Brevet FR2970003A1 — publié le 20120706

i DOMAINE DE L'INVENTION L'invention se rapporte au domaine de la purification de substances d'intérêt à l'aide de supports d'affinité utilisables à l'échelle industrielle, en particulier pour l'obtention de substances purifiées d'intérêt médical. ART ANTERIEUR Il existe un besoin récurrent pour la disponibilité de supports pour chromatographie d'affinité qui permettent l'enrichissement sélectif d'un produit de départ en une substance d'intérêt. Dans le domaine médical, des supports de io chromatographie d'affinité sont utilisés pour purifier des substances ultérieurement utilisées comme principes actifs de médicament. Principalement, sont utilisés des supports de chromatographie d'immuno-affinité sur lesquels sont immobilisés des anticorps. Les supports d'immuno-affinité sont adaptés à une purification de substances d'intérêt médical à l'échelle industrielle car ils possèdent une bonne 15 capacité de rétention de la substance cible, ainsi qu'une bonne sélectivité vis-à-vis de la substance cible. De tels supports d'immuno-affinité peuvent être régénérés sans altération substantielle de leur capacité de rétention ou de leur sélectivité, ce qui permet leur utilisation sur une longue période de temps. De plus, du fait de leur bonne capacité de rétention, les supports d'immuno-affinité permettent la 20 purification de grandes quantités de la substance cible, ce qui rend leur utilisation compatible avec les exigences techniques et économiques de la fabrication des médicaments. Les supports d'immuno-affinté présentent toutefois des inconvénients lorsqu'ils sont utilisés pour la purification de substances d'intérêt médical, en raison 25 notamment (i) du relarguage de fragments protéiques immunogènes dérivés des anticorps immobilisés durant la phase d'élution de la substance cible préalablement retenue et (ii) de la fragilité des anticorps vis-à-vis des conditions d'élution et des traitements périodiques de sanitisation anti-bactérienne et anti-virale. Diverses recherches ont été entreprises afin de trouver des alternatives aux 30 supports d'immuno-affinité connus. Certaines de ces recherches ont concerné la mise au point de supports d'affinité sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques, en tirant parti de travaux antérieurs décrivant des techniques d'immobilisation d'aptamères nucléiques, essentiellement dans un objectif de détection ou de diagnostic de substances cibles, y compris de protéines cibles. Pour la fabrication de supports d'affinité avec des aptamères nucléiques immobilisés, on a décrit principalement la fixation non covalente d'aptamères couplés à la biotine sur des supports solides activés par l'avidine, la streptavidine ou leurs dérivés. Cette technique tire parti de la sélectivité et de la forte affinité de la biotine pour son ligand avidine ou streptavidine ainsi que de la stabilité du complexe non-covalent résultant de leur association. Ce type de support d'affinité présente toutefois des limitations techniques, parmi lesquelles une sensibilité de la biotine, et de l'avidine ou streptavidine, aux traitements susceptibles d'induire une dénaturation protéique, comme pour les supports d'immuno-affinité décrits ci-dessus. De plus, la io dissociation du complexe biotine/streptavidine est observée à faible température, notamment dans des solutions aqueuses non ioniques ou à faible concentration saline. Pour ces différentes raisons, des supports d'affinité comprenant des aptamères nucléiques immobilisés par le complexe biotine/streptavidine ne sont pas adaptés à une utilisation dans des procédés de purification industriels. 15 On a aussi décrit plusieurs techniques de greffage chimique covalent d'acides nucléiques sur des supports solides, essentiellement dans l'objectif de disposer de nouveaux outils destinés à la mise en oeuvre de méthodes analytiques. On a ainsi décrit le greffage d'aptamères nucléiques possédant un groupe amine réactif sur un support de sépharose activé par le bromure de cyanogène (Madru et 20 al., 2009, Anal. Chem., Vol. 81 : 7081-7086). On a aussi décrit le greffage d'aptamères ARNs oxydés par du periodate sur un support d'agarose activé par des groupes dihydrazide d'acide adipique (Caputi et al., 1999, The EMBO Journal, Vol. 18(14) : 4060-4067). On connait également des techniques de greffage d'aptamères nucléiques par l'intermédiaire d'agents de couplage bi-fonctionnels comme le SIAB 25 ou le SMCC (Rehder et al., Electrophoresis, Vol. 22(17) : 3759 ; Peyrin et al., J Separation Science, Vol. 32(10) : 1531-1536). L'état de la technique divulgue également des techniques de couplage covalent d'acides nucléiques, entre autres d'aptamères, sur des supports solides de type silice ou agarose activés par le N-hydroxysuccinimide (NHS) (Goss et al., 30 1990, J Chromatogr, Vol. 508: 279-287 ; Larson et al.,1992, Nucleic Acids research, Vol. 20(13) : 3525, Allerson et al., 2003, RNA, Vol. 9 : 364-374). Les méthodes précitées de greffage d'aptamères ou d'acides nucléiques par couplage sur un support pré-activé par le N-hydroxysuccinimide (NHS) ont consisté en une application directe des techniques utilisées conventionnellement pour le 35 couplage de protéines sur des supports activés par le NHS. Les travaux de Goss et al. (1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287) ont ainsi décrit le couplage, pendant 30 minutes à un pH de 7,5, d'un oligonucléotide poly(dT)18 sur un support macroporeux de silice pré-activé par le NHS. Goss et al. (1990, Supra) étaient parvenus à capturer une faible quantité d'un mélange d'acides nucléiques modèles de oligo-(dA)12_18i puis à les éluer successivement dans un tampon d'élution à gradient de salinité. Allerson et al. (2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont décrit une tentative de couplage, à un pH de 8,3, d'aptamères nucléiques, comprenant un site de reconnaissance pour une protéine régulatrice IRP1 ou IRP2, sur un support de sépharose pré-activé par le NHS. Le couplage avait été réalisé « selon les io recommandations du fabricant ». On précise que le fabricant recommande, encore aujourd'hui, de réaliser le couplage d'un ligand sur un support pré-activé par le NHS à un pH compris entre 6 et 9 (voir par exemple le document d'instructions n ° 71-5000-14 AC de GE Healthcare). Selon ces auteurs, aucune des techniques d'immobilisation d'acides nucléiques connues antérieurement à leurs travaux, par 15 association non covalent ou par greffage covalent, n'avait permis de charger une quantité d'acide nucléique supérieure à quelques nanomoles/millilitre sur un support solide. Allerson et al. ont eux-mêmes constaté que la réaction de couplage d'aptamères d'ARN présentant une fonction amine primaire avec un support pré-activé par le NHS fournit un rendement de couplage très faible, de l'ordre de 2%, 20 quels que soient la durée de la réaction de couplage ou le type de solutions tampon utilisées, sans parvenir à surmonter cet inconvénient technique. Allerson et al. (2003, Supra) se sont finalement détournés de cette technique de greffage au profit d'une technique de greffage à l'aide d'un composé de greffage bi-fonctionnel comme le sulfo-(SIAB). De la même manière, Ruta et al. (2008, Anal. Bioanal. 