Brevet FR2961526A1 — publié le 20111223

ULVANE LYASE, PROCEDE DE FABRICATION ET UTILISATIONS DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte notamment à des ulvanes lyases, à des séquences d'acides nucléiques codant pour ces ulvanes lyases, à des vecteurs comprenant ces séquences codantes, à un procédé de fabrication de ces ulvanes lyases, ainsi qu'à un procédé de dégradation d'ulvanes utilisant ces ulvanes lyases. La présente invention trouve notamment des applications dans la valorisation des bio-ressources naturelles constituées par les organismes et les microorganismes comprenant des ulvanes, notamment les algues vertes. En particulier, elle trouve des applications en laboratoire, pour l'analyse de ces ulvanes, ainsi que dans l'agro-alimentaire, dans le domaine de la cosmétique et dans le domaine des médicaments et formulations pharmaceutiques ou les produits de dégradation des ulvanes sont valorisables. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Les algues vertes appartenant au genre Ulvales (Ulva sp. et Enteromorpha sp.) sont présentes partout sur le globe terrestre et sont très communément rencontrées sur les côtes. Ces algues sont fréquemment impliquées dans la prolifération algale favorisée par l'eutrophisation des eaux côtières donnant lieu aux « marées vertes ». Jusqu'à présent cette biomasse indésirable avait une très faible valeur ajoutée et est utilisée essentiellement comme compost. Les polysaccharides anioniques complexes présents dans la paroi des ulves, appelée ulvanes, possèdent des structures originales et représentent une source de biopolymères dont les fonctionnalités sont encore peu explorées. Les ulvanes sont composés de différentes unités de répétition disaccharidiques construites avec des unités rhamnoses, acides glucuroniques, acides iduronique, xyloses et de sulfates. Les deux principaux motifs de répétition sont appelés acide aldobiuronique, ou acides ulvanobiuroniques, ou respectivement A (A3S) et B (B3s), dont les formules sont les suivantes : n -o H Le motif A (A3S) est l'acide béta-D-1,4-glucuronique (1--4) alpha-L-1,4-rhamnose 3-sulfate. Le motif B (B3s) est l'acide alpha-L-1,4-iduronique (1-4) alpha-L-1,4-rhamnose 3-sulfate. Les acides uroniques sont parfois remplacés par des résidus 15 xylose sulfatés en O-2. Les ulvanes possèdent des propriétés physicochimiques uniques qui en font des candidats attractifs pour de nouvelles applications agroalimentaires, pharmaceutiques, et cosmétiques. Les ulvanes possèdent des structures très originales composées de sucres ou 20 monosaccharides rares comme le rhamnose et l'acide iduronique. Le rhamnose est un composé important des antigènes de surface de nombreux microorganismes reconnus spécifiquement par les lectines de mammifères. Il est également utilisé pour la synthèse d'arômes. L'acide iduronique est utilisé pour la synthèse des glycosaminoglycans, par 25 exemple l'héparine. En plus des monomères, les ulvanes et oligo-ulvanes présentent des propriétés biologiques intéressantes. En effet, des travaux ont montré, par exemple, que les oligo-ulvanes ont des activités antitumorales, antivirales, notamment antigrippales, et anticoagulantes. Une liste non-exhaustive d'applications potentielles des ulvanes a été proposée par M. Lahaye et A. Robic dans le document Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromolecules 2007, 8, 1765-1774 [1]. Dans ce contexte, une meilleure compréhension de la structure des ulvanes et le développement de procédés permettant de fragmenter les ulvanes sous forme oligomérique ou monomérique revêt un très grand intérêt. Actuellement, faute de moyens permettant de les connaître mieux et de les dégrader efficacement, les algues, notamment les algues vertes, sont essentiellement compostées et aucune valorisation industrielle n'en est faite. Ceci est d'autant plus déplorable que la source est abondante et parfois gênante en termes de pollution de nos côtes maritimes. Leur élimination est actuellement réalisée par voie de compost. II existe donc un réel besoin de trouver de nouveaux moyens de dégradation des ulvanes afin de pouvoir valoriser cette bio-ressource, issue notamment des algues vertes, en produisant des fragments oligo- ulvanes à façon dans la perspective d'applications cosmétiques, agro-alimentaires et médicales. Exposé de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin en fournissant des ulvanes lyases qui dégradent très efficacement les ulvanes par dépolymérisation. L'étude des modalités de reconnaissance des enzymes de la présente invention réalisée par les inventeurs démontre leur activité glucuronique lyase. Les inventeurs fournissent en particulier des ulvanes lyase extraites du microorganisme déposé sous le numéro 1-4324 à la collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. Ce microorganisme est appelé également dans la présente et dans les documents de dépôt à la CNCM « 01-PN-2010 ». Ces ulvanes lyase, appelées aussi protéines ulvanolytiques, 5 peuvent être par exemple de 30 ou 46kD et comprendre dans leur séquence peptidique les quatre séquences suivantes : PNDPNLK (SEQ IDn°9), LLEVGNTGTFGSTGS (SEQ IDn°10), DLANPDNV (SEQ IDn° 11), et 10 WNLPE (SEQ IDn°12). Les inventeurs ont en effet isolé notamment des ulvanes lyases de 30 kD ou 46 kD présentant ces séquences en commun dans leur séquence respective. Bien que ces protéines possèdent des fragments peptidiques