Brevet FR2984357A1 — publié le 20130621

DESCRIPTION La présente invention concerne un procédé dans lequel au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon biologique, est amplifié par un procédé d'amplification transcriptionnelle permettant de réunir des étapes de températures différentes, à savoir la dénaturation et l'amplification proprement dite. L'état de la technique est constitué par un certain nombre d'articles scientifiques qui traite de l'effet thermo-stabilisant des polyols sur les enzymes, c'est notamment le cas de : - Lee en 1981 dans J. Biol. Chemistry 256(14):7193-7201, intitulé : « The stabilization of proteins by sucrose », qui décrit l'effet thermostabilisant du sucrose sur l'a-chymotrypsin, la chymotrypsinogen et l' ARNase. - Bernier en 1988 dans J. Biotechnol. 7 :293-298, ayant pour titre : « Stabilization of aglucosidase by polyhydric alcohols » démontrant l'effet thermo-stabilisant des polyols sur la a-glucosidase. - Carninci en 1998 dans Proc. Natl Acad. Sci. 95 :520-524, intitulé : « Thermostabilization and thermoactivation of thermolabile enzymes by trehalose and its application for the synthesis of full length cDNA » qui présente la thermo-stabilisation par le tréhalose d'enzymes de transcripton inverse et d'enzymes de restriction. - Spiess en 2004 dans Clinical chemistry 50 (7) : 1256- 1259, qui titre « Trehalose is a potent PCR enhancer : lowering of DNA melting temperature and thermal stabilization of taq polymerase by disaccharide trehalose », où l'effet thermo-stabilisant du tréhalose sur la Taq polymérase est mis en évidence. Il est donc clair que depuis une trentaine d'années un nombre important de chercheurs ce sont intéressés à l'effet thermo-stabilisant des polyols sur les enzymes. D'ailleurs une demande de brevet a été déposée voilà quinze ans, sous le numéro EP-A-0.821.058, qui propose une méthode d'amélioration d'une activité enzymatique à température élevée. Le brevet correspondant revendique l'utilisation de polyols pour thermo-stabiliser une polymérase et une enzyme de restriction. Malgré l'intérêt des scientifiques, il apparaît que personne n'a tenté d'adapter cette approche aux technologies d'amplification transcriptionnelle, du type NASBA, TMA, etc. qui, pour fonctionner, font appel à plusieurs activités enzymatiques différentes. La première étape consiste en la dénaturation de la cible, un acide nucléique, généralement un acide ribonucléique (ARN) à 65°C pendant 2 minutes et la deuxième étape consiste, elle, à ajouter des enzymes nécessaires à l'amplification isothermale à 41°C. Ces deux étapes rendent la méthode techniquement contraignante pour l'utilisateur de part l'utilisation de deux températures successives. De plus, l'utilisation d'une seule température (41°C) pose actuellement des problèmes divers tels que l'amplification des cibles riches en guanine et cytosine présentant des structure secondaires difficilement amplifiables. La solution la plus connue pour rendre ces structures secondaires facilement amplifiables par les techniques d'amplification transcriptionnelle est l'utilisation d'un cinquième nucléotide dans le mélange d'amplification, qui est la riboinosine triphosphate (K Nakahara et al. Nucleic Acids Res. 1998 April 1; 26(7): 1854-1856). On peut facilement utiliser des cibles d'acide désoxyribonucléiques (ADN) avec la technologie NASBA. Pour ce faire il suffit, par exemple d'appliquer préalablement à l'échantillon traité un procédé selon le brevet EP-B-0.397.269 ou selon la demande de brevet WO-A-02/070735, pour permettre l'amplification des cibles ADN. Alors que l'homme du métier a utilisé ce type de transcription des cibles d'ADN avec deux étapes de températures différentes pendant