Brevet FR2968672A1 — publié le 20120615

Construction des souches vaccinales SC9-1 et SC9-2 de virus recombinant de la maladie de Marek et leur utilisation La présente invention concerne la construction et l'utilisation des souches vaccinales SC9-1 et SC9-2 de virus recombinant de la maladie de Marek (MDV). L'invention appartient au domaine de la biologie moléculaire des produits biologiques vétérinaires. Puisque le virus de la maladie de Marek (MDV) a été pour la première fois isolé et identifié en 1968, des programmes de vaccination pour lutter contre la maladie de Marek (MD) sont menés depuis plus de 40 ans. A cause du changement continu de la pathogénicité du MDV, sa virulence et sa pathogénicité ont augmenté progressivement. Différents types de vaccins ont donc été développés et utilisés, depuis l'herpèsvirus monovalent des dindes de sérotype III jusqu'au vaccin bivalent de HVT plus SB-1 de sérotype II. Finalement, la souche CVI988/Rispens atténuée de MDV sérotype 7 a été utilisée dans le monde entier, bien qu'il ait été identifié que la souche CVI988/Rispens soit une souche atténuée présentant une certaine tumorigénicité avant que son utilisation soit autorisée aux USA au milieu des années 1990. Selon une étude épidémiologique, les MDV faiblement pathogènes (mMDV) étaient les principales souches sauvages que l'on trouvait dans les élevages de poulets, puis les MDV virulents (vMDV) sont devenus les principales sources sauvages. Ces 20 dernières années, des MDV très virulents (vvMDV) ont à nouveau remplacé les vMDV et sont devenus les principales souches sauvages. Des MDV très virulents plus (vv+MDV) sont même apparus dans certaines zones des USA il y a 10 ans (Witter RL. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates. Avian Diseases, 1997, 41 (1) . 149-163.). Depuis de nombreuses années, les scientifiques ont sélectionné diverses souches de MDV comme candidat pour l'élaboration d'un vaccin afin d'améliorer l'efficacité des vaccins de diverses manières, mais ces tentatives n'ont pas abouti. Par exemple, Witter et Kreager ont comparé 10 nouvelles souches candidates pour l'élaboration d'un vaccin en raison de leur efficacité protectrice contre la MD, mais aucune d'entre elles n'était meilleure que la souche CV1988/Rispens (Witter RL et Kreager KS. Serotype 1 viruses modified by backpassage or insertional mutagenesis : Approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek' s disease. Avian Dis. 2004, 48 : 768-782.). Face è l'augmentation de la virulence et de la pathogénicité des MDV sauvages, il semble qu'il n'y ait aucun espoir d'améliorer l'efficacité protectrice des vaccins au moyen des technologies traditionnelles ou classiques. Cependant, il est possible que la virulence des souches sauvages de MDV augmente encore ces prochaines années si l'on se base sur l'évolution de la virulence des MDV depuis 40 ans. Ces dernières années en Chine, il est apparu une augmentation de la mortalité par tumeur dans certains élevages de poulets vaccinés avec le CV1988/Rispens. Bien qu'il n'ait pas été confirmé la présence de souches sauvages vv+MDV en Chine, la mutation du MDV a été rapportée. Par exemple, les investigateurs ont isolé et identifié une souche sauvage GX0101 de MDV dont la virulence n'est pas supérieure à celle de la souche Md5 de vvMDV, mais dont la capacité de transmission horizontale est bien plus élevée que celle de la souche Md5 (Xu X. et al., Acta Microbioloogica Sinica, 2009, 49 : 590-543 ; Cui Z et al., Virus Genes, 2009). Il semble qu'il soit nécessaire de développer un vaccin plus efficace contre la MD au moyen de nouveaux procédés avant qu'une nouvelle souche sauvage plus virulente, capable de passer à travers la protection conférée par CV1988/Rispens, commence à se propager dans les élevages de poulets. Les investigateurs ont cloné la totalité du génome de GX0101 dans un vecteur de chromosome bactérien artificiel (BAC) et ont construit le clone infectieux GX0101-BAC. La transfection de cellules CEF avec l'ADN de GX0101-BAC a permis d'obtenir le virus MDV recombinant bac-GX0101 (Sun et al., Chinese Science Bulletin, 2009, 54 : 2641-2647). Ensuite, deux gènes meq du MDV bac-GX0101 ont été supprimés comme suit : en utilisant comme matrice le plasmide pKD13, FRT-gène kanr de résistance à la kanamycine a été amplifié par PCR. Pour remplacer les gènes meq dans le génome de la souche GX0101 de MDV par le gène kanr, les extrémités 5' des amorces sens et antisens servant à amplifier le FRT-gène kanr contiennent respectivement un fragment homologue