Brevet FR2985667A1 — publié le 20130719

Composition verrou aqueuse comprenant de l'éthanol et un anticoagulant polysaccharidique L'invention concerne une composition verrou aqueuse comprenant un composé choisi parmi les anticoagulants polysaccharidiques et de l'éthanol. L'invention concerne plus particulièrement une composition verrou aqueuse présentant des propriétés antiseptiques et antimicrobiennes et destinée à être utilisée dans tout dispositif intra-vasculaire, notamment dans des cathéters, implanté chez un patient. L'invention concerne également une méthode pour verrouiller un dispositif intra-vasculaire implanté chez un patient comprenant l'introduction dans le dispositif de ladite composition verrou aqueuse. Chaque année, des millions de cathéters veineux centraux sont implantés pour administrer des traitements intraveineux notamment des chimiothérapies anti-infectieuses, anticancéreuses ou immunomodulatrices, de l'alimentation parentérale ou encore des produits sanguins labiles. Ces cathéters veineux centraux peuvent être également utilisés pour la surveillance hémodynamique des patients et pour la délivrance de l'hémodialyse. La septicémie associée au cathéter représente la première complication par ordre de fréquence. Les dysfonctions de cathéters, principalement en rapport avec une thrombose de ces cathéters, sont relativement fréquentes, provoquant leur infection et nécessitant ainsi leur remplacement. Pour prévenir les thromboses de cathéters lorsque les cathéters sont inemployés mais laissés en place chez le patient, il est classique d'instiller dans la lumière du cathéter un anticoagulant. Il s'agit le plus souvent d'une solution à base d'héparine, de fibrinolytique ou de citrate. Cette stratégie est communément utilisée en hémodialyse. Malgré l'amélioration des précautions d'asepsie lors de la pose et de la réfection des pansements, l'éducation et la formation des personnels médicaux et soignants, les taux d'infections de cathéters veineux centraux demeurent élevés. Parmi les stratégies complémentaires de prévention et de traitement des infections de cathéters, l'utilisation de compositions verrou anti-infectieuses est de plus en plus répandue. La stratégie du verrou anti-infectieux consiste à instiller dans la lumière du cathéter et à laisser en place pendant une durée variable une composition antimicrobienne. Il a été démontré l'efficacité de compositions verrou à base d'antibiotiques combinées ou non à l'héparine pour prévenir ou traiter les infections associées au cathéter chez les patients dialysés et chez les patients cancéreux (Vercaigne et al. , Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2002); 49, 693- 696). Toutefois l'utilisation des antibiotiques expose à un risque d'émergence de résistance. L'éthanol est un antiseptique, puissant bactéricide sur le biofilm constitué. Il est connu que l'activité antiseptique de l'éthanol dépend de sa concentration et du temps d'exposition. Il a été décrit une composition verrou pour cathéter comprenant une solution d'éthanol à 60% et une héparine avec une teneur de 500 Ul/mL et présentant des propriétés antimicrobiennes (Ackoundou-N'guessan et al., Nephrol Dial Transplant (2006); 21, 3339-33402006). Cependant, ce document ne fournit aucune indication quant à la stabilité de la solution. De plus, il n'a été décrit aucune activité anti coagulante. En effet, il est bien connu que l'éthanol concentré est utilisé en chimie analytique pour extraire par précipitation certains composés et notamment les mucopolysaccharides dont l'héparine. Il est également communément admis que cette précipitation annule les propriétés anti coagulantes de l'héparine. Ainsi, il n'existe pas aujourd'hui de compositions verrou stables, combinant des propriétés antibiofilm, anticoagulantes et détergentes, mais n'induisant pas de résistance microbienne, de dégradation des cathéters et de toxicité liée à la diffusion systémique de la composition. Ainsi un premier objectif de l'invention est de proposer une composition verrou qui apporte une solution à tout ou partie des problèmes des compositions de l'état de la technique. Un autre