Brevet FR2977811A1 — publié le 20130118

La présente invention concerne le domaine technique des matériaux adaptés pour réaliser de la synthèse supportée, et plus précisément des matériaux adaptés pour servir de support de synthèse, dans des synthétiseurs automatisés, pour des oligonucléotides ou des peptides. Les nanoparticules de taille de l'ordre de 2-100 nm, notamment, sont de plus en plus étudiées pour des applications en imagerie et en diagnostic car elles offrent une très grande surface spécifique, l'augmentation de la surface d'une sphère est proportionnelle au carré de son rayon. De plus, pour des applications in vivo, les mécanismes de diffusion dans les tissus et de pénétration dans les cellules des nanoparticules sont différents de ceux d'objets de taille plus importante qui sont rapidement éliminés par l'organisme. Pour de telles applications, il est souvent nécessaire que ces nanoparticules soient porteuses de peptides ou d'oligonucléotides. Dans ce contexte, les inventeurs de la présente demande de brevet se sont intéressés à la problématique de préparer des nanoparticules en tant que support pour réaliser de la synthèse supportée requérant des réactions en chaîne, comme c'est le cas, en particulier, pour la synthèse de peptides ou d'oligonucléotides. Il est difficile de coupler des peptides ou oligonucléotides sur des nanoparticules car ces dernières sont difficiles à culotter au fond d'un tube (par centrifugation). Leur remise en solution est aussi très délicate et peut poser des problèmes d'agrégation irréversible. De plus, les conformations (ou structures tri-dimentionnelles) que prennent les biomolécules en solution provoquent fréquemment un fort encombrement stérique autour des fonctions réactives nécessaires au greffage sur les nanoparticules. De ce fait, les rendements de couplage des biomolécules sur des objets de taille nanométrique sont faibles. Dans la littérature, les densités de greffage de biomolécules les plus élevées obtenues par des techniques de couplage sont de l'ordre de 0,01-0,05 oligonucléotides/nm2 (Y. Cheng, T. Stakenborg, P.V. Dorpe, L. Lagae, M. Wang, H. Chen, G. Borghs, Anal Chem, 83 (2011) 1307-1314). De plus, la synthèse supportée en automate n'est pas envisageable à l'heure actuelle sur des nanoparticules car cette stratégie requiert un confinement des nanoparticules dans des cellules de synthèse fermées par des filtres poreux du type frittés ou membranes poreuses ce qui pose deux problèmes majeurs. Tout d'abord, la taille minimale des pores des filtres poreux requise pour que les solvants et réactifs de synthèse puissent passer dans la cellule de synthèse sans modifier la pression du circuit dans lequel les solvants et réactifs circulent (en général de 4 à 6 bars maximum) est de 2 à 4 pm. Une taille de pore plus petite pour les filtres poreux engendre une augmentation de la pression conduisant à des débits plus faibles, à des colmatages des matériaux support en surface et donc à des synthèses de mauvaise qualité. Ensuite, il n'existe pas de filtre poreux qui soit, à la fois, résistant aux solvants organiques utilisés dans de telles synthèses (qui sont en général de l'acétonitrile, du dichlorométhane, de la pyridine, du tétrahydrofurane, ...) et qui présente des pores inférieurs au micron. Pour tenter de répondre à cette problématique, certains des inventeurs de la présente demande de brevet ont proposé de confiner les nanoparticules en les immobilisant temporairement sur des microparticules de silice. Ainsi, les inventeurs ont déjà proposé des assemblages, nommés NOM (pour Nano-on-Micro) constitués de particules de silice de taille micrométrique (2 à 4 pm) et de forme sphérique, recouvertes par une monocouche de nanoparticules qui offrent une taille globale supérieure à 4 pm, taille théoriquement compatible avec la stratégie de synthèse supportée en automate. Des synthèses de fragments d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ont été effectuées avec succès (Farre et a/.,Langmuir, 2010, 26(7), 4941-4950, C. Farre, M. Lansalot, R. Bazzi, S. Roux, C.A. Marquette, G. Catanante, L.3. Blum, N. Charvet, C. Louis, C. Chaix, Langmuir, (2010) 26(7) 4941-4950). Néanmoins, les NOM proposées ne permettent pas de surmonter certaines des difficultés. Tout d'abord, les NOM, de taille encore trop petite, ont tendance à colmater les filtres et à ne pas se remettre en suspension correctement, entre les différentes étapes de synthèse. De plus, les frottements mécaniques exercés sur les NOM, par les flux d'argon et le passage des différents réactifs et solvants utilisés lors des synthèses (qui agitent fortement les particules), entraînent le décrochage d'un grand nombre de nanoparticules, au cours de la synthèse. Il a ainsi été observé, par certains des inventeurs, une perte des nanoparticules au cours de la synthèse, ainsi qu'une mauvaise qualité des synthèses oligonucléotidiques effectuées sur les nanoparticules. La présente invention propose une solution permettant de pallier à ces inconvénients. L'invention concerne un matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente et dans lequel au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support. La Figure 1 est une représentation schématique d'un matériau selon (invention sur laquelle le support porte la référence 1, les nanoparticules la référence 2 et les pores la référence 3. Le greffage des nanoparticules au sein des pores du support les protège des frottements mécaniques résultant du passage des fluides de synthèse et des flux d'argon dans les cellules de synthèse lors des synthèses mises en oeuvre. Néanmoins, les nanoparticules restent accessibles, car bien que logées à l'intérieur