Brevet FR2969174A1 — publié le 20120622

LIGAND SPECIFIQUE DE LA PROTEINE LAR Domaine de l'invention La présente invention concerne un ligand spécifique de la protéine LAR, ainsi que son 5 utilisation diagnostique et thérapeutique, ou son utilisation pour la détection in vitro de la protéine LAR dans un échantillon biologique. Arrière-plan technique La protéine tyrosine phosphatase apparentée à l'antigène leucocytaire commun, PTP 10 LAR (Protein Tyrosine Phospatase Leukocyte common Antigen-Related), ou protéine LAR, connue également sous le nom de protéine tyrosine phosphatase, de type récepteur, F, PTPRF (Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor type, F), joue un rôle important dans le développement des glandes mammaires (Schaapveld et al. (1997) Dev. Biol. 188:134-146) et dans la tumorigenèse du cancer du sein (Freiss et al. (2004) Critical Reviews in 15 Oncology/Hematology. 52:9-17). Il a été démontré, entre autres, que l'expression de la protéine LAR est augmentée dans les cellules de cancer du sein, notamment transformées avec l'oncogène ErbB-2 (Yang et al. (1999) Mol. Carcinog. 25:139-149 ; LeVea et al. (2000) Breast Cancer Reasearch and Treatment 64:221-228). D'autre part, il semblerait que la protéine LAR soit importante pour la régulation de l'activité de plusieurs récepteurs tyrosine 20 kinase (Kulas et al. (1996) JBiol Chem 271:748-754). La protéine LAR peut également servir de biomarqueur pour prédire la réponse à des traitements anti-EGFR pour le cancer du sein (WO2009021684). En outre, cette protéine est un inhibiteur connu des voie d'activation de l'insuline et un niveau d'expression accru de cette protéine a été trouvé dans les tissus insulino-sensibles des 25 obèses et des personnes insulino-résistantes (Ahmad et al. (1995) J Clin Invest 95:2806-2812). Ainsi, il a été démontré que la protéine LAR pouvait contribuer à des pathologies liées à la résistance à l'insuline comme les maladies coronariennes chez les patients atteints de diabète de type 2 (Menzaghi et al. (2008) Jlntern Med 263:653-654). Les ligands de la protéine LAR identifiés jusqu'à ce jour, essentiellement de type 30 immunoglobuline, présentent des limitations, notamment en terme de coût de synthèse, d'immunogénicité ou d'affinité pour leur cible. Résumé de l'invention La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, d'un aptamère, de nature nucléotidique, reconnaissant spécifiquement la protéine LAR à la surface de cellules, avec une constante de dissociation de l'ordre du nanomolaire. Ainsi, la présente invention concerne un aptamère comprenant un acide nucléique capable de reconnaître spécifiquement la protéine LAR à la surface d'une cellule. Plus particulièrement, l'invention concerne un aptamère comprenant, ou consistant en, un acide nucléique comprenant, ou constitué de : la séquence ACUGUCCCAGUAUGACGCGACUGCUUAGGUGGGAUGUUUCCC 10 AUGCCUCG (SEQ ID NO : 1), ou une séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, sous réserve qu'un acide nucléique constitué de cette séquence se lie à la protéine LAR. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'aptamère selon 15 l'invention, pour son utilisation à titre de médicament ou d'agent diagnostique. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou diagnostique comprenant, à titre de substance active, au moins un aptamère selon l'invention, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. A ce titre, l'invention concerne également une méthode in vitro de diagnostic d'un 20 cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mettre en contact l'échantillon biologique avec un aptamère selon l'invention ; - déterminer la quantité d'aptamère fixé dans l'échantillon ; - éventuellement comparer la quantité d'aptamère fixé dans l'échantillon à au moins une valeur prédéterminée 25 en déduire si l'individu est atteint d'un cancer. La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : administrer un aptamère selon l'invention à l'individu ; - détecter, quantifier et/ou localiser l'aptamère dans l'individu ou une partie de 30 l'individu ; - en déduire si l'individu est atteint d'un cancer. La présente invention concerne également l'utilisation in vitro d'un aptamère selon l'invention, pour détecter la présence de protéine LAR, ou déterminer la quantité de protéine LAR, présente dans un échantillon biologique. La présente invention concerne une méthode in vitro de détection ou détermination de la quantité de protéine LAR dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : - mettre en contact l'échantillon biologique avec un aptamère selon l'invention ; quantifier, ou détecter la présence ou l'absence d'aptamère fixé dans l'échantillon ; - en déduire la quantité, ou la présence ou l'absence de protéine LAR dans l'échantillon. La présente invention concerne également une méthode de détection, de quantification ou de localisation de protéine LAR, dans un individu ou une partie d'un individu, comprenant les étapes suivantes : administrer un aptamère ou une composition diagnostique tel que défini ci-dessus à 10 l'individu ; détecter, quantifier et/ou localiser l'aptamère dans l'individu ou une partie de l'individu ; en déduire la présence ou l'absence, la quantité, et/ou la localisation de protéine LAR dans l'individu ou la partie de l'individu. 