Brevet FR2961692A1 — publié le 20111230

La présente invention concerne l'utilisation cosmétique d'un extrait issu de champignons pédonculés comestibles, comme les cèpes, champignons comestibles de la famille des bolets, ainsi que des compositions cosmétiques en comportant et un procédé cosmétique les mettant en oeuvre. De nombreux cosmétiques ont pour le moment été proposés pour le soin de la peau, et notamment son traitement anti-âge. Plusieurs mécanismes intervenant dans ce domaine ont été mis en évidence. La peau humaine est constituée de trois couches : - la couche superficielle, l'épiderme, constitué majoritairement de kératinocytes et de cornéocytes. - le derme, constitué principalement de fibroblastes, repose sur l'hypoderme qui assure la jonction avec les structures anatomiques sous-cutanées. Riche en fibres conjonctives principalement le collagène et l'élastine, le derme confère la résistance et l'élasticité de la peau. - l'hypoderme, un tissu conjonctif lâche richement vascularisé qui, selon les conditions de nutrition et les régions de la peau, contient plus ou moins de tissu adipeux. Le phénomène de vieillissement cutané peut être accéléré par une exposition répétée aux rayonnements solaires ou aux polluants atmosphériques. Ces facteurs entraînent la formation de radicaux libres. Un radical libre est un atome ou une molécule qui a gagné ou perdu un électron. C'est ce nombre impair d'électrons qui rend la molécule instable. Celle-ci ne cesse de capter ou céder un électron à une autre molécule de son entourage, propageant ainsi le phénomène. Dans l'organisme, cette réaction est appelée stress oxydatif. Les radicaux produits sont l'anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène et le radical hydroxyle. Ces espèces oxygénées réactives sont susceptibles d'altérer les membranes des cellules, l'ADN, les protéines et les lipides. L'intérêt d'un actif comme piégeur de radicaux peut être évalué par le test au 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl (DDPH). En outre, le vieillissement cutané est favorisé par les réactions de glycation. La glycation est une réaction, dite de Maillard, non enzymatique, qui correspond à la fixation d'un ose réducteur ou d'un aldéhyde sur le résidu aminé d'une protéine pour former une base de Schiff. Celle-ci peut engendrer, après un réarrangement moléculaire d'Amadori, un pontage intermoléculaire. La glycation rend les protéines plus résistantes à la protéolyse empêchant ainsi leur renouvellement. Ce phénomène se produit particulièrement au niveau des fibres de collagène qui perdent leur solubilité et deviennent difficilement dégradables. Ainsi, une rigidification des tissus entraîne une perte de tonicité de la peau. La capacité d'inhiber des produits de glycation révèle pour un actif son intérêt pour l'élasticité de la peau. Enfin, la fonction barrière de la peau est assurée par le stratum corneum, couche superficielle de l'épiderme. Il permet une protection des couches sous-jacentes contre les agressions extérieures telles que les expositions aux radiations solaires, les agents polluants chimiques et atmosphériques. A la surface du stratum corneum se trouvent les cornéocytes, issus d'une différentiation des kératinocytes. Ces cornéocytes renferment de la filaggrine, protéine qui joue un rôle important d'agrégation des filaments de kératine et assure la différentiation des kératinocytes en cornéocytes. Lors de sa dégradation, la filaggrine libère des acides aminés et leurs dérivés qui seront métabolisés pour former les composants des NMF (Natural Moisturizing Factor). Les NMF sont responsables du maintien de l'hydratation du stratum corneum. Une diminution de la synthèse de la filaggrine suite à un vieillissement cutané peut ainsi aboutir à une perte en eau et par conséquent un dessèchement de la peau. La capacité, pour un actif, d'augmenter l'expression de la filaggrine révèle son intérêt pour le renforcement de la fonction barrière de la peau. Il est connu que certains extraits naturels ont des propriétés anti-oxydantes. Ainsi, des extraits de Boletus edulis ont déjà été décrits (Tsai et al. [11]), notamment pour leur propriété anti-oxydantes, dans le domaine alimentaire. Toutefois, l'incorporation de ces extraits dans des compositions cosmétiques n'est ni décrite, ni suggérée dans ce document. Par ailleurs, l'effet hydratant de divers extraits dont un extrait de bolet est mentionné dans le document JP-2004 224702. Toutefois, leur utilisation dans le traitement anti-âge de la peau, notamment à des fins anti-radicalaires, antiglycation ou de stimulation de la synthèse de la filaggrine ne sont pas décrites ni suggérées. Il existe encore un besoin pour des principes actifs au moins pour les activités décrites ci-dessus, à savoir la stimulation de la synthèse de la filaggrine, la capture des radicaux libres et/ou l'inhibition des phénomènes de glycation. Il reste aussi un besoin pour des compositions cosmétiques et des principes actifs ou actifs, d'origine naturelle, accessibles, faciles à isoler et dont la préparation est reproductible, aisés à formuler et cosmétiquement acceptables et qui présentent en outre au moins certaines des propriétés cosmétiques intéressantes ci-dessus. 