Brevet FR2961597A1 — publié le 20111223

PROCEDE DE_CARACTERISATION D'UN PRODUIT AGROALIMENTAIRE ET APPAREIL POUR LA MISE EN OEUVRE D'UN TEL PROCEDE L'invention porte sur un procédé spectroscopique de caractérisation d'un produit agroalimentaire, en particulier destiné à déterminer la naturalité, la fraîcheur, l'authenticité d'un tel produit, voire sa conformité à un produit cible. L'invention porte également sur un appareil pour la mise en oeuvre d'un tel procédé. Le procédé se base sur des méthodes chimiométriques, et en particulier sur l'analyse statistique multivariée ou multivoies de spectres de fluorescence naturelle. L'analyse multivoies est l'extension naturelle de l'analyse multivariée lorsque les données sont arrangées dans des tableaux à trois voies ou plus. On pourra se rapporter à ce propos à l'ouvrage de référence de R. Bro, « Multi-way Analysis in the Food Industry Models, Algorithms, and Applications », PhD thesis, Universiteit van Amsterdam, 1998. La « naturalité » et la « fraicheur » des produits agroalimentaires conservés ou transformés - c'est à dire leur proximité par rapport aux produits frais initiaux - sont des paramètres importants tans pour les consommateurs que pour les producteurs. Malheureusement, ces paramètres sont difficiles à définir de manière précise, et encore plus difficiles à quantifier. L'invention vise précisément à permettre une telle quantification. Le procédé de l'invention permet également d'évaluer l' « authenticité » d'un produit agroalimentaire par rapport à un produit de référence, en tenant compte de la variabilité moyenne inévitable sur ledit produit de référence reconnu comme authentique (région d'origine, terroir, méthode de fabrication...). Ce procédé peut également constituer un outil de standardisation au service de l'industrie agroalimentaire, permettant de comparer tout produit fabriqué à un échantillon cible, jugé comme optimal. Un procédé de caractérisation d'un échantillon d'un produit agroalimentaire ou plus largement tout produit soumis à un procédé de fabrication (cosmétique, médicament, ...) selon l'invention se caractérise en ce qu'il comporte a) l'éclairage dudit ou de chaque échantillon à analyser par une pluralité de rayonnements lumineux d'excitation à des longueurs d'onde 5 respectives ; b) l'acquisition de spectres de fluorescence naturelle dudit ou de chaque échantillon, correspondant chacun à un rayonnement lumineux d'excitation respectif ; c) l'application auxdits spectres d'un procédé d'analyse 10 multivariée ou multivoies fournissant un nombre N de variables représentatives dudit ou de chaque échantillon, de telle sorte que ledit ou chaque échantillon puisse être représenté par un point dans un espace à N dimensions ; d) le calcul d'une distance, dans ledit espace à N 15 dimensions, entre le point représentant ledit ou chaque échantillon et une cible représentant un ou plusieurs échantillons de référence ; et e) la détermination d'une caractéristique dudit ou de chaque échantillon en fonction de ladite distance. Selon différentes caractéristiques avantageuses de 20 l'invention, prises isolément ou en combinaison : - Ladite caractéristique peut être choisie parmi un indicateur de naturalité, un indicateur de fraîcheur, un indicateur d'authenticité et un indicateur de conformité. - Le nombre N de variables représentatives dudit ou de 25 chaque échantillon peut être compris entre 1 et 10 et de préférence entre 1 et 5. - Ledit procédé d'analyse multivariée ou multivoies peut être choisi parmi une analyse par composantes principales, ou PCA ; une régression par composantes principales, ou PCR ; une régression par 30 moindres carrés partiels, ou PLS ; une analyse discriminante par moindres carrés partiels, ou PLS-DA, une décomposition PARAFAC. - Ladite distance peut être choisie parmi une distance euclidienne et une distance de Mahalanobis. Ladite étape b) peut consister à acquérir des spectres de fluorescence frontale. - Le procédé peut comporter également, entre lesdites étapes b) et c), une étape b') de prétraitement des spectres de fluorescence acquis par soustraction d'une contribution due à la diffusion Rayleigh du premier ordre du rayonnement lumineux d'excitation, ladite contribution étant calculée au moyen d'un modèle linéaire généralisé. - Le nombre de rayonnements lumineux d'excitation, et de spectres de fluorescence correspondants pour chaque échantillon, peut être compris entre deux et six, et de préférence entre trois et cinq. - L'écart spectral moyen entre lesdits rayonnements lumineux d'excitation peut être d'au moins 20 nm, et de préférence d'au 15 moins 50 nm, sur une plage spectrale d'au moins 100 nm. Un autre objet de l'invention est un appareil d'analyse spectroscopique d'au moins un échantillon comportant : - un ensemble de sources lumineuses pour éclairer