Brevet FR2997960A1 — publié le 20140516

NOUVELLE SOUCHE BACTERIENNE DE LACTOBACILLUS PLANTARUM ET UTILISATIONS DE CETTE SOUCHE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention est relative au domaine des probiotiques. Plus précisément, la présente invention est relative à une nouvelle souche bactérienne de Lactobacillus plantarum (CNCM 1-4643) et à ses utilisations, laquelle souche bactérienne présente une résistance aux stress du tractus digestif et la capacité à renforcer le système immunitaire, notamment contre le virus de la grippe. ART ANTERIEUR Les infections respiratoires sont des infections des organes du système respiratoire qui peuvent être causées par des bactéries ou des virus. Les virus sont responsables d'environ 80% des infections respiratoires aigües. Les principales familles de virus causant des infections respiratoires sont les suivantes : Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae et Adenoviridae. La grippe compte parmi les infections respiratoires les plus fréquentes. Elle est causée par des virus à ARN de la famille des Orthomyxoviridae comprenant trois genres : Myxovirus influenzae A, B et C. Ces virus peuvent infecter certains mammifères et les oiseaux. Chez les humains, et pour les personnes en bonne santé, les symptômes de la grippe sont principalement la fièvre, les douleurs musculaires, la toux ou encore les maux de tête. Dans certains cas, la grippe peut s'accompagner d'une surinfection bactérienne pouvant éventuellement conduire à des pneumopathies. Parfois, notamment chez les personnes immunodéprimées, les personnes âgées, les femmes enceintes et les enfants, la grippe peut avoir des conséquences plus graves, allant jusqu'à la mort. Chaque année, la grippe cause entre 250 000 et 500 000 décès dans le monde et entre 1 500 et 5 000 décès en France. De plus, la grippe est une cause très fréquente d'arrêt maladie pour les personnes actives et a un coût médico-économique très important évalué entre 450 et 500 millions d'euros pour la France pour une épidémie moyenne. Dans les zones tempérées, la grippe est une infection épidémique survenant principalement de l'automne au printemps, d'où son appellation de grippe saisonnière. Dans les zones tropicales, la grippe peut survenir tout au long de l'année. Le virus de la grippe se transmet par voie respiratoire, c'est-à-dire par l'intermédiaire de gouttelettes contenant des virus provenant de projections buccales et/ou nasales, lorsqu'une personne contaminée parle, tousse ou éternue. Le moyen le plus utilisé jusque-là pour lutter contre la grippe est la vaccination, qui a permis de limiter l'expansion du virus. Cependant, ces virus sont caractérisés par une grande variabilité génétique s'exprimant selon deux mécanismes différents. Le premier mécanisme est le glissement antigénique, causé par des mutations touchant préférentiellement les gènes codant pour les glycoprotéines antigéniques de l'enveloppe mais ne modifiant pas la structure antigénique globale du virus, ce qui permet au système immunitaire de rester efficace au moins partiellement et à court terme. Le second mécanisme responsable de la variabilité des virus de la grippe est le réassortiment génétique entraînant l'apparition régulière de nouveaux sous-types viraux. Elle se caractérise par des réassortiments entre les segments d'ARN génomique de deux types de virus différents. Cette variabilité ne touche que les virus du genre influenzavirus type A. Ce sont ces nouveaux sous-types viraux, contre lesquels les populations humaines ne sont pas immunisées, qui créent des pandémies. Parmi les sous-types viraux ayant été à l'origine de pandémies, on retrouve Myxovirus influenzae A sous-type H1N1, Myxovirus influenzae A sous-type H3N2, ou encore dernièrement Myxovirus influenzae A sous-type H5N1. Il existe donc un besoin pour un moyen de prévenir et/ou traiter les infections, notamment les infections respiratoires comme la grippe, en renforçant le système immunitaire, plus particulièrement durant les périodes propices aux épidémies de grippe. Plus généralement, il existe un besoin pour un moyen de moduler le système immunitaire pour lutter contre les infections et pour limiter les réactions allergiques. SOMMAIRE DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis en évidence, de manière surprenante et inattendue, une souche bactérienne de Lactobacillus plantarum présentant un effet positif sur le système immunitaire, à la fois pour l'immunité innée et pour l'immunité adaptative. Cet effet se manifeste notamment dans le cas de la grippe. De manière plus surprenante encore, cette souche bactérienne présente une résistance aux sels biliaires, qui est un stress inhérent au tube digestif humain et en particulier aux intestins. Un premier objet de l'invention concerne une souche bactérienne de L. plantarum déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur) sous le numéro d'accession CNCM 1-4643, ou un mutant de celle-ci. Un autre objet de l'invention concerne une utilisation de la souche de l'invention comme probiotique. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant la souche bactérienne L. plantarum de l'invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Schéma décrivant le protocole expérimental suivi pour la détermination de la résistance aux sels biliaires de la souche Lactobacillus plantarum de l'invention. Figure 2 : Graphique présentant une vue globale des retards d'entrée en phase exponentielle des souches testées pour le stress aux sels biliaires. Figure 3 : Graphique présentant le ratio IL 12p70/IL 10 mesuré pour les souches testées pour la détermination de leur profil pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire. Figure 4 : Graphique présentant la variation d'IL8 mesurée pour les souches testées pour la détermination de leur profil pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire. Figure 5 : (A) et (B) Graphiques présentant l'efficacité chez la souris de la souche L. plantarum de l'invention contre le virus de la grippe H1N1/PR8 sur les variations pondérales. Figure 6: Graphique présentant l'efficacité chez la souris de la souche L. plantarum de l'invention contre le virus de la grippe H1N1/PR8 sur l'état physique (scores visuels). Figure 7: Graphique présentant l'efficacité chez la souris de la souche L. plantarum de l'invention contre le virus de la grippe H1N1/PR8 sur la charge virale. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention concerne une souche bactérienne de Lactobacillus plantarum déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur) sous le numéro d'accession CNCM 1-4643, ou un mutant de celle-ci. La souche L. plantarum de l'invention a été déposée selon le traité de Budapest à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) de L'Institut Pasteur (28 rue du Docteur Roux 75024 Paris Cedex 15) avec le numéro d'enregistrement CNCM 1-4643. Par Lactobacillus plantarum on entend au sens de la présente invention une souche bactérienne probiotique isolée du lait de yack. La souche Lactobacillus plantarum de l'invention correspond à la souche Lactobacillus plantarum VEL 12238. Les termes « Lactobacillus plantarum », « L. plantarum » et « VEL 12238 » peuvent être utilisés indifféremment. Aux termes de la présente invention, une "souche bactérienne" est constituée par une succession de cultures dérivées d'une culture pure de bactéries. La souche bactérienne n'est pas nécessairement issue d'un ancêtre unique par division cellulaire. Par "probiotique", on entend, au sens de la présente invention, des microorganismes vivants ou morts qui, administrés en quantité suffisante à un hôte, animal notamment, ont un effet bénéfique sur la santé de l'hôte. Plus particulièrement, les probiotiques sont connus pour avoir un effet bénéfique sur le microbiote intestinal (anciennement flore intestinale) en maintenant son équilibre. Le microbiote intestinal a quatre fonctions reconnues : une fonction physiologique, à la fois sur l'anatomie et l'histologie du tube digestif et sur le transit intestinal ; une fonction digestive, par la digestion de certains types de molécules telles que les lipides et les protéines ; une fonction de protection anti-infectieuse, en empêchant le développement de germes potentiellement pathogènes dans les intestins et enfin une fonction immunitaire, par l'activation du système immunitaire. Par « mutant », on entend, au sens de la présente invention, une souche bactérienne de Lactobacillus plantarum ayant subi une ou plusieurs mutations, c'est-à- dire un ou plusieurs changements dans une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques (telle que la séquence d'un gène) ou dans une ou plusieurs séquences d'acides aminés, comparé, par exemple, à la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés présente dans la souche bactérienne de Lactobacillus plantarum typique telle que décrite dans la présente invention. Lesdites mutations sont par exemple des substitutions et/ou délétions et/ou insertions de un ou plusieurs nucléotides ainsi que des combinaisons de celles-ci. Ces mutations peuvent apparaître spontanément ou bien être introduites en utilisant notamment des techniques de biologie moléculaire. Dans certains modes de réalisation, les mutants de la souche bactérienne de l'invention ont la ou les mêmes activités biologiques ou des activités biologiques similaires à celle de la souche bactérienne de l'invention. Le terme « mutant » peut être utilisé de manière interchangeable avec le terme « variant ». De manière préférée, la souche Lactobacillus plantarum présente une résistance au stress acide induit par les sels biliaires. Par « acides biliaires » et « sels biliaires » on entend, au sens de la présente invention, les acides se trouvant dans la bile des mammifères et sécrétés par le foie dans lequel ils sont formés à partir de dérivés de la bilirubine et de stéroïdes acides. Les acides biliaires ont pour rôle la fragmentation des globules lipidiques dans les intestins lors de la digestion et l'inhibition de la prolifération bactérienne dans la partie haute du tube digestif (duodénum). Parmi les acides biliaires, on compte les acides cholique, glycocholique, taurocholique, désoxycholique ou encore chénodésoxycholique. De manière préférée, la souche Lactobacillus plantarum présente des propriétés pro-inflammatoires. Par « pro-inflammatoire », on entend, au sens de la présente invention, la capacité à activer et maintenir une inflammation des tissus causée par une infection ou une maladie. De manière préférée, la souche bactérienne probiotique de l'invention, Lactobacillus plantarum peut être administrée à l'homme ou à l'animal sans risque pour sa santé. Un autre objet de l'invention concerne une utilisation de la souche bactérienne de Lactobacillus plantarum de l'invention comme probiotique. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant la souche bactérienne Lactobacillus plantarum de l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention est une composition probiotique et/ou pharmaceutique Par « composition probiotique » on entend, au sens de la présente invention un complément alimentaire qui a des effets bénéfiques pour la santé de l'hôte auquel il est administré. Une composition probiotique contient des microorganismes probiotiques qui doivent être ingérés pour induire des effets bénéfiques chez l'Homme selon la définition de l'OMS (2001) ; lesquels microorganismes peuvent être vivants ou morts . Les probiotiques vivants peuvent sécréter une gamme complète d'antigènes, se multiplient pour promouvoir les interactions avec la muqueuse intestinale et adhèrent aux tissus intestinaux pour stimuler la réponse immunitaire. Par « composition pharmaceutique », on entend, au sens de la présente invention, une formulation comprenant un agent actif, qui est une bactérie probiotique dans la présente invention, en combinaison avec des excipients permettant de stabiliser ladite composition et son administration par voie orale. De manière préférée, la souche de l'invention peut être utilisée en association avec une ou plusieurs autres espèces probiotiques pour la préparation des compositions probiotiques. A titre d'exemple, des espèces appartenant aux genres Bifidobacterium, Streptococcus et Lactococcus, couramment utilisés dans l'industrie laitière, peuvent être utilisées (par exemple Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus). Elles peuvent être utilisées sous forme de bactéries entières vivantes ou non, et aussi sous forme de lysat bactérien, ou sous forme de fractions bactériennes. Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention comprend au moins 105, de préférence au moins 106, et au plus 1010 cellules de Lactobacillus plantarum de l'invention par mL. De manière préférée, la composition probiotique de l'invention comprend un ou plusieurs excipients acceptables. Par « excipient » on entend, au sens de la présente invention toute substance, autre que le principe actif de la composition probiotique, destinée à conférer à ladite composition probiotique des caractéristiques physiques, chimiques ou gustatives particulières et n'interagissant pas avec le principe actif. Lesdits excipients peuvent être d'origine naturelle ou d'origine synthétique. Un homme du métier sera à même, au regard de ses connaissances, d'identifier un excipient acceptable pour une composition probiotique. Des exemples d'excipients acceptables incluent : des sucres tels que le saccharose, le glucose, le fructose, le palatinose, le tréhalose, le lactose et le xylose ; des polyols tels que le sorbitol, le xylitol, l'érythritol, et le lactitol ; des émulsifiants tels que les esters de saccharose d'acides gras, les esters de glycérol d'acides gras et la lécithine ; des épaississants et stabilisants tels que le carraghénane, la gomme de xanthane, la gomme de guar, la pectine et la gomme de caroube ; des acidifiants tels que l'acide citrique, l'acide lactique et l'acide malique ; des jus de fruits tels que le jus de citron, le jus d'orange et des jus de baies ; des vitamines telles que la vitamine A, la vitamine B, la vitamine C, la vitamine D et la vitamine E; et des minéraux tels que le calcium, le fer le manganèse et le zinc. Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition de l'invention se présente sous une forme administrable par voie orale. De telles compositions peuvent prendre la forme de gélules, de comprimés, de poudres, de pastilles, de granules, de capsules molles, de poudres reconstituables, de suspensions, de compositions surgelées, de préparations liquides orales ou encore de produits alimentaires conventionnels. De préférence, la composition de l'invention se présente sous la forme d'une gélule. Les comprimés et les gélules à administration orale peuvent être unidoses et peuvent contenir un ou plusieurs excipients acceptables tels que des liants, des agents de remplissage, des lubrifiants, des agents mouillant ou encore des agents désintégrant. Les comprimés peuvent être enrobés par des méthodes bien connues dans le domaine pharmaceutique. Les préparations orales liquides peuvent par exemple être sous la forme de suspensions aqueuses ou huileuses, de solutions, d'émulsions, de sirops ou encore d'élixirs sous la forme de produits déshydratés reconstituables avec de l'eau ou tout autre véhicule acceptable. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs communément utilisés tels que des agents de suspension, des émulsifiants, des véhicules non aqueux, des conservateurs et éventuellement des arômes et/ou des colorants. Alternativement, la composition de l'invention se présente sous la forme d'un produit alimentaire ou un complément alimentaire. Par « produit alimentaire » et « produit alimentaire conventionnel », on entend, au sens de la présente invention, toute substance ou produit, ayant été transformé, partiellement transformé ou non transformé et destiné à être ingéré par l'homme ou l'animal. Les produits alimentaires peuvent être d'origine animale, végétale ou minérale. Les produits alimentaires apportent à l'organisme l'énergie et les nutriments nécessaires à son fonctionnement. Le produit alimentaire selon l'invention peut être un liquide, donc une boisson, ou solide. Par « complément alimentaire », on entend, au sens de la présente invention, tout produit contenant des nutriments bénéfiques pour la santé et qui sont ajoutés au régime alimentaire normal des être humains ou des animaux. Les compléments alimentaires contiennent, mais sans s'y limiter, des vitamines, des minéraux, des acides aminés, des enzymes et des probiotiques. La composition de l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit laitier. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être à base de lait cru. Les laits utilisés peuvent être par exemple des laits de vache, de chèvre, de brebis, de yack, de bufflone ou encore du lait de soja. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être sous forme liquide, solide ou de poudre. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être par exemple du lait, du beurre, du fromage ou encore de la crème. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être à base de laits végétaux. Les laits végétaux comprennent mais ne sont pas limités au lait de soja, de riz, d'avoine ou encore d'amande. La composition de l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit laitier fermenté. Un produit laitier fermenté est par exemple un yaourt. La souche de l'invention peut être utilisée en association avec des ferments du yaourt, à savoir Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Lorsque L. plantarum est utilisé en association avec des ferments du yogourt, ladite composition comprend avantageusement au moins 107, de préférence entre 2x108 et 1x109 cellules de S. thermophilus par mL, et au moins 5x105 et de préférence entre 4x106 et 2x107 cellulesde L. bulgaricus par mL. La composition selon l'invention présente une fonction immunomodulatrice la rendant utile tout à la fois dans le traitement et/ou la prévention des infections et/ou des allergies. Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention est destinée à prévenir et/ou traiter des infections. De manière préférée, la composition de l'invention est destinée à prévenir et/ou traiter des infections respiratoires. Par « infection respiratoire » on entend, au sens de la présente invention une maladie, un trouble ou une infection affectant le groupe d'organes composant le système respiratoire et responsable du transport de l'oxygène depuis l'air jusqu'à la circulation sanguine et du rejet du carbone expiré dans l'air. Le système respiratoire est constitué du nez, des fosses nasales, du pharynx, du larynx, de la trachée, des bronches et des poumons. Par « prévenir » et « prévention » on entend, au sens de la présente invention éviter l'apparition d'une maladie, d'un trouble ou d'un ou plusieurs signes et/ou symptômes d'une maladie ou d'un trouble. Par « traiter » et « traitement » on entend, au sens de la présente invention, améliorer ou remédier à une maladie, un trouble ou à un ou plusieurs signes et/ou symptômes d'une maladie ou d'un trouble. La composition de l'invention permet de renforcer