Brevet FR2976587A1 — publié le 20121221

La présente invention concerne une nouvelle méthode de dosage in vitro des molécules de la matrice extracellulaire synthétisées par des cellules en culture et ses utilisations sous forme de kit de mesure in vitro etlou de méthode de screening d'ingrédients cosmétiques et/ou pharmaceutiques. s La matrice extracellulaire (MEC) tient un rôle essentiel dans la structure des tissus du corps humain et animal, en particulier par ses fonctions de soutien, d'adhérence et de régulation des échanges cellulaires. La MEC est constituée en grande partie de glycoprotéines, protéines et glycosaminoglycannes. Ces molécules sont synthétisées sous forme native dans les cellules en contact avec ~o la MEC. Du compartiment intracellulaire, elles sont excrétées en dehors des cellules. Après des phénomènes de maturation, elles s'organisent et s'agencent en un réseau qui forme la MEC. Elles sont alors sous leur forme fonctionnelle. Les molécules de la MEC sont particulièrement étudiées dans les domaines cosmétiques et pharmaceutiques où de nombreux ingrédients visent à stimuler 15 leur synthèse et ainsi améliorer l'état général du tissu concerné. In vitro, les cellules en culture dans des conditions appropriées produisent leur matrice extracellullaire et constituent un modèle d'études particulièrement simple, notamment pour mesurer l'activité de synthèse par les cellules d'une ou plusieurs molécules constituant la MEC et l'influence d'ingrédients sur cette 20 activité. Dans ce type de modèle de cellules en culture, les molécules de la MEC sont présentes, dans différents compartiments de culture et éventuellement sous différentes formes notamment de précurseurs: intracellulaire, dans le milieu de culture, ou contenues dans la MEC. Les techniques de mesures classiques consistent à mesurer la quantité de 25 molécules de la MEC dans le milieu de culture. Ainsi, selon la technique la plus courante, on dose dans le milieu de culture par technique ELISA des molécules de la MEC telles que les collagènes, éventuellement sous leur forme précurseur telles que le procollagène. Une autre technique plus couteuse, plus contraignante et plus globale, consiste à inclure dans le milieu de culture des 30 molécules radiomarquées utilisés par les cellules pour la synthèse des molécules de la MEC et à mesurer globalement l'intensité de la radioactivité ainsi obtenue dans la totalité des compartiments. Par exemple, la proline tritiée est utilisée pour mesurer la quantité de collagène globalement produit par les cellules en culture. Ces techniques permettent de rendre compte de l'activité de synthèse des cellules en culture mais pas de la fonctionnalité des molécules ainsi synthétisées s c'est-à-dire de la quantité de molécules dans la MEC. Seule l'analyse immunohistochimique permet de déterminer et seulement en partie la fonctionnalité des molécules de la MEC ainsi synthétisées. Cette technique consiste à éliminer le milieu de culture, marquer avec des anticorps dirigés contre les molécules de la MEC étudiées, puis lire et/ou visualiser la io fluorescence. Cette technique permet de quantifier les molécules contenues dans le compartiment intracellulaire, extracellulaire et dans la MEC et surtout de visualiser leur localisation. Cette technique est néanmoins lourde à mettre en oeuvre et nécessite des équipements couteux. La technique en elle-même ne permet pas en outre d'analyser un grand nombre d'ingrédients. Par ailleurs, elle ts est subjective et dépend de l'expérimentateur. Ainsi, avant la présente invention aucune mesure quantitative objective ne permettait de déterminer la quantité de molécules fonctionnelles c'est-à-dire les molécules réellement intégrées dans la MEC de manière suffisamment rapide, fiable, simple et prédictive. Par ailleurs, aucune méthode ne permettait le screening d'ingrédients d'intérêt cosmétiques 20 et/ou pharmaceutiques. Or, une synthèse importante de