objectif de l'invention est de proposer une méthode pour réduire voir supprimer les risques d'infections microbiennes et de coagulation dans un dispositif intra-vasculaire, notamment un cathéter, implanté chez un patient. La présente invention a pour objet une composition verrou aqueuse comprenant : - de 10 à 6000 Ul/mL d'au moins un composé (a) choisi parmi les anticoagulants polysaccharidiques, et - de 20 à 55% v/v d'éthanol. Par anticoagulant polysaccharidique, on entend tout agent ayant une structure polysaccharidique et capable de retarder, voire d'empêcher la coagulation du sang. Par teneur en anticoagulant polysaccharidique exprimée en Ul/mL, on entend la teneur en anticoagulant polysaccharidique exprimée en Unité Internationale par mL de composition aqueuse. Par teneur en volume d'éthanol, on entend la teneur d'éthanol exprimée en mL pour 100 mL de composition aqueuse. Selon l'invention, la composition comprend de 25 à 55% v/v, de préférence de 25 à 50% v/v d'éthanol. Selon l'invention, le composé (a) peut être choisi parmi les héparines de bas poids moléculaire. Par héparine de bas poids moléculaire, on entend toute héparine ayant une 5 masse moléculaire moyenne inférieure ou égale à 12000 Daltons, de préférence allant de 3000 à 12000 Daltons, avantageusement allant de 3000 à 8000 Daltons. Selon l'invention, le composé (a) peut être choisi parmi l'énoxaparine, la 10 tinzaparine, la nadroparine et la daltéparine et leurs dérivés. De manière avantageuse, le composé (a) est choisi parmi un sel d'énoxaparine, un sel de tinzaparine, un sel de nadroparine et un sel de daltéparine. 15 Par sel, on peut citer notamment les sels calciques ou sodiques. Dans un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend : - de 10 à 4700 Ul/mL, de préférence de 10 à 600 Ul/mL, d'un sel de 20 nadroparine, et - de 25 à 45% v/v d'éthanol. De manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend 450 Ul/mL d'un sel de nadroparine et 40% v/v d'éthanol. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la composition comprend : - de 10 à 3200 Ul/mL, de préférence de 10 à 700 Ul/mL, d'un sel de tinzaparine, et - de 25 à 40% v/v d'éthanol. De manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend 100 Ul/mL d'un sel de tinzaparine et 40% v/v d'éthanol. 25 30 Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la composition comprend : - de 10 à 1900 Ul/mL, de préférence de 10 à 1500 Ul/mL, d'un sel de daltéparine, et - de 25 à 50% v/v d'éthanol. De manière avantageuse, la composition comprend 200 Ul/mL d'un sel de daltéparine et 40% v/v d'éthanol. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la composition comprend : - de 10 à 4600 Ul/mL d'un sel d'énoxaparine, et - de 25 à 50% v/v d'éthanol. De manière avantageuse, la composition comprend 500 Ul/mL d'un sel d'énoxaparine et 40% v/v d'éthanol. De manière également avantageuse, la composition comprend 400 Ul/mL d'un sel d'énoxaparine et 40% v/v d'éthanol. De manière également avantageuse, la composition comprend 200 Ul/mL d'un sel d'énoxaparine et 45% v/v d'éthanol. Selon l'invention, le composé (a) peut être choisi parmi les héparinoïdes. De manière avantageuse, le compose (a) est le danaparoïde. Dans un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend : - de 25 à 2100 Ul/mL de danaparoïde, et - de 25 à 45% v/v d'éthanol. De manière avantageuse, la composition comprend 225 Ul/mL de 30 danaparoïde et 40% v/v d'éthanol. Selon l'invention, le composé (a) peut être choisi parmi les anticoagulants pentasaccharidiques. De manière avantageuse, le composé (a) est le fondaparinux. Dans un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend : - de 20 à 700 Ul/mL de fondaparinux, et 5 - de 25 à 45% v/v d'éthanol. De manière avantageuse, la composition comprend 235 Ul/mL de fondaparinux et 40 % v/v d'éthanol. 10 Selon l'invention, la composition peut également comprendre un composé choisi parmi les sels différents du composé (a) ou les agents dispersants. Selon l'invention, le sel peut être choisi parmi les sels de sodium, comme le chlorure de sodium, le gluconate de sodium ou le bicarbonate de sodium, les 15 sels de magnésium comme le chlorure de magnésium, les sels de calcium comme le chlorure de calcium, le sulfate de calcium ou le gluconate de calcium et les sels de potassium comme le chlorure de potassium ou le gluconate de potassium. 