Brevet FR2967423A1 — publié le 20120518

LIGAND SPECIFIQUE DE L'ANNEXINE 2 Domaine de l'invention La présente invention concerne un ligand spécifique de l'annexine 2, ainsi que son utilisation diagnostique et thérapeutique, ou son utilisation pour la détection in vitro de l'annexine 2 dans un échantillon biologique. Arrière-plan technique L'annexine 2, également nommée annexine A2, annexine II, lipocortine II, chaîne lourde de la calpactine I, chromobindine-8, p. 36 ou protéine placentaire anticoagulante IV, est une protéine de 38 kDa qui fait partie de la famille des annexines. Les annexines sont des protéines qui possèdent une double localisation cellulaire : cytosolique et membranaire. Elle est codée chez l'homme par le gène ANXA2. L'annexine 2 est structurée en 2 domaines : le coeur qui contient les sites de liaison au Cal+ responsables de la liaison aux membranes, et le domaine N-terminal qui possède le site de liaison à la protéine S1 OOA 10 avec laquelle elle forme un tétramère. L'annexine 2 est impliquée dans de nombreuses fonctions : l'angiogénèse, le processus métastatique, le transport du cholestérol, l'infection par certains virus, les phénomènes d'exocytose et d'endocytose, la régulation de l'action du plasminogène, la fibrinolyse, la formation de canaux ioniques, les interactions membrane-cytosquelette, la formation de jonctions intercellulaires (pour une revue voir Hajjar, K. A. & S. Krishnan (1999). Trends in Cardiovascular Medicine 9(5): 128-138). Sur le plan pathologique, la surexpression de l'annexine A2 a été retrouvée dans plusieurs cancers humains, incluant, de manière non restrictive, les gliomes de haut grade, les leucémies aiguës promyélocytaires, le cancer colorectal, le cancer du pancréas, les carcinomes à cellules rénales, les carcinomes hépatocellulaires, les carcinomes à cellules squameuses, le cancer de la prostate, et le cancer du poumon. La surexpression de l'annexine 2 a d'ailleurs été corrélée à un mauvais pronostic dans le cancer colorectal (Emoto et al. (2001). Cancer 92:1419-26) et à un risque de récidive après chirurgie chez les patients atteints du cancer du pancréas (Takano et al. (2008). Ann Surg Oncol 15:3157-68). L'implication de l'annexine 2 a été rapportée dans plusieurs maladies. Ainsi, il apparaît que des niveaux anormalement élevés d'expression d'annexine 2 sur les cellules de leucémie promyélocytaire aiguë augmentent la production de plasmine, une protéine fibrinolytique, ce qui contribuerait aux complications hémorragiques observées dans cette leucémie (Menell et al. (1999) New England Journal of Medicine 340:994-1004 ; Hajjar & Krishnan (1999) Trends Cardiovasc. Med. 9:128-138 Stein et al. (2009) Best Pract. Res. Clin. Haematol. 22:153-63. Il a également été rapporté que l'annexine 2 favoriserait l'angiogenèse, la progression tumorale, ainsi que les métastases de certains cancers (Yusuke, S. et al. (2008). Journal of Cellular Biochemistry 105(2): 370-380). Par ailleurs, l'annexine 2 serait également impliquée dans le risque accru de thrombose artérielle et veineuse que présentent les patients porteurs d'anticorps antiphospholipides (APLA) (Zhang & McCrae (2005) Blood 105:1964-1969). L'annexine 2 favoriserait aussi l'infection des cellules par certains virus. L'annexine 2 est donc une cible thérapeutique prometteuse ainsi qu'un marqueur diagnostique intéressant, et il serait avantageux de disposer de ligands spécifiques de cette protéine, que ce soit pour bloquer ses fonctions pathologiques ou pour la détecter. A ce titre, il a été montré que plusieurs ligands protéiques de l'annexine 2 avaient une action thérapeutique. Ainsi, il a été montré chez la souris qu'un anticorps monoclonal dirigé contre l'annexine 2 permettait de réduire de 70% la croissance tumorale dans un modèle murin de carcinome pulmonaire de Lewis (Sharma et al. (2006) Exp. Mol. Pathol. 81:136145). De même, il a été démontré que l'effet anti-angiogénique du polypeptide TM601, forme synthétique de la chlorotoxine, serait lié à son interaction avec l'annexine 2 (Kesavan et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:4366-4374 ; Lima et al. (2010). J Cell Physiol 225:855-864). Par ailleurs, il a été montré que le fragment Fab d'un anticorps monoclonal anti-annexine 2 bloque l'activation endothéliale provoquée par des APLA (Zhang & McCrae (2005) Blood 105:1964-1969). Toutefois, les ligands de l'annexine 2 identifiés jusqu'à ce jour présentent des limitations, notamment en terme de coût de synthèse, d'immunogénicité ou d'affinité pour leur cible. Résumé de l'invention La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, d'un aptamère, de nature nucléotidique, reconnaissant spécifiquement l'annexine 2 à la surface de cellules, avec une constante de dissociation de l'ordre du nanomolaire. Ainsi, la présente invention concerne un aptamère comprenant un acide nucléique capable de reconnaître spécifiquement l'annexine 2 à la surface d'une cellule. Plus particulièrement, l'invention concerne un aptamère comprenant, ou consistant en, un acide nucléique comprenant, ou constitué de : la séquence GGAACGCAAGAACUGAGGCCAUGAGGCGCCUUCCCUUGCUCA GGACGC (SEQ ID NO : 1), ou - la séquence AGCUAGGCCGCAAGGUGCCUCAACGCCAUCUGAGUGCCGACC CGAUCGC (SEQ ID NO : 2), ou une séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, sous réserve qu'un acide nucléique constitué de cette séquence se lie à lannexine 2. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'aptamère selon l'invention, pour son utilisation à titre de médicament ou d'agent diagnostique. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou diagnostique comprenant, à titre de substance active, au moins un aptamère selon l'invention, en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. A ce titre, l'invention concerne également une méthode in vitro de diagnostic d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mettre en contact l'échantillon biologique avec un aptamère selon l'invention ; déterminer la quantité d'aptamère fixé dans l'échantillon ; - éventuellement comparer la quantité d'aptamère fixé dans l'échantillon à au moins une valeur prédéterminée - en déduire si l'individu est atteint d'un cancer. La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - administrer un aptamère selon l'invention à l'individu ; - détecter, quantifier et/ou localiser l'aptamère dans l'individu ou une partie de l'individu ; - en déduire si l'individu est atteint d'un cancer. La présente invention concerne également l'utilisation in vitro d'un aptamère selon l'invention, pour détecter la présence d'annexine 2, ou déterminer la quantité d'annexine 2, présente dans un échantillon biologique. La présente invention concerne une méthode in vitro de détection ou détermination de la quantité d'annexine 2 dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : - mettre en contact l'échantillon biologique avec un aptamère selon l'invention ; - quantifier, ou détecter la présence ou l'absence d'aptamère fixé dans l'échantillon ; - en déduire la quantité, ou la présence ou l'absence d'annexine 2 dans l'échantillon. La présente invention concerne également une méthode de détection, de quantification ou de localisation d'annexine 2, dans un individu ou une partie d'un individu, comprenant les étapes suivantes: administrer un aptamère ou une composition diagnostique tel que défini ci-dessus à l'individu ; détecter, quantifier et/ou localiser l'aptamère dans l'individu ou une partie de 1' individu ; - en déduire la présence ou l'absence, la quantité, et/ou la localisation d'annexine 2 dans l'individu ou la partie de l'individu. La présente invention concerne également l'utilisation d'un aptamère tel que défini ci- dessus, pour le criblage de ligands de l'annexine 2. La présente invention concerne également une méthode de criblage de ligands de l'annexine 2 comprenant les étapes suivantes : - la mise en présence d'annexine 2 et, concomitamment ou successivement, d'un ligand à cribler et d'un aptamère tel que défini ci-dessus ; - déterminer la quantité d'aptamère fixé à l'annexine 2 ; - en déduire si le ligand est un ligand de l'annexine 2. Description détaillée de l'invention Comme on l'entend ici, un « aptamère » désigne un composé, comprenant au moins un acide nucléique, susceptible de se lier de manière spécifique à une cible, notamment de nature protéique, par l'intermédiaire de l'acide nucléique. Un aptamère est dit se lier de manière spécifique à une cible lorsqu'il ne présente essentiellement pas d'affinité pour un composé sans rapport structural avec la cible. De préférence, dans le cas d'une cible protéique, un composé protéique est dit sans rapport structural avec la cible selon l'invention, lorsque l'identité de séquence entre la cible et le composé est inférieure à 60%, de préférence inférieure à 70%, de préférence encore inférieure à 80%. De préférence, selon l'invention, un aptamère est dit ne présenter essentiellement pas d'affinité pour un composé selon l'invention, notamment lorsque la constante de dissociation de l'aptamère vis-à-vis du composé est supérieure à 10-6 mol/1, de préférence supérieure à 10-' mol/1. La constante de dissociation peut notamment être déterminée, dans des conditions standards, à l'aide des représentations de Scatchard et de Lineweaver Burk bien connues de l'homme du métier. De manière avantageuse, l'aptamère selon l'invention est spécifique de l'annexine 2, en particulier de l'annexine 2 humaine, notamment lorsque l'annexine 2 est exprimée à la surface d'une cellule. L'annexine 2, également nommée annexine A2, annexine II, lipocortine II, chaîne lourde de la calpactine I, chromobindine-8, p.36 ou protéine placentaire anticoagulante IV, est bien connue de l'homme du métier. L'annexine 2 humaine est notamment décrite sous la référence AAH52567.1 dans la base de données GenBank. A titre d'exemple, l'annexine 2 humaine est représentée par la séquence SEQ ID NO : 5. L'aptamère selon l'invention peut également comprendre au moins un groupement additionnel en plus de l'acide nucléique. Ainsi, l'acide nucléique selon l'invention peut être lié à au moins un groupement additionnel. Par ailleurs, de manière préférentielle, l'aptamère selon l'invention est constitué de l'acide nucléique selon l'invention et d'au moins un groupement additionnel selon l'invention. Le groupement additionnel selon l'invention peut être de tout type et de toute nature. Le groupement additionnel selon l'invention peut ainsi être un radioisotope, une molécule organique comprenant 100 atomes de carbone au plus, une nanoparticule, une protéine, notamment une glycoprotéine, un glucide, un lipide, ou encore un polynucléotide. Selon l'invention, on préfère toutefois que le groupement additionnel selon l'invention soit sélectionné dans le groupe constitué d'un marqueur détectable, d'un composé pharmacologique, et d'un composé susceptible de modifier les caractéristiques pharmacocinétiques d'un acide nucléique auquel il est lié, tel que le polyéthylène glycol (PEG). Le marqueur détectable selon l'invention peut être de tout type, il peut notamment s'agir d'un fluorophore, par exemple la fluorescéine ou la luciférase ; d'un radioisotope, notamment adapté à la scintigraphie, par exemple 99mTc ; d'une étiquette reconnaissable par un anticorps, par exemple la protéine c-Myc ; d'une étiquette d'affinité, par exemple la biotine ; d'une enzyme, par exemple la peroxydase de raifort. Le composé pharmacologique selon l'invention peut également être de tout type, il peut notamment s'agir d'un agent de chimiothérapie anticancéreuse, tel qu'un agent cytostatique ou cytolytique. Le composé pharmacologique selon l'invention peut également être de toute nature, il peut notamment s'agir d'un dérivé du platine, d'une molécule organique comprenant moins de 100 atomes de carbone, d'un peptide, d'un analogue de nucléotide, d'une toxine, d'un ARN interférent, ou d'un oligonucleotide antisens. De préférence, l'acide nucléique selon l'invention est de l'ARN. Comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, il est tout particulièrement préféré que l'acide nucléique selon l'invention soit monobrin. II est également tout particulièrement préféré que l'acide nucléique selon l'invention ait une structure tridimensionnelle lui permettant de se lier spécifiquement à l'annexine 2. Par ailleurs, le squelette ou le ribose de l'acide nucléique selon l'invention peut être modifié, en totalité ou en partie, notamment pour le rendre résistant à une dégradation hydrolytique, en particulier du fait de l'action de nucléase, notamment lorsque l'acide nucléique est de l'ARN. De telles modifications sont bien connues de l'homme du métier et recouvrent notamment les modifications de la fonction OH sur le carbone en position 2' du ribose par méthylation, ou la