Brevet FR2977893A1 — publié le 20130118

PROCEDE DE PREPARATION D'UN CONCENTRE D'IMMUNOGLOBULINES POLYVALENTES La présente invention concerne un procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes en vue d'une utilisation thérapeutique. Les immunoglobulines (Ig) sont synthétisées par les lymphocytes B et les plasmocytes, qui se distribuent dans le plasma, les liquides extravasculaires et les sécrétions. Elles sont divisées en 5 catégories, isotypes ou classes, sur la base de leur structure protéique: IgG, IgA, IgM, IgE et IgD. Leur répartition naturelle dans le corps humain est la suivante: IgG : 75%, IgA : 20%, IgM : 5% et Les immunoglobulines polyvalentes d'origine humaine et pharmaceutiquement utilisées sont composées à 97% d'IgG correspondant à la présence d'une grande diversité d'anticorps contre divers agents infectieux. L'utilisation de fractions de plasma humain enrichies en immunoglobulines polyvalentes pour le traitement de diverses infections ou déficiences congénitales est connue pour son effet thérapeutique. Les immunoglobulines polyvalentes ou normales sont administrées pour corriger un déficit immunitaire primitif et certains déficits secondaires (leucémies, myélomes ou infections récidivantes). Elles sont à dissocier des anticorps spécifiques (Anticorps cytotoxiques anti-rhésus ou anti-D). Elles peuvent être prescrites à doses très élevées, jusqu'à 2 g/kg/jour, pour freiner l'évolution de certaines maladies, dont la physiopathologie est mal connue, mais comporte une composante de type immunitaire. L'administration d'immunoglobulines polyvalentes a montré son efficacité, au moins transitoire, dans le traitement de la thrombocytopénie d'origine immunologique, appelée aussi purpura thrombogénique idiopathique. Les immunoglobulines polyvalentes peuvent également avoir un effet bénéfique dans le traitement du syndrome de Guillain-Barré, R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc des polyneuropathies démyélinisantes, de la sclérose en plaques, du syndrome myasthénique de Lambert-Eaton, des dermatomyosites. Les immunoglobulines polyvalentes contiennent diverses molécules si bien 5 que leur mécanisme d'action est complexe : en intervenant à plusieurs niveaux, elles modifient l'équilibre immunitaire du patient et peuvent ainsi avoir un effet bénéfique. Plusieurs procédés de préparation de concentrés d'immunoglobulines polyvalentes sont déjà connus de l'homme du métier. Le procédé de préparation le 10 plus connu comprend plusieurs étapes de précipitation à l'éthanol (Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459). Le brevet EP 0703 922 (Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, « Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et 15 procédé de production dudit concentré ») décrit en particulier un procédé de production d'un concentré d'immunoglobulines G à partir de plasma humain ou de surnageant de plasma cryoprécipité. Ce procédé ne comprend pas de précipitation à l'éthanol et comprend une succession d'étapes de chromatographie et une étape d'inactivation virale par solvant/détergent. Cette méthode ne permet que de donner 20 un rendement relativement faible, à cause de la succession d'étapes de chromatographie, 1 e procédé décrit incluant en effet deux cycles d'échangeur anionique et cationique en tandem ainsi que deux étapes d'ultrafiltration. Le brevet EP 1 385 886 (Laboratoire Français du Fractionnement et des 25 Biotechnologies, «Procédé de préparation de concentrés d'immunoglobulines humaines à usage théarapeutique ») décrit un procédé de préparation de concentrés d'immunoglobulines humaines comprenant une prépurification par précipitation de contaminants lipidiques et protéiques et une étape unique de chromatographie effectuée sur un échangeur d'anions à pH alcalin. Cette méthode permet d'obtenir 30 jusqu'à 4g d'immunoglobulines par litre de plasma initialement traité. Néanmoins, les indications thérapeutiques des immunoglobulines s'étant multipliées, il existe un besoin important d'augmenter le rendement de la production R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc d'immunoglobulines, tout en s'assurant que le produit final présente une pureté élevée et soit dépourvu de contaminants viraux. Par conséquent, la présente invention a pour objet un procédé de 5 préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines avec un rendement supérieur par rapport aux procédés connus de l'homme du métier. L'invention concerne ainsi un procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines à partir d'une solution initiale de plasma 10 sanguin ou d'une fraction de plasma enrichie en immunoglobulines, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) une étape d'élimination des contaminants protéiques par l'acide caprylique pour obtenir une solution dépourvue de protéases, (b) une étape de chromatographie en lit fluidisé de la solution dépourvue de 15 protéases, ledit procédé permettant d'obtenir un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines avec un rendement supérieur à 4,5 g d'immunoglobulines/litre de solution initiale de plasma sanguin ou de fraction de plasma enrichie en immunoglobulines. 