à la séquence de 50 pb se trouvant devant et derrière le gène meq. Les séquences des fragments des deux amorces étaient les suivantes : ..meq-F, séquence ID NO. 1 : 5'-AGAAACATGGGGCATAGACGATGTGCTGCTGAGAGTCACAATGCGGATCAcg tgtaggctggagctgcttc-3' ; ^meq-R, séquence ID NO. 2 : 5'-CTTGCAGGTGTATACCAGGGAGAAGGCGGGCACGGTACAGGTGTAAAGAGca ttccggggatccgtcgac-3' (les lettres en majuscule indiquent les séquences homologues de 50 pb se trouvant devant et derrière le gène meq, les lettres en minuscule indiquent les séquences provenant de la cassette FRT-gène kanr) . Le système réactionnel et les conditions utilisés pour amplifier la cassette FRT-gène kan'~ étaient : 2,5 pl. de tampon 10X, 1 pl de matrice pKD13 (environ 100 ng/pl), 2 pl de me (15 mmol/l), 2 pl de dNTP (2,5 mmol/l), 1 pl de chacune des amorces sens et antisens (25 pmol/pl), 0,1 pl d'enzyme Taq (5 U/pl), eau distillée deux fois ajoutée jusqu'à 25 pl. Condition PCR : 95 °C pendant 10 minutes, puis 95 °C pendant 1 minute, 55 °C pendant 1 minute, 72 °C pendant 1 minute, 30 cycles ; finalement, extension à 72 °C pendant 10 minutes. Les produits PCR ont été identifiés par électrophorèse sur gel. Dans la cassette FRT-gène kan' de pDK13, il existe des cibles de reconnaissance flp (FRT) aux deux extrémités de kant. La recombinase flp reconnaît le FRT de 34 pb et coupe spécifiquement la séquence d'ADN entre les deux sites de FRT. Le produit PCR a été digéré avec l'enzyme DpnI pendant 1 heure pour éliminer la matrice plasmidique circulaire pDK13. Le produit PCR digéré a été introduit dans E. cou FL250 transformé par GX0101-BAC par électroporation à 1800 V/100 Q/25 pF (Sun et a1., 2009, Chinese Science Bulletin. 54 : 2641-2647). Après l'électroporation, la réaction a été remise en suspension dans 1 ml de milieu LB et cultivée pendant 2 heures à 32 °C, puis 100 ml de culture bactérienne ont été mis sur une plaque LB contenant de la kanamycine. 16 heures plus tard, des colonies individuelles ont été indépendamment prélevées et identifiées par PCR pour déterminer si le gène meq avait été remplacé par le gène kanr (Schumacher, D., B. K. Tischer, W. Fuchs, et N. Osterrieder. 2000. Reconstitution of Marek' s disease virus serotype 1 (MDV-1) from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-1 mutant. J. Virol. 74 : 11088-11098). Une des colonies parmi les colonies individuelles identifiées dans lesquelles le gène meq a été remplacé par le gène kanr a été inoculée dans un milieu LB et soumise à une incubation avec secouage pendant une nuit à 32 °C. Quand la valeur de la DO a atteint environ 0,5, une solution d'arabinose à 10 % a été ajoutée à la culture bactérienne et l'incubation a été poursuivie pendant une heure pour induire l'expression de la recombinase flp et le gène de résistance à la kanamycine a été coupé. Les bactéries obtenues ont été mises sur des plaques de gélose LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol ou de gélose LB contenant à la fois du chloramphénicol et de la kanamycine pour confirmer que la colonie individuelle n'était plus du tout résistante à la kanamycine. Après la confirmation de la délétion du premier gène meq, ce protocole a été répété pour supprimer la seconde copie de Meq contenue dans GX0101-BAC. Le clone plasmidique infectieux obtenu a été appelé GX010làmeq-BAC, et le virus récupéré à partir des cellules CEF transfectées par l'ADN plasmidique de GXO101Ameq-BAC a été appelé GX01010meq. Pendant le procédé de délétion du second meq, un autre gène kanr a été introduit dans le clone plasmidique infectieux recombinant. Comme il n'est pas autorisé d'utiliser des virus contenant le gène kanr comme vaccin vivant conformément à la réglementation sur la biosécurité des produits biologiques, le gène kanr se trouvant dans le plasmide doit également être supprimé avant d'utiliser le virus comme candidat pour l'élaboration d'un vaccin. L'objet de la présente invention est de proposer une construction de génome viral d'un virus recombinant de la maladie de Marek, ladite construction de génome contenant les fragments suivants en tant que marqueurs d'identification de celle-ci : (1) deux fragments de 34 pb possédant la séquence ID No. 5, résultant de la délétion du gène Meq des deux sites originaux contenant le gène Meq ; (2) un fragment d'environ 539 pb de la répétition terminale longue du virus de la réticuloendothéliose (RPV-LTR) possédant la séquence ID No. 6, inséré à environ 370 pb en amont du site de jonction US/TRS dans le génome viral. Un autre objet de l'invention est de proposer une