une réponse immunitaire systémique spécifique vis-à-vis d'un micro-organisme pathogène des voies respiratoires. Selon un mode de réalisation préféré, lesdites infections respiratoires sont causées par des virus. De manière préférée, lesdits virus sont des virus des voies respiratoires. Selon un mode de réalisation préféré, lesdits virus sont choisis parmi les rhinovirus, les myxovirus, les coronavirus ou encore les adénovirus. Le terme « myxovirus » désigne les virus appartenant aux familles Orthomyxoviridae et Paramyxoviridae. Le terme « rhinovirus » désigne un genre de virus appartenant à la famille des Picornaviridae. Le terme « coronavirus » désigne les virus appartenant à la famille des Coronaviridae. Le terme « adenovirus » désigne les virus appartenant à la famille des 30 Adenoviridae. De manière encore préférée, ledit virus est un virus de la grippe. Lesdites infections respiratoires virales peuvent être par exemple la grippe, la bronchiolite, la bronchite, la pharyngite, la rhinopharyngite, la pneumonie, la rhinite, la sinusite, le Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SRAS), ou encore le rhume. De manière encore préférée, ladite grippe est une grippe transmise par le virus Myxovirus influenzae A sous-type H1N1. L'invention comprend également une méthode de prévention et/ou de traitement des infections respiratoires, comprenant une étape d'administration à un patient d'une quantité thérapeutiquement efficace de la souche Lactobacillus plantarum ou d'une composition comprenant ladite souche de l'invention. Par « quantité thérapeutiquement efficace », on entend, au sens de la présente invention, la quantité minimale nécessaire à l'obtention de l'effet attendu par l'administration d'une telle souche ou d'une telle composition. Par « patient », on entend, au sens de la présente invention, un animal, de manière préférée un mammifère, et de manière encore préférée un humain, nécessitant l'administration de la souche Lactobacillus plantarum ou d'une composition comprenant ladite souche pour la prévention et/ou le traitement d'infections respiratoires. Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention. EXEMPLES Exemple 1: Méthode multifactorielle et à haut débit pour l'étude de la résistance des souches au stress aux sels biliaires Le but de cette manipulation a été de tester la résistance d'une souche de Lactobacillus plantarum VEL 12238 (CNCM 1-4643) aux sels biliaires par rapport à 157 autres souches isolées au sein de différents biotopes et incluant une majorité de lactobacilles (90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bifidobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp. et 1 Bacillus spp.). Les souches de Lactococcus et de Streptococcus ont été cultivées à 30°C sans agitation sur milieu M17 (DIFCO) supplémenté avec 5% de lactose. Les souches de Lactobacilius et de Pediococcus ont été cultivées à 37°C sans agitation sur milieu MRS (DIFCO). Les souches de eidobacterium ont été cultivées à 37°C en conditions anaérobies (GENBOX MICROAER; BIOMERIEUX) sans agitation sur milieu MRS (DIFCO) supplémenté avec 10% de cystéine (SIGMA). La souche de Bacillus a été cultivées sur milieu LURIA- BERTANI (DIFCO) à 37°C sous agitation. Le protocole expérimental suivi est le suivant. Il est également exposé en figure 1. 1 mL de culture en phase stationnaire est transvasé dans un tube EPPENDORF. Centrifugation à 5000g pendant 5 minutes Remise en suspension du culot dans 1 mL d'eau peptonnée. Ajustement de la Densité Optique à 1 pour faire le blanc optique. Division de la précédente solution de 1mL en deux solutions de 500 pL dans deux tubes EPPENDORF différents. - Le premier est appelé (S) pour Stressé - Le second est appelé (NS) pour Non Stressé Ajout de 10 pL de solution stressante stérile (solution de sodium cholate et sodium déoxycholate, 50 mg de chaque sel dilué dans 1 ml d'eau stérile, filtrée à 0,2 p.m) dans le tube S. Ajout 10 pl_ d'eau stérile dans le tube NS. Incubation des tubes stressés et non stressés 1h à 37°C. Arrêt de la réaction dans les tubes S et NS par centrifugation à 5 000 g pendant 5 minutes puis reprise dans 1 ml l'eau peptonnée stérile. Cent microlitres de cette suspension sont ensuite ajoutés à 900 pl de milieu MRS. Dans une plaque de 384 puits : Dépôt de 60 !IL par puit de S et NS dilués au 1/4erne Puis 5 dilutions en cascade au 1/2 à partir du premier dépôt. Suivi de la croissance pendant 19h à la DO de 600 nm. Les résultats obtenus sont exposés en figure 2 pour la résistance aux sels biliaires. Ces résultats expriment le retard d'entrée en phase exponentielle en heures pour chaque souche testée. La figure 2 est un graphique présentant une vue globale des retards d'entrée en phase exponentielle des souches testées pour le stress aux sels biliaires. Les retards d'entrée en phase exponentielle vont d'environ Oh pour la souche la plus résistante aux sels biliaires jusqu'à 19h, soit le temps maximal de suivi de la croissance, pour les souches les moins résistantes au stress aux sels biliaires. La souche Lactobacillus plantarum selon l'invention présente un retard d'entrée en phase exponentielle d'environ 3h. Environ 75% des souches testées présentent un retard d'entrée en phase exponentielle supérieur à celui de la souche Lactobacillus plantarum pour le stress aux sels biliaires. Exemple 2 : criblage des souches bactériennes avec les cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) Le but de cette manipulation est de tester les propriétés immuno-modulatrices de la souche Lactobacillus plantarum VEL 12238 en comparaison d'une collection de près de 160 souches ((La collection comprend 158 souches provenant de différents biotopes et incluant : 90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bedobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp et 1 Bacillus spp.)lors d'un criblage avec des PBMC provenant tous d'un même donneur. Préparatifs : - Chauffer le bain marie à 37°C - Nettoyer les hottes - Ramener un flacon de Phosphate Buffer Saline (PBS) de la chambre froide - L-glutamine 200mM (=100x pour utilisation dans cet essai) : 2 mM final - Sérum de Veau Foetal (SVF) : 10% final - Bleu trypan pour l'énumération des PBMC en cellule de Malassez - Milieu RPMI-1640 - Pipettes jetables/stériles 5, 10 et 25 ml - Un mélange pénicilline + streptomycine à 1000x - Prévoir un flacon poubelle stérile (= bouteille