Brevet FR2981660A1 — publié le 20130426

L'invention se rapporte à l'utilisation des protéines XRCC4 et XLF humaines pour améliorer le rendement des réactions in-vitro de ligation (ou ligature) de molécules d'ADN, lesquelles réactions sont opérées au laboratoire, le plus souvent, à l'aide de la ligase T4 d'origine microbienne. Ce procédé est particulièrement utile pour les manipulations de 10 biologie moléculaire procédant de l'assemblage de fragments d'ADN isolés, notamment pour le clonage ou l'obtention de séquences d'ADN recombinant. Préambule Depuis leur première purification et caractérisation en 1967, les ADN 15 ligases sont devenues des outils de base indispensables de la biologie moléculaire. Elles correspondent à un type particulier d'enzymes de la classe EC 6.5.1.1, ayant la propriété de former des liaisons phosphodiester covalentes et ainsi de ligaturer des fragments d'ADN double brin dont les extrémités sont, selon les cas, cohésives, c'est-à-dire dont la coupure laisse 20 un brin plus long que l'autre (les deux extrémités étant complémentaires l'une de l'autre), ou franches, c'est-à-dire dont la coupure laisse les deux brins de même longueur. Au laboratoire, les ADN ligases permettent d'assembler des fragments d'ADN in-vitro de différentes provenances en vue de combiner 25 entre-elles différentes séquence d'ADN. Les ADN ligases sont ainsi particulièrement utiles pour générer des séquences d'ADN dites « recombinantes ». Ces séquences sont généralement assemblées pour former des constructions génétiques, notamment sous la forme de plasmides ou de vecteurs, qui permettent, par exemple, le clonage des gènes, leur 30 séquençage et leur expression dans des cellules hôtes. En général, de tels fragments d'ADN proviennent de réaction d'amplification telle que la PCR, et sont coupés par des enzymes de restriction avant d'être ligaturés. Les ADN ligases utilisées dans les kits de biologie moléculaire sont le plus souvent d'origine microbienne, à l'instar de celles qui ont été découvertes initialement chez la bactérie Escherichia cou [Weiss, B.; Richardson, CC (1967) Enzymatic Breakage and Joining of Deoxyribonucleic Acid, I. Repair of Single-Strand Breaks in DNA by an Enzyme System from Escherichia coli lnfected with T4 Bacteriophage. PNAS 57(4): 1021-8]. Les ligases d'origine microbienne sont en effet faciles à mettre en oeuvre dans des solutions tampon appropriées, dont le pH est généralement compris entre 7 et 8. Ces solutions tampon comprennent typiquement entre 20 et 40 mM de Tris-HCI, environ 10 mM de MgCl2 et 0,5 mM d'ATP. La présence d'ATP dans le milieu de réaction suffit théoriquement à ce que ces ligases catalysent la réaction de ligation. Néanmoins, dans la pratique, le rendement des réactions de ligation n'est en général pas très élevé et varie selon les rapports de concentration entre les différents fragments d'ADN présents dans le milieu de réaction. Ainsi, lorsqu'on dispose d'une faible concentration d'un fragment d'ADN, la ligation de ce fragment à d'autres fragments plus concentrés, peut s'avérer fastidieuse, notamment dans le cadre de ligations impliquant plusieurs types de fragments. L'ADN ligase la plus utilisée au laboratoire, issue du bactériophage T4, est couramment désignée « ligase T4 ». La ligase T4 est particulièrement connue dans la mesure où c'est la seule ligase commerciale actuellement capable de ligaturer des fragments d'ADN ayant des extrémités franches ("blunt ends") [Tabor-Stanley. DNA Ligasis. Chapter in: Current Protocols in Molecular Biology, 2001, Wiley Interscience]. Elle doit également son succès au fait qu'elle peut être mise en oeuvre à température ambiante, sa température optimale de réaction étant de 25°C. Dans ce contexte, on ne fait que très rarement appel, au laboratoire, aux ligases de mammifères, notamment aux ligases d'origine humaine. En effet, celles-ci sont plus difficiles à produire et à purifier et sont, a priori, plus délicates à mettre en oeuvre in-vitro. En