Brevet FR2963241A1 — publié le 20120203

Vaccin Anti-Paludisme Gestationnel Domaine de l'Invention La présente invention concerne l'utilisation d'une région spécifique de la partie N-terminale de la protéine VAR2CSA dans la prévention ou le traitement du paludisme gestationnel. Contexte de l'Invention Le paludisme (ou malaria) est la plus fréquente des infections parasitaires observées dans le monde. Il est dû à un parasite du genre Plasmodium, qui est transmis lors de la piqûre par une femelle moustique (Anopheles). Plusieurs espèces de Plasmodium peuvent infecter l'être humain, mais Plasmodium falciparum est l'espèce la plus fréquente et la plus pathogène et celle qui est responsable des cas mortels. Une fois introduit dans le sang, le parasite infecte les cellules hépatiques, dans lesquelles il prolifère, avant de circuler à nouveau dans le sang et d'envahir les globules rouges (érythrocytes ou hématies). Le paludisme touche une centaine de pays dans le monde, particulièrement dans les zones tropicales défavorisées d'Afrique, d'Asie et d'Amérique latine ; l'Afrique étant, de loin, le continent le plus affecté. Selon les estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé, le paludisme est responsable annuellement de 400 à 900 millions de cas de fièvres et entre 1 et 3 millions de morts. Les moyens de lutte existants sont les médicaments antipaludiques (dont les plus connus sont la chloroquinine et la quinine) et la lutte contre les moustiques vecteurs du parasite. Mais la situation est d'autant plus préoccupante que depuis plusieurs années, les parasites développent de plus en plus de résistances aux médicaments et les moustiques développent des résistances aux insecticides. Aucun vaccin n'est aujourd'hui disponible. Le paludisme concerne majoritairement les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes, en particulier les primigestes (c'est-à-dire enceintes pour la première fois). Les femmes enceintes sont particulièrement vulnérables car le placenta constitue une cible où les parasites peuvent s'accumuler. Chez la femme enceinte, l'infection palustre peut provoquer toute une gamme d'effets dommageables : avortement spontané, accouchement prématuré, insuffisance pondérale à la naissance, transmission congénitale, et décès néonatal. Dans les zones d'Afrique où le paludisme est endémique, 3 à 5% des décès des nourrissons à la naissance peuvent être imputés au paludisme gestationnel. En outre, il présente également un réel danger pour la mère qui peut souffrir d'une anémie parfois sévère, voire mortelle. Actuellement, la prévention du paludisme chez la femme enceinte repose sur le traitement préventif par la sulfadoxine-pyriméthamine (Cot et al., Br. Med. Bull., 2003, 67: 137-148). Mais ce traitement intermittent n'est pas à même d'assurer une prévention du paludisme pendant l'ensemble de la grossesse : premièrement, parce que l'administration du médicament ne se fait qu'à partir de la 20ème semaine de grossesse (le risque tératogène au cours de l'embryogénèse étant considéré trop important) ; deuxièmement parce qu'il repose sur deux administrations à dose curative de sulfadoxine-pyriméthamine espacées d'au moins un mois, ce qui ne procure qu'une couverture médicamenteuse partielle ; et troisièmement, parce que l'efficacité du sulfadoxine-pyriméthamine est en train de diminuer très largement dans l'ensemble des zones d'endémie palustre en raison de l'expansion de la résistance parasitaire (Cot et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 1998, 59: 813-822; WHO/HTM/MAL/2005.1103. Geneva: World Health Organization; ter Kuile et al., JAMA, 2007, 297: 2603-2616; Mockenhaupt et al., J. Infect. Dis., 2008, 198: 1545-1549; Briand et al., J. Infect. Dis., 2009, 991-1001; Harrington et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106: 9027-9032). Des médicaments sont actuellement à l'étude dans ce contexte ; et de nombreux efforts sont également concentrés vers le développement d'un vaccin contre le paludisme gestationnel. La possibilité de vacciner la femme enceinte ou la jeune fille pré-pubère constituerait un avantage évident sur un traitement médicamenteux, dans la mesure où la couverture préventive de la grossesse serait étendue, et potentiellement de meilleure qualité. Une des stratégies vaccinales envisagées pour lutter contre le paludisme gestationnel est de recréer l'immunité protectrice naturelle. En effet, la sévérité clinique du paludisme dû à Plasmodium falciparum est liée en partie à des altérations des érythrocytes infectés. Ces altérations sont induites par les protéines du parasite qui sont exportées à la surface des érythrocytes durant la phase de développement dans le sang. Certaines de ces protéines de surface de la famille PfEMP1 (Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1), codées par les parasites, confèrent de nouvelles propriétés de cytoadhérence aux érythrocytes. Les érythrocytes sont alors capables de se fixer à la paroi interne des vaisseaux sanguins, empêchant par là même l'acheminement des érythrocytes infectés vers les organes épurateurs du système immunitaire, dont l'un des rôles est de détruire les cellules reconnues comme anormales. Dans le cas du paludisme gestationnel, les érythrocytes parasités se fixent à un sucre, la chondroïtine sulfate A (CSA), présent dans le placenta. Après plusieurs grossesses, les femmes acquièrent des anticorps protecteurs qui bloquent cette adhésion. Une des stratégies vaccinales est de recréer cette immunité protectrice, en bloquant l'adhésion des érythrocytes infectés au placenta. La protéine VAR2CSA, une des protéines de la famille PfEMP1, fait actuellement l'objet de nombreuses recherches en vue de l'obtention d'un vaccin spécifique de la femme enceinte (Tuikue Ndam et al., J. Infect. Dis., 2005, 192: 331-335 ; Chia et al., J. Infect. Dis., 2005, 192: 1284-1293; Tuikue Ndam et al., J. Infect. Dis., 2006, 193: 713-720 ; Dahlbàck et al., PLoS Pathogens, 2006, 2: 1069-1082 ; Badaut et al., Mol. Biochem. Parasitol., 2007, 15: 89-99; Khattab et al., Parasitol. Res., 2007, 101: 767-774; Guitard et al., Malaria J., 2008, 11: 7-10; Guitard et al., Malaria J., 2010, 9: 165; Gangnard et al., "Functional and immunological characterization of the var2csa DVL5e domain of a placental Plasmodium falciparum isolate", Mol. Biochem. Parasitol., 2010, sous presse ; Gnidehou et al., "Insight into Antigenic Diversity of VAR2CSA-DBL5e Domain from Multiple Plasmodium falciparum Placental isolates", Mol. Biochem. Parasitol., 2010, sous presse). Ces travaux se heurtent au polymorphisme de VAR2CSA, mais des essais de phase 1 sont néanmoins envisagés. De plus la totalité du domaine extracellulaire de cette protéine vient d'être exprimée en système hétérologue (Srivastava et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107: 4884-4889 ; Khunrae et al., J. Mol. Biol., 2010, 397: 826-834), ce qui ouvre la porte à l'élaboration de nouvelles approches vaccinales, même si ces dernières doivent faire face aux nombreux épitopes immunodominants qui n'induisent pas des anticorps « antiadhérence ». Il apparaît donc crucial de continuer à explorer et développer de nouvelles stratégies de lutte et de prévention contre le paludisme gestationnel. Résumé de l'Invention Dans le cadre de l'étude de la modulation de la réponse immunitaire vis-à-vis de Plasmodium falciparum pendant la grossesse, les inventeurs ont généré des fragments chevauchants de la séquence du gène var2csa de la souche parasitaire FCR3, les ont insérés dans un plasmide, et ont injecté, par voie intramusculaire, chacun des plasmides obtenus à des souris (vaccination génétique - voir Exemples). L'étude des anticorps ainsi induits contre chaque protéine recombinante secrétée