substitution de cette fonction OH par un groupement amino ou par un halogène, notamment par le fluor, ainsi que le recours à un squelette phosphorothioate, ou à des structure de type acide nucléique bloqué (Locked Nucleic Acid, LNA) ou acide nucléique peptidique (Peptide Nucleic Acid, PNA). Ainsi, de manière préférée, l'acide nucléique selon l'invention est un ARN dont les riboses des nucléotides pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2', les riboses des nucléotides puriques pouvant être inchangés. Une séquence ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2 selon l'invention, diffère notamment de SEQ ID NO : 1 ou 2 par l'insertion, la suppression ou la substitution d'au moins un nucléotide. Comme on l'entend ici, le pourcentage d'identité entre deux séquences est défini comme le nombre de positions pour lesquelles les bases sonf identiques lorsque les séquences sont alignées de manière optimale, divisé par le nombre total de bases de la plus grande des deux séquences. Deux séquences sont dites alignées de manière optimale lorsque le pourcentage d'identité est maximal. Par ailleurs, comme cela apparaitra de manière claire à l'homme du métier, il peut être nécessaire de faire appel à des ajouts de positions lacunaires (des « gaps ») de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Un acide nucléique est dit se lier à l'annexine 2, si la constante de dissociation de l'acide nucléique vis-à-vis de l'annexine 2, notamment humaine, de préférence exprimée par une cellule, en particulier une cellule de lignée cellulaire CHO, HEK293, MDA MB 231, MCF-7, A431, PC12 MEN2A, U87, 4T1, ou EMT6, comme cela est illustré dans les exemples, est inférieure à 10-6 mol/1, de préférence inférieure à 10-' mol/1. Comme cela apparaîtra clairement à l'homme du métier, lorsque l'aptamère selon l'invention comprend un acide nucléique selon l'invention, il peut également comprendre d'autres acides nucléiques. En revanche, lorsque l'aptamère selon l'invention est constitué de l'acide nucléique selon l'invention, il ne comprend pas d'autres acides nucléiques. De manière similaire, lorsque l'acide nucléique selon l'invention comprend une séquence, il peut également comprendre des séquences additionnelles s'étendant du côté 5' et/ou 3' de la séquence en question. En revanche, lorsque l'acide nucléique selon l'invention est constitué d'une séquence, il ne comprend pas de séquences additionnelles en plus de la séquence en question. Une séquence comprenant SEQ ID NO : 1 ou 2 selon l'invention peut notamment comprendre des séquences du côté 5' et/ou 3' visant à structurer l'acide nucléique. On préfère ainsi que l'acide nucléique selon l'invention comprenne, ou soit constitué de SEQ ID NO : 3 ou 4, qui comprennent respectivement SEQ ID NO : 1 et 2. Dans ce cadre, l'invention concerne alors également, en particulier, un acide nucléique comprenant, ou constitué d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 3 ou SEQ ID NO : 4, sous réserve qu'un acide nucléique constitué de cette séquence présente se lie à l'annexine 2. De préférence, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4. De préférence également, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 15 nucléotides consécutif d'une séquence ayant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%, d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4 selon l'invention. De manière plus préférée, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4. De manière encore plus préférée, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4. De manière particulièrement préférée, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4 selon l'invention, comprend ou est constituée d'au moins 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 nucléotides, ou tous les nucléotides, consécutifs d'une séquence ayant au moins 95% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4. Par ailleurs, de manière alternative, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3, ou 4 selon l'invention, peut être constituée d'une séquence de 95 nucléotides présentant au moins 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% d'identité avec SEQ ID NO : 3 et un acide nucléique constitué de cette séquence est susceptible d'adopter la structure de formule (I) suivante : G87 A86 Gu Ues C89 084 A90 X83 Y91 X82-Y92 X81-Y93 X80-Y94 C79 C95 Y78 Y77 A73 A72 Y74 Y75 Y76 C71 X69 X68 X67 070 Y66A 05 5' X1 X2 X3 4 A6 I Y12 Y11 Y10A U7 9 G8 Ü34 G13 Y65-X15 Y64X16 Y 63-X17 U18 Y62-X19 Y 61-X20 Y60-X21 Y59-X22 Y58-X23 Y 57-X24 Y56-X25 Y55 -X26 Y 54-X27 X4X46 X47 X53 X28 }{44 Y48 Y52-X29 X43 Y49 Y51-X30 X42 ,Yso X41 A32 G4o G33 X39 A34 X38 Ais X37 X36 Am (I) dans laquelle : - A, C, G, U sont les ribonucléotides Adenosine, Cytidine, Guanosine, et Uridine ; - chacun des X et des Y, identiques ou différents, représente A, C, G ou U ; - chacune des paires X-Y ou Y-X, identiques ou différentes, représentent des paires A-U, U-5 A, G-C, C-G, G-U ou U-G ; - de préférence (i) X36, X37, X38, X39 sont capables de former des paires A-U, U-A, G-C, C-G, G-U ou U-G respectivement avec Y66, Y65, Y64 et Y63, et (ii) X44, X45, X46, X47 sont capables de former des paires respectivement avec Y78, Y77, Y76 et Y75. De manière alternative également, la séquence comprenant, ou constituée d'au moins 10 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3, ou 4 selon l'invention, peut être constituée d'une séquence de 96 nucléotides présentant au moins 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% d'identité avec SEQ ID NO : 4 et un acide nucléique constitué de cette séquence est susceptible d'adopter la structure de formule (II) suivante : G22 023 021 G24 X29 -Y25 X19 -Y26 C11 Ü10 X12 X13 X14 X15 X16 X17 029 Y48 Y47 Y46 Y45 Y44 Y43 Y 30 A9 C49 G42 G X39 Y31 X6, -Y59 G41 40 X; ~Y32 G33 X37 X7 -Y51 C 34 X6 -Y52 A35 X5 -Y63 X4 -Y54 G3 055 A56 A63 062 G 57 C 64 X58 X59 X60 X61 Y91 Y90 Y89 Y88 Ae7 C65 G92 U86X85 Y66 A93 X84-Y 67 X83 Y68 X82-Y 69 X81-Y 70 X80-Y71 U79 X78-Y 72 A77 A73 A76 A74 15 A75 (II) dans laquelle : - A, C, G, U sont les ribonucléotides Adenosine, Cytidine, Guanosine, et Uridine ; U27 U18 A28 G2 5' G, 3' C98 U95 A94 - chacun des X et des Y, identiques ou différents, représente A, C, G ou U ; - chacune des paires X-Y ou Y-X, identiques ou différentes, représentent des paires A-U, U-A, G-C, C-G, G-U ou U-G. L'homme du métier peut aisément déterminer la