Brevet FR2986668A1 — publié le 20130809

-1- « Module d'excitation multi-couleurs pour un système d'imagerie multi- photonique, système et procédé associés » Domaine technique La présente invention concerne un module d'excitation multi-couleurs pour un système d'imagerie multi-photonique. On parle de façon équivalente d'imagerie multi-photonique ou non linéaire, notamment de microscopie multi-photonique ou non linéaire. Le domaine de l'invention est plus particulièrement celui de l'excitation multi-couleur et l'imagerie multi-photonique de fluorescence, c'est-à-dire l'observation de signaux retour dits « de fluorescence » émis par des chromophores présents dans un échantillon, en réponse à l'absorption de lumière d'un faisceau laser excitateur pulsé. Typiquement, l'imagerie multi-photonique utilise une excitation à deux 15 ou trois photons. Elle est particulièrement utile pour observer en profondeur et de façon non destructive les tissus biologiques. Les chromophores peuvent être présents naturellement dans l'échantillon. On peut également prévoir de les y injecter. On parle également, de façon plus précise, de fluorophores, c'est-à-dire des substances chimiques 20 capables d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation. Les signaux retour sont dits « de fluorescence », puisqu'ils correspondent à une émission lumineuse consécutive à l'excitation d'une molécule (ici par absorption d'au moins deux photons). Le domaine de l'invention est plus particulièrement mais de manière non 25 limitative celui de la microscopie à deux photons. La présente invention concerne également un système d'imagerie multiphotonique multi-couleurs comprenant un module d'excitation permettant d'exciter plusieurs chromophores différents, ainsi qu'un procédé mis en oeuvre 30 dans ledit module. Etat de la technique antérieure On connaît dans l'art antérieur différents modules d'excitation multi- photonique multi-couleurs pour un système d'imagerie multi-photonique, 35 adaptés à exciter au moins trois chromophores distincts. -2- Une première solution consiste à utiliser au moins une source laser accordable pour exciter les chromophores. Un balayage en longueur d'onde d'émission de la source laser accordable permet d'exciter successivement les au moins trois chromophores distincts. On obtient successivement au moins trois images, chaque image correspondant à un chromophore, et on peut superposer ces images. Le changement de la longueur d'onde d'émission de ladite source laser prend au mieux plusieurs secondes, pour des sources laser impulsionnelles femtosecondes à spectre étroit généralement utilisées dans les systèmes 10 d'imagerie multi-photonique. Un inconvénient de cette première solution est donc qu'il est impossible de produire simultanément les signaux retour correspondant à chacun desdits au moins trois chromophores. Cet inconvénient peut être particulièrement limitant lorsqu'il s'agit 15 d'imager des échantillons biologiques dans lesquels se produisent des mouvements rapides, présents à l'échelle de la seconde. La superposition des images est alors difficile voire impossible à exploiter. Une deuxième solution consiste à utiliser une unique source laser, pour 20 exciter simultanément au moins trois chromophores distincts et présentant des fréquences d'excitation très proches. Un inconvénient de cette deuxième solution est que la gamme de fréquences d'excitation est restreinte, ce qui réduit la gamme de chromophores aptes à être excités de façon efficace. On ne peut imager 25 simultanément que des ensembles de chromophores proches spectralement (par exemple environ 10 nm entre deux pics d'excitation). Un autre inconvénient de cette deuxième solution est qu'elle ne permet pas de contrôler indépendamment l'efficacité d'excitation des différents chromophores. 30 Une troisième solution consiste à utiliser une source laser impulsionnelle par chromophore que l'on souhaite exciter simultanément. Un inconvénient de cette troisième solution est bien entendu son coût prohibitif puisqu'au moins trois sources laser impulsionnelles sont nécessaires. 35 -3- L'objectif de la présente invention est de proposer un module d'excitation multi-photonique multi-couleurs pour un système d'imagerie multiphotonique, permettant d'imager simultanément au moins trois chromophores d'un échantillon, et qui ne présente pas au moins l'un des inconvénients de l'art antérieur. En particulier, un objectif de la présente invention est de proposer un module pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter efficacement et imager simultanément au moins trois chromophores d'un échantillon. Un autre but de la présente invention est de proposer un module simple et peu onéreux pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter efficacement au moins trois chromophores d'un échantillon. Un autre objectif de la présente invention est de proposer un module pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter efficacement au moins trois chromophores d'un échantillon, lesdits trois chromophores présentant des longueurs d'onde d'excitation éloignées les unes des autres, par exemple d'au moins 50 nm. Enfin, la présente invention a pour but de proposer un système d'imagerie multi-photonique comprenant un tel module, ainsi qu'un procédé 20 mis en oeuvre dans ledit module. Exposé de l'invention Cet objectif est atteint avec un module pour un système d'imagerie multi-photonique, pour exciter simultanément au moins trois chromophores 25 d'un échantillon, ledit module comprenant : - une première source laser femtoseconde, émettant un premier faisceau d'excitation sous forme d'impulsions présentant un taux de répétition 1/T et une longueur d'onde (centrale) À1 apte à exciter l'un premier des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés 30 provenant du premier faisceau d'excitation ; - une deuxième source laser femtoseconde, émettant un deuxième faisceau d'excitation sous forme d'impulsions à une longueur d'onde (centrale) À2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant du 35 deuxième faisceau d'excitation. -4- Le premier faisceau d'excitation comprend une partie dite « d'excitation » servant à exciter l'échantillon, et une partie dite « de pompage », cette partie de pompage servant de faisceau de pompe pour exciter de façon synchrone la deuxième source laser femtoseconde, de façon que la deuxième source laser soit synchrone avec la première source laser, c'est-à-dire de même taux de répétition 1/T. Le module selon l'invention comprend en