Brevet FR2976077A1 — publié le 20121207

L'invention concerne les procédés et appareils d'imagerie de fluorescence. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de détermination des temps de vie (tiI, i2, ..., tin) d'un déclin d'intensité de luminescence d'un échantillon ainsi qu'un procédé de détermination des coefficients d'un processus de transfert d'énergie intermoléculaire. Les études des interactions moléculaires en cellule vivante sont au centre de nombreuses problématiques en biologie puisqu'elles permettent de mettre en évidence des mécanismes de dysfonctionnement cellulaire impliqués notamment au cours de maladies neuro-dégénératives ou métaboliques telles que le diabète ou encore certains cancers. Ces interactions peuvent notamment être étudiées in vivo en microscopie grâce à des mesures de transfert d'énergie entre molécules luminescentes (c'est-à- dire fluorescentes ou phosphorescentes) marquant des protéines d'intérêt (connues sous l'acronyme anglais de FRET, pour Fôrster Resonance Energy Transfer). La technique la plus robuste pour quantifier ce transfert d'énergie est basée sur la mesure des temps de vie de fluorescence (connues sous l'acronyme anglais de FLIM, pour Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) des molécules luminescentes. Ces mesures de temps de vie de luminescence peuvent être réalisées suivant deux méthodes : la méthode temporelle (plus précise) et la méthode fréquentielle (plus rapide). Néanmoins, quelque soit la méthode employée, l'analyse des images de FLIM constitue aujourd'hui un verrou majeur qui requiert un haut niveau d'expertise, sous peine d'entraîner une interprétation erronée des résultats. Généralement, les paramètres recherchés dans ces images, à savoir les temps de vie et les proportions (ou contributions) de chaque molécule luminescente, sont extraits des données expérimentales de FLIM grâce à l'ajustement successif de l'ensemble des données collectées expérimentalement au moyen d'équations théoriques à plusieurs inconnues. Ces méthodes d'analyse posent cependant un certain nombre de problèmes pouvant entrainer une interprétation erronée des résultats. En effet, la qualité de l'ajustement dépend du choix du modèle d'ajustement, du nombre de variables d'ajustement, ou encore du nombre d'itérations (en particulier en raison de la présence de minimum locaux), ce qui limite fortement l'utilisation de cette méthode en empêchant notamment la réalisation de mesures quantitatives des coefficients de FRET de manière automatisée. Il existe également un procédé permettant de visualiser une représentation polaire d'images de temps de vie. Pour le domaine temporel, ce procédé consiste à convertir dans le domaine fréquentiel des données acquises temporellement en calculant la transformée de Fourier du déclin de fluorescence puis en séparant les parties réelle et imaginaire de la transformée afin d'obtenir une représentation polaire (appelée également diagramme d'Argand). Grâce à cette opération mathématique, il est possible de séparer visuellement le nombre d'exponentielles du déclin de luminescence et donc déterminer s'il est mono- ou multi-exponentiel. En effet, un échantillon exhibant un déclin de luminescence mono-exponentiel sera localisé sur un demi cercle centré en [0,5;0] et de rayon 0,5 dans le diagramme d'Argand. Les temps de vie courts seront proches du point [1,0] alors que les temps de vie longs se rapprocheront de l'origine (point [0,0]). En revanche, si le déclin de luminescence de l'échantillon est multiexponentiel, la localisation de l'échantillon sera à l'intérieur du demi-cercle. Ce procédé ne permet cependant pas de calculer les temps de vie et les contributions de molécule luminescente lorsque leur déclin d'intensité est multi-exponentiel. L'article « Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells », de S. Padilla-Parra, N. Auduge, M. Coppey-Moisan et M. Tramier, Biophys. J., 95 (6), 2976-2988 (2008), décrit également une méthode d'analyse sans ajustement des données par un modèle. Les auteurs proposent de calculer la fraction minimale de donneur (Minimal fraction of donor (mfd) en anglais) Néanmoins, afin de calculer cette quantité, il est nécessaire de connaitre le temps de vie de fluorescence du donneur seul. Cette méthode ne permet donc pas non plus de réaliser des mesures quantitatives des paramètres de FRET sans a priori sur un paramètre au moins (ici, le temps de vie du donneur). Un objectif de l'invention est donc de proposer un procédé permettant de déterminer les paramètres caractérisant un déclin d'intensité d'un échantillon luminescent (c'est-à-dire fluorescent ou phosphorescent), qui ne dépende pas de paramètres ajustables qui soit simple, robuste et facile à mettre en oeuvre, et qui puisse en particulier être appliqué à des mesures quantitatives d'interactions moléculaires par FRET en haut débit. Pour cela, l'invention propose un procédé de détermination des temps de vie (tiI, i2, ..., tin) d'un déclin d'intensité de luminescence à n exponentielles (n 1) d'un échantillon luminescent, le procédé comprenant les étapes consistant à : - sélectionner une région d'intérêt de l'échantillon luminescent, la région étant formée d'une pluralité de pixels; - exciter la région d'intérêt avec une source lumineuse pulsée ou dont l'intensité est modulée selon une fréquence donnée, - détecter des photons émis par la région d'intérêt, - déterminer les n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) dudit déclin, caractérisé en ce que, au cours du procédé, on utilise au moins n fréquences (w,, ..., wn) différentes (300) pour déterminer les n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) caractérisant le déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel. Certains aspects préférés mais non limitatifs du procédé de détermination des temps de vie d'un déclin d'intensité selon l'invention sont les suivants : * la région d'intérêt présente en chaque pixel un déclin d'intensité de luminescence (In(t)) à n exponentielles défini selon la formule suivante : _t t t In (t) = + a2.e + ...