Brevet FR2963234A1 — publié le 20120203

-1- La présente invention se situe dans le domaine des compositions cosmétique et pharmaceutique appliquées aux cheveux. La présente invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant au moins un extrait peptidique de fèves, pour limiter la chute des cheveux et/ou stimuler la croissance des cheveux, ainsi que plusieurs procédés de traitement cosmétiques non thérapeutiques utilisant ladite composition. Les cheveux sont des annexes kératiniques au même titre que les poils, les cils, les sourcils ou encore les ongles. Ils ont un rôle physiologique de protection du cuir chevelu, mais surtout un rôle social et ce depuis longtemps dans l'histoire de l'homme. Les cheveux peuvent être de différentes natures, longs, courts, raides, bouclés...mais ils obéissent tous à la loi du cycle. En effet, les 100 000 à 150 000 follicules pileux qui forment une chevelure « normale » se renouvellent tous de façon cyclique, asynchrone et stochastique à partir d'un réservoir de cellules souches adultes folliculaires. Aussi bien chez les hommes que chez les femmes, on constate qu'il est normal de perdre de 100 à 150 cheveux par jour. Les cheveux tombent et se renouvellent d'eux même. Mais lorsque la chute dépasse largement les 150 cheveux, ou lorsque le renouvellement par un autre follicule est défaillant (cheveux très fins, ou raréfiés), on parle alors de chute de cheveux, encore appelée alopécie. Par alopécie, on entend la chute des cheveux ou des poils de manière totale ou partielle, définitive ou transitoire, due notamment à l'âge, à des facteurs génétiques ou faisant suite à une affection locale ou générale... On distingue différents types d'alopécie en fonction de l'origine du trouble : - l'alopécie liée à l'âge, à la vieillesse ; - l'alopécie androgénique (souvent héréditaire) est la plus fréquente : elle se manifeste 25 par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes (mais elle atteint également les femmes) ; - l'alopécie aiguë : elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, une irradiation aiguë ; 30 - l'alopécie localisée : elle peut être provoquée par des problèmes de peau (tumeur, brûlure, pelade), une radiothérapie ou des parasites (teigne, lichen) ; - l'alopécie congénitale ; 2963234 -2- - l'alopécie Areata qui semble être d'origine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits. Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête, on parle d'alopécie Totalis et, parfois l'ensemble du corps on parle alors d'alopécie Universalis (dans ce cas il 5 n'y a plus aucun poils ni cheveux sur l'ensemble du corps). Différents traitements cosmétiques et/ou médicamenteux ont été développés ces dernières années afin de traiter au mieux les différents types d' alopécies. Par exemple, de nombreux traitements ont été développés afin de traiter l'alopécie androgénique, étant 10 donné que c'est un type d'alopécie qui touche beaucoup de monde, les hommes en particulier. L'origine de ce type d'alopécie est due à une trop grande sensibilité aux hormones masculines ou androgènes, elle-même due à l'hérédité. Sous l'influence d'une enzyme, la 5-alpha-réductase, la testostérone se transforme en dihydrotestostérone ou DHT qui va stimuler les glandes sébacées. Il se créera ainsi une séborrhée permanente qui 15 va entraîner l'obstruction progressive du follicule pileux et l'asphyxie du bulbe, ayant pour conséquence l'arrêt brutal de la phase anagène. Mais la majeure partie des alopécies est plutôt liée à l'âge et ne relève pas forcément de ce type de traitement, par ailleurs, non sans effets secondaires. De plus, une composante non négligeable dans l'alopécie androgénique est elle-même due à l'âge. 20 C'est pourquoi une autre piste a été explorée, celle du cycle de croissance du cheveu. En effet, le follicule pileux est une annexe cutanée autonome avec son propre contrôle hormonal, son propre cycle, une structure complexe et stable (Bernard B. A. ; Médecine/Sciences 2006 ; 22 : 138-43). Le cycle du cheveu se décortique en 3 phases : les phases anagène, catagène et télogène. La phase anagène, ou phase de croissance du cheveu, dure entre 3 et 7 ans (variable selon l'âge, le sexe et la zone du cuir chevelu). Cette phase est suivie par une phase de repos appelée catagène et dure environ 3 semaines. Alors que des processus d'apoptose ont lieu durant cette phase catagène, entrainant ainsi la chute du cheveu, la phase suivante appelée télogène va permettre à un nouveau bulbe de se former à partir d'un germe pileux qui va initier le cycle suivant (Arouete J., J. Med. Esth. Et Chir. Derm., Sept. 2005, 119, 165-167). Cette phase télogène durera, quant à elle, environ 3 mois. C'est ainsi que, sur une chevelure « normale », environ 85 % des follicules sont en phase de croissance, 2 % en phase de repos, et un peu plus de 10 % en phase de chute. 2963234 -3- Il a été démontré récemment, que les gènes régulateurs du cycle circadien, notamment le gène CLOCK, montraient une expression corrélée à celle du cycle de croissance du cheveu, avec particulièrement, une augmentation d'expression lors de la transition entre la phase télogène et la phase anagène (M. Geyfman et al. Aging, Vol.2, N° 2, 2009). 