20 De manière avantageuse, le sel est le chlorure de sodium. Selon l'invention, le dispersant est un dispersant un dispersant stable en présence d'éthanol et biocompatible avec les matériaux invasifs constitutifs des dispositifs intra-vasculaires, notamment des cathéters et peut être une 25 enzyme. De manière avantageuse, le dispersant est la Dispersin B ou une amylase ou une nucléase 30 Selon l'invention, la composition peut être utilisée pour le verrouillage de dispositifs intra-vasculaires. Par dispositif intra-vasculaire, on entend notamment les cathéters intravasculaires ou les chambres à cathéter implantable. De manière avantageuse, la composition selon l'invention est utilisée pour le verrouillage des cathéters intravasculaires. Selon l'invention, le dispositif intra-vasculaire est implanté et laissé en place chez le patient, sans être utilisé pendant un délai pouvant aller de 1 jour à 5 ans. L'invention a également pour objet un kit de préparation d'une composition verrou aqueuse selon l'invention, comprenant : - une solution aqueuse (b) comprenant de 10 à 6000 Ul/mL d'un composé (a) choisi parmi les anticoagulants polysaccharidiques, en particulier les héparinoïdes ou les héparines, notamment les héparines de bas poids moléculaire, et - une solution aqueuse comprenant de 20 à 55% v/v d'éthanol (c). Les différentes caractéristiques ou préférences de la composition selon l'invention présentées pour le composé (a) s'appliquent également au kit selon l'invention. Selon l'invention, les solutions (b) et (c) sont mélangées extemporanément. Selon l'invention, le mélange extemporané des solutions (b) et (c) est effectué peu de temps avant ou au moment de son introduction dans le dispositif intra25 vasculaire. De manière avantageuse, le mélange extemporané des solutions (b) et (c) est effectué au lit du patient. 30 Ce mode de réalisation permet d'optimiser le contrôle de la stabilité dans le temps de la composition, en réduisant au maximum le temps de contact entre le composé (a) et l'éthanol, et ainsi de minimiser les risques de précipitation. Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour verrouiller un dispositif intra-vasculaire, notamment un cathéter, implanté chez un patient comprenant l'introduction dans le dispositif d'une composition verrou selon l'invention. Selon l'invention, la composition est introduite dans le dispositif intravasculaire dans un volume allant de 0,2 à 5 mL, de préférence de 0,5 à 2,5 mL. Selon l'invention, la composition peut être maintenue dans le dispositif intra- vasculaire durant un temps correspondant à la période s'écoulant entre chaque nouvelle administration d'un produit, médicament ou traitement au patient. Selon l'invention, la composition peut être introduite dans le dispositif intra- vasculaire simultanément à chaque nouvelle administration d'un produit, médicament ou traitement au patient puis maintenue dans le dispositif pendant une durée allant de 1 minute à 3 mois, de préférence de 30 minutes à 3 semaines. Un autre objet de l'invention concerne un dispositif pour introduire une composition verrou aqueuse dans un dispositif intra-vasculaire, notamment un cathéter, le dispositif comprenant : - une seringue, - une composition verrou aqueuse selon l'invention. De manière avantageuse, la seringue est stérilisée. Un autre objet de l'invention concerne une méthode de prétraitement d'un 30 dispositif intra-vasculaire, notamment d'un cathéter, comprenant l'imprégnation du dispositif au moyen d'une composition verrou selon l'invention. Dans un mode de réalisation, le dispositif est trempé dans la composition verrou selon l'invention. Le dispositif ainsi traité possède alors des propriétés antimicrobiennes et anticoagulantes améliorées. La présente invention et ses différents modes de réalisation seront mieux compris à la lecture des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre indicatif, sans caractère