15 La présente invention concerne également l'utilisation d'un aptamère tel que défini ci-dessus, pour le criblage de ligands de la protéine LAR. La présente invention concerne également une méthode de criblage de ligands de la protéine LAR comprenant les étapes suivantes : la mise en présence de protéine LAR et, concomitamment ou successivement, d'un 20 ligand à cribler et d'un aptamère tel que défini ci-dessus ; déterminer la quantité d' aptamère fixé à la protéine LAR ; - en déduire si le ligand est un ligand de la protéine LAR. Description détaillée de l'invention 25 Comme on l'entend ici, un « aptamère » désigne un composé, comprenant au moins un acide nucléique, susceptible de se lier de manière spécifique à une cible, notamment de nature protéique, par l'intermédiaire de l'acide nucléique. Un aptamère est dit se lier de manière spécifique à une cible lorsqu'il ne présente essentiellement pas d'affinité pour un composé sans rapport structural avec la cible. De préférence, dans le cas d'une cible protéique, un 30 composé protéique est dit sans rapport structural avec la cible selon l'invention, lorsque l'identité de séquence entre la cible et le composé est inférieure à 60%, de préférence inférieure à 70%, de préférence encore inférieure à 80%. De préférence, selon l'invention, un aptamère est dit ne présenter essentiellement pas d'affinité pour un composé selon l'invention, notamment lorsque la constante de dissociation de l'aptamère vis-à-vis du composé est supérieure à 10-6 mol/1, de préférence supérieure à 10-7 mol/1. La constante de dissociation peut notamment être déterminée, dans des conditions standards, à l'aide des représentations de Scatchard et de Lineweaver Burk bien connues de l'homme du métier. De manière avantageuse, l'aptamère selon l'invention est spécifique de la protéine LAR, en particulier de la protéine LAR humaine, notamment lorsque la protéine LAR est exprimée à la surface d'une cellule. La protéine LAR, ou protéine tyrosine phosphatase apparentée à l'antigène leucocytaire commun, PTP LAR (Protein Tyrosine Phospatase Leukocyte common Antigen-Related), connue également sous le nom de protéine tyrosine phosphatase, de type récepteur, F, PTPRF (Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor type, F) est bien connue de l'homme du métier. La protéine LAR humaine est notamment décrite sous la référence P10586 dans la base de données GenBank. A titre d'exemple, la protéine LAR humaine est représentée par la séquence SEQ ID NO : 3. L'aptamère selon l'invention peut également comprendre au moins un groupement additionnel en plus de l'acide nucléique. Ainsi, l'acide nucléique selon l'invention peut être lié à au moins un groupement additionnel. Par ailleurs, de manière préférentielle, l'aptamère selon l'invention est constitué de l'acide nucléique selon l'invention et d'au moins un groupement additionnel selon l'invention. Le groupement additionnel selon l'invention peut être de tout type et de toute nature. Le groupement additionnel selon l'invention peut ainsi être un radioisotope, une molécule organique comprenant 100 atomes de carbone au plus, une nanoparticule, une protéine, notamment une glycoprotéine, un glucide, un lipide, ou encore un polynucléotide. Selon l'invention, on préfère toutefois que le groupement additionnel selon l'invention soit sélectionné dans le groupe constitué d'un marqueur détectable, d'un composé pharmacologique, et d'un composé susceptible de modifier les caractéristiques pharmacocinétiques d'un acide nucléique auquel il est lié, tel que le polyéthylène glycol (PEG). Le marqueur détectable selon l'invention peut être de tout type, il peut notamment s'agir d'un fluorophore, par exemple la fluorescéine ou la luciférase ; d'un radioisotope, notamment adapté à la scintigraphie, par exemple 99mTc ; d'une étiquette reconnaissable par un anticorps, par exemple la protéine c-Myc ; d'une étiquette d'affinité, par exemple la biotine ; d'une enzyme, par exemple la peroxydase de raifort. Le composé pharmacologique selon l'invention peut également être de tout type, il peut notamment s'agir d'un agent de chimiothérapie anticancéreuse, tel qu'un agent cytostatique ou cytolytique. Le composé pharmacologique selon l'invention peut également être de toute nature, il peut notamment s'agir d'un dérivé du platine, d'une molécule organique comprenant moins de 100 atomes de carbone, d'un peptide, d'un analogue de nucléotide, d'une toxine, d'un ARN interférent, ou d'un oligonucleotide antisens. De préférence, l'acide nucléique selon l'invention est de l'ARN. Comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, il est tout particulièrement préféré que l'acide nucléique selon l'invention soit monobrin. Il est également tout particulièrement préféré que l'acide nucléique selon l'invention ait une structure tridimensionnelle lui permettant de se lier spécifiquement à la protéine LAR. Par ailleurs, le squelette ou le ribose de l'acide nucléique selon l'invention peut être modifié, en totalité ou en partie, notamment pour le rendre résistant à une dégradation hydrolytique, en particulier du fait de l'action de nucléase, notamment lorsque l'acide nucléique est de l'ARN. De telles modifications sont bien connues de l'homme du métier et recouvrent notamment les modifications de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation, ou la substitution de cette fonction OH par un groupement amino ou par un halogène, notamment par le fluor, ainsi que le recours à un squelette phosphorothioate, ou à des structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA) ou acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA). Ainsi, de manière préférée, l'acide nucléique selon l'invention est un ARN dont les riboses des nucléotides pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2', les riboses des nucléotides puriques pouvant être inchangés. Une séquence ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec SEQ ID NO : 1 selon l'invention, diffère notamment de SEQ ID NO : 1 par l'insertion, la suppression ou la substitution d'au moins un nucléotide. Comme on l'entend ici, le pourcentage d'identité entre deux séquences est défini comme le nombre de positions pour lesquelles les bases sont identiques lorsque les séquences sont alignées de manière optimale, divisé par le nombre total de bases de la plus grande des deux séquences. Deux séquences sont dites alignées de manière optimale lorsque le pourcentage d'identité est maximal. Par ailleurs, comme cela apparaitra de manière claire à l'homme du métier, il peut être nécessaire de faire appel à des ajouts de positions lacunaires (des « gaps ») de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Un acide nucléique est dit se lier à la protéine LAR, si la constante de dissociation de l'acide nucléique vis-à-vis de la protéine LAR, notamment humaine, de préférence exprimée par une cellule, en particulier une cellule de lignée cellulaire MCF-7, A-431, MDA-MB-231, HEK293, HEK293-KDR, 4T1, ou EMT6, comme cela est illustré dans les exemples, est inférieure à 10-6 mol/1, de préférence inférieure à 10-7 mol/1, de préférence encore inférieur à 10"8 mol/1. Comme cela apparaîtra clairement à l'homme du métier, lorsque l'aptamère selon l'invention comprend un acide nucléique selon l'invention, il peut également comprendre d'autres acides nucléiques. En revanche, lorsque l'aptamère selon l'invention est constitué de l'acide nucléique selon l'invention, il ne comprend pas d'autres acides nucléiques. De manière similaire, lorsque l'acide nucléique selon l'invention comprend une séquence, il peut également comprendre des séquences additionnelles s'étendant du côté 5' et/ou 3' de la séquence en question. En revanche, lorsque l'acide nucléique selon l'invention est constitué d'une séquence, il ne comprend pas de séquences additionnelles en plus de la séquence en question. Une séquence comprenant SEQ ID NO: 1 selon l'invention peut notamment comprendre des séquences du côté 5' et/ou 3' visant à structurer l'acide nucléique. On préfère ainsi que l'acide nucléique selon l'invention comprenne, ou soit constitué de SEQ ID NO : 2. Dans ce cadre, l'invention concerne alors également, en particulier, un acide nucléique comprenant, ou constitué d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 2, sous réserve qu'un acide nucléique constitué de cette séquence présente se lie à la protéine LAR. De préférence, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2. De préférence également, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 15 nucléotides consécutif d'une séquence ayant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%, d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention. De manière plus préférée, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2. De manière encore plus préférée, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2. De manière particulièrement préférée, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2. Par ailleurs, de manière alternative, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention, peut être constituée d'une séquence de 95 nucléotides présentant au moins 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% d'identité avec SEQ ID NO : 2 et un acide nucléique constitué de cette séquence est susceptible d'adopter la structure de formule (I) suivante : C79 U80 Y29-X81 Y28-X82 Y27 X83 Y26 X84 Y25-X85 A24 G86 G23 C22 U87 A21 U20 U88 C19 G89 u48 U58 Y57 G59 1 X62 U60 U61 Y56 X63 C47 G46 U49 U45 A50 C44 G51 A43 Y52 Y53 Y54 Y55 G42 X67 X66 X65 X64 Y41-X68 Y40-X69 Y39 X70 X38 X71 Y37-X72 Y3fi X73 A35 Y34-X74 Y33-X75 Y32 X76 Y31-X77 Y30-X78 A18 Y16 X91 Y15-X92 Y14-X93 Y13-X94 Y10 Y11 Y12 I I I X4 X3 X2 G1 5' A90 G17 G8 U7 A6 Y9 X5 A95 A96 G97 3' (I) dans laquelle : - A, C, G, U sont les ribonucléotides Adenosine, Cytidine, Guanosine, et Uridine ; 5 - chacun des X et des Y, identiques ou différents, représente A, C, G ou U ; - chacune des paires X-Y ou Y-X, identiques ou différentes, représentent des paires A-U, U-A, G-C, C-G, G-U ou U-G. L'homme du métier peut aisément déterminer la structure secondaire susceptible d'être adoptée par un acide nucléique ayant une séquence selon l'invention, par exemple à l'aide d'algorithmes ou de logiciels de modélisation bien connus de l'homme du métier, tels que mfold (version 3.4) décrit dans Nucleic Acids Res. (2003) 31:3406-15 et vsfold5 RNA Pseudoknot Prediction décrit dans PLoS One (2007), 2:905. A ce titre, les inventeurs ont établi, à l'aide de tels outils de modélisation, que l'aptamère V8 de séquence SEQ ID NO : 2, qui est décrit dans les Exemples, adopte une structure de formule (I). Lorsque l'aptamère selon l'invention est utilisé à titre de médicament ou est compris dans une composition pharmaceutique, il est notamment utile pour inhiber l'angiogenèse, ainsi que pour la prévention ou le traitement, notamment en inhibant l'angiogenèse, des cancers, et des maladies impliquant une néovascularisation oculaire, telles que la dégénérescence maculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique. Par ailleurs, lorsqu'il est utilisé à titre de médicament ou est compris dans une composition pharmaceutique, l'aptamère selon l'invention est également utile pour le traitement des maladies métaboliques, en particulier de l'insulino-résistance, du diabète, notamment du diabète de type 2, du syndrome métabolique ou des maladies cardiovasculaires, telles que les maladies coronariennes, notamment chez les patients atteints de diabète de type 2. Lorsque l'aptamère selon l'invention est utilisé à titre