Brevet FR2988857A1 — publié le 20131004

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA RESISTANCE CELLULAIRE AUX MEDICAMENTS L'invention porte sur un procédé de détermination de la résistance cellulaire aux médicaments, et notamment de la résistance à la 5 chimiothérapie de cellules tumorales. Le procédé de l'invention se base sur la résonance magnétique nucléaire du 129Xe hyperpolarisé. La chimiothérapie est un outil thérapeutique très important dans le traitement des cancers. Cependant, il arrive que des cellules cancéreuses développent une résistance à la chimiothérapie, la rendant 10 inefficace. Afin d'effectuer les choix thérapeutiques les plus appropriés pour le patient, il est donc essentiel de mettre en évidence le plus rapidement possible et de manière fiable cette résistance. De même, il est connu que les bactéries peuvent développer une résistance ou tolérance aux antibiotiques. Dans les deux cas, la résistance peut être due à des mécanismes 15 moléculaires d'expulsion des substances cytotoxiques, notamment au moyen de protéines membranaires (principalement la p-glycoprotéine dans le cas de la résistance à la chimiothérapie). D'une manière générale, on parle de résistance aux médicaments (MDR, de l'anglais Multi Drug Resistance). Dans la suite on s'intéressera plus spécifiquement à la résistance à la 20 chimiothérapie, mais l'invention concerne également d'autres formes de résistance aux médicaments, comme par exemple la résistance microbienne aux antibiotiques. Des techniques in vitro connues de l'art antérieur utilisent une détection par fluorescence de la présence et de l'activité de la p25 glycoprotéine. Ces techniques ne sont pas applicables in vivo car le rayonnement de fluorescence ne pénètre que faiblement dans les tissus. Par ailleurs, elles sont lentes, car elles nécessitent un temps d'incubation. En outre, l'adjonction d'un fluorophore altère de manière irréversible l'échantillon si on veut répéter l'expérience, il est nécessaire de se procurer un nouvel 3 0 échantillon. Pour les applications in vivo on a généralement recours à des techniques d'imagerie moléculaire (tomographie par émission de positrons, 2 98885 7 2 scintigraphie) qui sont complexes, emploient des radiations potentiellement nocives et sont couteuses à mettre en oeuvre. L'invention vise à procurer un procédé alternatif de détermination de la résistance cellulaire aux médicaments, et notamment de 5 la résistance à la chimiothérapie de cellules tumorales, ne présentant pas les inconvénients et limitations précités de l'art antérieur. En particulier, le procédé de l'invention est relativement simple à mettre en oeuvre, au moyen d'un équipement relativement standard ; il est rapide (pas d'incubation préalable, temps de mesure court, de l'ordre de quelques minutes), n'implique 10 pas d'altération irréversible de l'échantillon et présente une sensibilité élevée qui permet d'utiliser un nombre relativement réduit de cellules (aussi petit que 10 millions). En outre, il convient à des applications aussi bien in vitro que in vivo. Le procédé de l'invention se base sur la mesure de la vitesse 15 à laquelle les cellules expulsent le Xénon. Cette mesure peut être réalisée par résonance magnétique nucléaire (RMN), en utilisant du Xénon (129Xe) hyperpolarisé, comme décrit dans l'article de C. Boutin et al. « Hyperpolarized 129Xe NMR signature of living biological cells » NMR Biomed. 2011; 24: 1264 - 1269. Il convient de souligner qu'en principe il n'est pas évident qu'il existe 20 une corrélation entre cette vitesse d'expulsion et la résistance aux médicaments, car le Xénon ne joue aucun rôle dans le métabolisme cellulaire. Les présents inventeurs supposent que le Xénon peut être assimilé à une petite molécule hydrophobe (on entend par « petite molécule » toute molécule de masse molaire inférieure à 1000 g/mol) et se comporte, vis-à-vis des 25 mécanismes d'échange transmembranaire, de manière semblable à des médicaments tels que les médicaments anticancéreux et les antibiotiques. Une vitesse élevée d'expulsion du Xénon serait donc la signature des mécanismes d'élimination active des molécules cytotoxiques qui sont considérées comme étant à l'origine de la résistance aux médicaments. 