par les cellulaires musculaires des souris a permis aux inventeurs d'identifier la région N-terminale de VAR2CSA, et notamment la région recouvrant le NTS jusqu'à la fin du DBL2x (N-terminal subdomain DBLlx-Idl-DBL2x) de VAR2CSA, comme étant celle qui contient des épitopes capables d'induire in vivo les anticorps qui bloquent l'adhérence au CSA des hématies infectées par Plasmodium falciparum. Les inventeurs ont ensuite produit in vitro, en système eucaryote, la protéine recombinante correspondant à ce fragment de VAR2CSA, ce qui leur a permis de confirmer les observations de la vaccination génétique et de montrer l'existence de ces anticorps chez les femmes multigestes qui possèdent une immunité contre le paludisme gestationnel (voir Exemples). Ces travaux sont les premiers à identifier la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x comme une région antigénique de VAR2CSA impliquée dans l'acquisition de l'immunité protectrice vis-à-vis de la séquestration placentaire qui a lieu dans le paludisme gestationnel. En conséquence, un premier aspect de la présente invention est l'utilisation de séquences polypeptides et polynucléotidiques correspondant à la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes, dans la gestion du paludisme de la femme enceinte. Plus spécifiquement, l'invention concerne un polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA, ou d'une de ses variantes, pour le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel. Dans certains modes de réalisation préférés, le polypeptide est caractérisé en ce que la séquence de la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA est la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence homologue ou un fragment biologiquement actif. L'invention vise également un polypeptide recombinant, synthétique, ou chimérique caractérisé en ce qu'il comprend, ou consiste en, au moins un polypeptide comme défini ci-dessous. L'invention concerne aussi un polynucléotide isolé ou purifié comprenant, ou consistant en, une séquence codant pour la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel. Dans certains modes de réalisation préférés, le polynucléotide est caractérisé en ce qu'il code pour la séquence SEQ ID NO: 1. Dans un autre aspect, la présente invention se rapporte à un vecteur de clonage ou d'expression comprenant au moins un polynucléotide comme décrit ici. Les vecteurs de clonage ou d'expression selon l'invention permettent la production du domaine NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA dans des cellules hôtes. Les vecteurs peuvent être des phages, des plasmides, des cosmides, ou des virus. Le domaine NTS-DBLlx-Idl-DBL2x peut être fusionné avec une autre séquence polypeptidique, formant ainsi une protéine chimérique conduisant à augmenter l'effet thérapeutique recherché. La présente invention couvre également les cellules hôtes (transformées ou recombinantes) comprenant au moins un polynucléotide ou un vecteur tel que décrit ici. Les cellules peuvent être des bactéries, des levures, des cellules d'insectes ou des cellules de mammifères. Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition immunogène comprenant au moins un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique et au moins un élément appartenant au groupe constitué des polypeptides selon l'invention, des polynucléotides selon l'invention, et des vecteurs selon l'invention. Préférablement, une telle composition immunogène est caractérisée en ce qu'elle est capable d'induire des anticorps qui empêchent l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA (chondroïtine sulfate A). Dans une variante de cet aspect, l'invention se rapporte également à des vaccins contre le paludisme gestationnel. En particulier, l'invention fournit un vaccin comprenant au moins un polypeptide selon l'invention, un polynucléotide selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. L'invention vise également un vaccin ADN contenant un ADN nu ou formulé qui comprend et exprime in vivo une séquence nucléotidique codant au moins pour la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une des ses variantes, en fusion ou non avec une ou plusieurs séquences supplémentaires ajoutées. Dans certains modes de réalisation préférés, la séquence nucléotidique du vaccin ADN code pour la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence homologue ou un fragment biologiquement actif. L'invention vise également un vaccin protéique ou polypeptidique comprenant, ou consistant en, la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes. Préférablement, les vaccins selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont capables d'induire des anticorps qui empêchent l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA. Les vaccins décrits ici peuvent en outre comprendre un adjuvant. Dans une autre variante de cet aspect, l'invention concerne des méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel. En particulier, l'invention fournit une méthode pour induire une réponse immunitaire protectrice contre Plasmodium falciparum chez un être humain de sexe féminin, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'une composition immunogène ou d'un vaccin décrit ici. L'invention fournit également une méthode de vaccination d'un être humain de sexe féminin contre Plasmodium falciparum, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'un -5 vaccin, en particulier d'un vaccin ADN décrit ici ou d'un vaccin protéique décrit ici. Les méthodes de traitement et de prévention du paludisme gestationnel s'adressent principalement aux jeunes filles pré-pubères et aux femmes en âge de procréer. Dans certains modes de réalisation préférés, une méthode de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel est caractérisée en ce qu'elle induit, chez l'être humain de sexe féminin, des anticorps qui empêchent l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA. Dans les méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel selon l'invention, l'administration de la composition immunogène ou du vaccin peut se faire par n'importe quelle voie appropriée. Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous. Description Détaillée de l'Invention D'une manière générale, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une région spécifique du domaine extracellulaire de la protéine VAR2CSA de la lignée parasitaire FCR3 pour la prévention et/ou le traitement du paludisme gestationnel. I - NTS-DBL1x-DBL2x Polynucléotides et Polypeptides Relatifs à NTS-DBL1x-Idl -DBL2x La présente invention se rapporte à des polynucléotides et polypeptides dérivés du domaine extracellulaire de VAR2CSA et impliqués dans le paludisme gestationnel, ainsi qu'à leurs applications dans la gestion du paludisme gestationnel. Le gène codant pour VAR2CSA a été isolé chez plusieurs souches parasitaires dont FCR3 (GenBank Accession Number : AY372123) et séquencé. La protéine VAR2CSA correspondante a été déduite (GenBank Accession Number : AAQ73926.1) ont été isolés et séquencés. En particulier, la présente invention concerne des polypeptides isolés ou purifiés correspondant à la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes. Préférablement, un polypeptide selon l'invention comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID NO: 1, une séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence modifiée de la séquence SEQ ID NO: 1 ou encore un fragment biologiquement actif de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'une séquence modifiée. Les termes " NTS-DBLlx-DBL2x " et "NTS-DBLlx-Idl-DBL2x " sont ici employés indifféremment. Ils désignent la région de VAR2CSA constituée par les domaines : Duffy-binding-like domain lx (DBL1x), l'interdomaine 1 (Idl) et Duffy-binding-like domain 2x (DBL2x). L'invention couvre -6 également les polypeptides recombinants, synthétiques ou chimériques comportant au moins un polypeptide selon l'invention, en particulier un polypeptide dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID NO: 1, une de ses séquences homologues, ou une de ses séquences modifiées. Les termes "peptide", "protéine", "séquence peptidique", "séquence polypeptidique", et "polypeptide" sont ici employés indifféremment. Par ces termes, on entend désigner un enchaînement précis d'acides aminés, modifiés ou non, liés entre eux par des liaisons peptidiques. Par "séquence peptidique homologue de la séquence SEQ ID NO: 1", on entend toute séquence peptidique qui diffère de la séquence SEQ ID NO: 1 par substitution, délétion, et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit de acide aminés, à des positions telles que ces séquences peptidiques homologues ont substantiellement les mêmes propriétés biologiques que la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de VAR2CSA. De préférence, une telle séquence peptidique homologue a un pourcentage d'identité tel qu'elle est identique à au moins 75% de la séquence SEQ ID NO: 1, préférablement au moins 85%, plus préférablement encore au moins 95%. Par "séquence peptidique modifiée de la séquence SEQ ID NO: 1", on entend toute séquence polypeptidique qui diffère de la SEQ ID NO : 1 par une ou plusieurs modifications, telles que par exemple les modifications cellulaires post-traductionnelles (ex. "editing", glycosylation, sulfatation, etc) font également partie de l'invention, tout comme l'utilisation de ces séquences modifiées. Par "fragment biologiquement actif de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'une séquence modifiée", on entend une portion de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'une de ses séquences modifiées, qui possède approximativement les mêmes propriétés biologiques que SEQ ID NO: 1 ou des propriétés biologiques supérieures, en particulier en ce qui concerne la faculté d'induire des anticorps inhibiteurs de la cytoadhérence au CSA chez l'être humain. Un fragment selon l'invention correspond généralement une région spécifique de SEQ ID NO: 1 ou d'une séquence modifiée de SEQ ID NO: 1 et comprend un nombre d'acides aminés moins élevé que celui de la séquence SEQ ID NO: 1 ou de la séquence modifiée. La présente invention concerne également des polynucléotides isolés ou purifiés codant pour la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA (ou d'une de ses variantes) ou un polypeptide homologue, et préférablement codant pour la séquence SEQ ID NO: 1, pour une séquence peptidique homologue de la séquence SEQ ID NO: 1, ou pour une séquence peptidique modifiée de la séquence SEQ ID NO: 1, ou encore pour un fragment biologiquement actif de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'une de ses séquences homologues ou modifiées. Les termes "séquence nucléotidique", "acide nucléique", "séquence nucléique", "polynucléotide" et "oligonucléotide" sont ici employés indifféremment. Par ces termes, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir une région d'un acide nucléique, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin ou un ADN simple brin qu'à des produits de transcription de ces ADNs. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences nucléotidiques ou deux séquences peptidiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après alignement optimal. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties au hasard et sur toute la longueur de la séquence. Les termes "alignement optimal" et "meilleur alignement", qui sont utilisés de façon interchangeable ici, désignent l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme décrit ci-dessous est le plus élevé. L'alignement optimal des séquences, nécessaire à la comparaison, peut être réalisé manuellement ou au moyen de logiciels informatiques (GAP, BESTFIT, BLASTP, BLASTN, FASTA, et TFASTA, qui sont disponibles soit sur le site NCBI, soit dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI). Le pourcentage d'identité entre deux séquences nucléotidiques ou deux séquences peptidiques est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100. Préparations de Polynucléotides et Polypeptides Relatifs à NTS-DBL1x-Idl-DBL2x Les polynucléotides et polypeptides de la présente invention peuvent être préparés par n'importe quelle méthode appropriée. Les techniques pour isoler ou cloner un gène ou une séquence nucléotidique codant pour un domaine spécifique d'une protéine sont connues dans l'art et incluent l'isolation à partir d'ADN génomique, la préparation à partir d'ADN complémentaire, ou une combinaison de ces méthodes. Le clonage d'un gène, ou d'une séquence nucléotidique codant pour un -8 domaine spécifique d'une protéine, à partir d'un ADN génomique peut être effectué par exemple en utilisant une réaction de chaîne polymérase (PCR) ou par criblage de librairies d'expression pour détecter les fragments d'ADN clonés avec des caractéristiques structurelles identiques (Innis et al., "PCR: A Guide to Method and Application", 1990, Academic Press: New York). D'autres méthodes d'amplification d'acides nucléiques connues de l'homme du métier peuvent être utilisées, comme par exemple, une réaction en chaîne par ligase (LCR), une transcription activée par ligation (LAT) et la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification). Il est également possible d'utiliser une méthode de synthèse chimique pour préparer une séquence nucléotidique. Les méthodes de synthèse chimique totale de brins d'ADN ou d'ARN sont connues de l'homme du métier, et utilisent des synthétiseurs automatisés commerciaux. Les méthodes pour préparer une séquence peptidique incluent les méthodes chimiques (R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85: 2149-2154; "Solid Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology, G.B. Fields (Ed.), 1997, Academic Press: San Diego, CA), et les méthodes recombinantes (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2'a Ed., 1989, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring, NY) utilisant des cellules hôtes. Un exemple de méthode recombinante pour la production de NTS-DBLlx-Idl-DBL2x est fourni dans les Exemples ci-dessous. Vecteurs de Clonage ou d'Expression La présente invention se rapporte également à des vecteurs de clonage ou d'expression qui permettent la production de NTS-DBLlx-Idl-DBL2x dans des cellules hôtes. En particulier, la présente invention concerne des vecteurs de clonage ou d'expression comprenant au moins une séquence polynucléotide selon l'invention, c'est-à-dire une séquence polynucléotide codant pour NTS-DBLlx-Idl-DBL2x, et codant en particulier pour la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence homologue ou un fragment biologiquement actif. Les vecteurs visés par l'invention peuvent être des phages, des plasmides, des cosmides, ou des virus. Les vecteurs selon l'invention peuvent avantageusement comporter un promoteur et/ou un élément de régulation de l'expression dans la cellule hôte. En particulier, les vecteurs peuvent comporter des séquences capables d'augmenter l'immunogénicité des polynucléotides et polypeptides selon l'invention, par exemple des séquences CpG, le gène du GMCSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) ou des gènes des cytokines ou de chemokines. Les cellules hôtes transformées (ou recombinantes) comprenant au moins un polypeptide ou une vecteur selon l'invention entrent également dans le champ de l'invention. Ces cellules peuvent être choisies parmi les bactéries, les levures, les cellules d'insectes ou de mammifères. II - Compositions Immunogènes