d'agent diagnostique ou est compris dans une composition diagnostique, il est notamment utile pour le diagnostic des cancers ou des maladies métaboliques, telles que l'insulino-résistance. De préférence, dans les méthodes de détection ou de diagnostic selon l'invention la détection d'aptamère fixé dans l'échantillon est effectuée par mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) destinée à amplifier l'aptamère, notamment une RT-PCR (PCR comprenant une étape de transcription inverse). De préférence, lorsque l'acide nucléique selon l'invention comprend SEQ ID NO : 2, la PCR est mise en oeuvre à l'aide du couple d'amorces de séquences CTTGTCATCAACCTGCCAGCCAGT (SEQ ID NO : 4) et GGGAGATGCTCTGTCAGACTACG (SEQ ID NO : 5) ou du couple d'amorce ayant les séquences complémentaires de SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5. Par ailleurs, l'invention concerne également un acide nucléique comprenant ou constitué de SEQ ID NO : 4 ou de SEQ ID NO : 5 ou des séquences complémentaires de SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5. De préférence également, dans les méthodes de détection ou de diagnostic selon l'invention, lorsque l'aptamère est administré à un individu, on préfère que l'aptamère soit détectable par des méthodes d'imagerie in vivo, notamment externes, telles que l'imagerie fluorescente planaire ou tridimensionnelle (3D), ou internes, telles que l'endoscopie par exemple. Par ailleurs, la présente invention concerne également un ligand de la protéine LAR pour son utilisation comme inhibiteur de l'angiogenèse, ainsi que pour la prévention ou le traitement, notamment en inhibant l'angiogenèse, des cancers, et des maladies impliquant une néovascularisation oculaire, telles que la dégénérescence maculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique. Le ligand de la protéine LAR selon l'invention peut être de tout type, il peut notamment s'agir d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps comprenant la partie de liaison à l'antigène ou paratope, un fragment Fv mono-chaîne (scFv), ou encore un aptamère, notamment, comme cela a été indiqué ci-dessus, un aptamère selon l'invention. Description des figures Fi ure 1 : schéma du . rotocole de sélection La figure 1 représente le protocole de sélection des aptamères utilisé par les inventeurs pour 15 obtenir l'aptamère V8. Figure 2 : Prédiction de structure de l'aptamère V8 La figure 2 représente la structure secondaire de l'aptamère V8 prédite à l'aide du programme mfold (version 3.4, http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-forml.cgi). Sur cette structure, les 20 séquences fixes permettant une amplification par PCR ont été surlignées en gris. Figure 3 : Protocole d'identification de la cible de l'aptamère V8 La figure 3 représente le protocole d'identification de la cible de l'aptamère V8. Brièvement, l'aptamère biotinylé est incubé sur les cellules MCF-7 en suspension. Après plusieurs lavages, 25 des billes magnétiques couplées à la streptavidine sont ajoutées. Seules les cellules qui ont fixé l'aptamère V8 biotinylé vont être retenues sur les billes. Les cellules sont alors lysées et les protéines retenues par l'aptamère V8 sont éluées. Les protéines sont alors déposées sur gel SDS-PAGE et les bandes spécifiques sont analysées par spectrométrie de masse. 30 Figure 4 : Migration des protéines par électrophorèse SDS-PAGE La figure 4 est une photographie d'un gel SDS-PAGE sur lequel sont mis à migrer les éluats provenant de billes mises directement en contact avec les cellules (billes), d'un oligonucléotide contrôle (séquence contrôle), ou de l'aptamère V8. La principale bande correspondant à l'éluat provenant de l'aptamère est indiquée. La bande correspondant à l'Albumine Sérique Bovine (BSA), utilisée comme compétiteur non spécifique, est également représentée. Brièvement, les protéines sont déposées sur un gel SDS PAGE 10%. Le gel est ensuite coloré à l'aide du kit protéosilver silver stain kit (sigma). Les bandes intéressantes sont découpées, décolorées avec le même kit et analysées en spectrométrie de masse. Figure 5 : Pontage aux UV des aptamères V1, V8 et V10 La figure 5 est une autoradiographie d'un gel SDS-PAGE à 10% sur lequel sont mis à migrer des lysats cellulaires de cellules HEK293-KDR mise en présence des aptamères V1, V8 et V10 ou la banque naïve (BN) radiomarqués et pontés par irradiation UV. L'aptamère seul, quant à lui, migre vers 37 kDa (piste Apta). La flèche indique la principale protéine pontée par l'aptamère V8, dont la taille correspond à celle de la protéine LAR. Brièvement, les aptamères et la banque naïve ont été incubés sur les cellules à une concentration de 25 nM. Après 15 minutes d'incubation à 37°C, les séquences non associées aux cellules ont été éliminées. Le pontage aux UV a été réalisé avec une énergie d'irradiation de 800 000 µJ/cm2, puis les cellules ont été lysées et les protéines ont été déposées sur un gel 10%. Figure 6 : Effet de la surexpression de la protéine LAR sur la fixation de l'aptamère V8 La figure 6 représente la quantité d'aptamères V8 fixés par puits (axe des ordonnées, pmoles) contenant des cellules HEK293 non transfectées (0), non transfectées et mise en présence de lipofectamine (0 (+ lipo)), ou transfectées par 0,25 µg, 0,5 µg, 0,75 µg ou 1µg de plasmide exprimant la protéine LAR (axe des abscisses). L'aptamère radiomarqué est incubé à une concentration de 10 nM pendant 15 minutes. Après plusieurs lavages, la radioactivité fixée aux cellules est comptée et la quantité d'aptamères fixés est déterminée (en pmoles/cupule). Figure 7 : Effet de la surexpression