Brevet FR2962133A1 — publié le 20120106

Plusieurs technologies telles que la fermentation à grande échelle sont appliquées pour la production industrielle d'huile à partir de microorganismes en utilisant comme substrat des matières grasses ou du glycérol. Dans le cadre de ces projets, les microorganismes sont utilisés comme usine cellulaire en réorientant leur métabolisme cellulaire vers la production de composés d'intérêt industriel ou alimentaire, tels que les esters cireux, les isoprénoides, les polyhydroxyalkanoates et les acides gras hydroxylés. La plupart de ces technologies ciblent la production de lipides de réserve avec une structure et/ou une composition spécifique. Ceux-ci comprennent les huiles enrichies en acides gras polyinsaturés essentiels qui peuvent être potentiellement utilisés comme complément alimentaire, les lipides ayant des similitudes de composition au beurre de cacao et des huiles non spécifiques destinées à être utilisées dans la synthèse des biocarburants. De ce fait, on constate un intérêt grandissant pour l'amélioration de la composition et de la teneur en huile des microorganismes, particulièrement des levures. Les microorganismes oléagineux sont des organismes capables d'accumuler des réserves lipidiques pouvant dépasser 20 % de la matière sèche de la cellule. La levure Yarrowia lipolytica est, parmi ces microorganismes, l'un des plus étudiés et les plus utilisés, de par sa capacité à accumuler des lipides cellulaires jusqu'à 40 % de son poids sec. Les levures, et en particulier Y. lipolytica, sont capables d'utiliser efficacement des substrats hydrophobes, par exemple des alcanes, des acides gras et des huiles comme seule source de carbone (Fickers et al., FEMS Yeast Research, 5(6-7): 527-543, 2005). Les chaînes aliphatiques ingérées peuvent être utilisées pour la production d'énergie ou accumulées sous des formes inchangées ou modifiées. Les molécules de stockage telles que les triglycérides (TG) et/ou les esters de stérols, (sterylesters ; SE), incapables de s'intégrer dans les bicouches de phospholipides, se groupent pour former le noyau hydrophobe de corps lipidiques (lipid bodies ; LB). Lesdits corps lipidiques ont longtemps été uniquement considérés comme un stockage de lipides neutres pouvant être mobilisés en période de privation. Toutefois, l'image desdits corps lipidiques comme simple compartiment de stockage a dû être révisée depuis que de nombreuses protéines desdits corps lipidiques ont été identifiées comme des enzymes impliquées dans le métabolisme lipidique, en particulier dans la synthèse et/ou la dégradation des triglycérides. Dans les levures, la synthèse des triglycérides suit la voie Kennedy. Les acides gras libres sont activés pour le coenzyme A (CoA) et utilisés pour l'acylation du glycérol, pivot de la synthèse des triglycérides. Dans la première étape d'assemblage de triglycérides, le glycérol-3-phosphate (G-3-P) est acylé par l'acyltransférase spécifique du glycérol-3-phosphate (glycerol-3-phosphate acyltransférase ou SCT1) pour donner de l'acide lysophospatidique, qui est ensuite acylé par l'acyltransférase spécifique de l'acide lysophosphatidique (Phosphatidic acid acyltransférase ou SLC1) pour donner de l'acide phosphatidique (PA). Celui-ci est ensuite déphosphorylé par une phosphohydrolase spécifique de l'acide phosphatidique (phosphatidic acid phosphohydrolase (PAP)) pour libérer du diacylglycérol (DAG). Dans la dernière étape le diacylglycérol est acylé soit par une diacylglycérol acyltransférase soit par une phospholipide diacylglycérol acyltransférase pour produire des triglycérides. Le tableau 1 décrit les gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras chez les levures, particulièrement chez Yarrowia lipolytica, (YL). Les séquences sont accessibles par leurs noms ou numéros d'accession à l'adresse htt~:llcbi.labri.fr/Genolevures!index. rht# Dans les levures, la dégradation des acides gras se produit par une bêta-oxydation, un processus en plusieurs étapes nécessitant quatre activités enzymatiques différentes. Chez les levures, les enzymes sont essentiellement localisées dans les peroxysomes, contrairement aux mammifères chez qui elles sont localisées dans les mitochondries et les peroxysomes. La mobilisation des lipides accumulés se produit au cours des trois phases distinctes : (i) au cours de la phase exponentielle, les composés lipidiques stockés sont utilisés pour la synthèse des lipides membranaires afin de soutenir la croissance et la division cellulaire, (ii) au cours de la phase stationnaire, lors de l'épuisement des nutriments, les acides gras libres sont libérés, plutôt lentement, à partir des triglycérides et 30 soumis à la [3- oxydation peroxysomale ; (iii) en sortie de phase de carence, par exemple quand les cellules sortent de phase stationnaire et ré-entrent dans la phase de croissance végétative avec supplémentation en carbone, les dépôts lipidiques sont très rapidement dégradés en acides gras libres. Le glycérol-3-phosphate (G3P), est un acteur crucial dans le métabolisme des triglycérides. Il existe deux voies de synthèse pour le glycérol-3-phosphate. - Dans la première, le glycérol-3-phosphate est dérivé du glycérol par l'intermédiaire de la glycerol kinase codée par le gène GUT1. - Dans la deuxième voie, le glycérol-3-phosphate est directement synthétisée à partir de la dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Cette réaction est catalysée par la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (codée par le gène GPD1). Cette dernière réaction est réversible et la formation de DHAP à partir de glycérol-3- phosphate est catalysée par une deuxième isoforme de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase, dont le gène est dénommé GUT2. Les présents inventeurs ont précédemment montré que l'inactivation du gène GUT2 entraine une accumulation accrue de lipides chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica (WO 2010/004141 ; Beopoulos et al., Appl Environ Microbiol., 74(24): 7779- 7789, 2008). Le gène GUT2 code l'isoforme Gut2p de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase, laquelle catalyse la réaction d'oxydation du glycérol-3-phosphate en DHAP. De façon surprenante et inattendue, la surexpression de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase codée par le gène GDP1 (SEQ ID NO : 1 ; SEQ ID NO : 2), qui est l'enzyme catalysant la réaction de synthèse de glycérol-3-phosphate à partir du DHAP, n'a aucun effet sur l'accumulation de lipides dans une souche qui est par ailleurs sauvage. De même, la surexpression de GPD1 dans un mutant inactivé pour le gène GUT2 n'a aucun effet sur l'accumulation de lipides dans les levures. En revanche, les inventeurs ont montré qu'il est possible d'obtenir une accumulation de 25 lipides en surexprimant le gène GPD1 dans des levures chez lesquelles la bêta-oxydation des acides gras est déficiente. Cette accumulation est bien plus importante que tout ce qui a été décrit précédemment dans l'art antérieur. En particulier, alors que les souches dans lesquelles GUT2 est inactivé accumulent au plus 50 % de lipides quand elles sont cultivées en présence 30 d'acide oléique (WO 2010/004141 ; Beopoulos et al., Appl Environ Microbiol., 74(24): 7779-7789, 2008), les souches de l'invention, qui sont déficientes dans la bêta-oxydation et qui surexpriment le gène GPD1, accumulent, dans les mêmes conditions, plus de 60 % de lipides. En outre, les souches présentant une déficience de la bêta-oxydation et surexprimant 35 le gène GPD1 présentent la particularité de lyser facilement, ce qui n'est pas le cas avec les souches de l'art antérieur. Cette propriété présente un intérêt certain d'un point de vue industriel, puisque facilitant la lyse des cellules pour récupérer les lipides produits. La présente invention concerne donc une souche de levure chez laquelle la bêta-5 oxydation des acides gras est déficiente et qui surexprime le gène GPD1, ladite souche mutante étant capable d'accumuler des lipides. On entend au sens de la présente invention par le terme « levure » les souches de levure en général, c'est-à-dire que ce terme comprend, entre autres, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Schizzosaccharomyces 10 pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindnerr), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, plus particuliérement chez les levures 15 oléagineuses (Ratledge, in : Ratlege C, Wilkinson SG editors, Microbial lipids, Vol 2. London : Academic press 1988). Les levures oléagineuses les plus connue inclus les genres Candida, Cryptoccocus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lypomyces, Yarrowia. Une levure préférée au sens de la présente invention est Yarrowia lipolytica. La bêta-oxydation est la voie de dégradation des acides gras. Elle fait intervenir 4 20 réactions successives au cours desquelles interviennent une acyl-CoA oxydase dont les 6 isoformes