Brevet FR2964667A1 — publié le 20120316

La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de culture d'algues unicellulaires en condition mixotrophe, permettant l'enrichissement du contenu lipidique de ces algues. Ce procédé repose sur un apport de lumière dans le milieu de culture variable ou discontinu au cours du temps, lequel apport induit une augmentation du rendement des cultures et du contenu lipidique des algues. Préambule Les algues unicellulaires font l'objet actuellement de nombreux projets industriels en vue de leur utilisation directe, en tant que complément alimentaire, ou indirecte en tant que matière première pour la chimie verte. Les lipides issus de ces microalgues sont particulièrement recherchés car ils présentent d'excellentes qualités nutritionnelles. En particulier, ils contiennent des acides gras polyinsaturés à longues chaînes (PUFA) essentiels, comme l'EPA et le DHA, lesquels sont utilisés, notamment, dans la formulation des substituts de lait maternels. En aquaculture, les microalgues servent de substitut aux huiles et farines de poisson. Du fait qu'en conditions favorables les microalgues peuvent accumuler jusqu'à 80 % de leur poids sec en acides gras, celles-ci offrent une alternative crédible à la culture des plantes terrestres oléagineuses pour la production de biocarburants [Li, Y et al., 2008 Biotechnol. Prog., 24 : 815-820]. Les algues unicellulaires se présentent comme des microorganismes photosynthétiques au caractère autotrophe, c'est-à-dire qu'elles ont l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse. La plupart des espèces d'algues unicellulaires rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont strictement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître autrement que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matières organiques ne leur est pas favorable et tend même à inhiber leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces d'algues unicellulaires, de familles et d'origine très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. Certaines d'entre-elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique. D'autres espèces d'algues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables de tirer parti, à la fois, de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique. Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme coexistent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6 :87-102]. A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques qu'elles contiennent. Cette classification renseigne peu sur le caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe, alors que celles-ci recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171]. De ce fait, une souche est considérée comme étant mixotrophe dès lors que, de manière expérimentale, il peut être prouvé qu'elle a la capacité de croître par photosynthèse dans un milieu minimum, dans lequel est ajouté un substrat carboné tel que du glucose, de l'acétate ou du glycérol. Si cette supplémentation en substrat carboné ne donne pas lieu à une inhibition de croissance durant la phase éclairée, alors la souche peut être considérée comme étant mixotrophe. Si, pour certaines espèces d'algues, le fait de pouvoir croître en conditions mixotrophes permet théoriquement d'atteindre, en culture, un meilleur rendement en ce qui concerne la biomasse cellulaire et la production de lipides [Ceron Garcia M.C. et al. 2000, Journal of Applied Phycology, 13 :239-248], un tel niveau de rendement n'est que rarement atteint. En effet, la gestion du rapport quantité de lumière/quantité de substrat carboné à introduire dans le milieu de culture pour obtenir un rendement optimal, reste délicate à déterminer [Lee Y.K. et al. 2001, Journal of Applied Phycology, 13 :307-315], notamment pour ce qui est de produire, une quantité exploitable de lipides. Il subsiste donc un besoin d'améliorer les procédés de culture actuels des microalgues mixotrophes pour obtenir des conditions de production assurant une biomasse importante et des concentrations élevées de lipides. Des travaux menés sur différentes espèces de microalgues ont établi que l'intensité lumineuse avait une influence directe sur le rendement quantitatif et qualitatif des cultures effectuées en mode