de la protéine LAR sur la fixation de l'aptamère V8 La figure 7 représente la quantité d'aptamères V8 fixés par puits (axe des ordonnées, pmoles) contenant des cellules HEK293 non transfectées (0), non transfectées et mise en présence de lipofectamine (0 (+ lipo)), ou transfectées par un plasmide exprimant la protéine LAR, en présence de 5 nM, 10 nM et 50 nM d'aptamère V8 (axe des abscisses). Les aptamères radiomarqués sont incubés pendant 15 minutes. Après plusieurs lavages, la radioactivité fixée aux cellules est comptée et la quantité d'aptamères fixés est déterminée (en pmoles/cupule). Figures 8A et 8B : Etude de la fixation de l'aptamère V8 sur les cellules MCF-7 et U87-MG en cytométrie de flux Les figures 8A et 8B représentent la quantité de cellules MCF-7 (figure 8A) et U-87MG (figure 8B) triées en cytométrie de flux (axe des ordonnées, en pourcentage de la fluorescence maximale) en fonction de la fluorescence émise par l'aptamère V8 (courbe noire), la séquence contrôle (courbe gris foncée), et les cellules seules (courbe gris claire) (axe des abscisses, unités arbitraires). Les cellules ont été incubées avec les aptamères à une concentration de 5 nM pendant 30 minutes, lavées et analysées en FACS. 100 000 évènements ont été comptés pour chaque condition. Figure 9: Biodistribution de 1'aptamère V8 et d'une séquence contrôle dans des souris «nude » ayant développé des tumeurs après une xénogreffe de cellules MCF-7 La figure 9 représente des images acquises au Tomofluo 3D de souris « nude » ayant développé des tumeurs après une xénogreffe de cellules MCF-7 auxquelles ont été injectées par voie intraveineuse 1,4 nmoles d'aptamère V8 (partie supérieure de la figure, V8) ou de séquence contrôle (partie inférieure de la figure, Ctrl) marqués à l'Alexa Fluor 680. Les images ont été acquises entre 5 et 180 minutes après injection. La tumeur ainsi que la zone de référence qui permet de mesurer le rapport signal dans la tumeur/référence interne sont indiquées. Figure 10 : Pourcentage de la dose injectée d'aptamère V8 et d'une séquence contrôle présente dans des tumeurs après xénogreffe de cellules MCF-7 L'aptamère V8 ou une séquence contrôle marqués avec de l'Alexa Fluor 680 ont été injectés dans des souris développant des tumeurs suite à une injection sous cutanée de cellules MCF- 7. Trois heures post-injection, le signal fluorescent dans la tumeur a été mesuré par tomographie fluorescente à l'aide d'un appareil TomoFluo3D. La figure 10 représente la quantité de fluorescence déterminée en triplicat en pourcentage de la dose injecté (%DI, axe des ordonnées) dans la tumeur pour l'aptamère V8 et une séquence contrôle. Figure 1 l : Effet de l'aptamère V8 sur la formation de tubes endothéliaux par des HUVEC Les cellules HUVEC ont été cultivées en présence ou non de 5µM d'aptamère V8 ou de séquence contrôle. Après 16 heures d'incubation à 37°C et 5% de CO2, la formation des tubes a été évaluée par microscopie en contraste de phase. Le rapport entre le nombre de tubes et le nombre de noeuds visualisés par champ de vue a été calculé. La figure 11 représente le nombre de tubes par noeud de cellules sur quatre champs de vue choisis aléatoirement (axe des ordonnées), en l'absence d'oligonucléotide (contrôle), en présence d'une séquence contrôle, et en présence de l'aptamère V8 (axe des abscisses). EXEMPLES Exemple 1 : obtention de l'aptamère V8 spécifique de la protéine LAR 1- Identification de l'aptamère V8 après 17 tours de sélection sur les cellules HEK293-VEGFR2 Les inventeurs ont utilisé la technique de SELEX, notamment décrite dans la demande WO 2005/093097, dans le but de sélectionner des aptamères contre le récepteur VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2). Pour cela, des cellules HEK293 surexprimant VEGFR2 et pour la contre-sélection des cellules HEK293 n'exprimant pas VEGFR2 (Figure 1). Au cours de ce SELEX, les inventeurs ont fait varier différents paramètres dans le but d'augmenter progressivement la pression de sélection (Tableau 1). Par rapport au protocole décrit dans la demande WO 2005/093097, les inventeurs ont apporté quelques modifications : durant quelques tours, les inventeurs ont changé de type cellulaire dans le but d'augmenter la spécificité. Pour ces tours, les inventeurs ont utilisés des cellules endothéliales aortiques de porc (PAE) transfectées de manière stable pour exprimer le VEGFR2 (PAE-VEGFR2) pour la sélection, et non transfectées (PAE) pour la contre-sélection (tours 13 et 14). De plus, les inventeurs ont inversé l'étape de sélection et de contre-sélection (tours 16 et 17). Enfin, tout au long du processus de sélection, du VEGF, le ligand du récepteur VEGFR2, a été ajouté 10 minutes avant la fin de l'incubation avec la banque, à chaque tour de SELEX. Ceci dans le but de sélectionner des aptamères qui ne soient pas décrochés par le VEGF. Les conditions de sélection sont présentées dans le Tableau 1 ci-dessous : cycle Type CS : lb de S : Nb de Inversion Vdu me [] en Temps Nb de Condition tRNA cellulaire cellules cellules CSetS d'incubation ARN 2'F- d'Incubation lavages particulière de (millions) (millions) (mL) Py(µfi (nin) lavages 1 HEK293 10 10 3 1 30 3 2 HEK293 10 10 3 1 30 3 3 HEK293 10 + 10 10 3 1 25 3 4 HEK293 5+5 5 3 1 25 4 HEK293 5+5 5 3 1 20 4 6 HEK293 5+5 5 3 1 20 5 7 HEK293 5+5 5 3 1 20 5 8 HEK293 5+5 5 3 1,5 20 5 L5:5rrin 9 HEK293 5+5 5 3 1,5 20 5 15:5rrin HEK293 5+ 5 5 3 1 20 5 L5:5nin 11 HEK293 5+5 5 3 1,5 20 5 L5:5nin + 12 HEK293 5+5 5 3 1 20 5 L5:5nin + 13 PPE 5+5 5 3 2 20 5 L5:5rrin + 14 PPE 5+5 5 3 0,5 20 5 L5:5rrin + HEK293 5+5 5 3 2 20 5 15:5mn + 16 HEK293 5 5 + 3 2 20 5 15:5rrin + 17 HEK293 5 5 + 3 1,5 20 5 L5:5nin + S : Sélection, CS : Contre-sélection, L : lavage. Tableau 1 : évolution de la pression de sélection au cours du SELEX. 