limitatif. Exemple 1 : étude de la stabilité de compositions verrou aqueuses selon 10 l'invention pour cathéters d'hémodialyse comprenant différentes concentrations en éthanol. Préparation des échantillons : 15 Divers mélanges éthanol/énoxaparine sodique ont été préparés dans des tubes à hémolyse en verre de 5mL associant soit : a) une concentration fixe en énoxaparine sodique à 400 UI /mL (correspondant à la dose utilisée en verrou anti-thrombotique préventif) dans une gamme de concentrations croissantes en éthanol (30, 40, 45, 50, 60 et 70 20 % en volume (v/v)), les dilutions de l'éthanol ayant été réalisées dans du sérum physiologique (NaCI à 0,9 g/100mL). b) des concentrations croissantes d'énoxaparine sodique (50, 100, 400, 500 et 1000 Ul/mL) dans une solution éthanolique de concentration fixe (40, 45 ou 50 %, v/v). 25 Observations visuelles : L'observation visuelle des différents mélanges éthanol/énoxaparine a été réalisée par une appréciation de la présence (ou non) d'une précipitation lors 30 de la mise en contact des deux solutions ; les phénomènes observés correspondant, soit à l'absence (niveau 0 noté -), soit à la présence d'une précipitation. L'importance de la précipitation a été appréciée, soit par l'apparition d'un trouble, soit par la formation d'un dépôt sous forme de gouttelettes et les niveaux ont été évalués par des scores : +, ++, +++. Concernant l'appréciation de la formation d'un dépôt, un premier niveau correspondant à la formation d'un film a été ajouté et les scores +, ++, +++ n'ont été utilisés pour la formation des gouttelettes. L'observation a été suivie dans le temps, soit après 1 minute, 1 heure, 24 heures, 48 heures et 72 heures de contact et ce, à deux températures, 20°C et 37 °C. Dosage de l'éthanol : La stabilité de l'éthanol a été contrôlée par un dosage selon la méthode de Nicloux (Traité d'oenologie sciences et techniques du vin, tome 1. RibéreauGayon et al, Bordas éditeur, Paris 1976), par oxydation de l'éthanol à l'aide d'un excès connu de bichromate de potassium, suivie d'un dosage retour du bichromate par une solution de sulfate ferreux en présence d'orthophénantroline ferreuse. Le dosage a été effectué parallèlement à un témoin et, afin de s'affranchir des 20 erreurs dues à une éventuelle oxydation de l'héparine, une distillation préalable a été réalisée afin de doser sélectivement l'éthanol. Dosage de l'énoxaparine 25 Le dosage de l'énoxaparine a été réalisé par une méthode de couplage CLHP-DEDL. Afin de se situer dans la zone de linéarité de la réponse du détecteur, les échantillons ont été dilués au dixième dans du sérum physiologique. L'analyse a été réalisée dans les mélanges associant de l'énoxaparine sodique 400U1/mL à des concentrations croissantes en éthanol 30 (30% à 70% (V/V)), comparativement à une gamme d'étalonnage de la composition d énoxaparine (commercialisée sous le nom Lovenox (D) préparée dans du sérum physiologique aux concentrations suivantes : 6UI, 12UI, 40UI, 80UI, 120U1/mL. Pour les échantillons présentant un trouble, une centrifugation préalable à 1600g pendant 5 minutes a été réalisée et seul le surnageant a ensuite été analysé. Les conditions opératoires de la séparation chromatographique ont été les suivantes : - Colonne analytique de 150mm de longueur et de 4,6mm de diamètre, remplie de phase stationnaire C18 5pm. - Séparation des constituants en mode isocratique à l'aide d'un mélange méthanol/eau, 50/50 (V/V) avec un débit de 0,3mL/min. - Détection à l'aide d'un détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL) : température d'évaporation de 40°C, gain du détecteur = 3 et pression d'azote (gaz de nébulisation) = 3,5 bar. Résultats : Observations visuelles : Les phénomènes observés lors de la mise en présence d'une composition d'énoxaparine sodique 400U1/mL et de concentrations croissantes en éthanol sont les suivants : - Pour des concentrations en éthanol inférieures ou égales à 40% v/v, le mélange reste limpide et incolore jusqu'à 72h, à 20°C comme à 37°C, - Pour les teneurs en éthanol plus importantes (60 et 70% v/v), le trouble 25 s'accentue au fur et à mesure que la teneur en éthanol augmente. Dosage