Brevet FR2976001A1 — publié le 20121207

La présente invention se rapporte à un modèle de cuir chevelu reconstruit, son procédé de préparation et son utilisation pour évaluer l'effet de produits topiques cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques. Le cuir chevelu reconstruit selon l'invention pourra encore être utilisé pour la préparation de greffons destinés à être transplantés sur des mammifères, plus particulièrement sur des patients humains tels que des grands brûlés. Depuis plusieurs années, des modèles de peau reconstruite plus ou moins proches de la peau humaine ont été mis au point. Comme modèles de peau reconstruite, on peut par exemple citer les modèles décrits dans les documents suivants : EP 0 285 471, EP 0 285 474, EP 0 418 035, WO 90/02796, WO 91/16010, EP 0 197 090, EP 0 020 753, FR 2 665 175, FR 2 689 904. Ces modèles permettent, d'une part, d'effectuer les études nécessaires à la meilleure compréhension du rôle de la peau tant dans le domaine mécanique que dans le domaine physiologique, et d'autre part, constituent des tests prédictifs de l'activité d'actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques ou encore des effets secondaires d'ingrédients topiques. La demanderesse a constaté que ces modèles convenaient bien pour les études concernant la peau du corps humain mais qu'ils n'étaient pas idéaux pour les études concernant une peau spécifique, le cuir chevelu. A sa connaissance, aucun modèle de cuir chevelu reconstruit n'a été proposé à ce jour. Le cuir chevelu est la partie de la peau localisée sous la chevelure, c'est-à-dire sur le crane. Chez un adulte, sa surface peut varier entre 650 à 700 cm2. Sa structure est classique mais il a plusieurs particularités importantes qui le distinguent de la peau d'autres parties du corps humain : - l'épaisseur de son épiderme est plus élevée, du fait d'un renouvellement plus rapide de ces cellules, - son stratum corneum est plus épais mais il est désorganisé, - les activités de ses follicules pileux sont les plus importantes du fait de leur importante présence (environ 200 à 300 follicules/cm2), - la production de ses glandes sébacées est intense et l'activité de ses glandes sudorales est élevée ce qui y permet une forte colonisation bactérienne et fongique. De manière générale, les modèles de peau reconstruite décrits dans les documents cités ci-dessus sont préparés à partir de fibroblastes de la papille dermique ou de la gaine conjonctive et/ou de cellules prélevées dans la gaine épithéliale externe (encore appelée ORS pour Outer Root Sheath), en raison de la facilité d'obtention de ces cellules. En effet, ces cellules sont prélevées lorsqu'on arrache un cheveu et sont capables de fabriquer un épiderme lorsqu'elles sont déposées sur un support, souvent un équivalent de derme, et cultivées dans un milieu de culture adapté. Or le tissu que l'on obtient en cultivant des cellules de la papille dermique, présente une expression de macromolécules (collagène notamment) qui ne correspond pas à celle d'un cuir chevelu in-vivo. Le tissu que l'on obtient en cultivant des cellules de l'ORS n'a pas non plus les caractéristiques d'un cuir chevelu. De plus, on n'observera pas le phénomène de desquamation normal qui se produit sur un cuir chevelu in vivo puisque les cellules de l'ORS, n'étant jamais au contact de l'air, ne desquament pas. Le modèle ainsi obtenu ne pourra ainsi pas être utilisé pour reproduire in vitro l'apparition de pellicules. Enfin, les tailles et les morphologies des épidermes et des dermes obtenus en utilisant ces différentes cellules ne seront pas les mêmes que celles d'épidermes et de dermes de cuir chevelu : dans le cas du cuir chevelu, le derme est plus épais et plus invaginé que dans le cas de la peau. De façon surprenante, la demanderesse a mis en évidence que la culture de cellules interfolliculaires du cuir chevelu permettait de mettre au point un modèle de cuir chevelu reconstruit, présentant la plupart des caractéristiques d'un cuir chevelu in-vivo. Une caractéristique de ce modèle de cuir chevelu est l'expression, dans les dernières couches supra-basales, c'est-à-dire dans les couches granuleuses de l'épiderme, de l'involucrine et de la kératine K10 (voir notamment la figure 1). Les cellules de la couche granuleuse sont situées en dessous du stratum corneum. La couche granuleuse (ou stratum granulosum) est formée de trois couches de kératinocytes aplatis, à noyau ovale et dense. L'expression tardive de l'involucrine et de la kératine K10 est retrouvée sur une coupe de cuir chevelu issu d'un prélèvement réalisé lors d'un « lifting » alors que l'on observe, dans une coupe de peau reconstruite, l'expression de ces marqueurs dans la totalité des couches supra-basales, c'est-à-dire dans des cellules de la couche du corps muqueux de Malpighi (qui constitue le stratum spinosum). Cela démontre que le modèle de cuir chevelu selon l'invention présente les spécificités d'un cuir chevelu in vivo. Ces caractéristiques permettent en particulier de distinguer un modèle de cuir chevelu obtenu selon le procédé de l'invention par rapport à des modèles de peau reconstruite classiques. Ainsi, la demanderesse a mis au point un nouveau procédé de préparation d'un équivalent de cuir chevelu. La demanderesse a isolé des cellules interfolliculaires du cuir chevelu et a eu l'idée de les utiliser pour mettre au point un équivalent de cuir chevelu. On entend par « équivalent de cuir chevelu », aussi désigné modèle de cuir chevelu ci-après, l'ensemble équivalent d'épiderme de cuir chevelu reposant sur un40 équivalent de derme de cuir chevelu. C'est une structure produite in vitro par un procédé technique. L'invention porte donc sur un procédé de préparation d'un équivalent de cuir chevelu, comprenant une étape d'ensemencement et une étape de culture des kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu sur un équivalent de derme, ledit équivalent de derme comprenant du collagène et des fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu. Les équivalents de derme, peuvent être préparés selon différents procédés, par 10 exemple tels que décrits dans les documents EP 0 418 035, WO 00/29553 ou encore EP 0 285 471 en prenant bien soin d'utiliser les fibroblastes cités ci-dessus. Comme équivalents de derme on peut citer les lattices mixtes collagène/fibroblastes, le derme préalablement désépidermisé, les membranes artificielles comme par 15 exemple les filtres de la marque Millipores, les substituts sous-cutanés à base de collagène, le plastique ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire. Préférentiellement, l'équivalent de derme selon l'invention est sous la forme de lattice de collagène ou d'éponge de collagène. 20 Le terme «lattice de collagène » est bien connu dans l'état de l'art (Bell et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.76, N°3, pp.1274-1278) et il désigne un modèle d'équivalent de derme connu et utilisé depuis des décennies. Préférentiellement, selon l'invention, on prépare la lattice selon la méthode décrite 25 par Asselineau et al., 1987 (Models in dermato., vol. III, Ed Lowe & Maibach, 1-7). Le terme « éponge de collagène » est aussi bien connu de l'homme du métier. Il désigne des biopolymères à base de collagène (un exemple : Mimedisk® commercialisé par BASF Beauty Gare). 30 Selon l'invention, le collagène peut être tout type de collagène de toute origine. A cet égard, on se référera aux différents types de collagène cités dans les revues de Van der Rest et Garonne, 1990, Biochem., vol. 72, 473-484 ou encore 1991, Faseb journal, vol.5, 2814-2823. Ainsi, selon l'invention, le collagène est choisi de 35 préférence parmi les collagènes fibrillaires de type I, III ou V. Préférentiellement, selon l'invention, on utilise du collagène d'origine animale, particulièrement du collagène d'origine bovine. Le collagène préférentiellement utilisé selon l'invention est du collagène de type I. 40 Très préférentiellement selon l'invention on utilise du collagène bovin de type I. Bien entendu selon l'invention, on peut utiliser un mélange de collagène de différents types en toute proportion et/ou de différentes origines. Préférentiellement, l'équivalent de derme est une lattice de collagène contractée et l'ensemencement en kératinocytes est réalisé, préférentiellement après 2 à 6 jours, plus préférentiellement après 3 à 5 jours, encore plus préférentiellement après 3 jours de contraction de la lattice. La contraction du gel de collagène est due, préférentiellement, à l'action des fibroblastes interfolliculaires de cuir chevelu sur le collagène. Les fibroblastes et/ou kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu sont préférentiellement isolés à partir, respectivement, de derme et d'épiderme, provenant d'un prélèvement de cuir chevelu. Dans un mode de réalisation préférentiel, on aura préalablement éliminé de ce prélèvement les kératinocytes de la gaine épithéliale externe, par exemple par épilation des cheveux sur ledit prélèvement. L'épilation des cheveux sur le prélèvement de cuir chevelu, par exemple au moyen d'une pince à épiler, se fera de manière à éliminer totalement de ce prélèvement les kératinocytes de la gaine épithéliale externe. Les kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu sont obtenus préférentiellement par les étapes suivantes : - séparation du derme de l'épiderme de cuir chevelu par traitement protéolytique d'un prélèvement de cuir chevelu et en particulier par mise en contact d'un prélèvement de cuir chevelu avec de la dispase ou de la thermolysine, - récupération de l'épiderme de cuir chevelu, - mise en contact de l'épiderme de cuir chevelu ainsi obtenu avec de la trypsine, - récupération des kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu et - culture des kératinocytes ainsi obtenus. Les kératinocytes sont amplifiés avant ensemencement selon la technique de Rheinwald et Green (Oeil, vol 6 , 331-344,1975) par culture sur un support nourricier constitué de fibroblastes dans un milieu adapté connu de l'homme du métier, en présence de facteurs de croissance, notamment d'acides aminés, sérum, toxine cholérique, insuline, tri-iodo-thyronine et solution tampon de pH. En particulier, un tel milieu de culture pourra notamment contenir au moins un facteur de croissance mitogénique pour les kératinocytes (par exemple epidermal growth factor (EGF) et/ou keratinocyte growth factor (KGF), en particulier du KGF), de l'insuline, de l'hydrocortisone et facultativement un antibiotique (ex : gentamycine, amphotericine B). Avantageusement, ledit milieu pourra comprendre en outre du sérum ou un extrait pituitaire, par exemple d'origine bovine, de l'épinephrine, de la transferrine et/ou des acides aminés non essentiels. Les fibroblastes utilisés pour cette culture seront plus préférentiellement des fibroblastes 3T3. Les fibroblastes 3T3 sont bien connus de l'homme du métier. C'est une lignée cellulaire de fibroblastes connue depuis 1962. « 3T3 » signifie « 3-day transfer, inoculum 3x105cells ». La culture des kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu est préférentiellement une coculture avec des fibroblastes (préférentiellement des fibroblastes 3T3) dont la prolifération a été préalablement stoppée, préférentiellement en les ayant préalablement irradiés (par exemple, avec des UV) ou préalablement traités à la mitomycine. La mitomycine (en particulier, la mitomycine C) bloque la prolifération de ces cellules sans pour autant les empêcher de produire des substances nutritives utiles pour la prolifération des kératinocytes. Selon un autre mode de réalisation, les kératinocytes sont amplifiés avant ensemencement en les