molécules de la MEC par des cellules en culture mesurée dans le milieu intracellulaire et/ou extracellulaire ne se traduit pas nécessairement par une quantité plus importante de molécules fonctionnelles c'est-à-dire de molécules dans la MEC. 25 En effet, la Demanderesse a pu constater que certains ingrédients actifs cosmétiques permettent de stimuler globalement la synthèse de collagène de la MEC sans toutefois visualiser d'amélioration de la fonctionnalité du collagène c'est-à-dire pas d'augmentation de la teneur du collagène dans la MEC. La Demanderesse a également constaté que certains ingrédients améliorent la 30 fonctionnalité du collagène c'est-à-dire sa teneur dans la MEC sans toutefois mesurer d'augmentation de la synthèse de procollagène. (exemples 6 et 7) 2 Les techniques de l'art antérieur ne sont donc pas appropriées pour quantifier la fonctionnalité des molécules de la MEC c'est à dire leur teneur dans la MEC en ce qu'elles ne sont pas directes ni assez fiables, prédictives, reproductibles, répétables et spécifiques. Par ailleurs, elles ne permettent pas le screening ou « criblage » d'ingrédients cosmétiques et/ou pharmaceutiques susceptibles d'améliorer la fonctionnalité des molécules de la MEC d'une manière satisfaisante. Il existait donc un besoin de disposer d'une technique de dosage de molécules de la MEC synthétisées par des cellules en culture qui permette de io doser directement, quantitativement, de manière fiable, simple, répétable, prédictive et spécifique la fonctionnalité des molécules de la MEC c'est à dire leur teneur dans la MEC. La Demanderesse vient maintenant de découvrir de manière surprenante et inattendue que ce problème peut être résolu en effectuant une étape de lyse 15 spécifique des cellules en culture et un dosage direct sur la MEC des molécules d'intérêt. La méthode selon l'invention fournit ainsi une solution technique au problème de l'art antérieur et présente l'avantage d'être rapide, miniaturisable, et de permettre le screening d'un grand nombre d'ingrédients pour leur capacité à augmenter ou diminuer la quantité de molécules dans la MEC, avantageusement 20 sous forme automatisable. La présente invention a pour objet une méthode de dosage in vitro par technique immunologique d'au moins une molécule de la matrice extracellulaire synthétisée par des cellules en culture comprenant au moins les étapes : a) une étape de mise en culture des cellules, 25 b) une étape préférentielle de prélèvement du milieu de culture, c) une étape de lyse des cellules par une solution d'amine quaternaire, d) une étape de prélèvement du lysat cellulaire, e) une étape de dosage par technique immunologique de ladite molécule dans la matrice extracellulaire. 30 La présente invention a en outre pour objet une méthode de dosage in vitro par technique immunologique d'au moins une molécule de la matrice 3 extracellulaire synthétisée par des cellules en culture comprenant au moins les étapes : a) une étape de mise en culture des cellules, b) une étape de prélèvement du milieu de culture et de dosage de la molécule de 5 la MEC et/ou un précurseur de la molécule de la MEC, c) une étape de lyse des cellules par une solution d'amine quaternaire, d) une étape de prélèvement du lysat cellulaire et de dosage de l'ADN et/ou de dosage de la molécule de la MEC et/ou un précurseur de la molécule de la MEC, e) une étape de dosage par technique immunologique de ladite molécule de la 10 MEC contenue dans la matrice extracellulaire. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la méthode de dosage selon l'invention pour le screening et/ou l'étude in vitro d'au moins un ingrédient d'intérêt cosmétique et/ou pharmaceutique pour ses propriétés à augmenter ou diminuer la quantité d'une molécule dans la matrice extracellulaire. 