Brevet FR2972117A1 — publié le 20120907

i SYSTEME MICROFLUIDIQUE POUR CONTROLER UN PROFIL DE CONCENTRATION DE MOLECULES SUSCEPTIBLES DE STIMULER UNE CIBLE. La présente invention se rapporte au domaine de la microfluidique. La microfluidique met en oeuvre des systèmes de dimensions micrométriques, dont la taille est généralement comprise entre quelques dizaines et quelques centaines de microns. io Ces systèmes trouvent application dans de nombreux domaines comme les tests de diagnostic cellulaire, le développement de médicaments, la biologie fondamentale ou la cosmétologie. Dans ces domaines, il existe une demande croissante de systèmes microfluidiques pour déterminer quantitativement la réponse de 15 cellules vivantes à certaines molécules et particulièrement, la réponse à un profil de concentration spatialement et temporellement contrôlé. Par exemple, il peut s'agir de mesurer la réponse de cellules cancéreuses à des molécules utilisées pour la chimiothérapie. Pour déterminer avec précision cette réponse, il est nécessaire d'exercer un 20 contrôle sur l'application des molécules qui vont engendrer cette réponse. Ce contrôle peut concerner la quantité de molécules interagissant avec les cellules cancéreuses, le profil de concentration des molécules auxquelles les cellules cancéreuses sont soumises, l'évolution dans le temps de la quantité de ces molécules et/ou du profil de concentration de ces molécules appliqués 25 aux cellules cancéreuses, etc. Dans le domaine de la cosmétologie, des systèmes microfluidiques peuvent servir à des tests de toxicité de certaines molécules sur des cellules vivantes et/ou des tissus cellulaires. Le contrôle de la quantité de molécules, éventuellement toxiques, administrée aux cellules et la façon 30 dont ces molécules sont administrées est nécessaire pour déterminer le seuil de toxicité. Un exemple de système microfluidique largement utilisé pour stimuler des cellules vivantes est présenté dans le document US 7 374 906. Ce système microfluidique permet notamment de soumettre les cellules vivantes à un gradient de concentration de molécules, dont le profil est linéaire et stable dans le temps. Un inconvénient majeur de ce type de système microfluidique est que les cellules vivantes sont soumises à un flux générant des forces de cisaillement les perturbant. Cet effet de cisaillement est particulièrement gênant lorsque l'on cherche à étudier la réponse chimiotactique du cône de io croissance de cellules nerveuses. En effet, le flux génère des contraintes de cisaillement qui modifient la réponse des cellules cibles dans le meilleur des cas, voire qui provoquent la mort ou l'arrachement des cellules. Le comportement physiologique des cellules vivantes ainsi étudiées est perturbé avec le système divulgué dans ce document. 15 Des solutions ont donc été proposées pour soumettre des cellules vivantes à un gradient de concentration de molécules, sans qu'elles soient perturbées par un flux. Un système microfluidique permettant d'appliquer un gradient de concentration de molécules susceptibles de stimuler des cellules vivantes 20 est par exemple présenté dans l'article « Generating steep, shear-free gradients of small molecules for cell culture », Taesung Kim, Mikhail Pinelis et Michel M. Maharbiz, Biomed Microdevices (2009), vol. 11, pp. 65-73. Ce système microfluidique comprend un dispositif microfluidique 10 et des moyens (non représentés) pour alimenter le dispositif 25 avec des fluides. Le système microfluidique 10 divulgué dans ce document est représenté sur la figure 1, selon une vue en perspective éclatée. Il comprend une base 11 en polydiméthylsiloxane (PDMS) comportant une zone centrale 12, de forme sensiblement carrée, reliée à des 30 canaux 13a, 13b, 13c et 13d disposés en forme de croix par rapport à la zone centrale 12. II comprend également une membrane microporeuse 14 en polyester, recouvrant la zone centrale 12 de la base 11 en PDMS. II comprend enfin un couvercle 15 en PDMS, recouvrant à la fois la membrane 14 en polyester, la base 11 en PDMS et les canaux 13a, 13b, 13c, 13d (le couvercle 15 est représenté de façon tronquée sur la figure 1). Le système microfluidique 10 est ainsi séparé en deux parties par la membrane 14 en polyester. Une première partie forme un canal dans lequel des fluides en mouvement peuvent circuler, ce canal étant fermé dans sa partie supérieure par la membrane 14, la face inférieure de la membrane formant ainsi une io paroi de ce canal soumise à un flux. Une deuxième partie est formée par la face supérieure de la membrane 14, opposée au canal, et sur laquelle se situent les cellules vivantes (CV) en culture. Les moyens d'alimentation des fluides ne sont pas 15 représentés. Il faut cependant noter qu'un premier fluide est introduit dans la base 11 du système microfluidique 10 par l'entrée El et qu'un deuxième fluide est introduit dans cette base 11 du système microfluidique 10 par l'entrée E2, opposée à l'entrée El. L'un au moins de ces fluides comprend des molécules destinées à stimuler les cellules vivantes, en traversant la membrane 14 en 20 polyester. Les fluides entrant par les entrées El, E2 circulent ainsi dans la base 11 du système microfluidique 10, sont mis en contact face à face, ce qui crée une zone de mélange au niveau de l'interface de ces deux fluides, puis sortent de cette base 11 par les sorties S. 25 Pour contrôler la culture des cellules vivantes dans le temps comme dans l'espace, il est possible, avec le système microfluidique 10, de régler les débits des fluides pour établir un profil de concentration de molécules prédéterminé sur la membrane 14 en polyester. Plus précisément, après avoir choisi les fluides adéquats, le 30 réglage du débit de chacun des deux fluides permet de créer une zone de mélange bien particulière au niveau de l'interface entre les deux fluides, c'est- à-dire de créer un profil de concentration bien particulier de molécules destinées à stimuler les cellules vivantes. Cette zone de mélange dans laquelle un gradient de concentration est généré selon un profil déterminé s'étend sensiblement le long d'un axe A, représenté sur la figure 1, passant par les deux sorties S de la base 11. Ce système microfluidique présente cependant plusieurs inconvénients. Premièrement, les débits respectifs des fluides provenant des entrées El, E2 doivent être contrôlés très précisément pour réaliser un profil Io de concentration de molécules stable sur la face inférieure de la membrane 14 en polyester. Ce contrôle des débits de fluide s'effectue en amont du système microfluidique 10, à savoir au niveau des moyens d'alimentation en fluide eux-mêmes, le gradient étant quant à lui généré dans la base 11, au 15 niveau de l'interface entre les deux fluides. Ainsi, une perturbation du débit de l'un ou de l'autre des deux fluides modifie l'interface entre les deux fluides et par suite, le profil de concentration de molécules sur la face inférieure de la membrane 14 est également modifié. La stabilité du profil de concentration est donc délicate à 20 obtenir. Par ailleurs, dans la mesure où les cellules vivantes sont disposées sur la face supérieure de la membrane 14, le profil de concentration appliqué sur les cellules vivantes correspond sensiblement au profil appliqué sur la face inférieure de la membrane. Ceci est d'autant plus 25 vrai que la membrane 14 présente une épaisseur faible de 10pm. Deuxièmement, la pente du profil de concentration obtenu au niveau des cellules vivantes dépend de la vitesse du fluide dans le canal microfluidique et de la position de l'interface entre les deux fluides provenant des entrées El, E2. La pente du profil est donc très délicate à contrôler. 