Brevet FR2962443A1 — publié le 20120113

L'invention concerne un procédé de sélection d'une population cellulaire comprenant des préadipocytes exprimant le facteur Pref-1 et son utilisation pour la réalisation d'un modèle cellulaire contenant des adipocytes, en particulier un modèle de tissu adipeux. ETAT DE LA TECHNIQUE Le tissu adipeux, dernier tissu à se développer chez l'adulte est parmi les plus abondants du corps humain. Le tissu adipeux blanc est le lieu principal de 10 stockage énergétique de l'organisme sous forme de triglycérides et sa masse peut varier de manière considérable en fonction du statut énergétique de l'organisme et dans les situations pathologiques comme l'obésité ou la cachexie ou dans le cadre du vieillissement. Cette variation est due à l'augmentation de la taille (hyperhypotrophie) et/ou du nombre des adipocytes (hyper-hypoplasie). La lipolyse et la 15 lipogenèse sont les deux mécanismes impliqués respectivement dans ces processus de libération ou d'accumulation de triglycérides par les adipocytes et sont influencés par de nombreux facteurs hormonaux, environnementaux et métaboliques. Les adipocytes ont acquis au cours de la dernière décennie le statut de 20 cellules sécrétrices, synthétisant un grand nombre de composants de la matrice extracellulaire ainsi que de molécules de nature peptidique. Parmi celles-ci, on peut citer l'adiponectine qui est une protéine de 244 acides aminés uniquement sécrétée par les adipocytes différenciés et qui constitue ainsi un des marqueurs de maturation des adipocytes signal de leur fonctionnalité. Au niveau du muscle 25 squelettique l'action essentielle de l'adiponectine semble se situer au niveau musculaire et avoir pour conséquence une diminution des taux plasmatiques d'acides gras libres et de triglycérides (J Clin Endocrinol Metab, 2003. 88(5): 2014-18). Au niveau hépatique, l'adiponectine provoque une diminution des protéines de transport des acides gras ainsi qu'une réduction du contenu hépatique 30 en triglycérides. L'adiponectine est également une hormone importante par la régulation négative qu'elle entretient au niveau de l'hématopoïèse et du système5 immunitaire (Blood, 2000. 96(5): 1723-32). Elle inhiberait la multiplication de lignées cellulaires myélomonocytaires par l'induction de phénomène d'apoptose. Ainsi, elle pourrait avoir, notamment, une action anti-inflammatoire en modulant les fonctions des cellules macrophagiques matures, par exemple en modérant leur action phagocytaire et leur production de tumor necrosis factor alpha TNFa. L'adiponectine est régulée par une voie dépendante des récepteurs PPAR y (Peroxisome proliferator-activated receptors y Diabetes, 2001. 50(9): 2094-09). L'étude de sa synthèse par les adipocytes est donc d'un grand intérêt au niveau pharmaceutique. Les pré-adipocytes, précurseurs adipocytaires, sont des cellules d'origine mésenchymateuse qui entourent les adipocytes. Ils sont contenus dans la « fraction stromale vasculaire ». La culture de la fraction stromale vasculaire a d'abord été utilisée pour étudier la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures. Plusieurs études indiquent que la fraction stromale vasculaire est une source de cellules souches multipotentes avec des potentialités pour se différencier en adipocytes matures, en chondrocytes, en myoblastes, en ostéoblastes et en cellules endothéliales dans des conditions et un environnement appropriés (Sang Thrombose Vaisseaux, 2005. 17 (2): 101-08). La différenciation des cellules adipocytaires à partir de précurseurs mésenchymateux est un processus à plusieurs étages faisant tout d'abord intervenir les adipoblastes. In vitro, après une phase de croissance exponentielle, l'adipoblaste présente un morphotype fibroblastique. A confluence, l'arrêt de la croissance cellulaire semble requis pour l'engagement des cellules vers la différenciation adipocytaire. Les adipoblastes deviennent alors des préadipocytes. Le processus de différenciation peut schématiquement être divisé entre des évènements précoces et tardifs. Cependant, à l'heure actuelle, encore peu d'informations sont disponibles concernant le contrôle de l'étape précoce de transition entre l'adipoblaste et le préadipocyte. Plusieurs facteurs transcriptionnels jouant un rôle séquentiel et coopératif dans le déroulement de la différenciation adipocytaire ont été identifiés. Ils appartiennent entre autres à la famille des PPARs (Peroxisome proliferatoractivated receptor), aux C/EBP (CAAT/ Enhancer Binding proteins) à la famille des protéines à motif HLH (hélice-boucle-hélice). D'autres facteurs interviennent dans la régulation de la différenciation adipocytaire notamment le preadipocyte factor 1 (PREF-1). Egalement appelé DLK1, PREF-1 est décrit comme un inhibiteur de la différenciation adipocytaire. C'est une protéine transmembranaire possédant six motifs «EGF like » dans la partie extracellulaire, un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique. Il existe quatre ARNm différents nommés Pref-1 A, Pref-1B, Pref-1C et Pref-1D qui sont le résultat d'épissages alternatifs pendant la transcription. Ces quatre formes de Pref-1 sont alors traduites et des modifications post traductionnelles interviennent alors pour donner naissance à quatre isoformes solubles de poids moléculaires différents. La plus importante est celle de 41 kDa. Pref-1 est uniquement exprimé dans les préadipocytes et son expression diminue au cours de la différenciation, contrairement aux facteurs de transcription C/EBPS et PPARs uniquement détectés lorsque le processus de différenciation est enclenché. Pref-1 est donc un marqueur des préadipocytes, totalement absent dans les adipocytes matures. Il a été démontré que Pref-1 inhibe la différenciation adipocytaire (Molecular mechanisms of adipocyte differentiation and inhibitory action of Pref-1. Smas CM, Sul HS. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 1997;7(4):281-98, Pref-1, a protein containing EGF-like repeats, inhibits adipocyte differentiation. Smas CM, Sul HS. Cell. 1993 May 21;73(4):725-34, Pref-1 (preadipocyte factor 1) activates the MEKlextracellular signal-regulated kinase pathway to inhibit adipocyte differentiation. Kim KA, Kim JH, Wang Y, Sul HS. Mol Cell Biot. 2007 Mar;27(6):2294-308). Les dérégulations de l'expression de Pref-1 chez l'homme ont été étudiées. Ainsi la demande de brevet (W02004063222) a décrit des ORFs (Open Reading Frames) du génome humain codant pour des polypeptides de type facteur 1 des préadipocytes, et des réactifs associés à ceux-ci, ainsi que des ligands et des antagonistes dirigés contre ces polypeptides. Cette demande décrit en outre des procédés permettant d'identifier et de produire ces molécules, de préparer des compositions pharmaceutiques les contenant, et de les utiliser pour le diagnostic, la prévention et le traitement de maladies impliquant une dérégulation de Pref-1. La différenciation adipocytaire est en outre influencée par un grand nombre d'hormones, signaux de transduction, composants de la matrice extracellulaire, l'environnement cellulaire. Physiologiquement, les différentes étapes conduisant à l'augmentation du tissu adipeux en particulier sous cutané sont la prolifération des pré-adipocytes, leur différenciation en adipocytes et la maturation des adipocytes se traduisant par le stockage accru de lipides. Toutefois, lorsque ces adipocytes ont atteint un niveau to de remplissage important de lipides, ils atteignent un seuil et ne peuvent en stocker plus. Ils induisent alors la prolifération de nouveaux pré-adipocytes pour poursuivre le stockage des lipides. Ce phénomène explique pourquoi après un régime permettant aux adipocytes matures de déstocker les lipides, une nouvelle prise de poids et le stockage de lipides peut être plus importante que la précédente, 15 et ceci après chaque régime, car le nombre d'adipocytes matures ne diminuant pas les capacités de stockage après régime sont systématiquement augmentées. Il est donc important de disposer de méthodes d'études du tissu adipeux cutané, en particulier de mammifère, et en particulier de l'être humain. Certaines des connaissances sur le tissu adipeux ont été mises à profit dans le 20 domaine de l'ingénierie cutanée et différents modèles incluant des précurseurs adipocytaires ont été développés afin d'étudier et de moduler en particulier la différenciation adipocytaire. Ces modèles sont pour la plupart réalisés à partir de cellules souches dérivés de tissus adipeux. Ceci présente l'inconvénient de nécessiter un temps long 25 de maturation adipocytaire. Les modèles d'ingénierie de tissu adipeux décrits dans l'art antérieur sont le plus souvent réalisés à partir de la fraction stromale vasculaire en particulier des cellules souches mésenchymateuses issues du tissu adipeux obtenus par lipectomie ou lipoaspiration, après élimination des adipocytes. La modulation entre la 30 prolifération et la différenciation adipocytaire est ensuite réalisée par une combinaison simultanée ou séquentielle de facteurs de croissance (SVF, EGF, FGF, PDGF, NGF, SCF...) ou de facteurs adipogéniques (insuline, transferrine, triodothyronine (T3), dexaméthasone, isobutylmethylxanthine (IBMX) et agoniste de PPARy pendant la période de culture (WO2007041869 - US6777231 - FR2843123). Il a ainsi été décrit dans les brevets FR2843123 - US6777231 la sélection de cellules souches mésenchymateuses HLA Classe 1 négatives (mesuré par cytométrie de flux) selon un procédé complexe basé sur leurs capacités d'adhésion (avant ou après 12h), la fraction adhérente avant 12 heure étant ensuite enrichie jusqu'à l'obtention d'une population quiescente exprimant le facteur de Io transcription Oct4 exprimé par les cellules souches embryonnaire de souris et humaines et pouvant s'auto-renouveler pendant 200 doublements de population. Cette population dépourvue de préadipocytes, adipocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, péricytes, mastocytes et cellules de muscle lisse peut se différencier ensuite en adipocytes mais également en ostéoblastes, myocytes, chondrocytes ou 15 cellules nerveuses selon la combinaison de milieu de proliférationldifférenciation utilisée. Plusieurs types cellulaires peuvent être obtenus conjointement. Les cellules peuvent être utilisées en monocouches pour évaluer le potentiel d'actif modulateur de l'adipogenèse, substance lipolytique ou anti-lipolytique et peuvent être utilisées pour la chirurgie cosmétique ou réparatrice, la synthèse de protéines 20 recombinantes ou la thérapie génique. Le procédé de criblage permettant d'identifier des agents susceptibles de présenter une activité lipolytique est caractérisé par 1- l'ensemencement des cellules souches dans des conditions permettant l'obtention d'adipocytes, 2- la mise en contact avec l'agent candidat, 3-l'évaluation de l'activité lipolytique. Dans le cas d'activité anti-lipolytique 25 recherchée, le même protocole est appliqué, mais c'est une activité anti-lipolytique qui est évaluée pour l'agent candidat (FR2843123). En ingénierie cutanée, les recherches actuelles ont pour but d'ajouter un hypoderme sous le derme de la peau reconstruite pour obtenir une peau reconstruite adipeuse ou d'optimiser les modèles de culture de précurseurs 30 adipocytaire et d'hypoderme. L'un des modèles décrits (WO2007/041869, J Biomaterials, 2007. 