Brevet FR2980577A1 — publié le 20130329

La présente invention se rapporte à système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon de fluide constituant un matériau biologique. La présente invention trouve une application dans les instruments 5 automatisés de diagnostic in vitro dans le domaine clinique ou dans le domaine industriel. Dans le domaine clinique, le diagnostic est réalisé à partir d'un prélèvement biologique humain (urine, sang, salive, pus, liquide céphalorachidien, etc.), pour la détection ou la quantification d'analytes issus ou non 10 d'un micro-organisme externe (bactérie, virus, parasite, anticorps, etc.) sous la forme de tests immunologiques ou de tests de biologie moléculaire. Dans le domaine industriel, le diagnostic est réalisé à partir d'un échantillon de produit alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique, pour contrôler la qualité microbiologique du produit sous la forme de tests 15 microbiologiques. De tels tests microbiologiques vérifient généralement soit la stérilité (aucun microorganisme ne doit être présent), soit l'absence de bactéries pathogènes (à l'origine d'une infection), soit encore qu'une bactérie commensale (normalement présente chez l'homme et banale en faible concentration) n'est présente qu'en dessous d'un certain seuil. 20 L'invention peut également trouver une application dans le domaine des analyses dynamiques, c'est-à-dire en temps réel, en l'occurrence dans les tests immunologiques et les tests de biologie moléculaire où les réactions immunologiques/biologiques peuvent être pilotées ou surveillées dans le temps. 25 L'invention se rapporte plus particulièrement à un système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie comprenant : - une source de rayonnement lumineux émettrice d'un faisceau principal dans une longueur d'onde dite d'émission donnée ; - un diviseur optique disposé en sortie de la source de rayonnement pour 30 diviser le faisceau principal en un premier faisceau d'excitation de l'échantillon et un second faisceau de référence ; - un premier moyen photodétecteur conçu pour délivrer un premier signal analogique de détection en réponse à une détection d'un rayonnement de fluorescence émis par l'échantillon, dans une longueur d'onde dite de 35 fluorescence, sous l'effet de l'excitation induite par le premier faisceau d'excitation ; - un second moyen photodétecteur conçu pour délivrer en sortie un second signal analogique de détection en réponse à une détection du second faisceau de référence. De tels systèmes de détection et/ou de quantification in vitro sont connus, en particulier dans les instruments automatisés de diagnostic in vitro par fluorimétrie, comme par exemple dans les documents EP 0 864 089 B1, EP 0 871 863 B1, EP 0 241 268 A1, et WO 2004/055502 A2, qui emploient des sources de rayonnement du type source de lumière pulsé, lampe laser ou lampe à arc. De manière classique, l'analyse des signaux en provenance des deux moyens photodétecteurs s'effectue par un traitement analogique, avec notamment un algorithme de détection du pic de fluorescence représentatif de la présence/quantité d'analyte à détecter. L'inconvénient d'un tel traitement analogique réside essentiellement dans ses limitations à réduire le bruit, et donc à augmenter le rapport signal sur bruit. La présente invention a pour but de fournir un système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie comprenant des moyens de traitement des signaux assurant une détection/quantification de l'analyte avec une sensibilité améliorée obtenue par une augmentation du rapport signal sur bruit. A cet effet, elle propose un système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon de fluide, comprenant : - une source de rayonnement émettrice d'un faisceau principal dans une 25 longueur d'onde dite d'émission donnée; - un diviseur optique disposé en sortie de la source de rayonnement pour diviser le faisceau principal en un premier faisceau d'excitation de l'échantillon et un second faisceau de référence ; - un premier moyen photodétecteur conçu pour délivrer un premier signal 30 analogique de détection en réponse à une détection d'un rayonnement de fluorescence émis par l'échantillon, dans une longueur d'onde dite de fluorescence, sous l'effet de l'excitation induite par le premier faisceau d'excitation ; - un second moyen photodétecteur conçu pour délivrer en sortie un second 35 signal analogique de détection en réponse à une détection du second faisceau de référence ; ce système étant remarquable en ce qu'il comprend : - un générateur délivrant un signal sinusoïdal porteur à une fréquence prédéfinie dite fréquence porteuse, et au moins un signal numérique de démodulation à cette même fréquence porteuse ; - un moyen de conversion numérique/analogique relié au générateur pour convertir le signal sinusoïdal porteur en un signal analogique de modulation à la fréquence porteuse ; - un modulateur d'amplitude relié au moyen de conversion numérique/analogique et à la source de rayonnement pour moduler en 10 amplitude le faisceau principal à la fréquence porteuse, par application du signal analogique de modulation sur ladite source de rayonnement ; - des moyens de conversion analogique/numérique reliés aux moyens photodétecteurs pour convertir le premier signal analogique de détection en un premier signal numérique dit de fluorescence, et le second signal analogique 15 de détection en un second signal numérique de référence ; - des moyens de traitement numérique reliés au générateur et aux moyens de conversion analogique/numérique, conçus pour, d'une part, traiter le premier signal numérique de fluorescence par démodulation afin de calculer une première valeur dite de fluorescence caractéristique de l'amplitude du 20 rayonnement de fluorescence et, d'autre part, traiter le second signal numérique de référence afin de calculer une seconde valeur dite de référence caractéristique de l'amplitude du faisceau de référence ; - un moyen de comparaison entre la première valeur de fluorescence et la seconde valeur de référence pour calculer un résultat final pour établir la 25 détection et/ou la quantification de l'analyte. Ainsi, le système selon l'invention effectue un traitement numérique par modulation d'amplitude et démodulation, qui permet d'atteindre des rapports signal sur bruit particulièrement intéressants. Un tel traitement numérique est de préférence réalisé avec une 30 diode électroluminescente (LED), notamment dans le spectre UV, comme source de rayonnement, car les diodes électroluminescentes sont particulièrement bien adaptées pour un pilotage en modulation. Avec une diode électroluminescente, on peut en particulier assurer une série de flashs lumineux d'amplitude, de formes temporelles et fréquentielles bien définies et 35 contrôlées, les flashs pouvant être espacés temporellement les uns des autres de manière contrôlée et précise. Avec une telle possibilité de pilotage de la diode électroluminescente, le traitement numérique qui suit permet de rejeter/limiter le bruit. Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de traitement numérique comprennent : - un premier moyen de démodulation conçu pour démoduler le premier signal numérique de fluorescence, en le multipliant par au moins un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse, afin d'engendrer au moins un premier signal démodulé de fluorescence ; et - un premier moyen de calcul conçu pour calculer, à partir du au moins un 10 premier signal démodulé de fluorescence, la première valeur de fluorescence. Selon une caractéristique, le premier moyen de démodulation comprend : - un premier multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en phase avec le signal sinusoïdal porteur, ledit premier 15 multiplicateur étant éventuellement suivi d'un premier filtre passe-bas à une fréquence de coupure inférieure à la fréquence porteuse, afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en phase ; et - un second multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal 20 porteur, ledit second multiplicateur étant éventuellement suivi d'un second filtre passe-bas à la même fréquence de coupure, afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en quadrature de phase ; et en outre le premier moyen de calcul, en sortie desdits premier et second multiplicateurs, calcule la première valeur de fluorescence correspondant au 25 module de la somme du premier signal démodulé de fluorescence en phase et du premier signal démodulé de fluorescence en quadrature de phase. Avec cette caractéristique, le procédé de démodulation correspond à une démodulation cohérente en phase et quadrature de phase qui est particulièrement avantageuse pour améliorer le rapport signal sur bruit. 