+ an.e où : In(t) est le déclin d'intensité de luminescence à n exponentielles, a,, a2, ..., an sont des proportions, et tif, ti2, ..., tin sont les temps de vie du déclin d'intensité de luminescence In(t), et le procédé comprend en outre les étapes suivantes : - mesurer le déclin de l'intensité de luminescence en chaque pixel, déterminer une transformée de Fourier (FT) du déclin d'intensité de luminescence (In(t)) ; - déterminer une partie réelle (u(w)) et une partie imaginaire (v(w)) de la transformée de Fourier (FT) ainsi obtenue ; - calculer, en chaque pixels, la valeur de la partie réelle (u(w)) et de la partie imaginaire (v(w)) de la transformée de Fourier de leur déclin de luminescence (In(t)); et - en déduire les temps de vie (tiI, ti2, .., tin) du déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel ; * la région d'intérêt présente en chaque pixel un déclin d'intensité de luminescence (I(t)) bi-exponentiel défini selon la formule suivante : t t I(t)=a~.e +(1-al)e ti2 où : I(t) est le déclin d'intensité de luminescence bi-exponentiel, a, est une proportion, et i1 et ti2 sont les temps de vie du déclin d'intensité de luminescence I(t). * la proportion a, et les temps de vie i1 et ti2 sont définis comme suit : n -1+e`,`) (ti2(1+Ti2o2))(-1+u, +i22u,cO2) a, = 2n - ti2(1+ti 2002)(-1+u1 +ti 22u1002)+e`2«-ti +ti 2 )(-1+ 2 o2+u1 (1+ti 2(02)(1+ti22002)) 1 1 1 1 (1-u, -vit2cw) (J)(vl -u1t2w) 2 alw(ul (ul - u2) + vl (ul - a12u2 )) (a,6(u, _1)2 u221,12 +u; (u2 -1)(u; -u,u2 +v, )) - 2a13u2 V ul -a12u2 +(a,2 -1)111u2vl((u, -1)u, +2v 1 ) (a12(ul -1)-u,/\ul -u2)+(a12 -1)1,1 x +2aul -a,2u2 +(a,2 -1i,u2v,(2u12 -u,(u2 +1)+2vi Oa,2(ul -1)-u,ku, -u2)+(a,2 -1)v; * on réalise en outre une image des temps de vie de la région d'intérêt en chaque pixel ; * on détermine en outre des proportions (a;) pour chaque déclin de l'intensité de luminescence ; 10 * on mesure en outre, pour chaque fréquence (w,, ..., wn), un histogramme du déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel ; * la détection des photons et la mesure de leur temps d'arrivée respectif est réalisée par comptage de photons uniques corrélés dans le temps (Time Correlated Single Photon Counting, TCSPC) ; 15 * au cours de l'étape de détection: - on détermine, pour chaque photon détecté, son temps d'émission par la région d'intérêt, et on l'associe à un pixel de l'image ; et - on détermine, à partir de la détection des photons (P) et de leur temps d'émission respectif, l'histogramme du déclin de l'intensité de luminescence 20 en chaque pixel ; t1 = 1 1 t2 = 5 +a,4u2((u, -1)2u1 (u, -u2)+(ul -1)u1(2+5u1 -6u2)v1 +4(ul -u2)v4) +a,2u,((1-u,)u; (4u, -2u2 -1)(u, -IIu2)+u,(1-8(u; -u2(5+3IIuu2)+5(u, +2u,u2)w; +4(u(2 -u, )v4) -a,u,(u2 -1)v1 -a13(u1 -1)u2v, +u1Vu1 -alzuz +(a2 -1)u1u2 V(alz(ul -1)-ul)(ul -u2)+(a,2 -1)1,12 * l'histogramme du déclin d'intensité de luminescence est réalisé en accumulant dans un repère le nombre de photons détectés ou le logarithme de ce nombre en fonction du temps de retard de ces photons ; * le procédé comprend en outre les étapes suivantes : - mesurer, en chaque pixel et pour chaque fréquence, une modulation m et un déphasage cp du déclin d'intensité, u(Cw)= m(cw)cos(p(cw) v(Cw) = m(Cw) sin (p (Cw) - calculer, à partir des valeurs de modulation m et de déphasage cf), la valeur d'une partie réelle (u(w)) et d'une partie imaginaire (v(w)) de la transformée de Fourier du déclin de luminescence (In(t)) en chaque pixel et pour chaque fréquence, et - en déduire les temps de vie (tiI, i2, .., tin) du déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel. * les fréquences (w,, ..., wn) appliquées à l'échantillon dépendent de la gamme de temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) à mesurer ; * pour une gamme de temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) comprise entre 1 et 10 ns, les fréquences (tûl, ..., wn) sont comprises entre 10 MHz et 100 MHz, de préférence entre 20 MHz et 80 MHz ; et * on excite la région d'intérêt avec une seule fréquence (w,), et on détermine les n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) grâce aux n-1 autres fréquences (w2, ..., wn) en ne conservant que les photons détectés pendant la durée d'impulsions correspondant à chacune des n-1 autres fréquences (w2, ..., wn). Selon un deuxième aspect, l'invention propose un procédé d'analyse d'un transfert d'énergie (FRET) entre un donneur et un accepteur, l'un au moins du donneur et de l'accepteur étant luminescent, comprenant les étapes consistant à : - déterminer, pour le donneur et/ou l'accepteur, les temps de vie (i,, i2, ..., tin) de son déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel lorsqu'il est seul ; - mettre en présence le donneur et l'accepteur ; - déterminer les temps de vie respectifs des déclins d'intensité de luminescence en chaque pixel du donneur et/ou de l'accepteur conformément au procédé selon l'invention ; et - comparer les temps de vie des déclins d'intensité de luminescence du donneur et/ou de l'accepteur en chaque pixel avec les temps de vie correspondants des déclins d'intensité de luminescence déterminés suite à leur mise en présence ; et - déterminer si le donneur et l'accepteur ont été engagés dans un transfert d'énergie ; Un aspect préféré mais non limitatif du procédé d'analyse est qu'on détermine en outre l'efficacité du processus de FRET à partir de la comparaison des temps de vie des déclins d'intensité du donneur seul et du donneur en présence de l'accepteur. Selon un troisième aspect, l'invention propose un produit programme d'ordinateur comprenant des instructions de code de programme pour l'exécution des étapes du procédé de détermination des temps de vie d'un déclin d'intensité conforme à l'invention, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur, et un produit programme d'ordinateur comprenant des instructions de code de programme pour l'exécution des étapes du procédé d'analyse conforme à l'invention, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur. Selon un dernier aspect, l'invention propose une installation adaptée pour la mise en oeuvre d'un procédé de détermination des temps de vie (i,, ti2, ..., tin) d'un déclin d'intensité de luminescence à n exponentielles (n 1) d'un échantillon luminescent conforme à l'invention, l'installation étant caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants : - des moyens pour sélectionner une région d'intérêt de l'échantillon luminescent, la région étant formée d'une pluralité de pixels - une source lumineuse adaptée pour appliquer une lumière pulsée à la région d'intérêt, - un détecteur pour détecter des photons émis par le fluorophore, - des moyens pour déterminer, à partir de la détection des photons le déclin de l'intensité de luminescence en chaque pixel, et - des moyens pour déterminer, à partir du déclin de l'intensité de luminescence en chaque pixel, les n temps de vie (tiI, i2, ..., tin) dudit déclin en chaque pixel. D'autres caractéristiques, buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre, au regard des figures annexées, données à titre d'exemples non limitatifs et sur lesquelles : La figure 1 représente un histogramme d'un déclin d'intensité de luminescence pour un pixel d'une image pouvant être obtenu au cours du procédé de l'invention, La figure 2 représente un organigramme représentant différentes étape d'une forme de réalisation du procédé d'analyse et de mesure d'un transfert d'énergie (FRET) entre deux molécules, et La figure 3 représente schématiquement une installation sur laquelle les procédés selon l'invention peuvent être mis en oeuvre. Nous allons à présent décrire un procédé de détermination dans le domaine temporel de temps de vie de fluorophores présentant un déclin d'intensité de fluorescence à n exponentielles (avec n un nombre entier supérieur ou égal à 1) caractérisé par n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) et n proportions (a,, ..., an). Pour une meilleure compréhension de l'invention, nous détaillerons dans ce qui suit le procédé dans son application au cas d'un échantillon fluorescent. Ceci n'est cependant pas limitatif, dans la mesure où le procédé peut être appliqué mutatis mutandis à un échantillon phosphorescent. Par ailleurs, les exemples seront donnés plus particulièrement pour un échantillon à déclin bi-exponentiel caractérisé par deux temps de vie ti et i2. L'échantillon fluorescent peut être biologique (composé d'une ou de plusieurs cellules et/ou tissus animales ou végétales) ou non et doit comprendre au moins un fluorophore. Nous sélectionnons dans cet échantillon une région d'intérêt R formée par une pluralité de pixels (étape 100), par exemple lors de l'acquisition d'une image de ladite région d'intérêt R. Au cours d'une deuxième étape 200, on excite la région d'intérêt R avec une source lumineuse pulsée selon une fréquence d'excitation donnée. La source lumineuse pulsée peut être un laser à impulsions 10 de durée d'impulsion très brève, par exemple inférieure à 100 ps, et dont la longueur d'onde appartient au domaine de la lumière visible ou infrarouge (l'excitation étant alors non-linéaire). Par ailleurs, on choisit de préférence une puissance d'excitation faible (de l'ordre de quelques pW sur l'échantillon) afin de ne pas stresser les échantillons biologiques, ce qui pourrait en effet modifier les temps de vie mesurés. Les fluorophores peuvent être intrinsèques (i.e. des espèces naturellement fluorescentes) ou extrinsèques (i.e. des espèces ajoutées à un échantillon qui n'est pas fluorescent ou qui ne possède pas les propriétés spectrales souhaitées). Les fluorophores peuvent par exemple être une molécule d'intérêt telle qu'une protéine particulière. Par exemple, pour des protéines de type CFP (selon l'acronyme anglais correspondant à Cyan Fluorescent Protein, signifiant protéines fluorescentes cyan), on peut utiliser une diode laser 10, émettant une lumière pulsée