outre une ligne à retard optique agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, de façon à exciter au moins un troisième des chromophores par absorption multi-photons (à deux couleurs), lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation. Pour des raisons de concision, on parle simplement d'absorption de 15 photon(s) provenant du premier faisceau d'excitation, plutôt que d'absorption de photon(s) provenant de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. On parle d'excitation « de façon synchrone », puisque l'excitation de la deuxième source laser par une partie du premier faisceau d'excitation fait en 20 sorte que les trains d'impulsions des deux faisceaux d'excitation aient la même cadence. La deuxième source laser femtoseconde est ainsi formée synchrone avec la première source laser femtoseconde. Il est ainsi possible de superposer spatialement et temporellement les 25 premier et deuxième faisceaux d'excitation. Par nature, ils sont en effet similaires, à un décalage temporel près. Ce décalage temporel peut être compensé par la ligne à retard optique. Lorsqu'on parle de superposition spatiale et temporelle, on désigne de préférence une superposition spatiale et temporelle dans l'échantillon étudié. 30 De préférence, la ligne à retard optique (on parlera simplement de « ligne à retard » dans la suite) superpose spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie restante du premier faisceau d'excitation qui n'est pas utilisée comme faisceau de pompe pour la deuxième source laser. 35 -5- La ligne à retard peut être agencée en particulier pour ajuster le chemin optique parcouru par la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, de façon à superposer ladite partie d'excitation sur le deuxième faisceau d'excitation à la sortie de la ligne à retard. Alternativement, la ligne à retard peut être agencée pour ajuster le chemin optique parcouru par le deuxième faisceau d'excitation, de façon à superposer ce faisceau sur la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, à la sortie de la ligne à retard. La ligne à retard peut comprendre des miroirs montés sur une 10 translation, afin de contrôler un décalage temporel entre le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation Puisque les premier et deuxième faisceaux d'excitation, en sortie de la ligne à retard, sont superposés spatialement et temporellement, on peut 15 exciter simultanément au moins trois chromophores par une excitation mettant en oeuvre des absorptions simultanées de photons provenant : - du premier faisceau d'excitation uniquement ; - du deuxième faisceau d'excitation uniquement ou ; - à la fois du premier et deuxième faisceau d'excitation. 20 Par conséquent, on peut également imager simultanément des signaux retour dits « de fluorescence » correspondants. On peut ainsi suivre une évolution à l'échelle inférieure à la milliseconde, des signaux retour provenant par exemple d'échantillons biologiques. 25 Puisque seules deux sources laser sont nécessaires pour imager simultanément au moins trois chromophores, le module selon l'invention est peu onéreux. La ligne à retard supplémentaire n'implique pas de réels surcoûts puisqu'il s'agit d'un élément optique courant du commerce. Puisque les au moins trois chromophores respectifs peuvent être 30 excités par absorption multi-photons de plusieurs photons provenant : - du premier faisceau d'excitation uniquement ; - du deuxième faisceau d'excitation uniquement ou ; - à la fois du premier et deuxième faisceau d'excitation ; il est possible d'exciter des chromophores présentant des longueurs 35 d'onde d'absorption très variées (par exemple au moins 50 nm entre deux -6- longueurs d'onde d'excitation) en fonction du choix de la première et la deuxième source laser. On peut par exemple imager rapidement et efficacement des tissus marqués avec plusieurs protéines fluorescentes dont les émissions vont du bleu au rouge. Une source femtoseconde (fs) produit des impulsions ultra-courtes dont la durée est généralement de l'ordre de quelques quelques centaines de fs (1 fs = 10-15 secondes). L'excitation simultanée des chromophores permet également leur détection simultanée. On peut ainsi imager les au moins trois chromophores appartenant à un échantillon dans lequel se produisent des mouvements rapides, présents à l'échelle de la seconde, sans être affecté par ces mouvements lors d'une comparaison des images ou signaux obtenus pour chaque chromophore. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, des moyens de séparation sont agencés en amont de la deuxième source laser femtoseconde, pour séparer le premier faisceau d'excitation en la partie d'excitation et la partie de pompage. Les ternes « amont » et « aval » font référence au sens de propagation 20 du premier faisceau d'excitation. Les moyens de séparation peuvent comprendre un miroir dichroïque, pour séparer : - d'une part, la partie de pompage du premier faisceau d'excitation ; - d'autre part la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. 25 Le terme « séparer » utilisé ne présuppose en aucun cas des directions de propagation de la partie de pompage d'une part et de la partie d'excitation d'autre part. La ligne à retard peut alors comprendre en particulier un élément de réunion tel qu'un miroir dichroïque, agencé en aval de la deuxième source 30 laser femtoseconde, pour replacer le faisceau d'excitation retardé sur le même chemin optique que le faisceau d'excitation non retardé. La ligne à retard est agencée de préférence à l'extérieur de la deuxième source laser femtoseconde. -7- On peut également considérer que la partie d'excitation et la partie de pompage du premier faisceau d'excitation sont au moins partiellement confondues. Le premier faisceau d'excitation traverse la deuxième source laser femtoseconde, faisant alors office de faisceau de pompage. En sortie, il est au moins partiellement réutilisé en tant que faisceau d'excitation. Dans ce cas, on peut s'affranchir desdits moyens de séparation. La ligne à retard peut alors être située directement à l'intérieur de la deuxième source laser femtoseconde. Alternativement, la ligne à retard peut être en aval de la deuxième source laser femtoseconde, Dans ce cas, on doit prévoir des moyens pour séparer le premier faisceau d'excitation et le deuxième faisceau d'excitation, en sortie de la deuxième source laser. L'un des deux faisceaux d'excitation est amené à la ligne à retard. Ensuite, on recombine les deux faisceaux d'excitation. De