outre, elles ont généralement une 2 9 8 1660 3 température optimale plus élevée, qui se situe autour de 37 °C. La ligase IV humaine, par exemple, a tendance à s'agréger lorsqu'elle est maintenue à température ambiante. En outre, contrairement aux ligases d'origine microbienne, le 5 fonctionnement des ligases de mammifères requiert généralement plusieurs protéines annexes, formant un complexe hautement régulé. Cette exigence provient du fait que les ligases de mammifères sont essentielles, in-vivo, au maintien de l'intégrité génétique des individus et qu'elles sont fortement impliquées dans les mécanismes de réparation des lésions de l'ADN au sein 10 de la cellule eucaryote. On distingue quatre types de ligases humaines : les ADN ligases de type I qui interviennent dans les mécanismes de réplication dans la ligation des fragments d'Okazaki; - les ADN ligases de type II et de type III, qui interviennent dans 15 la réparation de l'ADN notamment dans les processus d'excision et de recombinaison; - les ADN ligases de type IV qui interviennent dans les mécanismes de réparation d'ADN double brin en cas de cassure de l'ADN et qui sont impliquées plus particulièrement dans les 20 recombinaisons des séquences codant les immunoglobulines à l'origine du processus de diversification et de sélection clonale des anticorps. Le complexe des ADN ligases de type IV impliqué dans le processus de NHEJ ("non homologous end-joining") requiert au moins cinq protéines in 25 vivo : la Ligase IV, Ku, DNA-PKcs, XRCC4, ainsi qu'un co-facteur appelé XLF (également désigné Cernunnos ou NHEJ-1). Le rôle de la protéine XLF dans le maintien de l'intégrité du génome a pu être mis en évidence chez des patients, chez lesquels la protéine est inactive. De tels patients montrent des déficiences immunitaires, ainsi qu'une 30 tendance élevée à développer des cancers [Buck D. et al. (2006) Cernunnos, a novel non homologous end-joining factor, is mutated in human immunodeficiency with microcephaly. Cell 124:287-299]. La protéine XRCC4 contribue à la stabilité de la ligase IV comme cela a pu être mis en évidence par Li, Z. et al. [(1995) The XRCC4 gene encodes a novel protein involved in DNA double-strand break repair and V(D)J recombination. Cell 83:1079-1089], ainsi que chez des souris transgéniques XRCC4'-. De telles souris présentent un taux anormalement élevé de lymphomes liés à des translocations chromosomiques et des amplifications géniques attribuables à un défaut de fonctionnement du complexe NHEJ. Des études plus récentes ont montré que les protéines XLF et XRCC4 ont la capacité d'interagir ensemble au sein du complexe NHEJ et de se juxtaposer pour former une structure en forme de filament capable de se lier à l'ADN [Andres et aL (2007) Crystal structure of human XLF: A Twist in Nonhomologous DNA End-joining. Motecular Cell 28:1093-1101][Ropars V et al. (2011) Structural characterization of filaments formed by human Xrcc4- Cernunnos/XLF complex involved in non-homologous DNA end-joining. PNAS. 8(31)12663-8] [Hammel M et al. (2011) XRCC4 Protein Interactions with XRCC4-like Factor (XLF) Create an Extended Grooved Scaffold for DNA Ligation and Double Strand Break Repair. J. BioL Chem. 286(37):32638-50] [Wu Q, et al. (2011) Non-homologous end-joining partners in a helical dance: structural studies of XLF-XRCC4 interactions. Biochem Soc Trans. 39(5):1387-92]. En poursuivant leurs recherches sur le sujet, et bien qu'il n'existe pas de protéines homologues des protéines humaines XLF et XRCC4 chez les bactéries ou les bactériophages, les inventeurs ont découvert que les protéines pouvaient stimuler in-vitro les ligases provenant de bactéries ou de bactériophages couramment utilisées au laboratoire, notamment la ligase T4. En particulier, l'inventeur a pu constater que l'adjonction d'un mélange de protéines recombinantes XLF et XRCC4 dans un milieu de réaction contenant une ligase T4 ou d'origine bactérienne, permettait très significativement