souche vaccinale SC9-1 ou SC9-2 de virus recombinant de la maladie de Marek comprenant ladite construction de génome. La souche SC9-1 de MDV a été déposée au centre 30 général de collecte des cultures microbiologiques de Chine le 3 décembre 2010, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 4399 ; et la souche SC9-2 de MDV a été déposée au centre général de collecte des cultures microbiologiques de Chine le 24 novembre 2011, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 5502. Un autre objet de l'invention est de proposer des fibroblastes d'embryon de poulet infectés par la souche SC9-1 ou SC9-2 de MDV recombinant mentionnée ci-dessus. Un autre objet de l'invention est de proposer un vaccin contre le virus de la maladie de Marek, contenant la construction de génome de virus recombinant de la maladie de Marek de la présente invention. Un autre objet de l'invention est de proposer un vaccin contre le virus de la maladie de Marek, contenant la souche vaccinale recombinante SC9-1 ou SC9-2 de la maladie de Marek de la présente invention. Le vaccin contre le virus de la maladie de Marek contient les fibroblastes d'embryon de poulet infectés par SC9-1 ou SC9-2 de la présente invention. Un autre objet de l'invention est de proposer l'utilisation de la construction de génome de virus recombinant de la maladie de Marek, de la souche vaccinale SC9-1 ou SC9-2 de virus de la maladie de Marek et des fibroblastes d'embryon de poulet infectés par SC9-1 ou SC9-2 de la présente invention, dans la préparation de vaccins contre le virus de la maladie de Marek. L'invention concerne également un procédé de prévention de la maladie de Marek chez les poulets, dans lequel les poulets reçoivent des doses efficaces d'un point de vue prophylactique de vaccins contre le virus la maladie de Marek contenant la construction de génome de virus recombinant de la maladie de Marek, la souche vaccinale SC9-1 ou SC9-2 de virus de la maladie de Marek et les fibroblastes d'embryon de poulet infectés par SC9-1 ou SC9-2. L'invention concerne en outre un procédé de préparation d'une construction de génome viral d'un virus recombinant de la maladie de Marek, ce procédé comprenant les étapes suivantes la délétion des premiers gènes Kant au moyen d'un procédé classique utilisant l'enzyme flp la délétion du second gène Kano par digestion partielle avec l'enzyme flp et criblage négatif de la résistance à la kanamycine, pour obtenir un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-1 ; et l'élimination des gènes parents du vecteur BAC, insérés lors de la construction originale des clones BAC, contenus dans un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC--Kana-Sv-Cre-US2, qui est capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-2. Dans le procédé, lesdits gènes parents comprennent 25 le gène de résistance au chloramphénicol et le facteur mini-F. En d'autres termes, l'induction incomplète de l'expression de la recombinase flp pour la digestion partielle des 3 sites FRT est utilisée pour supprimer 30 le gène kali!' en remplacement du second gène meq dans le clone plasmidique GX0101-BAC ; un clone plasmidique GX0101-BAC ne contenant ni de gène meq ni de gène kanr pour récupérer un dérivé GX0101 en tant que candidat pour élaborer un vaccin est détecté par comparaison de colonies sur des plaques de gélose LB avec ou sans kanamycine. Comme résultat, un virus MDV SC9-1 à gène meq supprimé ne contenant pas de gène kanr par rapport à la souche sauvage pathogène GXO101 de MVD d'origine est obtenu et il est confirmé que SC9-1 est un bon candidat pour élaborer un vaccin. Une souche virale SC9-2 de MDV est également obtenue par la suppression supplémentaire de la majeure partie de la séquence de base du plasmide BAC contenant le gène du chloramphénicol (CMr). Deux gènes meq sont supprimés dans la construction de génome de l'invention au moyen de la cassette flpkanr, puis les deux gènes kanr sont également supprimés, la délétion du premier gène kan` étant réalisée selon un procédé classique utilisant l'enzyme flp et le second gène kanr est supprimé par digestion partielle avec l'enzyme flp et criblage négatif de la résistance à la kanamycine, pour obtenir un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC (figure 1) capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-1 ; puis les gènes parents du vecteur BAC insérés lors de la construction d'origine des clones BAC, tels que le gène de résistance au chloramphénicol et le facteur mini-F, sont ensuite éliminés d'un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 (figure 2), qui est capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-2. L'invention présente les effets techniques suivants . 