sont codée par les 6 gènes PDX, une enzyme multifonctionnelle codée par le gène MFE1 et une 3-oxoacyl-CoA thiolase codée par le gène POT1. Comme indiqué plus haut, la bêta-oxydation chez les levures se déroule exclusivement dans le peroxysome, un organite cytoplasmique dont la biogénèse est contrôlée par les gènes 25 PEX (voir Tableau 2). Quand le peroxysome n'est pas correctement assemblé ou quand il n'est pas fonctionnel, les acides gras ne sont pas correctement dégradés (WO 2006/064131 ; Thevenieau et al., Fungal Genet Biol., 44(6): 531-42, 2007). De façon générale, les mutations affectant la bêta-oxydation selon l'invention sont des mutations de perte de fonction qui entrainent une très forte diminution, voire une 30 absence totale, de la bêta oxydation. Les mutations de perte de fonction selon l'invention peuvent correspondre à des mutations ponctuelles, à des insertions, à des délétions totales ou partielles, à des remplacements de gènes ou à tout autre cause moléculaire qui aboutit à une diminution substantielle de la bêta-oxydation. Les souches de levure chez lesquelles la bêta-oxydation des acides gras est déficiente 35 comprennent, au sens de l'invention, toutes les souches portant au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un gène codant une enzyme directement impliquée dans la bêta-oxydation, mais aussi toutes les souches qui portent au moins une mutation de perte de fonction qui n'affecte la bêta-oxydation que de façon indirecte, notamment à travers la biogénèse ou la fonction des peroxysomes. Il est bien entendu que les souches selon l'invention comprennent aussi toutes les souches portant des combinaisons des mutations décrites plus haut. Par exemple, entrent aussi dans le cadre de la présente invention les souches qui portent au moins une mutation de perte de fonction affectant directement la bêta-oxydation et au moins une mutation de perte de fonction n'affectant la bêta-oxydation que de façon indirecte. Les souches déficientes dans la bêta-oxydation des acides gras comprennent, selon un aspect préféré de l'invention, toute souche portant une mutation de perte de fonction dans un des gènes PEX listés dans le tableau 2. Selon un autre aspect préféré de l'invention, les souches déficientes dans la bêta-oxydation des acides gras comprennent les souches portant au moins une mutation de perte de fonction dans l'un des gènes suivants : PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5, PDX6, MFE1, POT1. Plus préférentiellement, les souches selon l'invention comprennent au moins une mutation de perte de fonction dans l'un au moins des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. De façon encore plus préférée, les souches selon l'invention comprennent des mutations dans chacun des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a donc pour objet une nouvelle souche de levure, particulièrement une souche de levure de Y. lipolytica, mutante, qui surexprime le gène GPD1 et qui comporte au moins une mutation de perte de fonction dans un des gènes responsable de la bêta-oxydation des acides gras, ladite souche de levure étant capable d'accumuler des lipides. Avantageusement, ladite souche de levure comporte au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un des gènes choisis parmi les gènes PEX, PDX, MFE1 et POT1. De manière plus particulièrement préférée, les gènes PDX sont partiellement (PDX2 à PDX5) ou totalement (PDX1 à PDX6) inactivés dans la souche mutante de l'invention, ladite souche mutante étant capable d'accumuler des lipides. Outre les mutations de perte de fonction précitées, qui conduisent à une déficience de la bêta-oxydation, la souche de levure selon l'invention peut comporter une ou plusieurs mutations additionnelles dans au moins un gène codant une enzyme impliquée dans le métabolisme des acides gras. Cette(ces) mutation(s) additionnelle(s) peut(vent) avoir pour effet d'augmenter encore la capacité de la souche à accumuler des lipides. Alternativement, elle(s) peut(vent) altérer le profil des acides gras stockés. Ainsi, les présents inventeurs ont aussi montré que l'expression des gènes TGL3 et TGL4 est augmentée quand les gènes PDX sont inactivés. Les gènes TGL3 et TGL4 codent des lipases impliquées dans la dégradation des acides gras (Kurat et al., J. Biol. Chem., 281 : 491-500, 2006). Sans vouloir être limité par la théorie, on peut penser que l'augmentation de l'expression de ces deux gènes sert sans doute à compenser l'absence d'une voie de bêta-oxydation fonctionnelle pour la dégradation des acides gras. L'invention a donc aussi pour objet une souche de levure, préférentiellement Y. lipolytica, mutante, déficiente pour la bêta-oxydation, déficiente pour les produits des gènes TGL3 et TGL4, ladite souche surexprimant le gène GPD1 et étant capable d'accumuler des lipides. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la souche de levure préférentiellement Y. lipolytica, mutante, déficiente pour la bêta-oxydation, ladite souche surexprimant le gène GPD1 et étant capable d'accumuler des lipides, comporte en outre une mutation de perte de fonction dans le gène GUT2. Il a aussi été montré que l'inactivation du gène YALIOB10153g, qui code une 012 désaturase d'acide gras, permet d'augmenter la proportion d'acides gras en C18 :1 (WO 2005/047485). C'est donc aussi un objet de la présente invention que de fournir une souche de levure, notamment de Y. lipolytica, mutante, déficiente pour la bêta-oxydation, qui surexprime le gène GPD1 et est capable d'accumuler des lipides, et qui, en outre, comporte un gène YALIOB10153g inactivé. Selon encore un autre aspect, la souche de levure de l'invention, préférentiellement Y. lipolytica, mutante, déficiente pour la bêta-oxydation, qui surexprime le gène GPD1 et est capable d'accumuler des lipides, contient en outre un gène dont l'expression permet de modifier le profil en acide gras de ladite souche. Il a en effet été rapporté que l'expression ectopique de gènes codant certaines désaturases permet de modifier le profil en acides gras polyinsaturés dans une souche de levure et en particulier chez Y. lipolytica. Ainsi l'expression d'une 012 désaturase d'acide gras permet d'obtenir des acides gras en C18 :2 en plus grande quantité (WO 2005/047485). De la même façon, l'expression d'une 08 désaturase ou d'une 015 désaturase conduit à un changement du profil des acides gras chez Y. lipolytica (WO 2005/047480 ; WO 2006/012325). L'invention a donc aussi pour objet une souche de levure, notamment de Y. lipolytica, mutants, déficiente pour la bêta-oxydation, qui surexprime le gène GPD1 et est capable d'accumuler des lipides, et qui, en outre, exprime un gène codant pour une enzyme choisie parmi une 08 désaturase, une 012 désaturase et une 015 désaturase. De préférence, ladite enzyme est une 012 désaturase. Encore plus préférentiellement, le gène codant ladite 012 désaturase est le gène de Y. lipolytica dont le numéro d'accession est le YALIOB10153g. L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'une souche de levure mutante, ladite souche mutante étant capable d'accumuler des lipides. Dans un mode préféré de réalisation, la levure est Y. lipolytica. Le procédé selon l'invention comporte au moins deux étapes, lesdites étapes pouvant être réalisées soit simultanément soit consécutivement. Si les deux étapes sont réalisées l'une après l'autre, l'ordre dans lequel elles sont réalisées importe peu. Le procédé selon l'invention comporte donc les étapes consistant à : - inactiver au moins un gène contrôlant la bêta-oxydation et - transformer dans la souche de levure par un polynucléotide permettant l'expression du gène GPD1 La première étape du procédé selon l'invention consiste donc à inactiver un gène responsable de la bêta-oxydation. Comme indiqué plus haut, ces gènes sont aussi bien les gènes PDX, MFE1, POT1 (Tableau 1) que les gènes PEX (Tableau 2). L'art antérieur enseigne aussi différentes méthodes pouvant permettre l'obtention de souches de levure, particulièrement Y. lipolytica, dans lesquelles un gène est inactivé. Par exemple, on citera la méthode appelée POP IN/ POP OUT qui a été utilisée chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica, pour la délétion des gènes LEU2, URA3 et XPR2 comme il est décrit dans la revue de G. Barth et coll.: (Yarrowia lipolytica, in: Nonconventional Yeasts in Biotechnology A Handbook (Wolf, K., Ed.), Vol. 1 , 1996, pp. 313-388. Springer-Verlag). Elle consiste à intégrer un vecteur comprenant un gène d'intérêt délété au locus considéré, puis à sélectionner l'excision dudit vecteur et d'identifier un clone qui par recombinaison a éliminé le gène sauvage et conservé le gène muté. Préférentiellement selon l'invention on pourra utiliser une méthode conduisant à l'inactivation du gène d'intérêt. Par inactivation ou invalidation d'un gène d'intérêt (les deux termes tels qu'utilisés dans la présente demande sont synonymes et ont