10 La demanderesse a maintenant mis en évidence que des extraits de champignons pédonculés comestibles répondent aux problèmes ci-dessus. Elle a notamment mis en évidence que les extraits de champignon ont non seulement la propriété de capter les radicaux libres, limitant ainsi le vieillissement 15 cellulaire, mais encore ils inhibent les phénomènes de glycation et induisent une stimulation de la synthèse de la filaggrine. Les extraits utilisables selon l'invention répondent donc aux besoins évoqués ci-dessus. 20 C'est pourquoi la présente invention concerne l'utilisation cosmétique d'extraits de champignons comestibles pédonculés. Ces extraits sont utilisés pour le traitement anti-âge de la peau par application d'une composition topique comportant au moins un tel extrait et un véhicule cosmétiquement acceptable, notamment à des fins anti-radicalaire, anti-glycation et/ou de stimulation de la synthèse de la 25 filaggrine. De plus, la présente invention concerne des compositions cosmétiques comportant au moins un extrait de champignon comestible pédonculé et un véhicule cosmétiquement acceptable. Elle concerne aussi un procédé cosmétique comportant l'application de 30 compositions selon l'invention. Parmi les champignons comestibles pédonculés, on peut utiliser selon l'invention notamment les bolets, et parmi ceux-ci, Boletus edulis, Boletus erythropus,5 Boletus badius, Boletus luridus, Suillus bovinus, Sui/lus granulatus, Leccinum scabrum, Boletus aereus, Boletus pinicola et Boletus aestivalis et leurs mélanges. Comme cela apparaîtra dans les exemples, un actif utilisable selon l'invention a été obtenu par une extraction aqueuse des molécules hydrosolubles d'un mélange comportant Boletus edulis, très majoritairement, et Boletus aereus, Boletus pinicola et Boletus aestivalis, c'est-à-dire des champignons communément appelés « cèpe ». L'extraction des molécules d'intérêt peut être réalisée par toute méthode compatible avec la conservation de leurs propriétés, à partir de matière fraîche ou sèche. Dans un mode de réalisation particulier, on peut obtenir un extrait utilisable selon l'invention, ci-après « extrait », à partir de la matière sèche de champignon incorporée à une concentration convenable dans un solvant d'extraction convenable, par exemple dans l'eau, en procédant à reflux et en séparant par tout moyen connu, par exemple par centrifugation. On peut aussi prévoir des extraits hydroalcooliques avec des alcools tels que les alcanols, notamment l'éthanol. Dans un mode particulier de l'invention, l'extrait, qui peut-être aqueux, répond à l'un au moins des critères suivants : a) taux de matière sèche, déterminé par lyophilisation, compris entre 0,1 et 100 g/L, de préférence entre 1 et 50 ; b) pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 4 et 6 ; c) taux de protéine compris entre 0,0005 et 10 g/L, de préférence 0,001 et 1 g/L ; d) taux de sucres totaux compris entre 0,01 et 100g/L, de préférence entre 0,05 et 50g/L ; e) taux de phénol totaux compris entre 0,001 et 50g/L, de préférence 0,005 et 10g/L ; f) une fraction oligosaccharidique représentant entre 50 et 95% massique de la fraction glucidique totale, de préférence composée de 65 à 99% molaire de glucose, de préférence entre 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale de préférence composée de 75 à 98% molaire de glucose et comprenant éventuellement des traces de rhamnose et de fucose ; g) une fraction polysaccharidique représentant entre 2 et 50% massique de la fraction glucidique totale, de préférence comportant au minimum 50% de glucose et de 15 à 35% de mannose et comprenant éventuellement des traces de xylose et de galactose, de préférence représentant entre 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale, de préférence comportant au minimum 60% de glucose et de 20 à 30% de mannose et comprenant éventuellement des traces de xylose et de galactose ; h) une fraction polysaccharidique essentiellement constituée de glucanes de masse moléculaire comprise entre 500 et 65 000 Da. Dans un mode plus privilégié de réalisation de l'invention, l'extrait répond à l'un au moins des critères suivants : a) taux de matière sèche, déterminé par lyophilisation, compris entre 15 et 25 g/L, de préférence 19,34 ± 0,20 g/L ; b) pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 4 et 6; c) taux de protéine valant 0,02 ± 0,01 g/L ; d) taux de sucres totaux allant de 1 à 25 g/L, de préférence valant 7,99 ± 1 g/L ; e) taux de phénol totaux compris entre 0,1 et 2,5 g/L, de préférence 0,85 ± 0,05g/L ; f) une fraction oligosaccharidique isolée par chromatographie d'exclusion stérique sur gel BIO-RAD CL4B, représentant entre 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale. Elle est composée de 75 à 98% molaire de glucose et comprend quelques traces de rhamnose et de fucose, composition déterminée par chromatographie en phase gazeuse équipée d'une colonne capillaire (0.32mm*50m) CP-SIL-5CB et d'un détecteur à ionisation de flamme (FID) ; g) une fraction polysaccharidique représentant entre 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale, comportant au minimum 60% de glucose et de 20 à 30% de mannose, et éventuellement des traces de xylose et de galactose ; h) une fraction polysaccharidique essentiellement constituée de glucanes de masse moléculaire est comprise entre 1000 et 50 000 Da. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un extrait de champignon comestible pédonculé pour stimuler la synthèse de la filaggrine favorisant ainsi l'hydratation de la peau et/ou réduire les phénomènes de glycation responsables de la perte d'élasticité de la peau et réduire les phénomènes de stress oxydatif responsables du vieillissement prématuré de la peau. Les extraits peuvent être utilisés à des fins anti-glycation, de stimulation de la filaggrine, ou des fins anti-radicalaires. Il est apparu notamment que les extraits utilisables selon l'invention ont notamment significativement augmenté l'expression de la filaggrine de façon dépendante de la concentration. Ils présentent donc un effet pro-différenciant, et permettent ainsi de renforcer la fonction barrière épidermique. D'autres avantages, propriétés et caractéristiques des extraits de l'invention apparaîtront dans les exemples ci-après et sur les figures annexées. La figure 1 illustre l'activité anti-radicalaire d'un extrait utilisable selon l'invention comparée à un témoin. La figure 2 illustre l'activité anti-glycation d'un extrait utilisable selon l'invention par comparaison avec un témoin. On peut obtenir les extraits de champignon par exemple à partir de matière sèche introduite à raison de 0,2 à 20% en poids et plus particulièrement de 3,33 ± 1% en poids dans l'eau. Cette extraction peut être réalisée à reflux à 70-90°C et plus particulièrement à 80°C pendant 15 à 60 min et plus particulièrement pendant 30 minutes L'extrait est récupéré par centrifugation à 3500 rpm pendant 10 minutes. Les caractéristiques suivantes peuvent être mises en évidence notamment à l'aide des techniques comme indiquées ci-après. L'extrait présente : - Un taux de matière sèche compris entre 1 et 50 g/L. Ce taux est déterminé par lyophilisation de la matière. - Un pH compris entre 3 et 8 et plus particulièrement entre 4 et 6. Le pH est déterminé par une méthode potentiométrique. - Un taux de protéine compris entre 0.001 et 1 g/L. Ce taux est déterminé par un dosage colorimétrique selon la méthode de Bradford [1]. - Un taux de sucres totaux compris entre 0.05 et 50g/L. Ce taux est déterminé par un dosage colorimétrique selon la méthode de Dubois [2] et de Blumenkrantz [3]. - Un taux de phénol totaux compris entre 0.005 et 10g/L. Ce taux est déterminé par un dosage colorimétrique selon la méthode de Singleton and Rossi [4]. - Une fraction oligosaccharidique isolée par chromatographie d'exclusion stérique sur gel BIO-RAD CL4B, représentant entre 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale. Elle est composée de 75 à 98% molaire de glucose et comprend quelques traces de rhamnose et de fucose, composition déterminée par chromatographie en phase gazeuse équipée d'une colonne capillaire (0.32mm*50m) CP-SIL-5CB et d'un détecteur à ionisation de flamme (FID). Ces résultats ont été obtenus par triméthylsilylation des monosaccharides selon la méthode de Kamerling [5]. - Une fraction polysaccharidique isolée par chromatographie d'exclusion stérique sur gel BIO-RAD CL4B représentant entre 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale. Elle est composée d'au minimum 60% de glucose et de 20 à 30% de mannose, et comprend quelques traces de xylose et de galactose, composition déterminée par chromatographie en phase gazeuse. Cette fraction est essentiellement constituée de glucanes dont la masse moléculaire est comprise entre 1000 et 50000 Da [6]. Le ou les extraits en mélange sont utilisés selon l'invention dans une composition contenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable, c'est-à-dire un milieu compatible avec la peau, les ongles, et les cheveux, et de façon générale toute matière kératinique. Les compositions cosmétiques selon l'invention étant destinées à être appliquées par voie topique sur le visage, le cou, les cheveux, les ongles ou toute autre zone cutanée du corps, elles se présentent sous une forme appropriée pour une telle application topique. Ainsi, les compositions de l'invention se présentent sous forme de crème, de pommade, d'émulsion, de gel, de lotion ou de sérum. Ces compositions peuvent constituer notamment des crèmes de protection, de traitement ou de soin pour le visage, pour les mains ou pour le corps, des laits corporels de protection ou de soin, des lotions, gels ou mousses pour le soin de la peau. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous la forme de compositions anti-âge, compositions anti-stress, notamment anti-stress oxydatif, compositions anti-radicalaire, compositions anti-vieillissement cellulaire, compositions anti-oxydante, compositions anti-rides, compositions favorisant l'élasticité de la peau ou sa fonction barrière. Elles se présentent notamment sous forme de solutions ou lotions aqueuses, hydroalcooliques ou huileuses, de dispersions du type lotion ou sérum, de gels anhydres ou huileux, d'émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), de suspensions ou d'émulsions de consistance molle, semisolide ou solide du type crème, gel, de micro-émulsions, ou encore de micro-capsules, de micro-particules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique et similaires et de façon générale toute autre forme cosmétique compatible avec la présence et l'incorporation d'un tel extrait. Les compositions de l'invention destinées à une application topique comprennent de manière appropriée un véhicule physiologiquement acceptable. Par milieu physiologiquement acceptable, on entend de façon connue un milieu compatible avec la peau, les muqueuses (y compris