30 Le système comprend éventuellement au moins un filtre passe-bas, à une fréquence de coupure inférieure à la fréquence porteuse, en sortie du premier moyen de démodulation afin de filtrer le ou chaque premier signal démodulé de fluorescence. Selon une autre caractéristique, les moyens de traitement 35 numérique comprennent, en entrée des premier et second multiplicateurs : - un filtre à encoche centré sur la fréquence porteuse afin de filtrer le premier signal numérique de fluorescence et délivrer un premier signal intermédiaire filtré ; et - un soustracteur réalisant la soustraction du premier signal numérique de fluorescence et du premier signal intermédiaire filtré, afin de générer un premier signal de fluorescence filtré, ce premier signal de fluorescence filtré étant injecté dans lesdits premier et second multiplicateurs du premier moyen de démodulation. Le filtre à encoche associé au soustracteur forme au final un filtre 10 passe-bande excluant la composante entrante fréquentielle à la fréquence porteuse. Dans une réalisation particulière, les moyens de traitement numérique comprennent : - un second moyen de démodulation conçu pour démoduler le second signal 15 numérique de référence, en le multipliant par au moins un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse, afin d'engendrer au moins un second signal démodulé de référence ; et - un second moyen de calcul conçu pour calculer, à partir du au moins un second signal démodulé de référence, la seconde valeur de référence. 20 Dans cette réalisation, le second moyen de traitement applique un traitement par démodulation sur le second signal numérique de référence, avec les avantages afférents à ce type de procédé pour améliorer le rapport signal sur bruit. Selon une possibilité de l'invention, le second moyen de 25 démodulation comprend : - un premier multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en phase avec le signal sinusoïdal porteur, ledit premier multiplicateur étant éventuellement suivi d'un premier filtre passe-bas à une fréquence de coupure inférieure à la fréquence porteuse, afin de délivrer un 30 second signal démodulé de référence dit en phase ; et - un second multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal porteur, ledit second multiplicateur étant éventuellement suivi d'un second filtre passe-bas à la même fréquence de coupure, afin de délivrer un second signal 35 démodulé de référence dit en quadrature de phase ; et le second moyen de calcul, en sortie desdits premier et second multiplicateurs, calcule la seconde valeur de référence correspondant au module de la somme du second signal démodulé de référence en phase et du second signal démodulé de référence en quadrature de phase. Selon une autre possibilité de l'invention, les moyens de traitement numérique comprennent, en entrée de ces premier et second multiplicateurs : - un filtre à encoche centré sur la fréquence porteuse afin de filtrer le second signal numérique de référence et délivrer un second signal intermédiaire filtré ; et - un soustracteur réalisant la soustraction du second signal numérique de référence et du second signal intermédiaire filtré, afin de générer un second signal de référence filtré, ce second signal de référence filtré étant injecté dans lesdits premier et second multiplicateurs du second moyen de démodulation. Avantageusement, le système comprend en outre, intercalé entre 15 la source de rayonnement et le diviseur optique, un filtre optique passe-bande centré sensiblement sur la longueur d'onde d'émission. L'emploi d'un tel filtre optique passe-bande permet d'augmenter le signal au niveau des moyens photodétecteurs, en améliorant à la source le signal par filtrage des fréquences interférentes. 20 Selon une caractéristique, le système comprend en outre, intercalé entre l'échantillon et le premier moyen photodétecteur, un filtre optique passe-bande centré sensiblement sur la longueur d'onde de fluorescence. L'emploi d'un tel filtre optique passe-bande permet d'augmenter le signal au niveau du le premier moyen photodétecteur, en filtrant les fréquences 25 interférentes. Selon une caractéristique, le système comprend en outre, intercalé entre le filtre optique passe-bande et le premier moyen photodétecteur, un guide d'ondes réalisé sous la forme d'un cône de guidage. Dans un mode de réalisation particulier, le système comprend en 30 outre, intercalé entre le diviseur optique et le second moyen photodétecteur, un filtre optique passe-bas qui présente une longueur d'onde basse de coupure sensiblement inférieure à la longueur d'onde d'émission. Selon une possibilité de l'invention, le système comprend en outre, intercalé entre le filtre optique passe-bas et le second moyen photodétecteur, 35 un guide d'ondes réalisé sous la forme d'un cône de guidage. Selon une autre possibilité de l'invention, le signal sinusoïdal porteur se présente sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales à la fréquence porteuse, l'écart de temps entre deux itérations consécutives étant supérieur à la période des itérations sinusoïdales. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, d'un exemple de mise en oeuvre non limitatif, faite en référence aux figures annexées dans lesquelles : - la figure 1 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention ; - la figure 2 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention selon une première configuration ; - la figure 3 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention selon une seconde configuration ; - la figure 4 est un graphe illustrant respectivement le spectre de transmission d'un filtre optique passe-bande et le spectre d'émission d'une diode UV équipant tous deux un système conforme à l'invention, ainsi que les spectres d'excitation du 4-MU et du 4-MUP ; - la figure 5 est un graphe schématique d'un spectre de transmission d'un diviseur optique équipant un système conforme à l'invention ; - la figure 6 est un graphe schématique de la variation de la photosensibilité d'une photodiode équipant un système conforme à l'invention, en fonction de la longueur d'onde du rayonnement détecté, à une température de 25°C ; - la figure 7 est un graphe schématique du spectre de fluorescence du 4-MU, et le spectre de transmission d'un autre filtre optique passe-bande et d'un cône de guidage équipant tous deux un système conforme à l'invention ; - la figure 8 est une vue schématiquement d'un système conforme à l'invention illustrant sa partie traitement du signal, selon une première configuration ; - la figure 9 est un graphe illustrant les courbes de variation en fonction du temps du signal sinusoïdal porteur SNM, du premier signal numérique de fluorescence SFN et du second signal numérique de référence SRN, ces signaux se présentant sous la forme de quatre itérations périodiques sinusoïdales ; - la figure 10 est un graphe illustrant une itération pour les trois courbes de la figure 9 ; - la figure 11 est une vue schématique de deux trames transportant les données numériques pour le système conforme à l'invention ; - la figure 12 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention illustrant sa partie traitement du signal, selon une seconde configuration correspondant à un perfectionnement de la première configuration ; - la figure 13 est un graphe illustrant la courbe de variation du RFU en fonction de la concentration en 4-MU dans l'échantillon ; - la figure 14 est un graphe illustrant la courbe de variation du courant de pilotage ID(t) en fonction du temps t pour une impulsion ; - la figure 15 est un graphe illustrant la courbe de variation du courant de pilotage ID(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 16 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal analogique de détection