1. la résolution réussie d'un problème technique lié à la délétion du gène kanr par digestion de FRT par la recombinase fl.p quand il existe 3 sites FRT dans le plasmide pGX0101àMeq-BAC après le double remplacement des gènes meq par le gène kanr flanqué de 2 séquences FRT ; 2. les souches SC9-1 et SC9-2 de MDV peuvent être utilisées pour préparer des vaccins destinés à prévenir chez les poulets une maladie de Marek induite par les virus vvMDV ou les virus émergents vv+MDV et conférer une meilleure immunité protectrice que CV1988/Rispens, qui est le plus communément utilisé dans le marché global ; 3. en tant que virus parent primaire de SC9-1 et SC9-2, GX0101 est un MDV recombinant naturel contenant un insert de LTR provenant du virus de la réticuloendothéli_ose et est moins pathogène que vvMDV Md5, le virus parent de rMdMmeq. Bien que rMd5Ameq induise une bonne immunité protectrice et n'induise pas de tumeurs, il s'avère que ses effets immunosuppresseurs sont importants dans ses faibles passages et il ne peut pas être utilisé comme candidat pour élaborer un vaccin commercial. Les souches SC9-1. (SC90MegAKanr) et SC9-2 (SC9àmegàKanràCMr) peuvent conférer une bonne immunité protectrice identique à celle conférée par rMd5àmeq sans induire de tumeurs et d'immunosuppression, c'est pourquoi elles pourraient être utilisées comme candidats pour l'élaboration d'un vaccin commercial ; 4. en tant que virus parent primaire de SC9-1 et SC9-2, GX0101 est un MDV recombinant naturel contenant un insert de LTR provenant du virus de la réticulo- endothéliose et est moins pathogène que vvMDV Md5, le virus parent de rMd5émeq, mais sa capacité de transmission horizontale est supérieure à celle de Md5. On s'attend à ce que SC9-1 et SC9-2 présentent une capacité de transmission horizontale supérieure à celle de rMd5omeq. Dans les élevages de poulets de grande taille, un grand nombre de poulets doit être vacciné en un temps limité, il est donc inévitable que certains oiseaux ne reçoivent pas la vaccination. Une capacité de transmission horizontale plus élevée peut favoriser la vaccination naturelle des poulets non vaccinés par contact avec les oiseaux vaccinés, et cela diminuera un éventuel échec de la vaccination à cause de poulets n'ayant pas reçu la vaccination. Par conséquent, l'invention concerne la construction et l'utilisation des souches SC9-1 et SC9-2 de MDV recombinant. Le procédé de construction de l'invention comprend la délétion du gène kanr par digestion de PRT avec la recombinase flp quand il existe 3 sites FRT dans le même génome viral après le double remplacement des gènes meq par le gène kanr flanqué de 2 fragments FRT. Les souches SC9-1 et SC9-2 de MDV recombinant résultantes peuvent être utilisées pour préparer des vaccins afin de produire un vaccin vivant protégeant contre le MDV et de prévenir chez les poulets des maladies de Marek induites par les virus vvMDV ou les virus émergents vv+MDV, lesquelles confèrent une meilleure immunité protectrice que la souche vaccinale CVI988/Ri.spens la plus communément utilisée dans le marché global. En outre, elles n'induisent ni tumeurs ni immunosuppression, ce qui les .2 rend davantage appropriées pour être utilisées comme vaccin. La figure 1 représente le schéma de structure du plasmide BAC recombinant qui a été utilisé pour transfecter les cellules CEF afin d'obtenir la souche SC9-1 de MDV (SC9ôMegAKan), dans lequel 2 meq indique que le gène meq au niveau de ce site e été supprimé. Dans ce plasmide, il existe encore des séquences issues du vecteur BAC, notamment les séquences du gène CMr de résistance au chloramphénicol, du gène gpt et de mini-F. La figure 2 représente le schéma de structure du plasmide recombinant pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 qui a été utilisé pour construire la souche SC9-2 ne contenant plus les séquences du vecteur BAC. Par rapport à pSC9-BAC, la séquence du gène Kana-SV-cre est insérée sur le côté droit de mini-F, dans laquelle le gène SV-Cre exprime un type d'enzyme de restriction quand l'ADN plasmidique transfecte une cellule eucaryote, telle que des cellules CEF. Ce produit du gène SV--Cre peut reconnaître 2 sites loxP, puis supprimer la séquence entière du vecteur BAC se trouvant entre les sites. La figure 3 représente une partie de la structure génomique de la souche SC9-2, dans laquelle la séquence du vecteur BAC (comprenant le gène CMr) entre les sites Sorti et Us2 d'origine du génome de MDV a été supprimée, un seul site loxP étant encore présent. L'induction incomplète de l'expression de la recombinase flp pour la digestion partielle de 3 sites FRT a été utilisée pour supprimer le gène kans, ce qui a entraîné le remplacement du second gène meq dans le .3 clone plasmidique GX0101 BAC ; un clone plasmidique GX0101-BAC ne contenant ni de gène meq ni de gène kan' pour récupérer un dérivé GX0101 en tant que candidat pour élaborer un vaccin a été détecté par comparaison de colonies sur des plaques de gélose LB avec ou sans kanamycine. Dans des études précédemment publiées (Li Y. Biological Characteristics of a meq-deleted Marek's Disease Virus and Its Immune Bffects. Thèse de doctorat, 2010, Chinese Academy of Agricultural. ; Yanpeng Li, Aijun Sun, Shuai Su, Peng Zhao, Zhizhong Cui, Hongfei Zhu, Deletion of the Meq Bene significantly decreases immunosuppression in chickens caused by pathogenic Marek's disease virus. Virology Journal 2011, 8 : 2), le clone plasmidique BAC recombinant pGX010l meq-BAC ayant 2 gènes meq supprimés a été construit à partir du GX0101-BAC d'origine. Après le remplacement d'un gène meq par la cassette ERT-kan, la colonie détectée a été inoculée dans un milieu LB liquide et cultivée sous secouage. Quand la DO de la culture a atteint 0,5, une solution d'arabinose à 10 % a été ajoutée à la culture bactérienne jusqu'à une concentration finale de 0,1 % d'arabinose, puis la culture a été soumise à une incubation pendant une heure supplémentaire afin d'induire l'expression de la recombinase fip pour couper le gène de résistance à la kanamycine. La culture bactérienne induite a été placée sur des plaques de gélose LB contenant 30 pg/m1. de chloramphénicol ou de gélose LB contenant 50 pg/m1. kanamycine. Si des colonies se développaient sur une plaque contenant du chloramphénicol et non sur une plaque contenant de la kanamycine, cela indiquait que les colonies induites contenaient encore le gène de résistance au chloramphénicol et aucun gène kanr. Une telle colonie bactérienne a été choisie pour effectuer ensuite une construction par recombinaison. Cependant, la colonie qui a été sélectionnée et son plasmide contiennent encore une cible de reconnaissance de la recombinase flp (FR'1') au niveau du site où le premier gène meq était localisé. Ce protocole a été répété pour supprimer la seconde copie de Meq contenue dans pGX010l-BAC. Le clone piasmidique infectieux obtenu a été appelé pGX0101êmeq-BAC, lequel contenait à nouveau un gène kanr et contenait 3 FRT, l'un d'entre eux provenant de la délétion du premier meq. Bien que la même technique d'induction avec de l'arabinose puisse être utilisée pour induire et activer totalement la recombinase flp pour la délétion du gène kanr, une certaine partie du génome de MDV pourrait être supprimée par coupure et aucun virus ne pourrait être récupéré. Lors de la construction des clones GX0101-BAC à meq supprimé, 12 colonies appelées pSCAMeq-BACI à pSCÊMeq-BAC12 ont été obtenues, toutes ne contenant plus les deux gènes meq qui avaient été supprimés, mais contenant un gène kan'. L'ADN a été préparé par culture sur grande échelle de chacune de ces colonies et utilisé pour la transfection de cellules CFF. Quand les cellules ont formé les plaques caractéristiques de MDV, les virus récupérés ont été obtenus et appelés SClAMeq à SC12àMeq. Leur capacité de réplication dans les cellules CEF a été comparée. Le virus récupéré à partir du plasmide pSCAMeq-BAC9 formait davantage de plaques et cela plus rapidement que les autres clones. Ensuite, le plasmide pSCAMeq---BACS a été utilisé pour la délétion ultérieure du gène kanr. En raison de la présence de 3 sites FRT sur le plasmide pSCL Meq-BAC9, il est conçu un nouveau procédé comprenant en combinaison « l'induction incomplète de l'expression de la recombinase flp, la digestion partielle de FRT et un criblage sur deux plaques » pour la délétion du gène kanr dans le plasmide pSCQMeq-BAC9. Selon ce procédé, seulement deux des trois sites FRT sont soumis à une digestion par la recombinase flp dans une partie des molécules du plasmide pSCAmeq-BAC. Si seulement les deux sites FRT flanquant le gène kanr sont digérés, alors le gène kanr est seulement supprimé par digestion avec la recombinase flp et l'autre site FRT n'est pas touché, le génome de MDV associé étant ainsi totalement conservé. La procédure qui a permis cela est présentée ci- dessous : la souche EL250 d'E. coll. transformée avec