20 L'invention repose sur la constatation que la combinaison d'une étape d'élimination des contaminants protéiques par l'acide caprylique avec une étape de chromatographie en lit fluidisé permet d'augmenter de façon surprenante le rendement de la production d'immunoglobulines. 25 De façon avantageuse, l'invention repose sur la combinaison d'une étape ménagée d'élimination des contaminants protéiques par l'acide caprylique à pH acide suivie d'une clarification à pH acide du surnageant permettant la fixation des immunoglobulines sur un gel de chromatographie mis en oeuvre dans une colonne fluidisée (gel de type échangeur anionique et/ou de pseudo-affinité, de préférence de 30 type mode-mixte), ce qui permet d'augmenter le rendement de la production d'immunoglobulines polyvalentes. De façon préférentielle, la productivité peut être augmentée si les conditions d'élution des immunoglobulines polyvalentes du gel de chromatographie permettent une compatibilité directe avec les étapes suivantes du R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc procédé sans étape de formulation par des techniques de types dialyse ou ultrafiltration. De façon particulière, le procédé selon l'invention permet d'obtenir un gain de productivité de 0,25% d'immunoglobulines polyvalentes par litre de plasma et un produit final ayant une pureté élevée (99%). Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend entre l'étape d'élimination de contaminants protéiques par l'acide caprylique (a) et l'étape de chromatographie en lit fluidisé (b), une étape de clarification à pH acide, de préférence par filtration en profondeur. Les étapes d'élution seront avantageusement définies afin d'extraire sélectivement les immunoglobulines de type G (IgG). L'invention concerne également un procédé de préparation d'un concentré 15 d'immunoglobulines polyvalentes humaines à partir d'une solution initiale de plasma sanguin ou d'une fraction de plasma enrichie en immunoglobulines, caractérisé en ce qu'il comprend : (a') une étape d'élimination des contaminants protéiques par l'acide caprylique à pH acide pour obtenir une solution dépourvue de protéases, (b') une étape de clarification à pH acide, (c') une étape de chromatographie en lit fluidisé de la solution dépourvue de protéases, (d') une élution dans un tampon permettant par simple dilution et ajustement du pH la suite du procédé de purification des immunoglobulines. De façon particulière, l'étape (b') de clarification sera réalisée par une filtration en profondeur se basant sur une porosité la plus élevée possible mais 30 autorisant le passage du surnageant clarifié sur une colonne en lit fluidisé. L'invention concerne également le procédé tel que décrit ci-dessus et intégrant après l'étape (b') une étape de remontée de pH, correspondant au R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc 10 20 25 conditionnement des immunoglobulines polyvalentes permettant la fixation de ces dernières sur un gel de chromatographie mis en oeuvre en mode fluidisé. On entend par « immunoglobulines polyvalentes » dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines entières, ou des fragments d'immunoglobulines, tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication. On entend par « fraction de plasma», toute solution sanguine obtenue après un traitement qui permet de séparer ou fractionner du plasma sanguin humain naturel, notamment toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes. On entend par « fraction de plasma enrichie en immunoglobulines », une 15 fraction de plasma contenant un taux d'immunoglobulines supérieur à celui contenu dans du plasma humain naturel. On entend par « contaminants protéiques » toutes les protéines autres que les immunoglobulines de type G, par exemple et de façon non limitative, les 20 immunoglobulines de type A, E ou M ainsi que les autres protéines plasmatiques telles que, de façon non limitative : - l'albumine, la transferrine, l'a2-macroglobuline, le plasminogène etc..., - les facteurs de la coagulation tels que, de façon non limitative, le FX, FXI, ou le FXII, 25 - les protéases telles, de façon non