30 Troisièmement, le système microfluidique 10 met en oeuvre une membrane 14 en polyester, collée par sa face inférieure sur les bords de la base 11 en PDMS, de forme carrée, et collée, par sa face supérieure, au couvercle 15 réalisé en PDMS. Ces matériaux sont choisis car ils permettent notamment un collage de la membrane 14, de la base 11 et du couvercle 15 ensemble selon un procédé précisé dans ce document. La présence du couvercle 15 sur la membrane 14 et les canaux 13a, 13b, 13c, 13d permet de renforcer la tenue mécanique et l'étanchéité entre la membrane 14 et la base 11, le collage entre la membrane 14 et la base 11 ne s'effectuant en effet que sur les bords de la base 11. Par ailleurs, le collage de la membrane 14 s'effectue à l'aide d'un dépôt de prépolymère du PDMS, ce qui permet une io fabrication irréversible du dispositif par chauffage sous pression mécanique. Une fois la membrane 14 et le couvercle 15 collés, les cellules peuvent être insérées sur la membrane 14, par des ouvertures laissées sur le côté du couvercle 15. Avec cette disposition et le choix de ces matériaux, une tenue 15 mécanique et une étanchéité convenables peuvent ainsi être obtenues. Pour assurer l'étanchéité entre le canal et la membrane 14, le système microfluidique doit être fermé par le couvercle. II est alors nécessaire d'effectuer la culture des cellules à l'intérieur du système microfluidique 10. Ceci n'est pas très pratique pour des cultures cellulaires complexes, comme 20 les cultures primaires de neurones, les explants ou les tranches de tissus. De plus, un couvercle 15 en PDMS ne permet pas ou permet difficilement de visualiser la réponse des cellules vivantes à une stimulation. Ceci est d'autant plus critique qu'un couvercle en PDMS doit présenter une certaine épaisseur pour permettre sa manipulation, ce matériau présentant un 25 faible module élastique. Une épaisseur importante diminue encore les qualités optiques de ce matériau. Il est donc très difficile d'observer, par un moyen optique adapté, la réponse des cellules vivantes disposées sur la membrane. Un objectif de l'invention est de pallier l'un au moins de ces inconvénients. 30 Pour atteindre l'un au moins de ces objectifs, l'invention propose un système microfluidique pour contrôler un profil de concentration de molécules susceptibles de stimuler une cible, par exemple formée par un ensemble de cellules vivantes, le système comprenant : un dispositif microfluidique comprenant au moins un canal microfluidique muni d'au moins un orifice d'entrée et d'au moins un orifice de sortie pour au moins un fluide ; au moins un moyen pour alimenter le canal microfluidique avec au moins un fluide comprenant des molécules susceptibles de stimuler la cible ; au moins une chambre ou un autre canal microfluidique comportant une base destinée à recevoir la cible ; et io au moins une membrane microporeuse séparant la chambre ou l'autre canal microfluidique du canal microfluidique, ladite membrane microporeuse étant disposée à l'écart de la base de sorte que lorsque le moyen d'alimentation fournit au canal microfluidique ledit au moins un fluide s'écoulant selon un régime laminaire au contact de la 15 membrane microporeuse, les molécules susceptibles de stimuler la cible diffusent alors, après avoir traversé la membrane microporeuse, à travers la chambre ou ledit autre canal microfluidique pour finalement former un profil de concentration stable dans cette chambre ou cet autre canal microfluidique. Le système pourra prévoir d'autres caractéristiques 20 techniques, prises seules ou en combinaison : le canal microfluidique comprend un couvercle réalisé en un matériau choisi parmi : du verre ou du silicium, un polymère photoréticulé non élastomérique, un métal, un alliage conducteur électrique ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère ; 25 ledit au moins un orifice d'entrée et ledit au moins un orifice de sortie pour les fluides sont formés dans le couvercle ; le canal microfluidique comprend au moins une paroi en résine photodurcie et/ou thermodurcie ; la membrane microporeuse s'étend transversalement sur la paroi 30 latérale du canal microfluidique pour fermer ledit canal dans sa partie inférieure ; le canal microfluidique est organisé en plusieurs niveaux, chaque niveau comportant au moins un orifice d'entrée pour au moins un fluide ; la base de la chambre ou dudit autre canal microfluidique est réalisée en un matériau optiquement transparent ; la chambre ou ledit autre canal microfluidique comprend des parois latérales en résine photodurcie et/ou thermodurcie ; la membrane microporeuse s'étend transversalement entre les parois latérales de la chambre ou dudit autre canal microfluidique pour fermer ladite chambre ou ledit autre canal microfluidique dans sa partie io supérieure ; la membrane microporeuse est réalisée en un matériau choisi parmi : le verre, le polycarbonate, le polyester, le polyéthylène téréphtalate, le quartz, le silicium, la silice ou le carbure de silicium ; la membrane microporeuse comprend des pores dont la densité est 15 comprise entre 103 et 1010 pores/cm2 ; les pores présentent un diamètre hydraulique compris entre 0,051.im et 12µm, de préférence entre 0,051am et 31am : il comprend un moyen de visualisation optique ; le moyen optique met en oeuvre une technique de microscopie de 20 localisation par photoactivation ou une technique de microscopie de déplétion par émission stimulée. D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention seront énoncés dans la description détaillée ci-après faite en référence aux figures suivantes : 25 - la figure 2 est un schéma d'un dispositif microfluidique selon l'invention, selon une vue en perspective partiellement coupée; - les figures 3(a) à 3(d) représentent, selon le cas, des étapes d'un procédé de fabrication du dispositif microfluidique représenté sur la figure 3 ou des structures intermédiaires obtenues à l'issue de certaines 30 étapes de ce procédé ; - les figures 4(a) à 4(c) représentent des structures intermédiaires obtenues lors de la fabrication d'un ensemble formé par une base et des parois latérales du dispositif, ledit ensemble étant destiné à former une partie du dispositif microfluidique de la figure 2 ; - la figure 5(a) représente un canal microfluidique du dispositif microfluidique conforme à l'invention, la figure 5(b) représente des fluides s'écoulant dans ce premier canal selon l'invention et la figure 5(c) représente un profil de concentration obtenu dans une chambre du dispositif selon l'invention; io - les figures 6(a) à 6(c) représentent toutes le dispositif microfluidique selon l'invention en vue de coupe, pour lesquelles on peut observer successivement différentes étapes de la stabilisation, dans le temps, d'un profil de concentration de molécules destinées à stimuler des cellules vivantes dans la chambre du dispositif ; 15 - la figure 7(a) représente un autre canal microfluidique du dispositif microfluidique conforme à l'invention, la figure 7(b) représente des fluides s'écoulant dans ce premier canal et la figure 7(c) représente un profil de concentration obtenu dans une chambre du dispositif selon l'invention; - la figure 8 représente l'évolution dans le temps pour 20 l'établissement, par diffusion, d'un régime permanent de molécules destinées à stimuler des cellules vivantes, et ce pour différentes solutions ; - la figure 9 est un schéma, selon une vue en coupe, d'une variante de réalisation du dispositif microfluidique selon l'invention, permettant de générer des profils de concentration plus complexes qu'avec le dispositif 25 microfluidique schématisé sur la figure 2 ; - la figure 10 représente un profil de concentration périodique spatialement, susceptible d'être obtenu dans la chambre du dispositif microfluidique selon la figure 9 ; - les figures 11(a) à 11(c) représentent plusieurs structures 30 intermédiaires obtenues au cours d'un procédé de fabrication du dispositif microfluidique représenté sur la figure 9. L'invention concerne un système microfluidique pour contrôler