d'améliorer le rendement des réactions de ligation, aussi bien pour des fragments d'ADN ayant des extrémités cohésives que des extrémités franches. De façon tout aussi inattendue, il est apparu aux inventeurs que la mise en oeuvre des protéines XLF et XRCC4 in-vitro en présence de ligase microbienne, permettait d'orienter la réaction de ligation vers des réactions intermoléculaires, c'est-à-dire entre fragments d'origine différente, par rapport aux réactions intramoléculaires, conduisant au repliement des fragments sur eux-mêmes. Cette propriété est particulièrement avantageuse lorsqu'on cherche à assembler plusieurs fragments d'ADN en vue de réaliser des constructions génétiques. Il est donc apparu que l'utilisation de ces deux protéines permettait d'augmenter significativement l'efficacité et le rendement des réactions de ligation in-vitro opérées par une ligase d'origine microbienne. Ainsi, l'invention décrite dans la présente demande de brevet a pour objet un procédé et un kit de biologie moléculaire associant les protéines XRCC4 et XLF humaines à des ligases non humaines, de préférence d'origine microbienne, permettant de faciliter l'assemblage de fragments d'ADN dans l'obtention de séquences d'ADN recombinantes utiles dans les manipulations de génie génétique. Figure 1 : Photographie de gels d'électrophorèse (agarose 0,8 % TBE) montrant les molécules d'ADN présentes dans le milieu de réaction à l'issue des réactions de ligation (après déprotéinisation). Le marquage de l'ADN est effectué au bromure d'éthydium. A : Les réactions ont été effectuées en présence de molécules d'ADN plasmidiques pUC19 linéarisées par l'enzyme de restriction Xbal, ce qui donne lieu à des coupures d'ADN cohésives. Les indications portées dans le tableau au-dessus de la photographie font état de la présence ou de l'absence dans le milieu de réaction des protéines XRCC4, XLF et T4 DNA ligase. La piste 1 correspond à l'échelle d'ADN 1 kb DNA ladder (New England Biolabs). La piste 6 montre l'ADN ayant réagi avec les trois protéines selon le procédé de l'invention, lequel forme des dépôts dans la partie haute du gel correspondant aux formes multimériques résultant de l'assemblage intermoléculaire de plusieurs plasmides pUC19 les uns avec les autres. B : Les réactions ont été effectuées en présence de molécules d'ADN plasmidiques pUC19 linéarisées par l'enzyme de restriction Smal, ce qui donne lieu à des coupures d'ADN franches. Les indications du tableau font état de la présence ou de l'absence dans le milieu de réaction des protéines respectives XRCC4, XLF et T4 DNA ligase. La piste 1 correspond à l'échelle d'ADN 1 kb DNA ladder. La piste 6 montre l'ADN ayant réagi avec les trois protéines selon le procédé de l'invention, lequel forme des dépôts dans la partie haute du gel correspondant aux formes multimériques résultant de l'assemblage intermoléculaire de plusieurs plasmides pUC19 les uns avec les autres. Description détaillée La présente invention a donc pour objet un procédé de ligation de fragments d'ADN, caractérisé en ce qu'il fait intervenir l'association de deux protéines d'origine humaine XRCC4 et XLF pour augmenter le rendement d'une ligase dans son milieu de réaction. Les protéines XRCC4 et XLF humaines sont respectivement référencées dans la base de données UNIPROT sous les références Q13426 et Q9H9Q4 (http://www.uniprot.org). Sans être liés par la théorie, les inventeurs ont découvert que ces protéines forment des homodimères capables de s'assembler sous la forme de filaments ayant la propriété de joindre deux molécules d'ADN de sorte à pouvoir les rapprocher. Les inventeurs pensent que ces filaments, dépourvus en eux-mêmes d'activité enzymatique, permettent de faciliter l'action enzymatique de la ligase, laquelle a pour effet de lier de manière covalente les extrémités des molécules d'ADN. Dans l'un de ses aspects, l'invention consiste donc en l'utilisation des protéines XRCC4 et XLF, en tant qu'activateurs d'une réaction de