Brevet FR2969488A1 — publié le 20120629

UTILISATION DE HYLURONATE DE CALCIUM POUR L'HYDRATATION CUTANEE DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte à l'utilisation cosmétique de hyaluronate de calcium, à une composition cosmétique comprenant du hyaluronate de calcium, ainsi qu'à un procédé cosmétique mettant en oeuvre du hyaluronate de calcium. La présente invention trouve ses applications dans le domaine de la cosmétique. Le taux d'hydratation cutanée s'exprime en surface, mais c'est en profondeur que tout commence. Avant d'arriver dans les couches superficielles de l'épiderme, l'eau suit un circuit bien établi. Ce cheminement fait intervenir de nombreuses structures et mécanismes. Il prend naissance dans les couches profondes de la peau puisque l'eau transite depuis le flux sanguin jusqu'à la surface de la peau à travers le derme et l'épiderme puis s'évapore de façon imperceptible (perte insensible en eau ou PIE). L'eau en provenance de la circulation sanguine est tout d'abord stockée dans le derme qui représente le véritable réservoir en eau de la peau avec presque 70 % de l'eau totale. L'eau joue également un rôle au niveau du derme en améliorant ses qualités de résistance à la traction et à la compression. L'eau est captée et stockée grâce à des polymères, protéoglycanes et glycosaminoglycanes (acide hyaluronique ou hyaluronate, chondroitine sulfate, dermatane sulfate). Ces polymères fixent d'importantes quantités d'eau et assurent la turgescence des tissus et l'hydratation continue de la peau. Malgré la grande capacité de ces molécules à capter l'eau, une partie de celle-ci demeure mobilisable et diffuse vers l'épiderme dont la partie la plus superficielle va réellement jouer un rôle de barrière. Entre le derme très hydraté et l'épiderme, un gradient décroissant existe. Au niveau de l'épiderme, ce gradient est encore plus marqué entre les couches les plus profondes et les couches les plus superficielles. En particulier, si toutes les couches vivantes de l'épiderme présentent un taux d'hydratation élevé, la chute du gradient hydrique est abrupte à partir de la transition stratum granulosum et stratum corneum. A ce niveau le taux de 300/0 d'hydratation chute encore de moitié dans le stratum corneum jusqu'à atteindre 150/0 au niveau des couches les plus superficielles. Au-delà de ce gradient hydrique, la mise en place d'autres gradients physiologiques permet aux cellules épidermiques d'exercer leurs fonctions spécifiques. C'est en particulier le cas du gradient de pH passant du pH neutre (7,4) dans les couches vitales à plutôt acide à la surface cutanée (environ 5,5). Ces mouvements d'eaux et de solutés sont accompagnés de mouvements cellulaires qui participent eux aussi à la mise en place de l'homéostasie cutanée. Ceux-ci sont le fruit d'un programme de différenciation cellulaire des couches basales prolifératives, source de renouvellement épidermique, à la couche cornée, jusqu'à l'étape ultime de desquamation. L'eau «capturée» au niveau de la couche cornée est maintenue grâce à différents composés comme les FNH (Facteurs Naturels d'Hydratation), le ciment intercellulaire et le film hydrolipidique qui confèrent à la peau une cohésion indispensable à sa fonction. Tous les paramètres décrits précédemment correspondent à des conditions physiologiques non perturbées, assurées par une homéostasie régulée. En situation physiologique, la peau répond aux variations environnementales, notamment aux variations de température, d'humidité relative, aux ultraviolets, à la pollution, aux détergents, etc. Dans certains cas, la réponse adaptative de l'organisme est insuffisante ou dérégulée. C'est en particulier le cas des peaux « sèches ». Le phénotype « peau sèche » se caractérise par une peau rêche squameuse, de souplesse limitée avec une impression de tension au toucher. Pour les peaux âgées, ces symptômes sont accompagnés par des rougeurs, des fissures ou des démangeaisons. Des trois compartiments de la peau, c'est le derme qui se modifie le plus profondément durant les phénomènes de vieillissement, mais les autres compartiments ne sont pas épargnés. La nature et la quantité des composants du derme, notamment le collagène, l'élastine, les glycoprotéines et les