préférence, la première source laser femtoseconde est formée par un oscillateur, par exemple un laser Titane Saphir (TiS) ou un laser à fibre. Ce type de laser femtoseconde possède un large spectre d'émission dans le proche infrarouge, souvent centré vers 800 nm. La deuxième source laser femtoseconde peut être formée par un oscillateur paramétrique optique (OPO). Un oscillateur paramétrique optique est une source mettant en oeuvre des interactions optiques non-linéaires à partir d'un signal de pompe formé ici par une partie du premier faisceau d'excitation, émis par la première source laser femtoseconde. Un avantage des OPO est qu'ils donnent accès à des longueurs d'onde difficilement atteignables (de longueur d'onde supérieure à 1000 nm) avec d'autres types de sources laser. L'OPO étant pompé par le premier faisceau d'excitation femtoseconde, il peut émettre à son tour un deuxième faisceau d'excitation lui aussi femtoseconde. De préférence, le module selon l'invention est adapté pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en 35 unité de longueur d'onde. -8- Chaque signal retour présente un pic centré sur une longueur d'onde qui est celle prise en compte pour mesurer ledit espacement d'au moins 50 nm. Le module selon l'invention peut comprendre en outre au moins un télescope agencé pour mettre en oeuvre un recouvrement spatial, dans l'échantillon, du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. L'au moins un télescope est agencé de préférence sur le chemin optique 10 de l'un parmi le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. Par exemple, le télescope peut faire partie de la ligne à retard. Avantageusement, on peut prévoir un télescope sur le chemin optique du deuxième faisceau d'excitation seul, et un télescope sur le chemin optique 15 de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation seule. Le deuxième et le premier faisceau d'excitation présentent des longueurs d'onde différentes. En l'absence de mesure particulière et lorsque ces longueurs d'ondes sont très éloignées l'une de l'autre (par exemple plus de 300 nm), ils pourraient être focalisés chacun à une profondeur différente 20 dans l'échantillon. On ne réaliserait alors pas de recouvrement spatial des deux faisceaux d'excitation dans l'échantillon. On ne pourrait donc pas obtenir un signal retour correspondant à l'absorption d'au moins un photon du premier signal d'excitation et au moins un photon du deuxième signal d'excitation. 25 L'au moins un télescope permet en particulier de contrôler indépendamment les tailles et les divergences relatives du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. On peut ainsi corriger un éventuel décalage du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, dans l'axe de la 30 profondeur de l'échantillon. Selon un mode de réalisation avantageux du module selon l'invention : - la première source laser femtoseconde émet un premier faisceau d'excitation à une longueur d'onde (centrale) À1 apte à exciter l'un -9- premier des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation; - la deuxième source laser émet un deuxième faisceau d'excitation à une longueur d'onde (centrale) À2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation; et - la ligne à retard optique est agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, de façon à exciter un troisième des chromophores par absorption à deux photons, les deux photons provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation. On met ainsi en oeuvre des phénomènes d'absorption à deux photons (on parle aussi de « 2PEF » pour « fluorescence excitée à 2 photons »), qui 15 sont les plus couramment utilisés en particulier dans le domaine de la microscopie multi-photonique. Ce mode de réalisation n'est pas limitatif, et on pourra par exemple envisager également la mise en oeuvre de phénomènes d'absorption à trois photons (on parle aussi de « 3PEF » pour « fluorescence excitée à 3 20 photons »). L'invention concerne également un système d'imagerie multi-photonique comprenant un module selon l'invention, et comprenant en outre des moyens de détection à au moins trois canaux, chaque canal étant agencé pour 25 détecter un signal retour respectif associé à une absorption multi-photons correspondante. Le nombre de canaux dépend du nombre de chromophores détectés (l'expression « nombre de chromophores » désigne un nombre de types de chromophores). Le nombre de chromophores pouvant être détectés dépend 30 lui-même du nombre de photons mis en oeuvre par l'absorption multi-photons (on considère que chaque chromophore peut être excité par une longueur d'onde distincte). Pour une absorption à deux photons, trois combinaisons sont possibles (photons A-A, photons B-B, photons A-B) donc le système selon l'invention comprend trois canaux. Pour une absorption à trois photons, 35 quatre combinaisons sont possibles (photons A-A-A, photons A-A-B, photons -10- A-B-B, photons B-B-B) donc le système selon l'invention comprend quatre canaux. Puisque la détection des différents signaux retour est simultanée, dans le cas où la largeur spectrale d'un canal est telle qu'il détecte aussi une partie d'un signal retour spectralement voisin, on peut traiter les signaux reçus par chacun des canaux de façon à séparer pour chaque canal un signal retour dédié et un signal retour parasite correspondant au signal retour dédié à un canal spectralement voisin. Selon un mode de réalisation préféré du système d'imagerie multi- photonique selon l'invention, celui-ci comprend en particulier des moyens de détection à trois canaux, - un premier canal correspondant à une première absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation ; - un deuxième canal correspondant à une deuxième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation ; et - un troisième canal correspondant à une troisième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation. De préférence, le système d'imagerie multi-photonique selon l'invention forme un système parmi : - un endoscope ; - un microscope ; - un microscope à balayage point-par-point ; - un microscope à éclairage multi-points ; - un microscope à éclairage à nappe de lumière ; - un système d'imagerie macroscopique. On voit donc que l'invention n'est pas limitée à une application en particulier, mais peut être appliquée à diverses géométries d'imagerie multiphotonique. L'invention concerne également un procédé mis en oeuvre dans un module selon l'invention. Selon ce procédé, on ajuste le réglage de la ligne à retard de façon à superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation , en détectant l'apparition d'un signal retour correspondant à l'excitation d'au moins un troisième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation. En effet l'excitation dudit au moins troisième des chromophores suppose une absorption simultanée par ledit chromophore d'au moins un photon provenant du premier faisceau d'excitation et d'au moins un photon provenant de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. Il faut donc pour cela que le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation soient superposés spatialement et temporellement. Le réglage de la ligne à retard est donc particulièrement simple à mettre en oeuvre. Selon un mode de réalisation privilégié du procédé selon l'invention, ce procédé met en oeuvre des absorptions à deux photons, et on détecte trois signaux retour correspondant respectivement à : - une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation ; - une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation ; et - une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation. Dans ce mode de réalisation privilégié, on peut ajuster l'intensité relative du signal retour correspondant à une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation, en ajustant le réglage de la ligne à retard. En effet, selon que le deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation soient parfaitement ou non 35 superposés spatialement et temporellement, la probabilité d'absorptions -12- simultanées d'un photon de chacun des deux faisceaux d'excitation est plus ou moins élevée. Il s'ensuit que l'intensité du signal retour correspondant est plus ou moins élevée. On peut donc ajuster l'intensité dudit signal retour sans modifier les intensités des deux autres signaux retour correspondant respectivement à l'absorption de deux photons du premier signal d'excitation ou deux photons du deuxième signal d'excitation. En particulier, dans ce même mode de réalisation privilégié, on peut ajuster indépendamment l'intensité relative des trois signaux retour en ajustant respectivement : - l'intensité de sortie de la première source laser femtoseconde ; - l'intensité de sortie de la deuxième source laser femtoseconde ; et - le réglage de la ligne à retard. On voit donc que le mode de réalisation de l'invention associé à des 15 absorptions à deux photons est particulièrement avantageux, puisqu'il permet ces ajustements indépendants de chacun des signaux retours. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés 20 d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en unité de longueur d'onde. Description des figures et modes de réalisation D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la 25 lecture de la description détaillée de mises en oeuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés suivants : - la figure 1 illustre un mode de réalisation de module et de système selon l'invention ; - la figure 2 illustre les premiers et deuxième faisceaux d'excitation en 30 l'absence de ligne à retard mettant en oeuvre leur superposition spatiale et temporelle ; - les figures 3A à 3D illustrent les absorptions multi-photons mises en oeuvre dans un mode de réalisation de module et de système selon l'invention ; -13- - la figure 4 illustre des spectres d'excitation de différentes protéines fluorescentes ; - les figures 5A et 5B illustrent différentes acquisitions pouvant être obtenues grâce aux module et système selon l'invention ; - la figure 6 illustre des spectres d'excitation de différentes protéines fluorescentes, et les largeurs spectrales de détection des canaux de détection associés ; - la figure 7 illustre des signaux retour acquis dans un système selon l'invention, en faisant varier un retard temporel entre les premier et deuxième 10 faisceaux d'excitation ; et - les figures 8A à 8D illustrent un test de recouvrement spatial optimal entre le premier et le deuxième faisceau d'excitation. On va tout d'abord décrire, en référence à la figure 1, un premier mode 15 de réalisation de module 1 pour un système d'imagerie multi-photonique100. Dans toute la suite, on développera l'exemple d'un module 1 selon l'invention, pour imager simultanément trois chromophores d'un échantillon grâce à des absorptions à deux photons. Cependant, cet exemple n'est nullement limitatif et on pourra prévoir de mettre en oeuvre le module et le 20 système d'imagerie selon l'invention dans le cadre d'absorption à trois photons au moins, en vue d'imager simultanément quatre chromophores au moins d'un échantillon. Lorsqu'on parle d'un chromophore, on désigne une substance donnée (et non une molécule individuelle). 25 Le module 1 selon l'invention comprend un oscillateur titane : saphir 2 (Ti : S) émettant un premier faisceau d'excitation 20 à une longueur d'onde À1 égale à 820 nm. L'oscillateur titane : saphir 2 est un laser femtoseconde, c'est-à-dire émettant un signal pulsé dont les impulsions présentent une 30 largeur de l'ordre de la dizaine voir la centaine de femtosecondes. La longueur d'onde d'émission À1 de cet oscillateur est choisie notamment pour pouvoir exciter par absorption multi-photons au moins un chromophore d'un échantillon à étudier. L'oscillateur titane : saphir 2 (Ti : S) doit être excité par une diode d'excitation. Le module 1 selon l'invention ne comprend qu'une 35 unique diode d'excitation. -14- Une partie du premier faisceau d'excitation 20 est amenée jusqu'à un oscillateur paramétrique optique (OPO) 3 pour servir de faisceau de pompe. Un miroir dichroïque 41 agencé à 45° (angle en degrés où 180° vaut n radians) sur le chemin optique du premier faisceau d'excitation 20 en amont de l'OPO sépare d'une partie cette partie dite « de pompage » du premier faisceau d'excitation, et d'autre par une partie dite « d'excitation » du premier faisceau d'excitation. L'oscillateur paramétrique optique (OPO) 3 émet alors un deuxième faisceau d'excitation 30 à une longueur d'onde À2 égale à 1180 nm. La longueur d'onde d'émission À2 de cet oscillateur est choisie notamment pour pouvoir exciter par absorption multi-photons au moins un chromophore de l'échantillon à étudier. Les deux longueurs d'onde d'émission À1 et À2 de ces oscillateurs sont choisies notamment pour pouvoir exciter par absorption multi-photons 15 mélangeant ces deux longueurs d'onde, au moins un chromophore de l'échantillon à étudier. Le miroir dichroïque 41 agencé à 45° sur le chemin optique du premier faisceau d'excitation 20 dirige la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation vers une ligne à retard 4 du module 1 selon l'invention. 