l'intérieur des paupières et les lèvres), les ongles et/ou les fibres kératiniques (cheveux et cils) et incorporant l'extrait utilisable selon l'invention. En outre, les compositions de l'invention peuvent contenir des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les parfums, les charges, les matières colorantes (pigments ou colorants), des filtres solaires, les solvants et encore des vésicules lipidiques. Ces adjuvants sont utilisés dans les proportions habituelles dans le domaine cosmétique ou dermatologique, et par exemple de 0,01 à 20% du poids total de la composition, et ils sont, selon leur nature, introduits dans une phase aqueuse ou dans une phase huileuse de la composition, ou encore dans des vésicules. Bien entendu, l'homme de l'art veillera à choisir ce ou ces éventuels additifs et/ou leurs quantités de manière telle que les propriétés avantageuses attachées intrinsèquement à la composition conforme à l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées par la ou les adjonctions envisagées. Selon la fluidité de la composition que l'on souhaite obtenir, on peut y ajouter un ou plusieurs gélifiants. Comme gélifiant, on peut citer les argiles, les gommes polysaccharides et leurs dérivés, notamment gomme de xanthane, carboxyméthylcellulose, hydroxypropyl guar, les polymères carboxyvinyliques ou carbomers, les polyacrylamides tels que celui commercialisé sous la dénomination SEPIGEL 305 par la société SEPPIC et les polymères d'acide acrylamidométhylpropanesulfonique au moins partiellement réticulés tels que le produit commercialisé sous la dénomination HOSTACERIN AMPS par la société HOECHST. Ces gélifiants sont généralement utilisés à des concentrations allant de 0,1 à 10% de préférence 0,1 à 5% et mieux de 0,1 à 3% du poids total de la composition. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la composition a un pH proche de celui de la peau, compris entre 4 et 9, de préférence entre 4 et 7. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles dans le domaine cosmétique. On peut procéder, par exemple, par mélange de l'extrait avec le véhicule cosmétiquement acceptable, ou tout autre pré-mélange. L'extrait ou les extraits sont utilisés tel qu'obtenus, ou encore concentrés ou au contraire dilués. De façon préférée, la concentration de l'extrait utilisé dans les compositions est inférieure à environ 2 mg sec/ml, soit environ 10% massique d'extrait en solution. Par ailleurs, la concentration massique finale en extrait dans la composition n'excède pas 10% en poids. Dans la suite, les concentrations exprimées en pourcentage correspondent au pourcentage d'extrait liquide pur issu de l'extraction, les concentrations exprimées en mg sec/ml correspondent à la masse de l'extrait lyophilisé (sec) par millilitre de solvant. Ainsi, les extraits utilisables selon l'invention représentent entre 0,01% et 10% du poids total de la composition, de manière préférée entre 0,1% et 5% du poids total de la composition. Lors de l'incorporation, de façon préférée, la température des extraits, véhicules, adjuvants, et mélanges, est comprise entre 40°C et 85°C, de façon préférentielle, entre 40°C et 80°C. Enfin, dans la composition finale, la teneur en éthanol n'excède pas 40% en poids. Comme solvant que l'on peut utiliser dans la composition de l'invention, on peut citer tout solvant cosmétiquement acceptable. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir tout autre composé ayant des propriétés hydratantes et/ou améliorant la fonction barrière et/ou anti- oxydante et/ou stimulant la filaggrine. Les compositions peuvent notamment comprendre d'autres extraits de champignon, les extraits obtenus pouvant être utilisés en mélange, ou d'autres espèces, ou tout autre produit conduisant notamment à une modulation de la glycation, de la formation de filaggrine ou de la présence de radicaux. L'invention a encore pour objet un procédé de traitement cosmétique anti-âge, c'est-à-dire pour lutter contre les signes du vieillissement cutané consistant à appliquer sur la peau une composition telle que définie ci-dessus. EXEMPLES Exemple 1 On a obtenu un extrait selon l'invention à partir de matière sèche de cèpe composée majoritairement de Boletus edulis et de Boletus aereus, Boletus pin/cola et Boletus aestivalis, à 3% dans l'eau, en extrayant à reflux à environ 80°C pendant environ 30 minutes L'extrait a été récupéré par centrifugation à 3500 rpm pendant 10 minutes. L'extrait obtenu présente - un taux de matière sèche d'environ 19.34g/l, taux déterminé par lyophilisation de la matière ; - un pH compris entre 4 et 6, pH déterminé par une méthode potentiométrique. - un taux de protéine de 0.02g/L, taux déterminé par un dosage colorimétrique selon la méthode de Bradford [1] ; - un taux de sucres totaux d'environ 7.99g/L, taux déterminé par un dosage colorimétrique selon la méthode de Dubois [2] et de Blumenkrantz [3] ; - un taux de phénol totaux d'environ 0.85g/L, taux déterminé par un dosage colorimétrique selon la méthode de Singleton and Rossi [4] ; - une fraction oligosaccharidique isolée par chromatographie d'exclusion stérique sur gel BIO-RAD CL4B, comprise entre 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale. Cette fraction était composée de 75 à 98% molaire de glucose et comprenait quelques traces de rhamnose et de fucose, composition déterminée par chromatographie en phase gazeuse