donc la même signification), on entend selon l'invention, toute méthode aboutissant à la non expression de la protéine native codée par ledit gène d'intérêt, par modification de l'enchaînement des nucléotides constituant ledit gène de telle sorte que quand bien même sa traduction serait effective, elle ne conduirait pas à l'expression de la protéine native codée par le gène d'intérêt sauvage. Préférentiellement selon l'invention, on utilise une méthode conduisant à une extinction totale de l'expression du gène d'intérêt. Cela peut être réalisé par une délétion totale du gène d'intérêt, par une délétion partielle du gène d'intérêt, par l'insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans ledit gène d'intérêt, ladite méthode utilisée rendant le gène d'intérêt non fonctionnel (gène d'intérêt inactivé ou invalidé), à tout le moins codant une protéine ne possédant pas les propriétés de la dite protéine native. On obtient ainsi une souche de levure n'exprimant pas le gène d'intérêt que l'on nommera par la suite dans le présent texte "souche défective en gène d'intérêt". On peut aussi utiliser la méthode SEP (Maftahi et al., Yeast, 12 : 859-868, 1996) qui a été adaptée chez Y. lipolytica pour la disruption successive des gènes PDX (Wang et al., J. Bacteriol., 181: 5140-5148, 1999). Cette méthode est plus rapide, mais nécessite toujours l'utilisation d'un marqueur permettant une contre sélection. Avantageusement selon l'invention on utilisera la méthode SEP/Cre développée par Fickers et al. (J. Microbiol. Methods, 55/3: 727-737, 2003) et décrite dans la demande internationale WO2006/064131. C'est une méthode rapide et qui ne nécessite pas l'utilisation d'un marqueur permettant une contre sélection. Cette méthode consiste à : 1) sélectionner le gène d'intérêt que l'on veut déléter, 2) construire une cassette de disruption par PCR (« Polymerase Chain Reaction) ou 20 par clonage, 3) introduire un marqueur de sélection contenant de part et d'autre des séquences de recombinaison (avantageusement des séquences loxP et/ou loxR ou dérivées) permettant une recombinaison entre elles pour l'élimination du marqueur (avantageusement une séquence de type loxP qui permet la recombinaison sous 25 l'action de la recombinase Cre), 4) sélectionner les souches avec le gène d'intérêt délété (transformation et sélection des transformants) et de vérifier la délétion, 5) transformer avec un vecteur permettant l'expression de la recombinase (avantageusement la recombinase Cre qui permet la recombinaison des séquences 30 IoxP/IoxR et l'élimination du marqueur) 6) isoler un clone présentant la délétion du gène d'intérêt et ayant perdu le plasmide d'expression de la recombinase. La cassette d'insertion de l'étape 2 comprend un gène codant un marqueur de sélection (gène de sélection), ledit gène étant préférentiellement encadré par les 35 régions promotrices et terminatrices du gène d'intérêt, de façon à permettre le remplacement complet du gène d'intérêt par recombinaison homologue. Selon un mode particulier de réalisation, le gène de sélection est en outre encadré par une ou des séquences de recombinaison, lesdites séquences de recombinaison permettant une recombinaison entre elles conduisant à l'élimination du gène codant le marqueur de sélection. Avantageusement la ou les séquence(s) de recombinaison, est (ou sont) une (ou des) séquence(s) loxP ou une (ou des) séquence(s) loxR ou (une ou des) séquence(s) dérivée(s) de ces séquences de recombinaison, ladite (lesdites) séquence(s) dérivées(s) ayant conservée(s) l'activité des séquences de recombinaison d'origine. Préférentiellement à cette étape, le gène codant le marqueur de sélection pourra être encadré par des séquences de type loxP qui, sous l'action de la recombinase Cre se recombinent entre elles en donnant naissance à un plasmide comprenant la séquence du gène codant ledit marqueur de sélection. L'introduction de la cassette d'invalidation à l'étape 3 dans la souche de levure récipiendaire peut se faire par toute technique connue de la personne du métier. Comme indiqué plus haut, on se référera pour cela à G. Barth et al. (Yarrowia lipolytica. in: Nonconventional Yeasts in Biotechnology A Handbook (Wolf, K., Ed.), Vol. 1, 1996, pp. 313-388. Springer-Verlag). Les transformants exprimant le marqueur de sélection sont sélectionnés à l'étape 4. La présence du marqueur peut être vérifiée par toute méthode usuelle connue de la personne du métier, comme par exemple la PCR ou l'hybridation par Southern blot. Dans l'étape 5, on introduit dans un transformant sélectionné dans l'étape précédente un plasmide permettant l'expression d'une recombinase. Préférentiellement, le plasmide sera porteur du gène de la recombinase Cre (Sauer, Mol. Cell. Biot., 7 : 2087-2096, 1987) qui permet la recombinaison des séquences IoxP/IoxR et l'élimination du marqueur. Cette technique est couramment utilisée par l'homme du métier cherchant à exciser une séquence intégrée spécifique (Hoess and Abremski, J. Mol. Biot., 181 : 351-362, 1984). L'étape 6 est une étape standard de sélection d'un clone ayant excisé le gène de sélection et présentant donc un phénotype d'absence du marqueur de sélection. Précisément, l'invention a pour objet une procédé d'obtention d'une souche de levure, particulièrement une souche Y. lipolytica, mutante, n'exprimant pas un gène contrôlant la bêta-oxydation, caractérisé en ce que - dans une première étape, on construit une cassette d'invalidation comprenant les séquences promotrices et terminatrices dudit gène de levure, particulièrement de Y. lipolytica, encadrant un gène codant un marqueur de sélection (gène de sélection), ledit gène de sélection étant lui-même encadré de part et d'autre de sa séquence par une (ou des) séquence(s) de recombinaison, lesdites séquences de recombinaison permettant une recombinaison entre elles conduisant à l'élimination dudit gène codant le marqueur de sélection ; - dans une deuxième étape, on introduit ladite cassette d'invalidation obtenue en 1 , dans une souche de levure, particulièrement une souche Y. lipolytica ; - dans une troisième étape, on sélectionne, parmi les souches de levure transformées à l'étape 2, une souche de levure, particulièrement une souche de Y. lipolytica, défective pour le gène d'intérêt, souche ayant introduit par double recombinaison (double cross-over) le gène marqueur en lieu et place dudit gène d'intérêt, conduisant ainsi à un gène inactivé ; - dans une quatrième étape, on vérifie l'invalidation dudit gène dans ladite souche de levure sélectionnée à l'étape 3. Selon une variante de l'invention, le procédé peut en outre présenter 2 étapes 15 supplémentaires à savoir : - une cinquième étape au cours de laquelle on transforme ladite souche sélectionnée à l'étape 4 avec un vecteur permettant l'expression d'une recombinase afin d'obtenir l'élimination du gène exprimant le marqueur de sélection ; - une sixième étape, au cours de laquelle on isole une souche de levure défective pour 20 le gène, et n'exprimant plus le gène marqueur. Le procédé d'inactivation d'un gène de la bêta-oxydation peut ensuite être répété de façon à inactiver un autre gène, si cela est nécessaire. La personne du métier sera ainsi à même d'inactiver autant de gènes que nécessaire, par simple répétition du procédé SEP d'inactivation de gène. Ladite personne peut ainsi construire les souches 25 de levure mutantes décrites plus haut, qui comportent plusieurs gènes inactivés. Selon l'invention, on pourra avantageusement utiliser une souche de levure qui ne réalisera pas la bêta-oxydation des lipides, par exemple une souche qui n'exprimera pas les gènes responsables de la bêta-oxydation des lipides comme les gènes PDX, MFE1 ou POT1 , avantageusement une souche n'exprimant pas les gènes PDX, à tout 30 le moins les gènes PDX2, PDX3, PDX4 et PDX5, préférentiellement les gènes PDX1 , PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6, comme par exemple les souches décrites dans la demande internationale WO 2006/064131 publiée le 22 juin 2006, préférentiellement les souches : MTLY37 (Leu+, Ura+; Apox5, Opox2, Opox3, Apox4 ::URA3), 35 MTLY40 (Leu+, Ura-; Opox5-PT, Opox2-PT, Apox3-PT, Opox4::ura3-41), MTLY64 (Leu-, Ura-, Hyg+; Apox5, Apox2, Opox3, Apox4::ura3-41 , leu2 ::Hyg), MTLY66 (Leu-, Ura-; Apox5, Apox2, Opox3, Apox4::ura3-41, Oleu2), MTLY82 (Leu-, Ura-, Hyg+; Apox5, Apox2, Opox3, Apox4::ura3-41, Oleu2, pox1 ::Hyg), MTLY86 (Leu-, Ura-; Apox5; Apox2, Opox3, Apox4::ura3-41, Oleu2, Apox1), MTLY92 (Leu-, Ura-, Hyg+; Apox5, Apox2, Opox3, Apox4::ura3-41, Oleu2, Opoxl , pox6::Hyg), MTLY95a (Leu-, Ura- ; Apox5, Apox2, Apox3, Apox4::ura3-41, Oleu2, Apox1, Opox6) Dans un autre aspect de l'invention, on pourra aussi utiliser une souche de levure telle que celles décrite dans la demande PCT WO 2010/004141, publiée le 14 janvier 2010. On pourra par exemple utiliser les souches : JMY1351 (Leu-, Ura+, Apox5, Apox2, Opox3, Apox4::ura3-41, Oleu2, Opoxl, Opox6, Ogut2) JMY1393 (Leu-, Ura+, Apox5, Apox2, Opox3, Apox4::ura3-41, Apox1, Opox6, Ogut2). Dans encore un autre aspect de l'invention, on pourra utiliser les souches décrites dans les publications Béopoulos et al. (Appt Environ Microbiol., 74(24): 7779-7789, 2008) et Wang et al (J. Bacteriol., 181: 5140-5148, 1999). Dans une deuxième étape du procédé selon l'invention, le gène GPD1 est surexprimé dans une des souches déficientes dans la bêta-oxydation obtenues à l'étape précédente. Le gène GPD1 code pour la glycérol-3-phosphate déshydrogénase catalysant la réaction de synthèse de glycérol-3-phosphate à partir du DHAP. Le gène GPD1 peut être surexprimé de toutes les manières connues de la personne du métier. Pour cela, chaque copie de la phase ouverte de lecture GPD1 est placée sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées. Lesdites séquences régulatrices comprennent des séquences promotrices, placées en amont (en 5') de la phase ouverte de lecture de GPD1, et des séquences terminatrices, placées en aval (en 3') de la phase ouverte de lecture de GPD1. De préférence, les séquences promotrices et terminatrices utilisées appartiennent à des gènes différents de manière à minimiser les risques de recombinaison non désirée 30 dans le génome de la souche de Yarrowia. De telles séquences promotrices sont bien connues de l'homme du métier et peuvent correspondre notamment à des promoteurs inductibles ou constitutifs. A titre d'exemple de promoteurs utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer notamment le promoteur d'un gène de Y. lipolytica qui est fortement réprimé par le glucose et qui est 35 inductible par les acides gras ou les triglycerides tel que le promoteur PDX2 du gène de l'acyl CoA oxydase 2 de Yarrowia lipolytica et le promoteur du gène LIP2 décrit dans la demande PCT WO 01/83773. On peut aussi utiliser le promoteur du gène FBA1 du gène de la fructose-bisphosphate aldolase (US 2005/0130280), le promoteur du gène de la phosphoglycerate mutase GPM (WO 2006/0019297), le promoteur du gène YAT1 du gène du transporteur de l'ammonium (US 2006/0094102 A1), le promoteur du gène GPAT du gène de la glycérol-3-phosphate 0-acyltransferase (US 2006/0057690 A1), le promoteur du gene TEF (Muller et al., Yeast, 14 : 1267-1283, 1998 ; US 2001/6265185), le promoteur hybride hp4d (WO 96/41889) ou encore les promoteurs hybrides XPR2 décrits dans Mazdak et al. (J Mol Microbiol Biotechnol., 2(2):207-16, 2000). De telles séquences terminatrices sont également bien connues de l'homme du métier et on peut citer, à titre d'exemple de séquences terminatrices utilisables dans le procédé selon l'invention, la séquence terminatrice du gène PGK1, la séquence terminatrice du gène LIP2 décrit dans la demande PCT WO 01/83773. La surexpression de GPD1 peut être obtenue en remplaçant les séquences contrôlant l'expression de GPD1 par des séquences régulatrices permettant une expression plus forte, telles que celles décrites ci-dessus. La personne du métier peut ainsi remplacer la copie du gène GPD1 dans le génome, ainsi que ses séquences régulatrices propres, par transformation de la souche mutante de levure par un polynucléotide linéaire comprenant la phase ouverte de lecture de GPD1 sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites plus haut. Avantageusement, ledit polynucléotide est encadré par des séquences qui sont homologues de séquences situées de chaque côté du gène GPD1 chromosomique. Dans la mesure où cet évènement de recombinaison est rare, des marqueurs de sélection sont insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Avantageusement, la surexpression de GPD1 est obtenue par l'introduction dans la souche de levure de l'invention de copies surnuméraires du gène GPD1 sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites plus haut. Lesdites copies supplémentaires de GPD1 peuvent être portées par un vecteur épisomal, c'est-à-dire capable de se répliquer dans la levure. Préférentiellement, elles sont portées par un vecteur intégratif, c'est-à-dire s'intégrant à un endroit donné dans le génome de la levure (Mazdak et al., J Biotechnol., 109(1-2): 63-81, 2004). Dans ce cas, le polynucléotide comprenant le gène GPD1 sous le contrôle de régions régulatrices est intégré par intégration ciblée. L'intégration ciblée d'un gène dans le génome d'une levure est une technique de biologie moléculaire fréquemment utilisée. Dans cette technique, un fragment d'ADN est cloné dans un vecteur intégratif, introduit dans la cellule à transformer, lequel fragment d'ADN s'intègre alors par recombinaison homologue dans une région ciblée du génome receveur (Orr-Weaver et al., Proc. Nat/. Acad. Sci. USA, 78 : 6354-6358, 1981). De tels procédés de transformation sont bien connus de l'homme du métier et sont décrits, notamment, dans Ito et al. (J. Bacteriol., 153: 163-168, 1983) dans Klebe et al. (Gene, 25: 333-341, 1983) et dans Gysler et al. (Biotechn. Techn., 4: 285-290, 1990). Dans la mesure où cet évènement de recombinaison est rare, des marqueurs de sélection sont insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Elles peuvent aussi être portées par des fragments de PCR dont les extrémités présentent de l'homologie avec un locus donné de la levure, permettant ainsi l'intégration desdites copies dans le génome de la levure par recombinaison homologue. Toute méthode de transfert connue de l'art antérieur peut être utilisée pour introduire la cassette d'invalidation 1 dans la souche de levure. Préférentiellement on pourra utiliser la méthode à l'acétate de lithium et au polyéthylène glycol (Gaillardin et al., Curr. Genet., 11 : 369-375, 1987 ; Le DalI et al., Curr Genet, 26(1): 38- 44, 1994). Selon l'invention, il est possible d'utiliser toute méthode de sélection connue de l'art antérieur compatible avec le gène (ou les gènes) marqueur(s) utilisés, toute souche exprimant le gène marqueur choisi étant potentiellement une souche de levure détective en gène GUT2, URA3 ou LEU2. Les marqueurs de sélection permettant la complémentation d'une auxotrophie, également communément appelés marqueurs d'auxotrophie, sont bien connus de l'homme du métier. Le marqueur de sélection URA3 est bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. lipolytica dont le gène URA3 (ladite séquence est aussi accessible par le numéro d'accession YALIOE26719g à l'adresse « http://cbi.labri.fr/Genolevures/index.php# »), codant pour I'orotidine-5'-phosphate décarboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en uracile. L'intégration du marqueur de sélection URA3 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu dépourvu d'uracile. Le marqueur de sélection LEU2 décrit notamment dans le brevet US 4,937,189 est également bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. lipolytica dont le gène LEU2 (YALIOE26719g), codant pour la R-isopropylmalate déhydrogenase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en leucine. Comme précédemment. L'intégration du marqueur de sélection LEU2 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en leucine. Le marqueur de sélection ADE2 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de Yarrowia dont le gène ADE2 (YALIOB23188g), codant pour la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en adénine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection ADE2 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en adénine. L'invention a encore pour object l'utilisation d'une souche de levure mutante, notamment une souche de Y. lipolytica, pour la synthèse de lipides, particulièrement des acides gras libres et des triacylglycérols. Dans un aspect plus particulièrement préféré, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure, plus particulièrement de Y. lipolytica, mutante, déficiente pour la bêta-oxydation et surexprimant GPD1, ainsi que décrit plus haut, pour la synthèse d'acides gras libres et de triacylglycérols. La présente invention a aussi pour objet un procédé de synthèse de lipide dans lequel : - dans une première étape, on cultive une souche de levure selon l'invention dans un milieu approprié et - dans une seconde étape on récolte les lipides produits par la culture de l'étape 1 Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et Figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée. Légendes des figures Figure 1. Schéma des différentes voies de synthèse des acides gras, stockage et dégradation des lipides neutres et leur lien avec les cycles du glyoxylate et du TCA. Les flèches en pointillé indiquent des réactions enzymatiques hypothétiques. Les flèches avec tirets représentent des réactions simplifiées. Les protéines codées par les gènes entre parenthèses ont été montrées comme étant associées aux corps lipidiques (LB) chez Y. lipolytica. DAG, diacylglycerol; DHA, dihydroxyacetone; DHAP, dihydroxyacetone phosphate; FFA, free fatty