ledit ou chaque échantillon à analyser par des rayonnements lumineux d'excitation 20 respectifs, présentant des longueurs d'onde différentes; un moyen d'acquisition des spectres de fluorescence frontale émis par ledit ou de chaque échantillon lorsqu'il est éclairé par lesdits rayonnements lumineux d'excitation ; et un moyen de traitement des spectres de fluorescence 25 acquis, adapté pour mettre en oeuvre un procédé tel que décrit ci-dessus. Selon différentes caractéristiques avantageuses l'invention, prises isolément ou en combinaison : - Ledit appareil peut comporter entre deux et six, et de préférence entre trois et cinq, desdites sources lumineuses, avec un écart 30 spectral moyen d'au moins 20 nm sur une plage spectrale d'au moins 100 nm. - Ledit appareil peut comporter : une première source lumineuse émettant un rayonnement à une longueur d'onde comprise entre 270 et 300 nm ; une deuxième source lumineuse émettant un rayonnement à une longueur d'onde comprise entre 300 et 360 nm ; et une troisième source lumineuse émettant un rayonnement à une longueur d'onde comprise entre 400 et 500 nm. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement : - La figure 1, trois spectres « bruts » de fluorescence frontale d'un échantillon d'un produit agroalimentaire (chicorée torréfiée), correspondant à trois rayonnements d'excitation à des longueurs d'ondes différentes ; - Les figures 2A, 2B, 2C et 3, quatre graphiques illustrant 15 l'opération de soustraction de la diffusion de Rayleigh par la méthode utilisant un modèle linéaire généralisé ; - La figure 4, une illustration schématique de la notion de concaténation des spectres ; - La figure 5, une illustration schématique de la factorisation 20 PARAFAC; - La figure 6, le schéma de principe d'un appareil d'analyse selon un mode de réalisation de l'invention ; - La figure 7, un schéma de principe d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention 25 - La figure 8, un graphique illustrant l'application d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention à la détermination de la naturalité d'un échantillon de lait ; et Les figures 9A et 9B, deux graphiques l'application d'un procédé selon un autre mode de réalisation de l'invention à la détermination 30 de la naturalité de différents jus d'orange. Le procédé selon un mode de réalisation de l'invention utilise le signal de fluorescence naturelle émis à la surface de l'aliment après illumination par des faisceaux lumineux à des longueurs d'onde déterminées du domaine UV-visible (approximativement : 250 - 750 nm). Ce signal est analysé par des méthodes chimiométriques qui permettent d'extraire l'information qui se trouve corrélée aux caractéristiques de « naturalité » ou « fraicheur » que l'on cherche à quantifier. L'existence d'une telle corrélation est déduite du fait que, au cours de la production agricole, la conservation et la transformation, la fluorescence intrinsèque des constituants naturels de l'aliment (vitamines, protéines et autres constituants naturels ou ajoutés intentionnellement ou non), ainsi que leur réflectance, évoluent, alors que dans le même temps, de nouveaux signaux apparaissent du fait de la formation de nouvelles molécules. On parle de fluorescence néoformée ou acquise selon que les fluorophores sont formés de novo ou proviennent de l'environnement. L'évolution conjointe des signaux natifs (SN), néoformés (SNF) et nouvellement acquis (SNA) est corrélée de manière robuste aux modifications physiques, physico-chimiques, chimiques ou microbiologiques de l'aliment, en particulier aux changements des paramètres de qualité, induits au cours de la production, la conservation et/ou la transformation. Les facteurs de changement qui influent sur la qualité de l'aliment sont les rayonnements ultraviolets oxydants, la destruction de microorganismes ou, au contraire, le développement de certains d'entre eux pouvant entraîner la synthèse de mycotoxines, l'intervention humaine sur les cultures (engrais, pesticides ...), ou l'application de procédés modifiant la température, la pression ou tout autre paramètre physique au sein de l'aliment et qui induisent par voie de conséquence une modification de la composition physico-chimique et des paramètres de qualité. Les rayonnements lumineux d'excitation présentent des longueurs d'onde choisies de manière à explorer le spectre UV-visible le plus largement possible. De manière générale, on peut choisir a priori : - une longueur d'onde comprise entre 270 et 300 nm permettant d'exciter le tryptophane, les phénols comme l'acide chlorogénique ou l'hydroxytyrosol ou encore la vitamine E, molécules émettant dans l'UV ; - une longueur d'onde comprise entre 400 et 450 ou 500 nm permettant d'exciter la riboflavine, les porphyrines et la chlorophylle, molécules émettant dans le visible (500-700 nm) ; - une ou deux longueurs d'onde comprises entre 300 et 360 voire 400 nm sont introduites pour exciter les fluorophores néoformés, essentiellement des produits de Maillard et des produits de peroxydation lipidique, mais également les mycotoxines émettant dans l'UV lointain-proche visible (400-500 nm). Ces longueurs d'onde pourront être modifiées en fonction de l'application spécifique. En tout cas, pour plus de précision, il est possible de choisir les longueurs d'onde les plus proches possibles des maxima des loadings représentant le vecteur excitation obtenu par la décomposition PARAFAC d'une matrice MEE complète obtenue avec un fluorimètre de laboratoire sur d'un lot d'échantillons représentatifs. D'une manière générale, l'étude des spectres de fluorescence utilisant un rayonnement d'excitation visible ou ultraviolet fournit plus d'informations sur les transformations subies par les produits agroalimentaires que celui des spectres infrarouges. De préférence, le nombre de longueurs d'onde utilisées est compris entre 2 et 6, avantageusement entre 3 et 5, et de préférence égal à 5, permettant d'exciter tour à tour un nombre correspondant de groupes de fluorophores parmi ceux décrits plus haut. L'utilisation d'un nombre aussi restreint de longueurs d'onde est avantageux pour rendre possible la mise en oeuvre du procédé de l'invention dans un milieu industriel. Elle contraste avec les techniques chimiométriques traditionnelles, basées sur l'utilisation d'un nombre important de longueurs d'onde d'excitation. Par contre, elle impose des contraintes additionnelles, comme cela sera discuté plus loin. L'intensité du rayonnement d'excitation est choisie de sorte à ce que l'énergie d'émission de fluorescence de ces fluorophores soit significativement modifiée au cours de la transformation (pasteurisation, stérilisation...) ou de la conservation du produit à caractériser. La figure 6 montre un schéma très simplifié d'un appareil pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Cet appareil comprend trois sources lumineuses SI, S2, S3 émettant chacune un faisceau de rayonnement monochromatique à une longueur d'onde différente dirigée de sorte à éclairer l'échantillon E. Le signal de fluorescence F (en fait, mélange de fluorescence et diffusion Rayleigh du ter et parfois du 2nd ordre) émis par cet échantillon est transporté par une fibre optique vers un spectromètre qui décompose le rayonnement lumineux émis en spectre. Les spectres acquis sont traités par un moyen de traitement des données MTD (typiquement un ordinateur programmé d'une manière opportune) qui permet d'en extraire l'information chimiométrique recherchée. Les sources lumineuses peuvent être, typiquement, des diodes électroluminescentes, voire des lasers (de préférence à semiconducteur) si des intensités plus importantes sont requises. L'analyse des données spectroscopiques, effectuée par l'ordinateur MTD, comporte quatre étapes principales : - le prétraitement des spectres ; l'application auxdits spectres d'un procédé d'analyse multivariée ou multivoies permettant de les « projeter » dans un espace de dimensions réduites (N dimensions) ; - le calcul d'une distance, dans ledit espace à N 20 dimensions, entre le point représentant ledit ou chaque échantillon et une cible représentant un ou plusieurs échantillons de référence ; et - la détermination quantitative d'une caractéristique (fraîcheur, naturalité...) dudit ou de chaque échantillon en fonction de ladite distance. 25 On considère d'abord le prétraitement des spectres, en référence à un exemple spécifique, dans lequel un échantillon de chicorée torréfiée est éclairé successivement par trois rayonnements d'excitation à 280, 340 et 429 nm. Chacun des trois spectres de fluorescence est constitué de 1515 valeurs d'intensité spectrale pour autant de longueurs d'ondes X 30 différentes. La résolution spectrale est de 0,25 nm/pixel, mais elle peut être divisée par 5, voire plus, sans qu'une dégradation des résultats du procédé de l'invention ne soit observée. Les spectres « bruts » (figure 1) sont dominés par la diffusion de Rayleigh du premier ordre, à la longueur d'onde des rayonnements d'excitation (280, 340 et 429 nm). Le spectre de chaque signal de fluorescence, en effet, est partiellement superposé au rayonnement d'excitation diffusé, qui est beaucoup plus intense. Ce problème est connu, et est généralement résolu en remplaçant les valeurs d'intensité correspondant à la région spectrale de superposition par des zéros ou des valeurs manquantes. Ces méthodes conventionnelles présentent des inconvénients, car le remplacement par des zéros engendre des artéfacts et donc fausse l'analyse en créant des variances artificielles. Le remplacement par valeurs manquantes engendre des difficultés au niveau de la convergence des modèles