pSCAMeq-BAC9 a été inoculée dans un milieu LB liquide et cultivée sous secouage. Quand la culture a atteint une DO de 0,5, une solution d'arabinose à 5 % a été ajoutée à la culture (1 : 100 en volume/volume) jusqu'à la concentration finale en arabinose de 0,05 % (par rapport à l'induction totale où la concentration finale était de 10 %) et l'induction a été réalisée pendant 40 minutes (par rapport à l'induction totale de 60 minutes). Cela a entraîné seulement une induction incomplète de l'expression de la recombinase flp et la digestion partielle des sites FRT sur les molécules de pSCAMeq--BACS. Grâce au procédé, seulement 2 sites FRT flanquant le gène kanr ont été soumis à la digestion et le gène kanr a été supprimé tandis que le génome de MDV n'a pas été touché. Après (.'induction avec l'arabinose, la culture bactérienne a été mise sur une plaque de gélose LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol et soumise à une incubation pendant une nuit à 32 °C. Les colonies individuelles présentant une résistance au chloramphénicol ont été mises séparément sur deux plaques de gélose LB, l'une contenant seulement 30 pg/ml de chloramphénicol (A), l'autre contenant à la fois 30 pg/ml de chloramphénicol et 50 pg/ml de kanamycine (B). Les deux plaques ont été numérotées sur leur partie inférieure externe, une colonie identique sur les deux plaques ayant le même numéro. Les colonies se développant sur la plaque A et non sur la plaque B ont été sélectionnées en tant que colonies contenant potentiellement le génome intact de MDV et aucun gène kanr. Elles ont été inoculées sur des plaques de gélose LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol et cultivées pendant une nuit à 32 °C. Ces colonies ont été prélevées et inoculées séparément dans un milieu LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol et soumises à une incubation pendant une nuit à 32 °C. Pour déterminer si les colonies étaient les bonnes, l'ADN génomique a été extrait de récoltes bactériennes provenant de chaque colonie, et une PCR a été menée avec des amorces spécifiques du gène kanr et du gène pp38 de MDV (pp38-F, 5'-AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG, séquence ID. NO. 3 et pp38-R, 5'-ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA, séquence ID NO. 4). Les colonies positives à pp38 de MDV, mais négatives au gène kanr, lors de la PCR ont été sélectionnées pour la préparation de l'ADN du clone BAC. Chaque colonie sélectionnée a été inoculée dans un bouillon LB contenant 30 dag/ml de chloramphénicol dans 500 ml. L'ADN plasmidique purifié du clone BAC a été préparé avec le kit plasmid Maxi (QIAGEN). Le plasmide qui a été utilisé avec succès pour la transfection des fibroblastes d'embryon de poulet afin de produire la souche SC9-1 a été appelé pSC9-BAC (figure 1). Après une vérification supplémentaire de la structure de leur génome par PCR, chaque ADN de clone BAC a été transfecté séparément dans des cellules CEE'. Les plaques typiques de MDV indiquaient la récupération du MDV recombinants. L'un des virus récupérés, pour lequel il avait été confirmé qu'il ne contenait ni gène meq ni gène kanr, e été appelé MDV SC98MegoKan' (désigné par SC9-1) et envisagé comme candidat potentiel pour élaborer un vaccin, La souche SC9-1 e été déposée au centre général de collecte des cultures microbiologiques de Chine, dans le Bacterial reference lab, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Pékin, le 3 décembre 2010, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 4399. Comme la réglementation liée à la biosécurité pour les produits génétiques recombinants en ce qui concerne les gènes de résistance aux antibiotiques est différente selon les pays, la souche SC9-2 à gène CM'' supprimé e également été construite tandis que la souche SC9-1 était construite. Selon un procédé précédemment décrit (Zhao et al., Self-excision of the BAC sequences from the recombinant Marek's disease virus genome increases replication and pathogenicity, Virology Journal, 2008, 5 : 19), un vecteur plasmidique transgénique recombinant pPartial-F-Kan-Cre-US2-US3 a été tout d'abord construit. Il contient une cassette kanr et SV-cre flanquée d'un fragment partiel mini-F provenant d'un vecteur BAC et une zone de jonction US2-US3 de MDV CX0101. La souche 5.L250 d' E. cou a été co- transformée à la fois avec les ADN de pPar.tial.