des pores du support, elles restent à proximité de la surface du support, dans les pores situées en surface du support, même si certaines ont pu pénétrer plus en profondeur dans la masse du support. Les pores dits de surface sont visibles en surface du support et forment des trous ou ouvertures en surface du support. Les cavités ou canaux correspondant à de tels pores sont donc accessibles à partir de la surface du support. De manière privilégiée, le support est un verre minéral, de préférence à base de silice ou de silicate. En particulier, le support est constitué exclusivement de silice ou est constitué exclusivement d'un silicate dans lequel la silice est en mélange avec un autre ou d'autres oxydes tels B2O3 pour former des borosilicates ou AI2O3 pour former des aluminosilicates, éventuellement en mélange avec Na2O. En particulier, il est possible que le support soit à base de silice sous la forme de particules poreuses de forme et de taille hétérogènes, la taille des particules étant supérieure à 1 pm, et de préférence appartenant à la gamme allant de 5 à 200 pm. La taille des particules est définie comme leur plus grande taille et pourra être mesurée grâce à un microscope électronique à balayage ou un microscope optique. La taille des objets de forme hétérogène est définie comme la longueur du côté le plus grand de l'objet. Par exemple, une particule non sphérique ayant une longueur maximale de 10 pm, une largeur et une profondeur (hauteur) maximales de 5 pm sera caractérisée par une taille de 10 11m. Un matériau de verre à porosité contrôlée, nommé CPG (de l'anglais « Controlled Pore Glass ») et notamment décrit dans Masad J. Damha et al. dans Nucl. Acids Res. (1990)18(13),3813-3821, MH Caruthers, dans Science (1985) 18 (230), 281-285, Gelb L. D., Gubbins K. E., Characterization of porous glasses : Simulation models, adsorption isotherms, and the Brunauer-Emmet-Teller analysis method, Langmuir (1998), 14, 2097-2111 et Lit. N°DS1007ENOO Rev. B sur le site Millipore www.millipore.com peut être utilisé comme support d'immobilisation des nanoparticules. Ce matériau est d'ailleurs utilisé classiquement pour la synthèse supportée de fragments d'acides nucléiques sur automate. Il est constitué de petits cailloux poreux de silice de forme très hétérogène. La taille des pores est, par contre, contrôlée. Il est, par exemple possible d'utiliser la CPG décrite dans les documents US 346,608 et US 3,549,524, par Kdster H. et al. dans Tetrahedron (1984) 40 (1), 103-112 ou celles proposées par la société Millipore. La Figure 2 présente des photographies prises au microscope électronique à balayage à différents grossissements d'un support CPG (Fluka-CPG 3000, Réf 27732). Il peut également être envisagé que le support soit en un polymère, tel qu'en un polymère polystyrène-co-divinylbenzène ou polypropylène-co-30 divinylbenzène. Néanmoins, les supports en verre minéral et, en particulier, en CPG sont préférés, les matériaux polymères pouvant présenter des risques de gonflement et donc une moins bonne maîtrise de leur porosité. De façon avantageuse, et ce quels que soient le support et les nanoparticules utilisés, la taille minimale moyenne des ouvertures de surface formées par les pores de surface du support est au moins 3 fois égale, de préférence 5 à 30 fois égale, à la taille moyenne des nanoparticules. Il reste ainsi, au sein des pores, encore suffisamment de volume pour effectuer les synthèses supportées souhaitées. Par taille minimale moyenne des ouvertures de surface formées par les pores de surface, on entend la moyenne arithmétique de 50 mesures de la plus petite taille des ouvertures de surface correspondant aux pores qui sont visibles sur un cliché du support par microscopie électronique à balayage. La moyenne arithmétique est donc calculée à partir des mesures de la plus petite taille mesurée sur un cliché de 50 pores visibles en surface du support. La taille moyenne des nanoparticules correspond à la moyenne arithmétique de la plus grande taille ou du plus grand côté de 50 nanoparticules mesurée par microscopie électronique à transmission, préalablement étalonnée, après décrochage des dites nanoparticules du support par un traitement spécifique adapté au clivage du lien covalent formé entre le support et les nanoparticules comme détaillé dans la suite. Par exemple, un traitement par une solution d'ammoniaque à 1% est appliqué pour la coupure d'un lien ester. Après décrochage des nanoparticules et neutralisation de l'ammoniaque résiduelle par un acide, par exemple une solution d'acide acétique, quelques microlitres (typiquement 1 à 5 pL) de solution de nanoparticules sont déposés et laissées séchés à l'air libre sur une grille adaptée à l'observation en microscopie électronique par transmission (par exemple, une grille de cuivre ou de nickel recouverte de Formvar (polyvinyl formol), de collodion (nitrate de cellulose) ou de carbone ou d'un mélange collodion-carbone). Le plus souvent, les nanoparticules utilisées sont essentiellement sphériques, c'est-à-dire que leur forme ne dévie pas de plus de 10% d'une sphère parfaite. Il est également possible que les nanoparticules soient sous la forme de nanotubes. Dans ce cas, leur plus grande taille correspond à leur longueur. De façon avantageuse, le support utilisé présente au moins une des caractéristiques suivantes ou une quelconque combinaison de ces 5 caractéristiques : -le diamètre moyen des pores du support utilisé appartient à la gamme allant de 30 à 600 nm, et de préférence à la gamme allant de 100 à 400 nm. Le diamètre moyen des pores du support est mesuré selon la méthode d'intrusion de mercure ou la technique d'adsorption d'azote selon la norme 10 ISO 15901 (Distribution des dimensions des pores et porosité des matériaux solides par porosimétrie au mercure et par adsorption de gaz), la méthode d'intrusion de mercure étant préférée. -le support présente une porosité homogène correspondant au fait qu'au moins 80% des pores ont un diamètre dont la valeur ne varie pas de 15 plus de 10% par rapport au diamètre moyen des pores. - le support présente un volume de pores par gramme de 0,5 à 2 mL/g, - le support présente une surface spécifique appartenant à la gamme allant de 5 à 80 m2/g, ce qui permet de greffer un nombre important de nanoparticules par unité de surface. 