multivoies utilisés pour l'analyse des données. De plus, la présence des valeurs manquantes empêche l'utilisation des prétraitements de standardisation (voir ci-après), qui ne peuvent être appliqués qu'à des valeurs réelles. Ces problèmes sont acceptables dans le cas des techniques basées sur l'utilisation de MEE de grandes dimensions, ce qui est le cas usuel dans l'art antérieur, mais deviennent facilement rédhibitoires dans un procédé tel que celui selon le mode préféré de réalisation de l'invention, basé sur l'analyse de données très faiblement résolues en longueur d'onde d'excitation. Pour cette raison, il est préférable de supprimer la contribution de la diffusion de Rayleigh du premier ordre par une technique innovante qui se base sur la prédiction de la région de diffusion qui chevauche la fluorescence via un modèle linéaire généralisé (GLZ) avec une fonction de liaison log. Voir à ce propos : J. Rizkallah, « Chemometric Analysis of Front Face Fluorescence Data - Estimation, of Neoformed Contaminants in Processed Foods. » PhD thesis, Agro Paris Tech France, 2007. R. Davidson ; J.G. MacKinnon « Econometric theory and 30 methods. Generalized least squares and related methods » dans « Econometric Theory and Methods », Oxford University Press 2004, pp 255-261. La technique a déjà été décrite dans la Demande de brevet en France 09/06088 déposée le 16/12/2009 au nom de la demanderesse et 5 non publiée à la date de dépôt de la présente Demande. Ce modèle est calibré sur une région du spectre dans laquelle la contribution de la fluorescence est négligeable, et l'intensité spectrale est attribuée exclusivement à la diffusion (référence RD sur les figures 2A et 2B). Le modèle linéaire généralisé est de la forme: 10 f(pY)=bo+b,x Dans l'équation, f(py) est la fonction de liaison de p,,, valeur attendue de y, y étant le vecteur des intensités de diffusion de Rayleigh qui ne se chevauchent pas avec la fluorescence, tandis que x est un vecteur d'indices (1,2,3, etc.) de même taille que y. 15 Grace au modèle généralisé, des relations non linéaires (entre x et y) peuvent être modélisées via la fonction de liaison. Le modèle généralisé peut être utilisé pour modéliser des variables dépendantes ayant des distributions appartenant à la famille exponentielle (Normale, Gamma, Poisson, etc.). La régression linéaire multiple est un cas spécial du modèle 20 GLZ qui correspond à une fonction de liaison égale à la fonction identité et à une variable dépendante (y) présentant une distribution normale. Les paramètres b, du modèle GLZ sont estimés par la méthode statistique de maximisation de la vraisemblance (L) : L=F(Y,modèle )=fn 1p[yi,bi]. 25 Kyi, b;] étant la probabilité de y; conditionnée par b;. Le but est trouver les paramètres qui donnent la plus grande probabilité (densité jointe) de réalisation de y pour toutes les observations. Une estimation itérative (algorithme de Fisher, qui est une méthode quasi-Newtonienne) est utilisée pour trouver les paramètres bi en maximisant L: alog( L) _ 0 30 ab, 2961597 i0 Une fois les b; estimés, le modèle GLZ est appliqué sur les indices de la diffusion correspondant à la région spectrale superposée avec la fluorescence (fig2B - région de prédiction RP) pour prédire les intensités de la diffusion « pure ». Après cette prédiction, les spectres de diffusion complets (partie réelle et prédite) sont soustraits des MEE pour obtenir le spectre de fluorescence pure SF (figure 2C - à comparer avec la figure 2A montrant le spectre de fluorescence partiellement superposé au spectre de la lumière diffusée). Sur la figure 3, les références F280, F340 et F429 représentent 10 les spectres de fluorescence relatifs aux excitations à 280, 340 et 429 nm respectivement, dans lesquels la diffusion de Rayleigh a été prédite par application du modèle généralisé, et soustraite. La suppression de la diffusion de Rayleigh est particulièrement importante lorsque l'analyse se base sur des spectres de 15 fluorescence frontale d'échantillons denses, et donc turbides. Cependant, l'invention peut également être mise en oeuvre sur des échantillons dilués, ce qui rend le prétraitement des données moins critique. Les opérations successives ne portent plus sur les trois spectres de fluorescence considérés individuellement, mais sur les spectres 20 concaténés, c'est à dire disposés l'un à la suite de l'autre dans une colonne unique (voir la figure 4). Les spectres concaténés peuvent être soumis selon les cas à: - Une simple normalisation par division de chaque valeur 25 d'émission de chaque spectre concaténé, par la norme de ce même vecteur X;. Cette normalisation est appliquée à chaque échantillon (i=1 à I échantillons), soit X.' X1J(normalisé) !XII! L 2961597 Il où j est le nombre de longueurs d'ondes du spectre ; ou - Une correction par « Multiplicative scatter correction » (MSC) (correction multiplicative de la dispersion) qui consiste à réaliser une régression entre le vecteur x; (le spectre d'émission concaténé de chaque échantillon i) et le vecteur concaténé moyen de tous les échantillons (i=1 à I échantillons), puis à retrancher l'ordonnée à l'origine et à diviser par la pente respectives chaque intensité du spectre concaténé d'émission pour chaque échantillon, comme décrit ci-dessous: a. +b;x1 (MSC)=x'-a' b; Voir à ce propos la publication précitée de R. Bro ainsi que l'article de M.S. Dhanoa et al. « The link between multiplicative scatter correction (MSC) and standard normal variate (SNV) transformations of NIR spectra. » J. Near lnfrared Spectrosc. 