équipée d'une colonne capillaire (0.32mm*50m) CP-SIL-5CB et d'un détecteur à ionisation de flamme (FID). Ces résultats ont été obtenus par triméthylsilylation des monosaccharides selon la méthode de Kamerling [5] ; - une fraction polysaccharidique isolée par chromatographie d'exclusion stérique sur gel BIO-RAD CL4B représentant entre 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale. Elle était composée d'au minimum 60% de glucose et de 20 à 30% de mannose, et comprenait quelques traces de xylose et de galactose, composition déterminée par chromatographie en phase gazeuse. Cette fraction est essentiellement constituée de glucanes ayant une masse moléculaire comprise entre 1000 et 50000 Da. L'extrait peut être repris à diverses concentrations dans l'eau, comme cela apparaîtra dans les exemples suivants, selon les tests effectués. Exemple 2 : Effet sur la stimulation de la synthèse de la filaggrine : 15 1. MATERIEL ET METHODES 1.1 Modèles biologiques .Kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) - Type cellulaire: NHEK, K074 utilisés au 3ème passage Conditions de culture: 37°C, 5% CO2 20 - Milieu de culture: Keratinocyte-SFM (Invitrogen 17005-034) complémenté avec Epidermal Growth Factor (EGF) 0,25 ng/ml - Extrait Pituitaire (EP) 25 ng/ml (Invitrogen 3700015) - Gentamycine 25 pg/ml (Sigma G1397) - Milieu d'essai: Keratinocyte-SFM (Invitrogen 17005-034) complémenté avec Gentamycine 25 pg/ml (Sigma G1397). 25 .Fibroblastes épidermiques humains normaux (NHDF) - Type cellulaire: NHDF, pool PF2 utilisés au Sème passage Conditions de culture: 37°C, 5% CO2 - Milieu de culture: DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Invitrogen 21969035) 30 Glutamine 2 mM (Invitrogen 25030024) Pénicilline 50 Ul/ml - Streptomycine 50 pg/ml (Invitrogen 15070063) Sérum de veau foetal (SVF) 10% (Invitrogen 10270098) .2 Composés testés et références Composé testé Aspect Solution stock Dilution Concentrations testées Extrait ex. 1 Liquide / Milieu 1%, 5% et 10% Stockage à d'essai (0,19 et 1,93 mg Température sec/ml) sur ambiante kératinocytes Référence Solution stock Dilution Concentration testée Chlorure de calcium 150 mM Milieu 1.5 mM (PROLABO 22319294) d'essai Acide rétinoïque 10-2 M en DMSO Milieu 10' M (Sigma R2625) d'essai 1.3 Tests préliminaires de cytotoxicité Kératinocytes Fibroblastes Plaques : 96 puits Cellules/puits : 20000 cellules/puits en 2000 milieu cellules/puits en d'essai milieu d'essai Gamme de produit : cf. Tableau 1 cf. Tableau 2 Replicates : 6 Contact 48 heures + 96 heures 72 heures Paramètre d'évaluation : réduction du MTT et observations morphologiques au microscope (objectif x 10) 1.4 Evaluation de l'expression de filaggrine Des kératinocytes épidermiques humains normaux ont été cultivés en plaques de 96 puits en milieu de culture pendant 24 heures. A subconfluence, le milieu de culture a été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (Témoin) les composés à tester ou les références (acide rétinoïque et CaCl2). Toutes les conditions ont été réalisées en n=6. Après 144 heures d'incubation, le milieu de culture a été éliminé et les cellules ont été rincées puis fixées par une solution de PBS contenant 4% de paraformaldéhyde puis perméabilisées avec une solution de PBS contenant 0.1% de triton X-100. Les sites de liaison non spécifiques ont ensuite été saturés 12 par incubation dans le tampon PBS/TWEEN/BSA 5%. Les tapis ont été marqués avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine d'intérêt (FLG, Anticorps monoclonal de souris, Tebu sc-66192) puis révélé par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome et dirigé contre des immunoglobulines de souris (GAM- Alexa 488, Invitrogen A11001). En parallèle, les noyaux des cellules ont été colorés au Hoechst (bis-benzimide, Sigma B1155). L'acquisition des images a été réalisée à l'aide de l'appareil ln Cell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare). Des contrôles sans anticorps primaire (anticorps secondaire seul) ont été réalisés afin de régler les paramètres d'acquisition de la caméra. Pour chaque puits, 5 saisies d'images numérisées ont été réalisées. Les marquages ont été quantifiés par mesure de l'intensité de fluorescence des protéines rapportée au nombre de noyaux identifiés par le Hoechst (intégration des données numériques par le logiciel Developer Toolbox 1.5, GE Healthcare). 1. 5 Traitement des données Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel®. Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l'aide du test de Student. Les analyses statistiques peuvent être interprétées si n ? 