Brevet FR2980849A1 — publié le 20130405

La présente invention concerne le domaine médical en général, et en particulier du cancer. Plus précisément, l'invention concerne un procédé et un kit de détermination du caractère invasif et/ou de la susceptibilité de développer des métastases chez des patients atteints de cancer, et en particulier de cancer du sein ou de cancer du côlon. Le cancer constitue un problème majeur de santé publique. Des efforts importants ont été apportés concernant le diagnostic des cancers, et en particulier à des stades précoces de la maladie. Une fois le cancer diagnostiqué, il reste néanmoins important de pouvoir disposer de marqueurs permettant de déterminer le pronostic, bon ou mauvais, chez les patients atteints de cancer, en particulier pour adapter le traitement et/ou le suivi des patients. Par exemple, les patients atteints d'un cancer associé à un mauvais pronostic seront des candidats pour la mise en place d'une thérapie plus agressive, afin d'essayer de traiter préventivement le patient avant l'apparition de métastases, comme par exemple le traitement par le trastuzumab des patientes atteintes de cancer du sein présentant une surexpression de la protéine HER2 mise en évidence par immunohistochimie. Parmi les exemples de critères permettant de définir un pronostic, le caractère invasif c'est-à-dire agressif du cancer, et en particulier le risque d'invasion métastatique à distance, représentent des cibles majeures permettant d'orienter la thérapeutique des patients atteints de cancer. Un certain nombre de marqueurs cliniques et histologiques, dont des marqueurs protéiques, existent à ce jour et permettent de déterminer le pronostic d'un cancer (i.e. cancer de bon ou de mauvais pronostic), tels que l'âge du patient, la taille de la tumeur, l'envahissement ganglionnaire (absence vs. présence et/ou degré d'envahissement). Plus spécifiquement pour les cancers du sein sont utilisés le grade histopronostique de Scarff Bloom et Richardson (SBR) qui comprend trois grades I II III, obtenu par l'addition de trois critères ; architecture, atypies cytonucléaires et nombre de mitoses (les trois critères étant cotés en 1, 2 et 3), l'expression des récepteurs hormonaux (récepteurs aux oestrogènes et récepteurs à la progestérone) et l'expression de l'oncogène HER2. Plus spécifiquement pour les cancers du côlon, le critère pronostique le plus important est le stade de la maladie selon la classification TNM (Tumor, Nodes, Metastasis) où ces trois critères - taille et profondeur de la tumeur, atteinte ou non des ganglions lymphatiques et nombre de ganglions atteints, présence ou non de métastases - permettent de définir le stade du cancer selon la classification TNM. Le stade des cancers colorectaux au moment du diagnostic est généralement exprimé par un chiffre romain allant de 0 à IV (selon la classification TNM). Deux critères permettent de considérer ces cancers comme de bon pronostic : un histologique (inflammation intratumorale ou péritumorale avec follicules lymphoïdes) et un génétique (le génotype MSI (Microsatellite Instability)). Des facteurs prédictifs de la réponse au traitement pour ces cancers sont par exemple le génotype MSI (Microsatellite Instability), les mutations K-RAS et EGFR (epidermal growth factor receptor). Il existe également des marqueurs pronostics basés sur l'analyse de l'expression de plusieurs gènes (analyses transcriptomiques, exemple : signature d'expression de 70 gènes pour les cancers du sein (MammaPrint(R) (Agendia, Amsterdam,NL). Cependant, ces analyses restent longues, assez coûteuses et peuvent s'avérer complexes, voire parfois inexactes. Par exemple, une étude publiée par le groupe de Catherine Hill (Michiels S., et coll., 2005, Lancet, 365(9458):488- 492) montre que les listes de gènes identifiés comme pronostiques à partir d'études transcriptomiques sont très instables d'une étude à l'autre; les signatures moléculaires étant très dépendantes de la sélection des patients. 5/7 analyses transcriptomiques qu'ils ont étudiées classent les patients de façon aléatoire. Une autre étude (Washington University School of Medicine, St. Louis) portant sur le sous-type « normal-like» dans les cancers du sein montre qu'une signature de 50 gènes, en analyse transcriptomique, avait permis de mettre en évidence ce 5ème sous-type de cancers du sein. Cependant, les chercheurs ont montré qu'au lieu d'être le 5ème sous-type de cancers du sein, la classification "normal-like" est un indicateur de contamination d'un échantillon tumoral par du tissue normal. Cependant, il existe un réel besoin de disposer de marqueurs pronostics concernant l'agressivité, et en particulier la progression métastatique des cancers. C'est dans ce contexte que la présente invention se propose de fournir un nouveau biomarqueur pronostic, en particulier de l'agressivité, et notamment du risque de progression métastatique, dans les cancers du sein et du côlon. De plus, la présente invention trouve une application toute particulière pour le pronostic des cancers du sein considérés au moment du diagnostic comme de bon pronostic sur la base des critères classiques actuellement disponibles, et notamment considérés comme non métastatiques au diagnostic, en particulier sur la base du grade SBR, des récepteurs hormonaux, Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet un procédé d'identification d'un cancer agressif et/ou susceptible de développer des métastases chez un patient atteint de cancer du sein ou du côlon, de préférence de cancer du sein, comprenant les étapes consistant à : mesurer le niveau d'expression ou l'activité de la protéine APC11 dans un échantillon issu dudit patient, et classer le cancer comme agressif et/ou susceptible de développer des métastases lorsqu'une différence significative du niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 est mise en évidence par rapport à une valeur de référence. Ainsi, les inventeurs ont montré que la protéine APC11 (Anaphase Promoting Complex subunit 11) est un marqueur pronostic de l'agressivité et/ou du développement des métastases pour les cancers du sein ou du côlon. Le procédé selon l'invention est donc un procédé pronostic des cancers du sein et du côlon, de préférence des cancers du sein. La protéine APC11 est une ubiquitine ligase de type E3 qui possède un rôle central dans la régulation du cycle cellulaire. La mesure du niveau d'expression ou de l'activité enzymatique de la protéine APC11 selon l'invention