structure secondaire susceptible d'être adoptée par un acide nucléique ayant une séquence selon l'invention, par exemple à l'aide d'algorithmes ou de logiciels de modélisation bien connus de l'homme du métier, tels que mfold (version 3.4) décrit dans Nucleic Acids Res. (2003) 31:3406-15 et vsfold5 RNA Pseudoknot Prediction décrit dans PLoS One (2007), 2:905. A ce titre, les inventeurs ont établi, à l'aide de tels outils de modélisation, que l'aptamère ACE8 de séquence SEQ ID NO : 3, qui est décrit dans les Exemples, adopte une structure de formule (I) et que l'aptamère ER4, de séquence SEQ ID NO : 4, qui est décrit dans les Exemples, adopte une structure de formule (II). Lorsque l'aptamère selon l'invention est utilisé à titre de médicament ou est compris dans une composition pharmaceutique, il est notamment utile pour la prévention ou le traitement des cancers, notamment en inhibant l'angiogenèse, pour la prévention ou le traitement des maladies impliquant une néovascularisation oculaire, telles que la dégénérescence maculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique, pour la prévention ou le traitement de la thrombose artérielle ou veineuse chez les patients porteurs d'anticorps antiphospholipides (APLA), pour la prévention ou le traitement des hémorragies chez les patients atteints de leucémie promyélocytaire aiguë, ainsi que pour la prévention ou le traitement des infections virales. Lorsque l'aptamère selon l'invention est utilisé à titre d'agent diagnostique ou est compris dans une composition diagnostique, il est notamment utile pour le diagnostic des cancers. De préférence, dans les méthodes de détection ou de diagnostic selon l'invention la détection d'aptamère fixé dans l'échantillon est effectuée par mise en oeuvre d'une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) destinée à amplifier l'aptamère. De préférence, lorsque l'acide nucléique selon l'invention comprend SEQ ID NO : 3 ou 4, la PCR est mise en oeuvre à l'aide du couple d'amorces de séquences GATTCTGCCTACGAACGACGACTT (SEQ ID NO : 6) et CTCGCATCAACGGATCATCTCCC (SEQ ID NO : 7). Par ailleurs, l'invention concerne également un acide nucléique comprenant ou constitué de SEQ ID NO : 6 ou de SEQ ID NO : 7. De préférence également, dans les méthodes de détection ou de diagnostic selon l'invention, lorsque l'aptamère est administré à un individu, on préfère que l'aptamère soit détectable par des méthodes d'imagerie in vivo, notamment externes, telles que l'imagerie 2967423 tt fluorescente planaire ou tridimensionnelle (3D), ou internes, telles que l'endoscopie par exemple. Description des figures Figure 1 : schéma du protocole de sélection La figure 1 représente le protocole de sélection des aptamères utilisé par les inventeurs pour obtenir l'aptamère ACES. 10 Figures 2 et 3 : Effet de l'endothéline sur la liaison des aptamères La figure 2 représente la fixation des aptamères ACES, ER2 et ER4 sur les cellules CHOETBR (graphe du haut) et CHO non transformées (CHO-WT, graphe du bas) en présence ou non d'endothéline. Les cellules CHO-ETBR ont été pré-incubées dans des cupules pendant 30 minutes (colonnes sombres) ou non (colonnes claires) avec 100nM d'endothéline. Puis les 15 aptamères radiomarqués sont ajoutés à une concentration de 10 nM pendant 30 minutes. Après plusieurs lavages, la radioactivité fixée aux cellules est comptée et la quantité d'aptamères fixés est déterminée (en pmoles/cupule). La figure 3 permet de visualiser l'endothéline sur CHO-ETBR et CHO-WT. Les cellules sont incubées pendant 30 min avec de l'endothéline-l-FAM à une concentration de 20 nM. Après 20 deux lavages, les cellules sont visualisées par microscopie fluorescente (photographies du haut) et montre une forte internalisation de l'endothéline. Les photographies du bas représentent les champs clairs correspondant aux champs fluorescents. Figure 4 : Prédiction de structure de l'aptamère ACE8 25 La figure 4 représente la structure secondaire de l'aptamère ACE8 prédite à l'aide du programme mfold (version 3.2, http://mfold.bioinfo.rpi.edukgi-bin/rna-forml.cgi). Sur cette structure, les séquences fixes permettant une amplification par PCR ont été surlignées en gris. La formation potentielle de pseudo-noeuds prédite par le programme Vsfold5 a été rajoutée (Vsfold5 pseudoknot prediction program, http://www.rna.it-chiba.ac.ip/-vsfold/vsfold5/). 30 Figure 5 : Visualisation de l'aptamère ACE8 sur différents types cellulaires La figure 5 représente des photographies prises en microscopie à fluorescence (photographies du haut) et les champs clairs correspondants (photographies du bas) pour des cellules A-431, HEK-293, MCF-7, MDA-MB-231 et PC 12 MEN2A mises en contact avec l'aptamère ACE8 ou la séquence contrôle marqué à la phycoérythrine. L'aptamère ou la séquence contrôle est incubé sur les cellules pendant 15 min à une concentration de 50 nM. Après 2 lavages, les cellules sont visualisées au microscope à fluorescence. Le temps d'exposition a été fixé à 200 ms pour toutes les expériences. Figures 6 et 7: Fixation de l'aptamère ACE8 sur des cellules MCF-7 en suspension La figure 6 représente des photographies prises en microscopie à fluorescence de cellules MCF-7 incubées en présence de l'aptamère ACE8 ou d'une séquence contrôle couplée à la phycoérythrine et en présence de protéinase K (+PK), de trypsine (+T) ou de PBS. Brièvement, les cellules MCF-7 sont détachées avec une solution de PBS-EDTA 5 mM. Les cellules en suspension sont pré-incubées avec de la protéinase K (+PK), de la trypsine (+T) ou du PBS pendant 10 min à 37°C. 1 mL de sérum de veau foetal inactivé (SVFi) sont ajoutés pour inhiber les enzymes. Les cellules sont alors incubées pendant 30 min avec l'aptamère ACE8 ou 1a séquence contrôle couplés à la phycoérythrine et lavées deux fois. Les cellules sont observées entre lame et lamelle au microscope à épifluorescence. La figure 7 représente les champs clairs correspondants aux champs fluorescents. Figure 8 : Protocole d'identification de la cible de l'aptmère ACE8 La figure 8 représente le protocole d'identification de la cible de l'aptamère ACE8. Brièvement, l'aptamère biotinylé est incubé sur les cellules MCF-7 en suspension. Après plusieurs lavages, des billes magnétiques couplées à la streptavidine sont ajoutées. Seules les cellules qui ont fixé l'aptamère ACE8 biotinylé vont être retenues sur les billes. Les cellules sont