Brevet FR2963791A1 — publié le 20120217

METHODE DE DIAGNOSTIC DES MALADIES NEURODEGENERATIVES Domaine de l'invention La présente invention concerne une méthode de diagnostic des maladies 5 neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer. Arrière-plan technique Le diagnostic des maladies neurodégénératives n'est pas aisé. Ainsi, pour la maladie d'Alzheimer, selon les critères classiques dits NINCDS-ADRDA (McKhann et al. (1984) 10 Neurology 34:939-944), on distingue entre maladie d'Alzheimer possible, probable et certaine, le diagnostic d'une maladie d'Alzheimer certaine ne pouvant être établi que postmortem, après autopsie du malade et examen neuropathologique du cerveau mettant en évidence l'existence de plaques séniles d'une part, et une dégénérescence neurofibrillaire d'autre part. 15 Le diagnostic d'une maladie d'Alzheimer possible ou probable repose essentiellement sur des critères cliniques et des tests neuropsychologiques qui visent tout d'abord à établir si un individu présente un syndrome démentiel, en général selon les critères du DSM IV (Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders, 4ème édition, American Psychiatric Association, 1994), puis à déterminer l'étiologie de la démence. Les critères de démences 20 comprennent essentiellement l'association d'un trouble de la mémoire et d'autres fonctions cognitives retentissant sur les activités socio-professionnelles et entraînant un déclin par rapport au fonctionnement antérieur. Le diagnostic se renforce par le suivi de l'évolution du patient, ce qui permet de préciser les causes de la démence, notamment en écartant d'autres causes de déclin cognitif. A ce titre, l'imagerie cérébrale est un élément important du 25 diagnostic en évaluant l'atrophie régionale hippocampique, qui peut toutefois être présente dans d'autres maladies atteignant les personnes âgées, et en excluant d'autres causes de troubles cognitifs, telles que des séquelles d'accidents vasculaires cérébraux. Cependant, on considère généralement qu'environ seulement 85% des cas de maladie d'Alzheimer probable sont confirmés post-mortem. Les 15% de faux positifs résultent 30 généralement d'autres maladies neurodégénératives, telles que les démences frontotemporales, dont notamment la démence avec corps de Lewy (Delacourte (1998) Annales de Biologie Clinique 56:133-142). La méthodologie actuelle de diagnostic de la maladie d'Alzheimer manque donc de spécificité. En outre, il apparaît qu'entre le déclenchement de la maladie, défini par l'apparition des premiers troubles cognitifs, et les premiers symptômes de démence pouvant donner lieu à l'établissement d'un diagnostic de maladie d'Alzheimer possible ou probable, il peut s'étendre une période de plus de 10 ans (Amieva et al. (2008) Ann. Neurol. 64:479-480). Le diagnostic de la maladie d'Alzheimer est donc actuellement établi tardivement, alors que la maladie se trouve à un stade très avancé. Les traitements actuellement envisagés pour la maladie d'Alzheimer nécessiteraient toutefois, pour être efficace, d'être mis en oeuvre dès le début du processus pathologique, par exemple alors que l'individu à traiter ne présente encore que des troubles cognitifs légers (Mild Cognitive Impairement, MCI), ce qui implique de pouvoir précocement diagnostiquer la maladie. De fait, des examens complémentaires, tels que le dosage de marqueurs biochimiques dans le liquide céphalorachidien de patients, peuvent être effectués pour améliorer le diagnostic de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, il a notamment été montré que la détermination des niveaux, dans le liquide céphalorachidien, du peptide (3-amyloïde1_42 (A(342) et du niveau total du peptide tau (Tubulin Associated Unit), c'est-à-dire à la fois sous forme phosphorylée et sous forme non phosphorylée, permettait de diagnostiquer la maladie d'Alzheimer avec une sensibilité de 92% et une spécificité de 89% (Sunderland et al. (2003) JAMA 289:2094-2103). Depuis, un troisième marqueur a été ajouté, en plus de A1342 et de tau total (T-tau), à savoir tau phosphorylé (ptau), notamment au niveau de la thréonine 181. En outre, il a pu être montré que la combinaison de ces trois marqueurs permettait de détecter une maladie d'Alzheimer naissante chez des individus souffrant de MCI avec une sensibilité de 83% et une spécificité de 72% (Mattson et al. (2009) JAMA 302:385-393). Toutefois, à