et Vaccins Les polypeptides et les polynucléotides selon l'invention sont particulièrement adéquats pour une utilisation comme médicaments dans la gestion du paludisme de la femme enceinte. En effet, comme l'ont démontré les inventeurs, les polypeptides selon l'invention constituent des antigènes du paludisme gestationnel, et les polypeptides selon l'invention codent pour des protéines antigéniques de ce paludisme spécifique. A ce titre, ils peuvent être utilisés comme tels ou sous une forme modifiée en tant que composition immunogène ou vaccin. Une modification appropriée des polypeptides selon l'invention est la réalisation de conjugués. Ceux-ci comportent au moins un polypeptide selon l'invention, lié(s) à un support. Les conjugués peuvent être obtenus par couplage via une liaison convalente entre un polypeptide et un support physiologiquement acceptable, non toxique, naturel ou synthétique, susceptible par exemple d'accroître le caractère immunogène du polypeptide. Concernant les conjugués, on citera à titre d'exemple, la demande WO 2006/124712, qui décrit des méthodes de préparation de conjugués comportant une pluralité de peptides antigéniques de Plasmodium falciparum liés à une protéine support améliorant l'immunogénicité desdits antigènes. Les supports préférés selon l'invention sont choisis parmi les particules virales, des lipides, par exemple des lipides de type C16-C18, les polylysines, les poly(DL-alanine)-poly(Lysine)s, la nitrocellulose, les microparticles de polystyrène, les microparticules de billes de latex, les polymères biodégradables, les microparticules de polyphosphoglycanes, les protéines supports telles que l'OPMC (outer membrane protein complex of Neisseria meningitidis) ou l'OPMC améliorié, la BSA (bovine serum albumin), le TT (tetanus toxoid), l'ovalbumine, la KLH (heyhole limpet hemocyanin), la THY (bovine thyroglobulin), l'HbSAg et l'HBcAg du virus de l'hépatite B, les protéines capsides rotavirus, la protéine L1 du virus papillome humain, la VLP (virus like particle) de type 6, 11 et 16, le tuberculin PPD (purified protein derivative). -10- Les conjugués et les vecteurs de clonage selon l'invention peuvent être avantageusement utilisés comme médicaments, notamment dans des compositions immunogènes ou des vaccins. Compositions Immunogènes Une composition immunogène selon l'invention comprend, en plus d'un polypeptide décrit ici, d'un polynucléotide décrit ici ou d'un vecteur décrit ici, un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Le terme "véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique" désigne tout véhicule ou milieu qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique du principe actif de la composition, et qui n'est pas toxique pour l'individu à la concentration à laquelle il est administré. L'utilisation de tels véhicules ou excipients pour la formulation de substances actives est bien connue dans l'art ("Remington 's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 18' Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA). La formulation d'une composition immunogène de la présente invention peut varier en fonction de la voie d'administration et du dosage. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, une composition immunogène de l'invention peut être administrée sous toute forme appropriée pour l'administration à un être humain, par exemple sous forme solide ou liquide. L'homme du métier sait sélectionner les véhicules et excipients les plus appropriés à la préparation d'un certain type de formulation. Ainsi, par exemple, les excipients tels que l'eau, 2-3-butanediol, solution isotonique de chlorure de sodium, mono ou diglycérides synthétiques, et acide oléique sont souvent utilisés pour la formulation de préparations injectables. Les compositions liquides, y compris les émulsions, microémulsions, solutions, suspensions, sirops, etc., peuvent être formulées en présence de solvants, d'agents solubilisants, d'émulsifiants, d'huiles, d'acides gras et d'autres additifs comme des agents de suspension, des conservateurs, des agents viscosants, etc. Les compositions solides pour administration par voie orale peuvent être formulées en présence d'un excipient inerte comme le citrate de sodium, et éventuellement d'additifs tels que des agents liants, des agents humectants, des agents de désintégration, des accélérateurs d'absorption, des agents lubrifiants, etc. Selon un mode de réalisation préféré, les compositions immunogènes et les vaccins de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants utilisés en combinaison. Des adjuvants classiques tels que le Montanide et/ou l'Alum peuvent être utilisés. Cependant d'autres adjuvants tels que QS21, SBQS2, MF59, mLT, PHL, CpG DNA, phosphate de calcium, sulfate de calcium déshydraté, PLG, CT, LTB, CT/LT, AS02A sont également appropriés. Les compositions immunogènes et vaccins selon l'invention peuvent comporter en outre au moins un antigène spécifique des stages préérythrocytaires (CSP, TRAP, LSA-1, LSA-3, SALSA, STARP, EXP-1), érythrocytaires asexués (MSP-1, MSP-3, AMA-1, EBA-175, GLURP, MSP-2, MSP-4, MSP-5, RAP-2, RESA, PfEMP-1, toxine GPI synthétituq) ou sexués (PfS25). Vaccins, Vaccins Polypeptidiques, Vaccins ADN D'une façon générale un vaccin contre le paludisme gestationnel selon l'invention comprend au moins un polypeptide décrit ici, un polynucléotide décrit ici ou un vecteur de clonage ou d'expression décrit ici et est utilisé pour l'induire chez les sujets vaccinés des anticorps inhibiteurs de la cytoadhérence au CSA. En particulier, l'invention concerne un vaccin ADN (également appelé vaccin plasmidique ou vaccin polunucléotidique) contre le paludisme gestationnel. L'invention concerne aussi un vaccin protéique (également appelé vaccin polypeptidique) contre le paludisme gestationnel. Vaccins Protéiques La présente invention a donc pour objet un vaccin protéique comprenant une séquence polypeptidique correspondant à la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes. Préférablement, la séquence polypeptide d'un vaccin protéique comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID NO: 1, une séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence modifiée de la séquence SEQ ID NO: 1, ou encore un fragment biologiquement actif de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'une de ses séquences homologues ou modifiées. Dans un vaccin protéique selon l'invention, la séquence correspondant à la région NTSDBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA peut être fusionnée avec au moins une autre séquence peptidique (appelée ici "partenaire de fusion" ou "séquence partenaire de fusion") pour former une protéine de fusion. Par "séquence partenaire de fusion", on entend ici une séquence peptidique qui confère à la protéine de fusion une ou plusieurs propriétés souhaitables. Ainsi, une séquence partenaire de fusion peut consister en une protéine qui favorise l'expression de la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x dans la cellule hôte lors de la préparation de la protéine de fusion, et/ou en une protéine qui facilite la purification de la protéine de fusion, et/ou en une protéine qui augmente la stabilité (ex. stabilité plasmatique) -12- de la protéine de fusion (par comparaison avec une séquence correspondant à NTS-DBLlx-Idl-DBL2x non fusionnée), et/ou en une protéine qui favorise l'administration de la protéine de fusion au sujet vacciné, et/ou en une protéine qui augmente l'effet thérapeutique recherché (par exemple en augmentant la réponse immune et vaccinale) et/ou en une protéine présentant une activité biologique ou thérapeutique. Les partenaires de fusion qui peuvent être utilisés dans le contexte de la présente invention