28(18):2850-2860) utilise modèle sans support biologique. Son aspect morphologique est proche du tissu adipeux sous cutané. De plus, il reproduit les principales fonctions du tissu adipeux blanc : sécrétion d'adipokines, biosynthèse de triglycérides et lipolyse induite par le récepteur 13-adrénergique. Cet hypoderme est proposé comme modèle pour des tests métaboliques in vitro ou pour la reconstruction de tissu mou autologue en chirurgie réparatrice et esthétique. Il est réalisé sur support plastique à partir de cellules stromales dérivées de tissus adipeux de lipoaspirat. La culture est réalisée dans deux différents milieux de culture le premier contenant de l'acide ascorbique entre 20 et 200µg/ml et le second contenant un stimulus adipogénique tels que l'insuline, la T3, dexaméthasone, l'IBMX, et un agoniste de PPARy (rosiglitazone ou pioglitazone). Ces deux milieux peuvent être combinés ou utilisés séquentiellement dans un ordre indifférent. Les auteurs obtiennent un feuillet dérivé de tissus adipeux de 20 à 60pm en 21-35 jours minimum avant qu'il ne soit manipulable pour être délicatement empilé manuellement afin d'obtenir une surface de 3.5 cm2. L'empilage de 3 feuillets permet d'atteindre une épaisseur allant jusqu'à 153.5i.tm après quelques jours de culture supplémentaires en présence de vitamine C pour obtenir une cohésion forte entre les feuillets; la culture totale ayant donc durée 30 jours dans cet exemple mais pouvant être prolongée jusqu'à 63 jours. Par ailleurs il est mentionné qu'un feuillet dérivé de tissu adipeux est obtenu et contient un mélange de préadipocytes et d'adipocytes avec une teneur en adipocytes comprise entre 20% et 90% et donc de préadipocytes de 80% à 10%. Néanmoins, aucune méthode permettant la mise en évidence des préadipocytes n'est décrite et seule la présence d'adipocytes est mentionnée par une coloration à l' oil red O incluant une extraction en nonidetlisopropanol et une quantification à 520nm ou la synthèse d'adiponectine et de leptine. L'adiponectine n'apparaissant qu'à 7 jours sans induction adipogénique, il est donc présumé que la teneur en préadipocytes est calculée par déduction mais cette méthode ne permet pas de déterminer la teneur relative en préadipocytes. Un modèle de peau reconstruite est réalisé en 43 jours par ensemencement de kératinocytes sur le feuillet obtenu soit par des cellules stromales uniquement différenciées ou non par le cocktail adipogénique, soit par une superposition de 2 couches dermiques sur 2 couches stromales. Le mélange de cellules stromales et dermales permet d'obtenir une partie sous épithéliale plus épaisse. Seule l'induction par le cocktail adipogénique permet la visualisation des vacuoles lipidiques. Les modèles de tissus adipeux de l'art antérieur nécessitent par ailleurs de réaliser plusieurs feuillets destinés à être empilés pour reconstituer un tissu adipeux, ce qui présente de nombreux inconvénients parmi lesquels, la nécessité de procéder à de multiples ensemencements et culture, les manipulations d'empilements, l'augmentation du risque de contamination, le manque de reproductibilité, et la difficulté d'industrialiser ou de robotiser la réalisation de tels modèles. L'inconvénient des modèles de l'art antérieur est donc le temps nécessaire à leur réalisation, la complexité et la multiplicité des étapes nécessaires, ceci impactant la qualité des tissus reconstruits ainsi obtenus. 1.5 DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention a donc pour but de résoudre les problèmes techniques mentionnés ci-dessus. En particulier, la présente invention a pour but de raccourcir 20 le temps de réalisation des modèles de tissus adipeux, de simplifier leur réalisation, d'en améliorer la qualité et la reproductibilité, d'en permettre l'industrialisation. La présente invention a donc pour but de fournir une population de préadipocytes ayant une capacité de différenciation supérieure à celle de l'art antérieur. 25 La présente invention a donc pour but de fournir un procédé de préparation de ces modèles tissulaires de manière plus rapide que ceux de l'art antérieur et/ou pour améliorer la qualité de cette population cellulaire. nventeurs ont découvert de manière particulièrement surprenante et inattendue que la sélection d'une population de préadipocytes exprimant Pref-1, 30 pourtant inhibiteur de la différenciation adipocytaire permettait d'obtenir une population d'adipocytes matures plus rapidement, réduisant ainsi la durée de la phase de différenciation et augmentant par la même la qualité des tissus ainsi obtenus. Cette observation est d'autant plus surprenante que Pref-1 est connu pour son action inverse, inhibitrice de la différentiation adipocytaire. La présente invention concerne ainsi un procédé de culture cellulaire pour 5 la préparation d'une population cellulaire comprenant des pré-adipocytes, ledit procédé comprenant : - l'isolement d'une population cellulaire contenant des pré-adipocytes, et de préférence obtenue à partir de tissu adipeux d'un être humain ; - la sélection d'une population de pré-adipocytes enrichie en préadipocytes exprimant Pref-1 ; - la prolifération de la population de pré-adipoc es ; - éventuellement la différenciation d'au moins une partie des préadipocytes en adipocytes. La présente invention porte également sur la population de préadipocytes 15 ainsi obtenues par ce procédé qui présente une capacité de différenciation supérieure à celles disponibles sur le marché notamment les cellules souches dérivées de tissu adipeux selon les techniques précédemment décrites dans l'art antérieur (Adipose-derived Stem Cells dites ADSC), comme ceci est démontré dans l'exemple 3. 20 Ce procédé selon l'invention permet de fournir un nouveau modèle de tissu adipeux, et notamment de réaliser un modèle d'hypoderme reconstruit dit « hypoderme » selon l'invention ou un modèle de tissu adipeux reconstruit dit « tissu adipeux » selon l'invention de manière plus rapide et donc également de qualité supérieure. Ce procédé rend en effet possible la réalisation de modèles 25 dépourvus des inconvénients de l'art antérieur notamment ne nécessitant pas nécessairement d'empiler plusieurs feuillets ce qui diminue le risque de contamination, augmente la reproductibilité, et permet d'envisager une industrialisation ou robotisation pour la réalisation de tels modèles. La présente invention porte ainsi sur ces modèles cellulaires et/ou 30 tissulaires. Ces modèles sont particulièrement utiles comme modèle tissulaire de test dans l'industrie cosmétique, dermatologique et/ou pharmaceutique, notamment pour le criblage de principes actifs en particulier pour détecter leurs propriétés sur les tissus adipeux. Ces modèles peuvent également constituer un support pour l'ingénierie tissulaire, la chirurgie réparatrice, reconstructrice, cosmétique, de dermatologie cosmétique, notamment pour le comblement de tissus mous, par exemple pour le comblement de rides, de perte de substance et de cicatrices. En outre, ces modèles constituent des modèles alternatifs aux tests sur animaux dans le cadre de tests de pharmacotoxicologie et/ou d'activité d'ingrédients actifs, notamment en cosmétique et pharmaceutique. Enfin ces modèles constituent des modèles d'étude particulièrement avantageux des mécanismes impliqués dans les phénomènes de lipogenèse et éventuellement dérégulés dans certaines pathologies telles que l'obésité. L'invention porte encore sur une population cellulaire essentiellement des 15 pré-adipocytes, enrichie en pré-adipocytes exprimant le marqueur Pref-1. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention porte sur un procédé de culture cellulaire pour la 20 préparation d'une population cellulaire comprenant des pré-adipocytes, ledit procédé comprenant : - l'isolement d'une population cellulaire contenant des pré-adipocytes, et de préférence obtenue à partir de tissu adipeux d'un être humain ; - la sélection d'une population de pré-adipocytes enrichie en pré- 25 adipocytes exprimant Fra-1 ; - la prolifération de la population de pré-adipocytes ; - éventuellement la différenciation d'au moins une partie des préadipocytes en adipocytes. On entend par population cellulaire contenant des pré-adipocytes, une 30 population de différents types de cellules dont au moins une partie est constituée de préadipocytes. On entend par population de pré-adipocytes enrichie en pré-adipocytes exprimant Pref- 1 une population cellulaire spécialement sélectionnée pour augmenter le nombre de pré-adipocytes exprimant le marqueur cellulaire préadipocyte factor-1 (Pref-1). Le procédé comprend ainsi la sélection d'au moins une population de pré-adipocytes exprimant Pref-1. Selon un mode préférentiel de la présente invention, l'étape d'isolement d'une population cellulaire contenant des pré-adipocytes comprend l'extraction cellulaire à partir de tissu adipeux, et de préférence par lipectomie de tissus adipeux humains ou lipoaspiration de tissus adipeux humains de préférence la fraction stromale vasculaire, puis la séparation tissulaire afin d'obtenir des cellules stromales, notamment par digestion fractionnée enzymatique, de préférence avec une collagénase. Les adipocytes et les hématies sont préférentiellement retirés. Selon l'invention, une population de pré-adipocytes enrichie en préadipocytes exprimant Pref-1 est sélectionnée. Différentes techniques classiques de séparation cellulaire connues par l'Homme de l'art peuvent être utilisées pour cette étape de sélection. On peut citer à titre d'exemple particulièrement approprié les techniques de tri cellulaire par cytométrie de flux dites CMF ou FACS, billes magnétiques ainsi que les techniques de séparation sur phase solide notamment MACS. De manière particulièrement avantageuse, les inventeurs ont en outre découvert qu'une population de pré-adipocytes exprimant Pref-1 est une population de pré-adipocytes adhérant spontanément au support de culture cellulaire. Comme démontré dans les exemples l'expression de Pref-1 est ensuite maintenue dans la population de pré-adipocytes ainsi sélectionnée. Ainsi selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'étape de sélection des pré-adipocytes comprend la mise en contact des pré-adipocytes avec un support de culture cellulaire, ladite étape de sélection comprenant la sélection des pré-adipocytes adhérents au support de culture cellulaire, de préférence après 30 minutes, et de préférence après 45 minutes, et encore de préférence après ou à environ 1 heure de culture en contact avec le support de culture cellulaire. De préférence, cette mise en contact n'est pas supérieure à 6 heures, de préférence pas supérieure à 2 heures. La population de préadipocytes peut être caractérisée par son expression du marqueur Pref-1 à l'aide des techniques classiques de mesures d'expression 5 génique et/ou protéomique. Préférentiellement, la population de pré-adipocytes enrichie en préadipocytes exprimant Pref-1 contient au moins 50% de préadipocytes exprimant Pref-1, encore préférentiellement au moins 70% et encore préférentiellement au moins 90% de préadipocytes exprimant Pref-1. Selon un mode particulièrement 10 avantageux, la population de pré-adipocytes est constituée essentiellement de préadipocytes exprimant Pref-1. Selon un mode particulièrement avantageux, la population de pré-adipocytes est constituée exclusivement de pré-adipocytes exprimant Pref-1. L'invention concerne ainsi selon un autre aspect une population cellulaire 15 comprenant essentiellement des pré-adipocytes, caractérisée en ce qu'elle est enrichie en pré-adipocytes exprimant le marqueur Pref-1. Selon l'invention, l'étape de prolifération des pré-adipocytes comprend très avantageusement l'ensemencement et la culture des pré-adipocytes en présence d'un milieu de prolifération comprenant le Fibroblast Growth Factor (FGF) ou le 20 Epidermal Growth Factor (EGF), de préférence à une concentration d'environ lOng/ml, et de préférence avec FGF, et encore de préférence avec le b-FGF. Le milieu de prolifération est aussi appelé milieu d'amplification. La culture dans le milieu de prolifération est avantageusement effectuée pendant 12 à 18 jours, préférentiellement pendant 14 et 16 jours et de manière 25 optimale pendant 14 jours, avantageusement dans le milieu de prolifération selon l'invention ci-après décrit. Il a en effet été découvert qu' à 14 jours de culture après ensemencement dans ce milieu, les préadipocytes présentent une capacité optimale de différenciation. De manière surprenante, une durée de culture plus longue ne permet pas d'améliorer cette capacité. Préférentiellement, la population cellulaire obtenue à l'issue de l'étape de prolifération contient majoritairement des préadipocytes exprimant Prefpréférentiellement au moins 90% de la population cellulaire exprime Pref- Le procédé de culture cellulaire selon l'invention est utile pour la préparation d'une population cellulaire contenant des préadipocytes exprimant Pref-1 présentant des capacités optimales de différentiation. Cette population est dite indifférenciée. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé comprend une étape de différenciation d'au moins une partie de la population de préadipocytes en adipocytes. Cette étape comprend avantageusement la culture des pré-adipocytes en présence d'un milieu de différenciation comprenant au moins l'une des substances suivantes : un sérum de veau, de préférence foetal (SVF), l'hydrocortisone, la dexaméthasone, et un activateur d'AMPc comme par exemple la 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), et de préférence un mélange comprenant un sérum de veau, de préférence foetal (SVF), l'hydrocortisone, et la dexaméthasone et éventuellement l'IBMX. Les cellules sont préférentiellement ensemencées et cultivées dans un milieu de différenciation selon l'invention ci-après décrit. La culture dans le milieu de différenciation est avantageusement effectuée pendant 3 à 20 jours, préférentiellement 4 à 10 jours et encore préférentiellement 7 jours. De manière préférentielle, le procédé comprend la culture de la population de pré-adipocytes dans le milieu de prolifération s'effectue pendant 12 à 18 jours, puis dans le milieu de différenciation s'effectue pendant 3 à 20 jours, préférentiellement 4 à 10 jours et encore préférentiellement 7 jours. Selon ce mode de réalisation, le procédé selon l'invention permet l'obtention d'une population cellulaire contenant des pré-adipocytes et des adipocytes en une teneur contrôlée. Selon un mode avantageux, la population mixte de préadipocytes et d'adipocytes contient majoritairement des adipocytes matures, préférentiellement au moins 70% d'adipocytes matures. Selon un mode de réalisation particulier selon l'invention, le procédé peut être mis en oeuvre sans support matriciel tel qu'un gel, une éponge notamment à base de collagène ou collagène, chitosan, glycosaminoglycanes (GAG) ou un quelconque réseau tridimensionnel pour supporter la culture cellulaire, et ne nécessite pas d'association intermédiaire de différentes sous parties ou feuillets du modèle afin d'obtenir l'état de différenciation et l'épaisseur désirée pour la réalisation d'un modèle tissulaire selon l'invention. Ceci permet de simplifier considérablement la réalisation des modèles et de mettre en oeuvre le procédé de manière automatisée et reproductible. . Les modèles selon l'invention incluent en particulier les cellules en monocouche, un modèle de tissu, en particulier un modèle d'hypoderme ou un 10 modèle de tissu adipeux. Selon l'invention, on entend par hypoderme un tissu obtenu par prolifération et différenciation d'au moins une partie de la population de préadipocytes selon le procédé selon l'invention, éventuellement en présence de d'autres types cellulaires, préférentiellement des fibroblastes et/ou des 15 kératinocytes et/ou des mélanocytes et/ou des cellules endothéliales et/ou des cellules dendritiques interstitielles(IDC) et/ou des cellules de Langherhans (LC) éventuellement sur support inerte. Lorsque l'hypoderme contient des fibroblastes, il est couramment dénommé « derme adipeux». Selon l'invention, on entend par modèle de tissu adipeux, un tissu 20 reconstruit 3D en feuillets ou dans un support de type éponge notamment à base de collagène, ou de collagène, chitosan, glycosaminoglycanes (GAG) dont l'un au moins comprend des adipocytes obtenus après prolifération et différenciation de préadipocytes selon le procédé selon l'invention. Préférentiellement le modèle de tissu adipeux contient ou est un hypoderme selon l'invention. Le modèle de tissu 25 adipeux est couramment dénommé « modèle de peau reconstruit adipeuse » lorsqu'il contient des fibroblastes et des kératinocytes. Un modèle de peau reconstruite adipeuse contenant des mélanocytes est couramment dénommé « modèle de peau reconstruite adipeuse pigmentée » . L'invention concerne ainsi un hypoderme comprenant une population de 30 pré-adipocytes et d' adipocytes obtenue selon le procédé de l'invention. De manière avantageuse, les adipocytes sont matures et différenciés. Selon un mode avantageux, l'hypoderme contient majoritairement des adipocytes matures, préférentiellement au moins 70% d' adipocytes matures. Le procédé selon l'invention permet l'obtention de manière surprenant d'hypoderme ayant une épaisseur plus importante que les modèles de l'art antérieur. L'hypoderme obtenu selon l'invention a une épaisseur d'au moins 70 !am, et de préférence supérieure à 100pm, et encore de préférence supérieure à 130pm, notamment obtenus en moins de 28jours à partir d'une population de préadipocytes selon l'invention. Cet avantage très significatif par rapport au modèle de l'art antérieur permet d'éviter la superposition de feuillets pour la réalisation d'un tissu adipeux, inconvénient des modèles de l'art antérieur. Cette méthode de culture aisée et automatisable permet d'obtenir un tissu adipeux ou hypoderme reconstruit après une phase de prolifération de la population de préadipocytes dans un premier milieu dit de prolifération permettant la formation d'un tissu adipeux ou hypoderme tridimensionnel indifférencié puis dans un milieu dit de différenciation permettant la transformation des préadipocytes en adipocytes. Selon un mode particulièrement avantageux, le modèle d'hypoderme peut contenir des fibroblastes. Le procédé selon l'invention rend en effet possible le coensemencement de fibroblastes et sa coculture avec la population de préadipocytes selon l'invention. Selon un mode de réalisation alternative, l'ensemencement de fibroblastes peut être réalisé sur l'hypoderme après son obtention. De manière générale, l'ensemencement des fibroblastes peut donc se faire avant, en même temps ou après celui des préadipocytes Selon un mode particulièrement avantageux, le modèle d'hypoderme peut également contenir des cellules endothéliales, des cellules dendritiques interstitielles(IDC) et/ou des cellules de