de l'éthanol : La méthode chimique de dosage de l'éthanol utilisée est destinée en routine à 30 la détermination de l'alcoolémie et par conséquent à la détermination de teneurs beaucoup plus faibles que celles utilisées dans les compositions verrou. Ainsi, les échantillons ont du être dilués au 1/100 ce qui peut éventuellement introduire une source d'erreur supplémentaire ayant un léger impact sur la précision du dosage (CV calculé de 2,5% en moyenne au lieu des 2,0 % de la validation). L'association d'énoxaparine sodique à 400 Ul/ML et d'éthanol à 40 % (v/v) n'a pas d'influence significative sur la teneur initiale en éthanol. Dosage de l'énoxaparine sodique par CLHP-DEDL : La particularité de la détection en DEDL est que la relation entre l'aire du pic chromatographique A et la masse m est rarement linéaire ; elle est généralement de type A = amb où a et b sont des coefficients dépendant en particulier de la taille des gouttelettes formées, de la nature, de la concentration et de la volatilité du soluté, des débits de gaz et de phase mobile. Une représentation log-log peut parfois s'avérer nécessaire pour une calibration adéquate. Il s'est avéré dans l'application présente que l'aire du pic chromatographique A de l'énoxaparine n'était pas directement proportionnelle à la masse m et qu'une linéarité de forme Y= aX +b était obtenue avec Y= log A et X = concentration en énoxaparine en Ul/mL. Les résultats montrent que, pour l'éthanol à 70% v/v, les teneurs en énoxaparine retrouvées dans le surnageant après centrifugation ne sont pas détectables. L'énoxaparine n'est alors pratiquement plus soluble et a précipité pour former des gouttelettes par décantation. Ces résultats montrent que la solubilité de l'héparine de bas poids moléculaire diminue notablement pour une teneur en éthanol élevée, notamment égale à 70% v/v. Exemple 2 : étude de la stabilité de compositions verrou aqueuses selon l'invention comprenant différentes natures et concentrations en héparine de bas poids moléculaire. Les compositions verrou testées ont été les suivantes : - composition comprenant le mélange nadroparine calcique et éthanol, - composition comprenant le mélange tinzaparine sodique et éthanol, - composition comprenant le mélange daltéparine sodique et éthanol, - composition comprenant le mélange énoxaparine sodique et éthanol. La concentration d'éthanol exprimée en % d'éthanol v/v ne faisant pas précipiter la composition verrou a été déterminée pour chaque composition verrou, en faisant varier la teneur en héparine. Les compositions ont été testées à température ambiante et à 37°C et les résultats observés après 48h. Les résultats sont présentés dans les tableaux 1 à 4. Teneur en nadroparine Teneur en éthanol (% Teneur en éthanol (% calcique (Ul/mL) v/v) à température v/v) à 37°C ambiante 43,7 44,6 500 41,7 41,7 1000 39,7 38,7 Tableau 1 Teneur en tinzaparine Teneur en éthanol (% Teneur en éthanol (% sodique (Ul/mL) v/v) à température v/v) à 37°C ambiante 10 42,1 44,0 500 34,3 41,0 1000 26,3 38,0 Tableau 2 10 20 Teneur en daltéparine Teneur en éthanol (% Teneur en éthanol (% sodique (Ul/mL) v/v) à température v/v) à 37°C ambiante 10 44,6 47,8 500 35,7 41,9 1000 26,7 35,9 Tableau 3 Teneur en énoxaparine Teneur en éthanol (% Teneur en éthanol (% sodique (Ul/mL) v/v) à température v/v) à 37°C ambiante 10 47,6 48,2 500 40,7 45,8 1000 33,7 43,3 Tableau 4 Les résultats confirment que pour une large gamme de teneur en héparine de bas poids moléculaire et pour une teneur en éthanol allant de 20 à 50%, les compositions verrou aqueuses selon l'invention sont stables dans le temps. Exemple 3 : étude de l'effet anticoagulant d'une composition verrou selon l'invention comprenant un mélange enoxaparine sodique 400U1/mL et éthanol 40% v/v. L'effet anticoagulant d'une composition verrou selon l'invention comprenant un mélange enoxaparine sodique 400U1/mL et éthanol 40% v/v a été évalué en 15 laboratoire. Pour cela, 2 méthodes ont été employées : - évaluation globale de l'effet anticoagulant par mesure du temps de génération de thrombine (TGT) en thrombinographie sur plasma riche en 20 plaquette (PRP). - mesure