communs entre elles, leurs séquences n'ont jamais été 15 décrites dans l'art antérieur. Ces séquences de 30 ou 46 kD sont actives pour dégrader les ulvanes par dépolymérisation selon la présente invention. Elles ont été extraites comme indiqué dans les exemples ci-dessous. L'une de ces séquences est la séquence SEQ ID n°1 de 30 kD. 20 La présente invention se rapporte donc également à cette séquence. Cette séquence est la partie catalytique d'une ulvane lyase isolée par les inventeurs et de 46 kD (SEQ IDn°4). Cette ulvane lyase est représentée sur la figure 2 annexée. La séquence ID n°1 peut donc comprendre à son extrémité C- 25 terminale, la séquence SEQ IDn°2 du listage de séquences annexé. Selon l'invention, ces ulvanes lyases, quelle que soit leur séquence, peuvent comprendre en outre, à leur extrémité N-terminale, une séquence signal ou séquence d'adressage. Cette séquence signal peut être une des séquences signal connues de l'homme du métier pour que la 30 protéine, lorsqu'elle est synthétisée dans une cellule hôte, soit dirigée vers un organite ou une zone particulière de la cellule hôte. II peut s'agir par exemple d'une séquence signal trouvée dans les sites spécialises dans la prédiction de peptides signaux par exemple http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ [2] ou encore http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.htmL [3]. Il peut s'agir par exemple la séquence SEQ IDn°3 du listage de séquences annexé. Cette séquence signal peut être clivée après synthèse de la protéine ou non. Les procédés de clivage connus de l'homme du métier peuvent être utilisés, par exemple ceux impliquant des protéases spécifiques d'un site de clivage. On choisi alors une séquence signal présentant un tel site. La présente invention se rapporte également aux acides nucléiques codant pour les ulvanes lyases de la présente invention, notamment pour la protéine SEQ IDn°1. Il peut s'agir par exemple d'un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ IDn°5 du listage de séquences annexé. La présente invention se rapporte également à un acide nucléique codant pour la protéine de séquence SEQ IDn°2 du listage de séquences annexé. II peut s'agir par exemple de la séquence SEQ IDn°6 du listage de séquences annexé. La présente invention se rapporte également à un acide nucléique codant pour la protéine de séquence SEQ IDn°3 du listage de séquences annexé. II peut s'agir par exemple de la séquence SEQ IDn°7 du listage de séquences annexé. La présente invention se rapporte également à un acide nucléique codant pour la protéine de séquence SEQ IDn°4 du listage de séquences annexé. Il peut s'agir par exemple de la séquence SEQ IDn°8 du listage de séquences annexé. Ces séquences d'acides nucléiques ou gènes de la présente invention sont les premiers représentants d'une nouvelle famille de gènes codant pour des polysaccharides-lyases et représentent également les premiers gènes d'enzymes conformes à la présente invention de dégradation de l'ulvane. La présente invention se rapporte également à un vecteur comprenant un acide nucléique codant pour une des ulvanes lyases de la présente invention, par exemple un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ IDn°5 ou 8. Le vecteur peut être un des vecteurs connus de l'homme du métier pour fabriquer des protéines par recombinaison génétique. Il est choisi en général notamment en fonction de l'hôte cellulaire choisi. Le vecteur peut être par exemple choisi parmi les vecteurs listés dans le catalogue http:llwww.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm [4] ou http://www.giagen.com/overview/giagenes.aspx?gaw=PROTQIAgenes080 7&gkw=mammalian+expression [5], ou encore http://www.scbt.com/chap_exp_vectors. php?type=pCruzTM %20Expressio n%20Vectors [6]. II peut s'agir par exemple du vecteur d'expression décrit dans le document WO 83/004261 [7]. Les acides nucléiques de la présente invention ou les vecteurs de la présente invention sont utilisables notamment pour la fabrication par recombinaison génétique des ulvanes lyases de la présente invention. Aussi, la présente invention se rapporte également à une cellule hôte comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un 2 0 vecteur selon l'invention. La cellule hôte ou hôte cellulaire peut être tout hôte approprié pour la fabrication des ulvanes lyase de la présente invention à partir des acides nucléiques ou des vecteurs de l'invention. II peut s'agir par exemple d'E. coli, de Pischia pastoris, de Saccharomyces cerevisiae, de cellules 25 d'insectes, par exemple un système cellules d'insectes-baculovirus (par exemple cellules d'insecte SF9 utilisant un système d'expression de baculovirus), de mammifères. Aussi, la présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication d'une ulvane lyase selon l'invention par 30 recombinaison génétique utilisant un acide nucléique ou un vecteur selon l'invention. Les procédés de recombinaison génétique connus de l'homme du métier sont utilisables, L'origine marine ou terrestre n'influence pas la possibilité de recombinaison et d'expression hétérologue. Les inventeurs de la présente sont en outre les tout premiers à avoir isolé un microorganisme, nommé par eux 01-PN-2010, qui produit les ulvanes lyase de la présente invention. II s'agit d'une bactérie marine. Cette bactérie marine se trouve par exemple dans les fèces d'Aplysia punctata (Mullusca, Gastropoda). Ils ont déposé cette bactérie conformément au Traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt des micro-organismes aux fins de la procédure en matière de brevets à la collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. Le numéro de dépôt de cette souche à la CNCM est 1-4324. Les inventeurs ont purifié à partir de ce microorganisme les deux ulvanes lyases de 30 kD et 46 kD décrites dans la présente. Aussi, la présente invention se rapporte également au microorganisme déposé sous le numéro 1-4324 à la collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. Ce microorganisme peut donc être utilisé notamment pour la fabrication d'ulvanes lyase. La présente invention se rapporte donc également à un procédé de fabrication d'ulvanes lyase comprenant la mise en culture du microorganisme déposé sous le numéro 1-4324 à la CNCM en France. Cette mise en culture se fait de préférence dans un milieu de culture permettant la croissance de ce microorganisme marin. II peut s'agir par exemple milieu de culture liquide ZoBell, comme décrit dans le document ZoBell, CE 1941 Studies on marine bacteria. I. The cultural requirements of heterotrophic aerobes, J Mar Res 4, 41-75 [8]. Des conditions de culture utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention sont également décrites dans ce document. Le pH de culture est de préférence compris entre 7 et 9, de préférence pH 8. La température de culture est de préférence comprise entre 15 et 30°C, de préférence entre 15 et 30°C, de préférence 25°C. La culture est de préférence réalisée avec une concentration NaCI de 20 à 30g.l de préférence de 25 g.I"'. Ce procédé de fabrication des ulvanes lyase en utilisant le microorganisme de l'invention ou tout autre cellule hôte transformée pour une fabrication par recombinaison génétique conformément à la présente invention, peut comprendre en outre une étape de récupération des ulvanes Iyases. Cette étape de récupération ou d'isolement peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une technique choisie parmi une électrophorèse, un tamisage moléculaire, une ultracentrifugation, une précipitation différentielle, par exemple au sulfate d'ammonium, par ultrafiltration, une filtration sur membrane ou sur gel, un échange d'ions, une élution sur hydroxyapatite, une séparation par interactions hydrophobes, ou tout autre moyen connu. Un exemple de procédé d'isolement de ces ulvanes Iyases utilisable pour la mise en oeuvre de la présente invention est décrit ci-dessous. Le microorganisme précité ou tout autre cellule hôte transformée pour une fabrication par recombinaison génétique conformément à la présente invention peut également être utilisé directement pour dégrader des ulvanes, dans leur milieu naturel ou en culture. Lorsqu'il s'agit d'une culture, il peut s'agir d'un système discontinu ou continu. On peut utiliser par exemple un réacteur de culture contenant un milieu de culture approprié au développement du microorganisme. La présente invention se rapporte donc également à un procédé de dégradation d'ulvanes comprenant une étape de mise en contact des ulvanes avec une ulvane lyase selon l'invention ou avec une cellule hôte selon l'invention ou avec le microorganisme déposé sous le numéro 1-4324 à la CNCM en France, dans les conditions permettant la dégradation des ulvanes par digestion enzymatique par ladite ulvane lyase ou ladite cellule hôte transformée ou ledit microorganisme déposé sous le numéro 1-4324 à la CNCM en France. Les conditions permettant la dégradation des ulvanes, lorsqu'on utilise une cellule hôte ou microorganisme, sont celles exposées ci-dessus, respectivement pour la cellule hôte ou pour le microorganisme. Pour la digestion enzymatique, la détermination des constantes de Michaelis Menten (Km et Vmax) permet aisément à l'homme du métier de trouver les conditions optimales de concentration de l'ulvane lyase utilisée et de concentration des ulvanes pour la dégradation des ulvanes dans le milieu où elles se trouvent ou dans le milieu dans lequel elles ont été placées. Le pH est de préférence compris entre 7 et 8, de préférence entre 9 et 9,5. Il s'agit en effet de la gamme de pH optimale. La température (optimale) est de préférence comprise entre 30°C et 40°C. La force ionique supérieure à 300 mM NaCl pour la protéine de 46 kD et sans sel avec la protéine de 30 kD L'invention permet avantageusement de mobiliser la très grande ressource algues actuellement inexploitée, notamment d'algues vertes. L'invention permet en outre de favoriser la biodégradation des algues, notamment des algues vertes, de produire des molécules originales, qui sont des fragments d'ulvanes ou oligo-ulvanes, par exemple des oligosaccharides, par exemple aussi des hydrocolloïdes, et d'offrir une source nouvelle de monosaccharides rares pour des applications cosmétiques, agro-alimentaires et médicaments ou formulations pharmaceutiques et parapharmaceutiques. Les produits de dégradation des ulvanes donnent accès à de nouveaux produits qui peuvent être des actifs alimentaires, cosmétiques, pharmaceutique et parapharmaceutique utilisables dans les domaines agro-alimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques et parapharmaceutique. Ces nouveaux produits peuvent également être des produits non actifs mais présentant une neutralité et/ou une stabilité qui est très intéressante pour une utilisation dans