25 Chem., Vol. 390: 1051-1057) ont montré que la phase stationnaire résultant du greffage d'aptamères d'ADN dirigés contre la D-adénosine sur un support de silice activé par le NHS présentait une capacité de liaison pour la D-adénosine très faible. Il existe donc un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux 30 procédés de préparation de supports d'affinité, notamment de supports d'affinité adaptés à la purification à l'échelle industrielle de substances d'intérêt médical. RESUME DE L'INVENTION La présente invention est relative à un procédé d'immobilisation d'acides 35 nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide présentant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé comprenant une étape de couplage desdits acides nucléiques sur ledit support solide activé à un pH inférieur à 4,5. Avantageusement, l'étape de couplage est réalisée à une température 5 inférieure à 10°C. Avantageusement, l'étape de couplage a une durée Dl supérieure à 12 heures. Dans certains modes de réalisation, l'étape de couplage comprend les deux étapes suivantes : io cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 4,5, pendant une durée D1, et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des 15 conditions de pH supérieur à 7,5, pendant une durée D2, Avantageusement, l'étape c2) a une durée D2 inférieure à 12 heures. Dans certains modes de réalisation, les groupes acides carboxyliques activés ont été obtenus par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de ses dérivés. 20 L'invention concerne aussi un support comprenant des acides nucléiques immobilisés par greffage chimique, susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus. La présente invention a également trait à un procédé de purification d'un ligand cible avec un support d'affinité, comprenant les étapes suivantes : 25 a) mettre en contact une composition à purifier comprenant un ligand cible d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et b) libérer ledit ligand cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer 30 ledit ligand cible purifié. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 100 pg de Facteur VII humain transgénique sur un support 35 solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain. Le pic n°1 correspond a une fraction de FVII humain non retenu sur le support d'affinité. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres. La Figure 2 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 pg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 io correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres. La Figure 3 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 1000 pg de Facteur VII humain transgénique sur un 15 support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres. 20 La Figure 4 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une composition comprenant 200 pg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain, ledit support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de sanitisation comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n°2 correspond au FVII humain 25 contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres. .La Figure 5 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une 30 composition comprenant 1000 pg de Facteur VII humain transgénique sur un support solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain, ledit support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de sanitisation comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n°2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n° 3 correspond au FVII humain 35 contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention fournit de nouveaux supports d'affinité comprenant des acides nucléiques immobilisés, ainsi que des procédés pour les préparer. De manière générale, un support d'affinité de ce type tire parti de l'aptitude connue de certains acides nucléiques à se lier sélectivement à un ligand cible, ledit ligand cible pouvant être de nature très variée, y compris des acides nucléiques, io des protéines et des substances organiques ou minérales. La demanderesse a montré qu'il était possible de préparer des supports d'affinité sur lesquels sont immobilisés des acides nucléiques, lesdits supports d'affinité étant utilisables dans des techniques préparatives de purification de substances d'intérêt thérapeutique, qui possèdent à la fois une bonne capacité de 15 rétention sélective des substances cibles, une excellente résistance vis-à-vis des traitements subis lors des étapes d'élution ou de régénération, et dont l'utilisation n'entraîne pas de risque d'introduction de substances potentiellement toxiques dans la préparation purifiée résultante. Plus précisément, il a été montré selon l'invention que des supports d'affinité 20 à base d'acides nucléiques peuvent être préparés par greffage chimique desdits acides nucléiques sur un support solide comprenant des fonctions acides carboxyliques activées, dans des conditions spécifiques de greffage permettant à la fois un haut rendement de greffage et le maintien de l'intégrité des acides nucléiques greffés. 25 L'invention a pour objet un procédé d'immobilisation d'acides nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide présentant des fonctions acides carboxyliques activées, comprenant une étape de couplage covalent desdits acides nucléiques sur ledit support solide à un pH inférieur à 4,5. 30 Par « fonction acide carboxylique activée» ou « groupe acide carboxylique activé », on entend une fonction chimique dérivée de la fonction « acide carboxylique » apte à réagir avec un nucléophile tel qu'une amine primaire. Les fonctions « acides carboxyliques activées » sont bien connues de l'homme du métier et englobent les fonctions chlorures d'acide, anhydrides mixtes et esters. Par « acide nucléique », on entend selon l'invention un composé comprenant un polymère de nucléotides, de ribonucléotides ou de désoxyribonucléotides éventuellement modifiés chimiquement, ayant avantageusement une longueur allant de 5 à 10 000 nucléotides de longueur, de préférence une longueur allant de 5 à 1000 nucléotides de longueur, et encore mieux de 5 à 120 nucléotides de longueur. Un acide nucléique englobe classiquement les poly-ribonucléotides et les polydésoxyribonucléotides, le cas échéant chimiquement modifiés. Dans certains modes de réalisation, un acide nucléotidique consiste en un polymère de nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonucléotides. Dans d'autres modes de réalisation, un io acide nucléique consiste essentiellement en un polymère de nucléotides et comprend une partie non-nucléotidique, ladite partie non-nucléotidique étant préférentiellement de longueur réduite, comparée à la longueur de la partie nucléotidique, par exemple une longueur linéaire inférieure à la longueur occupée par une chaîne de cinq nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonucléotides. 15 Selon l'invention, un acide nucléique comprend une fonction amine réactive lorsque ledit acide nucléique possède une fonction amine accessible au solvant et apte à réagir avec un groupe réactif approprié porté par une autre entité moléculaire. Les fonctions amines réactives englobent en particulier les amines primaires. 