ligation réalisée in-vitro, au moyen d'une ligase non humaine, de préférence d'origine microbienne, telle que la ligase T4. L'invention vise également l'utilisation de protéines homologues de 30 XRCC4 et XLF ou ayant une séquence polypeptidique proche de celles-ci (variants), humaine ou non, mutée ou non mutée, ayant, elles aussi, la propriété d'activer la réaction de ligation selon l'invention. Ainsi, l'invention vise un procédé de ligation faisant intervenir une ligase non humaine, caractérisé en ce qu'on fait agir ladite ligase sur lesdits fragments d'ADN, en présence des deux protéines ayant respectivement au moins 80 % d'identité avec la protéine XRCC4 humaine (SEQ ID NO.1) et la protéine XLF humaine (SEQ ID NO.2), dans une solution tampon appropriée. Les pourcentages d'identité permettant de caractériser les protéines ci-dessus sont déterminés par la méthode Blast (Basic local alignement Research tool) appliquée aux protéines [Altschul, S. F. et al. (1990) Basic local alignment search tool. Journal of molecular biology, 215(3): 403-10]. Ces protéines présentent, généralement, au moins 90 %, plus généralement plus de 95 % et encore plus généralement au moins 99 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. Les pourcentages d'identité ci-dessus tiennent compte de la variabilité génétique constatée chez les mammifères pour ces protéines, dont la séquence polypeptidique peut varier d'au moins 10 % sans modification de leur fonction. Comme cela est illustré dans les exemples de la présente demande, la fonction d'activation de la ligation selon l'invention se traduit, notamment, par un meilleur rendement des réactions visant à assembler entre-eux des fragments d'ADN. Cette activation accroît généralement d'au moins 25 %, 20 souvent d'au moins 30 % et jusqu'à 50 % le nombre de molécules d'ADN assemblées, par rapport à la même réaction effectuée avec la ligase seule, notamment lorsque les fragments d'ADN utilisés ont des extrémités franches. En général, les protéines activatrices XLF et XRCC4 sont utilisées à égales concentrations, en respectant un ratio par rapport à la ligase compris 25 entre 1:1 et 5:1, lesdites protéines étant, de préférence, ajoutées en excès par rapport à la concentration de la ligase. En pratique, l'effet de stimulation est généralement observé lorsque la concentration des protéines XLF et XRCC4 est égale ou supérieure à la concentration en extrémités d'ADN. Le procédé de ligation selon l'invention peut être mis en oeuvre pour 30 des fragments d'ADN présentant des extrémités cohésives ou franches. A cet égard, une ligase microbienne, de préférence une ligase de bactériophage, telle qu'une ligase T4, est avantageuse car mieux à même de réagir avec des fragments d'ADN ayant des extrémités franches (blunt ends). Les ligases microbiennes présentent également l'avantage de pouvoir être mises en oeuvre selon l'invention à température ambiante (environ 20°C), c'est à dire de préférence entre 15 et 30 °C et plus préférentiellement entre 18 et 25°C. Un exemple d'une telle ligase est la 5 ligase T4 commercialisée par New England Biolabs sous la référence M0202, purifiée à partir de la souche d'E. coi/ C600 pc1857 pPLc28 lig8. La solution de tampon appropriée pour la réaction est généralement celle normalement utilisée pour la ligase, c'est-à-dire prescrite par le fabricant de ladite ligase. 10 Le procédé de ligation selon l'invention est particulièrement avantageux pour réaliser des constructions ou des recombinaisons génétiques, comme par exemple, le clonage d'un gène dans un vecteur. L'invention a ainsi pour objet un procédé de clonage, caractérisé en ce qu'il fait intervenir une ligase, de préférence d'origine microbienne, ainsi 15 que deux protéines ayant respectivement au moins 80 % d'identité avec la protéine XRCC4 humaine (SEQ ID NO.1) et la protéine XLF humaine (SEQ ID NO.2), dans une solution tampon appropriée, de la manière décrite précédemment. L'invention, qui peut être facilement