comprise entre 400 et 440 nm, par exemple de l'ordre de 405 nm (lumière violette), d'une durée d'excitation de quelques picosecondes et avec un taux de répétition de 20MHz. De préférence, la durée d'excitation (c'est-à-dire la durée de chaque impulsion) est largement inférieure au temps de vie des fluorophores, typiquement de l'ordre de cent fois plus faible. Sous cette excitation lumineuse, les fluorophores émettent alors une lumière pendant une durée et selon une intensité déterminées, la durée de l'émission fluorescente dépendant ni de la source, ni de l'excitation, ni de la concentration des fluorophores, mais de son environnement (pH, température, etc.). Typiquement, les protéines de l'exemple précédent émettent une lumière d'une longueur d'onde comprise entre 450 et 500 nm, pendant une durée de l'ordre de quelques nanosecondes. Les photons émis par les fluorophores sont alors détectés (étape 210) en tout ou partie par un système 20 capable de mesurer le déclin d'intensité de fluorescence pour chaque pixel qui lui est associé dans l'image. Par exemple, le système 20 peut comprendre un détecteur 22 et le cas échéant une carte de comptage adaptés pour mesurer le temps d'arrivée des photons selon la méthode conventionnelle de comptage de photons uniques corrélés en temps (ou TCSPC, qui est l'acronyme anglais de Time Correlated Single Photon Counting). Une telle méthode permet en effet de déterminer de manière très précise le temps d'arrivée de chaque photon détecté et de l'associer au pixel correspondant de l'image, obtenant ainsi une très bonne résolution temporelle et spatiale (étapes 220 et 230). Le choix du système 20 de mesure du temps d'arrivée des photons n'est cependant pas limitatif. Il est cependant préférable que le système 20 soit adapté pour acquérir une image avec une bonne résolution spatiale et temporelle. Quelle que soit la méthode mise en oeuvre, l'objectif est, pour chaque pixel de l'image, d'acquérir un histogramme de déclin de fluorescence. Pour cela, dans le cas d'un détecteur 22 adapté pour le TCSPC, on détermine alors, à partir de la détermination des temps d'arrivée de chaque photon, leur temps de retard d'émission respectif (étape 410) par rapport à l'impulsion d'excitation correspondante et on répète cette opération jusqu'à l'obtention de l'histogramme de déclin d'intensité pour chaque pixel donnant le nombre de photons (ou le logarithme de ce nombre) comptés en fonction de leur temps de retard respectif (étape 240). On notera que, dans la méthode TCSPC, plus le nombre d'impulsions d'excitation est grand, plus les histogrammes seront précis et significatifs et plus ils approcheront la courbe théorique du déclin d'intensité de fluorescence. En variante, on peut également utiliser un détecteur 22 à porte temporelle. Un tel détecteur est adapté pour détecter, pendant un intervalle de temps défini (porte temporelle), des photons émis par les fluorophores. On ne détecte donc pas les photons individuellement, les uns après les autres, comme dans la méthode de TSPC décrite ci-dessus, mais par vagues. Afin de corréler les photons détectés avec les pixels correspondants, il est possible de balayer la région d'intérêt R pixel par pixel avec un laser à impulsions ou d'illuminer la région d'intérêt R en champ large et détecter la fluorescence émise à l'aide d'un détecteur à porte temporelle couplé avec un capteur CCD (qui est l'acronyme en anglais de Charge Couple Device, pour dispositif à transfert de charge en français). A partir des vagues de photons ainsi détectées et de leurs associations aux pixels correspondants dans la région d'intérêt R, on obtient alors l'histogramme de déclin d'intensité en chaque pixel. L'obtention d'un tel histogramme à partir de la détection de vagues de photons étant connue en soi, elle ne sera pas détaillée davantage ici. On pourra se référer par exemple à l'article de F. Desty, S. M. Ameer-Beg, T. Ng et K. Suhling : « Imaging proteins in vivo using fluorescence lifetime microscopy », Mol. BioSyst, 2007, 3, 381-397 pour plus d'informations. Quel que soit le système de détection 20 choisi, pour une image de dimensions 10x10 pixels, on obtient une série de 10x10 histogrammes de déclin pour une première fréquence wl. Par « fréquence wl », on entendra ici la fréquence d'excitation appliquée par la source lumineuse lors de l'étape par la source lumineuse 10 à la région d'intérêt R. En variante, afin de simplifier la mise en oeuvre du procédé et d'éviter de modifier la fréquence d'excitation de la source lumineuse 10 entre deux étapes, il est également possible de choisir pour wl la fréquence de mesure de l'histogramme du déclin d'intensité, c'est-à-dire la fréquence correspondant à l'intervalle de temps de mesure de l'histogramme de déclin. La fréquence de mesure est alors nécessairement supérieure ou égale à la fréquence d'excitation. Par exemple, pour un histogramme du déclin d'intensité réalisé sur une durée de détection de 12.5 ns, la fréquence de mesure wl est alors de 80 MHz, tandis que pour une durée de détection de l'ordre de 50 ns, elle est de 20 MHz. Au cours d'une troisième étape 280, on réitère alors les étapes d'excitation 200, de détection 210 - 230 et de réalisation 240 des histogrammes de déclin d'intensité de ces mêmes fluorophores à une deuxième fréquence w2, différente de la