30 Ce procédé présente plusieurs avantages : - L'utilisation de 129Xe hyperpolarisé assure une grande sensibilité de la détection par RMN, ce qui permet l'utilisation d'un nombre réduit de cellules et une analyse rapide qui garantit leur viabilité (pour les applications in vitro). - La technique peut être transposée in vivo, et cela d'autant plus facilement que le Xénon n'est pas toxique et son temps de résidence 5 dans l'organisme est bref. - Sa mise en oeuvre ne nécessite qu'un spectromètre RMN conventionnel et une source de 129Xe hyperpolarisé. Elle est simple, rapide et peu couteuse. - Le procédé peut être couplé à d'autres mesures RMN 10 d'intérêt clinique, et permet une localisation spatiale qui peut s'avérer intéressante dans les applications in vivo. Le procédé permet plus particulièrement de cibler des échantillons dont le volume peut être aussi faible que 100 pm3. - Le Xénon introduit dans l'échantillon perd 15 progressivement sa polarisation et peut être remplacé par du Xénon hyperpolarisé « frais » ; le procédé peut donc être répété de multiples fois sur un même échantillon. Ainsi, un objet de l'invention est constitué par un procédé de détermination de la résistance cellulaire aux médicaments, comportant les 2 0 étapes consistant à : a) mettre des cellules, et un milieu extracellulaire les entourant, en contact avec du 129Xe hyperpolarisé ; b) mesurer, par résonance magnétique nucléaire, une vitesse d'échange du 129Xe hyperpolarisé de l'intérieur desdites cellules 25 vers ledit milieu extracellulaire ; et c) déterminer, à partir de ladite vitesse d'échange, si lesdites cellules présentent une résistance aux médicaments. Selon différents modes de réalisation particuliers de l'invention : 30 - Le procédé peut être mis en oeuvre in vitro, lesdites cellules étant en suspension dans ledit milieu extracellulaire. - En variante, le procédé peut être mis en oeuvre in vivo, et comporter l'introduction du 129Xe hyperpolarisé dans un organisme vivant par une technique de préférence non chirurgicale telle que l'inhalation ou l'injection intraveineuse ou sous-cutanée d'une solution biocompatible dans laquelle le 129Xe hyperpolarisé est dissout. Une technique d'intervention sur le corps humain ou animal est considérée comme « non chirurgicale » lorsque, tout en pouvant éventuellement comprendre une étape intrusive, elle n'implique pas d'intervention physique substantielle nécessitant une expertise médicale professionnelle et comportant un risque substantiel pour la santé. - Dans le cas d'une mise en oeuvre in vivo, ladite étape b) peut être mise en oeuvre par une technique d'imagerie spectroscopique par résonance magnétique nucléaire. - Ladite étape c) peut comprendre également une mesure de la concentration de 129Xe à l'intérieur desdites cellules et la prise en 15 compte du résultat de cette mesure pour déterminer si elles présentent une résistance aux médicaments. - Ladite étape b) peut comprendre la génération d'une séquence d'impulsions radiofréquence (à la fréquence de Larmor) pour l'étude de phénomènes d'échange lent, ladite séquence agissant de manière 20 différenciée sur les spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules et dans ledit milieu extracellulaire. On parle d'« échange lent » lorsque la vitesse d'échange mesurée est inférieure à la différence des fréquences de résonance des spins nucléaires entre les deux environnements parmi lesquels se produit l'échange. 25 - Plus particulièrement, ladite étape b) comprend une excitation sélective des spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules ou dans ledit milieu extracellulaire, ainsi que l'acquisition d'un signal d'induction libre émis par lesdits spins. - Plus particulièrement encore, ladite étape b) peut mettre 30 en oeuvre une séquence du type inversion-récupération comprenant : b1) la génération d'une impulsion radiofréquence sélective pour inverser les spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules ou dans ledit milieu extracellulaire ; b2) après un intervalle de durée A (typiquement comprise entre 1 et 500 ms), la génération d'une impulsion radiofréquence de lecture provoquant un basculement d'au moins les spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules, et l'acquisition d'un signal d'induction libre émis par lesdits spins ; b3) la répétition des étapes b1) et b2) pour une pluralité de valeurs de A ; et b4) la