SAD1(t) en fonction du temps t pour une impulsion ; - la figure 17 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal numérique de fluorescence SFN(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 18 est un graphe illustrant la courbe de variation de la fonction HNotch(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 19 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal de fluorescence filtré SFN0(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 20 est une vue schématique d'un ensemble de deux multiplicateurs, deux filtres passe-bas et un moyen de calcul pour un premier module d'acquisition/traitement du signal numérique de fluorescence ; - la figure 21 est un graphe illustrant la courbe de variation du signal démodulé intermédiaire en phase SFsIN'(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 22 est un graphe illustrant la courbe de variation du signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFcos'(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 23 est un graphe illustrant la courbe de variation de la fonction HLpsmooth(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 24 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal démodulé en phase SFsIN(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 25 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal démodulé en quadrature de phase SFcos(f) en fonction de la fréquence f. La première partie de la description qui suit porte sur l'architecture ou partie structurelle du système 1 conforme à l'invention pour la détection et/ou la quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon E de fluide constituant un matériau biologique. Les figures 1 à 3 illustrent schématiquement l'architecture d'un tel système 1 conforme à l'invention et conçu pour équiper un instrument automatisé de diagnostic in vitro. Ce système 1 est destiné en particulier à l'analyse par fluorimétrie du rayonnement fluorescent émis lors d'un test immunologique basé sur la 4- méthylumbelliférone (4-MU), comme résultant de l'hydrolyse du substrat 4- méthylumbelliferyl-phosphate (4-MUP) dans l'échantillon E de fluide. Ainsi, la fonction de ce système est d'effectuer une mesure instantanée du rayonnement fluorescent émis par la 4-MU dans l'échantillon E, sous l'incidence d'un faisceau d'excitation adapté pour exciter la 4-MU, tout en évitant d'exciter le substrat 4-MUP. Ce système 1 comprend un bâti B supportant une source de 20 rayonnement 10 lumineux émettrice d'un faisceau principal FP. La source de rayonnement 10 est constituée d'une diode électroluminescente émettrice dans l'ultraviolet (UV LED). Les courbes C3 et C4 de la figure 4 illustrent respectivement les spectres d'excitation du 4-MUP et du 4-MU, en fonction de la longueur d'ondes 25 (en nm), qui présentent des pics d'excitation respectivement à 350 nm et 365370 nm. Pour obtenir une émission d'un rayonnement de fluorescence du 4-MU, il est donc nécessaire d'avoir une diode qui émette un faisceau principal FP dans la gamme de longueur d'onde de 365-370 nm. Bien que le maximum du pic d'excitation du 4-MU soit situé à 365 30 nm, il est cependant préférable que le faisceau principal FP soit centré autour de 370 nm. En effet, une longueur d'onde de 365 nm pour le faisceau principal exciterait trop le 4-MUP et provoquerait ainsi une interférence nuisible à la bonne analyse du signal de fluorescence de la 4-MU. La diode électroluminescente 10 est donc de préférence émettrice dans une longueur 35 d'onde d'environ 370 nm ; une diode étant théoriquement monochromatique. 2 9805 77 10 Par exemple, la diode 10 est constituée d'une diode de référence « NSHU591A Rank 6 » commercialisée par la société NICHIA Corporation, émettrice dans la gamme de longueurs d'ondes 370-375 nm, avec une demi-largeur de spectre de 15 nm. La courbe C2 de la figure 4 illustre le spectre de 5 la diode de référence NSHU591A en fonction de la longueur d'ondes (en nm). Pour répondre à la problématique de limitation de la longueur d'onde du faisceau principal FP autour de 370 nm, le système 1 comprend en outre un filtre optique passe-bande 11 centré sur la longueur d'onde de 370 nm ; ce filtre optique passe-bande 11 étant disposé devant la diode 10. 10 Par exemple, le filtre optique passe-bande 11 peut être constitué d'un filtre optique passe-bande de référence « Biom-0007 Rev A - 370/10 » commercialisé par la société Semrock, ayant les caractéristiques suivantes : - longueur d'onde centrale (CWL pour Central Wave Lenght) : 370 nm ; - largeur totale à la moitié du pic de transmission (FWHM pour Full Width at 15 Half Maximum) : 11,5 nm ± 1 nm ; - pourcentage de transmission au pic : 90 % ; - densité optique (OD pour Optical Density) > 5 pour la gamme 300-355 nm ; et - densité optique (OD pour Optical Density) > 4 pour la gamme 385-1000 nm. La courbe Cl de la figure 4 illustre le spectre de transmission d'un tel filtre optique passe-bande 11 en fonction de la longueur d'ondes (en nm). Bien entendu, d'autres couples de diode 10 et de filtre optique passe-bande 11 peuvent être envisagés. Dans tous les cas, il est indispensable de sélectionner une diode par sa bande spectrale d'émission en fonction de la bande spectrale de transmission du filtre optique passe-bande, ou inversement, étant donné qu'il faut faire coïncider ces deux bandes spectrales relativement étroites. Pour canaliser le rayonnement émis par la diode 10 et filtré par le filtre optique passe-bande 11, le système 1 comprend, derrière le filtre optique 30 passe-bande 11, une lentille de convergence 12, telle qu'une lentille plan-convexe particulièrement bien adaptée pour une diode UV. Le système 1 comprend en outre, derrière la lentille de convergence 12, un diviseur optique 13 pour diviser le faisceau principal FP en un premier faisceau d'excitation FE de l'échantillon et un second faisceau de 35 référence FR. Ce diviseur optique 13 est par exemple réalisé sous la forme d'un miroir semi-réfléchissant ou prisme semi-réfléchissant ou lame séparatrice (beam splitter en anglais). Par exemple, le diviseur optique 13 peut être constitué d'un prisme semi-réfléchissant en verre de type BK7 présentant un taux de réfraction (ou transmission) d'environ 95 %, et un taux de réflexion d'environ 5 % ; le premier faisceau d'excitation FE correspondant au faisceau réfracté (ou transmis) par le diviseur optique 13 et le second faisceau de référence FR correspondant au faisceau réfléchi par le diviseur optique 13. La figure 5 illustre le spectre de transmission d'un tel prisme semi-réfléchissant en verre de type BK7. Comme décrit ultérieurement, il est indispensable de récupérer une partie du faisceau principal FP sous la forme du second faisceau de référence FR, pour réaliser la détection de l'intensité de la diode 10 et contrôler sa stabilité. En outre, le taux de réfraction (ou transmission) sera ultérieurement pris en compte dans la détermination de l'énergie transmise à l'échantillon E. Le système 1 comprend également un support S pour l'échantillon E, ce support S étant positionné pour que le premier faisceau d'excitation FE irradie l'échantillon E et excite la 4-MU qui émettra alors un rayonnement de fluorescence RF sous l'effet de l'excitation induite par ce premier faisceau d'excitation FE. Le rayonnement de fluorescence RF de la 4-MU (ou signal de fluorescence de la 4-MU) présente un pic d'émission à environ 450 nm. La courbe Cl 1 de la figure 7 illustre le spectre de fluorescence de la 4-MU qui présente un pic d'émission à environ 450 nm. Le système 1 comprend un premier moyen photodétecteur 14 conçu pour détecter ce rayonnement de fluorescence RF, et délivrer un premier signal analogique de détection SAD1 en réponse à une détection de ce rayonnement de fluorescence RF. Le premier moyen photodétecteur 14 est par exemple du type photodiode, et le premier signal analogique de détection SAD1 correspond à un courant de diode (intensité en ampère). Par exemple, le premier moyen photodétecteur 14 est constitué d'une photodiode à silicium de référence « S1227 BR » commercialisée par la société Hamamatsu, et dont la figure 6 illustre la variation de la photosensibilité en fonction de la longueur d'onde du rayonnement détecté, à une température de 25°C. On note ainsi qu'une telle photodiode