Brevet FR2982369A1 — publié le 20130510

La présente invention se rapporte à l'observation des tissus biologiques, notamment les matières kératiniques comme la peau. L'invention concerne plus particulièrement mais non exclusivement les procédés visant à déterminer la distribution, notamment la quantité et/ou la répartition, de la mélanine dans des tissus biologiques, en vue notamment d'évaluer l'action d'un traitement cosmétique ou thérapeutique. Arrière-plan La couleur des tissus biologiques est étroitement liée à la quantité et à la distribution tridimensionnelle de la mélanine. Aujourd'hui, la caractérisation de la quantité et de la distribution de la mélanine peut être faite soit sous forme bidimensionnelle par imagerie en lumière blanche et quantification de la mélanine marquée au Fontana Masson sur coupe histologique, soit sous forme tridimensionnelle par imagerie multiphoton et quantification tridimensionnelle de la mélanine après traitement des images. La microscopie multiphoton facilite l'observation en profondeur des tissus biologiques, notamment des tissus vivants très diffusants. En effet, la lumière infrarouge pénètre mieux dans les tissus car elle est moins diffusée et moins absorbée et le fait d'utiliser un mécanisme non-linéaire pour produire le signal introduit un critère plus fort de sélection des signaux en milieu diffusant. Ce mécanisme non-linéaire implique l'interaction simultanée de deux voire plusieurs photons avec la molécule ou la structure qu'on cherche à détecter. Généralement, le faisceau excitateur est focalisé et balayé dans l'échantillon, et le signal non-linéaire créé est détecté afin d'obtenir une image. La particularité de ce type d'imagerie repose sur la capacité de sectionnement optique qu'elle procure du fait de la dépendance non-linéaire du signal avec la puissance d'excitation. La densité de puissance excitatrice étant très élevée au niveau du point focal, c'est seulement dans un volume focal limité que l'effet non-linéaire considéré a lieu de façon efficace ; cette propriété essentielle assure un confinement du signal obtenu dans l'échantillon et permet donc d'obtenir une résolution tridimensionnelle intrinsèque de l'ordre du micromètre. La profondeur d'imagerie varie en fonction des tissus, elle peut être d'environ 130-200 jim pour la peau humaine. En outre, du fait de l'utilisation de sources endogènes de signal, cette technique d'imagerie ne requiert pas le marquage des composants tissulaires. Les signaux de fluorescence sont créés par des chromophores endogènes, outre la mélanine on peut citer le NAD(P)H, les flavines, la kératine et l'élastine. La demande FR 2 944 425 divulgue un procédé d'évaluation de la pigmentation de la peau par microscopie multiphoton reposant sur le fait que, dans la peau, au niveau des couches basales de l'épiderme, la mélanine fortement concentrée se traduit par une intensité de fluorescence plus forte que celle des autres fluorophores endogènes. Les pixels présentant une forte intensité sont attribués à la mélanine. Néanmoins, cette méthode n'est pas toujours satisfaisante, car d'une part elle peut être 10 perturbée par d'autres fluorophores présentant également une forte intensité de fluorescence comme la kératine, et d'autre part elle ne prend pas en compte la mélanine présentant un signal de fluorescence comparable à celui des autres fluorophores endogènes. Un procédé plus spécifique consiste à prendre en compte la durée de vie de 15 fluorescence de la mélanine. En effet, la durée de vie de fluorescence de la mélanine dépend des propriétés intrinsèques de fluorescence de la mélanine et non de l'intensité de fluorescence ni de la concentration du fluorophore dans le volume d'excitation. La mélanine présente une durée de vie de fluorescence excitée à deux photons qui est différente de celle des autres fluorophores endogènes. Cette durée de vie de fluorescence 20 peut être estimée à partir des images acquises par FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging), technique décrite dans l'article de M.S. Roberts et al., « Non-invasive imaging of skin physiology and percutaneous penetration using fluorescence spectral and lifetime imaging with multiphoton