protéoglycanes, régissent les propriétés mécaniques de la peau et sont à l'origine des modifications physiopathologiques les plus visibles du relief cutané observées au cours du vieillissement. Les fibres donnent à la peau solidité, résistance, élasticité et tonicité. Les glycoprotéines et protéoglycanes apportent le volume et participent à l'hydratation. Les protéoglycanes, macromolécules complexes de grande taille dispersées entre les fibres du tissu conjonctif dermique, assurent en grande partie la tonicité de la peau. En fait, la structure des glycosaminoglycanes (GAGs) confèrent aux protéoglycanes des charges négatives permettant de « piéger » les ions, l'eau et divers métabolites, contribuant ainsi principalement à l'hydratation de la peau et à la résistance aux forces de pression et d'étirement. En vieillissant, la peau se ride, se relâche, est moins hydratée et se répare plus difficilement. L'acide hyaluronique (AH) joue un rôle structural important du fait de ses propriétés hydrodynamiques uniques. En s'imbriquant dans le réseau de faisceaux de collagènes, ces structures supramoléculaires d'AH déterminent la forme et l'organisation architecturale des tissus. Ils leur confèrent des propriétés mécaniques, notamment amortisseur des cartilages et élasticité des vaisseaux sanguins, tout en contribuant au maintien de l'intégrité et l'hydratation de nombreux tissus comme la peau et le cerveau. Plus de 500/0 de l'AH de l'organisme est présent dans la peau. Il est cependant intéressant de noter que pratiquement la totalité d'AH a disparu de l'épiderme dans la peau sénile. Dans le derme, le niveau total d'AH reste relativement constant mais avec l'âge, sa qualité se modifie. La taille du polymère se réduit et il devient moins extractible. Ces altérations pourraient être responsables de la perte d'hydratation observée dans la peau sénescente. L'AH possède également un fort pouvoir hygroscopique et de grandes capacités rhéologiques. Il augmente le volume de la MEC par remplissage, en se liant à l'eau et aux électrolytes. La molécule clé de l'hydratation cutanée est donc l'AH, capable d'attirer et de fixer jusqu'à 1000 fois son poids moléculaire en eau. L'AH est également impliqué dans la circulation des nutriments, des hormones et des cellules. Il a un rôle essentiel dans la plasticité des tissus au niveau des espaces extracellulaires, ainsi que dans la mobilité cellulaire, la prolifération et l'organisation tissulaires. Au cours du vieillissement cutanée sa concentration diminue et sa qualité se dégrade contribuant à une détérioration de la qualité des tissus et des processus de réparation, se manifestant par un ralentissement de la cicatrisation des plaies, un dessèchement très important, une atrophie dermique et des vergetures. Par ailleurs, au cours de la ménopause, et avec la diminution de la progestérone et des oestrogènes, le taux d'AH baisse de façon considérable dans le derme. Tous ces éléments contribuent au phénomène de formation des rides. Avec le vieillissement, l'exposition aux polluants environnementaux et les rayons ultraviolets du soleil, les cellules perdent graduellement leur capacité à produire de l'acide hyaluronique. Des études montrent que la peau des personnes âgées contient des niveaux inférieurs d'acide hyaluronique à ceux des personnes plus jeunes. En vieillissant, notre tissu cutané se déshydrate et les fibres de collagène et d'élastine perdent leur structure. Cela entraîne une perte du volume de la peau et la formation de rides et de sillons faciaux, caractéristiques courantes d'une peau marquée par l'âge. De nombreuses expérimentations ont déjà été effectuées pour injecter de l'acide hyaluronique au niveau du derme afin de palier à la diminution de sa concentration et de sa qualité avec l'âge. L'acide hyaluronique disponible dans le commerce permet d'obtenir certains résultats de comblement et de réhydratation, mais ces résultats ne sont pas aussi satisfaisant que prévu. Le pouvoir hydratant de ces acides hyaluroniques est insuffisant. Il existe donc un réel besoin de trouver un produit alternatif présentant à la fois un pouvoir hydratant amélioré et permettant d'apporter une solution efficace aux problèmes précités de l'art antérieur, en particulier permettant