc obtenues. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré d'élimination ou le facteur de réduction en PrPsc. Ainsi, la mise en oeuvre de la présente méthode peut être effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le cadre d'un traitement d'élimination de l'ATNC suivant l'obtention du produit biologique. En particulier, un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique est un procédé d'obtention ou de purification de produits sanguins utilisant par exemple les chromatographies ou la nanofiltration, en particulier les chromatographies décrites dans le brevet EP 0 359 593 et dans la demande de brevet WO 02092632. Avantageusement, le matériel infectieux purifié obtenu selon l'invention peut être utilisé en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC. Dans ce cas, on infecte artificiellement le matériel à décontaminer. Pour cela, on met en contact le matériel infectieux selon l'invention, de titre infectieux connu, avec le matériel à décontaminer puis on applique la procédure de décontamination à ce matériel. Enfin, on détermine le titre d'un échantillon prélevé sur le matériel décontaminé, c'est-à-dire ayant subi la procédure de décontamination. Celui-ci est comparé au titre infectieux initial du matériel infectieux selon l'invention pour évaluer l'efficacité de la procédure de décontamination. Le matériel peut, par exemple, être un matériel de purification, en particulier une colonne de chromatographie. La procédure de décontamination peut, par exemple, être la sanitisation d'une colonne de chromatographie à l'aide de soude. Avantageusement, le matériel infectieux purifié de l'invention peut être utilisé en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation d'un composé inhibant ou modulant l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, la capacité inhibitrice ou modulatrice de l'infectiosité d'un ATNC est testée en présence ou non du composé susceptible d'inhiber ou de moduler cette infectiosité. L'invention concerne également l'utilisation du matériel infectieux en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de confinement de matériel infectieux, en particulier une procédure et un équipement de type P3. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLES: Exemple 1 : Préparation d'un matériel infectieux contenant des prions a) Culture des cellules et récupération du matériel infectieux On utilise comme matériel de départ une lignée cellulaire transgénique MovS6 (Archer F. et al. 2004), exprimant des protéines prions PrP. Les cellules sont ensemencées à T=0 jour (semaine 0) dans une flasque T-25, à raison de 500.000 cellules, dans 10mL de milieu DMEM + HanF-12 (3 :1) complémenté en Pen/Strep (1% final) et sérum de veau foetal (5% final), dans lequel à été introduit 4Opt d'homogénat à 20% (poids/volume) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/mi par la souche de Scrapie PG127, c'est-à-dire par un homogénat à 20% (poids/volume) de cerveau de mouton PG127/98 (Veterinary Laboratory Agency, Addelstone, UK) (cf Vilotte JL et al., Journal of Virology, Vol.75, n°13, p.5977-5984, 2001, Matériel et Méthodes). Après 7 jours à 37°C, soit T=7 jours (semaine 1), le milieu de culture est jeté, et remplacé par un milieu de culture identique au précédent, mais exempt d'agent infectieux Après 7 jours de croissance cellulaire à 37°C, soit T=14 jours (semaine 2), le milieu de culture est jeté et seul 10% des cellules sont conservées et repiquées dans une nouvelle flasque avec un milieu de culture toujours exempt d'agent infectieux. Après 7 jours de croissance cellulaire à 37°C, soit T=21 jours (semaine 3), le milieu de culture est jeté et à nouveau seulement 10% des cellules sont conservées et repiquées dans une nouvelle flasque avec un milieu de culture exempt d'agent infectieux. Après 7 jours de croissance cellulaire à 37°C, soit T=28 jours (semaine 4), le milieu de culture est jeté et à nouveau seulement 10% des cellules sont conservées et repiquées dans une nouvelle flasque avec un milieu de culture exempt d'agent infectieux. Après 7 jours de croissance cellulaire à 37°C, soit T=35 jours (semaine 5), le milieu de culture est jeté et à nouveau seulement 10% des cellules sont conservées et repiquées dans une nouvelle flasque avec un milieu de culture exempt d'agent infectieux. Après 7 jours de croissance cellulaire à 37°C, soit T=42 jours (semaine 6), le milieu de culture est jeté. 10% des cellules sont conservées et repiquées dans 10 nouvelles flasques avec un milieu de culture exempt d'agent infectieux. A T=49 jours (semaine 7), les cellules sont arrivées à la phase plateau. Les cellules de chaque flasque sont repiquées une dernière fois à 10%, à chaque fois dans 10 nouvelles flasques T-25 avec un nouveau milieu de culture identique au premier milieu de