Brevet FR2969762A1 — publié le 20120629

SONDE DE MICROSCOPE À FORCE ATOMIQUE, SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET SES UTILISATIONS DESCRIPTION 5 DOMAINE TECHNIQUE La présente invention appartient au domaine des capteurs et, plus particulièrement, au domaine des sondes de microscope à force atomique (ou AFM pour « Atomic Force Microscope ») notamment utiles en 10 biologie. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'une sonde d'AFM telle qu'une sonde à capteur intégré piézo-électrique et les méthodes de préparation de cette sonde pour l'analyse 15 chimique fine de liens moléculaires par le biais de la spectroscopie de force chimique en milieu liquide et notamment en milieu liquide biologique. Les applications directes de ce type de sonde couvrent typiquement le séquençage de l'ADN, le 20 diagnostic personnalisé, l'ingénierie pharmacologique et les tests moléculaires dans le domaine nanotoxicologique. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE 25 L'utilisation de microleviers (ou « cantilevers » en anglais) d'AFM standard, combinés à une détection par un levier optique externe impliquant un laser ou une photodiode, pour la spectroscopie de force chimique dans l'analyse de liaisons moléculaires 30 a déjà été démontrée et mise en oeuvre en routine (Janshoff et al., 2000, Angew. Chem. Int. Ed., vol 39, pages 3212-3237). Plusieurs brevets et demandes de brevet concernent la spectroscopie par force chimique utilisant une pointe d'AFM. Le brevet US 7,013,717 au nom de Veeco Instruments Inc. envisage de greffer un ADN simple-brin sur la pointe d'un cantilever d'AFM et l'ADN simple-brin complémentaire sur la surface sondée. La demande internationale WO 2007/087653 au nom de Universitàt Linz propose une méthode pour détecter la 5-méthylcytosine impliquant des anticorps anti-5-méthylcytosine greffés sur la pointe d'un cantilever d'AFM. De plus, certains systèmes commerciaux récents de spectroscopie par force chimique commencent à apparaître sur le marché comme la machine automatisée proposée par les compagnies nAmbition ou JPK. En parallèle, l'utilisation de sondes d'AFM à capteur intégré piézo-électrique a déjà été démontrée 20 par plusieurs équipes dans le monde. En particulier, dans le brevet US 5,641,896, Karraï utilise, pour les applications en microscopie optique à champ proche (ou SNOM pour « scanning nearfield optical microscopy »), le retour de force fourni 25 par la sonde piézo-électrique pour approcher une fibre optique collée sur la sonde à quelques dizaines de nanomètres de la surface. Le brevet US 6,240,771 décrit l'utilisation d'une telle sonde d'AFM à capteur intégré piézo-électrique avec une pointe métallique, bien 30 acérée, collée à l'extrémité de la sonde pour scanner des cristaux avec une résolution atomique. Kaghesima et al. (2002, Applied Surface Science, vol. 188, pages 440-444) et Rensen et van Hulst (2000, Appl. Phys. Lett., vol. 77, pages 1557-1559) ont également démontré l'utilisation de cette sonde pour l'AFM en milieu liquide avec immersion totale de la sonde, respectivement dans une solution organique ou dans l'eau ultrapure. D'autres équipes ont utilisé la sonde piézo-électrique en-dehors du liquide, mais avec la pointe immergée dans un ménisque de liquide pour sonder la surface en-dessous (par exemple, Koopman et al., 2003, Appl. Phys. Lett., vol. 83, pages 5083-5085). Enfin, certains travaux ont illustré l'utilisation de ces sondes à capteur intégré piézo-électrique pour analyser les propriétés des liquides telles que viscosité et densité (Brevet US 6,393,895 au nom de Symyx Technologies Inc.) ou comme nez chimique permettant de détecter des molécules sélectivement greffées (Brevet US 6,393,895 et Demande de brevet US 2010/0068697 au nom de Drexel University). Les sondes à capteur intégré comme les capteurs piézo-électriques ont plusieurs avantages par rapport à un cantilever d'AFM standard car elles permettent de s'affranchir du système classique de détection optique de ces derniers. Elles sont plus faciles à intégrer et à utiliser dans des environnements extrêmes. Mais un point essentiel quant à leur utilisation dans des applications biologiques est la nécessité de pouvoir les plonger dans une solution biologique en gardant un bon comportement mécanique et électrique. Cette condition n'est pas évidente à satisfaire parce que les solutions salines utilisées en biologie comme HEPES, Tris ou PBS sont extrêmement conductrices en raison de la présence de nombreux ions dans le milieu aqueux. Ainsi, la sonde est inutilisable en tant que telle dans ces liquides en raison de problèmes inévitables de fuites électriques, de courts-circuits ou d'effets de corrosion sur les électrodes du capteur piézo-électrique. Les inventeurs se sont donc fixés pour but de proposer un système comprenant une sonde d'AFM et notamment une sonde d'AFM à capteur intégré piézo-électrique utile pour l'analyse des liens moléculaires en spectroscopie de force chimique et ce, dans des solutions tampons notamment dans les solutions mises en oeuvre dans le domaine de la biologie. La sonde d'AFM doit en outre conserver de bonnes propriétés mécaniques et électriques, présenter un bon facteur de qualité, lorsque cette dernière est utilisée dans les solutions tampons et être obtenue par un procédé simple de mise en oeuvre. Pour rappel, le facteur de qualité est une description de l'amortissement d'un système oscillant. Il est donné par le rapport entre l'énergie transmise et l'énergie perdue. Dans le cas d'une sonde, le facteur de qualité représente l'énergie transmise dans la bande passante autour de la résonance par rapport à l'énergie contenue hors de la bande passante. EXPOSÉ DE L'INVENTION Les inventeurs ont résolu les problèmes techniques précités et atteint le but fixé. En effet, la présente invention concerne une sonde de microscope à force atomique comprenant : i) un résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante ; et ii) une pointe fixée sur ledit résonateur revêtu et fonctionnalisée par au moins un groupement ou une molécule d'intérêt. La sonde d'AFM selon la présente invention est une sonde à capteur intégré piézo-électrique. En effet, elle est basée sur un matériau piézo-électrique associé à deux électrodes permettant d'exciter le résonateur en appliquant une tension oscillante. Les mêmes deux électrodes sont également utilisées pour analyser la réponse du résonateur piézo-électrique par un amplificateur de courant-tension convertissant le courant de déplacement en une tension. La Figure 1A illustre le modèle électrique équivalent du résonateur piézo-électrique dans l'air. C quartz est la capacité proportionnelle à la rigidité mécanique, L quartz est l'inductance proportionnelle à la masse effective de la sonde et R quartz est la resistance proportionnelle a l'amortissement de la sonde (à cause des pertes d'énergie). C stray quartz est une capacité parasite formée par les deux électrodes autour du matériau piézo-électrique. Par conséquent, si l'une des trois propriétés mécaniques précédemment mentionnées, i.e. masse, raideur et amortissement, est modifiée par l'environnement externe de la sonde, cela entraîne une modification de la réponse électrique détectée par l'amplificateur. De plus, comme le résonateur mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est revêtu d'une couche isolante et est susceptible d'être utilisé dans une solution biologique. Le milieu liquide, mais aussi le revêtement modifient les propriétés mécaniques et donc les propriétés électriques du résonateur piézo- électrique comme illustré par le circuit de la Figure IB. Le résonateur piézo-électrique mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est en un matériau piézo-électrique notamment choisi parmi le quartz, la topaze, la tourmaline, la berlinite, le nitrure d'aluminium, l'oxyde de zinc, le sulfure de cadmium, le