20 On entend par surface spécifique, la surface spécifique B. E. T. déterminée par adsorption d'azote conformément à la norme ASTM D 3663-78 établie à partir de la méthode BRUNAUER-EMMETT-TELLER décrite dans le périodique "The Journal of the American Chemical Society, 60, 309 (1938)" 25 Les CPG, telles que précédemment définies, sont des matériaux de choix pour présenter l'ensemble de ces caractéristiques. De façon avantageuse, les nanoparticules immobilisées par liaison covalente sur le support et au moins pour partie sur la surface des pores du support, de manière à être logées, de préférence entièrement, dans ces 30 dernières, présentent au moins une des caractéristiques suivantes ou une quelconque combinaison de ces caractéristiques : - les nanoparticules ont une taille moyenne appartenant à la gamme allant de 2 à 100 nm, - les nanoparticules sont des nanoparticules de silice, d'or, d'argent, de graphite, des nanocristaux fluorescents (également nommés quantum dots), des nanoparticules de polymère du type polystyrène, polypropylène ou polybutadiène, ou des nanoparticules d'oxyde métallique, notamment d'oxyde d'étain, de gadolinium, d'aluminium, de titane, de cérium, de niobium d'erbium, d'ytterbium, de terbium, de dysprosium, d'europium, ou d'un mélange de ces oxydes, éventuellement enrobées pour permettre leur fonctionnalisation, - au moins 80%, et de préférence au moins 90% des nanoparticules greffées sont directement liées par liaison covalente au support, c'est à dire sans nanoparticule intermédiaire assurant ladite liaison, - les nanoparticules sont fonctionnalisées par des fonctions réactives choisies parmi les alcools, les amines et les thiols permettant la croissance de peptides ou d'oligonucléotides. On entend par là que les nanoparticules sont porteuses de bras hydrocarbonés pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, notamment choisis parmi N et 0, et se terminant par une fonction -OH, NH2 ou SH respectivement. - les nanoparticules sont fonctionnalisées avec des molécules organiques hydrophiles libres, par exemple choisies parmi le polyéthylène glycol, le polyéthylamine, ... ou par des molécules organiques fluorescentes telles que la fluorescéine, la rhodamine, les cyanines, - les nanoparticules sont fonctionnalisées, par liaison covalente, avec des ligands biologiques choisis parmi les peptides et les oligonucléotides. Selon un mode de réalisation particulier, le matériau selon l'invention comporte une densité importante de ligands biologiques greffés en surface des nanoparticules correspondant à plus de 0,1 molécule de ligand biologique par nm2 de nanoparticules. Mais certaines applications peuvent nécessiter un taux de greffage moins élevé. Dans ce cas, le taux de greffage pourra être moins important, par exemple en diminuant les rendements d'incorporation du premier monomère peptidique ou nucléotidique, lors de la synthèse de la biomolécule. Compte tenu du fait que les nanoparticules lors de la croissance des ligands biologiques sont fixées sur un support, les nanoparticules porteuses de ligands biologiques obtenues sont, le plus souvent, dissymétriques, de sorte qu'au moins 90°h des ligands biologiques sont greffés sur une zone continue représentant moins de 70% de la surface de la nanoparticule sur laquelle ils sont greffés. De manière préférée, les matériaux selon l'invention combineront les caractéristiques mentionnées ci-dessous ou dans le reste de la description pour le support et celles mentionnées ci-dessous ou dans le reste de la description pour les nanoparticules. Selon des modes de réalisation préférés pouvant être combinés aux précédents, les nanoparticules sont greffées sur le support par un lien clivable dans des conditions douces, par exemple par un lien ester, un lien alkoxysilyl, un pont disulfure, le lien acide 4-(2-hydroxyéthyl)-3- nitrobenzoïque, le lien acide N-[9-(hydroxyméthyl)-2-fluorényl]succinamique, le lien thiophosphoramidatehydroxypropyl ou un lien amide activé par un groupement 2-propane diol. De tels liens sont stables dans les conditions mises en oeuvre par la suite lors de synthèses supportées d'oligonucléotides ou de peptides notamment et pourront être clivés ensuite dans des conditions douces, c'est-à-dire dans des conditions qui n'altéreront pas les molécules greffées en surface des nanoparticules et ne couperont pas les liaisons covalentes existant entre ces dernières et les nanoparticules. Les molécules d'intérêt et notamment les ligands biologiques sont greffés aux nanoparticules par un lien covalent résultant du couplage du premier nucléoside phosphoramidite dans le cas de la synthèse oligonucléotidique sur les fonctions réactives présentes en surface des nanoparticules, et notamment du type amine, thiol ou alcool. Le lien covalent résultant de ce couplage correspond à un phophoramidate diester ou un phosphorothioate diester ou un phosphate diester. Ce couplage covalent entre les nanoparticules et les molécules qui y sont greffées (et en particulier les ligands biologiques) ne met pas en oeuvre le