mise en oeuvre au laboratoire, a 20 également pour objet un kit de biologie moléculaire pour réaliser une réaction de ligation in-vitro, comprenant un ou plusieurs des composants suivants - une ligase ; - une protéine ayant au moins 80 % de préférence au moins 90 %, plus préférentiellement au moins 95% et plus préférentiellement au moins 25 99% d'identité avec la protéine XRCC4 humaine, et - une protéine ayant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 90 %, plus préférentiellement au moins 95 % et plus préférentiellement au moins 99 % avec la protéine XLF humaine. Les protéines susceptibles d'être incluses dans le kit, peuvent être 30 obtenues, par exemple, à partir de cellules humaines ou par voie recombinante selon les techniques conventionnelles décrites plus loin. Selon un aspect préféré de l'invention, le kit comprend les différentes protéines ci-dessus séparément ou en mélange. Ces protéines peuvent être conditionnées, par exemple dans des tubes ou des flacons individuels, de préférence sous forme concentrée, voire déshydratée, de sorte à pouvoir être conservées et diluées lors de leur utilisation. Le kit présente alors l'avantage de pouvoir être utilisé en plusieurs fois, à la faveur de réactions opérées successivement ou parallèlement. Un kit selon l'invention comprend également de préférence une notice décrivant la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, au moyen des protéines et de la ligase telles que décrites ci-dessus. Davantage de précisions concernant la mise en oeuvre du procédé de l'invention et les conditions des réactions de ligation ressort des exemples qui suivent. Ces exemples ont pour but de compléter la description et ne sauraient être considérés comme limitant la portée de la protection revendiquée. Exemples : 1 - Clonage et expression de la protéine XRCC4 Les amorces suivantes P1 et P2 ont été utilisées pour obtenir par PCR des séquences d'ADN contenant la séquence codante de la protéine XRCC4 humaine en y ajoutant une séquence codant une queue histidine (His-tag) et des sites de restriction Ncol et Xhol aux extrémités à partir d'ADNc de cellules humaines HeLa. P1: CCCCCCATGGAGAGAAAAATAAGCAGAAT (SEQ ID NO.3) P2: GGGGGGCTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGAATCTCA TCAAAGAGTCTTCT (SEQ ID NO.4) Les produits de PCR ainsi obtenus ont été digérés à l'aide des enzymes de restriction Ncol-Xhol, puis purifiés et clonés dans les sites Ncol-Xhol du plasmide pET28a (Novagen) pour donner le plasmide d'expression pBMM42 suivant le procédé décrit par Modesti et al. [EMBO Journal (1999) 18(7) :2008-2018]. Pour l'expression de XRCC4, pBMM42 a servi à transformer une souche d'E. coll de type Rosetta/pLysS cells (Novagen). L'expression a été induite par addition d'IPTG dans le milieu de culture à une concentration finale de 1 mM et incubation de 2 h à 37°C. Les protéines recombinantes comprenant une queue histidine ont été extraites dans une solution tampon (20 mM Tris-HCI, pH =8.0, 0.5 M KCI, 20 mM imidazole pH 7.0, 20 mM (3- mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.2% Tween 20, 1 mM PMSF et 0.1 mg/ml lysozyme). Après clarification par centrifugation à 30 000 g pendant 1 h, XRCC4 a été purifiée sur une colonne de chromatographie au nickel (GE healthcare). Les protéines ont été éluées à l'aide d'un gradient linéaire de 40 ml de 160 à 500 mM imidazole (élution à -200 mM imidazole). Les fractions de pics ont été rassemblées et dialysées contre un tampon A (20 mM TrisHCI pH 8.0, 150 mM KCI, 2 mM DTT et 10% glycerol). La préparation a été chargée sur une colonne Mono Q HR 5/5 (GE healthcare) préalablement équilibrée avec le tampon A. Les protéines ont été éluées à l'aide d'un gradient linéaire de 40 ml de 150 à 500 mM KCI. La protéine XRCC4 a été éluée à -350 mM KCI. Les fractions de pics ont été rassemblés et dialyses contre le tampon A, aliquotées puis conservés à -80°C. 2 - Clonage et expression de la protéine XLF humaine recombinante L'ADNc correspondant