l'heure actuelle, ces dosages ne sont pas réalisés en routine, en partie car le gain qu'ils permettent en terme fiabilité et de précocité du diagnostic de la maladie d'Alzheimer n'est pas suffisant pour justifier d'avoir recours à ces derniers systématiquement. La protéine kinase ARN double-brin dépendante (PKR) est une sérine/thréonine kinase dont la principale cible est le facteur d'initiation de la traduction eukaryote 2a (eIF2a). PKR existe sous une forme activée par phosphorylation de la thréonine en position 446 et/ou de la thréonine en position 451. Des niveaux élevés de PKR activée ont pu être notamment mis en évidence dans le cerveau de patients souffrant de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Huntington, et de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, ainsi que dans les lymphocytes sanguins de patients souffrant de la maladie d'Alzheimer (pour revue voir Hugon et al. (2009) Expert Rev. Neurother. 9:1455-1457). Description de l'invention L'invention découle de la mise en évidence, par les présents inventeurs, que la détermination du niveau de PKR, notamment sous sa forme activée phosphorylée, dans le liquide céphalorachidien d'individus est utile pour diagnostiquer la maladie d'Alzheimer chez ces individus de manière sélective et spécifique, y compris à un stade précoce de la maladie. Ainsi, la présente invention concerne une méthode de diagnostic, notamment in vitro, d'une maladie neurodégénérative chez un individu, dans laquelle : - on détermine le niveau de la protéine kinase ARN double-brin dépendante (PKR) dans un échantillon biologique de l'individu, notamment un échantillon de liquide céphalorachidien, - on en déduit si l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative. La présente invention concerne également une méthode de diagnostic, notamment in vitro, d'une maladie neurodégénérative chez un individu, dans laquelle : - on détermine le rapport du niveau de PKR activée sur le niveau total de PKR dans un échantillon biologique de l'individu, notamment un échantillon de liquide céphalorachidien, - on en déduit si l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative. La présente invention concerne également une méthode de diagnostic, notamment in vitro, d'une maladie neurodégénérative chez un individu ne présentant pas de symptôme de démence, dans laquelle : - on détermine le niveau de la protéine kinase ARN double-brin dépendante (PKR) dans un échantillon biologique de l'individu, notamment un échantillon de liquide céphalorachidien, - on en déduit si l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative. Comme on l'entend ici, l'expression «maladie neurodégénérative » désigne une maladie dégénérative, c'est-à-dire à dégradation progressive, affectant le système nerveux et en particulier le cerveau. De manière préférée la maladie neurodégénérative selon l'invention est une démence. Les démences sont bien connues de l'homme du métier ; on considère généralement qu'une démence se caractérise par une détérioration progressivement du fonctionnement intellectuel d'un individu, compromettant ainsi ses facultés d'adaptation à son environnement, en particulier face à des situations nouvelles, ce qui conduit à une perte de son autonomie. De préférence, les symptômes de démence selon l'invention sont en particulier ceux définis dans le Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders, 4eme édition (1994) de l'American Psychiatric Association (DSM IV) pour les démences de type maladie d'Alzheimer, à savoir : A. Le développement de déficits cognitifs multiples se manifestant à la fois par : (1) des troubles de la mémoire (capacité réduite d'apprendre de nouvelles informations ou de se rappeler des informations précédemment apprises). (2) un (ou plusieurs) des troubles cognitifs suivants : (a) aphasie (trouble du langage) (b) apraxie (capacité réduite de mettre en ceuvre des activités motrices malgré des fonctions motrices intactes) (c) agnosie (incapacité à reconnaître ou à identifier des objets malgré des fonctions sensorielles intactes) (d) troubles du fonctionnement exécutif (c'est-à-dire planifier, organiser, fractionner en séquence, penser de manière abstraite) B. Les déficits cognitifs des critères Al et A2 causent chacun des troubles significatifs du fonctionnement social ou professionnel et représentent un déclin significatif par rapport à un niveau