and confocal microscopy » (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics vol. 77 (2011), pp 469- 488), qui consiste à suivre la décroissance du 25 signal de fluorescence avec le temps. La demande JP2009-142597 décrit une méthode de visualisation de la mélanine alliant microscopie multiphoton et FLIM. Cette dernière technique, pour offrir une bonne estimation de la durée de vie de fluorescence, nécessite d'intégrer le signal de fluorescence dans le temps et dans l'espace, opération coûteuse en temps, ce qui limite les possibilités d'application de cette technique, en particulier dans le 30 cadre de l'imagerie tridimensionnelle. Résumé Il existe ainsi un besoin pour bénéficier d'un procédé sensible, facile à mettre en oeuvre, non invasif, pour visualiser de façon tridimensionnelle la distribution de la mélanine dans les tissus biologiques, permettant d'obtenir des résultats fiables, rapides et pertinents. La présente invention a pour objectif de développer un procédé plus simple et plus rapide que les procédés de l'art antérieur, qui permette de détecter spécifiquement la mélanine et de caractériser sa distribution tridimensionnelle dans un tissu biologique, en particulier l'épiderme. Il existe également un besoin pour permettre de vérifier l'efficacité ou l'innocuité d'un produit, par exemple à base d'actifs anti-pigmentant, dépigmentant ou pro-pigmentant utilisé lors d'un traitement. Il y a encore un intérêt à caractériser la pigmentation, notamment cutanée, pour objectiver les différences de quantité et répartition de la mélanine selon le type de peau, la population, la localisation géographique, ou encore l'alimentation ..., et pour caractériser des désordres pigmentaires, notamment cutanés tels que les lentigos actiniques, les éphélides (taches de rousseur) ou les mélasmas (masque apparaissant parfois en cours de grossesse). De plus, dans le cadre de la recherche pour développer de nouveaux tissus de façon reconstruite ou synthétique il y a un besoin d'objectiver les différences de quantité et répartition de la mélanine, selon le type de modèle de tissu, en particulier de modèle de peau. L'invention vise à répondre à tout ou partie de ces besoins. L'invention a ainsi pour objet, selon l'un de ses aspects, un procédé de détection, de quantification et/ou de visualisation d'un composant fluorophore endogène; tel que la mélanine, au sein d'un tissu biologique, le procédé comportant les étapes consistant à : a) acquérir après excitation multiphotonique un ensemble d'images tridimensionnelles ou bidimensionnelles successives renseignant sur la décroissance dans le temps des signaux de fluorescence dans l'échantillon, b) déterminer par traitement de ces images, en effectuant une régression linéaire du logarithme des signaux de fluorescence, la distribution spatiale dans l'échantillon des pentes de ladite régression linéaire, et c) générer une information sur la présence et/ou la quantité du fluorophore au sein de l'échantillon au moins à partir de cette distribution spatiale tridimensionnelle. Le procédé est non invasif et peut être utilisé dans un cadre cosmétique, non-thérapeutique. Le procédé peut permettre d'évaluer la pigmentation. Les images acquises sont des images temporelles tridimensionnelles. On entend par « image temporelle tridimensionnelle », une série d'images tridimensionnelles successives dans le temps. Chaque image tridimensionnelle correspond à une pile d'images bidimensionnelles représentatives à un instant donné et une profondeur donnée de la structure de l'échantillon. Chaque pixel de chaque image tridimensionnelle ou bidimensionnelle peut être défini par des coordonnées spatiales (x, y, z), z étant la profondeur dans l'échantillon. Ainsi chaque image bidimensionnelle correspond à un cas particulier d'image tridimensionnelle, dans lequel l'acquisition se fait uniquement à une profondeur z donnée. Les pixels des images tridimensionnelles sont regroupés par ensembles de pixels ayant les mêmes coordonnées spatiales d'images prises à divers instants, chacun de ces ensembles étant appelé « pixel temporel ». La valeur du signal de fluorescence de chaque pixel peut être obtenue par intégration au cours d'un