Brevet FR2966459A1 — publié le 20120427

La fièvre catarrhale ou maladie de la langue bleue (ou BT pour « Blue Tongue ») est une maladie virale infectieuse, mais non contagieuse, affectant les ruminants et transmisse par certaines espèces de moucherons piqueurs (genre Culicoïdes). Elle est causée par un virus appartenant au genre des Orbivirus (Reoviridae) et couramment appelé « virus de la Bluetongue » ou BTV. Ce virus est présent dans le monde entier sur une large bande couvrant l'Amérique du Nord et du Sud, l'Afrique, l'Asie du sud et l'Australie du nord, conduisant à considérer la fièvre catarrhale comme une des maladies les plus importantes affectant le bétail domestique. Historiquement, ce virus arrivait également de temps en temps sur les bords du l'Europe du sud. Les récentes incursions de BT dans ce secteur ont signé un changement spectaculaire de la situation épizootique avec l'apparition de nouveaux sérotypes (sérotypes 1, 2, 4, 8, 9, 16) dans des zones endémiques et l'émergence du virus dans des zones restées jusqu'alors indemnes. Le point de départ fut observé en 1998 avec l'arrivée du BTV-9 en Grèce. Puis des incursions de BTV-8 furent rapportées presque simultanément en Belgique, en France, en Allemagne et en Hollande au mois d'août 2006, conduisant à la plus grande épizootie jamais enregistrée affectant les troupeaux de moutons et de bovins. Les raisons de ce changement radical dans l'épidémiologie de la fièvre catarrhale sont complexes mais semblent liées à l'extension du territoire colonisé par son vecteur principal, Culicoides imicola, l'apparition de nouveaux vecteurs de types Culicoïdes ainsi qu'au réchauffement climatique. Les signes cliniques d'une infection à BTV sont extrêmement variables. Chez le mouton, ils sont généralement aigus et caractériser par de la fièvre, des lésions buccales, un amaigrissement, une boiterie, avec un taux de mortalité des moutons infectés d'environ 20 à 50% (MacLachlan and Pearson, 2004; Verwoerd and Erasmus, 2004). Les symptômes sont moins apparents chez les bovins et plus de 90% des animaux infectés par le BTV ne présentent pas ou peu de signes cliniques. Cependant, l'infection bovine est un facteur important de l'épizoologie du BTV de part leur fonction de réservoir viral. D'importantes pertes économiques sont donc associées à l'infection BTV, de façon directe par la réduction de la production, voire la décimation des cheptels, mais surtout indirectement par la mise en place d'embargos et d'une restriction de l'export des bovins ainsi que de coûteuses mesures de contrôle. Les membres de la Communauté Européenne ainsi que la Suisse ont donc adopté un plan de vaccination afin de réduire les pertes dans les élevages d'animaux domestiques, contenir toute propagation de la maladie et faciliter le marché des animaux de rentes. Les vaccins basés sur une atténuation du virus vivants, aussi appelés vaccins atténués ou vaccins MLV (Modified-Live Virus), étaient les seuls vaccins disponibles contre la fièvre catarrhale lors de la dernière épizootie. Ce type de vaccins ont donc été importé et utilisé en urgence contre le BTV de sérotype 2, 4, 9 et 16 dans le sud de l'Europe (Corse, Portugal, Îles Baléares et Italie). Cependant, les risques associés à l'utilisation de ces derniers restent importants. Il a été ainsi rapporté qu'une atténuation insuffisante du virus peut conduire à des manifestations cliniques de la maladie et une tératogénicité. De plus, une réversion de la virulence par réarrangement génique avec les souches sauvages co-existantes peut survenir. Afin d'éviter ce genre de problématique, une alternative préférable est l'utilisation de vaccins basés sur une inactivation totale du virus, vaccins dits inactivés. Des vaccins anti-BTV-2,-4 et -16 de ce type, alliant efficacité et réduction des risques, ont ainsi été développés. Actuellement, différents vaccins inactivés anti-BTV8 sont disponibles en Europe (BLUEVAC 8, CZ Veterinaria S.A., Porriûo, Espagne; Zulvac® 8, Fort Dodge Animal Health, Naarden, Hollande et BTVPUR® AlSap 8, Merial S.A.S, Lyon, France) et d'autres sont en cours de développement en Inde et en Chine contre d'autres sérotypes. Le diagnostic de la fièvre catarrhale peut être effectué par un isolement et une identification du virus, par une détection de séquences spécifiques de l'ARN viral ou par la mise en évidence dans le sérum d'anticorps spécifiques d'antigènes viraux. Cependant, la nécessité d'une phase d'amplification du virus rend la technique d'isolement viral complexe et longue. La détection de l'ARN du BTV par RT-PCR bien que plus rapide reste une méthode coûteuse. Les tests sérologiques, plus faciles et moins onéreux, sont dés lors les plus couramment utilisés. Cette famille de tests comprend la fixation du complément, l'immunodiffusion, l'immunofluorescence, l'hémolyse en gel et le dosage d'immunoadsorption enzymatique (enzyme linked immunosorbent assay ou ELISA). Le test ELISA est essentiellement utilisé pour la détection d'anticorps anti-BTV groupe-spécifique ("The use of a monoclonal antibody in a blocking ELISA to detect group-specific antibodies to bluetongue virus , Anderson J. et al., J.Immunol.Methods Vo1.74, pp 139-149, (1984)). Il est basé sur la détection d'anticorps dirigés contre une région particulière de la protéine de capside VP7 très immunogène et fortement conservée entre les 24 sérotypes du BTV. Des anticorps anti-VP7 peuvent être mis en évidence chez les ruminants dés le 7ème jour après infection et 10 à 40 jours après vaccination en fonction des animaux testés et des vaccins utilisés. Malheureusement, il a été démontré que les anticorps ainsi détectés ne sont pas forcément neutralisants. Ainsi, un statut sérologique anti-VP7 positif pour des animaux naturellement infectés peut co-exister avec un état contagieux. De plus, une séroconversion anti-VP7 est également observée après vaccination des bovins à l'aide de vaccins commerciaux. Dans ce contexte, les tests ELISA actuels basés sur la VP7 ne peuvent pas différencier les animaux naturellement infectés des animaux vaccinés (DIVA pour « Differentiating Infected Vaccinated Animals ») et le seul moyen d'être sûr du statut sanitaire d'un animal reste de vérifier l'absence de génome viral dans le sang par RT-PCR. De nouveaux tests sérologiques, plus économiques et plus faciles à réaliser, sont donc nécessaires aux études épidémiologiques du BTV et afin de coordonner les futures campagnes de vaccinations. Dans ce but, les protéines non-structurales (NS) du virus de la fièvre catarrhale ont été identifiées comme une famille d'antigènes intéressants. En effet, les vaccins préconisés étant de type inactivés, cela implique que le virus ne peut se multiplier que dans les animaux naturellement infecté et non dans les animaux vaccinés. Des lors, un test basé sur une protéine non-structurale qui n'est exprimé qu'au cours de la réplication virale est théoriquement un bon candidat pour le développement d'un test DIVA. Des stratégies similaires ont été réalisées dans le passé, notamment pour les vaccins contre la grippe aviaire ("Overview of avian influenza DIVA test stratégies", Biologicals, Vo1.33, pp221-226 (2005)). J.Anderson, P.Mertens et K.Herniman ont été les premiers à décliner cette stratégie DIVA pour le diagnostic de la fièvre catarrhale. Ils ont ainsi développé un ELISA de compétition (c-ELISA) à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine non-structurale NS 1 du BTV et appelé « F58 » ("A competitive ELISA for detection of anti-tubule antibodies using a monoclonal antibody against Bluetongue virus non-structural protein NSI ", Journal of Virological Methods, Vo1.43, pp167- 176 (1993». Dans ce test, la capacité de fixation de l'anticorps F58 à NS1 est abolie par les sérums d'animaux naturellement infectés, ou vaccinés à l'aide de vaccins atténués, mais pas par les sérums d'animaux vaccinés à l'aide du vaccin inactivé qu'ils ont produit. Ils ont également montré qu'il n'y avait pas d'inhibition par les sérums d'animaux infectés par le virus de la maladie hémorragique épizootique ou EHDV (epizootic hemorrhagic disease virus), un autre orbivirus transmis par les culicoïdes et pouvant interférer avec le diagnostic de la fièvre catarrhale par un test ELISA classique. Le test ainsi décrit combine donc des caractéristiques DIVA et de spécificité de sérogroupe. Malheureusement, cette approche a ses limites. En effet, les protéines non-structurales se retrouvent partiellement co-purifiées avec le virus et donc en faible quantité dans la formulation de vaccins inactivés. Une réponse immunologique dirigée contre ces protéines peut alors être induite. De plus, différents sérotypes de la fièvre catarrhale sont présents en Europe, conduisant à plusieurs cycles de campagnes de vaccination (BTV 1 et BTV8 ou BTV 1 et BTV 16, etc...). L'association d'un manque de traçabilité à des échanges commerciaux intenses peut alors mener à des situations de multiple vaccination contre un même sérotype et pour un seul animal. Dans ce contexte, de très faibles quantités de protéines NS contaminant les vaccins inactivés peuvent induire une séroconversion et donc l'apparition de « sérums problématiques »lors de tests DIVA. La Demanderesse a mis en évidence qu'il était possible d'utiliser la protéine non-structurale NS 1 du virus BTV, ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1, pour la préparation, la sélection et la production d'anticorps monoclonaux, ainsi que des test associés, permettant de différencier un animal infecté spécifiquement par le BTV d'un animal vacciné contre un tel virus. Ce test est adapté à l'analyse d'échantillons biologiques d'animaux dont le statut sanitaire vis à vis de cette infection est inconnu. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine native ou recombinante NS 1 du virus de la langue bleue (dénommé « BTV » pour Blue Tongue Virus), pour la préparation d'un réactif ou d'un kit pour son usage in vitro et destiné à différencier un animal vacciné contre un virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV, caractérisée en ce que ledit anticorps est un anticorps monoclonal obtenu à partir d'un surnageant de culture d'un hybridome, ledit hybridome ayant été obtenu par fusion entre une cellule myélomateuse et une cellule lymphoïde de mammifère animal, ledit mammifère ayant été préalablement immunisé avec une composition ou un composé immunogène comprenant une protéine NS1, native ou recombinante, de BTV, ou l'un de ses fragments antigéniques, et caractérisée en ce que ledit anticorps est sélectionné par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 du BTV ; et b) - i) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 de virus de la maladie hémorragique épizootique (« EHDV » pour epizootic hemorrhagic disease virus) ; et c) la sélection dudit anticorps testé si ce dernier : - 1) reconnaît de manière spécifique ladite protéine NS1 du BTV, ou son fragment antigénique, et - ii) ne reconnaît pas ladite protéine NS1 de EHDV. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit anticorps est sélectionné par un procédé comprenant en outre à l'étape b) : b) - ii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le EHDV, et en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iii) il y a une réaction croisée pour la reconnaissance de la protéine NS1 du BTV 25 entre ledit anticorps test et ledit sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV. Dans un mode de réalisation encore plus particulièrement préféré, ledit anticorps est sélectionné par un procédé comprenant en outre à l'étape b) : 30 b) - iii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le BTV ou vacciné contre celui-ci, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le BTV, et en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iiii) a) Il y a une compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV, de préférence un signal représentant 0 à 20 %, de manière plus préférée 0 à 15 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif ; et (3) Il n'y a pas ou peu de compétition observée pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal vacciné contre le BTV, de préférence un signal représentant plus de 50 %, de manière plus préférée de plus de 60 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. Dans un mode de réalisation préféré, ladite protéine NS1 du virus BTV, ou composition ou composé la comprenant, ou l'un de ses fragments antigéniques est choisi parmi : a) une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1, GenBank: CAO85724.1), ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8, GenBank: CAM57246.2), ou de séquence ayant au moins 85 % , 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou b) un virus BTV, ou l'un de ses fragments contenant la protéine NS1, ou l'un de ses 25 fragments antigéniques, telle que définie en a). Selon un mode de réalisation également préféré, - ledit EHDV est un EHDV de sérotype 1 ou 2, de préférence de type 2, et ladite protéine NS1 du virus EHDV est la protéine NS1 EHDV de sérotype 1 ou 2 de 30 séquence respective SEQ ID NO :3 (séquence référence NCBI: YP_003240112.1) ou SEQ ID NO :4, (GenBank: CAN89169.1) ou de séquence ayant au moins 85 % , 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % d'identité avec SEQ ID NO :3 ou SEQ D NO :4. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, - ledit anticorps est l'anticorps sécrété par ledit anticorps est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. Par fragment fonctionnel dudit anticorps, on entend désigner de préférence les fragments choisis parmi les fragments Fab, (Fab')z, Fab', Fv, scFv, scFv-Fc dudit anticorps, ces fragments ayant les caractéristiques fonctionnels de l'anticorps dont ils sont issus et tels que définies notamment à l'étape c). Les fragments d'anticorps monoclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur un épitope de la protéine NS1 de BTV 1 ou 8 et sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes bien connues de l'homme de l'art. Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière les fragments d'anticorps monoclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc.... En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow et al., 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps monoclonaux utilisés selon la présente invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine NS1 de BTV 1 ou 8 et, ou un de ses fragments, comportant l'épitope reconnu spécifiquement par ledits anticorps monoclonal dénommé 9B4 Id Vet selon l'invention. Ladite protéine NS1 de BTV 1 ou 8 et, ou un de ses fragments antigéniques, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la séquence de l'ADNc codant pour la protéine NS1 de BTV 1 ou 8 et ou par synthèse peptidique à partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la protéine NS1 de BTV 1 ou 8 et, de préférence la protéine NS1 de BTV 1 ou 8 et de séquence SEQ ID NO :1 ou 2. Les anticorps monoclonaux utilisables selon l'invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisée la protéine NS1 de BTV 1 ou 8 et ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par ledit anticorps monoclonal dénommé 9B4 Id Vet selon l'invention. L'utilisation ou les méthodes ci-après selon la présente invention peuvent mettre en oeuvre un anticorps anti-NS 1 de BTV, de préférence de sérotype 1 ou 8 et ou un de ses fragments, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps chimériques ayant les mêmes CDRs (« CDR » pour Régions Déterminant la Complémentarité que l'anticorps monoclonal anti-NS1 de BTV et tel que défini ci-avant. Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps monoclonal chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Sont également compris dans l'invention, les utilisations ou méthodes DIVA de différentiation dans lesquelles les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, ou encore les protéines NS1 de BTV 1 ou 8, ou leurs homologues à au moins 85 % identiques, ou leurs épitopes/fragments antigéniques, sont obtenus par recombinaison génétique (protéines recombinantes) ou par synthèse chimique. L'invention comprend également les utilisations ou méthodes de détection ou de diagnostic dans lesquelles les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, ou encore les protéines NS1 de BTV 1 ou 8, leurs homologues à au moins 85 % d'identité, ou leurs épitopes/fragments antigéniques, sont marqués. Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments ou encore les protéines NS1 de BTV-1 ou de BTV-8 ou leurs épitopes/fragments antigéniques, peuvent être également, marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, ou encore les protéines NS1 de BTV-1 ou -8, leurs homologues à au moins 85 % identiques, ou leurs épitopes/fragments antigéniques, incluent par exemple des anticorps ou antigènes dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la P-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, l'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylénediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylénetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluoréscéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate. D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine. Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou l'antigène NS1 de BTV 1 ou 8, leurs homologues, ou un de leurs fragments, on peut également cités les marqueurs radioactifs tels que 14C, 36C1, 57Co, 58Co, 58Cr, 59Fe 1'H 125I 121I, 32P ou 35S qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à scintillations etc.... Selon un mode de réalisation également préféré, - ledit réactif ou kit comprend en outre une protéine NS1 du virus BTV, ou composition ou composé la comprenant, ou un de ses fragments antigéniques. De préférence, ladite protéine NS1 du virus BTV, ou composition ou composé la comprenant, ou un de ses fragments antigéniques est telle que définie dans la revendication 4 a) et 4 b). Selon d'autres caractéristiques de l'invention : - ledit fragment antigénique de la protéine NS1 est un fragment capable de se fixer spécifiquement sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. - ladite protéine NS1 de BTV ou l'un de ses fragments antigéniques, ou la composition ou le composé la comprenant, est fixée ou adsorbée sur un support solide, de préférence sur une cupule de microplaque. Selon un mode de réalisation également préféré ledit animal d'où provient ledit échantillon biologique est un ruminant, de préférence choisi parmi les bovins, ovins ou caprins. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV à partir d'un échantillon biologique dudit animal comprenant les étapes suivantes : A) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine NS1 d'un virus 30 BTV, ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et B) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-NS1 susceptible d'être présent dans ledit échantillon, cette révélation étant réalisée par une méthode d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps anti- NS1, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de reconnaître spécifiquement la protéine NS1 du virus BTV, ou l'un de ses fragments antigéniques, ledit anticorps-anti-NS 1 étant un anticorps monoclonal obtenu à partir d'un surnageant de culture d'un hybridome, ledit hybridome ayant été obtenu par fusion entre une cellule myélomateuse et une cellule lymphoïde de mammifère animal, ledit mammifère ayant été préalablement immunisé avec une composition ou un composé immunogène comprenant une protéine NS1 de BTV, native ou recombinante, ou l'un de ses fragments antigéniques, et caractérisée en ce que - ledit anticorps anti-NS 1 est sélectionné par un procédé comprenant les étapes 15 suivantes : a) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 du BTV ; et b) - i) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de 20 surnageant de culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 de virus de la maladie hémorragique épizootique (« EHDV » pour epizootic hemorrhagic disease virus) ; et c) la sélection dudit anticorps testé si ce dernier : - i) reconnaît de manière spécifique ladite protéine NS1 du BTV, ou son fragment 25 antigénique, et - ii) ne reconnaît pas ladite protéine NS1 de EHDV. Selon un mode particulièrement préféré de la méthode selon l'invention, - ledit anticorps test est sélectionné par un procédé comprenant en outre à l'étape 30 b) : b) - ii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le EHDV, et en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iii) il y a une réaction croisée pour la reconnaissance de la protéine NS 1 du BTV 5 entre ledit anticorps test et ledit sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV. Selon un mode en plus particulièrement préféré de la méthode selon l'invention, ledit anticorps est sélectionné par un procédé comprenant en outre à 10 l'étape b) : b) - iii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le BTV ou vacciné contre celui-ci, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le BTV, et 15 en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iiii) a) Il y a une compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV, de préférence un signal représentant 0 à 20 % du signal 20 obtenu pour ledit contrôle négatif ; et (3) Il n'y a pas ou peu de compétition observée pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal vacciné contre le BTV, de préférence un signal représentant plus de 50 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. 