alors lysées et les protéines retenues par l'aptamère ACE8 sont éluées. Les protéines sont alors déposées sur gel SDS-PAGE et les bandes spécifiques sont analysées par spectrométrie de masse. Figure 9 : Migration des protéines par électrophorèse SDS-PAGE La figure 9 est une photographie d'un gel SDS-PAGE sur lequel sont mis à migrer les éluats provenant de billes mises directement en contact avec les cellules (billes), d'un oligonucléotide contrôle (Ctrl), ou de l'aptamère ACE8. Les principales bandes correspondant à l'éluat provenant de l'aptamère sont indiquées. La bande correspondant à l'Albumine Sérique Bovine (BSA), utilisée comme compétiteur non spécifique, est également représentée. Brièvement, les protéines sont déposées sur un gel SDS PAGE 10%. Le gel est 2967423 l3 ensuite coloré à l'aide du kit protéosilver silver stain kit (sigma). Les bandes intéressantes sont découpées, décolorées avec le même kit et analysées en spectrométrie de masse. Fi_ure 10 : Etude de l'effet de siRNA sur l'ex-ression de l'annexine 2 -ar -PCR dans les 5 cellules MCF-7 La figure 10 représente la quantité d'ARNm codant l'annexine 2 (axe des ordonnées, en pourcentage de la quantité exprimée en l'absence de siRNA) exprimée par des cellules MCF-7 en présence d'un siRNA ciblant (+siRNA) ou non (-siRNA) FARNm de l'annexine 2. Les cellules sont transfectées ou non avec un siRNA ciblant l'annexine 2 en présence de 10 lipofectamine. 72 h après, l'ARN total des cellules MCF-7 est extrait, rétro-transcrit et une gPCR est réalisé en utilisant des amorces spécifiques de l'annexine 2 et du gène PO pour normaliser les résultats. Figure 11 : Diminution de la fixation de l'aptamère ACES après traitement avec un siRNA 15 ciblant l'annexine 2 La figure 11 représente la quantité d'aptamères ACE8 (axe des ordonnées, en pourcentage de la quantité fixée en l'absence de siRNA) fixée à la surface de cellules MCF-7 en présence d'un siRNA ciblant (siRNA Annexine 2) ou non (siRNA contrôle) l'ARNm de l'annexine 2 Les cellules MCF-7 sont transfectées avec un siRNA ciblant l'annexme 2 ou avec un siRNA 20 contrôle en présence de lipofectamine. 72 h après, l'aptamère ACE8 radiomarqué ou une séquence contôle radiomarquée est incubé à une concentration de 10 nM pendant 15 min. La radioactivité est alors comptée. ** correspond à un écart significatif de la fixation de ACE8 entre les cellules transfectées par le siRNA ciblant l'annexine 2 et les cellules transfectées par le siRNA contrôle mesuré par un test de student avec P Figure 13 : Ciblage de nanoparticules à l'aide de l'aptamère ACES La figure 13 représente des photographies en microscopie à fluorescence de cellules MCF-7 mises en présence de l'aptamère ACE8 ou d'une séquence contrôle couplés à des Quantum Dots (QDs) pendant 15 min ou 1 h. L'aptamère permet un ciblage rapide des QDs à la membrane des cellules MCF-7 puis une partie est internalisée en moins d'une heure. Une séquence contrôle couplée à des QDs ne montre aucun marquage des cellules. Figure 14 : Utilisation de l'aptamère ACE8 en cytométrie de flux (FACS) Les cellules MCF-7 ou A431 sont incubées avec l'aptamère ACE8 ou la séquence contrôle marqués à la phycoérythrine à une concentration de 5 nM pendant 30 min. Les cellules sont alors lavées et analysées par cytométrie de flux. La figure 14 représente la quantité de cellules triées (axe des ordonnées) MCF-7 (graphe de gauche) et A431 (graphe de droite) en fonction de la fluorescence émise par l'aptamère ACE8 ou la séquence contrôle (axe des abscisses, unités arbitraires). Figure 15 : Utilisation de l'aptamère ACE8 en imagerie in vivo fluorescente planaire L'aptamère ACE8 ou une séquence contrôle marqués avec de l'alexaFluor680 ont été injectés dans des souris développant des tumeurs suite à une injection sous cutanée de cellules MCF-7. La Figure 15 représente leur biodistribution mesurée à l'aide de photographies obtenues à différents temps par imagerie fluorescente planaire à l'aide d'un appareil TomoFluo3D développé par le CEA-LETI. La tumeur ainsi que la zone de référence qui permet de mesurer le rapport signal dans la tumeur/référence interne sont indiquées par des flèches blanches. Fi ures 16 et 17 : Utilisation de l'aptamère ACE8 en imagerie in vivo fluorescente 3D L'aptamère ACE8 ou une séquence contrôle marqués avec de l'alexaFluor680 ont été injectés dans des souris développant des tumeurs suite à une injection sous cutanée de cellules MCF-7. Trois heures post-injection, le signal fluorescent dans la tumeur a été mesuré par tomographie fluorescente à l'aide d'un appareil TomoFluo3D développé par le CEA-LETI. La figure 16 montre un rendu 3D de la fluorescence au niveau de la tumeur dans le cube au dessus d'une image de fluorescence planaire de l'animal. La figure 17 représente la quantité de fluorescence déterminée en triplicat en pourcentage de la dose injecté (%DI, axe des ordonnées) dans la tumeur pour l'aptamère ACE8 et une séquence contrôle. Le symbole * correspond à un écart significatif du ratio entre ACE8 et la séquence contrôle mesuré par un test de student avec P Figures 18 et 19 : Utilisation de l'aptamère ACE8 comme inhibiteur de l'angiogénèse Des cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC) ont été cultivées, avec ou sans oligonucléotide (5µM), sur du Matrigel dans un mileu à faible teneur en hormones de croissance contenant 2% (v/v) de sérum de veau foetal et du facteur de croissance basique de fibroblaste (bFGF à 3 ng/mL). Dans ces conditions, les HUVEC forment un réseau de tubes endothéliaux qui peut être observé par microscopie et représente un modèle in vitro éprouvé de l'angiogénèse. La Figure 18 représente des photographies en microscopie des réseaux formés en l'absence d'oligonucléotide, en présence d'une séquence contrôle, et en présence de Paptamère ACE8. La formation de ce réseau n'est pas affectée par la présence de la séquence contrôle. Par contre l'aptamère ACE8 inhibe fortement la formation de ce réseau. La figure 19 représente le nombre de tubes par noeud de cellules sur quatre champs de vue choisis aléatoirement, en l'absence d'oligonucléotide (contrôle), en présence d'une séquence contrôle, et en présence de l' aptamère ACE8. * * * correspond à un écart significatif du ratio entre ACE8 et la séquence contrôle mesuré par un test de Student avec P Figure 20: Utilisation de l'aptamère ACE8 -our cribler des molécules -ouvant se