15 La présente invention a également pour objet une méthode de screening et/ou d'étude in vitro d'au moins un ingrédient d'intérêt cosmétique et/ou pharmaceutique pour ses propriétés à augmenter ou diminuer la quantité d'une molécule dans la matrice extracellulaire comprenant au moins les étapes : a) une étape de mise en culture des cellules en présence de l'ingrédient, 20 b) préférentiellement une étape de prélèvement du milieu de culture et encore préférentiellement de dosage de la molécule de la MEC et/ou un précurseur de la molécule de la MEC dans ledit milieu de culture ainsi prélevé, c) une étape de lyse des cellules par une solution d'amine quaternaire, d) une étape de prélèvement du lysat cellulaire et préférentiellement de dosage 25 de l'ADN et/ou de dosage de la molécule de la MEC et/ou un précurseur de la molécule de la MEC, e) une étape de dosage par technique immunologique de ladite molécule de la MEC contenue dans la matrice extracellulaire. Un autre objet de la présente invention est un kit de dosage par méthode 30 immunologique utile selon l'une des méthodes selon l'invention comprenant au 4 moins une solution d'amine quaternaire et un anticorps dirigé contre la molécule de la MEC, éventuellement couplé à un anticorps secondaire: Un autre objet de la présente invention est un procédé de sélection d'une solution de lyse utile dans la méthode de dosage selon l'invention caractérisé en ce que la méthode de dosage selon l'invention est mise en oeuvre avec une solution de lyse à tester pendant au moins 10 min, préférentiellement 10 min, et le ratio du résultat du dosage de la molécule de la MEC obtenus à l'étape e) sur le résultat du dosage de l'ADN dans le lysat cellulaire est comparé à celui obtenu avec une solution de lyse d'hydroxyde d'ammonium à 20mM appliquée pendant io le même temps, préférentiellement 10 minutes. Selon l'invention, on entend par « molécules de la MEC », les molécules organiques qui constituent et/ou sont contenues dans la matrice extracellulaire et qui sont synthétisées par des cellules, d'origine humaines ou animales. II s'agit notamment des protéines constitutives de la MEC, en particulier 15 sélectionnées parmi : La famille des collagènes de la MEC: les collagènes fibrillaires notamment de type I, III, V, les collagènes FACITS (Fibril Associated Collagen with lnterupted Triple Helix) notamment de type VI, XII, XIV, XVI, les collagènes IV et VII, les collagènes XXII, XXVII, XVIII 20 La famille des fibres élastiques de la MEC: l'élastine, la tropoélastine, les protéines associées à l'élastine notamment la fibrilline 1, les lysyl oxidases, notamment LOX et LOXL, l'EBP (Elastine Binding Protein), les fibullines 3 et 5, les Emilin 1 et 2. II s'agit notamment des protéoglycanes constitutifs de la MEC, en particulier 25 les protéoglycanes sécrétés choisis parmi le Perlecan, le versican, les protéoglycanes riches en leucine (SLRPs) notamment la decorine, le biglycan et le lumican. Il s'agit également des glycoprotéines constitutifs de la MEC, notamment la fibronectine, la laminine, la SPARC (Secreted Protein Rich in Cystein), la 30 tenascine . 5 II s'agit en outre des glycosaminoglycans (GAG) constitutifs de la MEC, en particulier l'acide hyaluronique, heparane sulfate, dermatan sulfate, chondroitine sulfate. Il s'agit également des facteurs de croissance de la MEC qui sont des s protéines contenues dans la MEC, notamment le VEGF, le PDGF, le HGF, les FGF, et en particulier FGF2 et FGF 7. Certaines molécules de la MEC existent dans d'autres compartiments que la MEC sous forme de précurseur. Les « molécules de la MEC » désignent les molécules dans la MEC ou io dans d'autres compartiments notamment intracellulaire et extracellulaire dans le milieu de culture, éventuellement sous forme de précurseurs. Selon l'invention, on entend par « précurseur de molécule de la MEC » une forme native et/ou intermédiaire de la molécule de la MEC, synthétisée par la cellule, avant de constituer ou être contenue dans la MEC. Ces formes subissent 15 des phénomènes de maturation avant d'être dans la MEC et sont