25 Selon un mode également préféré de la méthode selon l'invention, ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode immunodosage en compétition est un anticorps marqué, de préférence la méthode immunodosage en compétition est une méthode ELISA en compétition, de préférence ledit anticorps 30 est marqué à la péroxydase. Selon un mode plus particulièrement préféré de la méthode selon l'invention, ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode d'immunodosage en compétition est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. Selon un mode également préféré de la méthode selon l'invention, 5 ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine NS1 d'un virus BTV, ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, ladite protéine NS1 étant préalablement capturée par immunocapture sur une phase solide revêtue d'un 10 anticorps anti-NS1- BTV de type polyclonal, ou, de type monoclonal et tel que défini dans la revendication 1 ; b) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-NS1 susceptible d'être présent dans ledit échantillon, cette révélation étant réalisée par une méthode 15 d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps anti-NS1, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence marqué, tel que défini dans la revendication 1, 2 ou 3, de préférence 2 et 3. Selon un mode également préféré de la méthode selon l'invention, 20 ladite méthode comprend les étapes suivantes : - à l'étape a) : a) l'anticorps anti-NS1 revêtu sur la phase solide et tel que défini dans la revendication 1; et b) l'anticorps anti-NS1, de préférence marqué, tel que défini dans la revendication 2 25 ou 3 est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I-4198. De préférence encore, ladite protéine NS1 du virus BTV mis en oeuvre à l'étape a), ou composition ou composé la comprenant, ou l'un de ses fragments antigéniques est choisi parmi : 30 a) une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1) ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8), ou de séquence ayant au moins 85 % , 90 %, 95 %, 98% ou 99 % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou b) un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments contenant la protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques. Selon un mode de réalisation préféré: - soit ladite protéine NS1 du virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques, mis en oeuvre à l'étape a), ou - soit ledit anticorps capable de reconnaître spécifiquement la protéine NS1 du virus 10 BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8-8, mis en oeuvre à l'étape b), est marqué, de préférence à la peroxydase. Selon un mode de réalisation préféré, ledit échantillon biologique est un échantillon de fluide biologique, de préférence choisi parmi le plasma, le sérum, 15 du jus de viande ou un échantillon de sang total de l'animal, le sérum étant le plus préféré. Selon un mode de réalisation également préféré, à l'étape b), une réaction de compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle 20 négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV, de préférence un signal représentant 0 à 20 %, de manière plus préférée 0 à 15 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition en deux 25 étapes ou en une étape, ou tout immunodosage d'anticorps par compétition connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les méthodes d'immunodosages par compétitions mises en oeuvre dans les méthodes selon l'invention, la protéine non-structurale NS1 de BTV, de 30 préférence de sérotype 1 ou 8, ou un fragment antigénique de ladite protéineNS1, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être immobilisé ou marqué, il en est de même pour l'anticorps anti-NS1 de BTV, de préférence de sérotype 1 ou 8. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles. On peut citer par exemples les cupules de microplaques. Dans une méthode d'immunodosage en une étape, on revêt une cupule de microplaque d'anticorps anti-NS1 de BTV, de préférence de sérotype 1 ou 8 tel que décrit ci-avant, non marqué. Puis on ajoute successivement à la cupule l'échantillon biologique à tester et l'antigéneNS1 de BTV, de préférence de sérotype 1 ou 8, préalablement marqué. Cette étape étant suivie d'une étape d'incubation et de lavage de la cupule avant l'étape suivante de détection et/ou de quantification du marqueur. Une telle méthode dite ELISA par compétition en une étape (par opposition à la méthode d'ELISA par compétition en deux étapes, telle que décrites notamment dans les exemples ci-après) fait également partie de la présente invention. A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio-immunologique (RIA) ou équivalent. Selon un mode de réalisation également préféré : - ledit échantillon biologique préalablement prélevé chez l'animal ou obtenu à partir de l'animal est un échantillon de fluide biologique, de préférence choisi parmi le plasma, le sérum, du jus de viande ou encore un échantillon de sang total de l'animal, le sérum étant le plus préféré. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un kit ou trousse de réactifs pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV, ledit kit comprenant : A) un composé ou composition comprenant la protéine NS1 du virus BTV, ou un fragment antigénique de ladite protéine NS 1 ; B) un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine NS1 du virus BTV, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine NS1, le cas échéant marqué, de préférence ledit anticorps est polyclonal, monoclonal ou chimérique ; et, C) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; et D) le cas échéant, les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. Selon d'autres caractéristiques de l'invention : A) ledit composé ou ladite composition comprenant la protéine NS1 du virus BTV-8, ou ledit fragment antigénique de ladite NS1, est choisi parmi : a) une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1) ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8), ou de séquence ayant au moins 85 % , 90 %, 95 % ,98 ou 99 % % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou b) un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments contenant la protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques telle que définie 20 ci-dessus dans la revendication 10, et B) ledit un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine NS1 du virus BTV, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine NS1, le cas échéant marqué, est choisi parmi l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. 25 Selon d'autres caractéristiques, ledit kit ou trousse de réactifs comprend : - un réactif A) comprenant un premier anticorps dit de capture anti-NS1-BTV de type polyclonal, ou l'anticorps sécrété par l'hybridome tel que défini dans la revendication 1, le cas échéant revêtu sur une cupule de microplaque ; - un réactif B) comprenant une protéine NS 1 native isolée et, le cas échéant purifiée, 30 ou recombinante de virus BTV, ou encore un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8 entier, le cas échéant, le réactif B) ayant été préalablement fixé sur ladite cupule du réactif A) ; et - un réactif C) comprenant l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 I d Vet déposé à la CNCM, le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198, le cas échéant marqué. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de sélection d'un anticorps pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV, le cas échéant utilisable dans une méthode d'immunodosage en compétition Selon d'autres caractéristiques, ledit procédé de sélection selon 10 l'invention comprend l'étape suivante: a), le cas échéant la sélection d'un hybridome obtenu après immunisation d'un animal avec un antigène choisi parmi : - une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé 15 SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1) ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8), ou de séquence ayant au moins 85 % , 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou - un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments contenant la protéine NS1, 20 b) la mise en contact dudit anticorps à tester avec la protéine NS1 du virus BTV tel que défini en a), ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et c) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (b) entre 25 ladite protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques, et ledit un anticorps testé, et dans laquelle étape la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) est réalisée par une méthode d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps, ou l'un des fragments fonctionnels, ledit un anticorps étant l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4Id Vet déposé à la CNCM, le le 7 30 juillet 2009 sous le numéro I- 4198, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué. Sous un autre aspect, l'invention comprend l'hybridome dénommé 9B4Id Vet déposé à la CNCM, le le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué. L'invention comprend aussi l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4Id Vet déposé à la CNCM, le le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué. 10 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures. Les figures dont les légendes sont ci-après, ainsi que les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant en limiter la portée. 