verre) - Nettoyer à l'alcool tout ce qui rentre sous la hotte Les PBMC sont livrées sur carboglace et se conservent dans l'idéal dans l'azote liquide. A défaut à -80°C. Il vaut mieux ne pas dépasser une semaine à -80°C pour garder une bonne viabilité de la population cellulaire. Le jour de l'essai, décongeler les PBMC selon le protocole fourni. Avant la décongélation, il faut toutefois préparer du milieu pour recevoir les cellules. DNAse 1: a pour rôle d'empêcher les agrégats. A utiliser à partir d'une solution stock à 10 mg/m1 pour une concentration finale de 100pg/ml. Transvaser les PBMC décongelées dans un flacon contenant déjà un mix milieu + DNAse I: en deux fois ; pipetage du volume (environ 1,8m1) du tube de PBMC, puis ajout dans ce tube d'un peu de milieu pour rincer. Compléter le flacon à 15-20m1. Composition du mix : - RPM11640 : 150 ml - L glutamine : 1,5 ml - FBS : 15 ml - PS : 150 gl Cycle de centrifugation/resuspension : centrifugation 15 mn à 2000 g puis reprise dans 15-20m1 de mix. Note : lorsqu'au cours des pipetages, on recrache le liquide, le faire sur les parois et à vitesse lente pour ne pas abîmer les cellules. Le protocole indique des pertes maximales possibles allant jusqu'à 30%. Après la 2è centrifugation, remise en suspension dans 10m1, agitation douce pour séparer les cellules, puis compléter à 40m1 et faire une énumération pour déterminer le nombre de cellules viables et leur concentration. Utilisation de deux dilutions : une première au 10ème, suivie d'une 2ème au 1/2 (20è final). Enumération au bleu trypan : - Prendre 900 de milieu RPM1 puis 10111 de cellules, puis 50111 de ce mélange avec 50111 de bleu (comptage de la dilution au 20è, donc) Dans chaque puits, on veut déposer 1.106 cellules Cette suspension cellulaire est déposée à l'aide de pipettes de 20 ml dans les puits des plaques sous hotte stérile. On dépose donc environ 1 ml par puits. Préparation des co-incubations : Les précultures bactériennes sont centrifugées, lavée dans du PBS, centrifugées à nouveau et reprise dans du PBS (1 ml). On ajuste ensuite la DO à 1 en diluant les échantillons dans du PBS. Une DO de 1 à 600 nm correspond à environ 5.108 cellules bactériennes. Exemple : Pour la souche VEL 12191 : DO (après dilution au 1/10) = 0,49; donc DO = 4,9. 1 uDO x 1000 / 4,9 uDO = 204 pl et 1000 - 204 = 796 pl. Donc pour cette souche, prendre 204 pl de la suspension dans PBS à la DO de 4,9 et rajouter 796 pl de PBS pour ramener le volume à 1 ml. Dépôt de 20 pl de ces suspensions dans les puits contenant les PBMC. Dépôts en triple. Récupération des surnageants des plaques et dépôt sur DEEPWELL contenant au préalable 10 pl d'anti protéase. Les surnageant sont congelés et conservés à -80°C jusqu'au jour de l'analyse. L'analyse est effectuée par dosage de l'IL-10 et de l'IL-12p70 par la méthode ELISA. Le ratio IL-12p70 / IL-10 est calculé. Les résultats obtenus par le dosage de l'IL-10 et de l'IL-12p70 par ELISA sont exposés en figure 3. Cette figure représente le ratio IL-12p70 / IL-10 mesurés en fonction de la souche bactérienne testée. Les ratios calculés vont de 0,1 pour la souche la plus anti-inflammatoire jusqu'à environ 8 pour la souche la plus pro-inflammatoire. Les souches appelées souches neutres ont un ratio IL-12p70 / IL-10 compris environ entre 1,5 et 3. Pour la souche Lactobacillus plantarum, le ratio IL-12p70 / IL-10 est légèrement inférieur à 7. Seules deux des souches testées on un ratio IL-12p70 / IL-10 supérieur à celui de la souche Lactobacillus plantarum. Il apparaît que la souche Lactobacillus plantarum de l'invention a un profil pro- inflammatoire. Exemple 3 : criblage de souches bactériennes avec les HT29 Le but de cette manipulation est de tester les propriétés immuno-modulatrices de la souche Lactobacillus plantarum en comparaison d'une collection de près de 160 souches ((La collection comprend 158 souches provenant de différents biotopes et incluant : 90 Lactobacillus spp., 31 Lactococcus spp., 31 Bedobacterium spp., 3 Streptococcus spp., 2 Pediococcus spp et 1 Bacillus spp.) lors d'un criblage avec des HT29. J-7 : Préparation des cellules HT 29; A partir d'une préparation (labo) de HT29 repris dans du milieu « Dulbecco's Modified Eagle Medium » (DMEM) + Sérum de Veau Foetal (SVF) 10% et glutamine 1% avec une concentration de 0.1 106 cellules/mi : - Répartition des cellules en plaques 24 puits à valeur de 500p1 de milieu par puits ; Mise des plaques à 37°C à l'étuve CO2 10% pendant 72 heures. J-4 : Changement des milieux de culture des cellules HT29; Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ; - Ajout de 5000 de milieu DMEM + sérum SVF 10% et glutamine 1% à valeur de 500pl/puits, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ; - Mise des plaques à 37°C à l'étuve CO2 10% pendant 24 heures. J-3 : Changement des milieux de culture des cellules HT29; - Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ; Ajout de 500p1 de milieu DMEM + sérum SVF 10% et glutamine 1% à valeur de 500g1/puits, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ; Mise des plaques à 37°C à l'étuve CO2 10% pendant 24 heures ; Lancement des pré-cultures bactériennes. J-2 : Changement des milieux de culture des cellules HT29; Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ; Ajout de 5000 de milieu DMEM + sérum SVF 10% et glutamine 1% à valeur de 5000/puits, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ; Mise des plaques à 37°C à l'étuve CO2 10% pendant 24 heures ; J-1 : Changement des milieux de culture des cellules HT29; Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ; Ajout de 5001i1 de milieu DMEM + sérum SVF 5% (attention changement de concentration pour le sérum, mise en stress des cellules HT29) et glutamine 1% à valeur de 500111/puits, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ; Mise des plaques à 37°C à l'étuve CO2 10% pendant 24 heures ; Lancement des cultures bactériennes à partir des pré-cultures de 48h. JO : Co-incubation HT29 / bactéries et récupération des surnageants : a) Calcul de la concentration en HT29 et estimation de la quantité de bactéries à ajouter pour la co-incubation : On sait que pour une surface de croissance de 200 mm2 on a une concentration en HT29, à confluence, de 2 105 cellules. Or, la surface d'un puits (plaque 24 puits) est de 182,62 mm2, donc on peut estimer la concentration de nos HT29: 182,62 x 2 105 / 200 = 1,83 105 HT29/puits. Pour