un profil de concentration de molécules susceptibles de stimuler une cible, par exemple formée par un ensemble de cellules vivantes, le système comprenant un dispositif microfluidique et au moins un moyen d'alimentation de ce dispositif avec au moins un fluide comportant des molécules susceptibles de stimuler cette cible. Le dispositif microfluidique est décrit à l'appui de la figure 2 et un procédé de fabrication de ce dispositif est décrit à l'appui des figures 3(a) à 3(d) et 4(a) à 4(c). Nous décrirons ensuite, à titre d'exemples non limitatifs, io des formes particulières de canal microfluidique pouvant être utilisé au sein de ce dispositif, à l'appui des figures 5(a) et 6(a). Sur la figure 2, on a représenté un dispositif microfluidique 1 conforme à l'invention, selon une vue en perspective partiellement coupée. Ce dispositif microfluidique 1 comprend un couvercle 2, 15 avantageusement rigide, muni de deux orifices 21, 22, une paroi latérale 3 avantageusement réalisée en résine photodurcie et/ou thermodurcie, La paroi latérale 3 du dispositif 1 est réalisée dans une seule couche de résine photodurcie et/ou thermodurcie. Le dispositif microfluidique 1 comprend également, dans sa 20 partie inférieure, une ouverture 47 recouverte par une membrane microporeuse 5 s'étendant transversalement à la base de la paroi latérale 3. La paroi latérale 3, le couvercle 2 et la membrane microporeuse 5 permettent de définir un canal microfluidique 4 dont l'entrée et la sortie sont constituées par lesdits orifices 21, 22. 25 La membrane microporeuse 5 empêche le fluide destiné à s'écouler dans le canal microfluidique 4 de passer de l'autre côté de cette membrane, cette dernière laissant cependant diffuser les molécules susceptibles de stimuler la cible transportées par le fluide dans le canal microfluidique 4. 30 Le dispositif microfluidique 1 comprend également une base 6, avantageusement rigide et transparente, et des parois latérales 7a, i0 7b, avantageusement réalisées en résine photodurcie et/ou thermodurcie. Ces parois latérales 7a, 7b, la base 6 et la membrane microporeuse permettent de former une chambre 8, constituant une chambre de culture pour les cellules cibles. Pour former la chambre 8, quatre parois latérales sont prévues, ces parois pouvant en réalité être assimilées à un seul contour, car le procédé de fabrication réalise avantageusement ces parois d'un seul tenant. Le fond de la chambre 8 est formé par la face supérieure 61 de la base 6, laquelle est destinée à recevoir la cible par exemple formée de cellules vivantes. Les cellules vivantes ne sont donc pas destinées à être disposées sur la membrane microporeuse 5, mais à l'écart de celle-ci, sur la base 6 de la chambre 8. Elles peuvent ainsi être cultivées dans des conditions standard, séparément du dispositif microfluidique 4. La membrane microporeuse 5 sépare ainsi le dispositif en deux canaux microfluidiques 4, 8 distincts. Le canal microfluidique 4 permet de faire circuler un fluide comportant des molécules susceptibles de stimuler la cible. Ceci s'effectue, comme cela sera expliqué de façon plus détaillée dans la suite de la description, par diffusion à travers la membrane microporeuse 5 vers la chambre 8, puis par diffusion à travers la chambre 8 (chambre de culture) au fond duquel se trouve, par exemple, des cellules vivantes (CV) qu'on cherche à stimuler. Avantageusement, la base 6 est réalisée en un matériau optiquement transparent, par exemple du verre. Ceci est intéressant, car il est alors possible de disposer un moyen de visualisation optique à l'extérieur du dispositif pour visualiser, par exemple, la réponse à une stimulation des cellules vivantes disposées au fond de la chambre 8. Le couvercle 2 peut être réalisé en un matériau choisi parmi : du verre ou du silicium, un polymère photoréticulé non élastomérique, un métal, un alliage conducteur électrique ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère. Il La dimension des pores de la membrane microporeuse 5 est choisie pour éviter tout passage de fluide entre le premier canal mircrofluidique 4 et la chambre 8. Si les pores sont cylindriques, cette dimension est assimilable au diamètre de pore. Plus généralement, on pourra assimiler la dimension d'un pore au diamètre hydraulique de celui-ci. La membrane microporeuse 5 ne peut en réalité pas être totalement étanche à un passage de fluide. Aussi, on peut considérer que les cellules situées dans le fond de la chambre 8 ne sont soumises à aucun flux si la vitesse de traversée du fluide à travers la membrane microporeuse 5 est inférieure à une valeur limite. On peut par exemple considérer que cette vitesse limite est de l'ordre 1µm/s. Dans ce cas, les contraintes de cisaillement appliquées aux cellules sont négligeables, même pour une chambre 8 présentant une hauteur h' faible, par exemple de 20µm. Par ailleurs, la vitesse dans le canal microfluidique 4 sera généralement comprise entre 100µm/s et 1000µm/s. Aussi, pour obtenir la valeur limite de 1µm/s, la résistance hydraulique Rh,membrane de la membrane microporeuse 5 doit être, selon la vitesse du fluide dans le canal 4, de 100 à 1000 fois supérieure à la résistance hydraulique Rh, canal du canal microfluidique 4. En particulier, si la vitesse d'écoulement du fluide dans le canal microfluidique 4 est de 1000µm/s, alors il faut respecter l'inégalité : 1000*Rh, canal inférieure pour le diamètre hydraulique des pores, ce qui explique pourquoi il est envisageable de mettre en oeuvre des pores dont le diamètre hydraulique atteint 0,051_tm. Si des pores de dimensions plus importantes sont utilisés, l'utilisation du dispositif microfluidique est cependant plus délicate (par exemple dans le choix des débits d'écoulement dans le canal microfluidique 4) pour s'assurer que le fluide ne traverse pas la membrane microporeuse 5. La densité des pores peut quant à elle être comprise entre 10 103 et 1010 pores/cm2. La hauteur des pores peut être comprise entre 50nm et 100µm. Par ailleurs, la membrane microporeuse 5 peut être réalisée dans divers matériaux tels que le verre, le quartz, le silicium, la silice ou le carbure de silicium ou encore des polymères de même nature que les 15 polymères susceptibles d'être employés pour le reste du dispositif microfluidique. On peut ainsi employer du polycarbonate, du polyester ou du polyéthylène téréphtalate. Selon un premier exemple, on peut prévoir une membrane microporeuse 5 en polycarbonate, dont le diamètre hydraulique des pores est 20 comprise entre 0,21,tm et 1µm, par exemple de type cyclopore de la société Whatman (Whatman CycloporeTM). Selon un deuxième exemple, on peut prévoir une membrane microporeuse 5 en polyester, dont le diamètre hydraulique des pores est comprise entre 0,41m et 311m, par exemple de type Transwell de la société Corning (Corning® Transwell®). Selon un troisième 25 exemple, on peut prévoir une membrane microporeuse 5 en polyéthylène téréphtalate, dont le diamètre hydraulique des pores est compris entre 0,4µm et 8µm, par exemple de type « Track-Etched » de la société Becton Dickinson. Ces membranes microporeuses présentent l'avantage d'être 30 compatibles avec un procédé de fabrication du dispositif microfluidique 1, qui est décrit ci-après en référence aux figures 3(a) à 3(d). Elles présentent également l'avantage d'être biocompatibles et fonctionnalisables pour être spécifiquement perméables à des molécules variées. Par fonctionnalisable, on entend que la membrane microporeuse 5 peut être modifiée chimiquement pur remplir une fonction particulière (rétention de certaines espèces, réactions chimiques,...). De manière générale, le dispositif pourra présenter les dimensions suivantes. La hauteur h du canal microfluidique peut être comprise entre 11,tm et 10001.1m, avantageusement entre 10µm et 2001am. Sa largeur (non représentée) peut être comprise entre 10µm et 