limitative, la kallikréine, la prékallikréine, ou l'activateur de la Prékallikréine, et - les hémagglutinines anti A et B. On entend par « chromatographie en lit fluidisé » : une technique qui par 30 application d'un débit dans le sens inverse de la gravité sur des billes de chromatographie de densité élevée permet de ménager un espace entre celles-ci permettant ainsi le passage dans la colonne de chromatographie d'une solution faiblement clarifiée sans engendrer de colmatage du flux de solution. Les R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc chromatographies en lit fluidisé peuvent être des chromatographies de type échange d'ions, de « pseudo-affinité », ou de type « mode mixte » (c'est-à-dire à la fois échange d'ions et pseudo-affinité). De façon particulière, la chromatographie en lit fluidisé est réalisée avec le gel UpFront IVIG de type mode-mixte comprenant la présence sur les billes d'un ligand chimique combinant des charges électrostatiques et des groupements hydrophobes conférant une pseudo-affinité spécifique pour les immunoglobulines. La concentration d'acide caprylique utilisée dans le procédé selon l'invention doit être ménagée, c'est-à-dire suffisamment faible de manière à ne pas piéger d'immunoglobulines polyvalentes lors de la précipitation des autres constituants de la solution. Il est recommandé que cette concentration en acide caprylique aille de 0,5 à 1,5 %, notamment de 0,8 à 1,2 %, particulièrement de 0,9 à 1,1 % (le pourcentage en acide caprylique correspond à des grammes d'acide caprylique par volume de solution à traiter). La demanderesse a constaté de façon surprenante que la concentration d'acide caprylique mise en oeuvre dans un procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes influence directement le rendement du procédé. Si la concentration en acide caprylique est trop faible, la précipitation sera imparfaite (en particulier une partie importante de lipides reste en solution) et la clarification sera très difficile. Par contre, si la concentration en acide caprylique est trop forte, les immunoglobulines polyvalentes seront piégées dans le précipité formé et ne seront plus disponibles dans le surnageant après clarification. Dans un mode de réalisation, une étape de clarification par filtration en profondeur doit être ajoutée entre l'étape d'élimination des contaminants protéiques par l'acide caprylique et l'étape de chromatographie en lit fluidisé. Cette clarification doit être réalisée de manière à ne retenir que les plus grosses particules pouvant gêner le fonctionnement du lit fluidisé. De préférence, les filtres clarifiants de type SEITZ T5500 seront utilisés à cette étape et plus particulièrement le filtre T2600. Tout type de filtre, chargé ou non, permettant une clarification équivalente peut être R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc utilisé. La clarification sera avantageusement réalisée en présence de terres de filtration, permettant ainsi de réduire la surface de filtre à utiliser. Afin d'augmenter la température de la solution à fluidifier, il est avantageux de réaliser l'invention entre 4 et 30 °C, plus particulièrement entre 10 et 25°C, par exemple entre 20 et 25°C. De façon avantageuse, le filtre utilisé dans l'étape de clarification selon l'invention a une capacité d'au moins 40 litres par m . A l'issue de la filtration profondeur le pH et l'osmolalité du surnageant de filtration sont avantageusement ajustés sans étape de dialyse ou d'ultrafiltration, en 10 fonction des besoins de l'étape suivante du procédé. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de chromatographie en lit fluidisé peut être une chromatographie de pseudo affinité de type mode-mixte qui comprend : 15 - la charge sur une colonne de chromatographie préalablement équilibrée avec un tampon à un pH compris entre 4,5 et 7, plus particulièrement entre pH 4,5 et 7,5 ; 4,5 et 7,0 ; 4,5 et 6,8 ; 4,5 et 6,5 ; 5,0 et 7,0 ; 5,0 et 6,5 ; 5,5 et 6,3 ; ou 5,7 et 6,3 ; de la solution ayant subi l'étape de clarification par filtration en profondeur préalablement ajustée au même 20 pH, c'est-à-dire à un pH compris entre 4,5 et 7, plus particulièrement entre 4,5 et 7,5 ; 4,5 et 7,0 ; 4,5 et 6,8 ; 4,5 et 6,5 ; 5,0 et 7,0 ; 5,0 et 6,5 ; 5,5 et 6,3 ; ou 5,7 et 6,3, - le lavage de la susdite colonne par une solution tampon jusqu'à élimination de toutes les protéines non adsorbées sur la colonne, 25 - l'élution des immunoglobulines polyvalentes adsorbées sur la colonne par un tampon d'élution ajusté à pH compris entre 8 et 10, de préférence entre 8 et 9,8 ; 8,3 et 9,8 ; 8,5 et 9 ,8 ; 8,8 et 9,8 ; 9,0 et 9,8 ; 9,5 et 9,8, et - la récupération de la solution enrichie en immunoglobulines polyvalentes humaines. 