Brevet FR2969299A1 — publié le 20120622

Domaine technique de l'invention La présente invention concerne le domaine du diagnostic. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode et un kit pour prédire l'efficacité d'un traitement de l'hépatite C. Etat de la technique Selon le Bulletin épidémiologique hebdomadaire de l'Institut de Veille Sanitaire en date du 1er Juillet 2008, le nombre annuel de décès associés au virus de l'hépatite C (VHC) en 2001 était de 3 618 (respectivement 6,1 décès pour 100 000 habitants). Le nombre annuel de décès imputables au VHC était 2 646 (4,5 pour 100 000 habitants). 95 % avaient une cirrhose et 33 % un carcinome hépatocellulaire. Cette mortalité devrait augmenter dans les années à venir sachant que l'augmentation très importante du nombre de cancer primitif du foie dans les pays occidentaux est en grande partie liée au virus de l'hépatite C. Actuellement, trois types de thérapies sont disponibles pour soigner l'infection à VHC : 15 - le traitement par l'interféron, efficace chez environ 20 % des personnes infectées par le VHC ; - l'association interféron pégylé-ribavirine, efficace chez environ 50 % des personnes infectées par le VHC ; - l'interféron mis au point par des techniques biologiques, efficace chez environ 60 à 70 20 % des personnes infectées par le VHC. Tous ces traitements, qui sont administrés par injection, ont des effets indésirables tels que la fièvre, les maux de tête, la fatigue, la nausée et les vomissements. En outre, le traitement modifie la formule sanguine. Chez les patients atteints d'hépatite chronique Cr l'association interféron pégyté- 25 ribavirine entraîne une réponse virale prolongée dans 55 r%o des cas. L'obtention d'une réponse virologique prolongée est l'objectif principal du traitement de l'hépatite chronique C (environ 60 à 80 % des patients infectés par le VHC). Elle est associée à ia disparition de l'activité histologique et éventuellement de la fibrose hépatique, ainsi qu'à une réduction du risque de carcinome hépatocellulaire. 30 Les patients non répondeurs (45%) peuvent être identifiés par la détection de ia charge virale au mieux au bilan de la 12semaine, voire à l'arrét du traitement (6 ou 12 mois suivant le génotype). La charge virale présente à la 12 semaine peut onditionner l'arrét therapeutiqt La non réponse au traitement est un problème en particulier pour les patients infectés par le génotype 1 du virus qui ne répondent favorablement que dans 40-50% des cas par rapport aux patients infectés par les génotypes 2 et 3 qui ont 80-90% de réponse au traitement. Une étude récente a mis en évidence des facteurs qui influencent La réponse au traitement dont l'âge, le génotype viral, l'indice de masse corporelle (Elefsiniotis et al, 2008). Mais ces éléments ne sont pas assez performants pour dicter un choix thérapeutique. En étudiant in vitro les mécanismes de résistance au traitement du VHC, il apparait que différentes protéines virales (E2, NS3/4A et NS5A) puissent y jouer un rôle (Hofmann et al, 2005). Dans la majorité des études cliniques il n'a pourtant pas été possible de lier les variations de séquence de ces protéines à la réponse au traitement (Wohnsland etal, 2007). En parallèle des approches génomiques globales (puce, SNP - de l'anglais 'single nucleotide polymorphism') ont été menées pour trouver des marqueurs prédictifs de réponse au traitement. A ce jour quelques pistes existent notamment dans certains polymorphismes du promoteur de l'IElO (Morgan et al., 2008) mais aucun marqueur n'est validé ou utilisé en clinique. Il existe donc un besoin de pouvoir disposer d'un marqueur prédictif fiable de réponse au traitement à base d'interféron, qui est un traitement contraignant et couteux. Un tel marqueur, dit « théragnostique », serait très utile et permettrait d'ajouter un élément important dans le choix thérapeutique offert aux patients infectés par le virus de l'hépatite C. Description des figures Les figures 1 et 2 représentent ia distribution du niveau d'ASH2, et respectivement, du 25 niveau d'apo-C3, chez des patients répondeurs et non-répondeurs â un traitement â base d'interféron. La figure 3 représente l'aire sous la courbe d'ASH2 et/ou d'apo-C3 (pour les patients répondeurs). Description de l'invention 30 Les inventeurs ont découvert, et c'est le fondement de l'invention, qu'i corrélation entre la présence du dimère de l'albumine