de l'activité anti-Xa sur plasma pauvre en plaquettes (PPP). Pour se rapprocher des conditions d'utilisation in vivo de la composition verrou selon l'invention, ont été ajouté, au sang citraté de volontaires sains différentes quantités : - de la composition verrou selon l'invention, - d'une composition d'enoxaparine sodique 400U1/mL (contrôle). Ces solutions ont été préparées la veille et conservées à 4°C avant usage. Après incubation 1 h à 37°C des mélanges, le temps de génération de thrombine (TGT) sur PRP et l'activité anti-Xa sur plasma pauvre en plaquettes (PPP) ont été mesurés. Les résultats de la mesure du temps de génération de thrombine (TGT) montrent qu'un effet anticoagulant dose dépendant de la composition verrou selon l'invention a été observé. Celui-ci est proche de l'effet anticoagulant obtenu avec la composition d'enoxaparine 400U1/mL seule. Les IC50 ETP de la composition verrou selon l'invention correspondant à la dose qui inhibe 50% de l'ETP et donc à une activité anticoagulante satisfaisante (l'ETP étant le potentiel endogène de thrombine, i.e. le reflet de l'action coagulante du PRP testé) sont obtenus pour une activité anti-Xa médiane de 1.78 [1.05-2]. L'IC50 ETP de la composition d'enoxaparine 400U1/mL seule est obtenu pour une activité anti-Xa médiane de 0.68 [0.25-0.90]. Les résultats de la mesure de l'activité anti-Xa sur plasma pauvre en plaquettes (PPP) montrent qu'un effet anticoagulant dose dépendant pour la composition verrou selon l'invention a été observé. Celui-ci est proche de celui obtenu avec la composition d'enoxaparine sodique 400U1/mL seule. Les ratios (enoxaparine sodique 400U1/mL / mélange enoxaparine sodique 400U1/mL-éthanol 40%) s'échelonnent entre 1.5 et 2 suivant les volontaires. Ainsi, pour une concentration finale en enoxaparine sodique de 2 Ul/mL dans le sang total, l'activité anti-Xa mesurée sur PPP est de 3.58 en médiane [3.024.28] pour la composition d'enoxaparine seule contre 2.38 [1.89- 2.82] pour la composition verrou selon l'invention. Par ailleurs, une stabilité de l'effet anti coagulant de la composition verrou selon l'invention a été observée pendant 9 jours. Une perte de 17% d'activité anti-Xa a été observée dans le solvant éthanol à 24 heures. Après cette perte d'activité, aucune perte supplémentaire jusqu'à J 9 n'a été observée. Ces résultats montrent qu'une composition verrou selon l'invention a une activité anticoagulante satisfaisante et suffisante dans les conditions d'utilisation envisages, i.e. utilisée seule. Exemple 4: étude de l'effet anti biofilm d'une composition verrou selon l'invention comprenant un mélange énoxaparine sodique 400U1/mL et éthanol 40% v/v. Il s'agissait de déterminer l'activité anti biofilm d'une composition selon l'invention par mesure du nombre de bactéries viables (Unité Formant Colonie ou UFC) après 4, 24 et 48 heures de contact avec ladite solution. Souches microbiennes et conditions de culture : Les souches de Staphylococcus epidermidis CIP 68.21, Staphylococcus aureus CIP 65.25 (résistante à la methicilline), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et Klebsiella pneumoniae LM 21 ont été sélectionnées. Ces souches bactériennes ont été cultivées dans un milieu Luria Bertani (LB). Les organismes ont été maintenus à 70°C dans leur milieu respectif en présence de 15% de glycérol, et pour chaque essai le biofilm a été établi à partir du stock original. Formation du biofilm dans les cathéters en polyuréthane : La formation du biofilm dans les cathéters en polyuréthane a été effectuée dans des microfermenteurs aérés de 60 mL comme décrit par Ghigo (Ghigo JM, Nature (2001), 412 (6845), 442-445) ainsi que dans le document internet de l'Institut Pasteur (www.pasteur.fr/recherche/unites/Ggb/matmet.html). Des segments de 1 cm de longueur de cathéters stériles en polyuréthane (DualCath IO, Medcomp, Harleyville, USA ; Hemotech, Ramoville, France) ont 10 été fixés à la surface de la lame de verre amovible interne des microfermenteurs. Les souches provenant du stock congelé à -70°C ont été cultivées dans un milieu LB à 0,4% de glycérol toute une nuit. Un inoculum constitué de 109 15 bacilli ou 108 cocci a été utilisée pour inoculer les microfermenteurs comprenant les segments de cathéters. Un débit continu de 10 mL/h d'un milieu LB à 0,4% de glycérol et une aération constante avec un air stérile pressurisé (0,3 bar) ont été utilisés pour obtenir des conditions de culture optimales. 