Langherhans (LC), préférentiellement une population de cellules mixtes 1DCILC telle que décrit dans la demande de brevet W003/050271. Le procédé selon l'invention rend en effet possible le coensemencement de cellules endothéliales et sa coculture avec la population de préadipocytes selon l'invention. Ce mode de réalisation présente l'avantage de fournir un support cellulaire particulièrement propice à la culture de la population de préadipocytes du fait de la capacité des fibroblastes à sécréter et organiser les composants de la matrice extracellulaire. Le modèle d'hypoderme ou le modèle d'hypoderme fibroblastique peuvent être épidermisés par des kératinocytes cultivés en phase immergée pendant un temps suffisant pour permettre la couverture de l'hypoderme ou de l'hypoderme fibroblastique puis en phase émergée pendant un temps suffisant pour permettre la différenciation épidermique. Pendant la culture de la partie stromale, le milieu de prolifération adipodermique est tout d'abord utilisé puis celui de différenciation adipodermique. Lors de l'ensemencement des kératinocytes, un milieu de type milieu de green est utilisé qui est ensuite appauvri pendant la phase d'élévation à l'interface air-liquide. Avantageusement, l'invention est mise en oeuvre dans le dispositif de culture cellulaire décrit dans le brevet (FR2881434) comprenant au moins un puits de culture cellulaire destiné à recevoir des cellules avec leur milieu de culture contenant au moins une couche de matériau poreux de support des cellules, cette couche étant obtenue par déshydratation d'un gel aqueux coulé directement soit dans ledit fond du puits, soit dans le fond d'une nacelle ou insert d'une dimension adaptée pour être insérable dans le volume du puits. Ce procédé de préparation de dispositif de culture cellulaire permet de manière reproductible, sûre et fiable, de réaliser un screening de principes actifs à haut débit par une plate-forme automatisable. Le substrat de culture correspond à un gel comprenant un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide et de chitosan, éventuellement modifié, par exemple en ayant un taux d'acylation, de préférence d'acétylation, réglé en fonction de l'application envisagée, différents taux d'acétylation étant bien connus de l'homme de l'art et en particulier décrits dans le document européen (EP 0296 078). Avantageusement les modèles d'hypoderme et d'hypoderme fibroblastique, 30 éventuellement épidermalisé peuvent être réalisés dans une éponge notamment à base de collagène ou à base de collagène, chitosan, glycosaminoglycanes (GAG) en particulier comprenant en poids de la composition aqueuse: entre 60 et 90% de collagène entre 10 et 30% en poids de chitosan entre 0 et 15% de GAG Une seconde alternative décrite dans le brevet US6777231 consiste à utiliser des matrices biocompatibles composées de monomères d'acides glycolique, lactique, propyl fumarate, caprolactone, glycosaminoglycanes, protéines, polysaccharides, polydhydroxyacides, polyorthoesthers, polyanhydrides, polyphaophazènes, et d'autres polymères synthétiques biocompatibles. Ces agents pouvant être utilisés en mélange soit pour former un hydrogel réticulé soit une éponge notamment à base de collagène ou de collagène, chitosan, glycosaminoglycanes (GAG) ou un réseau de porosité comprise entre 100 et 300pm. Ces modèles sont particulièrement utilisables pour réaliser des kits de comblement pour la chirurgie en particulier humaine telle que le comblement de rides, de cicatrices ainsi que pour la greffe de tissu adipeux dans les cas de pathologies de déficiences. La fonctionnalité de l'hypoderme a été démontrée dans les exemples notamment par l'expression des marqueurs de maturation des adipocytes par exemple l'adiponectine et dans le cas d'un hypoderme fibroblastique, par la synthèse des constituants de la matrice extracellulaire. En outre, la fonctionnalité de l'hypoderme a été démontrée par sa capacité de réponse aux agents classiques amincissants notamment la caféine, en particulier via des mesures de variations d'épaisseurs et de sécrétion d'adiponectine en réponse aux agents. L'invention permet ainsi la réalisation d'un modèle fiable, économique, reproductible et de manière très rapide et automatisable. L'hypoderme selon l'invention peut être mis en oeuvre de manière automatisée, en particulier selon l'un ou plusieurs des modes de réalisation suivant : - aucun support matriciel tel qu'un gel, une éponge notamment à base de collagène ou de collagène chitosan, glycosaminoglycanes (GAG) ou un quelconque réseau tridimensionnel n'est utilisé pour supporter la culture cellulaire qui peut être réalisée dans des plaques de culture multipuits de 6 à 96 puits en phase immergée. - les préadipocytes préalablement sélectionnés et éventuellement caractérisés peuvent être ensemencés par une station automatisée ou robot - la phase de culture peut se faire en utilisant seulement 3 milieux différents séquentiellement dont le renouvellement peut être piloté par une station automatisée ou robot. - l'épaisseur totale est obtenue sans aucune autre étape comme une étape de superposition de feuillets. L'invention concerne également un modèle de tissu adipeux comprenant un hypoderme défini précédemment. De manière avantageuse, l'hypoderme, éventuellement fibroblastique et/ou épidermalisé a une épaisseur suffisante pour être utilisé seul pour réaliser un modèle de tissu adipeux sans nécessité de d'auto-assembler 3 couches ce qui était 15 inconvénient majeur des modèles de l'art antérieur. En effet, l'auto-assemblement de différentes couches complique largement le procédé de production de modèle de tissu adipeux voire les rend impossible et ne permet pas d'envisager certaines applications pharmaceutiques en particulier injection. Le modèle de tissu adipeux selon l'invention rend en revanche possible son utilisation par injection pour le 20 comblement en chirurgie. Les modèles selon l'invention trouvent de nombreuses utilisations. L'invention concerne en outre un procédé de criblage de principes actifs caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un modèle selon l'invention, préférentiellement un hypoderme ou un modèle de tissu adipeux. 25 Le procédé selon l'invention permet la réalisation d'un modèle particulièrement approprié pour le criblage de principes actifs, et permet notamment de tenir compte de la réponse des deux populations de préadipocytes et adipocytes. Il permet ainsi de fournir des principes actifs agissant sur la composante préadipocytaire et/ou adipocytaire de la peau afin de moduler le taux 30 de prolifération et de différenciation des préadipocytes, ainsi que l'état de maturité des adipocytes et par la même de sélectionner des principes actifs amincissant et/ou pour la prévention et/ou le traitement de l'obésité. De manière avantageuse, la présente invention permet l'identification de substances ayant la capacité de diminuer la prolifération et la différenciation des préadipocytes et/ou uniquement le niveau de différenciation/maturité des adipocytes chez des sujets notamment ayant une peau dont l'hypoderme est trop important, en particulier des personnes en surpoids ou obèses ou souffrant de lipodystrophies, ayant ou non des fluctuations ou perturbations hormonales, ayant ou non des problèmes de drainage en particulier lymphatique. Les modèles selon l'invention peuvent être utilisés pour cribler des principes actifs et identifier ceux qui agissent sur la composante pré-adipocytaire et/ou adipocytaire afin de moduler le taux de prolifération et/ou de différenciation des préadipocytes et/ou sur l'état de maturité des adipocytes dans le but d'augmenter ou de diminuer la masse cutanée adipeuse de l'individu. La croissance du tissu adipeux sous cutané est fonction à la fois de la prolifération des préadipocytes et de leur potentiel de maturation. Il est donc avantageux d'évaluer à la fois l'effet de substance sur la viabilité cellulaire, la prolifération cellulaire et la différenciation des préadipocytes afin d'évaluer l'effet global d'une substance. Des étapes de mesure peuvent être effectuées pendant le procédé de culture selon l'invention ou sur les modèles obtenus suite à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Selon un mode préférentiel de réalisation, le procédé de culture cellulaire comprend une ou plusieurs étapes de mesure de l'expression génique et/ou protéique de Pref-1 et/ou peut être couplée à d'autres critères d'étude notamment : - étude la viabilité cellulaire - étude de la prolifération cellulaire notamment l'épaisseur - étude de la différenciation cellulaire notamment mesure de l'épaisseur, de la taille des vacuoles et/ou de la sécrétion d'adiponectine - de l'expression des composants de la matrice extracellulaire cutanée tels que les collagènes, en particulier type I, III, V, VI, et/ou - de tous facteurs impliqués dans la lipolyse et/ou la lipogenèse. Avantageusement la méthode d'évaluation de l'expression génique est une méthode de RT-PCR, de préférence quantitative. Avantageusement la méthode d'évaluation de l'expression protéique est une méthode de western bloc, de cytométrie en flux ou d'immuno-localisation sur 5 cellules ou sur coupes histologiques. Avantageusement la qualité de l'hypoderme reconstruit est évaluée après une coloration à hématoxyline-phloxine-safran ou trichrome de Masson ou hématoxyline-éosine et permet la mesure de l'épaisseur. Avantageusement l'évaluation des vacuoles lipidiques se fait après une coloration 10 des lipides comme par exemple à l'Oil red O. Avantageusement la lipolyse est évaluée par la sécrétion de glycérol après stimulation de l'hypoderme reconstruit avec un agoniste adrénergique. Avantageusement la lipogenèse est évaluée en particulier par la mesure de sécrétion d'adiponectine par la méthode ELISA. 