ainsi souvent désignées par les préfixes « Pro-» ou «Tropo- ». II s'agit par exemple les procollagènes, les tropocollagènes, la proélastine, la tropoélastine. Selon l'invention, on entend par « cellule en culture », les cellules humaines ou animales capables de synthétiser une ou plusieurs molécules de la MEC. 20 Elles peuvent être normales, mutées ou immortalisées, cultivées en monocouche éventuellement en coculture avec un ou plusieurs autres types cellulaires capables ou non de synthétiser une ou plusieurs molécules de la MEC. Ces cellules sont notamment des cellules stromales, préférentiellement fibroblastes, ostéoblastes et/ou adipoblastes, des cellules épithéliales, préférentiellement 25 kératinocytes ou des cellules endothéliales. Elles sont extraites de biopsies, préférentiellement de peau, ou en lignées cellulaires. Selon l'invention, on entend par « méthode immunologique », les techniques de dosage quantitatif par anticorps dirigé contre des protéines ou des sucres. 30 II s'agit des techniques de dosage enzyme-substrat de type EIA (Enzyme Immuno Assay), notamment ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), de 6 radiolabelling dit RIA (radioimmunoassay) et de mesure de fluorescence dit FIA (Fluorescente immunoassay) en particulier en fluorescence en temps retardé dite TRF (Time Resolved fluorescence). Selon l'invention, on entend par « ingrédient d'intérêt cosmétique et/ou pharmaceutique », une ou plusieurs molécules naturelles et/ou de synthèses, et/ou un extrait végétal, éventuellement synthétisé et/ou modifié par génie biologique, en particulier par fermentation par microorganismes, dont les propriétés sur les molécules de la MEC sont évaluées pour ses capacités à augmenter ou diminuer la quantité de molécule dans la MEC. lo L'objet selon l'invention est une méthode de dosage in vitro par technique immunologique d'au moins une molécule de la matrice extracellulaire synthétisée par des cellules en culture comprenant au moins les étapes successives : étape de mise en culture des cellules - une étape préférentielle de prélèvement du milieu de culture 15 - étape de lyse des cellules par une solution d'amine quaternaire étape de prélèvement du lysat cellulaire - étape de dosage par technique immunologique de ladite molécule contenue dans la matrice extracellulaire. La méthode selon l'invention permet de doser au moins une molécule de la 20 MEC et avantageusement une ou deux. Selon un mode préférentiel, les molécules de la MEC sont choisies parmi les protéines constitutives de la MEC, les glycoprotéines constitutives de la MEC, les glycoaminoglycanes constitutives de la MEC, les protéoglycanes constitutives de la MEC et les facteurs de croissance contenues dans la MEC. Encore 25 préférentiellement, elles sont choisies parmi les collagènes de type I, III, V, VI, XII, XIV, XVI, IV et Vil, l'élastine, la tropoélastine, la fibrilline 1, LOX, LOXL, l'EBP (Elastine Binding Protein), les fibullines 3 et 5, les Emilin 1 et 2, le Perlecan, le versican, la decorine, le biglycan, le lumican, la fibronectine, la laminine, l'acide hyaluronique, heparane sulfate, le VEGF, le PDGF, le FGF-2, FGF-7 , et HGF. 7 Selon un mode particulièrement avantageux, les molécules de la MEC sont choisies parmi les collagènes de type I, III, V, XVIII, IV, VII, le perlecan, la fibronectine, le FGF-2, l'élastine, l'acide hyaluronique. Les cellules capables de synthétiser les molécules de la MEC sont mises en culture in vitro préférentiellement en monocouche selon les techniques habituelles en la matière. Elles sont ensemencées sur support de culture approprié, préférentiellement une plaque de culture cellulaire comprenant des puits, et cultivées dans un milieu de culture approprié jusqu'au stade de confluence, préférentiellement entre 80 et 100% de confluence, encore préférentiellement entre 90 et 100%, encore préférentiellement 100%. Pour l'utilisation de la méthode en screening moyen