intervalle de temps du signal de fluorescence excitée à deux photons. L'intégration du signal de fluorescence peut en particulier être effectuée à intervalles réguliers, notamment sur une durée comprise entre 1 et 3 ns, par exemple égale à 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ou 3 ns. La pente de décroissance des signaux de fluorescence peut être obtenue par régression linéaire du logarithme des durées de vie de fluorescence. Le procédé peut ne nécessiter l'acquisition que d'un nombre limité d'images temporelles tridimensionnelles, par exemple compris entre trois et cinq, ce qui offre un bon compromis entre temps d'acquisition et précision. L'utilisation des pentes obtenues par régression linéaire du logarithme facilite cette limitation du nombre d'acquisitions. Par rapport à la technologie FLIM, l'invention réduit le nombre d'acquisitions temporelles et rend le procédé plus facile et plus rapide à mettre en oeuvre. Alors que la technologie FLIM permet une meilleure estimation de la durée de vie de fluorescence, mais nécessite un temps d'acquisition assez long (environ 30 s) et une dégradation de la résolution de l'image tridimensionnelle, le procédé selon l'invention est plus rapide et particulièrement avantageux pour accéder à une visualisation ou une quantification de façon tridimensionnelle, tout en gardant une résolution équivalente à la résolution théorique du microscope. La durée totale d'acquisition pour les pixels temporels de coordonnées (x, y, z) d'un échantillon donné, est d'environ 0.28 us au lieu de quelques ms en FLIM. Le nombre d'acquisitions temporelles pour chaque pixel temporel est par exemple égal à quatre et pour chaque pixel le signal de fluorescence excitée à deux photons est intégré au cours du temps entre deux acquisitions, en particulier par intervalle régulier de 2 ris. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre in vivo, mais aussi sur des échantillons ex vivo et in vitro. L'invention améliore la rapidité du procédé d'acquisition et du procédé de traitement des images. Grâce à l'invention, la caractérisation en 3D du tissu est possible et permet une application in vivo avec un haut débit. Le tissu peut être constitué de matières kératiniques humaines. Par « matières kératiniques », on entend les cheveux, les cils, les sourcils, la peau, les ongles, les muqueuses, le cuir chevelu, entre autres. Le tissu biologique, en particulier les matières kératiniques, selon l'invention peut être naturel ou artificiel, l'échantillon est par exemple de la peau humaine, de peau reconstruite ou artificielle. Le tissu biologique peut être des cellules mélanisées en culture. L'information peut être générée sous la forme d'au moins une image, notamment une image bidimensionnelle ou tridimensionnelle. L'information générée peut renseigner sur la surface et/ou le volume occupé par la mélanine au sein dudit tissu, ainsi que sur sa répartition 3D par rapport aux autres constituants du tissu. Selon un autre de ses aspects l'invention a pour objet un procédé pour évaluer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement notamment pro-pigmentant, dépigmentant ou anti pigmentant, sur un tissu biologique, comportant les étapes consistant à : évaluer la pigmentation au sein d'un tissu biologique à l'aide d'un 5 procédé tel que précédemment décrit, - exposer l'échantillon à un stimulus choisi parmi : un rayonnement lumineux, notamment solaire, ultra-violet (UVA et/ou UVB), infrarouge (IR), un stimulus provoquant une réponse inflammatoire, une action mécanique (tension, pression, pelage, décollement, exfoliation, peeling, abrasion) ou à un traitement, en particulier par au moins 10 un produit pro-pigmentant, dépigmentant ou anti pigmentant, - faire une deuxième évaluation de la pigmentation au sein du tissu biologique à l'aide d'un procédé tel que précédemment décrit, - comparer les informations générées lors des deux évaluations, et évaluer l'action du stimulus ou du traitement sur la pigmentation à partir 15 au moins de cette comparaison. Le traitement peut être non thérapeutique, notamment cosmétique. Le traitement peut être choisi parmi : l'application, l'injection, l'ingestion, l'inhalation d'un