15 Les études de viabilité cellulaire et de prolifération cellulaire peuvent être réalisées sur les préadipocytes après leur caractérisation par l'expression des marqueurs PREF-1 par l'utilisation de méthodes bien connues de l'homme de l'art comme par exemple le comptage cellulaire manuel ou automatique, le test au MTT (3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolum) ou PNPP (paranitrophenyl 20 phosphate). Les études de prolifération sont réalisées sur des préadipocytes dans un milieu contenant des concentrations optimales ou appauvries en facteurs de prolifération mais ne contenant pas de facteurs adipogéniques. Les préadipocytes sont en phase proliférative et ne peuvent se différencier par manque de facteurs 25 adipogéniques ; par exemple la substance criblée est ainsi considérée comme étant un principe actif : - ne modulant pas la prolifération des préadipocytes si le nombre de cellules ne varie pas ou peu (±15%) du nombre de cellules non traitées par la substance criblée après le même temps d'incubation ; - augmentant la prolifération des préadipocytes si le nombre de cellules est supérieure de 15%, de préférence de 30%, au nombre de cellules non traitées par la substance criblée après le même temps d'incubation - diminuant la prolifération des préadipocytes si le nombre de cellules est inférieur de 15%, de préférence de 30%, au nombre de cellules non traitées par la substance criblée après le même temps d'incubation ; dans ce cas là, la substance criblée peut également être toxique pour les préadipocytes. La différence entre toxicité et diminution du potentiel de prolifération peut être faite par l'observation des phénomènes de nécrose ou apoptose. Les études d'expression géniques et protéiques suivantes s'entendent à nombre de cellules constant. Par augmentation de l'expression génique, on entend selon l'invention une augmentation supérieure ou égale à 20% (ou 1,2 fois), de préférence 50%, de préférence 100% (ou 2 fois) le niveau d'expression des cellules en culture sans la molécule criblée, au même temps d'incubation. Par diminution de l'expression génique, on entend selon l'invention une diminution supérieure ou égale à 20% (ou 0,8 fois), de préférence 50% (ou 0,5 fois) le niveau d'expression des cellules en culture sans la molécule criblée, au même temps d'incubation. Par augmentation de l'expression protéique, on entend selon l'invention une augmentation supérieure ou égale à 10% (ou 1,1 fois), de préférence 30% (ou 1,3 fois) le niveau d'expression des cellules en culture sans la molécule criblée, au même temps d'incubation. Par diminution de l'expression génique, on entend selon l'invention une 25 diminution supérieure ou égale à 10% (ou 0,9 fois), de préférence 30% (ou 0,7 fois) le niveau d'expression des cellules en culture sans la molécule criblée, au même temps d'incubation. Les études de différenciation peuvent être réalisées sur des préadipocytes dans un milieu contenant des concentrations optimales ou appauvries en facteurs 30 de prolifération avec ou sans facteurs adipogéniques. Les préadipocytes sont en phase proliférative et peuvent se différencier en fonction de la présence de facteurs adipogéniques ; Par exemple, la substance criblée est ainsi considérée comme étant un principe actif : - diminuant le potentiel de maturation des préadipocytes si l'expression génique et/ou protéique de Pref-1 est augmentée ; - déclenchant la maturation des préadipocytes si l'expression génique et/ou protéique de Pref-1 est diminuée. Si le déstockage lipidique des adipocytes matures peut être aisément évalué par la libération de glycérol marqué, la possibilité de dédifférenciation adipocytaire n'a jamais été clairement démontrée puisqu'il faut partir d'une to population ne contenant plus de préadipocytes ou de précurseurs mésenchymateux. I1 serait éventuellement possible d'étudier ce phénomène sur des adipocytes matures n' exprimant plus Pref-1 mais exprimant au moins un marqueur comme l'adiponectine, ceci en milieux de différenciation de préférence sans agent prolifératif et facteurs adipogéniques. Dans ce milieu, les adipocytes peuvent 15 éventuellement se dé-différencier et par exemple, la substance criblée est considérée comme étant un principe actif : - ne modulant pas la maturation des adipocytes si la différence de l'expression génique et/ou protéique de Pref-1 ne varie pas ou peu (±10%) de l'expression génique de cellules non traitée par la substance criblée pendant le 20 même temps d'incubation ; - réversant la maturation des adipocytes si l'expression génique et/ou protéique de Pref-1 est augmentée de plus de 10%, de préférence de 30%, par rapport à l'expression génique de cellules non traitées par la substance criblée pendant le même temps d'incubation. 25 Les substances ainsi sélectionnées pour leurs capacités à stimuler la prolifération des préadipocytes, leur différenciation en adipocytes et la maturation des adipocytes peuvent être utilisés comme principe actif pour la préparation d'une composition pour moduler la réactivité du tissu adipeux cutané d'un individu, en particulier pour augmenter la prolifération et la différenciation des préadipocytes 30 et/ou uniquement le niveau de différenciation/maturité des adipocytes chez des sujets notamment ayant une peau dont l'hypoderme n'est pas assez important ou ferme, tels que des êtres humains âgés ou souffrant de cachexie ou de lipodystrophies, ayant ou non des fluctuations ou perturbations hormonales. L'invention porte en outre sur l'utilisation d'un modèle selon l'invention en particulier un hypoderme ou un modèle de tissu adipeux selon l'invention, comme support pour l'ingénierie tissulaire, la chirurgie réparatrice, reconstructrice, cosmétique, de dermatologie cosmétique, notamment pour le comblement de tissus mous, par exemple pour le comblement de rides, de perte de substance et de cicatrices. La présente invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant une population de préadipocytes selon l'invention. Ladite composition comprend avantageusement un excipient pharmaceutiquement acceptable, et éventuellement d'autres substances pharmaceutiquement actives. La présente invention porte également sur un produit pharmaceutique injectable contenant une population de préadipocytes selon l'invention en suspension dans un support pharmaceutique approprié tel qu'un gel ou un liquide injectable ou autre véhicule pharmaceutique injectable. La présente invention concerne également l'utilisation d'un tel produit ou composition pour le comblement des rides et pertes de substance, la prévention et/ou la réparation des cicatrices, et/ou des lipodystrophies par injection sous cutanée ou intra musculaire. L'invention porte en outre sur l'utilisation d'un modèle selon l'invention en particulier un hypoderme ou un modèle de tissu adipeux selon l'invention comme modèle pour effectuer des tests de pharmacotoxicologie et/ou d'activité d'ingrédients actifs, notamment en cosmétique et pharmaceutique. L'invention concerne aussi un milieu pour la prolifération cellulaire de la population de préadipocytes enrichie en préadipocytes exprimant Pref-1 selon l'invention, caractérisée en ce qu'il comprend des pré- adipocytes et du FGF ou du EGF, de préférence à une concentration comprise entre 5 et 20ng/ml, préférentiellement entre 8 et 12 ng/ml. Les inventeurs ont en effet démontré que ce milieu est particulièrement avantageux pour le maintien de l'expression de Pref-1 et constitue le milieu de prolifération préférentiel (Expérience 1B Selon un mode de réalisation, la population de cellules isolées et/ou sélectionnées selon le procédé selon l'invention peut être congelée dans un milieu approprié. Un milieu particulièrement adapté à la congélation de pré-adipocytes et à la conservation de leur caractère indifférencié a été identifié et, comprend du sérum de veau foetal à plus de 50%, de préférence à plus de 75%, et de préférence à plus de 80%, et de préférence à environ 90%, en volume par rapport au volume total du milieu. Les Inventeurs ont en effet démontré qu'un tel milieu de congélation permet le maintien de l'expression de Pref-1 (expérience 2). L'invention concerne ainsi une population de préadipocytes, éventuellement enrichi en préadipocytes exprimant Pref-1 dans un milieu de congélation selon l'invention. L'invention concerne aussi un milieu pour la différentiation cellulaire de pré-adipocytes, caractérisée en ce qu'il comprend une population de préadipocytes, préférentiellement exprimant Pref-1 et du sérum de veau foetal, de préférence à une concentration comprise entre 5 et 20% en volume par rapport au volume total du milieu, de l'hydrocortisone, de la dexaméthasone, et un activateur d'AMPc comme par exemple la 3-isobutyl-l-methylxanthine (IBMX), et de préférence un mélange comprenant un sérum de veau, de préférence foetal (SVF), l'hydrocortisone, et la dexaméthasone, et éventuellement l'IBMX. Les inventeurs ont en effet démontré qu'un tel milieu de différenciation permet le maintien de l'expression de Pref-1 (expérience 3). D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. Les pourcentages de Sérum sont exprimés en volume par rapport au volume total du milieu considéré. EXEMPLES Exemple 1 : Protocole d'optimisation d'extraction et de prolifération des préadipocytes A- Extraction Le tissu adipeux (TA) sous cutané est collecté au bloc opératoire lors de chirurgie esthétique ou réparatrice, de lipectomies, de préférence de lipoaspirations. Les préadipocytes sont extraits par exemple selon la méthode de Bjômtorp ou par une méthode plus douce à la seringue : - La méthode classique de lipoaspiration, utilisée par de nombreux chirurgiens. Le prélèvement est réalisé grâce à une canule introduite sous la peau à travers de petites incisions. Elle est reliée à un puissant système d'aspiration. La pression standard d'aspiration est de 700 mmHg. Grâce à des mouvements de va et vient de la canule guidée par le chirurgien, la graisse en excès va être morcelée et aspirée. - Le tissu adipeux peut également être prélevé par une technique proche de la lipostructure de Coleman et al.. Le principe fondamental est le caractère atraumatique de la manipulation du tissu adipeux. Le prélèvement doit être fait à l'aide d'une canule d'aspiration spécifique d'un diamètre de 3 mm, d'une longueur de 15 cm, possédant une extrémité