20 De tels acides nucléiques sont bien connus dans l'état de la technique et sont classiquement utilisés pour leur couplage chimique à des supports ou à des substances marqueurs. Classiquement, il s'agit d'acides nucléiques qui ont été modifiés par l'ajout d'une fonction amine à leur extrémité 3' ou à leur extrémité 5'. Le plus fréquemment, la fonction amine est ajoutée à l'extrémité 5' de l'acide nucléique 25 où son incorporation est plus aisée comme étape finale d'un procédé de synthèse d'un polynucléotide. Dans certains modes de réalisation, la fonction amine réactive et l'extrémité 5' ou 3' de l'acide nucléique sont séparées par une chaîne espaceur. Selon l'invention, un acide nucléique peut comprendre une fonction amine réactive à son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que la fonction amine réactive est 30 couplée sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique. Selon d'autres modes de réalisation, un acide nucléique peut comprendre une fonction amine réactive « du côté » de son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que ladite fonction amine n'est pas couplée directement sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique, mais est liée de manière covalente à une partie non-nucléotidique 35 dudit acide nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non-nucléotidique qui est interposée entre ladite fonction amine réactive et ladite extrémité de la partie nucléotidique dudit acide nucléique. Les supports solides présentant des fonctions « acides carboxyliques activées » sont bien connus dans l'état de la technique et nombre d'entre eux sont commercialisés. Ces supports solides peuvent être également préparés selon des méthodologies bien connues de l'homme du métier, par exemple en faisant réagir un support présentant des fonctions acides carboxyliques à sa surface avec un agent chimique adapté permettant l'activation des fonctions acides carboxyliques. Lesdits supports solides englobent les supports classiquement utilisés pour la io chromatographie, y compris les supports de silice, d'agarose ou de sépharose, et qui ont été traités afin de présenter à leur surface des groupes acides carboxyliques activés. Les supports solides pré-activés englobent des gels de dextrane, d'agarose, d'amidon, des dérivés cellulosiques, ou encore des polymères synthétiques tels que des polyamides et des polyacrylamides, ou encore des 15 supports minéraux tels que des supports de silice ou d'alumine, sur la surface desquels sont présents des groupes acides carboxyliques activés. De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les aptamères de l'invention englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, des membranes, etc. Les 20 supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, les billes paramagnétiques, les matériaux supports de membrane filtrante, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les 25 supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, des dérivés de polyacrilamide et des combinaisons de ceux-ci. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le support solide présente des fonctions acides carboxyliques activées par le N- 30 hydroxysuccinimide ou un de ses dérivés. En d'autres termes, le support solide présente à sa surface des groupes esters de type esters de succinimidyle. Les dérivés du N-hydroxysuccinimide englobent, entre autres, le N-hydroxysulfosuccinimide. Un tel support activé peut être obtenu à partir d'un support comprenant des 35 fonctions acides carboxyliques selon des méthodologies bien connues de l'homme du métier pour la préparation des esters de succinimidyle. A titre d'exemple, il est possible de préparer un support adapté au procédé selon l'invention en faisant réagir un gel de silice commercial présentant des fonctions acides carboxyliques libres avec le N-hydroxysuccinimide (NHS), éventuellement en présence d'un carbodiimide tel que l'EDC ou l'EDAC. On peut également utiliser un support solide commercial pré-activé par le NHS comme par exemple un gel « NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) » commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis) ou encore un gel «NHS-Activated Agarose » commercialisé par la société Thermo Scientific io Pierce. La demanderesse a montré dans les exemples que, contrairement à ce qu'indiquait l'article de Goss et al. (1990, Supra) la technique de couplage d'un ligand comprenant une fonction amine réactive sur un support pré-activé par NHS, qui est couramment utilisée pour le couplage de protéines sur un support, ne peut 15 pas être directement transposée pour le greffage d'acides nucléiques sur un support. Les résultats des exemples montrent notamment qu'en utilisant la méthode classique de couplage réalisée à un pH compris entre 6 et 9 avec une variété d'acides nucléiques distincts, on obtient un rendement de greffage variant de 0% à 20 10% au maximum. Les résultats des exemples confirment ceux déjà relevés par Allerson et al. (2003, Supra), qui avaient opté pour d'autres techniques de couplage. Dans l'objectif de rechercher des méthodes de couplage alternatives aux méthodes connues, la demanderesse a testé des conditions de couplage sur support activé par NHS dans lesquelles les charges anioniques portées par les 25 acides nucléiques sont bloquées par l'ajout d'une source d'ions monovalents ou divalents, en l'occurrence par addition d'ions Mg2+, Cal+ et/ou Na' Les résultats des exemples montrent que la neutralisation des charges anioniques portées par les acides nucléiques et/ou l'augmentation de la force ionique par ajout de cations divalents ou monovalents ne permet pas d'augmenter le rendement de greffage qui 30 reste compris dans une gamme allant de 0% à 10%. Egalement, la demanderesse a testé l'efficacité d'un couplage mettant en oeuvre des acides nucléiques dans lesquels la fonction amine réactive et l'extrémité 5' du polynucléotide sont séparées l'une de l'autre par une chaîne espaceur chargée positivement. La chaîne espaceur consistait en un polyamide comprenant 35 au moins une fonction amine tertiaire. Les résultats, non présentés dans les i0 exemples, ont montré l'obtention d'un excellent rendement de greffage, proche de 100%, sur le support pré-activé avec NHS. En revanche, la demanderesse a montré que la mise en contact du support ainsi greffé avec une solution à un pH alcalin d'environ 9-10 altérait la structure de la chaîne espaceur et entraînait le décrochement des acides nucléiques du support. Une telle technique de couplage, qui permet un excellent rendement de couplage, fournit donc un support d'affinité qui s'est révélé inadapté à une mise en oeuvre dans des procédés industriels de purification qui comprennent généralement des étapes drastiques de lavage et/ou d'inactivation microbienne. io La solution technique qui a été finalement mise au point selon l'invention a consisté à réaliser la réaction de couplage des acides nucléiques sur le support pré-activé par le N-hydroxysuccinimide, dans des conditions de pH inférieur à 4,5. La solution technique de l'invention est tout à fait surprenante car à un pH acide, l'homme du métier se serait normalement attendu à ce que la réaction de 15 couplage n'ait pas lieu du tout, ou à tout le moins ait lieu dans une si faible proportion qu'un très faible rendement de greffage soit obtenu. Or, on a montré dans les exemples que la réalisation de l'étape de couplage d'un acide nucléique sur un support pré-activé par le NHS, dans des conditions de pH inférieur à 4,5, permet l'obtention d'un support greffé avec un rendement de 20 greffage de 100%, ou très proche de 100%. C'est de manière tout aussi surprenante qu'il est montré que la réalisation de l'étape de couplage à un pH acide n'affecte pas l'intégrité fonctionnelle des acides nucléiques, alors que la grande sensibilité des acides nucléiques aux conditions de pH acide est bien connue par l'homme du métier. 