à silicium présente une photosensibilité de l'ordre de 0,25 A/W pour une longueur d'onde de l'ordre de 450 nm, correspondant pour rappel à la longueur du pic d'émission du rayonnement de fluorescence RF de la 4-MU. Pour que le premier moyen photodétecteur 14 soit sensible au rayonnement de fluorescence RF de la 4-MU, le système 1 comprend, dans un canal de guidage du rayonnement de fluorescence RF placé entre l'échantillon E et le premier moyen photodétecteur 14, un filtre optique passe-bande 141 et un guide d'ondes 142. Le filtre optique passe-bande 141 est centré sensiblement sur la longueur d'onde du rayonnement de fluorescence RF, et donc sur la longueur 10 d'onde de 450 nm pour la détection de la fluorescence de la 4-MU. Par exemple, le filtre optique passe-bande 141 présente les caractéristiques optiques suivantes : - longueur d'onde centrale : 450 nm ± 5 nm ; - largeur de la bande-passante : 40 nm ± 4 nm ; 15 - pourcentage de transmission à la longueur d'onde centrale > 45 %, de l'ordre de 80 à 90 %. La courbe C13 de la figure 7 illustre le spectre de transmission d'un tel filtre optique passe-bande 141, qui présente un pic de transmission coïncidant sensiblement avec le pic du spectre de fluorescence de la 4-MU 20 illustré sur la courbe C11. Le guide d'ondes 142 est réalisé de préférence sous la forme d'un cône de guidage ou cône optique, par exemple en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), afin de canaliser le rayonnement de fluorescence RF filtré par le filtre optique passe-bande 141 en direction du premier moyen 25 photodétecteur 14. Par exemple, le cône de guidage 142 peut présenter une caractéristique de filtre passe-haut, avec une fréquence basse de coupure inférieure à la longueur d'onde du rayonnement de fluorescence RF, en l'occurrence inférieure à 450 nm. La courbe C12 de la figure 7 illustre le 30 spectre de transmission d'un tel cône de guidage 142 qui présente une longueur d'onde basse de coupure de l'ordre de 375-385 nm. La figure 7 illustre que le cône de guidage 142 n'influe pas sur le rayonnement de fluorescence RF en termes spectrales, et que le filtre optique passe-bande 141 sélectionné est adapté pour la détection par le premier 35 moyen photodétecteur 14. En effet, les caractéristiques optiques du filtre optique passe-bande 141 coïncident sensiblement avec le spectre d'émission 2 9805 77 13 du rayonnement de fluorescence RF et atténuent fortement les signaux d'excitation interférents pouvant être émis par l'échantillon E irradié. Le système comprend également une lentille de convergence 143 disposé en entrée du canal de guidage du rayonnement de fluorescence RF, 5 avant le filtre optique passe-bande 141 pour faire converger le rayonnement de fluorescence RF vers le cône de guidage 142 ; cette lentille de convergence 143 pouvant être du type lentille biconvexe. Ainsi, le premier faisceau d'excitation FE interagit avec le milieu contenu dans l'échantillon E, provoquant ainsi l'émission d'un rayonnement de fluorescence RF qui est collecté par la lentille 143, avant de passer par le filtre optique passe-bande 141 et le cône de guidage 142 jusqu'au premier moyen photodétecteur 14. Le système 1 comprend également un second moyen photodétecteur 15 conçu pour détecter le second faisceau de référence FR, et délivrer un second signal analogique de détection SAD2 en réponse à une détection de ce le second faisceau de référence FR. Le second moyen photodétecteur 15 est par exemple du type photodiode, et le second signal analogique de détection SAD2 correspond à un courant de diode (intensité en ampère). Par exemple, le second moyen photodétecteur 15 est du même type que le premier moyen photodétecteur 14 et peut être est constitué d'une photodiode à silicium de référence « S1227 BR » commercialisé par la société Hamamatsu, et dont la figure 6 illustre la variation de la photosensibilité en fonction de la longueur d'onde du rayonnement détecté, à une température de 25°C. On note ainsi qu'une telle photodiode à silicium présente une photosensibilité de l'ordre de 0,17 A/W pour une longueur d'onde de l'ordre de 370 nm, correspondant pour rappel sensiblement à la longueur du faisceau principal FP, et donc du second faisceau de référence FR, après passage à travers le filtre optique passe-bande 11 décrit ci-dessus. Pour que le second moyen photodétecteur 15 soit sensible au second faisceau de référence FR, le système 1 comprend, dans un canal de guidage du second faisceau de référence FR placé entre le diviseur optique 13 et le second moyen photodétecteur 15, un filtre passe-bas 151 et un guide d'ondes 152. Le filtre optique passe-bas 151 présente une longueur d'onde basse de coupure sensiblement inférieure à la longueur d'onde du second faisceau de référence FR, qui pour rappel est de l'ordre de 370 nm. Par exemple, le filtre optique passe-bas 151 présente les 5 caractéristiques optiques suivantes : - pourcentage de transmission de l'ordre de 40 % ± 5 % pour la gamme de longueur de d'ondes comprise entre 360 et 380 nm ; - pourcentage de transmission inférieur à 1 % pour la gamme de longueur de d'ondes comprise entre 405 et 790 nm ; et 10 - pourcentage de transmission de l'ordre de 0,2 % pour la gamme de longueur de d'ondes comprise entre 425 et 790 nm. Le guide d'ondes 152 est réalisé de préférence sous la forme d'un cône de guidage ou cône optique, par exemple en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), afin de canaliser le second faisceau de référence FR filtré 15 par le filtre optique passe-bas 151 en direction du second moyen photodétecteur 15. Dans le mode de réalisation de la figure 3, des miroirs réfléchissants 144 et 154 sont disposés à 45° respectivement après la lentille de convergence 143 sur le canal de guidage du rayonnement de fluorescence 20 RF et après le diviseur optique 13 sur le canal de guidage du second faisceau de référence FR, pour pouvoir disposer les deux moyens photodétecteur 14, 15 en-dessous de la diode 10. Dans d'autres modes de réalisation non illustrés, d'autres éléments optiques peuvent être incorporés comme par exemple des lentilles 25 supplémentaires. La deuxième partie de la description qui suit porte sur la partie traitement du signal du système 1 conforme à l'invention, qui permet d'analyser les signaux en provenance des deux moyens photodétecteur 14, 15 et de contrôler la diode 10 pour réaliser une détection par fluorimétrie de l'analyte 30 présent dans l'échantillon E, avec l'avantage d'obtenir un rapport signal sur bruit très satisfaisant. La figure 8 illustre schématiquement un système 1 conforme à l'invention équipé de sa partie traitement du signal, selon une première configuration. 35 Cette partie traitement du signal comporte trois blocs principaux, à savoir : - un bloc de préamplification 2 (ou « Preamplification Board ») relié aux deux moyens photodétecteur 14, 15 ; - un bloc de traitement numérique du signal 3 (ou « Digital Signal Process Board ») disposé en sortie du bloc de préamplification 2 pour calculer la 5 quantité d'analyte présent dans l'échantillon ; et - un bloc de pilotage 4 de la diode 10 (ou « LED Driver Board ») disposé en sortie du bloc de traitement numérique du signal 3 et pilotant en courant la diode 10. Le bloc de préamplification 2 comprend : 10 - un premier moyen de conversion analogique/numérique 21 relié au premier moyen photodétecteur 14 pour convertir le premier signal analogique de détection SAD1 en un premier signal numérique dit de fluorescence SFN. - un second moyen de conversion analogique/numérique 22 relié au second moyen photodétecteur 15 pour convertir le second signal analogique de 15 détection SAD2 en un second signal numérique dit de référence SRN. La figure 12 relative à une seconde configuration du système 1, illustre de manière plus complète et détaillée le bloc de préamplification 2. Comme visible sur cette figure 12, le premier moyen de conversion analogique/numérique 21 comprend : 20 - un premier convertisseur courant/tension 23 pour convertir le premier signal analogique de détection SAD1 (intensité en ampère) en une première tension de détection VD1 (en volt), avec une conversion du type VD1= SAD1. RD1, où RD1 correspond à une première résistance en Ohm employée pour la conversion courant