débit, les plaques sont avantageusement des plaques de 96 ou 384 puits. Selon un mode préférentiel, les cellules en culture sont choisies parmi des fibroblastes, préférentiellement dermique et/ou des kératinocytes et/ou adipocytes, avantageusement humaines, et préférentiellement extraites de biopsies, préférentiellement de peau, préférentiellement des cellules humaines normales c'est-à-dire non mutées non immortalisées. Les études effectuées ont en effet montré que la méthode selon l'invention convient particulièrement bien à ces types cellulaires. C'est généralement au stade de confluence que les cellules vont commencer à sécréter les molécules de la MEC. Ainsi avantageusement, les cellules sont maintenues en culture au stade de confluence pendant une durée allant de 24 à 96 heures, préférentiellement 48 heures. Selon un mode particulièrement avantageux, le collagène est la molécule de la MEC dosée et la culture de fibroblastes est avantageusement maintenue pendant environ 48 heures. Selon un mode de réalisation, à confluence, un ingrédient d'intérêt cosmétique et/ou pharmaceutique est ajouté dans le milieu de culture. Il peut également s'agir d'un ingrédient témoin de stimulation ou inhibition de molécules de la MEC. Préférentiellement, le témoin de stimulation est choisi parmi préférentiellement la vitamine C et le TGF beta. La vitamine C est alors s avantageusement utilisée à une dose comprise dans une gamme allant de 5pM à 100pM, encore préférentiellement à 50pM. Le TGF beta est alors avantageusement utilisé à une dose allant de 1 ng/mI à 100ng/mI, préférentiellement à I Ong/ml. De manière préférentielle, la culture de cellules dans le milieu de culture contenant l'ingrédient d'intérêt cosmétique et/ou pharmaceutique est effectuée pendant au moins 24 heures et préférentiellement de 24 à 96 heures, préférentiellement pendant 48 heures. Une étape de prélèvement du milieu de culture totale ou partielle est alors to préférentiellement effectuée. Selon un mode avantageux, la molécule de la MEC étudiée et contenue dans le milieu de culture, éventuellement sous une forme précurseur, est dosée par méthode immunologique, préférentiellement par dosage type ELISA. La méthode selon l'invention comprend alors une étape de lyse des cellules 15 en culture avec une solution d'amine quaternaire, préférentiellement une solution aqueuse, encore préférentiellement une solution d'ammonium éventuellement sous forme de sels. Selon un mode préférentiel, la solution d'amine quaternaire est choisie parmi une solution de chlorure d'ammonium, une solution d'hydroxyde d'ammonium et leurs mélanges. 20 Selon l'invention, on entend par « solution d'amine quaternaire » une solution dans laquelle la forme quaternaire de l'amine représente au moins 51% des formes de l'amine. Selon un mode préférentiel, la solution d'amine quaternaire contient seulement l'amine quaternaire en solution aqueuse. Selon un autre mode 25 préférentiel, la solution d'amine quaternaire à un pH basique, préférentiellement compris entre 10 et 13, encore préférentiellement de 11. Les résultats présentés dans l'exemple 3 mettent en évidence les avantages des solutions d'amine quaternaire au regard des solutions classiques de lyse cellulaire. De manière surprenante, la solution d'amine quaternaire 30 présente en effet les meilleurs taux de lyse des cellules et de dosage des molécules de la MEC. 9 Lors de cette étape de lyse, la solution d'amine quaternaire est mise en contact avec les cellules en culture, dans un état de confluence et préférentiellement après retrait total ou partiel du milieu de culture. La solution d'amine quaternaire est appliquée à une concentration suffisante pour lyser les cellules. Les études menées par la Demanderesse ont mise en évidence qu'une concentration suffisante pour lyser les cellules est généralement comprise dans une gamme allant de 100 pM à 2M. Selon un mode préférentiel, la concentration de la solution