première fréquence wl utilisée au cours de la deuxième étape 200. Les conditions de réalisation (c'est-à-dire le choix du laser pulsé 10 et son réglage (longueur d'onde, durée des impulsions, etc.), du détecteur 20 ou encore le type de fluorophores), restent inchangés. On obtient alors une deuxième série d'histogrammes du déclin de l'intensité pour chaque pixel de l'image, correspondant à la deuxième fréquence w2.30 Les fréquences wl et W2 choisies pour chaque étape 200 et 280 dépendent de la gamme de temps de vie des déclins d'intensité à déterminer. De préférence, on choisit des fréquences de l'ordre de l'inverse du temps de vie à déterminer. Ainsi, pour des temps de vie compris entre 1 et 10 ns (qui correspondent sensiblement aux temps de vie de fluorescence), les fréquences sont choisies entre 10 et 100 MHz (par exemple wi = 20 MHz et w2 = 80 MHz), tandis que pour des temps de vie plus longs (correspondant à des temps de vie de phosphorescence par exemple), les fréquences sont plus faibles et peuvent être inférieures à 1 MHz. On détermine alors (étape 500), directement sur la base de ces deux séries d'histogrammes obtenues pour les deux fréquences différentes, par exemple à 20 MHz et à 80 MHz, la proportion a, et les temps de vie i1 et i2 du déclin de l'intensité de fluorescence des fluorophores testés. Pour un fluorophore présentant un déclin d'intensité de fluorescence bi-exponentiel, le déclin d'intensité de fluorescence I(t) est défini selon la formule suivante : t t I(t) = al .e 'l + (1 - al )e 22 où : a, est une proportion, et i1 et ti2 sont les temps de vie de fluorescence. On peut alors déterminer la transformée de Fourier (FT) de ce déclin de fluorescence I(t) selon les techniques usuelles, puis la séparer en partie réelle (Re[FT(It))]) et imaginaire (Im[FT(It))]), que l'on nommera par la suite u et v respectivement. On obtient alors, pour une fréquence w : u(co) = Re[FT(I(t))] v(co) = Im[FT(I(t))] 10 15 En remplaçant FT(I(t)) par sa formule analytique, on obtient alors : f 1(t) cos(cwt)dt u(w) f I(t)dt f 1(t) sin (cet )dt v(w) f I(t)dt où l'intégrale est réalisée sur l'intervalle de mesure des temps d'arrivée des photons à la fréquence w. Afin de résoudre tous les paramètres du déclin d'intensité I(t), à savoir la proportion a, et les temps de vie i1 et i2, il suffit analytiquement le système d'équation suivant : f I(t)cos(cwlt)dt f I(t)dt 11(0 sin(cOlt)dt (wl) - f I(t)dt 1I(t) cos(cw2t)dt f I(t)dt f I(t)sin(cw2t)dt v2(co2)= f I(t)dt On obtient alors : i 27c -1+e" ti2(1+ti12cw2))(-l+ul +ti22u1cW2) -ti2(1+ti12W2)(-1+u1 +ti22u1cW2)+e`Zwl-til +ti2)(-1+tlt2W2+ul(1+ti2co2)(1+t22W2)) (1-ul -v1t2W) C~(vl -tilt 2W) alors de résoudre vl al = '1 = 15 aiw(ui (ui - (a,«u1 -1 - 2a13u2 + 2au, - a12 +ai4u2((u, +vi -ai2u2)) 2u2v1 +u~ (uu2 -1)(uI2 -ul u2 +v~ l) Zut +1a,2 -1)uiu2v,«u, -1)u, +2v1 )-Nl(a,2(u1 -1)-u,ku, - 2 +(a12 -1)iu2vi(2u1 -ui(u2 +1)+2vi )-Ni(ai2(ui -1)-u1)(u 2u; (u, -u2)+(u, -1)u,(2+5u, -6u2)v1 +4(u, -u2)v4) ti2 x +al2ul «1-ul)u~ (4ul - 2u2 -1)(ul -u2)+ul (1-8u; -u2(5+3u2)+5(ul +2ulu2))vI2 + 4(u2 -ul)v4) -(u2 -1)v1 -a,3(u, -1)u2v, +u,-a,2u2 +(a2 -1)u1u2 (a12 (u1 -1)-u,ku, -u2)+(a,2 -1)v1 Connaissant les valeurs de ui, vi, u2 et v2 en chaque pixel grâce aux histogrammes, on en déduit alors les valeurs de a,, i1 et i2 en chaque pixel. On peut alors réaliser une image de temps de vie de fluorescence en représentant, pour chaque pixel, les temps de vie de fluorescence i1 ou ti2 obtenus. La figure 1 illustre un exemple d'histogramme de déclin d'intensité de fluorescence en un pixel donné et pour une fréquence donnée, pouvant être obtenu grâce au système de mesure de temps de vie. On a porté en abscisses le temps d'émission t des photons par le fluorophore (avec t=0 au moment de l'impulsion d'excitation), et en ordonnées le logarithme du nombre N de photons détectés. En calculant la transformée de Fournier FT des histogrammes et en séparant la partie réelle et imaginaire pour deux fréquences différentes, on peut alors déterminer les valeurs ui(w), vi(w), u2(w) et v2(w), et en déduire les paramètres du déclin (proportion a; et de temps de vie Ti). On comprendra ici que, contrairement aux procédés conventionnels, il n'est plus nécessaire d'ajuster les histogrammes obtenus avec des équations théoriques afin d'obtenir les différents paramètres du déclin de fluorescence. Par ailleurs, la mise en oeuvre de deux fréquences de mesure différentes permet de déterminer l'ensemble des paramètres du déclin sans la nécessité de fixer l'un des paramètres à déterminer. Il est également possible de déterminer les valeurs de a,, ti et i2 en n'effectuant que la première étape du procédé, à la première fréquence wl, et en déduisant, à partir de l'image obtenue, l'image associée pour une deuxième fréquence w2 plus élevée. Par exemple, une fréquence de 20 MHz correspond à une durée entre début d'impulsions de 50 ns, tandis qu'une fréquence de 80 MHz correspond à une durée entre début d'impulsions de 12.5 ns. Cette variante consiste à acquérir une première série d'histogramme avec une fréquence d'excitation et de mesure de 20 MHz. A partir de cette première série, il est possible de ne garder que les points de l'histogramme compris entre 0 et 12.5 ns. De cette manière, on obtient une seconde série d'histogrammes correspondant à une fréquence de mesure de 80 MHz. Cette variante de réalisation permet donc de réduire le nombre de mesures à effectuer. Elle est cependant moins précise que dans le cas où l'on effectue directement les deux mesures en appliquant les deux fréquences wi et w2. Le procédé conforme à l'invention est également applicable à la détermination des temps de vie d'un déclin d'intensité de fluorescence multiexponentiel. Par exemple, pour un déclin à n exponentielles, le déclin d'intensité In(t) prend la forme suivante : t t t I12(t) = al.e +az e 22 +...