SAD1 / tension VD1 ; et 25 - un premier convertisseur analogique/numérique 24 en sortie du premier convertisseur courant/tension 23 pour convertir la première tension de détection VD1 en le premier signal numérique dit de fluorescence SFN. De même, le second moyen de conversion analogique/numérique 22 comprend : 30 - un second convertisseur courant/tension 25 pour convertir le second signal analogique de détection SAD2 (intensité en ampère) en une seconde tension de détection VD2 (en volt), avec une conversion du type VD2= SAD2. RD2, où RD2 correspond à une seconde résistance en Ohm employée pour la conversion courant SAD2 / tension VD2 ; et - un second convertisseur analogique/numérique 26 en sortie du second convertisseur courant/tension 25 pour convertir la seconde tension de détection VD2 en le second signal numérique dit de référence SRN. Dans un perfectionnement illustré sur la figure 12, le premier 5 moyen de conversion analogique/numérique 21 comprend en outre un premier soustracteur 27 qui soustrait à la première tension de détection VD1 une tension de décalage dite tension d'offset VOFF, afin de délivrer en sortie une tension VS1=VoFF-VD1, ce premier soustracteur 27 étant intercalé entre le premier convertisseur courant/tension 23 et le premier convertisseur 10 analogique/numérique 24. De même, le second moyen de conversion analogique/numérique 22 comprend en outre un second soustracteur 28 qui soustrait à la seconde tension de détection VD2 la même tension de décalage dite tension d'offset Voff, afin de délivrer en sortie une tension VS2=VoFF-VD2, ce second 15 soustracteur 28 étant intercalé entre le second convertisseur courant/tension 25 et le second convertisseur analogique/numérique 26. L'introduction d'une tension de décalage VOFF permet d'utiliser toute la dynamique d'entrée des convertisseurs analogique/numérique 24, 26, en injectant dans ces derniers des tensions adaptés à leurs performances. 20 Comme illustré sur la figure 8, le bloc de traitement numérique du signal 3 comprend un module de génération de signaux de modulation/démodulation 30, qui comprend : - un générateur 300 délivrant un signal sinusoïdal porteur SNM à une fréquence porteuse fo prédéfinie, qui est fixée pour la suite de la description à 25 2kHz ; et - un module de sortie analogique 301 disposé en sortie du générateur 30. En référence à la figure 9, le signal sinusoïdal porteur SNM est transmis dans des paquets de données numériques de 16 bits, et se présente sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales. 30 Dans l'exemple des figures 9 et 10 (la figure 10 illustrant l'une des cinq itérations des trois courbes de la figure 9), le nombre d'itérations est de quatre et chaque itération est formée de trente et une oscillations sinusoïdales. Chaque oscillation sinusoïdale (autrement une période unique du signal sinusoïdal) est construite avec quarante points d'échantillonnage espacés 35 chacun de 12,5 ps (soit 0,0125 ms). Ainsi, la période du signal sinusoïdal à l'intérieur d'une itération est de 500 ps (soit 0,5 ms, correspondant à quarante fois 0,0125 ms). En conséquence, chaque itération sinusoïdale dure 15,5 ms, équivalent à trente et une fois la période de 0,5 ms, du fait des trente et une oscillations sinusoïdales dans une itération. L'écart de temps entre deux itérations consécutives, autrement dit entre la fin d'une itération et le début d'une itération, est de 80 ms, largement supérieur à la période des oscillations sinusoïdales (0,5 ms) et à la durée d'une itération (15,5 ms). Ainsi, la périodicité des itérations est de 95,5 ms et au total, une série de quatre itérations dure globalement 302 ms entre les première et dernière itérations. Le générateur 300 émet également deux signaux numériques de démodulation à cette même fréquence porteuse fo, à savoir : - un signal numérique de démodulation SINE à la fréquence porteuse fo et en 15 phase avec le signal sinusoïdal porteur SNM, ce signal numérique de démodulation SINE étant identique au signal sinusoïdal porteur SNM ; et - un signal numérique de démodulation COSINE à la fréquence porteuse fo et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal porteur SNM. Pour cela, le générateur 300 intègre un déphaseur à 90° pour 20 générer le signal numérique de démodulation COSINE. Le module de sortie analogique 301, en sortie du générateur 300, comprend successivement : - un moyen de conversion numérique/analogique 303 pour convertir le signal sinusoïdal porteur SNM, avant filtrage, en un signal analogique de modulation 25 initial SAM° à la fréquence porteuse fo ; et - en sortie du moyen de conversion numérique/analogique 303, un module de traitement analogique 304 qui traite analogiquement le signal analogique de modulation initial SAM° pour délivrer un signal analogique de modulation SAM (ou « LED Signal ») à la fréquence porteuse fo, ce signal analogique de 30 modulation SAM formant un signal de pilotage analogique de la diode 10. Comme illustré sur la figure 12, ce module de traitement analogique 304 comporte successivement : - un filtre passe-bas 305 du type filtre RC ; - en sortie du filtre passe-bas 305, un soustracteur 306 qui soustrait à la 35 tension en sortie du filtre 305 une tension dite d'offset Txoffset, qui permet de maintenir la diode 10 éteinte quand le signal analogique de modulation initial SAM° est nul, avec par exemple Txoffset = 0,012 V ; et - en sortie du soustracteur 306, un amplificateur 307 de gain prédéfini, et qui délivre en sortie le signal analogique de modulation SAM. Avant de poursuivre avec la description du bloc de traitement numérique du signal 3, il est à noter que le bloc de pilotage 4 comprend un modulateur d'amplitude relié au moyen de conversion numérique/analogique 303 et à la diode 10 pour moduler en amplitude le faisceau principal FP à la fréquence porteuse fo, par application du signal analogique de modulation SAM sur la diode 10. Le bloc de pilotage 4 comprend plus spécifiquement un convertisseur tension/courant 40 pour convertir le signal analogique de modulation SAM en un courant de pilotage ID de la diode 10 via une résistance RD en Ohm. La tension VD réelle mesurée aux bornes de la résistance RD correspond à un signal sinusoïdal de feed-back de la diode 10 (« Led Feedback Signal ») et répond à la relation VD=ID.RD. Ainsi, le bloc de pilotage 4 pilote en tension et donc en intensité la diode 10 de sorte que celle-ci émette un faisceau principal FP composé de plusieurs flashs régulièrement espacés dans le temps, chaque flash étant modulé à la fréquence porteuse fo, autrement dit présente une composante sinusoïdale à la fréquence porteuse fo. Dans l'exemple de la figure 12, le bloc de traitement numérique du signal 3 comprend en outre un module de contrôle rétroactif 308 qui reçoit en entrée la tension mesurée VD (signal sinusoïdal de feed-back) provenant du bloc de pilotage 4, afin de déterminer l'erreur ou l'écart entre cette tension VD mesurée aux bornes de la résistance RD et le signal analogique de modulation SAM qui pilote la diode 10, pour un asservissement par boucle de retour du courant de pilotage ID de la diode 10. Ce module de contrôle rétroactif 308 comporte successivement : - en sortie du bloc de pilotage 4, un sommateur 309 qui somme la tension mesurée VD et une tension dite d'offset Rxoffset, qui permet de compenser la tension négative VD entrante lorsque le signal analogique de modulation initial SAM° est nul, avec par exemple Rxoffset = 0,038 V ; - en sortie du sommateur 309, un amplificateur 313 de gain prédéfini ; et - en sortie de l'amplificateur 313, un convertisseur analogique/numérique 311 qui délivre en sortie un signal de feedback numérique SFD. Un premier objet de ce module de contrôle rétroactif 308 est de pouvoir ajuster l'amplitude et le zéro (classiquement appelé « offset ») du courant de pilotage ID (ID=VD/RD), afin que ce courant de pilotage ID corresponde au signal sinusoïdal souhaité. Un second objet de ce module de contrôle rétroactif 308 est de permettre de contrôler, à chaque itération du signal, le décalage entre le courant de pilotage ID et le signal analogique de modulation SAM, afin de générer des alertes si un seuil de décalage ou d'erreur est dépassé. Du fait de la modulation du faisceau