chacun de ces domaines. L'utilisation des ulvanes lyases de la présente invention donne en outre accès à des monosaccharides rares utilisables comme synthons en glycochimie. La dégradation de l'ulvane avec les ulvanes lyase combinée à d'autre enzymes peut donner accès à l'acide iduronique (sucre rare) utilisé pour la synthèse des glycoaminoglycans de synthèse. La présente invention ouvre également de nouvelles perspectives d'utilisation de ces algues pour des applications en bioénergie et en chimie. La production de fragments oligosaccharides peuvent servir de molécules de base pour la fabrication d'autres molécules. La dépolymérisation de l'ulvane devrait faciliter la fermentation par des microorganismes conduisant à la production de méthane par exemple. D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées. Brève description des figures - La figure 1 est un gel d'électrophorèse des protéines ulvanolytiques de 30kD (Gel A) et de 46 kD (Gel B) de la présente invention. Les flèches indiquent les bandes qui ont été excisées puis utilisées pour le séquençage des peptides par spectrométrie de masse. - La figure 2 représente la séquence protéique d'ulvane lyase de 46Dka (SEQ IDn°4) de la présente invention avec en gras le peptide ou séquence signal (SEQ IDn°3). En texte normal, le module catalytique, déterminé par spectrométrie de masse, SEQ IDn°1. La partie de la séquence protéique non catalytique (SEQ IDn°2) de la protéine 46kD est soulignée. - La figure 3 représente la séquence du gène codant la protéine ulvane lyase de 46Dka. En gras le gène codant pour le peptide ou séquence signal (SEQ IDn°7). En texte normal, le gène SEQ IDn°5 codant pour le module catalytique de SEQ IDn°1, déterminé par spectrométrie de masse. En souligné, la séquence SEQ IDn°6 codant pour la partie non catalytique de la protéine de 46kD (SEQ IDn°2) présente dans le peptide 46kD. - La figure 4 représente les résultats obtenus d'expériences de chromatographie échangeuse d'ions conduite avant ou après incubation d'un disaccharide (graphique A) ou d'un tétrasaccharide (graphique B) avec l'ulvane lyase de la présente invention. La dégradation du tétrasaccharide démontre l'activité glucuronique lyase de l'enzyme. Sur ces graphiques, l'axe des abscisses représente le temps d'élution en minute (min). et l'axe des ordonnées représente la conductimétrie en nano- Coulomb (nC). EXEMPLES Exemple 1: identification du microorganisme de la présente invention Plusieurs individus d'Aplysia punctata (Mollusca, Gastropoda) ont été nourris avec des algues vertes appartenant au genre Ulva (Ulva sp.), en particulier Ulva armoricana. Les fèces des mollusques ont été collectés puis congelées pour stockage à -80°C. Une fraction des fèces a été récoltée et a servi d'inoculum dans un milieu de culture POPSO. En particulier, cette fraction de fèces a été incubée sous agitation, rotation à 200 rpm, dans un incubateur qui contrôle température et rotation à 20°C pendant 72 heures dans 5 mL de milieu de culture POPSO (acide piperazine-N, N'-bis[2-hydroxypropane-3- sulfonique]) dont la composition est la suivante : 25 mM du tampon POPSO pH 7,0, - 50 mM NaCl, - 0,4 g d'acide casamino, - 3 g d'ulvane 1 L d'Eau de mer. L'ulvane utilisée ici et dans les exemples ci-dessous a été préparée par le procédé décrit dans le document Lahaye M. et al., Procédé d'extraction des ulvanes, (1996) Hydrobiologia, 326/327, 473 [9]. Une autre fraction des fèces a été incubée sous agitation pendant 72h dans 5mL de milieu de culture ZoBell 2216E (ZoBell, 1941) (voir ZoBell et al [8]). Le milieu ZoBell utilisé comprend les éléments suivants (pour 1 L de milieu ZoBell) : 5g de bactotryptone, 1g d'extrait de levure, 200 mL d'eau distillée et 800 mL d'eau de mer. Chacune des cultures liquides ont ensuite été étalées sur des boîtes d'agar contenant du milieu de culture Zobell enrichi en ulvane ou « boites d'agar-Zobell-ulvane ». Ces milieux ZoBell solidifiés comprenaient outre la composition ci-dessus, 1,5% en poids d'agar (15g) et 0,4% en poids d'ulvane. Les boîtes ZoBell-agars ont été maintenues à 20°C pendant une semaine. Après une semaine de culture à 37°C, sont apparues des colonies possédant des caractéristiques phénotypiques très différentes (couleur, la taille, forme, etc.). Ces colonies ont été isolées et repiquées plusieurs fois sur boites d'agar-Zobell-ulvane, avec à chaque fois une culture pendant une durée permettant de voir les colonies à une température de 20°C. Une vingtaine de souches ont été isolées. Toutes les souches isolées ont été cultivées pendant 24 heures à 20°C en milieu de culture liquide Zobell enrichi avec 0,4% en poids d'ulvane. Après centrifugation à 1000 x g, les culots bactériens ont été lysés à l'aide d'une presse de French ou par un tampon de lyse chimique puis centrifugés à 1000 x g. Les surnageants de cultures bactériennes et les surnageants des lysats bactériens ont été examinés séparément après avoir été incubés en présence d'ulvane. Pour cela, 50 pL de surnageant de culture bactérienne ou 5 pL de lysat bactérien ont été ajoutés à chaque fois à 1 mL de milieu réactionnel comprenant en % en poids : 1% d'ulvane, 200 mM NaCl dans 20 mM Tris-HCI, pH 7,7. La formation de double-liaison produite par les activités des ulvanes lyases éventuellement présentes dans les extraits a été suivie par spectrophotométrie à 235 nm et la dépolymérisation du polysaccharide a été