15 LEGENDES DES FIGURES - La figure 1 représente un test de compétition entre les anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4. Les anticorps monoclonaux 9B4 ou 11G1 ont été mis en présence de l'anticorps monoclonal 11G1 couplé à la péroxydase (11G1-HRP) à 20 différentes concentrations (ratio Mab/11G1-HRP) sur des plaques sensibilisées par la protéine NS1 native (A) ou recombinante (B). - La figure 2 représente une évaluation des anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 en western-blot. Un échantillon de préparation d'antigène NS1 natif a été analysé par électrophorèse en SDS-PAGE, puis transféré sur membrane PVDF 25 avant d'être mis en présence d'anticorps monoclonaux anti-NS1 (10B1, 9B4 et 11G1). La révélation a été effectuée à l'aide d'un anticorps anti-souris couplé à la péroxydase. - La figure 3 représente le potentiel DIVA BT des anticorps monclonaux 11G1 et 9B4 sur des sérums d'animaux multivaccinés. Un cheptel ovin 30 (n=6) a été vacciné contre le BTV8 à l'aide d'un vaccin commercial (Mérial). Les animaux ont reçu 2 injections d'une dose à 36 jours d'intervalle (JO et J+36) puis une double dose au 74e jour (J+74). Les sérums ont été prélevés régulièrement pendant 108 jours. La présence d'anticorps anti-NS1 compétitifs des anticorps5 monoclonaux 11G1 (A., triangle blancs) ou 9B4 (B., carrés blancs) a été comparée la présence d'anticorps anti-VP7 (losanges noirs) par technique ELISA. - La figure 4 représente une évaluation de la séroconversion anti-VP7 et anti-NS1 après infection par le BTV. Un panel de sérums bovins naïfs (n=71) ou infectés par le BTV-8 (n=87) ont été testés pour la présence d'anticorps dirigés contre les protéines VP7 (A.) et NS1(B) par technique d'ELISA de compétition à l'aide d'un test classique (ID Screen® Bluetongue Competition) ou du test cELISA DIVA-BT NS 1. Les résultats sont représentés sous forme de distribution des échantillons en fonction du pourcentage de la valeur obtenue pour chaque échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). - La figure 5 représente une évaluation de la séroconversion anti-VP7 et anti-NS 1 après vaccination contre le BTV chez les bovins : un cheptel bovin (n=30) a été vacciné contre le BTV8 à l'aide d'un vaccin commercial. Les sérums ont été prélevés le jour de la première injection vaccinale (JO) et au 64e jour (1+64) et la présence d'anticorps dirigés contre les protéines VP7 (A.) et NS 1(B) a été mise en évidence par technique d'ELISA de compétition. Les résultats sont représentés sous forme de distribution des échantillons en fonction du pourcentage de la valeur obtenue pour chaque échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). - La figure 6 représente une évaluation de la séroconversion anti-VP7 et anti-NS 1 après vaccination contre le BTV chez les ovins : un cheptel ovin (n=75) a été vacciné contre le BTV8 à l'aide d'un vaccin commercial (Mérial). Les sérums ont été prélevés le jour de la première injection vaccinale (JO) et au 33e jour (1+33) et la présence d'anticorps dirigés contre les protéines VP7 (A.) et NS 1(B.) a été mise en évidence par technique d'ELISA de compétition. Les résultats sont représentés sous forme de distribution des échantillons en fonction du pourcentage de la valeur obtenue pour chaque échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). EXEMPLES Exemple 1 Matériels et réactifs 1.1 Préparation de l'antigène NS1 natif Une monocouche de cellules Véro à 80% de confluence dans une flasque de 75cm2 (MEM, 0.5% SVF, gentamycine 40 µg/mL, amphotéricine B 1µg/mL) a été infectée par le BTV-1. Les cellules ont ensuite été décrochées et séparées du milieu de culture par centrifugation de 10 min à 1000 rpm quand le pourcentage de lyse observé est supérieur à 70 %. Le culot cellulaire est repris au 1/100e du volume initial à l'aide de tampon de lyse (Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, Tx100 0,5 %, Inhibiteurs de protéase). La suspension a été incubée 1 h à +4 °C, soniquée 5 min. sur glace puis centrifugée 20 min. à 2200 x g.. Le surnageant contenant l'antigène NS1 natif a été récupéré et conservé à -20 °C. 1.2 Préparation de l'antigène NS1 recombinant La séquence complète de l'ADN correspondant à la région M6 du BTV-1 a été obtenue par RT-PCR. La construction du baculovirus recombinant contenant la séquence d'intérêt a été effectuée par la société GenScript (Piscataway, USA). Brièvement, le gène codant pour la protéine NS1 du BTV-1 a été sous-cloné dans le plasmide pGSF1 à l'aide des sites de restriction EcoR I et Sal I afin de greffer un tag 6xHIS en N-terminal de la protéine NS1 recombinante. Ce fragment codant pour la 6xHIS-NS1 a été transféré dans le vecteur DH10Bac pour permettre l'expression protéique dans les cellules d'insectes. Les cellules Sf9 ont ainsi été transfectées par le baculovirus recombinant DHlOBac-6xHIS-NS1 à l'aide de Cellfectin (Invitrogen, USA) et cultivées 5 à 7 jours en milieu SF-9000 (GIBCO, USA). Les cellules Sf9 exprimant NS1 ont été lysées à l'aide tampon lyse (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, Imidazole 20 mM, 0.1 % NP40, PMSF et Inhibiteurs de Protéase) et soniquée durant 5 min. Après centrifugation le surnageant a été déposé sur colonne de nickel et la protéine NS1 éluée par ajout d'imidazole à 250 mM. La fraction recueillie contenant l'antigène NS1 recombinant a été vérifiée sur gel SDSPAGE et par Western-blot à l'aide d'un anticorps anti-6xHIS. La concentration a été déterminée par mesure de la densité optique à 280nm. 1.3 Banques de sérums 1.3.1 Sérums d'animaux naïfs Les sérums des animaux naïfs ont été récupérés au courant de l'année 2006 auprès de l'abattoir d'Alès (France). 1.3.2 Sérums d'animaux naturellement infectés BTV Les sérums des animaux infectés par le BTV proviennent de plusieurs zones de campagne de prélèvement. Les sérums bovins BTV-8 positifs ont été fournis par le laboratoire d'Arsia (Belgique) et sont relatifs à l'épisode épidémique de 2007 dans la région de Liège (Belgique). 1.3.3 Sérums d'animaux infectés EHDV Les sérums EHDV ont été fournis par Veterinary Diagnostic Technology (Wheat Ridge, Etats-Unis) et correspondent au suivi sérologique d'une 20 infection expérimentale de 6 bovins inoculés par l'EHDV de sérotype 1 ou 2, ainsi que des sérums positifs de référence qualifiés par immunodiffusion en gel d'agarose (technique AGID). 1.3.4 Sérums d'animaux vaccinés BTV 1.3.4.1 Sérums Ovins : Les sérums ovins exempts d'infection naturelle et vaccinés contre BTV-8 ont été fourni par Mérial et correspondent à un essai interlaboratoires 30 Merial/Fort Dodge/CZ Veterinaria S.A au cours duquel les animaux on été vaccinés à l'aide de vaccins inactivés BTV-8 (BLUEVACe 8, CZ Veterinaria S.A.; Zulvac® 8, n=5, Fort Dodge Animal Health, n=3 et BTVPUR® AlSap 8, Merial, n=3) selon le protocole des fabricants, ainsi qu'un essai vaccinal Mérial anti-BTV8 (BTVPUR® AlSap 8). Le protocole suivi dans ce dernier cas consiste à une triple injection 35 vaccinale à 14 jours d'intervalle entre chaque prise, suivi d'un prélèvement 21 jours après la dernière injection. Les animaux ayant reçu deux doses supplémentaires par 15 25 rapport au protocole standard établit pour ce vaccin, les sérums obtenus sont considérés comme des « sérums hyperimmuns » Les sérums d'ovins exempts d'infection naturelle et vaccinés contre le BTV-1 et -8 ont été fournis par l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT, Toulouse, France). Les animaux ont reçu une dose et deux doses de vaccin inactivé BTV-8 (BTVPUR® AlSap 8, Mérial) et BTV-1 (Zulvac®1 ovin, Fort Dodge Animal Health), respectivement, selon le protocole des fabricants. Les sérums ovins exempts d'infection naturelle et vaccinés contre le 10 BTV-2 et -4 ont été obtenus par d'IDVET et correspondent à une immunisation à l'aide du vaccin inactivé bivalent BTVPUR® AlSap 2 - 4 (Mérial) 1.3.4.2 Sérums Bovins : 15 Les sérums bovins exempts d'infection naturelle et vaccinés contre BTV-8 ont été fourni par Mérial et correspondent à un essai interlaboratoires Merial/Fort Dodge/CZ Veterinaria S.A au cours duquel les animaux on été vaccinés à l'aide de vaccins inactivés BTV-8 (BLUEVACe 8, CZ Veterinaria S.A.; Zulvac® 8, n=6, Fort Dodge Animal Health, n=7 et BTVPUR® AlSap 8, Merial, n=4) selon 20 le protocole des fabricants. 1.4 Réactifs des tests ELISA Sauf indication contraire, l'ensemble des réactifs utilisés dans le 25 cadre de la technique ELISA sont des éléments entrants dans la composition des kits commerciaux de la société IDVET. Afin de définir les termes utilisés, les différentes solutions utilisées sont identifiées ci-dessous : Solution de Lavage : Solution SL (du test IDScreen® ou solution de 30 lavage de type PBST (0.01 M PBS contenant 0.05% Tween-20, pH 7.2) Solution de Saturation : Solution ST (solution de saturation à base de PBST contenant 3% de BSA) Solution de Révélation : Solution SR ( « Solution de Révélation » du 35 test IDScreen® ou solution de révélation à base de 3,3',5,5'-tétramethylbenzidine (TMB)) Solution d'Arrêt : Solution SA (« Solution d'Arrêt » du test IDScreen® ou solution d'arrêt à base d'acide sulfurique 0,5 M). Solution de dilution des sérums : DL18 ou solution SL contenant 2 % de lait écrémé. Solution de dilution de l'anticorps monoclonal conjugué à la péroxydase : DL19 ou solution SL. De telles solutions sont bien connues de l'homme de l'art et sont décrites notamment dans le « Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres (2009, OIE) ou dans les manuels standards tels que par exemple « Antibodies A Laboratory Manual » (Ed Harlow et David Lane, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory). Les données ont été obtenues par lecture de la densité optique à 15 450nm à l'aide d'un spectrophotomètre multicanaux (Sunrise, Tecan) Exemple 2 Méthode de préparation des hybridomes 2.1 Préparation du BTV pour l'inoculation 20 Des cellules de la lignée Vero (ATCC, CCL-81) ont été cultivées et portées à 80 % de confluence en milieu DMEM contenant 10 % de sérum de veau foetal (SVF), 50 µg/mL de gentamycine + 100 U de pénicilline + 100 µg/mL de streptomycine (Gibco). Le milieu de culture a été remplacé par du milieu 25 d'infection (MEM + 0,5 % SVF + 50 µg/mL de gentamycine + 100 U de pénicilline + 100 µg/mL de streptomycine) et les cellules ont été infectées par la souche BTV-1. Trois jours après infection, le milieu d'infection a été éliminé, les cellules ont été lavées à l'aide PBS et 10 mL de PBS contenant 5 % de saccharose ont été ajoutés. La boîte de culture a subit un cycle de congélation/décongélation rapide -70 30 °C/+37 °C. Le virus BTV-1 natif contenu dans le lysat cellulaire ainsi récupéré a été déterminé par dilution limite et détection des P.F.0 par immunofluorescence indirecte sur cellules Vero et à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris anti-VP7 BTV (IDVET) et un anticorps anti-IgG de souris couplé à la fluorescéine (Sigma), puis conservé à -20 °C avant d'être utilisé pour l'immunisation des souris. 