la co-incubation, le rapport HT29 / bactéries est fixé à 1/40, donc on veut : 40 x 1,83 105 = 7,32 106 CFU/puits. Le volume à ajouter par puits est lui aussi fixé à 500, donc on veut : 7,32 106 CFU/50111. Si on veut 7,32 106 CFU pour 500, nous avons besoin d'une concentration : 1000 x 7,32 106/ 50 = 1,46 108 CFU/ml Or, pour une DO de 1, on estime la concentration à 5 108 CFU/ml, donc pour avoir une concentration de 1,46 108 CFU/ml : 1,46 108x 1 / 5 108 = DO 0,3. b) Préparation des milieux : TNFa (cytokines permettant d'activer la voie NFK13), il se présente à une concentration de 100ngffil dans des tubes de 20, on veut une concentration finale dans le DMEM de 5ng/ml, on le dilue donc au 1/20000, pour préparer 80 ml de DMEM on ajoute 4 pl de TNFa ; DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1%, à valeur de 160 ml pour = 50 souches ; DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1% + antibiotiques PS 0.1%, à valeur de 80 ml pour 144 puits à 500111/puits ; DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1% + antibiotiques PS 0.1% + TNFa (5ng/m1) à valeur de 80 ml pour 144 puits à 500111/puits ; c) Préparation des bactéries : Les cultures de 24 heures sont centrifugées à 3000g pendant 5 minutes ; Les culots sont repris dans 1 ml de DMEM ; Centrifugation à 3000g pendant 5 minutes ; Les culots sont repris dans 1 ml de DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1%; La DO est mesurée pour chacune des souches (dilution 1/10 DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1%, blanc : DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1%) ; Ajustement de la DO avec du DMEM + sérum SVF 5% + glutamine 1% pour obtenir une solution bactérienne de 1m1 avec DO = 0,3; d) Co-incubation HT29 / bactéries : Elimination du DMEM à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide, attention de ne pas toucher le fond des puits car les cellules HT29 y sont adhérées ; Ajout de 4501.11/puits de milieu DMEM + 5% sérum SVF, glutamine 1% et 0.1% PS ou de milieu DMEM + 5% sérum SVF, glutamine 1%, 0.1% PS et TNFa, verser le milieu en prenant soin de viser la paroi du puits et non pas le fond pour éviter de décrocher les cellules ; Ajout de 500 de DMEM + 5% sérum SVF, glutamine 1% et 0.1% PS (témoin) ou 500 de solutions bactériennes (plan de plaques) ; Mise des plaques à 37°C à l'étuve CO2 10% pendant 6 heures. e) Récupération et stockage des surnageants de cultures HT29 / bactéries : Préparation pour 1 plaque « DEEP WELL » : - Dissoudre une pastille d'anti-protéase (ROCHE) dans 2 ml de PBS, solution au 50X; Dépôt de 10111 par puits dans la plaque, la solution se retrouve à 1X car ajout de 500p.I de surnageants de cultures. Récupération des surnageants : Les plaques sont centrifugées 10 minutes à 13000 g puis les surnageants sont récupérés dans la DEEPWELL en présence d'anti-protéase. Stockage des plaques : Les plaques « DEEPWELI » sont conservées à -80°C en attendant le dosage ELISA ; - Les plaques 24 puits sont lavées avec du PBS (500 pl) puis le PBS est éliminé à l'aide d'une pipette pasteur relié à un système de pompe à vide ; - Enfin, les plaques sont conservées à -20°C en attendant le dosage des protéines par la méthode BRADFORD. f) Dosage des protéines : L'interleukine 8 est dosée par la méthode ELISA. Les protéines totales sont dosées par la méthode de BRADFORD. Les résultats obtenus sont exposés en figure 4. Cette figure représente le pourcentage de variation d'IL-8 mesuré en fonction de la souche bactérienne testée. Les quantités mesurées vont d'environ -45% pour la souche la plus anti-inflammatoire jusqu'à environ 75% pour la souche la plus pro-inflammatoire. Pour la souche Lactobacillus plantarum, la variation d'IL-8 est d'environ + 45%. Seules quatre des souches testées on une variation d'IL-8 supérieure à celle de la souche Lactobacillus plantarum. Il apparaît que la souche Lactobacillus plantarum de l'invention a un profil pro- inflammatoire. Exemple 4 : Test de l'efficacité de la souche bactérienne probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention contre un virus de la 15 grippe chez la souris Le but de ces expérimentations est de tester les propriétés immunomodulatrices de la souche bactérienne L. plantarum dans le cas d'infections hivernales. a) Inoculation virale chez la souris 20 Souris : Des souris BALB/c femelles (Janvier, France) ont été utilisées pour cet essai. Elles ont été réparties en lots de 8 souris (4 souris par cage). Les expérimentations ont commencé après deux semaines d'acclimatation des souris au sein de l'Unité d'Expérimentation Animale Rongeurs dans une cellule à atmosphère 25 confinée, du fait de l'utilisation du virus de la grippe. Pendant toute la durée de l'expérience, les souris avaient un accès illimité à la nourriture et à l'eau. Virus de la grippe : Le virus de la grippe H1N1/PR8/34 (virus grippal adapté au modèle murin) a été produit par une culture dans des oeufs âgés de 11 jours de poules 30 fertiles, pendant 2 jours à 35°C. Le titre viral a été quantifié par un essai sur plaque utilisant les cellules « Madin-Darby Canine Kidney » (MDCK) et le stock viral est gardé à -80°C pour les utilisations ultérieures. Infections intra-nasales par le virus : Les souris, âgées de sept semaines, ont d'abord été anesthésiées par une injection intra-péritonéale de IMALGENE 1000/kétamine (MERIAL) et Rompum/xylazine (ALCYON) (0,1% kétamine + 0,06% xylazine, qsp eau physiologique). Elles ont ensuite été infectées par le dépôt de 25 tL de suspension virale dans chaque narine. Plusieurs concentrations d'inoculums viraux ont été testés : 2000, 200 et 100 PFU afin d'identifier la concentration n'induisant pas de mortalité, en dehors des symptômes visibles de la maladie. b) Préparation des bactéries Les cultures en phase stationnaire des souches candidates de bactéries probiotiques (Lactobacillus plantarum VEL 12238 et Lactobacillus paracasei VEL 12195) ont été centrifugées à 3000g pendant 10 minutes. Les culots ont été lavés dans du PBS stérile. Les culots ont ensuite été resuspendus dans du PBS stérile pour avoir une concentration finale de 1.109 UFC/souris. Les souris ont reçu quotidiennement 20011L de cette dose bactérienne par des administrations orales (gavages intra-gastriques), ou simplement du PBS pour les lots témoins, pendant 10 jours en préventif et 9 jours en curatif après l'infection virale. Les souris sont