20 La ligne à retard 4 comprend au moins deux réflecteurs 42 définissant un chemin optique supplémentaire pour la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation 20. La ligne à retard comprend en outre un deuxième miroir dichroïque 43, agencé pour replacer sur le même chemin optique le deuxième faisceau 25 d'excitation 30 et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation 20. Le miroir dichroïque 43 est agencé à 45° sur le chemin optique du deuxième faisceau d'excitation et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation. Le deuxième faisceau d'excitation traverse le miroir dichroïque 43 sans être dévié. La partie d'excitation du premier faisceau d'excitation est 30 dévié à 90° par le miroir dichroïque 43. Dans toute la suite de la description des figures, et pour des raisons de concision, on appellera simplement « premier faisceau d'excitation 20 » la partie du premier faisceau d'excitation 20 qui a été amenée vers la ligne à retard 4. -15- Sur la figure 1, et pour des raisons de lisibilité de la figure, le deuxième faisceau d'excitation 30 et le premier faisceau d'excitation 20 ne sont pas superposés. En réalités, ces deux faisceaux sont bien évidement superposés spatialement. On peut prévoir des éléments optiques tels qu'un télescope 90 à l'intérieur de la ligne à retard 4, afin d'assurer un recouvrement spatial des impulsions, en contrôlant la taille et la divergence de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, indépendamment du deuxième faisceau d'excitation. Dans l'exemple représenté à la figure 1, un deuxième télescope 90' est également agencé sur le chemin optique du deuxième faisceau d'excitation seul, en amont du deuxième miroir dichroïque 43. Chaque télescope 90, 90' permet d'ajuster de façon indépendante la divergence de chaque faisceau d'excitation, et de préférence de façon 15 indépendante également la taille de ces faisceaux. On peut utiliser par exemple des télescopes à trois ou quatre lentilles. On pourrait aussi imaginer que ces systèmes de conditionnement des faisceaux soient basés sur des éléments d'optique active ou adaptative. 20 L'invention consiste à superposer dans l'espace et dans le temps au moins deux trains d'impulsions de longueurs d'onde différentes (premier et deuxième faisceaux d'excitation), dans un système d'imagerie multiphotonique tel qu'un microscope multi-photonique. Grâce à une telle superposition, différents types de chromophores d'un 25 échantillon peuvent émettre simultanément un signal de fluorescence en réponse à l'absorption respectivement de deux photons du premier train d'impulsion, de deux photons du deuxième train d'impulsion, ou de deux photons provenant chacun de l'un des deux trains d'impulsion. 30 On va maintenant décrire, toujours en référence à la figure 1, les éléments du système d'imagerie multi-photonique100 selon l'invention, outre le module 1 qui vient d'être décrit. En sortie deuxième miroir dichroïque 43, les premier et deuxième faisceaux d'excitation 20, 30 sont dirigés vers des moyens de balayage 5 dans -16- le plan (xOy), puis des moyens de balayage 6 selon l'axe (Oz) correspondant à l'axe de la profondeur d'un échantillon 7. Les moyens de balayage 6 comprennent également des optiques de focalisation pour focaliser les signaux d'excitation à un endroit voulu dans l'échantillon 7. L'échantillon 7 comprend au moins trois chromophores émettant un signal de fluorescence en réponse à l'absorption : - de deux photons à 820 nm ; - de deux photons à 1180 nm ; ou - d'un photon à 820 nm et un photon à 1180 nm. Les différents signaux de fluorescence sont émis en réflexion. Un miroir dichroïque 80 les dévie vers un étage de détection comprenant un canal respectif 81, 81', 81" pour chacun des trois signaux de fluorescence 82, 82', 82 On peut ainsi détecter à la fois les signaux produits par un oscillateur pris individuellement, et le signal produit par mélange de fréquence entre ces deux oscillateurs. On peut ainsi, avec une chaîne d'excitation comportant deux lasers synchronisés, exciter simultanément trois types de chromophores spectralement très distincts. On peut parler notamment d'imagerie multiphotons multi-couleurs par impulsions synchronisées, ou d'imagerie multiphotons multi-couleurs par combinaison de fréquences. On peut notamment imager simultanément trois signaux de protéines fluorescentes bleues, jaunes, et rouges ou bleues, vertes, et rouges. La figure 2 permet d'illustrer le principe mis en oeuvre selon l'invention. La figure 2 illustre les trains d'impulsion en fonction du temps, et en l'absence de ligne à retard 4, du premier faisceau d'excitation 20 (traits épais) et du deuxième faisceau d'excitation 30 (traits pointillés). La ligne à retard permet en particulier d'annuler l'écart temporel At entre les deux trains d'impulsions. On voit que l'invention permet d'exciter simultanément : - (voir figure 3A) un chromophore absorbant deux photons du premier faisceau d'excitation 20, produisant un signal retour à la longueur d'onde 35 À,12, soit 410 nm (bleu) dans l'exemple développé ici ; -17- - (voir figure 3C) un chromophore absorbant deux photons du deuxième faisceau d'excitation 30, produisant un signal retour à la longueur d'onde À2/2, soit 590 nm (rouge) dans l'exemple développé ici ; - (voir figure 3B) un chromophore absorbant un photon du premier 5 faisceau d'excitation 20 et un photon du deuxième faisceau d'excitation 30, produisant un signal retour à la longueur d'onde 1 1 1 , soit 484 nm (jaune) dans l'exemple développé ici, ce qui correspondrait à une absorption de deux photons d'un faisceau d'excitation central à la longueur d'onde 968 nm. On parle dont ici d'un troisième faisceau d'excitation, virtuel. 10 La figure 3D illustre les signaux d'excitation utilisés, notamment le signal d'excitation virtuel recréé artificiellement grâce à l'invention. L'axe des abscisses correspond à une longueur d'onde en nm, l'axe des ordonnées à une intensité en unité arbitraire. 