35 24 2.2 Immunisation des souris Des souris femelles adultes de souche BALB/c ont été immunisées par voie intrapéritonéale à l'aide du stock viral précédemment obtenu BTV-1 (106 PFU de BTV-1/injection) à raison de 0,5 mL contenant 50 % (vol/vol) d'adjuvant complet de Freund. Les souris ont été resensibilisées au 14ème et 35'' jour à l'aide d'une dose identique de BTV-1 contenant 50 % (vol/vol) d'adjuvant incomplet de Freund. Enfin, une inoculation de BTV-1 (106 PFU de BTV-1/injection) a été effectuée au 3'' mois post-infection avant l'étape de fusion cellulaire et la recherche d'anticorps anti-BTV dans les surnageants d'hybridomes. 2.3 Test des sérums de souris immunisées Après 3 mois, la présence d'anticorps murins anti-VP7 et anti-NS1 du BTV1 a été vérifiée par méthode ELISA indirect. La protéine native NS1 et les protéines recombinantes NS1 et VP7 du BTV-1 ont été déposées dans des plaques 96 puits à des dilutions en PBS prédéterminées puis incubées à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée. La solution ST a ensuite été éliminée et 50 µL/puit de sérum de souris immunisée ont été déposés. Après 5 h d'incubation à 37 °C, les plaques ont été lavées trois fois à l'aide de la solution SL et 50 µL/puit d'anticorps anti-IgG souris couplé à la péroxydase (Sigma-Aldrich, A4416 au 1/1000e) ont été ajoutés et incubés 30 min. supplémentaires à température ambiante. 50 µL/puit de solution SR ont été ajoutés après les derniers lavages. La réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. 2.4 Préparation des splénocytes à la fusion Les souris ont été sacrifiées puis les rates de chaque animal ont été retirées en conditions d'asepsie et placées dans une boîte de Pétri contenant 10 mL de milieu sans sérum (DMEM + 50 µg/mL de gentamycine + 100 U de pénicilline + 100 µg/mL de streptomycine). Après dilacération à l'aide d'un scalpel, les agrégats spléniques résiduels ont été dissociés par aspiration-refoulement à la pipette et la suspension obtenue a été passée sur tamis cellulaire. La suspension cellulaire ainsi obtenue a été centrifugée 5 min. à 500 x g. et le surnageant a été éliminé. Une lyse des hématies a été effectuée par 5 min. d'incubation à température ambiante après reprise du culot cellulaire dans 5 mL de solution de chlorure d'ammonium. La réaction a été arrêtée par ajout de 40 mL de milieu sans sérum et 5 min. à 500 x g. Le surnageant a été retiré et le culot contenant les splénocytes a été lavé deux fois supplémentaires (40 mL milieu sans sérum, centrifugation 5 min. à 500 x g) puis repris dans 10 mL de DMEM sans sérum et la concentration déterminée par comptage sur cellule de Malassez. 2.5 Préparation des cellules myélomateuses à la fusion 10 Des cellules de myélome SP2/0-Ag14 (ATCC #CRL 1581) ont été utilisées pour la fusion avec les splénocytes des souris immunisées. Ces cellules ont la particularité d'être résistantes à la 8-azaguanine à une concentration de 20 µg/mL et sensibles à l'hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) car dépourvues de 15 l'enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transférase. Ces cellules myélomateuses ont été maintenues en culture dans un milieu complet DMEM/HEPES/pyruvate (DMEM + 10% SVF + 10 mM HEPES + 1 mM pyruvate de sodium + 100 U de pénicilline + 100µg/mL de streptomycine) et passées tous les 3 jours avant utilisation pour la fusion. 20 Le jour de la fusion, 20 mL de suspension ont été lavés une fois à l'aide de milieu de DMEM sans sérum préchauffé à 37 °C et centrifugés 5 min. à 400 x g. Le culot cellulaire a été repris dans 10 mL et la concentration déterminée par comptage sur cellule de Malassez. 25 2.6 Préparation des hybridomes sécréteurs d'anticorps L'obtention des hybridomes a été réalisée sur la base des protocoles décrits par Galfre et coll. (Nature, 1977 ; 266:550-2) et Yokoyama W.M. et coll. (Current Protocols in Immunology, 1995 ; 2.5.1-2.5.17) et est décrite ci-dessous. 30 Brièvement, 0,5 g de polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000) ont été mis à fondre à 60 °C au bain-marie puis placé à 37 °C après ajout de 0,5 mL de DMEM sans sérum. Les suspensions cellulaires de splénocytes et de cellules myélomateuses ont été ramenées à la même concentration cellulaire finale pour un 35 volume final de 10 mL de milieu sans sérum. Les deux suspensions ont ensuite été rassemblées dans un seul tube (ratio cellulaire « SP2/0-Ag14 » / « splénocytes » de 1 :1). Le mélange a été centrifugé 5 min. à 800 x g pendant 5 min. puis le surnageant a été soigneusement éliminé. Le PEG 50% a été délicatement ajouté à l'aide d'une pipette Pasteur sur le culot cellulaire sous agitation lente en bain-marie à 37 °C et sur une durée totale d'une minute. Le mélange a été soumis à agitation une minute supplémentaire puis 10 mL de milieu de culture sans sérum (préchauffé à 37 °C) ont été ajouté goutte-à-goutte sur 2 min. supplémentaires. Les cellules ont ensuite été centrifugées 5 min. à 400 x g, le surnageant éliminé puis le culot remis en suspension dans l OmL puis 200mL de milieu complet (DMEM + 20 % de SVF + 10 mM HEPES + 1 mM pyruvate de sodium + 100 U/ml pénicilline + 100 µg/ml streptomycine). La suspension cellulaire (2,5.106 cell/mL) a été distribuée dans des plaques de culture 96 puits à raison de 100 µL/puit et incubée à 37 °C (5 % CO2). Le lendemain, 50 µL/puit de milieu de sélection des hybridomes (milieu complet + HAT 1X) ont été ajoutés et la moitié du milieu de culture a été remplacé par ce même milieu de sélection tous les 2 jours pendant 2 semaines. Le surnageant de chaque hybridome obtenu a été évalué comme décrit ci-après et les hybridomes sécréteurs d'anticorps sélectionnés ont été amplifiés puis clonés par technique de dilution limite. Les anticorps monoclonaux correspondant ont ainsi pu être produits par purification sur colonne d'affinité des surnageants de culture et conformément à la technique décrite par Eaton et coll. (1988). Exemple 3 Identification des hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux anti-BTV NS1 La protéine NS1 native ou recombinante du BTV-1 ont été déposées dans des plaques 96 puits à des dilutions en PBS prédéterminées puis incubées à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée. La solution ST a ensuite été éliminée et 50 µL/puit de surnageant de culture d'hybridome ont été déposés. Après 3 h d'incubation à 37 °C, les plaques ont été lavées trois fois à l'aide de solution SL et 50 µL/puit d'anticorps anti-IgG souris couplé à la péroxydase (Sigma-Aldrich, A4416 au 1/1000e) ont été ajoutés et incubés 30 min. supplémentaires à température ambiante. 50 µL/puit de solution SR ont été ajoutés après les derniers lavages. La réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Des plaques non sensibilisées ont été utilisées comme contrôles négatifs dans cette expérience. Les hybridomes dont les surnageants ont donné un signal positif sur les plaques non sensibilisées ont été écartés. Ceux répondant sue les deux types de plaques sensibilisés (NS1 native ou recombinante) ont été sélectionnés. Les hybridomes ainsi retenus sont sécréteurs d'anticorps monoclonaux anti-BTV dont les épitopes sont portés par la protéine virale NS1. Exemple 4 Identification des hybridomes sécréteurs d'anticorps 10 monoclonaux anti-BTV NS1 à potentiel DIVA La protéine NS1 native ou recombinante du BTV-1 ont été déposés dans des plaques 96 puits à des dilutions en PBS prédéterminées puis incubées à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène 15 non fixé, une saturation des plaques a été effectuée. La solution ST a ensuite été éliminée et 50 µL/puit de sérums d'animaux naïfs, infectés ou vacciné dilué au 'A en solution SL ont été déposés. Après 2 h d'incubation à 37 °C et 50 µL/puits de surnageant d'hybridome ont été ajoutés pour lh d'incubation supplémentaires à 37 °C. Les plaques ont été lavées trois fois et 50µL/puit d'anticorps anti-IgG souris 20 couplé à la péroxydase (Sigma-Aldrich, A4416 au 1/1000» ont été ajoutés et incubés 30 min. à température ambiante. 50 µL/puit de solution SR ont été ajoutés après les derniers lavages. La réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA et les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été relevées. 