même type de liaison que celles utilisées pour lier les nanoparticules au support. En particulier, le greffage des nanoparticules sur le support notamment du type CPG peut être effectué via un lien ester qui est clivable en milieu basique. Pour cela, les nanoparticules seront fonctionnalisées par des bras alcool avec une fonction hydroxylterminal et le support avec des fonctions acides. En particulier, dans le cadre de l'invention, la liaison covalente entre les nanoparticules et le support pourra être obtenue par couplage entre un bras avec une fonction terminale acide, situé sur le support, choisi parmi :-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m-COOH, -(CH2)n-COOH, -(CH2)n-NH-(CH2)m-COOH, avec n un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 18 et m un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 6, et un bras avec une fonction terminale alcool, situé sur les nanoparticules, choisi parmi : -(CH2)q-NH-CO-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)s-OH, -(CH2)q-0-[(CH2)2-0]p-H et -(CH2)q-CONH-(CH2)r-OH, - (CH2)q-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)q-CHOH-CH2-NH-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH2OH)]-NH-(CH2)p-OH , - (CH2)q-CHOHCH2-O-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH2OH)]-0-(CH2)p-OH, -(CH2)q-CHOHCH2-O-CO-NH-(CH2)p-OH avec s un entier appartenant à l'intervalle allant 2 à 18, p un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 6, q un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12, et r un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12. Etant donné que les bras présents sur les nanoparticules ne réagissent pas tous avec les bras présents sur le support pour former un lien ester, il reste en surface des nanoparticules des bras libres qui pourront réagir avec les monomères peptidiques ou oligonucléotidiques utilisés ensuite pour réaliser des synthèses peptidiques et oligonucléotidiques. D'autres types de liens clivables dans des conditions douces peuvent également être envisagés : - un lien alkoxysiiyl résultant de la réaction d'un bras alcool sur des 30 fonctions OH présentes en surface du support (notamment des silanols dans le cas des CPG) et qui se coupent dans des conditions basiques (Farre, C. et al., Langmuir, 2010, 26(7), 4941-4950), - un lien oxalyl résultant de la réaction de l'acide oxalique et d'un bras alcool et qui se coupe en milieu basique (Pon, R. et Yu S., Nucl. Acids Res., 1997, 25, 18, 3629- 3635), - un pont disulfure ou encore lien disulfide résultant de la réaction de 5 deux fonctions thiol et qui se coupe en milieu réducteur (DTT) (Asseline, U. et al., Tetrahedron, 1992, 48, 1233-1254.), - un lien thiophosphoramidatehydroxypropyl résultant d'une réaction entre une fonction amine et un groupement hydroxypropylphosphoramidite suivie d'une oxydation du phosphite formé par un soufre et qui se coupe à 10 90°C dans des conditions neutres (Grajkowski, A. et al.,Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 1696-1706), - un lien amide activée par un groupement 2-propane diol qui se coupe dans des conditions basiques (Réf: Azhayev, A. V. et al., Tetrahedron, 2001, 57, 4977-4986). 15 Pour la modification et la fonctionnalisation des supports, on pourra se référer à Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Editors : S. L. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, R. A. Jones, John Wiley & Sons, Inc., 2004. Pour la synthèse de nanoparticules de silice, on pourra se référer à l'article de Zou H., Wu S. and Shen J., Polymer/silica nanocomposites : 20 preparation, characterization, properties and applications, Chem. Rev. (2008), 108(9), 3893-3957 et au livre de Bergna, H.,E. et Roberts, W.O., Colloidal silica fundamentals and applications, Surfactant Science Series, Vol. 131, Taylor & Francis, CRC Press Book, 2006. Pour la modification et la fonctionnalisation des nanoparticules de silice, on pourra se référer aux 25 revues de Oh, S. J., Hong, B. J., Choi, K. Y. and Park J. W. Surface modification for DNA and protein microarrays, OMICS, A journal of Integrative Biology, 2006, 10, 327; Trewyn, B. G., Slowing, I. I., Giri, S., Chen, H.-T., Lin, V. S.-Y. synthesis and functionalization of a mesoporous silica nanoparticle based on the sol-gel process and applications in controlled 30 release, Acc. Chem. Res., 2007, 40, 846-853 ; et pour la fonctionnalisation de particules de métal ou d'oxyde de métal à la revue de Neouze, M.-A., Schubert, U., Surface modification and functionalization of metal and metaloxide nanoparticles by organic ligands, Monatsh, Chem., 2008, 139, 183-195. En particulier, dans le cas où les nanoparticules sont des nanoparticules de silice, les fonctions réactives -OH utilisées ne correspondront pas aux fonctions silanols directement présentes en surface des nanoparticules de silice ou obtenues après activation par exemple par un acide ou une base, ces dernières ne permettant pas, par la suite, d'avoir des liaisons suffisamment stables avec les biomolécules d'intérêt, de type peptide ou oligonucléotides notamment. Dans le cas de la synthèse oligonucléotidique, ces fonctions silanols seront modifiées par réaction avec un groupement alcoxysilane porteur d'une fonction-OH terminale qui sera elle-même couplée à un nucléoside phosphoramidite pour former un lien phosphate diester stable. Dans le cas de la synthèse peptidique, les fonctions -OH terminales des nanoparticules seront modifiées en fonctions -NH2 par réaction d'un amino alkyl phosphoramidite C3, C6, C12 ou autres, comme commercialisés par la société Gien Research (Sterling, Virginie, USA). Ces fonctions -NH2 permettront d'amorcer la synthèse peptidique par réaction