mixotrophe. Ainsi, une intensité lumineuse égale à celle pratiquée en mode autotrophe est généralement trop forte pour pratiquer la culture des algues en mode mixotrophe. En raison de ce phénomène de photo-inhibition, il convient souvent de réduire l'intensité lumineuse pour obtenir de meilleurs rendements [Liang Y. et al., 2009, Biotechnol. Lett., 31 :1043-1049 ; Chojnacka, K. et al., 2004, Enzyme and Microbial Technology, 34 :461-465 ; Bouarab L. et al., 2004, Water Research, 38:2706-2712; Jeon Y.C. et al. 2006, Enzyme and Microbial Technology, 39 :490-495]. Du fait que les cultures d'algues, à l'échelle industrielle, s'effectuent souvent à ciel ouvert, c'est-à-dire avec un éclairement naturel, les expériences réalisées pour déterminer les conditions optimales de cultures en mode mixotrophe, sont généralement réalisées avec des phases d'éclairement continues. Dans certains cas, une phase éclairée alterne avec une phase obscure de façon quotidienne (photopériode), reproduisant ainsi le jour et la nuit. Toutefois, il n'est pas fait état, dans l'art antérieur, d'alternances répétées ou de variations significatives au cours du temps de l'intensité lumineuse apportée aux cultures. Des expériences antérieures portant sur des cultures alternant des phases de culture en mode autotrophe (éclairé) et hétérotrophe (obscur), de plusieurs heures chacune, se sont montrées décevantes en termes d'optimisation des cultures, du fait de la nécessité pour les algues de s'adapter aux changements de conditions de culture. Il a été observé une période de latence au début de chaque cycle, liée au phénomène dit de photo-activation, participant à une baisse de rendement des cultures [Ogbonna J.C. et al., 1997, Journal of Applied Phycology 9 :359-366]. C'est sans doute la raison pour laquelle les auteurs des différents travaux d'optimisation de la culture des algues en mode mixotrophe, n'ont pas jugé qu'une alternance de phases éclairées et obscures pouvait avoir un effet favorable sur le rendement des cultures. De façon surprenante, l'inventeur a constaté, au contraire, qu'un apport de lumière discontinu n'était pas préjudiciable au rendement des cultures réalisées en mode mixotrophe. Il a notamment observé qu'en faisant varier l'intensité lumineuse, soit par l'alternance rapprochée de phases obscures et de phases éclairées (flashs), soit en faisant fluctuer l'intensité lumineuse au cours du temps, il pouvait agir positivement sur le rendement des cultures en termes de biomasse, et plus particulièrement, sur le contenu lipidique des cellules. Sur la base de ces observations, l'inventeur a mis au point un procédé de culture d'algues mixotrophes permettant d'atteindre, d'une part, une biomasse plus élevée, et d'autre part, d'enrichir le contenu des algues en lipides. Ce procédé est fondé sur un apport lumineux variable ou discontinu au cours du temps. Ce procédé, objet de la présente demande, semble pouvoir se généraliser à de très nombreuses espèces d'algues unicellulaires mixotrophes. Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après. Description détaillée La présente invention a ainsi pour objet un procédé de culture d'algues unicellulaires (microalgues) permettant d'augmenter la biomasse et d'enrichir le contenu des algues en lipides. Ce procédé est caractérisé en ce que le flux de lumière apporté aux algues en culture est variable ou discontinu au cours du temps. Contrairement aux idées reçues, il est apparu qu'un éclairement variable ou discontinu des cultures, en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait, notamment, d'accroître la production de lipides par ces dernières. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu ou variable de lumière a pour effet de provoquer un stress chez les algues favorable à la synthèse des lipides. En effet, il est fréquent, dans la nature, que les algues accumulent des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement. Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées. Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement discontinu est apporté sous forme de flash, c'est-à-dire sur des périodes de courtes durées. Les phases successives d'éclairement sont alors généralement comprises entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. Par éclairement variable, il faut entendre un éclairement qui n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais dont l'intensité varie au cours du temps, de manière cyclique ou non. Selon l'invention, l'éclairement peut varier de manière continue, c'est- à-dire que l'intensité lumineuse n'est pas constante et varie en permanence au cours du temps (dpmol(photons)/dt # 0). Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues. 5 L'invention vise, en particulier, un procédé de culture d'algues unicellulaires, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude de plus de 10 pmol. m-2. s-' à raison de plusieurs fois par heure. Le point commun de ces différents modes d'éclairement, discontinu ou variable, réside dans le fait que, selon l'invention, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. m-2. s-'), varie plusieurs fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement supérieure à 8 pmol. m-2. s-', préférentiellement supérieure ou égale à 10 pmol. m-2. s-', plus préférentiellement supérieure ou égale à 15 pmol. m2. s-'. Autrement dit, l'intensité lumineuse atteint, chaque heure, de préférence plusieurs fois dans l'heure, une valeur haute et basse, dont la différence est égale ou supérieure à celle indiquée ci-dessus. De préférence, ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 2 pmol. m-2. s-' et 10 pmol. m-2. s-' à chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 0 et 50 pmol. m2. s-', plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 20 pmol. m2. s' . Il est rappelé que 1 pmol. m-2. s-' correspond à 1 pE m-2. s-' (Einstein), unité utilisée dans les exemples de la présente demande. L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante. Le procédé selon l'invention s'applique plus particulièrement aux algues unicellulaires capables de croître en condition de mixotrophie. Comme indiqué dans le préambule de la présente demande, une culture d'algues en mode mixotrophe se définit comme une culture réalisée en mode autotrophe dans un milieu de culture enrichi en substrats carbonés. De préférence, lesdits substrats carbonés comprennent, ou consistent en, de l'acétate, du glucose, de la cellulose, de l'amidon, du lactose, du saccharose ou du glycérol. Au sens de la présente invention, une espèce d'algue est considérée comme mixotrophe, dès lors qu'elle peut être cultivée à la lumière, dans un milieu minimum (par exemple MM ou f/2) dans lequel est ajouté un substrat carboné à raison, par exemple, d'une concentration en carbone ou en glycérol, équivalente ou supérieure à 5 mM, sans observer d'inhibition de croissance, c'est-à-dire sans constater de perte de biomasse en poids sec par rapport à une culture effectuée dans un même milieu minimum dépourvu de substrat carboné, c'est-à-dire en mode autotrophe. Aux fins de la présente invention, on utilisera, de préférence, des microalgues mixotrophes, dont au moins 25 %, de préférence au moins 50 0/0 de l'énergie produite par celles-ci, provient de l'exploitation par l'algue dudit substrat carboné. Avantageusement, on sélectionnera les espèces d'algues mixotrophes parmi les classes suivantes : Euglenophyceae, Prasinophyceae, Eustigmatophyceae, Bacillariophyceae, Prymnesiophyceae, Prymnesiophyceae, Pinguiophyceae, Eustigmatophyceae, Bacillariophyceae, Dinophyceae, Trebouxiophyceae, Bicosoecophyceae, Katablephariophyceae, Dinophyceae, Chlorophyceae, Haptophyceae, Raphidophyceae, Chysophyceae, Coscinodiscophyceae, Alveolata, Bangiophyceae, Rhodophyceae. Les microalgues appartenant à la classe des Prasinophyceae, sont de préférence du genre Tetraselmis. sp. Un procédé de culture selon l'invention est, par exemple, réalisé en mixotrophie en présence d'un apport de lumière sous forme de flashs de lumière, de préférence entre 20 et 30 flashs par heure, dont l'intensité est généralement comprise entre 5 et 50 pmol. m-2. s-', de préférence entre 5 et 15 pmol. m-2. s-'. Selon un mode préféré de l'invention, 30 flashs de 30 secondes par heure d'une intensité d'environ 10 pmol. m-2. s-' sont appliqués à un milieu 30 de culture comprenant notamment du glucose et du calcium. Le milieu de culture peut contenir d'autres éléments, tels que du potassium, du magnésium, des micro-éléments et des vitamines. Les concentrations en glucose et