Brevet FR2976951A1 — publié le 20121228

L'invention se rapporte à un procédé de culture et de sélection de souches de microalgues appartenant au genre Isochrysis impliquant un apport discontinu de lumière sous forme de flashs, ainsi qu'à des souches d'Isochrysis sélectionnées, particulièrement adaptées à la production d'acides gras polyinstaurés, notamment d'EPA (acide éicosapentaénoïque) en mode de culture mixotrophe. Préambule Il est rappelé que les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse. Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins, qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres. La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont strictement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et tend même à inhiber leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre-elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique. D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer partie de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique. Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme co-existent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6 :87-102]. A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que celles-ci recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171]. Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de secréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés. Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés de la série des omégas 3 (AGNI ou PUFA-w3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA, C20:5 w3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6 w3) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques [Horrocks L.A. et al. (2000) Health Benefits of DHA. Pharmacol. Res. 40: 211-225]. Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive. De nouvelles sources d'EPA et de DHA doivent donc être 30 recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés. Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante, et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol. Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt. La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Il existe des variations importantes parmi les différentes espèces des différentes classes composant ces phylums en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. Par ailleurs, les proportions relatives d'EPA et de DHA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture [Yongmanitchai, W. et Ward, O.P. (1989) Omega-3 fatty acids : alternative sources of production. Process. Bioch em. 24 :117-125]. Dans la perspective d'une exploitation industrielle des microalgues, ce sont les espèces à caractère hétérotrophe ou mixotrophe, qui suscitent actuellement le plus d'intérêt de la part des industriels. En effet, la dépendance réduite de ce type de microalgues vis-à-vis de la lumière, permet d'envisager leur culture dans des récipients fermés de grande dimension, comme cela se pratique en fermenteurs pour des bactéries ou des levures. Par rapport aux cultures classiques en mode autotrophe, ces nouveaux modes de culture permettent de gagner de l'espace et de réaliser des économies d'énergie liées à un apport de lumière d'intensité plus faible et à un brassage moins intensif des cultures. Néanmoins, de nombreuses espèces de microalgues cultivées traditionnellement en mode autotrophe ne se montrent pas cultivables en 30 mode de culture hétérotrophe. C'est le cas, en particulier, des microalgues du genre Isochrysis, qui sont des microalgues marines flagellées de couleur brune appartenant à la classe des Prymnesiophyceae. Les microalgues du genre Isochrysis sont très utilisées en pisciculture dans les écloseries de poissons, crevettes, mollusques et crustacés comme complément alimentaire riche en DHA. Ces microalgues sont commercialisées généralement sous forme de préparations de microalgues concentrées à longue conservation (Algues instantanées®, 871 East Hamilton Ave, Campbell, CA 95008, USA). La particularité de ces microalgues est de stocker leurs acides gras intra cellulairement sous la forme d'inclusions lipidiques. Comme leurs parois sont relativement fines, plusieurs études placent Isochrysis parmi les microalgues se prêtant le mieux à une extraction de leurs lipides à l'échelle industrielle. Les souches d'Isochrysis actuellement décrites sont dépendantes de la lumière, ce qui explique qu'elles ne peuvent pas être cultivées en mode hétérotrophe. Cependant, des études (Liu, C-P. and Lin, L-P. (2001) Ultrastructural study and lipid formation of Isochrysis sp. (2001) Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 207-214] ont déterminé que certaines souches, notamment la souche commerciale CCMP1324, pouvaient être cultivées en mode mixotrophe dans de l'eau de mer artificielle (3,2 % NaCl) à 25°C, pH=8, avec un apport continu de lumière de 10 klux (plus de 160 pmol. m-2. s-' exprimés en photons) en présence d'une concentration de 10 à 50 mM d'acétate de sodium (substrat carboné). Dans de telles conditions, une biomasse totale de 4 g/I en poids sec de microalgues a été obtenue, avec une production optimale de DHA correspondant à 16 mg par litre de culture. Ce faisant, à la connaissance du demandeur, aucune souche d'Isochrysis sp. ne s'est montrée capable de produire de l'EPA dans ces conditions. C'est donc de façon surprenante, au terme de nombreuses expérimentations réalisées avec des souches variées dans différentes conditions de mixotrophie, que le demandeur est parvenu à sélectionner et cultiver des souches d'Isochrysis capables de produire de l'EPA en mode mixotrophe. Ce procédé, objet de la présente invention, a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement discontinu, notamment sous forme de flashs. L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures, perçue