la mise en place d'une réponse adaptative suffisante et régulée de la peau vis-à-vis des variations environnementales, notamment des variations de température, d'humidité relative, des ultraviolets, de la pollution, des détergents, etc.. EXPOSE DE L'INVENTION Les inventeurs de la présente sont les tout premiers à avoir mis en évidence que l'utilisation de hyaluronate de calcium dans des applications cosmétiques, à la place de l'acide hyaluronique utilisé dans l'art antérieur, permet précisément de fournir une solution aux problèmes et besoins précités de l'art antérieur. Les données expérimentales montrent en effet de manière inattendue que le hyaluronate de calcium induit une augmentation significative des glycosaminoglycanes acides (GAGs acides) au niveau dermique et épidermique et une nette densification du réseau dermique, de la matrice extracellulaire et des espaces intercellulaires épidermiques. L'ensemble des observations et analyses réalisées montrent une meilleure hydratation de la peau sous l'action du hyaluronate de calcium. Le hyaluronate de calcium a en effet une action hydratante réelle et bien supérieure à l'acide hyaluronique de l'art antérieur, notamment au hyaluronate de sodium, le plus couramment utilisé en cosmétique. Aussi, la présente invention se rapporte à l'utilisation de hyaluronate de calcium dans des applications cosmétiques, notamment pour la stimulation des glycosaminoglycanes de la peau. La présente invention se rapporte également à une composition cosmétique comprenant du hyaluronate de calcium. Autrement dit, le hyaluronate de calcium peut être utilisé seul ou dans une composition cosmétique. La présente invention se rapporte également à une telle composition 30 où la composition est une composition de stimulation des glycosaminoglycanes de la peau. La présente invention se rapporte également à une telle composition cosmétique, ladite composition étant une composition d'hydratation de la peau. Selon l'invention, l'acide hyaluronique dans une telle composition peut être utilisé comme seul agent à l'origine de l'hydratation de la peau ou en combinaison avec d'autres agents hydratants, par exemple ceux connus de l'homme du métier. Selon l'invention, le hyaluronate de calcium peut être obtenu par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut être obtenu par exemple par succession des étapes suivantes : fermentation au moyen de Iactobacilles à partir de glucose et de peptides issus du blé, purification, hydrolyse acide, concentration, précipitation au bioéthanol et séchage. Comme hyaluronate de calcium, on peut utiliser exemple Primalhyal 20 calcium (marque de commerce) commercialisé par la société Soliance (France). Dans la présente, on entend par « hydratation de la peau » ou « hydratation cutanée », l'hydratation du derme et/ou de l'épiderme. De la même manière, dans la présente, on entend par « stimulation des glycosaminoglycanes de la peau », stimulation des glycosaminoglycanes du derme et/ou de l'épiderme. Selon l'invention, dans l'utilisation ou la composition cosmétique, la masse moléculaire du hyaluronate de calcium est de préférence de 5 à 50 20 kD, de préférence de 5 à 20kDa. Selon l'invention, ladite composition cosmétique peut comprendre par exemple de 0,010/0 à 99,90/0 en poids de hyaluronate de calcium par rapport au poids total de la composition cosmétique. Par exemple, la concentration de hyaluronate de calcium peut aller de 0,010/0 à 500/0, par 25 exemple de 0,010/0 à 100/0, par exemple de 0,010/0 à 100/0, par exemple de 0,010/0 à 50/0, par exemple de 0,010/0 à 10/0 en poids de la composition cosmétique. La composition cosmétique de la présente invention peut être obtenue par simple mélange du hyaluronate de calcium avec une 30 composition cosmétique déjà connue de l'homme du métier, hydratante ou non, ou par mélange du hyaluronate de calcium dans une composition cosmétique préparée spécialement à cet effet, hydratante ou non sans le hyaluronate de calcium. Ainsi, la composition selon l'invention peut comprendre en plus de l'acide hyaluronique un ou plusieurs agents de formulation ou additifs d'usage connu et classique dans les compositions cosmétiques. Il peut s'agir par exemple d'un adoucissant, d'un colorant, d'un filtre