2mm. La hauteur h' de la chambre 8 peut être comprise 101am et 1000µm, avantageusement entre 50µm et 200µm. Par ailleurs, la distance entre l'entrée E et la sortie S est de quelques centimètres. Un exemple de procédé de fabrication du dispositif microfluidique 1 selon l'invention est un procédé qui comporte au moins les étapes consistant à: (a) utiliser un timbre 1' en un matériau élastomérique pour imprimer un liquide photodurcissable et/ou thermodurcissable placé sur un support 2' muni de la membrane microporeuse 5 ; (b) photo-irradier et/ou chauffer le liquide L pour former une première paroi latérale 3 fermée à sa base par la membrane microporeuse 5 ; (c) coller le couvercle 2 muni d'au moins deux orifices 21, 22 sur la première paroi latérale 3, du côté opposé au support 2' pour former le canal microfluidique 4, dans lequel un fluide peut circuler; (d) après avoir retiré le support 2', coller sur la partie de la première paroi latérale 3, rendue accessible par le retrait du support 2', un ensemble comprenant au moins la base 6 et lesdites au moins deux deuxièmes parois latérales 7a, 7b en résine photodurcie et/ou thermodurcie, pour former la chambre 8. Ce procédé s'appuie sur le procédé divulgué dans le 30 document WO 2008/009803. L'opération effectuée lors de l'étape (a) est représentée sur la figure 3(a). Le timbre 1' utilisé lors de l'étape (a) peut être réalisé en matériau élastomère tel que le PDMS. II comporte un profil utilisé comme moule complémentaire de celui du dispositif microfluidique 1 que l'on veut produire. Le timbre 1' comporte ainsi une protubérance l'a correspondant au canal 4 du dispositif microfluidique 1 que l'on souhaite obtenir. Il comporte également une zone creuse l'b entourant la protubérance l'a, zone dans laquelle ladite première paroi latérale 3 du dispositif microfluidique 1 est io destinée à être formée. Le support 2' peut également être réalisé en PDMS et présente un profil plan. La membrane microporeuse 5 est préalablement disposée sur le support 2', puis le timbre 1' est pressé contre le support 2'. Le timbre 1' coince ainsi la membrane 5 contre le support 2' par l'intermédiaire de la 15 protubérance l'a. Ensuite, la résine photoréticulable et/ou photopolymérisable sous forme liquide RL remplit le volume situé entre le timbre 1' et le support 2' en quantité appropriée, notamment dans la zone creuse l'b du timbre 1'. Ce remplissage ne modifie pas la position de la membrane microporeuse 5, car 20 cette dernière est coincée entre le timbre 1' et le support 2'. La résine photoréticulable et/ou photopolymérisable est une solution ou une dispersion à base de monomères et/ou de pré-polymères. On utilise dans le procédé de l'invention des résines photoréticulables et/ou photopolymérisables habituellement utilisées comme adhésifs, colles ou 25 revêtements de surface. Avantageusement, on choisit des adhésifs, colles ou revêtements de surface habituellement employés dans le domaine optique. De telles résines, lorsqu'elles ont été irradiées et photoréticulées et/ou photopolymérisées, deviennent solides. De préférence, le solide ainsi formé 30 est transparent, dépourvu de bulles ou de toute autre irrégularité. De telles résines sont généralement à base de monomères/comonomères/pré-polymères de type époxy, époxysilane, acrylate, méthacrylate, acide acrylique, acide méthacrylique, mais on peut encore citer des résines thiolène, polyuréthane, uréthane-acrylate. Les résines peuvent être remplacées par des gels aqueux photoréticulables comme des gels de polyacrylamide et elles sont choisies pour être liquides à la température ambiante. Les résines peuvent également être remplacées par du polydiméthylsiloxane (PDMS). Parmi les résines photoréticulables utilisables dans la présente invention, on peut citer les produits commercialisés par la société Norland Optics sous la marque NOA® Norland Optical Adhesives, comme par exemple les produits NOA81 et NOA60, les produits commercialisés par la société Dymax dans la gamme « Dymax Adhesive and light curing systems », les produits commercialisés par la société Bohle dans la gamme « UV adhesives », les produits commercialisés par la société Sartomer sous les références commerciales SR492 et SR499. La polymérisation et/ou la réticulation de ces résines s'effectue par photoactivation à l'aide de tout moyen approprié, tel qu'une irradiation par des rayonnements U.V., visible, I.R. On choisit préférentiellement une résine qui, une fois polymérisée et/ou réticulée, est rigide et non souple, car les résines élastomériques ont tendance à se déformer lorsque l'on fait circuler des fluides sous pression dans le dispositif microfluidique 1. Toutefois, pour certaines applications, comme l'étude de l'élasticité de cellules vivantes, l'utilisation de résines photoréticulables élastomériques n'est pas exclue. Après le remplissage avec la résine liquide RL du volume situé entre le timbre 1' et le support 2', on applique alors une pression P au timbre 1' pour chasser d'éventuels excès de résine. Sur la figure 2, les parties saillantes et notamment la protubérance l'a du timbre 1' en élastomère sont au contact du support 2'. La résine liquide prend la forme des zones creuses du timbre 1'. La structure obtenue à l'issue de l'étape (b) est représentée sur la figure 3(b). Lors de l'étape (b), l'irradiation de la résine est faite dans l'axe perpendiculaire à la base du dispositif, au travers du timbre 1'. L'irradiation doit être dosée de façon, si on le souhaite, à laisser sur la superficie de ladite première paroi latérale 3 en résine, des sites de polymérisation et/ou de réticulation actifs. Puis, le timbre 1' est ôté du dispositif. Sur la figure 3(b), on observe la première paroi latérale 3 en résine photo-polymérisée et/ou photo-réticulée, de profil complémentaire de celui des zones creuses du timbre 1'. io On comprend qu'il est possible de prévoir que le profil du timbre 1' soit adapté pour que la résine photo-polymérisée et/ou photo-réticulée définisse d'autres motifs. C'est notamment le cas pour le dispositif microfluidique 100 conforme à l'invention qui sera décrit ultérieurement à l'appui de la figure 9. 15 L'impression à l'aide d'un timbre 1' en élastomère dans une résine à l'état liquide permet d'obtenir des structures de très petites tailles avec une très bonne résolution. On fixe alors, lors de l'étape (c), le couvercle 2 comportant aux moins deux orifices 21, 22 sur le dispositif, du côté de ladite première 20 paroi latérale 3 précédemment en contact avec le timbre 1'. Le support 2' peut alors être retiré. La structure obtenue à l'issue de l'étape (c) est représentée sur la figure 3(c). Le retrait du support 2' s'effectue sans que la membrane microporeuse ne se décolle de la résine photo-polymérisée et/ou photo- 25 réticulée, et sans qu'elle soit arrachée ou partiellement déchirée. Le couvercle 2 peut être réalisé avec du verre, du silicium, un film de polymère solide, un métal, un alliage conducteur ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère. De préférence, on choisit une lame de verre, un film de 30 polymère ou une lame de silicium. Les matériaux utilisés pour former le couvercle 2 sont choisis en fonction de l'application qui sera faite du dispositif microfluidique 1. Ainsi, un couvercle 2 en matériau optiquement transparent, comme le verre, est plus approprié pour faciliter l'observation, la détection optique (transparence). Un autre atout du verre est sa très bonne conductivité thermique qui permet d'effectuer un chauffage homogène des dispositifs. II convient de noter que la disposition de la membrane microporeuse 5 en partie inférieure du canal microfluidique 4 rend son utilisation compatible avec les protocoles standards de culture de cellules vivantes. En effet, il est alors envisageable que la base 6 soit une lame de verre sur laquelle s'effectue une culture