à la séquence codant la protéine XLF, issu du clone IMAGE 4026495c, a été amplifié par PCR à l'aide des amorces suivantes : Rev:CCCACGGCATATATACTATCTATGGAAGAACTGGAGCAAGG CCTG (SEQ ID NO.5), et Fw: GGGCTCGAGTTAACTGAAGAGACCCCTTGGCTTCTTC (SEQ ID NO.6). Les produits de PCR ont été digérés à l'aide des enzymes de restriction BceAl and Xhol, puis clonés dans le plasmide pETDuet-1 (Novagen) au niveau des sites de restriction Ndel and Xhol afin de générer un vecteur d'expression pMJ4489 codant pour la protéine XLF dans toute sa longueur. La protéine recombinante XLF comprenant une queue histidine a été exprimée à partir du plasmide pMJ4489 dans des cellules Rosetta/pLysS (Novagen) mises en culture à 37°C. L'expression a été induite en ajoutant de l'IPTG à une concentration de 1 mM pendant 5 heures. Les cellules ont été resuspendues dans un tampon R (20 mM Tris, pH 8.0, 1 mM [3- mercaptoéthanol, 10 % glycerol, 100 mM KCI), en présence d'un inhibiteur de protéase (2 mM Benzamidine-HCI, 474 pM Leupeptine, 2 mM Pepstatine- A), et 0,01 g/L de déoxyribonucléase I. Après lyse et clarification, le lysat a été porté à 1,5 M KCI puis passé sur une colonne IMAC au nickel (GE healthcare) équilibrée avec un tampon S (20 mM Tris, pH 8.0, 1 mM (3-mercaptoéthanol, 10 % glycerol, 1.5 M KCI, 10 mM d'imidazole). Les protéines XLF liées ont été rincées avec du tampon S contenant 25 mM d'imidazole, puis éluées à l'aide du tampon S contenant 220 mM d'imidazole, puis purifiées par filtration sur gel en utilisant une colonne Superdex 16/60 équilibrée à l'aide du tampon T (10 mM Tris, pH 8.0, 5 mM dithiothréitol, 1 mM EDTA, 200 mM KCI). Les fractions contenant la protéine XLF ont été dialysées contre le tampon U (20 mM HEPES 8.0, 150 mM KCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % glycerol), aliquotées et conservées à -80°C. 3 - Réactions de liqation par la liqase T4 en présence de XRCC4 et XLF Les protéines humaines XRCC4 et XLF recombinantes purifiées ci-dessus ont été ajoutées, à stoechiométrie égale, dans un milieu de réaction comprenant de l'ADN linéarisé (plasmide pUC19) coupé par les enzymes de restriction Xbal et Smal, en vue d'obtenir respectivement des terminaisons d'ADN cohésives ou franches. La réaction s'est produite dans un volume final de 20 pL contenant 10 ng/pL de plasmide pUC19 linéarisé, le milieu de réaction étant propre à celui d'une ligase T4 de qualité commerciale (New England Biolabs) dans le tampon recommandé par le fabricant comprenant à savoir 2 mM MgCl2, 1 mM d'ATP, 5 mM d'HEPES pH=8, 37,5 mM KCI, 0,25 mM EDTA, 2,5 % glycérol et 0,25 mM DTT. Les protéines recombinantes XRCC4 et XLF humaines ont été ajoutées à une concentration finale de 1 pM chacune. Un témoin a été réalisé dans lequel ces protéines n'étaient pas présentes. La réaction de ligation a été maintenue pendant 1 heure à température ambiante (22°C) en présence de 8 unités d'ADN ligase T4. Les produits de réaction ont été traités avec de la protéinase K et fractionnés par électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 %) en utilisant la technique standard faisant appel à un tampon Tris-Borate. L'ADN a été détecté par un marquage au bromure d'éthidium. Comme cela peut être constaté dans la Figure 1, l'addition des deux protéines XRCC4 et XLF dans des quantités stoechiométriques par rapport à la ligase, a pour effet d'augmenter considérablement la formation de produits d'ADN multimériques visibles dans la partie haute du gel. Ces ADN multimériques proviennent de la ligation intermoléculaire des plasmides linéarisés pUC19. Cela s'observe en comparant la piste 3 à la piste 6, ainsi que la piste 9 à la piste 12. Les pistes 3 et 6 correspondent à des ligations réalisées à l'aide de plasmides ayant des extrémités cohésives (Figure 1A), tandis que les pistes 9 et 12 correspondent aux ligations effectuées à l'aide de plasmides ayant des extrémités franches (Figure 1B). On peut constater que l'efficacité de la réaction est équivalente avec des extrémités franches et cohésives, ce qui n'est généralement pas le cas lorsqu'on laisse agir la ligase seule (i.e. la ligase seule agit plus efficacement en présence d'extrémités cohésives). On peut constater également que l'addition de XRCC4 et XLF dans 20 le milieu de réaction a tendance à favoriser un assemblage multimérique des plasmides linéarisés, plutôt qu'une religation des plasmides sur eux-mêmes (ligation intra-moléculaire). L'ajout séparé de l'une ou l'autre des protéines XRCC4 ou XLF (pistes 4, 5, 10 et 11) ne permet pas d'obtenir ces mêmes effets. 