détermination d'une vitesse d'échange du 129Xe hyperpolarisé de l'intérieur desdites cellules vers ledit milieu extracellulaire à partir des signaux d'induction libre émis pour différentes valeurs de A. - Ladite étape b2) peut notamment comprendre la génération d'une impulsion radiofréquence de lecture provoquant un basculement de 90° desdits spins nucléaires. - Ladite étape b4) peut comprendre en particulier : b4i) la détermination d'un spectre de résonance magnétique nucléaire du 129Xe hyperpolarisé pour chaque valeur de A ; b4ii) l'identification dans chaque dit spectre d'un pic correspondant à la contribution du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules ; et b4iii) la détermination d'une constante de temps exprimant la variation de l'aire dudit pic en fonction de A. - Lesdites cellules peuvent notamment être des cellules tumorales et ladite étape c) consister à déterminer, à partir de ladite vitesse d'échange, si lesdites cellules tumorales présentent une résistance à la chimiothérapie. 2 98885 7 6 D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple, dans lesquels : - La figure 1 illustre de manière générale la mise en oeuvre 5 d'un procédé in vitro selon un mode de réalisation de l'invention ; - La figure 2 représente un dispositif permettant l'introduction du 129Xe hyperpolarisé dans une suspension de cellules pour la mise en oeuvre du procédé de la figure 1 ; - La figure 3 montre un spectre RMN montrant deux pics 10 correspondant, respectivement, au 129Xe intra- et extracellulaire ; - La figure 4 montre une séquence d'impulsions radiofréquence de type inversion-recouvrement, pouvant être utilisée dans un procédé selon l'invention ; - La figure 5 illustre l'évolution des spectres RMN, acquis à 15 l'aide de la séquence de la figure 4, pour des délais A croissants ; et - Les figures 6A et 6B montrent comment le calcul de la vitesse d'échange du 129Xe permet la discrimination entre les cellules sensibles et résistantes aux médicaments, et plus particulièrement à la chimiothérapie. 20 Comme illustré sur la figure 1, un procédé selon un mode de réalisation de l'invention se déroule en plusieurs étapes : 1) Préparation et stockage du 129Xe hyperpolarisé. Cette étape est conventionnelle ; voir par exemple les documents US 6,125,654 et US 5,809,801. 25 D'une manière générale, il existe essentiellement deux méthodes d'hyperpolarisation du 129Xe : le pompage optique et la polarisation nucléaire dynamique. En ce qui concerne la mise en oeuvre du procédé considéré ici, compte tenu du fait que le Xénon est soluble à environ 5 mM/bar dans l'eau à 20°C, 1 minute de pompage optique suffit pour polariser une quantité de Xénon en large excès par rapport au nombre de cellules pouvant être maintenues en suspension dans un tube RMN (entre 10 et 150 millions). 2) Préparation des suspensions cellulaires. Une preuve de concept du procédé de l'invention a été réalisée en utilisant deux lignées de cellules LR73 : une lignée sensible à la chimiothérapie (LR73-S) et une lignée résistante (LR73-R), qui a été obtenue par transfection de la lignée mère (sensible) avec le gène MDR1 exprimant la p-glycoprotéine. Les cellules adhérentes ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640 glutamax (Roswell Park Memorial Institute) complété avec 10% de sérum de veau foetal désactivé par la chaleur, et 100U de pénicilline/streptomycine. Avant l'expérience, elles ont été rincées avec du tampon phosphate (PBS) et incubées avec de la trypsine (5 minutes à 37°C). La réaction de trypsination a été arrêtée par ajout de milieu. Les cellules ont ensuite été rincées trois fois dans du PBS par centrifugations successives (1500 tours par minute, 10 minutes). Les cellules ont enfin été reprises dans un volume de 500pL de PBS deutéré et 30 pL de D20. La suspension cellulaire à étudier, contenant entre 10 et 150 millions de cellules, a été placée dans un tube RMN vissé, puis dégazée par bullage à l'hélium suivi d'une détente statique. 