sacrifiées le 10ème jour (J10). c) Evaluation des scores visuels Des marqueurs macroscopiques renseignant sur l'état physique des souris ont été utilisés tout au long de l'essai : Le poids des souris a été suivi tous les jours à partir de l'infection virale ainsi que L'état des souris prenant en compte leur aspect extérieur en utilisant une échelle de notation (Kawase, He et al. 2009) : 5. Saine (aucun symptôme clinique) 4. Légère (fourrure légèrement hérissée) 3. Modérée (fourrure modérément hérissée et léthargique) 2. Sévère (fourrure sévèrement hérissée et maigre) 1. Très sévère (pas de réaction à la stimulation) L'évaluation de ces scores a été réalisée en aveugle par des binômes de notateurs extérieurs à l'essai. d) Lavages broncho-alvéolaires Le jour de l'abattage, les souris ont été euthanasiées par dislocation cervicale. Des lavages broncho-alvéolaires (BALF, « Broncho-Alveolar Lavage Fluid ») ont été collectés à l'aide d'un cône attaché à une seringue, inséré dans la partie supérieure de la trachée de la souris. Des allers-retours ont alors été pratiqués avec un volume total de 1mL de PBS afin de laver les poumons. Les BALF ont été congelés à -80°C jusqu'à leur utilisation. Des dosages d'anticorps (IgA totaux, IgM totaux, IgE totaux, IgG1 spécifique au virus, IgG2a spécifique au virus et IgA spécifique au virus) ont été réalisés. Les dosages des anticorps totaux (IgA, IgM et IgE) ont été effectués à l'aide des kits ELISA (MABTECH). Les dosages des anticorps spécifiques au virus ont été faits avec un protocole ELISA adapté, comprenant notamment une étape de fixation des plaques avec des protéines virales et l'utilisation d'anticorps anti-IgG1, IgG2a ou IgGA (BD-PHARMINGEN, France) conjugués à une peroxydase. e) Dosage de la charge virale Les poumons ont ensuite été prélevés et congelés dans l'azote liquide et conservés à -80°C. Un morceau de quelques milligrammes de poumon a été broyé en présence de tampon de lyse (RLT + [3-mercaptoéthanol) et de billes en céramique de diamètre 1 mm. L'extraction de l'ARN total à partir des poumons des souris a ensuite été effectuée avec le QIAGEN RNEASY MINI KIT (QIAGEN). Les ARN ont ensuite été traités avec la DNase I. La concentration en ARN total a été dosée avec un NANODROP (THERMO FISHER SCIENTIFIC). Une transcriptase inverse a été réalisée avec la transcriptase inverse SUPERSCIPT II (INVITROGEN) et une amorce spécifique à partir de 2,5 lig d'ARN total selon les indications du fournisseur. Une réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitative a été finalement réalisée avec le mélange du kitPCR QUANTI TECT SYBR GREEN PCR (APPLIED BIOSYSTEMS), les amorces spécifiques du virus H1N1 PR8/34 et l'appareil MASTERCYCLER REALPLEX (EPPENDORF). Les conditions d'amplification ont été les suivantes : 10 minutes à 95°C, 40 cycles (15 secondes à 95°C, 20 secondes à 64°C et 30 secondes à 72°C), 15 secondes à 95°C, 15 secondes à 60°C, 20 minutes pour la courbe d'hybridation puis 15 secondes à 95°C. La quantification a été réalisée par comparaison à une gamme étalon virale établie à partir d'un plasmide contenant la séquence du gène cible (capside) des amorces utilisées. f) Analyse statistique Les comparaisons entre les différents résultats obtenus ont été analysées par le logiciel GRAPHPAD PRISM5®. Les différences ont été considérées comme significatives si P Il y a une augmentation significative de l'aire sous la courbe pour le lot de souris infecté par le virus et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 par rapport au lot infecté par le virus et n'ayant pas reçu de doses de bactéries probiotiq ues. Aspect extérieur : La figure 6 présente les scores visuels définissant l'aspect extérieur des souris pour les trois lots infectés par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195 ou encore de L. plantarum VEL 12238, à JO et à J10. A JO, les trois lots ont le score visuel maximal de l'échelle, 5, qui signifie que les souris ne présentent aucun symptôme de la grippe (Saine). A 110, les lots de souris infectés par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195 ont un score visuel approximativement identique de 3, correspondant à une fourrure modérément hérissée et léthargique (Modérée). A J10, le lot de souris infecté par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 ont un score visuel proche de 4, correspondant à une fourrure légèrement hérissée (Légère). Les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum sont en meilleur état physique que les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195. La souche bactérienne probiotique L. plantarum VEL 12238 a donc un effet protecteur contre le virus de la grippe, et particulièrement le virus H1N1. Charge virale : La figure 7 représente la charge virale (logarithme du nombre de copies de génome viral dans 2,5 gg d'ARN total) à J10 et J14 dans les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS ou de L. paracasei VEL 12195 ou encore de L. plantarum VEL 12238. A J10, les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS présentent une charge virale d'environ 3,5; les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. paracasei VEL 12195 présentent une charge virale d'environ 4; les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 présentent une charge virale comprise entre 2 et 2,5. A J14, les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS présentent une charge virale d'environ 1,5; les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. paracasei VEL 12195 présentent une charge virale d'environ 2; les poumons des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238 présentent une charge virale d'environ 0,5. Il apparait donc que l'administration de doses de L. plantarum VEL 12238 à des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 permet une diminution significative de la charge virale dans les poumons des souris entre 110 et J14. De plus, l'administration de doses de L. plantarum VEL 12238 à des souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 montre une différence significative de la charge virale entre les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de PBS et les souris infectées par le virus H1N1 PR8/34 et ayant reçu des doses de L. plantarum VEL 12238. La souche bactérienne probiotique L. plantarum de l'invention a donc un effet protecteur contre le virus de la grippe, et particulièrement le virus