titanate de plomb, le titano-zirconate de plomb, le niobate de lithium, le tantalate de lithium, le niobate de potassium, le langasite, l'arseniure de gallium, le niobate de baryum sodium, l'oxyde de bismuth germanium, l'arseniure d'indium, l'antimoniure, un polymère piézoélectrique tel que le polyfluorure de vinylidène (PVDF) et ses dérivés, ainsi que leurs mélanges. Plus particulièrement, le résonateur piézo-électrique mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est en quartz. Les électrodes mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention sont avantageusement métalliques et notamment en un métal choisi parmi l'or, le nickel, l'aluminium, le cuivre, l'étain et l'argent. Le résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention peut se présenter sous toutes les configurations et géométries notamment envisagées dans les sondes d'AFM. Plus particulièrement, le résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes se présente sous forme d'un diapason piézo-électrique (ou « Tuning fork » en anglais) avec une électrode disposée sur chacune des branches du diapason, ou dans une configuration d'interdigitation des électrodes disposées sur les deux branches du diapason. La couche isolante utilisée pour revêtir le résonateur de la sonde selon la présente invention correspond à une couche de passivation nécessaire pour protéger les électrodes de cette sonde de tout contact avec un liquide. Elle est présente sur l'ensemble du résonateur et sur une partie des électrodes dont il est muni. En effet, les extrémités des électrodes non- passivées assurent un bon contact électrique du résonateur et notamment du diapason piézoélectrique vers un connecteur relié à la chaîne d'amplification en aval. La partie critique à isoler et protéger du milieu liquide biologique via le dépôt d'une couche isolante est le résonateur et notamment le diapason piézoélectrique en fonctionnement. Ce revêtement doit satisfaire plusieurs conditions qui sont : - être chimiquement et mécaniquement stable dans une solution saline, - présenter une barrière de résistance électrique large pour éviter les fuites de courant de moins de quelques pico-ampères (le courant de déplacement ou la sonde ont un ordre de magnitude de dizaines de pico-ampères), - présenter une constante diélectrique faible par rapport à la fréquence pour éviter un fort effet de 30 capacitance parasite (voir Figure 1B) avec la capacitance parasite ajoutée C stray coating due à la couche de revêtement, - être conforme à la géométrie de la sonde où des angles aigus et singuliers peuvent être présents, - être mince pour éviter de trop affecter les propriétés mécaniques de la sonde, - être biocompatible et non-toxique. Toute couche isolante répondant aux conditions précitées est utilisable pour revêtir le résonateur de la sonde selon l'invention. Avantageusement, cette couche isolante peut être une peinture cathodique ou anodique électrophorétique commerciale notamment utilisée dans l'industrie automobile pour revêtir la structure de la voiture et la protéger contre la corrosion, mais aussi dans l'industrie alimentaire pour enrober la partie intérieure des conserves pour éviter tout contact du métal avec la nourriture. En outre, ce type de peinture a déjà été utilisé pour isoler la pointe d'un microscope à effet tunnel et d'un microscope électrochimique à balayage. A titre d'exemple d'une telle peinture, on peut citer la peinture électrophorétique GLASSOPHOR de BASF et la peinture électrophorétique CLEARCLAD de CLEARCLAD COATINGS Inc. En variante, cette couche isolante peut être en un matériau choisi parmi le dioxyde de silicium, le parylène ou un autre dérivé du [2,2]paracyclophane, le polyimidine, l'oxyde d'aluminium, le nitrure d'aluminium, un polymère vinylique et un silane hydrophobe notamment un silane hydrophobe tel que défini dans la demande de brevet US 2010/0068697. Plus particulièrement, dans le cadre de la présente invention, la couche isolante est une couche en parylène. La couche isolante, comme précédemment indiqué, doit être mince pour éviter de trop affecter les propriétés mécaniques de la sonde. Par conséquent, son épaisseur dépendra de la taille du résonateur piézo-électrique et notamment de la taille du diapason. Ainsi, la couche isolante mise en oeuvre dans l'invention présente avantageusement une épaisseur constante ou sensiblement constante sur le résonateur piézo-électrique. Cette épaisseur est, typiquement, comprise entre 50 nm et 20 pm, notamment entre 250 nm et 10 pm et, en particulier, entre 750 nm et 5 pm. Dans le cadre de la présente invention et de la microscopie à force atomique de façon générale, la pointe fixée et notamment collée sur le résonateur sonde la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser. Cette pointe se présente sous forme d'un fil, d'une fibre ou d'un nanotube. De plus, elle présente un apex défini comme la partie terminale de la pointe effilée ou du nanotube soumise à l'interaction via le groupement ou la molécule greffé(e) pour l'analyse des liens moléculaires en spectroscopie de force chimique. La pointe mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention comprend au moins un matériau choisi parmi le platine, le chrome, le chrome-or, le platine- iridium, le titane-platine, le nitrure de titane, le carbure de tungstène, le tungstène, le carbone ou un de leurs mélanges. Avantageusement, la pointe selon l'invention peut être uniquement constituée d'un seul des matériaux précédemment listés. En fonction du matériau la constituant, la pointe pourra être plus ou moins souple, voire plus ou moins rigide. Elle peut notamment être en platine-iridium ou en platine. En variante, la pointe selon l'invention peut 10 présenter deux zones distinctes, chacune constituée d'un des matériaux précédemment listés. En effet, les travaux des inventeurs ont montré que, lors de l'immersion dans une solution, une pointe trop souple sera distordue par l'interaction fluidique 15 et électrostatique avec le liquide en évitant son contact avec la surface. La réduction de la longueur de cette pointe très flexible augmentera sa rigidité et donc, sa stabilité pour rester droite en cours du fonctionnement en milieu liquide. Mais fixer une telle 20 pointe flexible avec une fonctionnalisation chimique spécifique, avec une longueur réduite pour augmenter suffisamment sa rigidité, directement au résonateur et notamment directement à une branche du diapason, ne sera pas compatible avec le fonctionnement de la pointe 25 seule immergée dans une solution. Dans cette configuration, le corps du résonateur piézo-électrique est gardé à l'extérieur du liquide pour obtenir la sensibilité la plus élevée avec un facteur de qualité élevé. Les inventeurs ont donc proposé d'ajouter une 30 pointe longue rigide entre le résonateur et notamment la branche du diapason et la pointe flexible avec une fonctionnalisation chimique spécifique qui sera en contact avec la surface. Dans cette variante, la pointe présente : - un ter élément fixé et notamment collé au résonateur (partie rigide) et - un 2nd élément (partie souple) fixé et notamment collé au ter élément et fonctionnalisé par un groupement ou une molécule d'intérêt. De façon avantageuse, le ter élément est un fil de platine/iridium et le 2nd un fil de platine, une fibre de graphite ou un nanotube de carbone. Ce 2nd élément constitue l'apex tel que précédemment défini. Quelle que soit la variante envisagée, la pointe mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention présente une longueur totale comprise entre 2 }gym et 5 mm, notamment entre 3 }gym et 1 mm et, en particulier, entre 4 }gym et 100 }gym. Dans le cas de la variante d'une pointe avec deux éléments distincts, la longueur du ter élément est comprise entre 2 }gym et 4 mm et, notamment, entre 3 }gym et 1 mm et la longueur du 2nd élément est comprise entre 400 nm