acid; GAD3P, glyceraldehydes-3-phosphate; Gly-3P, glycerol-3-phosphate; LPA, lysophosphatidic acid; MAG, monoacylglycerol, PA, phosphatidic acid; PL, phospholipid; SE, steryl ester; TAG, triacylglycerol, TCA cycle, tricarboxylic acid cycle. Figure 2. Analyse de l'expression des gènes impliqués dans l'homéostase des triacylglycérols dans différentes souches de Y. lipolytica. L'expression des différents gènes a été mesurée par qRT-PCR en utilisant des amorces spécifiques de chacun des gènes et a été rapportée à la quantité de transcrits du gene ACT1 codant pour l'actine (YALIOD08272g). Ces résultats correspondent à la moyenne ± déviation standard provenant de trois expériences indépendantes. Figure 3. Accumulation des lipides dans des souches différentes de Y. lipolytica Les levures ont été cultivées 24 h en YNBD2 (A) ou en YNBD0.5O3 (B). Les barres noires représentent les souches surexprimant GPD1, les barres blanches représentent les souches parentales. L'extraction des acides gras a été reproduite à partir de trois échantillons indépendants. Figure 4. Croissance de différentes souches en milieu YNBD0.5O3. La croissance des souches WT et mutantes listées dans le Tableau 1 a été suivie en fonction du temps. Ces résultats correspondent à la moyenne ± déviation standard provenant de trois expériences indépendantes. Figure 5. Phénotypes des LB dans différentes souches de Y. lipolytica. Les morphologies des LB des souches WT, Agut2, Apoxl-6, Agut2Apoxl-6, WT GPD1+, Agut2 GPD1+, Apoxl-6 GPD1+ and Agut2Apoxl-6 GPD1+ sont montrées. Les images en microscopie optique sont présentées sur les panneaux de gauche et les images correspondantes de microscopie en fluorescence sont présentées à droite. La fluroescence a été obtenue après coloration avec le colorant neutre vert LipidToxTM Les souches ont été cultivées pendant 24 h sur milieu YNBD0.5O3. Figure 6. Contenu en triacylglycérols et en acides gras libres en tant que fractions des 5 lipides totaux. Ce graphe représente l'accumulation totale de lipides après 24 h de croissance en milieu YNBD0.5O3, en tant que pourcentage de la masse sèche des cellules. Les lipides ont été fractionnés en triacylglycérol et acides gras libres par extraction en phase solide et la quantification a été effectuée par chromatographie en phase 10 gazeuse. L'extraction des acides gras a été reproduite à partir de deux échantillons indépendants ; un résultat représentatif des deux expériences est montré. Figure 7. A. Séquence du gène GPD1+ ; B Séquence du polypeptide Gpdl. 15 EXEMPLES Matériel et méthodes Yeast strains, growth, and culture conditions Les souches de Y. lipolytica utilisées dans cette étude sont dérivées de la souche 20 sauvage (wild-type ; WT) de Y. lipolytica W29 (ATCC20460) (Table 3). La souche auxotrophique Pold (Leu- Ura-) a été décrite par Barth and Gaillardin (1996. Yarrowia lipolytica, p. 313-388. In K. Wolf, K. D. Breunig, and G. Barth (ed.), Nonconventional yeasts in biotechnology, vol. 1. Springer-Verlag, Berlin, Germany.). La souche auxotrophique MTY94, dans laquelle les six gènes PDX codant des acyl-CoA 25 oxydases (Aox) ont été inactivatés, a été décrite précédemment (Beopoulos et al., Appl Environ Microbiol., 74(24): 7779-7789, 2008). La souche auxotrophique JMY1346, dans laquelle le gène GUT2, qui code la glycerol-3-phosphate déhydrogenase, a été inactivé, dérive de la souche JMY1202 (WO 2010/004141 ; Beopoulos et al., Appl Environ Microbiol., 74(24): 7779-7789, 2008). La souche auxotrophique JMY1367, 30 dans laquelle les six gènes PDX qui codent les acyl-CoA oxidases (Aox) et le gène GUT2, qui code la glycerol-3-phosphate déhydrogénase, ont été inactivés, dérive de la souche JMY1351 (Beopoulos et al., Appl Environ Microbiol., 74(24): 7779-7789, 2008). Pour obtenir JMY1346 et JMY1367, le marqueur URA3 a été excisé de JMY1202 et de JMY1351, respectivement, ainsi que précédemment décrit (Beopoulos et al., Appl Environ Microbiol., 74(24): 7779-7789, 2008). Les souches utilisées dans cette étude sont listées dans le Tableau 3. Les milieux et les conditions de culture pour Escherichia coli sont décrits dans Sambrook et al. (1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), et ceux pour Y. lipolytica sont décrits dans Barth et Gaillardin (1996. Yarrowia lipolytica, p. 313-388. In K. Wolf, K. D. Breunig, and G. Barth (ed.), Nonconventional yeasts in biotechnology, vol. 1. Springer-Verlag, Berlin, Germany). Le milieu riche (YPD) et le milieu minimal avec du glucose (YNB) ont été préparés comme précédemment décrits (Mlickova" et al., Appl. Environ. Microbiol., 70: 3918-3924, 2004). Le milieu minimum YNB contient 0,17 % de YNBww (milieu YNB sans acides aminés et sulfate d'ammonium ; Difco, Paris, France), 0,5 % de NH4CI, 0,1% d'extrait de levure (Bacto-DB) et 50 mM de tampon phosphate à pH 6,8. Ce milieu peut être supplémenté avec 0.2 % de casamino-acides (Difco, Paris, France) et/ou 0,1 g/L d'uracile. Les milieux supplémentés en source de carbone sont : - le milieu YNBD (glucose à 2%, Merck, Fontenay-sous-Bois Cedex, France) ; - le milieu YNBG (glycérol à 2%, Merck); - le milieu YNBDO (milieu supplémenté à 3% en acide oléique de Merck pur à 60%) ; - le milieu YNBOu.p. (milieu supplémenté à 3% en acide oléique de Flucka pur à 20 98%) ; - le milieu YNBO (YNBD0.5O3) utilisé pour suivre l'accumulation optimale et la remobilisation des acides gras est du milieu YNB supplémenté à 0,5% de glucose et 3% d'acide oléique ; - le milieu YP2D4O3 utilisé pour optimiser l'accumulation de lipides contient de l'extrait 25 de levure (1%), de la protéose peptone (2%), du glucose (4%) et de l'acide oléique (3%). De l'uracile (0,1 g/L) et de la leucine (0,2 g/L) ont été ajoutés en cas de besoin. Pour les milieux solides, 1,5 % d'agar a été ajouté. L'acide oléique est émulsionné par sonication, en présence de 0,02% de Tween 40 (Mlickova" et al., Appl. Environ. Microbiol., 70: 3918-3924, 2004). 30 En règle générale, les cultures ont été réalisées comme suit : à partir d'une boite YPD, une première pré-culture est inoculée dans du milieu YPD (15 ml dans des Erlenmeyers de 50 ml à 170 tr / min, à 28°C pendant 6 h). Les cellules ont été utilisées pour inoculer une pré-culture en milieu YNBD (50 ml dans un Erlenmeyer de 500 ml à 170 tr / min, à 28°C, pendant une nuit). Pour la culture, des cellules en croissance exponentielle ont été récoltées par centrifugation au lendemain de la pré-culture, lavées et resuspendues dans du milieu YNB frais à une densité optique à 600 nm de 0,5. Pour déterminer la croissance des cellules, les cultures ont été centrifugées à 3000 g pendant 5 min, et le culot de cellules a été lavé deux fois avec des volumes égaux de solution SB (9 g / L de NaCl - 0,5% BSA). La biomasse produite a été déterminée en mesurant la densité optique à 600 nm. et en estimant le poids sec des cellules après lyophilisation. Techniques générales de génétique Les techniques générales de génétique moléculaire ont été utilisées comme décrit dans Sambrook et al. (1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Les enzymes de restriction utilisées proviennent de Eurogentec SA (Liège, Belgique). La transformation des cellules de levure a été réalisée selon la méthode à l'acétate de lithium décrite dans Le Dall et al. (Curr Genet, 26(1): 38- 44, 1994). L'ADN génomique de levure (sauvage ou transformées) a été préparé tel que décrit par Querol et al. (Appt. Environ. Microbiol., 58(9) : 2948-2953, 1992). Les amplifications par PCR ont été réalisées sur un thermocycleur Eppendorf 2720, avec soit de l'ADN polymérase Taq (Promega, Madison, WI, USA) soit de l'ADN polymérase Pfu (Stratagene, La Jolla, Californie). Le gène GPD1 a été amplifié avec les amorces décrites dans le tableau 4. Les fragments de PCR ont été purifiés au moyen du kit de purification QIAGEN (Qiagen, Hilden, Allemagne) et les fragments d'ADN récupérés à partir de gels d'agarose en utilisant un kit QlAquick Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Allemagne). L'ensemble de programmes Staden (Dear. et Staden, Nucleic Acid Res., 19 : 3907-3911, 1991) a été utilisé pour l'analyse des séquences. Préparation des ARN et quantification des transcrits Les échantillons biologiques ont été congelés dans l'azote liquide et gardés à -80°C. Les ARN ont été extraits avec le kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) en suivant les instructions du fabricant. Pour les expériences de Q-PCR, l'ARN total de chaque échantillon a été traité à la Dnasel (Ambion). L'absence d'ADN genomique dans les préparations d'ARN a été vérifiée par PCR en utilisant les ARN totaux traités à la Dnase I comme matrice et la Taq (Promega, Madison, WI) comme enzyme. La qualité des ARN totaux a été contrôlée avec le Bioanalyzer Agilent 2100, les réactifs du kit Agilent RNA 6000 Nano et des puces à ARN. Les ARN totaux traités à la Dnase I (1 pg) ont été traités avec la reverse transcriptase Thermoscript RT (Invitrogen, Carlsbad, USA), en suivant les