incluent, sans limitation, la protéine liant le maltose, la séquence signal de la protéine liant le maltose, des segments poly-histidine capables de lier des ions métalliques, un S-Tag, la glutathione-S-transférase, la thiorédoxine, la (3-galactosidase, streptavidin, dihydrofolate reductase, la séquence signal pelB, la séquence signal ompA, la séquence signal de l'alkaline phosphatase, protéine fluorescente verte, une toxine telle que, par exemple l'entérotoxine LT de E. coli ou sa sous-unité B, un domaine du fragment C de la toxine tétanique, la toxine du choléra ou sa sous-unité B, CTAl-DD. D'autres partenaires de fusion peuvent être l'hormone de croissance humaine, une cytokine immunostimulante telle que : interleukin-2 (IL-2), un facteur de croissance tel que le granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), le granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), des peptides ou hormones tels que la calcitonin, l'interferon-beta, interferon-alpha, le glucagon like peptide 1 (GLP-1), glucagon like peptide 2 (GLP-2), PA toxin, parathyroid hormone (PTH(1-34) and PTH(1-84)), butyrylcho linesterase, glucocerebrosidase (GBA), et exendin-4. La préparation d'un vaccin protéique, qui peut se faire par voie chimique ou biochimique (protéine recombinante) entre dans les compétences de l'homme du métier. L'administration d'un vaccin protéique peut se faire par n'importe quelle voie appropriée, comme par exemple par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, orale, topique ou systémique. Vaccins ADN La présente invention a donc également pour objet un vaccin ADN contre le paludisme gestationnel. La vaccination génétique ou vaccination par ADN a pour but d'induire une réponse immunitaire et consiste à introduire directement dans certaines cellules de l'organisme un gène ou une séquence polynucléotidique codant pour un antigène vaccinal ou un plasmide purifié d'ADN contenant une séquence codant pour l'antigène vaccinal. Les cellules concernées sont, dans l'exemple de l'invention, des cellules musculaires, mais tout autre type de cellule peut convenir, comme par exemple les cellules de la peau. L'administration se fait, de façon non-exclusive, par injection intra-musculaire ou par "bombardement" de particules sur la peau ou encore par voie nasale. L'ADN pénètre dans les cellules musculaires, les cellules de la peau ou autres; et ces cellules synthétisent ensuite elle-même l'antigène. L'antigène est présenté au système immunitaire et déclenche une réponse (la production d'anticorps capables, lors d'une infection, de reconnaître spécifiquement cet antigène sur le parasite). Le vaccin est donc produit, localement, par l'organisme de l'individu à immuniser. Cette méthode de vaccination, simple et peu coûteuse, présente d'importants avantages en termes d'efficacité: l'antigène ainsi produit se présente généralement sous sa séquence peptidique native, fusionnée ou non à une ou plusieurs séquences peptidiques (partenaires de fusion). Surtout, il est produit de façon prolongée par les cellules de l'organisme, et cette présentation durable de l'antigène au système immunitaire devrait permettre d'éviter le recours aux rappels. De plus, les vaccins ADN sont chimiquement définis et thermiquement stables, ce qui réduit la nécessité de maintenir la chaîne du froid. La présente invention a donc pour objet un vaccin ADN comprenant un ADN nu, en particulier plasmide vaccinal circulaire, super-enroulé ou non, ou une molécule d'ADN linéaire, incorporant et exprimant in vivo une séquence nucléotidique codant pour la région DBLlx-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes. Par "ADN nu", on entend comme cela est aujourd'hui communément accepté, une unité de transcription ADN sous forme d'une séquence polynucléotidique comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour un antigène vaccinal et les éléments nécessaires à son expression in vivo. Les polynucléotides selon l'invention peuvent être avantageusement insérés dans un plasmide de type DNA-CSP, Nyvac pf7, VR1020, VR1012, etc. Les éléments nécessaires à l'expression d'une séquence nucléotidique in vivo incluent, par exemple, un promoteur, une région d'initiation de la transcription, et une région de terminaison de la transcription qui sont fonctionnels dans une cellule humaine. De plus, des séquences qui augmentent l'expression génique, comme les introns, les séquences "enhancer" et les séquences "leader" sont souvent nécessaires pour l'expression d'une séquence codant pour une protéine immunogène. Comme il est connu dans l'art, ces éléments sont préférablement liés de façon opérationnelle à la séquence nucléotidique qui doit être exprimée. Les termes "lié opérationnellement" et "lié de façon opérationnelle" sont utilisés indifféremment et font référence à un lien fonctionnel entre les séquences régulatrices et la séquence d'acide nucléique qu'elles contrôlent. -14- Des exemples de promoteurs utiles dans les vaccins ADN, en particulier, dans les vaccins ADN destinés à la vaccination humaine, incluent de façon non-limitative les promoteurs du virus SV40, du virus de tumeur mammaire de souris (MMTV), du virus VIH, du virus de Moloney, du cytomégalovirus (CMV), du virus Epstein-Barr (EBV), du virus sarcome Rous (RSV), ainsi que les promoteurs de gènes humains tels que le gène humain de l'actine, de la myosine, de l'hémoglobine, de la créatine musculaire et de la métallothionéine. La construction d'un vaccin ADN entre dans les compétences de l'homme du métier. Il est également envisagé que l'ADN nu soit incorporé dans un vecteur de médicament. Des exemples de vecteurs de médicaments appropriés incluent de façon non-limitative des microcapsules biodégradables, des complexes immuno-stimulants, des liposomes, des lipides cationiques et des vecteurs vivants génétiquement atténués comme des virus et des bactéries. Un vaccin ADN de l'invention peut également être administré en conjonction avec un agent qui améliore la pénétration du matériel génétique du vaccin dans les cellules traitées. Ainsi le vaccin ADN peut être formulé pour contenir un tel agent ou être administré en même temps qu'un tel agent. Des exemples d'agents qui améliorent la pénétration du matériel génétique du vaccin dans les cellules traitées incluent de façon non limitative les esters d'acide benzoique, les anilides, les amidines, les uréthanes, et leurs sels d'hydrochlorure (U.S. Pat. No. 6,248,565). L'administration de l'ADN aux cellules peut-être favorisée par des vecteurs chimiques (comme, par exemple, les polymères cationiques ou les lipides cationiques), des techniques physiques telles que l'électroporation, la sonoporation, la magnétofection, etc, ou encore des vecteurs viraux tels que les virus associés à l'adénovirus, etc. III - Utilisations des Compositions Immunogènes et Vaccins Les compositions immunogènes et les vaccins peuvent être avantageusement utilisés pour immuniser des êtres humains de sexe féminin (des jeunes filles pré-pubères et des femmes en âge de procréer) dans le cadre d'une thérapie préventive du paludisme gestationnel. En conséquence, l'invention concerne également des méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel. En particulier, l'invention fournit une méthode pour induire une réponse immunitaire protectrice contre Plasmodium falciparum chez un être humain de sexe féminin, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'une composition immunogène ou d'un vaccin décrit ici. L'invention fournit -15- également une méthode de vaccination d'un être humain de sexe féminin contre Plasmodium falciparum, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'un vaccin, en particulier d'un vaccin ADN ou d'un vaccin protéique décrit ici. Dans