de cellules vivantes, cette lame étant ensuite fixée sur la structure obtenue à l'issue de l'étape (c) pour former la chambre 8 (chambre de culture), comme cela est expliqué dans la suite de la description. L'ensemble comprenant une base 6 et deux deuxièmes parois latérales 7a, 7b peut être réalisé à partir des étapes de procédé suivantes : (el) utiliser un moule 3' ouvert en matériau élastomérique présentant une face de support 3'a et une cavité 3'b destinée à recevoir une résine liquide RL photodurcissable et/ou thermodurcissable ; (e2) disposer la base 6 sur la face de support 3'a du moule 3' ; (e3) disposer un masque 4' sur la base 6, puis photo-irradier ou chauffer pour former lesdites deuxièmes parois latérales 7a, 7b. La structure obtenue à l'issue des étapes (el) à (e3) est représentée sur la figure 4(a), dans le cas où l'étape (e3) consiste en une 25 photo-irradiation de la résine liquide. Le moule 3', comme le timbre 1' et le support 2', peut être réalisé en un élastomère tel que le PDMS. La résine liquide photodurcissable et/ou thermodurcissable utilisée pour former les parois 7a, 7b peut être choisie parmi les possibilités 30 déjà décrites pour la résine liquide employée lors de l'étape (a). De préférence, les résines liquides employées pour les étapes (a) et (el) à (e3) sont les mêmes. En variante, on pourrait utiliser des gels aqueux photoréticulables tels que ceux décrits précédemment ou du polydiméthylsiloxane (PDMS). La base 6 peut être choisie parmi les matériaux employés pour le couvercle. Avantageusement, on pourra utiliser un matériau optiquement transparent pour faciliter la visualisation optique par un dispositif dédié. Ce matériau optiquement transparent peut notamment être du verre, la base 6 formant ainsi un couvercle de verre usuellement utilisé pour la culture de cellules vivantes (CV). L'utilisation du verre permet par ailleurs de profiter des traitements de surfaces chimiques et biologiques existant pour ce substrat. Le masque 4' peut présenter des orifices 4'a, 4'b permettant de photo-irradier des zones précises de la résine liquide afin de former lesdites deuxièmes parois latérales 7a, 7b du dispositif microfluidique. Une fois l'étape (e3) terminée, il ne reste plus qu'à retirer le masque 4' et le moule 3' lors d'une étape (e4) pour ne laisser que l'ensemble formé par lesdites deuxièmes parois latérales 7a, 7b et la base 6. Cet ensemble est représenté sur la figure 4(b). Généralement, une étape (e5) est alors effectuée, celle-ci consistant à rincer ledit ensemble, par exemple par un mélange éthanol/acétone dans des proportions volumiques 90/10. Ce rinçage permet de retirer toute la résine non photo-irradiée ou non chauffée susceptible de rester sur la base 6. Puis, on effectue une culture de cellules vivantes (CV) avant 25 que cet ensemble ne soit disposé avec la structure obtenue à l'issue de l'étape (c) et avant de commencer l'étape (d). Pour cela, il faut rendre cet ensemble biocompatible. A cet effet, on peut photo-irradier fortement cet ensemble, par exemple par UV, puis effectuer un rinçage énergique dans une solution 30 neutre, telle que l'eau pendant plusieurs heures. Enfin, une culture de cellules vivantes peut alors être effectuée sur la face supérieure 61 de la base 6, comme représenté sur la figure 4(c). Cette culture s'effectue dans des conditions standards. En particulier, cette culture peut s'effectuer sur une base 6 se présentant sous la forme d'une lame de verre classique. Une fois cette culture terminée, l'étape (d) peut être réalisée. L'opération effectuée lors de l'étape (d) est représentée sur la figure 3(d). Une fois l'étape (d) réalisée, le dispositif microfluidique 1 est io prêt à l'emploi. Il comprend notamment des cellules vivantes sur la face supérieure 61 de la base 6, laquelle est opposée à la membrane microporeuse 5 au sein de la chambre 8 (chambre de culture). Pour utiliser ce dispositif microfluidique 1, celui-ci est associé à un moyen d'alimentation en fluide (non représenté) appartenant également 15 au système microfluidique selon l'invention. Ce moyen d'alimentation permet d'alimenter le canal microfluidique avec au moins un fluide comportant des molécules susceptibles de stimuler des cellules vivantes. Ce moyen d'alimentation peut par exemple être formé d'un ensemble de réservoirs de fluide, relié au canal microfluidique 4 par des 20 capillaires. Ce moyen permet alors d'effectuer des dilutions et/ou des mélanges entre les différents fluides provenant des différents réservoirs, avant l'entrée dans le canal microfluidique. Par ailleurs, le canal microfluidique 4 peut présenter une forme particulière. 25 Un exemple de canal microfluidique 4 susceptible d'être utilisé est schématisé sur la figure 5(a), selon une vue en perspective. Il s'agit d'un canal microfluidique 4 pour deux fluides différents FI, F2. Les fluides FI, F2 diffèrent seulement par la présence, dans l'un des deux fluides et en faible concentration, de molécules de stimulation 30 pour les cellules cibles. Les fluides sont amenés dans deux branches 42, 43 qui se joignent en une branche commune 44 comportant une interface 41 sur laquelle la membrane microporeuse 5 du dispositif microfluidique 1 est destinée à être disposée. On comprend que, dans ce cas particulier, le moyen d'alimentation prévoit deux sources de fluide, pour les fluides FI, F2 respectivement. Ces fluides FI, F2 sont introduits dans le canal microfluidique 4 par les entrées 420, 430. Par ailleurs, l'extrémité de la branche commune 44 comporte une sortie commune 45 pour les deux fluides FI, F2. La forme générale du canal microfluidique 4 est une forme en Y. Il convient de noter que les entrées 420, 430 sont à rapprocher de l'orifice d'entrée 21 de la figure 2 et que la sortie 45 est à rapprocher de l'orifice de sortie 22 de la figure 2. Sur la figure 2, le canal microfluidique 4 est conçu pour ne faire circuler qu'un seul fluide, entrant par un seul orifice 21 et sortant par un seul orifice 22. La figure 5(b) schématise l'écoulement des fluides FI, F2 dans les différentes branches du canal microfluidique 4. En particulier, on note que, dans la branche commune 44, les fluides FI, F2 s'écoulent en régime laminaire, l'un à côté de l'autre. L'écoulement étant laminaire, les fluides ne se mélangent pas hydrodynamiquement. De manière connue, l'écoulement est considéré comme laminaire si le nombre de Reynolds de l'écoulement dans cette branche commune 504 est inférieur à nombre de Reynolds critique, lequel peut être aisément déterminé à l'aide de manuels de mécanique des fluides. Le nombre de Reynolds est un nombre sans dimension défini par la relation Re = (V.Dh)/v où V est la vitesse des fluides dans la branche commune 44, Dh le diamètre hydraulique de la branche commune 44 et v la viscosité cinématique des fluides. Le diamètre hydraulique dépend de la géométrie de la branche commune 44. Compte tenu de la forme du canal microfluidique, le nombre 30 de Reynolds critique est de l'ordre de 2300. Compte tenu de la nature de cet écoulement, on parle de moyen d'alimentation de type « co-flow ». En pratique, les dimensions du canal microfluidique 40 étant micrométriques, l'écoulement est laminaire pour les fluides et les vitesses d'écoulement de ces fluides usuellement employés pour les applications visées par l'invention. Ces fluides FI, F2 sont destinés à s'écouler dans le canal microfluidique 4 du dispositif microfluidique 1, tous deux au contact de la membrane microporeuse 5, mais pas dans la chambre 8 (chambre de io culture). Le transport des molécules (contenues dans l'un au moins des deux fluides FI ou F2) susceptibles de stimuler les cellules vivantes, entre le canal microfluidique 4 et lesdites cellules installées sur la base 6 de la chambre 8, s'effectue alors par diffusion dans la chambre 8, à travers la 15 membrane microporeuse 5. Plus précisément, le transport de ces molécules s'effectue d'abord par diffusion à travers la membrane microporeuse 5, puis par diffusion à travers la chambre 8, pour enfin atteindre la face supérieure 61 de la base 6 de la chambre 8, face 61 sur laquelle les cellules vivantes sont situées. 