cultivant sur un milieu de culture traité ou supplémenté en fibronectine (par exemple une boite de culture « coatée à la fibronectine») ou en collagène (par exemple une boite de culture « coatée au collagène de type I ») ou sur un milieu de culture riche tel que le milieu Epilife® (Gibco). La dispase (appelée aussi protéase neutre) est une enzyme appartenant à la famille des protéases et qui a la capacité de cliver la fibronectine et les collagènes de type I et IV. Les fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu sont obtenus préférentiellement par les étapes suivantes : - séparation du derme de l'épiderme de cuir chevelu par traitement protéolytique d'un prélèvement de cuir chevelu et notamment par mise en contact d'un prélèvement de cuir chevelu avec de la dispase ou de la thermolysine, - récupération du derme de cuir chevelu, - mise en contact du derme de cuir chevelu ainsi obtenu avec de la collagénase et/ou de la trypsine, - récupération des fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu et - mise en culture des fibroblastes ainsi obtenus. Il est bien entendu que les enzymes citées ci-dessus sont utilisées à des concentrations connues de l'homme du métier leur permettant d'avoir les effets désirés. Préférentiellement, c'est la dispase que l'on utilisera pour séparer le derme de l'épiderme de cuir chevelu. La trypsine (Gibco) permettra d'obtenir une suspension de kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu à partir d'un épiderme de cuir chevelu. La collagénase (Boehringer) et/ou la trypsine permettront d'obtenir une suspension de fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu à partir d'un derme de cuir chevelu. La récupération des kératinocytes ou des fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu est préférentiellement réalisée par filtration de la suspension obtenue par l'action de la trypsine ou de la collagénase suivie d'une centrifugation, dans les conditions connues de l'homme du métier, et de la remise en suspension du culot de centrifugation. Plus spécifiquement, le procédé selon l'invention comprend : a- l'ensemencement par des kératinocytes interfolliculaires de cuir chevelu d'une lattice de collagène reposant sur un support immergé dans un milieu de culture ; b- la multiplication des kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu à la surface de ladite lattice de collagène; c- l'élévation dudit support de telle sorte que le milieu de culture ne recouvre pas la face supérieure de l'équivalent d'épiderme en cours d'élaboration. En particulier, le support peut être une grille-support. L'équivalent de derme selon l'invention est, en particulier, obtenu par ensemencement d'un milieu de culture par des fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu, suivi de l'ajout de collagène. Le procédé selon l'invention peut comprendre les étapes suivantes de culture : a) de cellules contractiles récoltées, par exemple, à partir de cultures monocouches réalisées sur un milieu nutritif ensemencé par des fragments de tissu animal ou humain avec b) un milieu nutritif additionné de composants de la matrice extracellulaire du derme, en particulier de collagène, ledit mélange formant un gel qui se contracte en expulsant le milieu nutritif pour former l'équivalent de derme et en particulier la lattice de collagène contractée. On utilisera comme cellule contractile, des fibroblastes interfolliculaires de cuir chevelu obtenus à partir de donneurs humains sains et récoltées, à partir des cultures monocouches, par trypsinisation ménagée ou par l'utilisation de collagénase. La mise en oeuvre du procédé de préparation selon l'invention consiste à ensemencer l'équivalent de derme -ou substrat dermique- avec des kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu. On maintient des conditions permettant la multiplication des kératinocytes à la surface dudit substrat, le développement de cette culture de kératinocytes interfolliculaires de cuir chevelu étant favorisé par l'utilisation d'au moins un milieu nutritif minimum, de préférence un milieu 3F tel que décrit dans l'exemple 1 au contact desdits kératinocytes. Avantageusement, après l'ensemencement des kératinocytes sur le substrat, on maintient, de préférence entre 5 à 7 jours, le substrat implanté en immersion dans ce milieu nutritif qui recouvre les kératinocytes. Ensuite, on place l'équivalent de derme en contact avec l'air. Pour cela, on le place sur une grille-support surélevée par rapport au fond du réceptacle et on ajuste le niveau du milieu nutritif, pour que la grille-support soit juste recouverte mais que le milieu nutritif ne recouvre pas la face supérieure de l'équivalent de peau en cours d'élaboration. Selon le procédé de l'invention, l'équivalent de derme contracté et ensemencé par les kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu est ainsi préférentiellement mis en culture pendant 5 à 7 jours en immersion dans un milieu de culture puis mis en émersion pendant 5 à 7 jours sur un support adapté. L'équivalent de cuir chevelu selon l'invention ainsi constitué est bien différencié, bien organisé. Il est aussi globalement homogène. Selon une variante du procédé selon l'invention, il est possible d'obtenir un 20 équivalent de cuir chevelu comportant des cheveux, en implantant, dans ledit équivalent de derme de cuir chevelu (en particulier dans la lattice de collagène) contracté ou en cours de contraction, des fibroblastes du cheveu choisis parmi des fibroblastes de la papille dermique et/ou des fibroblastes de la gaine conjonctive, et/ou des papilles dermiques entières et/ou des gaines conjonctives et/ou des 25 fractions de gaines conjonctives. Cette implantation pourra se faire, par exemple à l'aide d'une seringue. Ces fibroblastes du cheveu, les papilles dermiques entières, les gaines conjonctives et/ou