Brevet FR2966047A1 — publié le 20120420

PROCEDE DE PREPARATION DE COLLAGENE FIBRILLE La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice transparente de collagène fibrillé apte à être utilisée comme biomatériau, notamment comme substitut cornéen. Le collagène est la protéine la plus abondante chez les mammifères. C'est une protéine structurale majeure des tissus conjonctifs, dans lesquels il remplit le rôle d'armature. En effet, les types de collagène les plus abondants s'assemblent sous la forme de fibrilles dont la résistance, à poids égal, surpasse celle de l'acier. Ils sont associés au sein d'édifices supramoléculaires à de nombreux autres types de collagène ainsi qu'à d'autres macromolécules partenaires. La trame de fibrilles de collagène est non seulement responsable de la cohésion des tissus, mais aussi de leur architecture spécifique qui leur confère des propriétés mécaniques particulières. Ainsi, suivant les tissus considérés, le collagène sera organisé de façon spécifique, de manière à répondre de façon optimale à ses fonctions. Dans des conditions physiologiques, les fibrilles forment des édifices supramoléculaires organisés de façon très précise à partir des triples hélices de collagène au cours d'un processus nommé fibrillogenése. La plus remarquable caractéristique structurale des fibrilles de collagène est le décalage axial des molécules les composant par des valeurs multiples de D. La période D est classiquement donnée pour -67 nm et correspond à 234+1 acides aminés, déterminés par analyse de séquence. Les mécanismes de la fibrillogenése in vivo sont encore mal connus et plusieurs hypothèses ont été formulées. L'une de ces hypothèses décrit la fibrillogenése comme un processus extracellulaire d'auto-assemblage de triples hélices de collagène, principalement gouverné par des forces physico-chimiques classiques. La fibrillogenése in vitro est réalisée par plusieurs techniques qui sont rappelées par F. Gobeaux (Thèse de doctorat de l'Université Pierre et Marie Cuire httpJltel.archives- omy _frl . _/___/~_/7~/____?/__ _!T AL ) et qui sont les suivantes : La précipitation induite thermiquement (Heat precipitation) - Traditionnellement, les études sur la fibrillogenése ont été réalisées à partir de solutions salines neutres de collagène conservées à 4°C, qui ont comme propriété de précipiter sous forme de gel fibrillaire quand leur température est remontée à 37°C. Les fibrilles composant ces gels présentent la périodicité axiale caractéristique du collagène à l'état natif. Cependant on a montré que le produit de la précipitation pouvait être inhomogéne et qu'une partie des triples hélices pouvait déjà se dénaturer à ces températures. Concentration - La plupart des études de la fibrillogenése in vitro rapportées dans la littérature concernent des solutions diluées, dont les fibrilles sont éventuellement concentrées par centrifugation. Cependant, certains travaillent à partir d'échantillons lyophilisés, ou simplement desséchés et réhydratés après coup. Or, une fois déshydraté, le collagène se redisperse mal en solution. Ces techniques présentant de nombreux inconvénients, l'équipe des inventeurs a mis au point des techniques de fibrillogenése in vitro à partir de solutions denses de collagène (Gobeaux F. et al., Langmuir, 2007, 23, 6411-6417 ; J. Mol. Biol. (2008), 376, pp. 1509-1522). Le collagène joue aussi un rôle primordial dans l'oeil, puisqu'il contribue aux propriétés optiques de la scléra et de la cornée, respectivement l'opacité et la transparence. La cornée consiste en une organisation en forme de contre-plaqué comprenant des couches constituées de fibrilles de collagène I dense équidistantes. Le diamètre de ces fibrilles est très régulier (20 nm 5nm) pour assurer sa transparence. L'organisation en forme de contreplaqué tourne de façon hélicoïdale sur toute l'épaisseur du stroma. Des kératinocytes sont répartis entre les couches de collagène et assurent la réparation des tissus en cas de besoin. La cornée est le premier élément réfractif de l'oeil dont elle couvre environ un cinquième de la surface. Située à l'avant de l'oeil, devant l'iris et le cristallin, la cornée est une sorte de fenêtre par laquelle entre la lumière dans l'oeil. Elle participe aussi à l'ajustement de la vision. Sa parfaite transparence est une condition sine qua non d'une bonne vue. Les maladies qui opacifient la cornée sont une cause majeure de cécité. La greffe de cornée, à partir d'une cornée saine prélevée sur un