+an.e où : a,, a2, ..., an sont les proportions, et tif, ti2, ..., tin sont les temps de vie de fluorescence. Il suffit alors de réaliser les étapes d'excitation 200, de détection 210-230 et de réalisation 240 de la série d'histogrammes de déclin d'intensité des mêmes fluorophores avec n fréquences d'excitation wn différentes de manière à obtenir en tout n séries d'histogrammes du déclin d'intensité de fluorescence, les conditions de réalisation restant inchangées. On peut alors résoudre analytiquement le système à n équations, connaissant les valeurs de (u,, v,), ..., (un, vn) et en déduire des valeurs de a;, Ti et Ti, (i allant de 1 à n) pour chaque histogramme de déclin d'intensité (étape 400), et le cas échéant réaliser l'image de temps de vie de fluorescence correspondante 410. De manière optionnelle, on réitère la mesure des temps de vie Ti et des proportions a; en appliquant la source lumineuse pulsée à plusieurs régions d'intérêt, typiquement une trentaine de régions différentes, afin de déterminer l'erreur sur les valeurs obtenues (les fluorophores restant en revanche les mêmes). Ce procédé peut également facilement être étendu pour des mesures de temps de vie de fluorescence dans le domaine fréquentiel. En effet, les systèmes d'acquisition de temps de vie de fluorescence dans le domaine fréquentiel permettent de mesurer la modulation m et le déphasage (p du déclin d'intensité en chaque pixel. Or ces deux quantités sont directement reliées aux valeurs de u et v précédemment décrites par : u(Cw)= m(cw)cos(p(cw) v(Cw) = (co) sin (p (co) Par conséquent, si on applique une première fréquence d'excitation wl, on obtient :25 ul (w1) =m~(COcos(p~(COI vl (w1) =m~(COI )sin (pi (w1) Lorsqu'on on applique une seconde fréquence d'excitation w2, on obtient : u2(wz)=m2(wz)cos(p2(w2) v2(wz)=m2(w2)sin p2(w2) De préférence, la source lumineuse est un laser continu dont la l'intensité à modulée aux fréquences wi et w2. En variante, la source 10 lumineuse peut également être pulsée. A partir de ces valeurs de ui, vi, u2 et v2, connaissant la modulation m et le déphasage cp en chaque pixel, on peut en déduire a,, tiI, i2 grâces aux équations définies plus haut pour les proportions a; et les temps de vie Ti. 15 La connaissance des paramètres (temps de vie Ti et proportions a;) du déclin d'intensité de fluorescence des fluorophores permet alors d'étudier des transferts d'énergie intermoléculaires (étapes 600 à 800). En effet, lorsque deux molécules fluorescentes interagissent, il s'effectue un transfert d'énergie de l'une des molécules, dite « donneur », 20 vers l'autre des molécules, dite « accepteur ». Le principe sur lequel repose le procédé est que la durée de vie d'un fluorophore dépend alors, entre autres, de l'efficacité du processus de FRET et donc de l'énergie transférée entre les deux molécules. Par conséquent, plus le transfert d'énergie entre le donneur et l'accepteur est efficace, plus le 25 déclin d'intensité de fluorescence du donneur (respectivement de l'accepteur) est rapide (respectivement lent). Une comparaison des déclins d'intensité du donneur et/ou de l'accepteur engagés dans un FRET avec leur déclin d'intensité respectif lorsqu'ils sont « libres », c'est-à-dire seuls ou sans5 qu'il y ait eu de transfert d'énergie, permet donc de déterminer si un processus de FRET a eu lieu et de le quantifier. Pour cela, on détermine en premier lieu les temps de vie respectifs des fluorophores donneurs et/ou accepteurs que l'on souhaite tester. Les temps de vie peuvent être déterminés selon le procédé décrit précédemment (étapes 100 à 500), ou selon tout autre procédé conventionnel, Il est possible ici de mettre en oeuvre à la fois un donneur et un accepteur fluorescent. Néanmoins, selon une forme de réalisation préférée, seul le déclin d'intensité du donneur est examiné ici, le caractère fluorescent de l'accepteur n'étant utilisé que pour vérifier sa présence. Les fluorophores peuvent être intrinsèques ou extrinsèques. On met ensuite en présence les fluorophores donneurs et accepteurs, et on leur applique le procédé de l'invention (application d'un flux de lumière pulsée, détection des photons et obtention des séries d'histogrammes de déclin d'intensité de fluorescence en chaque pixel pour n fréquences d'excitation wn différentes, lorsque les fluorophores sont caractérisés par n exponentielles) afin d'obtenir les paramètres de leur déclin d'intensité (étape 600). Avantageusement, les fluorophores donneur et accepteur émettent 20 dans des gammes de longueur d'onde différentes afin de permettre le transfert d'énergie. On compare alors (étape 700), pour le fluorophore donneur et/ou le fluorophore accepteur, les temps de vie respectifs des histogrammes de déclin ainsi obtenus en chaque pixel avec les temps de vie correspondant de 25 