de fonctionnement antérieur. C. L'évolution est caractérisée par un déclenchement progressif et un déclin cognitif continu. D. Les déficits cognitifs des critères Al et A2 ne sont dus à aucun de ce qui suit : (1) autres maladies du système nerveux causant des déficits progressifs cognitifs et de la mémoire (par exemple, maladie cérébrovasculaire, maladie de Parkinson, maladie de Huntington, hématome sous-dural, hydrocéphalie à pression normale, tumeur du cerveau). (2) maladies systémiques connues pour causer des démences (par exemple, hypothyroïdisme, carence en vitamine B12 ou en acide folique, carence en niacine, hypercalcémie, neurosyphilis, infection par le HIV). (3) maladies induites par des substances. E. Les déficits ne se produisent pas uniquement au cours d'un délirium. F. Le dérangement ne peut être mieux compris comme étant dû par un autre trouble d'Axe I (au sens du DSM IV, c'est-à-dire nécessitant une attention immédiate) (par exemple un trouble dépressif majeur, ou une schizophrénie). De manière préférée, la maladie neurodégénérative selon l'invention est sélectionnée dans le groupe constitué de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Huntington, de la 30 maladie de Creutzfeld-Jakob, et de la maladie de Parkinson. De manière particulièrement préférée, la maladie neurodégénérative selon l'invention est la maladie d'Alzheimer. L'individu selon l'invention est de préférence un humain. L'individu selon l'invention peut présenter un ou plusieurs symptômes de démence ou être atteint de démence. L'individu selon l'invention peut également ne pas être atteint de démence. Lorsqu'il ne présente pas de démence, l'individu selon l'invention peut être atteint de troubles cognitifs, notamment de troubles cognitifs légers, correspondant à la dénomination anglo-saxonne de Mild Cognitive Impairement (MCI), bien connue de l'homme du métier et notamment définie par Petersen et al. (1999) Arch Neurol 56:303-308. Un individu est généralement défini comme présentant un MCI en cas de plainte subjective associée à une évidence objective d'un déficit de la performance mnésique avec épargne du fonctionnement cognitif et intelléctuel global et intégrité des activités de la vie de tous les jours. De préférence, un individu présentant un MCI selon l'invention a un score au test Mini Mental State Examination (MMSE), notamment dans la version consensuelle du Groupe de Réflexion sur les Evaluations Cognitives (GRECO), supérieur au score correspondant au 5eme centile, en fonction de son âge et de son niveau socio-culturel. Par ailleurs, l'individu selon l'invention peut également ne pas présenter de troubles cognitifs. De préférence également, le niveau, dans un échantillon de liquide céphalorachidien de l'individu, d'au moins un marqueur biologique de maladie neurodégénérative est normal. Comme on l'entend ici, le niveau d'un marqueur biologique de maladie neurodégénérative est dit normal lorsque son niveau est inférieur à la valeur seuil généralement retenue par l'homme du métier pour diagnostiquer l'individu comme étant atteint de la maladie neurodégénérative à laquelle le marqueur est associé. De nombreux marqueurs biologiques de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, sont connus de l'homme du métier. De préférence, le marqueur biologique de maladie neurodégénérative selon l'invention est un marqueur biologique de la maladie d'Alzheimer, notamment choisi dans le groupe constitué du marqueur 13-amyloïde (A(3), en particulier 13-amyloïde1_42 (A(342), de tau total (T-tau), et de tau phosphorylé (ptau), en particulier au niveau de la thréonine 181 (ptaul8l). Ces marqueurs et les méthodes de mesure de leur niveau dans un échantillon de liquide céphalorachidien sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment définis dans Sunderland et al. (2003) JAMA 289:2094-2103, Blennow et al. (2006) Lancet 368:387-403 et dans Mattson et al. (2009) JAMA 302:385-393. La protéine kinase ARN double-brin dépendante (PKR) également nommée E2AK2 est bien connue de l'homme du métier et est notamment définie dans Hugon et al. (2009) Expert Rev. Neurother. 