30 La chromatographie de type mode-mixte en lit fluidisé mise en oeuvre dans l'invention utilise, de préférence, des billes ayant des tailles différentes, ce qui permet de stabiliser le lit de chromatographie. Les billes mises en oeuvre dans la R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc chromatographie de type mode-mixte en lit fluidisé selon l'invention ont une densité moyenne de 2,5 à 3,5 kg/L, un diamètre compris entre 20 et 400 µm et une capacité de fixation des immunoglobulines polyvalentes dans les conditions de l'invention pouvant avantageusement dépasser 70 g/L. L'élution mis en oeuvre dans la chromatographie en lit fluidisé avec ce gel d'affinité est par exemple une élution à pH basique et à faible force ionique afin de pouvoir enchaîner directement l'étape suivante du procédé, après avoir procédé à des ajustements simples en pH et en conductivité . Un tampon d'élution utilisable dans le cadre de l'invention peut par exemple contenir : Glycine de 5 à 500 mM, notamment 20mM, et NaCl de 5 à 500 mM, notamment 20 mM, à pH compris entre 7 et 10, notamment compris entre 9 et 10 et de façon plus intéressante entre pH 9,5 et 9,8. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention 15 comprend en outre, après l'étape de chromatographie en lit fluidisé, une ou plusieurs des étapes suivantes : (i) une étape d'inactivation virale (ii) une étape de chromatographie d'échange d'anions de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente ayant pour but d'éliminer les composants chimiques utilisés lors de l'étape d'inactivation virale et de réduire la contamination en IgA et IgM. (iii) une étape d'élimination d'anticorps anti-A et anti-B de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, (iv) une étape de filtration au travers de filtres nanométriques de porosité décroissante de 100 à 15 nm., (v) une étape de concentration par ultrafiltration de la solution issue de l'étape précédente associée à une étape de formulation, (vi) une étape de filtration stérilisante conventionnelle. 30 Le concentré d'immunoglobulines polyvalentes obtenu selon le procédé de l'invention a généralement subi au moins une étape d'élimination ou d'inactivation d'au moins un agent infectieux. Parmi les agents infectieux, on peut citer les virus et les ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme le prion. Une R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc 20 25 inactivation virale comprend souvent un traitement avec des produits chimiques, par exemple par solvant, et/ou détergent et/ou par la chaleur, par exemple par UVC, irradiation Gamma, et/ou pasteurisation. Une nanofiltration est aussi utile pour éliminer un agent infectieux, notamment les virus. De préférence le procédé comprend au moins un traitement par solvant et détergent, et une nanofiltration. Le traitement par solvant et/ou détergent (appelé généralement traitement solvant/détergent) comprend notamment le traitement par tri-n-butylphosphate et/ou un détergent qui est choisi parmi le Triton X-100, Tween (de préférence Tween 80) et cholate sodium. La nanofiltration se réfère généralement à la filtration du concentré d'immunoglobulines polyvalentes à travers un filtre avec une taille de pores inferieure a 80 nm. Des filtres disponibles sont par exemple les filtres BioEx, Planova TM 75 nm, Planova TM 35 nm, Planova TM 20 nm ou PlanovaTM 15 nm (Asahi corporation), Ultipor DV 50 or DV 20 (Pall corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR ou NFP (Millipore). De préférence une nanofiltration est réalisée avant l'étape (v) d e concentration des immunoglobulines polyvalentes par ultrafiltration associée à une étape de formulation. Dans un mode de réalisation particulier, le concentré d'immunoglobulines polyvalentes purifié est filtré sur une séquence de filtres avec une taille de pores entre 15 et 50 nm, par exemple de 20 ou 35 nm. La chromatographie d'échange d'anions mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est effectuée à pH alcalin et faible force ionique pour permettre la fixation des immunoglobulines polyvalentes. Cette étape est réalisée par exemple selon le procédé décrit dans le brevet EP 1 385 886 (Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, «Procédé de préparation de concentrés d'immunoglobulines humaines à usage thérapeutique »). La résine est équilibrée par tout tampon ayant un pouvoir tampon à faible concentration pour des pH compris entre 8,5 et 9,5, tel que les tampons Tris ou plus particulièrement glycine. La concentration en glycine peut être comprise entre 5 et 50 