les fractions de gaines conjonctives seront ajoutés après que les fibroblastes interfolliculaires ont commencé leur action sur le collagène. Leur ajout ne se fait donc pas en même temps que les fibroblastes interfolliculaires 30 du cuir chevelu. Les fibroblastes du cheveu seront préférentiellement ajoutés à une quantité de 1000 à 10000 cellules soit environ une proportion de 1 à 10 fibroblastes du cheveu pour 100 fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu. Du fait de l'implantation des fibroblastes du cheveu tels que les fibroblastes de la 35 papille ou les fibroblastes de la gaine conjonctive ou de la papille entière ou de la gaine conjonctive ou des fractions de la gaine conjonctive dans l'équivalent de derme, les kératinocytes reproduiront la morphogenèse du poil ou du cheveu (tige pilaire) (Reynolds AJ, Lawrence CM, Jahoda CA Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J Invest Dermatol.1993 Oct;101(4):634-8), 40 Un autre objet de l'invention est un équivalent de cuir chevelu susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.15 Cet équivalent de cuir chevelu présente une expression d'involucrine et/ou de kératine K10 dans ses couches granuleuses, ce qui est une expression comparable à un cuir chevelu in vivo. Par « expression comparable », on entend une expression des gènes codant pour ces protéines qui se fait dans les cellules situées au même endroit que dans le tissu in vivo et/ou selon la même intensité. Etant donné que l'équivalent de cuir chevelu présente les caractéristiques d'un cuir chevelu in vivo, il pourra être greffé de la même façon et avec le même succès que des greffons prélevés sur la nuque ou la zone occipitale de l'individu à traiter. Des techniques d'autogreffe sont décrites par exemple par Bouhanna et al. (Dermatol Surg. ; Nov 2003; 29 (11):1130-4). Après une greffe, l'équivalent de cuir chevelu selon l'invention, présente ainsi la capacité de remplacer de façon adéquate, la partie de cuir chevelu d'origine. L'équivalent de cuir chevelu trouvera donc également des applications pour la préparation de greffons destinés à traiter un désordre cutané du cuir chevelu tel qu'une brûlure, un défaut de cicatrisation, la canitie, donc destinés à être transplantés sur des mammifères, plus particulièrement sur des patients humains tels que des grands brûlés. Un greffon est défini comme étant une partie d'un tissu destinée à la greffe. Ainsi, un autre objet de l'invention concerne un équivalent de cuir chevelu tel que décrit précédemment, pour son utilisation pour traiter ou dans le traitement de l'un des désordres cutanés du cuir chevelu cités ci-dessus. Cet équivalent de cuir chevelu ou greffon présentera des caractéristiques en termes d'expression d'involucrine et de kératine K10 comparables à celles d'un cuir chevelu in vivo (i.e. une expression dans les dernières couches granuleuses de l'épiderme, de l'involucrine et de la kératine K10). L'invention concerne donc aussi l'utilisation d'un équivalent de cuir chevelu tel que décrit précédemment, pour la fabrication d'un greffon destiné à traiter l'un de ces désordres cutanés du cuir chevelu. Quelque soit la variante de procédé retenue pour sa préparation, l'équivalent de cuir chevelu que l'on obtient, est un modèle tridimensionnel utile comme test alternatif pour tous les tests qui nécessiteraient des expérimentations animales, par exemple, les études de libération d'actifs, de leur pénétration et/ou de leur absorption et/ou de leur biodisponibilité cutanée, les études de tolérance, de compatibilité, d'efficacité d'actifs et/ou d'ingrédients cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques. Ainsi, un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un équivalent de cuir chevelu tel que décrit précédemment, pour tester la pénétration et/ou l'absorption et/ou la biodisponibilité cutanée et/ou l'efficacité de composés sur le cuir chevelu et/ou pour tester la tolérance et/ou la compatibilité de composés vis-à-vis du cuir chevelu. Cette utilisation permet donc de voir si un composé pénètre dans les différentes couches du cuir chevelu ou s'il a bien l'effet que l'on souhaite. Cet équivalent de cuir chevelu est notamment utile pour l'identification de composé modulateur de la pousse des cheveux et/ou de molécules agissant sur la qualité et l'homéostasie du cuir chevelu et notamment sur la desquamation du cuir chevelu, le traitement de l'état pelliculaire ou du cuir chevelu sensible. Il peut, de plus, permettre la recherche de bio marqueurs liés au statut normal ou pathologique du cuir chevelu. Un intérêt supplémentaire réside dans la possibilité d'étudier l'implantation de follicules pileux, de glandes sudoripares ou sébacées afin de se rapprocher encore plus d'un cuir chevelu in vivo. Ce modèle est nécessaire pour induire la formation du cheveu par injection de cellules souches. Le modèle de cuir chevelu reconstruit selon l'invention pourra permettre de quantifier l'activité de molécules susceptibles d'induire la formation de cheveux à partir de cellules souches (par exemple à partir des cellules du bulbe). Les équivalents de cuir chevelu comportant des follicules pileux permettront de réaliser notamment des cinétiques de pousse des poils ou cheveux et donc toute étude nécessitant de nombreux cheveux vivants et aussi complets que possibles dans un contexte in vivo tel que l'étude du cycle du cheveu et des facteurs capables d'influencer ce cycle allant jusqu'à l'étude d'actifs favorisant la croissance du cheveu, d'actifs permettant de lutter contre la chute des cheveux ou encore d'actifs ralentissant la pousse des poils. Les procédés de criblage de produit en vue d'identifier de nouveaux actifs comprennent une étape (a) de mise en contact dudit produit à tester avec un équivalent de cuir chevelu selon l'invention puis une étape (b) d'analyse