9:1455-1457 ou par la référence d'accès P19525 de la base de données UniProtKB. Comme on l'entend ici, l'expression « protéine kinase ARN double-brin dépendante » ou « PKR » se réfère indifféremment à PKR non phosphorylée, à PKR phosphorylée (pPKR) sur la thréonine position 446 (pPKR446) et/ou sur la thréonine en position 451 (pPKR451), ou à l'ensemble de ces formes de PKR. L'ensemble des formes de PKR dans l'échantillon biologique de l'invention, phosphorylées et non phosphorylées est également nommé PKR total. Ainsi, dans un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de diagnostic de l'invention, on déduit que l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative, notamment de la maladie d'Alzheimer, à partir du niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon, du niveau de PKR total dans l'échantillon, ou du rapport du niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon sur le niveau de PKR total dans l'échantillon. Dans un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de diagnostic de l'invention, on déduit que l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative, notamment de la maladie d'Alzheimer, à partir de la comparaison entre : - le niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon, le niveau de PKR total dans l'échantillon, ou le rapport du niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon sur le niveau de PKR total dans l'échantillon, et - au moins une valeur prédéfinie, notamment lorsque le niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon, le niveau de PKR total dans l'échantillon, ou le rapport du niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon sur le niveau de PKR total dans l'échantillon est supérieur à la valeur prédéfinie. La valeur prédéfinie selon l'invention peut être déterminée de manière aisée par l'homme du métier. Il peut notamment s'agir du niveau moyen de PKR selon l'invention, ou d'un multiple supérieur à 1 de ce niveau moyen, dans des échantillons de LCR d'individus témoins ne souffrant pas de troubles cognitifs. Il peut également s'agir d'une valeur seuil obtenue à partir de courbes Receiving Operating Characteristics (ROC) établie pour PKR total, PKR phosphorylée, notamment pPKR446, ou le rapport du niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon sur le niveau de PKR total dans l'échantillon, en fixant des valeurs particulière de sélectivité et de spécificité, notamment pour maximiser la somme de la sélectivité et de la spécificité, comme cela est illustré dans les exemples qui suivent. Ainsi, à titre d'exemple, selon l'invention un individu sera diagnostiqué comme ayant la maladie d'Alzheimer lorsque le rapport du niveau de PKR phosphorylée, notamment pPKR446, dans l'échantillon sur le niveau de PKR total dans l'échantillon, sera supérieur à 0,77. Par ailleurs, dans un autre mode de réalisation particulier, la méthode de diagnostic selon l'invention comprend en outre la détermination du niveau d'au moins un autre marqueur biologique de maladie neurodégénérative, notamment de la maladie d'Alzheimer, tel que défini ci-dessus. L'échantillon biologique selon l'invention est de préférence un échantillon biologique fluide, plus préférablement du liquide céphalorachidien (LCR). L'homme du métier sait bien comment obtenir du LCR à partir d'un individu, par exemple par ponction lombaire. De préférence, dans la méthode selon l'invention, on détermine le niveau de PKR selon l'invention dans l'échantillon biologique selon l'invention par une méthode immunologique, c'est-à-dire une méthode mettant en oeuvre des anticorps, notamment monoclonaux, des fragments d'anticorps comprenant la partie de l'anticorps se liant spécifiquement à l'antigène, ou encore des aptamères, spécifiquement dirigé contre PKR, c'est-à-dire ne se liant essentiellement pas à d'autre constituant de l'échantillon biologique, notamment de l'échantillon de LCR. Comme cela apparaîtra clairement à l'homme du métier des anticorps utiles pour mesurer le niveau de PKR total sont dirigés contre une partie de PKR non modifiée par phosphorylation ; a contrario, des anticorps utiles pour mesurer le niveau de pPKR446 ou pPKR451 se lient sur la partie de PKR phosphorylée (et non sur la même partie lorsqu'elle n'est pas phosphorylée). De tels anticorps anti-PKR sont bien connus de l'homme du métier. Les méthodes immunologiques selon l'invention sont bien connues de l'homme du métier et recouvrent notamment le marquage de Western ou la technique ELISA. L'invention sera davantage illustrée de manière non-limitative à l'aide des figures et des exemples qui suivent. Description des figures Figures 1, 2 et 3 Les figures 1 à 3 