solaire, d'un actif filmogène, d'un tensio-actif, d'un conservateur, d'un émulsionnant, d'un glycol, d'une vitamine. Grâce à ces connaissances en matière de cosmétiques, l'homme du métier saura quels agents de formulation ajouter à la composition et en quelles quantités en fonction des propriétés recherchées. La composition cosmétique de la présente invention peut se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier. Il peut s'agir, par exemple, d'une forme choisie dans le groupe comprenant une émulsion, par exemple une emulsion eau dans l'huile ou une émulsion huile dans l'eau, un sérum, un gel, un gel moussant et une lotion. Par exemple, l'émulsion peut être une microémulsion ou une nanoémulsion. Par ailleurs, l'émulsion peut être, par exemple, une émulsion eau dans l'huile ou une émulsion huile dans l'eau. A titre d'exemple, l'émulsion peut être, par exemple, un lait. La présente invention se rapporte également à un procédé de traitement cosmétique comprenant une application topique de hyaluronate de calcium ou d'une composition cosmétique tels que définis ci-dessus. Selon l'invention, le procédé peut comprendre par exemple une application du hyaluronate de calcium ou de la composition cosmétique comprenant le hyaluronate de calcium à une fréquence d'au moins une fois par jour à au moins une fois par mois. Cette application peut être réalisée par exemple sur une période allant d'une semaine à un an ou plus, selon l'utilisatrice ou l'utilisateur. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES - Les figures 1 à 3 représentent des clichés photographiques d'observations en microscopie optique d'expiants de peau humaine : la figure 1 représente un lot témoin non traité, la figure 2 représente un lot traité avec du hyaluronate de sodium après 10 jours de traitement, et la figure 3 représente un lot traité avec du hyaluronate de calcium conformément à la présente invention, après 10 jours de traitement. Les observations sont toutes réalisées à l'aide d'un microscope Leica (marque de commerce) DMLB, à l'objectif x 40. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra tri CCD Sony DXC 390P. L'échelle est indiquée sur les clichés. - La figure 4 représente une analyse statistique des données effectuée par le logiciel jmp de la société SAS. En ordonnée le pourcentage de surface des expiants occupés par des GAGs acides (% surf / GAGs ac), et en abscisse les lots analysés : contrôle (T) = témoin ; P1 = lot traité avec du hyaluronate de sodium de l'art antérieur ; P2 = lot traité avec du hyaluronate de calcium conformément à la présente invention. - La figure 5 représente un graphique permettant une comparaison des moyennes de GAGs (% surface occupée par les GAGs en ordonnée) par condition : contrôle à gauche, hyaluronate de sodium au centre, et hyaluronate de calcium à droite. Tout à droite, contrôle test de Dunnett 0,05. EXEMPLES Ces expérimentations ont permises de démontrer le pouvoir hydratant important du hyaluronate de calcium et de comparer ce pouvoir hydratant avec un autre hyaluronate, le hyaluronate de sodium. Deux formulations cosmétiques ont été appliquées sur expiant de peau humaine : plastie abdominale de femme de type caucasien de 43 ans, maintenue en survie sur les structures épidermiques et dermiques. I. Produits testés - Formulation comprenant le sodium hyaluronate (P1) : les inventeurs ont utilisé de l'acide hyaluronique TBPM (« Très Bas Poids Moléculaire ») (marque de commerce) de la société Salience. Dans les expérimentations, la formulation utilisée avec ce hyaluronate de sodium est la suivante (exprimée en % en poids) : - eau déminéralisée : 97,8 0/0 - Acide hyaluronique TBPM (marque de commerce) : 0,09 0/0 - SEPINOV EMT 10 (marque de commerce) (copolymère d'acrylate hydroxyéthyl / d'acryloyldiméthyl taurate de sodium) de la société Seppic : 2 0/0 - KATHON CG (marque de commerce) (eau et méthylchloroisothiazolinone & méthylisothiazolinone) de la société Romh and Haas : 0,1 %. - Formulation comprenant le hyaluronate de calcium (P2) : Il s'agit du Primalhyal 20 calcium commercialisé par la société Soliance (code produit SO_PRIM20CA). Ce produit se présente sous la forme d'une poudre blanche. En solution aqueuse 10/0 en poids dans de l'eau, il