principal FP, les deux signaux 10 analogiques de détection SAD1, SAD2, mesurés aux bornes de deux photodétecteurs 14, 15, se présentent également chacun sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales à la fréquence porteuse fo. Ainsi, et comme illustré sur les figures 9 et 10, le premier signal 15 numérique de fluorescence SFN (ou « Fluo Signal ») et le second signal numérique de référence SRN (ou « Ref Signal »), en sortie du bloc de préamplification 2, se présentent chacun sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales, ayant sensiblement les mêmes caractéristiques temporelles et fréquentielles que le signal sinusoïdal porteur 20 SNM. Le bloc de traitement numérique du signal 3 comprend un module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 disposé en sortie du générateur 300 et du bloc de préamplification 2. Ce bloc de traitement numérique du signal 3 comprend un premier module d'acquisition/traitement 32 25 du signal numérique de fluorescence SFN (ou « Fluo Signal ») et un second module d'acquisition/traitement 33 du second signal numérique de référence SRN (ou « Ref Signal »). D'un point de vue communication, le bloc de traitement numérique du signal 3 utilise pour la transmission du signal sinusoïdal porteur SNM et la 30 réception/acquisition du premier signal numérique de fluorescence SFN et du second signal numérique de référence SRN, un bus de communication BCO numérique comme par exemple du type SPI (Serial Peripheral Interface Bus) à 32 bits, capable de recevoir et émettre en même temps 32 bits. En référence à la figure 11, le générateur 300 du bloc de traitement 35 numérique du signal 3 émet à intervalle régulier un point d'échantillonnage PEM(i) (i étant un entier) pour le signal sinusoïdal porteur SNM dans un paquet de données PD11 de 16 bits de la trame de 32 bits, l'autre paquet de données PD12 de 16 bits étant inutilisé. Pour rappel, l'écart de temps entre deux points d'échantillonnage successifs PEM(i-1) et PEM(i) est de 12,5 ps (soit 0,0125 ms), ce qui correspond à un écart de temps entre deux trames successives de 12,5 ps. En référence à la figure 11, à chaque fois qu'un point d'échantillonnage PEM(i) est transmis pour le signal sinusoïdal porteur SNM, le bloc de traitement numérique du signal 3, et plus spécifiquement son module principal d'acquisition/traitement des signaux 31, réceptionne un point d'échantillonnage PEF(i-1) pour le premier signal numérique de fluorescence SFN et un point d'échantillonnage PER(i-1) pour le second signal numérique de référence SRN ; les points d'échantillonnage PEF(i-1) et PER(i-1) étant les réponses au point d'échantillonnage PEM(i-1) précédemment émis pour le signal sinusoïdal porteur SNM. Les points d'échantillonnage PEF(i-1) et PER(i- 1) sont transmis et réceptionnés dans deux paquets respectifs de données PD21, PD22 de 16 bits de la trame de 32 bits. Ainsi, l'intervalle de temps entre deux points d'échantillonnage PEM(i) pour le signal sinusoïdal porteur SNM (12,5 ps) correspond au même intervalle de temps d'acquisition entre les points d'échantillonnage PEF(i) et 20 PER(i). Grâce au procédé de démodulation d'amplitude en phase et en quadrature (Phase and Quadrature Coherent Demodulation Process) mis en oeuvre par le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 et décrit ultérieurement, tous les déphasages (« phase shifts ») éventuellement 25 introduits par le système n'affectent pas l'analyse des signaux pour extraire une valeur de quantification de l'analyte présent dans l'échantillon E ; de tels déphasages pouvant trouver leurs origines dans des délais de réponse entre le courant de pilotage ID et l'émission du faisceau principal FP, des délais introduits le long des chemins optiques des faisceaux FP, FE, FR, RF, des 30 délais de réponse entre la détection du rayonnement de fluorescence RF par la première photodiode 14 et la génération du premier signal analogique de détection SAD1, des délais de réponse entre la détection du second faisceau de référence FR par la seconde photodiode 15 et la génération du second signal analogique de détection SAD2, l'inversion de phase introduite par le 35 premier soustracteur 27 du premier moyen de conversion analogique/numérique 21 et l'inversion de phase introduite par le second soustracteur 28 du second moyen de conversion analogique/numérique 22 (voir figure 12), des délais d'amplification trans-impédance introduits par des condensateurs en parasitage. Il est particulièrement intéressant de générer un signal sinusoïdal 5 porteur SNM sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales. En effet, il est possible d'utiliser la première itération uniquement pour vérifier si les deux signaux analogiques de détection SAD1, SAD2 sont au-dessus de seuils minimaux prédéfinis, par exemple fixés à -7V et +8V. Si le 10 premier signal de détection SAD1 est en-dessous du seuil minimal correspondant, une boucle de retour est prévue pour réduire le signal analogique de modulation SAM, notamment de l'ordre de trois fois par rapport au signal initial. Ainsi, un coefficient de correction est appliqué en amont sur le 15 module du premier signal de détection SAD1, pour chaque itération, afin de compenser une décroissance du premier faisceau d'excitation FE. L'objet d'une telle boucle de retour est d'éviter une mauvaise lecture due à des saturations de canaux électronique, et également d'étendre la gamme de lecture par fluorescence, de sorte que même des hautes concentrations de 4-MU puissent 20 être détectées. Les trois autres itérations sont utilisées pour extraire les valeurs des modules du premier signal numérique de fluorescence SFN et du second signal numérique de référence SRN, pour chaque itération. A l'intérieur de chacune de ces trois itérations, la dernière 25 oscillation sinusoïdale est utilisée pour vérifier la tension VD, autrement appelée le signal sinusoïdal de feed-back de la diode 10 (« Led Feedback Signal »), qui correspond pour rappel à la tension réelle mesurée aux bornes de la diode 10. Pour précision, et en accord avec le principe de la modulation en 30 amplitude, le module du premier signal numérique de fluorescence SFN correspond à l'enveloppe de la partie sinusoïdale (à l'intérieur d'une itération sinusoïdale) du premier signal numérique de fluorescence SFN, et le module du second signal numérique de référence SRN correspond à l'enveloppe de la partie sinusoïdale (à l'intérieur d'une itération sinusoïdale) du second signal 35 numérique de référence SRN. 2 9 8 0 5 7 7 22 Dans l'exemple illustré sur les figures 9 et 10, les signaux numériques fluorescence SFN et de référence SRN sont des signaux modulés et les modules respectifs de ces deux signaux correspondent sensiblement à la moitié de l'amplitude en tension Vpp de la partie sinusoïdale du signal correspondant. Pour détecter un éventuel défaut ou une éventuelle défaillance de la diode 10 ou des dispositifs optiques 11, 12, 13 illustrés sur les figures 2 et 3, le bloc de traitement numérique du signal 3 vérifie automatiquement, à la fin de chaque itération, que le module du second signal numérique de référence SRN est compris à l'intérieur d'une gamme de fonctionnement prédéfinie, autrement dit entre deux seuils prédéfinis de sécurité. La suite de la description porte spécifiquement sur le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 qui permet de mettre en oeuvre d'un procédé de démodulation d'amplitude en phase et en quadrature. Le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 comporte, pour rappel : - un premier module d'acquisition/traitement 32 relié au générateur 300 et au premier moyen de conversion analogique/numérique 21 du bloc de préamplification 2, pour l'acquisition et le traitement du premier signal 20 numérique de fluorescence SFN ; et - un second module d'acquisition/traitement 33 relié au générateur 300 et au second moyen de conversion analogique/numérique 22 du bloc de préamplification 2, pour l'acquisition et le traitement du second signal numérique de référence SRN. 25 Le premier module d'acquisition/traitement 32 comprend un premier moyen de démodulation 34 conçu pour démoduler le premier signal numérique de fluorescence SFN, et comprenant : - un premier multiplicateur 341 par le signal numérique de démodulation SINE en phase, ce premier multiplicateur 341 étant suivi d'un premier filtre passe-bas 30 351 à une fréquence de coupure fc inférieure à la fréquence porteuse fo (par exemple fc = 11 0 Hz), afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en phase SFsiN ; et - un second multiplicateur 342 par le signal numérique de démodulation COSINE en quadrature de phase, ce second multiplicateur 342 étant suivi d'un 35 second filtre passe-bas 352 à la même fréquence de coupure fc, afin de 2 9805 77 23 délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en quadrature de phase SFcos. Le premier module d'acquisition/traitement 32 comporte en outre, en sortie des premier et second filtres passe-bas 351, 352, un moyen de calcul 5 353 d'une première valeur dite de fluorescence VALF caractéristique de l'amplitude du rayonnement de fluorescence RF, correspondant au module du premier signal numérique de fluorescence SFN et ainsi au module de la somme du premier signal démodulé de fluorescence en phase SFsiN et du premier signal démodulé de fluorescence en quadrature de phase SFcos. 