certains modes de réalisation préférés, une méthode de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel est caractérisée en ce qu'elle induit, chez l'être humain de sexe féminin, des anticorps qui empêchent l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA. Dans les méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel selon l'invention, l'administration de la composition immunogène ou du vaccin peut se faire par n'importe quelle voie appropriée (voie orale, parentérale, mucosale). Dans certains modes de réalisation, l'administration d'un vaccin ADN se fait par voie intramusculaire, intradermique, ou mucosale. Dans d'autres modes de réalisation, l'administration d'un vaccin protéique se fait, par exemple, par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, orale, topique ou systémique. Une composition immunogène ou un vaccin selon l'invention peut être administré en une seule dose ou en plusieurs doses. L'homme de l'art saura déterminer la dose efficace de protéine immunisante ou d'ADN à utiliser dans chaque protocole d'immunisation ou de vaccination. IV - Kits La présente invention vise également un kit pour la prévention contre le paludisme gestationnel. Plus spécifiquement, le kit comprend du matériel utile pour la réalisation d'une vaccination selon la méthode de l'invention. En général, un kit comprend une composition immunogène ou un vaccin selon l'invention, et des instructions pour effectuer une vaccination. De façon optionnelle, le kit peut en outre comprendre des moyens pour effectuer la vaccination. Le kit peut comprendre des réactifs ou des solutions pour la préparation de la composition à administrer. Les différents composants du kit peuvent être fournis sous forme solide (par exemple sous forme lyophilisée) ou sous forme liquide. Un kit peut éventuellement inclure un récipient contenant chacun des réactifs ou solutions, et/ou des récipients (tubes à essais, flacons, etc.) pour réaliser la préparation de la composition à administrer. Enfin, une notice sous la forme prescrite par une agence gouvernementale régulant la vente et l'utilisation de produits pharmaceutiques peut être incluse dans le kit. -16- A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence. Les exemples suivants et les figures sont présentés pour illustrer certains modes de réalisation des procédures décrites ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Exemples Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention. Dans l'étude présentée ci-dessous, les inventeurs ont investigué la possibilité de produire, par in vivo DNA electrotransfert intramusculaire, des antisera fonctionnels envers des régions restreintes de VAR2CSA. Ils ont montré que les anticorps levés contre NTSDBL1X-DBL2X, une construction spécifique de VAR2CSA, bloquent efficacement la fixation de parasites au CSA, et sont aussi efficaces dans leur capacité à bloquer cette fixation que les anticorps induits contre le domaine extracellulaire entier de VAR2CSA. Ces observations ont été confirmées par injection de la protéine recombinante NTS-DBLlx-Idl-DBL2x. Méthodes Utilisées 1. Immunisation de Souris et Criblage d'Anticorps Utilisant des constructions de domaines simples et multiples des protéines de VAR2CSA provenant de la nouvelle annotation du gène de var2csa du génome du parasite FCR3 (qui est disponible à Sanger.ac.uk) comme décrit précédemment (Khunrae et al., J. Mol. Biol., 2010, 397 : 826-834). Utilisant des constructions de domaines simples et multiples des protéines de VAR2CSA provenant du gène synthétique de var2csa, des séquences ont été clonées dans l'épine dorsale du vecteur dérivé de pVaxl (Invitrogen) dans lequel le promoteur original de cytomégalovirus (CMV) a été remplacé par le promoteur CMV du plasmide de pCMVb (Clontech) comme déjà décrit (Leblond et al., Bioconjug. Chem., 2007, 18: 484-493). Des injections in vivo d'ADN de plasmide ont été effectuées sur souris femelles suisses âgées d'une semaine (Janvier, France), et le transfert d'ADN a été assuré par des impulsions électriques comme précédemment décrit (Mir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96: 4262-4267). Des protéines recombinantes représentant chacun des 6 différents domaines DBL du VAR2CSA de FCR3 ont été utilisées dans des tests ELISA pour évaluer la réponse anticorps contre la construction spécifique de plasmide dans des prélèvements consécutifs. 2. Evaluation d'Anticorps sur le Parasite Pour examiner la réactivité d'IgG induits contre les différentes constructions, les déposants ont d'abord utilisé des érythrocytes infectés par la souche homologue du parasite FCR3. L'expression de VAR2CSA a été continuellement enrichie dans la population de parasites par adhésion des érythrocytes infectés sur des cellules BeWo comme précédemment décrit (Haase et al., Infect. Immun., 2006, 74: 3035-3038). La lignée de parasites en résultant est reconnue de manière sexe-spécifique par des plasmas de région endémique pour le paludisme et fixe spécifiquement la décorine (données non présentées). Les déposants ont utilisé la cytométrie en flux (FACS, Calibur) pour examiner la réactivité de sérum des souris vaccinées envers la surface des érythrocytes infectés. En bref, des cultures de parasites sélectionnés par rapport à CSA ou des isolats de parasites de terrain ont été enrichis pour contenir des parasites aux stades trophozoïtes âgés et schizontes par exposition à un champ magnétique fort (VarioMACS et colonnes CS, Miltenyi). Des aliquotes (2 x 105 érythrocytes infectés) ont été marquées au bromure d'éthidium et séquentiellement exposées à du sérum humain/murin puis à des IgG-FITC anti-humain/murin (Invitrogen). Les données ont été acquises sur un cytomètre en flux (FACSCalibur, Beckman). Tous les échantillons concernant un isolat particulier de parasites ont été traités et analysés lors d'un même essai. 3. Expression et Purification de Protéines Des cellules d'insecte Hi5 cultivées dans 600 mL de milieu sans sérum (Gibco, 10486) ont été infectées avec 18 mL de la 2ème amplification des particules de recombinaison de virus. Après deux jours d'induction, les cellules ont été centrifugées (8000 g, 4°C, 10 minutes) et le surnageant a été filtré sur deux membranes de 10 kDa NMWC PES (0,45 µm) (GE Healthcare). Le surnageant a alors été concentré à 30 mL et diafiltré six fois sur ÀKTA (GE Healthcare) avec le tampon A (10 mM de phosphate de sodium pH 7,4, 500 mM de NaCl). Le rétentat a été récupéré du système et filtré (0.2 µm). Avant le chargement sur -18- colonne HisSelect, 150 µL d'imidazole 1 M (Sigma-Aldrich) pH 7,4 ont été ajoutés à l'échantillon, donnant une concentration finale en imidazole de 15 µM. Les échantillons pour les colonnes Capto S HP et d'héparine HP ont été dilués au 1/10 avec 10 mM de phosphate de sodium pH 7,4, donnant une concentration finale en sel de 50 mM de NaCl. La protéine attachée a été éluée avec le tampon A + 200 mM d'imidazole (HisSelect) ou un gradient de sel s'étendant de 50 mM à 1000 mM de NaCl (Capto S et héparine H). 4. Test de Réactivité des Sérums Humains Les niveaux plasmatiques d'anticorps contre les protéines recombinantes ont été mesurés par ELISA à une concentration en protéine de 0,5 µg/mL. Les niveaux d'anticorps ont été mesurés chez des femmes enceintes, primagravides et multigravides ; et des sérums de femmes françaises enceintes non-exposées et d'enfants et d'hommes sénégalais exposés à la malaria ont été utilisés comme contrôles négatifs. Les sérums des femmes enceintes et des contrôles négatifs ont également été testés contre la protéine recombinante PfAMAl de la souche FVO. 5. Préparation d'IgG Les immunoglobulines IgG totales de sérums de souris ont été purifiées sur colonne de protéine G HP conformément aux recommandations du fabricant (GE Healthcare). Les immunoglobulines IgG construction-spécifiques ont été purifiées à partir de sérum humain sur colonne Hi-Trap sur laquelle la protéine recombinante correspondante avait été couplée conformément aux recommandations du fabricant (GE Healthcare). 