observée par électrophorèse (C-PAGE) et par chromatographie de filtration de gel Quatre des vingt souches isolées présentaient une très forte activité ulvanolytique dans les lysats bactériens et les surnageant de culture. La souche la plus active a été référencée sous le nom de 01- PN-2010 et a ensuite été utilisée pour la purification des ulvanes lyases (exemples 2 et 3). Cette souche a été déposée à la collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, sous le numéro 1-4324. Exemple 2 : Recherche des conditions optimales de culture de la souche 01-PN-2010 de la présente invention et caractérisation de la souche Différentes cultures de la souche 01-PN-2010 ont été réalisées dans un milieu ZoBell 2216E, comme dans l'exemple 1, à des températures de 4, 10, 20, 30, 37 et 42°C pendant 24 h. La croissance de 01-PN-2010 a été observée par mesure de la densité optique à 600nm, en utilisant un spectrophotomètre Shimadzu (marque de commerce). Une croissance est observée d'environ 4°C à 35°C, l'optimum de croissance est entre 20 et 30, et plutôt autour de 25°C. Le pH optimum de culture a été déterminé à 20°C sur milieu ZoBell en ajoutant différents tampons : 20 mM de tampon MES pour les pH 5,5 ; 6 et 6,5 ; 20 mM de tampon MOPS pour pH 7 ; 20 mM de tampon HEPES pour pH 7,5 20 mM de tampon TRIS-HCI pour pH 8 et 8,5 ; 20 mM tampon CHES pour pH 9 ; 9,5 et 10. Une croissance de 01-PN-2010 a été observée entre pH 6,5 et 9 après 3 jours d'incubation, avec un optimum de croissance à pH 7,5 à 8. L'effet de NaCI sur la croissance a également été testé sur milieu ZoBell, à 20°C et pH 8, avec différentes concentrations de NaCl : 0 ; 0,25 ; 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ; 6,0 ; 8,0 ; 10, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70 et 80 g.r'. Après 2 jours d'incubation, une croissance a été observée dans les milieux ZoBell comprenant de 2,0 à 65 g.r' de NaCl, avec un optimum se situant autour de 25 g.r' (2,5% poids/volume). Dans les conditions optimales identifiées suivantes : - température de culture de 15 à 30°C, de préférence 15 à 25°C, de préférence 25°C ; pH entre 7 et 9, de préférence pH 8 ; 20 à 30g.l 1 de NaCl, de préférence 25 g.r-' de NaCl, le le temps de doublement de la souche est de 3 heures. Les colonies sur un milieu ZoBell 2216E Agar en boîte de pétrie sont circulaires, luisantes, oranges, avec un diamètre de 2 à 3 mm après 5 jours d'incubation à 20°C. La culture de la souche sur milieu ZoBell-ulvane en boîte de pétrie pendant 24 heures à 20°C provoque la formation d'un trou qui résulte de l'hydrolyse de l'ulvane par la souche. Exemple 3 : purification d'une ulvane (vase selon l'invention de 30kD La purification a été réalisée à partir d'une culture de 1 L de milieu de Zobell (voir ci-dessus pour la composition) avec 0,4% en poids d'ulvane inoculé avec 50 mL d'une culture fraîche de 01-PN-2010 possédant une densité optique à 600 nm. La culture a été conduite en Erlenmeyer et maintenue à 20°C pendant 96 heures sous une agitation de 230 rpm (appareil, voir ci-dessus). Tout au long de la croissance bactérienne l'activité ulvanolytique a été suivie par spectrométrie à 235 nm. Les bactéries ont été éliminées du milieu de culture par centrifugation à 7500 x g, 30 min à 10°C. Le surnageant a été concentré jusqu'à 120 mL par ultrafiltration à flux tangentielle sur un filtre de 10 kD (Prep/Scale (marque de commerce)-TFF, Milipore). Une fraction des protéines a été précipitée par ajout de 1M (NH4)2SO4 par petite quantité sous agitation douce de la solution maintenue dans la glace. Le précipité a été éliminé après centrifugation à 20 000 x g à 10°C et le surnageant possédant l'activité ulvanolytique a été utilisé pour la suite de la purification. La totalité du surnageant a été injecté sur une colonne HiTrap phenyl-sepharose high sub (1 mL; GE Healthcare) équilibrée avec tampon A [20mM Tris-HCL pH 7,5, 1M (NH4)2SO4] à un débit de 1 mL / min à la température ambiante, ici 22°C. Le gel a été lavé avec 2 volumes de colonne de tampon A. L'élution des protéines a été réalisée en appliquant un gradient linéaire décroissant de 1 M à 0 M (NH4)2SO4 [tampon A sans (NH4)2SO4 respectivement] sur 20 volumes de colonne. Les fractions actives (15 mL) ont été réunies puis dessalées sur une colonne de dessalage HiPrep (2,6 x 30cm ; GE Healthcare) équilibré dans tampon B [20 mM Tris-HCL, pH 8,0]. Le débit de chargement et d'élution était de 3 mL / min. L'échantillon dessalé a été chargé sur une colonne HiTrap Q FF (1 mL ; GE Healthcare) équilibrée avec tampon B. Le gel a été lavé avec de 2 volumes de colonne de tampon B avant élution avec un gradient linéaire de NaCl dans tampon B de 0 M à 1 M sur 20 volumes de colonne. Les fractions actives ont été réunies et chargées sur une colonne HiTrap héparine HP (1 mL ; GE Healthcare) équilibré avec tampon C [tampon de phosphate de 10 mM, pH 7.0] à un débit de 1 mL min-1. Le gel a été lavé avec 2 volumes de colonne de tampon C avant élution avec un gradient linéaire de NaCl dans tampon C de O M à 1 M sur 20 volumes de colonne. Les fractions actives (5 mL) ont été rassemblées et chargées sur une colonne du Superdex 75 HiPrep (1,6 x 60 cm ; GE Healthcare) équilibrée avec le tampon B avec 100 mM NaCl. Les protéines ont été éluées par un gradient isocratique avec le même tampon à 1 mL / min. Les inventeurs ont ainsi isolé une protéine de 30 kD. Cette protéine est une