en calcium du milieu de culture ont une influence favorable sur la croissance des algues unicellulaires, en particulier sur le temps de latence, le temps de génération, ainsi que sur la concentration en biomasse et le rendement. Les flashs lumineux ont une influence significative sur le contenu lipidique cellulaire. Selon un aspect de l'invention, le milieu de culture doit contenir une quantité de glucose suffisante pour la fermentation, mais pas trop élevée pour éviter d'inhiber la croissance des algues. En particulier, le milieu de culture selon l'invention présente une concentration en glucose inférieure à 10 g/L, préférentiellement comprise entre 4 et 6 g/L. Un mode réalisation préféré consiste à utiliser la technique de culture en Fed-Batch, qui permet de maintenir le glucose à des concentrations non inhibitrices, tout en accumulant de la biomasse. Préférentiellement, le glucose utilisé dans le milieu de culture est du D-glucose ou dextrose, en particulier du dextrose provenant de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre. Les hydrolysats de l'amidon sont constitués de molécules de petite taille, qui sont également facilement assimilables par les algues, permettant d'obtenir un meilleur développement de la biomasse. Selon un autre aspect de l'invention, la croissance des souches dépend de la présence dans le milieu de culture, de calcium en forte concentration, à savoir plus de 80 mg/L de calcium, et préférentiellement entre 120 et 190 mg/L. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le milieu de 25 culture comprend entre 3 et 10 g/L de glucose et 100 et 200 g/L de calcium. Avantageusement, un tel milieu permet d'obtenir un temps de latence d'environ 18 heures, et un temps de génération compris entre 3 et 4 heures. Le procédé de culture selon l'invention doit être réalisé à une température moyenne permettant une bonne croissance des algues, 30 préférentiellement comprise entre 4 et 32°C. Dans ces conditions, on observe une réduction du temps de culture à moins de 40 heures, les temps de latence et de génération étant très faibles. En tant que telles, les algues obtenues selon le procédé de l'invention, peuvent être utilisées dans l'alimentation, notamment l'alimentation animale, car elles sont riches en protéines et en acides gras polyinsaturés (ex : EPA et DHA). Selon un aspect préféré de l'invention, le procédé de culture précédemment défini permet également la production de lipides. Ce procédé de production de lipides est caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des étapes suivantes : i) on met en culture des algues unicellulaires selon le procédé précédemment décrit, et ii) on récupère les algues unicellulaires cultivées à l'étape i), et iii) on extrait les lipides du contenu intracellulaire des algues récupérées à l'étape ii). Les lipides peuvent être extraits en lysant les cellules et fractionnés selon les techniques connues de l'homme du métier. Les lipides ainsi obtenus sont utiles dans différentes applications, notamment en tant que substituts d'huile de poisson, ainsi que dans la production de biocarburants. Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer l'invention sans y apporter de limitation. Exemples I- Matériels et Méthodes 1- Souches : Les souches du genre Tetraselmis (n=78) ont été commandées auprès 30 des souchothèques internationales CCAP (Ecosse), SAG (Allemagne), CCMP (USA) et CSIRO (Australie). - Milieux de culture : Les microalgues d'eau douce sont cultivées en autotrophie en milieu minimum MM liquide [50 mL/L Solution Beijerink (NH4CI 8g/L, CaCl2 1g/L, MgSO4 2g/L), 1 mL/L Tampon Phosphate (K2HPO4 106 g/L, KH2PO4 53 g/L), I mL/L solution d'oligoéléments (BO3H3 11.4 g/L, ZnSO4 7H2O 22 g/L, MnCl2 4H2O 5.06 g/L, FeSO4 7H2O 4.99 g/L, CoCl2 6H2O 1.61 g/L, CuSO4 5H2O 1.57 g/L, Mo7024(NH4)6 4H2O 1.1 g/L, EDTA 50g/L), 2.42 g/L Trizma base, pH ajusté entre 7.2 et 7.4 par HCI, 1.2 mg/L vitamine B1 et 0.01 mg IL vitamine B12 (ajoutées extemporanément)] et en milieu MM solide (+1.5 % agar). Dans un premier temps, les microalgues marines sont cultivées en autotrophie en eau de mer reconstituée ou milieu f/2 liquide [NaNO3 0.64 g/L, KCI 0.74 g/L, NaCl ou Tropic marin sait 26g/L, CaCl2 1 g/L, MgSO4 7H2O 1.92 g/L, NaH2PO4 2H2O 50 mg/L, I