6. Inhibition de la Fixation d'Erythrocytes Infectés au CSPG par des IgG Spécifiques Des boîtes de Pétri (Falcon) ont été recouvertes avec 20 µL de ligand (1% BSA, decorin 5 µg/mL) dilué dans du PBS. Les spots ont été incubés pendant la nuit à 4°C en chambre humide. Chaque spot a été aspiré en utilisant une pompe à vide, puis bloqué avec 3% BSA dans du PBS, 30 minutes à température ambiante. Les suspensions de parasites âgés ont également été bloquées dans du BSA/RPMI pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir ôté le tampon de blocage, 20 µL de suspension de parasites/anticorps ou de suspension de parasites/500 gg CSA ont été rapidement ajoutés à chaque spot et incubés 12 minutes en chambre humide à température ambiante. La boîte de Pétri a été lavée sur une station de migration utilisant un écoulement continu de PBS jusqu'à ce que toutes les cellules non fixées soient au centre de la boîte. Les cellules non fixées ont été aspirées par le vide et les spots ont été fixés avec 1,5% glutaraldéhyde dans du BPS, pendant 10 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été colorées avec 10 mL d'une solution de Giemsa à 10% pendant 2 minutes à température ambiante. Toutes les cellules ont été comptées au microscope avec un objectif à immersion afin de distinguer les érythrocytes infectés et les érythrocytes non-infectés. Légendes des Figures Figure 1 est un graphe présentant les résultats des analyses fonctionnelles des anticorps anti-VAR2CSA obtenus par immunisation génétique chez la souris. Ce graphe montre la réactivité (présentée en gris) des anticorps contre VAR2CSA natif exprimé à la surface des érythrocytes infectés par FCR3 adhérant au CSA mesurée par cytométrie en flux, et la capacité (présentée en noir) des antisera à empêcher la fixation au CSA des érythrocytes infectés par FCR3 et exprimant VAR2CSA. Les résultats obtenus sur 5 souris sont indiqués pour chaque construction. Figure 2(A) montre la réactivité mesurée par cytométrie en flux des IgG murines purifiées dirigées contre VAR2CSA natif exprimé sur la surface des érythrocytes infectés par FCR3 adhérant au CSA. a : anti-BDL6, b : anti-DBL 1+2, c : pré-vaccination, d : contrôle. Figure 2(B) est un graphe présentant la capacité des IgG purifiées anti-DBLIX-DBL2X à empêcher l'adhésion au CSA des érythrocytes infectés par FCR3 VAR2CSA. Figure 3 est un SDS-PAGE de NTS-DBLIX-DBL2X purifié sur colonne de 1 mL HisSelect (Ni +), de 1 mL Capto S HP (IEX) et de 1 mL HP d'héparine (Hep), respectivement. 2,5 et 5 µg de la protéine recombinante purifiée sont déposées sur un gel acrylamide en présence ou non de réducteur (DTT: dithiothréitol). Figure 4 illustre la spécificité de la reconnaissance de NTS-DBLIX-DBL2X par les anticorps. (A) montre la reconnaissance en ELISA d'un antigène de P. falciparum non spécifique du paludisme gestationnel : la protéine AMA1 par les IgG plasmatiques ; (B) montre la reconnaissance en ELISA de NTS-DBLIX-DBL2X par les IgG plasmatiques ; (C) montre la reconnaissance en Western Blot de NTS-DBLIX-DBL2X par des IgG spécifiques du tag histidine ; (D) montre la reconnaissance en Western Blot de NTS-DBLIX-DBL2X par des IgG totales purifiées d'un pool de plasma de multigestes du Bénin ; et (E) montre la reconnaissance en Western Blot de NTS-DBLIX-DBL2X par des IgG spécifiques de NTSDBL1X-DBL2X purifiées par affinité à partir d'un pool de plasma de multigestes du Bénin. Figure 5 montre que les IgG anti-NTS-DBLIX-DBL2X sont capables de reconnaitre spécifiquement et d'inhiber l'adhérence des parasites du paludisme gestationnel au CSA. L'activité des anticorps a été mesurée sur 8 isolats parasitaires fraichement recueillis de femmes enceintes du Bénin. Les globules rouges parasités par la souche HB3 et sélectionné pour le phénotype d'adhérence au CSA ont également été étudiés. Aucune fixation n'est visible sur la BSA. Les identifiants des parasites sont présentés en haut de la figure. Figure 6 montre que des anticorps purifiés par affinité contre la protéine recombinante NTS-DBLIX-DBL2X inhibent l'adhérence des parasites FCR3-Bewo sur la CSA. Les IgG totales du pool de plasmas négatifs à 2 mg/mL n'inhibent pas l'adhérence. Figure 7 montre que comme les anticorps issus de la vaccination génétique, ceux produits par la vaccination protéique inhibent l'adhésion des parasites au CSA. L'activité des anticorps induits chez 4 souris a été mesurée sur la souche FCR3-Bewo. Les plasmas recueillis après la deuxième immunisation avec la protéine recombinante NTS-DBLlx-Idl-DBL2x (DBL1,2) produite chez baculovirus sont capables d'inhiber totalement l'adhérence des parasites sur la CSA. Résultats L'électrotransfert d'ADN dans le muscle squelettique a été employé pour induire efficacement un antisérum de haut-titre contre diverses constructions de la protéine de VAR2CSA chez la souris. Avant la vaccination, il est impératif que le meilleur vecteur d'expression d'ADN soit construit pour obtenir un haut niveau d'expression d'antigène. L'application des impulsions électriques augmente la captation d'ADN, ce qui a pour effet d'augmenter l'expression du gène de 100 à 1000 fois (par rapport à une administration d'ADN nu) et d'augmenter la réponse immunitaire envers le transgène (Bachy et al., Vaccine, 2000, 19: 1688-1693 ; Otten et al.,Vaccine, 2004, 22: 2489-2493). Toutes les constructions de simples et de multi-domaines de VAR2CSA basés sur FCR3 ont induit des anticorps après la vaccination. Bien que tous les simples et multi-domaines de VAR2CSA ont induit des anticorps réagissant avec VAR2CSA natif sur la surface des érythrocytes infectés, il s'est avéré que les constructions contenant DBLIX, DBL2X, DBL5E et DBL6E étaient les plus efficaces à induire des anticorps réactifs avec la surface (valeurs de MFI, Figure 1). Ces anticorps réactifs de surface ont été obtenus chez les cinq souris immunisées, mais pour les autres constructions il y avait une différence marquée entre la capacité des anticorps induits à identifier la protéine native entre les différents animaux des groupes (Figure 1). Le test d'adhésion statique en boîte de Pétri décrit ci-dessus a été employé pour examiner la capacité des sérums à empêcher la fixation au CSA des érythrocytes infectés par la souche parasitaire FCR3 exprimant VAR2CSA. De toutes les combinaisons de domaines de FCR3 VAR2CSA examinées, les immunogènes situés entre la NTS (séquence N-terminale) et le DBL3X ont induit de anticorps inhibiteurs (Figure 1). Des anticorps fortement inhibiteurs ont été obtenus avec les constructions NTS-DBL1-Idl-DBL2. Les constructions contenant le DBL4x-Id4 avec les mêmes frontières qui ont induit des anticorps inhibiteurs chez le rat (Nielsen et al., Infect. Immun., 2009, 77 : 2482-2487) ont été sous-clonés dans le plasmide pVaxl et employés pour la vaccination. Bien qu'une réponse efficace ait été obtenue chez la souris, cette construction n'a pas permis d'obtenir les anticorps inhibiteurs comme précédemment chez le rat (résultats non présentés). Pour confirmer que l'inhibition observée avec l'antisérum NTS-DBL1X-Idl-DBL2X était IgG-dépendante, les IgG des souris immunisées avec cette construction ont été purifiées sur protéine G et leur activité d'inhibition de l'adhésion a été étudiée. Les IgG purifiées ont empêché approximativement 100% de l'adhésion à une concentration de 0,5 mg/mL en immunoglobulines IgG totales, alors que les IgG purifiées de sérum pré-vaccination ou