produit, notamment d'un produit cosmétique. Le traitement peut correspondre à la prise de compléments alimentaires et/ou 20 de médicaments. Il peut également comporter l'exposition des tissus biologiques à un traitement choisi parmi : l'application, l'injection, l'ingestion, l'inhalation d'un produit, notamment d'un produit cosmétique ou la prise de compléments alimentaires et/ou de médicaments. Par « produit cosmétique », on entend un produit tel que défini dans la 25 Directive 93/35/CEE du 14 juin 1993, modifiant la Directive 76/768/CEE. Le produit peut avoir un effet dépigmentant. Ainsi, le traitement peut comporter l'application de tout agent chimique modulateur de la pigmentation. Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour évaluer l'efficacité ou l'innocuité d'actifs dépigmentant, anti-pigmentant, ou pro-pigmentant. Les actifs peuvent 30 être à visée thérapeutique comme par exemple I'hydroquinone ou les rétinoïdes, et/ou cosmétique. Le procédé selon l'invention peut être également être utilisé pour évaluer les effets secondaires sur la pigmentation de certains produits, par exemple les dermocorticoïdes. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé pour évaluer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement, notamment anti-pigmentant, pro-pigmentant ou dépigmentant, sur un tissu biologique, dans lequel au moins deux régions du tissu sont exposées différemment au stimulus et/ou traitées différemment, et dans lequel on compare l'information sur la présence et/ou la quantité de mélanine dans lesdites régions, obtenue à l'aide d'un procédé tel que précédemment décrit, avant et après exposition audit stimulus ou audit traitement. Pour tester l'action d'un produit on peut comparer une évaluation faite après traitement avec un placébo du produit et une évaluation faite après traitement avec ce produit. Le placébo est par exemple le même milieu cosmétique que celui du produit utilisé pour le traitement mais sans le ou les actifs correspondants. On peut mettre en oeuvre une évaluation de la distribution de mélanine dans les tissus biologiques d'un individu ou sur des échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités par un composé cosmétique, et comparer à une évaluation de la distribution de mélanine dans les tissus biologiques du même individu ou les mêmes échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités par un placebo du composé cosmétique. Le traitement peut correspondre à l'application d'un produit, notamment cosmétique. Le produit peut par exemple être sous la forme d'une crème, une lotion, une pommade, une huile, une poudre, cette liste n'étant pas limitative. Le produit peut également être contenu dans un support à appliquer sur les tissus biologiques, notamment la peau humaine, reconstruite ou artificielle, par exemple un patch, un pansement, un bandage ou un masque. Le produit peut ne pas être un produit pigmentant ou dépigmentant destiné uniquement à agir sur la quantité et/ou la répartition de la mélanine dans les tissus biologiques. Le produit peut ainsi être destiné par exemple au maquillage, à l'hydratation, à la protection des tissus biologiques, notamment solaire, ou à la réparation des tissus biologiques, tout en ayant des effets sur la quantité et/ou la répartition de la mélanine dans les tissus biologiques. Le produit peut ainsi contenir différents composés, notamment des actifs autres que des actifs destinés à agir sur la mélanine des tissus biologiques. Le procédé peut permettre de visualiser la mélanine dans les tissus biologiques, il peut par exemple permettre de connaître la répartition de la mélanine dans les différentes couches de l'épiderme de la peau. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé pour promouvoir un traitement, notamment non thérapeutique, dans laquelle on fait état d'une action du traitement sur la mélanine, mise en évidence par un procédé tel que défini plus haut. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé comportant l'étape consistant à faire état, lors de la commercialisation d'un produit, par exemple dans la publicité ou sur un emballage, du fait que l'efficacité du produit a été vérifiée par un procédé tel que défini plus haut. L'invention pourra être mieux comprise à la lecture qui va suivre, de la description d'exemples non limitatifs de mise en oeuvre de celle-ci, et à l'examen des figures du dessin annexé, sur lequel : - la figure 1 illustre différentes étapes d'un procédé conforme à l'invention, la figure 2 représente, de façon schématique et partielle, un exemple de dispositif multiphoton pouvant être mis en oeuvre dans un procédé selon l'invention, - les figures 3A à 3D illustrent un exemple d'acquisition d'image selon l' invention, - les figures 4A et 4B illustrent différents exemples d'évolution temporelle de la fluorescence à l'intérieur d'un échantillon, la figure 5 illustre une représentation paramétrique des durées de vie de fluorescence pour une coupe d'un échantillon de peau à une profondeur fixe, - les figures 6 et 7 illustrent des masques bidimensionnel et tridimensionnel de distribution de mélanine dans un échantillon de peau obtenus par un procédé selon - la figure 8 illustre un masque bidimensionnel de distribution de mélanine dans un échantillon de peau obtenu par un procédé de l'art antérieur, les figures 9A à 9D illustrent la quantité de mélanine dans un échantillon de peau avant et après un traitement, et - les figures 10A, 10B et 10C illustrent la caractérisation des phototypes 1 à IV de peau humaine par la quantité de mélanine. L'étape 1 d'un procédé selon l'invention peut consister à acquérir par microscopie multiphoton des ensembles d'images temporelles bidimensionnelles à différentes profondeurs d'un échantillon de tissu biologique. Chaque pixel peut être obtenu par intégration au cours d'un intervalle de temps du signal de fluorescence excitée à deux photons, par exemple en utilisant un dispositif en comptage de photons TCSPC (Time-correlated single photon counting) L'utilisation d'un dispositif de microscopie multiphoton peut permettre une automatisation des étapes d'acquisition des images du tissu biologique. On peut en particulier générer une image temporelle tridimensionnelle à partir d'une pile d'images temporelles bidimensionnelles à différentes profondeurs. Chaque pile peut comporter plusieurs dizaines d'images temporelles bidimensionnelles, par exemple entre 50 et 100 images, notamment entre 65 et 80 images. Dans une étape 2, pour chaque pixel de coordonnées (x, y, z) on étudie la variation de l'intensité de fluorescence en fonction du temps en calculant son logarithme. On ajuste ensuite le logarithme par une régression linéaire afin d'en estimer la pente, qui est liée à la durée de vie de fluorescence. Les données obtenues peuvent ainsi être représentées par une image des pentes obtenues par régression linéaire du logarithme de l'intensité de fluorescence. L'image des pentes, aussi nommée image paramétrique, contient deux types de pixels : des pixels caractérisés par une pente faible, et des pixels caractérisés par une grande valeur de la pente. On attribue les pixels ayant des pentes de grande valeur à la mélanine qui possède une durée de vie plus courte par rapport aux autres fluorophores endogènes des cellules de l'épiderme comme la kératine, NAD(P)11, FAD, En effet, la mélanine est caractérisée par deux durées de vie de fluorescence. La principale, très courte, est de l'ordre de 0,1-0,2 ns (nanoseconde). L'autre durée de vie de fluorescence de la mélanine est minoritaire et plus longue, comprise entre 0,7 et 1,4 ns. Par comparaison les autres fluorophores endogènes des cellules de l'épiderme comme la kératine, NAD(P)H, FAD, ... présentent des durées de vie de fluorescence majoritairement plus longues, supérieures à 1,5 ns. L'étape 3 consiste à extraire, à partir de l'image des pentes, les pixels correspondant à la mélanine. On applique par exemple un filtrage surfacique à chaque image bidimensionnelle qui tient compte de la taille des mélanosomes, c'est-à-dire la compare à une surface de référence d'environ 1 pm2, pour éliminer le bruit et détecter plus spécifiquement la mélanine. L'information sur la présence et/ou la quantité de mélanine au sein de l'échantillon est par exemple générée après avoir éliminé les signaux de fluorescence ayant des pentes de faible valeur et les structures de taille inférieure à 1 p.m2. L'information peut être générée sous la forme d'au moins une représentation de la distribution spatiale de la mélanine, en particulier sous la forme d'une image 10 bidimensionnelle correspondant au masque de mélanine pour une profondeur de I ' échantillon. L'étape 2 de calcul des pentes et l'étape 3 de filtrage du masque associé peuvent être réalisées sur la totalité de l'image bidimensionnelle correspondant à une profondeur donnée, et réitérées pour chaque image de la pile tridimensionnelle. 