d'un acide aminé réactif pour former une liaison peptidique (-NH-CO). Certaines CPG déjà fonctionnalisées avec des fonctions acide carboxylique ou amines sont, par exemple, commercialisées par la société PureBiotech LLC (752A Lincoln Blvd.Middlesex, N] 08846). Il est, par exemple, possible d'utiliser la LCAA-CPG (Long Chain Alkylamine Controlled Pore Glass), par exemple, commercialisée par Millipore (290 Concord Road, Billerica, MA 01821), qui est classiquement utilisée en synthèse oligonucléotidique. La LCAA-CPG est fonctionnalisée avec des fonctions amine qui pourront être transformées en fonction acide carboxylique, par exemple par réaction avec de l'anhydride succinique. De façon avantageuse, le solvant utilisé lors du greffage des nanoparticules sur le support sera un solvant dans lequel les nanoparticules sont stables, c'est-à-dire non agrégées. L'utilisation d'un tel solvant permet d'obtenir un recouvrement homogène du support avec des nanoparticules individualisées. Dans le cas de nanoparticules de silice, le diméthylformamide (DMF) pourra, par exemple, être utilisé. Le greffage des nanoparticules a lieu à la fois à l'intérieur des pores et à proximité de la surface du support. Mais dans le cadre de l'invention, l'intérêt réside dans le fait qu'au moins une partie des particules est greffée de manière covalente à l'intérieur des pores de surface du support tout en restant accessible, et va ainsi être protégée par la suite, lorsque les particules seront soumises à des contraintes mécaniques, évitant ainsi leur décrochage. Avant d'utiliser le support ainsi obtenu, présentant des nanoparticules greffées de manière covalente à l'intérieur des pores de surface, il est, le plus souvent, préférable de neutraliser ou désactiver les fonctions réactives résiduelles présentes en surface du support. De telles techniques sont connues de l'homme de l'art. Par exemple, dans le cas de fonctions acides carboxyliques, celles-ci pourront être bloquées par action de la pipéridine, afin d'éviter l'amorçage de réactions parasites ultérieures à la surface du support. Après couplage entre les nanoparticules et le support, il reste des fonctions réactives libres en surface des nanoparticules qui vont pouvoir réagir, au sein d'une cellule d'un synthétiseur automatisé, avec la première brique (également nommé monomère) peptidique ou oligonucléotidique permettant la synthèse des peptides ou oligonucléotides souhaités. Le plus souvent, ces fonctions réactives qui vont permettre la fixation du ter nucléotide ou du 1er acide aminé sont les mêmes que celles ayant permis de lier de manière covalente les particules au support. Néanmoins, deux fonctions réactives différentes pourraient être prévues en surface des nanoparticules, certaines pour permettre leur greffage au support, d'autres pour le greffage ultérieur de molécules d'intérêt. Etant donné que les nanoparticules sont greffées sur le support, seulement une partie de leur surface va être accessible et va pouvoir être liée de manière covalente avec les peptides ou oligonucléotides souhaités. En général, les nanoparticules obtenues sont dissymétriques, avec au moins 90% des ligands biologiques greffés sur une zone continue représentant moins de 70% de la surface de la nanoparticule sur laquelle ils sont greffés. Le matériau selon l'invention est donc parfaitement adapté pour réaliser des synthèses supportées de peptides ou d'oligonucléotides notamment. L'intérêt principal de la synthèse supportée est qu'elle permet de greffer en surface d'un objet, des blocs fonctionnels à partir d'un support de base, suivant la demande et à façon. Un autre intérêt de la synthèse supportée est le parfait contrôle de l'orientation des biomolécules greffées. L'invention a également pour objet un procédé de croissance de peptides ou d'oligonucléotides dans lequel la croissance est réalisée sur un matériau conforme à l'invention. De façon avantageuse, une telle croissance est réalisée dans un synthétiseur automatisé dans lequel le support est confiné dans une cellule grâce à un filtre au travers duquel circulent alternativement des flux d'argon et de réactifs. Avant l'opération de croissance, il y a également des nanoparticules greffées de manière covalente, sur la surface externe du support ou à l'extérieur des pores, mais ces dernières sont, pour la plupart, éliminées après réaction dans le synthétiseur par les flux d'argon et de réactifs, seules les nanoparticules localisées à l'intérieur des pores étant conservées. Les méthodes classiques de synthèses peptidiques et oligonucléotidiques en synthétiseur automatisé pourront être mises en oeuvre. Pour plus de détails sur la synthèse automatisée d'oligonucléotides, on pourra se référer au livre Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Editors : S. L. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, R. A. Jones, John Wiley& Sons, Inc., 2004. Pour plus de détails sur la synthèse automatisée de peptides, on pourra se référer à la revue de Amblard, M., Fehrentz, 3.-A., Martinez, J., Subra, G., Methods and protocols of modern solid phase peptide synthesis, Molecular Biotechnology, 2006, 33, 239-254. Le plus souvent, une fois la croissance réalisée, la liaison covalente entre le support et les nanoparticules est clivée. Par exemple, dans le cas d'un lien ester, le clivage peut être réalisé en milieu basique, par exemple dans une solution de NH4OH 1%, à 60°C. Dans le cas des autres liens envisagés, on pourra se référer aux publications citées précédemment qui détaillent les conditions de clivage utilisables. Dans le cadre de l'invention, le terme « oligonucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléotide, on entend un composé organique consistant en une base purine ou pyrimidine liée à un ose (ribose ou deoxyribose) et à un groupe phosphate. Par nucléotide modifié, on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphotriester. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507 et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié. Le terme « peptide » signifie notamment tout enchaînement d'au moins deux acides aminés, tels que protéine, fragment de protéine, oligopeptide qui a été extrait, séparé, isolé ou synthétisé, comme un peptide obtenu par synthèse chimique ou par expression dans un organisme recombinant. Sont inclus aussi tous les peptides dans la séquence desquels un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un ou plusieurs acides aminés de la série série D, et vice-versa; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH est remplacée par une liaison NH-CO; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH est remplacée par une liaison NH-CO, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu'il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs desdites liaisons CO-NH, étant soit conservée, soit inversée par rapport aux résidus aminoacyle constituant un peptide de référence (ou immunorétroïdes) ; et tout mimotope. Dans le cadre de l'invention, il est donc possible de préparer des nanoparticules fonctionnalisées avec des peptides ou des oligonucléotides, mais également avec d'autres molécules du type molécules fluorescentes. De telles nanoparticules, de par la nature même de la nanoparticule et des éléments qu'elles pourront incorporer, peuvent servir de marqueurs ou de traceurs, dans des applications in vivo, notamment. Les nanoparticules obtenues peuvent être fluorescentes, radioactives, conductrices, magnétiques, pourront servir d'agents de contraste IRM, ... Différentes variantes peuvent être apportées à l'invention. Notamment, il est possible d'utiliser les mêmes fonctions présentes sur les nanoparticules, à la fois pour réaliser leur greffage sur le support et pour réaliser ensuite la croissance des peptides ou oligonucléotides. Il pourrait également être envisagé d'utiliser des fonctions différentes, par exemple en greffant successivement sur la surface des nanoparticules, différents blocs fonctionnels. 1.Activation de la surface du support CPG par l'acide nitrique La CPG utilisée est de la CPG 3000 (Fluka-Réf 27732). Pour la CPG 3000, le diamètre moyen des pores donnée par le fournisseur est de 300 nm 20 ± 75 nm environ, ce qui correspond à un écart-type de 25%. L'étape d'activation de la surface de CPG permet de fonctionnaliser le support CPG avec des groupements silanols (SiOH) réactifs vis-à-vis du bras qui va permettre l'accrochage des nanoparticules. 2 g de CPG 3000 sont chauffés dans 10 mL d'acide nitrique 68% à 25 100°C (montage à reflux) pendant 1h. Après retour à température ambiante, le support est filtré puis lavé à l'eau distillée jusqu'à neutralité du pH du filtrat. L'activation peut également être réalisée en milieu basique, par exemple par action d'hydroxyde de sodium aqueux. 30 2. Fonctionnalisation du support CPG par des amines primaires La CPG activée obtenue au paragraphe 1) (2 g) est mise en suspension dans 15 mL d'une solution aqueuse d'aminopropyltriéthoxysilane (APTES) à 10% (v/v) ajustée à pH 4 par de l'acide chlorhydrique. La suspension est chauffée à 70°C sous agitation rotative pendant 2h30. Après avoir enlevé le liquide surnageant, la CPG est chauffée à l'étuve à 120°C pendant 16h dans un creuset en céramique. La CPG est ensuite filtrée et lavée par de l'acétone, puis séchée à l'air libre. 3. Fonctionnalisation du support CPG par des acides carboxyliques La CPG activée obtenue au paragraphe 2) (2 g) est mise en suspension dans 15 mL d'une solution d'anhydride succinique 1M dans l'acétone avec 1% de triéthylamine (v/v). La suspension est agitée pendant 5h à température ambiante. La CPG est filtrée et lavée à l'acétone, puis séchée à l'air libre. Les fonctionnalisations obtenues aux paragraphes 1 à 3 sont schématiquement illustrées Figure 3. 4. Fonctionnalisation des nanoparticules 4.1 Synthèse d'un bras alcool De l'aminohexanol (476 mg, 4,06 mmol) et du triéthoxysilylpropylisocyanate (1 mL, 4,06 mmol) sont mis en réaction dans l'isopropanol sous atmosphère d'argon et sous agitation magnétique à température ambiante pendant 30 min. Le bras alcool triéthoxysilylpropylhexanolurée ainsi formé est utilisé sans purification. 4.2 Fonctionnalisation des nanoparticules avec le bras alcool Les nanoparticules de silice utilisées sont fournies par la société Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Ces particules sont de type coeur-couronne, le fluorophore étant incorporé dans le coeur comme décrit dans l'article de Burns pour la cyanine 5 (A. A. Burns, J. Vider, H. Ow, E. Herz, 0. Penate-Medina, M. Baumgart, S. M. Larson, U. Wiesner, M. Bradbury, Fluorescent silicananoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine, Nana Letters (2009) 9(1), 442-448). Une solution de nanoparticules de silice porteuse de fonctions Si-OH en surface de 30 à 70 nm de diamètre dans le diméthylformamide (C=10 mg de NP/mL) est mise en réaction avec 95 équivalents de silane alcool précédemment formé au paragraphe 4.1 et 5 équivalents de 1,2-bis(triéthoxysilyl)éthane en présence de triéthylamine. Le mélange réactionnel est porté à reflux à 120°C pendant 16h. Après retour à température ambiante, les nanoparticules sont purifiées par centrifugation et redispersion dans du DMF (3 fois). 