de l'effet dudit produit sur au moins un paramètre de l'équivalent de cuir chevelu et une étape (c) de sélection du produit modifiant ledit paramètre. De préférence, pour la mise en oeuvre de l'étape (a), le produit à tester est appliqué de façon topique, par exemple, formulé dans des formulations topiques classiques ou bien introduit dans le milieu de culture. Le paramètre de l'équivalent de cuir chevelu est préférentiellement choisi parmi l'expression, la production et/ou l'activité de marqueurs préalablement choisis dans l'équivalent de cuir chevelu et/ou la desquamation de l'équivalent de cuir chevelu. L'étape (b) pourra, en particulier, être réalisée par l'analyse de l'expression, de la production et/ou de l'activité de marqueurs liés à la qualité et/ou à l'homéostasie du cuir chevelu comme par exemple des marqueurs épidermiques et/ou dermiques, tels que des protéines de structure, notamment, des protéines de différentiation épidermique et macromoléculaires de la matrice dermique. Comme exemple de protéines de structure peuvent être citées les kératines du cheveu. Ces marqueurs liés à la qualité et/ou à l'homéostasie du cuir chevelu pourront être représentatifs de la desquamation du cuir chevelu, d'un état pelliculaire ou du cuir 10 chevelu sensible. Lorsque le modèle de cuir chevelu selon l'invention comprend des fibroblastes du cheveu tels que les fibroblastes de la papille ou les fibroblastes de la gaine conjonctive ou de la papille entière ou de la gaine conjonctive ou des fractions de la 15 gaine conjonctive qui ont été implantés comme décrits ci-dessus dans l'équivalent de derme, les tests de criblage pourront également être destinés à identifier des produits susceptibles d'induire la pousse de la tige pilaire. Pour cela, on analysera à l'étape (b) du procédé de criblage l'effet du produit sur la 20 pousse de la tige pilaire. Lorsque le modèle de cuir chevelu selon l'invention comprend des cellules du système immunitaire, comme les cellules de Langerhans, les tests de criblage pourront également être destinés à identifier des produits susceptibles d'induire des 25 irritations ou des réactions allergiques. Pour cela, on analysera à l'étape (b) du procédé de criblage l'effet du produit sur au moins l'un des paramètres préférentiellement choisis parmi : - la cytotoxicité ; 30 - la libération de médiateurs de l'inflammation ; - les dommages cellulaires révélés par histologie ou par la libération de lactate dehydrogénase (marqueur de l'intégrité membranaire des kératinocytes) (Roguet et al J Tox ln vitro 6:303 (1992) et Ponec M dans ln Vitro Toxicology. Eds Rougier, Maibach et Golberg p 107, 1994) ; 35 - la modification de la synthèse et de la composition des lipides de la peau, particulièrement les céramides et les phospholipides (JID 86,598 (1986)) ; - la stratification des cellules épithéliales comme marqueur de leur différenciation (M Prunieras & R Roguet Toxicologie cellulaire in vitro methodes & applications Eds M Adolphe, A Guillouzo et F Marano eds 40 INSERM 1995 p 191-236)(DUFFY PA, FLINT OP: In vitro dermal irritancy test. In CK Atterwill and CE Steele (Eds): In vitro methods in Toxicology Cambridge Univ. Press Cambridge 1987, pp 279-297) (Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy, Roguet, Oeil Biology and Toxicology, 1999:15, 63-75). L'étape (b) d'analyse de l'effet du produit sera préférentiellement une comparaison 5 d'au moins un paramètre mesuré sur l'équivalent de cuir chevelu mis en contact avec le produit à tester à celui ou ceux mesuré(s) sur un équivalent de cuir chevelu témoin cultivé dans les mêmes conditions mais qui n'a pas reçu le produit à tester. L'étape (c) de sélection du produit modifiant le paramètre de l'équivalent de cuir 10 chevelu se fera en fonction d'un critère déterminé à l'avance. La modification de ce paramètre pourra être une stimulation, une diminution ou une inhibition totale ou partielle de l'expression, de la production et/ou de l'activité desdits marqueurs et/ou de la pousse de la tige pilaire et/ou de la desquamation de 15 l'équivalent de cuir chevelu. Le critère de sélection dudit produit sera par exemple que ce produit à un effet stimulateur ou inhibiteur du paramètre mesuré. 20 L'équivalent de cuir chevelu selon l'invention peut aussi être utilisé dans des procédés automatisés de criblages de composés cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques pour identifier de nouveaux actifs. La figure 1 permet de mieux illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée. Dans cette figure, les photos montrent des coupes de peau reconstruite (équivalent de peau) (A), d'équivalent de cuir chevelu selon l'invention (B) et de prélèvement de cuir chevelu (C) après immunomarquage à l'aide d'anticorps anti-involucrine (I) et anti-K10 (II). Les exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de l'invention. Exemple 1 - Préparation d'un modèle de cuir chevelu Des kératinocytes et des fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu sont isolés à partir de prélèvements de cuir chevelu réalisés dans le cadre d'un lifting (donc provenant de femmes plutôt âgées) ou à partir de prélèvements de cuir chevelu provenant d'hommes plutôt jeunes. Pour isoler ces cellules de cuir chevelu, on réalise une épilation de cheveux de façon à éliminer les kératinocytes de la gaine épithéliale externe, puis on sépare le derme 25 30 35 40 de l'épiderme pour extraire les deux populations cellulaires visées à savoir les fibroblastes et les kératinocytes interfolliculaires. Protocole expérimental : Sauf indication contraire, l'ensemble des milieux et tampons utilisés dans les exemples sont décrits dans Bell et col. 1979, (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222) ou Asselineau et col., 1987, (Models in dermato., vol.11l, Ed. Lowe & Maibach, 1-7). Le milieu MEM + 10% FCS + 3F (appelé milieu 3F) a la composition suivante : Réactif Marque Volume MEM BIOCHROM KG 500 ml L-Glutamine 200mM GIBCO 5 ml Pyruvate Na 100mM BIOCHROM KG 5 ml NEA BIOCHROM KG 5 ml FCS BIOCHROM KG 50 ml Pénicilline- BIOCHROM KG 1 ml Streptomycine Antibiotic-antimycotic GIBCO 0,5 ml EGF 10pg/ml TEBU 0,5 ml Choléra toxine 10-5M SIGMA 5 pl Hydrocortisone 0,5mg/ml SIGMA 0,4 ml - Placer les morceaux de partie "Haute" dans une boite de culture diamètre 100 mm 15 contenant 30-40 ml de dispase (Roche) et stocker toute la nuit (environ 15 heures) à 4°C ou stocker 1 h30 à 37°C dans l'incubateur sec en veillant à bien découper de petits morceaux. 