lier à l'annexine 2. Chaque aptamère radiomarqué est incubé à une concentration de 10 nM sur les cellules CHO- ETBR en présence (colonnes sombres) ou non (colonnes claires) des deux autres aptamères non-radiomarqués en excès (100 nM) pendant 30 minutes. Après plusieurs lavages, la radioactivité fixée aux cellules est comptée et la quantité d'aptamères fixés est déterminée (en pmoles/cupule). La figure 20 représente la liaison (axe des ordonnées, en pmoles/cupule) de l'aptamère ACE8, ER2, ou ER4, seul (première colonne) ou en présence des deux autres (deuxième colonne). Cette expérience démontre une compétition entre ACE8 et ER4 pour la liaison aux cellules suggérant que ER4 se lie à l'annexine 2. Figure 21 : Prédiction de structure de l'aptamère ER4 La figure 21 représente la structure secondaire de l'aptamère ER4 prédite à l'aide du 30 programme mfold (version 3.2, httpi/mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-forml.cgi). EXEMPLES Exemple 1 : obtention de Paptamère ACE8 spécifique de Pannexine 2 1. Répartition de l'aptamère ACE8 après 15 et 18 tours de sélection sur les cellules CHOETBR Les inventeurs ont utilisé la technique de SELEX, notamment décrite dans la demande WO 2005/093097, dans le but de sélectionner des aptamères contre le récepteur à Pendothéline de type B (ETBR). Pour cela, des cellules CHO surexprimant de manière stable PETBR ont été utilisées pour la sélection et des cellules CHO n'exprimant pas l'ETBR pour la contre-sélection (Figure 1). Au cours de ce SELEX, les inventeurs ont fait varier différents paramètres dans le but d'augmenter progressivement la pression de sélection (Tableau 2). Par rapport au protocole décrit dans la demande WO 2005/093097, les inventeurs ont apporté quelques modifications : durant quelques tours, l'étape de sélection et de contre-sélection ont été inversées (tours 14 et 15) et les aptamères ont été décrochés des cellules par l'ajout d'endotheline-1 pour les trois derniers tours (16 à 18). Les conditions de sélection sont présentées dans le Tableau 1 ci-dessous : N° du nombre de nombre de inversion volume concentration durée nombre condition compétiteur mode cycle cellules de particulière ajouté durant d'elution pour la lavage de lavage l'incubation sélection (100pg/ml de (millions) tRNA) cellules selection -d'incubation en ARN-2'F- d'incubation pour la contre- (ml) Py (NM) (minutes) contre- selection selection (millions) 1 10 10 3 1 30 2 tri-reagent 2 10 10 3 1 30 3 tri-reagent 3 10 10 3 1 25 3 tri-reagent 4 5 5 3 1 25 3 tri-reagent 5 5 3 1 25 4 tri-reagent 6 5 5 3 1 20 4 tri-reagent 7 5 5 3 0,5 20 5 tri-reagent 8 5 5 3 0,5 15 5 tri-reagent 9 5 5 3 0,5 15 5 5 min pour tri-reagent le dernier lavage 5 5 3 0,5 10 5 5 min pour tri-reagent le dernier lavage 11 5 5 3 0,5 10 5 5 min pour + tri-reagent le dernier lavage 12 5 5 3 0,5 10 5 5 min pour + tri-reagent le dernier lavage 13 5 5 3 0,5 10 5 5 min pour + tri-reagent les 2 derniers lavages 14 5 5 + 3 0,5 10 5 5 min pour + tri-reagent les 2 derniers lavages 5 5 + 3 0,5 10 5 5 min pour + tri-reagent les 2 derniers lavages 16 5 5 3 0,025 10 5 5 min pour + elution par les 2 250nM derniers d'endotheline- lavages 1 17 5 5 3 0,025 10 5 5 min pour + elution par les 2 250nM derniers d'endotheline- lavages 1 18 5 5 3 0,025 10 5 5 min pour + elution par les 2 250nM derniers d'endotheline- lavages 1 Tableau 1 : évolution de la pression de sélection au cours du SELEX Les banques issues du tour 15 et du tour 18 ont été clonées et séquencées. De manière 5 intéressante une séquence (ACES) est deux fois plus abondante dans le tour 18 que dans le tour 15. 2. Effet de Pendothéline sur la fixation des aptamères Les inventeurs ont testé l'affinité d'une trentaine de séquences pour ces cellules à 10 25nM. Ceci leur a permis d'identifier une dizaine d'aptamères particulièrement intéressant avec une forte affinité pour les cellules CHO-ETBR. Parmi tous ces aptamères, ceux dont 2967423 l8 l'affinité pour les cellules pouvaient être liée avec l'expression du récepteur à l'endothéline de type B ont été recherchés. Pour cela, les inventeurs ont comparé l'affinité des aptamères pour des cellules CHO-ETBR préalablement incubées en présence d'endothéline. Lorsque l'endothéline se fixe sur le récepteur ETBR, le récepteur est très rapidement internalisé 5 (Figure 3). Suite à l'internalisation du récepteur à l'endothéline, trois aptamères ont montré une perte d'affinité pour les cellules (ACE8 (SEQ ID NO : 3), ER2 (SEQ ID NO : 4) et ER4 (SEQ ID NO : 8)) (Figure 2). Cependant, tous ces aptamères ont également de l'affinité pour les cellules CHO-WT, qui n'expriment pas le récepteur. De plus, suite au traitement à l'endothéline des CHO-WT, l'affinité de ces aptamères ne diminue pas. Toutes ces 10 expériences semblent démontrer que la cible de ces aptamère n'est pas ETBR mais une autre protéine qui pourrait être endocytée en même temps qu'ETBR après fixation de l'endothéline. Afin d'évaluer l'intérêt potentiel de ces aptamères, les inventeurs ont mesuré leur affinité sur des cellules MCF-7. Ces cellules humaines issues de lignée de cancer du sein sont connues pour exprimer les récepteurs à l'endothéline de type A et B. De façon intéressante 15 l'aptamère ACE8 et l'aptamère ER4 ont montré une forte affinité pour les cellules MCF-7. Ceci démontre que ces aptamères peuvent se fixer sur une cible d'origine humaine et pas seulement à la surface de cellule de hamster. De plus, des expériences de binding ont révélé que la cible de l'aptamère ACE8 était 10 fois plus abondante à la surface des cellules MCF-7 qu'à la surface des cellules CHO. Suite à ce résultat, les inventeurs se sont plus particulièrement intéressés à l'aptamère ACE8. 3. Séquence de l'aptamère ACE8 La séquence de l'aptamère ACE8 est la suivante : 5' GGGAGAUGAUCCGUUGAUGCGAGGGAACGCAAGAACUGAGGCCAUGAGGCG 25 CCUUCCCUUGCUCAGGACGCAAGUCGUCGUUCGUAGGCAGAAUC3' (SEQ ID NO : 3) Il est à noter qu'afin d'améliorer la résistance de l'aptamère ACES aux nucléases, les riboses des pyrimidines portent un atome de fluor sur le carbone en position 2' (les riboses des purines sont quant à eux porteurs, comme c'est le cas dans l'ARN naturel, d'une fonction 30 hydroxyle (OH) sur le carbone en position 2'). La Figure 4 représente une prédiction de structure secondaire de l'aptamère ACE8 réalisée par le logiciel mfold (version 3.4) (Nucleic Acids Res. (2003) 31:3406-15) et vsfold5 RNA Pseudoknot Prediction (PLoS One (2007), 2:905). 