1994, 2, 43-47. Après avoir acquis et prétraité les spectres de fluorescence d'un certain nombre d'échantillons d'étalonnage (deux au minimum, correspondant à des valeurs extrêmes du paramètre à quantifier ; de préférence davantage), il est possible de déterminer le modèle statistique multivoies qui sera utilisé pour l'analyse d'autres échantillons, à caractériser. Cela comporte le calcul des vecteurs de « loadings » de ce modèle. On considère d'abord le cas d'un modèle multilinéaire de type « PARAFAC ». Le principe, illustré par la figure 5, est de décomposer une structure à trois voies (cube de données) X en une somme de produits externes de trois vecteurs (« triades ») a;, b;, c;, plus un résidu E, lui aussi sous la forme d'un « cube de données ». Les trois voies constituant le « cube » X sont : les échantillons, les rayonnements d'excitation, les longueurs d'onde d'émission. On peut donc écrire : d'émission concaténés (j= 1 à 4545) et Ilx;.II = IEIxii F X ijk E af bJ.fckf + eYk .f=1 Où : « i » est l'index des échantillons, « j » celui des rayonnements d'excitation, « k » celui des longueurs d'onde d'émission, « f » 5 celui des F facteurs de décomposition PARAFAC. La concaténation des spectres permet d'écrire la décomposition PARAFAC sous forme matricielle : XI*JK = A(C ® B)T; où: 10 - I, J et K sont les nombres d'échantillons, de longueurs d'onde d'excitation et de longueurs d'onde d'émission respectivement ; - XI*JK est la matrice des fluorescences concaténées de tous les échantillons ; - Be et CKF sont les vecteurs (à JF et KF éléments, 15 respectivement) « loadings» d'excitation et d'émission (profils bilinéaires de fluorescence) ; - AIF est le vecteur (à IF éléments) des « scores » (ou intensités des loadings spectraux) ; - le symbole 10 représente le produit tensoriel de Khatri-2 0 Rao ; et - l'exposant T indique la transposée de la matrice colonne. Les vecteurs des loadings sont calculés à partir d'échantillons d'étalonnage choisis de manière à être représentatifs de la variabilité totale attendue au sein du groupe des échantillons à caractériser subséquemment. 25 Par exemple, si l'on souhaite quantifier la naturalité d'un produit, on utilisera des échantillons d'étalonnage correspondant à des produits frais (naturalité parfaite), d'autres correspondant à des produits très transformés (naturalité faible), et de préférence d'autres encore correspondant à des valeurs intermédiaires de naturalité. II en va de la même manière pour les autres 30 paramètres à quantifier. II faut considérer que le modèle est empirique ; il n'est donc valide que pour des échantillons similaires à ceux qui ont servi à l'étalonnage. Les paramètres A, B et C du modèle PARAFAC peuvent être calculés par la méthode d'alternance des moindres carrés (méthode itérative non linéaire). Dans cette méthode une première estimation du vecteur A est calculée conditionnellement sur des valeurs initiales aléatoires attribuées à B et C pour minimiser la somme des carrés des résidus. Le paramètre B est ensuite actualisé en utilisant l'estimation de A, puis le paramètre C est actualisé en utilisant la nouvelle valeur de B ; et ainsi de suite. Chaque actualisation itérative de A, B et C améliore donc la solution (baisse de la surface d'erreur). L'algorithme converge lorsque l'amélioration de la solution au niveau d'une itération devient très petite (par défaut, ce critère est de 10-6). La convergence du modèle PARAFAC pour des données faiblement résolues et qui, de plus, ne sont pas véritablement trilinéaires, peut être problématique (voir les publications précitées de R. Bro et Rizkallah). En effet, la surface d'erreur du modèle peut contenir des minima locaux (points plus bas que leur voisinage mais plus élevés que le vrai minimum de la surface), des points col, des terrains plats, et des vallées très étroites qui peuvent ralentir ou bien empêcher la convergence de l'algorithme. Les présents inventeurs ont remarqué qu'en imposant une limitation sur le nombre d'itérations (par exemple 30 itérations maximum) et/ou en augmentant le critère de convergence (10"Z ou 10-3 au lieu