5 L'horloge circadienne est contrôlée par une boucle négative de régulation impliquant un ensemble de gènes, notamment les gènes PER-1 (Period), CLOCK (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput) et BMAL1 (Brain and Muscle ARNt-like Protein). Il a été montré que les gènes circadiens qui sont surexprimés lors du passage entre la phase télogène et le début de la phase anagène, sont tous les gènes cibles du duo CLOCK/BMAL1, incluant 10 ainsi les gènes PERs, Dbd et Rev-Erba. Aussi, la Demanderesse a mis en évidence les propriétés en tant qu'agent antichute d'un extrait particulier de fèves, particulier en ce que l'extrait de fèves est un extrait peptidique. Jusqu'à présent des extraits de fèves étaient intégrés dans des compositions 15 cosmétiques destinées au traitement de la peau (brevet FR 2925331). D'autres types d'extraits de fèves ont été intégrés dans des compositions destinées au traitement de cicatrices dues à des affections virales (brevet US6509042). Le brevet japonais JP6100423 décrit quant à lui une composition comprenant un extrait de fèves et de minoxidil pour prévenir le blanchiment des cheveux. Cependant, jusqu'à aujourd'hui, 20 aucun document ne décrit l'utilisation d'un extrait peptidique de fèves pour limiter la chute des cheveux et stimuler leur pousse. Ainsi, le premier objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une composition comprenant au moins un extrait peptidique de fèves en tant qu' agent actif 25 pour limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance. Le second objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une composition comprenant au moins ledit extrait en tant qu' agent actif pour moduler les gènes Clock, Per1 et Bmall dans les cellules de la papille dermique. Un troisième objet de la présente invention est l'utilisation dudit extrait pour la 30 fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance dans les cas de chute de cheveux résultant d'un état pathologique. 2963234 -4- D'autres objets de la présente invention se rapportent à des procédés de traitement cosmétiques non-thérapeutiques destinés à limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance, resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la papille dermique, et enfin renforcer le follicule pileux et le protéger des agressions extérieures. Les fibres kératiniques humaines auxquelles s'applique l'invention sont notamment les cheveux, les sourcils, les cils, les poils de barbe, de moustache, les poils pubiens et les ongles. Plus spécialement, l'invention s'applique aux cheveux et/ou aux cils humains. 10 La présente invention concerne donc l'utilisation d'une composition comprenant au moins un extrait peptidique de fèves en tant qu'agent actif pour limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance. On entend par « extrait peptidique », un hydrolysat comprenant un mélange de composés majoritairement représentés par des peptides ou des oligopeptides. Selon 15 l'invention, on utilisera indifféremment les termes « hydrolysat peptidique », « extrait », « extrait solubilisé » ou « agent actif ». On entend par « agent actif capable de limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance » tout extrait peptidique de fèves, capable de stimuler le follicule du cheveu, de stimuler la prolifération au niveau des cellules de la papille dermique, de stimuler 20 l'expression de marqueurs de prolifération comme Ki67, ainsi que l'expression de protéines telles que les kératines K14 et K15. L'extrait selon l'invention peut être utilisé pour stimuler la croissance des cheveux dans les cas d'alopécie liée à l'âge due à des dysfonctionnements du cycle de croissance du cheveu. En effet, le lien entre les dysfonctionnements du cycle circadien, et 25 notamment une déficience en Bmall, a été prouvé il y a quelques années (Kondratov et al., Genes Dev., Jul. 2006, 15 ;20(14) :1868-73). Il a aussi été démontré que l'expression du gène Clock diminuait avec l'âge dans les cellules de la papille dermique. Or, ce sont ces cellules qui détiennent le potentiel prolifératif dans le follicule pileux. Ainsi, l'extrait de fèves selon l'invention permet de stimuler l'expression de la protéine Ki67 et des 30 kératines K15 et K14 pour renforcer le follicule pileux. L'extrait a démontré son action sur les différents marqueurs cités ci-dessus (cf exemples). En effet, on assiste à une hausse de l'expression de ces marqueurs lorsqu'une composition comprenant au moins ledit extrait est appliquée sur les cellules de la papille dermique de follicules en culture. 5 2963234 -5- La conséquence de ces surexpressions se traduit en une limitation de la chute des cheveux, un renforcement des cheveux, et par la suite une stimulation de la pousse de ceux-ci. 5 Un second objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un extrait peptidique de fèves selon l'invention, en tant qu'agent actif capable de moduler les gènes Clock, Per1 et Bmal l dans les cellules papilles dermiques. Par « moduler les gènes Clock, Perl et Bmall », on entend capable augmenter ou diminuer leur activité, soit par augmentation ou baisse de leur synthèse protéique (par modulation directe ou indirecte de 10 l'expression génique) soit par d'autres processus biologiques tels que la (dé)stabilisation de ces protéines ou encore la (dé)stabilisation des transcrits d'ARN messager. Ainsi, l'extrait peptidique de feves permet de restaurer le rythme circadien et de resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la papille dermique. 