1. Préparation de la primoculture de kératinocytes normaux humains 20 - Sortir les échantillons du bain de dispase et les placer dans une boite de culture (diamètre 100mm) contenant 10 ml de trypsine-EDTA (0,05%-0,02%). - Effectuer la séparation du derme et de l'épiderme à l'aide de pinces courbes et gratter doucement la surface du derme avec le dos de la pince afin de récupérer les 25 kératinocytes basaux. - Placer l'épiderme dans un tube conique (50m1) avec les 10 ml de trypsine-EDTA de la boite. - Rincer la boîte avec 5 ml de trypsine-EDTA - Filtrer sur de la gaze stérile - Neutraliser avec 20 ml de sérum de veau foetal (Fetal 30 Calf Serum ou FCS) pur - Placer la suspension dans un tube conique 50 ml - Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 1200 tr/min 10 - Eliminer le surnageant, reprendre le culot avec du MEM 10% FCS + 7F (ce milieu comprend les mêmes composés que le milieu 3F et quatre composés supplémentaires : adénine, transferrine, T3, insuline) - Compter les cellules viables - Ensemencer les boites de cultures à 10 000 cellules vivantes/cm2 - 24h après, effectuer une coculture classique en rajoutant les 3T3 (12 000 cellules/cm2) traités à la mitomycine C (Amétycine®) sans changer le milieu, 2. Protocole d'isolement des cellules du derme: a) Préparer une solution comprenant 0,1% de glucose, 0.8% de Na Cl et 0.04% de K Cl. - Ajouter de la collagénase à 0,1 % (Worthington). 15 - Filtrer la solution avec un filtre Millipore ou Nalgene 0,22 pm. b) Dans un bécher de 50 ml, mettre le derme sous forme de petits morceaux de 2 mm de côté environ, 20 ml de la solution de collagénase et 1 barreau stérile. 20 - Mettre à tourner à 37°C, 5% CO2, pendant 1h30. - Filtrer la suspension obtenue sur une double épaisseur de gaze stérile, - Centrifuger la suspension filtrée dans les conditions habituelles de centrifugation des cellules. 25 c) Resuspendre le culot dans du milieu de culture frais, compter les cellules, ensemencer les boîtes. 3. Préparation des lattices: 30 Si l'expérience à réaliser comporte plus de 25 lattices, il faut doubler tous les volumes ci-dessus. MEM 1.76X 17.6 ml de MEM 10X 35 5.1 ml de NaHCO3 7.5 0.88 ml de L-Glutamine (1.76 mM) 0.88 ml de Sodium Pyruvate (0.88 mM) 0.88 ml Acides aminés non essentiels 0.88 X (Réf. : K 0293 - Fournisseur : Biochrom KG) 40 0.088 ml Pénicilline Streptomycine 8.8 U / 8.8 pg/ml (0.088 %) (Réf. : A2212 - Fournisseur : Biochrom KG) 0.044 ml d'antibiotique anti-mycotique 0.04 X (0.04 %) 75 ml d'eau ultra pure stérile10 MEM Hépes 10% FCS 50 ml de MEM 25mM Hépes 0.5 ml de L-Glutamine (2 mM) 0.5 ml de Sodium Pyruvate (1 mM) 0.5 ml Acides aminés non essentiels 1 X 0.1 ml de Pénicilline Streptomycine 20 U / 20 pg / ml (0.2%) 0.05 ml d'antibiotique anti-mycotique 0.1 X (0.1 %) 5 ml de FCS10 %. NaOH 0.1 N 10 ml NaOH 1 N 90 ml d'eau ultra pure stérile Cette solution est passée sur filtre Millipore à membrane GV Durapore 0.22pm. Acide acétique 1/1000 0.5 ml d'acide acétique glacial 100% 499.5 ml d'eau ultra pure stérile A l'aide des milieux ainsi réalisés : - Préparer dans un erlenmeyer stérile, 5 ml de la solution suivante : 3.22 ml de MEM 1.76 X 25 0.63 ml de FCS 0.35 ml de NAOH 0.1N 0.6 ml d'acide acétique 1/1000 0.2 ml de MEM Hépes 10% FCS. 30 - A cette solution ajouter 0.5 ml de suspension cellulaire de fibroblastes interfoliculaires du cuir chevelu. - Puis ajouter lentement le volume nécessaire de collagène froid (2.1 ml si ce collagène est du collagène Gattefossé ou Symatèse ou 1.5 ml s'il est du collagène Coletica). 35 - Agiter vigoureusement l'erlenmeyer jusqu'à l'homogénéisation (la solution rose fushia vire à une coloration saumonée). - Vider le contenu de l'erlenmeyer dans une boîte bactério Falcon 0 60 mm. - Placer la boîte à l'étuve (37°C - 5 % CO2) pendant environ l h30-2h. - Lorsque le gel est pris et le milieu relargué, vérifier le début de la contraction. 40 - Dans l'après-midi, secouer régulièrement les lattices pour ne pas qu'elles se recollent. - Laisser la contraction se faire pendant 3 jours.20 4. Culture-Ensemencement en kératinocytes L'ensemencement en kératinocytes se fait après 3 jours de contraction des lattices. 5 a) Préparation de la colle - Préparer 0.7 ml de la solution suivante, donnée pour coller 2 lattices 0.46 ml MEM 1.76 X 0.09 ml FCS 10 0.05 ml NaOH 0.1N 0.1 ml MEM Hépes 10% FCS - Ajouter dans ce tube 0.3 ml de collagène dialysé. Le volume final est donc de 1 ml. 15 Remarques: - Les volumes ci-dessus sont donnés pour le collage de 2 lattices - Pour plusieurs lattices, préparer une solution globale correspondant à n+1 échantillons à coller dans un erlenmeyer. 