des décennies, il ne lui était pas encore venu à l'esprit d'essayer d'améliorer la thermo-stabilité des enzymes utilisées pour diminuer les contraintes de ce type de procédé d'amplification transcriptionnelle. La présente invention décrit donc une simplification de la méthode d'amplification transcriptionnelle qui est alors réalisée en une seule étape de part l'ajout simultané de l'acide nucléique cible et des réactifs d'amplification, tels que tampons, enzymes, nucléotides, en présence d'additifs chimiques thermo-stabilisants, qui permettent l'utilisation d'une température d'amplification plus élevée avec un alignement avec la température de l'étape de dénaturation desdites cibles. C'est un effet qui est particulièrement inattendu et donc surprenant. La nouveauté réside en la thermo-stabilisation simultanée de l'ensemble des activités enzymatiques, notamment des trois activités enzymatiques présentes dans la méthode d'amplification NASBA, par l'utilisation d'additifs chimiques de types polyols permettant de préserver les activités de l'ARN polymérase T7, l'ARNase H et l'AMV-RT à des températures plus élevées que 41°C, et permettant ainsi de réunir les étapes expérimentales de dénaturation et d'amplification. La présente invention propose un procédé d'amplification transcriptionnelle dans lequel : a) au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon biologique, est mis en présence : - d'amorces d'amplification, - de l'ensemble des réactifs nécessaires à la réalisation de l'amplification, dont les enzymes participant à l'amplification, et - d'au moins un polyol permettant de stabiliser les enzymes nécessaires à la réalisation de l'amplification, b) on chauffe le mélange à une température supérieure à 41°C, c) on réalise une amplification transcriptionnelle de l'acide nucléique cible à une température supérieure à 41°C. Selon un mode de réalisation du procédé d'amplification, la température à laquelle l'amplification est comprise entre 41 et 49°C. Selon un autre mode de réalisation du procédé d'amplification, la température à laquelle l'amplification est réalisée est supérieure ou égale à 46°C. Quelque soit le mode réalisation du procédé d'amplification, les activités enzymatiques assurées par les enzymes sont : - l'activité ARN polymérase (T7, SP6, etc.), - l'activité transcriptase inverse (AMV-RT, MMLV-RT, etc.), et - l'activité ARNase H. L'activité ARNase H peut être donnée par une enzyme indépendante (activité dite individuelle) ou par une enzyme ayant une autre activité enzymatique (activité dite associée). Cette autre activité associée à l'ARNase H peut être donnée par une enzyme transcriptase inverse ou ARN polymérase ou une enzyme différente. Les activités enzymatiques permettent de réaliser des amplifications isothermes, telles que : - la NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), - la TMA (transcription mediated amplification), - la 3 SR (self-sustained sequence replication), - la SMART (signal mediated amplification of RNA technology), - la MDA (Multiple Displacement Amplification), et - toutes autres amplifications isothermes faisant intervenir au moins une des trois activités citées précédemment et utilisées pour des amplifications du génome entier (whole genome amplification) ou pour des amplifications d'une séquence spécifiques ADN ou ARN). Quelque soit le mode réalisation du procédé d'amplification, le ou les polyols sont constitués par l'un des composés ou une combinaison des composés suivants : - lactose, - sorbitol, - sucrose, - mannitol, et - tréhalose. Quelque soit le mode réalisation du procédé d'amplification, la concentration en polyol(s) est comprise entre 0,4 et 1,5 M. La présente invention concerne