25 On a aussi montré dans les exemples que les acides nucléiques greffés sur le support conservent leur intégrité chimique et physique, du fait que leur fonctionnalité est intacte. Cet aspect est illustré dans les exemples par un support greffé avec des aptamères nucléiques aptes à se lier au Facteur VII humain (FVIIh). On montre que l'aptitude desdits aptamères nucléiques anti-FVIIh est intacte après 30 leur greffage dans des conditions de pH acide sur le support pré-activé par le NHS. La demanderesse a aussi montré que lorsqu'on utilise pour le greffage un aptamère nucléique apte à se lier sélectivement à des formes de Facteur VII humain actif comprenant un domaine Gla correctement gamma-carboxylé, l'aptamère greffé conserve l'aptitude de l'aptamère non-greffé à discriminer (i) les formes actives du Facteur VII humain à domaine Gla correctement gamma-carboxylé des (ii) formes non actives du Facteur VII humain. De plus, les exemples montrent que le procédé de l'invention aboutit à l'obtention de supports d'affinité possédant une forte densité d'acides nucléiques greffés et permet en conséquence la disponibilité de supports d'affinité possédant une grande capacité de capture de ligands cibles, utilisables à l'échelle industrielle. Les caractéristiques combinées de haute sélectivité vis-à-vis d'un ligand cible et de grande capacité de capture dudit ligand cible illustrent la compatibilité d'un support d'affinité obtenu selon le procédé de l'invention avec une utilisation io dans une étape de purification de ligands cibles à l'échelle industrielle. Un support d'affinité obtenu selon le procédé ci-dessus est destiné à être utilisé principalement pour la purification d'une grande quantité de ligands-cibles, dans des conditions industrielles. Une illustration est l'utilisation d'un support d'affinité selon l'invention dans un procédé de purification de ligands cibles d'intérêt 15 médical, y compris de protéines cibles d'intérêt médical. Dans ces applications industrielles, un avantage supplémentaire d'un support d'affinité selon l'invention est sa capacité de résistance à des traitements comprenant d'exposer le support à un pH fortement alcalin et/ou à des composés fortement polaires. Ainsi, on a montré dans les exemples que les propriétés 20 chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées par un traitement par une solution ayant une concentration finale de NaOH de 0,5 M. On a également montré que les propriétés chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas altérées par un traitement par une solution ayant une concentration finale de propylène glycol de 50 % (vol/vol). 25 Ainsi, un support d'affinité selon l'invention n'est pas altéré par des traitements drastiques du type décrit ci-dessus, qui sont notamment destinés à éliminer les micro-organismes indésirables susceptibles de contaminer les préparations purifiées du ligand cible, en particulier les bactéries, les champignons et les virus. 30 C'est de manière tout à fait surprenante qu'il est montré selon l'invention que des acides nucléiques soumis, lors de la réaction chimique de greffage, à des conditions de pH acides ne sont pas altérés et conservent leur aptitude de liaison initiale à un ligand cible, par exemple à une protéine d'intérêt thérapeutique comme le Facteur VII humain. Selon une autre définition, le procédé d'obtention d'un support d'affinité selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine réactive, et c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 4,5, étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent. Dans certains modes de réalisation, les groupes acides carboxyliques du support ont été activés par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou un de ses dérivés tels que le N-hydroxysulfosuccinimide. Dans des modes de réalisation préférés, les groupes « acides carboxyliques activés » sont obtenus par réaction des fonctions acides carboxyliques initialement présentes sur le support non-activé avec le N-hydroxysuccinimide. Les groupes « acides carboxyliques activés » correspondent donc, dans ces modes particuliers de réalisation, à des groupes « esters de N-succinimidyle », ou encore appelés « esters de succinimidyle » ou « esters de N-hydroxysuccinimide », de formule suivante (I) où R représente la ramification du support solide à laquelle la fonction ester est fixée: Selon l'invention, les conditions de couplage à un pH inférieur à 4,5 englobent des conditions de couplage à un pH inférieur à 4,4, inférieur à 4,3, inférieur à 4,2, inférieur à 4,1 et inférieur à 4,0. Comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être réalisée à un pH d'environ 4,2. De préférence, le couplage est réalisé en présence d'un milieu tamponné présentant un pH inférieur à 4,4. Le milieu tamponné peut être préparé à partir de tout type d'acides et/ou de bases faibles, dans la mesure ou le ou les acides et bases faibles utilisées ne sont pas susceptibles de réagir au cours de la réaction de couplage. Comme cela est illustré dans les exemples, il peut s'agir d'une solution d'acétate de sodium. Avantageusement, l'étape de couplage est réalisée à une température basse afin de prévenir la réaction d'hydrolyse des acides nucléiques qui est susceptible d'avoir lieu en présence d'un pH acide. Par température basse pour la réaction de couplage, on entend une température inférieure à 15°C, y compris une température inférieure à 14°C, 13°C, 12°C, 11°C, 10°C, 9°C, 8°C, 7°C, 6°C ou 5°C. La température de couplage peut être d'environ 4°C, comme cela est illustré dans les exemples. Avantageusement la durée de l'étape de couplage est supérieure à 12 heures, afin d'obtenir un rendement de greffage compatible avec les utilisations de purification envisagées, ce qui englobe une durée de couplage d'au moins 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, et au moins 40 heures. La durée de l'étape de couplage peut être d'environ 48 heures, comme cela est illustré dans les exemples. Bien entendu, l'homme du métier peut, sur la base des conditions générales ci-dessus, adapter les conditions de la réaction de couplage afin de déterminer les conditions optimales adaptées dans chaque cas précis, sur la base de ses connaissances générales en chimie. A titre illustratif, l'homme du métier peut facilement prévoir que, pour l'obtention d'un rendement de couplage donné, l'abaissement de la température de réaction est susceptible de nécessiter une augmentation de la durée de l'étape de couplage. Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense qu'aux conditions de pH acide utilisées pour l'étape de couplage, les acides nucléiques à greffer ne sont pas chargés négativement ou peu chargés négativement, et même portent peu ou pas de charges positives, ce qui est de nature à minimiser ou annihiler les forces répulsives électrostatiques qui sont susceptibles d'être générées entre lesdits acides nucléiques et la surface du support, dans d'autres conditions de pH, et en particulier aux conditions de pH conventionnelles de pH neutre à alcalin utilisées pour le greffage de ligands sur un support pré-activé par le NHS. Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense qu'aux conditions de pH acide utilisées pour la réaction de couplage, les acides nucléiques à greffer sont sous forme linéaire, ce qui favorise l'accessibilité de leur groupe amine réactif au solvant, et en particulier favorise la réaction dudit groupe amine réactif avec un groupe acide carboxylique activé accessible à la surface du support solide. Dans certains modes de réalisation du procédé d'obtention d'un support d'affinité selon l'invention, la réaction de couplage peut être achevée en plaçant la combinaison support pré-activé/acides nucléiques dans des conditions de pH alcalin pendant une durée courte. Dans ces modes de réalisation, l'étape de couplage du procédé de l'invention comprend elle-même les deux étapes suivantes : cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH inférieur à 4,5, pendant une durée Dl, et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH supérieur à 7,5, pendant une durée D2, Avantageusement, la durée D2 est inférieure à la durée D1. Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense que, la mise en oeuvre de la sous étape c2) favorise l'achèvement de la réaction de couplage sans altérer significativement (i) la capacité des acides nucléiques à réagir avec le support pré-activé et (ii) sans altérer la structure ni l'aptitude des acides nucléiques à se lier sélectivement à leur ligand cible. Avantageusement, la phase finale de couplage à pH alcalin est réalisée à un pH d'au moins 7,5, ce qui englobe les pH d'au moins 8, et d'au moins 8,5. Les exemples illustrent la réalisation de l'étape c2) à un pH d'environ 9. Avantageusement, la phase finale de la réaction de couplage (c'est-à-dire l'étape c2)) est réalisée à une température basse. Par température basse pour la phase finale de la réaction de couplage, on entend une température inférieure à 15°C, y compris une température inférieure à 14°C, 13°C, 12°C, 11°C, 10°C, 9°C, 8°C, 7°C, 6°C ou 5°C. La température de couplage peut être d'environ 4°C, comme cela est illustré dans les exemples. Avantageusement la durée de la phase finale de l'étape de couplage est inférieure à 12 heures, ce qui englobe une durée inférieure à 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 et 1 heures. La durée de la phase finale de l'étape de couplage peut être d'environ 8 heures, comme cela est illustré dans les exemples. Pour ladite phase finale de l'étape de couplage, l'homme du métier peut aisément, sur la base des indications ci-dessus, déterminer les conditions optimales de combinaison de pH, température et durée, au cas-par-cas. Dans des modes de réalisation avantageux, la réaction de couplage est suivie par une étape de neutralisation d) ou de blocage des groupes acides carboxyliques activés n'ayant pas réagi au cours de l'étape de couplage proprement dit. A titre illustratif, le blocage des fonctions acides carboxyliques activées et n'ayant pas réagi peut être réalisé par incubation du support greffé avec une solution de blocage comprenant 0,5 M d'éthanolamine, 0,5M de NaCl à pH 8,3 ou bien avec une solution de blocage à 0,1 M Tris-HCI à pH 8,5, comme cela est recommandé notamment par le fabricant et décrit par ailleurs dans les exemples. La durée de l'étape de neutralisation ou de blocage est avantageusement d'au moins une heure à température basse. Elle peut être réalisée par exemple pendant une durée de 2h30 à la température de 4°C, comme décrit dans les exemples. En dernier lieu, le procédé selon l'invention comprend à l'issue de l'étape de couplage c) et/ou à l'issue de l'étape de blocage ou de neutralisation d) une ou plusieurs étapes de lavage e) dudit support dans des conditions classiques de manière à obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi. A titre illustratif, la ou les étapes de lavage peuvent être réalisées avec une solution tampon de 0,1M Tris-HCI à un pH allant de 8 à 9, ou bien avec une solution tampon de 0,1M acétate, 0,5M NaCl à un pH allant de 4 à 5, comme cela est illustré dans les exemples. Dans certains modes de réalisation, une étape de lavage comprend successivement (i) un lavage par une solution tampon de 0,1M Tris-HCI à un pH allant de 8 à 9, suivi de (ii) un lavage par une solution tampon de 0,1M acétate, 0,5M NaCl à un pH allant de 4 à 5. Classiquement, on réalise une pluralité d'étapes de lavage, par exemple 3 étapes de lavage, comme cela est illustré dans les exemples. Au vu de la description qui précède, le procédé d'obtention d'un support d'affinité selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine réactive, c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 4,5, et d) bloquer la réaction de couplage. Le procédé d'obtention d'un support d'affinité selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine réactive, c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 4,5, d) bloquer la réaction de couplage, et e) réaliser une ou plusieurs étapes de lavage du support. Comme cela déjà été précisé précédemment, dans certains modes de réalisation, l'étape c) comprend elle-même les deux étapes suivantes : cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 4,5, pendant une durée D1, et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH supérieur à 7,5, pendant une durée D2, Selon d'autres aspects avantageux, les résultats des exemples montrent qu'un support d'affinité selon l'invention permet la purification quantitative d'un ligand cible de manière extrêmement sélective. Egalement, les résultats des exemples montrent qu'un support d'affinité obtenu selon le procédé de l'invention peut être utilisé sur une très longue période de temps, notamment peut être utilisé selon un grand nombre de cycles de capture/lavage/élution/lavage sans perte significative de ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible. On montre aussi, comme cela a déjà été mentionné précédemment, qu'un support d'affinité selon l'invention conserve ses propriétés de rétention sélective et quantitative du ligand cible, même après avoir subi les étapes drastiques de régénération ou de sanitisation antibactérienne, antifrongique ou anti-virale. En d'autres termes, les résultats des exemples illustrent la capacité d'un support d'affinité selon l'invention a réaliser de manière parfaitement reproductible des étapes de purification quantitatives d'un ligand cible, et ceci dans des conditions d'utilisation industrielles classiques, qui sont en général délétères pour les supports d'affinité connus, y compris pour les supports d'immuno-affinité couramment