donnent des représentations en boites à moustaches des niveaux (unités arbitraires), mesurés dans le LCR de patients atteints de maladie d'Alzheimer (AD), de PKR total (PKR) (figure 1), de pPKR446 (pPKR) (figure 2) et du rapport pPKR446/PKR total multiplié par 100 (pPKRIPKR) (figure 3), par rapport à ceux mesurés dans le LCR d'individus témoins ne souffrant pas de troubles cognitifs (témoin). Figures 4, 5 et 6 Les figures 4 à 6 représentent les courbes ROC donnant la sélectivité (axe des ordonnées) et 1 - spécificité (axe des ordonnées) du diagnostic de la maladie d'Alzheimer à partir du niveau 35 de PKR total (figure 4), de pPKR446 (figure 5) et du rapport pPKR446/PKR total (figure 6). Figure 7 La figure 7 représente la relation entre le rapport pPKR446/PKR total multiplié par 100 5 (pPKR/PKR, axe des ordonnées, unités arbitraires) et le niveau de ptaul81 (ptau, axe des abscisses, pg/mL) dans le LCR ainsi que la droite de corrélation correspondante. Figure 8 La figure 8 représente le rapport du niveau de pPKR446 sur le niveau de PKR total (axe des 10 ordonnées, unités arbitraires) dans le LCR de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (AD), notamment avec des niveaux des marqueurs A(342, T-tau et ptaul 81 normaux (ADPLn) ou intermédiaires (AD-PLi) ; d'individus témoins sans troubles cognitifs (HC) ; de témoins présentant des troubles cognitifs sans rapport avec la maladie d'Alzheimer (CC) ; d'individus présentant une démence alcoolique (OH) ; et d'individu présentant un trouble 15 cognitif léger (MCI). EXEMPLE Exemple 1 20 1. Patients et méthodes Patients 46 patients diagnostiqués comme ayant la maladie d'Alzheimer (AD) et 39 individus témoins n'ayant pas la maladie d'Alzheimer ont été inclus dans l'étude. Les patients AD ont 25 été inclus sur la base des critères NINCDS-ADRDA. Tous les patients provenaient du Centre Mémoire de l'hôpital Lariboisière (Paris, France). Aucun des individus témoins ne présentait de trouble cognitif et ne remplissait les critères de la maladie d'Alzheimer. Des échantillons de liquide céphalorachidien (LCR) ont été collectés après ponction lombaire dans le cadre de la procédure de diagnostic classique, en association avec un examen neurologique, des tests 30 sanguins de routine, des tests neuropsychologiques et une imagerie IRM du cerveau. L'étude a reçu l'approbation du comité d'éthique de l'Hôpital Paris Nord Bichat. Analyse du LCR par marquage de Western : détermination des niveaux de PKR total et PKR phosphorylée sur la thréonine 446 (pPKR446) Les échantillons de LCR ont été prétraités sur colonne (ProteoExtractTM, Calbiochem®) pour retirer l'albumine et les IgG puis préparés, selon les techniques standards, pour un marquage de type Western. Les concentrations de protéines ont été déterminées à l'aide du kit Micro BCA Protein Assay (Thermo Scientific) selon les instructions du fabriquant. Les échantillons de LCR ont été séparés sur gel de polyacrylamide 4-12% NuPAGE BisTris (Invitrogen) puis électrotransférés sur des membranes de nitrocellulose (GE Healthcare). Les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires de lapin reconnaissant respectivement pPKR446 spécifiquement au niveau de la thréonine 446 phosphorylée et la totalité des protéines PKR (SantaCruz), bloquées dans 5% de lait en PBS puis incubées en présence du fluorophore IR DyeTM 800 couplé à un anticorps anti-lapin (Rockland Immunochemical Inc.) dilué au 1/5000. Les protéines liées ont été visualisées à l'aide du système d'imagerie Odyssey (LI-COR biosciences) puis quantifiées par densitométrie à l'aide du logiciel Multigauge (Fuji). Le rapport pPKR446/PKR total a été déterminé pour chaque patient et chaque individu témoins. Tous les résultats ont été ajustés par rapport à un témoin interne (cerveau humain atteint de la maladie d'Alzheimer). L'analyse statistique de la quantification a été effectuée à l'aide de la version 5 du logiciel Prism (GraphPad). Analyse du LCR par ELISA : f3-amyloïde142 (AE342), tau total (T-tau), tau phosphorylé au niveau de la thréonine 181 (ptau181) Les niveaux de A1342, T-tau and ptaul81 ont été déterminés par ELISA (Innotest tests Abeta, Innotests tau , Innotests p181 tau, Innogenetics, Gand, Belgique) dans les mêmes échantillons de LCR que ceux utilisés pour la détermination des niveaux de PKR total et de pPKR446 en suivant les recommandations du fabriquant. Analyse statistique