sérique humaine (ci-après, ASH2) et/ou de l'apolipoproteine CIII (ci-après, apo-Ce) et la réponse ou non-réponse :3 tint, therapie a base d'interféron chez des patients Infectes par le virus de 1 hépatite Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé in vitro pour prédire la réponse à un traitement à base d'interféron chez un patient infecté par fe VHC, ledit procédé comprenant une étape de mesure du niveau d'ASH2 et/ou d'apo-C3 dans un échantillon biologique dudit patient préalablement à tout traitement. Typiquement, l'échantillon biologique est un échantillon de sérum ou de plasma. La réponse au traitement à base d'interféron peut prendre différentes formes : (I) une amélioration de la situation clinique pendant et après le traitement, (ii) une amélioration de la situation clinique pendant le traitement mais une rechute après le traitement, ou (iii) aucune amélioration de la situation clinique pendant ou après le traitement. Les patients visés au (ï) seront qualifiés par la suite de patients « répondeurs » (R) alors que les patients visés aux (ii) et (iii) seront qualifiés par la suite de patients « non répondeurs » (NR). L'amélioration de la situation clinique d'un patient se traduit par une diminution (statistiquement) significative de sa charge virale, qui est mesurée par des techniques connues en soi. Par « interféron » on entend au sens de la présente invention l'interféron-alpha (alpha 2a ou 2b) et ses formes pégylées ou non pégylées, l'interféron-bêta (bêta la ou lb) ainsi que l'interféron-gamma. Selon un mode de réalisation, le traitement à base d'interféron est un traitement à base d'interféron-alpha pégylé ou non pégylé, éventuellement en association avec la ribavirine. Selon un autre mode de réalisation, le traitement à base d'interféron est un traitement à base d'interféron-bêta. Selon un mode de réalisation, le procédé conforme à l'invention comprend en outre la comparaison du niveau d'ASH2 mesuré à un niveau seuil d'ASH2, un niveau d'ASH2 mesuré égal ou supérieur au niveau seuil étant prédictif d'une réponse au traitement à base d'interféron. Le niveau seuil d'ASH2 est établi à partir d'une population de patients infectés par le VHC, chez qui on a prélevé et analysé un échantillon biologique avant le début du traitement à base d'interféron et qui ont été ensuite classés comme patients répondeurs ou non répondeurs, typiquement par détection de leur charge virale au bilan de la 12semaine, comme indiqué ci-dessus. Le niveau seuil est la valeur qui permet au mieux de répartir statistiquement la population étudiée entre le groupe R et le groupe NR en utilisant une technologie donnée ; il est ensuite possible, pour déterminer l'appartenance eu groupe R ou NR de tout nouveau patient, de mesurer son niveau d'ASH2 en utilisant la nleme technologie 't de comparer ne niveau au niveau seuil. Bien entendu, le niveau seuil d'ASH2 est susceptible de varier selon la technique et l'appareillage utilisés pour mesurer les niveaux d'ASF-12, et l'homme du métier sera à même de déterminer ce niveau seuil en fonction du matériel dont il dispose. Comme on peut le constater à la lecture de ia Figure 1, il existe un seuil statistiquement significatif d'ASH2 au-delà duquel on peut prédire avec une excellente spécificité (93,8%) que les patients infectés par le VHC vont répondre à un traitement à base d'interféron. Selon un autre mode de réalisation, qui peut être combiné avec le mode de réalisation précédent, le procédé conforme à l'invention comprend en outre la comparaison du niveau d'apo-C3 mesuré à un niveau seuil d'apo-C3, un niveau d'apo-C3 mesuré inférieur ou égal au niveau seuil étant prédictif d'une réponse au traitement à base d'interféron. L'apo-C3 est un polypeptide de 8,8 kDa composé d'une séquence mature de 79 acides aminés précédée d'un peptide signal de 20 acides aminés. La digestion enzymatique par la thrombine lors de la coagulation qui est déclenchée lors de la préparation du sérum (mais pas du plasma) clive la séquence mature pour générer un fragment, correspondant aux acides 41-79 (COOH terminal) (Catapano et al. 1987). Ce fragment est détecté dans les prélèvements de sérum, et son dosage correspond donc dans ce cas au niveau d'apo-C3 sanguin. Le niveau seuil d'apo-C3 est établi de manière analogue à ce qui a été décrit ci-dessus pour ASH2. De la même manière, ce niveau est susceptible de varier