utilisés dans les méthodes d'obtention de protéines thérapeutiques, qu'elles soient des protéines recombinantes ou des protéines non recombinantes. Les caractéristiques techniques de chacune des étapes du procédé de l'invention, selon les différentes définitions ci-dessus, ont déjà été précisées précédemment dans la présente description. Les exemples décrivent l'obtention d'un support d'affinité de l'invention par greffage d'aptamères nucléiques, et de manière illustrative par greffage d'aptamères d'ADN. Par « aptamère nucléique », on entend selon l'invention un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement à un ou plusieurs ligands cibles. Les aptamères englobent ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec un seul ligand io cible ou avec une variété de ligands cibles donnés, après une étape préalable de mise en contact des partenaires respectivement nucléique et ligand cible. Les aptamères englobent les aptamères d'ARN et les aptamères d'ADN. Le terme « aptamère » tel qu'utilisé ici désigne une molécule d'acide nucléique monobrin, ADN ou ARN, capable de se lier de manière spécifique à un ou 15 plusieurs ligands cibles, telle qu'une protéine. Les aptamères comprennent généralement entre 5 et 120 nucléotides et peuvent être sélectionnés in vitro selon un procédé connu sous le nom de SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Les aptamères présentent de nombreux avantages. De par leur nature oligonucléotidique, les aptamères possèdent une faible 20 immunogénicité et une résistance importante à des conditions physico-chimiques stringentes (présence d'urée, de DMSO, d'un pH très acide ou très basique, utilisation de solvants organiques ou de température élevée) permettant des stratégies de sanitisation variées dans le cadre d'un usage en tant que ligand d'affinité. De plus leur sélectivité est importante. Enfin la production d'aptamères 25 implique des coûts relativement limités. Le terme « ligand cible » (ou « substance cible ») tel qu'utilisé ici désigne un ligand capable de se lier de manière spécifique à l'aptamère. Il peut s'agir de d'acides nucléiques, de protéines ou de substances organiques ou minérales. Les protéines peuvent être tout type de protéines, et en particulier, les protéines 30 plasmatiques. Par « protéine plasmatique », on entend selon l'invention toute protéine, spécialement toute protéine d'intérêt industriel ou thérapeutique, contenue dans le plasma sanguin. Les protéines du plasma sanguin englobent les anticorps, l'albumine, alpha/macroglobuline, antichymotrypsine, antithrombine, antitrypsine, 35 Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta Xlla, C 1-inhibiteur, protéine C-réactive, C7, Cl r, Cl s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, C1 q, C8, C9, carboxypeptidase N, céruloplasmine, Facteur B, Facteur D, Facteur H, Facteur I, Facteur IX, Facteur V, Facteur VII, Facteur Vlla, Facteur VIII, Facteur X, Facteur XI, Facteur XII, Facteur XIII, Fibrinogène, Fibronectine, Haptoglobine, Hemopexine, Héparine cofacteur Il, Histidine rich GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, Kininase II, Kininogène HPM, Lysozyme, PAI 2, PAI I, PCI, Plasmine, Inhibiteur de la plasmine, Plasminogène, Préalbumine, Prokallicréine, Properdine, Protéase Nexine INH, Protéine C, Protéine S, Protéine Z, Prothrombine, TFPI, Thiol-protéinase, Thrombomoduline, Facteur tissulaire (TF), TPA, Transcolabamine II, Transcortine, io Transferrine, Vitronectine, et le Facteur de Willebrand. Notamment, les protéines plasmatiques englobent les protéines de la coagulation, c'est-à-dire les protéines plasmatiques impliquées dans la chaîne de réactions en cascade aboutissant à la formation d'un caillot sanguin. Les protéines de la coagulation englobent le Facteur I (fibrinogène), le Facteur Il (prothrombine), 15 le Facteur V (proaccélérine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur VIII (facteur anti-hémophilique A), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF), la PK (Prékalicrine) le KHPM (kininogène de haut poids moléculaire), la thromboplastine tissulaire, le 20 cofacteur Il de l'héparine (HCII), la protéine C (PC), la thrombomoduline (TM), la protéine S (PS), le facteur de Willebrand (Wf) et l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), ou encore les facteurs tissulaires. Dans certains modes de réalisation, la protéine plasmatique consiste en une protéine de la coagulation à activité enzymatique. 25 Les protéines de la coagulation à activité enzymatique englobent le Facteur Il (prothrombine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur IX (facteur antihémophilique B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF) et la PK (Prékalicrine). 30 Dans certains modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique consiste en une protéine plasmatique humaine, naturelle ou recombinante. Dans des modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique est le Facteur VII humain, naturel ou recombinant. Dans certains modes de réalisation, un « aptamère nucléique » utilisé pour 35 le greffage au support solide pré-activé, selon le procédé défini ci-dessus, peut comprendre une partie non nucléotidique ou nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non nucléotidique, qui relie l'une des extrémités 5' ou 3' de la partie nucléique dudit aptamère et la fonction amine réactive utilisée pour le greffage chimique dudit support pré-activé. Dans ces modes de réalisation, un aptamère nucléique peut être de formule (I) suivante : NH2-[SPAC]- [NUCL] (I), dans laquelle : - NH2 signifie la fonction amine réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à un ligand cible, ledit acide nucléique comprenant au moins 10 nucléotides de longueur.. La « chaîne espaceur » désignée [SPAC] dans le composé de formule (I) peut être de tout type connu. Il peut s'agir d'un composé non-nucléotidique, d'un oligonucléotide ou d'un composé comprenant une ou plusieurs parties non- nucléotidiques et une ou plusieurs parties nucléotidiques. La chaîne espaceur ne participe pas, en général, à la liaison du ligand cible sur le support. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé de formule (I) est greffé chimiquement ce qui permet une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCL], par rapport à la surface dudit support solide. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec la partie nucléique de l'aptamère, gênent les évènements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules du ligand cible susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci. Dans le composé de formule (I), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL]. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence la chaîne espaceur est un Polyéthylène Glycol (PEG) ou une chaine carbonée éventuellement dérivée par des fonctions Polyéthylène Glycol (PEG) ou un oligonucléotide non spécifique. Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur. Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (I) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur englobe notamment les polyéthylène glycols de type PEG (C10) à PEG(C18), notamment PEG (Cl 1) et PEG(C12). D'autres espaceurs hydrophiles peuvent être utilisés, tels que le 6-(Trifluoroacétylamino)hexyl-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)], le 11-(trifluoroacétamido)-3,6,9-trioxaundécan-1 -yl-[(2-cyanoéthyl)- (N,N-diisopropyl) qui est un espaceur hydrophile en C11 proposé par la société Link Technologies ou le 12-(4-Monométhoxytritylamino)dodécyl-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)] qui est un espaceur en C12, comme cela est illustré dans les exemples. Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur peut être composite et comprendre la succession d'un PEG(C12) et d'un oligonucléotide, par exemple io d'un oligo(dT). Les exemples illustrent l'obtention de supports d'affinité tels que définis ci-dessus par greffage du support pré-activé par le NHS avec deux aptamères nucléiques distincts, respectivement (i) un premier aptamère anti-FVII humain et (ii) un second aptamère anti-FVII humain. Ainsi, les résultats des exemples montrent 15 que le procédé d'obtention d'un support d'affinité qui est décrit dans la présente description peut être utilisé, quel que soit l'identité ou le type d'acide nucléique d'intérêt à greffer. La présente invention concerne aussi un support d'affinité obtenu conformément au procédé décrit dans la présente description. Ledit support 20 d'affinité est caractérisé notamment en ce qu'il comprend des acides nucléiques couplés au matériau support par une liaison amide. La présente invention est également relative à un procédé de purification d'un ligand cible avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : 25 a) mettre en contact une composition à purifier comprenant un ligand cible d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini dans la présente description, afin de former un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et b) libérer ledit ligand cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer 30 ledit ligand cible purifié. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage. On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un 35 tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une concentration élevée en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du ligand cible au support d'affinité. A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% en volume, par rapport au volume total de la solution tampon. Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, ou au moins 60%.en volume, par rapport au volume total de la solution tampon. De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol comprise entre 20% et 50%, de préférence entre 30% et 50%. Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à l'étape a') contient à la fois du NaCl et du propylène glycol comme décrit dans les exemples. De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l' E DTA. A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM. L'expression « au moins 1 mM » englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM. L'expression « au plus 30 mM » englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM. Avantageusement, on utilise, pour la régénération du support d'affinité, un tampon comprenant un mélange de NaCl et de propylène glycol, qui peut être du même type que celui décrit ci-dessus pour l'étape de lavage. La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.35 EXEMPLES Exemple 1 : Obtention d'un support d'affinité - Tampon de greffage : Acétate de sodium 100mM, pH = 4,2 - Préparation de 1595 µI d'aptamère à 2,5 g/I dans tampon de greffage soit : 4 mg d'aptamère. Pour le greffage, on a utilisé respectivement : a) pour la réalisation d'un premier support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide « Mapt 2 CS » de séquence SEQ ID N° 1 lié à son extrémité 5' à la chaîne espaceur 11-(trifluoroacetamido)-3,6,9-trioxaundecan-l-yl-[(2- io cyanoethyl)- (N,N-diisopropyl) (espaceur C11 hydrophile proposé par la société Link Technologies) b) pour la réalisation d'un second support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide « Mapt 1.2 » de séquence SEQ ID N°2 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur 12-(4-Monométhoxytritylamino)dodécyl-[(2- 15 cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)] (espaceur C12) et lié à son extrémité 3' à un oligo-dT c) pour la réalisation d'un troisième support d'affinité, un aptamère comprenant le polynucléotide « Mapt 2 CS » de séquence SEQ ID N° 1 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaceur 6-(Trifluoroacétylamino)héxyl-[(2- 20 cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)] (espaceur C6) Préparation d'1 ml de gel comprenant des groupes acides carboxyliques activés par le NHS à savoir le gel pré-activé « NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) » en réalisant un lavage avec HCI 1 mM, puis un lavage avec le tampon de greffage. 25 - On a vérifié que le pH dans la préparation d'aptamère dans la solution tampon était de 4,2 - On a mélangé la préparation d'aptamère avec 1 ml de gel pré-activé. Le gel pré-activé a été incubé en présence des aptamères sous agitation pendant 48h (+/- 2H) à 4°C 30 - On a ajouté un demi volume réactionnel (797111) de Tampon borate 200mM pH=9 en agitant, puis on a incubé pendant 8h sous agitation à 4°C - On a récupéré le surnageant et on a dosé la quantité d'aptamères non greffés - On a ajouté 2ml de Tris-HCL 0,1 M pH = 8.5 sous agitation pendant 2h30 à 4°C pour bloquer la réaction de couplage. - On a réalisé 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1) 1 ml de Tris-HCI 0,1M pH = 8.5 puis 2) 1 ml d'acétate de sodium à 0,1 M NaCl 0,5 M, pH = 4,0, afin d'obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi. Les résultats montrent que la solution résultante obtenue après la réalisation du greffage chimique ne comprend pas de quantité détectable d'aptamère nucléique, c'est-à-dire, dans les conditions d'analyse utilisées, comprend une quantité d'aptamère inférieure à 0,08mg/ml Il peut être déduit de ces résultats que le rendement de greffage est de 100%, ou très proche de 100%. Exemple 2 : Utilisation d'un support d'affinité pour la purification de Facteur VII humain recombinant produit dans le lait de lapines transgéniques. - Gel : l ml greffé avec Mapt 2CS- PEG(C11) préparé comme décrit à l'exemple 1, à 4mg/ml packé dans une colonne XK-16 (GE) - Injection d'une composition de facteur FVII humain recombinant purifié, produit dans le lait de lapines transgéniques (FVII-TG) : 100 ou 200 ou 1000µg de FVIITG La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par neutralisation du citrate contenu initialement dans la formulation par du CaCl2 et modification du tampon de formulation pour obtenir : entre 35 et 40 mM de NaCl et entre 3,2 et 4 mM de MgCl2 - Tampon utilisé pour la chromatographie :Tris 50mM / NaCl 50mM / CaCl2 10mM / MgCl2 4mM - Débit : 0,5m1/min - Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA 10mM, pH = 7.4 - Tampon de lavage ou régénération : NaCl 1 M/Propylène glycol 50% - Solution de sanitisation utilisée entre chaque essai : 0,1 ou 0,5 M NaOH (1m1) + NaCl 1 M/Propylène glycol 50% (2x 1 ml) Les résultats sont représentés sur les figures 1 à 5. Les figures 1 et 2 montrent que la presque totalité du facteur VII humain est retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à