ulvane lyase active. Ils ont observé une petite contamination par deux autres protéines moins abondantes et de poids moléculaires très proches. La protéine majoritaire de 30kD a été digérée par la trypsine, puis les peptides obtenus ont été analysés par spectrométrie de masse sur la plate-forme RIO "Biopolymères" localisée à l'INRA de Nantes. Les résultats d'analyse et de séquençage sont présentés dans le tableau 1 de l'exemple 5 ci-dessous. Exemple 4 : purification d'une autre ulvane (vase selon l'invention La purification de cette autre ulvane a été réalisée à partir d'une culture de 01-PN-2010 en fermenteur de 5 L dans le milieu de ZoBell décrit ci-dessus avec 0.4% en poids d'ulvane, à 25°C et avec un pH maintenu à pH 7,8 pendant 48 heures. Les bactéries ont été éliminées par centrifugation à 8000 x g, l h à 10°C. Le surnageant a été concentré jusqu'à 220 mL par ultrafiltration tangentielle sur le système milipore (Prep/Scale (marque de commerce)-TFF) avec un filtre de 10 kD. Comme précédemment, les protéines ont précipitées par ajout de 1 M (NH4)2SO4. Le culot a été éliminé après centrifugation à 20 000 x g, 30 min 3 0 à 10°C. 30 mL résine phénylsepharose 6 high sub équilibrée avec tampon B avec 1M (NH4)2SO4 ont été ajoutés au surnageant et maintenue pendant 30 min sous agitation douce. La résine a été séparée du milieu par filtration sur verre fritté. La résine a ensuite été lavée avec deux volumes de 75 mL de tampon B avec 1 M (NH4)2SO4 et l'élution a été effectuée avec tampon B dans des aliquotes de 25 mL sur le verre fritté. La suite de la purification a été conduite d'une manière similaire que pour la protéine de 30 kD dans l'exemple précédent. Les fractions actives (100 mL) ont été chargées sur une colonne HiTrap phényl- sepharose high sub (1 mL ; GE Healthcare) équilibré dans tampon B avec 1 M (NH4)2SO4 à un débit de 1 mL / min à température ambiante, ici 22°C. Les fractions actives (30 mL) ont été mélangées et dessalées sur une colonne de dessalage HiPrep (2,6x30cm ; GE Healthcare) équilibrés dans tampon D [20mM Bis-Tris pH 6.0]. L'échantillon dessalé a été chargé sur une colonne HiTrap DEAE (1 mL ; GE Healthcare) équilibré avec tampon D à 1 mL / min. Le gel a été lavé avec 5 volumes de colonne de tampon D avant l'élution avec un gradient linéaire de NaCI de jusqu'à 1 M dans du tampon D. Les fractions actives ont été mélangées (7 mL) et diluées à 50 mL dans tampon B avant chargement sur une colonne HiTrap Q FF (1 mL ; GE Healthcare) équilibré avec tampon B. Le gel a été lavé avec 5 volumes de colonne de tampon B avant l'élution avec un gradient linéaire de NaCl de jusqu'à 1 M dans tampon B. Les fractions actives (5 mL) ont été mises et injectées en 25 commun sur une colonne Superdex 75 HiPrep (1,6 x 60 cm ; GE Healthcare) équilibré avec tampon B avec 100mM NaCl. Les protéines ont été éluées par un gradient isocratique avec le même tampon à 1 mL / min. Les fractions actives (15 mL) ont été mélangées et dialysées sur 30 la nuit contre tampon C. L'échantillon dessalé a été chargé sur colonne HiTrap héparine HP préemballé (1 mL ; GE Healthcare) équilibré avec Tampon C [10mM tampon de phosphate pH 7,01 à un débit de 0,5 mL ! min. Le gel a été lavé avec 2 volumes de colonne de Tampon C avant l'élution avec un gradient linéaire de NaCl dans tampon C de 0 M à 1 M sur 20 volumes de colonne. A chaque étape de la purification, les fractions actives ont été analysées par SDS-PAGE suivant la technique décrite dans le document LaemmLi UK and Favre M 1973 Links maturation of the head of bacteriophage T4.1. DNA packaging events. J Mol Biol 80:575-599 [10]. La quantification de protéines a été exécutée selon la technique décrite dans le document Bradford MM 1976 ; A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254 [11] utilisant le réactif Biorad [Biorad protein assay (marque de commerce)] avec de l'albumine de sérum de boeuf en tant que standard. L'activité de ulvane lyase extraite a été analysée par une méthode spectrophotométrique : 25-50 pL d'extrait est ajouté à 1 mL milieu réactionel [20 mM Tris-HCL pH 7,7, 200 mM NaCl et 1% en poids d'ulvane]. L'augmentation de l'absorbance à 235 nanomètre a été suivie pendant 5 mn. Pour l'identification des fractions actives, les inventeurs ont utilisé une méthode de détection sur boîte de pétrie suivant la méthode décrite dans le document Gacesa P and Wusteman FS 1990 Plate assay for simultaneous detection of alginate lyases and determination of substrate specificity. Appl and Environ Microbiol 56: 2265-2267 [12]. Des aliquotes de 2 microlitres des fractions de protéine sont déposées sur des gels d'agarose (1% en poids d'agarose, 0,1% en poids d'ulvanes, 20mM Tris-pH 7,7, 200mM NaCI). La boîte de pétrie a été maintenue durant la nuit à la température ambiante, ici 22°C, et la présence d'activité enzymatique est révélée par l'ajout d'une solution de rouge de ruthénium (0,5% en poids dans de l'eau) pendant 10 minutes. Les fractions actives sont identifiées par des tâches claires (non colorées) sur fond rose. Les protéines purifiées ont migrées sur gel d'électrophorèse puis ont été colorés par du bleu colloidal. Les bandes de protéine ont été excisées des gels de SDS-PAGE et ont été analysées par spectrométrie de masse sur la plateforme RIO « Bioploymères » INRA, à Nantes. Les inventeurs ont ainsi isolé une protéine de 46 kD de séquence SEQ IDn°4. Les séquences des