15 Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, l'extrait est un hydrolysat peptidique provenant de l'hydrolyse des protéines de feves Vicia faba L.. L'hydrolysat peptidique est constitué par un mélange de composés majoritairement représentés par des peptides. Le terme « peptide » désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques ou par des liaisons peptidiques 20 modifiées ; le terme « polypeptide » désignant un peptide de taille plus importante. L'utilisation d'hydrolysats peptidiques, et en particulier d'hydrolysats peptidiques de bas poids moléculaires, présente de nombreux avantages en cosmétique. Outre le fait de générer des composés de nature peptidique qui ne préexistaient pas dans le mélange protéique de départ, l'hydrolyse et la purification permettent d'obtenir des mélanges plus 25 stables, plus facilement standardisables et ne provoquant pas de réactions allergiques en dermato-cosmétique. Protocole d'extraction Le principe actif selon l'invention peut être obtenu par extraction de protéines 30 d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des fragments peptidiques biologiquement actifs. De très nombreuses protéines trouvées dans les plantes sont susceptibles de contenir des fragments peptidiques biologiquement actifs au sein de leur structure. L'hydrolyse 2963234 -6- ménagée permet de dégager ces fragments peptidiques. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les fragments peptidiques ensuite. Il est également possible d'utiliser certains extraits 5 hydrolysés sans en purifier les fragments peptidiques correspondant aux peptides biologiquement actifs selon l'invention, mais en s'assurant toutefois de la présence desdits fragments par des moyens analytiques appropriés. Pour réaliser l'extraction, on peut utiliser la plante entière, ou une partie spécifique de la plante (feuille, grain, etc.) 10 Plus particulièrement selon l'invention on utilise des graines de plante de la famille des Fabacées (légumineuses), de l'espèce Vicia faba L., ou fève. Le terme « fève » désigne aussi la graine qui, consommée à l'état frais ou sec, est l'un des légumes les plus anciennement cultivés. Préférentiellement, le principe actif selon l'invention est un hydrolysat peptidique et 15 provient de l'hydrolyse des protéines des graines de fèves (Vicia faba L.). Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'hydrolysat selon l'invention. Dans une première étape, la plante est broyée à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être "délipidée" à l'aide d'un solvant organique 20 classique (comme par exemple un alcool, l'hexane ou de l'acétone). On réalise ensuite l'extraction des protéines de la plante suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié ; le broyat de plante est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0.01 -20 %) ; en effet il a été observé que les opérations d'hydrolyses et de 25 purifications ultérieures étaient facilitées par ce moyen. En particulier, la concentration en substances de type phénoliques, interagissant avec les protéines, se trouve nettement réduite. La fraction soluble, contenant les protéines et les glucides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. Cette solution brute est ensuite hydrolysée dans 30 des conditions ménagées pour générer des peptides solubles. Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, 2963234 -7- etc.). Cette forme brute d'hydrolysat constitue une première forme du principe actif selon l'invention. Pour les mêmes raisons que précédemment, c'est-à-dire l'élimination des substances polyphénoliques, une quantité de PVPP est additionnée au milieu réactionnel lors de cette 5 étape d'hydrolyse ménagée. Après l'étape de filtration, qui permet d'éliminer les enzymes, le filtrat (solution) obtenu constitue une première forme de l'agent actif selon l'invention. On procède alors à une phase de dilution. Ainsi, l'extrait est solubilisé dans un ou plusieurs solvants physiologiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le 10 propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, ou tout mélange de ces solvants. Cette étape de dilution est suivie d'une stérilisation afin d'obtenir un extrait peptidique caractérisé par une teneur en composés de nature peptidique de 1 à 4 g/1. L'hydrolysat obtenu à ce stade peut être encore purifié par ultrafiltration afin de 15 sélectionner les fractions de bas poids moléculaires, préférentiellement inférieures à 6 kDa. Ainsi, au moins 70 % des composés de nature peptidique présents dans l'extrait sont des peptides de taille inférieure à 6 kDa, et préférentiellement au moins 85%. La purification s'effectue avantageusement par des étapes d'ultrafiltrations successives à travers des filtres de porosité décroissante ou par une méthode de type 20 chromatographique. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait peptidique a un pH compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 4 et 5, un extrait sec titrant entre 2 et 5 g/1 et de manière préférée entre 3 et 4 g/1, sa teneur en composés de nature peptidique 25 est comprise entre 1 et 4 g/1, et préférentiellement entre 1,5 et 3,5 g/l, et sa teneur en sucres est de 0,5 à 1 g/1. Selon un second mode de réalisation de l'invention, l'extrait solubilisé peut être encapsulé ou mis dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes 30 ou toute autre microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique, ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement acceptable. 2963234 -8- Ainsi l'extrait solubilisé est utilisé dans les compositions selon l'invention à une concentration comprise entre 0,001 % à 5 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 % et 1 % environ par rapport au poids total de la composition finale. 5 Préférentiellement, la composition selon l'invention se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique. La composition utilisable selon l'invention peut en particulier consister en une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, un après-shampooing, 10 une lotion de mise en plis, une lotion traitante pré- ou post- traitement agressif pour les cheveux, une crème ou un gel coiffant, une lotion restructurante pour les cheveux, un masque, de mousse traitante etc. La composition pourra notamment être sous forme de crème, émulsion huile-danseau, eau-dans-huile, ou émulsions multiples de type huile-dans-eau-dans-huile ou eau- 15 dans-huile-dans-eau, suspension, gel aqueux, solutions aqueuses, hydroalcooliques, ou huileuses. La composition peut être plus ou moins fluide et se présenter sous la forme d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une mousse, d'une biphase, ou encore sous forme d'un aérosol. 20 Enfin, la composition pourra comprendre tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des co-solvants (éthanol, glycérol, alcool benzylique, humectant...), des épaississants, des diluants, des émulsionnants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des huiles 25 essentielles, des oligo-éléments, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, des filtres chimiques ou minéraux, des agents hydratants ou des eaux thermales etc. On peut par exemple citer des polymères hydrosolubles de type polymère naturel, tels que les polysaccharides, ou polypeptides, des dérivés cellulosiques de type méthylcellulose ou hydroxypropylcellulose, ou encore des polymères synthétiques, 30 polaxamères, carbomères, PVA ou PVP et notamment les polymères vendus par la société ISP. Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses 2963234 -9- recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids, et de préférence de 5 à 50 %, par rapport au poids total de la composition. Les 5 émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids par rapport au poids total de la composition. Par ailleurs, la composition selon l'invention peut comprendre en outre, au moins un 10 composé améliorant la santé des cheveux. Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend en outre, des vitamines, d'autres extraits peptidiques végétaux, des esters de l'acide nicotinique, des oligo-éléments, des agents anti-inflammatoires, de l'acide rétinoïque ou ses dérivés, du rétinol, des inhibiteurs de la 5a-réductase ou des composés peptidiques issus de la 15 synthèse chimique. Comme exemple de vitamine on peut citer les vitamines A, E, B5, B6, C, H, ou PP, comme exemple d'oligo-éléments on peut citer le zinc, le cuivre, le magnésium, ou encore le silicium. Dans un mode plus particulier de réalisation, la composition selon l'invention comprend, outre l'hydrolysat peptidique de fève : 20 - au moins un composé activateur du cytochrome c, et/ou ; - au moins un composé hydratant, tel qu'un composé activateur des aquaporines et/ou ; - au moins un composé activateur des sirtuines et/ou ; - au moins un composé qui augmente la production de protéines matricielles telles que le collagène, et/ou ; 25 - au moins un composé modulateur des protéines HSP et/ou; - au moins un composé qui augmente l'énergie cellulaire et/ou; - au moins un composé modulant la pigmentation des cheveux et/ou ; - au moins un composé améliorant la résistance aux agressions extérieures, tels que un composés activateur de la transglutaminase ou de la HMG-CoA réductase et/ou ; 30 Lesdits composés ci-dessus peuvent être d'origine naturelle, comme des hydrolysats peptidiques de plantes, ou encore d'origine synthétique, comme des composés peptidiques. 2963234 -10- De par ses activités particulières, l'extrait selon l'invention peut être utilisé en tant que médicament. Ainsi, l'extrait peut être utilisé pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance dans les cas de chute de cheveux résultant d'un état pathologique. En effet, l'extrait peut 5 être incorporé dans une composition pharmaceutique afin de ralentir la chute des cheveux ou stimuler leur croissance dans les cas d'alopécie Areata ou encore d'alopécie causée par des affections de la peau telles que des brûlures ou encore des parasites. Un quatrième objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement 10 cosmétique non thérapeutique destiné à limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance, caractérisé en ce que l'on applique quotidiennement sur la zone du cuir chevelu à traiter une composition selon l'invention. Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de traitement cosmétique non thérapeutique destiné à resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la papille 15 dermique, par application quotidienne sur la zone du cuir chevelu à traiter d'une composition telle que décrite précédemment. La resynchronisation desdites cellules passe entre autre par la modulation de la quantité de Clock, Per1 et Bmall dans lesdites cellules. Enfin, un dernier objet de la présente invention concerne un procédé de traitement cosmétique non thérapeutique destiné à renforcer le follicule pileux et à le protéger des 20 agressions extérieures, par application d'une composition selon l'invention en prétraitement avant l'exposition au soleil, à des produits chimiques ou des sources de chaleur, telles que des colorations, des défrisages, des permanentes, ou encore des brushings. En effet, de part son action sur la structure du cheveu (kératine K14 notamment), l'extrait peptidique de fèves permet de protéger le follicule pileux, 25 notamment lors de l'exposition de celle-ci à des traitements agressifs. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. 30 2963234 -11- Exemple 1 : Préparation d'un hydrolysat peptidique de graines de fève (Vicia aba L. Les graines de fève (Vicia faba L.) sont mises en solution dans 10 volumes d'eau en présence de 2% de POLYCLAR° 10 (polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble). Le 5 mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 8 avec une solution aqueuse de soude 1 M. Une précipitation en milieu acide est ensuite réalisée. Le culot est remis en solution et après ajustement du pH, de la papaïne à 2% est ajoutée dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 55°C. On procède ensuite à l'inactivation de l'enzyme par chauffage de la solution à 80°C pendant 2 heures. Après 10 centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à un hydrolysat brut de fève est récupérée. Le procédé de purification de l'hydrolysat brut commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0.2 µm) afin d'obtenir une solution jaune clair, brillante et limpide, qualifié 15 d'hydrolysat 1. A cette étape, l'hydrolysat 1 de fève est caractérisé par un extrait sec titrant de 40 à 50 g/kg, un taux de protéines de 20 à 30 g/1 et un taux de sucres de 3 à 5 g/1. La nature protéique de l'hydrolysat 1 est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). 20 L'hydrolysat protéique de fève est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE® LDS. Une solution de NuPAGE® Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites ne se réoxydent durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE® MES avec le standard 25 SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie® R-250. Dans ces conditions, on observe que les peptides obtenus ont un poids moléculaire inférieur à 10 kDa. L'hydrolysat 1 est ensuite purifié afin de ne conserver que les peptides de poids moléculaire inférieur à 6 kDa, à l'aide de filtrations à flux tangentiel. Pour cela, 30 l'hydrolysat 1 est pompé sous pression à travers un support Pellicon® équipée de cassette Pellicon® 2 Biomax 5 kDa. En fin de purification, on obtient un hydrolysat peptidique -12- brillant et limpide. On procède ensuite à une phase de dilution afin d'obtenir un hydrolysat peptidique caractérisé par une teneur en protéines de 1,5 à 3,5 g/1. Cet hydrolysat peptidique dilué est alors analysé en chromatographie liquide haute pression (HPLC) à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'hydrolysat 2 est une Nucleosil® 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn), permettant de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0.2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié). Dans ces conditions chromatographiques, plusieurs fractions peptidiques ont pu être isolées. Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier leurs pics moléculaires. La détermination de la composition en acides aminés du principe actif selon l'invention a également été réalisée. Celle-ci est réalisée après hydrolyse acide et identification par chromatographie liquide haute pression à l'aide d'une pré-dérivation au PICT (phenylisothiocyanate). Un exemple de composition en acides aminés de l'hydrolysat est donné dans le tableau suivant (en %) : Acides aminés % Alanine 4,8 Acide Aspartique 12,8 Arginine 10,6 Acide Glutamique 20,7 Glycine 4,8 Histidine 2,6 Isoleucine 4,8 Leucine 8,5 Lysine 7,4 Phénylalanine 5,3 Proline 4,8 Serine 5,8 Thréonine 4,2 Tyrosine 4,8 valine 5,8 Tryptophane 5,3 Exemple 2 : Action de l'extrait peptidique de fèves sur des follicules maintenus en 20 culture in vitro 2963234 -13- Cultures de biopsies de cuir chevelu et inclusion des coupes Des biopsies de peaux (issues de liftings) présentant des cheveux sont cultivées de la même manière que des explants de peaux. Des biopsies de 6 mm sont réalisées au moyen de punch de biopsies et mises en culture sur des inserts dans un milieu WILLIAM 5 E. en présence de Primocine (Invivogen), 10 µg/ml d'insuline 10 ng/ml, d'Hydrocortisone et 2 mmol/L de L-Glutamine. Les explants de peaux sont déposés dans des plaques 6 puits et traités ou non en mettant 20 µl d'extrait à 0,5 % ou à 1 % (selon l'expérience) dilué dans du PBS, en contact sur les biopsies, pendant 48 heures de culture (ou plusieurs jours selon 10 l'expérience). A la fin de l'expérience, l'enrobage des explants peut se faire soit dans la paraffine, soit dans de l'OCT suivi d'une congélation selon le type de marqueur utilisé. Enrobage paraffine Les biopsies sont mises en cassette et fixées dans du formol à 10 % pendant 2 heures dans 15 un appareil automatisé (VIP). Par la suite, les biopsies sont déshydratées par une série de bains d'alcool (à concentration et temps croissants), suivie de 2 bains de xylène et enfin incluses dans de la paraffine. La durée totale de cette série d'opérations est d'une douzaine d'heures. Les biopsies ainsi enrobées sont ensuite orientées afin d'être ensuite coupées à 4 par un microtome. Enrobage dans l'OCT (optimum cutting température): Les coupes sont mises dans l'OCT (optimum cutting température) et refroidies rapidement dans un bain d'azote liquide. Lles blocs ainsi solidifiés sont ensuite coupés au cryotome où des coupes de 6µm sont réalisées. Les coupes sont recueillies sur des lames d'observation poly-lysinées. 2.1 Immunomarquage de la Kératine K15, de la Kératine K14, et de Ki67 Pour le marquage de la kératine K14, des coupes paraffinées sont utilisées. Pour cela, les coupes sont déparaffinées et réhydratées avant la mise de l'anticorps. A cet effet, une série de bains de xylène, suivie d'une série de bains d'alcool (à concentration et temps décroissants) et d'un rinçage dans de l'eau puis dans du PBS sont réalisées à cet effet. Après démasquage au micro-onde, les coupes déparaffinées sont rincées au PBS pendant 2 minutes, puis entourées, et on incube chaque coupe dans 100 µl de BSA 5 % pendant 2963234 -14- 30 minutes. Puis, 100 µl d'anticorps primaire anti-K14 (Abcam, Mouse monoclonal) dilué à 1/50ième sont ajoutés et mis pendant 60 minutes minimum sous agitation en chambre humide. Après rinçage avec du PBS pendant 30 minutes, 100 µL d'anticorps secondaire dilué au 1/1000ième (Invitrogene, Alexa Fluoro 488 anti-Rabbit) marqué à la 5 fluorescence sont ajoutés et laissés durant 1 h à l'obscurité sous agitation en chambre humide. Ces marquages sont réalisés en parallèle sur des biopsies traitées ou non pendant 48 h avec l'extrait peptidique de fèves dilué à 1 %. Les lames sont ensuite rincées dans le PBS, montées entre lame et lamelle à l'aide de Fluromount G. Pour le marquage de la kératine K15 et de Ki67, des coupes congelées sont utilisées. 10 Pour cela, les coupes sont séchées à l'étuve à 37 °C pendant 30 minutes, puis fixées à l'aide d'un bain à l'acétone. Après rinçage dans du PBS pendant 5 minutes, 100 µl d'un anticorps primaire anti-K15 (Abcam, mouse monoclonal) dilué au 1/501ème sont ajoutés. Pour le marquage de la protéine Ki67, 100 d'un anticorps primaire anti-Ki67 (Novocastra, rabbit polyclonal) dilué au 1/100ième sont ajoutés. Après mise sous agitation 15 pendant 60 minutes et un bain de PBS, 100 µl d'un anticorps secondaire dilué au 1/1000ième (Invitrogene, Alexa Fluoro 488 anti-Rabbit) marqué à la fluorescence, sont ajoutés et laissés durant 1 heure à l'obscurité sous agitation en chambre humide. Après rinçage au PBS, 100 de DAPI à 0,3nM sont ajoutés pendant 5 minutes à l'obscurité sous agitation en chambre humide. Enfin, les lames sont rincées dans le PBS, et montées 20 entre lame et lamelle à l'aide de Fluromount G. L'intensité de la fluorescence est quantifiée par analyse d'image à l'aide du logiciel Image-Pro Analyser version 5. Résultats Concernant le marqueur de prolifération Ki67, on constate une augmentation 25 significative de celui-ci dans les biopsies traitées à l'aide de l'extrait peptidique de fèves utilisé à 1 %. Dans les cas des kératines K14 et K15, on constate là aussi une augmentation de l'expression de celles-ci. Grâce à un logiciel de quantification de la fluorescence, on a pu constater une hausse de l'ordre de 32,6 % de la kératine K15, et de 30,9 % dans les 30 follicules pileux des biopsies traitées à l'aide de l'extrait actif par rapport aux biopsies non traitées. 2963234 -15- Conclusions On sait que la kératine K15 est impliquée dans les stades précoces de la différentiation des kératinocytes dans les follicules pileux et que le Ki67 est un marqueur de prolifération des cellules. Par conséquent, on peut donc conclure que l'extrait selon l'invention a joué 5 un rôle activateur dans le renouvellement et la prolifération des cellules formant le follicule pileux. L'augmentation de la kératine K14 quant à elle, prouve le rôle de l'extrait de fèves sur la structure du cheveu, en renforçant la structure du cheveu, en particulier la cohésion de l'ORS. 10 2.2 Immunomarquage des protéines Clock, Perl et Bmall Afin de réaliser les marquages des protéines Clock, Perl et Bmall, des coupes congelées sont utilisées. Les coupes sont préparées comme décrit ci-dessus, et les anticorps primaires sont appliqués. Pour le marquage de la protéine Clock, 100 [il d'un 15 anticorps primaire anti-Clock (Abcam, rabbit polyclonal) dilué au 1/250ième sont ajoutés. Pour le marquage de la protéine Perl, 100 d'un anticorps primaire anti-Perl (CosmoBio Co., rabbit polyclonal) dilué au 1/100ième sont ajoutés. Enfin, pour le marquage de la protéine Bmall, 100 µl d'un anticorps primaire anti-Bmall (Cliniscience, rabbit polyclonal) dilué au 1/250ième sont ajoutés. Dans chaque cas, après mise sous 20 agitation pendant 60 minutes et un bain de PBS, 100 111 d'un anticorps secondaire dilué au 1/1000ième (Invitrogene, Alexa Fluoro 488 anti-Rabbit) marqué à la fluorescence, sont ajoutés et laissés durant 1 heure à l'obscurité sous agitation en chambre humide. Après rinçage au PBS, 100 µl de DAPI à 0,3nM sont ajoutés pendant 5 minutes à l'obscurité sous agitation en chambre humide. Enfin, les lames sont rincées dans le PBS, et montées 25 entre lame et lamelle avec le Fluromount G. Résultats On constate que les marquages des protéines Clock, Perl et Bmall, sont maintenus aux mêmes niveaux dans les cellules du follicule pileux qu'il y ait eu traitement à l'aide 30 de l'actif à 1 % ou non. Il n'y a pas eu de hausse de l'expression de ces protéines dans les cellules du follicule pileux. Ces résultats confirment que les follicules en question sont en phase anagène, c'est-à-dire la phase vitale du cheveu et sont concordants avec la 2963234 -16- littérature. On peut donc conclure que l'extrait de fèves selon l'invention permet de maintenir les cellules du follicule pileux en phase anagène c'est-à-dire en phase active. Exemple 3: Action de l'extrait peptidique de fèves sur des cellules de papilles 5 dermiques humaines (HDPC) Des cellules de papilles dermiques humaines (HDPC) sont maintenues en culture afin de réaliser un immunomarquage des marqueurs du rythme circadien, c'est-à-dire les protéines Clock, Perl et Bmall. Les cellules HDPC ont été choisies puisque c'est à partir de ces cellules que se fait la pousse du follicule pileux. Les cellules sont mises en culture 10 en présence ou non de l'extrait peptidique de fèves dilué à 0,5 ou à 1 % pendant 48 heures. Après lavage des cellules au PBS, fixation au méthanol froid puis rinçage au PBS, les cellules sont perméabilisées avec du triton X-100 à 0,2 % pendant 15 minutes sous agitation. Après rinçage au PBS, les anticorps primaires sont appliqués. Pour le marquage de la protéine Clock, 150 µl d'un anticorps primaire anti-Clock (Abcam, rabbit 15 polyclonal) dilué au 1/250ième sont ajoutés. Pour réaliser le marquage de la protéine Per1, 150 µl d'un anticorps primaire anti-Per1 (CosmoBio Co., rabbit polyclonal) dilué au 1/100'ème sont ajoutés. Enfin, pour le marquage de la protéine Bmall, 100 ~l d'un anticorps primaire anti-Bmal 1 (Cliniscience, rabbit polyclonal) dilué au 1/250ième sont ajoutés. Dans chaque cas, après mise sous agitation pendant 60 minutes et plusieurs bains 20 de rinçage au PBS, 150 µl d'un anticorps secondaire dilué au 1/1000ième (Invitrogene, Alexa Fluoro 488 anti-Rabbit) marqué à la fluorescence, sont ajoutés et laissés durant 1 heure à l'obscurité sous agitation en chambre humide. Enfin, les lames sont rincées dans le PBS, et montées entre lame et lamelle avec le Fluromount G. L'intensité de la fluorescence est quantifiée par analyse d'image à l'aide du logiciel Image-Pro Analyser 25 version 5. Résultats : On constate que l'extrait de fèves a augmenté l'expression de la protéine Clock dans le noyau des cellules HDPC par rapport aux cellules non traitées avec l'extrait. 30 Quantitativement, cette hausse est de l'ordre de 19,1 % avec l'extrait utilisé à 0,5 %, et de 30,7 % avec l'extrait utilisé à 1 %. On constate donc que l'effet de l'extrait est dose-dépendant. 2963234 -17- L'expression de la protéine Bmall est elle aussi augmentée grâce à l'extrait peptidique de fèves par rapport aux cellules HDPC non traitées. L'augmentation du marquage de la protéine Bmal 1 est surtout localisée autour du noyau. Cette hausse est de 21,2 % avec l'extrait utilisé à 0,5 %, et de 48,2 % avec l'extrait utilisé à 1 % (effet dose- 5 dépendant). Il en est de même pour la protéine Perl dans les cellules HDPC par rapport aux cellules non traitées à l'aide de l'actif peptidique. L'augmentation de la protéine Per 1 est principalement constatée au niveau du noyau, mais elle a lieu également dans le cytoplasme. La hausse constatée est de 33,4 % avec l'extrait utilisé à 0,5 % et de 41,5 % 10 avec l'extrait utilisé à 1 % (effet dose-dépendant). En complément, un marquage de la protéine Ki67 a été réalisé dans les mêmes conditions expérimentales, en présence ou non de l'actif à 0,5 ou à 1 %. On constate alors une hausse du marquage de la protéine Ki67 dans le noyau par rapport aux cellules non traitées. La hausse est de 10,8 % avec l'actif à 0,5 % et de 56,2 % avec l'actif utilisé à 15 1 %. Cette hausse du marquage Ki67 témoigne d'une prolifération plus importante des cellules de la papille dermique. Conclusions : Les différents marquages réalisés au niveau des cellules de la papille dermique 20 démontrent que l'extrait de fèves selon l'invention a permis d'augmenter l'expression des protéines majeures du rythme circadien. De plus, l'extrait a permis d'augmenter l'expression de la protéine Ki67, protéine impliquée dans le cycle cellulaire et présente uniquement dans les cellules en prolifération. 25 Exemple 4 : Action de l'extrait peptidique sur la croissance des follicules Mesures de l'élongation des follicules Des biopsies de peaux issues de liftings sont rasées, puis mises en culture dans un milieu approprié (milieu Wiliam E.) en présence ou non de l'extrait peptidique actif à une 30 concentration de 0,5 % dans la condition 1, et 1 % dans la condition 2. En absence de principe actif, les follicules sont mis en culture dans du PBS. Les biopsies sont maintenues en culture pendant 17 jours, et le traitement à l'aide de l'actif a lieu tous les jours, une fois par jour. Des photos sont réalisées à l'aide de la Vivacam (petite camera 2963234 -18- qui équipe le Vivascope) au temps zéro. Des mesures d'élongation de la tige capillaire sont réalisées aux jours 7, 10, 14 et 17. Les photos aux différents temps sont ensuite retraitées par le logiciel « Image Pro Analyzer » qui nous permet de mesurer la taille (en [.m) de chaque tige capillaire 5 séparément. L'élongation globale des tiges capillaires traitées et non traitées est mesurée et une étude statistique est réalisée. Résultats /Conclusions: A l'issue de ce test, on constate que l'application de l'extrait peptidique de fèves aide 10 à la stimulation de la pousse des cheveux in vitro. L'effet de l'extrait selon l'invention est dose-dépendant puisque les résultats sont meilleurs avec l'extrait à 1 % qu'avec l'extrait à 0,5 %. Le meilleur résultat sur l'élongation est obtenu après 7 jours d'application. Grâce à l'analyse par logiciel, une mesure statistique sur la pousse des cheveux a été réalisée. La pousse des cheveux est favorisée, après 7 jours de traitement, de plus de 219 % dans les 15 biopsies ayant reçues le traitement avec l'actif à 0,5 %. La pousse est favorisée de l'ordre de 234 % dans la condition 2, c'est à dire avec l'actif utilisé à 1 % (effet dose-dépendant donc). Par conséquent, on peut conclure que l'actif selon l'invention a permis de stimuler la pousse des tiges capillaires in vitro. Exemple 6 : Préparation de compositions 20 1. Sérum pour la pousse des cheveux Disperser le Natrosol 250HHR et le Disodium EDTA dans l'eau sous agitation. Chauffer à 50-60 °C, et agiter jusqu'à obtenir un aspect uniforme. Ajouter le Styleze® CC-10, et agiter jusqu'à obtenir un aspect uniforme. Laisser refroidir à température ambiante et ajouter les 25 ingrédients dans l'ordre de la liste en agitant jusqu'à obtenir un aspect uniforme entre chacun d'eux. Formulations N° 1 N° 2 Nom INCI Nom % % Fournisseur commercial massique massique Eau Q.S. Q.S. Hydroxyethylcellulose Natrosol 0,35 0,50 Hercules/Aqualon 250HHR Disodium EDTA Dissolvine 0,05 0,05 Akzo Nobel NA-2S 2963234 -19- VP/DMAPA Acrylates Styleze® CC- 5,00 5,00 ISP Copolymères 10 Quaternium-26 Ceraphyl® 1,00 1,00 ISP 65 Panthénol Ritapan DL 0,15 0,15 RITA Propylène Glycol Liquid 0,50 0,50 ISP Urée Diazolidinyle Germall® Plus Iodopropynyl Butylcarbamate Extrait peptidique de fèves 1,00 1,00 ISP Total 100,00 100,00 Appliquer le produit sur le cuir chevelu humide. Masser pour répartir uniformément le produit. Le sérum favorise la pousse et/ou la repousse des cheveux tout en les rendant plus nerveux. 2. Lait traitant antichute de cheveux Mettre l'eau dans un récipient convenable et commencer l'agitation. Ajouter le Gafquat 755N et le Liquid Germall Plus et agiter jusqu'à obtenir un aspect uniforme. 10 Ajouter le RapiThix A-60 et agiter jusqu'à obtenir un aspect uniforme (environ 15 minutes). Ajouter 1'hydrolysat selon l'exemple 2 et agiter jusqu'à obtenir un aspect uniforme. Disposer le produit dans un vaporisateur non-aérosol équipé d'une pompe Calmar pump Mark VI WL31. Formulations N° 1 N° 2 Nom INCI Nom commercial % % Fournisseur massique massique Eau dé-ionisée - Q.S. Q.S. Polyquaternium-11 Gafquat® 755N 1,25 2,00 ISP Propylène Glycol Liquid Germall® 0,50 0,50 ISP Urée Diazolidinyl Plus Iodopropynyl Butylcarbamate/ Sodium Polyacrylate Polydecene RapiThixTM A-60 0,50 0,50 ISP Hydrogéné Trideceth-6/ Extrait peptidique de fèves 0,1 0,5 ISP Total 100,00 100,00 Le produit est conçu pour être vaporisé sur le cuir chevelu et sur cheveux humides. Masser pour répartir uniformément le produit. Le lait ainsi proposé permet de lutter contre la chute des cheveux tout en les rendant lisses et faciles à coiffer. 5 15 REVENDICATIONS1. Utilisation cosmétique d'une composition comprenant au moins un extrait peptidique de fèves en tant qu' agent actif pour limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur 5 croissance. 2. Utilisation selon la revendication 1 pour stimuler la croissance des cheveux dans les cas d'alopécie liée à l'âge due à des dysfonctionnements du cycle de croissance du cheveu. 3. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'extrait de fèves permet de stimuler l'expression de la protéine Ki67 et des kératines K15 et K14 pour renforcer le follicule pileux. 15 4. Utilisation cosmétique d'une composition comprenant au moins un extrait peptidique de fèves en tant qu'agent actif capable de moduler les gènes Clock, Perl et Bmal 1 dans les cellules de la papille dermique. 5. Utilisation selon la revendication 4 pour restaurer le rythme circadien et 20 resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la papille dermique. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'extrait est un hydrolysat peptidique provenant de l'hydrolyse des protéines de fèves Vicia faba L. 25 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'extrait est solubilisé dans un ou plusieurs solvants physiologiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou 30 tout mélange de ces solvants. 10 2963234 -21- 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'extrait solubilisé comprend au moins entre 1 et 4 g/1, et préférentiellement au moins entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés de nature peptidique. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'au moins 70 % des composés de nature peptidique présents dans l'extrait sont des peptides de taille inférieure à 6 kDa, et préférentiellement au moins 85%. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait solubilisé est utilisé en une quantité représentant de 0,001 % à 5 % du poids total de la composition, et préférentiellement en une quantité représentant de 0,01 % à 1 % du poids total de la composition. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique. 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition comprend en outre, au moins un composé améliorant la santé des cheveux. 13. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce ledit composé est choisi parmi des vitamines, d'autres extraits peptidiques végétaux, des esters de l'acide nicotinique, des oligo-éléments, des agents anti-inflammatoires, de l'acide rétinoïque ou ses dérivés, du rétinol, des inhibiteurs de la 5a-réductase ou des composés peptidiques issus de la synthèse chimique. 14. Utilisation d'un extrait tel que défini dans l'une des revendications précédentes pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance dans les cas de chute de cheveux résultant d'un état pathologique. 2963234 -22- 15. Procédé de traitement cosmétique non thérapeutique destiné à limiter la chute des cheveux et/ou stimuler leur croissance, caractérisé en ce que l'on applique quotidiennement sur la zone du cuir chevelu à traiter une composition telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 16. Procédé de traitement cosmétique non thérapeutique destiné à resynchroniser l'horloge biologique des cellules de la papille dermique, caractérisé en ce que l'on applique quotidiennement sur la zone du cuir chevelu à traiter une composition telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 17. Procédé selon la revendication précédente destiné à moduler la quantité de Clock, Per 1, et/ou Bmall dans les cellules de la papille dermique. 18. Procédé de traitement cosmétique non thérapeutique destiné à renforcer le follicule 15 pileux et à le protéger des agressions extérieures caractérisé en ce que la composition telle que définie selon l'une des revendications 1 à 13 est appliquée en prétraitement avant l'exposition au soleil, à des produits chimiques ou des sources de chaleur, telles que des colorations, des défrisages, des permanentes, ou encore des brushings. 20 25 5 10 30