permet en particulier d'établir un pronostic pour les cancers du sein, et tout particulièrement pour des cancers du sein qui ont été considérés comme de bon pronostic au moment du diagnostic, et notamment considérés comme non métastatiques au diagnostic. Par « cancers du sein considérés comme de bon pronostic », on entend par exemple des cancers de petite taille ( S'agissant des cancers du côlon, l'invention permet tout particulièrement d'établir un pronostic pour les cancers du côlon sans envahissement ganglionnaire. Dans le cadre de la présente demande, les termes « cancer » et « tumeur » sont utilisés indifféremment pour désigner un cancer, c'est-à-dire qu'ici le terme « tumeur » s'entend désigner une tumeur maligne c'est-à-dire cancéreuse. La mise en évidence d'une différence significative du niveau d'expression ou de l'activité de la protéine APC11 mesuré dans l'échantillon issu du patient à tester par rapport à une valeur de référence est associée à un phénotype agressif, et/ou à un risque accru de métastases, et ainsi à un mauvais pronostic pour ledit patient. De préférence, la protéine APC11 dont l'expression ou l'activité est mesurée dans le cadre du procédé de l'invention est la protéine APC11 humaine, en particulier telle que décrite par Chan, AH et coll., 2001, 3, Cell Biochem., 83 : 249-258 ou bien celle dont la séquence est enregistrée dans la base de données GenBank: AAH00607.2 GI:51574060 (18 mars 2009). La détection de la protéine APC11 peut être réalisée par n'importe quelle technique classique bien connue de l'homme du métier, parmi lesquelles on peut notamment citer le western blot, Ilmnnunohistochimie, l'immunofluorescence, l'immunoprécipitation, la technique ELISA, etc. De préférence, la protéine APC11 est détectée par immunohistochimie à l'aide d'anticorps anti-APC11. Une fois détectée, le niveau d'expression de la protéine APC11 peut également être quantifié par toute méthode de quantification ou serai-quantification classiquement utilisée dans le domaine, parmi lesquelles on peut notamment citer le western blot, la technique ELISA, etc. En particulier, la détermination du niveau d'expression ou de l'activité de la protéine est réalisée à l'aide d'outils ou de réactifs qui sont spécifiques de la protéine et qui permettent, directement ou indirectement de quantifier son niveau d'expression, comme par exemple des anticorps antiAPC11. De préférence, la quantification du niveau d'expression de la protéine APC11 est réalisée par western blot, par immunohistochimie, ou encore par immunofluorescence. Il est également possible de déterminer le pronostic selon l'invention à partir de la mesure de l'activité enzymatique de la protéine APC11. Parmi les méthodes de mesure qui peuvent être utilisées, on peut notamment citer la quantification de protéines ubiquitinylées, par exemple par Western Blot à l'aide d'un anticorps anti- ubiquitine, ou bien toute méthode de mesure d'une activité enzymatique classiquement utilisée dans le domaine et bien connue de l'homme du métier, telle que la mesure in vitro de l'activité ubiquitine ligase. Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon issu du patient à tester » ou « échantillon à tester », tout échantillon biologique susceptible de contenir la protéine APC11 et provenant du patient chez qui on souhaite déterminer l'agressivité du cancer et/ou sa susceptibilité de développer des métastases. Par conséquent, l'échantillon à tester utilisé dans le cadre du procédé selon l'invention peut être de différente nature. En particulier, l'échantillon à tester est choisi parmi les tissus de tumeurs du sein ou de tumeurs coliques, ou encore les cellules isolées à partir de ces tissus. De préférence, l'échantillon à tester issu dudit patient est un tissu, et en particulier un tissu qui est issu de la tumeur primaire, du sein ou du côlon. Le niveau d'expression ou l'activité de la protéine APC11 qui est détectée dans l'échantillon à tester est alors comparé à une valeur de référence. Dans le cadre de la présente invention, la valeur de référence peut correspondre à une valeur seuil d'expression ou d'activité ou bien au niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 mesurée dans un échantillon biologique issu d'un sujet sain, en particulier non atteint de cancer, ou bien atteint du même type de cancer mais qui n'est pas agressif ni susceptible de métastaser. La valeur de référence peut également correspondre à une valeur moyenne du niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 qui est détecté sur un pool d'échantillons tels que définis ci-dessus. Les échantillons biologiques à partir desquels peut être déterminée la valeur de référence peuvent être de différentes natures et notamment choisi parmi les échantillons biologiques qui sont mentionnés ci-dessus s'agissant de l'échantillon à tester (tissu, cellules, etc). Avantageusement, ces échantillons biologiques sont de même nature que celle de l'échantillon biologique à tester ou tout du moins d'une nature compatible pour constituer une référence quant à la détection de l'expression de la protéine APC11. En particulier, ces échantillons sont de préférence issus de personnes ayant les mêmes caractéristiques ou une majorité de caractéristiques communes, notamment du même sexe et/ou d'un âge similaire ou identique et/ou de même origine ethnique, avec celles du patient chez qui on souhaite déterminer l'agressivité du cancer, et en particulier sa susceptibilité de développer des métastases. Par exemple, de tels échantillons sont choisis parmi des tissus provenant de réductions mammaires, ou de tissus normaux de côlon prélevés à distance du tissu tumoral. Dans le cas d'une comparaison avec une valeur seuil, cette valeur peut être obtenue en déterminant le nombre ou la proportion, par exemple un pourcentage, de cellules qui expriment la protéine APC11 ou encore la quantité ou l'intensité d'expression ou d'activité de la protéine APC11 au sein d'échantillons issus de patients atteints de cancer du sein ou du côlon et dont on connait le sort ultérieur s'agissant de l'agressivité du cancer, et/ou du développement de métastases (instabilité chromosomique vs instabilité microsatellitaire pour les cancers du côlon MSI (Microsatellite Instalety), patients présentant une rechute après traitement, etc). Par exemple, la valeur seuil peut correspondre au pourcentage de cellules qui expriment la protéine APC11 détectée notamment par immunohistochimie sur des coupes de tissus de patients atteints