10 Plus précisément, la première valeur de fluorescence VALF est calculée selon l'équation suivante : VALF = (SFsiN2 + SFcos2)1"2. Le premier module d'acquisition/traitement 32 comporte aussi, en entrée des premier et second multiplicateurs 341, 342 : - un filtre à encoche 361 centré sur la fréquence porteuse fo afin de filtrer le 15 premier signal numérique de fluorescence SFN et délivrer un premier signal intermédiaire filtré SFN' ; et - un soustracteur 362 réalisant la soustraction du premier signal numérique de fluorescence SFN et du premier signal intermédiaire filtré SFN', afin de générer un premier signal de fluorescence filtré SFN0 = SFN - SFN', ce premier signal de fluorescence filtré SFN0 étant injecté dans les premier et second multiplicateurs 341, 342. Le second module d'acquisition/traitement 33 comprend un second moyen de démodulation 37 conçu pour démoduler le second signal numérique de référence SRN, et comprenant : - un premier multiplicateur 371 par le signal numérique de démodulation SINE en phase, ce premier multiplicateur 371 étant suivi d'un premier filtre passe-bas 381 à la fréquence de coupure fc inférieure à la fréquence porteuse fo, afin de délivrer un second signal démodulé de référence dit en phase SRsiN ; et - un second multiplicateur 372 par le signal numérique de démodulation COSINE en quadrature de phase, ce second multiplicateur 372 étant suivi d'un second filtre passe-bas 382 à la même fréquence de coupure fc, afin de délivrer un second signal démodulé de fluorescence dit en quadrature de phase SRcos. Le second module d'acquisition/traitement 33 comporte en outre, 35 en sortie des premier et second filtres passe-bas 381, 382, un moyen de calcul 383 d'une seconde valeur dite de référence VALR caractéristique de 2 9805 77 24 l'amplitude du faisceau de référence FR, correspondant au module du second signal numérique de référence SRN et ainsi au module de la somme du second signal démodulé de référence en phase SRsiN et du second signal démodulé de référence en quadrature de phase SRcos. 5 Plus précisément, la seconde valeur de référence VALR est calculée selon l'équation suivante : VALR = (SRsiN2 + SRcos2)1"2. Le second module d'acquisition/traitement 33 comporte aussi, en entrée des premier et second multiplicateurs 371, 372 : - un filtre à encoche 391 centré sur la fréquence porteuse fo afin de filtrer le 10 second signal numérique de référence SRN et délivrer un second signal intermédiaire filtré SRN' ; et - un soustracteur 392 réalisant la soustraction du second signal numérique de référence SRN et du second signal intermédiaire filtré SRN', afin de générer un second signal de référence filtré SRN0 = SRN - SRN', ce second signal de 15 référence filtré SRN0 étant injecté dans les premier et second multiplicateurs 371, 372. La suite de la description porte sur les calculs mis en oeuvre pour déterminer la fluorescence de l'échantillon E en l'exprimant sous forme d'unité relative de fluorescence (ou RFU pour Relative Fluorescence Unit), l'unité 20 relative de fluorescence étant définie comme le ratio entre l'intensité de fluorescence et l'intensité d'excitation. Les valeurs de RFU sont généralement ajustées pour une échelle de valeurs désirée, déterminée par un procédé de calibration préalable. Dans le cas du présent système 1, pour une concentration « x » 25 donnée de la 4-MU contenue dans l'échantillon E lors de la mesure par fluorimétrie, la valeur de RFU calibrée est calculée comme suit : RFUcai(x) = (Fx.gFLuo) / (Rx.gREF) , où - Fx est une valeur brute en mV du signal de fluorescence détecté au premier photodétecteur, qui correspond dans le cadre de l'invention à la 30 première valeur de fluorescence VALF (donnée numérique) issue du procédé de démodulation mis en oeuvre dans le bloc de traitement numérique du signal 3 ; - Rx est une valeur brute en mV du signal de référence détecté au second photodétecteur, qui correspond dans le cadre de l'invention à la seconde valeur de référence VALR (donnée numérique) issue du procédé de démodulation mis en oeuvre dans le bloc de traitement numérique du signal 3 , et - gFLuo et gREF sont des paramètres de gain ajustés durant la calibration optique du système 1. Le procédé de calibration est effectué par une analyse préalable, par fluorimétrie, d'une solution liquide de référence présentant une concentration CREF connue de la 4-MU et donnant une valeur donnée de RFUREF, avec par exemple CREF = 6410 nM et RFUREF = 3144 avec un certain intervalle de précision. Les paramètres de gain gFLuo et gREF sont établis durant l'analyse pour obtenir en sortie un RFU de l'ordre de RFUREF. Dans le cadre d'un test immunologique, la concentration de la 4-MU se situe dans la gamme 40 nM - 40000 nM. La figure 13 illustre la variation du RFU en fonction de la concentration en 4-MU, avec RFU fonction non linéaire de la concentration en 4-MU. Pour obtenir une telle courbe avec un système 1 conforme à l'invention, il est prévu d'appliquer sur la sortie du bloc de traitement numérique du signal 3 un facteur de conversion FCONV, en l'occurrence une fonction polynomiale de la concentration en 4-MU, pour que le RFU mesuré par le système 1 coïncide avec la courbe illustrée en figure 13 et ainsi obtenir la forme de courbe désirée. Ce facteur de conversion FCONV est établi en suivant un protocole d'analyses par fluorimétrie incluant plusieurs facteurs de variation (différentes solutions de 4-MU et différents instruments optiques) afin d'assurer la robustesse et la répétabilité de la mesure. Le détail des calculs est décrit ci-après. Dans un premier temps, on établit le courant de pilotage ID(t) de la 25 diode 10, issu de la conversion du signal analogique de modulation SAM. Pour une impulsion sinusoïdale, le courant de pilotage ID(t) (ou courant de diode) répond à l'équation (El) suivante : ID(t)= [A+B.sin (2-rrfot)].rect-r(t), soit ID(t)= [A+B.cos (2-rrfot - 7/2)].rect-r(t) (El) 30 où - fo = 2KHz (fréquence porteuse), - T = 15,5 ms (durée d'une impulsion sinusoïdale), - A correspond à l'intensité d'offset (décalage par rapport au zéro), qui peut prendre la valeur de 15 mA, et 2 9805 77 26 - B correspond à la demi amplitude du courant de pilotage, qui peut prendre la valeur de 10 mA. La figure 14 illustre ce courant de pilotage ID(t) en fonction du temps t pour une impulsion. 5 Dans le domaine fréquentiel, cette équation (El ) se traduit par l'équation (E2) suivante : ID(f)= A.T.sinc(fT)+B.T/2.(eird2.sinc[(f-fo)T)] + enT/2.sinc[(f+fo)T)]) (E2) La figure 15 illustre ID(f) en fonction de la fréquence f. Dans un deuxième temps, le courant de pilotage ID(t) (signal 10 porteur issu du procédé de modulation à la fréquence porteuse fo) est converti en le faisceau principal FP à une longueur d'onde donnée, en l'occurrence autour de 370 nm, avant d'être divisé en un premier faisceau d'excitation FE et un second faisceau de référence FR. Le premier faisceau d'excitation FE excite l'échantillon et les molécules de 4-MU, qui émettent en retour un rayonnement 15 de fluorescence RF détecté par le premier photodétecteur 14 ; cette photodétection se traduisant par un premier signal analogique de détection SAD1 aux bornes du premier photodétecteur 14. On établit l'équation (E3) suivante qui traduit le passage du courant de pilotage ID(t) vers le premier signal analogique de détection SAD1(t), signal 20 en sortie du premier photodétecteur 14 et à l'entrée du premier moyen de conversion analogique/numérique 21 ou du premier convertisseur analogique/numérique 24 : SAD1(t) = z(t),ID(t), soit SAD1(t) = K.