15 La figure 4 illustre sur un axe des abscisses correspondant à une longueur d'onde exprimée en nm (nanomètres) : - le spectre d'excitation (axe des ordonnées en unité arbitraire, correspondant à une puissance absorbée) de différentes protéines fluorescentes ; et 20 - les signaux d'excitation (axe des ordonnées en unité arbitraire, correspondant à une intensité lumineuse), notamment le signal d'excitation virtuel recréé artificiellement grâce à l'invention. On voit que les signaux d'excitation obtenus artificiellement ou non selon l'invention correspondent à des pics d'absorption de plusieurs protéines 25 fluorescentes qui vont ainsi pouvoir être imagées grâce à un module 1 et un système d'imagerie multi-photonique100 selon l'invention. La courbe 401 correspond à une protéine eCFP (pour « Enhanced Cyan Fluorescent Protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » bleu cyan). 30 La courbe 402 correspond à une protéine eYFP (pour « Enhanced Yellow Fluorescent Protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » jaune). -18- La courbe 403 correspond à une protéine tdTomato (une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » rouge vif). La courbe 404 correspond à une protéine mCherry (une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » rouge cerise). On a pu par exemple imager un tissu cérébral de souris marqué par ces différentes protéines. On peut parler de « technique brainbow » pour désigner cette technique de marquage. Chaque longueur d'onde d'excitation (notamment la longueur d'onde dite « virtuelle » et correspondant audit signal d'excitation central) peut exciter plusieurs types de chromophores différents. Cela apparaît ici pour le signal à 1100 nm qui correspond à un maximum d'absorption à la fois pour les protéines mCherry et tdTomato. On peut citer dans le tableau ci-dessous différents groupes de trois 15 chromophores pouvant être imagés simultanément grâce à un module 1 et un système d'imagerie multi-photonique 100 selon l'invention. Les noms des chromophores sont indiqués entre parenthèses, séparés par des virgules lorsque plusieurs chromophores peuvent être utilisés. Longueur d'onde du Longueur d'onde du Longueur d'onde du premier faisceau deuxième faisceau signal d'excitation d'excitation (À1) d'excitation (À2) virtuel recréé artificiellement grâce à l'invention (À c) 880 nm 1000 nm 1150 nm (mTFP1, Dendra2 Green) (Dendra2 Red) (mKate2) 760 nm 900 nm 1100 nm (DAPI) (mTFP1) (mCherry) 850 nm 950 nm 1080 nm (CFP) (GFP, YFP) (mRFP, DsREd, tTomato) 20 On va maintenant décrire en référence aux figure 5A et 5B un procédé de réglage de la ligne à retard 4 selon l'invention. -19- On voit à la figure 1 que les réflecteurs 42 de la ligne à retard 4 peuvent être montés sur une translation motorisée, de façon à pouvoir ajuster le réglage de ladite ligne à retard pour superposer au mieux les deux faisceaux d'excitation 20, 30. Le contrôle du retard induit par la ligne à retard 4 sur le premier faisceau d'excitation 20 fournit également un moyen d'ajuster l'intensité lumineuse du signal retour obtenu par mélange de fréquence (absorption de deux photons, l'un provenant du premier faisceau d'excitation et l'autre provenant du deuxième faisceau d'excitation), indépendamment des signaux retour ne dépendant que d'un seul faisceau d'excitation. En outre, l'existence d'un troisième signal retour obtenu par mélange de fréquence confirme que les premier et deuxième signaux d'excitation sont spatialement et temporellement superposés avec une précision égale à la résolution du système d'imagerie multi-photonique100. On voit donc que l'invention offre un « test d'alignement » particulièrement simple à mettre en oeuvre. Le contrôle de la puissance moyenne des deux faisceaux d'excitation permet en outre de contrôler les intensités relatives des trois signaux retour. Les intensités des signaux retour dits de fluorescences sont en effet respectivement, proportionnelles à : - P12, où P1 est la puissance moyenne de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation 20 (absorption de deux photons du premier faisceau d'excitation) ; - P22, où P2 est la puissance moyenne du deuxième faisceau d'excitation 30 (absorption de deux photons du deuxième faisceau d'excitation) ; - 21D1P2g(T) où est le délai entre les deux trains d'impulsions respectivement du premier et du deuxième faisceau d'excitation, en aval de la ligne à retard (absorption de deux photons, l'un de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation), et g est la fonction d'inter-corrélation temporelle des deux faisceaux d'excitation, proportionnelle à exp(-r2) dans le cas des faisceaux d'excitation à profils temporels gaussiens. Ce principe est illustré aux figures 5A et 5B qui présentent chacune de droite à gauche : -20- - l'image obtenue grâce au signal retour correspondant à une absorption de deux photons du premier faisceau d'excitation ; - l'image obtenue grâce au signal retour correspondant à une absorption de deux photons, l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième 5 faisceau d'excitation ; et - l'image obtenue grâce au signal retour correspondant à une absorption de deux photons du deuxième faisceau d'excitation. L'échantillon imagé est un drosophile avec un triple marquage fluorescent bleu, vert et rouge. 10 A la figure 5A, les impulsions du premier et du deuxième faisceau d'excitation sont parfaitement synchronisées par la ligne à retard (r = 0 fs). L'image centrale montre alors la présente d'un fort signal retour correspondant à une absorption de deux photons l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation. 15 A la figure 5B, les impulsions du premier et du deuxième faisceau d'excitation sont non parfaitement synchronisées (r = 350 fs). L'image centrale montre alors la présente d'un très faible signal retour correspondant à une absorption de deux photons l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation. 20 On peut également utiliser ce résultat pour compenser des effets d'interférence dits de « cross talk » entre le premier et le deuxième faisceau d'excitation, et qui tendent à diminuer l'intensité relative du signal retour correspondant à une absorption de deux photons, l'un du premier faisceau d'excitation et l'autre du deuxième faisceau d'excitation. 25 On peut également utiliser ce principe pour maintenir constantes au cours du temps les intensités absolues des trois signaux de retour tels que détectés, lors d'un balayage en profondeur d'un échantillon (faisant par conséquent varier un coefficient d'atténuation des faisceaux d'excitation et des signaux retour). 30 Les acquisitions sont obtenues avec des pixels de dimensions 0,8*0,8*3 pm3. On réalise par exemple des images en trois dimensions grâce à un balayage dans le sens de la profondeur de l'échantillon, par exemple une image en trois dimensions toutes les 45 secondes. 