donneur décédé, peut y remédier. La perte de la vue due à une maladie ou une blessure de la cornée affecte plus de dix millions de personnes dans le monde et c'est aussi la cause la plus fréquente de cécité. Aujourd'hui, le traitement de choix est l'implantation d'une cornée prélevée sur un cadavre mais le taux d'échec est assez élevé en raison du rejet des tissus étrangers par l'organisme receveur. Les substituts de cornée utilisés en chirurgie sont généralement à base de polymères synthétiques mais aucun d'entre eux ne présente l'élément biochimique majeur, sa densité, ou son organisation tri-dimensionnelle. Les transplantations de cornées artificielles, en polymères, sont encore peu répandues et en France la première a eu lieu en 2009. Un nombre restreint d'équipes chirurgicales réalisent ce type d'intervention et le manque de résultat est souvent lié à une opacité de la cornée biosynthétique liée en partie à la présence des sutures réalisées autour de l'implant. Des matrices transparentes, à base de collagène I issu soit de bovins (Liu et al., Biomacromolecules, (2006) 7,1819-1828) soit de concombre de mer (Cucumaria frondosa demande internationale WO 2007/106812) ont été synthétisés. Les matrices décrites par Liu et al. sont réticulées artificiellement et dans les fibrilles de concombre de mer, les protéoglycanes qui y sont présents joueraient, d'après les inventeurs, un rôle dans le renforcement de la matrice et permettraient d'obtenir l'architecture de la couche de contreplaqué de la cornée lors de la synthèse. La demande internationale WO 2009/126958 décrit un procédé de fabrication d'un collagène fibrillé qui utilise nécessairement une matrice de guidage interne pour orienter les fibrilles. Aussi existe-t-il un besoin de mettre au point un procédé simple et rapide qui permette de disposer d'un matériau, fabriqué à partir de la brique biochimique fondamentale du stroma (le collagène I) et présentant la structure la plus proche possible de la cornée, qui soit utilisable comme substitut cornéen, qui soit transparent sur une longue durée et qui ne nécessite pas de pontages. Au cours de leurs travaux sur les solutions denses de collagène, toujours maintenues hydratées, les inventeurs ont mis au point un procédé de fibrillogenèse de collagène pur permettant d'obtenir des matrices transparentes qui répondent aux exigences souhaitées. Aussi la présente invention a-t-elle pour objet un procédé de préparation d'une matrice de collagène pur fibrillé comprenant une étape de fibrillogenèse d'un collagène de type I, éventuellement associé au collagène de type V, en phase cristalline liquide ou non, ladite étape étant réalisée dans un milieu aqueux, à un pH compris entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5 en l'absence de tampon et d'agent réticulant, sans l'aide d'une matrice de guidage interne pour orienter les fibrilles lors de la fibrillogenèse et sans application d'une tension à l'extrémité des fibrilles. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la solution de collagène comprend soit une phase nématique/cholestérique, soit une phase smectique, soit toute autre type d'organisation cristal liquide. Au sens de la présente invention on entend par collagène fibrillé un collagène 30 présentant une agrégation non aléatoire des molécules de collagène et une période D d'environ 67 nm. Au sens de la présente invention, on entend par milieu aqueux de l'eau contenant éventuellement du NaCl à une concentration comprise entre 0,01 mM et 300 mM, avantageusement entre 0,01 mM et 0,05 mM. Au sens de la présente invention, on entend par collagène pur une solution de collagène purifiée suivant les méthodes classiques et notamment celle décrite par Gobeaux F. et al., (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417) ; il est notamment exempt d'agents réticulants comme les aldéhydes et de polymères de renforts synthétiques comme des polyesters ou naturels comme le chitosane. En revanche des additifs comme des molécules d'intérêt tels que des agents permettant de modifier sa porosité ou les charges de surfaces du collagène peuvent être ajoutés au matériau. Conformément à l'invention, le collagène peut être d'origine naturelle, recombinante ou synthétique. Il peut être disponible dans le commerce, ou peut provenir notamment de la peau ou des tendons d'où il est extrait par voie acide ou enzymatique selon des techniques connues de l'homme du métier. Les solutions initiales de collagène sont préparées selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment selon la technique décrite par Gobeaux F. et al. (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417). Dans ces solutions, le collagène est uniquement sous forme de monomères (triples hélices) et éventuellement sous forme d'agrégats. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la concentration de la solution initiale de collagène est comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml et à un pH compris entre 2,5 et 3. Le procédé selon l'invention est avantageusement mis en oeuvre à une température à laquelle le collagène n'est pas dénaturé, en particulier à une température comprise entre 15 et 30 °C, avantageusement entre 20 °C et 25 °C. Conformément à l'invention, la fibrillogenése peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par dialyse en présence d'un polymère osmotiquement actif dont le poids moléculaire est supérieur à la taille des pores de la membrane de dialyse. On peut citer à titre d'exemple le Dextran® et le polyéthylène glycol (PEG). Avantageusement le polymère est du polyéthyléneglycol dont le poids moléculaire est de 35000 Da. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé comprend les 30 étapes suivantes : a) préparation d'une solution acide de collagène pur dans un solvant aqueux à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml, b) concentration jusqu'à une concentration en collagène comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml, c) formation des fibrilles par dialyse contre du polyéthylèneglycol à 60 % à pH entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5. Le matériau fibrillé ainsi obtenu est organisé et la période D étant de 67+4 nm, correspond à la striation du collagène naturel. C'est un matériau dépourvu d'élément toxique, ce qui le rend parfaitement biocompatible. Enfin il est particulièrement résistant sur le plan mécanique. Conformément à l'invention, l'étape b) de concentration peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par centrifugation, par filtration, par dialyse ou par injection lente. Avantageusement le diamètre moyen des fibrilles est compris entre 10 et 25 nm, encore plus avantageusement entre 14 et 20 nm. Le diamètre des fibrilles varie en fonction de la force ionique du tampon utilisé pour la dialyse comme décrit dans Gobeaux F. et al. J. Mol. Biol. (2008), 376, pp. 1509-1522) et l'homme du métier est capable de modifier les conditions de dialyse pour obtenir des fibrilles de diamètres plus ou moins grands. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une matrice transparente comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'une solution acide de collagène pur dans un solvant aqueux à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml, b) concentration jusqu'à une concentration en collagène comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml, c) formation des fibrilles par dialyse contre du polyéthyléneglycol à 60 % à pH entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5. d) stockage pendant 3 semaines à 2 mois jusqu'à obtention d'une matrice transparente stable. Conformément à l'invention, l'étape b) de concentration peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par centrifugation, par filtration, par dialyse ou par injection lente. L'invention a également pour objet une matrice transparente susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, ladite matrice étant stable, le diamètre moyen des fibrilles étant avantageusement compris entre 10 et 25 nm, encore plus avantageusement entre 14 et 20 nm et la période D étant de 67+4 nm. Au sens de la présente invention, on entend par matrice transparente une matrice dont la densité d'absorption UV-Visible est équivalente à celle du collagène non fibrillé pur (sous forme monomérique à pH 2.5). Au sens de la présente invention, on entend par matrice stable, une matrice qui ne présente pas d'évolution de la taille des fibrilles dans des conditions physiologiques (37°C, haute force ionique...) et/ou en présence de cellules. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une matrice transparente ainsi obtenue pour la fabrication de tissus ou d'organes artificiels, notamment comme substitut de cornée, comme support pour la croissance de cellules et leur analyse comportementale ou comme support pour l'étude de procédés de bio-minéralisation. Cette matrice peut également être utilisée dans le cadre de reconstitution d'autres tissus car sa transparence permettra de suivre les processus d'intégration de l'implant au sein du patient. L'invention a également pour objet un substitut de cornée préparé à partir d'une matrice transparente telle que définie précédemment. L'invention sera mieux comprise à la lumière de l'exemple et des figures 1 à 5 qui suivent. La figure 1 montre une matrice transparente obtenue selon le procédé de l'invention : 1A) illustre la tenue mécanique de la matrice qui n'est pas liquide et sa transparence 1B) illustre la transparence de la matrice selon l'invention (on voit le point noir dessiné sur le support où est posée la matrice. La figure 2 montre une matrice transparente de collagène fibrillée obtenue selon le procédé de l'invention observée au microscope optique entre polariseurs croisés A) vue de face en présence d'une lame retardatrice d'onde. B) vue de profil en absence de lame retardatrice. La biréfringence montre l'organisation monolithique de la matrice caractérisée par l'orientation unidirectionnelle des fibrilles de la matrice. La figure 3 est l'observation par microscopie électronique à transmission d'une coupe ultra-fine d'une matrice obtenue selon le procédé de l'invention. L'échantillon a été préalablement fixé et enrobé dans de la résine afin d'en effectuer des coupes ultra fines par microtomie. A) Vue à faible grandissement montrant l'alternance de l'orientation des fibrilles de collagène. L'orientation des fibrilles ne varie pas de la même manière que dans la cornée en raison d'une concentration initiale en collagène supérieure à lmg/ml. B) vue à plus fort grandissement montrant la régulation fine du diamètre des fibrilles. La figure 4 est un cliché de diffraction X d'une matrice transparente de collagène fibrillée obtenue selon le procédé d'invention. Les pics de diffraction de Bragg correspondent aux harmoniques d'une fibrille de collagène possédant une organisation axiale de 67+4 nm. La figure 5 est une photo enregistrée sur un microscope photonique à transmission illustrant la bonne adaptation des fibroblastes humains sur une matrice transparente de collagène fibrillé obtenu selon le procédé de l'invention. La transparence de la matrice permet l'étude des fibroblastes sur un microscope photonique à transmission contrairement aux matrices de collagène synthétisées de manière classique. EXEMPLE 1 : PREPARATION D'UNE MATRICE FIBRILLÉE TRANSPARENTE DE COLLAGENE 1.1. Mode opératoire Un collagène de type I est préparé à partir de queues de jeunes rats Wistar, selon le mode opératoire décrit par Gobeaux F. et al. (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417). La solution initiale de collagène a une concentration de 4,3 mg/ml et le solvant est de l'acide acétique 5 mM. Le pH de la solution est de 3,5. 0,7 ml de cette solution est concentré par centrifugation à 3 000g pendant 8 h dans des tubes de filtration 3KD Nanosep® jusqu'à une concentration finale comprise entre 27 et 45 mg/ml en fonction de la durée de la centrifugation. Le tube de centrifugation est ensuite utilisé comme support de dialyse. Le tube rempli de la solution de collagène est dialysé contre du PEG 60 % à pH 5 jusqu'à formation de fibrilles présentant une striation périodique (Cross- striated fibrils). Les matrices sont stockées 1 à 2 mois à 20 °C. 1.2. Résultats Après 1 à 2 mois de stockage à 20 °C, on obtient une matrice transparente (voir figures lA et 1B), dans laquelle les fibrilles sont orientées de manière homogène (figure 2) et suivant deux orientations indiquant la nature rotationnelle de l'organisation à l'échelle macroscopique (figure 3). L'observation de coupes ultra-fines par microscopie électronique à transmission montre que les fibrilles de collagènes sont espacées régulièrement et que leur diamètre moyen est de l'ordre de 14,4 ± 2,3 nm. Elle montre l'organisation particulière des matrices dans laquelle des bandes de fibrilles de collagène coupées longitudinalement alternent avec des bandes de fibrilles de collagène coupées transversalement (figure 3). Les données de diffraction des rayons X montrent que les fibrilles présentent les 5 harmoniques caractéristiques du collagène naturel, à savoir, une D-période de 67 nm (figure 4) Des fibroblastes mis en culture sur ces matrices fibrillées transparentes adhérent et se développent bien (figure 5). La solubilisation dans l'acide acétique 500 mM (pH 2,5) de la matrice fibrillée 10 montre que cette dernière ne contient pas ou sinon qu'une très faible quantité de pontage intermoléculaire. 1. 2. 3. 4. 5.