de 10-6) on améliore significativement le modèle au niveau des paramètres (loadings et scores). En effet, un nombre excessif d'itérations peut dégrader la pertinence du modèle. La convergence peut être facilitée en imposant une contrainte de non négativité puisqu'on sait a priori que les spectres de fluorescence ainsi que leurs intensités relatives ne peuvent pas prendre des valeurs négatives. Enfin, il a été remarqué que le prétraitement de suppression de la diffusion de Rayleigh par application d'un modèle GLZ facilite la convergence du procédé itératif de calcul des vecteurs de loadings et de scores du modèle PARAFAC. Dans le cas de données parfaitement multilinéaires, le modèle PARAFAC n'admet en théorie qu'une solution unique. Cependant, dans le cas d'une MEE limitée à 3 excitations, et lorsque la fluorescence est recueillie en surface, la trilinéarité de la matrice MEE est fortement perturbée. De ce fait, la solution n'est plus unique et il est nécessaire de développer des critères de choix du nombre de facteurs ainsi que du modèle final. Ce choix est guidé par plusieurs critères connus en soi (voir l'ouvrage précité de R. Bro): - La vérification de la conformité entre les paramètres spectraux obtenus (vecteurs B et C) et la connaissance a priori des fluorophores présents dans l'échantillon analysé. - Un critère connu sous le nom de CORCONDIA qui sert à 15 vérifier le pourcentage de déviation du modèle par rapport à un modèle multilinéarité parfait. - L'étude du pourcentage de variance des données de fluorescence expliqué par le modèle. - L'étude de la structure des résidus, qui doivent être 20 aléatoires. - L'étude de la structure des scores (vecteur A) en termes de cohérence de l'évolution des scores par rapport à ce qui est attendu de l'application de la transformation sur le lot d'échantillons d'étalonnage. - La répétabilité et la reproductibilité des scores, etc. 25 Le modèle PARAFAC ainsi construit est appliqué à la MEE de chaque nouvel échantillon à caractériser ou, plus généralement, aux MEE de plusieurs échantillons à caractériser en même temps, assemblées pour former un cube de données. Les nouveaux scores sont calculés sur la base des vecteurs 30 « loadings » B et C du modèle comme suit: Anouveau = (B c)+ * Xnouveau ; où l'exposant + indique l'inverse généralisé du produit tensoriel et Xnouveau les données spectrales concaténées et prétraitées des nouveaux échantillons. La décomposition PARAFAC peut être considérée comme une technique de réduction dimensionnelle des données spectroscopiques. Avant la décomposition, chaque échantillon est identifié par 3x1515=4545 valeurs d'intensité spectrale ; il peut donc être représenté par un point dans un espace à 4545 dimensions. Après, chaque échantillon est identifié par les F valeurs des scores : il est donc représenté par un point (référence PE sur la figure 7) dans un espace de petites dimensions. En effet, F pourra être choisi aussi petit que 1 ou 2. D'autres méthodes d'analyse multivariée ou multivoies peuvent être utilisées à la place de la décomposition PARAFAC. On peut mentionner, à titre d'exemple non limitatif, l'analyse par composantes principales, ou PCA une régression par composantes principales (PCR) ; une régression par moindres carrés partiels (PLS) ou, mieux, une analyse discriminante par moindres carrés partiels (PLS-DA). La méthode PLS-DA présente l'avantage de prendre en considération la connaissance préalable des différents groupes d'échantillons ayant subi des traitements similaires, ce qui permet d'en optimiser la séparation. Dans le cas de l'analyse ou régression par composantes principales, les coordonnées des points PE ne seront pas données par des « scores », mais par des « composantes principales ». Quelle que soit la méthode d'analyse statistique utilisée, les échantillons de référence forment un nuage de points dans cet espace de dimensions réduites. Ce nuage de points permet de déterminer une « cible », ayant notamment la forme d'un intervalle (à 1 dimension), cercle (à 2 dimensions), sphère (à 3 dimensions) ou hyper-sphère (à plus de 3 dimensions). La figure 7 montre un exemple où le nombre de dimensions est égal à 2 ; la cible Cl est un cercle caractérisé par son centre Cc, (le centroïde ou barycentre du nuage de points ou, à une dimension, sa médiane) et son rayon Ru. Ce rayon peut et particulier être défini par l'intervalle de confiance des points de référence, ou par la distance entre le centre et le point le plus éloigné. Le nombre N de dimensions utilisées peut être compris, par exemple, entre 1 et 10 et de préférence entre 1 et 5. Pour chaque point PE, correspondant à un échantillon à caractériser, il est possible de déterminer une distance D de la cible (distance mesurée en fonction du centre de la cible ou de sa périphérie, selon le mode de