mM, par exemple entre 5 et 20 mM et plus particulièrement entre 8 et 10 mM. Le pH sera ajusté entre 8,5 et 9,5 et plus particulièrement entre 8,9 et 9,1. R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc De façon avantageuse, l'éluat est dilué et ajusté en pH de manière à permettre la fixation des immunoglobulines polyvalentes sur le support. Cette dilution est effectuée avec de l'eau de façon à amener la conductivité sous une valeur de 1500 µS/cm et plus préférablement sous 1100 µS/cm. La colonne est lavée dans le tampon d'équilibrage puis les immunoglobulines polyvalentes sont éluées en tampon Na/Na2 PO4 20 mM à pH 6,2. Enfin la colonne est lavée avec une solution de NaCl à 150 mM. L'élimination d'anticorps anti-A et anti-B dans la solution obtenue à partir de la chromatographie d'échange d'anions peut être effectuée selon la méthode décrite dans la demande de brevet WO 2007/077365 (Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, « Concentré d'immunoglobulines G (IgG) appauvri en anticorps anti-A et anti-B et en IgG polyréactives »). La solution obtenue à l'étape précédente est soumise à une étape d'élimination des anticorps anti-A et anti-B par chromatographie d'immunoaffinité par percolation dudit concentré d'immunoglobulines polyvalentes sur un mélange de supports dont les matrices sont greffées de groupes oligosaccharides antigéniquement similaires aux groupes sanguins A et B. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la solution de départ est une fraction de plasma enrichie en immunoglobulines par des méthodes bien connues de l'homme du métier et notamment par fractionnement éthanolique et/ou par séparation chromatographique, puis remise en solution dans un tampon. Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne un procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines, comprenant : (i) une étape d'élimination de contaminants protéiques par l'acide caprylique, (ii) une étape de clarification par filtration en profondeur, (iii) une étape de chromatographie en lit fluidisé, de type mode mixte; (iv) une étape d'inactivation virale par traitement solvant/détergent, (v) une étape de chromatographie d'échange d'anions, (vi) une étape d'élimination des anticorps anti-A et anti-B, R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc (vii) une filtration au travers de filtres nanométriques de porosité décroissante de 100 à 15 nm (viii) une étape de concentration par ultrafiltration de la solution issue de l'étape précédente associée à une étape de formulation, puis une étape de filtration stérilisante conventionnelle. Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne un procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines, comprenant : (i) le traitement d'une solution initiale de plasma sanguin ou d'une fraction de plasma par l' éthanol, pour obtenir un précipité « I+II+III » ou «II+III », selon la méthode de Cohn (déjà cité) ou de Kistler et Nitschmann (1962, Vox Sang. 7, 414), (ii) la remise en solution du précipité « I+II+III » ou « II+III » avec de l'eau, sous agitation, à 20°C (préférentiellement 4 à 15°C). Différents ions peuvent être apportés afin de faciliter la remise en solution des immunoglobulines polyvalentes précipitées, (iii) la précipitation à partir du précipité « I+II+III » ou « II+III » remis en solution, de contaminants protéiques par l'acide caprylique à une concentration de 0,5 à 1,5%, notamment de 0,8 à 1,2%, particulièrement de 0,9 à 1,1%, pour obtenir une solution plasmatique dépourvue de protéases, puis ajustement du pH entre 4,3 et 4,9, préférablement entre 4,6 et 4,8, (iv) la filtration de la solution plasmatique dépourvue de protéases issue de l'étape (iii) à pH acide par un filtre ayant la porosité la plus large possible permettant l'injection du filtrat sur une colonne de chromatographie utilisée en mode lit fluidisé, (v) un ajustement du pH et de l'osmolalité de la solution issue de l'étape (iv), (vi) une chromatographie en lit fluidisé de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, pour obtenir une solution sanguine enrichie en immunoglobulines polyvalentes humaines. De façon avantageuse, ladite chromatographie doit permettre une élution des R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc 5 10 15 20 25 30 immunoglobulines polyvalentes dans un tampon proche du tampon nécessaire aux étapes suivantes du procédé, afin de limiter les pertes d'immunoglobulines polyvalentes qui pourraient être dues à une étape de dialyse, d'ultrafiltration ou toute étape nécessaire à la reformulation de la solution, (vii) le traitement par solvant/détergent comprenant notamment le traitement