instructions du fabricant. Les expériences de Q-PCR ont été réalisées à l'aide du LightCycler 1.5 (Roche, Meylan, France) avec le kit LightCycler Fast Start DNA Master Sybr Green (Roche, Meylan, France), en suivant les instructions du fabricant. L'expression de chaque gène a été quantifiée avec la méthode de 2OCT, en calibrant avec ACT1 qui code l'actine. La réaction d'amplification était la suivante: 95°C 8 min, 95°C 10 s, 60°C 6 sec, and 72°C 10 sec (45 cycles), 95°C 15 s, 60°C 15 s, and 95°C 15 s, 40°C 5 min. La mesure de l'expression de chaque gène par Q-PCR a été reproduite sur de trois échantillons indépendants. Les amorces utilisées pour la Q-PCR sont indiquées dans le Tableau 4. Microscopie par fluorescence Pour la visualisation des corps lipidiques (LB), le fluorochrome LipidTOXTM Green (2.5 mg/ml en ethanol; Invitrogen) a été ajouté à une suspension de cellules (A600 = 5) et incubé pendant 10 min à tempréature ambiante. La microscopie a été réalisée avec un microscope à fluorescence, AXIO Imager M1 (Zeiss, Le Pecq, France) avec un objectif à immersion 100X. Le programme AxioVision Rel. 4.6 a été utilisé pour l'acquisition des images. Détermination des lipides Les lipides d'une quantité de cellules supérieure à 5 mg ont été extraits soit par la procédure de Folch et al. (J Biot Chem, 226(1) : 497-509, 1957) pour l'analyse TLC ou directement convertis en leurs esters méthyliques en utilisant des cellules lyophilisées selon Browse et al., (Anal Biochem, 152(1) : 141-145, 1986) pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse. La transméthylation complète a été vérifiée par une méthode au BF3 dans le méthanol (Athenstaedt et al., J Bacteriol, 181(20) : 6441-6448, 1999) et sur plaques TLC. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras a été réalisée à l'aide d'un Varian 3900 équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et une colonne Varian FactorFour vf-23ms, (3 pA à 260°C [30 m, 0,25, 0,25 pm])- Les acides gras libres ont été identifiés par comparaison avec des esters méthyliques d'acides gras normes (Fatty Acid Methyl Ester, FAME, Cayman, Supelco, Sigma (France)) et quantifiés par la méthode de l'étalon interne en ajoutant 50 pg de C17:0 commercial (Sigma). Analyse des corps lipidiques L'analyse des corps lipidiques a été faite en observant une culture cellulaire en croissance au microscope tel que décrit plus haut. Des objectifs de contraste de phase différentiel (Nomarski) ont été utilisés pour obtenir les images transmises. Analyse des classes de lipides Les lipides totaux ont été fractionnés en triacylglycérol et acides gras libres pour la quantification des lipides en utilisant une colonne Isolute SPE Aminopropyl (IST, France, Paris, France) en suivant l'enseignement de Laffargue et al. (Plant Physiol Biochem, 45(3-4) : 250-257, 2007). Le conditionnement de la colonne a été réalisé 3 fois avec 3 ml d'hexane normal à débit normal. Un ml de l'ensemble des lipides extraits par la méthode de Folch et al. (J Biol Chem, 226(1) : 497-509, 1957) dans du CHC13 a été chargé dans la colonne et la fraction des lipides neutres a été recueillie. L'élution totale des lipides neutres a été réalisée par lavage de la colonne 3 fois avec 3 ml de CHC13/Isopropanol (2/1). La fraction des acides gras libres a été recueillie en lavant la colonne 3 fois avec 3 ml de ET2O/acide acétique 2% avec un débit normal. Le solvant des fractions a été évaporé sous flux d'azote direct et la transméthylation a été suivie pour analyse par chromatographie en phase gazeuse (Laffargue et al., Plant Physiol Biochem, 45(3-4) : 250-257, 2007). Des plaques TLC ont été utilisées pour les extractions de vérification. L'efficacité de la procédure a également été vérifiée par comparaison des profils de chromatographie en 25 phase gazeuse des échantillons fractionnés ou non. Séparation des lipides par TLC Des plaques TLC (silice G60, 20*20 cm, épaisseur 0,25 mm) (Merck, Allemagne) ont été utilisées. Les différentes classes de lipides ont été séparées en utilisant un 30 système de solvant à double de développement : Système A (demi-plaque de migration): éther de pétrole/éther éthylique/ acide acétique: 20/20/0,8 (v/v/v); Système B (toute la plaque de migration): Ether de pétrole/Et2O 49/1 (v/v). Une solution à 5% d'acide phosphomolybdique a été pulvérisée sur les plaques et les bandes de lipides ont été révélées au bout de 10 min à 1050C. 35 Spectroscopie par RMN Des extraits PCA (acide perchlorique) ont été préparés à partir de 1 g en poids sec de Y. lipolytica en suivant la méthode décrite dans Auber et al. (J. Cell Biot., 133: 1251-1263, 1996). Les valeurs sont exprimées en mg g-1 de poids sec de levure. Les spectres ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker RMN (AMX 400, wide bore; Bruker, Billerica, MA) équipé avec une sonde multinucléaire de 10 mm ou de 25 mm réglée à 161.9 ou 100.6 MHz pour les analyses de 31P- et 13C. La résonance du deutérium 2H2O a été utilisée comme signal de référence. Pour les mesures, les acquisition de 13C-NMR et de 31P-NMR ont été réalisées comme décrit précédemment (Dulermo et al., New Phytol, 183 :1149-1162, 2009). Les solvants utilisés pour la RMN proviennent de Sigma-Aldrich et de Leman (Archamps, France). Résultats Construction of strains Le gène GPD1 de Y. lipolytica a été surexprimé dans des souches WT, Llgut2, Llpoxl-6 and Llgut2Llpoxl-6 de Y. lipolytica. Ces souches ont été transformées avec une cassette d'expression contenant GPD1 sous le contrôle du promoteur constitutif TEF (Muller et al., Yeast, 14:1267-1283, 1998). Les transformants contenant la cassette d'expression ont été identifiés par PCR (data not shown). Il a été observé par RT-PCR quantitative que le gène GPD1 était exprimé aux mêmes niveaux dans les différents transformants (Fig. 2). Dans les souches GPD1+, l'expression de GPD1 est augmentée d'un facteur 5 à 6 par rapport au sauvage. Des résultats identiques ont été obtenus en analysant deux transformants de chaque souche GPD1+. La surexpression de GPD1 entraine une augmentation de la quantité de lipides cellulaires Tout d'abord, la capacité des différentes souches de synthétiser des lipides de novo a été étudiée après 24 h de culture en YNBD2: à 24 h, la surexpression de GPD1 n'a aucun effet dans le sauvage et dans Llgut2, alors que la quantité de lipides cellulaires est augmentée de 34 % et de 25% dans les souches Llpoxl-6 GPD1+ et Llgut2Llpoxl-6 GPD+, respectivement, par comparaison avec les souches parentales isogéniques (Fig. 3A). Dans un second temps, la capacité d'accumulation des lipides des différentes souches a été analysée. Pour cela, les souches ont été cultivées en YNBD0.5O3. Alors que tous les transformants présentaient la même croissance que le sauvage en YNBD2 (data not shown), ce n'est pas le cas en YNBD0.5O3. Dans ce milieu particulier, la croissance de Llgut2Llpoxl-6 GPD1+, et, dans une moindre mesure, de Llpoxl-6 GPD1+ est dramatiquement affectée entre 24 et 48 h de culture, alors que ce n'est pas le cas pour les autres souches. En particulier, l'absorption de ces deux cultures chute brutalement entre 24 et 48 h, indiquant une lyse cellulaire (Fig. 4). La mort de ces cellules est probablement due à une trop forte accumulation de lipides. Pour cette raison, l'accumulation de lipides a été analysée dans les différents transformants après 24 h de culture en YNBD0.5O3 (Fig. 3B). Tout comme pour la synthèse de novo de lipides en YNBD2, l'accumulation de lipides est uniquement augmentée dans les souches Llpoxl-6 GPD1+ et Llgut2Llpoxl-6 GPD1+ de 70 % et 47 % par rapport à leurs souches parentales isogéniques, respectivement. L'accumulation des lipides représente plus de 65-75 % du poids sec de ces souches, c'est-à-dire 5 fois la quantité de lipides dans la souche sauvage à 24 h. La surexpression de GPD1 n'a aucun effet sur le profil en acides gras des transformants (Table 5). Analyse microscopique de souches surexprimant GPD1 La surexpression de GPD1 entraine une augmentation du contenu lipidique dans les souches Llpoxl-6 et Llgut2Llpoxl-6. Chez S. cerevisiae, la plupart des lipides stockés sont des lipides neutres, c'est-à-dire des triacylglycérols et des esters de stérols. Chez Y. lipolytica, les lipides neutres sont stockés dans un compartiment spécialisé, le corps lipidique (LB) (Czabany et al., Biochim. Biophys. Acta, 1771: 299-309, 2007). Afin d'estimer l'effet de la surexpression de GPD1 sur les corps lipidiques de Y. lipolytica, les cellules des différentes souches ont été analysées au microscope, après 24 h de croissance sur YNBD0.5O3. Les cellules Llgut2, Llgut2 GPD1+, Llpoxl-6, Llpoxl-6 GPD1+, Llgut2Llpoxl-6 and Llgut2Llpoxl-6 GPD1+ montraient des corps lipidiques très importants (Fig. 5). Aucune différence n'a pu être détectée entre le WT et le WT GPD1+, ainsi qu'entre le Llgut2 et le Llgut2 GPD1+. En revanche, les souches Llpoxl-6 GPD1+ et Llgut2Llpoxl-6 GPD1+ présentaient les