4. Caractérisation de l'aptamère ACE8 a- Validation de l'utilisation de l'aptamère ACE8 pour établir un profil d'expression à la surface de différentes lignées cellulaires. L'affinité et le Cmax de l'aptamère ACE8 ont été déterminés pour différentes lignées cancéreuses (Tableau 2). espèces Nom de la lignée Kd (nM) Cmax (pM) humaine MCF-7 4,9 +/- 1,7 484 +/- 81 A-431 5,3 +/- 1,1 450 +/- 35 MDA-MB-231 4,4 +/- 0,6 167 +/- 16 U87-MG 12,7 +/- 4,4 245 +/- 55 HEK-293 4,4 +1- 0,8 269 +/- 21 souris 4T1 3,7 +/- 0,3 247 +/- 11 EMT6 7,5 +/- 1,3 261 +/- 53 Hamster CHO-ETBR 3,4 +/- 0,8 86 +/- 13 Rat PC12-MEN-2A 18,8 +/- 2,6 914 +/- 134 Pour chaque type cellulaire, les courbes de binding ont été obtenues. A partir de la liaison spécifique, et à l'aide de la représentation de Scatchard, le Kd et le nombre de cibles par cellule ont été déterminés pour chacun des types cellulaires. La cible de l'aptamère ACE8 semble très abondante à la surface de deux lignées humaines de cancer (MCF-7 et A-431). Tableau. 2 : Affinité et nombre de cibles par cellule de l'aptamère ACE8 pour différentes lignées cellulaires L'aptamère ACE8 a une affinité d'environ 4 nM pour la plupart des lignées cellulaires, excepté pour les cellules PC12 MEN 2A et les cellules U87 où le Kd dépasse la dizaine de nM. Le nombre de cibles est très différent selon le type cellulaire allant d'un Cmax de 86+1-13 pM pour les CHO à 484 +/- 81 pM pour les MCF-7. De façon intéressante, la cible de l'aptamère ACE8 semble très abondante à la surface de la lignée humaine de cancer du sein MCF-7 et sur la lignée humaine de carcinome de l'épiderme A-431. b- Validation de l'utilisation de l'aptamère ACE8 en microscopie Une fois marqué par un composé fluorescent (phycoérythrine), l'aptamère a pu être utilisé en microscopie (Figure 5). Un contraste a pu être observé avec les cellules A-431 et MCF-7, les 25 types cellulaires qui ont le plus de cibles (450 +/- 35 et 484 +/- 81 pM, respectivement). Etant donné le nombre très important de cibles à la surface des MCF-7 et le bon contraste observé en microscopie, les inventeurs ont choisi d'approfondir l'étude de l'aptamère ACE8 sur ce type cellulaire, qui représente en plus l'avantage d'être une lignée de cancer du sein, indiquant ainsi que l'aptamère ACE8 pourrait éventuellement cibler une protéine impliquée dans ce cancer. 5. Identification de la cible de l'aptamère ACE8 a. Validation du protocole : Fixation de l'aptamère ACE8 sur cellules en suspension et détermination de la nature de la cible 10 Avant d'essayer de purifier la cible de l'aptamère ACE8, les inventeurs ont tout d'abord validé, d'une part, que l'aptamère ACE8 se fixe toujours lorsque les cellules sont en suspension (Figures 6 et 7). D'autre part, lorsque les cellules sont incubées avec de la trypsine et de la protéinase K, la fixation de l'aptamère est perdue ce qui démontre que la cible de l'aptamère est une protéine. 15 b. Protocole de purification de la cible de l'aptamère Afin d'identifier la cible de l'aptamère ACE8, un protocole dérivé de Berezovski et al. (2008) J. Am. Chem. Soc., Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery (AptaBiD) a été utilisé, dans lequel de la BSA a été rajoutée comme compétiteur pour éviter la fixation non spécifique 20 de protéines sur les billes. Le protocole est résumé dans la Figure 8. c. Gel SDS-PAGE et spectrométrie de masse Les protéines éluées à la fin du protocole résumé dans la Figure 8 ont été analysées par électrophorèse (Figure 9). 6 bandes spécifiques de l'aptamère ACE8 ont été identifiées. 25 Ces bandes ont été découpées et analysées par spectrométrie de masse. Parmi les différentes protéines identifiées, 4 sont impliquées dans les RAFTS lipidiques. Ceci suggère que la cible de l'aptamère ACE8 est une protéine localisée dans les RAFTs. Parmi ces protéines, les inventeurs ont choisi de s'intéresser plus particulièrement à l'annexine 2 au vue de l'intensité de la bande pour cette protéine. 30 d. Validation de la cible de l'aptamère ACE8 Afin de valider la cible de l'aptamère ACE8, des siRNA (SEQ ID NO : 9 et 10) ciblant l'annexine 2 ont été utilisés. Comme le montre la Figure 10, une diminution de 60% de l'expression de l'annexin 2 est observée 72 h après transfection de ces siRNA. De façon5 remarquable, lorsque l'aptamère ACE8 est incubé avec des cellules transfectées avec le siRNA ciblant l'annexine 2, la fixation de l'aptamère est réduite de 40% par rapport à des cellules MCF-7 transfectées par un siRNA contrôle (Figure 11). Ces résultats indiquent que la cible de l'aptamère ACE8 est bien l'annexine 2. Exemple 2 : utilisation de l'aptamère ACE8 en microscopie En utilisant différentes techniques de marquage de l'aptamère ACE8, directe ou non (phycoérythrine, alexafluor, quantum Dot) les inventeurs ont également montré que 10 l'aptamère ACE8 peut être utilisé de façon très simple en microscopie sur cellules vivantes (Figure 12). Exemple 3: utilisation de l'aptamère ACE8 comme molécule d'adressage de nanoparticules et internalisation de composés 15 L'aptamère ACE8 a conservé ses propriétés de ciblage une fois greffé à la surface d'un Quantum Dot, cela démontre qu'il pourrait être utilisé pour adresser de façon spécifique d'autres nanoparticules utiles pour l'imagerie ou la thérapie. L'aptamère ACE8 étant endocyté par les cellules au fil du temps, il est également capable de faire rentrer ces nanoparticules ou 20 d'autres composés, tels que des composés pharmacologiques ou des agents de contraste dans les cellules (Figure 13). Exemple 4 : utilisation de l'aptamère ACE8 en cytométrie en flux 25 L'aptamère ACE8 marqué de manière fluorescente a été utilisé en cytométrie en flux (CMF) après incubation sur les cellules MCF-7 et sur les cellules A-431 à une concentration de 5 nM (Figure 14). On peut voir une nette augmentation de l'intensité de fluorescence des cellules lorsqu'elles sont incubées avec l'aptamère ACE8 par rapport aux cellules incubées avec la séquence contrôle (SEQ ID NO : 11). De plus, cette augmentation d'intensité est plus 30 ou moins importante selon la quantité de cible à la surface des cellules. Ces résultats sont en accord avec les données de liaison : l'intensité de fluorescence des cellules MCF-7 est supérieure à celle des cellules A-431 après incubation avec l'aptamère ACE8, et les MCF-7 ont un nombre de cibles plus importantes