par tri-n-butylphosphate et/ou un détergent qui est choisi parmi le Triton X-100, le Tween (de préférence Tween 80) et le cholate de sodium, pour inactiver des virus dans la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, (viii) la chromatographie d'échange d'anions de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, utilisant un gel de polysaccharide réticulé ou de polymère vinylique, greffé de groupements TMAE afin d'éliminer les solvants et détergents utilisés à l'étape précédente et de retirer des contaminants de type IgA et IgM, (ix) la chromatographie d'affinité telle que décrite dans la demande de brevet WO 2007/077365 (Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, « Concentré d'immunoglobulines G (IgG) appauvri en anticorps anti-A et anti-B et en IgG polyréactives ») pour éliminer les anticorps anti-A et anti-B de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, (x) la nanofiltration de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, utilisant un préfiltre de porosité 50 (par exemple sur un filtre PALL DV20) ou 35 nm (par exemple sur un filtre PLANOVA 35 N), suivie d'un filtre de porosité 20 (par exemple un filtre PLANOVA 20 N) ou 15 nm (par exemple un filtre PLANOVA 20 N ou BIOEX) pour éliminer des prions ou des virus résistants au traitement de l'étape (ix), (xi) la concentration ou diafiltration de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, pour obtenir une solution contenant au moins 50g/L d'immunoglobulines polyvalentes. R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique d'immunoglobulines polyvalentes humaines congelée ou lyophilisée, caractérisée en ce que : a. l'on additionne à un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines, obtenu selon le procédé décrit dans l'invention, un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables, et b. l'on congèle ou lyophilise la préparation obtenue à l'étape précédente. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition pharmaceutique d'immunoglobulines polyvalentes humaine congelée ou lyophilisée pour le traitement de pathologies, telles que les polyneuropathies démyélinisantes, la sclérose en plaques , le syndrome myasthénique de Lambert-Eaton, les dermatomyosites, pour le traitement substitutif dans le cas de déficits immunitaires primitifs t e l s que les agammaglobulinémies congénitales et les hypogammaglobulinémies congénitales, le déficit immunitaire commun variable, le déficit immunitaire combiné sévère, le syndrome de Wiskott Aldrich, le myélome ou la leucémie lymphoïde chronique avec hypogammaglobulinémie secondaire sévère et infections récurrentes, les infections récurrentes chez l'enfant infecté par le VIH , ou pour le traitement de déficits immunitaires primitifs avec hypogammaglobulinémie ou atteinte fonctionnelle de l'immunité humorale. La présente invention comprend également l'utilisation de la composition pharmaceutique d'immunoglobulines polyvalentes humaines congelée ou lyophilisée de l'invention pour le traitement de déficits immunitaires secondaires de l'immunité humorale, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou le myélome avec hypogammaglobulinémie et associés à des infections à répétition, l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques avec hypogammaglobulinémi e a ssociée à une infection, ainsi que le traitement immunomodulateur du purpura thrombopénique idiopathique (PTI) chez l'adulte et l'enfant en cas de risque hémorragique important ou avant un acte médical ou chirurgical pour corriger le taux de plaquettes, de la rétinochoroïdite de Birdshot, du syndrome de Guillain-Barré, de la neuropathie motrice multifocale (NMM), des polyradiculonévrites inflammatoires démyélinisantes chroniques (PIDC), et de la maladie de Kawasaki. R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc Les exemples suivants décrivent des modes de réalisation du procédé selon l'invention. Les exemples ci-dessous visent à éclairer l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas ne visent à restreindre la portée de l'invention. Exemple 1 1.1 Remise en solution du précipité « I+II+III » On utilise comme matériel de départ le précipité « I+II+III » obtenu à partir de plasma sanguin fractionné à l'éthanol selon la méthode de Cohn ou de Kistler et Nistschmann (1962, Vox Sang. 7, 414). Ce précipité est remis en solution à raison de 56,7 g pour 228 ml d'eau déminéralisée ou proportions équivalentes. Agitation du mélange pendant 20 minutes à 15°C ± 5°C. Puis la température est remontée à 22°C ± 2°C et l'acide caprylique (1% poids/volume) est ajouté lentement dans le précipité I+II+II remis en solution. Le pH de la solution obtenue après l'addition d'acide caprylique est ajusté à 4,8 et la solution reste en agitation pendant 60 minutes. 1.2 Filtration en profondeur La remise en solution est clarifiée par une filtration en profondeur sur filtre SEITZ® T 2600 (Pall Corporation). Cette filtration retient à la fois les adjuvants de filtration présents dans le précipité I+II+III et le précipité protéique généré par l'addition d'acide caprylique. Le choix du media filtrant a été de préférence fait après le test de différents filtres en profondeur, sans précipitation caprylique dans un premier temps puis confirmé par la suite avec l'ajout de l'acide caprylique 1% tel que mentionné ci-dessus. Le pH de l'échantillon est également avantageusement étudié pour optimiser le 30 rendement de filtration. Les résultats, dans cet exemple de réalisation, montrent que le pH de la solution protéique doit être ajusté à 6,0 uniquement après la filtration. En effet l'ajustement du pH de 4,8 à 6,0 génère un léger précipité (insolubilité des R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc immunoglobulines polyvalentes) retenu par le filtre et donc une diminution du rendement de filtration en immunoglobulines polyvalentes. Le volume de rinçage du filtre (eau purifiée apyrogène) est également important et doit être de préférence équivalent au volume de l'échantillon de départ afin d'optimiser le rendement final. 1.3 Chromatographie de type mode-mixte en lit fluidisé Les conditions opératoires sont les suivantes : - Tampon d'équilibrage et de lavage : 20mM de Na/Na2PO4 à pH 6. - Tampon d'élution : 20mM Glycine/20mM de NaCl à pH 9,8. Le choix d'une élution par effet de pH dans un tampon Gly/NaC1 permet par simple dilution (ajustement de la conductivité et du pH) d'obtenir un échantillon prêt à être injecté sur la colonne d'échange d'ions (TMAE Fractogel). 1.4 Traitement par solvant/détergent L'éluat de la chromatographie de type mode-mixte en lit fluidisé selon l'exemple 1.3 subit un traitement d'inactivation virale par solvant/détergent comme 20 décrit par Neurath et Horowitz (US 4, 764, 369). Le mélange solvant/détergent 10 fois concentré contient 3% de TnBP (tri(nbutyl)phosphate) et 10% d'Octoxinol. La concentration finale dans l'éluat est de 0,3% de TnBP et 1% d'Octoxinol. Après 1 heure minimum d'inactivation, l'éluat est ajusté à pH 9,0 et dilué en eau 25 pour obtenir une conductivité inférieure à 1100 µS/cm. 1.5 Chromatographie d'échange d'ions Le gel d'échange d'ions mis en oeuvre est le TMAE-Fractogel®, Merck. 30 - Tampon de préeéquilibrage : glycine 80mM / NaC180mM à pH 9. - Tampon d'équilibrage : glycine 9mM / NaC19mM à pH 9. Après la charge de l'échantillon, la colonne est lavée dans le tampon d'équilibrage. R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc Puis elle est éluée en tampon Na/Na2 PO4 20 mM à pH 6,2 et ensuite lavée avec une solution de NaCl à 150 mM. 1.6 Chromatographie d'affinité Le gel d'affinité mis en oeuvre est l'Iso A/Iso B Hypercel, Pall Corporation. L'éluat de la chromatographie TMAE est soumis à cette chromatographie d'affinité, afin d'éliminer les anticorps anti-A et anti-B. L'échantillon traverse la colonne sans être retenu. - Equilibrage du gel en eau déminéralisée - Récupération du non-adsorbé sans lavage de la colonne. 1.7 Filtration La solution protéique issue de la chromatographie d'affinité est filtrée sur un filtre en profondeur 90LA CUNO, 3M puis sur un filtre 0,2 µm. Le rinçage des filtres en eau est incorporé au filtrat. 1.8 Nanofiltration Le filtrat précédent ajusté à pH 4,5 est préfiltré en ligne sur Fluorodyne II 0,1 µm, Pall Corporation et nanofiltré sur filtre DV50, Pall Corporation puis Planova 20N, Asahi. 25 1.9 Formulation Le produit est pré-concentré à environ 80 g/1 par ultrafiltration sur une cassette de seuil de coupure 30 kDa puis diafiltré à volume constant jusqu'à ce que la conductivité soit Trois lots pilote exploratoires ont été réalisés avec trois précipités I+II+III différents selon le procédé selon l'invention décrit dans l'exemple 1. L'élimination des protéases est obtenue avec 1% d'acide caprylique. La filtration est effectuée en filtre-presse sur plaques SEITZ T2600. Un lot pilote témoin est traité selon le procédé de référence, telle que décrit dans EP 1 385 886 (Lot « Clayrig® » ) Les résultats de rendement du nouveau procédé sont montrés dans le tableau ci-dessous : Rendements cumulés en g/L de protéines ou d'Ig de plasma au stade concentré formulé Lot selon Lot « Clayrig® » l'invention 10AXTO1064 015 10AXTO1064 038 Rendement 5,22 4,67 protéines en g. Rendement Ig 4,75 4,49 poly Le procédé selon l'invention permet d'augmenter