également un procédé de détection d'amplicons obtenus par le procédé d'amplification, tel que décrit ci-dessus, qui consiste à ajouter durant l'étape a) au moins un type de sonde de détection par acide nucléique cible recherché et susceptible d'être présent dans l'échantillon biologique, et à effectuer l'étape supplémentaire suivante : d) on effectue la détection de la présence d'amplicons issus de l'amplification réalisée à l'étape c) par hybridation de la sonde sur chaque amplicon en solution. La présente invention concerne également un procédé de prétraitement du ou des acides nucléiques cibles recherchés et susceptible d'être présents dans l'échantillon biologique, et devant être amplifié(s), tel que décrit ci-dessus, consistant à effectuer l'étape supplémentaire suivante avant l'étape a) dans laquelle ledit l'échantillon biologique est soumis à une température inférieure ou égale à 65°C pour l'ARN et à une température inférieure ou égale à 95°C pour l'ADN. La présente invention concerne également un procédé de prétraitement du ou des acides nucléiques cibles recherchés et susceptible d'être présents dans l'échantillon biologique, et devant être amplifié(s), tel que décrit ci-dessus, consistant à effectuer une étape supplémentaire, avant l'étape a), dans laquelle ledit l'échantillon biologique est soumis à une température inférieure ou égale à 49°C. La présente invention concerne également un procédé de diagnostic in vitro de la présence d'un ou de différents types d'acides nucléiques cibles recherchés et susceptible d'être présents dans l'échantillon biologique, consistant : a) à effectuer un procédé de prétraitement, tel que décrit ci-dessus, b) à effectuer un procédé d'amplification, tel que décrit ci-dessus, c) à effectuer un procédé de détection, tel que décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation du procédé de diagnostic, l'ensemble du procédé est réalisé en un seul récipient. Selon une première variante de réalisation du procédé précédent, l'ensemble du procédé est réalisé à une température unique supérieure à 41°C. Selon une première variante de réalisation du procédé précédent, l'ensemble du procédé est réalisé à une température unique comprise entre 46 et 49°C. Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. Les Figures 1 représentent le criblage fonctionnel de composés thermo-stabilisants lors d'amplifications NASBA à 46°C en présence de 7,5 cp/réaction de transcrits VIH-1B (sept réplicas par criblage), avec dans : - la Figure 1 A une concentration en lactose de 0,21 M, - la Figure 1B une concentration en maltose de 0,9 M, - la Figure 1C une concentration en raffinose de 0,05 M, - la Figure 1D une concentration en sorbitol de 1,2 M, - la Figure lE une concentration en sucrose 0,6 M, et - la Figure 1F une concentration en turanose 1,09 M. La Figure 2 décrit l'activité résiduelle (%) de l'ARN polymérase T7 après 3 minutes de pré-incubation à différentes température et en présence de différents composes thermo- stabilisants. La Figure 3A décrit l'activité résiduelle de l'ARN polymérase T7 après 15 minutes de pré-incubation à différentes températures, avec ou sans tréhalose 0,4 M. La Figure 3B décrit l'activité résiduelle de l'ARNase H après 25 minutes de pré-incubation à différentes températures, avec ou sans tréhalose 0,4 M. La Figure 3C décrit l'activité résiduelle de l'AMV-RT après 25 minutes de pré-incubation à différentes températures, avec ou sans tréhalose 0,4 M. La Figure 4 propose la mesure de la sensibilité (%) obtenue en présence de différents composés thermo-stabilisants lors d'une amplification NASBA VIH-1 type B à 5 cps/essai et sans phase de dénaturation de la cible (N=24). A noter qu'à 46°C, le référence