de cancer du sein ou du côlon, et dont on connait le sort ultérieur s'agissant de l'agressivité du cancer, et/ou du développement de métastases. Dans ce cas, ce pourcentage peut notamment être estimé en microscopie photonique classique par comptage des cellules positives pour l'expression ou l'activité d'APC11 par rapport aux cellules négatives dans un champ donné. Un exemple de valeur seuil peut correspondre à 50 % de cellules positives pour la protéine APC11 détectée par immunohistochimie sur coupes de tissus de patients atteints de cancer du sein. La valeur seuil peut également correspondre à une quantité de protéine APC11 mesurée par western blot dans un échantillon de cellules provenant de patients atteints de cancer du sein ou du côlon dont on connaît le sort ultérieur. Ainsi, avant la mesure du niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 proprement dite dans l'échantillon à tester, le procédé de l'invention peut comprendre l'obtention préalable de la valeur de référence à laquelle le niveau d'expression qui sera détecté dans l'échantillon à tester pourra être comparé afin de déterminer s'il existe ou non une différence significative du niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 dans l'échantillon à tester. Selon l'invention, la mise en évidence d'une différence significative du niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 dans l'échantillon à tester par rapport à la valeur de référence est associée à l'identification d'un cancer agressif et/ou susceptible de développer des métastases, et permet ainsi de classer le cancer dont est atteint le patient testé comme un cancer de mauvais pronostic. Par « différence significative du niveau d'expression de la protéine APC11 », on entend aussi bien une diminution qu'une augmentation significative du niveau d'expression de la protéine APC11. Dans le cadre de l'invention, une diminution définit à la fois la mesure d'un niveau significativement inférieur dans l'échantillon à tester par rapport à la valeur de référence ou bien une absence dans l'échantillon à tester. Ainsi, et comme mentionné ci-dessus, la détection au sens de l'invention peut aussi bien revêtir un aspect qualitatif que quantitatif. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de l'invention permet, chez un patient atteint de cancer du sein, de classer le cancer comme susceptible de développer des métastases lorsqu'une diminution significative du niveau d'expression ou de l'activité de APC11, de préférence du niveau d'expression, est mise en évidence dans l'échantillon issu du patient à tester par rapport à la valeur de référence. De préférence, une telle diminution est d'au moins %, d'au moins 25 %, d'au moins 50 %, d'au moins 75 %, de 100 % de l'expression ou de l'activité de APC11, de manière encore préférée d'au moins 50 par rapport à la valeur de référence. En particulier, le procédé de l'invention permet de classer un cancer du sein comme susceptible de développer des métastases 15 lorsque moins de 50 % des cellules expriment la protéine APC11, de préférence mise en évidence par imrnunohistochimie à l'aide d'anticorps anti-APC11. Le procédé de l'invention permet de manière avantageuse d'identifier un cancer du sein susceptible de développer des métastases chez une patiente atteinte d'un cancer du sein qui avait été considérée comme de bon pronostic au moment du diagnostic, et en particulier considéré comme non susceptible de développer des métastases. Le procédé de l'invention permet également de considérer une patiente comme atteinte d'un cancer du sein susceptible de développer des métastases indépendamment du statut des récepteurs hormonaux de cette patiente, c'est-à-dire que celui-ci soit positif ou négatif. En particulier, la présente invention permet d'identifier un cancer du sein susceptible de développer des métastases chez un patient atteint d'un cancer du sein de type luminal A, qui est un type de cancer caractérisé par l'expression positive des récepteurs hormonaux (récepteurs aux oestrogènes et/ou récepteurs à la progestérone) et considéré comme de bon pronostic. Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention permet, chez un patient atteint de cancer du côlon, de classer le cancer comme agressif lorsqu'une augmentation significative du niveau d'expression ou de l'activité de la protéine APC11, de préférence du niveau d'expression, est mise en évidence dans l'échantillon issu du patient à tester par rapport à la valeur de référence. De préférence, une telle augmentation est d'au moins 15 %, d'au moins 25 %, d'au moins 50 %, d'au moins 75 %, de 100 % de l'expression d'APC11, de manière encore préférée d'au moins 50 %, par rapport à la valeur de référence. Le procédé de l'invention permet de manière avantageuse d'identifier un cancer du côlon agressif chez un patient lorsque ledit patient est atteint d'un cancer du côlon sans envahissement ganglionnaire. Tous les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus peuvent être combinés indifféremment entre eux dans le cadre de l'invention. Selon un deuxième aspect, la présente invention a également pour objet l'utilisation de la mesure du niveau d'expression ou de l'activité d'APC11 en tant que biomarqueur pronostic des cancers du sein et du côlon. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure du niveau d'expression ou de l'activité d'APC11 est utilisée de préférence en tant que biomarqueur pronostic des cancers du sein, et en particulier des cancers du sein considérés comme de bon pronostic au moment du diagnostic, et de manière encore préférée considérés comme non métastatiques au diagnostic. En particulier, le pronostic consiste à déterminer l'agressivité et/ou la susceptibilité de développer des métastases des cancers du sein et du côlon, et en particulier de la susceptibilité de développer des métastases des cancers du sein. Dans le cadre de ce deuxième aspect, l'invention concerne de préférence l'utilisation de la mesure du niveau d'expression de la protéine APC11. Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de l'utilisation. Selon un troisième aspect, la présente invention a aussi pour objet un kit d'identification d'un cancer agressif et/ou susceptible de développer des métastases chez un patient atteint de cancer du sein ou du côlon comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression ou l'activité de la protéine APC11 et un échantillon contrôle. De préférence, le kit de l'invention contient des anticorps anti-APC11 en tant que réactif spécifique. L'échantillon contrôle peut être un contrôle positif ou un contrôle négatif. Parmi les exemples d'échantillon contrôle positif, on peut notamment citer un échantillon issu d'un patient atteint de cancer du sein ou du côlon qui présente un caractère agressif et/ou qui a développé des métastases, ou bien un contrôle négatif, comme par exemple un échantillon issu d'un sujet sain. Pour le contrôle positif, il peut également s'agir d'un échantillon calibré pour contenir la quantité de protéine APC11 qui correspond à la quantité moyenne mesurée dans un pool d'échantillons de patients atteints de cancer du sein ou du côlon qui présente un caractère agressif et/ou qui a développé des métastases. De même, pour le contrôle négatif, il peut également s'agir d'un échantillon calibré pour contenir la quantité de protéine APC11 qui correspond à la quantité moyenne mesurée dans un pool d'échantillons de sujets sains. De préférence, le kit peut également contenir à la fois un contrôle positif et un contrôle négatif, et notamment choisis chacun parmi les exemples précités. Le kit de l'invention peut en outre contenir tout autre réactif ou dispositif nécessaire pour réaliser le procédé selon l'invention, comme par exemple, des anticorps secondaires notamment biotinylés, des réactifs de fixation spécifique comme par exemple le paraformaldéhyde, le Bouin Hollande, le méthanol, etc ; des réactifs d'amplification spécifique comme par exemple un complexe streptavidinebiotine, etc ; des réactifs de révélation avec un chromogène spécifique comme par exemple la DAB (Diaminobenzidine), etc ; des réactifs de contre-coloration comme le bluing, l'hématoxyline, etc. L'invention couvre également l'utilisation d'un kit selon l'invention pour réaliser le procédé de l'invention, et en particulier pour identifier un cancer agressif et/ou susceptible de développer des métastases chez un patient atteint de cancer du sein ou du côlon, de préférence de cancer du sein, et de manière particulièrement préférée chez un patient atteint d'un cancer du sein considéré comme de bon 25 pronostic au moment du diagnostic, et notamment considéré comme non métastatique au diagnostic. Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé et l'utilisation constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant du kit et de son utilisation. 30 Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous en référence aux dessins annexés qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention. La figure 1 représente l'expression de APC11 mise en évidence par RT-PCR (A) et Western Blot (B) dans différentes lignées cellulaires de cancer du côlon. La figure 2 représente l'expression de APC11 mise en évidence par RT-PCR (A) et Western Blot (B) dans différentes lignées cellulaires de cancer du sein (M+ : métastatique, Mo : non métastatique, E : phénotype épithélial, M : phénotype mésenchymateux, E-M phénotype mixte épithélial-mésenchymateux, et la quantification de l'expression de la protéine APC11 à partir des résultats de Western Blot (C). La figure 3 représente l'expression de APC11 mise en évidence par RT-PCR dans des échantillons de tumeur primaire de cancer du sein. La figure 4 représente l'expression de la protéine APC11 en immunohistochimie sur des coupes de tissu mammaire normal (A) et de tumeurs du sein (B, C). Magnitude X 40. La figure 5 est une courbe de survie sans progression métastastatique (Kaplan Meier) établie en fonction du pourcentage de cellules marquées pour la protéine APC11, la valeur seuil est de 50 % de cellules marquées. La courbe représente la probabilité de survie en fonction du temps. EXEMPLES Matériels et Méthodes Cellules Lignées cellulaires de cancer du sein Sauf mention contraire, les lignées cellulaires établies de cancer du sein ont été obtenues de l'ATCC (American Type Culture Collection, www.ATCC.org). Lignées cellulaires de cancer du côlon Sauf mention contraire, les lignées cellulaires établies de cancer du côlon ont été obtenues de l'ATCC (American Type Culture Collection, www.ATCC.orq). La lignée colorectale EB a été fournie par P. Shaw et les cellules Co-115, IS1 (Isrecol), 152, 153, TC7 et TC71 ont été fournie par R. Hamelin. La lignée cellulaire 152 est dérivée des métastases hépatiques d'un adénocarcinome colique (Gayet et al., 2001, Oncogene, 20(36) :5025-5032; Cajot et al., 1997, Cancer Res., 57(13) : 2593-2597. Les autres lignées cellulaires sont dérivées de carcinomes du côlon primaires humains. Les cellules HME-1 (Cambrex, Clonetics) ont été cultivées en MEGM à 37°C avec CO2 comme décrit par Stampfer, (Hammond et Stampfer, 1984, Proc Natl Acad Sci U S A., ;81(17):5435-5439.).Les cellules ont été cultivées selon les protocoles de l'ATCC à 90 % de confluence et ont été collectées pour la préparation d'ARN totaux ou de protéines. Extraction des ARN totaux et synthèse des ADNc Les ARN totaux provenant de deux échantillons de tissus normaux mammaires humains et deux échantillons de tissus normaux de colon humains ont été obtenus auprès de l'Institut BioChain (BioChain Institute Inc., USA). Les ARN totaux ont été isolés à l'aide du réactif Tri-Reagent (Sigma Chemical Co.). Une étape supplémentaire de purification (vis à vis de contamination par l'ADN) a été réalisée à l'aide de tubes Phase-Lock gel (Eppendorf). La concentration en ARN des échantillons a été déterminée par spectrophotométrie par lecture de l'absorbante à 260 nm à l'aide du spectrophotomètre Beckman UV-VIS. La qualité des ARN a été analysée sur gel d'agarose 1% MOPS 1X. Les ADNc ont été synthétisés à l'aide du kit first-strand cDNA synthesis (Amersham Pharmacia Biotech) selon les recommandations du fabricant. PCR quantitative en temps réel L'expression de l'ARNm d'APC11 a été quantifiée avec la technique « two-step real-time PCR » à l'aide de l'appareil LightCycler (Roche Molecular Biochemicals). Les primers utilisés dans la réaction de PCR étaient disponibles dans le commerce (Applied Biosystems). Toutes les amplifications ont été réalisées en capillaires (Roche) avec le kit « LightCycler FastStart DNA Master PLUS SYBR Green I ». Chaque réaction contient de la polymerase FastStart TaqDNA polymerase, du tampon de réaction, un mix de deoxynucléosides, du MgCl2 inclus dans le kit, 0.25 pM de chaque primer, et 1,67 pl d'une solution diluée au 1/60 du 1er brin d'ADNc provenant d'un extrait tissulaire ou cellulaire. Le volume final était de 6.67 pl. L'eau était utilisée comme contrôle négatif. Tous