25 Les hybridomes dont les surnageants ont donné un signal positif en présence de sérum d'animaux naïfs ou vaccinés et négatif en présence de sérum d'animaux naturellement infectés ont été sélectionnés. Les hybridomes ainsi retenus sont sécréteurs d'anticorps monoclonaux anti-NS1 de BTV et capables de discriminer les animaux 30 naturellement infectés des animaux naïfs ou vaccinés à l'aide vaccin inactivé commercial (caractère DIVA). Exemple 5 Caractérisation des anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 35 28 5.1 Détermination de l'isotype Les anticorps 11G1 et 9B4 ont été soumis à un test d'isotypage par méthode ELISA. Les liquides d'ascites induits par chacun des hybridomes ont été dilués au 1/1000e en solution SL et 100 µL ont été déposés sur une plaque préalablement sensibilisée (kit anticorps SIGMA, dilution 1/1000». Après 90min. d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée et 100µL d'anticorps anti-Ig de souris ont été déposés (SIGMA). La plaque a été révélée à l'aide de 100 µL de substrat de la péroxydase après une incubation supplémentaire de 30 min. à 37 °C et lavages. La réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA et les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été relevées. Sérotype IgG1 gG2a gG2b gG3 IgM 0,536 0,364 1,798 0,194 0,008 0,354 1,915 0,215 0,043 0,050 0,121 0,206 Anticorps Monoclonal 11G1 9B4 Tableau 1 : Détermination isotypique des anticorps monoclonaux 11 GI et 9B4. Les résultats obtenus montrent que les anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 sont respectivement d'isotype IgG2b et IgGl. 5.2 Compétition 11G1/9B4 20 La protéine NS1 native ou recombinante du BTV-1 ont été déposées dans des plaques 96 puits à des dilutions en PBS prédéterminées puis incubées à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée. La solution de saturation ST a 25 ensuite été éliminée et 50 µL/puit d'anticorps monoclonal non marqué 9B4 ou 11G1 ont été ajoutés à différentes concentrations et incubés la nuit à +4 °C, les plaques ont été lavées trois fois à l'aide de solution SL et 50 µL/puit d'anticorps monoclonal 11G1 couplé à la péroxydase (11G1-HRP) ont été ajoutés et incubés 30 min. supplémentaires à température ambiante. Après les derniers lavages, 50 30 µL/puit de solution SR ont été ajoutés puis la réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA.15 Les résultats obtenus avec la protéine native (Fig.1A) ou recombinante NS1 (Fig. 1B) sont similaires. On observe une chute suivie d'une extinction du signal pour le couple contrôle 11G1/11G1-HRP aux ratios 1/140 et 8/1, respectivement. Ce profil caractéristique d'un effet de compétition entre deux anticorps confirme que les anticorps monoclonaux 11G1 et 11G1 couplé à la péroxydase reconnaissent le même épitope sur la protéine NS1. Au contraire, aucun effet de compétition n'est observable entre les anticorps monoclonaux 9B4 et 11G1-HRP. Ces résultats ont été confirmés dans le système réciproque (couple 9B4/9B4-HRP et 11G1/9B4-HRP). Les anticorps monoclonaux 9B4 et 11G1 reconnaissent donc des épitopes distincts de la protéine NS1 5.3 Fonctionnalité des anticorps monoclonaux 9B4 et 11G1 en 15 technique de Western-blot Définir si les anticorps monoclonaux 9B4 et 11G1 reconnaissent des épitopes conformationnels ou linéaires de la protéine NS1. 20 Afin de déterminer si les épitopes de NS1 reconnus par les anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 sont de type conformationnel ou linéaire, une expérience de western-blot a été menée. Cinq microlitres de préparation d'antigène natif précédemment évalué en test ELISA ont été déposés sur gel SDS-PAGE ( NuPAGE® Bis-Tris 10 %, Invitrogen) puis transférés sur membrane de 25 polyfluorure de vinylidéne (Immobilon PSQ, Millipore). Les pistes de migration correspondantes ont ensuite été mises en présence l'anticorps 9B4 ou 11G1 (3 µg/mL en TBS-lait 3 %) sur la nuit à 4 °C. Les membranes ont ensuite été incubée lh à température ambiante en présence d'anticorps anti-IgG souris couplé à la péroxydase (A4416 au 1/5000e, Sigma). Après lavage, la révélation a été effectuée 30 par ajout de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB small particles, BioFX) puis arrêtée par rinçage à l'eau bidistillée. L'anticorps monoclonal 10BI dirigé contre un épitope linéaire de la partie C-terminale de la NS1 du BTV-10 (P.Roy et coll., J. Virol. 1995) a également été utilisé comme contrôle positif. Les résultats obtenus ont montré que l'anticorps monoclonal 1OB1 a permis la détection de la protéine NS1 du BTV 1 à 62kDa. Cependant, aucun signal n'a été observé avec l'utilisation des anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4. Les épitopes de la protéine NS1 reconnus par les anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 semblent donc de type conformationnels. 5.4 Réactivité des anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 sur l'EHDV La recherche d'une éventuelle réaction croisée des anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 avec une protéine de l'EHDV apparentée à la protéine NS1 du BTV-1 a été menée. Une préparation d'antigène natif de l'EHDV a été effectuée conformément au protocole établit pour le BTV. Cinquante microlitres de solution dilués au 1/100 en PBS ont été déposées dans des plaques 96 puits puis incubées à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée. La solution ST a ensuite été éliminée et 50 itL/puit d'anticorps monoclonal 9B4 ou 11G1 couplé à la péroxydase ont été ajoutés et incubés 1 h à température ambiante, les plaques ont été lavées trois fois à l'aide de solution SL et 50 itL/puit de solution SR ont été ajoutés puis la réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Un sérum anti-EHDV (Veterinary Diagnostic Technology Inc., Etats-Unis) dilué au 1/100e en SL et révélé à l'aide d'un anticorps de souris anti-IgG bovins couplé à la péroxidase (IDVET) a été utilisé comme contrôle positif dans cette expérience. DO 450nm 11G1 0,110 9B4 0,022 Sérum Anti-EHDV 2,280 Tableau 1 : Test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-NS1 11 GI et 9B4 sur le virus EHDV. Ces résultats ont montrés que les anticorps monoclonaux 9B4 et 11G1 sont très peu ou pas réactifs sur les protéines natives d'EHDV. 5.5 Réactivité des anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 vis-à-vis des sérums d'animaux infectés par l'EHDV35 Une expérience d'ELISA NS1 de type compétition a été menée avec des sérums positifs EHDV. Cinquante microlitres de préparation d'antigène NS1 natif ont été dilués au 1/100e en PBS ont été déposées dans des plaques 96 puits puis incubées à température ambiante sur la nuit.. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée à l'aide de solution ST. L'excédent de solution a ensuite été éliminé et 50 itL/puit de sérums d'animaux naïfs ou infectés BTV-1, -8 ou EHDV dilué au 'A en solution SL ont été déposés. Après incubation sur la nuit à température ambiante, les plaques ont été lavées trois fois et 50 itL/puits de d'anticorps monoclonaux couplé à la péroxydase ont été ajoutés pour 30min. d'incubation supplémentaires à température ambiante. 50 itL/puit de solution SR ont été ajoutés après les derniers lavages et la réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été relevées. D.O.450nm SIN (%) 11G1 9B4 11G1 9B4 0,095 0,147 7 11 0,254 0,129 18 9 1,100 0,155 79 11 1,323 0,299 95 21 1,773 0,704 127 49 1,753 1,106 126 77 Tableau 2 : Evaluation de la réaction croisée des sérums EHDV positifs sur le système NS1-BTV/ 11 GI ou 9B4. Les résultats obtenus montrent une réduction du pourcentage de signal à 7 et 11 %, respectivement avec les anticorps 11G1 et 9B4, en présence d'un sérum d'un animal infecté par le BTV-1. De même, ce signal n'est que de 18 et 9 % en présence d'un sérum d'un animal infecté par le BTV-8. Les sérums à BTV sont donc bien en blocage dans les systèmes NS1-BTV/11G1 et NS1-BTV/9B4. La titration jusqu'au 1/40e d'un sérum fort EHDV induit une variation de 79 à 126 % du signal avec l'anticorps 11G1 contre 11 à 77 % avec dans l'anticorps 9B4. Nous pouvons ainsi conclure qu'il y a peu ou pas de réaction croisée pour la reconnaissance de la protéine NS1 du BTV entre des sérums EHDV BTV-1 BTV-8 Pur Contrôle EHDV 1/20 1/40 et l'anticorps monoclonal 11G1. Au contraire, cette réaction croisée est importante avec l'anticorps 9B4. Les 2 anticorps monoclonaux ont donc des comportements différents vis-à-vis des réactions croisées avec des sérums EHDV. 5.6 Différence de potentiel DIVA entre les anticorps monoclonaux 11G1 et 9B4 Afin d'obtenir des sérums problématiques dus à une multiplication des actes de vaccination, 6 animaux ont été vaccinés à l'aide d'un vaccin commercial (BTVPUR Alsap 8, Mérial) selon un protocole d' l dose à J0, J+38 et 2 doses à J+74, au lieu d'un protocole standard à 2 injections simples. Les sérums ont été prélevés régulièrement et la détection d'anticorps anti-VP7 et anti-NS1 a été effectuée par méthode ELISA de compétition. La détection d'anticorps anti-VP7 a été réalisée à l'aide du kit commercial BTC d'IDVET. La détection d'anticorps anti-NS1 a été menée par méthode ELISA direct de compétition à l'aide des anticorps 11G1 ou 9B4 couplé à la peroxydase et selon le protocole décrit ci-après. Cinquante microlitres de sérum dilué au en solution SL ont été déposés par puits sur une plaque présensibilisée à l'aide de protéine NS1 native. Après incubation sur la nuit à température ambiante, les plaques ont été lavées trois fois et 50 µL/puits de d'anticorps monoclonaux 11G1 ou 9B4 couplé à la péroxydase ont été ajoutés pour 30min. d'incubation supplémentaires à température ambiante. 50 µL/puit de solution SR ont été ajoutés après les derniers lavages et la réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été relevées. Les valeurs sont représentées en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). L'ensemble des résultats obtenus montre des réponses homogènes entre les animaux. La mise en place d'une séroconversion anti-VP7 est observable dés le le' jour post-injection avec un pourcentage d'environ 53 % du signal qui atteint une moyenne de 12,5 % à 108 jours. La séroconversion anti-NS1 n'apparaît qu'après la 2è' injection vaccinale avec une diminution à 40 % et 44 % du signal de l'anticorps monoclonal 11G1 et 9B4, respectivement, entre J+38 et J+73. Un différentiel s'établit entre les deux types d'anticorps monoclonaux anti-NS1 après la 3e injection vaccinale. En effet, le signal diminue de 51 % à J+74 à 16 % à J+108 pour l'anticorps 1 1G1. Dans ces conditions, les limites du potentiel DIVA de l'anticorps monoclonal 11G1 semblent donc atteintes. Au contraire, le signal de l'anticorps 9B4 reste stable aux alentours de 48 %. Aux vues de ces résultats, il apparaît que l'anticorps monoclonal 9B4 est plus performant en DIVA BTV que l'anticorps monoclonal 11G1. Exemple 6 Mise au point d'un test cELISA DIVA-BT NS1 6.1 Evaluation de la spécificité et de la sensibilité du test cELISA DIVA-BT NS1 : Discrimination des animaux naïfs ou infectés par le BTV 10 Afin de déterminer le pouvoir discriminant du test cELISA DIVABT NS1 entre des animaux naïfs ou infectés par le BTV, un panel de sérums bovins naïfs (n= 71) ou infectés (BTV8 positifs, n= 87) ont été testés en ELISA de compétition afin de comparer leurs séroconversions anti-VP7 et anti-NS1. La 15 détection d'anticorps anti-VP7 a été réalisée à l'aide du kit commercial ID Screen® Bluetongue Competition d'IDVET selon le protocole associé. La détection d'anticorps anti-NS1 a été effectuée comme suit. Cinquante microlitres d'anticorps monoclonaux anti-NS1 (8 µg/mL en PBS) ont été déposées dans des plaques 96 puits puis incubées à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever 20 l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée à l'aide de solution ST. L'excédent de solution a ensuite été éliminé et 50 µL/puits préparation d'antigène NS1 à une concentration prédéfinie ont été déposés sur les plaques sensibilisées et incubés sur la nuit à température ambiante. Les plaques ont été lavées trois fois et 50 µL/puits de sérum dilué au en solution SL ont été déposés. 