35 -21- La figure 6 présente un avantage supplémentaire d'une détection simultanée multi-canal. L'axe des abscisses correspond à une longueur d'onde en nm. L'axe des ordonnées correspond à une intensité de signal retour, en unité arbitraire. Les courbes 601, 602 et 603 correspondent à des spectres de signal retour. La courbe 601 correspond à une protéine endo émettant un signal retour dit « de fluorescence » bleu). La courbe 602 correspond à une protéine GFP (pour « green fluorescent protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit « de fluorescence » vert. La courbe 603 correspond à une protéine RFP (pour « red fluorescent protein », c'est-à-dire une protéine émettant un signal retour dit « de 15 fluorescence » rouge. Les créneaux en pointillés 611, 612, 613 correspondent respectivement : - à la largeur spectrale détectée par le canal de détection dédié au signal de retour bleu ; - à la largeur spectrale détectée par le canal de détection dédié au signal 20 de retour vert ; - à la largeur spectrale détectée par le canal de détection dédié au signal de retour rouge. L'émission étant simultanée, la détection l'est également. On peut donc, pour chaque canal (ici plus particulièrement pour le canal correspondant 25 au créneau 612), séparer les contributions des différents signaux retour. Pour séparer les contributions de deux chromophores A et B dans des canaux Cl et C2, on résout l'équation linéaire suivante : /C1\ (11(A C 2 ) RA2 RB2/ B/ , où - RA1, respectivement RA2, est la contribution normalisée (connue) du 30 chromophore A dans le canal Cl respectivement C2, et - RB1, respectivement RB2, est la contribution normalisée (connue) du chromophore A dans le canal Cl respectivement C2, - Cl et C2sont des intensités mesurées. -22- - A et B sont des intensités à déterminer. La figure 7 illustre les signaux retour 404, 401 et 402 de la figure 4. L'axe des abscisses correspond au retard r en femtosecondes entre le 5 deuxième faisceau d'excitation et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, en sortie de la ligne à retard. L'axe des ordonnées correspond à l'intensité en unité arbitraire. Comme vu précédemment, on illustre ainsi le fait que l'apparition d'un signal retour supplémentaire (correspondant à une absorption multi-photons 10 de photons provenant à la fois du premier et du deuxième faisceau d'excitation) indique un réglage optimal du recouvrement temporel entre les premier et deuxième faisceaux d'excitation. Les figures 8A à 8D illustrent plus particulièrement un test de 15 recouvrement spatial optimal entre le deuxième faisceau d'excitation, et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation, en aval de la ligne à retard. On se place dans l'exemple particulier d'une absorption à deux photons avec émission : - d'un signal retour rouge correspondant à l'absorption de deux photons 20 du même faisceau d'excitation ; - d'un signal retour bleu correspondant à l'absorption de deux photons du même faisceau d'excitation ; et - le cas échéant d'un signal retour vert correspondant à l'absorption d'un photon du premier signal d'excitation et un photon du deuxième signal 25 d'excitation. La figure 8A illustre les zones de focalisation 81 et 82 respectivement du premier et du deuxième faisceau d'excitation, lorsque le recouvrement spatial n'est pas réalisé entre ces deux faisceaux. La figure 8B montre l'image obtenue dans ce cas. On obtient deux 30 signaux distincts, l'un rouge et l'autre bleu. La figure 8C illustre les zones de focalisation 181 et 182 respectivement du premier et du deuxième faisceau d'excitation, lorsque le recouvrement spatial est réalisé entre ces deux faisceaux. -23- La figure 8D montre l'image obtenue dans ce cas. On obtient un seul signal blanc, correspondant à la superposition trois signaux distincts, rouge, bleu et vert. On voit ainsi que l'observation de l'image obtenue permet de régler de 5 façon optimale le recouvrement spatial entre le premier et le deuxième faisceau d'excitation. Selon l'art antérieur, on acquiert successivement le signal retour bleu et le signal retour rouge, puis on superpose sur une même image les images correspondantes à ces signaux. Cependant, en raison d'éventuelles 10 aberrations chromatiques des optiques de focalisation 6, les images correspondant respectivement au signal rouge et au signal bleu peuvent être déformées et déformées différemment, en particulier en bord de champ de vision (ces déformations proviennent de l'impact, sur les signaux d'excitation correspondant, des aberrations chromatiques que présentent les optiques de 15 focalisation 6). En pratique, on se place au centre du champ de vision. Ensuite on annule, en réglant les télescopes 90 et 90', un décalage entre la distance de focalisation du premier signal d'excitation et celle du deuxième signal d'excitation. Pour cela, on cherche à détecter un signal bleu et un signal rouge provenant d'un même plan de focalisation (les deux signaux 20 correspondant chacun à une absorption multi-photons de plusieurs photons provenant du même signal d'excitation). Ensuite, on annule le décalage temporel entre les deux signaux d'excitation, grâce à la ligne à retard. L'apparition d'un troisième signal correspondant à une absorption multi-photons d'au moins un photon du 25 premier signal d'excitation et au moins un photon du deuxième signal d'excitation indique quand ce décalage est annulé. Pour cette étape, on observe toujours les signaux retour au centre du champ de vision, là où ils ne sont pas déformés par des aberrations chromatiques. En peut enfin vérifier en bord de champ de vision à partir de quel angle 30 les aberrations chromatiques des optiques de focalisation deviennent gênantes pour un bon recouvrement des deux signaux d'excitation, en utilisant le test illustré par les figures 8A à 8D. Plus précisément, on s'éloigne petit à petit du centre du champ de vision et on repère la disparition du troisième signal retour. -24- Grâce à l'invention, on obtient une image finale regroupant les différents signaux retour bien plus proche de la réalité. En effet, l'absence du troisième signal retour montre que l'on a atteint une zone du champ de vision correspondant à des images rouges et bleues déformées. On peut donc supprimer cette partie du signal retour et ne conserver que le signal retour non affecté par des aberrations chromatiques. Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples 10 sans sortir du cadre de l'invention. En particulier toutes les caractéristiques, formes, variantes et modes de réalisation décrits précédemment sont combinables entre eux selon diverses combinaisons dans la mesure où ils ne sont pas incompatibles ou exclusifs les uns des autres. REVENDICATIONS1. Module (1) pour un système d'imagerie multi-photonique (100), pour exciter simultanément au moins trois chromophores d'un échantillon, ledit module (1) comprenant : - une première source laser femtoseconde (2), émettant un premier faisceau d'excitation (20) sous forme d'impulsions présentant un taux de répétition 1/T et une longueur d'onde À1 apte à exciter l'un premier des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation ; - une deuxième source laser femtoseconde, émettant un deuxième faisceau d'excitation (30) sous forme d'impulsions à une longueur d'onde À2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation ; caractérisé en ce que : - le premier faisceau d'excitation (20) comprend une partie dite « d'excitation » servant à exciter l'échantillon, et une partie dite « de pompage », cette partie de pompage servant de faisceau de pompe pour exciter de façon synchrone la deuxième source laser femtoseconde (3) , de façon que la deuxième source laser soit synchrone avec la première source laser (3), c'est-à-dire de même taux de répétition 1/T, et - une ligne à retard optique (4) est agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation ( 30) et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20), de façon à exciter au moins un troisième des chromophores par absorption multi-photons, lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation (20, 30). 2. Module (1) selon la revendication 1, caractérisé par des moyens de séparation (41) agencés en amont de la deuxième source laser femtoseconde (3), pour séparer le premier faisceau d'excitation (20) en la partie d'excitation 35 et la partie de pompage.-26- 3. Module (1) selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la première source laser femtoseconde (2) est formée par un laser Titane Saphir (TiS) ou un laser à fibre. 4. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la deuxième source de laser femtoseconde (3) est formée par un oscillateur paramétrique optique (0P0). 5. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est adapté pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en unité de longueur d'onde. 6. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que qu'il comprend en outre au moins un télescope agencé pour mettre en oeuvre un recouvrement spatial, dans l'échantillon, du deuxième faisceau d'excitation (30) et de la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20). 7. Module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que - la première source laser femtoseconde (2) émet un premier faisceau d'excitation (20) à une longueur d'onde À1 apte à exciter l'un premier des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation; - la deuxième source laser femtoseconde (3) émet un deuxième faisceau d'excitation (30) à une longueur d'onde À2 apte à exciter l'un deuxième des chromophores par absorption à deux photons, lesdits photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation; et - la ligne à retard optique (4) est agencée pour superposer spatialement et temporellement le deuxième faisceau d'excitation (30) et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20), de façon à exciter un troisième des chromophores par absorption à deux photons, les deux-27- photons provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30). 8. Système d'imagerie multi-photonique (100) comprenant un module (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de détection à au moins trois canaux (81, 81', 81"), chaque canal étant agencé pour détecter un signal retour respectif associé à une absorption multi-photons correspondante. 9. Système d'imagerie multi-photonique (100) selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en particulier des moyens de détection à trois canaux, - un premier canal (81 ; 81' ; 81") correspondant à une première absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation (20); - un deuxième canal (81" ; 81 ; 81') correspondant à une deuxième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation (30); et - un troisième canal (81' ; 81", 81) correspondant à une troisième absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30). 10. Système d'imagerie multi-photonique (100) selon la revendication 8 ou 25 9, caractérisé en ce qu'il forme un système parmi : - un endoscope ; - un microscope ; - un microscope à balayage point-par-point ; - un microscope à éclairage multi-points ; 30 - un microscope à éclairage à nappe de lumière ; - un système d'imagerie macroscopique. 11. Procédé mis en oeuvre dans un module selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on ajuste le réglage de la ligne à 35 retard (4) de façon à superposer spatialement et temporellement le deuxième-28- faisceau d'excitation (30) et la partie d'excitation du premier faisceau d'excitation (20), en détectant l'apparition d'un signal retour correspondant à l'excitation d'au moins un troisième des chromophores par absorption multiphotons, lesdits photons absorbés provenant des premier et deuxième faisceaux d'excitation (20, 30). 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé qu'il met en oeuvre des absorptions à deux photons et en ce que l'on détecte trois signaux retour correspondant respectivement à : - une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du premier faisceau d'excitation (20); - une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant du deuxième faisceau d'excitation (30); et - une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30). 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on ajuste l'intensité relative du signal retour correspondant à une absorption à deux photons, les deux photons absorbés provenant pour l'un du premier faisceau d'excitation (20) et pour l'autre du deuxième faisceau d'excitation (30), en ajustant le réglage de la ligne à retard (4). 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on ajuste 25 indépendamment l'intensité relative des trois signaux retour en ajustant respectivement : - l'intensité de sortie de la première source laser femtoseconde (2) ; - l'intensité de sortie de la deuxième source laser femtoseconde (3) ; et - le réglage de la ligne à retard (4). 30 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour exciter des chromophores émettant des signaux retour dits « de fluorescence » espacés d'au moins 50 nm les uns des autres, où chaque signal retour est exprimé en unité de longueur d'onde.