5. Activation des acides carboxyliques du support CPG La CPG préparée au paragraphe 3 est mise en suspension dans l'acétonitrile anhydre en présence de 0-(benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetraméthyluroniumhexafluorophosphate (HBTU), de diméthylaminopyridine (DMAP) et de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 16h. La CPG obtenue est filtrée et lavée au DMF. 6. Greffage des nanoparticules sur le support CPG La CPG obtenue au paragraphe 5 est mise en suspension dans du DMF anhydre puis la solution de nanoparticules obtenue au paragraphe 5.2 est ajoutée goutte à goutte. La suspension est agitée à température ambiante pendant 16h. La CPG obtenue est filtrée puis lavée au DMF et à l'acétonitrile et séchée à l'air libre. L'ensemble du procédé mis en oeuvre est illustré Figure 4. Les acides carboxyliques activés par le mélange HBTU/DMAP qui n'ont pas réagi avec les fonctions hydroxyle des nanoparticules sont bloqués (cappés) par action de la pipéridine, afin d'éviter l'amorçage de synthèses oligonucléotidiques parasites à la surface de la CPG. La CPG est mise en suspension dans de la pipéridine et le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant plusieurs jours. 7. Exemple de synthèse d'un oligodésoxyribonucléotide 23mer sur le support nanoparticules- CPG obtenu au paragraphe 6 30 mg de support nanoparticules-CPG sont introduits dans une colonne de synthèse installée sur un synthétiseur automatisé ABI 394 5 (AppliedBiosystems). La séquence de l'oligodésoxyribonucléotide est : 5'- ATC TCG GGA ATC TCA ATG TTA GT -3' La synthèse de l'oligodésoxyribonucléotide est effectuée avec le programme standard 1pM en utilisant les phosphoramidites iPr-Pac-dG, Ac- 10 dC, Pac-dA et dT (Gien Research). L'activateur utilisé est le tétrazole pour un temps de couplage de 60 s. Le rendement moyen de couplage par cycle est de 97,5%. La Figure 5 présente des photographies prises au microscope électronique à balayage du support CPG : (A) avant greffage des nanoparticules, (B) après greffage des nanoparticules, (C) et (D) après 15 synthèse des oligonucléotides sur les nanoparticules. La localisation des nanoparticules au sein des pores du support est bien mise en évidence. Avant synthèse des oligonucléotides, il y a également des nanoparticules en sur les parties externes du support (Photo B), mais ces dernières sont éliminées (photos C et D) après réaction dans le synthétiseur par les flux 20 d'argon et de réactifs, seules les nanoparticules localisées à l'intérieur des pores étant majoritairement conservées. 8. Exemple de synthèse d'un oligoribonucléotide 36mer modifié sur le support nanoparticules-CPG obtenu au paragraphe 6 25 30 mg de support nanoparticules-CPG sont introduits dans une colonne de synthèse installée sur un synthétiseur automatisé ABI 394 (AppliedBiosystems). La synthèse de l'oligoribonucléotide est effectuée avec le programme standard ARN lpM. L'étape de couplage est réalisée avec le 30 benzylthiotétrazole (Gien Research), avec un temps de couplage de 240 s. Des phosphoramidites 2'-O-méthylpurines et 2'-fluoropyrimidines sont utilisées. Le rendement moyen de couplage par cycle est de 98,9%. 9. Déprotection des oligonucléotides et décrochage des nanoparticules Les oligonucléotides obtenus au paragraphe 7 ou 8 sont déprotégés par une solution de carbonate de potassium 0,05M dans le méthanol à température ambiante pendant 6 heures minimum. Les nanoparticules sont ensuite décrochées du support par l'action d'ammoniaque 1% aqueux (500pL pour 30 mg de support) à 60°C. Après 15 à 30 minutes, les nanoparticules sont libérées en solution. La solution surnageante est alors prélevée, l'ammoniaque est neutralisée par ajout d'une solution d'acide acétique 0,05M jusqu'à obtention d'une solution neutre (pH 7). Le nombre de nanoparticules présentes dans la solution est estimé par mesure d'émission de fluorescence, les nanoparticules utilisées présentant des fluorophores (rhodamine ou fluorescéine) encapsulés dans le coeur de silice. Le nombre d'oligonucléotides à la surface de chaque particule est évalué par mesure d'absorbance UV à 260 nm. Le recouvrement est estimé entre 1000 et 5000 oligos par particule, ce qui correspond à 0.2 à 1 (si on prend en compte la moitié de la surface d'une particule de 60 nm de diamètre) oligonucléotides par nm2 de nanoparticules. Enfin, une excellente stabilité des nanoparticules porteuses d'oligonucléotides a été observée dans un tampon PBS et dans l'eau. Aucune agrégation des particules n'est observée après plusieurs semaines en suspension. La densité importante des biomolécules présentes en surface stabilise les nanoobjets obtenus en solution. De plus, les conjugués obtenus aux paragraphes 8 et 9 se sont révélés actifs pour le ciblage des cibles biologiques correspondantes (respectivement l'ADN du virus de l'hépatite B et la protéine MMP-9). REVENDICATIONS1 - Matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente caractérisé en ce qu'au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support. 2 - Matériau selon la revendication 1 caractérisé en ce que le support est un verre minéral, de préférence à base de silice ou de silicate. 3 - Matériau selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le support est constitué exclusivement de silice ou est constitué exclusivement d'un silicate dans lequel la silice est en mélange avec un autre ou d'autres oxydes tels B203 pour former des borosilicates ou AI203 pour former des aluminosilicates, éventuellement en mélange avec Na2O. 4 - Matériau selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le support est à base de silice sous la forme de particules poreuses de forme et de taille hétérogènes, la taille des particules étant supérieure à 1 pm, et de préférence appartient à la gamme allant de 5 à 200 pm. 5 - Matériau selon la revendication 1 caractérisé en ce que le support est en un polymère, en particulier en un polymère polystyrène-co-divinylbenzène ou polypropylène-co-divinylbenzène. 