peptides obtenus après incubation à la trypsine n'avaient aucune homologie significative avec des séquences de l'art antérieur dans la banque TrEMBL malgré la taille importante des fragments peptidiques séquencés. Les protéines, dites protéines ulvanolytiques, de 30kD isolée dans l'exemple 3 et de 46 kD isolée dans le présent exemple ont été purifiées sur gel d'électrophorèse commet représenté sur la figure 1 annexée : gel d'électrophorèse de la protéine de 30kD (Gel A) et de la protéine 46 kD (Gel B). Les flèches indiquent les bandes qui ont été excisées puis utilisées pour le séquençage des peptides par spectrométrie de masse. Tableau 1 : Séquences peptidiques obtenues à partir des protéines ulvanolytiques de 30 kD et 46 kD par séquençage de novo Masse moléculaire 30kD 46kD Séquences SEQ Séquences SEQ ID ID NO. NO. PNDPNLK 9 PNDPNLK 9 BLLEVGNTGTFGSTGSA 13 LLEVGNTGTFGSTGSYLMQAK 30 DLANPDNV 11 DLANPDNVGTVDDR 31 ALLGGQVFNWNLPES 14 QEMALLMQEVDWNLPE 32 BEQLNFR 15 ADLYR 33 LELLDLELE 16 WDNSTLPAADLYR 34 TGVGSYAR 17 ADLYR 35 BPVYG-NQVQVSFDLWR 18 YHDTNNMLTHSANLDDR 36 GGGGSNDPALCLYLAR 19 LYENGELVDEFL 37 ACPSSGVFQ 20 LLSGWG 21 BVYDNTLV 22 FGVTGPPT 23 DLLGNTLD 24 BDTDLPNPR 25 ATGAG 26 BSCYANYSESSLLGK 27 BDDPNNPGQTLHYAWK 28 BFWGLYNLTD 29 Les séquences en gras correspondent aux séquences communes aux ulvanes lyases de 30 et 46 kD de la présente invention. Les quatre premiers peptides sont communs pour les deux protéines. Ces données confrontées à la banque TrEMBL n'ont pas permise d'identifier de séquence homologue comprenant ces quatre séquences dans une seule protéine. Les séquences soulignées ont été employés pour la construction des amorces dégénérées utilisées dans l'exemple suivant. 10 Exemple 5 : identification d'un gène codant 4.1) Amorces dégénérées Six amorces dégénérées ont été synthétisées sur la base des 15 séquences peptidiques communes aux protéines de 30 et 46kD obtenues à partir de la spectrométrie de masse dans les deux directions (Forward : F et Reverse : R; tableau 2). Une amplification par PCR a été réalisée avec toutes les combinaisons possibles des amorces sur 75 ng d'ADN génomique de 01- 2 0 PN-2010 dans des milieux réactionnels de 25 pL contenant tampon GoTaq PCR lx, 1 mM MgCl2, 0.2 mM de chaque dNTP, 2 pM des amorces Forward et Reverse, et 1.25 U GoTaq (Promega). Le programme d'amplification était de 94°C pendant 2 minutes, trente-cinq cycles de : 94°C pendant 30 sec, 50°C pendant 30 sec et 72°C pendant 1 min 30 sec suivi par une étape finale à 72°C pendant 7 minutes. Ensuite les échantillons ont été maintenus à 4°C avant séquençage. De cette façon, les inventeurs ont obtenu un fragment de 700 pb du gène d'ulvane lyase 4.2) « Tait PCR » La méthode de TAIL-PCR décrite dans le document Liu YG and Whittier RF 1995 Thermal Asymmetric Interlaced PCR: Automatable Amplification and Sequencing of Insert End Fragments from P1 and YAC Clones for Chromosome walking. Genomics 25: 674-681 [13] a été utilisée pour obtenir la séquence des extrémités du gène d'ulvane lyase. Les amorces « spécifiques » sont des amorces dégénérées conçues en se basant sur les fragments de séquence du gène connue (Tableau 2). Cinq amorces dégénérées « arbitraires » différentes ont été choisies parmi celles déterminées dans la littérature (tableau 2 dans le document Liu et Whittier et al [6], et dans le document Liu YG, Mitsukawa N, Oosumi T and Whittier RF 1995 Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR. Plant J. 8: 457-463 [14]). Les programmes d'amplification étaient différents pour les différentes réactions de TAIL PCR (Tableau 3) et sont basés sur les programmes de Liu et al 1995 [14] mais adaptés aux machines de PCR disponibles au laboratoire. 22 Tableau 2 : Amorces utilisées pour identifier le gène de I'ulvane lyase (F : forward, R : reverse) Amorce SEQ ID NO. I Séquence (5' à 3') SEQ ID NO. Tm Amorces dégénérées de l'ulvane lyase VGNTGTFG-F 64 GTN GGN AAY ACN GGN ACN TTY GG 38 52-64 PNDPNLK-F 9 CCN AAY GAY CCN AAY YTN AA 39 42-56 ANPDNVG-F 65 GCN AAY CCN GAY AAY GTN GG 40 48-60 TLPAADLY-F 66 ACN YTN CCN GCN GCN GAY YTN TA 41 50-66 GGQVFNW-F 67 GGN GGN CAR GTN TTY AAY TGG 42 49-60 GQTLHYAW-F 68 GGN CAR ACN YTN CAY TAY GCN TGG 43 52-66 VGNTGTFG-R 64 CCR MN GTN CCN GTR TTN CCN AC 44 52-64 PNDPNLK-R 9 TTN ARR TTN GGR TCR TTN GG 45 42-56 ANPDNVG-R 65 CCN ACR TTR TCN GGR TTN GC 46 48-60 TLPAADLY-R 66 TAN ARR TCN GCN GCN GGN ARN GT 47 50-66 GGQVFNW-R 67 CCA RTT RAA NAC YTG NCC NCC 48 49-60 GQTLHYAW-R 68 CCA NGC RTA RTG NAR NGT YTG NCC 49 52-66 Amorces spécifiques pour TAIL PCR UL_133R - CTAG GTT GTA ATG TGT TAG GTG CAT CCC 50 60 UL_194R - GTG AAT CGC GCA TAA CTT CCC ACA CC 51 61 UL_285R - CC CGT GTG CTT ACC TTT GGC CTG C 52 63 UL_426F - GC AGC TGG AAG AAC CGA GGT CTT TC 53 61 UL_582F - CCG GAA CCA GAA CGA GGA AGA GAA TC 54 61 UL_643F - GGA GGA AGA GCA CAA ATG AGA TGG GC 55 61 AfterUL 1 F _ CAC GTA ATC TGG GTA GGT TTT TAT ATC ATG 56 61 ATA CC AfterUL 2F - GCT TCT GTA GGT GTG TAT CCT AAC CC 57 60 AfterUL 3F - GCT GGA CGT GTG TCT TCT TTG TAT TAC GC 58 62 23 Amorces arbitraires dégénérées pour TAIL PCR AD1 - TGW GNA GWA NCA SAG A 59 38-43 AD2 AGW GNA GWA NCA WAG G 60 38-43 AD3 - WGT GNA GWA NCA NAG A 61 38-43 AD4 - NTC GAS TWT SGW GTT 62 36-39 AD5 - NGT CGA SWG ANA WGA A 63 38-43 Tableau 3 : Conditions d'amplification utilisées pour le Tail-PCR Réaction Nombre Températures et durées de cycles Primaire 1 93°C, 2 min 94°C, 1 min; 