plus gros corps lipidiques et les plus nombreux. La surexpression de GPD1 non seulement entraine une augmentation de la quantité de lipides cellulaires mais semble aussi affecter le nombre et la taille des corps lipidiques chez Y. lipolytica. La surexpression de GPD1 entraine une augmentation de la fraction des triacylglycérols Afin de quantifier la fraction des triacylglycérols dans les souches in GPD1+, les lipides neutres et les acides gras libres ont été fractionnés avec une colonne SPE Aminopropyl. Les fractions de triacylglycérol et d'acides gras libres ont été ensuite analysées par chromatographie en phase gazeuse. La quantité de triacylglycérol a été analysée dans toutes les souches après 24 h de culture en YNBD0.5O3 (Fig. 6). La délétion de GUT2 et/ou la surexpression de GPD1 conduisent à une augmentation de la fraction des triacylglycérols. Le niveau de triacylglycérols est augmenté d'un facteur 1,3, 2,4 and 3,2 dans les souches WT GPD1+, Agut2 et Agut2 GPD1+, par rapport à la souche sauvage, respectivement. L'inactivation des gènes PDX1-6 a un petit effet sur le niveau de triacylglycérols, avec une augmentation d'un facteur 1,7 par comparaison avec la souche sauvage. En revanche, l'association des mutations PDX1-6 avec l'inactivation de GUT2 et/ou la sureexpression de GPD1 a un effet majeur sur la quantité de triacylglycérols, avec des niveaux de triacylglycérols dans les souches Agut2Apoxl-6, Apoxl-6 GPD1+ et Agut2Apoxl-6 GPD1+ atteignant 4, 6 et 10 fois respectivement le niveau observé dans la souche sauvage. Dans la souche Agut2Apoxl-6 GPD1+ la fraction des triacylglycérols correspond à plus de 50% du poids sec. Analyses métaboliques des différentes souches par RMN Les résultats obtenus montrent clairement que la surexpression de GPD1 affecte dramatiquement la synthèse des triacylglycérols. Ceci pourrait être expliqué par une augmentation de la concentration du G3P. Afin de verifier si l'inactivation de GUT2 ou la surexpression de GPD1 affecte la synthèse de G3P, les souches parentes et GPD1+ ont été cultivées sur YNBD0.5O3, et les métabolites ont été analysés par RMN. Les analyses des spectres de 31P indiquent que la concentration en G3P est augmentée de 1,5 à 5,6 fois, dans les souches où GUT2 est inactivé ou dans les souches surexprimant GPD1, par rapport à la souche sauvage (Table 6). Quand GUT2 est fonctionnel, la surexpression de GPD1 n'a que peu d'effets sur le niveau de G3P. Par exemple, la concentration de G3P est augmentée de 50% seulement dans les souches WT GPD1+ et Apoxl-6 GPD1+ en comparaison des souches parentales. Le niveau de G3P est légèrement plus élevé dans la souche Apoxl-6 comparée à la souche sauvage. La concentration de G3P est augmentée d'un facteur trois dans les souches Agut2 et Agut2Apoxl-6 par rapport à la souche sauvage. La concentration maximale de G3P est obtenue dans les souches Agut2 GPD1+. De plus, la concentration G3P dans la souche Apoxl-6 GPD1+ et de façon surprenante dans la souche Agut2Apoxl-6 GPD1+ est seulement deux fois la concentration de la sauvage. Il semble donc que la délétion de GUT2 ou la surexpression de GPD1 ont des conséquences différentes sur la synthèse de G3P. Le G3P est un métabolite intermédiaire de la synthèse du glycérol. Alors que la concentration de G3P est augmentée dans les souches Agut2 et GPD1+, la concentration de glycérol est diminuée dans ces souches et encore plus dramatiquement dans les souches Agut2 GPD1+, Apoxl-6 GPD1+, Agut2Apoxl-6 et Agut2Apoxl-6 GPD1+. Dans Agut2 GPD1+, la souche accumulant les plus hauts niveaux de G3P, un doublement et un triplement des concentrations respectives de glycérol phosphorylcholine (GPC) et de glycérol phosphoryléthanolamine (GPE) a été observé. La RMN n'étant pas suffisamment sensible, il n'a pas été possible de détecter plus de trois intermédiaires des cycles du glyoxylate/TCA (malate, citrate et succinate) ; un forte diminution a été observée pour chacun de ces trois composés dans les souches où les gènes PDX ou le gène GUT2 était inactivé. De plus, la surexpression de GPD1+ dans ces souches accentue la disparition de ces composés. Modification de l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme des triacylglycérides Nous avons analysé par RT-PCR quantitative l'expression de GUT2 et des gènes impliqués dans la synthèse des triacylglycérols, tels que SCT1, DGA1, LRO1, ARE1 et ARE2, qui codent des acyltransférases (Beopoulos et al., Prog. Lipid Res, 48 : 375- 387, 2009; Fig. 1). La surexpression de GPD1 n'a aucun effet sur l'expression de GUT2. De même, la délétion de GUT2 n'a aucun effet sur l'expression de GPD1. en revanche, un changement dans l'expression des genes impliqués dans le metabolisme du G3P a un effet marqué sur DGA1. Dans les souches Apoxl-6 GPD1+ et Llgut2Llpoxl-6 GPD1+, l'expression de DGA1 est augmentée 15 et 10 fois, respectivement, par rapport aux souches parentales. De façon surprenante, la délétion des gènes PDX entraine une forte augmentation de l'expression de SCT1 tandis que la délétion de GUT2 a un effet antagoniste et que la surexpression de GPD1 n'a aucun effet. L'expression de ARE1 est diminuée dans toutes les souches mutantes, alors que l'expression de ARE2 est diminuée dans la souche Agut2 seulement. L'expression de LRO1, qui est faiblement exprimé, n'est pas modifiée dans les différentes souches. L'accumulation des triacylglycérols ne dépend pas que des activités de synthèse. De fait, les processus de dégradation doivent avoir un rôle important rôle dans l'homéostasie des triacylglycérols. La première étape du catabolisme des triacylglycérols est catalysée par des lipases de triacylglycérols intracellulaires (Czabany et al., Biochim. Biophys. Acta, 1771 : 299-309, 2007; Fig. 1). La levure Y. lipolytica possède des lipases de triacylglycérols intracellulaires homologues des protéines Tg13 et Tg14 de S. cerevisiae, mais aucune homologue de Tg15 (Beopoulos et al., Appl Environ Microbiol, 74 : 7779-7789, 2008). L'expression des gènes TGL (TGL3 et TGL4) a été analysée par RT-PCR quantitative. Ces deux gènes ont des profils d'expression similaires. TGL3 and TGL4 sont fortement exprimés dans les souches dans lesquelles les gènes PDX sont inactivés. Cependant, la délétion de GUT2 ou la surexpression de GPD1 a un effet négatif sur leur expression. Par exemple, l'expression de TGL3 est augmentée 20 fois dans la souche Apoxl-6 et seulement 7 fois dans la souche Apoxl-6 Agut2 par rapport à la souche sauvage. Dans leur ensemble, ces résultats montrent clairement que la modification du métabolisme du G3P ou des gènes PDX affecte l'expression des gènes impliqués dans l'homéostasie des triacylglycérols. Tableau 1 : Gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras chez les levures, 20 particulièrement chez Y. lipolytica. Les séquences sont accessibles par leurs noms ou numéros d'accession à l'adresse « http://cbi.labri.fr/Genolevures/index.php# » Gène Nom N° EC Fonction GUT1 YALIOF00484g EC 2.7.1.30 Glycerol kinase GPD1 YALIOB02948g EC 1.1.1.18 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD(+)) GUT2 YALIOB13970g EC 1.1.99.5 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase SCT1 YALI0000209g EC 2.3.1.15 Glycerol-3-phosphate acyltransferase SLC1 YALIOE18964g EC 2.3.1.51 1-acyl-sn-gycerol-3-phosphate acyltransferase DGA1 YAL10E32769g EC 2.3.1.20 Diacylglycerol acyltransferase LRO1 YALIOE16797g EC 2.3.1.158 Phospholipid :diacylglycerol acyltransferase TGL3 YALIOD17534g EC 3.1.1.3 Triacylglycerol lipase TGL4 YALIOF10010g EC 3.1.1.3 Triacylglycerol lipase 5 ARE1 YALIOF06578g EC 2.3.1.26 Acyl-CoA :sterol acyltransferase ARE2 YALIOD07986g EC 2.3.1.20 Diacylglycerol acyltransferase TGL1 YALIOE32035g EC 3.1.1.13 Cholesterol esterase PDX1 YAL10E32835g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxidase PDX2 YALIOF10857g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxidase PDX3 YALIOD24750g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxidase PDX4 YALIOE27654g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxidase PDX5 YALIOC23859g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxidase PDX6 YALIOE06567g EC 6.2.1.3 Acyl-coenzyme A oxidase MFE1 YALIOE15378g EC 4.2.1.74 Multi-functional beta oxidation protein POT1 YALI018568g EC 2.3.1.16 Peroxisomal Oxoacyl Thiolase Tableau 2 : Gènes impliqués dans le métabolisme des peroxysomes chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica. Les séquences sont accessibles par leurs noms ou numéros d'accession à l'adresse « http://cbi.labri.fr/Genolevures/index.php# » Gène N° accession N° accession Fonction (ou source pour 3 gènes) S. cerevisiae Y. lipolytica PEX1 YKL197c YALIOC15356g AAA-peroxin PEX2 YJL210W YALIOF01012g RING-finger peroxin which functions in peroxisomal matrix protein import PEX3 YDR329c YAL10F22539g Peroxisomal membrane protein (PMP) PEX4 YGR133w YALIOE04620g Peroxisomal ubiquitin conjugating enzyme PEX5 YDR244w YAL10F28457g