culture décrit ci-dessus, toujours exempt d'agent infectieux, de sorte qu'on obtient 100 flasques identiques. Puis entre T=49 jours et T=90 jours le milieu de culture n'est plus renouvelé. A T=90 jours (soit T= 41 jours après le Passage 7 de l'étape a)), 100% des cellules sont mortes. Selon un exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'étape b) menant à la mort cellulaire peut durer au moins 20 jours, de préférence au moins 30 jours, de préférence encore entre 30 et 60 jours (le To étant par exemple J+7 post passage 7 de l'étape a)) A la fin du 90ème jour, on récupère les débris cellulaires et/ou surnageant de culture cellulaire, soit 20 ml de matériel infectieux. Le titre mesuré dans l'échantillon par Western blot selon la méthode de Spearman Karber (telle que décrite dans la demande de brevet W02010/026346) est de 4,27 20 LogUwb/ml dans l'échantillon. b) Concentration du matériel infectieux Les 20 ml d'échantillon récupérés sont introduits dans un tube à essai. Une sonication est conduite dans un sonicateur à raison de 0.1 minute/ml. 25 A la fin de l'étape de sonication, le titrage en matériel infectieux reste à 4,27 LogUwb/ml. Une étape de clarification par centrifugation à 250g pendant 5 minutes est réalisée. A la fin de l'étape de clarification, le titrage en matériel infectieux reste à 4,27 LogUwb/ml. 30 On procède ensuite à une centrifugation à 4500g pendant 1 heure, couplée à une nanofiltration sur un filtre AMICON 3K. 700111 de culot sont récupérés. Le titrage de ce matériel infectieux concentré est de 5,70 LogUwb/ml. On procède alors à une nanofiltration avec un filtre à 100nm. Le matériel infectieux alors récupéré a perdu 0.95 LogUwb/ml, et titre donc à 4,75 5 LogUwb/ml Le matériel infectieux ainsi obtenu peut être directement utilisé, par exemple en tant qu'inoculum infectant, dans un procédé de contrôle de la purification d'un produit sanguin. 10 Le matériel infectieux peut autrement être conservé pour une utilisation ultérieure. En effet, le matériel infectieux obtenu selon l'invention présente un degré de stabilité particulièrement élevé par rapport au matériel infectieux de l'état de la technique, non seulement de manière classique à -80°C, mais également à une température 15 comprise entre 30°C et 40°C, notamment 37°C. La stabilité du matériel infectieux a notamment été vérifiée par détection de la PrP par Western Blot après sonication et passage à travers un filtre 0.11.1.m. REVENDICATIONS1. Procédé in vitro de préparation d'un matériel infectieux contenant des protéines prions, comprenant les étapes consistant à: a. cultiver des cellules exprimant des protéines prions (PrP) et supportant la réplication de la forme pathogène de la protéine prion (PrPsc), jusqu'à ce que la croissance des cellules parvienne à une phase de plateau ; b. incuber ensuite les cellules sans apport nutritionnel, jusqu'à ce que les cellules meurent par apoptose ; c. recueillir le lysat cellulaire et/ou le surnageant de culture obtenu, qui constitue ledit matériel infectieux. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les cellules cultivées sont mises au moins une fois lors de l'étape a) en contact avec un inoculum infectieux de protéines prions PrPsc, et préférentiellement au moins lors de l'ensemencement des cellules. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le lysat cellulaire et/ou le surnageant de culture sont concentrées par centrifugation et/ou filtration après l'étape (c). 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre une étape de sonication des cellules obtenues à l'étape (b). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape (a) de culture cellulaire comprend au moins 5 passages, de préférence 7 passages. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les étapes (a) et (b) sont réalisées sur support solide, et l'étape (a) est terminée lorsque les cellules parviennent à confluence. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'étape (b) dure au moins 30 jours, de préférence au moins 40 jours, de préférence encore entre 40 et 60 jours. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel les cellules exprimant des protéines prions sont des cellules transgéniques exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène PrPSc de la protéine PrP. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel lesdites cellules sont des cellules de la lignée MovS6, ou un clone cellulaire issu de ladite lignée, et préférentiellement un clone MovS6-4. 10. Matériel infectieux contenant des protéines prions, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Utilisation du matériel infectieux de la revendication 10, en tant qu'inoculum pour contrôler la purification d'un produit biologique, tel qu'un produit sanguin, ou la décontamination d'un produit ou d'un dispositif.