Les statistiques descriptives ont été utilisées pour décrire les caractéristiques des patients et des témoins. Les groupes ont été comparés en utilisant le test t de Student pour les mesures continues et le test du chi2 pour les proportions. Les distributions des niveaux de PKR total et de pPKR446, ainsi que le rapport du niveau de pPKR446 sur le niveau de PKR total (pPKR446/PKR total) au sein des deux groupes (patients et témoins) ont été représentés 10 15 par la méthode des graphes en boites à moustaches. L'analyse de courbes ROC (Receiving Operating Characteristics) a été utilisée pour déterminer les meilleures valeurs de coupure (cutoff) du niveau des marqueurs du LCR mesurés et pour calculer l'aire sous les courbes (AUC). Les meilleures valeurs de coupure ont été définies comme donnant la somme de la sensibilité et de la spécificité la plus élevée. Le coefficient de corrélation de Spearman entre PKR et pPKR446 d'une part, et A(342, T-tau et ptau d'autre part a également été déterminé. 2. Résultats Les caractéristiques des individus étudiés sont présentées dans le Tableau 1 suivant : Témoins Alzheimer (AD) (N=39) (N=46) P Age, en années 69,5 (10.8) 70,7 (8,9) 0,59 Nombre de femmes (%) 21 (62) 26 (57) 0.64 MMSE 27.1 (2.9) 19.4 (6.4) Tableau 1 : caractéristiques des individus de l'étude Les données du tableau indiquent que les valeurs moyennes des concentrations de PKR et de PKR activée (pPKR446) et du rapport des concentrations pPKR446/PKR sont significativement plus élevées dans le LCR des patients atteints de maladie d'Alzheimer par rapport aux individus témoins. Ces observations sont confirmées pour les données dans leur ensemble par les représentations en boites à moustache données dans les Figures 1, 2 et 3. En particulier, l'ensemble des valeurs obtenues pour les concentrations de pPKR446 et pour le rapport pPKR446/PKR total des individus témoins est significativement inférieur à celui des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Par ailleurs, les courbes ROC ont été établies pour le PKR total, pPKR446 et le rapport pPKR446/PKR total. Les données de sensibilité et de spécificité tirées de ces courbes sont données dans le Tableau 2 suivant : Biomarqueurs AUC Seuil Sensibilité Spécificité Correctement criblé PKR total 0,87 62 76,1 79,5 77,7 pPKR446 0,96 40 100 76,9 89,4 pPKR446/PKR total 0,96 77 97,8 87,2 92,9 A1342 0.95 584 94,4 90,9 91,9 T-tau 0.97 282 93,2 100 95,2 ptaul81 0.98 61 90,9 100 93,6 Tableau 2 : Aire sous la courbe (AUC) des courbes ROC L'utilisation des niveaux de PKR total et surtout de PKR activé (pPKR446) et du rapport pPKR446/PKR total permet de détecter les malades atteints de la maladie d'Alzheimer. On observe notamment que la détermination du niveau de PKR activé (pPKR446) et du rapport pPKR446/PKR total permet une détection plus sensible de la maladie d'Alzheimer que celle offerte par les marqueurs diagnostics A(342, T-tau et ptaul8l. 5 Les coefficients de corrélation de Spearman entre les marqueurs A(342, T-tau et ptaul8l d'une part, et PKR total, pPKR446 et pPKR446/PKR total d'autre part, sont présentés dans le Tableau 3 suivant et dans la Figure 7. A(342 T-tau ptau 181 Rho P Rho P Rho PKR total -0,37 0,003 0,45 Les coefficients de corrélation de Spearman entre les marqueurs A(342, T-tau et ptaul8l d'une part, et PKR total, pPKR446 et pPKR446/PKR sont relativement faibles. Ces 10 deux groupes de marqueurs apparaissent donc relativement indépendant les uns des autres, ce qui laisse envisager que la combinaison des marqueurs de l'invention avec A(342, T-tau et ptaul8l pourrait améliorer l'efficacité diagnostic de ces derniers. Exemple 2 15 En suivant la méthodologie de l'Exemple 1, les inventeurs ont également comparé le rapport du niveau de pPKR446 sur le niveau de PKR total dans le LCR de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (AD), sélectionnés comme cela est indiqué dans l'Exemple 1, au même rapport mesuré dans le LCR d'individus témoins sans troubles cognitifs (HC), de 20 témoins présentant des troubles cognitifs sans rapport avec la maladie d'Alzheimer (par exemple secondaires à une dépression ou un autre trouble psychiatrique, à une démence fronto-temporale, à une démence vasculaire ou à une maladie à corps de Levy) (CC), d'individus présentant une démence alcoolique (OH), et d'individu présentant un trouble cognitif léger (MCI) (Figure 8). 