Peroxisomal membrane signal receptor PEX6 YNL329c YALIOC18689g AAA-peroxin PEX7 YDR142c YALIOF18480g Peroxisomal signal receptor PEX8 YGRO77c / Intraperoxisomal organizer of the peroxisomal import machinery PEX9 / YALIOE14729g Peroxisomal integral membrane protein PEX10 YDR265w YALI0001023g Peroxisomal membrane E3 ubiquitin ligase PEX11 YOL147c YALI0004092g Peroxisomal membrane protein PEX12 YMR026c YAL10D26642g C3HC4-type RING-finger peroxisomal membrane peroxin PEX13 YLR191w YALI0005775g Integral peroxisomal membrane PEX14 YGL153w YALIOE9405g Peroxisomal membrane peroxin PEX15 YOL044w i Phosphorylated tail-anchored type II integral peroxisomal membrane protein PEX16 i YALIOE16599g Intraperoxisomal peripheral membrane peroxin PEX17 YNL214w i Peroxisomal membrane peroxin PEX18 YHR160c i Peroxin PEX19 YDL065c YALIOB22660g Chaperone and import receptor PEX20 i YALIOE06831 g Peroxin PEX21 YGR239c i Peroxin PEX22 YAL055w i Putative peroxisomal membrane protein PEX23 P EX30 YALIOD27302g Integral peroxisomal membrane peroxin (YLR324w) PEX31 (YGR004w) PEX32 (YBR168w) PEX25 YPL112c YALIOD05005g Peripheral peroxisomal membrane peroxin PEX27 YOR193w i Peripheral peroxisomal membrane protein PEX28 YHR150w YALIOD11858g Peroxisomal integral membrane peroxin YALIOF19580g PEX29 YDR479c YALIOF19580g Peroxisomal integral membrane peroxin PEX30 YLR324W YALIOD27302g Peroxisomal integral membrane protein PEX31 YGR004W YALIOD27302g Peroxisomal integral membrane protein PEX32 YBR168w YALIOD27302g Peroxisomal integral membrane protein Tableau 3 : Souches de E. coli et de Y. lipolytica utilisées. Genotype or plasmid Strains (host strain) Source or reference E. Coli strains Mach1T1 J recA1398 endAl tonA cP80AlacMl5 LIacX74 hsdR(rr Invitrogen mK) JME1128 JMP 62 URA3 Ex-pTEF-GPD1 This work Y. lipolytica strains W29 MA Ta WT Aggelis et Sourdis, 1997 P01 d MATa ura3-302 1eu2-270 xpr2-322 Barth et Gaillardin, 1996 JMY1202 MATa ura3-302 1eu2-270 xpr2-322 Aqut2::URA3 Beopoulos et al., JMY1233 MA Ta ura3-302 xpr2-322 Aleu2 Apox1-6 Beopoulos et al., JMY1346 MATa ura3-302 1eu2-270 xpr2-322 Aqut2 Beopoulos et al., JMY1351 MATa ura3-302 xpr2-322 Aleu2 Apoxl-6 Aqut2::URA3 Beopoulos et al., JMY1367 MATa ura3-302 xpr2-322 Aleu2 Apoxl-6 Aqut2 Beopoulos et al., JMY1748 MATa ura3-302 1eu2-270 xpr2-322 + pTEF-GPDI-URA3 This work JMY1789 MATa ura3-302 xpr2-322 Aleu2 Apoxl-6 Aqut2 + pTEF- This work GPDI-URA3 JMY1796 MATa ura3-302 1eu2-270 xpr2-322 Aqut2 + pTEF-GPD1- This work URA3 JMY1972 MATa ura3-302 xpr2-322 Aleu2 Apoxl-6 + pTEF-GPD1- This work URA3 Tableau 4 : Amorces utilisées pour la construction des vecteurs et la Q-PCR. Pour chaque paire d'amorce, la première est l'amorce sens (« forward »), la deuxième l'amorce antisens (« reverse »).5 Vecteur Gène Amorces pour construction de vecteur SEQ ID NO: 3 GCGGATCCCACAATGAGCGCTCTACTTCGATCGTCCC JME1128 GPD1 SEQ ID NO: 4 GCGCCTAGGCTAGTTGGCGTGGTAAAGAATCTCGGG Gènes N° Accession Amorces pour analyses de Q-PCR SEQ ID NO: 5 TCCAGGCCGTCCTCTCCC SEQ ID NO: 6 GGCCAGCCATATCGAGTCGCA SEQ ID NO: 7 TCCTCAAGCGACACGTCTA SEQ ID NO: 8 CAGCAACAGCAGGTATCC SEQ ID NO: 9 TTCTCATCTTCCAGTACGCCTA SEQ ID NO: 10 GGCAATAAGATTGAGACCGTT SEQ ID NO: 11 TGTACCGATTCCAGCAGT SEQ ID NO: 12 GGTGTGGGAGATAAGGCAA SEQ ID NO: 13 CGAGACTACCGTTGCTTAC SEQ ID NO: 14 CAACAACGTTCTTAAGGGC SEQ ID NO: 15 TGTGTGGAACCTCGACTACAA SEQ ID NO: 16 CATCCAGAAGTAGGGAAGC SEQ ID NO: 17 CTCCGCCGACTTCTTTATG SEQ ID NO: 18 GAAGTATCCGTCTCGGTG SEQ ID NO: 19 ACT ARE1 YALIOF06578g ARE2 YALIOD07986g DGA1 YALI0E32769g GPD1 YALIOB02948g GUT2 YALIOF00484g LRO1 YALIOE16797g SCT1 YALI0000209g GAGATTGTGTCCGACACT SEQ ID NO: 20 TTTGTCGAATACGGATCGGT SEQ ID NO: 21 CAAGATTGTCTCTCCCTACG SEQ ID NO: 22 GTACTCGGATCAGGTTCAC SEQ ID NO: 23 GTTCGACAAGGAGCCTATT SEQ ID NO: 24 GGTCAGATGCGGATGATAAAG Tableau 5 : Profils des acides gras des souches sauvage et mutantes. Les souches ont été cultivées en YNB avec 0,5 % glucose et 3 % acide oléique (70 % pur). Les valeurs indiquées correspondent à la moyenne de trois expériences différentes après 24 h de culture. La déviation standard était REVENDICATIONS1. Souche de levure mutante chez laquelle la bêta-oxydation des acides gras est déficiente et qui surexprime le gène GPD1, ladite souche mutante étant capable d'accumuler des lipides. 2. La souche de levure de la revendication 1, caractérisée en ce que la levure est Yarrowia lipolytica. 3. La souche de levure de la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un gène choisi parmi les gènes PEX, les gènes PDX, le gène MFE1 et le gène POT1. 4. La souche de levure de l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une mutation de perte de fonction dans au moins un des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. 5. La souche de levure de l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte une mutation de perte de fonction dans chacun 20 des gènes PDX1, PDX2, PDX3, PDX4, PDX5 et PDX6. 6. La souche de levure de l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins une mutation additionnelle dans au moins un gène codant une enzyme impliquée dans le métabolisme des acides gras. 7. La souche de levure de la revendication 6, caractérisée en ce que la mutation additionnelle a pour effet d'augmenter encore la capacité de la souche à accumuler des lipides. 30 8. La souche de levure de la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est déficiente dans chacun des produits des gènes TGL3 et TGL4. 9. La souche de levure la revendication 7, caractérisée en ce que qu'elle comporte un gène GUT2 inactivé. 25 35. La souche de levure de la revendication 6, caractérisée en ce que la mutation additionnelle a pour effet d'altérer le profil des acides gras stockés. 11. La souche de levure de la revendication 10, caractérisée en ce que qu'elle 5 comporte un gène YALIOB10153g inactivé. 12. La souche de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'elle exprime un gène codant pour une enzyme choisie parmi une £ï8 désaturase, une Al2 désaturase et une A15 désaturase. 13. La souche de levure de la revendication 12, caractérisée en ce que ledit gène code pour une Al2 désaturase. 14. La souche de levure de la revendication 13, caractérisée en ce que ledit gène est 15 le gène YALIOB10153g de Yarrowia lipolytica. 15. Procédé d'obtention d'une souche de levure selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant les étapes consistant à : (a) inactiver au moins un gène contrôlant la bêta-oxydation et 20 (b) transformer dans la souche de levure par un polynucléotide permettant l'expression du gène GPDI 16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que la souche de levure est une souche de Yarrowia lipolytica. 25 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 et 16 caractérisé en ce que l'étape (a) comprend les étapes de : 1) sélectionner le gène d'intérêt que l'on veut inactiver, 2) construire une cassette de disruption, 30 3) introduire un marqueur de sélection contenant de part et d'autre des séquences de recombinaison permettant une recombinaison entre elles pour l'élimination du marqueur, 4) sélectionner les souches avec le gène d'intérêt délété et de vérifier la délétion, 5) transformer avec un vecteur permettant l'expression de la recombinase et 10) isoler un clone présentant la délétion du gène d'intérêt et ayant perdu le plasmide d'expression de la recombinase. 18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que les séquences de 5 recombinaison sont de séquences loxP et/ou loxR et que la recombinase est la recombinase Ore. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que l'étape (a) est répétée de façon à inactiver un autre gène. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que le gène GPD1 de l'étape (b) est sous le contrôle de séquences promotrices et de séquences terminatrices. 15 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, caractérisé en ce que la séquence promotrice est choisie parmi le promoteur PDX2, le promoteur LIP2, le promoteur FBA, le promoteur GPM, le promoteur YAT1, le promoteur GPAT, le promoteur TEF, le promoteur hybride hp4d et des promoteurs hybrides XPR2. 20 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, caractérisé en ce que la séquence promotrice est le promoteur TEF1. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, caractérisé en ce que la séquence terminatrice est choisie parmi la séquence terminatrice du gène PGK1 et 25 la séquence terminatrice du gène LIP2. 24. Souche de levure mutante obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 23. 30 25. Utilisation d'une souche de levure mutante selon l'une des revendications 1 à 14 et 24 pour la synthèse de lipides, particulièrement des acides gras libres et des triacylglycérols. 10. Procédé de synthèse de lipide comportant des étapes: (1) de culture d'une souche de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et 24 dans un milieu approprié et (2) de récolte les lipides produits par la culture de l'étape 1.