6 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la taille minimale moyenne des ouvertures de surface formées par les pores de surface du support est au moins 3 fois égale à la taille des nanoparticules. 7 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le diamètre moyen des pores du support appartient à la gamme allant de 30 à 600 nm, et de préférence à la gamme allant de 100 à 400 nm. 8 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le support présente une porosité homogène correspondant au fait qu'au moins 80% des pores ont un diamètre dont la valeur ne varie pas de plus de 10% par rapport au diamètre moyen des pores. 9 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que dans le support présente un volume de pores par gramme de 0,5 à 1,5 mL/g. 10 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en 5 ce que le support présente une surface spécifique appartenant à la gamme allant de 5 à 80 m2/g. 11 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules ont une taille moyenne appartenant à la gamme allant de 2 à 100 nm. 10 12 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'au moins 80%, et de préférence au moins 90% des nanoparticules greffées sont directement liées par liaison covalente au support, c'est à dire sans nanoparticule intermédiaire assurant ladite liaison. 13 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en 15 ce que les nanoparticules sont des nanoparticules de silice, d'or, d'argent, de graphite, des nanocristaux fluorescents, des nanoparticules de polymère du type polystyrène, polypropylène ou polybutadiène, ou des nanoparticules d'oxyde métallique, notamment d'oxyde d'étain, de gadolinium, d'aluminium, de titane, de cérium, de niobium d'erbium, d'ytterbium, de terbium, de 20 dysprosium, d'europium, ou d'un mélange de ces oxydes, éventuellement enrobées pour permettre leur fonctionnalisation. 14 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont fonctionnalisées par des fonctions réactives choisies parmi les alcools, les amines et les thiols permettant la croissance de 25 peptides ou d'oligonucléotides. 15 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont greffées sur le support par un lien clivable, dans des conditions n'altérant pas les ligands biologiques, par exemple par un lien ester, un lien alkoxysilyl, un pont disulfure, le lien acide 4-(2- 30 hydroxyéthyl)-3-nitrobenzoïque, le lien acide N-[9-(hydroxyméthyl)-2-fluorényl]succinamique le lien thiophosphoramidatehydroxypropyl ou un lien amide activé par un groupement 2-propane diol. 16 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la liaison covalente entre les nanoparticules et le support est obtenue par couplage entre un bras avec une fonction terminale acide, situé sur le support, choisi parmi :-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m-000H, -(CH2)n-COOH, - (CH2)n-NH-(CH2)m-COOH, avec n un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 18 et m un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 6, et un bras avec une fonction terminale alcool, situé sur les nanoparticules, choisi parmi : -(CH2)q-NH-CO-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)s-OH, -(CH2)q-O-[(CH2)2-0]p-H et -(CH2)q-CONH-(CH2)r-OH, - (CH2)q-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)q-CHOH-CH2-NH-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH2OH)]-NH-(CH2)p-OH , - (CH2)q-CHOHCH2-O-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH2OH)]-O-(CH2)p-OH, -(CH2)q-CHOHCH2-0-CO-NH-(CH2)p-OH avec s un entier appartenant à l'intervalle allant 2 à 18, p un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 6, q un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12, et r un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12. 17 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont fonctionnalisées avec des molécules organiques hydrophiles libres, par exemple choisi parmi le polyéthylène glycol et la polyéthylamine ou par des molécules organiques fluorescentes telles que la Fluorescéine, Rhodamine ou les Cyanines. 18 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont fonctionnalisées, par liaison covalente, avec des ligands biologiques choisis parmi les peptides et les oligonucléotides. 19 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la liaison covalente entre les nanoparticules et les ligands biologiques correspond à un lien peptidique ou phosphate diester. 20 - Matériau selon la revendication 18 ou 19 caractérisé en ce qu'il comporte une densité importante de ligands biologiques greffés en surface 30 des nanoparticules correspondant à plus de 0,1 molécule de ligand biologique par nm2 de nanoparticules. 21 - Matériau selon la revendication 18, 19 ou 20 caractérisé en ce que les nanoparticules sont dissymétriques, de sorte qu'au moins 90% des ligands biologiques sont greffés sur une zone continue représentant moins de 70% de la surface de la nanoparticule sur laquelle ils sont greffés. 22 - Procédé de croissance de peptides ou d'oligonucléotides caractérisé en ce que la croissance est réalisée sur un matériau conforme aux revendications 1 à 17. 23 - Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que la croissance est réalisée dans un synthétiseur automatisé dans lequel le support est confiné dans une cellule grâce à un filtre au travers duquel circulent alternativement des flux d'argon et de réactifs. 24 - Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'une fois la croissance réalisée, la liaison covalente entre le support et les nanoparticules est clivée.15