25 On observe que la valeur moyenne du rapport pPKR446/PKR total est plus élevée dans le LCR de patients atteints de la maladie d'Alzheimer que dans le LCR d'individus témoins ne présentant pas de troubles cognitifs (comme cela a été déjà vu dans l'Exemple 1) ainsi que dans le LCR d'individus présentant une démence alcoolique, dont la valeur moyenne du rapport est d'ailleurs similaire à celle des témoins sans troubles cognitifs. Dans le cas présent, cela indique que l'élévation du rapport pPKR446/PKR total est spécifique de la maladie d'Alzheimer et possiblement plus généralement des démences neurodégénératives. On observe en outre que la valeur moyenne du rapport pPKR446/PKR total dans le LCR de individus atteints de troubles cognitifs légers (MCI) est intermédiaire par rapport à celle des patients atteints de la maladie d'Alzheimer et à celle des individus témoins sans troubles cognitifs. Dans la mesure où le taux de conversion annuel des individus présentant des MCI en patients souffrant de la maladie d'Alzheimer est d'environ 15%, certains des individus ne développant pas de maladie d'Alzheimer ultérieurement, il est probable que l'élévation du rapport pPKR446/PKR total chez des individus atteints de MCI soit indicative de la présence d'une maladie d'Alzheimer naissante ou à stade précoce (c'est à dire avant l'apparition de symptômes de démence). Par ailleurs, la valeur moyenne du rapport pPKR446/PKR total dans le LCR d'individus témoins présentant des troubles cognitifs sans rapport avec la maladie d'Alzheimer est similaire à celle des témoins sans troubles cognitifs, ce qui indique que l'élévation du rapport pPKR446/PKR total chez les individus atteints de MCI est spécifique de la maladie d'Alzheimer et possiblement plus généralement des démences neurodégénératives Enfin, on observe qu'alors que certains des patients atteints de la maladie d'Alzheimer présentent des niveaux des marqueurs A1342, T-tau et ptaul 81 dans le LCR normaux (ADPLn) ou intermédiaires, c'est-à-dire compris entre la limite normale et la limite pathologique (AD-PLi), la valeur du rapport pPKR446/PKR total est élevée, ce qui indique que ce rapport peut être utile pour identifier des patients atteints de la maladie d'Alzheimer qui ne pourraient pas être identifiés à l'aide des marqueurs classiques. REVENDICATIONS1. Méthode de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative chez un individu, dans laquelle : - on détermine le niveau de la protéine kinase ARN double-brin dépendante (PKR) dans un échantillon de liquide céphalorachidien de l'individu, - on en déduit si l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la maladie neurodégénérative est 10 sélectionnée dans le groupe constitué de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Huntington, de la maladie de Creutzfeld-Jakob, et de la maladie de Parkinson. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'individu n'est pas atteint de démence. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'individu souffre de troubles 20 cognitifs légers (MCI). 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le niveau, dans un échantillon de liquide céphalorachidien, d'au moins un marqueur biologique de maladie neurodégénérative est normal. 7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle le marqueur biologique est choisi dans le groupe constitué du marqueur Ii-amyloïde (A13), de tau total (T-tau), et de tau phosphorylé (ptau). 30 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle on déduit que l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative à partir du niveau de PKR phosphorylé dans l'échantillon, du niveau de PKR total dans l'échantillon, ou du rapport du niveau de PKR phosphorylé dans l'échantillon sur le niveau de PKR total dans l'échantillon. 15 25 2963791 J5 9. Méthode selon la revendication 1 à 8, dans laquelle on déduit que l'individu souffre d'une maladie neurodégénérative à partir de la comparaison entre : - le niveau de PKR phosphorylé dans l'échantillon, le niveau de PKR total dans l'échantillon, ou le rapport du niveau de PKR phosphorylé dans l'échantillon sur le niveau de PKR total 5 dans l'échantillon, et - au moins une valeur prédéfinie. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant en outre la détermination du niveau d'au moins un autre marqueur biologique de maladie neurodégénérative, notamment 10 tel que défini dans la revendication 7.