en mousse et un double orifice assez large pour permettre le passage des adipocytes. Le vide dans la seringue est crée manuellement et progressivement, afin de ne pas soumettre les adipocytes à une trop forte dépression. La réalisation de multiples tunnels lors du prélèvement permet de diminuer les risques d'hémorragies et de traumatismes. La séparation tissulaire afin d'obtenir les cellules stromales est effectuée 30 grâce à une étape de digestion fractionnée. Brièvement, le tissu adipeux est digéré dans une solution de collagénase (EC 3.4.24.3 Roche 0,18-0,22U/m1) à différentes concentration 0,2 à bug/mi sous agitation constante pendant 15 à 60 minutes afin de sélectionner les conditions optimales permettant d'obtenir le meilleur taux de croissance et de rendement d'extraction en cellules exprimant Pref-1. L'action de l'enzyme est ensuite stoppée par ajout d'une solution de DMEM supplémenté par 10% en volume de SVF. Les adipocytes flottants sont retirés. Après centrifugation, le culot est repris dans du PBS afin d'éliminer toutes traces de sérum puis est filtré à 70 p.m. Les hématies restantes sont lysées par ajout d'un tampon de lyse (NH4C1 à 8,7 g/L) pendant 10 minutes à 37°C. Une nouvelle centrifugation permet d'éliminer les résidus d'hématies des cellules de la fraction stromale vasculaire. B- Optimisation d'un milieu de prolifération permettant de conserver l'expression protéique du marqueur Pref-1 Une matrice d'expérience a été réalisée afin d'évaluer l'effet de trois facteurs de croissance différents sélectionnés d'après la littérature : l'EGF, le FGF et le VEGF, ceci à deux concentrations 0 et 10ng/ml dans un milieu de base contenant : un mélange DMEM/Ham's F12, supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, 0,4 pg/ml d'hydrocortisone, 0,12 Ul/ml d'insuline, 24,3 pg/ml (ou 18,5nM) d'adénine, 2 nM de Tri iodo thyronine, isuproprénaline (isuprel à 0,4 pg/ml) ou toxine cholérique 10nM et d'un mélange d'antibiotiques (100 Ulhnl de pénicilline, 20 pg/ml de gentamycine et 1 pg/ml de fungizone. Brièvement, les préadipocytes sont ensemencés dans des flasques à la densité d'environ 7 000 cellules par cm2. Le milieu est changé tous les trois jours jusqu'à confluence des cellules. A confluence, les cellules sont détachées à la trypsine 0,0125%/EDTA 0.005%, centrifugées à 1000 rpm, et reprises dans 10 de milieu. Les cellules sont comptées sur des cellules de Malassez. Le temps de doublement de population (PD) et le taux de croissance (TC) sont calculés. Le temps de doublement de population (PD) correspond au nombre de multiplications survenues pendant la période de culture et le taux de croissance (TC) correspond au nombre de doublements de population par jour. PD = [ln (nbre de cellules obtenues 1 nbre de cellules ensemencées)]I1n2 TC PD/ (nbre de jours de culture) Les cellules sont ensemencées dans le milieu de culture approprié et cultivées à 37°C et 5% de CO2. La culture est réalisée en triplicate durant 6 5 passages (de PO à P5) sur des précurseurs issus de trois donneurs différents. C- Caractérisation des préadipocytes par analyse Western blot du marqueur Pref-1 La sélection du milieu de prolifération a donc été effectuée en tenant 10 compte de l'expression de Pref-1 dans les préadipocytes dans ce milieu. Les critères de sélection étaient de maintenir l'expression protéique de Pref-1 obtenue au jour de l'extraction au cours des passages dans les différents milieux de prolifération testés. Brièvement, les cellules de la fraction non adhérente, adhérente 1 heure et 15 de la fraction totale ont été lavées une fois avec du tampon phosphate (PBS), et les protéines ont été extraites 30 min à 4°C dans le tampon de lyse (TBS - Tris 50 mM, NaCl 250 mM), pH 7.5, 0.1% Sodium dodecyl sulfate (SDS), 2mM dithiothreitol (DTT), en présence d'inhibiteurs de protéases. Les lysats ont été centrifugés 15 min à 13 000 g à 4°C. Les surnageants sont dilués avec du tampon 20 Laemmli en présence de beta mercaptoéthanol avant l'électrophorèse. La même quantité d'échantillon (teneur équivalent en protéines totales) est déposée pour chaque condition. Pour l'immun-détection, les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide 4-12%. Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes sont ensuite 25 saturées pendant une heure à température ambiante en tampon TBS en présence de 3% d'albumine bovine sérique (BSA). Les protéines sont enfin immunodétectées après incubation de l'anticorps primaire anti PREF-1 humain, de chèvre ou souris dilué dans une solution de TBSIBSA à 1% à 4°C toute la nuit. L' anticorps primaire a ensuite été détecté par un anticorps secondaire anti-chèvre 30 (singe) (ou anti- souris) couplé à la peroxydase en utilisant un substrat chemiluminescent ou détecté par un anticorps secondaire couplé à Alexa 488 révélé en fluorescence. L'intensité des bandes peut être évaluée par analyse d'image et rapportée à la teneur en protéines totales de l'échantillon. Un western blot anti-actin permet de normaliser les résultats. D- Résultats Les résultats démontrent que la meilleure extraction dans un temps raisonnable est une concentration réalisée en 30mn. La concentration en collagénase optimale est sélectionnée à 0,Smglml car les résultats cumulés des temps 15 et 30 mn sont les plus avantageux à cette concentration. Les résultats du Western Blot utilisant le marqueur Pref-1 présentés en figure 1 peuuettent de montrer que la fraction adhérente exprime Pref-1. D'autre part, ces résultats ont permis de confirmer le phénotype « préadipocyte » des cellules cultivées dans le milieu contenant par exemple le FGF à 10ngtml. Les résultats démontrent clairement que la fraction ayant subi une étape d'adhésion pendant 1 heure permet d'obtenir une population enrichie en préadipocytes précoces exprimant fortement Pref-1. Ce protocole incluant une étape d'adhésion permet de sélectionner les cellules pré-adipocytaires exprimant Pref-1 parmi les cellules stromales extraites. Une adhésion d'une heure est suffisante pour enrichir la population en préadipocytes exprimant Pref-1, un temps supérieur ne permet pas d'obtenir de différence significative. E- Résultats milieu d'extraction et de prolifération L'analyse mathématique a permis de mettre en évidence que : Pris isolément, le bFGF et l'EGF à 10ng/m1 exercent une forte influence 25 positive, alors que le vEGF n'entraîne pas de réponse contrairement à ce qui était attendu d'après l'art antérieur L'interaction la plus frappante est l'effet négatif qu'exerce l'EGF sur le bFGF. On pouvait imaginer que l'association de plusieurs facteurs de croissance ayant une influence positive potentialiserait l'action au lieu de 30 la diminuer, ce qui n'est pas le cas Le FGF globalement donne les meilleurs résultats de prolifération. Concernant expression du marqueur Pref-1 (figure 2), il a été démontré que le milieu contenant EGF ou FGF permet le maintient de l'expression de Pref-1. En effet, le phénotype préadipocytaire est maintenu dans les milieux contenant EGF ou FGF à 10ng/ml au moins après 5 passages. L'anticorps Pref-1 ne reconnaît aucune des protéines extraites des fibroblastes (témoin négatif), montrant ainsi sa spécificité. Exemple 2 Sélection d'un milieu de congélation des préadipocytes Io permettant de conserver leur caractère indifférencié A préconfluence, les préadipocytes sont trypsinés et la suspension cellulaire est reprise par 1 ml de milieu de congélation. 3 milieux de congélation ont été testés afin de sélectionner celui donnant la meilleure reprise cellulaire après décongélation. 15 DMSO Sérum Veau Milieu de Foetal prolifération Milieu de congélation 1 10% 10% 80% Milieu de congélation 2 10% 40% 50% Milieu de congélation 3 10% 90% 0% Tableau 3 : Composition des 3 milieux de congélation en pourcentage en volume. A la décongélation, les préadipocytes issus de deux donneurs différentes 20 sont remis en suspension dans du milieu de prolifération, et les cellules vivantes et mortes sont comptabilisées afin d'évaluer le pourcentage de viabilité cellulaire ainsi que le rendement sur 2 passages. Les cellules sont ensemencées dans 3 flasques de 25 cm2 à raison d'environ 10 000 cellules/cm2 dans le milieu de prolifération. A confluence, les cellules ont été Ir) ps i nées, le temps de doublement 25 de population (PD) et le taux de croissance (TC) sont calculés selon la formule présentée dans l'exemple 1. Les préadipocytes sont également été ensemencés dans une flasque supplémentaire pour vérifier le phénotype préadipocytaire des cellules décongelées au 3è passage en comparaison avec des préadipocytes cultivés jusqu'en P3 mais sans congélation selon le protocole décrit dans l'exemple 1. L'analyse de la morphologie cellulaire par microscopie photonique démontrent que quel que soit le milieu de congélation utilisé la morphologie et la taille des cellules ne varie pas, elles ont toutes un aspect fibroblastique de cellules préadipocytaires non différenciées. Rendement (%) Pourcentage de viabilité % de 10 % 40 % 90 % 10 % 40 % 90 % sérum (en volume) Moyenne 65,3 67,33 82,4 80,6 69,8 84,2 Ecart type 7,62 5,99 15,58 13,63 9,63 6,22 Tableau 4: Rendement et pourcentage de viabilité des cellules a la décongélation. (n=4) Quel que soit le milieu, les résultats montrent que les trois milieux de congélation testés permettent une survie satisfaisante des cellules à la décongélation puisque le pourcentage de viabilité est environ égal ou supérieur à 70%. Cependant, les meilleurs pourcentages de viabilité cellulaire sont obtenus avec le milieu qui contient 90 % en volume de sérum. L'écart type du pourcentage de viabilité avec ce milieu est le plus faible. Il donne donc les résultats les plus constants. De plus, quelque soit la souche, le passage ou le milieu, les cellules sont capables d'adhérer et de reprendre leur prolifération. Les résultats du taux de croissance des cellules après décongélation ne sont significativement pas différents d'un milieu à l'autre (test de student ; p Exemple 3 Sélection d'un milieu de différenciation des préadipocytes en adipocytes matures A partir de données