et 50 }gym et, notamment, entre 800 nm et 10 }gym. L'apex de la pointe de la sonde selon la présente invention est fonctionnalisé par au moins un groupement d'intérêt ou au moins une molécule d'intérêt. Par « groupement d'intérêt » (ou « molécule d'intérêt »), on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement (ou une molécule) susceptible d'interagir chimiquement avec un autre groupement ou une autre molécule éventuellement présent(e) au niveau d'une surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser par microscopie à force atomique. Cette interaction chimique peut faire intervenir une liaison covalente entre la molécule ou une liaison non covalente telle qu'une liaison hydrogène ou ionique. Dans le cadre de la présente invention, le groupement d'intérêt peut être un groupement chimique simple ou complexe. Il est notamment choisi parmi -OH, -C(0)OH, -NH2r -CH3, -C(0)0-, -NH3+, -C(0)H, -N3, ou un alcène terminal. Dans le cadre de la présente invention, la molécule d'intérêt est une molécule, naturelle ou synthétique, notamment biologique. Avantageusement, elle est choisie parmi les peptides, les oligopeptides, les protéines telles que les enzymes, les anticorps ou fragments d'anticorps, les récepteurs cellulaires ou membranaires, les polysaccharides, les cellules ou parties cellulaires telles que des organites ou des membranes cellulaires, les acides nucléiques tels qu'ADN et ARN, et les molécules naturelles ou synthétiques à visée thérapeutique. La fonctionnalisation de la pointe par le groupement ou la molécule d'intérêt consiste à greffer, via au moins une liaison covalente, le groupement ou la molécule d'intérêt à la surface de l'apex de la pointe. Ce greffage peut être direct ou indirect. Avantageusement, la fonctionnalisation de la pointe par le groupement ou la molécule d'intérêt est indirecte et fait intervenir un bras de liaison lié de façon covalente, d'une part, à la pointe et notamment à la surface de l'apex de la pointe et, d'autre part, au groupement ou à la molécule d'intérêt. Tout bras de liaison communément utilisé en chimie est utilisable dans le cadre de la présente invention. Toutefois, le bras de liaison mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention comprend, de façon avantageuse, un groupement (hétéro)arylène. Le bras de liaison peut ne comprendre qu'un groupement (hétéro)arylène. En variante, le bras de liaison peut correspondre à un groupement (hétéro)arylène lié à un autre groupement du type chaîne moléculaire mobile tel qu'un groupement polyéthylène glycol (PEG). Cette variante permet de conférer, au groupement ou à la molécule d'intérêt, un degré de liberté plus grand par rapport au même groupement ou à la même molécule directement lié(e) au groupement (hétéro)arylène. Cette augmentation du degré de liberté favorise de fait les éventuelles interactions avec la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser. Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe arylène », une structure hydrocarbonée aromatique constituée d'un (ou plusieurs) cycle(s) aromatique(s) comportant chacun de 3 à 10 atomes de carbone, notamment de 3 à 8 atomes de carbone et, en particulier, 6 atomes de carbone. Dans le cadre de la présente invention, on entend, par « groupe hétéroarylène », une structure hydrocarbonée hétéroaromatique constituée d'un (ou plusieurs) cycle(s) hétéroaromatique(s) comportant chacun de 3 à 10 atomes de carbone, notamment de 3 à 8 atomes de carbone et, en particulier, 6 atomes de carbone, le (ou les) hétéroatome(s) pouvant être N, 0, P, Si ou S et notamment N, 0 ou S. Les hétéroatomes peuvent en particulier interrompre un cycle aromatique et/ou séparer deux cycles aromatiques d'un groupement arylène. La présente invention concerne également un procédé pour préparer une sonde de microscope à force 10 atomique telle que précédemment décrite. Le procédé selon l'invention comprend les étapes consistant à : a) déposer sur un résonateur muni de deux électrodes une couche isolante moyennant quoi un résonateur est obtenu ; b) fixer, sur le résonateur muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante obtenu à l'étape (a), une pointe ; c) éventuellement couper et/ou graver la pointe fixée lors de l'étape (b) ; d) fonctionnaliser la pointe fixée et affinée lors des étapes (b) et (c) par un groupement ou une molécule d'intérêt. L'étape (a) du procédé selon l'invention 25 consiste à déposer une couche mince isolante telle que précédemment définie sur la surface du résonateur. Ce dépôt peut être effectué par toute technique permettant d'obtenir une couche mince. Avantageusement, ledit dépôt est effectué par immersion (« dip coating »), par 30 vaporisation (« spray coating»), par centrifugation 15 20 (« spin coating »), par dépôt physique pyrolytique ou électrochimiquement. Plus particulièrement, le dépôt lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention est un dépôt physique pyrolytique ou un électrodépôt. La Figure 3 et la partie expérimentale ci-après décrivent un système utilisé pour la forme de mise en oeuvre impliquant un électrodépôt. L'homme du métier saura, en fonction de la nature et de la composition de la couche isolante à produire, le bain électrophorétique et le mode opératoire les mieux adaptés. La partie expérimentale ci-après présente également un protocole impliquant un dépôt physique pyrolytique de monomères, la couche isolante correspondant, dans ce cas, au polymère obtenu. Il convient de remarquer que les méthodes de passivation connues pour des matériaux conducteurs intrinsèques et de géométrie simple peuvent être plus difficiles à appliquer lorsque le résonateur piézo- électrique se présente sous forme d'un diapason. En effet, la passivation peut altérer les propriétés mécaniques, via notamment un effet de ménisque, de ce système pourvu d'électrodes et à géométrie plus complexe. Des résultats obtenus pour des résonateurs de type diapason piézoélectrique et décrits dans la partie expérimentale, il apparaît que : - lorsque la couche isolante est une peinture 30 électrophorétique, cette dernière est, de préférence, électrodéposée en mettant en oeuvre une rampe de tension de 0 V à une tension comprise entre 5 V et 50 V, notamment entre 10 V et 25 V et, en particulier, de l'ordre de 17 V (i.e. 17 V ± 2 V) et ce, en un temps compris entre 1 min et 20 min, notamment entre 2 min et 10 min et, en particulier, de l'ordre de 5 min (i.e. 5 min ± 2 min). Un tel procédé permet d'obtenir un dépôt conforme sur le diapason sans fuite de courant, sans perte de sensibilité et sans altération des propriétés mécaniques. - la passivation avec le parylène connue pour des systèmes de forme simple du type poutre ou disque et impliquant un dépôt physique pyrolytique de monomères n'a jamais été décrite sur des systèmes de résonateur piézo-électrique à géométrie complexe de type diapason, et, de fait, les résultats améliorés obtenus avec une telle couche isolante sur des diapasons n'ont jamais été décrits ou suggérés. L'étape (a) peut être répétée plusieurs fois et notamment au moins deux, trois ou quatre fois jusqu'à ce qu'une couche isolante présentant une épaisseur satisfaisante soit obtenue. De même, l'étape (a) peut comprendre une étape de recuit de la couche isolante, notamment lorsque la couche isolante est une peinture électrophorétique, une fois cette dernière déposée. Cette étape de recuit est effectuée, avantageusement, entre 80°C et 180°C et notamment entre 110°C et 160°C pendant 5 min à 60 min. Plusieurs travaux ont décrit différentes méthodes de fixation d'une pointe à l'extrémité d'un résonateur piézo-électrique (Brevet US 5,641,896 et Giessibl, 2003, Rev. Mod. Phys., vol. 75, pages 949-983), ces dernières peuvent être utilisées lors de l'étape (b) du procédé. Avantageusement, la pointe est fixée sur le résonateur au moyen d'une colle conductrice comme la colle