20 Après 24 heures d'incubation, les segments de cathéter ont été retirés de l'incubateur. Les biofilms formés sur les segments de cathéter ont été resuspendus dans 25 5mL de LB par utilisation d'ultra-sons et d'un vortex. Des volumes déterminés de dilutions des suspensions obtenues ont ensuite été placées à la surface de géloses nutritives LB pour déterminer la nombre de cellules viables (CFU) après incubation pendant une nuit à 37°C. 30 Le nombre de bactéries a été exprimé en logarithme décimal (log10) ; le seuil de détection dans les conditions expérimentales citées ci-dessus était de 1,6 log10 (40 CFU) par segment de cathéter. 2 98566 7 18 Protocole de traitement des données L'activité anti biofilm de la composition verrou selon l'invention a été déterminée sur des biofilms de 24 heures. Après incubation, les segments de 5 cathéter présentant un biofilm ont été récupérés, rincés avec 1 mL de solution saline puis placés dans un tube comprenant 1 mL de chaque composition verrou testée : - solution aqueuse d'éthanol à 40% v/v, préparée à partir d'éthanol 95% dilué dans une solution de chlorure de sodium, - composition aqueuse d'énoxaparine sodique 400 Ul/mL, - composition verrou selon l'invention, - solution saline. Pour chaque organisme, les expériences ont été répétées 3 ou 4 fois, et 15 durant chaque essai, les segments de cathéter ont été exposés aux différentes solutions jusqu'à 48 heures à 37°C. Par la suite, les segments de cathéter ont été récupérés, rincés avec une solution saline et le nombre de cellules viables a été déterminé comme décrit 20 ci-dessus. De plus, la biomasse du biofilm a été déterminée avant chaque traitement pour chaque souche par 3 fois. Les segments de cathéter ont été exposés aux différentes solutions pendant 4, 24 et 48 heures. Les résultats sont présentés dans les tableaux 5 à 8. 25 Durée du traitement Composition 4h 24h 48h Solution saline 2,66E+06 3,88E+06 1,65E+06 Composition aqueuse 3,43E+06 6,67E+06 1,47E+06 d'énoxaparine sodique 400 ' Ul/mL Solution aqueuse d'éthanol à 40% v/v ND ND ND 2 98566 7 19 Composition l'invention verrou selon ND ND ND ND : valeur non déterminée car en dessous du seuil de détection Tableau 5 : Staphylococcus epidermidis CIP 68.21 Durée du traitement Composition 4h 24h 48h Solution saline 5,79E+06 2,29E+06 2,39E+06 Composition aqueuse 3,93E+06 3,13E+06 1,84E+06 d'énoxaparine sodique 400 Ul/mL Solution aqueuse d'éthanol à 40% v/v 2,78E+04 ND' ND Composition verrou selon 1,61E+05 ND ND l'invention ND : valeur non déterminée car en dessous du seuil de détection 5 Tableau 6 : Staphylococcus aureus CIP 65.25 Durée du traitement Composition 4h 24h 48h Solution saline 4,72E+08 6,61E+08 2,03E+08 Composition aqueuse 9,52E+08 7,80E+08 2,03E+08 d'énoxaparine sodique 400 ' Ul/mL Solution aqueuse d'éthanol à 40% v/v ND ND ND Composition verrou selon ND ND ND l'invention ND : valeur non déterminée car en dessous du seuil de détection Tableau 7 : Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Durée du traitement Composition 4h 24h 48h Solution saline 4,52E+08 3,15E+08 1,13E+08 2 98566 7 20 Composition aqueuse 8,12E+08 2,80E+08 1,48E+08 d'énoxaparine sodique 400 Ul/mL Solution aqueuse d'éthanol à 2,51E+06 ND' ND 40% v/v Composition verrou selon 1,87E+06 ND ND l'invention 'ND : valeur non déterminée car en dessous du seuil de détection Tableau 8 : Klebsiella pneumoniae LM 21 Les résultats ne montrent aucune différence significative après traitement des 5 biofilms entre une solution d'éthanol 40% seul et une composition verrou selon l'invention, et ceci quelle que soit la souche bactérienne testée. L'activité bactéricide de l'éthanol n'est donc pas altérée par la présence d'énoxaparine sodique 400 UI. 10 Les résultats montrent notamment que pour deux des espèces bactériennes, (i.e. Staphylococcus epidermidis et Pseudomonas