25 REVENDICATIONS1. Procédé de ligation de fragments d'ADN faisant intervenir une ligase d'origine microbienne, caractérisé en ce qu'on fait agir ladite ligase d'origine microbienne sur lesdits fragments d'ADN en présence de deux protéines ayant respectivement au moins 80 % d'identité avec la protéine XRCC4 humaine (SEQ ID NO.1) et la protéine XLF humaine (SEQ ID NO.2), dans une solution tampon appropriée. 2. Procédé de ligation selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 90 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 3. Procédé de ligation selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 95 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 4. Procédé de ligation selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 99 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 5. Procédé de ligation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ligation est effectuée à une température comprise entre 15 et 30°C, de préférence entre 18 et 25 °C. 6. Procédé de ligation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au moins un des fragments d'ADN présente des extrémités cohésives. 7. Procédé de ligation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au moins un des fragments d'ADN présente des extrémités franches. 8. Procédé de ligation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ligase microbienne est une ligase de bactériophage, de préférence une ligase T4. 9. Procédé de clonage d'un gène dans un vecteur, caractérisé en ce qu'il fait intervenir une ligase, ainsi que deux protéines ayantrespectivement au moins 80 % d'identité avec la protéine XRCC4 humaine (SEQ ID NO.1) et la protéine XLF humaine (SEQ ID NO.2), dans une solution tampon appropriée. 10. Procédé de clonage selon la revendication 9, caractérisé en ce que la ligase est d'origine microbienne. 11. Procédé de clonage selon la revendication 10, caractérisé en ce que la ligase microbienne est une ligase de bactériophage, de préférence une ligase T4. 12. Procédé de clonage selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 90 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 13. Procédé de clonage selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 95 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 14. Procédé de clonage selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 99 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 15. Kit de biologie moléculaire pour réaliser une réaction de ligation, caractérisé en ce qu'il comprend sous forme séparée ou en mélange: - une protéine ayant au moins 80 % d'identité avec la protéine XRCC4 humaine, et - une protéine ayant au moins 80 % d'identité avec la protéine XLF humaine. 16. Kit de biologie moléculaire selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 90 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 17. Kit de biologie moléculaire selon la revendication 15 caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 95 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 18. Kit de biologie moléculaire selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdites protéines présentent au moins 99 % d'identité avec les protéines XLF et XRCC4 humaines. 19. Kit de biologie moléculaire selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une ligase. 20. Kit de biologie moléculaire selon la revendication 19, caractérisé en ce que ladite ligase est une ligase T4.