20 - Distribuer, par tube, 0.7 ml de cette solution à l'aide de la multipette - Ajouter ensuite 0.3 ml par tube de collagène - Travailler 2 lattices par 2 lattices. b) Collage des lattices 25 - Prendre un tube de 6 ml rempli de solution de colle - Agiter au vortex - Pipeter la solution et déposer dans 2 boîtes de culture Corning une goutte d'environ 0.45 ml de cette solution dans le milieu de chaque boîte 30 - Prélever à l'aide d'une pince courbe et d'un cell-lifter une lattice - Déposer la lattice dans l'intérieur du couvercle de sa boîte d'origine afin d'éliminer le surplus de milieu - Reprendre la lattice et la déposer sur la goutte de colle - Bien étaler en tournant la boîte pour que la colle se répartisse autour de la lattice 35 - Placer les boîtes à l'étuve (37°C-5% CO2) pendant 20-30 min pour permettre la prise de la colle. c) Ensemencement en kératinocytes 40 - Décongeler les cellules le plus rapidement possible en agitant l'ampoule dans un bain marie à 37°C, si ces cellules ont été congelées. - Transférer le contenu de l'ampoule dans un tube de culture Falcon de 50 ml contenant 35 ml de milieu MEM 10%FCS + 3F - Centrifuger 5 min à 1000 tr/min. - Eliminer le surnageant - Reprendre le culot de centrifugation avec du MEM 10%FCS + 3F pour obtenir une solution à 100 000 cellules / ml. - Remettre en suspension les cellules par aspiration-refoulement plusieurs fois. - Sur les lattices collées, déposer un anneau d'ensemencement de 14 mm de diamètre. - Dans cet anneau, déposer 0.5 ml de suspension cellulaire (= 50 000 cellules/anneau 1.5 cm2 soit environ 33000 cellules par cm2). - Autour de l'anneau ajouter 5 à 7 ml de MEM 10%FCS + 3F doucement pour ne pas décoller la lattice. - En parallèle, ensemencer 2 « anneaux témoins » (boîte avec anneaux sans lattice). - Placer les boîtes à l'étuve 37°C-5% CO2 pendant 2 heures. - Retirer à l'aide d'une pince courbe les anneaux après les 2 heures d'attachement - Remettre les boîtes à l'étuve 37°C-5% CO2. - Changer le milieu le mercredi et le vendredi (5 à 7 ml MEM 10%FCS + 3F par boîte). - Culture-Emersion des peaux reconstruites Après 7 jours de culture en immersion les peaux sont mises en émersion. Vérifier toutefois que les kératinocytes sortent de la lattice en observant au 25 microscope. - Dans une boîte bactério Falcon, placer une grille d'émersion, - Ajouter 7.5 ml MEM 10%FCS + 3 F en évitant la formation de bulles, - Découper la colle autour de la peau à émerger à l'aide d'un scalpel stérile, - Transférer la peau sur la grille avec une pince courbe et un cell-lifter, 30 - Placer les boîtes à l'étuve 37°C-5% CO2, - Changer le milieu le mercredi et le vendredi (7 à 7.5 ml MEM 10%FCS + 3F). Après 7 jours d'émersion, les peaux reconstruites du scalp sont prêtes à être utilisées. Exemple 2 : comparaison de l'expression de l'involucrine et la kératine K10 L'expression de l'involucrine et de la kératine K10 dans l'équivalent de cuir chevelu obtenu à l'exemple 1 est observée après immunomarquage à l'aide d'anticorps 40 monoclonaux de souris dirigé contre l'involucrine ou contre la K10. Cette expression est aussi observée dans un équivalent de peau classique et dans un prélèvement de cuir chevelu. 35 Préparation de l'équivalent de peau classique et du prélèvement de cuir chevelu : Pour préparer un équivalent de derme classique, on introduit, dans un tube Falcon stérile, 3,22 ml de milieu MEM 1,76 X, 0,63 ml de sérum de veau foetal, 0,35 ml de soude 0,1 N, et 0,20 ml d'un mélange milieu MEM/Hépes contenant 10 % sérum de veau foetal (MEM/Hepes/SVF10). On ajoute alors 0,50 ml milieu MEM/Hepes/SVF10 contenant des fibroblastes issus de plasties mammaires humaines préalablement préparés selon la méthode décrite par Bell et al. 1979, (P.N.A.S. USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984, (British J. of Derm., 111, 219-222) ou Asselineau et al., 1987, (Models in dermato., vol.11l, Ed. Lowe & Maibach, 1-7), à la concentration de 1x106 cellules pour 0,5 ml de milieu de culture. On ajoute alors lentement, contre la paroi du tube de façon à observer l'apparition d'un nuage blanchâtre, 2 ml d'un mélange volume/volume de collagène à la concentration de 3 mg/ml dans de l'acide acétique au 1/1000. L'ensemble est alors mélangé avec précaution et déposé dans une boite de Pétri de diamètre 60 mm (type Falcon 60 mm, réf. 1016). La boite de Pétri est alors placée dans une étuve à 37°C et laissée environ 2h30. Lorsque l'on observe l'apparition de 2 phases, (gel + milieu), on désolidarise avec précaution la lattice de son support et l'on laisse la lattice ainsi désolidarisée de son support pendant 4 jours à l'étuve. Pour préparer un équivalent de peau classique, l'équivalent de derme classique est bien étalé dans une boite de culture de type Corning de diamètre 60 mm sur une goutte de "colle" au collagène (0,6 ml) puis maintenue à 37°C dans une étuve pendant 20 - 30 minutes. Un anneau en acier stérile est placé sur la lattice et 0,5 ml d'une suspension cellulaire de kératinocytes humains provenant de plasties mammaires préparés selon Régnier et collaborateurs, (Frontier of Matrix Biology, Vol.9, 4-35, Karger, Basel 1981), à raison de 100 000 cellules/ml en milieu MEM 10% FCS + 3F sont placés à l'intérieur de l'anneau. Environ 6 ml de milieu (MEM 10% FCS + 3F) sont placés autour de l'anneau et la boite est placée dans une étuve à 37°C pendant 2 heures. L'anneau est alors retiré et la boite replacée à l'étuve. Après 8 jours, la culture est alors placée à l'interface air/liquide, ledit liquide étant alors constitué du même milieu que précédemment. La culture est ensuite poursuivie pendant 1 semaine jusqu'à obtention d'un équivalent d'épiderme histologiquement satisfaisant, c'est à dire un équivalent d'épiderme présentant les quatre couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Le prélèvement de cuir chevelu est récupéré suite à un lifting selon les méthodes connues de l'homme du métier. Mesure de l'expression de l'involucrine et la kératine K10 Après congélation, les différents tissus sont découpés en lamelles de 5 lm d'épaisseur à l'aide d'un cryostat. Les coupes sont alors rincées deux fois au PBS et 25 gl d'anticorps anti involucrine 15 (Sigma - Réf. : 19018) et anti K10 (Immuquest Ltd -Réf. AE20) dilués au 1/50 sont déposés sur chaque coupe et laissés durant 30 minutes à la température ambiante (25°C). Les coupes sont alors rincées deux fois au PBS et 25 gl d'anticorps conjugués FITC (Rabbit anti mouse FITC, Dako F232), sont déposés sur chaque coupe et laissés pendant 30 minutes à la température ambiante (25°C). Les coupes 20 sont rincées deux fois au PBS et observées après montage au microscope à fluorescence de marque LEICA, modèle LEITZ DMRB. L'observation montre que dans le témoin (peau reconstruite) l'involucrine (figure 1, I) et la kératine K10 (figure 1, II) sont exprimées dans la totalité des couches supra- 25 basales de l'épiderme reconstruit (figure 1, A), alors qu'elles sont exprimées tardivement, c'est-à-dire uniquement dans les couches granuleuses de l'épiderme des équivalents de cuir chevelu (figure 1, B) et des prélèvements de cuir chevelu (figure 1, C). 