62°C, 1 min; 72°C, 2 min 2 94°C 1 min; ramping to 25°C over 3 min; 25°C, 3 min; ramping to 72°C over 3 min; 72°C, 2 min 15 94°C, 30 sec; 65°C, 1 min; 72°C, 2 min; 94°C, 30 sec; 65°C, 1 min; 72°C, 2 min; 94°C, 30 sec; 45°C, 1 min; 72°C, 2 min 1 72°C, 7 min; 4°C, co Secondaire 1 93°C, 1 min 13 94°C, 30 sec; 62°C, 1 min; 72°C, 2 min; 94°C, 30 sec; 62°C, 1 min; 72°C, 2 min; 94°C, 30 sec; 45°C, 1 min; 72°C, 2 min 1 72°C, 7 min; 4°C, Tertiaire 1 93°C, 1 min 20 94°C, 30 sec; 45°C, 1 min; 72°C, 2 min 1 72°C, 7 min; 4°C, . Exemple 7 : Protocole de digestion d'ulvanes par les ulvanes Ivases 5 de la présente invention 25 pL d'une fraction d'ulvane lyase pure avec une concentration de 5,7 pg protéine par mL était ajouté dans 1 mL milieu réactionnel compose de NaCl (200 mM) , ulvane (1 g L-1) et Tris HCI (20 mM, pH 9,2) à 35 °C dans une cuvette de quartz. La dégradation de l'ulvane (ou plutôt la formation de double liaison) était suivi par l'augmentation de l'absorbance à 235 nm. Exemple 8 : dégradation d'oligo-ulvanes par les ulvanes (vases de la présente invention La figure 4 représente les résultats obtenus d'expériences de chromatographie échangeuse d'ions conduites avant ou après incubation d'un disaccharide (graphique A) ou d'un tétrasaccharide (graphique B) avec les ulvanes lyases de la présente invention obtenues dans les exemples ci-dessus, dans les mêmes conditions que l'exemple précédent. La dégradation du tétrasaccharide démontre l'activité glucuronique lyase de l'enzyme. Sur ces graphiques, l'axe des abscisses représente temps d'élution en minutes (min), et l'axe des ordonnées représente conductométrie en nano-Coulomb (nC). Listes des références [1] Marc Lahaye et Audrey Robic, Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromolecules 2007, Vol. 8, 1765-1774. [2] http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/. [3] http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.htmL. [4] http://www.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm. [5] http://www.giagen.com/overview/qiagenes.aspx?gaw=PROTQIAgene s0807&gkw=mammalian+expression. [6] http://www.scbt.com/chap_exp_vectors.php?type=pCruzTM%20Expr ession%20Vectors. [7] WO 83/004261. [8] ZoBell, CE 1941 Studies on marine bacteria. I. The cultural requirements of heterotrophic aerobes, J Mar Res 4, 41-75. [9] Lahaye M., Bimalendu R., Baumberger S., Quernener B. and Axelos M., Procédé d'extraction des ulvanes, (1996) Hydrobiologia, 326/327, 20 473. [10] LaemmLi UK and Favre M 1973 Links maturation of the head of bacteriophage T4.1. DNA packaging events. J Mol Biol 80:575-599. [11] Bradford MM 1976 ; A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye 25 binding. Anal Biochem 72: 248-254. [12] Gacesa P and Wusteman FS 1990 Plate assay for simultaneous detection of alginate lyases and determination of substrate specificity. Appl and Environ Microbiol 56: 2265-2267. [13] Liu YG and Whittier RF (1995), Thermal Asymmetric Interlaced PCR : Automatable Amplification and Sequencing of Insert End Fragments from P1 and YAC Clones for Chromosome walking. Genomics 25: 5 674-681. [14] Liu YG, Mitsukawa N, Oosumi T and Whittier RF (1995), Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR. Plant J. 8: 457-463. lo REVENDICATIONS1. Ulvane lyase extraite du microorganisme déposé le 17 juin 2010 sous le numéro 1-4324 à la collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, de 30 ou 46kD comprenant dans sa séquence peptidique les quatre séquences suivantes : PNDPNLK, LLEVGNTGTFGSTGS, DLANPDNV, et WNLPE. 2. Ulvane lyase selon la revendication 1, ladite protéine étant 15 de séquence SEQ IDn°1. 3. Ulvane lyase selon la revendication 2 comprenant en outre, à son extrémité C-terminale, la séquence SEQ IDn°2 du listage de séquence annexé. 4. Ulvane lyase selon la revendication 1 ou 2 comprenant en outre, à son extrémité N-terminale, une séquence signal. 5. Ulvane lyase selon la revendication 4, dans laquelle la 25 séquence signal est la séquence SEQ IDn°3 du listage de séquences annexé. 6. Acide nucléique de séquence SEQ IDn°5 du listage de séquences annexée. 20 30 CONFIDENTIEL 7. Acide nucléique selon la revendication 6 comprenant en outre, à son extrémité 3', la séquence SEQ IDn°6 du listage de séquences annexé. 8. Acide nucléique selon la revendication 6 ou 7 comprenant en outre, à son extrémité 5', la séquence SEQ IDn°7 du listage de séquences annexé. 9. Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une 10 quelconque des revendications 6 à 8. 10. Cellule hôte comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou un vecteur selon la revendication 9 . 11. Microorganisme déposé le 17 juin 2010 sous le numéro 1-4324 à la collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. 20 12. Procédé de fabrication d'une ulvane lyase selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 par recombinaison génétique utilisant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou un vecteur selon la revendication 9. 25 13. Procédé de dégradation d'ulvanes comprenant une étape de mise en contact des ulvanes avec une ulvane lyase selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou avec une cellule hôte selon la revendication 10 ou avec un microorganisme selon la revendication 11, dans les conditions permettant la dégradation des ulvanes par digestion 30 enzymatique par ladite protéine ou ledit hôte ou ledit microorganisme. 15 CONFIDENTIEL