d'amine quaternaire est de 1 mM à 200mM, encore préférentiellement de 10mM à 100mM encore préférentiellement io 20mM. Dans le cas particulier ou le milieu de culture n'a pas été prélevé ou seulement partiellement, le facteur de dilution est considéré pour ajuster la concentration de la solution d'amine quaternaire. Ces études effectuées dont une partie est présentée dans les exemples 2 montrent notamment que le temps de lyse préférentiel est compris entre 5 et 60 15 minutes. En effet, les résultats obtenus avec des temps plus longs ne sont pas meilleurs et ne justifient pas des temps de lyse plus longs. Selon un mode avantageux, la solution d'amine quaternaire est choisie parmi une solution de chlorure d'ammonium à une concentration comprise dans une gamme allant de 100 pM à 2M, préférentiellement de 1 mM à 200mM, 20 préférentiellement 10mM à 100mM, préférentiellement à une concentration de 20mM, et parmi une solution d'hydroxyde d'ammonium à une concentration comprise dans une gamme allant de 100 pM à 2M, préférentiellement de 1 mM à 200mM, préférentiellement 10mM à 1oOmM, préférentiellement à une concentration de 20mM et leurs mélanges. 25 Selon un mode alternatif, la solution d'amine quaternaire est préférentiellement choisie par comparaison aux résultats obtenus avec la solution d'hydroxyde d'ammonium à 20mM pendant 10 minutes et donne en particulier, lorsque testée dans les mêmes conditions, le même ratio de molécule de la MEC /ADN à plus ou moins 16%, et préférentiellement sans différence 30 significative avec d'hydroxyde d'ammonium à 20mM pendant 10 minutes.10 Selon un mode préférentiel, on choisit la concentration et le temps d'application de la solution d'amine quaternaire, préférentiellement d'ammonium par comparaison avec les résultats obtenus avec une solution de lyse d'hydroxyde d'ammonium à 20mM appliquée pendant 10 minutes. Ainsi, le ratio s du résultat du dosage de la molécule de la MEC obtenus à l'étape e) sur le résultat du dosage de l'ADN dans le lysat cellulaire est comparé celui obtenu avec une solution de lyse d'hydroxyde d'ammonium à 20mM appliquée pendant le même temps. Préférentiellement, la comparaison est effectuée par un test d'analyse 10 statistique des variances dit One Way Anova et la concentration et le temps d'application sont choisis de telle sorte que le ratio de la solution testé ne soit pas significativement différent pour au moins p La présente invention a également pour objet un procédé de sélection d'une solution de lyse utile dans la méthode de dosage selon l'invention caractérisé en ce que la méthode de dosage selon l'invention est mise en oeuvre avec une solution de lyse à tester pendant au moins 10 min, préférentiellement 10 min, et le ratio du résultat du dosage de la molécule de la MEC obtenus à l'étape e) sur le résultat du dosage de l'ADN dans le lysat cellulaire est comparé à celui obtenu avec une solution de lyse d'hydroxyde d'ammonium à 20mM appliquée pendant le même temps, préférentiellement 10 minutes. Préférentiellement, la comparaison est effectuée par un test d'analyse statistique des variances dit One Way Anova et la solution de lyse testée est is sélectionnée si le ratio de la solution testé n'est pas significativement différent pour au moins p EXEMPLES : EXEMPLE 1 : Méthode de dosage des collagènes de type I dans la MEC selon l'invention Principe : La molécule de la MEC dosée par la méthode selon l'invention est le collagène ~o de type I synthétisé par les fibroblastes. Protocole : - Etape a) : Des fibroblastes humains normaux obtenus à partir de biopsies abdominales sont ensemencés en plaque 96 puits et cultivés dans un milieu défini (FGM). 15 -Etapeb): Après 48 heures de culture, le milieu de culture est prélevé et éliminé. - Etape c) : Une étape de lyse est effectuée : 11OpI d'une solution d'hydroxyde d'ammonium à 20mM pendant 10 minutes à température ambiante et sous agitation. 