selon la technique et l'appareillage utilisés pour mesurer les niveaux d'apo-C3, et l'homme du métier sera à même de déterminer ce niveau seuil en fonction du matériel dont il dispose. Comme on peut ie constater à la lecture de la Figure 2, il existe un seuil statistiquement significatif d'apo-C3 au deçà duquel on peut prédire avec certitude que les patients infectés par le VHC vont répondre à un traitement à base d'interféron. Il est possible d'améliorer la sensibilité du procédé de l'invention en mesurant conjointement les niveaux d'ASH2 et d'apo-C3. Comme on peut le constater à la lecture de la Figure 3, une telle mesure conjointe permet de détecter 93,8% de répondeurs avec une bonne spécificité (75%). Les niveaux d'ASH2 et d'apo-C3 peuvent être mesurés par une technique de spectromu=utrie de masse appelée SFLDI-TOF (de l'anglais « surface enhanced laser desorptloncunization finie offlight mass spectromotry) Cette technique permet de retenir des protéines sur différentes surfaces chromatographiques et de les détecter en spectrométrie de masse. On peut ainsi obtenir rapidement un profil d'expression protéique qui va être analysé grâce à des moyens bioinformatiques. Les pics intéressants sont sélectionnés et les protéines correspondantes identifiées après purification biochimique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. On peut ensuite quantifier le niveau des protéines identifiées selon des techniques également bien connues de l'homme du métier (telles que immuno-détection ou spectrométrie de masse quantitative). Le procédé conforme à l'invention permet donc de prédire la réponse à un traitement à base d'interféron chez un patient infecté par le VHC à partir d'un échantillon biologique, typiquement un échantillon de sérum ou de plasma, prélevé chez le patient avant l'instauration du traitement. On comprend donc que le diagnostic de l'infection par VHC a été posé, au moyen de tests classiques (par exemple en mesurant la charge virale, déterminée par les niveaux d'ARN, et/ou le niveau d'antigène capsidique), et que le procédé conforme à l'invention a pour but de déterminer si un traitement à base d'interféron est approprié, c'est-à-dire si un patient est susceptible de tirer ou non un bénéfice d'un tel traitement. Grâce au procédé conforme à l'invention, on peut proposer à un patient infecté par le VHC, et en particulier par le génotype 1 du virus, un traitement alternatif au traitement à base d'interféron dès lors qu'on a déterminé (par les moyens simples et fiables décrits précédemment) qu'il ne répondra pas audit traitement à base d'interféron. Un tel traitement alternatif peut comprendre l'administration d'au moins un principe actif utile dans le traitement du VHC, choisi notamment parmi les inhibiteurs de protéase, les inhibiteurs de polymérase, les inhibiteurs de NS5A. Par ailleurs, le fait qu'un patient soit susceptible de répondre ou non à un traitement à base d'interféron va conditionner, à moyen et long terme, l'évolution de sa maladie, qui permettra le cas échéant une meilleure organisation de la prise en charge par les équipes médicales compétentes. Selon un second aspect, l'invention concerne une trousse kit ») pour la mise en oeuvre du procédé susmentionné. Cette trousse comprend - des standards permettant l'établissement d'une courbe de référence et/o - un ou plusieurs réactifs spécifiques (anticorps, tampons, réactifs de révélation) nécessaires à la réalisation des dosages ; et éventuellement des instructions pour mettre en ouvre le dosage quantitatif de 'ASH2 et/ou de i'upo C3. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre indicatif. Exemple 1 c mise en évidence de la présence du dimère de l'albumine sérique humaine et de I'apolipoprotéine CIIT chez les patients infectés par le 5 VHC Dans le cadre d'un protocole de recherche clinique du Centre Hospitalier Régional Universitaire de Montpellier validé éthiquement (autorisation du Comité de Protection des Personnes pour la Recherche Biomédicale - CPPRB), des prélèvements ont été effectués chez des patients infectés par le VHC (16 de génotype 1, 3 de génotype 2, 8 10 de génotype 3 et de 1 de génotype 4, les autres génotypes étant inconnus) préalablement à l'instauration d'un traitement à base d'interféron. Les prélèvements ont été analysés par spectrométrie de masse SELDI. Pour mettre en évidences les pics d'intérêt, les différents échantillons ont été déposés sur barrette CM10 et Q10 pH7. Le protocole était le suivant : 15 a) préparation des échantillons : on a mis 10pI de sérum dans 15p1 d'une solution urée CHAPS et on a agité 15min pour dénaturer les protéines. On a dilué 7,50 du mélange dans 300pl de tampon (Tris 100mM pH? + 0,1% Triton) ; b) incubation des barrettes : on a placé les 2 barrettes (CM10 et Q10) dans un bioprocesseur. On a ajouté 150pl de tampon (Tris pH7 + 0,1% Triton) sur les spots. 