3) Introduction du xénon hyperpolarisé. Le 129Xe est introduit dans le tube RMN au moyen d'une ligne à vide à travers une valve de J. Young, et accumulé par condensation au moyen d'un piège à azote liquide permettant de réaliser cette condensation dans la partie haute du tube sans congeler les cellules. Cela est illustré sur la figure 2, où la référence T indique le tube, SC la suspension de cellules, N2L l'azote liquide, contenu dans un rotor RMN creux R pour former un point froid, XeC le Xénon hyperpolarisé condensé en correspondance dudit point froid et W la valve de J. Young. L'introduction se fait de préférence sous champ magnétique de l'ordre de quelques 10.2 Tesla, de manière à préserver l'orientation des spins nucléaires du 129Xe. A la fin de l'étape de stockage, le Xénon condensé 3 0 commence à sublimer ; ainsi on le retrouve à l'état gazeux dans la partie supérieure du tube et à l'état de soluté à l'intérieur de la suspension de cellules. Il est opportun de secouer le tube afin de faciliter la solubilisation du Xénon. Les atomes de Xénon qui passent en solution peuvent rester dans la solution tampon (milieu extracellulaire) ou bien pénétrer à l'intérieur 5 des cellules. Comme le montre la figure 3, ces deux milieux induisent un déplacement chimique différent du 129Xe, ce qui conduit à l'apparition de deux pics distincts dans les spectres RMN, correspondant respectivement aux spins intra- (P1) et extracellulaires (P2). Les cellules ne correspondent qu'à une petite fraction de la suspension ; par conséquent, la plupart des atomes 10 de Xénon se trouve dans le milieu extracellulaire, ce qui explique la différence d'intensité entre les deux pics. 4) Détermination de la vitesse d'échange du hyperpolarisé par RMN. Le tube contenant la suspension cellulaire à étudier et le 129Xe 15 hyperpolarisé est ensuite introduit dans un spectromètre RMN pour réaliser une expérience de détermination de la vitesse d'échange du Xénon entre les milieux intra- et extracellulaire. Plus particulièrement, il s'agit de déterminer la vitesse d'échange de l'intérieur des cellules vers le milieu extracellulaire (Km), car c'est ce paramètre qui est le plus directement lié au phénomène de la 2 0 résistance à la chimiothérapie. La vitesse d'échange du milieu extracellulaire vers l'intérieur des cellules (kin) peut également présenter un intérêt à titre complémentaire. La vitesse d'échange kout peut notamment être déterminée à l'aide de la séquence illustrée sur la figure 4, de type inversion-récupération, 25 qui est particulièrement avantageuse en raison de sa simplicité. De manière conventionnelle, l'échantillon est maintenu dans un champ magnétique stationnaire, aligné avec la direction d'aimantation des noyaux de129Xe hyperpolarisé. Premièrement, on soumet l'échantillon à une impulsion radiofréquence sélective à 180°, RF1s, de manière à provoquer 30 l'inversion des spins nucléaires des seuls atomes de Xénon qui se trouvent à l'intérieur des cellules (ou des seules atomes de Xénon qui se trouvent dans le milieu extracellulaire, les deux choix étant sensiblement équivalents). Puis, 129Xe après un intervalle de durée A, on soumet ce même échantillon à une impulsion radiofréquence de lecture non sélective RFLNS - par exemple, une impulsion à 90°, provoquant le basculement des spins nucléaires de tous les atomes de Xénon (intra- et extracellulaires) dans le plan transversal au champ magnétique statique. La précession des spins nucléaires engendre un signal d'induction FID, dont la transformée de Fourier fournit le spectre RMN. La figure 5 montre 4 spectres correspondant à des valeurs différentes de A : 2 ms, 7 ms, 12 ms et 42 ms, obtenus pour des cellules résistantes (LR73-R). Sur le premier spectre, correspondant à A = 2 ms, on peut distinguer les deux pics P1 et P2 (P2, beaucoup plus intense, est tronqué). Le pic P1 apparait inversé, ce qui traduit l'inversion des spins nucléaires du Xénon intracellulaire par l'impulsion RF1s. Au fur et à mesure que le délai A augmente, le pic P1 décroît en valeur absolue, puis devient positif et commence à croître, tendant de manière asymptotique à une intensité maximale. Trois phénomènes contribuent à cette évolution : la relaxation longitudinale des spins, l'entrée dans les cellules d'atomes de Xénon qui se trouvaient initialement dans le milieu extracellulaire et la sortie du Xénon intracellulaire. On considère l'équilibre : avec A D'un point de vue quantitatif, on obtient à partir des équations de Bloch : où : - Ma est l'aimantation longitudinale (parallèle au champ magnétique stationnaire) du Xénon intracellulaire, dont la valeur au temps t 5 est