leurs histogrammes de déclins lorsqu'ils sont libres. Afin que la comparaison soit significative, on conserve de préférence les mêmes conditions ambiantes (température, concentration des fluorophores, pH, puissance d'excitation faible, etc.) lors de la mesure des temps de vie des déclins d'intensité des fluorophores engagés dans un 30 processus de FRET que lorsqu'on les a mesurés alors qu'ils étaient libres. Ces conditions influencent en effet la valeur obtenue pour les temps de vie. Si les temps de vie sont identiques, et ce même en réitérant les mesures avec plusieurs régions d'intérêt différentes, on peut alors en déduire une absence de processus de FRET (étape 800). En revanche, si les temps de vie diffèrent, on peut en déduire qu'il y a eu un transfert d'énergie du donneur vers l'accepteur. On peut alors retrouver, à partir des temps de vie déterminés selon le procédé, l'efficacité du processus de FRET selon toute technique conventionnelle (étape 800). En variante, l'un seulement parmi le donneur et l'accepteur est fluorescent. Il s'agit alors de préférence du donneur, de manière à simplifier le traitement ultérieur des résultats obtenus. Le procédé s'applique alors mutatis mutandis en ne comparant que les temps de vie du déclin de fluorescence du donneur libre avec celui du donneur engagé dans le FRET. Enfin, on notera que le procédé de détermination des temps de vie (i,, ti2, ..., tin) d'un déclin d'intensité de fluorescence à n exponentielles d'un fluorophore et le procédé d'analyse d'un transfert d'énergie (FRET) entre deux molécules peuvent être mis en oeuvre sur une installation 1 comprenant un laser 10, adapté pour appliquer une lumière pulsée 12 à une région d'intérêt R comprenant des fluorophores, et un système 20 comprenant un détecteur 22 adapté pour détecter les photons P émis par les fluorophores et un ordinateur 28, comprenant des instructions de code de programme pour l'exécution du procédé selon l'invention. Le système 22 peut en outre comprendre des filtres 24 afin de réduire le bruit, et/ou sélectionner la gamme de longueurs d'ondes correspondant au spectre d'émission des fluorophores dont on mesure les temps de vie. Par ailleurs, dans le cas d'une détection des photons selon la méthode TCSPC, le système 20 comprend en outre une carte de comptage 26. REVENDICATIONS1. Procédé de détermination des temps de vie (tiI, i2, ..., tin) d'un déclin d'intensité de luminescence à n exponentielles (n 1) d'un échantillon luminescent, le procédé comprenant les étapes consistant à : - sélectionner (100) une région d'intérêt (R) de l'échantillon luminescent, la région étant formée d'une pluralité de pixels; - exciter (200) la région d'intérêt (R) avec une source lumineuse pulsée ou dont l'intensité est modulée selon une fréquence donnée, - détecter (210) des photons (P) émis par la région d'intérêt, - déterminer les n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) dudit déclin, caractérisé en ce que, au cours du procédé, on utilise au moins n fréquences (w,, ..., wn) différentes (300) pour déterminer les n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) caractérisant le déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on réalise en outre une image des temps de vie de la région d'intérêt en chaque pixel (410). 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, dans lequel on détermine en outre (500) des proportions (a;) pour chaque déclin de l'intensité de luminescence. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la région d'intérêt présente en chaque pixel un déclin d'intensité de luminescence (In(t)) à n exponentielles défini selon la formule suivante : t t I12 (t) = + a2.e + ...+ an.e où : In(t) est le déclin d'intensité de luminescence à n exponentielles, a,, a2, ..., an sont des proportions, ettif, ti2, ..., tin sont les temps de vie du déclin d'intensité de luminescence In(t), et comprenant en outre les étapes suivantes : - mesurer (400) le déclin de l'intensité de luminescence en chaque pixel, - déterminer une transformée de Fourier (FT) du déclin d'intensité de luminescence (In(t)) ; - déterminer une partie réelle (u(w)) et une partie imaginaire (v(w)) de la transformée de Fourier (FT) ainsi obtenue ; - calculer, en chaque pixels, la valeur de la partie réelle (u(w)) et de la partie imaginaire (v(w)) de la transformée de Fourier de leur déclin de luminescence (In(t)); et - en déduire les temps de vie (tiI, ti2, .., tin) du déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel la région d'intérêt présente en chaque pixel un déclin d'intensité de luminescence (I(t)) biexponentiel défini selon la formule suivante : t t I(t)=a1.e +(1-al)e ti2 où : I(t) est le déclin d'intensité de luminescence bi-exponentiel, a, est une proportion, et i1 et ti2 sont les temps de vie du déclin d'intensité de luminescence 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la proportion a, et les temps de vie i1 et ti2 sont définis comme suit : 2n -1+e`2 (ti2(1+ti12o2))(-1+u1 +ti22u1w2) a1 = 2n -ti2(1+ti 2(4-1+u1 +ti22u1OJ2 )+e`2 (-ti1 +ti2 )( -1+ti1ti 2o2+u1 (1+ti 2w2)(1+ti22o2)) 1 1 23 (1-u1 -v1t2cw) w(V1 -u1t2w) ti2= 2 am(ui (u1 -u2)+v1 (u1 -a12u2)) ~a16(u1 _1)2 u221,12 +u; (u2 -1)(u1 -u1u2 +v, l) - 2a13u2 V u1 - a12u2 + (a12 - 11u2 v11(u1 -1)u1 + 2vI2 )/ V (a12 (u1 -1) - u111u1 - u2 ) + 1a12 -1l1,12 + 2aul /u1 - a12u2 + (a12 -1i1u2 v1 (2ui - u1(u2 + 1) + 2vi 0al2 (u1 -1) - u1)lu1 - u2) + 1a12 -1)1)12 x 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel on mesure en outre, pour chaque fréquence (wl, ..., wn), un histogramme du déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel la détection des photons (P) et la mesure de leur temps d'arrivée respectif est réalisée par comptage de photons (P) uniques corrélés dans le temps (Time Correlated Single Photon Counting, TCSPC). 