ne bénéficiant pas d'additifs thermo-stabilisants ne permet plus d'obtenir d'amplification. Bien que l'utilisation de sucres et plus généralement des polyols pour thermo-stabiliser les enzymes soit une information qui peut être trouver dans la littérature, leur utilisation à de fortes concentrations dans une amplification transcriptionnelle, telle que la NASBA, pour produire une amplification isotherme à plus de 41°C, notamment à plus de 44°C et préférentiellement à plus de 46°C, avec une pré incubation possible jusqu'à 49°C est une avancée technique permettant de simplifier techniquement ce genre d'amplification pour l'utilisateur final. Bien que cela fonctionne entre 41 et 45°C, il est notamment nécessaire d'augmenter la température d'amplification NASBA à 46°C afin de faciliter la dénaturation de cibles structurées, permettant ainsi d'améliorer les performances de détection. Les exemples ci-dessous utilisent la méthode d'amplification transcriptionnelle et isothermale NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification). Cependant, l'approche décrite dans ce document est aussi applicable aux autres méthodes d'amplification isothermale telles que la TMA (Transcription Mediated Amplification ) ou 3 SR (Self-Sustained Sequence Replication) par exemple (Gill et Ghaemi, 2008, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 27 :224-245 ; Leone et al. 1998, NAR, 26-9 : 2150-2155). La technologie NASBA est une technologie alternative à la PCR permettant à la différence de cette dernière, la détection génétique des micro-organismes vivants (bactéries, virus, etc...) par amplification d'ARN. Cette technologie d'amplification requiert trois activités enzymatiques pour fonctionner dont l'ARN polymérase T7, l'ARNase H et l'AMV-RT. Parmi ces trois activités enzymatiques, l'ARN polymérase T7 est l'enzyme la plus thermosensible. Exemple 1 : Sélection des composés thermo-stabilisants compatibles avec la méthode d'amplification transcriptionnelle et isothermale NASBA Un ensemble de composés aux propriétés thermo-stabilisantes ou supposées comme telles a été évalué dans un test d'amplification NASBA VIH-1 2.0 sur une plateforme d'amplification Nuclisens EasyQTM (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) en suivant les recommandations du fournisseurs. 5cp à 30cp d'un transcrit VIH-1 de type B a été utilisé comme cible dans chaque réaction en présence ou absence du composé à évaluer. L'obtention d'une amplification en présence du composé à une température de 46°C permet de valider le composé comme compatible et thermo-stabilisant pour la réaction NASBA. Comme le montrent les exemples des Figures 1A, 1B, 1C, 1D, lE et 1F, la présence ou l'absence d'une amplification NASBA à 46°C permet de sélectionner aisément les composés thermo-stabilisants tels que le sucrose, sorbitol et lactose qui donnent dans la plupart des cas, une amplification ayant un signal correct (au moins quatre signaux positifs sur sept réplicats). Les additifs ainsi isolés sont étudiés plus précisément par la suite. Exemple 2 : Sélection des composés thermo-stabilisants par suivi de la dénaturation thermique de l'ARN polymérase T7 par spectrophotométrie UV Il est démontré dans cet exemple que la température de dénaturation de l'ARN polymérase T7 (Tm T7) augmente considérablement en présence de certains additifs chimiques, en comparaison de celle du témoin sans additif. L'ARN polymérase T7 a été choisie comme enzyme modèle car elle est la plus sensible à la dénaturation thermique, la Tm T7 sans additif est de 48,5 °C. Une technique de spectrophotométrie UV est utilisée pour mesurer les Tm T7. L'évolution de l'absorbance de la protéine à X = 280 nm en fonction de la température