25 Après incubation sur la nuit à température ambiante, les plaques ont été lavées trois fois et 50 µL/puits de d'anticorps monoclonal 9B4 couplé à la peroxydase ont été ajoutés pour 30 min. d'incubation supplémentaires à température ambiante. 100 µL/puit de solution SR ont été ajoutés après les derniers lavages et la réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs 30 d'absorbance à 450 nm ont été relevées. Les valeurs sont représentées en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). Les résultats obtenus montrent que l'ensemble des sérums d'animaux 35 naïfs présentent un pourcentage de signal compris entre 70 et 110 % pour le test BT5 classique et 60 à 110 % pour le test cELISA DIVA-BT NS1. La spécificité est donc sensiblement similaire entre ces deux tests. Les sérums d'animaux infectés par le BTV présentent un blocage à 5 à 10 % avec l'utilisation du test BT classique. Ces sérums présentent une répartition comprise entre 5 et 40 % du signal avec l'utilisation du test cELISA DIVA-BT NS 1. Il y a donc bien une séroconversion anti-VP7 mais également anti-NS 1 chez les animaux naturellement infectés par le BTV. Bien que moins performant que le test classique au niveau de la sensibilité, le test cELISA DIVA-BT NS 1 montre cependant une très bonne discrimination entre les sérums d'animaux naïfs et ceux d'animaux naturellement infectés. 6.2 Evaluation du potentiel DIVA du test cELISA DIVA-BT NS 1 : Discrimination des animaux vaccinés ou infectés par le BTV Un cheptel de 30 bovins et de 75 ovins a été vacciné à l'aide d'un vaccin commercial selon le protocole défini par le fabricant. Les sérums ont été prélevés le jour de la première dose vaccinale et au 64' ou 33' jour pour les bovins et les ovins, respectivement. Ces 2 types d'échantillons ont testés en ELISA de compétition afin de comparer leurs séroconversions anti-VP7 et anti-NS 1. La détection d'anticorps anti-VP7 a été réalisée à l'aide du kit commercial ID Screen® Bluetongue Competition d'IDVET selon le protocole associé. La détection d'anticorps anti-NS1 a été effectuée comme précédemment décrit. Les valeurs sont représentées en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). Les résultats obtenus à l'aide du test cELISA classique de la BT montrent que la répartition des sérums de bovins passe de valeurs comprises entre 90 et 130 % du signal avant vaccination, avec un maximum entre 100 et 110 %, à des valeurs comprises entre 0 et 40 % du signal après vaccination, avec un maximum de 5-10 %. Concernant les sérums ovins, ils s'échelonnent entre 60 et 130 % du signal avant vaccination et entre 10 et 90 % après vaccination avec des maximums compris entre 100-110 % et 30-40 %, respectivement. Un seul animal n'ayant pas séroconverti. Comme attendu, il y a donc globalement l'acquisition d'un statut anti-VP7 de BTV séropositif suite à la vaccination contre le BTV-8. Au contraire, l'utilisation du test BTV DIVA-NS 1 décrit dans ce document démontre que ces animaux ont conservé un statut anti-NS 1 séronégatif. En effet, les sérums bovins avant vaccination présentent une répartition comprise entre 70 et 110 % du signal, avec un maximum à 90-110 %, contre une répartition comprise entre 70 et 120 % du signal, avec un maximum à 100-110 %, après vaccination. Les sérums ovins quant à eux conservent une répartition entre 60 et plus de 130 % du signal avant vaccination, avec un maximum qui passe de valeurs supérieures à 130% à des valeurs de 90-120 %. L'ensemble de ces résultats montre une séroconversion infectieuse, et non vaccinale, contre la protéine NS1 de BTV. Bien que le test cELISA DIVABT NS 1 ne permette pas de discriminer les animaux vaccinés des animaux naïfs (répartition entre 70 et 120 % du signal dans les deux cas), il permet cependant de distinguer les animaux vaccinés par un vaccin inactivé des animaux naturellement infectés (5 à 40 % du signal). REVENDICATIONS1. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine native ou recombinante NS1 du virus de la langue bleue (dénommé « BTV » pour Blue Tongue Virus), pour la préparation d'un réactif ou d'un kit pour son usage in vitro et destiné à différencier un animal vacciné contre un virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV, caractérisée en ce que ledit anticorps est un anticorps monoclonal obtenu à partir d'un surnageant de culture d'un hybridome, ledit hybridome ayant été obtenu par fusion entre une cellule myélomateuse et une cellule lymphoïde de mammifère animal, ledit mammifère ayant été préalablement immunisé avec une composition ou un composé immunogène comprenant une protéine NS1, native ou recombinante, de BTV, ou l'un de ses fragments antigéniques, et, caractérisée en ce que ledit anticorps est sélectionné par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de 15 culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 du BTV ; et b) - i) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 de virus de la maladie hémorragique épizootique (« EHDV » pour epizootic 20 hemorrhagic disease virus) ; et c) la sélection dudit anticorps testé si ce dernier : - i) reconnaît de manière spécifique ladite protéine NS1 du BTV, ou son fragment antigénique, et - ii) ne reconnaît pas ladite protéine NS1 de EHDV. 25 2. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit anticorps est sélectionné par un procédé comprenant en outre à l'étape b) : b) - ii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le EHDV, et en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iii) il y a une réaction croisée pour la reconnaissance de la protéine NS 1 du BTV 10 entre ledit anticorps test et ledit sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV. 3. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit anticorps est sélectionné par un 15 procédé comprenant en outre à l'étape b) : b) - iii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le BTV ou vacciné contre celui-ci, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le BTV, et 20 en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iiii) a) Il y a une compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV, de préférence un signal représentant 0 à 20 % du signal 25 obtenu pour ledit contrôle négatif ; et (3) Il n'y a pas ou peu de compétition observée pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal vacciné contre le BTV, de préférence un signal représentant plus de 50 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. 30 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine NS1 du virus BTV, ou composition ou composé la comprenant, ou l'un de ses fragments antigéniques est choisi parmi : a) une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1) ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8), ou de séquence ayant au moins 85 % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou b) un virus BTV, ou l'un de ses fragments contenant la protéine NS1, ou l'un de ses 10 fragments antigéniques, telle que définie en a). 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit EHDV est un EHDV de sérotype 1 ou 2, de préférence de sérotype 2 et en ce que ladite protéine NS1 du virus EHDV est la protéine NS1 EHDV de sérotype 1 ou 2 15 de séquence respective SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4 ou de séquence ayant au moins 85 % d'identité avec SEQ ID NO :3 ou SEQ ID NO :4. 6. Utilisation selon la revendication 1 à 5, caractérisée en ce que ledit anticorps est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 20 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. 7. Utilisation selon l'une des revendication 1 à 6, caractérisée en ce que le fragment fonctionnel dudit anticorps est choisi parmi les fragments Fab, (Fab')z, Fab', Fv, scFv, scFv-Fc dudit anticorps, ces fragments ayant les caractéristiques fonctionnels 25 de l'anticorps dont ils sont issus et tels que définies à l'étape c). 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit anticorps ou fragment d'anticorps est couplé à un marqueur. 30 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit réactif ou kit comprend en outre une protéine NS1 du virus BTV, ou composition ou composé la comprenant, ou un de ses fragments antigéniques. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite protéine NS1 du virus BTV, ou composition ou composé la comprenant, ou un de ses fragments antigéniques est telle que définie dans la revendication 3 a) et 3 b). et caractérisés en ce que : - ledit fragment antigénique de la protéine NS1 est un fragment capable de se fixer spécifiquement sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. 11. Utilisation selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que ladite protéine NS1 de BTV ou l'un de ses fragments antigéniques, ou la composition ou le composé la comprenant, est fixée ou adsorbée sur un support solide, de préférence sur une cupule de microplaque. 12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit animal est un ruminant, de préférence choisi parmi les bovins, ovins ou caprins. 13. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV à partir d'un échantillon biologique dudit animal, 20 caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine NS1 d'un virus BTV, ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et b) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine 25 NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-NS1 susceptible d'être présent dans ledit échantillon, cette révélation étant réalisée par une méthode d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps anti-NS1, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de reconnaître spécifiquement la protéine NS1 du virus BTV, ou l'un de ses fragments antigéniques, ledit anticorps-anti-NS 1 30 étant un anticorps monoclonal obtenu à partir d'un surnageant de culture d'un hybridome, ledit hybridome ayant été obtenu par fusion entre une cellule myélomateuse et une cellule lymphoïde de mammifère animal, ledit mammifèreayant été préalablement immunisé avec une composition ou un composé immunogène comprenant une protéine NS1 de BTV, native ou recombinante, ou l'un de ses fragments antigéniques, et, caractérisée en ce que ledit anticorps anti-NS 1 est sélectionné par un procédé 5 comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 du BTV ; et b) - i) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de 10 surnageant de culture desdits hybridomes avec une protéine native ou recombinante NS1 de virus de la maladie hémorragique épizootique; et c) la sélection dudit anticorps testé si ce dernier : - i) reconnaît de manière spécifique ladite protéine NS1 du BTV, ou son fragment antigénique, et 15 - ii) ne reconnaît pas ladite protéine NS1 de EHDV. 14. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit anticorps test est sélectionné par un procédé comprenant en outre à l'étape 20 b) : b) - ii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le EHDV, et 25 en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iii) il y a une réaction croisée pour la reconnaissance de la protéine NS1 du BTV entre ledit anticorps test et ledit sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le EHDV. 30 15. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que ledit anticorps est sélectionné par un procédé comprenant en outre à l'étape b) : b) - iii) la mise en contact desdits anticorps tests ainsi obtenus à partir de surnageant de culture desdits hybridomes avec un sérum, ou plasma, d'un animal infecté par le BTV ou vacciné contre celui-ci, ledit sérum ou plasma comprenant des anticorps polyclonaux dirigés contre le BTV, et en ce que ledit anticorps est sélectionné si en outre à l'étape c): c)- iiii) a) Il y a une compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV, de préférence un signal représentant 0 à 20 %, de manière plus préférée 0 à 15 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif ; et (3) Il n'y a pas ou peu de compétition observée pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal vacciné contre le BTV, de préférence un signal représentant plus de 50 %, de manière plus préférée de plus de 60 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. 16. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que : - soit ladite protéine NS1 du virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques, mis en oeuvre à l'étape a), ou - soit ledit anticorps capable de reconnaître spécifiquement la protéine NS 1 du virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8-8, mis en oeuvre à l'étape b), est marqué, de préférence à la peroxydase. 17. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode immunodosage en compétition est un anticorps marqué, de préférence la méthode immunodosage en compétition est une méthode ELISA en compétition, de préférence ledit anticorps est marqué à la peroxydase 18. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon l'une des revendication 13 à 17, caractérisée en ce que ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode d'immunodosage en compétition est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. 19. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon la revendication 18, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine NS1 d'un virus BTV, ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, ladite protéine NS1 étant préalablement capturée par immunocapture sur une phase solide revêtue d'un anticorps anti-NS1- BTV de type polyclonal, ou, de type monoclonal et tel que défini dans la revendication 1 ; b) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-NS1 susceptible d'être présent dans ledit échantillon, cette révélation étant réalisée par une méthode d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps anti-NS1, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence marqué, tel que défini dans la revendication 2. 20. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon la revendication 19, caractérisée en que : - à l'étape a) l'anticorps anti-NS1 revêtu sur la phase solide est un anticorps tel que défini dans la revendication 1; et - à l'étape b) l'anticorps anti-NS1, de préférence marqué, tel que défini dans la revendication 2 est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. 21. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon l'une des revendications 13 à 20, caractérisée en ce que ladite protéine NS1 du virus BTV mis en oeuvre à l'étape a), ou composition ou composé la comprenant, ou l'un de ses fragments antigéniques est choisi parmi : a) une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1) ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8), ou de séquence ayant au moins 85 % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou b) un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments 10 contenant la protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques. 22. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon l'une des revendications 13 à 21, caractérisée en ce que caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est un échantillon de 15 fluide biologique, de préférence choisi parmi le plasma, le sérum, du jus de viande ou un échantillon de sang total de l'animal, le sérum étant le plus préféré. 23. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV selon l'une des revendications 13 à 22, caractérisé 20 en ce qu'à l'étape b), une réaction de compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV, de préférence un signal représentant 0 à 20 %, de manière plus préférée 0 à 15 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. 25 24. Kit ou trousse de réactifs pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV, ledit kit comprenant : a) un composé ou composition comprenant la protéine NS1 du virus BTV, ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1 ; 30 b) un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine NS1 du virus BTV, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine NS1, le cas échéant marqué, de préférence ledit anticorps est polyclonal, monoclonal ou chimérique ; et, le cas échéant, c) les réactifs nécessaires à la réaction. 25. Kit ou trousse de réactifs selon la revendication 24, caractérisé en ce que : A) ledit composé ou ladite composition comprenant la protéine NS1 du virus BTV-8, ou ledit fragment antigénique de ladite NS1, est choisi parmi : a) une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1) ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8), ou de séquence ayant au moins 85 % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou b) un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments contenant la protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques telle que définie 15 ci-dessus dans la revendication 10, et B) ledit un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine NS1 du virus BTV, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine NS1, le cas échéant marqué, est choisi parmi l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4 Id Vet déposé à la CNCM le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198. 20 26. Kit ou trousse de réactifs selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend : - un réactif A) comprenant un premier anticorps dit de capture anti-NS1-BTV de type polyclonal, ou l'anticorps tel que défini dans la revendication 1, le cas échéant 25 revêtu sur une cupule de microplaque ; - un réactif B) comprenant une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, ou encore un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8 entier, le cas échéant, le réactif B) ayant été préalablement fixé sur ladite cupule du réactif A) ; et 30 - un réactif C) comprenant l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4Id Vet déposé à la CNCM, le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198, le cas échéant marqué. 27. Procédé de sélection d'un anticorps pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV d'un animal infecté par un virus BTV, le cas échéant utilisable dans une méthode d'immunodosage en compétition, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante: a), le cas échéant la sélection d'un hybridome obtenu après immunisation d'un ammal avec un antigène choisi parmi : - une protéine NS1 native isolée et, le cas échéant purifiée, ou recombinante de virus BTV, de préférence de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 (NS1 de BTV-1) ou SEQ ID NO :2 (NS1 de BTV-8), ou de séquence ayant au moins 85 % d'identité avec SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, ou l'un de ses fragments antigéniques; ou - un virus BTV, de préférence BTV-1 ou BTV-8, ou l'un de ses fragments contenant la protéine NS1, b) la mise en contact dudit anticorps à tester avec la protéine NS1 du virus BTV tel que défini en a), ou un fragment antigénique de ladite protéine NS1, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et c) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (b) entre ladite protéine NS1, ou l'un de ses fragments antigéniques, et ledit un anticorps testé, et dans laquelle étape la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) est réalisée par une méthode d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps, ou l'un des fragments fonctionnels, ledit un anticorps étant l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 9B4Id Vet déposé à la CNCM, le le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué. 28. Hybridome dénommé 9B4Id Vet déposé à la CNCM, le le 7 juillet 2009 sous le numéro I- 4198, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué. 29. Anticorps dénommé 9B4 Id Vet sécrété par l'hybridome selon la revendication 30 28, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué..