Brevet FR2963020A1 — publié le 20120127

PROCEDE D'OBTENTION D'UN EXTRAIT ET EXTRAIT POUR LE TRAITEMENT D'UN CANCER DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention d'un extrait de milieu de culture de cellules souches cancéreuses pour le traitement d'un cancer. La présente invention se rapporte également à un extrait obtenu par le procédé de l'invention. La présente invention trouve, notamment des applications dans le domaine technique de la médecine et de la recherche scientifique. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) se rapportent à la liste de références présentée à la fin du texte. Etat de la technique. Le cancer est une classe de maladies qui affecte des personnes de tout âge. Le risque du cancer augmente avec l'âge. Il existe beaucoup de différents types de cancers, mais ils partagent tous une caractéristique technique commune qui est la prolifération anarchique des cellules. La prévalence du cancer est très forte et il a représenté, en 2007, environ 13 % des décès sur le nombre total d'hommes décédés, soit environ 7,6 millions de morts. Le glioblastome multiforme (« Glioblastoma multiform" (GBM)) est la forme la plus commune de tumeur primaire du cerveau chez l'adulte avec un taux de survie moyen de 14 mois (Stupp et al., 2005 [37]). Le faible taux de survie de cette maladie est dû à la nature agressive des tumeurs, très vascularisées, diffuses et infiltrées à des sites distants de la tumeur primaire. (Wen and Kesari, 2008 [41]). Les traitements consistent en des résections chirurgicales suivies par des rayons et/ou des chimiothérapies (Shannon et aI. 2005 [32]) afin d'éliminer les cellules tumorales infiltrées. La radiothérapie combinée de façon concomitante avec des adjuvants permet une prolongation significative de la survie (Stupp et al., 2005 [37]), en particulier pour les patients qui présentent une altération de l'activité de réparation des dommages à l'ADN de la O-6 méthylguanine-ADN méthyltransférase (Hegi et al., 2004 [17]). Cependant, ces traitements restent largement inefficaces puisqu'ils n'empêchent pas les récidives, exclusivement localisées dans le cerveau, qui apparaissent à la fois au site initial de la tumeur mais également à distance. Il existe donc clairement un besoin dans l'état de la technique de trouver d'autres procédés et/ou traitements pour ces cancers ou tumeurs. L'échec du traitement des gliomes malins a été attribué à une résistance accrue des cellules initiant le gliome (« glioma initiating cells (GICs) ») aux thérapies cytotoxiques classiques. En effet, ces thérapies permettent de cibler efficacement la majorité de la tumeur qui est constituée par des cellules tumorales différenciées, mais le compartiment GICs caractérisé par un faible taux de prolifération, la propriété de s'autorenouveler et de réparer plus efficacement les dommages à l'ADN, est épargné. L'hypothèse concernant les GiCs est qu'une minorité de cellules extrêmement tumorogéniques sur l'ensemble de la tumeur, provenant de la transformation de cellules souches, de progéniteurs ou de cellules différenciées qui acquièrent les propriétés de renouvellement et de multipotence, est responsable de l'initiation, du développement et de l'agressivité de la tumeur (Germano et al., 2010 [15]). Le concept original des cellules souches tumorales a été proposé pour les leucémies myéloïdes (Passegue et al., 2003 [26]) puis étendu aux tumeurs solides dans un modèle murin de cancer du sein (Smalley and Ashworth, 2003 [34]). Récemment, les cellules souches cancéreuses (GIC) de différents types de tumeurs solides ont été isolées et caractérisées. La démonstration la plus convaincante que les GICs initient et assurent la croissance tumorale provient d'expériences de xénotransplantations qui ont démontrées qu'une centaine de GICs suffit à générer une tumeur hétérogène génotypiquement et phénotypiquement très semblable à la tumeur d'origine (Visvader and Lindeman, 2008 [37]). L'identification de GlCs dans des gliomes malins a été rapportée par différents groupes utilisant des approches expérimentales distinctes, tel que le tri des cellules cancéreuses exprimant le CD133, un marqueur de cellules souches, ou sur la base de la propriété des GICs à proliférer de façon clonale en formant des neurosphères non adhérentes (Galli et al., 2004 [14]; Ignatova et al., 2002 [19]; Singh et al., 2003 [33]). Des travaux récents ont par ailleurs démontré que les GlCs sont à l'origine de la radio chimiorésistance de la tumeur et ainsi responsables des récidives (Sao et al., 2006 [3]; Piccirillo and Vescovi, 2006 [28]). En effet, les GICs, en allongeant le temps d'activation des protéines kinases Chkl et Chk2 qui bloquent le cycle cellulaire favorisent une réparation plus efficace les dommages causés à l'ADN par les agents génotoxiques et échappent à l'apoptose. De façon remarquable, les GICs sont rendues vulnérables aux traitements génotoxiques et perdent leurs propriétés souches par la stimulation de la différenciation ce qui induit la perte de leur fort potentiel tumorigénique. Il existe donc dans l'état actuel de la technique un besoin de rechercher et identifier de nouvelles molécules et/ou composés permettant de cibler les GICs afin de forcer la perte de leurs propriétés souches et/ou d'induire leur différenciation dans le but d'éradiquer les GICs et traiter efficacement les gliomes malins. Dans cette perspective, il est important de progresser dans la compréhension des mécanismes par lesquels les GICs régulent leurs propriétés de maintien de l'état souche, de renouvellement et de différenciation. La régulation de ces fonctions cellulaires est en partie le résultat d'un contrôle épigénétique de l'expression des gènes. Une voie efficace pour ajuster le niveau d'expression génique est d'agir au niveau post-transcriptionnel par la régulation de la stabilité et de la traduction des ARNm. Récemment, une nouvelle classe de régulateurs post transcriptionnel constituée de petits ARNs non codant d'environ 22 nucléotides, appelés microARN (miARN) a été caractérisée pour induire l'inhibition de la traduction des ARNm et/ou leur dégradation. Des centaines de ces miARNs ont été identifiés chez les mammifères. Ils sont impliqués dans plusieurs processus biologiques tel que la prolifération et la mort cellulaire, la résistance au stress et le métabolisme des acides gras (« fat metobolism ») (Ambros, 2004 [2]). Le fait qu'un seul miARN peut avoir des centaines de gènes cibles (Sood et al., 2006 [35]) le caractérise comme un outil puissant de la régulation génique et suggère un rôle fondamental dans le contrôle du comportement/devenir cellulaire. C'est ainsi que des travaux récents ont démontré que le niveau d'expression soutenu de certains miARN contrôlait l'autorenouvelement et la pluripotence de cellules souches embryonnaires et leur répression rapide la différenciation (Rao, 2004 [30]). De manière intéressante, l'inhibition fonctionnelle des enzymes Dicer ou Drosha, responsable de la maturation de miARN, altère les processus de renouvellement et de différenciation (Wang et al., 2007 [39]). Cependant et malgré ces découvertes concernant les mécanismes du contrôle de l'expression des gènes et du comportement cellulaire, il n'existe pas dans l'état de la technique un procédé et/ou des médicaments permettant de traiter efficacement les cancers. En particulier, il n'existe pas dans l'état de la technique de traitement et/ou de médicaments permettant de traiter les tumeurs agressives, par exemple les glioblastomes. II n'existe pas non plus dans l'état de la technique des molécules et/ou composés permettant de cibler les GlCs, par exemple pour permettre la sortie de leur état souche (« stemness ») et/ou d'induire leur différenciation pour l'éradication des GlCs et le traitement des gliomes malins. En outre, les procédés de traitement du cancer par exemple, la chimio et/ou radiothérapies sont des procédés entrainant de nombreux effets secondaires tel que des nausées, céphalées, stérilité, problèmes digestifs, par exemple des diarrhées ou constipation, problèmes nerveux, par exemple perte de la sensibilité, problème de motilité etc. Il existe donc un besoin dans l'état de la technique de trouver un traitement et/ou un médicament pour le traitement du cancer dont les effets secondaires sont réduits. De plus, les traitements de l'état de la technique sont des traitements très couteux, nécessitant dans la plupart des cas des périodes d'hospitalisation longues. II existe donc un besoin dans l'état de la technique de trouver un nouveau médicament et/ou traitement permettant de diminuer le coût des traitements et/ou de diminuer les périodes d'hospitalisation. Ainsi, il existe dans l'état de la technique un besoin de trouver un procédé et/ou un médicament pour traiter le cancer, en particulier les gliomes, afin de surmonter les défauts et inconvénients des procédés et/ou 2 0 médicament de l'état de la technique. Description de l'invention La présente invention permet précisément de répondre aux besoins précités et de surmonter les défauts et inconvénients des 25 procédés et/ou médicaments de l'état de la technique en fournissant un extrait pour le traitement du cancer et un procédé pour le produire. En particulier, la présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'un extrait à partir d'un milieu de culture de cellules souches cancéreuses comprenant les étapes suivantes : 30 a. Obtention d'un vecteur viral comprenant les séquences codant pour le cluster de miARN 302-367 et un promoteur adapté pour l'expression desdites séquences dans des cellules souches cancéreuses, b. Transformation de cellules souches cancéreuses avec ledit vecteur viral, c. Culture des cellules transformées obtenues à l'étape b) dans un milieu de culture de cellules souches cancéreuses, et d. Récupération du milieu de culture desdites cellules transformées, ledit milieu de culture formant l'extrait. Dans la présente invention, par "cellules souches cancéreuses" on entend n'importe quelle cellule souche cancéreuse ou cellule initiatrice de tumeurs connue par l'homme du métier. Par exemple, il peut s'agir de cellules souches provenant de tumeurs, par exemple d'une tumeur maligne ou bénigne, de n'importe quel organe, par exemple du cerveau, du coeur, du poumon, de la peau, des yeux. Il peut s'agir par exemple de cellules souches d'un gliome, d'un carcinome, d'un sarcome. Il peut s'agir par exemple de cellules souches cancéreuses déposées à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), sous les numéros CNCM n°I-4259 (TG1), CNCM n°I-4260 (TG1 CL). Dans la présente invention, la séquence du cluster du miARN 302-367 est : 5'GGCTGAAGTCCCTGCCTTTTACCCTTCTGGAGGAGAACACGAATCT TTGGGAACTAGTTCAGGAAGGTAAAAAAATTTTTTTCTTCTAAAGTTAT GCCATTTTGTTTTCTTTCTCCTCAGCTCTAAATACTCTGAAGTCCAAAG AAGTTGTATGTTGGGTGGGCTCCCTTCAACTTTAACATGGAAGTGCTT TCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAGGAGTGAATCC AATTTACTTCTCCAAAATAGAACACGCTAACCTCATTTGAAGGGATCC CCTTTGCTTTAACATG GGG GTACCTGCTGTGTGAAACAAAAGTAAGTG CTTCCATGTTTCAGTGGAGGTGTCTCCAAGCCAGCACACCTTTTGTTA CAAAATTTTTTTGTTATTGTGTTTTAAG G TTACTAAG CTTGTTACAG GTT AAAGGATTCTAACTTTTTCCAAGACTGGGCTCCCCACCACTTAAACGT GGATGTACTTGCTTTGAAACTAAAGAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTGG TGATGGTAAGTCTTCCTTTTACATTTTTATTATTTTTTTAGAAAATAACT TTATTGTATTGACCG CAG CTCATATATTTAAGCTTTATTTTGTATTTTTA CATCTGTTAAGGGGCCCCCTCTACTTTAACATGGAGGCACTTGCTGTG ACATGACAAAAATAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGTGGTGGTTCCTACC TAATCAGCAATTGCGTTAACGCCCACACTGTGTGCAGTTCTTGGCTAC AGGCCATTACTGTTGCTAATATGCAACTCTGTTGAATATAAATTGGAAT TGCACTTTAGCAATGGTGATGGATTGTTAAGCCA-3' (SEQ ID N° 1) un 1 o de ses dérivés. Selon l'invention, le dérivé du cluster de miARN 302-367 peut être par exemple une séquence ayant un pourcentage d'homologie supérieur à 75 % avec la séquence SEQ ID N° 1, de préférence un pourcentage d'homologie supérieur à 80 %, de préférence supérieur à 15 85 °/a, de préférence supérieur à 90 %, de préférence supérieur à 95 %. Selon l'invention, le dérivé du cluster de miARN 302-367 peut également être par exemple la séquence précurseur ou mature sens et/ou antisens d'un miARN du cluster de miARN 302-367, et par exemple la combinaison de la séquence précurseur et/ou mature sens et/ou antisens 20 d'un ou plusieurs miARN du cluster de miARN 302-367. Selon l'invention, un promoteur adapté pour l'expression desdites séquences d'ARN peut être tout promoteur connu de l'homme du métier. II peut s'agir par exemple d'un promoteur constitutif, par exemple un promoteur constitutif décrit dans le document Zarrin et al., 25 « Comparison of CMV, RSV, SV40 viral and Vil cellular promoters in B and T lymphoid and non-lymphoid cell Unes » Biochimica et Biophisica Acta (1999, 1446) [49], un promoteur choisi dans le groupe comprenant les promoteurs viraux, les promoteurs aviaires, les promoteurs du cytomégalovirus, les promoteurs du SV40, le promoteur de la beta-actine, 30 le promoteur de l'albumine, le promoteur de la beta-globuline, le promoteur du facteur d'élongation 1-alpha, le promoteur de PgammaK, le promoteur MFG, or le promoteur du Rous sarcoma virus, et autres promoteurs bien connu dans le technologie des ADN recombinant. Il peut s'agir également de promoteurs inductibles, par exemple un promoteur inductible décrit dans les documents Murakami et al., (« Thiostrepton-induced gene expression in Streptomyces lividans. » J. Bactt. 171 (1989) 1459) [47], Mazodier et al., « Characterization of the groEL-like genes in Streptomyces albus. » J. Bact. 173 (1991) 7382 [48], Urlinger et al.,« Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. (2000) [50], Baron et al. « Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter », Nucleic Acids Res. (1995) [51], Neil Senzer et al, « TNFerade Biologic, an Adenovector With a Radiation-Inducible Promoter, Carrying the Human Tumor Necrosis Factor Alpha Gene: A Phase I Study in Patients With Solid Tumors », Journal of Clinical Oncology (2004) [52], Schmidt M et al, « Inducible promoters for gene therapy of head and neck cancer: an in vitro study », Eur Arch Otorhinolaryngol (2004) [53], Wolfgang Walther et al., « Heat-inducible in vivo gene therapy of colon carcinoma by human mdrl promoter-regulated tumor necrosis factor-alpha expression », Molecular Cancer Therapeutics (2007) [54], D G A Parker et al, « A steroid-inducible promoter for the cornea », Br J Ophthalmol (2009) [55], un promoteur inductible choisi dans le groupe comprenant un promoteur inductible par la tétracycline, un promoteur inductible par la doxicycline, un promoteur inductibie par le tamoxifene, une promoteur inductibie par la température, un promoteur inductibie par les radiations, un promoteur inductible par un facteur spécifique de l'état souche, un promoteur inductible par un facteur spécifique d'un état différencié, un promoteur inductible par un facteur spécifique d'un état tumoral. Le promoteur peut être également un promoteur choisi dans le groupe comprenant le promoteur 7SK U6 ou HI de l'ARN polymérase III, PGK, ou des promoteurs de cytomegalovirus. Avantageusement selon l'invention, le promoteur est un promoteur constitutif permettant une expression stable du cluster. II peut s'agir par exemple de promoteurs décrits dans le document van de Wetering M et al, « Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector », Embo rep. (2003) [56], Xia XG et al., « An enhanced U6 promoter for synthesis of short hairpin RNA. » Nucleic Acids Res. (2003) [57], W Bruening et al., « Activation of stress-activated MAP protein kinases up-regulates expression of transgenes driven by the cytomegalovirus immediate/early promoter », Nucleic Acids Res. (1998) [58]. Selon l'invention, le vecteur viral peut être tout vecteur viral connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce. Il peut s'agir par exemple d'un rétrovirus, lentivirus, adénovirus ou virus associés à l'adénovirus. Il peut s'agir par exemple d'un rétrovirus choisi dans le groupe comprenant les Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Lentivirus et Spumavirus. Il peut s'agir par exemple d'un lentivirus choisi dans le groupe comprenant le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (HIV1), le virus de l'immunodéficience humaine de type 2 (HIV2), le virus de l'immunodéficience simienne (SIV), le virus de l'immunodéficience féline (FIV), le virus de l'immunodéficience bovine (BIV), de l'anémie infectieuse des équidés (EIAV), visna du mouton, de l'encéphalite et de l'arthrite caprine (CAEV). Il peut s'agir par exemple d'un adénovirus choisi dans le groupe comprenant les Aviadenovirus, Atadenovirus, Mastadenovirus et Siadenovirus. Selon l'invention, l'obtention du vecteur viral, c'est-à-dire un vecteur viral tel que défini précédemment comprenant un promoteur adapté tel que décrit précédemment et un cluster de miARN tel décrit précédemment peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. II peut s'agir d'un procédé décrit dans le document Sambrook, Fritsch and Maniatis, « Molecular cloning, A laboratory manual », second edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989 [43], dans le document Maurizio Federico « Lentivirus gene engineering protocols », volume 229, 2003 [44], Fisher et al. (1996), "Transduction with recombinant adenoassociated virus for gene therapy is limited by leading-strand synthesis." J. Virol, 70:520-532 [46]; Michaela Scherr et al., « Lentivirus-mediated antagomir expression for specific inhibition of miRNA function « , Nucleic Acids Research (2007) [5858]; Letizia Venturini et al., « Expression of the miR-17-92 polycistron in chronic myeloid leukemia (CML) CD34+ cells », Blood (2007) [60]. Selon l'invention, la transfection des cellules cancéreuses peut être réalisée selon tout procédé connu de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce. II peut s'agir, par exemple d'une électroporation, d'une transfection par un précipité de phosphate de calcium, d'une transfection liposomale, d'une transfection à l'aide d'un mélange de lipides. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document Lin et al [21], Fujita Y, et al., « MiR-148a attenuates paclitaxelresistance of hormone-refractory, drug-resistant prostate cancer PC3 cells by regulating MSK1 expression », J Biol Chem. (2010) [61]. Selon l'invention, la culture des cellules transformées peut être réalisée dans toute condition permettant la culture de cellules cancéreuses, de préférence de cellules souches cancéreuses connues de l'homme du métier. Par exemple la culture des cellules peut être réalisée à une température de 10 à 40°C, de préférence de 15 à 37°C, de préférence à 37°C. La culture peut être réalisée, par exemple dans une atmosphère comprenant de 0 à 30 % d'oxygène, de préférence à 21 % d'oxygène. La culture peut être également réalisée dans une atmosphère comprenant de 0 à 20 % de Dioxyde de carbone (CO2), de préférence à 5 % de CO2. La culture peut être également réalisée dans une atmosphère comprenant de 80 à 100 % d'humidité, de préférence à 95 % d'humidité. Selon l'invention, la culture peut être réalisée dans tout milieu connu de l'homme de métier permettant la culture des cellules souches normales et cancéreuses, de préférence de cellules souches cancéreuses. Il peut d'agir par exemple d'un milieu décrit dans le document Patru et al. [27], Doering, Laurie C, Protocols for Neural Cell Culture, Springer Protocols Handbooks [62], d'un milieu disponible dans le commerce, par exemple un milieu de culture commercialisé par la société Invitrogen et/ou d'un milieu choisi dans le groupe comprenant un milieu DMEM et/ou F12 supplémenté, par exemple avec de la glutamine, du bicarbonate de sodium, de l'hepes , du glucose, du facteur de croissance épidermique EGF (« Epidermial Growth Factor ») du facteur de croissance 1 o fibroblastique bFGF (basic Fibroblast growth factor), et/ou tout autres suppléments adaptés à la culture des cellules souches adultes tel que le B27, le N2 et le G5 commercialisés par exemple par Invitrogen. Selon l'invention, la récupération du milieu de culture peut être réalisée selon tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir 15 également d'un procédé comprenant la filtration du milieu de culture, par exemple sur un filtre avec des pores dont le diamètre est compris de 0,4 à 0,22 pm, le pompage du milieu de culture étant assuré par exemple par une seringue, ou une pompe à vide. Il peut également s'agir d'une centrifugation à une vitesse de préférence comprise entre 800 et 1200 20 tours par minute, de préférence à 800 tours par minute, le temps de centrifugation peut être, par exemple de 1 à 10 minutes, de 3 à 7 minutes, égale à 5 minutes. Avantageusement, selon l'invention, la récupération du milieu de culture peut être effectuée par exemple par une centrifugation suivie d'une 25 filtration sur filtre millipore 0,22 pm permettant la rétention des cellules dans le culot du tube puis l'obtention d'un milieu sans cellule, sans débris cellulaire et sans agent pathogène. Selon l'invention, le procédé de l'invention peut comprendre une ou plusieurs étapes de purification par fractionnement physico-chimique du 30 milieu récupéré et/ou des composants du milieu de culture. Avantageusement, selon l'invention, la purification du milieu récupéré permet de concentrer les protéines et/ou les composants présents dans le milieu d'en faciliter le conditionnement et l'utilisation ultérieure. La purification du milieu peut être réalisée par tout procédé de purification connue de l'homme du métier, par exemple une purification par ultrafiltration. Par exemple, l'ultrafiltration peut être réalisée par exemple par centrifugation en utilisant un Amicon Ultra-15 (Millipore Corp). La vitesse de centrifugation peut être, par exemple, une vitesse comprise de 500 à 5000 g, de préférence à une vitesse de 4000 g. La durée de centrifugation peut être comprise par exemple de 1 à 60 minutes, de 5 à 45 minutes, de 10 à 30 minutes, égale à 15 minutes. L'ultrafiltration par centrifugation sur amicon Ultra-15 par exemple durant 15 min à 4000 g permet de concentrer 100 fois les protéines et/ou les composants du milieu de culture. Cette purification peut également être obtenue par tout procédé de séparation connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un procédé de concentration par évaporation sous vide, de concentration par centrifugation, de lyophilisation, de dialyse, de tamisage moléculaire, de chromatographie par échange d'ions, de chromatographie en contraste de phase. Selon l'invention qu'il y ait ou non une étape e) de purification, le procédé peut comprendre en outre une étape de concentration du milieu récupéré. Il peut s'agir de tout procédé de concentration connu de l'homme du métier, par exemple, d'une concentration sous vide, une concentration par centrifugation, d'une lyophilisation. La présente invention a également pour objet une cellule exprimant le cluster miR-302-367. Selon l'invention, la cellule peut être par exemple toute cellule obtenue par le procédé de l'invention. Il peut s'agir par exemple de cellules souches cancéreuses déposée à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), institut pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, CNCM n°I-4260 (TG1 CL). La présente invention a également pour objet un extrait d'un milieu de culture susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention et/ou à partir d'une culture de cellules souches cancéreuses exprimant le cluster miR-302-367. A partir du procédé de l'invention, les inventeurs ont noté que l'extrait peut comprendre une fraction active dont le poids moléculaire est compris de 3 à 500 kDa. Selon l'invention, l'extrait peut être une fraction du milieu récupéré ou la totalité du milieu récupéré. Lorsqu'il s'agit d'une fraction, il peut s'agir par exemple d'une fraction obtenu par filtration et/ou par purification et/ou par concentration. En d'autres termes, la fraction de l'extrait peut être une partie et/ou un concentrât et/ou l'extrait qui contient une fraction active. Selon l'invention, l'extrait peut être fractionné en fonction du poids moléculaire de ces composants. Il peut s'agir par exemple d'un fractionnement par un procédé connu de l'homme du métier, par exemple par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Avantageusement, le fractionnement de l'extrait permet de séparer les composés compris dans l'extrait en fonction de leur poids moléculaire. La présente invention a également pour objet l'extrait selon l'invention pour son utilisation comme médicament. Selon l'invention, le médicament peut comprendre, en outre un support pharmaceutiquement acceptable. Dans la présente par « support pharmaceutiquement acceptable », on entend tous composés connus par l'homme du métier pour être utilisés dans des médicaments. Il peut d'agir, par exemple des composés cités dans A. LEHIR (Ed. Masson, 1992 (hème édition)) [45]. Avantageusement, le support pharmaceutiquement acceptable peut permettre, par exemple, d'améliorer la biodisponibilité, la solubilité et/ou la fabrication du médicament. Le médicament comprenant l'extrait selon l'invention peut être formulé sous toute forme connue de l'homme du métier et permettant son administration à un patient ou à un animal. Il peut s'agir, par exemple, d'une formulation pour administration par voie orale, intraveineuse, péridurale, cutanée, transdermique ou intracérébrale. Il peut s'agir, par exemple d'une formulation orale par exemple un sirop, une poudre, des granules, un comprimé, un comprimé pelliculé, une gélule, un spray ; une formulation locale comme par exemple une crème, une lotion, un gel ; une formulation oculaire par exemple un collyre ; une formulation pour injection 1 o intraveineuse, une formulation injectable par dispositifs d'auto injection type stylo à insuline, un patch transdermique, comprimés disponibles per os, une formulation pour ingestion sublinguale, ou une formulation pour injection intracrânienne. Par exemple, il peut s'agir des différentes formulations 15 pharmaceutiques décrites dans l'ouvrage Pharmacie galénique de A. LEHIR (Ed. Masson, 1992 (hème édition)) [45]. Le médicament comprenant l'extrait de l'invention est de préférence administré afin d'obtenir une concentration intraveineuse permettant un effet biologique. 20 Le médicament comprenant l'extrait selon l'invention peut être conditionné pour une administration, par exemple, une fois par jour, deux fois par jour, trois fois par jour, tous les deux jours, tous les trois jours, une fois par semaine. Le mode d'administration et la quantité administrée peuvent être 25 adaptés à chaque individu et peuvent être déterminés par le praticien notamment en fonction des caractéristiques physiologiques de l'individu traité. La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'extrait selon l'invention pour le traitement du cancer. La présente invention a également pour objet l'utilisation des cellules souches cancéreuses exprimant le miR 302-367 selon l'invention pour le traitement du cancer. Dans la présente, par cancer on entend tout cancer connu de l'homme du métier. Il peut s'agir, par exemple, d'un cancer de tout tissu et/ou organe, par exemple du poumon, du foie, du cerveau, des yeux. II peut s'agir par exemple d'une tumeur telle que définie précédemment, d'un gliome, d'un carcinome, d'un sarcome. De préférence, le cancer est un gliome. Les inventeurs sont les premiers à avoir démontré que le milieu de culture obtenu par le procédé de l'invention permet d'inhiber la croissance des cellules cancéreuses. L'extrait obtenu selon le procédé de l'invention permet donc avantageusement de traiter le cancer. En particulier, les inventeurs sont les premiers à avoir démontré que l'extrait obtenu par le procédé de l'invention permet avantageusement d'induire une différenciation des cellules souches cancéreuses. De plus les inventeurs sont les premiers à avoir démontré que l'extrait de l'invention permet de modifier le phénotype des cellules souches cancéreuses permettant ainsi la perte de la multipotence de ces cellules. De plus les inventeurs sont les premiers à avoir démontré que l'extrait permet de modifier le phénotype des cellules souches cancéreuses permettant ainsi la perte de leur état souche et de la prolifération clonale. L'extrait obtenu selon le procédé de l'invention et/ou l'extrait selon l'invention permet également et avantageusement d'inhiber les propriétés tumorigéniques (infiltration et prolifération) de cellules souches cancéreuses dans un modèle de reconstitution organotypique tridimensionnel. L'extrait obtenu selon le procédé de l'invention et/ou l'extrait selon l'invention permet avantageusement de traiter le cancer tout en évitant le risque de rechute lié, notamment, aux cellules souches cancéreuses. En outre le procédé de l'invention permet avantageusement d'obtenir de grandes quantités de milieu de culture et/ou d'extrait permettant ainsi de diminuer les coûts et les frais de traitement du cancer. En outre les cellules souches cancéreuses transformées de la présente invention permettent avantageusement d'obtenir de grandes quantités de milieu de culture et/ou d'extrait permettant ainsi de diminuer les coûts et les frais de traitement du cancer. Enfin, la présente invention permet avantageusement d'améliorer le traitement du cancer en diminuant le risque de récidive. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les Figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des Figures - La figure 1 A est un diagramme en bâton représentant les résultats de l'analyse par PCR quantitative de l'expression du cluster miR-302-367 dans les cellules cultivées en NS34 (neurosphères auto-renouvelés) et après 3 jours de différenciation en MSVF (cellules différenciées (D3 : 3 jours)). L'ordonnée représente la valeur de CT correspondant aux nombres de cycles de PCR. L'abscisse représente les miR étudiés. Pour chaque point, l'ARN total a été isolé et analysé par PCR quantitative. ND non détecté. - La figure 1 B est un diagramme en bâton représentant les résultats de l'analyse par PCR quantitative en fonction du temps de l'expression du cluster miR-302-367 durant la différenciation des cellules. L'ordonnée représente le niveau d'induction (FI : facteur d'induction). L'abscisse représente les différents miR étudiés. Pour chaque point, l'ARN total a été isolé et soumis a une analyse par PCR quantitative. - La figure 1 C est un diagramme en bâton représentant les résultats de l'analyse par PCR quantitative de l'expression du cluster miR- 302-367 dans deux lignées de cellules souches neurales normales (CSNN 24 et 25). L'ordonnée représente le niveau d'induction. L'abscisse représente les différents miR étudiés. - La figure 1 D est un diagramme en bâton représentant les résultats de l'analyse par PCR quantitative de l'expression du cluster miR- 302-367 dans des cellules TG1 différenciées dans 0,5 % de sérum en présence ou non des composés U0126 et TWS. L'ordonnée représente le niveau d'induction. L'abscisse représente les différents miR étudiés. - La Figure 2 A comporte un diagramme en bâton et deux photographies. Le diagramme en bâton représente les résultats obtenus par PCR quantitative de la cinétique d'expression (RE : expression relative) de chacun des membres du cluster miR302-367 dans les cellules TG1 après transfection transitoire du cluster. L'ordonnée représente l'expression relative (RE) par rapport à des cellules TG1 transfectées avec un ADN contrôle, l'abscisse le miR mesuré en fonction du temps : Dl : 1er jour D2 : 2ème jour, D3 : Sème jour, D4 : 4ème jour, D5 : 5ème jour 5 et D6 : 6ème jour . Les illustrations permettent de visualiser l'effet du cluster sur la morphologie des cellules transfectées par le cluster (Cluster 302) comparé à la transfection d'un ADN contrôle après 48 heures dans du milieu NS34-. - La Figure 2 B comporte un diagramme en bâton et un panel de 4 photographies. Le diagramme en bâton présente le niveau d'expression des microARN du cluster dans des TG1 et TG6 génétiquement modifiées pour exprimer stablement le cluster (TG1 cluster 302 et TG6 cluster 302). En ordonnée, l'expression relative (RE) par rapport aux lignées contrôles génétiquement modifiées pour l'expression stable d'une séquence ARN contrôle, en abscisse, les microARN dosés. Les illustrations montrent le changement de morphologie des cellules TG1 et TG6 exprimant stablement le cluster (TG6 Cluster 302 et TG1 Cluster 302) après 4 jours de culture dans le milieu NS34- et comparer aux cellules contrôles (TG6 Ctl et TG1 Ctl). - La figure 2 C est un diagramme en bâton représentant les résultats obtenus par PCR quantitative de l'expression relative (RE) sur 4 jours, de GFAP, Olig2 et Shh dans des cellules TG1 cluster 302 (bâton noirs), cellules TG6 cluster 302. L'ordonnée représente l'expression relative (RE) par rapport à des cellules TG1 Ctrl et TG6 Ctrl, l'abscisse le miR étudié. - La Figure 3 A représente des photographies d'immunomarquage des marqueurs protéiques du caractère souche (« stemness ») : la protéine Sonic Hedgehog (« Sonic hedgehog homolog » (Shh)), la protéine Oct4, la protéine Nanog et la protéine Sox1 dans des cellules TG1 Ctrl ou TG1 Cluster 302 cultivées dans un milieu complet NS34+. Les marqueurs ont été détectés à la fois dans les cellules TG1 Ctrl (photographies supérieures) et dans les cellules TG1 cluster 302 (photographies inférieures). - La Figure 3 B représente des photographies d'immunomarquage des marqueurs glioneuronaux NeuN (première ligne) Olig2 (deuxième ligne), GFAP (troisième ligne), dans des cellules TG1 Cluster 302 cultivées dans un milieu complet NS34+ ou après 1 ou 2 jours (Dl ou D2) d'incubation dans un milieu minimum (NS34-) (conditions quiescentes). Les noyaux ont été colorés au DAPI. - La Figure 4 A est un diagramme en bâton représentant les résultats obtenus par PCR en temps réel de l'expression de la kinase PBK (PDZ Binding Kinase ; kinase liant PDZ) dans des cellules TG1 cluster 302 et comparée à l'expression dans des cellules TG1 Ctrl. L'ordonnée représente la répression relative (FR), l'abscisse les cellules testées : TG1 Ctrl, TG1 Ctrl incubées dans un milieu contenant 0,5 % de sérum (TG1 Ctrl + sérum) et des cellules TG1 cluster 302. - La Figure 4 B représente des photographies d'immunomarquage de la kinase PBK dans des cellules TG1 et TG6 Ctrl ou TG1 et TG6 Cluster 302. Les points blancs indiqués par les flèches montrent la forte expression de la kinase PBK dans les cellules en division. - La Figure 4 C est un diagramme en bâton représentant le pourcentage d'efficacité clonale (ordonnée) en fonction des cellules TG1 Ctrl ou TG1 cluster 302 (abscisse). Les illustrations montrent la morphologie des sphères obtenues à l'issue du test pour chaque type cellulaire. - La Figure 4 D représente un diagramme de l'évolution du nombre de cellules (ordonnée) en fonction du temps (abscisse). La courbe pleine représente les cellules TG1 cluster 302, la courbe en pointillés les cellules TG1 Ctrl. - La Figure 4 E est un diagramme en bâtons illustrant l'expression relative des ARNm du E2F1, de la cyline D et de la cycline A, dosée par PCR quantitative, dans les cellules TG1 CL (TG1 cluster 302) par rapport aux cellules TG1 Ctrl (TG1 contrôle) (en ordonnée). En abscisse est indiqué le nom des gènes dosés. - La Figure 4 F représente des photographies de cellules TG1 Ctrl ou TG1 Cluster 302 exprimant une protéine fluorescente rouge (TG1 Ctrl rouge ou TG1 Cluster 302 rouge) après 3 semaines de culture organotypique et inclusion dans de la paraffine. La photographie de gauche identifiée TG1 Ctrl correspond aux cellules TG1 contrôle, celle de droite correspondant aux cellules TG1 Cluster. La fluorescence permet de visualiser la croissance des cellules et le développement d'un tissu. - La Figure 4 G est un diagramme en bâton représentant le pourcentage d'efficacité clonale (ordonnée) en fonction des cellules TG6 Ctrl ou TG6 cluster 302 (abscisse). Les illustrations montrent la morphologie des sphères obtenues à l'issue du test pour chaque type cellulaire. - La Figure 4 H représente un diagramme de l'évolution du nombre de cellules (ordonnée) en fonction du temps. La courbe pleine représente les cellules TG6 cluster 302, la courbe en pointillés les cellules TG6 Ctrl. - La Figure 4 I représente des photographies de cellules TG6 Ctrl ou TG6 Cluster 302 exprimant une protéine fluorescente rouge (TG6 Ctrl rouge ou TG6 Cluster 302 rouge) après 3 semaines de culture organotyique et inclusion dans de la paraffine. La photographie de gauche identifiée TG6 Ctrl correspond aux cellules TG6 contrôle, celle de droite correspond aux cellules TG6 Cluster. La fluorescence montre la croissance cellulaire et le développement d'un tissu. - La Figure 5 A est un diagramme en bâton représentant les résultats obtenus par PCR quantitative de l'expression relative de CXCR4 (ordonnée), c'est-à-dire le rapport d'ARNm codant pour CXCR4 dans les cellules TG1 cluster 302 par rapport aux cellules TG1 Ctrl (abscisse). - La Figure 5 B représente des photographies de marquage par immunofluorescense de la protéine CXCR4 dans les cellules TG1 Ctrl ou TG1 Cluster 302. Les noyaux ont été colorés au DAPI. - La Figure 5 C représente des photographies de cultures organotypiques de coupes de cerveaux de souris mises au contact de TG1 Ctrl et TG1 Cluster pendant un mois, inclusion dans la paraffine et réalisation de coupe. Les Blocs 1 et 2 représentent deux cultures organotypiques différentes de coupes de cerveaux de souris. Sur le bloc 2 en contraste de phase, des cellules rouges TG1 Ctrl (photographie supérieure) ou rouges TG1 Cluster 302 (photographie inférieure) ont été ensemencées. Les zones claires représentent l'infiltration par les cellules du tissu neuronal. - La Figure 5 D représente des photographies de tissu neural humain fabriqué sur lequel ont été ensemencées des cellules TG1 contrôle exprimant une protéine fluorescente rouge. - La Figure 5 E représente des photographies de tissu neural humain fabriqué sur lequel ont été ensemencées des cellules TG1 Ctrl rouges (TG1 Ctrl) ou des cellules TG1 Cluster 302 rouges (TG1 Cluster 302). - La Figure 6 A représente des photographies de co-culture de cellules TG1 avec des cellules TG1 Cluster 302 rouge (photographies du haut) ou TG1 Ctrl (photographies du bas). Les photographies de droite représentent la différence de morphologie entre chaque culture. - La Figure 6 B représente des photographies de co-cultures de cellules TG1 rouge dans un milieu conditionné avec des cellules TG1 Cluster 302 (photographies du haut (milieu cluster 302) ou TG1 Ctrl (photographies du bas (milieu Ctrl)). Les photographies de droites représentent la différence de morphologie entre chaque culture. - La Figure 6 C est un diagramme en bâton représentant les résultats obtenus par PCR quantitative de l'expression relative (RE) de GFAP, Olig2 et Shh (abscisse) dans des cellules TG1 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 cluster 302 par rapport à l'expression dans des cellules TG1 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (ordonnée). - La Figure 6 D représente des photographies après immunomarquage de Shh ou de Sox1 dans des cellules TG1 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (milieu Ctrl) ou TG1 cluster 302 (milieu cluster 302). Les noyaux ont été colorés au DAPI. - La Figure 6 E est un diagramme en bâton représentant les résultats obtenus par PCR quantitative de l'expression relative de miR302a, b et 367 (abscisse) dans des cellules TG1 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 cluster 302 par rapport à l'expression dans des cellules TG1 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (ordonnée). - La Figure 6 F représente des photographies après immunomarquage de la cycline A (CyA) dans des cellules TG1 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (milieu Ctrl) ou TG1 cluster 302 (milieu cluster 302). Les noyaux ont été colorés au DAPI. - La Figure 7 A est un diagramme en bâton représentant le pourcentage d'efficacité clonale des cellules TG1 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (milieu TG1 Ctrl) ou dans un milieu conditionné par des cellules TG1 cluster 302 (milieu TG1 cluster 302). 100 % correspondant à 10 neurosphères pour 10 cellules isolées. L'analyse statistique a été réalisée via un test de Student. - La Figure 7B représente des photographies de cellules TG6 rouges après culture dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl ou TG1 Cluster 302. - La Figure 7C est un diagramme en bâton représentant le pourcentage d'efficacité clonale des cellules TG6 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (milieu TG1 Ctrl) ou dans un milieu conditionné par des cellules TG1 cluster 302 (milieu TG1 cluster 302). 100 % correspondant à 10 neurosphères pour 10 cellules isolées. L'analyse statistique a été réalisée via un test de Student. - La Figure 7D est un diagramme en bâton représentant le pourcentage d'efficacité clonale des cellules TG6 cluster 302 cultivées dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (milieu TG1 Ctrl) ou dans un milieu conditionné par des cellules TG1 cluster 302 (milieu TG1 cluster 302). 100 % correspondant à 10 neurosphères pour 10 cellules isolées. L'analyse statistique a été réalisée via un test de Student. - La Figure 7E est un schéma représentant la culture des cellules rouge TG1 dans un milieu conditionné par des cellules TG1 Ctrl (gauche) et TG1 cluster 302 (droite) sur des coupes de cerveaux, les cellules étant déposées à la surface des coupes de cerveaux. Les photographies représentent les cultures obtenues. Les zones claires correspondent aux cellules qui ont proliférées et se sont infiltrées dans le tissu neuronal. - La Figure 7F est un schéma représentant la culture de cellules TG1 Ctrl ou TG6 Ctrl sur des coupes de cerveaux dans un dispositif interface air/liquide nourri par le compartiment inférieur du dispositif air/liquide avec un milieu NS34+ ensemencé avec des TG1 Ctrl (à gauche) ou des TG1 cluster (à droite). Les photographies représentent les cultures obtenues. Les zones claires correspondent à l'infiltration et à la prolifération des cellules TG1 Ctrl et TG6 Ctrl dans le tissu cérébral. - La Figure 8 est un diagramme en bâton qui représente les résultats obtenus par le dosage en PCR quantitative de l'expression relative (RE) des chimiokines cxcl2, cxcl3 et cxcl8 (ordonnée) dans les cellules TG1 (TG1 CL) et TG6 (TG6 CL) exprimant stablement le cluster miR 302-367 cultivées dans un milieu NS34+ (abscisse) par rapport aux TG1 et TG6 contrôle. ND non détecté. EXEMPLES Exemple 1 : Etude de la corrélation entre l'expression du cluster miR-302-367 et la différenciation glio-neurale induite par du sérum Matériel et méthode: Les exemples suivants ont été mis en oeuvre avec les produits et procédés décrits ci-dessous. Réactifs et anticorps Les réactifs de culture cellulaire, kit de clonage pENTR (ref K2400-20), LR Clonase I l (ref 11791-020), reverse transcriptase (ref 18064-014), et Trizol ont été achetés chez Invitrogen. Le sérum foetal de veau provient de la société Hyclone. Le Hoechst 33342, U0126, TWS119, Méthyl Méthane Sulfonate (MMS) l'anticorps anti-B3Tubulin (ref CBL412-1/100°) ont été achetés chez Sigma. Les anticorps Anti-SHH (ref sc1194-1/50°), anti-Oct4 (ref sc9081-1/50°) ont été achetés dans la société Santa-Cruz biotechnology (tebu-bio, Leperrey en Yvelinne). Les anticorps Anti-Nanog (ref AF1997-5 pg/mL), anti-CXCR4 (ref MAB170, 1/100°), et anti-Olig2 (ref AF2418, 10 pg/mL) provenaient de la société R&Dsystem. Les anticorps Anti-GFAP (ref 2203PGF-1/200°) ont été achetés à la société AbCys. Les anticorps Anti-Cyclin A (NCL-Cyclin A, 1/250°) provenaient de la société Novocastra. Les anticorps Anti-NeuN (MAB377, 1/150°) provenaient de la société Chemicon (Chemicon International, Temecula, CA). Les anticorps Anti-PBK (ab59327, 1/100°) provenaient de la société Abcam. Les anticorps secondaires Anti-espèce couplés à l'Alexa 488 (1/500°) ou Alexa 546 (1/500°) ont été achetés à la société Alexa. Le kit microARN Taqman Reverse transcription (ref 4366596), Universal Taqman PCR Master Mix, TLDA array et les amorces Taqman ont été achetés à la société Applied biosystem. Le réactif de détection chimioluminescence provenait de la société Biorad. Culture cellulaire Les cellules de culture primaire TG1 et TG6 ont été isolées à partir de glioblastomes humains (Patru et al., 2010 [27]). L'ablation chirurgicale a été lavée dans une solution équilibrée de Hank (« Hank's Balanced Salt Solution » (HBSS)), dans de la trypsine-EDTA (0,005 %-0,05 mM) et dilacérée. La suspension cellulaire a été incubée à 37°C et mélangée doucement toutes les 10 minutes. Après 30 minutes, le surnageant a été collecté, les cellules ont été lavées avec du PBS, centrifugées 5 minutes à 800 tours par minute (tpm) et ensemencées dans du NBE/NS34+ (DMEMF12 1/1, Glutamine 10 mM, hepes 10 mM, bicarbonate de sodium 0,025 %, N2, G5, B27). Les cellules isolées des tumeurs ont été ensuite sélectionnées sur leurs propriétés à former des sphères et à s'autorenouveler en milieu NS34+. Le milieu pour la différentiation cellulaire (MFCS) était composé de DMEM-F12, Glutamine 10 mM, hepes 10 mM, bicarbonate de sodium 0,025 %, FCS 0,5 %. Pour les expériences de différentiation, les neurosphères ont été dissociées et 500 000 cellules individuelles ont été ensemencées dans du MFCS. Pour l'évaluation de la différenciation des cellules TG1 ou TG6 exprimant de manière stable le cluster miR-302-367, les neurosphères ont été dissociées et ensemencées dans du NB/NS34-(DMEM-F12 1/1, Glutamine 10 mM, hepes 10 mM, Sodium bicarbonate 0,025 %). Pour évaluer l'effet paracrine du cluster miR-302-367, les 30 cellules TG1 ont été dissociées et ensemencées dans du milieu NS34+ conditionné pendant 8 jours par des cellules TG1-cluster 302 (exprimant le cluster) ou des cellules TG1 contrôles (106 cellules/mL). Les cellules souches neurales normales (CSNN 24 et CSNN25) ont été isolées à partir d'interruption thérapeutique de grossesse. Les CSNN ont été ensemencées dans du milieu de base NeuroCult (marque déposée) avec des suppléments de prolifération et du facteur de croissance épidermique (EGF) provenant de la société StemCell (StemCell technology, Vancouver). - Constructions plasmidiques et les lignées cellulaires stables Le cluster miARN-302-367 a été amplifié à partir d'ADN génomique par réaction de polymérisation en chaine (PCR) avec les amorces : sens : GGCTGAAGTCCCTGCCTTTTACCC (SEQ ID N°2) antisens : TGGCTTAACAATCCATCACCATTGC (SEQ ID N°3) et cloné dans un vecteur commercial pENTR (Invitrogen, life technology). Les cycles de la PCR étaient les suivants : la température et le temps d'association des oligonucléotides avec leur cible étaient respectivement de 57°C et 30 secondes, la température et le temps d'élongation étaient respectivement de 72°C et l min 30 secondes. La PCR s'est déroulée pendant 30 cycles. Le clonage dans le vecteur lentiviral 2K7 blasticidine (2K7BSD) a été réalisé par recombinaison en présence de la LR clonase II. Les particules lentivirales ont été produites par transfection dans des cellules de la lignée HEK293T des constructions 2K7BSD-Cluster mir302 ou 2K7BSD-shLuc avec les vecteurs de conditionnement. Après infection lentivirale, les lignées cellulaires stables positives pour l'expression du cluster miR-302-367 (TG1-cluster302, TG6-cluster302) ou les cellules contrôles shLuc (TG6 Ctrl, TG1 Ctrl) ont été sélectionnées dans un milieu contenant la Blasticidin NBE (1 pg/mL) pendant au moins 15 jours. Plusieurs lignées cellulaires stables ont été réalisées séparément pour chaque construction à partir de différentes productions virales/infections et toutes présentent des comportements identiques. Les cellules exprimant la protéine de fluorescence rouge (RFP) de manière stable ont été obtenues après infection par les particules lentivirales 2K7BSD-RFP. - Immunofluorescence Les cellules ont été cultivées sur des lamelles de verre recouvertes de polylysine dans du milieu NBE, du MFCS ou un milieu conditionné par des cellules TG1 exprimant le cluster miR302-367 (TG1-cluster302). A des temps déterminés, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS puis fixées en méthanol pendant 5 minutes à -20°C et lavées une nouvelle fois. Le blocage et l'hybridation ont été réalisés dans du PBS contenant 10 % de FCS et 0,1 % de Triton X100 avec les anticorps primaires suivants: anti-SHH au 1/50°(N19), anti-Oct4 au 1/50°(H-134), anti-Nanog au 5 pg/mL, anti-GFAP au 1/250°, anti-Olig2 à 10 pg/mL, anti-B3tubulin au 1/100°, anti-Cyclin A (1/250°), anti-PBK (1/150°), anti-CXCR4 (1/100°), anti-NeuN (1/100°). Après une heure à température ambiante comprise de 12 à 35°C, de préférence de 22°C, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et hybridées pendant 30 minutes à température ambiante avec les anticorps espèces spécifiques couplés avec un fluorophore décrit précédemment. Dans le même temps les noyaux ont été colorés avec du Hoechst 33342 (1 pg/mL). Finalement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, de l'eau distillée et monté avec du « gel/mount ». L'immunofluorescence et les photographies en contraste de phase ont été obtenues avec un microscope Nikon eclipse. Essai clonogénique Les neurosphères ont été dissociées en pipetant doucement de haut en bas pour obtenir des cellules uniques. 10 cellules ont été ensemencées dans chacun des puits de la plaque 96 puits dans du milieu NBE/NS34+ ou dans un milieu conditionné avec des cellules TG1-cluster302. Après un mois, chaque puits a été observé et le nombre de neurosphères a été compté. Les expériences ont été répétées indépendamment trois fois. - RT-PCR Quantitative en temps réel Les ARN ont été extraits avec du Trizol (Invitrogen, Invitrogen SARL BP 96, 95613 Cergy Pontoise Cedex). Les niveaux d'expression des microARN et des ARNm ont été quantifiés par RT-PCR en temps réel en deux étapes. Les étapes de transcription inverse ont été réalisées avec une transcriptase inverse Superscript Il et le kit Taqman transcription inverse microARN pour respectivement les ARNm et les miARN, selon les instructions du fournisseur. La PCR en temps réel a été réalisée en utilisant le mélange Master Mix Taqman PCR. L'expression de chaque gène a été déterminée par rapport à l'expression du U54 qui est un petit ARN dont l'expression est relativement stable quelques soient les conditions expérimentales. Le facteur de répression ou d'induction a été calculé en utilisant la méthode AACT telle que décrite dans (Hellemans et al., 2007). - Culture organotypique des tissus neuraux embryonnaires (ENT) et les cellules souches cancéreuses. Les neurospheres dérivées de cellules souches embryonnaires, les cellules TG1 RFP-cluster ou contrôle RFP ont été ensemencées sur une membrane hydrophile de polytétrafluoroéthylène (PTFE) (6 mm de diamètre, 0,4 lm; BioCell-Interface, La Chaux-de-Fonds, Switzerland), préalablement déposée sur des inserts de plaques de cultures Millicell-CM (0,4 pm) (Millipore, Billerica, MA). Les cultures ont été nourries avec du MIN (1/1 vol DMEM/HAM-F12, 10 mM glutamine, HCO3 0,025 %, Hepes, 10 mM) pendant 3 semaines en interface air-liquide (Preynat-Seauve et al., 2009 [29]). - Culture organotypique de coupes de cerveaux de souris : Des cerveaux ont été disséqués à partir de souris nouveaux-nés, inclus en agar-agar à 4 % dissout dans un fluide Cérébrospinal artificiel (NaCl 124 mM, KCI 3 mM, NaHCO3 26mM, CaCl2 2 mM, MgSO4 1mM, KH2PO4 1,25 mM, glucose 10mM) et ensuite coupés à une épaisseur de 0,4 mm avec un vibratome. Les coupes ont été déposées sur des inserts de culture Millicell-CM (0,4 mm) et maintenues à l'interface air-liquide pendant plus de trois semaines sans nécrose. Enrobage des cellules/ cultures / tissus dans la paraffine Les cultures organotypiques (coupes de cerveaux et tissus neuraux) ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes à une température ambiante, puis lavées avec du PBS. Les échantillons disposés dans des cassettes d'inclusion ont été ensuite déshydratés comme suit: Les échantillons ont été immergés dans deux bains successifs d'éthanol à 70 % pendant 15 min puis un bain d'éthanol à 90 % pendant 15 min suivi d'un bain d'éthanol à 95 % pendant 15 min, puis trois bains d'éthanol à 100 % de 5 min chacun et enfin un bain de 5 min dans un réactif analogue au Xylène, le Roticlear. Ensuite, les échantillons ont été incubés dans un premier bain de paraffine pendant une heure à 62°C, puis dans un second bain de paraffine pendant une heure à 62°C. A l'issue de cette dernière incubation, les échantillons ont été correctement orientés dans des moules d'inclusion, immergés dans la paraffine en fusion et immédiatement transférés à une température de -20°C. Les échantillons ont ensuite été coupés au microtome à une épaisseur de 5 microm pour la réalisation d'expériences d'immuno- marquage et la prise de vues en lumière transmise et/ou en épifluorescence. - Essai de tumorigénèse Ex vivo : Environ 10 neurosphères de TG1 Ctrl, TG1 Cluster 302 ou TG6 Ctrl exprimant de manière stable une protéine fluorescente rouge (TG1 Ctrl rouge, TG1 Cluster 302 rouge ou TG6 Ctrl rouge) ont été déposées à la surface de MBS ou ENT et cultivées dans des conditions interface air- liquide pendant 3 semaines. L'infiltration et la croissance cellulaires ont été visualisées en suivant le signal de la protéine fluorescente rouge. Pour mettre en évidence l'effet paracrine du cluster miR-302-367 sur la tumorigénicité des GiCs, les cellules TG1 Ctrl ont été ensemencées à la surface du MBS sur une zone limitée par un anneau de clonage contenant du milieu NS34+ conditionné par les cellules TG1 Ctrl ou TG1 Cluster 302. Dans une deuxième série d'expériences, les cellules TG1 et TG6 contrôles ensemencées à la surface du MBS ont été nourries dans le compartiment inférieur du dispositif Air/Liquide avec du milieu NS34+ contenant des cellules TG1 contrôles ou TG1 clusters. L'infiltration et la croissance des cellules TGI/TG6 Ctrl ont été mesurées en suivant le signal de la protéine rouge fluorescente en utilisant le microscope Nikon eclipse Ti. Mesure de l'expression du cluster en fonction de la différenciation glio-neuronale induite par du sérum Les réactifs et procédés utilisés sont ceux décrits dans la partie « matériel et méthodes » ci-dessus. Pour identifier les miARN impliqués dans l'induction de la différenciation glioneurale des GICs, la technologie TLDA (Applied Biosystem) a été choisie et a permis de cribler l'expression de plus de 700 miARN humains. Pour cette analyse, les cultures primaires de TG1 et TG6, isolées à partir de tumeurs malignes glio-neuronales selon le procédé décrit dans Patru et al., 2010 [27], ont été utilisées. L'expression des miR a été mesurée sur les ARN totaux extraits des cellules TG1 non différenciées et des cellules TG1 cultivées en présence de sérum à 0,5 % pendant 3 jours pour induire leur différenciation. Parmi les miARN modulés durant cet événement, le cluster miR-302-367 composé du miR-302a, b, c, d et du miR-367 a été plus particulièrement étudié. Les résultats représentés dans la figure 1A ont montré que ces miR étaient systématiquement exprimés dans les cellules TG1 et TG6 différenciées tandis qu'ils n'étaient pas détectés dans ces cellules à l'état souche. Une analyse de l'expression endogène du cluster 302-367 en fonction du temps de différenciation des TG1 et des TG6 a montré une induction claire dès le premier jour avec un maximum d'expression au troisième jour (Figure 1 B). Ce niveau d'expression maximal est maintenu au moins 15 jours après l'addition du sérum (Figure 1B). Afin de savoir si le cluster miR-302-367 était également induit dans des cellules souches neurales adultes humaines lors d'une différenciation glio-neuronale stimulée par le sérum, son expression a été mesurée dans deux lignées primaires de cellules souches neurales normales humaines CSNN24 et CSNN25 (Figure 1C). Les profils d'expressions du cluster miR-302-367 dans les deux cultures de CSNN étaient similaires à ceux observés dans les cellules TG1 et TG6, c'est à dire une absence d'expression à l'état souche et une forte induction dès l'ajout du sérum (Figure 1A). Ces résultats démontrent que l'expression du cluster miARN n'est pas restreinte aux GiCs en cours de différentiation glio-neuronale. Les MAP kinases et la glycogène synthase kinase beta 3 (GSK3beta) ont été décrites comme impliquées dans l'induction de la différentiation dans les lignées gliales ou neuronales (Korur et al., 2009 [20]; Miloso et al., 2008 [23]). L'implication de ces kinases dans le contrôle de l'induction du cluster 302-367 a été analysée par PCR quantitative à partir d'ARN totaux extraits de TG6 différenciées en présence des composés U0126 et TWS inhibant respectivement les voies de signalisation MAPK et GSK3beta. Le blocage de ces voies de signalisation avec les inhibiteurs chimiques a compromis de manière importante l'expression du marqueur glial GFAP et du cluster miR-302-367, avec un effet plus marqué lorsque GSK3beta était inhibé (Figure 1 D). Ceci confirme la forte corrélation entre le processus de différenciation et l'expression du cluster miR-302-367. Ainsi, les résultats obtenus suggèrent la contribution du cluster miR-302-367 dans le processus de différenciation des cellules souches neurales normales et cancéreuses. Exemple 2 : Effet du cluster sur la répression de l'état souche (« stemness ») et sur l'engagement dans la voie gliale des GiCs Les réactifs et procédés utilisés sont ceux décrits dans la partie « matériel et méthodes » de l'exemple 1. Pour savoir si le cluster miR-302-367 pouvait induire ou non la différenciation de GiCs en absence de sérum, l'expression ectopique simultanée de chacun des membres du cluster miR-302-367 dans des cellules indifférenciées TG1 et TG6 a été réalisée. Pour ce faire, le cluster miR-302-367 entier a été amplifiées à partir de l'ADN génomique et cloné dans un vecteur lentiviral pour permettre son expression ectopique stable ou transitoire. Les essais de transfection transitoire dans des cellules TG1 ont montré une expression forte de chacun des membres du cluster miR-302-367 pendant au moins 6 jours (Figure 2A histogramme). Des cellules comprenant un ARN non codant ont été également produites et représentent les cellules contrôles. Pour mesurer les changements de morphologie cellulaire, les cellules TG1 ont été cultivées pendant 6 jours dans le milieu minimum décrit précédemment qui ne déclenche aucune différenciation spontanée. Tandis que les cellules transfectées avec une construction contrôle (ARN non codant) sont restées identiques à des neurosphères non adhérentes (Figure 2A photographie du haut), les cellules transfectées avec le cluster entier miR-302-367 ont montré un changement radical de comportement en devenant adhérentes et en arborant un phénotype similaire aux cellules en cours de différenciation. (Figure 2A photographie du bas). Afin de consolider ces observations, deux lignées cellulaires stables TG1 Cluster 302 et TG6 Cluster 302, qui expriment chaque membre du cluster miR-302-367 (figure 2B, histogramme) ont été observées (Figure 2B, photographie du bas). L'expression stable du cluster miR-302-367 induit l'adhésion et les changements spontanés de morphologie typique du phénotype différencié (Figure 2B photographie du bas) après 4 jours de culture dans des conditions quiescentes. Les TG1 Ctrl et TG6 Ctrl qui expriment de manière stable un ARN contrôle (ne codant pas de miARN), sont restées identiques aux neurosphères non adhérentes (Figure 2B photographie du haut). En accord avec ces changements de morphologie, l'analyse par PCR quantitative de marqueurs de la différenciation glio-neuronale et de l'état souche a révélé une induction claire des marqueurs gliaux GFAP et Olig2, tandis qu'une répression drastique du marqueur des cellules souches adultes neurales SHH a été mesurée dans les cellules TG1 Cluster 302 et TG6 Cluster 302 (Figure 2C). Pour démontrer la perte du caractère souche (« stemness ») et l'engagement glioneuronal, l'expression protéique de plusieurs marqueurs du caractère souche (« stemness ») et de la différenciation glioneuronale a été observée. Tandis que les cellules TG1 Ctrl cultivées dans un milieu défini (NS34+ contenant de l'EGF et le facteur béta de croissance des fibroblastes (bFGF)) ont montré une expression claire des marqueurs du caractère souche (« stemness ») SHH, Oct4, Nanog et Sox1 (Figure 3A), l'expression de ces protéines dans les cellules TG1 Cluster 302 a été pratiquement indétectable (Figure 3A). De manière intéressante, dès que les cellules TG1 Cluster 302 ont été privées d'EGF et bFGF (NS34-), les marqueurs GFAP et Olig2 ont été fortement induits et exprimés pendant au moins 4 jours après la déplétion (Figure 3B). Le marqueur de différenciation neuronale NeuN est resté indétectable. Ensemble, ces résultats démontrent clairement que l'expression du cluster miARN-302-367, dans un contexte favorable pour le maintien des cellules souches adultes neurales, induit la perte du caractère souche et contribue à l'engagement dans la voie gliale. Exemple 3: Effet de l'expression du cluster miR302-367 sur la prolifération et le potentiel clonogénique des GiCs TG1. Les réactifs et procédés utilisés sont ceux décrits dans la partie « matériel et méthodes » de l'exemple 1. L'expression du cluster miR-302-367 induit la perte de « stemness » des GiCs, aussi une recherche de l'altération éventuelle des propriétés clonales a été effectuée. La protéine kinase activée en mitose PBKITOPK est une protéine clef impliquée dans la promotion de la prolifération et du renouvellement des cellules progénitrices neurales. (Gurok et al., 2007 [16]). Les résultats d'analyse par puce à ADN ont montré que l'expression des ARNm de PBK était réprimée d'un facteur 2 dans les cellules TG1 Cluster 302 comparé aux cellules TG1 Ctrl (Figure 4A). De manière intéressante, la kinase PBK est également réprimée durant la différenciation induite par le sérum. Afin de confirmer cette répression au niveau protéique, des expériences d'immunofluorescence ont été réalisées sur des cellules TG1 et TG6 en croissance. Dans les cellules TG1 et TG6 Ctrl, PBK est exprimé de manière constitutive à un niveau basal dans l'ensemble de la population cellulaire et fortement stimulée dans les cellules en division (Figure 4B). Dans les cellules TG1 Cluster 302 et TG6 Cluster 302, l'expression de la protéine PBK est restée indétectable (Figure 4B). Ces résultats démontrent que le cluster miR-302-367 est capable d'altérer de manière drastique l'expression de PBK et suggère qu'il pourrait inhiber le renouvellement cellulaire. Afin de tester encore cette hypothèse, des tests de clonogénicité ont été réalisés en ensemençant 10 cellules par puit dans une plaque 96 puits. Les résultats ont montré que bien qu'au moins 95 % des cellules TG1Ctrl présentaient des propriétés clonales, seulement 35 % des TG1 Cluster 302 individuelles ont été capables de reformer des neurosphères (figure 4C). De plus, ces neurosphères étaient plus petites que les sphères formées par les cellules TG1 Ctrl, indiquant une inhibition de la prolifération (Figure 4C, photographie). Ces résultats ont été confirmés par une analyse du taux de prolifération des cellules TG1 Cluster 302 montrant un très net retard par rapport aux TG1 Ctrl (Figure 4D). Des articles récents ont montré que le cluster miR-302-367 contrôlait la progression du cycle cellulaire en réprimant la cycline D (Card et al., 2008 [7]). De manière similaire, l'expression stable du cluster miR-302-367 dans les cellules TG1 et TG6 réprime l'expression de la cycline D, de la cycline A et de E2F1 (Figure 4E). Ces résultats démontrent que l'expression stable du cluster 302 induit une profonde altération de la prolifération des cellules TG1. Afin d'étudier l'impact de l'inhibition de la prolifération clonale par le cluster sur la capacité des cellules à former une masse cellulaire tumorale ex-vivo, des cellules TG1 Ctrl et TG1 Cluster 302 exprimant une protéine rouge fluorescente ont été ensemencées dans des conditions de culture organotypique. Après un mois de culture, les cellules TG1 Ctrl avaient développé un tissu compact et épais (Figure 4F) contrairement aux cellules TG1 Cluster 302 qui n'ont pas proliférées et ont formées un feuillet monocellulaire à la surface du filtre (Figure 4F). De manière intéressante, ni les propriétés clonales (Figure 4G) ni la prolifération des cellules TG6 n'a été affectée par l'expression stable du cluster miR-302-367 bien que l'expression de PBK et des cyclines ait été réprimée. (Figure 4H). De plus, les cellules TG6 Ctrl et TG6 Cluster 302 ont développé des tissus tumoraux identiques dans des conditions de culture organotypique (Figure 41). Ces résultats indiquent que les cellules TG6, contrairement aux TG1, ont été capables de contourner les effets du cluster miR-302-367 et illustrent la singularité de chaque culture/population de GiCs en terme de réponse cellulaire. Il n'en reste pas moins essentiel de souligner que ce cluster de miR peut être un puissant suppresseur de tumeur capable de cibler les GiCs puisqu'il inhibe la capacité des TG1 à s'autorenouveler et à former une masse tumorale en condition de culture organotypique. Exemple 4 : effet du cluster miR-302-367 sur l'expression du CXCR4 et sur la capacité des GlCs d'infiltrer un tissu neural hôte. Les réactifs et procédés utilisés sont ceux décrits dans la partie « matériel et méthodes » de l'exemple 1. La surexpression du CXCR4 caractérise un fort potentiel tumorigénique et invasif des cellules cancéreuses et notamment les cellules progénitrices de gliomes (Ehtesham et al., 2008 [13]). De manière intéressante, l'analyse in silico (Miranda, pictar vert) de l'extrémité 3' UTR de l'ARNm de CXCR4 indique qu'il pourrait être une cible directe des miARN-302a, b, c, d du cluster miR-302-367. La comparaison des TG1 cluster et des TG1 Contrôle selon le procédé décrit dans l'exemple 1 a montré que l'expression de CXCR4, au niveau ARNm (Figure 5A) et protéique (Figure 5B), était réprimée de façon drastique dans les cellules TG1 Cluster 302 par rapport aux cellules TG1. Ces résultats suggèrent que le cluster miR-302-367 peut bloquer le potentiel invasif des GiCs médié par le CXCR4 in vivo. Afin d'étudier la capacité des TG1 cluster a infiltré un tissu glioneuronal sain et de former une masse tumorale, des cellules TG1 Ctrl ou TG1 Cluster 302 exprimant la protéine rouge fluorescente ont été ensemencées sur des coupes de cerveaux de souris selon le procédé décrit précédemment. Cette méthode permet de maintenir pendant un mois des coupes épaisses de cerveaux de souris sans altération du tissu. Trois semaines plus tard, les coupes de cerveaux ont été fixées et l'examen des coupes en paraffine a montré que les cellules TG1 Ctrl avaient une remarquable aptitude à infiltrer le tissu glioneuronal (coupe de cerveau) et à initier le développement d'une masse de type tumoral avec dissémination périphérique de cellules individuelles (Figure 5C, Block 1 et 2, photos du haut). En revanche, les cellules TG1 Cluster 302, incapables de pénétrer le tissu, sont restées à la surface des coupes de cerveaux (Figure 5C,, Block 1 photo du bas). Dans certaines circonstances, l'absence d'interaction entre les cellules exprimant le cluster et le tissu glioneuronal (coupe de cerveau), a conduit à la perte de cellules (Figure 5C, Block 2 photo du bas). Pour confirmer ces résultats dans un contexte organotypique humain, les inventeurs ont mis à profit une technologie récente (« Engineering Neural Tissue » (ENT)) (Preynat-Seauve et al., 2009 [29]) qui permet d'obtenir des tissus neuraux humains à partir de cellules souches embryonnaires pour modéliser les différentes étapes du développement d'une tumeur glioneuronale dans un tissu neural humain. En effet, dans ce contexte particulier, les cellules contrôles marquées en rouge, déposées à la surface du ENT l'ont infiltré et ont développé une masse de cellules tumorales capable de se disséminer dans différentes zones du tissu (Figure 5D). De façon remarquable, les cellules rouges TG1 Cluster 302 qui n'ont pas la capacité à infiltrer le tissu hôte et à développer une masse tumorale, demeurent sous la forme d'une monocouche à la surface du ENT. (Figure 5E, block 1 et 2, à droite). Ces résultats démontrent donc que l'expression constitutive du cluster miR-302-367, en inhibant leur capacité d'infiltration, compromet l'agressivité et la tumorigénicité des GiCs. Exemple 5 : Effet du milieu de culture conditionné par la culture de cellules souche cancéreuses exprimant de cluster miARN 302-367 sur les capacités à infiltrer et à proliférer dans le tissu neural. Les réactifs et procédés utilisés sont ceux décrits dans la partie « matériel et méthodes » de l'exemple 1. Afin de savoir si le cluster miR-302-367 à la propriété d'induire des effets par un mode d'action paracrine, une co-culture de cellules TG1 Cluster 302 et TG1 Ctrl rouge a été réalisée en milieu NS34-. Les conditions et les réactifs utilisés sont indiqués dans la partie « matériel et méthode » ci-dessus. En présence de TG1 exprimant le cluster, les TG1 contrôles ont été contraintes à adhérer et à adopter une morphologie typique de cellules différenciées par la présence de sérum (Figure 6A, panel du haut) alors que dans une co-culture de cellules TG1 contrôles les cellules restent en sphère non adhérentes (Figure 6A, panel du bas). Ces résultats suggèrent que le cluster stimule la sécrétion d'un élément soluble qui peut induire une différenciation cellulaire à distance. Afin de confirmer cette hypothèse, les cellules TG1 Ctrl ont été cultivées dans un milieu conditionné par les cellules TG1 Cluster 302 ou par des cellules TG1 Ctrl (contrôle). Les résultats ont clairement montré une induction de la différenciation des cellules cultivées dans le milieu conditionné par les cellules TG1 Cluster 302 (Figure 6B, en haut). Aucun effet n'a été observé en utilisant le milieu conditionné par les cellules TG1 Ctrl confirmant les résultats obtenus en co-culture (Figure 6B, en bas). Afin de caractériser ce processus de différenciation, les ARN totaux de TG1 contrôles cultivées en présence de milieu conditionné par les TG1 cluster ont été analysés en PCR quantitative. Comme attendus, une induction claire de l'expression des marqueurs gliaux GFAP et OLIG2, respectivement d'un facteur 3 et 2,5 ainsi qu'une répression drastique de l'ARNm de SHH ont été mesurées dès que les cellules TG1 ont été cultivées dans le milieu conditionné avec les cellules TG1 Cluster 302 (Figure 6C). L'extinction des marqueurs du caractère souche (« stemness ») SHH et Sox1 a été démontrée au niveau protéique en immunofluorescence (Figure 6D). De manière remarquable, le milieu conditionné par les cellules TG1 Cluster 302 induit une stimulation précoce de l'expression endogène du cluster miR-302-367 (Figure 6E). En outre, comme lors de l'expression ectopique du cluster miR-302-367, la cycline A, une des cibles identifiée par les inventeurs (Figure 4E) a été réprimée en présence de milieu conditionné par les TG1 cluster, démontrant ainsi que le cluster miARN endogène stimulé par le milieu conditionné des TG1 cluster était bien fonctionnel (Figure 6F). En conclusion, l'expression constitutive stable du cluster miR-302-367 dans les cellules TG1 permet la sécrétion de composés actifs qui induisent à distance, la sortie du caractère souche et l'engagement dans la voie gliale. En outre, le milieu conditionné déclenche une boucle de régulation positive capable d'induire l'expression du cluster endogène miR-302-367. Afin d'approfondir les connaissances sur les propriétés du milieu conditionné par l'invention (TG1 cluster), ces effets ont été évalués sur la prolifération clonale des GiCs. Le milieu conditionné cluster 302 induit une perte de plus de 95 % des capacités de prolifération clonale des cellules TG1 (Figure 7A). Des expériences identiques ont été réalisées sur des TG6 et des TG6 cluster Les résultats ont montré une inhibition drastique de la prolifération clonale des TG6 (Figure 7C) mais également de celle des TG6 Cluster 302 (Figure 7D), malgré leur aptitude à contourner les propriétés antiprolifératives et anticlonogéniques médiés par l'expression exogène du cluster miR-302-367 telle que montré dans les Figures 4 F, G et I. Par ailleurs, l'incubation des cellules TG6 dans le milieu conditionné par les cellules TG1 cluster 302 a induit un changement de morphologie typique de cellules différenciées démontrant ainsi la sortie de l'état souche (Figure 7B). Ces résultats démontrent donc clairement que le milieu conditionné par les cellules TG1 exprimant le cluster de miARN 302-367, agissant via un signal extracellulaire, est capable de cibler plusieurs populations de cellules isolées de tumeurs différentes et même des GiCs résistantes comme les TG6. A la lumière des propriétés du milieu conditionné à induire la sortie de l'état souche, à induire la différenciation et la répression des propriétés clonales des GiCs, l'étude de l'effet de ce milieu sur l'inhibition de l'invasion et du développement des tumeurs dans le cerveau a été réalisée. Pour ce faire, les cultures organotypiques de coupes de cerveaux de souris ont été utilisées et les cellules rouges TG1 Ctrl ont été 1 o ensemencées avec un anneau de clonage placé à la surface du tissu neural hôte dans un milieu conditionné avec les cellules TG1 Ctrl ou dans un milieu conditionné avec les cellules TG1 cluster 302 (Figure 7E). Trois semaines plus tard, l'infiltration et le développement d'une masse cellulaire a été visualisée grâce à la protéine fluorescente en rouge. Les cellules 15 TG1 Ctrl ensemencées dans un milieu conditionné par les cellules TG1 Ctrl ont infiltré le tissu neural hôte et y ont proliféré (Figure 7E). Cependant elles n'ont pas été capables de le faire au contact d'un milieu conditionné par les cellules TG1 Cluster 302 et sont restées à la surface des coupes de cerveaux ou ont disparu (Figure 7E). Afin d'approfondir la connaissance 20 des propriétés du milieu conditionné TG1 Cluster 302 et son mode d'action, des cellules TG1 cluster 302 ou TG1 Ctrl (contrôle) ont été ensemencées dans le compartiment inférieur du dispositif air/liquide pour conditionner le milieu en contact avec la base de la coupe de cerveau de souris. (Figure 7F). Les cellules rouges TG1 et TG6 contrôles ont été 25 ensemencées à la surface de la coupe sans contact direct avec le milieu du compartiment inférieur. L'examen des coupes en paraffine réalisées après 3 semaines de culture dans ces conditions a montré que les cellules rouges TG1 et TG6 contrôles ont normalement infiltré la coupe de cerveau en contact avec le milieu conditionné par les TG1 contrôle pour former une 30 masse tumorale alors qu'aucune infiltration n'a pu être détectée sur les coupes en contact avec le milieu conditionné par les cellules TG1 cluster. (Figure 7F, image de droite). Ces résultats confirment que le milieu de culture conditionné par des cellules exprimant le cluster miR-302-367 permet de bloquer efficacement l'infiltration des GiCs dans les tissus neurGnaux et que le principe actif est capable soit de diffuser au travers de la coupe de cerveau soit d'induire la transduction de son signal par le tissu lui même. Exemple 6: Recherche des molécules sécrétés par les cellules souches cancéreuses exprimant de cluster miARN 302-367. Les réactifs et procédés utilisés sont ceux décrits dans la partie « matériel et méthodes » de l'exemple 1. Les chimiokines sont des médiateurs solubles qui jouent un rôle fondamental dans la régulation du micro-environnement tumoral (Chemokines and the microenvironment in neuroectodermal tumor-host interaction ; Rajasekharan Somasundarama and Dorothee Herlyn Seminars in Cancer Biology Volume 19, Issue 2, April 2009, Pages 92-96). Afin d'identifier les molécules sécrétées par les TG1CL, une première approche a consisté à doser l'expression des ARNm de certaines chimiokines en PCR quantitative dans les TG1 et TG6 exprimant 2 0 stablement le cluster et dans des cellules contrôles. Le nombre de cellules en culture étaient de 1 million. Le milieu de culture était NS34+. Le protocole d'extraction des ARNm étaient identique à celui indiqué dans l'exemple 1 précité. Les amorces et conditions de réalisation de PCR étaient 25 identiques à celles de l'exemple 1. La figure 8 représente la stimulation de l'expression des chimiokines cxcl2, cxcl3 et cxcl8 (ordonnée) en fonction des cellules (abscisse) et calculé selon le rapport TG6CL/TG6 contrôle et TG1CL/TG1 contrôle respectivement. Les résultats obtenus ont montré que l'expression 30 stable du cluster de miR induit l'augmentation de l'expression des chimiokines cxcl2, cxcl3 et cxcl8 dans les TG1 CL (Figure 8). De façon remarquable, ces variations d'expression n'ont pas été détectées dans les TG6CL, résistantes aux effets du cluster i.e. inhibition de la prolifération clonale, inhibition du potentiel tumorigénique ex vivo, et, de plus, incapables de conditionner un milieu culture restituant les effets du cluster, contrairement aux TG1CL. Ces résultats mettent en évidence des candidats potentiels à la médiation des effets du cluster et sont une première étape dans l'identification des composés actifs contenus dans l'extrait. Il est probable compte tenu du poids moléculaire de la fraction active obtenu par le procédé de l'invention que ces chimiokines, si elles participent aux propriétés de l'extrait, sont actives sous la forme d'un ou plusieurs complexes de haut poids moléculaire. Les résultats obtenus démontrent donc une nouvelle fonction importante du cluster miARN302-367 dans le contrôle de l'état des GiCs. Alors qu'ils ne sont pas détectés dans les GiCs et les cellules souches neurales humaines normales en autorenouvellement, ces miARN sont rapidement et fortement stimulés lors d'une différenciation induite par du sérum. L'expression stable du cluster miR-302-367 dans les GiCs est suffisante pour mimer une partie de la réponse induite par le sérum et ainsi réprimer le caractère souche en inhibant les protéines Sox1 et Shh impliquées dans le maintien et l'autorenouvellement des cellules neurales adultes (Alcock and Sottile, 2009 [1]; Clement et al., 2007 [9]; Palma et al., 2005 [25]; Wegner and Stolt, 2005 [40]) ainsi que les marqueurs de pluripotence Oct4 et Nanog (Boyer et al., 2005 [6]; Medvedev et al., 2008 [22]). En outre, l'expression stable du cluster miR-302-367 dans des conditions de quiescence induit une adhésion cellulaire et un changement morphologique typique des cellules différenciées ainsi que l'induction de marqueurs de la différenciation gliale tels que GFAP et Olig2. L'expression artificielle du cluster mir302-367 dans des cellules cancéreuses humaines de la peau conduit à leur reprogrammation en cellules épithéliales souches présentant un profil d'expression génique très proche (plus de 86 % de similitude) de celui de cellules souches embryonnaires (Lin et al., 2008 [21]). Dans ce contexte particulier, le promoteur du cluster miARN 302-367 est régulé au niveau transcriptionnel par les facteurs Oct4, Sox2 et Nanog requis pour la pluripotence, restreignant ainsi son expression au compartiment des cellules souches embryonnaires ESC pendant les étapes de développement précoce de la souris. (Barroso-delJesus et al., 2008 [5]; Card et al., 2008 [7]). Cette régulation spécifique contraste avec celle des GiCs dans lesquelles l'expression du cluster miR-302-367 est concomitante à la répression de Oct4, Sox2 et Nanog et qu'elle reste indétectable en présence de ces facteurs de transcription. Le milieu conditionné par les cellules TG1 cluster 302, c'est-à-dire obtenu par le procédé de l'invention, permet également de réprimer de manière efficace l'autorenouvellement de cellules initiatrice de gliomes ou GiCs, ainsi que celles résistantes aux effets endogènes du cluster comme les TG6. En outre, en agissant via le compartiment extracellulaire, l'invention permet de contourner les mécanismes moléculaires mis en place par les TG6 pour maintenir leurs propriétés d'autorenouvellement. La présente invention permet donc de contourner les mécanismes de résistance d'autres cellules souches cancéreuses en ciblant l'activité suppresseur de tumeur stimulée par l'invention. La présente invention, l'extrait de la présente invention et le procédé de la présente invention permettent, en outre, de traiter des cancers contenant des cellules « résistantes » et/ou contenant des cellules