est mesurée. Quand l'enzyme est chauffée, la solution devient trouble, des agrégats se forment qui correspondent à la forme dénaturée. La Tm correspond à la température pour laquelle on a 50% de forme native et 50% de forme dénaturée (dérivée première de la courbe absorbance f(température)). Dans un flacon en polypropylène, on mélange 4 ml de tampon phosphate PBS 300 mM (Aldrich P-4417, St Quentin Fallavier, France) puis 12 11.1 d'enzyme ARN polymérase T7 (bioMérieux, Marcy, France) à 17 mg/m1 soit une concentration finale en protéine de 0,05 mg/ml. On introduit ensuite dans une cuve en quartz pour spectrophotométrie UV, 500 11.1 de solution d'ARN polymérase T7 à 0,05 mg/m1 et 500 11.1 d'une solution d'additifs (Aldrich, St Quentin Fallavier, France) concentrée ou de PBS 300 mM pour le témoin. Après homogénéisation, on mesure l'évolution de l'absorbance à X = 280nm en fonction de la température, entre 30 et 65°C à 1°C/min, afin de déterminer la Tm T7 comme décrit précédemment (Spectrophotomètre UV Cary, Varian, Les Ulis, France). Quelques résultats représentatifs obtenus d'après la méthode décrite précédemment sont reportés dans le Tableau 1 ci-dessous (les ATm sont reportés en fonction du type d'additif). Additifs ATm CV Nombre (°C) (%) d'expériences ARN polymérase T7 à 0,05mg/m1 BS' 150 mM, pH 7,5 - 1,6 26 idem BS, 150 mM, pH 7,5 / Sorbitol 1M + 0,9 1,1 3 idem BS, 150 mM, pH 7,5 / Sucrose 1M + 5,8 1,0 3 idem BS, 150 mM, pH 7,5 / Lactose (0,35M) + 5,5 0,2 3 idem BS, 150 mM, pH 7,5 / Raffinose (0, 085M) +0,5 0,2 3 idem BS, 150 mM, pH 7,5 / D-Turanose (0,15 M) - 4,4 0,1 2 Tableau 1 : Tableau récapitulatif des mesures de ATm observées en fonction du type d'additif On observe bien que le chauffage de l'enzyme ARN polymérase T7 en présence de certain additifs comme le sorbitol, le sucrose ou le lactose permet d'augmenter très significativement la température de dénaturation de l'enzyme et cela de plusieurs degrés ce qui confirme sa thermo-stabilisation. Exemple 3 : Mesure de thermo-stabilité (T112) à 46°C pour l'ARN polymérase T7 Dans cet exemple, les valeurs de T112 de l'ARN polymérase T7 sont déterminées en présence ou absence de polyols. Une description de la méthode de mesure est présentée ci-dessous, ainsi que les différents réactifs utilisés. Tampon A Tampon B Tampon C Tampon D KH2PO4/K2HPO4 Tris-HC120 mM, pH 7,5 KH2PO4/K2HPO4 Tris-HC13,2mM, 20 mM, pH 7,5 KC1 300 mM 200 mM, pH 7,2 pH 7,5 NaC1 100 mM Tréhalose 1 M Tréhalose 1 M NaC1 6,4 mM Tréhalose 1 M EDTA 7 mM Triton X-100 0,21 % DTT 0,13 mM EDTA 1 mM Triton X-100 0,21 % (w/v) (w/v) BSA 1,3 mg/mL Triton X-100 BSA 0,2 mg/mL DTT 1 mM Tréhalose 340 mM 0,268% (v/v) DTT 1 mM BSA 0,1 mg/mL Acétate de magnésium DTT 1mM 20m M Solution W1 : Mélanger les tampons B, C et D selon les proportions suivantes aux réactifs NuclisensTM VIH-1 2.0 (réf. : 285033 , bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) suivant (pour huit réactions): - 36,08 !IL tampon A 20 - 6,32 µL tampon B - 25,36 µL tampon C - 173,6 µL tampon D - Huit accusphère « reagent accuspheres NuclisensTM VIH-1 2.0 » - 960 !IL de diluent « Reagent diluent NuclisensTM VIH-1 2.0 » Solution S (Mix substrat) : - Tris-HC1 à 70 mM, pH 8,5 - dNTP à 1,3 mM chacun - rATP, rCTP et rUTP à 2,6 mM chacun - rGTP à 2 mM - rITP à 0,6 mM - Saccharose à 60 mM - Mannitol à 40 mM 10 - Dextran T-40 à 7 g/L - MgCl2 à 16 mM - KC1 à 320 mM - DTT à 20 mM - DMSO à 3,5 M 15 - Balise moléculaire (Molecular Beacon) MB1 entre 0,1 à 0,3 1.1M - Oligonucléotide T7-Min entre 10 nM et 20 nM - Oligonucléotide T7-plus entre 10 nM et 20 nM Séquences utilisées (orientation 5' - 3'): T7-min AATTCTAATACGACTCACTATAGTATGAGGGCAGCAGACATCGAATTT T7-plus AAATTCGATGTCTGCTGCCCTCATACTATAGTGAGTCGTATTAGAATT MB1 FAM - CTATCCCTTCGATGTCTGCTGCCCTCGGGATAG - Dabcyl 20 1. Les enzymes à évaluer sont diluées de telles manières à avoir une activité volumétrique de 109 kU/mL. 2. Un volume de 20 !IL de l'enzyme à évaluer sont dilués dans 840 !IL de solution Wl. 25 3. Puis 1141.it du composé à évaluer sont ajoutés à 193,5 !IL de mix enzymatique décrit au point 2 ci-dessus. 