[A+B.cos(2-rrfot - 7/2 + A)].rect-r(t), soit SAD1(t) = K.A.rectT(t) + [K.B.cos(2-rrfot + a )].rectT(t) (E3) où - z(t) est le signal d'amplification traduisant l'émission du rayonnement de fluorescence RF, et que l'on considère comme constant et égal à la constante K ; - a = 0-712, avec A correspondant à un déphasage introduit par le système entre la diode 10 et le premier photodétecteur 14. La figure 16 illustre ce premier signal analogique de détection SAD1(t) en fonction du temps t pour une impulsion. 2 9805 77 27 Dans un troisième temps, le signal analogique de détection SAD1(t) est converti en signal numérique pour donner le premier signal numérique de fluorescence SFN, après le passage dans le premier moyen de conversion analogique/numérique 21. Dans le domaine fréquentiel, on obtient 5 ainsi l'équation (E4) suivante : SFN(f) = K.A.T.sinc(fT)+K.B.T/2.(eJa.sinc[(f-fo)T)] + e- .sinc[(f+fo)T)]), soit SFN(f) = Y(f) = K.A.T.sinc(fT)+K.B.T/2.(eJa.sinc[(f-fo)T)] + ela.sinc[(f+fo)T)]) (E4) La figure 17 illustre SFN(f) en fonction de la fréquence f. Le premier signal numérique de fluorescence SFN est ensuite 10 acquis et traité par le bloc de traitement numérique du signal 3, et plus spécifiquement par le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31, selon les étapes suivantes du procédé de démodulation. Dans une première étape du procédé de démodulation, le premier signal numérique de fluorescence SFN(f) passe par un filtre passe-bande 15 composé du filtre à encoche 361 associé au soustracteur 362. Le filtre à encoche 361 se traduit par une fonction HNotch(f) centrée sur la fréquence porteuse f, avec une fréquence de coupure basse = 'fol - fdec et une fréquence de coupure haute f2 = 'fol+ fdec, où fdec peut être fixé à 100 Hz, de sorte que la largeur fréquentielle Af -notch de l'encoche est 20 Afnotch = 2.fdec = 200Hz. La figure 18 illustre la fonction HNotch(f) en fonction de la fréquence f. Le premier signal intermédiaire filtré SFN'(f) répond donc à l'équation SFN'(f) =1-1Notch(f). SFN(f). Ainsi, le filtre passe-bande composé du filtre à encoche 361 25 associé au soustracteur 362, se traduit par une fonction HBp(f) =1 - HNotch(f), qui est appliqué au premier signal numérique de fluorescence SFN(f). Le premier signal de fluorescence filtré SFN0(f) = SFN(f) - SFN'(f), répond ainsi à l'équation (E5) suivante : SFN0(f) = HBp(f).SFN(f) = (1 - HNotch(f)).SFN(f), soit 30 SFN0(f) = K.B.T/2.( eJa.sinc[(f-fo)T)] + ela.sinc[(f+t)T)]) (E5) La figure 19 illustre SFN0(f) en fonction de la fréquence f. Dans le domaine temporel, cette équation (E5) se traduit par l'équation (E6) suivante : SFN0(t) = [K.B.cos(2-rrfot + a)].rect-r(t), donc SFN0(t) = K.B.rectT(t).cos(a).cos(2-rrfot) - K.B.rectT(t).sin(a).sin(2-rrfot), soit SFN0(t) = Kc(t).cos(2-rrfot) - Ks(t).sin(2-rrfot) (E6) avec Kc(t) = K.B.rectT(t) cos(a) et Ks(t) = K.B.rect T(t).sin(a) Dans une deuxième étape du procédé de démodulation, le premier 5 signal de fluorescence filtré SFN0 passe par les deux multiplicateurs 341, 342 afin d'être multiplié aux signaux numériques de démodulation SINE et COSINE. Pour la description de cette deuxième étape, nous nous référerons utilement à la figure 20 qui illustre spécifiquement les deux multiplicateurs 341, 342, ainsi que les filtres passe-bas 351, 352 et le moyen de calcul 353 qui 10 suivent. Le signal SFN0(t) est multiplié, d'une part, dans le premier multiplicateur 341 par le signal numérique de démodulation SINE afin de générer en sortie un premier signal démodulé intermédiaire en phase SFsIN'(t) et, d'autre part, dans le second multiplicateur 342 par le signal numérique de 15 démodulation COSINE afin de générer en sortie un premier signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFcos'(t). Les signaux numériques de démodulation SINE et COSINE se présentent sous les formes temporelles suivantes : SINE(t) = Ks,n.sin(2-rrfot) = 2.sin(2-rrfot), et 20 COSINE(t) = Kc'.cos(2-rrfot) = 2.cos(2-rrfot) où Ks,n et Kc' correspondent aux amplitudes des signaux et sont fixés à la valeur de 2. Le signal démodulé intermédiaire en phase SFsiN'(t) et le signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFcos'(t) répondent aux 25 équations suivantes (E7) et (E8), dans le domaine temporel : SFsiN'(t) = [Kc(t).cos(2-rrfot) - Ks(t).sin(2-rrfot) ].2 sin(2-rrfot), soit SFsIN'(t) = 2.[1/2.Ks(t) - 1/2.Kc(t).cos(272fot) - 1/2.Ks(t).sin(272fot)], soit SFsiN'(t) = Ks(t) - Kc(t).cos(272fot) - Ks(t).sin(272fot) (E7) 30 SFcos'(t) = [Kc(t).cos(2-rrfot) - Ks(t).sin(2-rrfot) ].2 cos(2-rrfot), soit SFcos'(t) = 2.[1/2.Kc(t) + 1/2.Kc(t).cos(272fot) - 1/2.Ks(t).sin(272fot)], soit SFcos'(t) = Kc(t) + Kc(t).cos(272fot) - Ks(t).sin(272fot) (E8) Dans le domaine fréquentiel, ces équations (E7) et (E8) se traduisent par les équations (E9) et (E10) suivantes : SFsIN'(f) = [K.B.T.sin(a)].sinc(fT) - [(K.B.T.cos(a))/2].(sinc[(f-2QT)] + sinc[(f+2fo)T)]) - [(K.B.T.sin(a))/2].(eird2.sinc[(f-2fo)T)] + enT/2.sinc[(f+2fo)T)]) (E9) SFcos'(f) = [K.B.T.cos(a)].sinc(fT) + [(K.B.T.cos(a))/2].(sinc[(f-2fo)T)]+sinc[(f-F2fo)T)]) - [(K.B.T.sin(a))/2] (eird2.sinc[(f-2fo)T)] + enT/2.sinc[(f+2fo)T)]) (El 0) La figure 21 illustre SFsIN'(f) en fonction de la fréquence f et la figure 22 illustre SFcos'(f) en fonction de la fréquence f. Dans une troisième étape du procédé de démodulation, le signal 15 démodulé intermédiaire en phase SFsIN' et le signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFcos' sont filtrés par les filtres passe-bas 351, 352 respectifs, qui délivrent en sortie respectivement un premier signal démodulé en phase SFsIN et un premier signal démodulé en quadrature de phase SFcos. Chaque filtre passe-bas 351, 352 se traduit par une fonction HLp(f) 20 avec une fréquence de coupure fc fixée ici à 110 Hz. Dans un perfectionnement non illustré, chaque filtre passe-bas 351, 352 est suivi d'un filtre passe-bas de lissage (ou smooth low pass filter) qui se traduit par une fonction HLpsmooth(f) illustrée en figure 23, avec des fréquences de coupure à fcl = 2fo, fc2 = 4fo, etc. Chaque filtre passe-bas de lissage 25 permet d'effectuer une moyenne sur les vingt derniers points d'échantillonnage issus du filtre passe-bas HLp(f) précédent, pour augmenter le rejet des signaux aux fréquences de coupure multiple de 2fo. Le premier signal démodulé en phase SFsIN et le premier signal démodulé en quadrature de phase SFcos répondent aux équations suivantes 30 (El 1) et (El 2), dans le domaine fréquentiel : SFsIN(f) = SFsIN'(f).HLp(f).HLpsmooth(f) = [K.B.T.sin(a)].sinc(fT) (El 1) SFcos(f) = SFcos'(f).HLp(f).HLpsmooth(f) = [K.B.T.cos(a)] sinc(fT) (El 2) Les figures 24 et 25 illustrent respectivement les signaux SFsIN(f) et SFcos(f) en fonction de la fréquence f. 35 Dans le domaine temporel, ces équations (E11) et (E12) se traduisent par les équations (E13) et (E14) suivantes : 2 9805 77 30 SFsiN(t) = Ks(t) = K.B.rect T(t).sin(a) (E13) SFcos(t) = Kc(t) = K.B.rect-r(t).cos(a) (E14) Dans une quatrième étape du procédé de démodulation, le premier signal démodulé en phase SFsIN et le premier signal démodulé en quadrature 5 de phase SFcos sont injectés dans le moyen de calcul 353, afin de calculer le module du premier signal analogique de détection SAD1(t), qui correspond au module du signal [(SFsiN(t) + SFcos(t))2]1/2 ; ces étapes du procédé de démodulation permettant d'extraire le signal d'amplification z(t) sans être affecté par le déphasage inconnu introduit par le système. 10 Le module calculé, correspondant à la première valeur de fluorescence VALF générée en sortie du module principal d'acquisition/traitement des signaux 31, répond à l'équation (E15) suivante : VALF = Module [SAD1(t)], soit VALF = [Kc(t)2 + Ks(t)2]1"2 VALF = [(K.B.rectT(t).cos(a))2 + [K.B.rectT(t).sinowi1/2 VALF = [(K.B.rectT(t))2.(cos(a)2-F si n (a)2)]1/2 VALF = K.B.rectT(t) et donc, étant donné que rect T(t) = 1 pour t