Brevet FR2969153A1 — publié le 20120622

PROCEDE DE PURIFICATION DE PROTEINE AMYLOIDE P ET UTILISATION DE LA PROTEINE AINSI PURIFIEE Domaine de l'invention La présente invention concerne un procédé d'isolement et de purification de la protéine amyloïde P sérique, notamment humaine. L'invention concerne encore une protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue par ce procédé ainsi que son utilisation dans le diagnostic ou le traitement et/ou la prévention de l'amylose, incluant la maladie d'Alzheimer, ou son utilisation dans le traitement thérapeutique du diabète de type II ou de maladies auto-immunes chez un sujet. La présente invention concerne en outre un anticorps dirigé contre la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. La présente invention porte également sur un kit de détermination par scintigraphie de la présence de dépôts amyloïdes dans un tissu ou un organe chez un sujet comprenant comme réactif la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. Etat de la technique L'amylose est un groupe hétérogène de troubles dus à des dépôts extracellulaires de protéines dans des formes fibrillaires anormales insolubles touchant un ou plusieurs organes. Leur accumulation et persistance sont responsables de la perturbation de la structure et de la fonction des tissus atteints et conduit à une maladie grave généralement fatale. Bien qu'un dépôt d'amyloïde microscopique soit toujours présent chez les personnes âgées et provoque rarement des problèmes cliniques, une amylose plus substantielle, en particulier dans les organes vitaux, est en général associée à une maladie progressive, non traitable et habituellement fatale. Les troubles les plus courants associés à l'amylose sont la maladie d'Alzheimer et le diabète de type II, cependant d'autres formes d'amyloses acquises et héréditaires plus rares existent. Les symptômes sont très variables en fonction de l'organe atteint. Dans les amyloses secondaires, le traitement de la cause permet de retarder l'évolution de la maladie. En cas d'amylose localisée, l'ablation des dépôts localisés peut être proposée. Selon le type d'amylose, différents traitements peuvent être proposés, comme des anti-inflammatoires, des corticoïdes ou des immunosuppresseurs. Le diagnostic d'amylose peut être établi après ponction biopsique et examen histologique par une coloration au rouge Congo ou scintigraphie à l'iode radiomarquée. Dans le cadre de la scintigraphie, la méthode d'utilisation est la suivante : le composant amyloïde P purifié marqué à l'iode radioactif est injecté en R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc intraveineuse. Cette protéine est alors fixée par les dépôts amyloïdes existants dans l'organisme. L'examen par une gamma caméra permet ensuite de visualiser les dépôts amyloïdes ayant capté cette protéine marquée. En revanche, chez un sujet sain, cette protéine marquée circule dans le sang mais ne se dépose dans aucun tissu. Pour confirmer le diagnostic, une biopsie est nécessaire. La technique de scintigraphie permet également de quantifier la masse de tissu amyloïde de l'organisme. Plus il y a de tissu amyloïde, plus la protéine marquée est retenue et, par conséquent, est absente des urines de 24 heures. On peut alors calculer la dose radioactive éliminée. Plus cette dose est faible, plus la rétention corporelle est importante donc plus la masse amyloïde est grande. Le composant amyloïde P sérique humain est le constituant universel des dépôts amyloïdes dans toutes les formes d'amylose, y compris les dépôts amyloïdes cérébraux de la maladie d'Alzheimer, en raison de son affinité spécifique de liaison dépendante du calcium pour les fibrilles d' amyloïde. Le rôle physiologique du composant amyloïde P tissulaire humain dans la pathogenèse ou la persistance de l'amylose est encore mal connu. In vivo il pourrait agir comme co-facteur dans la formation des fibrilles amyloïdes et serait impliqué dans leur protection contre la dégradation protéolytique. En revanche, in vitro, le composant amyloïde P tissulaire humain ne semble pas nécessaire à une fibrillogenèse amyloïde, celle-ci étant générée à partir de précurseurs appropriés. Par ailleurs, le composant amyloïde P tissulaire humain impliqué dans l'amylose est identique à sa forme sérique. Celle-ci est rapidement absorbée et catabolisée dans les hépatocytes, contrairement à la forme tissulaire du composant amyloïde P qui n'est pas catabolisé dans les dépôts, car étant hautement résistant à la dégradation protéolytique. Le composant amyloïde P sérique humain est une glycoprotéine plasmatique décamèrique composée de sous-unités identiques associées de manière non covalente en deux cycles pentamères interagissant face à face. Chaque sous-unité a une masse molaire de 25 kDa et un pHi théorique de 6.1. Le composant amyloïde P sérique humain est naturellement présent dans le plasma à un taux compris généralement entre 30 et 40 µg/mL. Dans le plasma, le composant amyloïde P sérique humain est la protéine majeure de liaison à l'ADN et à la chromatine et à d'autres ligands comme par exemple la fibronectine, la protéine de liaison C4, les glycosaminoglycanes, la phosphocholine, la molécule Clq (collagen-like Clq molecule). Les techniques actuelles de purification du composant amyloïde P sérique permettent l'obtention d'une protéine (SAP) amyloïde P sérique humaine purifiée utilisable, après marquage par un radio-isotope, en scintigraphie pour le diagnostic de R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc l'amylose. Néanmoins ces méthodes de purification sont encore perfectibles, tant sur le plan du procédé que sur la sécurisation biologique. En effet il existe de réels besoins en procédés autorisant un haut degré de rendement mais aboutissant également à une stabilité et une pureté accrue. L'optimisation de la sécurité biologique est aussi l'un des enjeux majeurs actuels pour assurer l'élimination de tout contaminant, agent pathogène, virus ou prion et garantir une sécurité virale conforme aux réglementations en vigueur. Le composant amyloïde P sérique humain est décrit comme une protéine de liaison calcium dépendante ayant une haute affinité pour l'agarose. De Beer et al, 1982 (De Beer FC, Pepys MB , « Isolation of human C-reactive protein and serumamyloid P component » J Immunol Methods 1982 ;50(1):17-31) enseignent un procédé d'isolement et de purification de la protéine amyloïde P sérique humaine comprenant des étapes successives de chromatographie d'affinité calcium dépendante sur Sépharose 4B (agarose) non substituée, suivie de chromatographies d'affinité inverse, liant spécifiquement certains contaminants mais n'ayant pas d'affinité pour le composant amyloïde P sérique, (Sépharose-anti-sérum humain normal et optionnellement Blue-Sépharose) et filtration sur gel (Séphacryl S-300). L'élution se fait dans une solution Tris-saline-EDTA. Leur rendement après filtration sur gel est d'environ 14.71ag/mL de sérum avec une pureté indiquée comme étant de 100%. Cependant, aux vues des difficultés de reproductibilité liées à la qualité de l'agarose, il apparaît que l'utilisation de ce type de chromatographie ne soit pas indiqué pour purifier le composant amyloïde P sérique humain de façon industrielle. Urbanyi Z et al, 1992 (Urbanyi Z, Medzihradszky D « Rapid method to isolate serum amyloid P component from human plasma. Characterization of the isolatedprotein" J Chromatogr. 1992; 578(1):130-3) enseignent un protocole d'isolement et de purification du composant amyloïde P sérique humain comprenant une étape de recalcification, une étape de séparation par chromatographie d'affinité sur Sépharose 6B (agarose) avec élution de la protéine amyloïde P sérique humaine dans une solution Tris saline EDTA, pH7.8, et une étape d'isolement par chromatographie échangeuse d'ions avec une élution par une solution 0.3M en sels. Leur rendement est de 8.5 µg/mL de sérum. Cette publication de 1992 dévoile une étape de recalcification du plasma humain congelé en présence de sels de citrate, suivi de centrifugations, en revanche aucun autre processus de chromatographie n'est mentionné. La première étape de séparation par chromatographie d'affinité calcium dépendante sur agarose permet d'après Urbanyi Z et al, 1992 la séparation de la protéine amyloïde P sérique de la plupart des autres protéines plasmatiques, et l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes permet d'obtenir R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc selon Urbanyi et al, une protéine purifiée, sans préciser toutefois le degré de pureté. De plus, Urbanyi Z et al, 1992 ne dévoilent aucune étape d'inactivation virale. Mantovaara T et al, 1989 (Mantovaara T et al, " Purification of human serum amyloid P component (SAP) by calcium affinity chromatography" Biotechnology and Applied Biochemistry, 1989; 11:564-570) enseignent un procédé de purification en une seule étape du composant amyloïde P sérique humain par chromatographie d'affinité calcium dépendante sur billes d'agarose non substituée couplées à l'acide aspartique carboxy-méthylé (Ca-CM-Asp-agarose). La protéine amyloïde P sérique humaine est adsorbée sur la colonne d'agarose Ca-CM-Asp-agarose en présence de CaC12 0.25M et son élution est faite à pH5.0 en présence d'EDTA. Leur rendement indiqué est de 36 µg/mL de sérum ce qui correspond à récupérer 90% de la protéine SAP, leur facteur de purification est de l'ordre de 1900. Cependant, Mantovaara T et al, 1989 mentionnent qu'une élution de la protéine amyloïde P sérique humaine en présence d'EDTA est susceptible de modifier la conformation voire même les propriétés biologiques de cette protéine, donc l'utilisation d'EDTA dans la solution d'élution ne semble pas être une approche recommandée. Par ailleurs, ce mode de purification fait état d'une lourde contamination aux immunoglobulines, donc malgré un rendement important cette méthode de purification reste tout de même perfectible. L'ajout de CaC12 ,en vue de la chromatographie d'affinité calcium dépendante sur billes d'agarose non substituée couplées à l'acide aspartique carboxy-méthylé (Ca-CM-Asp-agarose), est simplement indiqué. Hawkins PN et al, 1991 (Hawkins PN et al, « Studies in vivo and in vitro of serum amyloid P component in normals and in a patient with AA amyloidosis » Clin Exp Immunol 1991 ; 84 :308-316) enseignent un protocole d'isolement et de purification du composant amyloïde P sérique et dont les étapes successives sont les suivantes : (i) chromatographie calcium dépendante sur phosphoéthanolamine-Sépharose, avec élution dans un tampon Tris saline EDTA en présence de l'agent antibactérien NaN3, pH8.0 ; (ii) chromatographies successives sur colonne protéine A-Sépharose, Blue-Sépharose, puis anti-impurity-Sépharose (immunisation de moutons avec un sérum déplété en protéine amyloïde P sérique, récupération de la fraction d'immunoglobulines G d'antisérum et couplage de cette fraction sur CNBr-Sépharose), (iii) concentration par ultrafiltration et dialyse (iv) chromatographie calcium dépendante sur une colonne phosphoéthanolamine-Sépharose avec élution à l'aide d'une solution Tris saline NaN3, pH8.0. Hawkins PN et al, 1991 obtiennent par ce procédé une concentration de la protéine amyloïde P sérique humaine en moyenne de 37 µg/mL de plasma, quelque soit le génotype considéré et qu'il s'agisse de donneurs sains ou de patients atteints d'amylose ou atteints d'une maladie prédisposant au développement d'une amylose. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc La demande de brevet WO 95/14234 a trait à un test diagnostic de dépistage de la maladie d'Alzheimer, et de suivi de l'évolution de cette maladie, par mesure du taux de protéine amyloïde P dans un prélèvement de fluide cérébrospinal d'un patient donné. La concentration plasmatique mesurée de protéine amyloïde P sérique humaine est en moyenne de 31 mg/mL chez les individus sains. Cependant, aucun procédé de purification de la protéine amyloïde P sérique humaine n'est décrit. Résumé de l'invention Ces exigences ont permis la mise au point d'un nouveau procédé de purification du composant amyloïde P sérique humain, comprenant les étapes de recalcification du plasma frais décongelé, de chromatographie d'interactions hydrophobes, de préférence de chromatographie de pseudo-affinité sur hydroxyapatite, et de préférence encore de chromatographie d'affinité sur protéine A. Outre l'amélioration considérable du rendement (12 à 17mg/L de plasma soit 34.8 à 48.6%), ce procédé permet, de manière industrielle, l'obtention d'un concentré de protéine SAP amyloïde P sérique présentant un haut degré de pureté (notamment 98,6%) et de sécurité biologique, et en conséquence, susceptible d'être utilisé à des fins de diagnostic, dans le suivi de traitement et/ou dans la prévention de l'amylose, incluant la maladie d'Alzheimer, ou dans le traitement thérapeutique du diabète de type II ou de maladies auto-immunes chez un sujet. Ce procédé permet également la préservation des propriétés biologiques de la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'invention et plus particulièrement sa capacité de liaison à des ligands naturels de la protéine amyloïde P sérique tels que la phosphoéthanolamine, la fibronectine, la molécule Clq, le collagène, la phosphocholine, l'ADN et la chromatine, les complexes immuns, les sucres et en particulier le méthyle 4,6-0-(1-carboxyéthylidène)-(3-D-galactopyranoside (MO13DG), des composants du complément, toutes les formes de fibrilles amyloïdes, la protéine de liaison C4 et les glycosaminoglycanes. Le procédé de l'invention se distingue tout particulièrement des procédés de purification connus à ce jour par l'utilisation de groupements hydrophobes notamment de type phényle pour chromatographier un surnageant recalcifié de cryoprécipité de plasma. Un tel procédé permet de mettre en oeuvre une étape de traitement solvant/détergent sur 1'éluat issu de cette chromatographie d'interactions hydrophobes, et en outre que le flux issu du traitement solvant/détergent peut être traité directement dans l'étape ultérieure de chromatographie par pseudo-affinité sur hydroxyapatite puis si besoin être soumis à une étape de chromatographie d'affinité sur protéine A avant d'être nanofiltré. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Le demandeur a trouvé de manière surprenante qu'un procédé de purification du composant amyloïde P sérique humain, combinant les étapes de recalcification du plasma frais décongelé, chromatographie d'interactions hydrophobes, de préférence de chromatographie de pseudo-affinité sur hydroxyapatite et éventuellement de chromatographie d'affinité sur protéine A permet de préparer, de manière industrielle, un concentré de composant amyloïde P sérique humain présentant un haut degré de pureté. Le degré de pureté atteint par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est à l'issue de l'étape (c) de chromatographie de pseudo-affinité sur hydroxyapatite supérieur ou égal à 94%, de manière préférée supérieur ou égal à 95%, de manière préférée supérieur ou égal à 96% et de manière encore plus préférée supérieur ou égal à 97%, encore plus avantageusement plus de 98%. Notamment le degré de pureté atteint par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est à l'issue de l'étape (d) de chromatographie d'affinité sur protéine A supérieur ou égal à 96%, de manière préférée supérieur ou égal à 97%, de manière préférée supérieur ou égal à 98% et de manière encore plus préférée supérieur ou égal à 99%. Ce concentré préparé selon l'invention est sensiblement dépourvu de protéines contaminantes et en particulier est dépourvu d'immunoglobulines, de manière préférée d'immunoglobulines M et G, et de facteurs C3 du complément, cette liste n'étant pas limitative. Le procédé de l'invention se distingue tout particulièrement des procédés de purification connus à ce jour par l'utilisation de groupements hydrophobes notamment de type phényle pour chromatographier un surnageant recalcifié de cryoprécipité de plasma contenant des protéines de haut poids moléculaire telles que le fibrinogène, la fibronectine, les immunoglobulines, les protéines du complément, cette liste n'étant pas limitative. Un tel procédé permet de mettre en oeuvre une étape de traitement solvant/détergent sur l'éluat issu de cette chromatographie d'interactions hydrophobes, et en outre que le flux issu du traitement solvant/détergent peut être traité directement dans l'étape ultérieure de chromatographie par pseudo-affinité sur hydroxyapatite puis si besoin être soumis à une étape de chromatographie d'affinité sur protéine A avant d'être nanofiltré. Un tel procédé permet également d'obtenir une protéine amyloïde P sérique purifiée sécurisée d'un point de vue virologique et en conséquence, susceptible d'être utilisée à des fins de diagnostic, de suivi de traitement et/ou dans la prévention de l'amylose, incluant la maladie d'Alzheimer, ou utilisée dans le traitement thérapeutique du diabète de type II ou de maladies auto-immunes chez un sujet. Par rapport au procédé décrit dans la publication De Beer, l'introduction des étapes de recalcification du plasma frais décongelé, de chromatographie d'interactions hydrophobes, de chromatographie de pseudo-affinité sur hydroxyapatite et de chromatographie d'affinité sur protéine A présentes dans le R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc nouveau procédé de purification du composant amyloïde P sérique humain, autorise un mode de production à l'échelle industrielle, du fait de la reproductibilité de ces étapes. De plus, dans le procédé mis au point par De Beer, il n'est nullement fait état de processus de sécurisation bactérienne ou virologique, l'étape de solvant/détergent permet donc une réelle avancée en matière d'inactivation virale. Par rapport à la publication de Urbanyi Z, on notera que les paramètres physico-chimiques sur lesquels reposent les principes de séparation relatifs aux chromatographies d'affinité sur Sépharose 6B (agarose), sont totalement différents de ceux mis en oeuvre dans les chromatographie échangeuse d'ions, chromatographie d'interactions hydrophobes et chromatographie de pseudo-affinité sur hydroxyapatite. Ainsi, l'invention fournit un procédé de purification de la protéine amyloïde P sérique à partir d'un matériel de départ caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) une étape de recalcification, b) une étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes. L'invention a encore pour objet la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. Cette protéine a une capacité de liaison à un ligand naturel de la protéine amyloïde P sérique qui est préservée à l'issue du procédé selon l'invention. Cette protéine se lie au site de liaison des fibrilles amyloïdes et présente par ailleurs une forte affinité pour les fibrilles amyloïdes. L'invention a encore pour objet un anticorps dirigé contre la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention. L'invention a encore pour objet une méthode de détermination de la présence de dépôts amyloïdes dans un tissu ou un organe chez un sujet caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : (i) l'administration systémique de la protéine amyloïde P selon l'invention; (ii) la détection à l'aide d'une gamma caméra d'un signal dans le tissu ou l'organe, ledit signal étant émis par ladite protéine ; et (iii) l'obtention d'au moins une image du tissu ou de l'organe, ladite image étant obtenue comme une sortie de données à partir d'une gamma-caméra. L'invention a encore pour objet une méthode de détermination de la présence de dépôts amyloïdes dans un tissu ou un organe chez un sujet (test diagnostic de dépistage) caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : (i) l'administration systémique de la protéine amyloïde P selon l'invention; (ii) la quantification dans un échantillon biologique dudit sujet du signal émis par ladite R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc protéine administrée ; et (iii) l'établissement d'un ratio entre la quantité de protéine quantifiée à l'étape (ii) et la quantité de protéine administrée à l'étape (i). La méthode de détermination de la présence de dépôts amyloïdes dans un tissu ou un organe chez un sujet selon la présente demande de brevet se différencie donc de la demande de brevet WO 95/14234 en ce que la quantification du signal émis par ladite protéine P purifiée selon le nouveau procédé de purification et administrée de façon systémique, se fait soit par scintigraphie grâce à une gamma-caméra, soit par prélèvement d'un fluide biologique dudit sujet, de préférence du sang ou de l'urine, et par l'établissement d'un ratio entre la quantité de protéine quantifiée dans l'échantillon et la quantité de protéine administrée. L'invention a aussi pour objet un kit de détermination par scintigraphie de la présence de dépôts amyloïdes dans un tissu ou un organe chez un sujet comprenant comme réactif la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention et radiomarquée. L'invention a encore pour objet la protéine amyloïde P selon l'invention pour le diagnostic ou le traitement thérapeutique et/ou prophylactique de l'amylose, incluant la maladie d'Alzheimer, chez un sujet, ou pour diagnostic ou le traitement du diabète de type II chez un humain, ou pour le diagnostic ou le traitement de maladies auto-immunes chez un sujet. La protéine amyloïde P selon l'invention est utilisée dans les traitements selon l'invention comme ligand ou vecteur pour transporter une molécule thérapeutique d'intérêt. Brève description des figures Figure 1 : Schéma résumant les étapes de purification de la protéine amyloïde P sérique humaine selon un mode de réalisation particulier de l'invention. Figure 2 : Gel en Bleu de Coomassie (Blue Safestain, Invitrogen) de l'éluat en sortie de la colonne de chromatographie d'interaction hydrophobe- Gel Novex Tris glycine 4-20% (InVitrogen, EC6025 Box), 40mA constant dans le Tampon Tris-Glycine-SDS (TGS) 1X contenant0.025M de Tris base, 0.192M de Glycine, 0.1% (v/v) de SDS dans 1L d'eau à pH 8.3±0.2 - Dénaturation des échantillons à +95°C pendant 5 minutes dans du tampon standard de dénaturation SB 5x , contenant 0,313 M de Tris-HC1, 50% de glycérol (v/v), 100 g/L SDS, 0,5 g/L de BBP et 25 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol dans une solution à pH 6,8. -Puit MW : Marqueur de poids moléculaire (BenchMarkproteinladder, InVitrogen, 10747-012), 5.1 - Puit 1 : Chargement - Puit 2 : Fraction non retenue/Lavage - Puit 3 : Lavage 1 - Puit 4 : Lavage 2 - Puit 5 : Lavage 3 - Puit 6 : Pic d'élution - Puit 7 : Fin Elution - Puit 8 : Régénération - Puit 9 : Pic d'élution (dosage 1 µg). R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Figure 3 : Gel en Bleu de Coomassie (Simply Blue Safestain, Invitrogen) de l'éluat en sortie de la colonne de chromatographie d'hydroxyapatite- Gel Novex Tris glycine 4-20% (InVitrogen, EC6025 Box), 40mA constant dans le Tampon TGS 1X-Dénaturation des échantillons à +95°C pendant 5 minutes dans du tampon standard de dénaturation SB 5x. Puit MW : Marqueur de poids moléculaire (BenchMarkproteinladder, InVitrogen, 10747-012), 5.1 - Puit 1 : Chargement - Puit 2 : Fraction non retenue/Lavage - Puit 3 : Lavage 10 mM PO4 - Puit 4 : Lavage 60 mM PO4 - Puit 5 : Elution 100 mM PO4 - Puit 6 : Régénération - Puit 7 : Fin Elution - Puit 8 : Elution 100 mM PO4 (10 µg). Figure 4: Gel de western-blot - Marqueur de poids moléculaire (BenchMarkPre-stainedproteinladder, InVitrogen, 10748-010): 10.1 - Ac primaire: Rabbitanti-SerumAmyloid P Component (Calbiochem, 565191), 1/7500, 1H - Ac secondaire: Anti-rabbitAlkaline Phosphatase conjugated (Promega, S373B), 1/7500, 1H - Révélation: NBT/BCIP - Puit 1: Marqueur de poids moléculaire (5µL) - Puit 2 :Sample Buffer 1X (20 µL) - Puit 3: R125/Pool Hydroxyapatite concentré (10 µg) - Puit 4 : Sample Buffer 1X (20 µL) - Puit 5 : BSA 0.2% (0.02 µg) - Puit 6 : BSA 0.5% (0.05 µg) - Puit 7 : BSA 1% (0.10 µg) - Puit 8 : BSA 1.5% (0.15 µg) - Puit 9 : BSA 2% (0.20 µg) - Puit 10 : BSA 4% (0.40 µg). Figure 5 : Test de compétition de liaison dont les résultats sont présentés sous forme de graphes avec en abscisse la valeur de densité optique (DO) mesurée à 450-620 nm pour des concentrations croissantes en fibronectine libre (µg/ml) Figure 5A : fibronectine liée au support de revêtement 10 µg/ml ; protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention ou protéine amyloïde P sérique disponible commercialement (standard) 12.5 µg/ml - Figure 5B : fibronectine liée au support de revêtement 10 µg/ml ; protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention ou standard 12.5 µg/m1- Figure 5C : fibronectine liée au support de revêtement 10 µg/m1 ; protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention ou standard 50 µg/ml. Figure 6 : Gel de SDS-PAGE en conditions réductrices ou non réductrices avant la chromatographie d'affinité sur protéine A. Figure 7 : Gel en Bleu de Coomassie (Simply Blue Safestain, Invitrogen) de l'éluat en sortie de la colonne de chromatographie d'affinité sur protéine A - Gel Novex Tris glycine 4-20% (InVitrogen, EC6025 Box), 40mA constant dans le Tampon Tris-Glycine-SDS (TGS) 1X contenant0.025M de Tris base, 0.192M de Glycine, 0.1% (v/v) de SDS dans 1L d'eau à pH 8.3±0.2 - Dénaturation des échantillons à +95°C pendant 5 minutes dans du tampon standard de dénaturation SB 5x , contenant 0,313 M de Tris-HC1, 50% de glycérol (v/v), 100 g/L SDS, 0,5 g/L de BBP et 25 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol dans une solution à pH 6,8. -Puit MW : R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Marqueur de poids moléculaire (BenchMarkproteinladder, InVitrogen, 10747-012), 1.1 - Puit 1 : Chargement - Puit 2: Fraction non retenue/Lavage - Puit 3 : régénération. Description détaillée de modes de réalisation de l'invention. Dans le cadre de la présente invention, on désigne par « amylose » ou « amyloïdose » ou « maladie amyloïde » une maladie caractérisée par l'accumulation extracellulaire du composant amyloïde P tissulaire dans les divers organes et tissus du corps. L'amylose, qui est une maladie directement causée par le dépôt d'amyloïde dans les tissus, comprend à la fois l'amylose locale, où les dépôts sont limités à une région anatomique et/ou un tissu ou organe, et l'amylose systémique dans laquelle les dépôts peuvent se produire dans tout type d'organes ou de tissus du corps. Par « protéine amyloïde P sérique », on désigne toute forme de protéine amyloïde P sérique présentant une affinité dépendante du calcium pour les dépôts de fibrilles amyloïdes. Ce terme englobe également les dérivés biologiquement actifs de la protéine amyloïde P sérique comme par exemple ceux ayant subi une ou plusieurs modifications post-traductionnelles ou toute autre forme naturellement présente dans le sang. Par «protéine amyloïde P sérique », on désigne également le composant amyloïde P tissulaire retrouvé dans les dépôts amyloïdes et qui est identique à la protéine amyloïde P sérique. Par « ligand naturel de la protéine amyloïde P sérique », on entend toute substance naturelle ou dérivée d'une substance naturelle capable de se lier à la protéine amyloïde P sérique de façon calcium dépendante telle que la phosphoéthanolamine, la fibronectine, la molécule Clq, le collagène, la phosphocholine, l'ADN et la chromatine, les complexes immuns, les sucres et en particulier le méthyle 4,6-0-(1-carboxyéthylidène)-(3-D-galactopyranoside (MO13DG), des composants du complément, toutes les formes de fibrilles amyloïdes, la protéine de liaison C4 et les glycosaminoglycanes. Par « anticorps dirigé contre la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'invention », on entend une molécule d'immunoglobuline ou un fragment en dérivant capable d'interagir et de se lier spécifiquement à un épitope de la protéine amyloïde P sérique ou à un fragment en dérivant. Par « diagnostic de l'amylose », on entend l'identification de toutes les formes d'amylose, qu'elles soient localisées ou systémiques. Les formes les plus fréquentes sont les amyloses AL (immunoglobuliniques) primitives et secondaires, les amyloses AA (inflammatoires) secondaires aux maladies inflammatoires chroniques (Polyarthrite rhumatoïde...), les amyloses ATTR (à transthyrétine), héréditaires, les R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc amyloses des dialysés, l'amylose associée à la fièvre familiale méditerranéenne, la maladie d'Alzheimer. Par « maladies auto-immunes », on entend une maladie caractérisée par la rupture des mécanismes de tolérance qui conduit à l'action pathogène du système immunitaire vis-à-vis de constituants naturels de l'organisme. Parmi les maladies auto-immunes, on distingue les maladies auto-immunes spécifiques d'organes telles que le diabète de type 1, la thyroïdite auto-immune, les hépatopathies auto-immunes, les myasthénie, les maladies bulleuses auto-immunes, le vitiligo, la uvéite auto-immune, la rétinite auto-immune, la cytopénies auto-immunes, des maladies auto- immunes systémiques (non spécifiques d'organes) telles que le lupus systémique, le syndrome de Gougerot-Sjôgren, la polyarthrite rhumatoïde, la sclérodermie, la polymyosite et dermato-polymyosite, la connectivite mixte, la vascularite primitive et la polychondriteatrophiante. Par « scintigraphie », on entend une méthode d'imagerie médicale qui procède par l'administration (systémique), dans l'organisme, d'isotopes radioactifs afin de produire une image médicale par la détection des rayonnements émis par ces isotopes après captation par les organes à examiner. Pour cela, on injecte au sujet une molécule vectrice associée à un marqueur radioactif. La molécule vectrice se localise de façon sélective sur une structure particulière de l'organisme. Le marqueur radioactif sert "d'émetteur" et renseigne sur sa localisation. Le marqueur radioactif émet un rayonnement à la fois adapté à sa détection et de très faible toxicité. Le délai de fixation sur l'organe cible est variable ce qui explique l'attente entre l'injection et les acquisitions d'image. La scintigraphie peut se référer à un système d'imagerie comprenant une gamma-caméra (caméra à scintillation) capable de détecter et de former une image au niveau de la source de rayonnement gamma. Le système d'imagerie peut également comprendre les appareils informatiques et logiciels destinés à produire une image dans une forme apparente à l'observateur, et d'analyser l'image pour obtenir des renseignements tels que l'intensité du rayonnement gamma émis ainsi que sa localisation. Par « suivi de traitement de l'amylose », on entend toute action (comme l'administration d'un ou plusieurs composés ou des compositions pharmaceutiques) initiée après le début des manifestations cliniques de l'amylose de manière à suivre, temporairement ou définitivement, l'évolution d'une manifestation clinique ou la progression de l'amylose. Par « prévention de l'amylose », on entend toute action (comme l'administration d'un ou plusieurs composés ou compositions pharmaceutiques) qui débute avant l'apparition d'un symptôme clinique de l'amylose de manière à prévenir, supprimer ou réduire, de façon temporaire ou permanente, l'apparition d'une R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc manifestation clinique de l'amylose chez un patient sain ou atteint d'amylose ou présentant un risque d'amylose, y compris la maladie d'Alzheimer. La protéine amyloïde P selon l'invention est alors liée à la molécule thérapeutique. Par « traitement thérapeutique de l'amylose », on entend toute action (comme l'administration d'un ou plusieurs composés ou compositions pharmaceutiques) qui débute après l'apparition d'un symptôme clinique de l'amylose (y inclus la maladie d'Alzheimer), de manière à supprimer ou réduire, de façon temporaire ou permanente, l'apparition d'une manifestation clinique de l'amylose. La protéine amyloïde P selon l'invention est alors liée à la molécule thérapeutique. Par « traitement thérapeutique du diabète de type II ou de maladies auto-immunes », on entend toute action (comme l'administration d'un ou plusieurs composés ou compositions pharmaceutiques) qui débute après l'apparition d'un symptôme clinique du diabète de type II ou de maladies auto-immunes, de manière à supprimer ou réduire, de façon temporaire ou permanente, l'apparition d'une manifestation clinique du diabète de type II ou de maladies auto-immunes chez un patient atteint du diabète de type II ou de maladies auto-immunes. La protéine amyloïde P selon l'invention est alors liée à la molécule thérapeutique. Par « sujet », on entend tout animal, de préférence mammifère et de manière préférée, d' origine humaine. Par « procédé de purification », on désigne un procédé permettant de séparer la protéine amyloïde P sérique des autres molécules contenues dans le matériel de départ. Ces molécules peuvent être des protéines différentes de la protéine amyloïde P sérique, des virus, des bactéries, des spores, du milieu de culture, du sérum de veau foetal, cette liste n'étant pas limitative. Par « matériel de départ », on entend un échantillon contenant la protéine amyloïde P sérique. Le matériel de départ peut être d'origine recombinante, transgénique ou plasmatique. Dans le cas où le matériel de départ est d'origine recombinante, il est issu d'un système unicellulaire, dans lequel on a induit l'expression de la protéine amyloïde P sérique par la transfection d'un vecteur contenant le gène codant pour la protéine amyloïde P sérique, de préférence le gène codant pour la protéine humaine, dans des lignées cellulaires animales ou humaines. De tels systèmes cellulaires expriment la protéine amyloïde P sérique au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier. Dans le cas où le matériel de départ est d'origine transgénique, il est issu d'un système pluricellulaire, notamment un animal ou une plante obtenu par transgénèse, c'est-à-dire dans lesquels une ou plusieurs cellules ont reçu une molécule d'ADN recombinant. A titre d'exemple on peut citer les chiens, les chats, les souris, les rats, le hamster, les vaches, les chèvres, les moutons, les lapins et les porcs, les chevaux, les insectes, les plantes, par exemple R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc le tabac, le soja, cette liste n'étant pas limitative. Dans le cas des animaux produisant la protéine amyloïde P sérique, cette production peut avoir lieu dans le sang ou dans divers milieux sécrétés par l'animal, par exemple l'urine, la salive, le lait, cette liste n'étant pas limitative. De telles méthodes de production peuvent être réalisées au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier. Dans le cas où le matériel de départ est d'origine plasmatique, il peut s'agir de plasma d'origine animale, de préférence mammifère et préférentiellement humaine. Par « échantillon biologique », on entend un échantillon contenant la protéine amyloïde P sérique qui est un fluide biologique. L'échantillon biologique est notamment du sang, de l'urine, de la salive, des extraits de ces fluides comme du plasma ou du sérum. Par « plasma », on désigne la partie liquide du sang, dans laquelle les cellules sont en suspension. Le plasma peut être séparé de la partie cellulaire d'un prélèvement de sang total pour un usage thérapeutique sous la forme de plasma frais congelé ou en vue d'une transformation ultérieure en cryoprécipité et en plasma dépourvu de cryoprécipité à des fins transfusionnelles. Il peut être utilisé pour la fabrication de médicaments dérivés de sang humain ou de plasma humain ou servir dans la préparation de mélanges de concentrés de plaquettes ou de mélanges de concentrés de plaquettes déleucocytés. Par « plasma frais congelé », on entend le plasma surnageant séparé d'un don de sang total ou de plasma prélevé par aphérèse, congelé et stocké. Le plasma frais congelé est conservé à une température de -25°C pendant une durée maximale d'un an. Par « étape de recalcification », on entend l'incubation du matériel de départ dans une solution de sels de calcium, de préférence de chlorure de calcium (CaC12), de préférence dans une solution tampon de CaC12 à une concentration finale comprise entre 1 mM et 50 mM, avantageusement à une concentration finale comprise entre 5 mM et 20 mM, et de manière préférée à une concentration finale de 10 mM. Préférentiellement, l'étape de recalcification est réalisée à une température sensiblement ambiante (par exemple de 25 ± 1°C) pendant 2 heures et sous faible agitation (100 rpm). Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de recalcification se produit par incubation du matériel de départ dans une solution contenant en outre des sels de magnésium, de préférence de chlorure de magnésium (MgC12), de préférence dans une solution tampon de MgC12 à une concentration finale comprise entre 1 mM et 50 mM, avantageusement à une concentration finale comprise entre 5 mM et 20 mM, et de manière préférée à une concentration finale de 10 mM. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Par « chromatographie d'interactions hydrophobes », on entend une technique de séparation des protéines d'après leurs propriétés d'hydrophobes. Dans ce type de chromatographie, les groupes hydrophobes tels que des groupements hydrophobes en C6, C8, C16, C18 ou encore tels que le phényle, l'octyle, le butyle, sont attachés à la colonne stationnaire. Les protéines qui traversent la colonne et qui possèdent à leurs surfaces des régions hydrophobes sont capables d'interagir et de se lier aux groupes hydrophobes fixés à la colonne. Ces interactions nécessitent l'ajout d'une solution tampon de force ionique élevée fortement concentrée en sels pour réduire la solvatation des solutés de l'échantillon et permettre l'adsorption des chaînes latérales d'acides aminés hydrophobes ainsi exposées. Plus la molécule d'intérêt est hydrophobe, moins il sera nécessaire d'avoir une solution tampon à haute teneur en sel pour que la liaison ait lieu. Pour éluer les protéines, la concentration en sel des solutions d'élution décroît afin de diminuer l'hydrophobicité. Parmi les sels préférablement utilisés dans la présente invention pour éluer, on peut citer le Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, NaCl, NH4C1, NaBr, NaSCN, et de manière préférée NaCl. Par « agents chélateurs », on désigne tout agent ayant une affinité particulière pour les sels alcalino-terreux et les métaux, avec lesquels il forme des composés solubles stables, où l'élément associé perd ses propriétés ioniques. Des exemples d'agents chélateurs capables de chélater le calcium sont l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA), l'acide éthylèneglycol-bis(bêta-aminoéthyléther)-N,N,N tétraacétique (EGTA) ou le citrate. Par « chromatographie d'affinité », on entend un procédé de purification de substances particulières d'une solution par exploitation de leur capacité à établir une liaison spécifique avec une/des molécule(s) connue(s). Le mélange à purifier est injecté à travers une colonne contenant un milieu solide sur lequel la molécule liante est attachée d'une façon covalente. Il existe plusieurs types de chromatographie d'affinité comme par exemple la chromatographie par immuno-affinité, la chromatographie par pseudo-affinité ou la chromatographie par affinité pour les ions métalliques. Par « chromatographie d'affinité sur protéine A ou protéine G », on entend une chromatographie ayant pour molécule liante attachée au milieu solide de chromatographie une protéine A ou une molécule dérivée d'une protéine A (chromatographie d'affinité sur protéine A) ou une protéine G ou une molécule dérivée d'une protéine G (chromatographie d'affinité sur protéine G). Préférentiellement, la chromatographie d'affinité sur protéine A utilise une matrice d' agarose sur laquelle est fixée une molécule liante dérivée de la protéine A stable dans des conditions alcalines. De manière préférée, la chromatographie d'affinité sur protéine A est une chromatographie d'affinité de type MabSelectSuRe. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Par « protéine A », on entend une protéine découverte à l'origine dans la paroi cellulaire des Staphylococcus qui se lie spécifiquement à une portion Fc d'une immunoglobuline G (IgG). Aux fins de la présente invention, la protéine A est une protéine identique ou similaire à la protéine A de Staphylococcus, notamment disponible dans le commerce et/ou des formes recombinantes de protéine A, ayant la capacité de se lier à une portion Fc d'une IgG. Par «protéine G », on entend une protéine à l'origine découverte dans la paroi cellulaire de Streptococcus qui se lie spécifiquement à une partie Fc d'une IgG. Aux fins de la présente invention, la protéine G est une protéine identique ou similaire à protéine G de streptocoques, notamment disponible dans le commerce et/ou des formes recombinantes de protéine G, ayant la capacité de se lier à une portion Fc d'une IgG. Par « chromatographie de pseudo-affinité », on désigne un procédé de purification de substances particulières d'une solution associant en même temps plusieurs modes de séparation par chromatographie. Avantageusement, une chromatographie de pseudo-affinité selon l'invention associe une chromatographie d'affinité avec au moins une autre technique de chromatographie comme par exemple une chromatographie échangeuse d'ions. Préférentiellement, une chromatographie de pseudo-affinité selon l'invention est une chromatographie sur hydroxyapatite. Par «hydroxyapatite », on désigne un composé inorganique à base de phosphate de calcium ayant la formule empirique Cas (PO4) 3(OH). A l'état naturel, on retrouve ce composé essentiellement dans les os et l'émail dentaire. Les différents mécanismes de liaison de l'hydroxyapatite sont utilisés dans les séparations chromatographiques où il agit principalement comme adsorbant, mais a également les propriétés d'un matériau échangeur d'ionset permet la séparation de protéines, enzymes, immunoglobulines et acides nucléiques. Divers matériaux d' hydroxyapatite sont connus. La résine hydroxyapatite utilisée dans l'invention peut être par exemple ceramic-Hydroxyapatite, Biogel HT, etc. Par « chromatographie sur hydroxyapatite », on entend une chromatographie sur un support d'hydroxyapatite. Le support d'hydroxyapatite est un support multimodale (« mixed-mode »). Le support d'hydroxyapatite permet principalement deux types d'interactions, des interactions résultantes de l'affinité des groupements carboxyles des protéines pour les ions calcium de l'hydroxyapatite et des liaisons ioniques entre les groupes chargés positivement aminés d'une protéine et les charges négatives des groupes phosphates de l'hydroxyapatite. Les résidus carboxyles d'une protéine se lient au support d'hydroxyapatite en raison de leur affinité pour le calcium et les résidus amines se lient par échange de cations. Les interactions mettant R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc en jeu le calcium peuvent seulement être éluées avec des ions ayant une haute affinité pour le calcium, comme par exemple le phosphate. Les interactions échangeuses de cations peuvent être éluées avec un sel. Avantageusement, la chromatographie sur hydroxyapatite est une chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite de type hydroxyapatite céramique. La chromatographie sur hydroxyapatite selon l'invention permet d'éliminer les protéines de haut poids moléculaire qui sont éluées avec la protéine amyloïde P sérique lors de l'étape (b) de chromatographie d'interactions hydrophobes. L'élimination de ces protéines de haut poids moléculaire contribue à l'obtention d'un composant amyloïde P sérique purifié. Il en résulte que l'éluat de protéine amyloïde P sérique résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite est significativement enrichi. Par « solvant-détergent », on entend tout mélange solvant-détergent approprié connu de l'homme du métier se composant de manière préférentielle d'un mélange Tween (polysorbate 80)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1%(v/v) - TnBP 0,3% (v/v). Le traitement d'inactivation virale par solvant-détergent est généralement mis en oeuvre pendant une durée de quelques heures (par exemple 6 heures), à une température sensiblement ambiante (par exemple de 25 ± 1°C). Dans un autre mode de réalisation, le traitement d'inactivation virale par solvant-détergent est mis en oeuvre pendant une durée d'environ 16 heures à la température de +4°C. Dans un mode de réalisation particulier, le traitement d'inactivation virale est effectué sous la forme d'un traitement par tri-n-butylphosphate, Triton X-100 ou cholate sodium. Par « diafiltration » d'une solution, on entend toute étape appropriée de clarification et purification des protéines, connue de l'homme du métier, consistant à séparer des protéines par filtration d'une solution sur une membrane, de préférence une membrane Millipore de Polyethersulfone, causée par une différence de pressions et l'ajout d'eau ou d'une solution appropriée au rétentat retardé sur la membrane afin de mieux éliminer les impuretés et petites molécules (sucres, sels...) qu'il contient. Par « concentration » d'une solution, on entend toute étape appropriée consistant à éliminer une partie plus ou moins importante de l'eau qu'elle contient par différents procédés connus de l'homme du métier. Il en résulte que l'éluat issu de cette étape de concentration est significativement enrichi en protéine d'intérêt. Par « nanofiltration » d'une solution, on entend tout procédé de séparation en phase liquide, connu de l'homme du métier, utilisant la filtration tangentielle au travers d'une membrane semi-perméable, de préférence un filtre Planova 15N (Asahi) ou Viresolve Pro Modus 1.1., sous l'action d'une pression et permettant d'éliminer une partie plus ou moins importante de impuretés, bactéries ou virus qu'elle contient. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de recalcification (a) correspond à l'incubation d'un matériel de départ dans une solution de CaC12, de préférence dans une solution tampon de CaC12 à une concentration finale comprise entre 1 mM et 50 mM, avantageusement à une concentration finale comprise entre 5 mM et 20 mM, et de manière préférée à une concentration finale de 10 mM. Préférentiellement, l'étape de recalcification est réalisée à une température sensiblement ambiante (par exemple de 25 ± 1°C) pendant 2 heures et sous faible agitation (100 rpm). Avantageusement, le matériel de départ est du plasma frais décongelé. Préférentiellement, la décongélation du plasma frais a lieu pendant 16 à 20 heures à une température comprise entre +2°C et +8°C. Dans un mode de réalisation particulier, la décongélation du plasma frais a lieu pendant 16 à 20 heures, de préférence à température ambiante. Avantageusement, l'étape de recalcification (a) est précédée d'une étape d'incubation du matériel de départ à une température sensiblement ambiante (par exemple de 25 ± 1°C) pendant 1 heure. Avantageusement, l'étape de recalcification (a) est suivie d'une étape de séparation de phase, de préférence par centrifugation en un surnageant. Préférentiellement, la centrifugation se produit pendant 20 minutes à une vitesse de 4000g et à la température de +4°C. Dans un mode de réalisation particulier, la centrifugation se produit pendant 20 minutes à une vitesse de 4000g et de préférence à température ambiante. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes (b) est mise en oeuvre sur une phase stationnaire comportant des groupements hydrophobes de type phényle. Avantageusement, l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes (b) utilise comme solution d'équilibration et/ou de lavage une solution tampon comprenant du CaC12 à une concentration comprise entre 1 mM et 50 mM, avantageusement à une concentration comprise entre 5 mM et 20 mM, et de manière préférée à une concentration de 10 mM. Dans un mode de réalisation particulier, la solution de lavage comprend en outre des sels de sodium, de préférence du chlorure de sodium (NaCl) à une concentration comprise entre 50 mM et 1,5 M, de manière préférée entre 100 mM et 1 M, de manière préférée entre 150 mM et 500 mM. Avantageusement, la colonne stationnaire de chromatographie d'interactions hydrophobes est lavée avec des solutions de lavage de concentration croissante en sels de sodium, de préférence de concentration croissante en NaCl. Dans un mode de réalisation préférée, l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes (b) utilise comme solution R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc d'équilibration et/ou de lavage une solution Tris 20 mM, CaC12 10 mM, pH7.5. Dans un mode de réalisation particulier, la colonne stationnaire de chromatographie d'interactions hydrophobes est lavée avec une première solution Tris 20 mM, CaC12 10 mM, pH7.5, puis avec des solutions de lavage Tris 20 mM, CaC12 10 mM, pH7.5 de concentration croissante en NaCl. De manière préférée, la colonne stationnaire de chromatographie d'interactions hydrophobes est lavée avec une solution Tris 20 mM, CaC12 10 mM, pH7.5 et/ou une solution Tris 20 mM, CaC12 10 mM, NaCl 150 mM, pH7.5 et/ou une solution Tris 20 mM, CaC12 10 mM, NaCl 500 mM, pH7.5 et/ou une solution Tris 20 mM, CaC12 10 mM, NaCl 1M, pH7.5. Avantageusement, l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes (b) utilise comme solution d'élution une solution tampon dépourvue de CaC12 et/ou dépourvue d'agent chélateur, de préférence une solution tampon saline, avantageusement dont la concentration en sels est supérieure à 150 mM, avantageusement de concentration en sels supérieure à 300 mM, avantageusement de concentration en sels supérieure à 500 mM, et de manière préférée de concentration en sels égale à 1 M, le sel étant de préférence NaCl. Dans un mode de réalisation préférée, l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes (b) utilise comme solution d'élution une solution Tris 20 mM, NaCl 1M, pH7.5. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de purification selon l'invention comprend en outre une étape (c) de chromatographie de pseudo-affinité sur hydroxyapatite ; dans un mode de réalisation préférée, l'étape de séparation par chromatographie de pseudo-affinité est une chromatographie sur hydroxyapatite de type hydroxyapatite céramique. Dans un mode de réalisation préférée, l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite permet l'élimination des protéines de haut poids moléculaire éluées avec la protéine amyloïde P sérique lors de l'étape (b) de chromatographie d'interactions hydrophobes. Leur élimination contribue à l'obtention d'un composant amyloïde P sérique purifié. Il en résulte que l'éluat de protéine amyloïde P sérique résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite est significativement enrichi. Le degré de pureté de la protéine amyloïde P sérique obtenue à l'issue de l'étape (c) de chromatographie de pseudo-affinité sur hydroxyapatite est supérieur ou égal à 94%, de manière préférée supérieur ou égal à 95%, de manière préférée supérieur ou égal à 96% et de manière encore plus préférée supérieur ou égal à 97%, avantageusement encore supérieur ou égal à 98%. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de purification selon l'invention comprend en outre une étape d'inactivation virale. Avantageusement, l'étape d'inactivation virale est mise en oeuvre sur l'éluat issu de l'étape (b). R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Dans un mode de réalisation particulier, l'éluat résultant de l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes (b) et inactivé viralement selon l'étape d'inactivation virale est chargé directement sur la résine d'hydroxyapatite, la purification sur hydroxyapatite permettant d'éliminer sensiblement l'intégralité du solvant et du détergent présents dans la fraction de protéine amyloïde P sérique. Dans un mode de réalisation préférée, l'étape d'inactivation virale permet d'inactiver les virus enveloppés et de sécuriser d'un point de vue virologique la protéine amyloïde P purifiée selon l'invention et destinée à une administration à des fins de diagnostic, de suivi de traitement et/ou de prévention de l'amylose. Avantageusement, l'étape d'inactivation virale se fait par un traitement solvant/détergent, de préférence en présence d'un mélange Tween (polysorbate 80)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1%(v/v) - TnBP 0,3% (v/v) final. Dans un mode de réalisation particulier, le traitement d'inactivation virale peut également être effectué sous la forme d'un traitement par tri-n-butylphosphate, Triton X-100 ou cholate sodium. Dans un mode de réalisation préféré, l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite (c) utilise comme solution d'équilibrage et/ou de lavage et/ou d'élution une solution phosphate et de manière préférée une solution de phosphate de sodium. Préférentiellement, l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite (c) utilise comme solution d'équilibrage et/ou de lavage une solution phosphate de concentration comprise entre 5 mM et 50 mM, et de manière préférée de concentration 10 mM. Préférentiellement, l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite (c) utilise comme solution d'équilibrage et/ou de lavage une solution Phosphate 10 mM, pH7.5. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite (c) comprend une première étape de lavage avec une solution Tris 20 mM, NaCl 1M TnBP0.3%, Tween80 1% pH7.5. Préférentiellement, l'étape (c) de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite utilise comme solution d'élution une solution phosphate de concentration comprise entre 25 mM et 250 mM, avantageusement de concentration comprise entre 50 mM et 200 mM, et de manière préférée de concentration 100 mM. Préférentiellement, l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite (c) utilise comme solution d'élution une solution Phosphate 100 mM, pH 7.5. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Le degré de pureté de la protéine amyloïde P sérique obtenue à l'issue de l'étape (c) de chromatographie sur hydroxyapatite est supérieur ou égal à 94%, de manière préférée supérieur ou égal à 95%, de manière préférée supérieur ou égal à 96% et de manière encore plus préférée supérieur ou égal à 97%, avantageusement supérieur ou égal à 98%. Dans un mode réalisation particulier, le procédé de purification selon l'invention comprend en outre une étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A ou G, et de manière préférée par chromatographie d'affinité sur protéine A. Dans un mode de réalisation préférée, l'étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A utilise comme solution d'équilibration et/ou de lavage une solution tampon comprenant un agent chélateur et de manière préférée, une solution Tris 10 mM, EDTA 10 mM, pH8.0. Dans un mode de réalisation particulier, la solution d'équilibration et/ou de lavage de l'étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A comprend en outre des sels dont la concentration est comprise entre 50 mM et 500 mM, avantageusement entre 100 mM et 250 mM, et de manière préférée dont la concentration en sels est de 140 mM, le sel étant de préférence NaCl. Avantageusement, l'étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A utilise comme solution d'équilibration et/ou de lavage une solution Tris 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 140 mM, pH8.0. Le degré de pureté de la protéine amyloïde P sérique atteint à l'issue de l'étape (d) de chromatographie d'affinité sur protéine A est supérieur ou égal à 96%, de manière préférée supérieur ou égal à 97%, de manière préférée supérieur ou égal à 98% et de manière encore plus préférée supérieur ou égal à 99%. Avantageusement, la protéine amyloïde P sérique obtenue à l'issue de l'étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A est sensiblement dépourvue de protéines contaminantes et en particulier, dépourvue d'immunoglobulines, de manière préférée d'immunoglobulines M et G, de facteur C3 du complément, cette liste n'étant pas limitative. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de purification selon l'invention comprend en outre une ou plusieurs étapes de concentration et/ou de diafiltration. Préférentiellement, à l'issue de l'étape de concentration, la concentration de la solution éluée est comprise entre 0.25 mg/mL et 5 mg/mL, avantageusement de concentration comprise entre 0.5 mg/mL et 2 mg/mL, et de manière préférée de concentration 1mg/mL. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de diafiltration se fait sur membrane Millipore de Polyethersulfone (PES) 30kDa 50cm2. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de diafiltration utilise comme solution de lavage une solution Tris 10mM, NaCl 140mM, EDTA 10mM, pH8.0. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de diafiltration utilise comme solution de lavage une solution Tris 10 mM, EDTA 10 mM pH8.0. Avantageusement, l'éluât issu de l'étape (c) de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite est diafiltré, préalablement à sa charge sur la colonne de chromatographie d'affinité sur protéine A de l'étape (d), contre une solution Tris 10 mM, EDTA10 mM, pH8.0. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de diafiltration utilise comme solution de lavage une solution Tris 10 mM, pH8.0. Avantageusement, l'éluât issu de l'étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A est diafiltré contre une solution Tris 10 mM, pH8.0. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de purification selon l'invention comprend au moins une étape additionnelle d'élimination virale effectuée de préférence par nanofiltration, permettant d'inactiver viralement l'éluât du composant amyloïde P sérique issu de l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite(c) ou de l'étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A. Dans un autre mode de réalisation préférée de l'invention, l'étape d'élimination virale effectuée par nanofiltration se fait de préférence sur des filtres de porosité inférieure à 35 nm, préférablement inférieure à 20 nm, plus préférablement sur un filtre ayant une porosité de 15 nm, de préférence sur au moins un filtre Planova 15N (Asahi). L'étape d'élimination peut être mise en oeuvre éventuellement en deux étapes avec des porosités décroissantes. Dans un mode particulier de réalisation, l'étape d'élimination virale effectuée par nanofiltration se fait de préférence sur des filtres Viresolve Pro Modus 1.1. Avantageusement, l'étape d'élimination virale effectuée par nanofiltration avec des filtres Viresolve Pro Modus 1.1 utilise comme solution d'équilibration et/ou de lavage une solution Tris 10mM, EDTA 10 mM, NaCl 140 mM, pH8.0. Une telle étape de nanofiltration permet plus particulièrement de sécuriser la protéine amyloïde P purifiée selon l'invention vis-à-vis des virus enveloppés ou non-enveloppés (virus de type poliovirus ou parvovirus) et des agents transmissibles non conventionnels (type prion). Dans le cadre du procédé de l'invention, la nanofiltration est de préférence effectuée après l'étape (d) de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A dans la mesure où la présence de concentrations importantes de protéines de haut R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc poids moléculaires dans l'extrait protéique à filtrer conduit généralement au colmatage du filtre, a fortiori lorsque le procédé est mis en oeuvre à une échelle industrielle. La protéine amyloïde P purifiée résultant du procédé comprenant l'étape d'élimination virale susmentionnée se révèle conforme aux recommandations internationales émises par l'EMEA ou la FDA en ce qui concerne les produits plasmatiques et biotechnologiques, dans la mesure où elle satisfait à la fois aux conditions de sécurité requises pour les virus non enveloppés et pour les virus nus. Dans un mode de réalisation particulier, le matériel de départ selon l'invention est un plasma d'origine humaine ou non-humaine. Avantageusement, le haut degré de pureté de la protéine amyloïde P sérique obtenue par le procédé selon l'invention est caractérisé l'absence de contaminants sériques tels que le facteur du complément C3, des immunoglobulines (Ig), de manière préférée d'immunoglobulines M et G, cette liste n'étant pas limitative. Avantageusement, la protéine amyloïde P sérique obtenue par le procédé conserve ses propriétés biologiques et plus particulièrement son affinité pour des ligands naturels de la protéine amyloïde P sérique tels que la phosphoéthanolamine, la fibronectine, la molécule Clq, le collagène, la phosphocholine, l'ADN et la chromatine, les complexes immuns, les sucres et en particulier le méthyle 4,6-0-(1- carboxyéthylidène)-(3-D-galactopyranoside (MO13DG), des composants du complément, toutes les formes de fibrilles amyloïdes, la protéine de liaison C4 et les glycosaminoglycanes. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention est radiomarquée, avantageusement à l'iode 125 (125I), l'iode 123 (123I), l'iode 131 (131I), l'iode 124 (1241), l'indium 111 (111In) ou le technétium 99m (99mTc). La présente invention concerne également une méthode de détermination de la présence de dépôts amyloïdes dans un tissu ou un organe chez un sujet mettant en oeuvre la protéine amyloïde P purifiée selon l'invention et marquée à l'aide d'un radio-isotope. De tels radio-isotopes sont bien connus de l'homme du métier et comprennent par exemple l'iode 125 (125I), l'iode 123 (123I), l'iode 131 (131I), l'iode 124 (124I), l'indium 111 (111In) ou le technétium 99m. (99mTc), et de préférence l'iode 123. Le composant amyloïde P purifié et radiomarqué selon l'invention est administré en intraveineuse chez un sujet et le sujet est ensuite soumis à un procédé d'imagerie par scintigraphie. La scintigraphie est réalisée 24 heures après administration de la protéine amyloïde P purifiée radiomarquée et plusieurs prises de vue sont réalisées comme par exemple des prises de vue antérieure, postérieures du R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc sujet pris dans sa totalité. Le procédé d'imagerie utilise une gamma caméra pour détecter le signal émis par le composant amyloïde P sérique purifié et radiomarqué selon l'invention et obtenir ainsi une image de la plaque amyloïde au sein du tissu ou de l'organe. La présente invention concerne également une méthode de détermination d'une amylose chez un sujet. La protéine amyloïde P purifiée radiomarquée selon l'invention est administrée à un sujet par voie intraveineuse. Des échantillons biologiques sont prélevés 5, 15, 30, 60 minutes puis dans les 24 heures suivant l'administration de la protéine amyloïde P purifiée radiomarquée. Avantageusement, le prélèvement d'échantillon biologique se poursuit pendant au moins 48 heures suivant l'administration de la protéine amyloïde P purifiée radiomarquée, de préférence au moins 72 heures, au moins 6 jours suivant cette administration. Les échantillons biologiques sont de préférence un fluide biologique, avantageusement du sang ou de l'urine. A partir de ces échantillons biologiques sera quantifiée le signal émis par la protéine amyloïde P purifiée radiomarquée selon l'invention et un ratio entre la quantité de protéine et la quantité de protéine administrée sera calculé. La quantification du signal émis par la protéine amyloïde P purifiée radiomarquée selon l'invention est réalisée par des techniques connues de l'homme du métier. La présente invention a aussi pour objet un anticorps dirigé contre la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. La présente invention a également pour objet un kit de détermination par scintigraphie de la présence de dépôts amyloïdes dans un tissu ou un organe chez un sujet comprenant comme réactif la protéine amyloïde P sérique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. Le procédé de la présente invention est illustré de manière plus détaillée par les exemples ci-dessous. Ces exemples décrivent des modes de réalisation spécifique de la présente invention et ne sauraient être considérés comme restreignant la portée de cette dernière. Exemples Exemple 1 : Conditions expérimentales mises en oeuvre pour la purification de la protéine amyloïde P sérique humaine A - Matériel de départ. Le matériel de départ est du plasma frais congelé humain. La 1ère étape consiste en la décongélation de la poche d'environ 250 mL de plasma frais congelé humain toute la nuit (environ 16 à 20 heures) à une température comprise entre +2°C et +8°C. Après décongélation, le plasma frais décongelé humain est placé à température ambiante (25 ± 1°C) pendant 1 heure. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc B - Recalcification. La recalcification se produit par incubation du plasma frais décongelé et laissé reposer à température ambiante pendant 1 heure, dans une solution de CaC12 10 mM final pendant 2 heures, à température ambiante (25 ± 1°C) et sous faible agitation (100 rpm). Le plasma frais décongelé recalcifié est ensuite centrifugé pendant 20 minutes, à la température de +4°C et à une vitesse de 4000g. Le surnageant résultant de la centrifugation du plasma frais décongelé recalcifié est récupéré et son volume est environ égal à 240 mL. C - Chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle L'étape de chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle se déroule à température ambiante et utilise le système de chromatographie GE Pharmacia Akta Explorer 100. Le surnageant résultant de la centrifugation du plasma frais décongelé recalcifié (environ 240 mL), est dilué deux fois dans une solution tampon d'équilibrage de composition Tris 20mM, CaC12 10mM, pH7.5. Le surnageant ainsi dilué est passé sur une colonne (XK16 hauteur 15 cm, volume 30 mL) comprenant une phase stationnaire de type phényle (PhénylTosoh 650M) préalablement équilibrée avec la solution tampon d'équilibrage de composition Tris 20mM, CaC12 10mM, pH7.5. Le débit étant préférentiellement de 7.5 mL par minutes. Un ter lavage de la colonne est effectué avec une solution tampon de lavage de composition Tris 20mM, CaC12 10mM, pH7.5. Deux autres lavages de la colonne sont effectués successivement avec la solution tampon de lavage de composition Tris 20mM, CaC12 10mM, pH7.5. L'élution de la protéine amyloïde P sérique humaine est ensuite effectuée par passage sur la colonne de la solution tampon d'élution de composition Tris 20 mM, NaCl 1M, pH7.5. D - Traitement solvant/détergent L'éluat résultant de l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle est soumis à une inactivation virale par traitement avec Tween 80 1%/TnBP 0.3% final. Le traitement d'inactivation virale est effectué pendant une durée de 6 heures à température ambiante (25 ± 1°C). Le traitement d'inactivation virale peut également être effectué sous la forme d'un traitement par tri-n-butylphosphate, Triton X-100 ou cholate sodium. Cette étape peut également être effectuée pendant une durée de 16 heures à température de +4°C (4 ± 1°C). E - Chromatographie sur hydroxyapatite R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc L'étape de chromatographie sur hydroxyapatite se déroule à température ambiante et utilise le système de chromatographie GE Pharmacia Akta Explorer 100. L'éluat résultant de l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle et viralement inactivé, est passé sur une colonne (C10, hauteur 9, volume 7 mL) de résine d'hydroxyapatite de type II et de granulométrie 80- m. La colonne a été préalablement équilibrée avec une lère solution d'équilibrage de composition Phosphate 200mM, pH7.5 puis une seconde solution d'équilibrage de composition Phosphate 10mM, pH7.5. Le débit est de 4 mL par minute. Un ter lavage de la colonne est effectué avec une solution tampon de lavage de composition Phosphate 10mM, pH7.5. Un 2eme lavage de la colonne est effectué avec une solution tampon de lavage de composition Phosphate 60 mM, pH7.5. L'élution de la protéine amyloïde P sérique humaine est ensuite réalisée par passage sur la colonne de la solution tampon d'élution de composition Phosphate 100 mM, pH7.5. La colonne est ensuite régénérée grâce à une solution tampon de régénération de composition Phosphate 200 mM, pH7.5. F - Concentration et diafiltration L'éluât résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite est soumis à une ultrafiltration sur membrane, de préférence sur membrane Polyethersulfonate (PES) 30kDa 50cm2 PelliconBiomax (Millipore). La concentration de l'éluât résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite et ultrafiltrée est égale à 1 mg/mL. L'éluat résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite, à la concentration de 1 mg/mL est ensuite diafiltrée contre 5 volumes de tampon Tris 10mM, NaCl 140 mM, EDTA 10 mM pH8.0. L'éluat résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite, et ultrafiltré à la concentration de 1 mg/mL et diafiltré est à nouveau concentré sur membrane Amicon SkDa (Millipore) jusqu'à obtenir un volume final de SmL. G - Nanofiltration du concentré obtenu après chromatographie sur hydroxyapatite et ultrafiltration/diafiltration Les filtres utilisés sont des filtres de référence Planova 15 N (Asahi). Les filtres utilisés sont composés de fibres creuses en cellulose cupro-ammonium hydrophile, dont la taille nominale des pores est de 15 ± 2 nm. Le rendement de nanofiltration en protéines totales est de 80%. H - Résultats H1-Analyse de la Pureté La pureté du concentré obtenu après les étapes de chromatographie sur hydroxyapatite et d'ultrafiltration/diafiltration, est analysée par dépôt et migration R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc sur gel SDS-PAGE (NovexTris-glycine 4-20%, Invitrogen EC6025 Box) de 10- g de protéines dudit concentré. Les échantillons suivants sont également déposés sur gel SDS-PAGE : - 5 µL d'un marqueur de poids moléculaire (BenchMarkproteinladder, InVitrogen, 10747-012) ; - 20 µL de la solution Sample Buffer (SB) 1X ; - des standards BSA correspondant à respectivement 0.2% (0.02 µg), 0.5% (0.05µg), 1% (0.10 µg), 1.5% (0.15µg), 2% (0.20 µg), 4% (0.40 µg) afin dévaluer la pureté du produit. Avant dépôt sur gel SDS-PAGE, chaque échantillon est chauffé pendant 5 min à +95°C. La migration des protéines de chaque échantillon s'effectue sous tension constante de 40 mA, dans le tampon TGS 1X. Un immunoblot est réalisé après électrophorèse sur gel SDS-PAGE (Figure 3). Après transfert sur nitrocellulose et saturation avec de l'albumine, un contact avec un anticorps primaire anti-lapin protéine amyloïde P sérique (Calbiochem, 565191) est réalisé. Le marquage par un anticorps secondaire anti-souris AP conjugué (Promega, S373B) est réalisé avant révélation par technique NBT/BCIP sur film d'autoradiographie. Les résultats sont montrés dans le Tableau 1. Bande Poids Volume de Volume Quantification Quantification Identifiant Moléculaire l'ensemble d'impureté en % (LOQ des bandes 0.2%*) 1 78749 3.75 3.75 0.13 0.20 2 70556 0.93 0.93 0.08 0.20 3 63711 0.71 0.71 0.07 0.20 4 52853 1.16 1.16 0.08 0.20 5 28932 15.21 15.21 0.34 0.34 6 27952 35.14 35.14 0.72 0.72 7 25504 2703.75 0.00 0.00 Pureté (%) 98.6 98.1 Tableau 1 : Pureté * Limit of Quantification, valeurs