4. On fait 12 portions de 201.it du mix qui a été généré au point 3, qui sont réparties dans des tubes de 0,2 mL et incubées à la température de 46°C dans un thermocycleur. Un tube est retiré du thermocycleur toutes les 10 minutes pendant 110 minutes et est stocké à 4°C avant 30 mesure de l'activité enzymatique résiduelle. 5. A 5 !IL de ce mélange pré incubé sont additionnés 20 !IL de solution S afin de mesurer la vitesse d'augmentation de fluorescence entre 5 et 10 minutes associée à l'activité résiduelle de l'enzyme. 6. L'activité résiduelle de chaque ARN polymérase T7 est exprimée en pourcentage de la fraction d'enzyme n'ayant pas été pré incubé et correspondant au 100% d'activité selon le calcul suivant : - pN = pente obtenue entre 5 et 10 min pour l'ARN polymérase T7 non pré incubé, - pT = pente obtenue entre 5 et 10 min pour la ARN polymérase T7 pré incubée à 46°C en présence ou absence de polyols, et - % activité relative = % (pT / pN). 7. La valeur de T112 correspond au temps qu'il faut pour que l'enzyme ne possède plus que 50% de son activité initiale. Les résultats de mesure de T112 de l'ARN polymérase T7 sont décrits dans le Tableau 2 : Molarité finale T112 46°C (min) Référence - 7 Tréhalose 0,40 63 Lactose 0,26 17 sucrose 0,74 -125 Sorbitol 1,48 >125 Tableau 2 : Valeurs des thermo-stabilités T112 de l'ARN polymérase T7 à 46°C D'après le Tableau 2, on constate que tous les composés chimiques évalués ont un effet thermo-stabilisant sur l'activité ARN polymérase T7 fonctionnant dans un environnement propre à la NASBA. Le sorbitol 1,48 M génère l'effet thermo-stabilisant le plus important tandis que le lactose possède un faible pouvoir thermo-stabilisant sur l'ARN polymérase T7, même s'il est visible et significatif.25 Exemple 4: Mesure de la température maximale de pré-incubation permettant de conserver l'activité ARN polymérase T7 Dans cette exemple, la température maximale que pouvait supporter la ARN polymérase T7 pendant un pré-incubation de 3 minutes en présence de composés thermo-stabilisants est déterminée. Cette étape pouvant être assimilée à une phase de pré-dénaturation ou pré-incubation des cibles. Le protocole utilisé dans cet exemple est similaire à celui de l'exemple 2 à l'exception du fait que les températures sont variables et que le temps de pré-incubation a été fixé à 3 minutes. La Figure 2 montre que le sucrose 0,7 M, le tréhalose 0,4 M et le sorbitol 1,4 M permettent de préserver 100% de l'activité ARN polymérase T7 pendant 3 minutes à 48°C, voir 3 minutes à 49°C pour le sorbitol. Exemple 5: Mesure de thermo-stabilité à différentes températures pour l'ARN polymérase T7, l'ARNase H et l'AlVIV-RT en présence ou absence de tréhalose 0,4 M D'une part et comme le montrent les Figures 3A, 3B et 3C, cet exemple met en évidence que l'ARN polymérase T7 (T7) est la plus thermosensible et que l'utilisation d'additif tel que du tréhalose permet de la rendre plus thermostable. D'autre part, on met aussi en évidence l'effet thermo-stabilisant du tréhalose sur les activités ARNase H (RH) et AMV-RT (RT). Description de la méthode de mesure des activités ARN polymérase T7, ARNase H et AMVRT pour l'exemple 5: 1. Les enzymes ARN polymérase T7, ARNase H et AMV-RT sont utilisées à des activités volumétriques de 109 kU/mL, 1 kU/mL et 25 kU/mL respectivement. 