30 L'expression de ces deux marqueurs se fait précocement dans la peau reconstruite (A) et tardivement dans le modèle de cuir chevelu reconstruit (B) et dans le prélèvement de cuir chevelu (C) aux endroits indiqués par les flèches sur la figure 1. Ces résultats permettent donc de confirmer que le modèle de cuir chevelu reconstruit 35 selon l'invention est proche de la structure et de la fonctionnalité d'un cuir chevelu in vivo. 10 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un équivalent de cuir chevelu, caractérisé en ce que l'on ensemence et cultive des kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu sur un équivalent de derme, ledit équivalent de derme comprenant du collagène et des fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu. 2. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que l'équivalent de derme est une lattice de collagène contractée et en ce que l'ensemencement en kératinocytes est réalisé après 2 à 5 jours de contraction de ladite lattice. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé 15 en ce que lesdits fibroblastes et kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu sont isolés à partir, respectivement, de derme et d'épiderme, provenant d'un prélèvement de cuir chevelu. 4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les 20 kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu sont obtenus à partir d'un prélèvement de cuir chevelu dont on a préalablement éliminé les kératinocytes de la gaine épithéliale externe. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce 25 que les kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu sont obtenus par les étapes suivantes : séparation du derme de l'épiderme de cuir chevelu par traitement protéolytique d'un prélèvement de cuir chevelu, récupération de l'épiderme de cuir chevelu, 30 mise en contact de l'épiderme de cuir chevelu ainsi obtenu avec de la trypsine, récupération des kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu et, culture des kératinocytes ainsi obtenus. 6. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la culture 35 des kératinocytes est une coculture avec des fibroblastes préalablement traités à la mitomycine ou irradiés ou une culture sur un milieu de culture supplémenté en fibronectine ou en collagène. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les fibroblastes 40 interfolliculaires du cuir chevelu sont obtenus par les étapes suivantes : séparation du derme de l'épiderme de cuir chevelu par traitement protéolytique d'un prélèvement de cuir chevelu, récupération du derme de cuir chevelu,mise en contact du derme de cuir chevelu ainsi obtenu avec de la collagénase et/ou de la trypsine, récupération des fibroblastes interfolliculaires du cuir chevelu et mise en culture des fibroblastes ainsi obtenus. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'équivalent de derme contracté et ensemencé par les kératinocytes interfolliculaires du cuir chevelu est mis en culture pendant 5 à 7 jours en immersion dans un milieu de culture puis mis en émersion pendant 5 à 7 jours sur un support adapté. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape où l'on implante dans ledit équivalent de derme contracté ou en cours de contraction, des fibroblastes du cheveu choisis parmi des fibroblastes de la papille dermique et/ou des fibroblastes de la gaine conjonctive, et/ou des papilles dermiques entières et/ou des gaines conjonctives et/ou des fractions de gaines conjonctives. 10.Equivalent de cuir chevelu obtenu par le procédé selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 9. 11. Equivalent de cuir chevelu selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il présente une expression d'involucrine et/ou de kératine K10 dans ses couches granuleuses. 12.Equivalent de cuir chevelu tel que défini dans l'une quelconque des revendications 10 ou 11, pour son utilisation dans le traitement d'un désordre cutané du cuir chevelu. 30 13.Equivalent de cuir chevelu tel que défini dans l'une quelconque des revendications 10 à 12, pour son utilisation dans le traitement d'un désordre cutané du cuir chevelu, ledit désordre cutané étant une brulure du cuir chevelu. 14. Utilisation d'un équivalent de cuir chevelu tel que défini dans l'une quelconque 35 des revendications 10 ou 11 pour la fabrication d'un greffon destiné à traiter un désordre cutané du cuir chevelu tel qu'une brûlure, un défaut de cicatrisation ou la canitie. 15. Utilisation d'un équivalent de cuir chevelu selon l'une quelconque des 40 revendications 10 ou 11, pour tester la pénétration et/ou l'absorption et/ou la biodisponibilité cutanée et/ou l'efficacité de composés sur le cuir chevelu. 25 16. Procédé de criblage de produit en vue d'identifier de nouveaux actifs comprenant une étape (a) de mise en contact dudit produit à tester avec un équivalent de cuir chevelu selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11 puis une étape (b) d'analyse de l'effet dudit produit sur au moins un paramètre de l'équivalent de cuir chevelu et une étape (c) de sélection du produit modifiant ledit paramètre.