15 Le procédé permet d'obtenir une pile de représentations bidimensionnelles formant une image tridimensionnelle du masque de mélanine. A partir du masque tridimensionnel de mélanine obtenu par ce procédé, on peut caractériser la mélanine en calculant sa densité et/ou sa distribution spatiale. Compte tenu de la rapidité des calculs, ce procédé peut être utilisé dans une 20 méthode de screening. Pour mettre en oeuvre le procédé ci-dessus, tout système connu de microscopie multiphoton, combiné à un système de mesure de la durée de vie de fluorescence, est utilisable. La longueur d'onde d'excitation utilisée peut être comprise entre 700 et 25 1000 nm, de préférence voisine de 760 nm. Cette gamme de longueur d'onde permet une imagerie de la plupart des constituants fluorescents des tissus. On a représenté sur la figure 2, de façon schématique et partielle, un exemple de dispositif multiphoton 100 pouvant être mis en oeuvre dans un procédé selon l' invention. 30 Le dispositif multiphoton 100 est par exemple du type DermaInspecte développé par la société Jenlab. Le dispositif 100 comporte un laser femtoseconde 10, par exemple un laser Titane-Saphir (Ti : Sa), accordable dans une gamme des longueurs d'onde infrarouge et pouvant fournir des impulsions de l'ordre de 100 femtosecondes à un taux de répétition de l'ordre de 80 MHz. Le laser 10 émet un faisceau infrarouge 11, qui est dirigé vers un dispositif de balayage 12 du faisceau laser sous la forme d'un « scanner XY ». Un balayage du faisceau laser peut être obtenu en déplaçant angulairement deux miroirs galvanométriques du dispositif de balayage 12. Le faisceau est ensuite réfléchi par un miroir dichroïque 14 et il est focalisé sur les matières kératiniques 13 à l'aide de l'objectif 15. Ainsi, les deux miroirs galvanométriques permettent un balayage du point de focalisation dans le plan (x, y) perpendiculaire à la direction de propagation du faisceau (axe z). Un dispositif piézo-électrique permet de translater l'objectif 15 et de changer ainsi le plan de focalisation dans les matières kératiniques 13. De la sorte, il est possible de reconstituer la distribution tridimensionnelle de la mélanine dans les matières kératiniques par superposition des images acquises. Pour ce faire, les signaux créés au point focal peuvent alors être détectés soit en épicollection à travers l'objectif d'excitation 15. Le premier miroir dichroïque 14 permet de sélectionner les signaux multiphoton créés, notamment l'autofluorescence (AF) provenant des matières kératiniques 13. Puis, un deuxième miroir dichroïque 16 permet de séparer les signaux d'autofluorescence (AF) des autres signaux multiphoton, correspondant par exemple à la génération de seconde harmonique (SHG). Dans tous les cas, les signaux passent au travers de filtres spectraux 17 et arrivent sur les détecteurs en comptage de photons (TCSPC° : Time-correlated single photon counting) 18, 19, permettant de cette façon de faire une image combinée, par exemple AF/SHG. Les premier et deuxième détecteurs 18 et 19 permettent de générer des signaux 18a et 19a qui sont transmis à un dispositif électronique 20 d'acquisition et de traitement des signaux. Exemple 1 : observation in vivo de la peau humaine Lors d'essais, des images tridimensionnelles ont été obtenues successivement in vivo chez l'homme sur l'avant-bras, une image tridimensionnelle étant constituée d'une pile comprenant 70 images bidimensionnelles acquises à des profondeurs variant de 2.346 depuis la surface de la peau obtenues à l'aide du dispositif Dermainspecte, avec une longueur d'onde d'excitation de 760 mu, et un objectif 40x/1.3 NA. Les Figures 3A à 3D illustrent une séquence temporelle d'images