proportionnelle à l'aire du pic P1 pour A=t ; - Ma' est la valeur de Ma° à l'équilibre de Boltzmann, c'est-à-dire en l'absence d'hyperpolarisation ; elle est très faible (plusieurs ordres de grandeur) par rapport aux valeurs que Ma prend au cours de la mesure ; - Ma° est la valeur de Ma au temps t=0, après introduction 10 du Xénon hyperpolarisé mais avant l'envoi de la première impulsion radiofréquence ; - Mb est l'aimantation longitudinale (parallèle au champ magnétique stationnaire) du Xénon extracellulaire, dont la valeur au temps t est proportionnelle à l'aire du pic P2 pour A=t ; 15 - Mbc° est la valeur de Mb° à l'équilibre de Boltzmann, c'est- à-dire en l'absence d'hyperpolarisation ; elle est très faible (plusieurs ordres de grandeur) par rapport par rapport aux valeurs que Mb prend cours de la mesure ; - Mb° est la valeur de Mb au temps t=0, après introduction 20 du Xénon hyperpolarisé mais avant l'envoi de la première impulsion radiofréquence ; - R1=1/T1 est le taux de relaxation longitudinale qui, dans un souci de simplicité, est considéré être le même pour le Xénon intra- et extracellulaire ; 25 - kil, est la vitesse d'échange du Xénon du milieu extracellulaire vers l'intérieur des cellules, c'est-à-dire la vitesse d'entrée du Xénon ; - kout est la vitesse d'échange du Xénon de l'intérieur des cellules vers le milieu extracellulaire, c'est-à-dire la vitesse de sortie du Xénon. La solution générale de ces équations différentielles est une 5 combinaison linéaire de deux exponentielles e-21t et e-22t dont les constantes de vitesse ?çi et 9L,2 sont respectivement R1 et Ri+kin-Fkout. A titre d'exemple, considérant le cas particulier de l'inversion sélective du pic de Xénon intracellulaire P1, et dans les conditions où R1« (kin+kout) - car les phénomènes d'échange, gouvernés par kin et kout, sont 10 beaucoup plus rapides que la relaxation des spins nucléaires gouvernées par R1 - on peut montrer que l'évolution de l'intégrale de ce pic au cours du temps permet d'extraire kin + kout La mesure du rapport des intégrales des pics (facteur K ci- 15 dessus, mesuré dans une acquisition simple préalable par exemple) permet de séparer kin et kout. En fait, dans des conditions expérimentales ordinaires on a kout>>kin (K= kin/kout10-3) car les cellules n'occupent qu'une petite fraction du volume de l'échantillon. Par conséquent, on peut simplement poser kin + kout kout. 2 0 Il convient de noter que l'impulsion de lecture à 90° conduit à la perte de l'hyperpolarisation du Xénon contenu dans la suspension. Toutefois, les bobines d'excitation ne couvrant pas la totalité du tube, l'impulsion radiofréquence n'affecte pas l'hyperpolarisation du gaz qui se trouve dans la partie supérieure du tube. Il suffit donc de secouer 25 vigoureusement le tube après chaque acquisition pour « recharger » la solution en 129Xe hyperpolarisé. Bien entendu, au cours du temps l'hyperpolarisation tend à se perdre même dans la phase gazeuse ; l'acquisition d'un spectre à petit angle de basculement permet de quantifier cet effet et de le compenser par une normalisation des spectres. 5) Détermination de la résistance ou sensibilité à la chimiothérapie des cellules. Les présents inventeurs ont découvert que la vitesse de sortie du Xénon kout est très différente dans des cellules tumorales sensibles à 5 la chimiothérapie et dans des cellules semblables mais résistantes. A titre d'exemple, pour les cellules sensibles LR73-S on a mesuré kouti-k,e,,knufk, 20 s-1, tandis que pour les cellules résistantes LR3-R on a trouvé kout+k,,,kkont 70 s-1, c'est-à-dire une valeur plus de trois fois plus élevée. Cela est illustré par les figures 6A et 6B, montrant l'évolution de Inorm (aire 10 normalisée du pic P1) en fonction de A. Sur ces figures, les points correspondent aux données expérimentales et les lignes continues à un ajustement exponentiel qui permet d'obtenir kout. La détermination de la sensibilité ou résistance des cellules peut se faire de plusieurs façons différentes. La possibilité la plus simple 15 consiste à déterminer, de manière empirique, deux seuils kthL et kthH avec ktnt ktni-, alors les cellules sont considérées résistantes, tandis qu'une valeur de kout comprise entre kthL et kthH correspond à un résultat indéterminé (cette possibilité étant exclue dans le cas particulier kthL=kthH). 