de souris immunisées avec la construction de domaine DBL6e de var2csa ne bloquent pas l'adhésion à une concentration de 1 mg/mL (Figure 2B). Clonage, production et purification de la partie NTS-DBL1X-Idl-DBL2X de VAR2CSA. La construction du double domaine comportant la moitié de la séquence N-terminale (NTS-DBL1X-Idl-DBL2X - SEQ ID NO : 1) de VAR2CSA de la souche FCR3 a été clonée pour permettre la traduction de l'acide aminé N8 à l'acide aminé A864. Le recombinant correspondant au fragment NTS-DBL1X-Idl-DBL2X inséré dans le baculovirus a été exprimé et sécrété comme protéine soluble dans le surnageant des cellules Hi5 infectées (Figure 3). L'obtention de la protéine de NTS-DBL1X-Idl-DBL2X correspondant à la taille prévue (105 kDa) a été confirmée sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante en présence ou non de réducteur (DTT). La formation de dimère qui disparaît avec la réduction au DTT est observée (Figure 3). Spécificité des IgG Plasmatiques pour NTS-DBLIX-ID1-DBL2X Recombinant. La reconnaissance de la protéine NTS-DBLIX-Idl-DBL2X par les sérums montre une spécificité pour les sérums des femmes enceintes vivant en région d'endémie palustre. Une reconnaissance parité-dépendante de la protéine est également visible et démontre que cette région de VAR2CSA contient des épitopes spécifiques des parasites placentaires (Figure 4B). Immunisation des Souris avec la Protéine Recombinante NTS-DBLIX-Idl-DBL2X Exprimée en Baculovirus. Les anticorps induits chez la souris par la protéine recombinante NTS-DBLIX-Idl-DBL2X ont montré les mêmes propriétés que ceux induits par les constructions plasmidiques utilisées en vaccination génétique. Leur réactivité avec les antigènes de surface du globule rouge parasité par les souches FCR3 et HB3 sélectionnés sur les cellules BeWo était similaire. De même les propriétés inhibitrices vis-à-vis de l'adhérence de ces hématies parasitées au récepteur CSA étaient reproduites (Figure 7). Ces observations ont conforté le rôle du fragment NTS-DBLIX-Idl-DBL2X dans l'induction des anticorps anti-adhérence et la possibilité d'induire ces anticorps par vaccination avec des protéines recombinantes reproduisant cette région de VAR2CSA. Reconnaissance des Antigènes de Surface des Globules Rouges Provenant de Femmes Enceintes du Bénin. Les anticorps anti-NTS-DBLIX-Idl-DBL2X induits chez la souris ont montré une reconnaissance spécifique des globules rouges parasités isolés des femmes enceintes du Bénin. Une forte reconnaissance des parasites a été observée sur les 8 isolats étudiés. L'activité inhibitrice de la cytoadhérence a été mise en évidence sur 7 des 8 isolats (Figure 5). Ce résultat démontre que le fragment NTS-DBLIX-Idl-DBL2X contient des épitopes communément exprimés par les isolats parasitaires spécifiques des femmes enceintes. Cette réactivité croisée est une observation majeure et souligne le rôle que pourraient jouer les anticorps anti-NTS-DBLIX-Idl-DBL2X dans le mécanisme de protection. Encore plus intéressante a été la mise en évidence de la présence de tels anticorps anti-adhérence chez les femmes multigestes immunes, anticorps spécifiques de cette région de VAR2CSA. En effet, les anticorps purifiés par affinité contre la protéine recombinante NTSDBL1X-Idl-DBL2X ont montré des propriétés inhibitrices de l'adhérence des parasites FCR3-Bewo sur la CSA (Figure 6). C'est la première fois que cette observation est faite, et démontre l'intérêt de cette partie de VAR2CSA dans l'induction des anticorps anti-adhérence chez les femmes enceintes exposées. Les anticorps purifiés à partir de sérum de femmes multigestes préalablement confirmés comme possédant des propriétés anti-adhérences, suggèrent que cette propriété acquise dans les conditions naturelles est au moins en partie -23- médiée par la réponse anticorps dirigés contre des épitopes contenus dans le fragment NTSDBL1X-Idl-DBL2X de VAR2CSA. Conclusions Ce travail démontre que des anticorps capables de reconnaître la surface des globules rouges parasitaires peuvent être induits par vaccination génétique ou protéique. La vaccination protéique est très généralisée. La vaccination génétique offre une alternative technologique flexible, peu coûteuse et rapide pour le screening d'un grand nombre de constructions antigéniques. Cette étude a permis d'identifier une région de la protéine VAR2CSA qui possède des propriétés fonctionnelles évidentes dans l'induction des anticorps capables d'empêcher l'adhérence des parasites au récepteur placentaire CSA. La partie N-terminale de la protéine VAR2CSA paraît jouer un rôle majeur dans la conformation requise pour l'interaction avec le CSA de VAR2CSA telle qu'exprimée à la surface du globule rouge parasité. Ceci suggère la présence d'épitopes universels impliqués dans l'induction de la réponse anti-adhérence dans la région NTS-DBLIX-DBL2X de VAR2CSA. Les résultats de ce travail démontrent l'intérêt de la partie N-terminale de VAR2CSA et notamment la région NTS-DBLIX-DBL2X pour le développement vaccinal. REVENDICATIONS1. Polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel. 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de la région NTS-DBL1x-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA est la séquence SEQ ID NO: 1. 3. Polypeptide recombinant ou chimérique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide selon la revendication 1 ou la revendication 2. 4. Polynucléotide isolé ou purifié comprenant, ou consistant en, une séquence codant pour la région NTS-DBLIx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une des ses variantes, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel. 5. Polynucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence de la région NTS-DBLIx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA est la séquence SEQ ID NO: 1. 6. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant au moins un polynucléotide selon la revendication 4 ou la revendication 5. 7. Cellule hôte comprenant au moins un polynucléotide selon la revendication 4 ou la revendication 5 ou au moins un vecteur selon la revendication 6. 8. Composition immunogène comprenant au moins un véhicule ou excipient acceptable sur la plan pharmaceutique et au moins un élément appartenant au groupe constitué des polypeptides selon la revendication 1 ou la revendication 2, des polypeptides selon la revendications 3, des polynucléotides selon la revendication 4, des polynucléotides selon la revendication 5, et des vecteurs selon la revendication 6. 9. Vaccin contre le paludisme gestationnel comprenant au moins un élément appartenant au groupe constitué des polypeptides selon la revendication 1 ou la revendication 2, des polypeptides selon la revendication 3, des polynucléotides selon la revendication 4, des polynucléotides selon la revendication 5, et des vecteurs selon la revendication 6.. Vaccin ADN contre le paludisme gestationnel comprenant un ADN nu comprenant une séquence nucléotidique codant pour la région NTS-DBL1x-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une des ses variantes et les éléments nécessaires à l'expression de ladite séquence nucléotidique in vivo. 11. Vaccin protéique contre le paludisme gestationnel comprenant un polypeptide consistant en la région NTS-DBLIx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA ou d'une de ses variantes et, fusionnée audit polypeptide, une séquence partenaire de fusion. 12. Vaccin ADN selon la revendication 10 ou vaccin protéique selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence de la région NTS-DBL 1 x-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA est la séquence SEQ ID NO: 1. 13. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 comprenant en outre au moins un adjuvant.