bibliographiques, une stratégie expérimentale optimale permettant de quantifier l'influence des différents éléments adipogéniques ajouté au milieu de culture a été utilisée. Trois matrices d'expériences successives ont permis de sélectionner le milieu minimal permettant une bonne différenciation des préadipocytes en adipocytes matures (résultats de la deuxième matrice d'expérience), la dernière expérimentation ayant permis de sélectionner un milieu optimal. Dans chaque cas, les préadipocytes en passage 3 ont été ensemencés à une densité d'environ 40 000 celluleslcm2 dans des flasques de 25 cm2 dans les différents milieux. L'interprétation des résultats a été faite en fonction de 3 critères : le nombre et la taille des adipocytes matures, la sécrétion d'adiponectine. L'analyse mathématique a permis l'étude des facteurs séparément et en interaction deux à deux. Les facteurs adipogéniques ont été choisis parmi les facteurs connus dans la littérature pour moduler la différenciation adipogénique : le sérum de veau, l'insuline, l'hydrocortisone, la déxamethasone, les activateurs d'AMPc (IBMX, isuprel=isoprénaline). Aucun agoniste de PPARy n'a été rajouté dans le milieu. Le sérum de veau utilisé n'est pas supplémenté en ingrédients connus pour avoir un effet agoniste de PPARy (certificat fournisseur Hyclone). Le milieu de base est un milieu dérivé de la composition du milieu de green utilisé pour la culture des peaux reconstruites dont la formule a été adaptée grâce à trois matrices d'expériences successives pour induire tout d'abord une différenciation adipogénique. Composants Milieu deGreen Milieu de différenciation (MD) DMEM/ HAM F12 (1 :1 Qsp P Sérum de veau (% en volume) 10% Concentration/qualité variables IBMX (pendant 3 jours) non concentrations variables Dexaméthasone non concentrations variables Serum de veau FetalClone 11(% en 10% concentrations variables volume) Hydrocortisone 0.4µ ml concentrations variables Umuline = insuline 0,12 UlIml concentrations variables Isuprel (ou toxine choleriquelnM) 0,4 la glml concentrations variables Tri iodo thyronine 2. nM 2. nM Adenine 24,3 µg/ml non (18,5nM) Facteur de croissance (EGF ou 10 ng(ml non FGF) Acide ascorbique 50µ ml 50p g/ml Penicilline 100 UIIml 100 UIIml Streptomycine 100 pg/ml 100 il g/ml Amphotericine B lgg/ml lpg/ml Tableau 5: Milieu de green et matrice d'expérience pour e milieu de différenciation A- Première matrice d'expérience La première matrice d'expérience comporte 11 milieux qui ont été comparés au milieu de prolifération dont les quatre ingrédients suivants on été évalués à des concentrations variables par rapport au milieu de green. - Le sérum de veau foetal (SVF) : 0 ou 10 % en volume, - La déxamethasone : 25 nM ou - L'hydrocortisone : 0 ou 10 nM, - Activateurs d'AMPc : IBMX à 0,5mM ou isoprénaline (isuprel) à 0,4 gg/m . L'IBMX est ajouté pendant trois jours uniquement du fait de sa cytotoxicité reconnue, l'isoprénaline par contre peut être laissée tout au long de la culture dans le milieu de différenciation. N° experience SVF Dexaméthasone Hydrocortisone AMPc (% en volume) A 1 0 % 25 nM 0 IBMX (0,5 mM) A 2 0 % 1 p.M 10 nM Isuprel (0,4 pg/ml) A 3 10 % 1 pM 0 Isuprel (0,4 pglml) A 4 10 % 25 nM 10 nM Isuprel (0,4 pglml) A 5 10 % 1 pM 10 nM IBMX (0,5 mM) A 6 10 % 25 nM 10 nM IBMX (0,5 mM) A 7 10 % 1 pM 0 IBMX (0,5 mM) A 8 10 % 25 nM 0 Isuprel (0,4 pg/ml) A 9 0 % 1 pM 10 nM IBMX (0,5 mM) A 10 0 % 25 nM 10 nM Isuprel (0,4 p g/ml) A 11 0 % 1 pM 0 Isuprel (0,4 pg/ml) Tableau 6: Composition en ingrédients évalués dans les eux de différenciation de la première matrice d'expérience Observation en microscopie optique (figure 4) Dans le milieu de prolifération (milieu témoin), les cellules s'organisent spontanément en feuillets épais, facilement prélevables. Aucun adipocyte mature au sein de ce feuillet n'est observé en surface. La seule différence entre le milieu de prolifération et les autres milieux, outre les variables, est la présence d'adénine et d'EGF. Les préadipocytes cultivés dans un milieu sans sérum ont des difficultés à adhérer. Les adipocytes sont plus petits avec de petits lobules lipidiques. Dans les milieux avec sérum, les cellules adhèrent et se différencient. Le nombre d'adipocytes matures est compté et la répartition est faite pour chaque milieu en adipocytes moyen ou gros.15 Dosage de l'adiponectine par radioimmunoanalyse Le dosage est réalisé à l'aide d'un kit commercia Linco research) de dosage ELISA de la concentration d'antigène fixe marqué à l'iode 125. Le témoin est un milieu Green. N° exp Moyenne sur 2 souches 2, 5 A 2 , 5 A 3 4,15 A 4 3,55 A 5 5,95 A 6 7,35 A 7 5,7 A 8 0 A 9 2,9 A10 0,9 A Il 2,65 Témoin 3,15 Tableau 7 : Sécrétion d'adiponectine en fonction du milieu de différenciation (ngjmV48h). Conclusion : Sur l'ensemble des critères, le milieu doit contenir du sérum (indispensable pour tous les critères d'évaluation), de l'IBMX (indispensable pour obtenir des adipocytes moyens et gros), de l'hydrocortisone et de la déxamethasone dosée à 25 nM (indispensable pour la sécrétion maximale d'adiponectine). Ce milieu correspond au milieu 6. 15 B- Deuxième matrice d'expérience La première matrice d'expérience a permis de montrer la forte influence du sérum de veau foetal à 10% en volume et de l'IBMX à 0,5mM sur tous les critères étudiés. Cependant, l'expérience montre qu'il existe des différences selon 20 le type de sérum comme par exemple entre le sérum de veau nouveau né ou le sérum de veau foetal. De plus, la dose optimale reste à affiner pour la dexaméthasone et l'hydrocortisone.5 La seconde matrice d'expérience comporte 7 milieux qui ont été comparés au milieu de prolifération dont les trois ingrédients suivants on été évalués à des concentrations ou qualités variables par rapport au milieu de green contenant de 1'IBMX à 0,5mM. Sérum de veau nouveau né (SVNN) ou sérum de veau foetal (SVF) à 10% Hydrocortisone : 5 ou 10 nM Dexaméthasone : 0 ou 1 p.M Na experience Sérum de veau Dexaméthasone Hydrocortisone B1 SVNN 0 5 nM B 2 SVNN 1 i.tM 10 nM B 3 SVF 0 10 nM B 4 SVF 1 pM 5 nM B 5 SVNN 0 10 nM B 6 SVNN 1 p.M 5 nM B 7 SVF O 5 nlVl Tableau 8: Composition en ingrédients évalués dans les milieux de différenciation de la seconde matrice d'expérience Observation en microscopie optique Les cellules cultivées dans du milieu avec du SVNN (milieu 1, 2, 5, 6) ont un aspect fibroblastique et sont organisées en un feuillet épais. Dans les milieux avec SVF (3, 4, 7), elles ont l'aspect d'adipocytes matures avec des lobules lipidiques et restent en monocouche sans former de feuillet. N° exp Adiponectine B 3,6 B 2 4,8 7,11 B 4 9,22 B 5 1,84 B 6 1,7 B 7 1,9 Tableau 9 : Sécrétion d'adiponectine sur une souche en fonction du milieu de 20 différenciation (ng/ml/48h). Conclusions: Facteurs pris isolément : Aucun facteur pris isolément ne semble déterminant sur la sécrétion d'adiponectine. Interactions entre les variables : L'analyse statistique minutieuse permet de montrer une tendance positive de l'association du sérum de veau foetal à l'hydrocortisone et à la dexaméthasone pour augmenter la réponse. Le sérum de veau nouveau né n'a aucun effet. En résumé, le sérum de veau foetal, la dexaméthasone et l'hydrocortisone à 10 nM sont donc indispensables pour une différenciation maximale des préadipocytes en adipocytes matures. C-Troisième matrice d'expérience Dans cette dernière expérimentation, le sérum de veau foetal à été sélectionné à 10% en volume, l'hydrocortisone à 10 nM, l'IBMX à 0,5mM et la T3 à 2nM. La dexaméthasone a été re-testée entre 25 et 1000 nM et l'insuline entre 0.150 à 1,5UIlml. Le milieu suivant a été le milieu retenu pour la différenciation optimale des préadipocytes en adipocytes, c'est-à-dire un milieu contenant SVF, l'hydrocortisone, la dexaméthasone, et l'IBMX. Composants Concentrations DMEM HamF12 (1 :1) Qsp SVF (% en volume) 10 % Tri-iodo thyronine 2 nM Hydrocortisone 10 nM IBMX (pendant 3 jours) 0,5 mM Insuline 0,15 UV Dexaméthasone 500 nM Penicilline 100 UY Gentamicine 20 p. ml g/ Tableau IO : composition du leu de différenciation optimisé Exemple 4: Comparaison de synthèse d'adiponectine lors de différenciation entre une population de cellules issue de cellules souches ADSC et une population de cellules issue de préadipocytes sélectionnés selon procédé selon l'invention Protocole : La population de pré-adipocytes (PAA07085) est isolée et sélectionnée conformément à l'exemple 1. La population de cellules souches ADSC est une population classique disponible sur le marché (hADSC, Invitrogen®) Les cellules sont mises en culture dans les mêmes conditions. Le milieu de prolifération est celui décrit dans l'exemple 1 (milieu de prolifération optimisé) pendant 15 jours avant induction de la différenciation (JO) et le milieu de différenciation est le milieu optimisé décrit à l'exemple 3. La synthèse d'adiponectine est suivie par dosage colorimétrique ELISA (R&D System) et la présence d'adipocytes déterminée par Oil Red O. Résultats : 15 Tableau 11 Population Temps de mesure (en Concentrations Ecart testée jours)* d' adiponectine type (en nglm ) ADSC 0 -8.6 0.21 3 -8.5 0.41 6 25.34 6.27 8 127.33 23.43 167.43 18.75 13 257.79 29.57 228.05 28.21 17 305.64 15.05 34 336.18 4.42 PAA07085 -9.37 1.68 -2 9.28 6.11 1 -1.31 25.18 0 -2.47 5.04 3 81.13 14.08 4 115.20 5.36 5 209.16 9.94 6 236.10 9.84 7 295.46 5.63 * JO étant le moment d'induction de la différenciation Ces résultats sont présentés dans la figure 5 Conclusion : La population obtenue à partir de préadipocytes exprimant Pref 1 selon l'invention (PAA07085) est capable de synthétiser plus rapidement l'adiponectine qu'une même population obtenue à partir de cellules souches (ADSC). Par ailleurs, les cellules obtenues selon le procédé selon l'invention présentent à J14 des vacuoles plus grosses que les cellules obtenues à partir d'ADSC. Ceci signifie que la sélection de pré-adipocytes exprimant Pref-1 permet de raccourcir la durée de la phase de différenciation et de générer plus rapidement une population d'adipocytes fonctionnels et donc de meilleure qualité. Il a en outre été observé