époxy conductrice et notamment la colle Epotek H21D. Dans la variante précédemment décrite où la pointe est constituée de deux éléments distincts, une colle conductrice, identique ou différente, est utilisée pour coller le ter élément au résonateur, d'une part, et le 2nd élément au ter élément, d'autre part. La pointe est collée de façon à être perpendiculaire à la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser. Pour cette raison, elle doit être collée à un certain angle sur le résonateur et notamment sur la branche du diapason, cet angle étant fonction de la configuration géométrique du support de sonde du microscope à force atomique utilisé par la suite. La longueur de la pointe, qu'elle comprenne un ou deux éléments, est critique pour effectuer des mesures précises et sans artefact. En particulier, dans le cas d'une pointe à deux éléments, la longueur du ter élément (partie rigide) et aussi la longueur du 2nd (partie souple ou flexible) sont très critiques pour conserver de bonnes propriétés d'oscillation et pour éviter des artefacts dans les mesures à cause de la déformation de la pointe souple pendant l'approche de la pointe vers la surface. Par conséquent, il peut être nécessaire de couper et/ou de graver la pointe de la sonde ou les différents éléments la constituant. Dans ce cas, l'étape (c) n'est pas optionnelle. L'étape (c) consiste plus particulièrement en une étape de gravure électrochimique de la pointe comprenant un ou deux élément(s). La gravure électrochimique est un procédé bien connu dans le domaine des STM pour préparer des pointes acérées dont le rayon présente quelques nanomètres, nécessaires pour obtenir des images à haute résolution latérale. Une coupe électrochimique de la pointe (de quelques millimètres à plusieurs dizaines de micromètres de long), mais aussi une fine gravure de l'apex (en-dessous de 100 nm) de la pointe fixée sur le résonateur peut être obtenue. La géométrie proposée par Fotino (1993, Rev. Sci. Instrum., vol. 64, pages 159-167) pour graver des pointes en tungstène, permet une gravure plus efficace en utilisant la force de cisaillement du flot de bulles produit pendant la réaction de gravure. La partie expérimentale ci-après propose des protocoles quant à la gravure chimique à mettre en oeuvre pour des pointes en platine/iridium et/ou en platine. Sur la base de cet enseignement et sur la base des connaissances de l'état de la technique, l'homme du métier saura déterminer les conditions opératoires optimales pour la gravure chimique à mettre en oeuvre lors de l'étape (c) du procédé en fonction de la nature de la pointe de la sonde. Le protocole chimique pour fonctionnaliser la pointe de la sonde avec un groupement ou une molécule d'intérêt, lors de l'étape (d) du procédé peut consister en tout protocole permettant de greffer, de façon covalente et de façon directe ou indirecte, un tel groupement ou une telle molécule au niveau la surface de la pointe de la sonde. Avantageusement, ce protocole met en oeuvre les procédés décrits dans les demandes internationales WO 2008/078052 et WO 2009/121944 au nom du CEA. Ces demandes décrivent le greffage de molécules issues de sels d'aryle clivable et notamment de sels d'aryle diazonium par mise en oeuvre de conditions non électrochimiques. Plus particulièrement, l'étape (d) du procédé selon l'invention met en oeuvre au moins un élément choisi parmi un sel d'aryle diazonium portant un groupement d'intérêt ou un précurseur d'un tel groupement, un sel d'aryle diazonium portant une molécule d'intérêt ou un précurseur d'une telle molécule, un sel d'aryle diazonium portant une fonction amine ou un précurseur de tels sels d'aryle diazonium. Par « précurseur », on entend, dans le cadre de la présente invention, une entité séparée du groupement d'intérêt, de la molécule d'intérêt ou du sel d'aryle diazonium par une étape opératoire unique et aisée à mettre en oeuvre. Les précurseurs peuvent présenter une stabilité plus importante que le groupement d'intérêt, la molécule d'intérêt ou le sel d'aryle diazonium dans les mêmes conditions environnementales. Par exemple, les arylamines sont des précurseurs des sels d'aryle diazonium. En effet, par simple réaction d'oxydation, par exemple, avec NaNO2 dans un milieu aqueux acide, ou avec NOBF4 en milieu organique, il est possible de former les sels d'aryle diazonium correspondants. De même, un sel d'aryle diazonium portant un groupement -NH2 peut être utilisé pour fonctionnaliser la pointe avec un groupement -OH comme montré au point III.2(C) ci-après. De même, un sel d'aryle diazonium portant un groupement -NH2 peut être greffé sur la pointe de la sonde puis être rediazotiser de façon à réagir avec une molécule d'intérêt ou avec une molécule portant un groupement d'intérêt. La molécule d'intérêt et la molécule portant un groupement d'intérêt dans le cadre de la présente invention correspondent à la molécule d'intérêt de la demande internationale WO 2009/121944. L'exemple du point III.2(D) illustre cette forme de mise en oeuvre particulière. L'homme du métier trouvera des informations quant aux protocoles opératoires et notamment quant aux conditions non électrochimiques à mettre en oeuvre dans les demandes internationales WO 2008/078052 et WO 2009/121944 et autres enseignements découlant des procédés décrits dans ces dernières. La présente invention concerne également l'utilisation d'une sonde telle que précédemment définie ou susceptible d'être préparée par un procédé tel que précédemment défini en microscopie à force atomique et notamment pour la spectroscopie de force chimique en solution biologique et pour l'imagerie AFM en solution biologique. Plus particulièrement, ces sondes sont utilisées en mode dynamique à une fréquence d'excitation proche ou égale à leur fréquence de résonance. En variante, ces sondes sont utilisées en mode dynamique hors resonance à une fréquence d'excitation éloignée de leur fréquence de résonance ou à une fréquence correspondant à un harmonique différent de leur fréquence fondamentale de résonance. Il convient de remarquer que, jusqu'à présent, aucun résonateur piézo-électrique de type diapason piézo-électrique n'a été utilisé avec une pointe fonctionnalisée et/ou en biologie, de même l'utilisation de ce système pour la spectroscopie de force chimique n'a jamais été décrite, voire envisagée. A l'heure actuelle, les trois principales méthodes pour conduire les sondes dynamiques en AFM sont (1) l'AFM-Modulation de fréquence (ou FM-AFM pour « Frequency Modulation-AFM ») également appelé « Non contact-AFM », (2) l'AFM-Modulation d'Amplitude (ou AMAFM pour « Amplitude Modulation-AFM), également appelé « Tapping AFM » et (3) l'AFM-Mode Phase (ou PM-AFM pour « Phase Mode-AFM »). Selon la méthode utilisée, les différentes variables de sortie dynamiques changeantes (changement de fréquence, amplitude, changement de phase) acquises au cours de l'AFM peuvent être converties en valeurs de force d'interaction entre l'extrémité de la pointe et la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser. Dans le cadre de la présente invention, la sonde est avantageusement utilisée en mode AM-AFM. Dans ce dernier, les signaux acquis en sortie par spectroscopie approche/retrait sont l'amplitude d'oscillation et le déphasage par rapport à la distance relative pointe-surface. Ces deux informations (amplitude et phase par rapport à la distance) peuvent alors être utilisées pour récupérer les forces d'interaction chimiques entre la pointe et la surface en utilisant le formalisme proposé ailleurs (Sader et al., 2004, Appl. Phys. Lett., vol. 84, pages 1801-18003 ; Katan et al., 2009, Nanotechnology, vol. 20, page 165703 ; Uchihashi et al., 2004, Appl. Phys. Lett., vol. 85, pages 3575-3577). L'interaction chimique entre la surface à analyser et la pointe fixée à l'extrémité du résonateur et notamment à l'extrémité d'une des