20 - Etape d) Le lysat est prélevé et analysé. L'ADN double brin contenu dans le lysat est dosé par méthode au bisbenzimide (Kit Picogreen Invitrogen). - Etape e) Le dosage du collagène dans la MEC est effectué directement sur la MEC par un 25 anticorps anticollagène I. Un anticorps secondaire couplé à l'europium a été utilisé avec une solution de révélation et la fluorescence a été mesurée. (kit Delfia® - Perkin Elmer). Les résultats de fluorescence ont été rationnalisés par rapport au taux d'ADNdb mesuré. 30 L'expérience a été effectuée sur 6 puits (n=6) Les résultats présentés correspondent à la moyenne (May) et l'écart type (EC) 17 Résultats : Coli 1 (RFU) Moy 104228 EC 4757 ADN (ng/ml) Moy 303.01 EC 10.98 RATIO Coli I /ADN Moy 343.98 EC 12.79 Discussions : La quantité de fluorescence étant proportionnelle à la quantité de collagène mesurée, la quantité de collagène peut être déterminée à l'aide d'une gamme étalon. EXEMPLE 2: Etude de l'influence du temps de lyse sur la méthode de dosage du collagène de type I dans la MEC selon l'invention Principe : La molécule de la MEC dosée par la méthode selon l'invention est le collagène Io de type I synthétisé par les fibroblastes en fonction du temps de lyse. Protocole : Le protocole décrit dans l'exemple 1 est appliqué avec différentes durées de l'étape de lyse avec la solution d'hydroxyde d'ammonium 20mM allant de 5 minutes à 240 minutes. 15 L'expérience est effectuée pour chaque durée sur 6 puits (n=6) Les résultats présentés correspondent à la moyenne (Moy) et l'écart type (EC) et la significativité déterminée par analyse One way Anova (Dunnett) au regard de la durée optimum de 10 minutes. NS : non significatif NT : non analysable 20 * : significatif à p EXEMPLE 3 : Etude de l'influence de la nature de la solution de lyse sur la méthode de dosage du collagène de type V dans la MEC selon l'invention Principe : La molécule de la MEC dosée par la méthode selon l'invention est le collagène de type V synthétisé par les fibroblastes et l'étude est menée en fonction de la nature de la solution de lyse. Protocole : Le protocole décrit dans l'exemple 1 est appliqué de la même manière. Ainsi des fibroblastes humains normaux obtenus à partir de biopsies abdominales sont ensemencés en plaque 96 puits et cultivés dans un milieu défini (FGM). 19 Après 48 heures de culture à 37°C sous 0.5% de CO2, le milieu de culture est prélevé. Les solutions de lyse testées sont les suivantes : solution selon l'invention NH4OH : 110p1 d'une solution d'hydroxyde d'ammonium à 20mM. solution 1 : solution contenant 52,55 g d'urée, 15,01 g de thiourée, 964 mg de DTT et 37,2 mg EDTA - solution 2 : solution contenant Tris 10mM/Triton 0.1% solution 3 : solution contenant Hepes 50mM io - solution 4 : solution contenant du Tris HCI à 5OMm pH7.5), un agent détergent (sodium de deoxycholate à 0.5mM) et un agent chelatant (EGTA à 20mM) solution 5 : solution contenant EDTA 50mM solution 6 : solution contenant NaOH 0.2N et 1 %SDS ls Le temps d'application de la solution de lyse testée est 10 minutes à température ambiante et sous agitation. Le lysat est prélevé et analysé. L'ADN double brin contenu dans le lysat est dosé par méthode au bisbenzimide (Kit Picogreen Invitrogen). Le dosage du collagène V dans la MEC est effectué directement sur la MEC par 20 un anticorps anticollagène V. Un anticorps secondaire couplé à l'europium a été utilisé avec une solution de révélation et la fluorescence a été mesurée. (kit Delfia® - Perkin Elmer). La fluorescence est mesurée. L'expérience est effectuée pour chaque solution de lyse sur 6 puits (n=6) 25 Les résultats sont présentés dans le tableau 3.1 L'expérience est renouvelée et les solutions de lyse testées sont les suivantes : - solution selon l'invention NH4OH : 110p1 d'une solution d'hydroxyde d'ammonium à des concentrations comprises entre 200pM et 2M . - Solution de monoéthylamine à 20mM 30 - Solution de diéthylamine à 20mM - Solution de triéthylamine à 20mM 20 Les résultats sont présentés dans le tableau 3.2 et 3.3 Les résultats présentés correspondent à la moyenne (Moy) et l'écart type (EC) et la significativité déterminée par analyse One way Anova (Dunnett) au regard de la solution de lyse NH4OH. NS : non significatif NT : non analysable * : significatif à p EXEMPLE 4: Méthode de dosage de collagène de type I dans les trois 15 compartiments selon'I'invention principe : Les différents compartiments : intracellulaire (lysat cellulaire), milieu de culture et MEC sont récupérés et les différentes formes du collagène I sont dosées. 