tridimensionnelles dont on ne montre que quatre images temporelles bidimensionnelles acquises in vivo sur la peau de l'avant-bras d'un volontaire sain, près de la couche basale de l'épiderme à une profondeur de 50 um par rapport à la surface de la peau. Pour chaque image temporelle, le signal de fluorescence a été intégré sur une durée de 2 ns. Dans les conditions expérimentales, pour un point de l'échantillon contenant de la mélanine, la majorité des photons de fluorescence émis sont collectés lors de la première acquisition temporelle. Le nombre de photons de cette première acquisition est d'autant plus élevé que la mélanine est fortement concentrée. La flèche I de la figure 3A, correspondant au premier canal temporel, indique une zone de forte concentration de mélanine en se basant sur le critère d'intensité. A ce niveau, la mélanine fortement concentrée crée un signal de fluorescence d'intensité plus forte que celle des autres fluorophores endogènes. Les Figures 4A et 4B montrent un exemple de courbe d'évolution temporelle (Figure 4A) et d'ajustement du logarithme de l'intensité de fluorescence par une régression linéaire (Figure 4B) pour un pixel de l'image correspondant à un point de l'échantillon avec mélanine et pour un pixel correspondant à un point de l'échantillon sans mélanine. Les figures 5, 6 et 8 correspondent à des représentations bidimensionnelles de peau humaine à une profondeur de 50 gm. La Figure 5 montre une image paramétrique des pentes obtenues par régression linéaire du logarithme de l'intensité de fluorescence. L'image présente deux types de pixels : des pixels caractérisés par une pente faible, et des pixels caractérisés par une grande valeur de la pente, attribués à la mélanine pour les raisons exposées précédemment. La figure 6 montre le masque bidimensionnel de mélanine obtenu à partir de la figure 5 par extraction des pixels attribués à la mélanine alors que la figure 8 illustre le résultat obtenu avec la méthode de l'art antérieur se basant uniquement sur l'intensité de 30 fluorescence. En comparant les figures 5 et 8, on observe que la présence de mélanine est sous-estimée par la Figure 8 car, seuls les pixels intenses sont attribués à la mélanine. Pour chaque image bidimensionnelle de la pile tridimensionnelle, le calcul des pentes du logarithme de l'intensité de fluorescence en fonction du temps correspondant à chaque pixel et le filtrage du masque bidimensionnel correspondant sont réitérées afin de visualiser de façon tridimensionnelle le masque de la mélanine associé comme illustré Figure 7 et de caractériser sa distribution de façon tridimensionnelle dans tout l'épiderme, y compris dans le Stratum Corneum. Les essais correspondant aux exemples 2 et 3 qui suivent, réalisés avec ce procédé, ont mis en évidence des différences de quantité de mélanine. Exemple 2 : évaluation d'un traitement par des dermocorticoïdes Les observations ont été effectuées à l'aide d'un microscope Dermalnspect® comme décrit précédemment sur une même zone de peau avant et après traitement par des dermocorticoïdes. La Figure 9A montre une image brute de fluorescence d'un échantillon de la zone de peau avant traitement et la Figure 9C illustre le masque de mélanine correspondant obtenu par un procédé selon l'invention. On traite la peau par des dermocorticoïdes (sous occlusion). Les figures 9B et 9D illustrent une image brute de fluorescence de l'échantillon et le masque de mélanine correspondant obtenu par un procédé selon l'invention après trois semaines de traitement. Le procédé selon l'invention permet une détection spécifique de la mélanine, la comparaison des masques illustrés aux Figures 8C et 8D met en évidence la diminution de la quantité de mélanine et permet ainsi une meilleure évaluation des modifications indui es par les dermocorticoïdes par une quantification tridimensionnelle de la mélanine dans la peau. Exemple 3 : caractérisation des phototypes I à IV de peau humaine On classe les peaux humaines selon leur réaction à une exposition solaire en six phototypes. Les peaux foncées (phototypes V et VI) possèdent une plus grande quantité de mélanine qui filtre naturellement les UV. Le procédé selon l'invention permet