que la vitesse de prolifération est plus importante pour la population obtenue selon le procédé selon l'invention que la population issue d'ADSC qui présente un taux de croissance inférieur. Il est en effet noté qu'au même taux d'ensemencement, la population issue d'ADSC atteint la confluence à J4 vs J3 pour la population issue de pré-adipocytes selon l'invention. Exemple 5 : Mise au point d'un hypoderme selon l'invention Dans les exemples précédents de mise au point de milieu de différenciation, il a été observé que les préadipocytes pouvaient s'organiser en feuillets lorsqu'ils étaient cultivés dans certains milieux. Cependant, les conditions de préparation de l'hypoderme ont été optimisées de manière à obtenir une population cellulaire dans laquelle coexistent des préadipocytes et des adipocytes matures de façon contrôlée. Le protocole suivi utilise des préadipocytes ensemencés par exemple en passage 3 à la densité d'environ 40 000 cellulesicm2 dans des flasques de 75 cm2. Les cellules sont cultivées pendant 2, 3 ou 4 semaines dans le milieu de prolifération supplémenté en vitamine C (50 pg/ml) ainsi que 19 jours dans un milieu de différenciation composé par exemple de 10 % en volume de sérum de veau foetal (SVF), 2nM de Tri iodo thyronine, 0,15 Ul/ml d'insuline, 1 IaM de déxamethasone, 10 nM d'hydrocortisone et 0,5 mM d'IBMX et sans vitamine C. Après 3 jours de différenciation l'IBMX est retiré du milieu. Le milieu est changé tous les 3 jours. Les cellules sont observées en microscopie optique à 5 jours en milieu de différenciation. Colorations histologiques et marquages immunohistologiques Coloration HPS Les échantillons de feuillets ont été décollés puis fixés dans une solution de formol 10%. Après déshydratation, ils sont transférés dans de la paraffine 10 liquide à 60°C et inclus dans des blocs de paraffine. Des coupes de 5gm sont déparaffinées et colorées à l'hématoxyline-phloxine-safran (HPS). Coloration Oil Red O Des coupes de 71.1m ont été fixées dans de l'isopropanol puis colorées par une solution d'Oil Red O. La cryocoupe a ensuite été contre-colorée par 15 l'hématoxyline de Harris. Analyses Immunohistologiques Les feuillets ont été fixés dans une solution de formol 10% et inclus en paraffine. Des coupes de 5 um ont été déparaffinées et les sites antigéniques ont été démasqués par une enzyme spécifique à chaque type d'anticorps. Les coupes 20 ont ensuite été incubées dans une solution de PBS/NGS 3% pendant une heure. L'anticorps primaire (anti collagène I et V humain polyclonal de lapin, anticollagène humain III et VI monoclonal souris) a été déposé sur les lames une nuit à température ambiante. Des anti-IgG de lapin ou de souris couplés à la peroxydase ont été utilisés pour détecter les immunocomplexes, en utilisant le 25 diaminobenzidine comme substrat. La contre-coloration a été effectuée par l'hématoxyline de Harris. Pour les contrôles négatifs, l'anticorps primaire a été omis. Sécrétion d'adiponectine selon le protocole décrit dans l'exemple 4. Western Biot de Pref-1 selon le protocole décrit dans l'exemple 1. 30 Résultats : Les résultats montrent que quelque soit le temps de culture dans le milieu de prolifération seul, les cellules ont un aspect fibroblastique. Dès 1 semaine de culture, les cellules s'assemblent en feuillet mais à ce temps de culture le feuillet 5 est trop fin pour être prélevé facilement. I1 est observé qu'une culture pendant une durée de 14 jours en milieu de prolifération est optimale dans la mesure où un temps plus long de culture dans le milieu de prolifération ne permet pas d'obtenir de meilleurs résultats sur l'épaisseur et sur la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures. 10 Associée à une culture de 19 jours dans le milieu de différenciation, soit 33 jours au total de culture, c'est la condition qui permet d'obtenir le plus d'adipocytes matures. Par ailleurs l'apparition des adipocytes matures est très précoce puisqu'à 3 jours après le changement en milieu de différenciation, les cellules présentent de 15 petites vacuoles lipidiques qui grossissent tout au long de la culture. A 28 jours l'épaisseur totale de l'hypoderme est d'environ 70pm. En outre, la présence des composants de la matrice extracellulaire MEC, en particulier l'apparition progressive des différents types de collagène a été observée, a été mise en évidence au sein de l'hypoderme reconstruit prouvant 20 ainsi sa qualité et sa fonctionnalité. - Sécrétion d'adiponectine par les feuillets selon le temps de culture dans le milieu de prolifération et dans le milieu de différenciation ml/48h) Tableau 12 Milieu Durée de culture avant Adiponectine en nglml/48h mesure (en jours) Expérience 1 Prolifération 14 0 Différenciation 7 L9 14 8 Expérience 2 Prolifération 2 1.9 Différenciation 7 2.5 14 2.7 Expérience 3 Prolifération 28 1.9 Différenciation 7 1.9 14 2.3 Les dosages d'adiponectine, montrent que la capacité des cellules à se différencier est optimale après un temps de culture en milieu de prolifération pendant 14 jours puisqu'une durée plus longue de culture en milieu de prolifération n'a pas permis d'obtenir une sécrétion d'adiponectine supérieure pendant la différenciation. Ceci confirme donc que la durée optimale de la phase de prolifération en milieu de prolifération est de 14 jours pour obtenir une bonne différenciation. L'analyse par western Blot de Pref-1 (figure 6), montre que quel que soit le feuillet, la bande spécifique de Pref-1 est présente ainsi que dans la population initiale de préadipocytes. Les résultats du western blot ont permis de confirmer la présence de préadipocytes caractérisé par la présence de Pref-1 au sein de tous les feuillets et met en évidence que : - l'expression de la protéine Pref-1 augmente avec le temps de prolifération des cellules. Figure 6A) - l'expression de la protéine Pref-1 diminue après 16 jours de différenciation figure 6B) Exemple 6 : Etude de l'effet d'ingrédients actifs sur la prolifération cellulaire et la clonogénicité Les cellules issues de 3 souches de donneurs différents, sont ensemencées par exemple à 7 000 cellules par cm2 en plaque 6 puits. L'actif testé est un hydrolysat de kappa-carrageenan correspondant au produit commercialisé sous le nom de Slim-excessTM par BASF BEAUTY CARE SOLUTIONS FRANCE et décrit dans la demande de brevet W02009000935. L' actif est ajouté dès le premier changement de milieu de culture ce qui correspond au deuxième jour de culture. Les préadipocytes sont cultivées jusqu'à confluence soit 7 jours de culture et sont décollées à la trypsinefEDTA. Après centrifugation, les cellules sont comptées sur des cellules de Malassez et le doublement de population (PD) et le taux de croissance (TC) sont calculés (formule décrite exemple 1). Conditions moyenne Ecart- Témoin non traité 2,70 tO,33e Actif 0,2 % 1,71 0,27 Actif 1% 0,167 0,07 Tableau 13: Nombre de millions de cellules après 7 jours de culture des 5 préadipocytes en milieu de prolifération. Conditions Moyenne Ecart- type Témoin non traité 0,876 0,03 Actif 0,2 % 0,766 0,04 Actif 1% 0,190 0,10 Tableau 14 : Evaluation du taux de croissance (TC) des préadipocytes après 7 jours de prolifération des préadipocytes et évaluation du taux de croissance. Les résultats montrent que l'actif évalué (à 0,2% et à 1%) diminue significativement la prolifération des préadipocytes par rapport au témoin négatif (test de student p Exemple 8 : sélection de modulateurs de la différenciation adipocytaire par évaluation de Pref-1 en RT-PCR quantitative. L'expression de Pref-1 et de l'actine a été analysée par RT-PCR en temps 15 réel (quantitative réverse transcriptase polymerase chain reaction).. Brièvement, les préadipocytes sont cultivés pendant 24 heures en milieu de prolifération et leur différenciation est induite ou non pendant 24h au moins en milieu de différenciation. Les milieux sont éliminés, les tapis rincés et les ARN totaux sont purifiés avec le kit « SV 96Total RNA Isolation System » (Promega, 20 Charbonnières, France). Les ARN purifiés sont élués dans 100 !IL d'eau (Promega, Charbonnières, France), dosés et répartis en plaques (96 puits, 10mL d'ARN totaux à 5ng/mL). Les amorces sélectionnées pour la réalisation de ce travail sont les suivantes : Actine Sens (SEQ IDN'l ) GTGGGGCGCCCCAGGCACCA Actine Antisens (SEQ IDN°2) CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC Pref-1 Sens (SEQ IDN°3) CTGGACGATGGCCTCTATGAATG Pref-1 Antisens (SEQ IDN°4) ATCATCCACGCAGGTGCCTC 25 Tableau 11 : amorces du marqueur Pref-1 La technique de RT-PCR en temps réel est réalisée avec le kit Quanti Techt SYBR Green RT-PCR » (Qiagen, France) sur les puits contenant l'ARNm, dans un thermocycleur OPTICON, qui réalise les cycles de prolifération. La rétrotranscription (RT) s'effectue 30 minutes à 50°C, suivie de 15 minutes à 95°C pour inhiber la réverse transcriptase, activer la polymérase et dénaturer l'ADN complémentaire (ADNc) obtenu. 50 cycles de polymérisation en chaîne (PCR) sont effectués (15 secondes à 95°C, 30 secondes à 60.9°C, 30 secondes à 72°C). A chaque fin de cycle, la fluorescence, qui est proportionnelle au nombre de fragments amplifiés est lue. Le niveau d'expression est défini par le rapport d'expression de chaque gène par rapport à l'actine. Dans ce modèle, il a été démontré que Pref-1 était exprimé faiblement dans les pré-adipocytes en monocouche mais disparait après différenciation. Les principes actifs sont sélectionnés lorsque le taux d'expression est augmenté ou diminué de 20% soit un facteur de 1.2 ou 0.8 fois du taux d'expression dans le cas du témoin non traité après normalisation à l'actine. Les principes actifs stimulant l'adipogenèse sont sélectionnés lorsque le taux d'expression de Pref-1 est diminué de 20% soit un facteur de 0.8 fois du taux d'expression dans le cas du témoin non traité après normalisation à l'actine Les principes actifs diminuant l'adipogenèse sont sélectionnés lorsque le 20 taux d'expression de Pref-1 est stable ou augmenté de 20% soit un facteur de 0.8 fois du taux d'expression dans le cas du témoin non traité après normalisation à 'actine.