20 Protocole : La méthode décrite dans l'exemple 1 est appliquée et les milieux de culture et de lyse prélevés sont analysés. L'expérience est effectuée sans ingrédient actif d'un part et avec l'acide ascorbique solubilisé dans du PBS à différentes concentrations de 0.1 à 100UM. 25 Sur le milieu de culture prélevé, un dosage de la quantité de procollagène est effectué (kit PIPc, TAKARA,) par ELISA pour déterminer la quantité de procollagène extracellulaire (tableau 4.1) Sur le milieu de lyse prélevé, un dosage de la quantité de procollagène (kit PIPc, TAKARA,) par ELISA est effectué pour déterminer la quantité de procollagène 30 intracellulaire (tableau 4.2). Un dosage de la quantité d'ADN (kit Picogreen, 22 invitrogen) est également effectué pour rationnaliser l'ensemble des mesures dans chaque puits à la quantité de cellules viables. Le dosage de la quantité de collagène I dans la MEC est effectué et présenté dans le tableau 4.3 Les quantités de collagène et procollagène mesurées sont rapportées à la quantité d'ADN présente dans chaque puits. Une analyse statistique One Way Anova a été effectuée par rapport au témoin. NS : non significatif NT : non analysable * : significatif à p EXEMPLE 7 : Etude des propriétés d'ingrédients screenés avec la méthode io selon l'invention - dosaqe de procollagène dans le milieu de culture : Lors de l'expérience 6 le procollagène a été dosé dans le milieu de culture prélevé à l'étape b) conformément dans la méthode décrite l'exemple 4. Les résultats sont présentés dans le tableau 7. Ingrédient actif Témoin Acide ascorbique extrait végétal (50pM) 1 % (vlv) Procoll Moy 1175 1983 624 (nglml) EC 156 400 18.5 ADN Moy 539 497.3 384.6 EC 22 26.41 16.5 Ratio : Moy 2.18 4.01 1.62 ProColilADN EC 0.33 0.9 0.08 Versus Moy 100 171.17 74.35 Témoin EC 14.98 31.53 3.5 Dunnett - .*. NS ls Conclusion : L'extrait végétal ne démontre pas d'augmentation de la synthèse de procollagène dans le milieu de culture mais avait démontré une augmentation de la quantité de collagène I dans la matrice. - analyse immunohistochimique 20 Protocole : Une analyse immunohistochimique a été effectuée selon le protocole suivant : Les fibroblastes humains normaux issus d'une biopsie ont été ensemencées sur des lames labtecks 8 puits à raison de 40000 celluleslcm2 et cultivées en milieu 28 de culture défini FGM. Les ingrédients évalués, l'extrait végétal 1% v/v ou acide ascorbique 50pM ont été appliqués pendant 72h. Après 72H, le milieu de culture est éliminé et l'immunomarquage est réalisé. L'anticorps primaire anti-collagène I polyclonal est appliqué puis après élimination du milieu l'anticorps secondaire couplé à un fluorochrome alexa 488 est rajouté. L'observation de la fluorescence est réalisée à l'aide du microscope confocal LSM700. Résultats : Les résultats mesurés en fonction de la fluorescence sont les to suivants : Ingrédient actif Témoin Acide ascorbique extrait végétal (50pM) 1% (vlv) Aire /cellules Moy 1871.01 124238.13 217414.26 EC 8426.84 41013.16 47249.63 % 100 114.96 201.18 Conclusion : L'étude de visualisation a permis de confirmer les résultats obtenus avec la méthode selon l'invention. 15 Ces résultats démontrent par ailleurs l'intérêt de screener un ingrédient en fonction de ses propriétés sur la quantité de molécules dans la MEC et justifient l'intérêt de la méthode selon l'invention 29