H1N1. Exemple 5: Essai clinique d'évaluation de l'efficacité de la souche Lactobacillus plantarum contre des épisodes de rhume chez l'homme. Cette étude vise l'évaluation de l'effet de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention sur les épisodes de rhume dans une population adulte en bonne santé (essai contrôlé contre placebo, en double aveugle et aléatoire). Objectifs de l'étude : Evaluation contre un placebo de l'effet de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention sur la sévérité du rhume. La sévérité est quantifiée par le score total de sévérité, c'est-à-dire la somme des scores de Jackson quotidiens pour tous les jours de l'épisode de rhume. Evaluation contre un placebo de l'effet de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention sur l'incidence du rhume, sur la qualité de vie liée à la santé mesurée avec le critère WURSS-21, les 8 symptômes du critère de Jackson, la température corporelle mesurée avec un thermomètre fiable (fourni à chaque participant de l'étude) et la durée de la maladie. Evaluation contre un placebo de la tolérance de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention. Evaluation contre un placebo de l'observance des patients à la prise de la souche probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention. Evaluation de la quantité de Lactobacillus plantarum de l'invention après 14 jours d'administration orale dans un échantillon séparé de deux groupes de 20 sujets correspondant au même critère de sélection mais pas intégrés à l'étude globale et randomisés séparément selon la même procédure en double aveugle contre un placebo. Cette étude auxiliaire est conduite séparément de façon à être analysée à l'avance sans rompre le caractère aveugle de l'étude. Conduite de l'étude : Les critères de sélection des patients participant à l'étude sont les suivants : sujets en bonne santé, âgés de 18 à 65 ans, sujets aux rhumes (au moins un dans l'année précédent cet essai) et ayant donné leur consentement éclairé écrit à leur participation à cette étude. Les patients correspondant aux critères de sélection sont randomisés en deux groupes de 200 sujets recevant le produit de l'étude en double aveugle, c'est-à-dire le placebo ou le véritable Lactobacillus plantarum de l'invention. Ces deux groupes de patients sont suivis pendant quatre mois. Tous les sujets ont une visite médicale à l'apparition du rhume (DO) et après 16 semaines (D112). Ils reçoivent un auto-questionnaire comprenant les critères de Jackson et WURSS-21 à compléter quand un épisode de rhume apparaîtra. Ils complètent l'auto- questionnaire quotidiennement pendant chaque jour de l'épisode de rhume depuis l'apparition du rhume jusqu'à sa fin, ce qui permet d'évaluer leur sévérité et leur durée. L'observation du protocole sera vérifiée par des appels téléphoniques réguliers mensuels. Les patients engagés dans la quantification du niveau de Lactobacillus plantarum VEL 12238 dans les matières fécales fournissent leur échantillon de selles à D14.30 Exemple 6: formules de compositions probiotiques comprenant Lactobacillus plantarum de l'invention 1. Capsule : Composé Quantité Lactobacillus plantarum CNCM 1-4643 109 UFC Citrate de calcium 300 mg/capsule Stéarate de magnésium 0.02 mg/capsule 2. Poudre : Composé Quantité Lactobacillus plantarum CNCM 1-4643 101° UFC Citrate de calcium 600 mg Citrate de magnésium 200 mg Gomme de xanthane 0,8 mg Benzoate de sodium 0,2 mg Maltodextrine qsp 30g 3. Yaourt : a) Fabrication Mélange homogène des constituants : lait écrémé et dégazé, sucre, arômes, eau, stabilisants Pasteurisation de ce mélange à 93°C pendant 5 minutes Refroidissement à 42°C Ensemencement par le Lactobacillus bulgaricus et le Streptococcus thermophilus et la souche Lactobacillus plantarum de l'invention Fermentation 3h à 42°C - Conditionnement Réfrigération rapide à +4°C b) Composition Composé Masse (%) lait 63 sucre 9,50 stabilisant 0,80 arôme 0,08 eau 26,62 total 100 Exemple 7 : Test de l'efficacité de la souche bactérienne probiotique Lactobacillus plantarum de l'invention dans ses propriétés 5 immunomodulatrices chez la souris Le but de ces expérimentations est de tester la capacité de cette souche à stimuler chez la souris une réponse immunitaire à la fois local (au niveau des muqueuses) et systémique. Pour cela, la souche est administrée à des souris par voie orale pendant 7 10 jours. À la fin de cette période, l'intestin grêle de souris est récupéré et les niveaux d'anticorps IgA sécrétoires (5-IgA) sont déterminés. 15 En outre, les cellules IgA+, les macrophages, les cellules dendritiques (DC) et les cellules caliciformes sont également déterminées sur les mêmes échantillons. REVENDICATIONS1. Une souche bactérienne de Lactobacillus plantarum déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur) sous le numéro d'accession CNCM 1-4643. 2. Utilisation de la souche telle que définie à la revendication 1 comme probiotique. 3. Une composition comprenant la souche bactérienne Lactobacillus plantarum telle que définie à la revendication 1. 4. La composition selon la revendication 3, ladite composition étant une composition probiotique et/ou pharmaceutique. 5. La composition selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, ladite composition comprenant au moins 105, de préférence au moins 106, et au plus 1010 cellules de Lactobacillus plantarum par mL. 6. La composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, ladite composition se présentant sous une forme administrable par voie orale, de préférence sous la forme d'une gélule. 7. La composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 3 à 6, ladite composition étant destinée à prévenir et/ou à traiter des infections et/ou des réactions allergiques par son action immunomodulatrice. 8. La composition selon la revendication 7, laquelle composition étant destinée à prévenir et/ou traiter chez un patient des infections, de préférence des infections respiratoires. 9. La composition selon la revendication 8, laquelle composition étant destinée à prévenir et/ou à traiter des infections respiratoires causées par un virus, de préférence un virus des voies respiratoires. 10. La composition selon la revendication 9, lesdits virus des voies respiratoires étant choisis parmi les rhinovirus, les myxovirus, les coronavirus ou encore les adénovirus, de préférence ledit virus étant un virus de la grippe.30