5 ; et pour n Pourcentage de stimulation : Moyenne des valeurs - Moyenne du témoin 0/0 stimulation = X 100 Moyenne du témoin Erreur standard de la moyenne : esm = écart-type (Sd)/fin L'erreur standard de la moyenne (esm) représente l'écart de la moyenne de l'échantillon par rapport à la moyenne de la vraie population. L'esm est calculé en divisant le Sd par la racine carrée de la taille de l'échantillon 2. RESULTATS 2.1 Tests préliminaires de cytoxicité L'effet de l'extrait de l'exemple 1, à diverses concentrations, sur la viabilité des cultures de kératinocytes et sur la viabilité des cultures de fibroblastes est respectivement présenté au tableau 1 et au tableau 2. Ces tests permettent de déterminer la concentration maximale non cytotoxique de l'extrait pour les kératinocytes et les fibroblastes : 10% (1,93 mg sec/ml). Tableau 1 Extrait de l'exemple 1 Unité % 0,25 0,50 1,00 5,00 10,00 20,00 50,00 100,00 * 0,04 0,09 0,19 0,96 1,93 3,86 9,65 19,34 Témoin 103 100 95 100 97 94 88 75 68 11 109 99 98 93 93 93 84 73 69 21 105 90 91 90 92 92 82 70 70 22 Viabilité (%) 104 87 89 92 88 93 79 72 67 24 103 92 95 93 96 93 79 74 70 7 112 97 102 106 104 105 88 80 80 29 Moyenne 100 95 96 95 95 83 74 71 19 esm 2 2 2 2 2 2 1 2 3 Observations + + + + +,ag +/-,ag -,ag -,ag -,ag morphologiques + : population normale ; +1- : réduction de croissance ; - : toxicité ; 0 : mortalité cellulaire g : grains de composé ; op : opacité due au composé. * : altérations morphologiques ; ag : cellules 10 agglutinées esm : erreur standard de la moyenne (déviation standard divisée par la racine carrée de la taille de l'échantillon) concentration en mg de matière sèche par ml 15 Tableau 2 Extrait de l'exemple 1 Unité% 0,25 0,50 1,00 5,00 10,00 20,00 50,00 100,00 * 0,04 0,09 0,19 0,96 1,93 3,86 9,65 19,34 Témoin 99 91 104 92 84 76 71 63 48 20 102 101 101 96 87 73 81 67 53 22 Viabilité (%) 104 94 98 97 92 84 81 72 51 24 98 96 95 97 91 83 83 69 54 22 104 102 103 102 99 85 81 74 49 22 103 104 101 98 94 82 77 65 46 23 Moyenne 100 100 97 91 80 79 68 50 22 esm 1 1 1 2 2 2 2 1 1 Observations + + + + + + +,g +/-,g -,g morpholoqiques + : population normale ; +1- : réduction de croissance ; - : toxicité ; 0 : mortalité cellulaire g : grains de composé ; op : opacité due au composé ; * : altérations morphologiques ; ag : cellules agglutinées esm : erreur standard de la moyenne (déviation standard divisée par la racine carrée de la taille de 20 l'échantillon) * concentration en mg de matière sèche par ml Les résultats des tests de viabilité au MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-tetrazolium bromide) et l'observation des tapis cellulaires ont conduit à sélectionner les concentrations à tester dans la suite de l'essai (cf. §1.2). 2.2 Effet sur l'expression de la filaggrine. L'effet de l'extrait de l'exemple 1, à différentes concentrations, sur l'expression de la filaggrine dans des cultures de kératinocytes est présenté au tableau 5 ci-après. Tableau 3 Traitement Concentration Intensité de % témoin esm (%) P fluorescence / nombre de cellules (UA) témoin 338 964 1122 100 25 - 1220 2483 950 Acide 294 rétinoïque 10-' M 18 15 5 4 ** 23 14 Chlorure de 9410 Calcium 1.5 m M 6526 12886 682 131 ** 11348 4681 3409 4154 1 % 1815 ou 6035 304 49 0,19 mg 3177 ** sec/ml 3443 Extrait de l'ex. 2891 1 1170 5% 3960 ou 4607 309 69 0,96 mg 3841 sec/ml 6620 1643 5209 10% 2973 ou 5138 801 260 1,93 mg sec 10802 /ml 23639 8926 (1) Seuil de significativité statistique : ns : > 0.05, Non significatif * : 0.01 à 0.05, Significatif 10 ** : 0.001 à 0.01, Très significatif *** : L'extrait de l'exemple 1, testé à ces concentrations 1%, 5% et 10% a significativement augmenté l'expression de la filaggrine de façon concentration dépendante (304% par rapport au témoin, p En conclusion, l'extrait de l'exemple 1 a présenté un effet pro-différenciant (augmentation de l'expression de la filaggrine). Exemple 3 : Effet anti-radicalaire : L'activité de piégeur de radicaux libres à été évaluée par le test au DPPH (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl) selon J. Buenger [7] et Yoshida [8]. Le résultat de ce test est exprimé en % de piégeage de radicaux libres. Le DPPH est un radical stable de par la délocalisation d'un électron libre autour de la molécule. Cet électron célibataire engendre une coloration violette du DPPH caractérisé par une bande d'absorption centrée à 520nm. Lorsque le DPPH est mélangé à une substance capable de donner un atome d'hydrogène, le DPPH passe sous forme réduite et la couleur disparaît. L'acide ascorbique est utilisé en tant que témoin positif. 2mL d'extrait de l'exemple 1 ou de témoin positif sont ajoutés à 2 mL de DPPH à 50pM, l'absorbance est mesurée à 515 nm au bout de 30 minutes. Le pourcentage d'inhibition est donné par la l'équation suivante : % de réduction du DPPH : Q (% d'inhibition) = (Ao-Ae) / Ao Ao : absorbance référence Ae : absorbance de l'échantillon Concentration % inhibition Témoin + 1% 95.65 Extrait 1% 0,19 mg sec /ml 84.15 5% 0,95 mg sec /ml 77.28 10% 1,9 mg sec /ml 68.72 Les résultats montrent que le principe actif à 1% inhibe 84% des radicaux libres présents. Exemple 4 : Effet anti-glycation : Le phénomène de glycation est représenté dans cet essai par la mise en contact d'une protéine, la BSA (Serum Albumine Bovine), et d'un sucre réducteur, le glucose, permettant ainsi de traduire la réaction de glycation. Le chlorure d'aminoguanidine est utilisé en tant que témoin positif. L'évaluation de l'inhibition de la glycation a été réalisée selon Xiaofang Peng et al. [9], et Rahbar et al. [10]. 5 g de BSA et 14,4 g de D-glucose (800mmol/L) sont dissous dans 100mL de tampon de phosphate (1,5 M ; pH 7,4) contenant 0,2 g/L de NaN3 pour obtenir une solution de référence avec 50 mg/mL de BSA et 0,8 mol/L de D-glucose (144mg/mL). 2 mL de la solution de référence est incubée à 37°C pendant 7 jours en présence ou en absence de 1 mL d'extrait de l'exemple 1 dans un tampon de phosphate (1,5 M ; pH 7,4). La solution contient également 0,2 g/L de NaN3 pour assurer la condition d'asepsie. 