mL/L solution d'oligoéléments (Na2EDTA 2H2O 4.36 g/L, FeCl3 6H2O 5.82 g/L, MnCl2 4H2O 2.46 g/L, ZnSO4 7H2O 34.5 mg/L, CoCl2 6H2O 12 mg/L, CuSO4 5H5O 9.8 mg/L, Na2MoO4 2H2O 2.2 mg/L), pH ajusté entre 7.2 et 7.4 par HCI, 0.1 mg/L vitamine B1, 0.6 mg/L vitamine B8 et 0.6 mg/L vitamine B12 (ajoutées extemporanément)] et en milieu f/2 solide (+ 1.2 % agar). Les cultures de microalgues en mixotrophie et en hétérotrophie ont été réalisées sur milieu MM ou f/2 additionné respectivement des substrats carbonés suivants: acétate 1 g/L, glucose 5 g/L, lactose 10 g/L, saccharose 10 g/L et glycérol 5 g/L. 3- Criblaqe Haut-Débit de la croissance de souches en milieu liquide en microplaques 24 et 96 puits Le caractère hétérotrophe et mixotrophe des souches de Tetraselmis a été évalué par une mise en culture des souches de microalgues aussitôt réceptionnées en milieu MM (souche d'eau douce) ou f/2 (souche marine) en présence d'un substrat carboné en microplaques 24 puits (V=2mL) ou 96 puits (V=1 mL) scellées par un film perméable aux gaz. Un contrôle de 10 croissance en autotrophie (MM ou f/2) a été systématiquement effectué pour servir de référence aux cultures en mixotrophie et hétérotrophie. Les microplaques ont été placées en chambre d'incubation (SANYO MLR-351H) à 22°C, 60 % d'humidité et 10pE d'intensité lumineuse pour les cultures en autotrophie et mixotrophie et en chambre d'incubation (BINDER KB53) à 22°C, 60 % d'humidité et à l'obscurité (0 pE) pour les cultures en hétérotrophie. La chambre d'incubation a été modifiée afin d'apporter un éclairage régulé sous forme de flashs de lumière de 10 pE à raison de 30 flashs de 10 30 secondes par heure. 4-Criblage haut-débit par spectrofluorimétrie du contenu lipidique intracellulaire des souches de microalques cultivées respectivement en mixotrophie et hétérotrophie : 15 Après 3 à 4 semaines de suivi de croissance en microplaques 24 ou 96 puits, le contenu lipidique intracellulaire des microalgues mixotrophes et hétérotrophes a été évalué par spectrofluorimétrie. Les lipides intracellulaires ont été marqués spécifiquement par un fluorochrome, le Nile Red. 20 En réponse à une excitation de fluorescence à 488 nm, les lipides neutres marqués au Nile Red émettent une fluorescence à 570 nm et les lipides polaires à 610-620 nm. A cet effet, les cultures liquides de souches de microalgues réalisées en conditions mixotrophes et hétérotrophes sont transférées en microplaques 25 PCR 96 puits (V= 100 à 200 pl de culture) et marquées avec 1-2 pl de Nile Red (0.1 mg/mL). Après 20 min d'incubation à l'obscurité, la microplaque PCR est placée dans un spectrofluorimètre (Varian) et un scan d'émission de fluorescence de 500 à 700 nm est réalisé. L'effet des flashs de lumière (colonnes autotrophie et mixotrophie) et 30 de substrats carbonés (colonnes mixotrophie et hétérotrophie) tels que le glucose (Glc 5g/L), l'acétate (Ac lg/L), le saccharose (Sac 10g/L), le lactose (Lac 10g/L) et le glycérol (Gly 5g/L) sur la croissance des 78 souches du genre Tetraselmis a été évalué par criblage en microplaques 96 puits sur milieu liquide MM ou f/2. Le suivi de croissance est réalisé durant 3 à 4 semaines de façon bi-hebdomadaire par observation macroscopique des cultures et microscopique à la binoculaire (objectifs 10X et 32X). II- Résultats Sur les 78 souches testées du genre Tetraselmis, 22 ont présenté un caractère hétérotrophe et seulement 7 souches se sont avérées strictement autotrophes. On observe en effet que les 22 souches hétérotrophes présentent une croissance significative à 0 pE sur un des substrats testés, comparable voire supérieure à celle en autotrophie. Le substrat carboné préférentiel des souches du genre Tetraselmis semble être le glucose avec 17 souches mixotrophes sur 21. Les souches sont dites strictement autotrophes lorsque l'ajout d'un substrat carboné en présence ou en l'absence de lumière n'améliore pas la croissance cellulaire par rapport à la culture en autotrophie. L'apport de lumière (10 pE) et du substrat carboné ont permis, dans le cas présent, à 71 souches du genre Tetraselmis d'atteindre une concentration cellulaire comparable ou supérieure à celle du contrôle en autotrophie. La culture en mixotrophie constitue donc la meilleure condition pour cultiver le plus