20 Le profil de concentration met cependant un certain temps avant de se stabiliser dans la chambre. En particulier, au niveau de la base 6 de la chambre 8, le temps de stabilisation tstab est de l'ordre de h'2/D où h' est la hauteur de la chambre 8 et D le coefficient de diffusion des molécules destinées à stimuler les cellules cibles dans la chambre 8. II convient de noter 25 que pour éviter des temps de stabilisation trop élevés, la hauteur de la chambre sera généralement limitée à 5001,tm. Les figures 6(a) à 6(c) représentent plusieurs étapes dans le phénomène de diffusion, en considérant une alimentation en fluide de type « co-flow ». En blanc, le fluide F2 comprend des molécules de stimulation 30 pour les cellules vivantes destinées à être posées sur la base 61 de la chambre 8. En noir, le fluide FI est neutre. Sur la figure 6(a), l'alimentation en fluide arrive au niveau de la membrane microporeuse 5 et les molécules commencent à se diffuser dans la chambre 8. Sur la figure 6(b), on se situe dans un régime transitoire où le profil de concentration est en phase de stabilisation. Sur la figure 6(c), le profil de concentration est stabilisé. On comprend que la diffusion s'effectue principalement selon la hauteur de la chambre 8 (chambre de culture), c'est-à-dire une direction qui est sensiblement perpendiculaire à la direction d'écoulement des fluides FI, F2 dans le canal microfluidique 4, même si cette diffusion dans la chambre 8 s'effectue également dans les autres directions. io On a représenté sur la figure 5(c), selon une vue en coupe, ce qui se passe au niveau de l'interface 41 avec le dispositif microfluidique 1. Pour cela, un test expérimental a été effectué avec une solution neutre comme premier fluide FI et une solution fluorescente comme deuxième fluide F2. La solution fluorescente F2 comprend des molécules 15 présentant un coefficient de diffusion similaire à celui des molécules usuellement utilisées pour la stimulation de cellules vivantes. En l'occurrence, la solution fluorescente utilisée peut être de la fluorescéine isothiocyanate, comprendre une protéine fluorescente dite GFPuv pour « Green Fluorescent Protein » selon la terminologie anglo-saxonne ou comprendre une protéine 20 associée à des molécules fluorescentes dextran-70MW-rhodamine. II s'agit là de la protéine dextran-70 couplée à des molécules fluorescentes de rhodamine-B. Au dessus de la membrane microporeuse 5, à savoir dans le canal microfluidique 4 du dispositif microfluidique 1, le profil de concentration 25 de la solution fluorescente représenté sur la figure 5(c) est en créneau (comme sur la figure 6(c) par ailleurs). En effet, cette solution fluorescente n'occupe qu'une partie du canal microfluidique 4, l'autre partie dudit canal 4 étant occupée par la solution neutre. Pour connaître le profil de concentration obtenu au niveau de 30 la face supérieure 61 de la base 6, sur laquelle des cellules vivantes qu'on cherche à stimuler sont susceptibles d'être disposées, le dispositif microfluidique 1 a alors été observé par un moyen optique 18 appartenant au système microfluidique selon l'invention. Le profil de concentration obtenu sur la face supérieure 61 de la base 6 présente la forme d'une courbe représentative d'une fonction de type « erf ». Cette forme est obtenue par la diffusion des solutions neutre et fluorescente à travers la membrane microporeuse 5, puis à travers la chambre 8. Avec le moyen d'alimentation 50 en fluide de type « co-flow », il est donc possible d'obtenir un profil de concentration bien particulier à la io base de la chambre 8 et par suite, sur les cellules vivantes qu'on cherche à stimuler. Une autre forme de canal microfluidique 4' est représentée sur les figures 7(a) à 7(c). Les fluides FI, F2 sont amenés dans deux branches 42', 43' 15 qui aboutissent toutes deux dans une même canalisation 44' comportant trois sorties menant à trois serpentins (non référencés). Le premier fluide FI passe par une première sortie et se dirige vers un premier serpentin, le deuxième fluide F2 passe par une deuxième sortie et se dirige vers un deuxième serpentin, un mélange des deux fluides FI et F2 passant enfin par une sortie 20 centrale de la canalisation 44' et se dirige vers un serpentin central. A la sortie des serpentins, les fluides se rejoignent en une branche commune 45' comportant une interface 41' avec la membrane microporeuse 5 du dispositif microfluidique 1 selon l'invention. L'extrémité 46' de la branche commune 45' comporte une 25 sortie pour les fluides FI, F2. La figure 7(b) schématise l'écoulement des fluides FI, F2 dans les différentes branches du canal microfluidique 4'. Les différents fluides s'écoulent dans le canal microfluidique 4 selon un régime laminaire. On parle ici de moyen d'alimentation en fluide de type « tri- 30 flow ». On a représenté sur la figure 7(c), selon une vue en coupe, le comportement des fluides au niveau de l'interface 41'. Le dispositif expérimental employé à cet effet est similaire à celui présenté précédemment pour le canal microfluidique 4 de type « co-flow ». La figure 7(c) montre notamment que le profil de concentration dans le canal microfluidique 4' présente la forme d'un escalier. Elle montre également que le profil de concentration obtenu sur la face supérieure 61 de la base 6 (optiquement transparente) présente une zone centrale linéaire, qui peut être utilisée pour stimuler certaines cellules cibles. io Ainsi, avec ce canal microfluidique 4' de type « tri-flow », il est possible d'appliquer un profil de concentration linéaire au centre du couvercle sur des cellules vivantes qu'on cherche à stimuler. Le système microfluidique selon l'invention n'est pas limité à l'emploi de premiers canaux microfluidiques 4, 4' conçus selon les seuls types 15 « co-flow » ou « tri-flow » décrits précédemment. Aussi, d'autres types de premiers canaux microfluidiques peuvent être envisagés selon le profil de concentration que l'on souhaite appliquer sur les cellules vivantes. Le système microfluidique selon l'invention permet ainsi un contrôle beaucoup plus aisé d'un profil de concentration de molécules 20 susceptibles de stimuler une cible, comme des cellules vivantes. Ainsi, une variation de débit de l'un ou l'autre des fluides FI, F2 n'engendre pas de modification substantielle du profil de concentration de molécules appliqué aux cellules vivantes. Une raison est liée au fait que les cellules vivantes ne sont 25 pas situées sur la membrane microporeuse 5, mais sur la base 6 de la chambre 8. En effet, les cellules vivantes étant disposées à l'opposé de la membrane 5, le temps de diffusion à travers la chambre 8 amortit les éventuelles perturbations de l'écoulement des fluides dans le canal microfluidique 4. Sur les figures 5(c) et 7(c), on a représenté, à titre d'exemples, différents profils de concentration susceptibles d'être appliqués aux cellules vivantes. La conception du système microfluidique selon l'invention 5 présente également un comportement dynamique permettant de réaliser rapidement de nombreux tests. Ceci est mis en évidence par les tests décrits ci-après, réalisés en régime dynamique. Pour ces tests, la membrane microporeuse 5 est une io membrane de type Cyclopore Whatman avec des pores de 400nm. La chambre de culture présente une hauteur h' = 2001am et une largeur de Imm. On a fait circuler un premier fluide FI (solution neutre) dans le canal microfluidique 4, puis on a fait circuler un deuxième fluide F2 dans ce même canal 4, le fluide F2 étant en l'occurrence formé par une solution 15 fluorescente comprenant des molécules présentant un coefficient de diffusion comparable aux molécules usuellement utilisées pour stimuler des cellules vivantes. Les résultats obtenus pour trois solutions fluorescentes (fluorescéine, GFP et Dextran70MW) sont représentés sur la figure 8. 