2 0 Dans l'exemple considéré ici, on peut poser par exemple kthL= 30 s-1 et kthH= 50 s-1. D'autres approches plus sophistiquées sont également envisageables. En particulier, il est possible de se baser sur un algorithme de classification binaire recevant en entrée plusieurs paramètres en plus que kout, 25 par exemple k,n, la valeur absolue de l'aire du pic P1 (les figures 6A et 6B montrent en effet que cette aire, exprimée par la valeur asymptotique de Inorm, est sensiblement moindre pour les cellules résistantes que pour les cellules sensibles), le déplacement chimique de ce pic et/ou du pic P2, les temps de relaxation T1 et T2, etc. 30 En tout état de cause, les valeurs de kin et kout dépendent du nombre et de la concentration des cellules dans l'échantillon. Ces paramètres 2 98885 7 13 doivent donc être connus (ce qui est possible au moyen de techniques conventionnelles) sauf si on se satisfait d'une mesure relative de kout, auquel cas il suffit de connaitre le rapport entre les concentrations cellulaires des différents échantillons que l'on compare. L'invention a été décrite en référence à un mode de réalisation particulier, relatif à une application in vitro, mais elle n'est pas limitée à ce mode de réalisation. Comme expliqué plus haut, elle peut également s'appliquer in vivo. Par ailleurs, la séquence d'impulsions de la figure 4 n'est pas la seule à pouvoir convenir à la mise en oeuvre de l'invention. Par exemple, l'impulsion de lecture peut être, elle aussi, sélective. Cette variante présente l'avantage de préserver l'hyperpolarisation du Xénon contenu dans le milieu extracellulaire, et donc de faciliter la répétition des acquisitions. De manière plus générale, plusieurs techniques RMN ont été développées pour étudier les phénomènes d'échange (principalement impliquant des atomes d'hydrogène). A ce propos, on peut se rapporter aux publications suivantes : - A. D. Bain « Chemical exchange in NMR », Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 43 (2003) 63 - 103 ; et - A. D. Bain, J. A. Cramer « Optimal NMR Measurements 20 for Slow Exchange in Two-Site and Three-Site Systems », J. Phys. Chem. 1993, 97, 2884-2887. Parmi toutes ces techniques, conviennent à la mise en oeuvre de l'invention celles qui : - permettent l'étude de phénomènes d'échange lent ; et 25 - agissent de manière différenciée sur des spins nucléaires qui se trouvent dans un environnement chimique différent. En ce qui concerne la première condition, comme cela a été, exposé plus haut, est considéré « lent » tout phénomène d'échange caractérisé par une vitesse (mesurée en s-1) inférieure-à la différence entre les 30 fréquences de résonance des spins nucléaires dans les deux environnements parmi lesquels se produit l'échange. Il s'agit notamment des techniques 2 98885 7 14 d'inversion-récupération (cf. la figure 4), saturation-récupération, « HYPERCEST » et d'utilisation d'un champ dit de « spin-lock ». Pour la technique HYPERCEST on peut se rapporter à la publication de L. Schrôder et al. « Temperature-controlled molecular 5 depolarization gates in nuclear magnetic resonance » Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008; 47: 4316-4320. Pour la technique de « spin-lock » on peut se rapporter à la publication de H. Desvaux et al. « Off-resonance ROESY for the study of dynamics processes » Journal of Magnetic Resonance, Series A 1994; 10 108:219-229. La deuxième condition peut être satisfaite, en particulier : - en utilisant une ou plusieurs impulsions sélectives en fréquence, comme dans l'exemple considéré ci-dessus ; ou - en ayant recours à une technique de RMN bidimensionnelle, 15 telle que la séquence EXSY (J. Jeener,et al. « Investigation of exchange processes by two-dimensional NMR spectroscopy » J Chem Phys 1979;71:4546-4553) où une forme de sélectivité est obtenue en utilisant une pluralité d'impulsions radiofréquences non sélectives séparées par un délai variable. L'article de L. Frydman et al. « The acquisition of multidimensional NMR spectra whithin a single scan », PNAS 99, No. 25, 15858 - 15862 (2002) décrit une technique permettant de mettre en oeuvre des techniques de spectroscopie RMN bidimensionnelle en une seule acquisition. Le principe de cette technique consiste à découper le tube RMN en tranches au moyen d'un gradient de champ, comme