20 On a incubé 5min sous agitation (500tr/min) puis on a éliminé le tampon et essuyé le bioprocesseur sur papier absorbant. c) dépôt des échantillons : on a déposé les échantillons dilués sur les spots (8 échantillons par barrette) d) lavage : on a lavé les spots deux fois Smin avec 1500 de tampon Tris pH7 + 0,1°70 25 triton pour enlever les protéines non fixées sur la surface biochimique, puis une fois 5min avec 150pl de tampon Tris pH7 sans triton afin d'ôter le détergent. On a ensuite rincé rapidement les barrettes dans 10m1 d'HEPES 5mM pH7 pour éliminer tous les sels et on les a laissé sécher 10min. e) analyse : on a ajouté 2 x O,Spl de matrice SPA (et on a laissé sécher 10min entre les 30 2 applications). L'analyse par SELDI-TOF a été faite à l'aide du spectromètre de niasse Protein Chip SELDI System PCS 4000 de la société Biorad. Les barrettes ont été lues en basse niasse (3500-20000 Da) et en haute masse (20000-150000 Da) selon deux protocoles de Iocture différents : - Basse masse (LMW): focalisation sur 10KDa ; énergie du laser 2100 n3 et sur une gamme de masse de 0-200000 Da, avec un tir d'initiation (« warning shot ») à 2300 et Y% du spot est lu. - Haute masse (HMW) : focalisation sur 130kDa, énergie du laser 2300 nJ et sur une gamme de masse de 0-200000 Da, avec un tir d'initiation (« warning shot ») à 2500 et ,4 du spot est lu. Après avoir passés tous les échantillons au SELDI-TOF, un spectre a été obtenu pour chaque échantillon. L'analyse a été faite principalement grâce au logiciel Protein chie Data manager. Avant d'analyser les spectres, il faut au préalable : aligner les différents spectres calculer le bruit de fond moyen dans une gamme de masse choisie ; ajuster au mieux la ligne de base avant sa soustraction au spectre ; normaliser les intensités des spectres en courant d'ion total (TIC). Une première série d'analyse sur 32 prélèvements a été faite permettant de sélectionner plusieurs pics SELDI d'intérêt (par différence statistique entre groupe R et NR basé sur un test de Student et un test de Mann-Whitney avec p La purification des marqueurs p10 et p4 a pu être effectué en reproduisant sur des volumes de sérum plus importants, dans des « spin » colonnes, les conditions de capture du SELDI. Les fractions obtenues ont été analysé en SELDI pour vérifier la présence du marqueur d'intérêt, puis elles ont été chargées sur un gel d'électrophorese. Après coloration du gel, la zone où le marqueur était attendu du fait de son poids moléculaire (PM) a été excisée. Une dernière vérification de la présence du marqueur élue du gel a été effectuée avant q sa séquence ne soit obtenue par analyse LC-MS/MS . En c qui concerne p10,, de !'Abuminre s~ rlque humaine (ASH) a pu être identifiée Sachant que l'albumine a un PM de 66kDa et que p10 a un PM de 132kDa, on peut conclure que p10 correspond à un dimère d'ASH. p4 quant à lui correspond à une forme tronquée de l'apolipoprotéine CIII. Pour ce dernier marqueur, tes peptides séquencés ont été les suivants : (SEQ ID N°:1) (SEQ ID N°:2) diDéia,issala (SEC? ID N":3) 1)iaii ».PEVRPTSAVAA (SEQ ID N°:4) L'alignement de ces peptides sur la séquence de l'apo-C3, précédée de son peptide signal, est illustré ci-dessous MQPRVLLVVA LLALLA3A.RA SEAEDASLLS FMQGYMKHAT KTAKDALSSV QESQVAQQAR GWVTDGFSSL KDYWSTVKDK FSEFWDLDPE VRPASAVAA (SEQ ID N°:5) La partie séquencée correspond donc au fragment 41-79 de l'apo-C3 que l'on retrouve dans les prélèvements de sérum par suite du clivage à la thrombine lors de la coagulation (Catapano et al. 1987). Exemple 2 : corrélation entre présence des marqueurs d'intérêt et réponse ou non réponse au traitement à base d'interféron Les patients mentionnés à l'exemple 1 ont été traités par interféron-alpha pégylé + ribavirine. Un suivi des patients a été réalisé 12 semaines après le début du traitement, date à laquelle de nouveaux prélèvements ont été effectués afin de déterminer d'une part