2. Les enzymes ARN polymérase T7, ARNase H et AMV-RT sont diluées dans la solution W1 de l'exemple 3 selon les ratios 1/43, 2/191 et 2/27 respectivement, afin de mimer l'environnement physicochimique de la réaction NASBA. 3. Aux mélanges précédents sont alors ajouté une solution de tréhalose 1,1 M de manière à avoir une concentration finale de 0,4M. 4. Des portions de 2Opt de la solution précédente sont alors réparties dans des tubes de 0.2mL et incubées pendant un temps déterminé à différentes températures. 5. L'activité résiduelle de chacune des activités ARN polymérase T7, ARNase H ou AMV-RT est alors mesurée par addition de 5 !IL de solution enzymatique à 20 !IL de solution S contenant les réactifs correspondants à chacune des activités mesurées. Solution S pour mesurer l'activité ARN Polymerase T7 : Similaire à exemple 3 Solution S pour mesurer l'activité ARNase H : - dNTP à 1,3 mM chacun, - rATP, rCTP, rUTP à 2,6 mM chacun, - rGTP à 2 mM, - rITP à 0,25mM, - Saccharose à 60 mM, - Mannitol à 40 mM, - Dextran T-40 à 7 g/L, - MgC12 à 16 mM, - KC1 à 400 mM, - DTT à 25 mM, - Tris-HC1 à 80mM, pH 8,5, - DMSO à 4,4M, et - Sonde RNAseH entre 0,2 et 2 1.1M : 5' FAM-AUAA-TAMRA 3'. Solution S pour mesurer l'activité ADN-dépendante de l'AlVIV-RT : - dNTP à 0,3 mM chacun, - rATP, rCTP, rUTP à 0,6 mM chacun, - rGTP à 0,5 mM, - rITP à 0,25 mM, - Saccharose à 15 mM, - Mannitol à 10 mM, - Dextran T-40 à 1,7 g/L, - MgC12 à 4 mM, - KC1 à 800 mM, - DTT à 50 mM, - Tris-HC1 à 165 mM, pH 8,5, - DMSO à 8,8 M, - Balise moléculaire MB2 entre 0,2 et 2 et de formule : 5' ROX- GATGCGGAGCGCAGTAGACATGCATCCGAACATCACAG CAGACACAGCCTGGTTTT-DABCYL 3', et - Oligonucléotide PRT entre 1 et 5 tIVI et de formule : 5' - AAAACCAGGCTGTGTCTG - 3' 6. L'activité résiduelle de chaque mutant est exprimée en pourcentage de la fraction d'enzyme n'ayant pas été pré incubée et correspondant au 100% d'activité selon le calcul suivant : - pN = pente obtenue entre 5 et 10 min pour l'enzyme non pré incubée, - pT = pente obtenue entre 5 et 10 min pour l'enzyme pré incubée à différentes températures, avec ou sans la présence du polyol à étudier, et - pourcentage d'activité relative = % (pT/pN). 20 Exemple 6: Etude de la sensibilité de la détection par méthode d'amplification transcriptionnelle NASBA à 46°C et en présence de composés thermo-stabilisants 25 Dans cet exemple, il est mis en évidence qu'il est possible de réaliser une amplification NASBA à 46°C en présence de composés thermo-stabilisants et sans phase de dénaturation des transcrits VIH-1B utilisés comme cibles à la concentration de 5 cps/réaction, limite de la détection NASBA. Ceci ayant pour but de simplifier la méthode de part l'ajout simultané des cibles aux mélanges enzymes et réactifs d'amplification. 30 Un kit d'amplification NuclisensTM HIV-1 2.0 (Réf. : 285033, bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) a été utilisé pour réaliser les expériences d'amplification en présence de tréhalose, sucrose ou sorbitol en limite de détection avec un transcrit VIH-1 type B à 5 cps/essai. Chaque amplification est répliquée 24 fois afin d'estimer la sensibilité de l'essai en présence de composés thermo-stabilisants à 46°C. La sensibilité est exprimée en pourcentage de signaux positifs déterminés par le système d'analyse EasyQTM par rapport au nombre total de répliquats. La Figure 4 démontre l'intérêt d'utiliser des températures réactionnelles plus élevées que 41°C en présence de certains polyols de part les gains de sensibilité obtenus, notamment avec le sorbitol qui permet de détecter 100% des transcrits VIH1-B.10 REVENDICATIONS1) Procédé d'amplification transcriptionnelle dans lequel : a) au moins un acide nucléique cible, présent dans un échantillon