réalisation considéré). La distance D peut être la distance euclidienne ordinaire cependant, dans le cas d'une factorisation PARAFAC il est préférable d'utiliser une distance de Mahalanobis, qui prend en compte la non parfaite indépendance des « coordonnées » définies par les facteurs PARAFAC. En tout cas, c'est cette distance qui permet de quantifier la fraîcheur et/ou la naturalité de l'échantillon. La figure 8 illustre l'application d'un procédé selon l'invention à la détermination de la naturalité du lait soumis à différents traitements thermiques. Ces échantillons ont été exposés successivement à trois rayonnements d'excitation à 280, 340 et 429 nm. Chacun des trois spectres de fluorescence est constitué de 1515 valeurs d'intensité spectrale pour autant de longueurs d'ondes différentes. La résolution spectrale est de 0,25 nm/pixel, mais elle pourrait être divisée par 5, voire plus, sans dégradation des résultats du procédé de l'invention. Les spectres sont prétraités par suppression de la diffusion de Rayleigh par application d'un modèle GLZ, concaténé, normalisés avec la méthodes SNV ; puis un modèle ACP est construit à partir des spectres prétraités, et la composante principale mettant mieux en évidence la différence entre les différents groupes d'échantillons, correspondant à différents traitements subis par le lait, a été choisie (dans ce cas, il s'agit de la le composante principale, expliquant environ 65% de la variabilité des échantillons). Des statistiques descriptives (valeurs minimales et maximales, médianes, valeurs du 1er et du 3e quartile, distance entre les centroïdes des groupes) des différents groupes sont calculées sur les scores de cette composantes principales. Ces statistiques permettent de déterminer si les groupes sont effectivement séparés, c'est à dire si la distance entre leurs médianes est significative. Sur la figure 8, les échantillons de référence, Ref, correspondent à du lait cru. D'autres échantillons ont été soumis à pasteurisation (groupe G1) ; traitement UHT direct (G2), UHT indirect (G3) et stérilisation (G4). Les échantillons (ou, plus précisément, leurs spectres de fluorescence) ont été projetés dans un espace à une seule dimension. On peut voir que les groupes G1 - G4 correspondent à une naturalité décroissante, comme on pouvait s'y attendre. Les rectangles encadrent 95% de la variabilité de chaque groupe. L'échelle sur la gauche du graphique de la figure 8 indique la « perte de naturalité », qui est proche de 0% pour les échantillons de lait cru (altération minimale) et de 100% pour ceux de lait stérilisé (forte altération). Le point PE correspond à un échantillon de lait microfiltré. La perte de naturalité (22,2%) est sensiblement la même que pour le lait frais pasteurisé, malgré l'absence de chauffage. Cela s'explique par le fait que, dans le lait microfilitré, la matière grasse est stérilisée. Les figures 9A et 9B illustrent l'application d'un procédé selon un autre mode de réalisation de l'invention à la détermination de la naturalité 20 du jus d'orange. On a considéré : ^ des échantillons de référence (Ref) de jus d'orange frais ; ^ des échantillons G1 de jus d'orange frais, chauffé à 100°C puis laissé refroidir ; ^ des échantillons G2 d'un jus du commerce, d'une marque 25 M1, 100% pur jus avec pulpe, soumis à pasteurisation flash, vendu au rayon frais ; ^ des échantillons G3 d'un jus à base de concentré, longue conservation, de cette même marque M1 ; ^ des échantillons G4 d'un jus du commerce, d'une marque 30 M2, 100% pur jus sans pulpe, soumis à pasteurisation flash, vendu au rayon frais ; ^ des échantillons G5 d'un jus du commerce, d'une marque M3, 100% pur jus sans pulpe, à teneur garantie en vitamine C, à longue conservation. Des spectres de fluorescence ont été acquis et prétraités de la même manière que pour l'exemple précédent. Une analyse par composantes principales a été effectuée, et les trois premières composantes principales PC1, PC2 et PC3 ont été prises en considération. La le composante principale PC1 explique 65,83% de la variabilité des échantillons ; la 2e composante principale PC2 explique 22,69% de la variabilité et la 3e composante PC3 seulement 5,08%. La figure 9A montre une représentation PC1/PC2, et la figure 9B une représentation PC1/PC3. On voit que cette deuxième représentation sépare mieux les différents groupes. Sur cette figure 9B on remarque : ^ que le simple réchauffement, même à 100°C, du jus d'orange n'a que peu d'impact sur sa naturalité, mesurée par la signature spectrale de fluorescence (les échantillons G1 sont les plus proches de la référence) ; ^ que, au contraire, l'addition de pulpe améliore la naturalité des jus (les échantillons G2 - frais avec pulpe - sont sensiblement plus 20 proches de la référence que ceux de G4, frais sans pulpe); et ^ que les jus