grand nombre de souches du genre Tetraselmis. L'effet de la lumière sur l'accumulation de lipides intracellulaires a été évalué chez les 21 souches mixotrophes du genre Tetraselmis capables de croître en conditions de mixotrophie en éclairage continu et discontinu, en microplaques 96 puits, en conditions de culture en phase stationnaire. Pratiquement, un aliquote de culture (V=200 pl) de chacune des 21 souches de Tetraselmis hétérotrophes est transféré sur microplaque 96 puits, puis marqué au Nile Red (C°= 1 pg/mL). Le signal d'émission de fluorescence, reflétant l'accumulation de lipides intracellulaires (lipides neutres à 570 nm et lipides polaires à 620 nm), est collecté au moyen d'un spectrofluorimètre. Pour les 21 souches testées, il est apparu un marquage plus intense au Nile Red des souches cultivées en présence de flashs, par rapport à celles cultivées en mode éclairé continu. Par ailleurs, le procédé de culture d'algues unicellulaires selon l'invention a permis de réduire le temps de culture des mêmes algues à moins de 40 heures, les temps de latence et de génération étant très faibles. En termes de biomasse, les rendements sont importants et la concentration en microalgues obtenue est comprise entre 100 et 150 g/L, ce qui est plus élevé que les concentrations obtenues avec les cultures en lumière continue. III- Conclusion Cette étude a montré qu'un apport de lumière sous forme de flashs (30 flashs de 30 secondes par heure d'environ 10 pE), en plus des substrats carbonés, à des cultures de différentes microalgues du genre Tetraselmis induit, chez toutes celles ayant un caractère mixotrophe, une accumulation significativement plus importante de lipides intracellulaires. REVENDICATIONS1. Procédé de culture d'algues unicellulaires cultivées en mode mixotrophe, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude de plus de 10 pmol. m-2. s-' à raison de plusieurs fois par heure. 2. Procédé de culture d'algues unicellulaires selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 2 pmol. m-2. s-' et 10 pmol. m-2. s-' à raison de plusieurs fois par heure. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'intensité lumineuse varie de manière cyclique. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'intensité lumineuse varie entre les valeurs 2 et 10 pmol. m-2. s-', de préférence entre 0 et 50 pmol. m-2. s-', de préférence entre 0 et 20 pmol. m-2. s-', une ou plusieurs fois par heure. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'apport de lumière est discontinu. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'apport de lumière s'opère par flashage. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit flashage consiste en des phases successives d'éclairement d'une durée comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit flashage consiste entre 20 et 30 flashs par heure, dont l'intensité est comprise entre 5 et 15 pmol. m-2. s-'. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'intensité lumineuse varie de manière continue au cours du temps. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture est un milieu minimum supplémenté en en substrat carboné comprenant de l'acétate, du glucose, de la cellulose, de l'amidon, du lactose, du saccharose ou du glycérol. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les algues unicellulaires sont sélectionnées parmi les classes : Euglenophyceae, Prasinophyceae, Eustigmatophyceae, Bacillariophyceae, Prymnesiophyceae, Prymnesiophyceae Pinguiophyceae, Eustigmatophyceae, Bacillariophyceae, Dinophyceae, Trebouxiophyceae, Bicosoecophyceae, Katablephariophyceae, Dinophyceae, Chlorophyceae, Haptophyceae, Raphidophyceae, Chysophyceae, Coscinodiscophyceae, Alveolata, Bangiophyceae, Rhodophyceae. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les algues unicellulaires appartiennent à la classe des Prasinophyceae, de préférence au genre Tetraselmis. sp. 13. Procédé de production de lipides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) on met en culture des algues unicellulaires selon le procédé de culture de l'une quelconque des revendications 1 à 12, et ii) on récupère les algues unicellulaires cultivées à l'étape i), et iii) on extrait les lipides du contenu intracellulaire des algues récupérées à l'étape ii).