5 La banque issue du tour 17 a été clonée et séquencée. Les inventeurs ont testé l'affinité d'une trentaine de séquences pour les cellules HEK293-VEGFR2 à 25 nM. Ceci leur a permis d'identifier 3 aptamères particulièrement intéressants avec une forte affinité pour ces cellules, V1, V8 et V10. Cependant, ces aptamères se fixent également sur les cellules HEK293, qui 10 n'expriment pas la cible, indiquant que la cible de ces aptamères n'est pas VEGFR2. Les inventeurs ont alors choisi de poursuivre la caractérisation de l'aptamère V8 qui présente la plus forte affinité pour les cellules (Kd ,., 5,3 nM). 2. Séquence de l'aptamère V8 : 15 La séquence de l'aptamère V8 est la suivante : 5' GGGAGAUGCUCUGUCAGACUACGACUGUCCCAGUAUGACGCGACUGCUUAGG UGGGAUGUUUCCCAUGCCUCGACUGGCUGGCAGGUUGAUGACAAG3' (SEQ ID NO : 2). Il est à noter qu'afin d'améliorer la résistance de l'aptamère V8 aux nucléases, les riboses des pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2' (les riboses des purines sont quant à eux porteurs, comme c'est le cas dans l'ARN naturel, d'une fonction hydroxyle (OH) sur le carbone en position 2'). La Figure 2 représente une prédiction de structure secondaire réalisée par le logiciel mfold (version 3.4) (Nucleic Acids Res. (2003) 31:3406-15). 3. Validation de l'utilisation de l'aptamère V8 pour établir un profil d'expression à la surface de différentes lignées cellulaires. L'affinité et le Cmax de l'aptamère V8 ont été déterminés pour différentes lignées de cellules cancéreuses (Tableau 2). espèce Type cellulaire Kd (nM) Cmax (pM) Nombre de cibles/ cellule MC F-7 1,6+/- 0,6 251 +/- 40 138 100 +/- 21 800 A-431 5,6+/- 0,6 455 +/- 21 134 300 +/- 6 100 Homme MDA-MB-231 3 +/- 0,4 131 +/-12 77 800 +/- 7 200 U87-MG - - - H EK293 3,8 +/- 0,9 264 +/- 52 80 000 +/- 15 600 HEK293-KDR 5, 3 +/- 1,5 119 +/- 6 46 000 +/- 2 200 Souris 4T1 2,9 +/- 0,1 167 +/-13 65 200 +/- 4 900 EMT6 2,8 +/- 0,6 129 +/- 24 42 400 +/- 8 000 Rat PC12-MEN-2A 34,9 +/- 4,4 764 +/-112 141 400 +/- 20 800 Pour chaque type cellulaire, les courbes de binding ont été obtenues. A partir du binding spécifique, et à l'aide de la représentation de Scatchard, le Kd et le Cmax ont été calculés pour chaque type cellulaire. En connaissant le Cmax et le nombre de cellules pendant le binding, les inventeurs ont pu 20 en déduire un nombre approximatif de cibles par cellule Tableau. 2 : Affinité et nombre de cibles par cellule de l'aptamère V8 pour différentes lignées cellulaires 25 L'aptamère V8 a une affinité d'environ 3 nM pour la plupart des lignées cellulaires, excepté pour les cellules PC12-MEN-2A pour lesquelles il a une affinité de 35 nM et les15 cellules U87-MG pour lesquelles il n'a aucune affinité. De façon intéressante, la cible de l'aptamère V8 semble très abondante à la surface de la lignée de cancer du sein MCF-7 et à la surface de la lignée A-431 de cancer de l'épiderme sur-exprimant EGFR. 4. Identification de la cible de l'aptamère V8 a. protocole de purification de la cible de l'aptamère Afin d'identifier la cible de l'aptamère V8, un protocole dérivé de Berezovski et al. (2008) J. Am. Chem. Soc., Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery (AptaBiD) a été utilisé, dans lequel de la BSA a été rajoutée comme compétiteur pour éviter la fixation non spécifique de protéines sur les billes. Le protocole est résumé dans la Figure 3. b. Gel SDS-PAGE et spectrométrie de masse Les protéines éluées à la fin du protocole résumé dans la Figure 3 ont été analysées par électrophorèse (Figure 4). Une bande spécifique de l'aptamère V8 a été identifiée. Cette bande a été découpée et analysée par spectrométrie de masse. Les peptides d'une vingtaine de protéines ont été détectés dans le fragment de gel. Parmi elles, une protéine a été identifiée comme étant susceptible de correspondre à la cible de l'aptamère V8. Cette protéine a été identifiée comme étant la " protein tyrosine phosphatase, receptor-type, F" (PTPRF) également appelé "leukocyte common antigen-related" (LAR). Il s'agit d'une protéine membranaire de 213 kDa. c. Validation de la cible de l 'aptamère V8 Afin de vérifier que l'aptamère V8 interagit avec la protéine LAR, les inventeurs ont 25 tout d'abord réalisé des expériences de pontage aux UV. Les irradiations aux UV peuvent induire la formation de liaisons covalentes au niveau des points de contact existants entre une protéine et un acide nucléique (Zhang et al. (2004) Biochem Biophys Res Commun 322:705-711). Les aptamères V1, V8, V10, ainsi que la banque naïve, radiomarqués ont été incubés 30 pendant 15 minutes sur les cellules puis les cellules ont été irradiées aux UV. Les protéines ont ensuite été extraites et déposées sur un gel SDS PAGE 10%. De façon intéressante, l'aptamère V8 a été ponté à une protéine dont la taille correspond à celle de la protéine LAR (Figure 5). Une deuxième validation a été effectuée en utilisant un plasmide d'expression de 1'isoforme la plus longue de la protéine LAR. Des cellules HEK293 ont été utilisées pour réaliser la transfection à l'aide de lipofectamine 2000 (Invitrogen). Plusieurs quantités de plasmide ont été transfectées (0,25 µg - lµg). 48 heures après, 10 nM d'aptamère V8 ou de séquence contrôle radiomarqués ont été incubés avec les cellules. Après plusieurs lavages, la radioactivité associée aux cellules a été comptée. L'aptamère V8 présente de l'affinité pour les cellules HEK293 (Tableau 2 et Figure 6). Cependant, la fixation de l'aptamère V8 est au minimum deux fois plus importante lorsque ces cellules ont été transfectées par le plasmide d'expression de la protéine LAR. On observe que la fixation n'augmente pas lorsque la quantité de plasmide transfecté est augmentée, ce qui indique que 0,25 µg de plasmide est suffisant pour avoir une expression maximale. Lorsque les cellules ont été traitées avec de la lipofectamine sans ajout de plasmide, la fixation de l'aptamère V8 est identique à celle obtenue avec des cellules non traitées, ce qui indique que l'augmentation de fixation est bien due à l'expression du plasmide et non à la présence de la lipofectamine. Afin de confirmer ce résultat, l'expérience a été reproduite, en transfectant 0,25 µg de plasmide et en testant différentes concentrations d'aptamère V8 (Figure 7). Comme précédemment, une augmentation de la fixation de l'aptamère V8 est observée lorsque les cellules ont été transfectées avec le plasmide exprimant la protéine LAR. Cette augmentation de fixation est visible quelle que soit la concentration d'aptamère utilisée. On remarque que plus la concentration d'aptamères incubés est élevée, plus l'aptamère se fixe de façon importante par rapport aux cellules non transfectées (5 fois plus de fixation à 50 nM contre 2 fois plus à 5 nM). Tous ces résultats démontrent que la cible de 1'aptamère V8 doit être la protéine LAR. Exemple 2 : utilisation de l'aptamère V8 en FACS L'aptamère V8 et la séquence contrôle (SEQ ID NO: 6), marqués avec de l'AlexaFluor 647 (Invitrogen), ont été incubés avec les cellules MCF-7 et les cellules U87-MG (Figure 8A et 8B). Que cela soit sur les cellules MCF-7 ou U87-MG, on observe que la séquence contrôle ne se fixe pas sur les cellules puisque l'intensité de fluorescence est identique à celle obtenue pour les cellules seules. L'aptamère V8 se fixe sur les cellules MCF-7, mais aucune augmentation de fluorescence n'est observée sur les cellules U87-MG. Ces résultats sont en accord avec les expériences de liaison décrites ci-dessus. Exemple 3 : utilisation de l'aptamère V8 en imagerie Afin d'évaluer si l'aptamère V8 peut permettre un ciblage tumoral in vivo, les inventeurs ont réalisé des expériences d'imagerie par fluorescence chez la souris. Pour cela, les inventeurs ont utilisé un appareil d'imagerie (TomoFluo3D, LETI, Grenoble, France). Cet appareil permet des mesures semi-quantitatives par imagerie planaire et quantitatives par tomographie (Garofalakis et al. (2010) Optics Letters 35:3024-3026). Ces expériences ont été réalisées avec des souris athymiques "nude". Des cellules MCF-7 ont été utilisées afin de réaliser des xénogreffes chez ces souris. De 2 semaines à 2 mois après l'injection des cellules en sous-cutanée au niveau du haut du dos, les xénogreffes obtenues atteignent des volumes de l'ordre de la centaine de mm3. Des expériences de biodistribution des aptamères peuvent alors être réalisées par imagerie optique. La biodistribution de l'aptamère V8 a été comparée à celle d'une séquence contrôle dans des xénogreffes MCF-7. Pour cela, les séquences marquées à l'Alexa Fluor 680 (1,4 nmoles) ont été injectées aux souris dans la veine caudale. L'imagerie planaire a été réalisée entre 1 minute et 3 heures après l'injection et l'imagerie tridimensionnelle a été réalisée dans les tumeurs au temps 3 heures afin de pouvoir quantifier la quantité d'aptamères parvenue dans la tumeur. 1. Imagerie planaire Suite à l'injection de l'aptamère V8 ou de la séquence contrôle en intraveineuse, des images ont été prises à différents temps post-injection. Pour chaque séquence, 3 souris ont été injectées. La Figure 9 représente respectivement les biodistributions de l'aptamère V8 et de la séquence contrôle dans une souris. Comme attendu, les séquences sont rapidement éliminées par les urines et par le système hépatobiliaire. Par ailleurs, à partir de ces images obtenues, et pour chacune des souris, des régions d'intérêt (ROI) ont été tracées au niveau de la tumeur et au niveau de la tête entre les deux oreilles (zone de référence) à l'aide du logiciel ImageJ (MacBiophotonics). L'intensité moyenne de fluorescence a alors été calculée pour chaque ROI. Le bruit de fond a été soustrait (autofluorescence de la souris mesurée à l'aide d'une photo prise avant injection) et le rapport entre la fluorescence dans la tumeur et la fluorescence dans la tête a été calculé au cours du temps. Les moyennes de ces rapports au cours du temps sont indiquées dans le Tableau 3. Temps (min) Contrôle V8 1,10 +/- 0,12 1,29 +/- 0,12 ns 1,17+/- 0,10 1,39+/- 0,09 ns 1,18 +/- 0,04 1,51 +/- 0,04 * 30 1,32+/- 0,08 1,66+/- 0,07 * 60 1,42+/- 0,09 1,73+/- 0,09 ns 90 1,43+/- 0,18 1,77+/- 0,18 * 120 1,52+/- 0,11 2,01+/- 0,11 ns 150 1,54+/- 0,15 1,80+/- 0,15 ns 180 1,57+/- 0,17 2,25+/- 0,17 ns Les résultats représentent la moyenne des rapports de fluorescence tumeur/zone de référence obtenus à différents temps pour 3 souris. * correspond à un écart significatif du ratio entre l'aptamère et la séquence contrôle mesuré par un test de Student avec P De façon intéressante, le rapport tumeur/zone de référence augmente plus rapidement pour l'aptamère V8 que pour la séquence contrôle et cette différence significative est observée 15 dès 15 minutes après injection (1,51 +/- 0,04 pour l'aptamère V8 et 1,18 +/- 0,04 pour la séquence contrôle). Après 15 minutes, le rapport augmente progressivement de façon similaire pour l'aptamère et la séquence contrôle et la différence entre l'aptamère et la séquence contrôle reste alors constante au cours du temps. 