20 La figure 8 représente l'évolution de l'intensité normalisée de la solution fluorescente mesurée par un moyen optique tel qu'un microscope confocal située derrière la base 6, en fonction du temps. La mesure du microscope s'effectue au niveau de la base 6, laquelle est en l'occurrence une lame de verre. 25 L'origine de chacune des trois courbes (t = Os) représentées sur la figure 8 correspond à la mise en circulation du deuxième fluide F2. On observe que le temps d'établissement du profil de concentration au niveau de cette lame de verre est compris entre quelques dizaines de secondes et quelques minutes, en fonction de la nature de la 30 solution fluorescente. De manière logique, plus les molécules contenues dans cette solution sont grosses, plus le temps d'établissement est long. De manière générale, on observe que les temps d'établissement sont relativement faibles, comparables à ceux d'une diffusion sur une distance de l'ordre de la hauteur h' de la chambre 8 (chambre de culture) et permettent de mettre en oeuvre une expérience rapidement, avec un profil de concentration stable. Dans la mesure où le système microfluidique permet d'effectuer la culture des cellules vivantes indépendamment, les tests peuvent être fait rapidement, dans un temps typiquement compris entre l h et 2h. Puis, on peut passer à un autre test, avec une autre culture. io Cela n'est pas envisageable avec le système microfluidique représenté sur la figure 1. En effet, dans ce cas, la culture s'effectue au sein même du système microfluidique, si bien que des durées de plusieurs jours sont nécessaires pour réaliser un test. Généralement, le système microfluidique comprendra un 15 dispositif optique pour visualiser la chambre de culture 8 à travers la base 6. Lorsqu'un tel dispositif optique est prévu, la base est avantageusement réalisée en un matériau optiquement transparent. On peut ainsi plus facilement suivre la réponse de cellules vivantes disposées sur cette base 6 à une stimulation de certaines molécules. 20 Sur la figure 9, on a représenté une variante de réalisation du dispositif microfluidique selon l'invention, selon une vue en coupe partielle. En effet, la figure 9 ne montre que la partie supérieure du dispositif microfluidique, un ensemble comprenant une base (susceptible par exemple de recevoir une culture de cellules vivantes) et des parois latérales 25 susceptibles de former une chambre sous la membrane microporeuse 5 étant nécessaire pour que le dispositif microfluidique 100 puisse être utilisé. Le dispositif microfluidique 100 présente des caractéristiques similaires au dispositif microfluidique 1 décrit à l'appui de la figure 2 et peut, à ce titre, être utilisé avec un canal microfluidique 40 de type « coflow » ou 30 « triflow ». Le canal microfluidique 40 peut être alimenté par un moyen d'alimentation en fluides tel que celui décrit précédemment. La structure du canal microfluidique est cependant modifiée. En effet, dans cette variante de réalisation, le canal microfluidique 40 est organisé en plusieurs niveaux, en l'occurrence deux niveaux 401, 402 sur l'exemple représenté sur cette figure 9. Chaque niveau comprend une entrée de fluide correspondant à un orifice 201, 202 formé dans le couvercle 20, la sortie de fluide 203 étant commune. Un avantage de mettre en oeuvre un dispositif microfluidique io comprenant un canal microfluidique à plusieurs niveaux est de permettre l'application de profils plus complexes de concentration de molécules susceptibles de stimuler des cellules vivantes. Par exemple, on peut envisager de mettre en oeuvre dans la chambre 8 des profils de concentration concaves, convexes ou périodiques, tout en conservant un nombre limité 15 d'entrées et de sortie pour les fluides. La figure 10 montre d'ailleurs le résultat d'une simulation obtenue avec un dispositif microfluidique comprenant un canal 4 à deux niveaux, permettant d'obtenir un profil de concentration périodique spatialement. En abscisse est représentée la largeur de la chambre 8 et en 20 ordonnées, la concentration normalisée en molécules de stimulation. Les différentes courbes pleines représentent l'évolution dans le temps du profil de concentration simulé jusqu'à stabilisation. La courbe en pointillés correspond aux données expérimentales, obtenues avec un écoulement de fluorescéine. En particulier, pour réaliser un profil de concentration donné 25 appliqué périodiquement, il est envisageable d'introduire des fluides FI, F2 avec un moyen d'alimentation de type « co-flow » dans le premier niveau 401 (par l'orifice 202) du canal microfluidique, puis d'introduire à intervalles réguliers, par exemple par un autre moyen d'alimentation de type « co-flow », d'autres fluides F'1, F'2 dans le deuxième niveau 402, par l'intermédiaire de 30 l'orifice 201. Ceci est notamment possible grâce au procédé de fabrication employé qui permet de structurer des canaux microfluidiques de toute forme au-dessus la membrane microporeuse 5. On comprend que le premier canal 40 pourrait prévoir plus de deux niveaux, selon la complexité du profil de concentration que l'on souhaite appliquer. Pour la fabrication de la structure représentée sur la figure 8, on se base sur le procédé précédemment décrit, en l'adaptant. Les étapes (a) et (b) sont ainsi mises en oeuvre pour réaliser la structure 200 représentée sur la figure 11(a). Le support utilisé lors de ces étapes est référencé 20' et une paroi latérale 30" fermée à sa base par la membrane microporeuse 5. La structure 200' représentée sur la figure 11(b) est ensuite réalisée en mettant en oeuvre des étapes analogues aux étapes (a) à (c) mentionnées précédemment. La structure 200' comprend quatre premières parois latérales 30, 30"' fixées sur un couvercle 2 muni de trois orifices 201, 202 (pour l'entrée de fluide) et 202 (ou la sortie commune des fluides). Ici, aucune membrane microporeuse n'est prévue à la base de la paroi latérale 30 dans la mesure où le niveau 401 du canal microfluidique 40 doit communiquer fluidiquement avec le deuxième niveau 402 de ce même canal microfluidique 40. Les structures 200 et 200' sont ensuite fixées l'une à l'autre, comme cela est représenté sur la figure 11(c). Cette fixation peut s'effectuer par photo-irradiation ou chauffage, afin que les parois latérales 30" et 30"' se fixent l'une à l'autre pour former la paroi latérale 30'. Cette étape permet ainsi de former le deuxième niveau 402 du canal microfluidique 40. On met enfin en oeuvre une étape similaire à l'étape (d) pour un ensemble comprenant deux deuxièmes parois latérales en résine photodurcie et/ou thermodurcie afin de former la chambre sous la membrane microporeuse. Un procédé reprenant les étapes (el) à (e3) décrites précédemment à l'appui des figures 4(a) à 4(c) est mis en oeuvre à cet effet. Il convient de noter que les dispositifs 1, 100 décrits précédemment comprennent une chambre 8 (par nature fermée lorsqu'elle collée avec le canal microfluidique 4, 40), dans laquelle sont situées les cellules vivantes. Cette chambre 8 pourrait comprendre un gel de culture, bien qu'avantageusement cela ne sera pas le cas. Par ailleurs, cette chambre peut être remplacée par un canal microfluidique, comprenant donc des ouvertures avantageusement disposées latéralement. Dans ce dernier cas, le dispositif microfluidique comprendra alors le canal microfluidique 4, 40 dans lequel le fluide circule et un autre canal microfluidique dans lequel les cellules vivantes io sont situées. Les possibilités offertes par le système microfluidique selon l'invention sont donc multiples. En particulier, il est possible d'appliquer un gradient de concentration de molécules destiné à stimuler des cellules vivantes, 15 présentant la forme souhaitée (les exemples cités précédemment montrent un gradient en forme de fonction « erf », ou un gradient de forme linéaire dans la partie centrale de la chambre 8 du dispositif 1, 100) au niveau de ces cellules vivantes. Le profil de concentration s'établit dans la chambre 8, les cellules vivantes étant disposées sur une base du dispositif située à l'écart de la 20 membrane microporeuse 5, et plus précisément, à l'opposé de cette membrane 5 au sein de la chambre 8 (cette chambre pouvant être remplacée par un canal microfluidique). Ainsi, l'application de ce profil ne s'effectue pas au niveau d'un moyen d'alimentation en fluide. Le moyen d'alimentation en fluide est 25 alors simple et fournit seulement des fluides dont le débit peut varier légèrement sans que le profil de concentration appliqué au niveau des cellules vivantes n'évolue sensiblement. Le contrôle du profil de concentration au niveau des cellules vivantes est donc plus aisé, et moins sensible aux éventuelles perturbations extérieures au système microfluidique. 