présente une DO (Densité Optique) à 420 nm inférieure à 0,100 et une DO à 600 nm inférieure à 0,050. Son pH standard en solution à 10/0 en poids dans de l'eau est de 5,0 - 8,0. Matière sèche, 1h à 105°C (Standard MS 105) supérieure à 850/0. Il présente une masse moléculaire de 5 - 20 kDa. Dans les expérimentations, la formulation utilisée avec ce hyaluronate de calcium est la suivante (exprimée en % en poids) : - eau déminéralisée : 97,8 0/0 - Primalhyal 20 calcium (hyaluronate de calcium hydrolysé) : 0,1 0/0 - SEPINOV EMT 10 (marque de commerce) (copolymère acrylate hydroxyéthyl / acryloyldiméthyl taurate de sodium) : 2 0/0 - KATHON CG (marque de commerce) (eau et méthylchloroisothiazolinone & méthylisothiazolinone) : 0,1 %. II. Mode opératoire Tous les expiants ont été maintenus en survie en milieu de culture (BEM BIO-EC's Expiants Medium, 2ml) pendant 10 jours. Les formulations ont été appliquées sur les expiants par voie topique quotidiennement pendant 10 jours. Aux jours 2, 4, 6 et 8 du traitement trois expiants de chaque lot (contrôle (= témoin), hyaluronate de sodium, hyaluronate de calcium) ont été prélevés et préparés pour des études histologiques. La description de la morphologie générale ainsi que l'évaluation de l'expression des glycosaminoglycanes ont été effectués. 11.1 Prélèvements A JO (= jour 0), les 3 expiants du lot TO ont été prélevés et coupés en deux. Une moitié a été fixée dans du formol tamponné et l'autre moitié a été 10 congelée à -80°C. A J10 (= 10eme jour de traitement), 3 expiants de chaque lot ont été prélevés et traités de la même manière. 11.2 Histologie 15 Après 24 heures de fixation dans le formol tamponné, les prélèvements ont été déshydratés et imprégnés en paraffine à l'aide d'un automate de déshydratation Leica TP1020. Les prélèvements ont été mis en bloc à l'aide d'une station d'enrobage Leica EG 1160. Des coupes de 5 pm ont été réalisées à l'aide d'un microtome type Minot, Leica RM 2125 et 20 collées sur des lames de verre histologiques Superfrost (marque déposée). Les observations microscopiques ont été réalisées en microscopie optique, à l'aide d'un microscope Leica type DMLB, à l'objectif x 40. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra tri CCD Sony DXC 390P. Les figures 1 à 3 annexées présentent les clichés de ces 25 observations : la figure 1 représente un lot témoin non traité, la figure 2 représente un lot traité avec du hyaluronate de sodium après 10 jours de traitement, et la figure 3 représente un lot traité avec du hyaluronate de calcium conformément à la présente invention, après 10 jours de traitement. 30 11.2.1 - Examen de la morphologie générale L'observation de la morphologie générale a été effectuée sur des coupes en paraffine après coloration au trichrome de Masson, variante de Goldner. Cette méthode est automatisée à l'aide de l'automate linéaire de coloration LEICA ST4040. L'objectif est de colorer les différentes structures cutanées afin de les identifier : I'hématoxyline de Groat colore les noyaux en noir ; le ponceau fuschine colore le cytoplasme des cellules en rose ; l'orange G molybdique permet de différencier la coloration induite par le ponceau fuschine ; - le vert lumière colore le tissu conjonctif (collagène) en vert ; - le bleu lumière peut remplacer le vert lumière. Le tissu conjonctif est alors coloré en bleu. En l'absence de derme ou de substrat dermique, les prélèvements de type peau ou épiderme reconstruit sont colorés sans les bains de vert lumière. Le mode opératoire qui a été utilisé est le suivant : Déparaffinaqe / réhydratation des coupes paraffine Placer les lames à colorer dans les paniers de coloration pour automate. Mettre l'appareil sous tension. Placer le panier dans le 1 er bain de Clearene de l'automate de coloration. Mettre l'automate en marche sur le programme « P1 » (2 min 30 / bain) 2 bains de Clearene 1 bain d'éthanol absolu 1 bain d'éthanol 95° 1 bain d'éthanol 70° 1 bain d'eau distillée Réhydratation des coupes cryostat - Placer les lames à colorer dans les paniers de coloration pour 30 automate. - Plonger les lames dans un bain d'eau distillée Fixation au Bouin Si les coupes n'ont pas déjà été fixées au Bouin (coupes cryostat ou coupes paraffine formol), une refixation est