que les cellules A-431.5 Exemple 5 : utilisation de Paptamère ACE8 en imagerie in vivo L'aptamère ACE8 a été utilisé pour l'imagerie in vivo de tumeur. L'aptamère ACE8 marqué de manière fluorescente a été injecté par voie intraveineuse dans des souris nudes développant des tumeurs issues de xénogreffes sous-cutanée de cellules MCF-7. La biodistribution de l'aptamère a été mesurée par imagerie fluorescente. Par imagerie semiquantitative in vivo (Figure 15), les inventeurs ont pu observer que l'aptamère diffuse très vite du compartiment sanguin et est très vite éliminé par voie urinaire et partiellement par voie hépatobiliaire. De manière intéressante, la comparaison du signal dans la tumeur par rapport à une zone de référence au niveau de la tête de l'animal (rapport tumeur/référence interne) augmente plus rapidement pour l'aptamère ACE8 que pour une séquence contrôle (SEQ ID NO : 11) et une différence significative est observée 15 minutes après l'injection (1,61 +/- 0,15 par rapport à 1,18 +/- 0,04, respectivement, voir le Tableau 3). Après 15 minutes, ce rapport augmente progressivement mais de manière similaire pour l'aptamère ACE8 et la séquence contrôle (Figure 15 et Tableau 1). Temps Ratio tumeur/reference interne Ratio tumeur/reference interne Test (min) Séquence contrôle ACE8 statistique de student (P Exemple 6 : utilisation de l'aptamère ACE8 comme inhibiteur de l'angiogénèse 5 L'utilisation de l'aptamère ACE8 comme inhibiteur de l'angiogénèse a été validée sur un modèle in vitro de formation de tubes endothéliaux. Des cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC) ont été cultivées, avec ou sans oligonucléotide (51.tM), sur du MatrigelTM (Becton-Dickinson) dans un milieu à faible teneur en hormone de croissance 10 comportant 2% (v/v) de sérum de veau foetal et du facteur de croissance basique de fibroblaste (bFGF à 3 ng/mL). Dans ces conditions, les HUVEC forment un réseau de tubes endothéliaux qui peut être observé par microscopie et représente un modèle in vitro éprouvé de l'angiogénèse. La formation de ce réseau n'est pas affectée par la présence de la séquence contrôle. Par contre l'aptamère ACE8 inhibe fortement la formation de ce réseau (Figure 18 15 et 19). Exemple 7: Utilisation de l'aptamère ACE8 pour cribler des molécules pouvant se lier à l'annexine 2. 20 Il a été montré qu'il est possible d'utiliser l'aptamère ACE8 pour cribler des molécules pouvant se lier à l'annexin 2 par des expériences de compétition. Pour ceci, les inventeurs ont étudié si une telle compétition avait lieu entre les aptamères entre eux. Ainsi, lorsque l'aptamère ER2 radiomarqué est incubé en présence des aptamères ACES et ER4, l'affinité est la même que l'aptamère seul, ce qui signifie que l'aptamère ER2 25 n'est pas en compétition avec les aptamères ACE8 et ER4. Par contre, lorsque l'aptamère ACE8 est incubé en présence des deux autres, une baisse d'affinité est observée. Il en est de même pour l'aptamère ER4 (Figure 20). Les résultats de ces expériences montrent une compétition entre les aptamères ACE8 et ER4, suggérant que l'aptamère ER4 aurait également pour cible l'annexine 2 30 L'aptamère ER4 et représenté dans la Figure 21 et est constitué de la séquence : 5' GGGAGAUGAUCCGUUGAUGCGAGAGCUAGGCCGCAAGGUGCCUCAACGCCA UCUGAGUGCCGACCCGAUCGCAAGUCGUCGUUCGUAGGCAGAAUC3' (SEQ ID NO : 4). REVENDICATIONS1. Aptamère comprenant un acide nucléique comprenant, ou constitué de : la séquence GGAACGCAAGAACUGAGGCCAUGAGGCGCCUUCCCUUGCUCA GGACGC (SEQ ID NO : 1), ou la séquence AGCUAGGCCGCAAGGUGCCUCAACGCCAUCUGAGUGCCGACC CGAUCGC (SEQ ID NO : 2), ou une séquence comprenant, ou constituée d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 60% d'identité avec SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, sous réserve qu'un acide nucléique constitué de cette séquence présente se lie à l'annexine 2. 2. Aptamère selon la revendication 1, comprenant un acide nucléique constitué de : la séquence GGGAGAUGAUCCGUUGAUGCGAGGGAACGCAAGAACUGAGG CCAUGAGGCGCCUUCCCUUGCUCAGGACGCAAGUCGUCGUUCGUAGGCA GAAUC (SEQ ID NO : 3), ou la séquence GGGAGAUGAUCCGUUGAUGCGAGAGCUAGGCCGCAAGGUGCC UCAACGCCAUCUGAGUGCCGACCCGAUCGCAAGUCGUCGUUCGUAGGCA GAAUC (SEQ ID NO : 4). 3. Aptamère selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'acide nucléique est lié à au moins un groupement additionnel. 4. Aptamère selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le groupement additionnel est sélectionné dans le groupe constitué d'un marqueur détectable et d'un composé pharmacologique. 5. Aptamère selon l'une des revendications 1 à 4, constitué de l'acide nucléique et d'au moins un groupement additionnel. 6. Aptamère selon l'une des revendications 1 à 5, pour son utilisation à titre de médicament.` 7. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de substance active, au moins un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 8. Utilisation in vitro d'un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5, pour détecter la présence d'annexine 2 ou déterminer la quantité d'annexine 2 dans un échantillon biologique. 9. Méthode in vitro de détection ou de quantification d'annexine 2 dans un échantillon biologique, comprenant : mettre en contact l'échantillon biologique avec un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 ; quantifier, ou détecter la présence ou l'absence d'aptamère fixé dans l'échantillon ; en déduire la quantité, ou la présence ou l'absence d'annexine 2 dans l'échantillon. 10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle la détection d'aptamère fixé dans l'échantillon est effectuée par mise en oeuvre d'une PCR destinée à amplifier l'aptamère. 11. Utilisation d'un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5, pour le criblage de ligands de l'annexine 2. 12. Méthode de criblage de ligands de l'annexine 2 comprenant : la mise en présence d'annexine 2 et, concomitamment ou successivement, d'un ligand à cribler et d'un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 ; déterminer la quantité d'aptamère fixé à l'annexine 2 ; en déduire si le ligand est un ligand de l'annexine 2. 13. Aptamère selon l'une des revendications 1 à 5, pour son utilisation à titre d'agent diagnostique. 14. Composition diagnostique comprenant, à titre de substance active, au moins un aptamère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5 en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.