branches du diapason piézo-électrique va modifier les propriétés de résonance du résonateur piézo-électrique. En d'autres termes, les modifications détectées des propriétés de résonance de la sonde piézo-électrique sont directement liées à l'information chimique des liaisons chimiques entre l'extrémité de la pointe et la surface comme le montre la Figure 2. Dans cette schématisation, la sonde comprend un diapason piézo-électrique (1), présentant une pointe (2) fonctionnalisée par un groupement ou une molécule d'intérêt (3). Elle est mise en contact avec un substrat solide (6) sur lequel est greffé un récepteur (5), permettant ainsi d'apprécier les interactions chimiques (4) entre ce récepteur et le groupement ou la molécule d'intérêt. L'analyse finale des liaisons chimiques utilise plusieurs courbes de force chimique acquises avec la sonde pour des taux de charge différents (ou vitesse d'approche-retrait) pour obtenir un diagramme de Bell- Evans. Ce schéma Bell-Evans, décrit par Müller et Dufrêne, 2008 (Nature Nanotechnology, vol. 3, pages 261-269 et Müller et al., 2009, Nature Chem. Biol., vol. 5, pages 383-390) permet d'obtenir les informations chimiques quantitatives et qualitatives sur le paysage énergétique des liens chimiques. Le taux de dissociation koff, les barrières de potentiel (enthalpies libres), les distances de transition peuvent être directement obtenus contre le taux de charge, mais aussi contre la température ou le pH de la solution. Il est ainsi possible d'observer s'il y a un phénomène d'attraction, de répulsion ou d'harponnage entre le groupement ou la molécule d'intérêt fonctionnalisant la pointe de la sonde et la surface à balayer, à étudier, à caractériser et/ou à analyser. Par conséquent, la présente invention trouve des applications dans le domaine du diagnostic, du séquençage de l'ADN par détection de l'hybridation entre brins d'ADN ou d'ARN complémentaires entre un brin cible fixé sur la pointe de la sonde selon la présente invention et un brin en solution ou fixé sur une surface et/ou de la détection de composés à intérêt thérapeutique du type sucres, protéines, anticorps ou oligopeptides. En effet, on peut envisager de greffer, sur une surface telle qu'une surface d'un support solide en silicium, en verre, en métal, en polymère ou en plastique, un récepteur membranaire notamment impliqué dans un état pathologique. Le greffage peut mettre en oeuvre un procédé tel que décrit dans les demandes internationales WO 2008/078052 et WO 2009/121944. Le récepteur ainsi greffé est maintenu dans un milieu biologique ou un tampon adapté notamment pour qu'il se présente dans une configuration native. La sonde selon l'invention est fonctionnalisée par une molécule synthétique ou naturelle dont on souhaite connaître un éventuel potentiel dans le traitement de l'état pathologique. La présente invention permettra de savoir s'il existe un phénomène d'attraction, de répulsion ou d'harponnage entre cette molécule et le récepteur greffé. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à la lecture des exemples ci-après donnés à titre illustratif et non limitatif et faisant référence aux figures annexées. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La Figure 1 présente les circuits électriques, équivalents aux circuits de Butterworth-Van Dyke, d'un quartz : dans le vide ou dans l'air (Figure 1A), avec un revêtement et immergé dans un liquide (Figure 1B). La Figure 2 est une schématisation de la sonde à capteur piézo-électrique intégré pour déterminer les interactions chimiques au niveau moléculaire. La Figure 3 illustre le dispositif pour effectuer le dépôt électrolytique pour obtenir un résonateur revêtu par une couche isolante. La Figure 4 présente une photographie du diapason obtenue lors d'un dépôt électrochimique de la peinture électrophorétique soit sans optimisation des paramètres de tension (pas de rampe de tension, la tension appliquée directement) (Figure 4A) soit en appliquant une rampe lente de tension (Figure 4B). La Figure 5 présente la rampe de tension (13) via le générateur de tension de rampe afin d'optimiser la couche de peinture électrophorétique (Figure 5A), avec le suivi simultané du courant pendant l'électrodéposition au cours de la première électrodéposition (14) et au cours de la seconde électrodéposition (15) (Figure 5B). La Figure 6 présente les courbes de résonance d'amplitude dans trois configurations différentes de la conduite obtenues pour un même diapason revêtu de la peinture électrophorétique : dans l'air, avec la seule pointe immergée dans la solution et avec la sonde entière immergée dans la solution. La Figure 7 présente l'amplitude (traits fins) et la phase (traits épais) d'un même type de diapason mais revêtu par une couche de parylène : dans l'air (Figure 7A) et la sonde entière immergée dans une solution (Figure 7B). La Figure 8 présente une vue détaillée de l'arrangement de la pointe portée par le diapason. La Figure 9 est une schématisation de la configuration utilisée pour effectuer la coupe électrochimique mais aussi la gravure fine de l'apex de la pointe fixée sur une branche du diapason piézo-électrique. La Figure 10 présente l'image au microscope optique d'une pointe de platine/iridium d'un diamètre de 50 pm après la gravure d'un fin apex (rayon de l'extrémité de la pointe inférieur à 100 nm). La Figure 11 présente les images au microscope optique d'une pointe de graphite d'un diamètre de 10 }gym avant (Figure 11A) et après (Figure 11B) la gravure d'un fin apex (rayon de l'extrémité de la pointe inférieur à 1 }gym). La Figure 12 présente différentes fonctionnalisations chimiques de l'extrémité de la pointe présentée sous forme d'un triangle, basées sur la chimie du sel de diazonium. La Figure 13 présente la fonctionnalisation chimique par de la BSA d'une surface basée sur la chimie du sel de diazonium. La Figure 14 présente trois courbes d'approche-retrait effectuées sur une surface de mica, revêtue d'or, propre sans chimie, avec des pointes dont l'extrémité est fonctionnalisée par (p-NH2 (Figure 14A), (p-CH3 (Figure 14B) et (p-OH (Figure 14C). Aucun produit chimique spécifique du greffage n'apparaît. La Figure 15 présente trois courbes d'approche- retrait effectuées sur une surface de mica, revêtue d'or et fonctionnalisée par de la BSA, avec des pointes dont l'extrémité est fonctionnalisée par (p-NH2 (Figure 15A), (p-CH3 (Figure 15B) et (p-OH (Figure 15C). Une signature de greffage chimique spécifique apparaît clairement sur les courbes de retrait. Le graphe de la Figure 15D présente une pointe dont l'extrémité est non fonctionnalisée utilisée pour sonder la surface de mica, revêtue d'or et fonctionnalisée par de la BSA.. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS I. Diapason piézo-électrique. La sonde piézo-électrique utilisée est un résonateur piézo-électrique en quartz à deux électrodes en métal obtenues par dépôt physique (pulvérisation ou évaporation d'une cible métallique) d'une couche d'accrochage en chrome ou titane (épaisseur de l'ordre de 50 nm) suivi d'un deuxième dépôt de nickel ou d'or (épaisseur de l'ordre de 400 nm) se présentant sous forme d'un diapason accessible dans le commerce (par exemple CITIZEN AMERICA CFS206). II. Revêtement isolant. II.1. Revêtement de peinture électrophorétique. Après un bain à ultrasons du résonateur en quartz dans de l'éthanol et de l'acétone, la sonde en quartz est revêtue dans un bain de GLASSOPHOR de BASF, peinture cathodique électrophorétique, suivie d'un rinçage à l'eau ultrapure Millipore et enfin un recuit. Le dispositif de la Figure 3 comprend un diapason piézo-électrique (1) et ses deux électrodes connectées ensemble (7) à un ampèremètre (8). La masse (9) est reliée à l'autre connecteur de l'ampèremètre avec l'électrode négative du générateur de rampe de tension (10). L'électrode positive du générateur de rampe de tension (10) est reliée à la contre-électrode en platine (11) du bain d'électrodéposition (12) contenant le mélange de peinture électrophorétique cathodique diluée dans de l'eau ultrapure. L'utilisation d'une peinture électrophorétique anodique est possible et implique d'inverser les polarités du générateur de tension de la rampe. La difficulté demeure pour le diapason standard en raison des effets du ménisque entre les branches comme le montre la Figure 4A. Mais après plusieurs essais faisant varier la dilution de la peinture dans le bain (40% dans l'eau ultrapure Millipore) et la température de recuit (140°C pendant 15 min), une fine couche homogène, sans effet de ménisque et sans bulles piégées dans la peinture durcie, est obtenue de façon reproductible comme illustré sur la Figure 4B. En outre, la vitesse de rampe de tension est essentielle pour contrôler l'épaisseur et l'uniformité de la couche de polymère électrodéposé de peinture électrophorétique (voir Figure 5). Une rampe de 0 V à 17 V en 300 sec a été trouvée optimale (Figure 5A). L'opération de revêtement électrophorétique (électrodéposition dans un bain + recuit) doit être répétée 2 ou 3 fois afin d'obtenir un revêtement isolant efficace avec une épaisseur de 3 pm. Au cours de la première électrodéposition dans le bain, un contrôle du courant permet de déterminer une phase en plateau au cours de la rampe où le dépôt de la couche est fini (courant I est égal à environ 300 pA), suivie d'une diminution du courant à zéro indiquant la fin du processus (voir Figure 5B). L'isolation du revêtement a été testée directement en étudiant le diapason revêtu dans une solution tampon (pH = 8,2 ; Tris = 10 mM, NaCl = 10 mM, MgC12 = 10 mM) en réalisant des courbes de résonance, d'une part, pour montrer que l'excitation et la détection du signal provenant de la sonde est possible sans problème de fuites de courant entre les électrodes et la solution conductrice, et, d'autre part, pour tester l'influence de l'environnement liquide sur les performances mécaniques de la sonde. Ainsi, la sonde a été testée, tout d'abord, complètement immergée dans une goutte de solution tampon, puis, avec seule la pointe collée à l'extrémité d'une des branches du diapason immergée dans la solution tampon. La pointe est un fil de Platine/Iridium, de diamètre 50 }gym et environ 4 mm de long, collé avec de la colle époxy sur une branche du diapason enduit de peinture électrophorétique. Trois configurations que sont le diapason dans l'air, le diapason tout entier dans la solution tampon et seule la pointe du diapason dans la même solution tampon ont été étudiées. Comme le montre la Figure 6, les courbes de résonance obtenues présentent un décalage de la fréquence de résonance vers les basses fréquences lorsque la pointe ou la sonde complète ont été immergées dans la solution tampon (f0 = 31'630 Hz dans l'air, f0 = 31'595 Hz avec seulement la pointe dans la solution, f0 = 31'146.8 Hz avec la sonde toute entière immergée dans la solution). Dans le même temps, les effets hydrodynamiques du liquide (Maali et al., 2005, J. Appl. Phys., vol. 97, pages 074907.1-074907.6) augmentent la dissipation d'énergie diminuant le facteur de qualité de la sonde (Q = 2000 dans l'air, Q = 1300 avec seulement la pointe dans une solution, Q = 60 avec la sonde toute entière immergée dans la solution). Cela signifie que la sensibilité de la détection de force, dépendant du rapport entre le facteur de qualité sur la constante de raideur du résonateur, sera la meilleure avec seulement la pointe immergée dans la solution, en gardant le corps du résonateur piézo-électrique revêtu d'une peinture électrophorétique en-dehors du liquide. II.2. Revêtement de parylène. La méthode est plus rapide que la précédente pour obtenir un revêtement conforme des sondes. Il s'agit d'un procédé en une étape. Le dépôt parylène permettant le revêtement de passivation est un dépôt physique pyrolytique de monomères, avec l'échantillon à revêtir à température ambiante. Ce procédé par pyrolyse est connu de l'Homme du métier et on peut se reporter par exemple sur le protocole de E. L. Heintz et al., 2001, IEEE-NANO 2001. Proceedings of the 2001 1st IEEE Conference on Nanotechnology, pp. 346-351 (2001). Le parylène est bien connu pour être hydrophobe et biocompatible, et très utilisé pour revêtir des outils de chirurgie. Il existe plusieurs types de parylène. Les plus efficaces pour un dépôt passivant sont le parylène N ([2,2]paracyclophane) et le parylène C (Dichloro[2,2]paracyclophane). Le diapason piézo-électrique a été revêtu dans le vide à température ambiante, après avoir été rincé à l'éthanol et l'acétone. L'épaisseur du parylène a été caractérisée à 545 nm et est conforme à la forme du résonateur. Le parylène N a été utilisé dans ce cas. Encore une fois, comme présenté sur la Figure 7, les courbes d'amplitude et de résonance de phase ont été effectuées dans l'air (Figure 7A) et après une immersion complète du même diapason dans la solution tampon (Figure 7B). La plus mince couche de parylène comparée à la couche de peinture électrophorétique permet de garder un facteur de qualité plus élevé et une fréquence de résonance plus élevée dans l'air mais aussi dans le liquide pour le diapason (f0 = 32'724 Hz, Q = 10'131 dans l'air et f0 = 31'223 Hz, Q = 109 la sonde entière immergée dans la solution). Cela signifie que la sensibilité de la détection de force, dépendant du rapport du facteur de qualité sur la constante du ressort du résonateur, sera meilleure avec une couche mince de parylène. III. Fabrication et fonctionnalisation chimique de la pointe. III.1. Fabrication de la pointe sur le résonateur piézo-électrique. Comme présenté Figure 8, le corps du diapason (1) détient, sur une de ses branches, une pointe rigide (2a) en platine/iridium, maintenue avec un point de colle époxy conductrice (16), comme la colle Epotek H21D. Un point de colle (17) est également ajouté à la branche opposée de façon à conserver la symétrie de masse pendant l'oscillation et donc à maintenir un facteur de qualité élevé. Le mode de vibration du diapason et la relation entre la symétrie de masse des branches avec le facteur de qualité sont expliqués en détail dans l'article de Ng et al. (2009, Ultramicroscopy, vol. 109, pages 291-295). À la fin de la pointe rigide (2a), l'extrémité de la pointe utilisée pour la fonctionnalisation chimique (2b) est également fixée à l'extrémité de la pointe rigide (2a) avec un point de colle époxy conductrice (18). La longueur de la pointe rigide (2a) et aussi la longueur de la pointe flexible (2b) sont très critiques pour conserver de bonnes propriétés d'oscillation et pour éviter des artefacts dans les mesures à cause de la déformation de la pointe souple (2b) pendant l'approche de la pointe vers la surface. Par conséquent, ces longueurs ont été contrôlées en gravant électrochimiquement la pointe. Le dispositif pour cette gravure est présentée Figure 9. Le diapason (1) est monté sur un traducteur Z (19) pour contrôler la taille de la pointe (2) à graver à l'intérieur de la solution électrochimique (20). La contre-électrode (21) relie la solution électrochimique à un connecteur d'un générateur de fréquence (22). Le matériau de la contre-électrode (21) et la composition chimique de la solution électrochimique (20) dépendent du matériau de la pointe à couper ou à graver. Pour graver et couper la pointe d'un fil en platine/iridium présentant un diamètre de 50 }gym, fixé à un diapason, une contre-électrode en platine présentant un diamètre de 500 }gym et une longueur de 8 mm a été utilisée avec une solution électrochimique de CaC12 (5 g) diluée dans l'eau ultrapure Millipore (30 ml) avec de l'acétone (2 ml). Pour graver et couper un fil de graphite de 10 }gym de diamètre, fixé sur la pointe rigide de platine/iridium, une contre-électrode en carbone présentant un diamètre de 4 mm et une