frais présentent une plus grande naturalité que ceux à longue conservation (les échantillons G2 et G4, frais, sont plus proches de la référence que ceux de G3 et G5, à longue conservation). L'authenticité et/ou la conformité d'un produit sont des 25 paramètres binaires : le produit est authentique ou ne l'est pas ; est conforme ou ne l'est pas. Ces paramètres peuvent être déterminés en comparant la distance D de l'échantillon du centroïde de la cible à un seuil. Par exemple, ce seuil peut être égal à Rc, : l'échantillon est considéré authentique/conforme si son point représentatif PE se trouve à l'intérieur de la cible, falsifié/non- 30 conforme s'il s'en trouve à l'extérieur. REVENDICATIONS1. Procédé de caractérisation d'un échantillon (E) d'un produit agroalimentaire caractérisé en ce qu'il comporte : a) l'éclairage dudit ou de chaque échantillon à analyser (E) par une pluralité de rayonnements lumineux d'excitation à des longueurs d'onde respectives ; b) l'acquisition de spectres de fluorescence naturelle (F280, F340, F429) dudit ou de chaque échantillon, correspondant chacun à un rayonnement lumineux d'excitation respectif ; 10 c) l'application auxdits spectres d'un procédé d'analyse multivariée ou multivoies fournissant un nombre N de variables représentatives dudit ou de chaque échantillon, de telle sorte que ledit ou chaque échantillon puisse être représenté par un point dans un espace à N dimensions ; 15 d) le calcul d'une distance (D), dans ledit espace à N dimensions, entre le point représentant ledit ou chaque échantillon et une cible (CI) représentant un ou plusieurs échantillons de référence ; et e) la détermination d'une caractéristique dudit ou de chaque échantillon en fonction de ladite distance. 20 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite caractéristique est choisie parmi un indicateur de naturalité, un indicateur de fraîcheur, un indicateur d'authenticité et un indicateur de conformité. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le nombre N de variables représentatives dudit ou de chaque 25 échantillon est compris entre 1 et 10 et de préférence entre 1 et 5. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit procédé d'analyse multivariée ou multivoies est choisi parmi une analyse par composantes principales, ou PCA ; une régression par composantes principales, ou PCR ; une régression par moindres carrés 30 partiels, ou PLS une décomposition PARAFAC. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite distance est choisie parmi une distance euclidienne et une distance de Mahalanobis. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans 5 lequel ladite étape b) consiste à acquérir des spectres de fluorescence frontale. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes comportant également, entre lesdites étapes b) et c), une étape b') de prétraitement des spectres de fluorescence acquis par soustraction d'une 10 contribution due à la diffusion Rayleigh du premier ordre du rayonnement lumineux d'excitation, ladite contribution étant calculée au moyen d'un modèle linéaire généralisé. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le nombre de rayonnements lumineux d'excitation, et de spectres de 15 fluorescence correspondants pour chaque échantillon, est compris entre deux et six, et de préférence entre 3 et 5. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'écart spectral moyen entre lesdits rayonnements lumineux d'excitation est d'au moins 20 nm, et de préférence d'au moins 50 nm, sur une plage 20 spectrale d'au moins 100 nm. 10. Appareil d'analyse spectroscopique d'au moins un échantillon comportant : - un ensemble de sources lumineuses (SI, S2, S3) pour éclairer ledit ou chaque échantillon à analyser (E) par des rayonnements 25 lumineux d'excitation respectifs, présentant des longueurs d'onde différentes; - un moyen d'acquisition (M, D) des spectres de fluorescence frontale émis par ledit ou de chaque échantillon lorsqu'il est éclairé par lesdits rayonnements lumineux d'excitation ; et un moyen de traitement (MTD) des spectres de 30 fluorescence acquis, adapté pour mettre en oeuvre un procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 1011 Appareil d'analyse spectroscopique selon la revendication 10 comportant entre deux et six, et de préférence entre trois et cinq, desdites sources lumineuses, avec un écart spectral moyen d'au moins 20 nm sur une plage spectrale d'au moins 100 nm . 12. Appareil selon la revendication 11 comportant : - une première source lumineuse (SI) émettant un rayonnement à une longueur d'onde comprise entre 270 et 300 nm ; une deuxième source lumineuse (S2) émettant un rayonnement à une longueur d'onde comprise entre 300 et 360 nm ; et une troisième source lumineuse (S3) émettant un rayonnement à une longueur d'onde comprise entre 400 et 500 nm. 15