-F-Kan-Cre-US2-US3 et de pSC9-BAC, puis mise sur des plaques LB contenant à la fois de la kanamycine et du chloramphénicol pour trouver des colonies résistant à la kanamycine. Le plasmide provenant des colonies criblées a été appelé pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 et amplifié sur grande échelle. L'ADN de pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 a été préparé et purifié avec des colonnes de purification d'ADN plasmidique. Des monocouches de cellules CEF ont été transfectées avec l'ADN de pSC9- BAC-Kana--Sv-Cre---032. Les cellules CEF transfectées ont été mises en suspension et remises en culture tous les 3 à 5 jours. Les plaques de MDV ont été vérifiées. Comme le promoteur SV40 de la cassette SV-cre est un promoteur eucaryotique, il active automatiquement l'expression du gène cre, et l'enzyme produit par le gène est capable de digérer deux sites loxP sur le génome viral et d'exciser le gène CMr et mini-F se trouvant entre les deux sites loxP, pour donner des virus SC9-2 à CMr supprimé, comme indiqué sur la figure 3. La majeure partie de la séquence d'ADN du squelette BAC contenant le gène CM', contenue dans la souche SC9-2 résultante, a été supprimée. Pour augmenter progressivement le taux de SC9-2 par rapport aux virus d'origine dans les cellules CEF après la transfection, des cellules CEF transfectées avec l'ADN plasmidique pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 présentant des plaques appropriées ont été soumises à des passages continus. Après 8 passages, il a été confirmé par analyse PCR que la majeure partie des plaques était induite par la souche SC9-2 à CM' supprimé, mais il existait encore certaines plaques virales contenant le vecteur BAC et le gène CM'. Selon un procédé par dilution limitée, des cellules CEF infectées par MDV et diluées ont été mises sur des plaques à 96 puits. Dans les puits, les cellules CEF formant seulement une plaque sous le microscope ont été digérées 7 jours après l'incubation et remises sur des plaques à 6 puits avec des monocouches normales de CEF une par une. Quand les plaques sont apparues, les cellules CEP ont été digérées et mises en suspension. Une partie a été utilisée pour effectuer une remise su.r plaque, et l'autre partie a été utilisée pour effectuer une analyse PCR enfin de confirmer la présence de la souche SC9-2 à CM" supprimé. Ce cycle a été répété une fois pour garantir la pureté du stock viral SC9-2. La souche SC9-2 a été déposée au centre général de collecte des cultures microbiologiques de Chine, dans le Bacterial reference lab, Institute of M.ic.r..ob.iology, Chinese Academy of Science, Pékin, le 24 novembre 2011, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 5502.30 Caractéristiques différentielles des souches SC9--1 et SC9-2 dérivant de la souche sauvage de MDV GX0101 dans _ ai laquelle deux gènes meq sont supprimés Il existe 3 fragments spécifiques, au niveau de 3 5 sites spécifiques dans le génome viral, pouvant être utilisés comme marqueurs d'identification : (1) deux fragments de 34 pb possédant la séquence ID No. 5, résultant de la délétion du gène Meq des deux sites originaux contenant le gène Meq ; 10 (2) un fragment d'environ 539 pb de la répétition terminale longue du virus de la réticuloendothéliose (REV-LTR) possédant la séquence ID No. 6, inséré à environ 370 pb en amont du site de jonction US/TRS dans le génome viral. 15 Différence entre SC9-1. et SC9-2 : il existe un gène CMr et une séquence mini-F dans SC9-1, mais aucun de ces fragments n'existe dans SC9---2. Pathogens_cite et immunité protectrice de SC9-1 20 (SC9AMegAKan'') et de SC9-2 (SC9AMegAKanrâCM'') chez les poulets Dans des études précédemment publiées, il est indiqué que GX01010meq ne présente aucune pathogénicité et induit une protection efficace à 100 % contre une 25 provocation avec un vvMDV chez les poulets (Su S, Li Y, Sun A, Cui Z, Acta Mi.crologica Sinica, 2010, 50 : 380--386). Comme GX010lâmeq contient le gène kanr, son utilisation comme vaccin vivant est interdite. La présente innovation utilise la souche SC9-1 et la 30 souche SC9-2 en dérivant comme nouveau virus vaccinal candidat, dans lequel non seulement 2 gènes meq et également le gène kanr sont supprimés. Des expériences sur des oiseaux similaires à celles réalisées avec GX0101âmeq (Su S, Li Y, Sun A, Cui Z, Acta Micrologica Sinica, 2010, 50 : 380-386), avec le même procédé et les mêmes conditions, ont été effectuées avec la souche SC9-1 (SC9àMegAKanr) et la souche SC9-2 (SC9AMegàKanràCMI) sur des poulets SPF. Exemple de test : 240 poulets SPF âgés de 1 jour ont été divisés en 8 groupes (30 oiseaux par groupe) et maintenus dans les isolateurs SPF avec une filtration d'air positive. Les