30 II est ainsi possible d'obtenir un profil de concentration stable dans la chambre 8, en particulier au niveau de la base 61 de cette chambre, après un temps de stabilisation dépendant principalement de la hauteur de la chambre et di coefficient de diffusion des molécules de stimulation. Le procédé de fabrication du dispositif microfluidique conforme à l'invention permet également d'employer une base en matériau optiquement transparente, par exemple une lame de verre sur laquelle une culture cellulaire peut être effectuée selon un procédé standard. L'observation du comportement des cellules vivantes (croissance, ...) peut ainsi être effectuée facilement avec un moyen de visualisation optique situé derrière la lame de verre. lo L'observation optique peut s'effectuer à haute résolution spatiale car la base en matériau optiquement transparent peut être très fine. Par exemple, on peut réaliser de la microscopie de fluorescence de haute résolution, voire même de super-résolution obtenues aves des techniques telles que la microscopie de localisation par photoactivation (PALM pour 15 « Photo-Activated Localized Microscopy » selon la terminologie anglo-saxonne) ou la microscopie de déplétion par émission stimulée (STED pour « STimulated-Emission-Depletion » selon la terminologie anglo-saxonne), en utilisant une base formée avec une lame de verre de 150µm d'épaisseur. Dans le même temps, ce moyen de visualisation permet de 20 connaître le profil de concentration des molécules stimulantes appliqué aux cellules vivantes. Il est donc beaucoup plus aisé d'effectuer expérimentalement des corrélations entre le comportement observé des cellules vivantes et le profil de concentration qui leur est appliqué. Enfin, de nombreux tests peuvent être effectués rapidement. 25 L'invention trouve en particulier application dans le domaine de la biologie, pour la culture, l'observation et l'étude de cellules vivantes. En particulier, on peut déterminer la réponse chimiotactique de cellules nerveuses à certaines molécules, par exemple afin d'élaborer des réseaux neuronaux. En particulier également, on peut mesurer la réponse de cellules 30 cancéreuses à des molécules employées pour la chimiothérapie. On peut également utiliser le système microfluidique pour la fabrication de biopuces. Les avantages liés à l'invention peuvent être intéressants pour d'autres domaines d'application, par exemple pour déterminer des seuils de toxicité de certaines molécules en cosmétologie.5 REVENDICATIONS1. Système microfluidique pour contrôler un profil de concentration de molécules susceptibles de stimuler une cible, par exemple formée par un ensemble de cellules vivantes, le système comprenant : un dispositif (1, 100) microfluidique comprenant au moins un canal microfluidique (4, 40) muni d'au moins un orifice d'entrée (21, 201, 202) et d'au moins un orifice de sortie (22, 203) pour au moins un fluide ; au moins un moyen pour alimenter le canal microfluidique (4, 40) avec io au moins un fluide comprenant des molécules susceptibles de stimuler la cible ; au moins une chambre (8) ou un autre canal microfluidique comportant une base (6) destinée à recevoir la cible ; et au moins une membrane microporeuse (5) séparant la chambre (8) ou 15 l'autre canal microfluidique du canal microfluidique (4, 40), ladite membrane microporeuse (5) étant disposée à l'écart de la base (6) de sorte que lorsque le moyen d'alimentation fournit au canal microfluidique (4, 40) ledit au moins un fluide s'écoulant selon un régime laminaire au contact de la membrane microporeuse (5), les molécules 20 susceptibles de stimuler la cible diffusent alors, après avoir traversé la membrane microporeuse (5, 50), à travers la chambre (8) ou ledit autre canal microfluidique pour finalement former un profil de concentration stable dans cette chambre (8) ou cet autre canal microfluidique. 25 2. Système microfluidique selon la revendication 1, dans lequel le canal microfluidique (4, 40) comprend un couvercle (2, 20) réalisé en un matériau choisi parmi : du verre ou du silicium, un polymère photoréticulé non élastomérique, un métal, un alliage conducteur électrique ou semi-conducteur, une céramique, du quartz, du saphir, un élastomère. 30 3. Système selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit au moins un orifice d'entrée (21, 201, 202) et ledit au moins un orifice de sortie (22, 203) pour les fluides sont formés dans le couvercle (2, 20). 4. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le canal microfluidique (4, 40) comprend au moins une paroi (3, 30, 30') en résine photodurcie et/ou thermodurcie. 5. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans io lequel la membrane microporeuse (5) s'étend transversalement sur la paroi latérale (3, 30, 30') du canal microfluidique (4, 40) pour fermer ledit canal dans sa partie inférieure. 6. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans 15 lequel le canal microfluidique (40) est organisé en plusieurs niveaux, chaque niveau comportant au moins un orifice d'entrée (201, 202) pour au moins un fluide. 7. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans 20 lequel la base (6) de la chambre (8) ou dudit autre canal microfluidique est réalisée en un matériau optiquement transparent. 8. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la chambre (8) ou ledit autre canal microfluidique comprend des 25 parois latérales (7a, 7b) en résine photodurcie et/ou thermodurcie. 9. Système microfluidique selon la revendication précédente, dans lequel la membrane microporeuse (5) s'étend transversalement entre les parois latérales (7a, 7b) de la chambre (8) ou dudit autre canal microfluidique pour 30 fermer ladite chambre ou ledit autre canal microfluidique dans sa partie supérieure. 10. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la membrane microporeuse (5) est réalisée en un matériau choisi parmi : le verre, le polycarbonate, le polyester, le polyéthylène téréphtalate, le quartz, le silicium, la silice ou le carbure de silicium. 11. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la membrane microporeuse (5) comprend des pores dont la densité est comprise entre 103 et 1010 pores/cm2. 12. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les pores présentent un diamètre hydraulique compris entre 0,051m et 1211m, de préférence entre 0,05µm et 31,tm. 13. Système microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel il est prévu un moyen de visualisation optique (18). 14. Système microfluidique selon la revendication précédente, dans lequel le moyen de visualisation optique (18) met en oeuvre une technique de microscopie de localisation par photoactivation ou une technique de microscopie de déplétion par émission stimulée.20