longueur de 8 mm a été utilisée avec une solution électrochimique de NaHCO3 dilué dans l'eau ultrapure Millipore (0,07 g/ml). Ensuite, l'autre connecteur du générateur de fréquence est connecté (23) à une électrode de platine (24) fixée au traducteur XYZ (25) afin de faire le contact électrique avec l'extrémité de la pointe du diapason (2) ou à la base de cette pointe (2) collée avec de l'époxy conductrice sur la branche du diapason (1). Ainsi, la forme d'onde, la fréquence, l'amplitude et la durée d'excitation du signal électrique délivré par le générateur de fréquence (22) permettent de contrôler la gravure fine ou la coupe électrochimique de la pointe. Un ampèremètre dans le circuit permet de suivre le processus de gravure et de l'arrêter afin d'obtenir une gravure fine, ou d'attendre un courant mesuré de zéro ce qui signifie que la pointe est coupée. Par exemple, pour couper la pointe d'un fil de platine/iridium, une forme d'onde sinusoïdale continue de 22 volts (crête à crête) avec une fréquence de 400 Hz a été utilisée. Pour graver l'apex de la pointe fine de platine/iridium, des salves de 250 ms, espacées de 750 ms, d'une onde sinusoïdale de 22 volts (crête à crête) avec une fréquence de 400 Hz ont été utilisées (voir Figure 10). Pour couper la pointe de graphite, une forme d'onde sinusoïdale continue de 16 volts (crête à crête) avec une fréquence de 46 Hz a été utilisée. Pour graver l'apex de la pointe fine de graphite, des salves de 250 ms, espacées de 750 ms, d'une onde sinusoïdale de 8 volts (crête à crête) avec une fréquence de 46 Hz ont été utilisées (voir Figure 11). III.2. Fonctionnalisation chimique de la pointe de la sonde. Ainsi, l'extrémité de la pointe de la sonde en graphite a été sélectivement greffée par des groupements (p-OH (hydroxyles), (p-NH2 (amines) ou (p-CH3 (méthyle), comme illustré sur la Figure 12. Le greffage direct de protéines sur l'extrémité de la pointe peut également être envisagé. A. Fonctionnalisation par (p-NI-12 Solution n °1 (100 ml d'amine à 0,1 M) . 1,8107 g de 1,4-phénylènediamine (par exemple de Sigma-Aldrich) sont dissous dans 100 ml de HCl à 0,5 M (21,64 ml de HCl à 37% dans 500 ml de H2O) . Le produit suivant utilisable pendant environ 2 heures à température ambiante est obtenu : C1-NH3- NY3{CI \ -i Solution n °2 (100 ml de HNO2 à 0,1 M) . 0,69 g de nitrite de sodium NaNO2 (par exemple de Fluka) est dissous dans 100 ml d'eau ultrapure Millipore pour réaliser la réaction chimique suivante : NaNO2 + H2O , HNO2 + NaOH30 Mélange des solutions n °2 et n °1 : Un barreau magnétique est placé dans le bain de réaction. Puis, 10 ml de la solution n°2 sont mis goutte à goutte dans 10 ml de solution n°1, c'est la première diazotisation telle que : HNO2 + NH2-cp-H3+NC1 , 2 H2O + NH2-cp-N2+Cl L'agitation est maintenue pendant 5 min, le bain de réaction prenant alors une couleur brun-orange avec de la mousse à la surface. Puis, 1,5 g de poudre de fer est ensuite ajouté en tant que réducteur permettant ainsi : H3+N-cp-N2+ + Fe + 3 H+ H3+N-cp' + Fe2+ + N2 Le mélange est ensuite chauffé à 40°C pendant une durée At pour polymériser une couche de plusieurs sels de diazonium avec une terminaison -NH2 sur la surface immergée dans le bain et à fonctionnaliser. L'épaisseur et ainsi la densité du (p-NH2 greffé peuvent être contrôlées en ajustant le At. Un At de 15 min a été utilisé pour la fonctionnalisation de l'apex de la pointe en graphite. Enfin, la surface fonctionnalisée a été rincée avec de l'acétone et de l'éthanol, avant d'être séchée sous l'azote. B. Fonctionnalisation par (p-CH3 0,294 g d'un hémi(sel de chlorure de zinc) de p-diazo-N,N-diéthyl-m-toluidine (formule ci-dessous) est dilué dans 20 ml d'eau ultrapure Millipore : 1% La solution est remuée pendant 30 min, avant l'ajout de 1,5 g de poudre de fer dans le bain. La surface à fonctionnaliser (i.e. l'extrémité de la pointe en graphite) dans ce bain est immergée pendant 15 min, avant d'être rincée avec de l'acétone et de l'éthanol et séchée sous l'azote. C. Fonctionnalisation par (p-OH Le protocole suivi est identique à celui pour la fonctionnalisation par (p-NH2. La surface de l'apex fonctionnalisée est mise, pendant 2 min, dans un bain de 15 ml de HC1 avec 15 ml de NaNO2 pour diazoter à nouveau le -NH2 terminal et le remplacer par un groupement -N2+ Tout de suite après, dans un endroit protégé de la lumière, une goutte d'eau ultrapure Millipore est placée sur la surface portant des groupements -N2+ et maintenue pendant 60 min avant de rincer la surface avec de l'éthanol et de la sécher avec de l'azote. Ainsi, le groupement -N2+ est remplacé par un groupement d'hydroxyle permettant d'obtenir un phénol stable. D. Fonctionnalisation d'un mica doré par (p-protéine, (BSA) Un mica préalablement doré par pulvérisation ou évaporation thermique d'une couche d'or de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur, sur lequel on applique le protocole similaire à celui pour la fonctionnalisation par (p-OH ; sauf qu'à la dernière étape, au lieu d'ajouter une goutte d'eau ultrapure Millipore, une solution protéique est déposée et laissée pendant 15 min, avant de rincer avec une solution tampon (telle que PBS ou Tris 10 mM). La solution protéique préparée est une solution de 25 mg de BSA (sérum albumine bovine) dans 4 ml d'eau ultrapure Millipore. La surface ainsi préparée est schématisée à la Figure 13. IV. Expériences de « harpon moléculaire ». IV.1. Principe et conditions. Il est bien connu qu'en jouant avec le pH de la solution, les fonctions chimiques à l'extrémité de la pointe peuvent lier prioritairement les groupements -COOH ou -NH2 de certains acides aminés des protéines par l'intermédiaire de liaisons hydrogène. Par conséquent, toutes les expériences de « harpon moléculaire » ont été réalisées dans une solution tampon de Tris = 10 mM, MgC12 = 10 mM et NaCl = 10 mm avec un pH = 8,2 pour activer les liaisons hydrogène avec les protéines greffées sur la surface d'essai. La pointe fonctionnalisée de la sonde est immergée dans cette solution. La surface d'essai est un échantillon de mica fraîchement clivé, revêtu d'or et couvert par des sels de diazonium pour greffer de la BSA. La fonctionnalisation de la surface de mica recouvert d'or par le sel de diazonium et la BSA a été vérifiée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier ou « spectroscopie FTIR ». La taille de l'extrémité de la pointe en graphite étant trop petite pour être caractérisée par une analyse par spectroscopie FTIR ou par spectroscopie de photoélectrons X (XPS), seule la spectroscopie de force chimique spectroscopie exposée dans les résultats ci-après permet de vérifier la fonctionnalisation de la pointe. Ainsi, une combinaison de différentes expériences de spectroscopie de force chimique a été menée avec la sonde piézo-électrique préparée conformément aux protocoles des points I, II et III ci-dessus en mode AM-AFM à l'aide des courbes d'approche- retrait vers la surface. Les signaux acquis en sortie sont l'amplitude d'oscillation et le déphasage par rapport à la distance relative pointe-surface. Ces deux informations (amplitude et phase par rapport à la distance) peuvent alors être utilisées pour récupérer les forces d'interaction chimique en utilisant le formalisme proposé ailleurs (Sader et al., 2004 ; Katan et al. ; Uchihashi et al., 2004). IV.2. Résultats sur une surface non fonctionnalisée. Afin de vérifier la sélectivité des « harpons moléculaires » greffés à l'extrémité de la pointe, les tests ont été d'abord effectués sur une surface de mica propre, revêtu d'or sans chimie, avec trois extrémités de pointe différentes ((P-OH, (p-NH2 et (p-CH3). La Figure 14 illustre trois courbes d'approche/retrait obtenues dans ces conditions. L'amplitude et le signal de phase sont acquis simultanément avec, en trait épais, les courbes d'approche vers la surface et, en trait fin, les courbes