groupes 1 à 4 ont reçu dans l'abdomen respectivement 2000 pfu/oiseau de GX0101àmeq, de SC9-1, de SC9-2 et de souche vaccinale CV1988/Rispens. Le groupe 5 a été utilisé comme témoin de provocation et le groupe 6 a été utilisé comme témoin d'oiseaux normaux en bonne santé. Les groupes 7 et 8 ont reçu 2000 pfu/oiseau de SC9-1. ou de SC9-2 pour effectuer une étude de pathogénicité. A l'âge de 6 jours, tous les oiseaux des groupes 1 à 5 ont été provoqués avec la souche Md5 de vvMDV avec 1000 pfu par oiseau. Les vitesses de croissance et les conditions cliniques ont été observées chaque semaine après la provocation. Pendant la période de l'expérience, chaque oiseau mort a été autopsié, et des échantillons de tissus d'organes présentant des lésions susceptibles d'avoir été provoquées par une MD ont été collectés pour obtenir des sections dans la paraffine, colorée par H.E. et observés au microscope pour réaliser une hist.opathologie. Quatre-vingt-dix jours après la provocation, tous les oiseaux ont été tués de manière humaine pour effectuer une autopsie, les lésions ont été vérifiées avec soin pour chaque oiseau et des échantillons de tissus de coeur, de rate et de foie de 5 oiseaux de chaque groupe ont été collectés et fixés avec une solution de formaline à 10 % pour effectuer des études d'histopathologie. Les échantillons ont été stockés à 4 °C, traités pour obtenir des sections dans la paraffine, colorés par H.E. et observés pour l' hi. stopatholog ie . Les résultats obtenus à partir des expériences réalisées sur les oiseaux ont montré que les souches SC9-1 et SC9-2 de MDV ne sont pas pathogènes pour les poulets SPF et qu'elles confèrent une bonne immunité protectrice contre la souche Md5 de vvMDV (tableau 1). Comme on peut le voir dans le tableau 1, la souche SC9-1 à gène kali' supprimé présente des caractéristiques biologiques pratiquement identiques à celles de son virus parent GX0101Ameq en ce qui. concerne leur pathogénicité et l'immunité protectrice chez les poulets. En outre, SC9-1 peut être un candidat pour élaborer un vaccin après la suppression du gène kan'. La souche SC9-2 ne contenant plus kanr et CM' est identique à SC9-1 en ce qui concerne toutes ces caractéristiques. Tableau 1. Comparaison des souches SC9--1 et SC9-2 de MDV à d'autres virus vaccinaux en ce qui concerne leur pathogénicité et l'immunité protectrice chez les 30 poulets SPF -- --- Taux Provocation indice de immunisation de avec (dans Mortalité protection (dans l'abdomen) tumeur l'abdomen) MD (%) Virus Dose Dose vvMDV (%) (%)* vaccinal (pfu) (pfu) 0/30 GX0101Lmeq 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) 0/30 SC9-1 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) 0/30 SC9-2 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) C V 19 0 0/ 2000 rMd5 --- ------ 4/30 87 1000 3/30 (10) Rispens (13) Témoin de 25/30 29/30 provo- - rMd5 1000 cation (83) (97) Témoin - - 0/30 (0) 0/30 négatif (0) 0/30 SC9-1 2000 - - 0/30 (0) - (0) ~ _ -- 0/30 SC9-2 2000 - - 0/30 (0) - (0) *Note : les poulets SPF de 1 jour des groupes 1 à 4 ont reçu dans l'abdomen pour la vaccination respectivement 2000 pfu de GX01018meq, de SC9-1, de SC9-2 et de CVI988/Rispens. A l'âge de 5 jours, les oiseaux ont reçu 1000 pfu de vvMDV rMd5. Tous les oiseaux ont été conservés et observés cliniquement pendant 13 semaines pour déterminer le taux de mortalité. Chaque oiseau mort a été autopsié, et des sections de tissus ont été observées pour trouver des lésions cancéreuses. A la fin des 13 semaines après la provocation, tous les oiseaux ont été tués de manière humaine pour effectuer une autopsie, et les lésions cancéreuses ont été observées et enregistrées. Les taux de tumeur MD rapportés dans le tableau sont le nombre total d'oiseaux morts ayant des tumeurs, ou d'oiseaux ayant des signes cliniques ou d'oiseaux présentant des tumeurs denses lors de l'autopsie réalisée à la fin des expériences. L'indice de protection a été calculé sur la base de la prévention des signes cliniques de MD et de décès. Les souches SC9-1 et SC9-2 ne présentent pas d'effet tumorigène ou immunosuppresseur sur les poulets Des expériences réalisées sur des poulets SPF ont montré que le virus d'origine cloné par BAC bac-GX01.01 induit un retard de croissance et une atrophie du thymus et des bourses de Fabricius. Les poids corporels et les proportions entre le thymus ou les bourses et le poids corporel étaient bien inférieurs chez les oiseaux provoqués par bac-GX0101 que chez les témoins (p 0,05). Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.