nécessaire : Plonger les lames dans un bain de Bouin pendant 1 min Plonger les lames dans de l'eau distillée. Renouveler les bains jusqu'à ce que l'eau reste limpide. Elimination de l'excès de Bouin Terminer la réhydratation dans l'automate : _ 1 bain de carbonate de lithium (permet de retirer l'excès de Bouin) 1 bain d'eau distillée Coloration Ouvrir le robinet d'eau courante. La coloration se poursuit automatiquement dans l'automate (2 min 30 / bain) 15 1 bain d'hématoxyline de Groat 2 bains d'eau courante _ 2 bains de fuschine-ponceau _ 1 bain d'eau acétique à 1 0/0 2 bains d'orange-G molybdique 20 _ 1 bain d'eau acétique à 1 0/0 _ 2 bains de vert lumière (ou de bleu lumière) 1 bain d'eau acétique à 0/0 _ 1 Déshydratation et montaqe La déshydratation se poursuit automatiquement dans l'automate (2 25 min 30 / bain) 1 bain d'éthanol absolu 1 bain d'éthanol absolu 2 bains de Clearene 30 11.4.2- Expression des glycosaminoglycanes (GAGs) Une coloration des coupes histologiques des expiants de peau au bleu alcian (référence MO-H-134 de la société BIO-EC) spécifique des GAGs acides a été réalisée. Les noyaux ont été contre colorés en rouge avec du 10 Nuclear Fast Red (marque de commerce) (référence H-3403 de la société Vector). Cette coloration a été réalisée sur des échantillons fixés au Bouin et imprégnés en paraffine, et sur des coupes montées sur lames silanisées. Le mode opératoire qui a été utilisé est le suivant : Déparaffinaqe / réhydratation - Placer les lames à colorer dans des paniers en fer - Placer le panier dans le 1 er bain de Clearene de l'automate de coloration (IE 007) - Mettre l'automate en marche sur le programme « P1 » (2 min30 / bain) 2 bains de Clearene 1 bain d'éthanol absolu 1 bain d'éthanol 95° 1 bain d'éthanol 70° 1 bain d'eau distillée _ 1 bain de carbonate de lithium (élimination de l'excès de Bouin) 1 bain d'eau distillée Préparation des bains Préparer un bain d'acide acétique à 30/0 : Mesurer 250 mL d'eau distillée dans une éprouvette graduée. Prélever 7,5 mL d'acide acétique glacial à la pasteurette. Ajouter directement dans l'éprouvette Recouvrir d'un morceau de parafilm. Mélanger par retournement. Verser dans un bac de coloration. Vérifier le pH du bleu alcian. L'ajuster si nécessaire par du NaOH 0,1 N ou du HCI IN. Filtrer la quantité nécessaire de bleu alcian directement dans un bac de coloration à l'aide d'un entonnoir et d'un filtre de taille 30 adaptée. Coloration Plonger le panier dans chacun des bacs mentionnés ci-dessous en respectant le temps imparti à chacun. Il est bon d'agiter doucement le panier dans les bains d'acide acétique et de Nuclear Fast Red. Entre chaque bain, le panier doit être égoutté au-dessus du bac puis essuyé légèrement sur un papier absorbant. Plonger dans l'acide acétique à 3 % pendant 3 min Plonger dans le bleu alcian pH 2,5 pendant 24 h à 37°C Plonger dans de l'eau distillée 3 fois pendant 5 minutes Plonger dans le Nuclear Fast Red pendant 1 à 10 minutes Plonger dans de l'eau distillée Remarques : La durée de la contre-coloration par le Nuclear Fast Red est variable en fonction l'âge de la solution. Après coloration, récupérer le bleu alcian et le Nuclear Fast Red. Déshydratation et montaqe Placer le panier dans un bain d'eau distillée dans l'automate de coloration Mettre l'automate en marche sur le programme « P1 » (2 min30 / bain) 1 bain d'eau distillée 2 bains d'éthanol absolu 2 bains de Clearene - Monter les lames à l'Eukitt Les GAGs sont des polysaccharides complexes retrouvés en 25 abondance à la surface des cellules, et constituent un élément important des matrices extracellulaires. Les GAGs neutres, proche de la jonction dermoépidermique ODE) sont des réservoirs de facteurs de croissance ; les GAGs acides, localisés dans l'épiderme et le derme papillaire sont essentiellement constitués d'acide hyaluronique, impliqué dans l'hydratation de la peau. In 30 vivo, les GAGs sont impliqués dans l'élasticité et l'hydratation de la peau.20 11.3 Analyse d'images Pour chaque biopsie, 9 images ont été analysées à l'aide du logiciel d'analyse d'images Olympus Ce11"D (marque de commerce). 