en imagerie, ce qui est possible dès lors que la sensibilité est suffisamment élevée (ce qui est le cas ici, grâce à l'utilisation du 129Xe hyperpolarisé). Sur chaque tranche, on peut effectuer une mesure d'inversion sélective - récupération du type de la figure 4, avec une valeur A différente. Ainsi, la détermination de kout peut se faire dans le temps requis pour une seule acquisition. REVENDICATIONS1. Procédé de détermination de la résistance cellulaire aux médicaments, comportant les étapes consistant à : a) mettre des cellules, et un milieu extracellulaire les entourant, en contact avec du 129Xe hyperpolarisé ; b) mesurer, par résonance magnétique nucléaire, une vitesse d'échange du 129Xe hyperpolarisé de l'intérieur desdites cellules vers ledit milieu extracellulaire ; et c) déterminer, à partir de ladite vitesse d'échange, si lesdites cellules présentent une résistance aux médicaments. 2. Procédé selon la revendication 1, mis en oeuvre in vitro, dans lequel lesdites cellules sont en suspension dans ledit milieu 15 extracellulaire. 3. Procédé selon la revendication 1, mis en oeuvre in vivo, comportant l'introduction du 129Xe hyperpolarisé dans un organisme vivant par une technique non chirurgicale telle que l'inhalation ou l'injection intraveineuse 20 ou sous-cutanée d'une solution biocompatible dans laquelle le 129Xe hyperpolarisé est dissout. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ladite étape b) est mise en oeuvre par une technique d'imagerie spectroscopique par 25 résonance magnétique nucléaire. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite étape c) comprend également une mesure de la concentration de 129Xe à l'intérieur desdites cellules et la prise en compte du résultat de cette 30 mesure pour déterminer si elles présentent une résistance aux médicaments. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite étape b) comprend la génération d'une séquence d'impulsions radiofréquence pour l'étude de phénomènes d'échange lent, ladite séquence agissant de manière différenciée sur les spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules et dans ledit milieu extracellulaire. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite étape b) comprend une excitation sélective des spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules ou dans ledit milieu extracellulaire, ainsi que l'acquisition d'un signal d'induction libre émis par lesdits spins. 8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel ladite étape 15 b) met en oeuvre une séquence du type inversion-récupération comprenant : bl) la génération d'une impulsion radiofréquence sélective (RFIs) pour inverser les spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules ou dans ledit milieu extracellulaire ; 20 b2) après un intervalle de durée A, la génération d'une impulsion radiofréquence de lecture (RFLNS) provoquant un basculement d'au moins les spins nucléaires du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules, et l'acquisition d'un signal d'induction libre émis par lesdits spins ; 25 b3) la répétition des étapes bl) et b2) pour une pluralité de valeurs de A ; et b4) la détermination d'une vitesse d'échange du 129Xe hyperpolarisé de l'intérieur desdites cellules vers ledit milieu extracellulaire à partir des signaux d'induction libre (FID) émis pour 30 différents valeurs de A. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel chaque répétition de ladite étape b2) comprend la génération d'une impulsion radiofréquence de lecture provoquant un basculement de 90° desdits spins nucléaires. 10. Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9 dans lequel ladite étape b4) comprend : b4i)la détermination d'un spectre de résonance magnétique nucléaire du 129Xe hyperpolarisé pour chaque valeur de A ; b4ii) l'identification dans chaque dit spectre d'un pic (P1) correspondant à la contribution du 129Xe hyperpolarisé contenu dans lesdites cellules ; et b4iii) la détermination d'une constante de temps exprimant la variation de l'aire dudit pic en fonction de A. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel lesdites cellules sont des cellules tumorales, et dans lequel ladite étape c) consiste à déterminer, à partir de ladite vitesse d'échange, si lesdites cellules tumorales présentent une résistance à la chimiothérapie.20