biologique, est mis en présence : - d'amorces d'amplification, - de l'ensemble des réactifs nécessaires à la réalisation de l'amplification, dont les enzymes participant à l'amplification, et - d'au moins un polyol permettant de stabiliser les enzymes nécessaires à la réalisation de l'amplification, b) on chauffe le mélange à une température supérieure à 41°C, c) on réalise une amplification transcriptionnelle de l'acide nucléique cible à une température supérieure à 41°C. 2) Procédé d'amplification, selon la revendication 1, dans lequel la température à laquelle l'amplification est réalisée est comprise entre 41 et 49°C. 3) Procédé d'amplification, selon la revendication 1, dans lequel la température à laquelle l'amplification est réalisée est supérieure ou égale à 46°C. 4) Procédé d'amplification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les activités enzymatiques assurées par les enzymes sont : i. l'activité ARN polymérase (T7, SP6, etc.), ii. l'activité transcriptase inverse (AMV-RT, MMLV-RT, etc.), et iii. l'activité ARNase H. 5) Procédé d'amplification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le ou les polyols sont constitués par l'un des composés ou une combinaison des composés suivants : i. lactose, ii. sorbitol, iii. sucrose, iv. mannitol, et y. tréhalose. 6) Procédé d'amplification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la concentration en polyol(s) est de 0,4 à 1,5 M. 7) Procédé de détection d'amplicons obtenus par le procédé d'amplification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, consistant à ajouter durant l'étape a) au moins un type de sonde de détection par acide nucléique cible recherché et susceptible d'être présent dans l'échantillon biologique, et à effectuer l'étape supplémentaire suivante : d) on effectue la détection de la présence d'amplicons issus de l'amplification réalisée à l'étape c) par hybridation de la sonde sur chaque amplicon en solution. 8) Procédé de prétraitement du ou des acides nucléiques cibles recherchés et susceptible d'être présents dans l'échantillon biologique, et devant être amplifié(s), selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, consistant à effectuer l'étape supplémentaire suivante avant l'étape a) dans laquelle ledit l'échantillon biologique est soumis à une température inférieure ou égale à 65°C pour l'ARN et à une température inférieure ou égale à 95°C pour l'ADN. 9) Procédé de prétraitement du ou des acides nucléiques cibles recherchés et susceptible d'être présents dans l'échantillon biologique, et devant être amplifié(s), selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, consistant à effectuer une étape supplémentaire, avant l'étape a), dans laquelle ledit l'échantillon biologique est soumis à une température inférieure ou égale à 49°C. 10) Procédé de diagnostic in vitro de la présence d'un ou de différents types d' acides nucléiques cibles recherchés et susceptible d'être présents dans l'échantillon biologique, consistant : a) à effectuer un procédé de prétraitement, selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, b) à effectuer un procédé d'amplification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, c) à effectuer un procédé de détection, selon la revendication 7. 11) Procédé, selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'ensemble du procédé est réalisé en un seul récipient. 12)Procédé, selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé par le fait que l'ensemble du procédé est réalisé à une température unique supérieure à 41°C. 13)Procédé, selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé par le fait que l'ensemble du procédé est réalisé à une température unique comprise entre 46 et 49°C.10