reportées avec cette limite Le volume IOD (Integrated Optical Density) des impuretés sur gel est quantifié par comparaison avec les bandes de standard BSA. La pureté de la protéine est calculée en retranchant le % des impuretés. Le gel est également coloré au bleu de Coomassie afin d'évaluer la pureté de chaque échantillon (Figure 4).Comme le montre la Figure 4, le concentré obtenu R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc après les étapes de chromatographie sur hydroxyapatite et d'ultrafiltration/diafiltration (piste 3) ne présente qu'une seule bande homogène. La totalité des protéines de haut poids moléculaire ont été éliminées dans le concentré obtenu après les étapes de chromatographie sur hydroxyapatite et d'ultrafiltration/diafiltration. Comme le montre le Tableau 1, la pureté du concentré obtenu après les étapes de chromatographie sur hydroxyapatite et d'ultrafiltration/diafiltration est égale à 98.6%. H2 - Tableau récapitulatif La méthode - BCA (MicroBCAssay) a été employée pour doser les protéines totales de chaque échantillon. Il s'agit d'un test colorimétrique. Le dosage antigénique de la protéine amyloïde P sérique humaine est réalisé par la technique ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay).Les résultats sont répertoriés dans le Tableau 2. Le rendement final avant l'étape de nanofiltration est de 12 mg/L de plasma (DO 280 nm) à 17 mg/L de plasma (ELISA), soit 34.8 à 48.6%. Résultats de µBCA et ELISA P125 µBCA ELISA Echantillon Volume Concentration mg % Concentration mg % (mL) (µg/mL) (µg/mL) Poche de 273 ND 30 8 plasma n°8495652 Poche de 288 38 11 plasma n°8428627 Poche de 270 26 7 plasma n°8428645 Poche de 293 34 10 plasma n°8495688 Réunion des 4 1124 36 100 poches Récupération 0 100 R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle (Toso 650M) Etat Initial 2180 25615 55841 100 13 28 100 Fraction non 3000 18001 54003 7 0 0 0 retenue 1" lavage 750 166 125 0 0 0 0 2ème lavage 750 44 33 0 0 0 0 3ème lavage 1650 0 0 0 0 0 0 Pic d'élution 150 64 10 0 134 20 71 Fin Elution 600 0 0 0 1 1 2 Régénération 600 738 443 1 0 0 0 Récupération 98 73 Chromatographie sur hydroxyapatite (type II, 80 µm) Etat Initial 160 299 47852 100 168 270 100 Fraction non 290 324 93962 196 0 0 0 retenue Lavage 10 90 48 4323 9 3 0 1 mM Lavage 60 90 0 0 0 0 0 0 mM Elution 100 35 386 13513 28 578 20 75 mM Fin Elution 70 29 2023 4 32 2 8 100 mM Régénération 60 20 1221 3 17 1 4 200 mM Récupération Protéines totales 35 87 Ultrafiltration (membrane PES 30 kDa)/ Diafiltration Elution sur 35 708 25 hydroxyapatite concentré diafiltré Tableau 2 : Elisa / Micro BC Assay H3 - Composition du composant sérique amyloïde P obtenu au stade matière première vrac purifiée (MPVP) R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc La composition de la préparation du SAP de haute pureté est décrite dans le tableau ci-dessous (Tableau 3). Nom des composants Formule Fonction Référence aux normes Principe actif Protéine amyloïde P 500 µg/mL Marqueur amyloïde Monographie sérique interne Autres composants Citrate trisodique 2.94 mg/mL Excipient Pharmacopée Européenne Chlorure de sodium 8.76 mg/mL Excipient Pharmacopée Européenne Protéines 520-540 µg/mL Protéine amyloïde P - sérique et protéines allogéniques résiduelles Tableau 3 : Formulation Les excipients citrate trisodique et chlorure de sodium sont ajoutés sous forme de tampon et assurent par leurs propriétés fonctionnelles : le pH final de la préparation (physiologique), l'osmolalité de la préparation (isotonique). La conformité à la formule de fabrication est conditionnée par les contrôles effectués sur la MPVP (Elisa SAP, Taux de protéines, Osmolalité, pH, endotoxines, Numération bactérienne, test d'activité et de fonctionnalité du SAP). Validation de la purification. L'analyse des résultats sur les trois lots étudiés montre, de manière industrielle, une bonne reproductibilité de procédé de fabrication du concentré de protéine amyloïde P purifié et une amélioration considérable du rendement (12 à 17mg/L de plasma soit 34.8 à 48.6%), de même que l'obtention d'un concentré de protéine SAP présentant un haut degré de pureté. - Analyse des fractions avant la nanofiltration, et MPVP avant et après filtration bactériologue sur les trois lots étudiés : l'efficacité de la nanofiltration et de la filtration bactériologique est montrée sur trois lots étudiés. L'innocuité microbienne des préparations de la protéine amyloïde P est montrée. - TNBP et Tween 80 : les concentrations résiduelles de Tween 80 et de TNBP sont inférieures à la norme établie par la pharmacopée européenne pour les trois lots étudiés. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc - Impureté d'origine microbienne : l'innocuité microbienne des préparations de protéine amyloïde P est démontrée et est conforme aux spécifications. - Pureté électrophorétique (gel SDS-PAGE) : la trace électrophorétique identifiée sur la piste 3 met en évidence une bande d'environ 25 kDa reconnue par l'anticorps anti-Protéine amyloïde P sérique, correspondant au composant amyloïde P purifié. Il n'est mis en évidence aucun contaminant allogénique. Exemple 2 : Mise en évidence de la reproductibilité du procédé selon l'invention I. Schéma de purification Le schéma de purification appliqué est le suivant : A - Matériel de départ Le matériel de départ est du plasma frais congelé humain. La 1ere étape consiste en la décongélation de 35 poches du plasma frais congelé humain (environ 300 ml par poche) à température ambiante durant une nuit. Les poches décongelées sont réunies dans un biotainer pour former un pool de plasma frais décongelé et transférer dans une poche de 20 litres, puis incubées sous agitation (mélangeur Wave) pour atteindre une température du pool de plasma frais décongelé de 20°C. B - Recalcification La recalcification se produit par ajout au pool de plasma frais humain décongelé d'une solution de CaC121M pour obtenir une concentration finale de 10mM, puis incubation sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Le pool de plasma frais décongelé recalcifié est ensuite centrifugé à une vitesse de 4000g pendant 20 minutes à température ambiante. Le surnageant résultant de la centrifugation du pool de plasma frais décongelé recalcifié est récolté. C - Chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle Le surnageant résultant de la centrifugation du pool de plasma frais décongelé recalcifié est dilué deux fois dans une solution tampon d'équilibrage de composition Tris 20mM, CaC12 10mM, pH7.5. Le surnageant ainsi dilué est passé sur une colonne (BPG 140 hauteur : 20cm, volume: 3078m1) comprenant une phase stationnaire de type phényle (PhénylTosoh 650M) préalablement équilibrée avec la solution tampon d'équilibrage de composition Tris 20mM, CaC12 10mM, pH7.5, avec une vitesse de débit de 400m1/min. Un premier lavage de la colonne est effectué avec une solution tampon de lavage de composition Tris 20mM, CaC12 10mM, pH7.5. Trois autres lavages de la colonne sont effectués successivement avec une solution Tris 20mM, CaC12 10mM, R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc NaCl 150mM pH7.5, une solution Tris 20mM, CaC12 l0mM, NaCl 500mM pH7.5, une solution Tris 20mM, CaC12 10mM, NaCl 1M pH7.5. L'élution de la protéine amyloïde P sérique humaine est ensuite effectuée par passage sur la colonne de la solution tampon d'élution de composition Tris 20mM, NaCl 1M, pH7.5. Les étapes de décongélation du plasma frais humain congelé, de recalcification du plasma frais humain décongelé et de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle sont réalisées deux fois de manière à traiter l'équivalent de 19 litres à 20 litres de plasma. Les deux éluas issus de l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle sont réunis en un pool dans une poche de 20 litres avant de procéder à l'étape d'inactivation virale par un traitement solvant/détergent. D - Etape d'inactivation virale par traitement solvant/détergent Le pool d'éluats résultant de l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle est soumis à une inactivation virale par traitement solvant/détergent. Le traitement solvant/détergent se produit par ajout au pool de TnBP 3%, Tween80 10% pour obtenir une concentration finale de 0.3% en TnBP et 1% enTween80. Le mélange ainsi obtenu est amené à une température de 25°C et incubé pendant 6 heures à 25°C sous agitation. E - Etape de séparation par chromatographie d'affinité sur hydroxyapatite Le pool d'éluas résultant de l'étape de séparation par chromatographie d'interactions hydrophobes de type phényle et viralement inactivé, est passé sur une colonne (Millipore Vantage 60 hauteur : 15cm ; volume : 424,5m1) de résine d'hydroxyapatite de type II et de granulométrie 80- m, à une vitesse de débit de 160ml/min. La colonne a été préalablement équilibrée avec une première solution d'équilibrage de composition Na Phosphate 200mM pH 7.5 puis une seconde solution d'équilibrage de composition Na Phosphate 10mM pH 7.5. Un premier lavage de la colonne est effectué avec une solution tampon de lavage de composition Tris 20mM, NaCl 1M, TnBP 0.3%, Tween 80 1% pH7.5.Un deuxième lavage de la colonne est effectué avec une solution tampon de lavage de composition Na Phosphate 10mM pH7.5. Un troisième lavage de la colonne est effectué avec une solution tampon de lavage de composition Na Phosphate 60mM pH7 .5. L'élution de la protéine amyloïde P sérique humaine est ensuite réalisée par passage sur la colonne de la solution tampon d'élution de composition Na Phosphate 100mM pH7.5. F - Etape de concentration et diafiltration par ultrafiltration tangentielle (UFT) R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc L'éluat résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite est soumis à une étape de concentration et diafiltration sur membrane de type PES, (Millipore Pellicon 2 cut off : 30kDa, surface : 0.lm ). La membrane est préalablement équilibrée avec une solution d'équilibration de composition Tris l0mM, NaCl 140mM, EDTA l0mM pH8. L'éluat résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite est concentré jusqu'à obtenir un volume final de 300m1 (TMP = 1.4 bars), puis diafiltré contre 5 volumes de tampon Tris l0mM, NaCl 140mM, EDTA10mM pH8. L'éluât résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite et diafiltré est à nouveau concentré jusqu'à obtenir un volume de 250m1. La membrane est ensuite rincée par 250ml d'une solution tampon Tris l0mM, NaCl 140mM, EDTA10mM pH8, puis la solution de rinçage et l'éluat résultant de l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite sont diafiltré et concentrés, puis sont réunis (volume final du rétentat d'environ 500m1). G - Etape de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A L'étape de séparation par chromatographie sur protéine A utilise une utilise une colonne (Vantage 44 hauteur : 10 cm ; volume : 150ml) comprenant une résine Mab Select Sure, préalablement équilibrée avec la solution tampon d'équilibrage de composition Tris 10mM, EDTA 10mM, NaCl 140mM pH8.0, avec une vitesse de débit de 8m1/min. Après charge de lu rétentat la colonne est lavée avec une solution de lavage de composition Tris 10mM, EDTA 10mM, NaCl 140mM, pH8.0. Le flux sortant est récupéré et filtrée sur des filtres de 0,22microm. H - Etape de nanofiltration L'étape de nanofiltration est réalisée sur des filtres de référence Viresolve Pro Modus 1.1 (Millipore, surface : 170cm2) préalablement équilibrés avec une solution d'équilibration de composition Tris 10mM, EDTA 10mM, NaCl 140mM pH 8.0. Le flux résultant de l'étape de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A est filtré, puis les filtres sont rincés avec une solution de lavage de composition Tris 10mM, EDTA 10mM, NaCl 140mM pH 8.0. Le rendement de nanofiltration en protéines totales est de 100%. I - Etape de concentration et diafiltration Le filtrat résultant de l'étape de nanofiltration est soumis à une étape de concentration et diafiltration sur membrane, de préférence sur membrane PES (Pellicon 2, cut off : 30kDa, surface : 0.lm) préalablement équilibrée avec une solution d'équilibration de composition Tris 10mM pH8. Le filtrat résultant de l'étape de nanofiltration est concentré dans un volume de 200ml (TMP = 1.4 bars), puis diafiltré contre 5 volumes de tampon Tris 10mM pH8. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Le filtrat résultant de l'étape de nanofiltration et diafiltré est à nouveau concentré dans un volume de 150m1. Les filtres sont ensuite rincés avec 100m1 d'une solution Tris l0mM de préférence à pH8. Le flux sortant et le filtrat résultant de l'étape de nanofiltration, diafiltré et concentré sont réunis, puis filtrés sur 0,221am. II. Résultats A - Analyse de la reproductibilité des trois lots à l'issue de l'étape de séparation par chromatographie sur hydroxyapatite (HA) Afin d'évaluer la reproductibilité du procédé de fabrication développé, 3 lots de reproductibilité ont été réalisés à l'échelle finale en respectant le schéma de purification de manière identique. Al - Analyse du rendement obtenu pour le premier lot de reproductibilité Le dosage par Elisa permet de donner une estimation de la quantité de SAP présente dans le pool plasma de départ ainsi qu'après la recalcification. Sa variabilité ne permet cependant pas d'estimer les rendements pour les étapes plus avancées du procédé. Pour ces étapes, les concentrations sont estimées par la méthode de BCA ou Bradford (dernière étape UFT). Le rendement global peut être estimé en compilant les données ELISA et Bradford. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Résultats des analyses de Protein Content (BCA), Bradford (étape UFT) et ELISA P125 Echantillon Vol. BCA Elisa ( ) cc - g/ml mg % cc - g/ml mg % PhenylTosoh #1 650M Début 17782 24365 433258 100% 24 427 100% FT 26080 16936 441691 102% 1 26 6% Lavage 1 6000 138 828 0,19% 0 0 0% Lavage 2 6000 31,89 191 0,04% 0 0 0% Lavage 3 12000 0 0 0,00% 0 0 0% Elution 2500 54 135 0,03% 113 283 66% Régénération 5000 472 2361 0,54% 4 20 5% Rendement 103% 77% PhenylTosoh #2 650M Start 17400 21036 366026 100% 26 45 100% FT 25300 10920 276276 75% 0 0 0% Lavage 1 6000 89 531 0,15% 0 0 0% Lavage 2 6300 32 202 0,06% 0 0 0% Lavage 3 12600 12 152 0,04% 0 0 0% Elution 3400 42 141 0,04% 85 289 64% Régénération 6000 361 2168 1% 2 12 3% Recovery 76% 67% Hydroxyapatite type II 80- m Start 6574 Non dosable 68 449 100% FT 8313 0 0 0% Lavage 10mM 1250 18 23 5% Lavage 60mM 1240 14 17 6% 0,47 1 0% Elution 100mM 1120 250 280 101% 183 205 46% Régénération 840 77 65 23% 60 50 11% 200mM Rendement 131% 62% protéine totale UFT Pellicon 2 PES 0,1 m2 BRADFORD Elisa Vol. ml cc - g/ml mg % cc - g/ml mg % Début 1120 271 304 100% 183 1208 100% Perméat 3200 Non dosable 79 253 21% Rétentat 510 549 280 92% 1697 865 72% Rétentat filtre 510 544 277 91% 1360 694 57% Interférence du Tween/TnBP avec le test BCA et Bradford Interférence de 1'EDTA avec le test BCA, mais compatible avec le Bradford Tableau 4 : Rendements R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Par la méthode de Bradford, la quantité finale de SAP est de ±277 mg pour 19 1 de plasma engagé (64 poches) soit une productivité de 14.6 mg de protéine amyloïde P sérique par litre de plasma. A2. Analyse des rendements obtenus pour les trois lots de reproductibilité Si on se réfère à une concentration moyenne de 20- g/ml de SAP dans le plasma (concentration mesurée par ELISA durant tout le développement), et en tenant compte des données du Bradford sur les élutions, on peut déduire les rendements par étape décrits dans le tableau suivant (repro signifiant lot de reproductibilité). Dosage par la méthode Bradford Etape Repro 1 Repro 2 Repro 3 Protein Rendement Protein rendement Protein rendement content de l'étape content de l'étape content de l'étape (mg) (mg) (mg) Start Phenyl 720 720 720 Start HA 449 62% 422 59% 408 57% Elution HA 280 62% 240 57% 240 59% Purifiedbulk 277 100% 288 120% 224 93% Rendement global 38% 40% 31% Rendement global moyen 36,33% Productivité (mg 14.6 15.2 11.8 de SAP/litre de plasma) Productivité moyenne (mg de 13,87 SAP/litre de plasma) Tableau 5 : rendements B - Analyse de la pureté de la protéine amyloïde P sérique humaine obtenue pour les trois lots de reproductibilité B1 - Analyse des impuretés à l'issue de l'étape de séparation par chromatographie d'affinité sur hydroxyapatite Méthode d'analyse 10 µg de rétentat UFT filtré (purified bulk) ont été déposés sur gel SDS-PAGE en conditions réductrices et non réductrices. Après coloration au bleu de coomassie, les bandes d'impureté ont été extraites. Chaque échantillon a subi une carboxylation préalable à l'aide d'iodoacétamide avant traitement à la trypsine toute la nuit et à 37°C. Les peptides trypsiques ont ensuite été analysés automatiquement par LCMSMS. Les analyses ont été processées à l'aide du système informatique R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc WARPLC (Bruker). Les comparaisons séquentielles ont été faites à partir des bases de données NCBI et SwissProt à l'aide du système d'exploitation MASCOT. Seules les protéines présentant une probabilité d'identification non négligeable ont été retenues. Résultats Cinq impuretés majeures ont été caractérisées et leur composition est répertoriée dans le tableau 6 ci-dessous, ces impuretés étant présentes sur le gel de la figure 6. Numéro de la bande Composition (abondance décroissante) 1 IG mu chain C région SAP Igheavychain V-III région BRAU Igheavychain V-III région CAM 2 Ig gamma 1 ChainC SAP Ig gamma 2 Chain C Ig heavy chain V-I Igmu heavy chain 3 SAP Ig gamma 1 chain C 4 SAP Iglamda chain 5A SAP Complément C3 factor Ig gamma 1 chain Ig Kappa chain 5B SAP Ig gamma 1 chain C Ig Kappa 1 chain C Ig gamma 3 chain C Ig gamma 2 chain C Ig Kappa chain V-III Ig Kappa Chain V-IA Tableau 6 : impuretés L'analyse des bandes montre que toutes les impuretés sont constituées de SAP (ou un fragment de celle-ci) liées à une autre protéine. Le contaminant le plus présent est issu des immunoglobulines, principalement des IgG et des IgM. La SAP est R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc d'ailleurs largement majoritaire excepté dans les bandes 1 et 2 correspondant aux impuretés à 50 et 80kDa. La pureté a été déterminée de façon conservatrice, mais certaines impuretés observées pourraient être des artéfacts liés aux conditions dénaturantes (présence SDS) lors de la réalisation du test SDS-PAGE, ce qui augmenterait alors le degré de pureté des solutions. B2 - Analyse des impuretés à l'issue de l'étape de séparation par chromatographie d'affinité sur protéine A (Mab Select Sure). L'analyse de la pureté de la protéine amyloïde P sérique humaine se fait par dépôt sur gel de 10 - g de rétentat UFT filtré (Purified bulk). Des standards BSA correspondant à respectivement 0.2%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2% et 4% de 10 - g sont également déposés pour évaluer la pureté du produit par spectrodensitométrie. Résultats Le tableau suivant résume les résultats de pureté obtenus sur les trois lots, dans les conditions réductrices ou non-réductrices mises en oeuvre pour les gels SDSPAGE. Pureté à l'issue de l'étape de Pureté à l'issue de l'étape de séparation par chromatographie séparation par chromatographie sur hydroxyapatite sur Protéine A condition condition non condition condition non réductrice réductrice réductrice réductrice Lot de reproductibilité 1 95,20% 95,20% 96,70% 97,70% Lot de reproductibilité 2 95,00% 95,40% 96,70% 97,30% Lot de reproductibilité 3 93,20% 95,10% 96,80% 97,60% Moyenne 94,5% 95,2% 96,7% 97,5% Tableau 7 : puretés C - Analyse de l'activité de la protéine amyloïde P sérique humaine obtenue selon le procédé de l'invention L' activité de la protéine amyloïde P sérique humaine obtenue selon le procédé de l'invention a été mise en évidence par mesure de sa capacité de liaison à des ligands connus de cette protéine tels que la fibronectine. Cl - Test de liaison au ligand La liaison de la protéine amyloïde P sérique humaine obtenue selon le procédé de l'invention a été mesurée selon le protocole de Bottazzi B et al, 1997 (Bottazzi et al, « Multimer formation and ligand recognition by the long pentraxin PTX3 », J BiolChem 1997, vol 272, 52 : 32817-32823). R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Les expériences ont été menées à 37°C. Un support de revêtement a été revêtu de la molécule Clq, du collagène de type IV, de la fibronectine ou de la gélatine, à une concentration constante ou variable (en concentration croissante), en présence d'une solution tampon PBS 1X dépourvue d'ions calcium. La protéine amyloïde P sérique humaine obtenue selon le procédé de l'invention a été diluée dans une solution tampon PBS 1X, Tween 20 0.05%, lait (Régilait, agent saturant) comprenant des ions calcium, puis déposée en concentration constante ou variable (concentration croissante) sur le support de revêtement. Après incubation et lavage, le support de revêtement a été incubé avec un anticorps primaire monoclonal de souris dirigé contre la protéine amyloïde P sérique (clone 5.4A), lavé à nouveau puis incubé avec un anticorps secondaire permettant une révélation par un système de type Streptavidine peroxydase/TMB. Les valeurs d'absorption ont été lues à 450-620 nm. Le test de liaison utilise comme contrôle positif une protéine amyloïde P sérique humaine disponible commercialement (standard). C2 - Résultats Test d'inhibition de liaison Un test d'inhibition de la liaison de la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention au ligand de revêtement (dans le cas présent, la molécule Clq ou le collagène) a été réalisée en employant comme inhibiteur la protéine CRP (C-reactive protein), laquelle est connue pour être capable de se lier à de tels ligands de revêtement. Les résultats montrent un effet inhibiteur de l'accrochage de la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention par la protéine CRP (données non présentées). Test de compétition de liaison Un test de compétition de liaison a été réalisé en mesurant les valeurs de densité optique après mise en contact du support de revêtement lié à un ligand de concentration constante avec une solution comprenant une concentration constante de protéine amyloïde P sérique humaine obtenue selon le procédé de l'invention ou de protéine amyloïde P sérique disponible commercialement (protéine standard), et à une concentration croissante de ligand de revêtement. La Figure 5 présente sous forme de courbe les résultats obtenus en utilisant comme ligand de revêtement la fibronectine fixée sur le support à une concentration de 101ag/ml, et pour des concentrations en protéine amyloïde P sérique humaine obtenue selon le procédé de l'invention ou de protéine amyloïde P sérique disponible commercialement égale à 12.51ag/ml (Figure 5A), 251ag/ml (Figure 5B) et 501ag/ml (Figure 5C). R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Les résultats de la Figure 5 montrent qu'aux trois concentrations testées de la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention et de la protéine standard, les courbes ont une allure sigmoïdale. Les résultats de la Figure 5 montrent également qu'aux trois concentrations testées de la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention et de la protéine standard, l'allure de la courbe obtenue pour la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention se calque sur celle obtenue pour la protéine standard. Les résultats ainsi obtenus montrent que la protéine amyloïde P sérique obtenue selon le procédé de l'invention conserve sa capacité de liaison à la fibronectine. R:\31500\31550 LFB\31550 FR\31550--101217 - DEPOT FR.doc Notre réf : 31550 FR LFB Votre réf :.VD - BT 12-1 / 10 60769