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, au cours de l'étape de détection (210) : - on détermine (220), pour chaque photon détecté, son temps d'émission par la région d'intérêt (R), et on l'associe (230) à un pixel de l'image ; et - on détermine (240), à partir de la détection des photons (P) et de leur temps d'émission respectif, l'histogramme du déclin de l'intensité de luminescence en chaque pixel. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'histogramme du déclin d'intensité de luminescence est réalisé en accumulant dans un repère t1 = +a14u2((u1 -1)2u1 (u1 -u2)+(u1 -1)u1(2+5u1 -6u2)v1 +4(u1 -u2)v4) +a12u1((1-u1)u; (4u1 -2u2 -1)(u1 -u2)+u1-u2(5+3u2)+5(u1 +2u1u2))v1 +4(u2 -u1)v4) -a1u1(u2 -1)1)1- al3(ul -1)u2v1 +u1Vu1 -a12u2 + (a2 -1)1u2 V1a12(u1 -1)-u1)(u1 -u2)+1a12 -1)1,12le nombre (N) de photons (P) détectés ou le logarithme de ce nombre en fonction du temps de retard (t) de ces photons (P). 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant en outre les étapes suivantes : - mesurer, en chaque pixel et pour chaque fréquence, une modulation m et un déphasage cp du déclin d'intensité, u(Cw)= m(cw)cos(p(cw) v(Cw) = m(Cw) sin (p (Cw) - calculer, à partir des valeurs de modulation m et de déphasage cf), la valeur d'une partie réelle (u(w)) et d'une partie imaginaire (v(w)) de la transformée de Fourier du déclin de luminescence (In(t)) en chaque pixel et pour chaque fréquence, et - en déduire les temps de vie (tiI, i2, .., tin) du déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel les fréquences (tûl, ..., wn) appliquées à l'échantillon dépendent de la gamme de temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) à mesurer. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel, pour une gamme de temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) comprise entre 1 et 10 ns, les fréquences (w,, ..., wn) sont comprises entre 10 MHz et 100 MHz, de préférence entre 20 MHz et 80 MHz. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel on excite (200) la région d'intérêt avec une seule fréquence (tûl), et on détermine les n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) grâce aux n-1 autres fréquences (w2, ..., wn) en ne conservant que les photons détectés pendant la durée d'impulsions correspondant à chacune des n-1 autres fréquences (w2, ..., wn). 15. Procédé d'analyse d'un transfert d'énergie (FRET) entre un donneur et un accepteur, l'un au moins du donneur et de l'accepteur étant luminescent, comprenant les étapes consistant à : - déterminer, pour le donneur et/ou l'accepteur, les temps de vie (i,, i2, ..., tin) de son déclin d'intensité de luminescence en chaque pixel (100-400) lorsqu'il est seul ; - mettre en présence le donneur et l'accepteur (500) ; - déterminer (600) les temps de vie respectifs des déclins d'intensité de luminescence en chaque pixel du donneur et/ou de l'accepteur conformément au procédé selon l'une des revendications 1 à 14 ; et - comparer (700) les temps de vie des déclins d'intensité de luminescence du donneur et/ou de l'accepteur en chaque pixel avec les temps de vie correspondants des déclins d'intensité de luminescence déterminés suite à leur mise en présence ; et - déterminer (800) si le donneur et l'accepteur ont été engagés dans un transfert d'énergie. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on détermine en outre l'efficacité du processus de FRET à partir de la comparaison des temps de vie des déclins d'intensité (810) du donneur seul et du donneur en présence de l'accepteur. 17. Produit programme d'ordinateur comprenant des instructions de code de programme pour l'exécution des étapes du procédé selon l'une des revendications 1 à 14, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur. 18. Produit programme d'ordinateur comprenant des instructions de 30 code de programme pour l'exécution des étapes du procédé selon l'une desrevendications 15 et 16, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur. 19. Installation adaptée pour la mise en oeuvre d'un procédé de détermination des temps de vie (tiI, i2, ..., tin) d'un déclin d'intensité de luminescence à n exponentielles (n 1) d'un échantillon luminescent selon l'une des revendications 1 à 14, l'installation étant caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants : - des moyens (20) pour sélectionner une région d'intérêt (R) de l'échantillon luminescent, la région étant formée d'une pluralité de pixels - une source lumineuse (10) adaptée pour appliquer une lumière pulsée ou dont l'intensité est modulée selon une fréquence donnée à la région d'intérêt (R), - un détecteur (22) pour détecter des photons (P) émis par le fluorophore, et - des moyens (20, 28) pour déterminer, à partir du déclin de l'intensité de luminescence en chaque pixel, les n temps de vie (tiI, ti2, ..., tin) dudit déclin en chaque pixel.