généralement comme stressante pour les microalgues, a permis, de façon surprenante, de sélectionner des souches d'Isochrysis capables de produire à la fois de l'EPA et du DHA en mode mixotrophe. Ce procédé a ainsi permis, pour la première fois, la production d'EPA par des souches d'Isochrysis en conditions de mixotrophie. Une souche (FCO 1111) représentative des nouvelles souches d'Isochrysis, sélectionnées et cultivées selon l'invention, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371 QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, le 27 mai 2011 sous le numéro d'accession CCAP 927/16. La mise en oeuvre des souches et du procédé de culture selon l'invention ouvre ainsi la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier d'EPA et de DHA, à l'aide de souches du genre Isochrysis, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit et économes en énergie. Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci-après. Description détaillée La présente invention a pour premier objet de nouvelles souches de microalgues du genre Isochrysis (Isochrysis sp.) caractérisées en ce qu'elles sont capables de produire de l'EPA en conditions de culture mixotrophe. A la connaissance du demandeur, les souches d'Isochrysis isolées selon l'invention sont les premières décrites comme pouvant produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives d'EPA pouvant représenter plus de 5 %, voire plus de 10 %, des lipides totaux contenus dans les microalgues. Ces nouvelles souches d'Isochrysis ont été isolées et sélectionnées selon les procédés de sélection et de culture détaillés plus loin. Une souche représentative des souches d'Isochrysis selon l'invention est la souche FCC 1111, déposée à la CCAP le 27 mai 2011, sous le numéro CCAP 927/16. Cette souche est caractérisée en ce qu'elle est capable de produire de l'EPA en mode de culture mixotrophe. Selon les analyses taxonomiques en cours, cette souche appartient au genre Isochrysis [Parke, M. 1949 (1949). Studies on marine flagellates. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 28: 255-288]. Néanmoins, compte tenu du fait que les principales espèces Isochrysis galbana, Isochrysis litoralis ou Isochrysis maritima sont phylogénétiquement proches, l'espèce précise à laquelle appartient la souche FCC 1111 n'a pas encore pu être définitivement établie. De ce fait, l'invention porte sur toute espèce d'Isochrysis capable de produire de l'EPA en mode de culture mixotrophe, telle que décrite dans la présente demande. La culture en mode mixotrophe d'Isochrysis selon l'invention s'effectue préférentiellement dans un milieu de culture de type f/2 [Guillard, R. R. and Ryther, J. H. (1962) Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacaea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology 8: 229-239], en présence d'au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, plus préférentiellement au moins 20 mM, et encore plus préférentiellement plus de 50 mM d'un substrat carboné. Ce substrat carboné comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange, du glucose, de la cellulose (ou dérivés de cellulose), de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol. Ce substrat carboné peut consister en des mélanges de molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de mais, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention. De préférence, le substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glycérol ou de lactose. L'invention a également pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Isochrysis en mode mixotrophe en vue de produire des acides gras polyinsaturés, notamment de l'EPA. Ce procédé a pour effet d'enrichir les microalgues du genre Isochrysis en acides gras polyinsaturés, ce qui se traduit généralement par une augmentation de la proportion d'EPA ou de DHA présents dans les lipides totaux produits par lesdites microalgues. De façon surprenante, le rendement des microalgues en EPA est plus élevé lorsqu'on cultive les microoalgues en présence d'un apport lumineux variable ou discontinu, autrement dit lorsque le flux de lumière apporté aux microalgues en culture est variable ou discontinu au cours du temps. Ainsi, contrairement aux idées reçues, il est apparu qu'un éclairement variable ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en oeuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles- ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer en partie, par le fait que, dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement. Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées. Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs, c'est-à-dire sur des périodes de courtes durées. Les phases successives d'éclairement sont alors généralement comprises entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, et que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de lumière peut être périodique, cyclique, voire aléatoire. Selon l'invention, l'éclairement peut varier de manière continue, c'est-à-dire que l'intensité lumineuse n'est pas constante et varie en permanence au cours du temps (dpmol(photons)/dt # 0). Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues. L'invention vise, en particulier, un procédé de culture de microalgues du genre Isochrysis, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude égale ou supérieure à 10 pmol. m-2. s-' à raison de plusieurs fois par heure, de préférence égale ou supérieure à 50 pmol. m-2. s-', plus préférentiellement égale ou supérieure à 100 pmol. m-2. s-'. Le point commun de ces différents modes d'éclairement, discontinu ou variable, réside dans le fait que, selon l'invention, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. m-2. s-'), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement supérieure à 10 pmol. m-2. s-', préférentiellement supérieure ou égale à 20 pmol. m-2. s-', plus préférentiellement supérieure ou égale à 50 pmol. m2. s-'. Autrement dit, l'intensité lumineuse atteint, chaque heure, de préférence plusieurs fois dans l'heure, une valeur haute et basse, dont la différence est égale ou supérieure à celle indiquée ci-dessus. De préférence, ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 50 pmol. m-2. s-' et 100 pmol. m-2. s-' à chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 0 et 50 pmol. m2. s-', plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 100 pmol. m-2. s-'. Il est rappelé que 1 pmol. m-2. s-' correspond à 1 pE m-2. s-' (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature. L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante. Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA. Le procédé de culture selon l'invention permet donc de sélectionner des souches d'Isochrysis à caractère mixotrophe, ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés et capables de produire de l'EPA en mode mixotrophe, comme la souche FCC 1111, déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 927/16. Un tel procédé comprend généralement une ou plusieurs des étapes suivantes : - la culture de différentes souches du genre Isochrysis dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie préférentiellement d'une amplitude égale ou supérieure à 50 pmol. m-2. s-' à raison d'au moins une fois par heure; - le maintien de ladite culture sur plusieurs générations; - l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations. Pour réaliser le criblage des souches, différentes souches d'Isochrysis peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et aux substrats carbonés, offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA). Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'un pool de microalgues diversifié et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière dicontinue ou variable avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en culture sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture. Le procédé de culture selon l'invention se caractérise plus particulièrement en ce que la culture des souches s'effectue sur plusieurs générations, de préférence en mode mixotrophe, et en ce qu'on récolte les cellules chargées en lipides. L'invention a donc également pour but la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Isochrysis à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier l'EPA. Les méthodes d'extraction sélective de l'EPA et du DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Gan. J.Biochem. Physiol 37:911-917]. L'invention porte également sur les microalgues du genre Isochrysis enrichies en acides gras polyinsaturés, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 20 %, souvent plus de 40 % et parfois même plus de 50 % d'EPA. De telles microalgues peuvent servir en tant que complément alimentaire, notamment en pisciculture.30 REVENDICATIONS1. Procédé de production d'EPA (acide éicosapentaénoïque) caractérisé en ce qu'il comprend la culture en mode mixotrophe d'une microalgue du genre Isochrysis, et la récupération de la biomasse ainsi formée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture en mode mixotrophe de ladite microalgue du genre Isochrysis s'effectue en présence d'un substrat carboné comprenant au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, et plus préférentiellement au moins 20 mM de glucose, de cellulose, d'amidon, de lactose, de saccharose, d'acétate et/ou de glycérol. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glycérol. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de lactose. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction des acides gras polyinsaturés accumulés dans les microalgues au cours de leur culture. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la culture d'une ou plusieurs souches du genre Isochrysis dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude de plus de 50 pmol. m-2. s-', à raison d'au moins une fois par heure;- le maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné dans le milieu de culture; - la récolte des cellules d'Isochrysis ainsi obtenues. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le flashage consiste en des phases successives d'éclairement d'une durée comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite microalgue du genre Isochrysis, est capable de produire de l'EPA en mode mixotrophe, comme la souche FC 1111, déposée le 27 mai 2011 auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa) sous le numéro CCAP 927/16. 10. Procédé de sélection de souches isolées du genre Isochrysis capables de produire de l'EPA en mode mixotrophe, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de production d'EPA par lesdites souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Microalgue du genre Isochrysis enrichie en EPA, susceptible d'être obtenue en mode de culture mixotrophe selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Microalgue du genre Isochrysis cultivée en mode mixotrophe, caractérisée en ce que ses lipides totaux contiennent plus de 5 %, de préférence plus de 10 %, plus préférentiellement plus de 20 % d'EPA. 13. Microalgue du genre Isochrysis selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisée en ce que ses lipides totaux comprennent également au moins 5 % de DHA. 14. Microalgue caractérisée en ce qu'elle consiste en une souche isolée du genre Isochrysis correspondant à la souche FC 1111, déposée le 27 mai 2011 auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 927/16. 15. Utilisation d'une microalgue du genre Isochrysis selon l'une des revendications 11 à 14, en tant que complément alimentaire, notamment en pisciculture.