les patients répondeurs (R) et les patients non répondeurs (NR); et d'autre part, pour chaque catégorie de patients, s'il existe une corrélation (statistiquement significative) entre les niveaux d'ASH2 et/ou d'apo-C3 déterminés avant l'instauration du traitement et a réponse ou non réponse audit traitement. Comme on peut e constater à la lecture du tableau 1 et de la Figure . existe une différence statistiquement significative du niveau d'ASH2 (déterminé avant l'instauration du traitement) entre répondeurs et non répondeurs (p De même on peut constater à la lecture du tableau 1 et de la Figure 2 qu'il existe une différence statistiquement significative du niveau d'apo-C3 (déterminé avant l'instauration du traitement) entre répondeurs et non répondeurs (p Enfin une combinaison de ces deux marqueurs en prenant comme critère les seuils pour ces deux paramètres permet encore d'améliorer les résultats de détection avec une aire ROC de 0,91 (voir tableau 2 et Figure 3). Tableau 1 : Valeurs d'apo-C3 et d'ASH2 mesurées pour les patients R et NR Groupe Apo-C3 ASH2 Groupe Apo-C3 ASH2 R 1,35 1,46 NR 2,66 1,81 R 2,57 2,15 NR 2,72 1,67 R 2,75 2,49 NR 3,46 1,84 R 2,15 2,00 NR 3,04 1,95 R 2,90 1,71 NR 3,77 1,90 R 2,59 2,42 NR 3,10 1,98 R 1,94 2,03 NR 3,05 2,00 R 1,65 1,77 NR 4,36 1,61 R 2,26 1,91 NR 1,47 1,11 R 1,01 ,93 NR 1,40 1,38 R 1,52 2,21 NR 1,69 1,76 R 211 257 NR 2148 1,65 R 1,24 1,23 NR 2,92 1,59 R 1,30 2,20 NR 1,41 1,85 _~ R 105 2,00 NR 1,04 1,65 R 1,57 2,04 NR 1,68 1,91 Tableau 2 Pic j Sensibilité Spécificité ROC Apo C3 100 43,8 0,72 ASH2 62,5 93,8 3,79 Apo-L3 -f ASi-i2 9 s,8 U15 Références bibliographiques Catapano AL. (1987) Activation of lipoprotein lipase by apolipoprotein C-11 is moduiated y the COOH terminal region of apolipoprotein C-III. Chem Phys Lipids. 1987 Oc 45( :39-47 Elefsiniotis, I. PaMis, Ketikogiou, L, Koutsounas, S., Scarmeas, N., Pantazis, D., Moulakakis, A. 8t. Tsianos, E. V. (2008). Patients age modifies the impact of the proposed predictors of sustained virological response in chronic hepatitis C patients treated with PEC-interféron plus ribavirin. Eurilntern Mec/ 19, 266-270. Hofmann, W. P., Dries, V., Herrmann, E., Gartner, B., Zeuzem, S. & Sarrazin, C. (2005). Comparison of transcription mediated amplification (TMA) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of hepatitis C virus RNA in liner tissue. J Clin Km132, 289-293. Morgan, T. R., Lambrecht, R. W., Bonkovsky, H. L., Chung, R. T., Naishadham, D., Sterling, R. K., Fontana, R. J., Lee, W. M., Ghany, M. G., Wright, E. C. & O'Brien, T. R. (2008). DNA polymorphisme and response to treatment in patients with chronic hepatitis C: results from the HALT-C trial. J Hepatol49, 548-556. Wohnsland, Hofmann, W. P. & Sarrazin, C. (2007). Viral determinants of résistance to treatment in patients with hepatitis C. Clin M/'cmbio/ Re v20, 23-38. REVENDICATIONS1. Procédé in vitro pour prédire la réponse à un traitement à base d'interféron chez un patient infecté par le virus de l'hépatite C (VHC), ledit procédé comprenant une étape de mesure du niveau d'ASH2 et/ou du niveau d'apo-C3 dans un échantillon biologique dudit patient préalablement à tout traitement. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on mesure le niveau d'ASH2 et on compare ce niveau d'ASH2 à un niveau seuil d'ASH2, un niveau d'ASH2 mesuré égal ou supérieur au niveau seuil étant prédictif d'une réponse au traitement à base d'interféron. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on mesure le niveau d'apo-C3 et 15 on compare ce niveau à un niveau seuil d'apo-C3, un niveau d'apo-C3 mesuré inférieur ou égal au niveau seuil étant prédictif d'une réponse au traitement à base d'interféron 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le patient est infecté par le génotype 1 du VHC. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le traitement à base d'interféron est un traitement par interféron-alpha pégylé ou non pégylé, par interféron-bêta ou par interféron-gamma. 25 6. Procédé selon fa revendication 5, dans lequel le traitement à base d'interféron est un traitement par interféron-alpha pégylé ou non pégylé. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'interféron-alpha pégylé ou non pégylé est utilisé en association avec la ribavirine. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel 'échantillon biologique est un échantillon de sérum ou de plasma, 20