aeruginosa), l'éradication est maximale (en dessous du seuil de détection de 40 UFC) dès 4h d'incubation. Pour les deux autres espèces bactériennes, une éradication complète est observée avec le temps d'incubation de 24h. Ces résultats démontrent qu'une composition verrou selon l'invention est non seulement caractérisée par une activité bactéricide équivalente à l'éthanol, mais également que cette activité est effective rapidement, notamment dès les premières heures après la mise en contact avec la souche bactérienne, et ne dépassant pas 24 heures. REVENDICATIONS1. Composition verrou aqueuse comprenant: - de 10 à 6000 Ul/mL d'au moins un composé (a) choisi parmi les anticoagulants polysaccharidiques, et - de 20 à 55% v/v d'éthanol. 2. Composition selon la revendication 1 comprenant de 25 à 55% v/v, de préférence de 25 à 50% v/v d'éthanol. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont le composé (a) est choisi parmi les héparines de bas poids moléculaire. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes dont le composé (a) est choisi parmi l'énoxaparine, la tinzaparine, la nadroparine et la daltéparine et leurs dérivés. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes dont le composé (a) est choisi parmi un sel d'énoxaparine, un sel de tinzaparine, un sel de nadroparine et un sel de daltéparine. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant : - de 10 à 4700 Ul/mL, de préférence de 10 à 600 Ul/mL, d'un sel de nadroparine, et - de 25 à 45% v/v d'éthanol. 7. Composition selon la revendication précédente comprenant 450 Ul/mL d'un sel de nadroparine et 40% v/v d'éthanol. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comprenant :- de 10 à 3200 Ul/mL, de préférence de 10 à 700 Ul/mL, d'un sel de tinzaparine, et - de 25 à 40% v/v d'éthanol. 9. Composition selon la revendication précédente comprenant 100 Ul/mL d'un sel de tinzaparine et 40% v/v d'éthanol. 10.Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comprenant : - de 10 à 1900 Ul/mL, de préférence entre 10 et 1500 Ul/mL, d'un sel de daltéparine, et - de 25 à 50% v/v d'éthanol. 11. Composition selon la revendication précédente comprenant 200 Ul/mL d'un sel de daltéparine et 40% v/v d'éthanol. 12.Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comprenant : - de 10 à 4600 Ul/mL d'un sel d'énoxaparine, et - de 25 à 50% v/v d'éthanol. 13. Composition selon la revendication précédente comprenant : - 500 Ul/mL de sel d'énoxaparine et 40% v/v d'éthanol, ou - 400 Ul/mL de sel d'énoxaparine et 40% v/v d'éthanol, ou - 200 Ul/mL de sel d'énoxaparine et 45% v/v d'éthanol. 14.Composition selon les revendications 1 ou 2 dont le composé (a) est choisi parmi les héparinoïdes, de préférence le danaparoïde. 15.Composition selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 14 comprenant : - de 25 à 2100 Ul/mL de danaparoïde, et - de 25 à 45% v/v d'éthanol. 16. Composition selon la revendication précédente comprenant 225 Ul/mL de danaparoïde et 40% v/v d'éthanol. 17. Composition selon les revendications 1 ou 2 dont le composé (a) est choisi parmi les anticoagulants pentasaccharidiques, de préférence le fondaparinux. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 17 comprenant : - de 20 à 700 Ul/mL de fondaparinux, et - de 25 à 45% v/v d'éthanol. 19. Composition selon la revendication précédente comprenant 235 Ul/mL de fondaparinux et 40% v/v d'éthanol. 20. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes pour le verrouillage d'un dispositif intra-vasculaire, de préférence d'un cathéter. 21. Kit de préparation d'une composition verrou selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, comprenant : - une solution aqueuse (b) comprenant de 10 à 6000 Ul/mL d'un composé (a) choisi parmi les anticoagulants polysaccharidiques, en particulier les héparinoïdes ou les héparines, notamment les héparines de bas poids moléculaire, et - une solution aqueuse comprenant de 20 à 55% v/v d'éthanol (c). 22. Méthode pour verrouiller un dispositif intra-vasculaire implanté chez un patient comprenant l'introduction dans le dispositif d'une composition verrou selon l'une quelconque des revendications 1 à 19.