11.4 Résultats et discussion 11.4.1 - Morpholoqie A JO (jour 0, départ des expérimentations), le stratum corneum est assez épais, compact et très nettement kératinisé en surface et à sa base. L'épiderme présente 4 à 5 assises cellulaires avec une bonne morphologie. Le relief de la jonction dermo-épidermique est net. Le derme papillaire présente un collagène avec des fibres assez épaisses formant un réseau assez dense. Il est bien cellularisé. Après 10 jours : - Sur le lot non traité (contrôle), le stratum corneum est épais, modérément feuilleté, nettement kératinisé en surface et très nettement à sa base. La parakératose est très nette. Le relief de la jonction dermoépidermique est net. Le derme papillaire présente un collagène avec des fibres assez épaisses formant un réseau plus ou moins dense. Il est bien cellularisé. - Sur le lot traité avec le produit «hyaluronate de sodium» (P1), le stratum corneum est épais, modérément feuilleté, nettement kératinisé en surface et modérément à sa base. La parakératose est très nette. L'épiderme présente 4 à 5 assises cellulaires. Le relief de la jonction dermo-épidermique est net. Le derme papillaire présente un collagène avec des fibres assez épaisses formant un réseau assez dense. Il est bien cellularisé. - Sur le lot traité conformément à la présente invention avec le produit « hyaluronate de calcium » (P2), le stratum corneum est très épais, modérément feuilleté, nettement kératinisé en surface et à sa base. La parakératose est assez nette. L'épiderme présente 6 à 7 assises cellulaires. Le relief de la jonction dermo-épidermique est net. Le derme papillaire présente un collagène avec des fibres assez épaisses formant un réseau dense. Il est bien cellularisé. 11.4.2- Expression des GAGs (voir clichés photographiques représentatifs des figures 2 et 3 annexées) A J0, les GAGs acides sont très faibles dans les espaces inter-cellulaires épidermiques et très modérés dans le derme papillaire. Après 10 jours : - Sur le lot non traité (contrôle ou témoin), les GAGs acides sont très faibles dans les espaces inter-cellulaires épidermiques et sont très modérés dans le derme papillaire. - Sur le lot traité avec le produit « hyaluronate de sodium » (P1), les GAGs acides sont très modérés dans les espaces inter-cellulaires épidermiques et sont très modérés dans le derme papillaire. - Sur le lot traité avec le produit « hyaluronate de calcium » (P2), les GAGs acides sont assez nets dans les espaces inter-cellulaires épidermiques et sont assez nets dans le derme papillaire. Le tableau 1 suivant présente les résultats des analyses d'image réalisées à partir d'une coloration des GAGs au bleu alcian) : Tableau 1 GAGs (% surface) Contrôle sodium calcium hyaluronate hyaluronate (P1) (P2) 9,2 26,1 7,3 22,7 13,9 50,2 16,4 16,3 14 11,7 12,1 14,4 18 9,8 23,4 12,3 22,3 16,1 9,3 11,6 39,3 7,5 16,2 18,6 5,9 20,2 37,9 La figure 4 annexée représente une analyse statistique des données effectuée par le logiciel jmp (SAS). En ordonnée le pourcentage de surface des expiants occupés par des GAGs acides, et en abscisse les lots analysés : contrôle = témoin ; P1 = lot traité avec du hyaluronate de sodium de l'art antérieur ; P2 = lot traité avec du hyaluronate de calcium conformément à la présente invention. La figure 5 annexée représente un graphique permettant une comparaison des moyennes de GAGs (% surface occupée par les GAGs en ordonnée) par condition : contrôle à gauche, hyaluronate de sodium au centre, et hyaluronate de calcium à droite. Tout à droite, contrôle test de Dunnett 0,05. Anal se de la variance Source Degrés Somme des Carré Rapport F Prob. > F de liberté carrés moyen Produit 2 676,0289 338,014 3,7763 0,0375* Résidus 24 2148,1978 89,508 - - Total 26 2824,2267 - - - Moyennes pour l'anova Niveau Nombre Moyenne Écart-type LIC 95 % LSC 95 0/0 contrôle 9 12,5556 3,1536 6,047 19,064 P1 9 16,5000 3,1536 9,991 23,009 P2 9 24,5778 3,1536 18,069 31,087 L'erreur-type utilise une estimation groupée de la variance de l'erreur Comparaisons de moyennes 20 Comparaisons avec un contrôle en utilisant la méthode de Dunnett Groupe de contrôle = contrôle Id Alpha 2,34947 0,05 Abs(différence)-différence la moins significative Niveau P-value Niveau Abs(différence)-différence la moins P-value significative P2 1,544 0,0235* P1 - 6,53 0,5868 contrôle - 10,5 1,0000 Les valeurs positives montrent des paires de