2. Imagerie tridimensionnelle Trois heures après l'injection, la quantité d'aptamères accumulée dans les tumeurs a été quantifiée par tomographie. Après reconstruction, l'intensité de fluorescence est visualisée en trois dimensions dans les tumeurs. Trois heures après injection, les zones correspondant aux tumeurs ont été scannées à 25 l'aide de l'appareil Tomofluo3D. Après reconstruction à l'aide du logiciel Imo3D, l'intensité de fluorescence a été visualisée en trois dimensions. 5 Il apparait ainsi que l'intensité de fluorescence est plus importante dans les tumeurs provenant des souris injectées avec l'aptamère V8, par rapport aux souris injectées avec la séquence contrôle. L'accumulation dans les tumeurs 3 heures après injection est donc plus importante pour l'aptamère V8 suggérant que cette accumulation est spécifique, provenant de la liaison de l'aptamère sur sa cible, la protéine LAR. A l'aide des courbes de calibration réalisées par une fusion tomographie par émission de positons (PET) / tomographie optique diffuse de fluorescence (fDOT), il est possible de quantifier une sonde marquée à l'Alexa Fluor 680 présente à des concentrations comprises entre 3 nM à 1µM (Garofalakis et al. (2010) Optics Letters 35:3024-3026). Le pourcentage de la dose injectée (%DI) présente dans les tumeurs trois heures après injection a donc pu être déterminée ainsi (Figure 10). Trois heures après injection, 0,97 +/- 1,1 %DI d'aptamère V8 sont présents dans la tumeur contre 0,07 +/- 0,11 %DI pour la séquence contrôle. L'accumulation de l'aptamère est donc environ 10 fois plus importante que celle de l'aptamère contrôle. Il est à noter que la différence observée en imagerie tridimensionnelle est plus importante qu'en imagerie planaire. Exemple 4 : utilisation de l'aptamère V8 pour inhiber l'angiogenèse Les inventeurs ont testé si l'aptamère V8 pouvait perturber le processus d'angiogenèse en utilisant un test de formation de tubes endothéliaux in vitro. Aucun rôle de la protéine LAR n'est connu à ce jour dans l'angiogénèse, néanmoins, il a été démontré que la protéine LAR peut être impliquée dans la régulation des contacts cellule-cellule épithéliale, ainsi que dans le contrôle des voies de signalisation de la bêta-caténine. Des cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC) ont été cultivées sur du MatrigelTM dans un milieu à faible teneur en hormone de croissance comportant 2% de sérum de veau foetal et du facteur de croissance de fibroblastes basique recombinant (bFGF à 3 ng/mL) (Invitrogen). Dans ces conditions, les HUVEC forment un réseau de tubes endothéliaux qui peut être observé par microscopie et représente un modèle in vitro de l'angiogénèse. L'effet de l'aptamère V8 sur la formation de ce réseau a été évalué (Figure 11). On observe qu'après 16 heures d'incubation, un réseau de tubes s'est formé pour la condition contrôle avec une moyenne de deux tubes formés par noeud. L'aptamère V8 inhibe la formation des tubes avec une moyenne de 0,72 tubes par noeud alors que la séquence contrôle n'a pas d'effet avec une moyenne de 2 tubes par noeud comme pour la condition contrôle. REVENDICATIONS1. Aptamère comprenant un acide nucléique comprenant, ou constitué de : la séquence ACUGUCCCAGUAUGACGCGACUGCUUAGGUGGGAUGUUUCCC AUGCCUCG (SEQ ID NO : 1), ou une séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, sous réserve qu'un acide nucléique constitué de cette séquence présente se lie à la protéine LAR. 2. Aptamère selon la revendication 1, comprenant un acide nucléique constitué de la séquence GGGAGAUGCUCUGUCAGACUACGACUGUCCCAGUAUGACGCGACUG CUUAGGUGGGAUGUUUCCCAUGCCUCGACUGGCUGGCAGGUUGAUGACAAG (SEQ ID NO : 2). 3. Aptamère selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'acide nucléique est lié à au moins un groupement additionnel. 4. Aptamère selon la revendication 3, dans lequel le groupement additionnel est sélectionné dans le groupe constitué d'un marqueur détectable, d'un composé pharmacologique, et d'un composé susceptible de modifier les caractéristiques pharmacocinétiques d'un acide nucléique auquel il est lié. 5. Aptamère selon la revendication 3 ou 4, constitué de l'acide nucléique et d'au moins un groupement additionnel. 6. Aptamère selon l'une des revendications 1 à 5, pour son utilisation à titre de médicament ou d'agent diagnostique. 7. Composition pharmaceutique ou diagnostique comprenant, à titre de substance active, au 30 moins un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.25 8. Utilisation in vitro d'un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5, pour détecter la présence de protéine LAR ou déterminer la quantité de protéine LAR dans un échantillon biologique. 9. Méthode in vitro de détection ou de quantification de protéine LAR dans un échantillon biologique, comprenant mettre en contact l'échantillon biologique avec un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 ; quantifier, ou détecter la présence ou l'absence d'aptamère fixé dans l'échantillon ; en déduire la quantité, ou la présence ou l'absence de protéine LAR dans l'échantillon. 10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle la détection d'aptamère fixé dans l'échantillon est effectuée par mise en oeuvre d'une RT-PCR destinée à amplifier l'aptamère. 11. Utilisation d'un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5, pour le criblage de ligands de protéine LAR. 12. Méthode de criblage de ligands de protéine LAR comprenant : la mise en présence de protéine LAR et, concomitamment ou successivement, d'un 20 ligand à cribler et d'un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 ; déterminer la quantité d'aptamère fixé à la protéine LAR ; en déduire si le ligand est un ligand de la protéine LAR.