les échantillons sont gardés à 4°C pendant la préparation. Les conditions d'amplification ont été élaborées en 4 étapes: étape 1: dénaturation et activation de la polymérase par chauffage à 95°C avant amplification ; étape 2 (45 cycles): dénaturation pendant 10 sec à 95°C, hybridation pendant 10 sec à 55°C et extension pendant 6 sec à 72°C ; étape 3: incrémentation de la température de 45°C à 95°C par étape de 0.1°C ; étape 4: refroidir pendant 30 sec à 40°C pendant un cycle. Contrôles et échantillons ont été analysés en double et répétés au moins trois fois. Toutes les données de fluorescence ont été analysées avec le logiciel LightCycler 4.0 (Roche) et les résultats CC exportés comme fichiers Excel. Une quantité importante d'ADNc de la lignée HMER-1 a été préparée avant la réalisation des PCR. Cet ADNc a été dilué et aliquoté pour server de calibrateur pour toutes les amplifications par PCR quantitative en temps réel. Pour la quantification relative et la normalisation, la méthode comparant les Ct a été utilisée (ou Enlàc, avec E représentant le facteur dépendant de l'efficacité des primers au cours de la PCR). Les valeurs de Ct du calibrateur et des échantillons ont été normalisées avec 3 gènes de référence dits "gènes de ménage" : PPIB (peptidyl propyl isomérase B ou cyclophiline B), (3-Actin et PGK (phosphoglycérokinase). Immunohistochimie Des carottages de blocs paraffinés de tumeurs du sein sont insérés en triple exemplaire à l'aide d'une aiguille de 600 Mm (Alphelys, Plaisir, France) dans trois blocs de TMA (Tissue Micro-Array). Chaque bloc est coupé en section de 4 mm d'épaisseur puis déparraffiné et réhydraté, les peroxydases endogènes sont bloquées en incubant les lames de TMA dans 5 % de peroxyde d'hydrogène dans de l'eau stérile. Un démasquage antigénique n'est pas nécessaire avant l'utilisation de l'anticorps polyclonal de lapin anti-APC11 (ab18303, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni). Les lames sont incubées une heure à température ambiante avec l'anticorps primaire dilué au 1/200ème en utilisant une solution de dilution (Chem Mate, Daki, Trappes, France). Après rinçage en PBS, les lames sont incubées avec un anticorps secondaire biotinylé conjugué à la streptavidine peroxydase (Vectastain Elite ABC reagent Vector, Abcys, Paris, France). La révélation est réalisée par addition du substrat 3,3'-diamino benzidine (LSAB+ kit substrat pour peroxydase, DAKO, Trappes, France). Les lames sont contre-colorées en hematoxyline. Chaque lame est analysée indépendamment par l'anatomo-pathologiste et par la technicienne. L'intensité de la coloration cytoplasmique (3 grades) ainsi que le pourcentage de cellules tumorales marquées positivement ont été déterminées. L'intensité de coloration a été notée sur une échelle de 0 à 2: "0" reflète un manque d'immunoréactivité, "1" reflète une faible immunoréactivité et "2" reflète une forte immunoréactivité. Les investigateurs n'étaient pas au courant des résultats de la RT- PCR au moment de la notation de la coloration. Le pourcentage de cellules positives (marquage cytoplasmique) permet de discriminer les patientes présentant un risque de progression métastatique. La valeur « cut-off » est placée à 50 % de cellules positives. Les cas discordants sont revus par les deux investigateurs pour arriver à un consensus. 2 98084 9 13 Identification du phénotype épithélial et mésenchymateux Le phénotype épithélial et mésenchymateux a été déterminé par western blot dans les lignées cellulaires de cancer du sein et dans les modèles cellulaires humains de progression tumorale mammaire en étudiant l'expression de la E- 5 cadhérine (marqueur épithélial) et de la vimentine (marqueur mésanchymateux). L'analyse par Western blot a été réalisée comme décrit par Wang et al. (2003, Oncogene, 22(10) :1486-1490). Des anticorps murins dirigés contre la E-cadhérine dilués au 1/2000ème (clone 36, Becton Dickinson, Glostrup, Denmark) et des anticorps murins dirigés contre la vimentine dilués au 1/500ème (clone V9, Dako, 10 Trappes, France) ont été utilisés. Le phénotype épithélial et mésenchymateux a également été déterminé par l'examen de la morphologie des cellules à l'aide d'un microscope inversé (Axiovert 25, Zeiss, Oberkochen, Germany). Les lignées BT-20 et HBL-100 sont indiquées comme présentant un phénotype mixte épithélial et mésenchymateux (E-M), car les deux marqueurs testés sont positifs et qu'il n'est 15 donc pas possible de conclure sur le phénotype E ou M de ces lignées. Anticorps et immunoblot Les culots cellulaires ont été dissociés avec du tampon RIPA (détection d'APC11) pendant 30 min dans la glace puis centrifugés 30 min à 13 000 rpm à 4°C. La concentration protéique dans le surnageant a été déterminée par la technique de 20 Bradford à l'aide du test Biorad Protein assay (Biorad). La BSA a été utilisée comme standard. 50 pg de protéines réduites et dénaturées ont été chargés sur un gel acrylamide-bisacrylamide à 20% pour la détection d'APC11 (9,8 kDa) et la migration a été réalisée dans un tampon Tris-Gly-SDS 1X (Sigma). Le transfert a été réalisé en conditions humides avec un tampon Tris-Gly 1X (Sigma), méthanol 10 % pendant 25 1h. La membrane de nitrocellulose (0,2 pm) a ensuite été incubées pendant 1h avec des anticorps polyclonaux anti-APC11 (Abcam, ab18303) dilués au 1/500ème dans du TBS 1X-0,5 °/0-Tween-5 % lait. Après 1h d'incubation, les membranes ont été lavées 3 fois avec du TBS 1X-0,5 % Tween. Les anticorps secondaires (P0217, Dako) ont été dilués au 1/3000ème dans le même tampon et incubés pendant 1h. L'expression 30 de la protéine APC11 a été révélée à l'aide du système Lumi-LightPLUS (Roche). L'intensité du signal a été normalisée à celui de l'actine. La quantité relative de protéine APC11 exprimée a été estimée à l'aide du logiciel Quantity One® (Bio-Rad) qui permet d'acquérir et d'analyser des images à partir d'un équipement d'imagerie. Echantillons cliniques Les échantillons de tissu congelés sous la forme de biopsies de tissus ont été utilisés pour l'analyse ARN et des blocs de tissus inclus en paraffine ont été utilisés pour les analyses en immunohistochimie. Etude des ARNm Les échantillons de tissus ont été fournis par Eric Tabone (Biological Resources Department, Centre Léon Bérard, French agreement number DC-200899) et ont été collectés avant toute thérapie à partir de 106 patients souffrant de cancer du sein diagnostiqué entre 1992 and 1999 qui ont subis une intervention chirurgicale au Centre Léon Bérard (Lyon, France). Les échantillons de tissus de seins normaux ont été obtenus à partir de 4 individus sains qui ont subis une chirurgie réductrice. Analyse immunohistochimique Des blocs paraffinés de tissus fixés en formaldehyde réalisés à partir de tumeurs du sein de 111 patientes diagnostiquées au Centre Léon Bérard (French agreement number DC-2008-99) en 1998. Des tissus normaux de sein ont été obtenus à partir de huit prélèvements de personnes non atteintes de cancer du sein ou de personnes atteintes de cancers du sein (4 de donneuses ayant subi une chirurgie plastique et 4 provenant de tissus sains de patientes atteintes de cancers du sein). Tous les échantillons de tissus ont été obtenus après l'approbation du Comité de Protection des Personnes Lyon Est, par le comité d'experts de l'institution et par le comité éthique du Centre Léon Bérard, après le consentement éclairé de chaque patiente. Description de la banque de données cliniques Les variables explicatives ont été extraites à partir de la banque de données institutionnel de cancers du sein du Centre Léon Bérard incluant toutes les patientes ayant subi une opération chirurgicale initiale au Centre Léon Bérard depuis 1996. La banque de données a été déclarée auprès des autorités de la CNIL. Les paramètres d'intérêt correspondent à: l'histoire clinique et chirurgicale de la patiente, l'histologie de la tumeur, le traitement adressé ainsi que les variables immunohistochimiques (le statut hormonal, HER2). Cette banque de données de cancers du sein est régulièrement mise à jour avec le suivi des données cliniques et autres jusqu'au décès de la patiente (lettre du médecin généraliste ou office des registres). Les informations sur l'évolution de la tumeur, avec notamment l'envahissement ganglionnaire ou les métastases à distance sont enregistrées régulièrement. Les paramètres cliniques considérés dans cette étude étaient: - les données cliniques (âge, statut ménopausique, statut métastatique au diagnostic) - les données histologiques (type histologique, pT (taille de la tumeur), le statut des ganglions lymphatiques, le grade SBR) - les données immunohistochimiques (statut hormonal, HER2 si disponible) - le sous-type de cancer (les tumeurs sont classées comme suit: luminales A, luminales B, HER2+ et « basal-like » comme décrit précédemment (Creighton et al., 2009, Breast Cancer Res. Treat. 114 :287-299; Hugh et al., 2009, 3. Clin. Oncol. 27 :1168-1176). Analyses statistiques Expression en ARNm et résultats emmunohistochimie (TMA) Une transformation de loge a été appliquée à l'expression de l'ARNm d'APC11 à partir du moment où les variables ne rencontrent pas la normalité. Basés sur les résultats en test Kolmogorov-Smirnov, la significativité statistique pour une répartition par rapport à la normalité était p=0.002 et p=0.291 avant et après transformation respectivement. Basé sur l'expérimentation, les Q-PCRs ont été emboitées avec les RTs, elles-mêmes emboitées avec les extractions, elles-mêmes emboitées avec les lignées cellulaires suggérant l'utilisation d'un modèle hiérarchique linéaire (Sullivan et al., 1999, Stat. Med. 18 :855-888 ; Goldstein et al., 2003, Multilevel Statistical models. Arnold Publishers, London). Par conséquent, la moyenne « Iog2 mean » de l'expression de l'ARNm d'APC11 pour les lignées de cancer du sein était estimée en utilisant le modèle mixte linéaire à 4 niveaux suivant (LMM): log 2 APC/Cfrei p + al +del +y + eird où 1-1 était la moyenne de toutes les valeurs de l'expression de l'ARNm d'APC11 après transformation log2 pour les effets randomisés, al représentait la variation entre cellules, der la variation entre extraction, Yrel la variation entre RTs ou à l'intérieur d'une extraction et eirei la variation intra RT ou la mesure de l'erreur. Les effets aléatoires étaient assurés d'être indépendants et normalement distribués entre la valeur de zéro et le coefficient de variance comme suit: (,2 al N(0,s ) dei - N(0,s y'1 N(O,s ) eirer N0,o- et La valeur 211 a été reportée avec son intervalle de confiance de 95% (95% IC) au niveau des résultats et représente la moyenne de l'expression en ARNm de APC11. Des estimations ont été réalisées en utilisant la méthode de maximum de vraisemblance à partir de la bibliothèque de nlme du logiciel R ([R Development 5 Core Team (2007). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org]). Pour les tests de ratios de vraisemblance, le niveau de significativité statistique était de 0.05. Une comparaison de la distribution des paramètres cliniques selon le 10 pourcentage des cellules marquées montrant un marquage cytoplasmique ( 50%) a été réalisée à l'aide du test de Pearson's x2 test; le test de Fisher exact a été utilisé quand le nombre de patients était faible. Le test de Wilcoxon a été utilisé pour les variables quantitatives. Analyses de survie 15 Les analyses de survie pertinentes dans cette étude ont été des études de survie sans progression métastatique (SPM) définies comme le temps entre la survenue d'un évènement métastatique et le diagnostic initial de cancer ou le suivi des patients sans métastases (observations recensées). Les analyses de survie ont été réalisées parmi un sous-groupe de patients sans métastases au diagnostic. Les 20 estimations de survie ont été calculées à l'aide de la méthode de Kaplan-Meier (Kaplan and Meier, 1958, J. Am. Stat. Assoc. 53 ;457-481). La différence dans l'estimation de survie entre les groupes présentant des quantités relatives de protéine APC11 .50°/0 versus >50% a été estimée par le test de log-rank (Peto et al., 1977, Br. J., Cancer, 35 :1-39) et les « hazard ratios » ont été calculées à l'aide 25 du modèle de Cox. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel SAS version 9.1 [SAS OnlheDoce, Version 9, Copyright C) 1999 by SAS Institute Inc., Cary, NC, USA] et R [R Development Core Team (2007). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, ISBN 3-900051- 30 07-0, URL http://www.R-projectorg] à l'aide du pack "nlme" [Jose Pinheiro, Douglas Bates, Saikat DebRoy and Deepayan Sarkar and the R Core team, (2007). nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. R package version 3.1-89]. Expression de APC11 dans des lignées cellulaires de cancer du colon L'expression des ARNm et de la protéine APC11 ont été étudiées par RT-PCR quantitative en temps réel et Western Blet respectivement dans des lignées cellulaires de cancers du côlon, comme indiqué dans la section « Matériels et Méthodes » ci-dessus. Les ARNm ont été obtenus à partir de 15 lignées cellulaires de l'ATCC établies à partir de cancers colorectaux (Caco2, Co-115, Colo-320, FET, HCT-116, HCT-15, HT-29, Lovo, LS-1034, LS-174T, SW-1116, SW-48, SW-480, SW620, SW-837), de la lignée colorectale EB et des lignées IS1 (Isrecol), IS2, 153, TC7 et TC71. Les protéines ont été obtenues à partir de 6 lignées cellulaires de l'ATCC établies de cancer du côlon (HCT-15, HT-29, Lovo, SW-480, SW-620, SW-1116), des cellules Co-115, Isreco (IS2), TC-7 et TC-71, et des cellules HME-1. Les résultats sont regroupés sur la figure 1. Concernant les ARNm, les résultats montrent une augmentation significative du niveau d'expression de APC11 dans les lignées cellulaires aneuploïdes, c'est-à- dire associées à une instabilité chromosomique (CIN), comparé aux lignées cellulaires diploïdes ou « presque diploïdes » (2N) (CIN:IC moyen = 1.906 (1.5952.278) vs diploïde : IC moyen = 0.995 (0.741-1.337), p = 0.0005). Les lignées cellulaires à instabilité microsatellite (MSI MicroSattelite InstabibM présentent un niveau d'ARNm inférieur à celui des lignées de tumeurs coliques à stabilité microsatellitaire (souvent instables au niveau chromosomique (MSI : IC moyen = 1.11 (0.852-1.437) vs MSS (MicroSattelite StabiliM : IC moyen = 1.97 (1.6352.362). De plus, des niveaux d'ARNm supérieurs ont été mesurés dans les cellules cancéreuses par rapport à ceux mesurés dans des cellules normales (p=0.0025)(résultats non représentés)(ces résultats ont-ils été obtenus à partir des lignées cellulaires décrites . Quatre des six lignées cellulaires aneuploïdes surexpriment la protéine APC11 et trois quart des lignées cellulaires diploïdes (2N) présentent un niveau d'expression de la protéine APC11 inférieur à celui mesuré dans la lignée cellulaire HME-1 (lignée cellulaire épithéliale mammaire immortalisée non tumorale). Des résultats similaires ont été obtenus avec d'autres lignées cellulaires de cancer du côlon. Les mesures semi-quantitatives du niveau d'expression de la protéine APC11 montrent une concordance de 60 % avec les niveaux d'ARNm. Au vu de ces résultats, APC11 peut donc être considéré comme un marqueur d'agressivité tumorale. Expression de APC11 dans des lignées cellulaires de cancer du sein L'expression des ARNm et de la protéine APC11 ont été étudiées par RT-PCT et Western Blot respectivement dans des lignées cellulaires de cancers du sein, comme indiqué dans la section « Matériels et Méthodes » ci-dessus. Les ARNm ont été obtenus à partir de 21 lignées cellulaires de l'ATCC établies à partir de cancers du sein (BT20, BT474, Cal-51, Cama1, HCC 1937, Hs578T, MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-459, MDA-MB549, SKBr3, T47D, UACC-812, ZR-75-1, HBL-100, MCF-10A, MCF12A). Les protéines ont été obtenues à partir de 8 lignées cellulaires de l'ATCC établies de cancers du sein (MCF-7, T47D, BT-20, UACC-812, MM-157, MM-231, MM-549 et HLB-100) et des cellules HME-1. Les résultats sont regroupés sur la figure 2. Concernant les ARNm, les résultats montrent que l'expression d'APC11 est significativement inférieure dans les lignées cellulaires métastatiques par rapport à celui présent dans les lignées non métastatiques (non métastatiques : IC moyen = 3.942 (2.611-5.953) vs métastatiques : IC moyen = 2.423 (2.046-2.87); p = 0.0181). Une diminution significative a également été observée dans les lignées d'origine métastatiques par rapport aux lignées cellulaires issues de tumeurs primaires (tumeurs primaires : IC moyen = 3.942 ((2.611-5.953) vs métastatiques : IC moyen = 2.551 (2.201-2.957); p = 0.0226). De plus, le niveau d'ARNm est significativement inférieur dans les lignées de phénotype mésenchymateux par rapport à celui mesurée dans les lignées cellulaires de phénotype épithélial (épithélial: IC moyen = 2.908 ((2.210-3.827) vs phénotype mésenchymateux: IC moyen = 1.745 (1.172-2.598); p = 0.0435) ; le phénotype mésenchymateux étant généralement corrélé à une susceptibilité métastatique accrue. La quantité de protéine APC11 présente dans la lignée de cancer du sein UACC-812 est prise comme valeur de référence car elle est non métastatique et de phénotype épithélial (valeur arbitraire de 1). De façon similaire aux résultats obtenus pour l'ARNm, ces résultats montrent que l'expression de la protéine APC11 est plus faible dans les lignées de phénotype mésenchymateux par rapport à l'expression quantifiée dans les lignées de phénotype épithélial. Les informations cliniques sur les lignées de l'ATCC ne permettent pas de savoir si les lignées de cancers du sein ont été établies à partir de tumeurs métastatiques au diagnostic, ou si les patientes ont présenté une rechute métastatique au cours du temps. Des résultats similaires ont été obtenus avec d'autres lignées cellulaires de cancer du sein. Les mesures semi-quantitatives du niveau d'expression de la 5 protéine APC11 montrent une concordance de 60 % avec les niveaux d'ARNm. Expression de APC11 dans des tumeurs primaires de cancer du sein L'expression de APC11 a été étudiée sur des biopsies de tumeurs primaires du sein par la mesure des ARNm. Les résultats sont regroupés sur la figure 3. 10 Les résultats montrent une diminution significative du niveau d'ARNm de APC11 dans les tumeurs métastatiques au diagnostic (non métastatiques au diagnostic : IC moyen = 0.99 (0.808-1.217) vs métastatiques au diagnostic : IC moyen = 0.42 (0.268-0.669); p = 0.0012). Dans les échantillons de tumeur primaire de cancer du sein, l'expression de 15 APC11 est donc corrélée à un paramètre clinique, c'est-à-dire qu'il existe une association claire entre l'expression de APC11 en ARNm et la présence de métastases au diagnostic. Pertinence pronostic et clinique de l'expression de la protéine APC11 dans des tumeurs primaires de cancer du sein 20 L'expression de la protéine APC11 a été étudiée par analyse TMA (Tissue MicroArray). Une analyse préliminaire par immunohistochimie a été réalisée avec 8 tissus de glande mammaire normale et a montré que l'expression de la protéine APC11 est non uniforme dans le cytoplasme des cellules luminales. Le signal dans le cytoplasme des cellules luminales est facilement détectable (correspondant à une 25 intensité de 2 et 50 % de cellules marquées). Aucune immunoréactivité positive n'est détectée dans les cellules basales ou les cellules stromales (figure 4A). Dans les cellules de tumeurs mammaires, le profil d'expression de la protéine APC11 est très variable. Certaines tumeurs sont négatives pour la coloration APC11 (intensité 0) (figure 4B), d'autres tumeurs présentent une intensité de coloration 30 plus faible que celle trouvée dans des tissus normaux (intensité 1 et 5 50 % de cellules marquées) alors que d'autres tumeurs présentent une intensité de coloration comparable à celle trouvée dans des tissus normaux (intensité 2 et > 50 0/0 de cellules marquées) (figure 4C). Les caractéristiques cliniques de la population de tumeurs analysée en TMA sont décrites dans le Tableau 1 ci-dessous. Dans cette population de tumeurs, 3 patients sur 111 présentent des métastases à distance au moment du diagnostic (contre 21 sur 106 dans la population ARNm). Tableau 1 Comparaison des populations tumorales analysees en:71191ket errAiMin Âge- au (années) N Mean (std) Médian (min max) Q1 - Q3 Statut Menopause: m Mean SD (niediénl [min,max] diagnostic population TMA population ARNm N=111 N-=106 111 96 58.55 (12.73) 57.36 (12.92) 56.70 (37.60 - 87.40) 55.40 (32.00 - 84.40) 48.20 - 69.90 48.25 - 66.40 (%) 14 Non 37 (33.3%) 32 (34.8%) Oui 74 (66.7%) 60 (65.2%) statut métastatique: 1 MO 108 (97.3%) 84 (80.0%) M1 3 (2.7%) 21 (20.0%) Taille de la tumeur (mm) 3 = 30 mm 42 (37.8%) 68 (66.0%) Type histologique : Lobulaire 8 (7.2%) 7 (6.6%) canalaire 94 (84.7%) 91 (85.8%) Mixte 1 (0.9%) Autres 9 (8.1%) 7 (6.6%) Grade histologique (SBR): 8 1 20 (18.0%) 12 (12.2%) 2/3 91 (82.0%) 86 (87.8%) Statut ganglionnaire : NO 46 (41.4%) 19 (17.9%) Micro metastases 18 (16.2%) 7 (6.6%) Macro metastases 47 (42.3%) 80 (75.5%) 'Récepteurs aux oestrogènes : % cellules marquées (comptage): Comparauson analysees en TMA et en ARNm tumorales m Mean SD (rnedian [min,max] : (%) ER- ( Tableau 2 :Mean :±:SD (riiitiMan:[rnirvirriax] les marque:APC ...:::.:.:::.... 501.1. N=g15:. N=66 Age au diagnostic (années N 45 66 Wilcoxon Mean (std) 55.34 (12.07) 60.73 (12.79) P = 0.026 Median (min - max) 53.00 (37.90 - 59.25 (37.60 - Q1 - Q3 82.70) 87.40) 46.40 - 63.00 50.00 - 72.30 Statut ménopause : Fisher Exact Non 18 (40.0%) 19 (28,8%) P = 0.227 Oui 27 (60.0%) 47 (71.2%) Statut métastatique Fisher Exact MO 45 (100A096) 63 (95.5%) P = 0.270 M1 0 (0.0%) 3 (4.5%) Taille de la tumeur (mm) Fisher Exact = 30 mm 24 (53.3%) 18 (27.3%) Type histologique: Fisher Exact Lobulaire 2 (4.4%) 6 (9.1%) P = 0.724 Canalaire 39 (86.7%) 55 (83.3%) Autres 4 (8.9%) (7.6%) Grade histologique (SBR): Fisher Exact 1 6 (13.3%) 14 (21.2%) P = 0.326 2/3 39 (86.7%) 52 (78.8%) Staut ganglionnaire: Fisher Exact NO 14 (31.1%) 32 (48.5%) P = 0.072 Micro metastases 6 (13.3%) 12 (18.2%) Macro metastases 25 (55.6%) 22 (33.3%) Récepteurs aux oestrogènes: % cellules marquées Fisher Exact (comptage): P = 0.221 ER- ( 10%) 34 (75.6%) 53 (80.3%) HER2 status Fisher Exact 1 1 P = 0.086 37 (84.1%) 62 (95.4%) +++ 7 (15.9%) 3 (4.6%) Sous-type tumoral Luminal A Fisher Exact Non 22 (48.9%)I 21 (31.896) P = 0.078 ^e plus, les tumeurs qui ont présenté plus de 50 % de cellules marquées étaient plus fréquemment des tumeurs de petite taille ( REVENDICATIONS1 - Procédé d'identification d'un cancer agressif et/ou susceptible de développer des métastases chez un patient atteint de cancer du sein ou du côlon comprenant les étapes consistant à : mesurer le niveau d'expression ou l'activité de la protéine APC11 dans un échantillon issu dudit patient, et classer le cancer comme agressif et/ou susceptible de développer des métastases lorsqu'une différence significative du niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 est mise en évidence par rapport à une valeur de référence. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit patient est atteint de cancer du sein et en ce que le cancer est classé comme susceptible de développer des métastases lorsqu'une diminution significative du niveau d'expression de APC11 est mise en évidence dans l'échantillon issu dudit patient par rapport à la valeur de référence. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diminution est d'au moins 50 % de l'expression de APC11 est mise en évidence. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit patient est atteint d'un cancer du sein qui avait été considéré comme de bon pronostic au moment du diagnostic. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit patient est atteint de cancer du côlon et que le cancer est classé comme agressif lorsqu'une augmentation significative du niveau d'expression de APC11 est mise en évidence dans l'échantillon issu dudit patient à tester par rapport à la valeur de référence. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le cancer est classé comme agressif lorsque l'augmentation est d'au moins 50 °A) de l'expression de APC11 est mise en évidence. 7 - Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que ledit patient est atteint d'un cancer du côlon sans envahissement ganglionnaire. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite protéine APC11 est la protéine APC11 humaine. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon issu dudit patient est un tissu, de préférence issu de la tumeur primaire.10 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la valeur de référence correspond au niveau d'expression ou d'activité de la protéine APC11 mesurée dans un échantillon issu d'un sujet sain qui n'est pas atteint de cancer. 11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le niveau d'expression de la protéine APC11 est quantifié en utilisant des anticorps anti-APC11. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la quantification du niveau d'expression de la protéine APC11 est déterminée par immunohistochimie. 13 - Utilisation de la mesure du niveau d'expression ou de l'activité d'APC11 en tant que biomarqueur pronostic des cancers du sein et du côlon. 14 - Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que le pronostic consiste à déterminer l'agressivité et/ou la susceptibilité de développer des métastases desdits cancers. 15 - Utilisation selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisée en ce que le pronostic consiste à déterminer la susceptibilité de développer des métastases du cancer du sein. 16 - Kit d'identification d'un cancer agressif et/ou susceptible de développer des métastases chez un patient atteint de cancer du sein ou du côlon comprenant un ou plusieurs réactifs spécifiques permettant de mesurer le niveau d'expression ou l'activité de la protéine APC11 et un échantillon contrôle. 17 - Kit d'identification selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend des anticorps anti-APC11 en tant que réactif spécifique.