de retrait, quand la pointe est retirée. La diminution de l'amplitude et l'augmentation de la phase sont synonymes du fait que la pointe entre en contact avec la surface. Les courbes d'approche et de retrait pour chaque cas sont très identiques. Cela signifie qu'aucun greffage chimique n'apparaît entre l'extrémité de la pointe et la surface. IV.3. Résultats sur une surface fonctionnalisée avec des protéines de BSA. En utilisant les mêmes pointes dont l'extrémité est fonctionnalisée par (p-OH, (p-NH2 ou (p-CH3r les mêmes courbes approche/retrait ont été réalisées sur une surface en mica, recouverte d'or et greffée par des protéines BSA. En comparant les résultats obtenus sur la Figure 15 avec ceux de la Figure 14, des différences nettes apparaissent dans les courbes de retrait (trait fin) montrant différentes étapes abruptes, plus visibles sur les courbes de phase. Chaque étape correspond au détachement d'un (ou de plusieurs) lien(s) chimique(s) créé(s) lors de l'approche de la pointe et pendant le temps de résidence de l'extrémité de la pointe sur la surface, contrôlé par le retour de force donné par la sonde piézo-électrique. Donc, une signature claire de certains liens moléculaires spécifiques entre la chimie de la pointe et la biochimie de la surface peut être obtenue, par le moyen des courbes de force chimique avec une sonde à capteur intégré piézo-électrique travaillant dans un environnement salin nécessaire pour étudier la matière biologique. Sur la base de travaux antérieurs (Wang et al., 2004, Langmuir, vol. 20, pages 7753-7759 ; Ebner et al., 2005, ChemPhysChem, vol. 6, pages 897-900), la sensibilité du système est de l'ordre de la centaine de picoNewtons. Le graphique de la Figure 15D présente les courbes obtenues en utilisant une pointe en graphite dont l'extrémité est non fonctionnalisée et la même surface de mica revêtue d'or et fonctionnalisée avec de la BSA. Dans ce dernier cas, aucun greffage chimique spécifique n'apparaît sur les courbes de retrait (les courbes d'approche et de retrait pour chaque cas sont très identiques) ce qui démontre que les courbes de force chimique avec des étapes abruptes au cours du retrait de la pointe sont réellement dues à la présence d'une chimie spécifique et contrôlée, à la fois, à l'extrémité de la pointe et à la surface de l'échantillon.20 REVENDICATIONS1) Sonde de microscope à force atomique comprenant : i) un résonateur piézo-électrique muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante ; et ii) une pointe fixée sur ledit résonateur revêtu et fonctionnalisée par au moins un groupement ou une molécule d'intérêt. 2) Sonde selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit résonateur piézo-électrique est en un matériau piézo-électrique notamment choisi parmi le quartz, la topaze, la tourmaline, la berlinite, le nitrure d'aluminium, l'oxyde de zinc, le sulfure de cadmium, le titanate de plomb, le titano-zirconate de plomb, le niobate de lithium, le tantalate de lithium, le niobate de potassium, le langasite, l'arseniure de gallium, le niobate de baryum sodium, l'oxyde de bismuth germanium, l'arseniure d'indium, l'antimoniure, un polymère piézo-électrique et leurs mélanges. 3) Sonde selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites électrodes sont métalliques et notamment en un métal choisi parmi l'or, le nickel, l'aluminium, le cuivre, l'étain et l'argent. 4) Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit résonateur piézo-électrique muni desdites deux électrodes se présente sous forme d'un diapason piézo-électrique (ou « Tuning fork » en anglais) avec une électrode disposée sur chacune des branches du diapason, ou dans une configuration d'interdigitation des électrodes disposées sur les deux branches du diapason. 5) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite couche isolante est : une peinture cathodique ou anodique électrophorétique commerciale ou - en un matériau choisi parmi le dioxyde de silicium, le parylène ou un autre dérivé du [2,2]paracyclophane, le polyimidine, l'oxyde d'aluminium, le nitrure d'aluminium, un polymère vinylique et un silane hydrophobe. 6) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite pointe présente : - un ter élément fixé au résonateur et un 2nd élément fixé au ter élément et fonctionnalisé par un groupement ou une molécule d'intérêt. 7) Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit ter élément est un fil de platine/iridium et ledit 2nd élement un fil de platine, une fibre de graphite ou un nanotube de carbone.30 8) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit groupement d'intérêt est choisi parmi -OH, -C(0)OH, -NH2r -CH3, -C(0)0-, -NH3+, -C(0)H, -N3 et un alcène terminal 9) Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est choisie parmi les peptides, les protéines telles que les enzymes, les anticorps ou fragments d'anticorps, les récepteurs cellulaires ou membranaires, les polysaccharides, les cellules ou parties cellulaires telles que des organites ou des membranes cellulaires, les acides nucléiques tels qu'ADN et ARN, et les molécules naturelles ou synthétiques à visée thérapeutique. 10) Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la fonctionnalisation de la pointe par le groupement ou la molécule d'intérêt est indirecte et fait intervenir un bras de liaison lié de façon covalente, d'une part, à la pointe et, d'autre part, au groupement ou à la molécule d'intérêt. 11) Sonde selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit bras de liaison comprend un groupement (hétéro)arylène. 12) Sonde selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit bras de liaison comprend un groupement polyéthylène glycol (PEG). 13) Procédé pour préparer une sonde de microscope à force atomique selon l'une des revendications précédentes, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) déposer sur un résonateur muni de deux électrodes une couche isolante ; b) fixer, sur le résonateur muni de deux électrodes et revêtu d'une couche isolante obtenu à l'étape (a), une pointe ; c) éventuellement couper et/ou graver la pointe fixée lors de l'étape (b) ; d) fonctionnaliser la pointe fixée et affinée lors des étapes (b) et (c) par un groupement ou une molécule d'intérêt. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le dépôt lors de ladite étape (a) est un dépôt physique pyrolytique ou un électrodépôt. 15) Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que ladite étape (c) est une étape de gravure électrochimique de la pointe. 16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que ladite étape (d) met en oeuvre au moins un élément choisi parmi un sel d'aryle diazonium portant un groupementd'intérêt ou un précurseur d'un tel groupement, un sel d'aryle diazonium portant une molécule d'intérêt ou un précurseur d'une telle molécule, un sel d'aryle diazonium portant une fonction amine ou un précurseur de tels sels d'aryle diazonium. 17) Utilisation d'une sonde telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou susceptible d'être préparée par un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 13 à 16, pour la spectroscopie de force chimique en solution biologique. 18) Utilisation d'une sonde telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou susceptible d'être préparée par un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 13 à 16, pour l'imagerie AFM en solution biologique. 19) Utilisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce que ladite sonde est utilisée en mode dynamique à une fréquence d'excitation proche ou égale à sa fréquence de résonance. 20) Utilisation selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce que ladite sonde est utilisée en mode dynamique hors résonance à une fréquence d'excitation éloignée de sa fréquence de résonance, ou à une fréquence correspondant à un harmonique différent de sa fréquence fondamentale de résonance.