100 mM de chlorure d'aminoguanidine est utilisé comme témoin positif. Le mélange est incubé pendant 7 jours à 37°C. L'intensité fluorescente est mesurée à une longueur d'émission de 410nm et d'excitation de 330nm. Le pourcentage d'inhibition des produits de glycation est donné par l'équation : % inhibition = [1 - (fluorescence avec inhibiteur/ fluorescence sans inhibiteur)] * 100 Concentration % inhibition Témoin + 1% 80.43 Extrait 1 % 0,19 mg sec /ml 3.60 5% 0,95 mg sec /ml 23.30 10% 1,9 mg sec /ml 43.90 Les résultats montrent que le principe actif à 10% inhibe 44% des produits de glycation. Exemple 5 : composition cosmétique Composition % pds Emulsionnant distéarate de polyglycéryl-3 méthylglucose 1.500 alcool cétéarylique 3.000 PEG-40 huile de ricin hydrogénée 3.000 cétéarylsulphate de sodium 3.000 Stabilisant stéarate de glycéryle 4.000 Emoliant isononyl isononanoate 8.000 Eau Aqua 75.495 Conservateur méthylchloroisothiazolinone/ 0.005 méthylisothiazoline Actif Extrait de Bolet de l'exemple 1 2.000 * actif pur issu de l'extraction Exemple 6 : composition cosmétique Composition % pds Eau Aqua 80.977 Gélifiant acrylates/C1o_30 alkylacrylate crosspolymer 0.475 Chondrus crispus (carraghénane) 0.163 Humectant bétaïne 0.400 Humectant glycérine 4.000 Solvent polyéthylèneglycol-8 0.500 Conservateur Chlophenesin 0.171 méthylparaben 0.057 phénoxyéthanol 0.587 butylparaben 0.684 Triclosan 0.050 hydroxide de sodium 0.050 Emoliant propylèneglycol 0.313 isononylisononanoate 6.000 triglycéride caprilique/caprique 4.000 Stabilisant Cétyl-alcool 0.600 Huile Buthylhydroxytoluène 1.500 Gossypium herbaceum - huile de graines 1.500 de coton Actif* Extrait de Bolet de l'exemple 1 2.000 18 * actif pur issu de l'extraction REFERENCES [1] Bradford, A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, Analytical Biochemistry 72, 248-254 (1976). [2] Dubois, A colorimetric method for the determination of sugars, Nature 168 :167, (1951). [3] Blumenkrantz et Asboe-Hansen, New method for quantitative determination of uronic acids, Anal Biochem 54 : 484, (1973). [4] Singleton and Rossi, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents, AJEV, 16: 144-158, (1965). [5] Kamerling J.P. et al., Characterisation by Gas-liquid chromatography- Mass spectroscopy and proton magnetic- Resonance spectroscopy of pertrimethylsilyl of glycoproteins and glycopeptides. Biochem. J, 151, 491-495, (1975). [6] Christophe Chauveau et al., A water-soluble 8-D-glucan from Boletus erythropus, Phytochemistry, Vol. 43, No. 2, pp. 413-415, (1996). [7] J. Buenger et al., "An interlaboratory comparison of methods used to assess antioxidant potentials", Internationnal Journal of Cosmetic Science, 28, 135-146, (2006). [8] Yoshida, T. et al., "Studies of Inhibition mechanism of autoxidation by tannins and flavonoids. 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Utilisation cosmétique d'un extrait de champignon comestible pédonculé, notamment un extrait de cèpe ou de bolet, pour le traitement anti-âge de la peau par application d'une composition topique comportant au moins un tel extrait et un véhicule cosmétiquement acceptable, notamment à des fins anti- radicalaires, anti-glycation et/ou de stimulation de la synthèse de la filaggrine. 2. Utilisation cosmétique selon la revendication 1, dans laquelle l'extrait est un extrait aqueux. 3. Utilisation cosmétique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'extrait de champignon répond à au moins un des critères suivants : a) taux de matière sèche, déterminé par lyophilisation, compris entre 0,1 et 100 g/L, de préférence entre 1 et 50 ; b) pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 4 et 6 ; c) taux de protéine compris entre 0,0005 et 10 g/L, de préférence 0,001 et 1 g/L ; d) taux de sucres totaux compris entre 0,01 et 100g/L, de préférence entre 0.05 et 50g/L ; e) taux de phénol totaux compris entre 0,001 et 50g/L, de préférence 0,005 et 10g/L ; f) une fraction oligosaccharidique représentant entre 50 et 95%, massique de la fraction glucidique totale, de préférence composée de 65 à 99% molaire de glucose, de préférence 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale, de préférence composée de 75 à 98% molaire de glucose et comprenant éventuellement des traces de rhamnose et de fucose ; g) une fraction polysaccharidique représentant entre 2 et 50% massique de la fraction glucidique totale, de préférence comportant au minimum 50% de glucose et de 15 à 35% de mannose et comprenant éventuellement des traces de xylose et de galactose, de préférence représentant 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale, de préférence comportant au minimum 60% deglucose et de 20 à 30% de mannose et comprenant éventuellement des traces de xylose et de galactose ; h) une fraction polysaccharidique essentiellement constituée de glucanes de masse moléculaire comprise entre 500 et 65 000 Da. 4. Utilisation cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'extrait aqueux de champignon répond à un au moins des critères suivants : a) taux de matière sèche, déterminé par lyophilisation, compris 10 entre 15 et 25 g/L, de préférence 19,34 ± 0,20 g/L ; b) pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 4 et 6 ; c) taux de protéine valant 0,02 ± 0,01 g/L ; d) taux de sucres totaux allant de 1 à 25 g/L, de préférence valant 7,99 ± 1 g/L ; 15 e) taux de phénol totaux compris entre 0,1 et 2,5g/L, de préférence 0,85± 0,05g/L ; f) une fraction oligosaccharidique, isolée par chromatographie d'exclusion stérique sur gel BIO-RAD CL4B, représentant entre 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale composée de 75 à 20 98% molaire de glucose et comprenant quelques traces de rhamnose et de fucose ; g) une fraction polysaccharidique représentant entre 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale, comportant au minimum 60% de glucose et de 20 à 30% de mannose, et éventuellement 25 des traces de xylose et de galactose ; h) une fraction polysaccharidique essentiellement constituée de glucanes de masse moléculaire est comprise entre 1000 et 50 000 Da. 30 5. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'extrait de champignon est choisi dans le groupe des extraits de Boletus erythropus, Boletus edulis, Boletus badius, Boletus luridus, Suillus bovinus, Suillus granulatus, Leccinum scabrum, Boletus aereus, Boletus pinicola et Boletus aestivalis ou leurs mélanges et en particulier Boletus edulis, Boletusaereus, Boletus pinicola et Boletus aestivalis, plus particulièrement Boletus edulis. 6. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comporte de 0,01 à 10% en poids de l'extrait ou des extraits, de préférence de 0,1 à 5% en poids de l'extrait ou des extraits, par rapport au poids total de la composition. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la concentration de l'extrait utilisé est inférieure ou égale à environ 2 mg de matière sèche par ml. 8. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 à 7, sous la forme de composition anti-âge, composition anti-stress notamment anti-stress oxydatif, composition anti-radicalaire, composition anti-oxydante, composition anti-ride, composition anti-vieillissement cellulaire, composition favorisant l'élasticité de la peau ou sa fonction barrière. 9. Utilisation cosmétique topique d'un extrait de champignon comestible pédonculé dans un véhicule cosmétiquement acceptable, notamment un extrait de cèpe ou de bolet, plus particulièrement un extrait de Boletus edulis, pour stimuler la synthèse de la filaggrine. 10. Composition cosmétique d'application topique comportant un véhicule cosmétiquement acceptable et au moins un extrait de champignon comestible pédonculé répondant aux critères suivants : a) taux de matière sèche, déterminé par lyophilisation, compris entre 0,1 et 100 g/L, de préférence entre 1 et 50 ; b) pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 4 et 6 ; c) taux de protéine compris entre 0,0005 et 10 g/L, de préférence 0,001 et 1 g/L ; d) taux de sucres totaux compris entre 0,01 et 100g/L, de préférence entre 0.05 et 50g/L ;e) taux de phénol totaux compris entre 0,001 et 50g/L, de préférence 0,005 et 10g/L ; f) une fraction oligosaccharidique représentant entre 50 et 95% massique de la fraction glucidique totale, de préférence composée de 65 à 99% molaire de glucose, de préférence entre 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale, de préférence composée de 75 à 98% molaire de glucose et comprenant éventuellement des traces de rhamnose et de fucose ; g) une fraction polysaccharidique représentant entre 2 et 50% massique de la fraction glucidique totale, de préférence comportant au minimum 50% de glucose et de 15 à 35% de mannose et comprenant éventuellement des traces de xylose et de galactose, de préférence représentant entre 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale, de préférence comportant au minimum 60% de glucose et de 20 à 30% de mannose et comprenant éventuellement des traces de xylose et de galactose ; h) une fraction polysaccharidique essentiellement constituée de glucanes de masse moléculaire comprise entre 500 et 65 000 Da. 20 11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'extrait répond aux critères suivants : a) taux de matière sèche, déterminé par lyophilisation, compris entre 15 et 25 g/L, de préférence 19,34 ± 0,20 g/L ; b) pH compris entre 3 et 8, de préférence entre 4 et 6 ; 25 c) taux de protéine valant 0,02 ± 0,01g/L ; d) taux de sucres totaux allant de 1 à 25 g/L, de préférence valant 7,99 ± 1 g/L ; e) taux de phénol totaux compris entre 0,1 et 2,5g/L, de préférence 0,85 ± 0,05g/L ; 30 f) une fraction oligosaccharidique, isolée par chromatographie d'exclusion stérique sur gel BIO-RAD CL4B, représentant entre 70 et 90% massique de la fraction glucidique totale composée de 75 à 98% molaire de glucose et comprenant quelques traces de rhamnose et de fucose ; 10 15g) une fraction polysaccharidique représentant entre 5 et 30% massique de la fraction glucidique totale, comportant au minimum 60% de glucose et de 20 à 30% de mannose, et éventuellement des traces de xylose et de galactose ; h) une fraction essentiellement constituée de glucanes de masse moléculaire est comprise entre 1000 et 50 000 Da. 12. Composition selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que l'extrait est choisi dans le groupe des extraits de Boletus erythropus, Boletus edulis, Boletus badius, Boletus luridus, Suillus bovinus, Suillus granulatus, Leccinum scabrum, Boletus aereus, Boletus pinicola et Boletus aestivalis ou leurs mélangeset en particulier Boletus edulis, Boletus aereus, Boletus pinicola et Boletus aestivalis, plus particulièrement Boletus edulis. 13. Procédé cosmétique de traitement anti-âge de la peau, dans lequel on applique une composition utilisée dans l'une des revendications 1 à 9 ou une composition selon l'une des revendications 10 à 12.