moyennes qui sont significativement différentes. III. Conclusion L'augmentation du bleu alcian est directement corrélée à l'augmentation des glycosaminoglycanes acides (GAGs acides) dans l'expiant de peau après 10 jours de traitement. L'augmentation des GAGs acides au niveau du derme papillaire concourt à une plus grande densification du réseau dermique. Cette augmentation permet également de densifier la matrice extracellulaire de l'espace intercellulaire épidermique. L'observation microscopique des expiants colorés au bleu alcian montre que le produit « hyaluronate de calcium » (P2) favorise l'augmentation des GAGs au niveau dermique et épidermique (voir paragraphe 4). Les données issues de l'analyse d'images indiquent que le produit « hyaluronate de calcium » (P2) induit une augmentation significative de la surface occupée par la coloration au bleu alcian en comparaison aux explants-contrôle (voir photographies et graphe annexés). En conséquence, le produit « hyaluronate de calcium » (P2) dans l'utilisation conforme à la présente invention favorise une nette densification du réseau dermique et des espaces intercellulaires épidermiques. L'augmentation significative des GAGs acides n'est pas observée lorsque les expiants de peau sont traités avec le produit « sodium hyaluronate (P1) (voir graphe). La présence des GAGs acides au niveau du derme papillaire et dans les espaces intercellulaires épidermiques reste très modérée. L'ensemble des observations microscopiques (morphologie et coloration au bleu alcian) ainsi que l'analyse des clichés photographiques traduisent une meilleure hydratation de l'épiderme et du derme sous l'action du produit « hyaluronate de calcium » (P2). Le hyaluronate de calcium a une action hydratante réelle et bien supérieure au sodium hyaluronate, le plus couramment utilisé en cosmétique dans l'art antérieur. IV. Exemple de composition cosmétique utilisable selon la présente invention Les pourcentages des composés sont exprimés en pourcentage en poids de la composition. « Q.S.P » signifie « quantité suffisante pour » ou « Quantum satis ». A. Gel moussant On prépare un gel moussant utilisable selon la présente invention par mélange des composés suivants : Composés 0/0 CARBOMER 8,00 LAURYL ETHER SULFATE DE SODIUM 5,00 C12-13 PARETH 3 0,50 DECYL GLUCOSIDE 10,00 COCAMIDOPROPYL BETAINE 5,00 GLYCERINE 5,00 PRIMALHYAL 0,10 CHELATANT 0,05 SODIUM HYDROXIDE q.s.pH CONSERVATEURS 0,05 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 B. Lotion On prépare une lotion utilisable selon la présente invention par mélange des composés suivants : Composés 0/0 GLYCOLS 2,00 ETHANOL 5,00 PRIMALHYAL 0,10 CHLORURE DE SODIUM 1,00 CONSERVATEURS 0,50 SOLUBILISANT 0,30 PARFUM 0,10 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 C. sérum On prépare un sérum utilisable selon la présente invention par mélange des composés suivants : Composés 0/0 ARISTOFLEX AVC 1,00 SEPIGEL 305 0,20 ISONONANOATE D'ISONONYLE 3,00 SILICONE VOLATIL 0345 5,00 ALUMINIUM STARCH OCTENYLSUCCINATE 2,00 ACIDE SALICYLIQUE 0,10 ALCOOL 96.2° NON DENATURE 5,00 GLYCERINE 4,00 PRIMALHYAL 0,10 TROMETHAMINE q.s.pH CONSERVATEURS q.s. PARFUM q.s. EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 D. Gel-Crème hydratant On prépare un gel-crème hydratant utilisable selon la présente invention par mélange des composés suivants : Composés 0/0 SENSIVA SC 50 0,20 TAPIOCA 1,00 SEPIGEL 305 1,00 ARISTOFLEX AVC 1,00 GLYCOLS 5,00 LUBRAJEL MS FREE 5,00 TRIGLYCERIDES C8 C10 1,50 SILICONE VOLATIL 0345 5,00 PHENYL TRIMETHICONE 1,00 SILICONE DC 5225 C 1,00 PRIMALHYAL 0,10 CHELATANT 0,05 CONSERVATEURS q.s. PARFUM q.s. EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 E. Crème hydratante On prépare une crème hydratante utilisable selon la présente invention par mélange des composés suivants : Composés 0/0 LANETTE SX 1,70 HYDROGENATED POLYISOBUTENE 7,00 ISONONANOATE D'ISONONYLE 5,00 STEARATE DE GLYCEROL AE 5,60 C12-15 ALKYL BENZOATE 3,50 METHYL GLUCETH 20 SEQUISTEARA 0,50 GLYCERINE 3,00 OSMOCIDE 3 5,00 CARBOMER 0,25 SILICA 0,15 SUBMICA FL 0,10 TALC ROSE 0,50 SILICONE DC 1503 0,15 PRIMALHYAL 0,10 EDTA DISODIQUE 0,10 CONSERVATEURS q.s. TROMETHAMINE q.s. EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 N/Ref : BIP208628FR00