une meilleure analyse de la pigmentation constitutive des phototypes I à IV correspondants à des peaux allant de très claire à mate. Les Figures 10A et 10B montrent une image brute de fluorescence pour des échantillons de peau pour différents phototypes et le masque de mélanine correspondant obtenu par un procédé selon l'invention. A partir des masques de la Figure 10B, on a calculé la densité 3D de mélanine afin d'obtenir le graphe comparatif de la Figure 10C mettant en évidence l'augmentation de la quantité de mélanine avec le phototype. Comme l'illustre le masque de la figure 10B correspondant au phototype I, le procédé selon l'invention permet de quantifier la présence de mélanine, même à faible concentration. Le procédé peut ainsi être utilisé pour tout type de tissu contenant de la 10 mélanine REVENDICATIONS1. Procédé de détection, de quantification et/ou de visualisation d'un fluorophore endogène, au sein d'un tissu biologique, le procédé comportant les étapes consistant à : a) acquérir après excitation multiphotonique un ensemble d'images tridimensionnelles ou bidimensionnelles successives renseignant sur la décroissance dans le temps des signaux de fluorescence dans l'échantillon, b) déterminer par traitement de ces images, en effectuant une régression linéaire du logarithme des signaux de fluorescence la distribution spatiale dans l'échantillon des pentes de ladite régression linéaire, et c) générer une information sur la présence et/ou la densité volumique ou surfacique d'un fluorophore au sein de l'échantillon au moins à partir de cette distribution spatiale, le fluorophore étant la mélanine. 2. Procédé selon la revendication 1, l'ensemble d'images comportant entre trois et cinq images. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, l'intégration du signal de fluorescence étant effectuée à intervalles réguliers, notamment sur une durée comprise entre 1 et 3 ns. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, l'information étant générée après avoir éliminé les pixels présentant des pentes de faible valeur. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 25 l'information étant générée sous la forme d'au moins une représentation de la distribution spatiale de la mélanine. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, l'information générée renseignant sur la surface et/ou le volume occupé par la mélanine au sein du tissu. 30 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, étant mis en oeuvre in vivo sur un tissu biologique. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le tissu étant de la peau humaine, de la peau reconstruite ou artificielle, ou des cellules mélanisées en culture. 9. Procédé pour évaluer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement, 5 notamment propigmentant ou dépigmentant, sur un tissu biologique, comportant les étapes consistant à : - évaluer la pigmentation au sein du tissu à l'aide du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, - faire une deuxième évaluation de la pigmentation au sein du tissu à l'aide 10 d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le tissu ayant été exposé à une action d'un stimulus choisi parmi : un rayonnement lumineux, notamment solaire, ultra-violet (UV), infrarouge (IR), un stimulus provoquant une réponse inflammatoire, une action mécanique ou d'un traitement, en particulier par au moins un produit cosmétique pro pigmentant ou dépigmentant, par exemple le lucinol ou tout autre 15 agent chimique modulateur de la pigmentation, comparer les informations générées lors des deux évaluations, et évaluer l'action du stimulus ou du traitement sur la pigmentation à partir au moins de cette comparaison. 10. Procédé pour évaluer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement, 20 notamment anti-pigmentant, pro-pigmentant ou dépigmentant, sur un tissu biologique, dans lequel au moins deux régions du tissu sont exposées différemment au stimulus et/ou traitées différemment, et dans lequel on compare l'information sur la présence et/ou la quantité de mélanine dans lesdites régions, obtenue à l'aide d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, avant et après exposition audit stimulus ou audit 25 traitement.