souches cancéreuses. La présente invention, l'extrait de la présente invention, le procédé de la présente invention et le mode de délivrance de la présente invention permet, avantageusement, de supprimer les mécanismes de résistance de cellules cancéreuses et donc de traiter le cancer. Exemple 7 : Procédé de production d'un extrait à partir d'un milieu de culture des cellules souches cancéreuses exprimant un cluster de miARN 302-367 Dans cet exemple, les cellules souches cancéreuses utilisées sont les cellules souches TG1 décrites précédemment. Le vecteur viral utilisé est le 2K7BSD. La séquence codant le miARN 302-367 est la séquence suivante : 5'GGCTGAAGTCCCTGCCTTTTACCCTTCTGGAGGAGAACACGAATCT TTGGGAACTAGTTCAGGAAGGTAAAAAAATTTTTTTCTTCTAAAGTTAT GCCATTTTGTTTTCTTTCTCCTCAGCTCTAAATACTCTGAAGTCCAAAG AAGTTGTATGTTGGGTGGGCTCCCTTCAACTTTAACATGGAAGTGCTT TCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAGGAGTGAATCC AATTTACTTCTCCAAAATAGAACACGCTAACCTCATTTGAAGGGATCC CCTTTGCTTTAACATGGGGGTACCTGCTGTGTGAAACAAAAGTAAGTG CTTCCATGTTTCAGTGGAGGTGTCTCCAAGCCAGCACACCTTTTGTTA CAAAATTTTTTTGTTATTGTGTTTTAAGGTTACTAAGCTTGTTACAGGTT AAAGGATTCTAACTTTTTCCAAGACTGGGCTCCCCACCACTTAAACGT GGATGTACTTGCTTTGAAACTAAAGAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTGG TGATGGTAAGTCTTCCTTTTACATTTTTATTATTTTTTTAGAAAATAACT TTATTGTATTGACCG CAGCTCATATATTTAAG CTTTATTTTGTATTTTTA CATCTGTTAAGGGGCCCCCTCTACTTTAACATGGAGGCACTTGCTGTG ACATGACAAAAATAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGTGGTGGTTCCTACC TAATCAGCAATTGCGTTAACGCCCACACTGTGTGCAGTTCTTGGCTAC AGGCCATTACTGTTGCTAATATGCAACTCTGTTGAATATAAATTGGAAT TGCACTTTAGCAATGGTGATGGATTGTTAAGCCA3'(SEQ ID NO 1) Le vecteur viral a été modifié afin de comprendre la séquence codant le cluster miARN selon le protocole : La séquence du cluster mir 302/367 a été amplifiée dans l'ADN génomique par une réaction PCR (30 cycles, température et temps d'association des oligonucléotides sur leur cible 57°C 30 secondes ; température et temps d'élongation 72°C pendant 1 minute et 30 seconde) utilisant les oligonucléotides identifiés séquence n°2 et séquence n°3 et une taq polymérise (invitrogen) dans les conditions d'utilisation recommandées par le fournisseur. L'amplicon correspondant à l'ADN codant le cluster de mir302/367 a ensuite été introduit dans le vecteur pENTR/D-Topo (invitrogen) suivant les instructions du fournisseur. Le vecteur obtenu désigné pENTR-clustermir302/367 a ensuite été recombiné avec le vecteur viral 2K7BSD et un vecteur pENTR-CMV en présence de LR clonase II (invitrogen) conformément aux instructions fournies pas le manuel d'utilisation de manière à obtenir le vecteur lentiviral 2K7-CMV-Cluster302/367-SV40-BSD. Ce vecteur a ensuite été transfecté dans des cellules HEK293 de façon à produire des particules virales selon le protocole décrit par Suter DM, Cartier L, Bettiol E, Tirefort D, Jaconi ME, Dubois-Dauphin M, Krause KH. Stem Cells. 2006 Mar;24(3):615-23. Epub 2005 Nov 17. Les cellules TG1 ont ensuite été transformées avec le surnageant viral de manière à obtenir la lignée TG1 CL selon le protocole suivant : 0,2 x 106 cellules TG1 ont été incubées dans du NS34+ en présence de 100 pL de surnageant viral pendant 48h puis cultivées pendant 15 jours dans du NS34+ en présence de blasticidine à la concentration de 5 dag/mL de manière à obtenir la lignée TGICL exprimant stablement le Cluster 302/367. Les cellules TG1 CL ont été mises en culture pendant 7 jours dans un milieu NS34 à une température de 37°C et à une concentration de 106 cellules/mL de manière à obtenir le surnageant conditionné correspondant à l'invention. Ce milieu conditionné a été récupéré par centrifugation à 800rpm pendant 5 minutes puis filtré sur un filtre de 0,22 pm. L'extrait de l'invention correspondant à un extrait du milieu conditionné par les cellules TG1 CL a été obtenu par une ultrafiltration par centrifugation selon le protocole suivant : 15 mL de milieu conditionné ont été introduits dans un centricon AM30 et centrifugés à 4000 rpm pendant 20 minutes. L'extrait du milieu conditionné contenu dans le compartiment supérieur du centricon a été ensuite lavé 2 fois par ajout de 14 mL d'H2O distillée et centrifugation. Exemple 8 : Production d'un milieu conditionné par le cluster miR-302-367 et purification d'une fraction active de 30kd. 8 millions de cellules TG1 cluster 302 sont cultivés dans 10 ml de milieu NS34+ dans une flasque de 75 cm2 (T75) pendant 8 jours. La suspension cellulaire est collectée et centrifugée à 1200 rotation par minute pendant 5 minutes. Le surnageant de culture (10 ml) est par la suite filtré sur un filtre d'une porosité de 0,45 pm puis chargé sur une colonne millipore 30KDa (ref: UFC903024) et centrifugé à 4000 g pendant 15 minutes à 4°C. Le filtrat est ensuite jeté et le retentât est dilué dans 15 ml d'H2O. La colonne est centrifugée à 4000 g pendant 15 minutes à 4 °C. Ces deux étapes sont répétées trois fois. Le retentât, environ 150 pl, est finalement collecté dans un tube ependorff (Marque déposée). Pour valider l'effet biologique, la fraction de 30 KDa est testée à une dilution au 1/50 sur des cellules TG1 ctrl cultivées dans le milieu NS34+ à raison de 1000 cellules par puits dans une plaque 96 puits contenant 100 pl de milieu. 24 heures plus tard, le changement de morphologie caractéristique d'une différenciation glioneuronale est observé et comparé à la morphologie des mêmes cellules traitées dans les mêmes conditions avec une fraction de 30KDa issue d'un milieu conditionné contrôle inactif (Figure 6B). Des effets similaires sont obtenus lorsque la fraction est utilisée sur d'autres cultures primaires de cellules souches cancéreuses de gliomes à savoir les cellules TG6 et GB1. L'inhibition des marqueurs souches SHH et Sox1 (Figure 6D) confirme l'activité de la fraction. Exemple 9 : Utilisation de CSC modifiées, exprimant le cluster miR 302-367, pour des essais de thérapie cellulaire visant à bloquer le développement tumoral Les résultats obtenus par les inventeurs sur leurs modèles organotypiques de développement tumoral démontrent que le mélange d'une CSC stablement modifiée pour exprimer le cluster miR 302-367 avec 10 CSCs contrôles est suffisant pour bloquer l'infiltration et la prolifération de ces cellules. Dans ce contexte, les résultats obtenus montrent que la fraction active sécrétée par les cellules transformées exprimant le cluster miR 302-367 diffuse dans le tissu neural hôte ouvrant de ce fait, de sérieuses perspectives en thérapie cellulaire. Pour valider cette approche in vivo une xénotransplantation, dans le cerveau de souris immunodéprimées, de mélanges de CSCs modifiées exprimant le cluster miR 302-367 et de CSCs contrôles est réalisée. a) A partir de CSCs contrôles, des CSCs exprimant stablement un gène rapporteur luciférase sous contrôle d'un promoteur ubiquiste sont générées. Le procédé utilisé est précité dans le présent document. Les cellules ainsi transformées peuvent être tracées et correspondent aux cellules contrôles après la xénotransplantation. Elles permettent de visualiser l'initiation et le développement tumoral dans le cerveau de l'animal vivant. b) Afin de déterminer un seuil d'efficacité en terme de nombre minimal de CSCs exprimant le cluster à co-transplanter avec les CSCs contrôles marquées, les partitions suivantes sont testées : - CSCs contrôles seules - 1 CSC cluster pour 5 CSCs contrôles - 1 CSC cluster pour 10 CSCs contrôles - 1 CSC cluster pour 50 CSCs contrôles - 1 CSC cluster pour 100 CSCs contrôles - 1 CSC cluster pour 1000 CSCs contrôles - 1 CSC cluster pour 10000 CSCs contrôles Ces différentes conditions sont préalablement testées dans les modèles organotypiques de développement tumoral humain et murin. Les trois meilleurs ratios sont sélectionnés pour les xénotransplantations dans le cerveau des souris immunodéprimmées. Pour être statistiquement relevant, 10 animaux sont utilisés par condition. Les xénotransplantations sont effectuées dans l'animalerie A2 du C3M, au moyen d'un cadre stéréotaxique à injecteur motorisé piloté par ordinateur. c) Par ailleurs une autre méthodologie pour renseigner sur la capacité des CSCs modifiées stablement pour exprimer le cluster à faire régresser une tumeur déjà existante au sein d'un tissu est développé. La xénotransplantation de CSCs contrôles exprimant stablement le gène rapporteur luciférase est réalisée. L'initiation et le développement des tumeurs sont visualisés sur l'animal vivant par imagerie du petit animal en suivant un traceur fluorescent ou luminescent. Lorsque la tumeur a atteint un stade de développement satisfaisant, les CSCs modifiées exprimant stablement le cluster sont injectées précisément dans la tumeur et la zone péri lésionnelle probablement infiltrée. Les quantités de cellules injectées sont déterminées en fonction de la taille de la tumeur, une approximation entre taille de la tumeur et nombre de cellules peut être établie sur la base du signal luciférase, et ajustée de manière à restituer les ratio CSC cluster/CSC contrôle optimaux déterminés ex vivo (b). Les techniques d'imagerie du petit animal (plateau technique C3M) permettent de suivre le devenir de la tumeur au cours du temps sans sacrifier l'animal. Ces expériences révèlent des données essentielles sur la capacité du cluster de miR à bloquer l'initiation et à faire régresser les tumeurs in vivo. Ces résultats permettent de valider in vivo notre stratégie de thérapie cellulaire pour le traitement des gliomes malins en ouvrant des applications à la clinique. Deux modes d'administration peuvent alors être testés : le premier consiste à réaliser une greffe de cellules modifiées exprimant le cluster. L'autogreffe est privilégiée lorsque la progression de la maladie est compatible avec le délai d'obtention de CSC du patient modifiées pour exprimer le cluster. La xénogreffe est couplée à un léger traitement immunosuppresseur. Le deuxième peut mettre en oeuvre une technique d'encapsulation des CSCs modifiées à l'intérieur d'une structure « type sachet de thé », emprisonnant les cellules mais laissant diffuser le principe actif sécrété. Dans tous les cas les CSCs modifiées exprimant stablement le cluster sont aussi modifiées pour exprimer un gène suicide (Timidine Kinase par exemple) qui permet d'éradiquer ces cellules en fin de traitement. Listes des références 1. Alcock, J., and Sottile, V. (2009). Dynamic distribution and stem cell characteristics of Soxl-expressing cells in the cerebellar cortex. Cell Res 19, 1324-1333. 2. Ambros, V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355. 3. Bao, S., Wu, Q., McLendon, R. E., Hao, Y., Shi, Q., Hjelmeland, A. 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Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les cellules souches cancéreuses sont cellules souches cancéreuses de gliomes. 5. Extrait d'un milieu de culture de cellules exprimant un cluster miARN 302-367 obtenu selon le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 4. 25 6. Extrait selon la revendication 5 dans lequel l'extrait comprend une fraction active dont le poids moléculaire est compris de 3 à 500 kDA. 7. Extrait selon la revendication 5 ou 6 pour son utilisation comme médicament. 30 8. Extrait selon la revendication 5 ou 6 pour son utilisation comme médicament pour le traitement d'un cancer. 15 20 CONFIDENTIEL 9. Extrait selon la revendication 5 ou 6 pour son utilisation comme médicament pour le traitement d'un gliome malin. 10. Cellules souches cancéreuses exprimant le cluster miR-302-367 et ses 5 dérivés CONFIDENTIEL