purifier, quelle que soit la quantité de Facteur VII contenue dans la composition de départ. On a estimé, pour les deux quantités de facteur VII à purifier (100µg et 200 µg) que moins de 10% du Facteur VII contenu dans la composition de départ n'est pas retenu sur le support d'affinité. Les figures 1 et 2 montrent aussi un pic d'élution étroit, ce qui illustre les excellentes propriétés chromatographiques du support d'affinité de l'invention. La Figure 3 illustre le profil chromatographique obtenu avec une composition de départ contenant 1 mg de Facteur VII humain. Le profil chromatographique de la Figure 3 est très similaire à ceux représentés sur les figures 1 et 2, ce qui illustre la très grande capacité de rétention d'un ligand cible du support d'affinité de l'invention. io Les figures 4 et 5 illustrent les profils chromatographiques obtenus par purification d'une quantité de Facteur VII humain de 200 pg (Figure 4) et 1000 pg (Figure 5) sur un support d'affinité préparé comme décrit à l'exemple 1 et ayant subi des étapes de traitement drastique de sanitisation avec une solution de sanitisation comprenant un mélange de 0,5 M NaOH et de 50 % de propylène glycol. Les profils 15 chromatographiques obtenus montrent la capacité de résistance d'un support d'affinité selon l'invention à des traitements délétères de sanitisation. On précise que le même profil chromatographique est obtenu lorsqu'on réalise une succession de purifications de Facteur VII humain transgénique et d'étapes de lavage et de sanitisation. Ceci démontre l'excellente stabilité du support 20 d'affinité, qui permet de réaliser la purification de ligands cibles d'intérêt de manière extrêmement reproductible. Exemple 3 : Essais comparatifs de greffage chimique d'acides nucléiques sur un support solide pré-activé par des groupes NHS 25 3.1. Essais comparatifs en utilisant différentes conditions de pH On a réalisé des essais comparatifs de greffage du support pré-activé de départ utilisé à l'exemple 1, dans des conditions de pH neutre ou légèrement alcalin, comme décrit dans le Tableau 1 présenté à la fin de la description. On a utilisé le protocole suivant : 30 - 1 ml de gel rincé avec 15m1 HCI 1 mM puis 7ml de tampon de greffage. Ajout des 6,5 ml (ou 3,5m1) de Mapt2CS à 1 g/1 et incubation du gel avec Mapt2CS pendant 4 heures à température ambiante - Neutralisation des sites activés par un tampon Tris 50mM pH = 7.4 On a mesuré la quantité d'aptamères non greffés en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage varie de 0% à 10% au maximum, quelles que soient les conditions de greffage décrites dans le Tableau 1 qui ont été utilisées. 3.2. Essais comparatifs en neutralisant les charges négatives des acides nucléiques à greffer par l'aiout de cations divalents ou par l'aiout de NaCl. On a utilisé le protocole suivant : - 1001.1I de gel rincé avec 15m1 HCI 1 mM puis 7001.1I de tampon de greffage / 10 Ajout des 650 pl de Mapt2CS (oligo 5) à 130mg/l et incubation du gel avec Mapt2CS pendant 4 heures à température ambiante - Conditions mises en oeuvre : ^ Condition 1 : Tampon MOPS 92mM pH = 7,0, CaCl2 200mM, MgCl2 200mM 15 ^ Condition 2 : Tampon MOPS 92mM pH = 7,0, CaCl2 200mM, MgCl2 200mM ^ Condition 3 : NaHCO3 0,2M, NaCl 0,5M, pH 8.3 ^ Condition 4 : NaHCO3 0,2M, NaCl 2 M, pH 8.3 20 On a mesuré la quantité d'aptamère non greffé en sortie de colonne après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage, quelles que soient les conditions de greffage décrites ci-dessus, varie de 0% à 10% au maximum. Il résulte de l'ensemble des expériences ci-dessus présentées que la mise 25 en oeuvre de l'étape de couplage en présence d'un pH basique ou neutre tel que recommandé dans l'état de la technique ou dans les notices d'utilisation des gels pré-activés fournit un rendement de couplage des aptamères sur le gel pré-activé très faible c'est-à-dire inférieur à 10% . L'augmentation de la force ionique par utilisation d'une solution de NaCl à 30 une concentration allant jusqu'à 2M ou l'utilisation de sels de cations divalents susceptibles de masquer les charges négatives des aptamères ne permettent pas d'augmenter le rendement de couplage. Contrairement à ce qu'aurait pu attendre l'homme du métier, la mise en oeuvre de l'étape de couplage en présence d'un pH acide permet d'augmenter de manière significative le couplage des aptamères sur le support pré-activé sans nuire à la capacité de liaison desdits aptamères à leur protéine cible. Tableau 1 Mapt2CS Modification (nature de Essai Quantité Conditions: l'espaceur) d'aptamère Tampon de greffage Oligo 1 5' amine espaceur C6 Essai 1 6,5mg MOPS 100mM, CaCl2 10mM, pH7,0 (Condition 1) MOPS 100mM, CaCl2 10mM NaCl 0,5M , pH7,0 (Condition 2) Oligo 1 Essai 2 6,5mg Oligo 1 Essai 3 6,5mg Oligo 4 5' amine espaceur C12 Essai 4 3,5mg NaHCO3 0,2M, NaCl 0,5M, pH 8.3 (Condition 3) 3'dT Essai 5 3,5mg NaHCO3 0,2M, NaCl 2 M, pH 8.3 (Condition 4) Oligo 5 5' amine espaceur C11 Essai 5 6,5mg MOPS 100mM, CaCl2 10mM, NaCl 0,5M pH7,0 hydrophile (Condition 2) REVENDICATIONS1. Procédé d'immobilisation d'acides nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé comprenant une étape de couplage desdits acides nucléiques sur ledit support solide activé à un pH inférieur à 4,5. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les groupes acides carboxyliques activés sont obtenus par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou un de ses dérivés. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine réactive, et c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 4,5, étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'étape de couplage c) est réalisée à une température inférieure à 10°C. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisée en ce que l'étape de couplage c) a une durée Dl supérieure à 12 heures. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'étape de couplage c) comprend les deux étapes suivantes : cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH inférieur à 4,5, pendant une durée Dl, et c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des conditions de pH supérieur à 7,5, pendant une durée D2, 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape c2) a une durée D2 inférieure à 12 heures.- 29 8. Procédé selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que l'étape de couplage est suivie d'une étape d) de blocage de la réaction de couplage. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'acide nucléique comprenant une fonction amine réactive consiste en un aptamère nucléique comprenant une fonction amine réactive. 10. Support comprenant des acides nucléiques immobilisés par greffage chimique, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Procédé de purification d'un ligand cible avec un support d'affinité tel que défini dans la revendication 10 comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact une composition à purifier comprenant un ligand cible d'intérêt avec un support d'affinité selon la revendication 10, afin de former un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand cible et b) libérer ledit ligand cible à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer ledit ligand cible purifié.