le rendement en g d'immunoglobulines polyvalentes par litre de plasma traité, par rapport au procédé de référence (EP 1 385 886). Le gain dans l'exemple ci-dessus est de 0,26 g d'IgG/1 de plasma, entre le lot selon 20 l'invention et le lot 10AXTO1064 038 (Clairyg) réalisé à partir du même précipité. R:\32500\32510 LFB\32510FR110711 - Demande tq déposée.doc REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines à partir d'une solution initiale de plasma sanguin ou de fraction de plasma enrichie en immunoglobulines, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) une étape d'élimination des contaminants protéiques par l'acide caprylique pour obtenir une solution dépourvue de protéases, (b) suivie d'une étape de chromatographie en lit fluidisé de la solution dépourvue de protéases, ledit procédé permettant d'obtenir un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines avec un rendement supérieur à 4,5 g d'immunoglobulines par litre de plasma sanguin mis en oeuvre. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration d'acide caprylique utilisée va de 0,5 à 1,5 %. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend entre l'étape d'élimination de contaminants protéiques par l'acide caprylique (a) et l'étape de chromatographie en lit fluidisé (b), une étape de clarification à pH acide, de préférence par filtration en profondeur. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de chromatographie en lit fluidisé de la solution dépourvue de protéases (b) est effectuée avec un support chromatographique de type échange d'ions, de type affinité, de type « pseudo-affinité » ou de type « mode-mixte ». 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'étape de chromatographie en lit fluidisé de type mode-mixte comprend : - la charge sur une colonne de chromatographie préalablement équilibrée avec un tampon à un pH compris entre 4,5 et 7 de la solution ayant subi l'étape de clarification par filtration en profondeur préalablement ajustée au même pH, - le lavage de la susdite colonne par une solution tampon jusqu'à élimination de toutes les protéines non adsorbées sur la colonne, 1 R:\32500\32510 LFB\32510FR111103 - rev amendées.doc- l'élution des immunoglobulines polyvalentes adsorbées sur la colonne par un tampon d'élution ajusté à pH compris entre 8 et 10, et - la récupération de la solution enrichie en immunoglobulines polyvalentes humaines. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 comprenant en outre, après l'étape (b), une ou plusieurs des étapes suivantes : (i) une étape d'inactivation virale, (ii) une étape de chromatographie d'échange d'anions de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, (iii) une étape d'élimination d'anticorps anti-A et anti-B de la solution obtenue à l'issue de l'étape précédente, (iv) une étape de filtration au travers de filtres nanométriques de porosité décroissante de 100 à 15 nm, (v) une étape de concentration par ultrafiltration de la solution issue de l'étape précédente associée à une étape de formulation, (vi) puis une étape de filtration stérilisante conventionnelle. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la solution de départ est une fraction de plasma enrichie en immunoglobulines par fractionnement éthanolique et/ou par séparation chromatographique, puis remise en solution dans un tampon. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 comprenant : (i) une étape d'élimination de contaminants protéiques par l'acide caprylique, (ii) une étape de clarification par filtration en profondeur, (iii) une étape de chromatographie en lit fluidisé de type mode-mixte, (iv) une étape d'inactivation virale par traitement solvant/détergent, (v) une étape de chromatographie d'échange d'anions, (vi) une étape d'élimination des anticorps anti-A et anti-B, (vii) une filtration au travers de filtres nanométriques de porosité décroissante de 100 à 15 nm, (viii) une étape de concentration par ultrafiltration de la solution issue de l'étape précédente associée à une étape de formulation, puis une étape de filtration stérilisante conventionnelle. R:\32500\32510 LFB\32510FR111103 - rev amendées.doc 9. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique d'immunoglobulines polyvalentes humaine congelée ou lyophilisée, caractérisée en ce que : (a) l'on additionne à un concentré d'immunoglobulines polyvalentes humaines obtenu selon l'une des revendications 1 à 8 un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables, et (b) l'on congèle ou lyophilise la préparation obtenue à l'étape précédente. 10. Utilisation d'une composition pharmaceutique d'immunoglobulines polyvalentes humaines congelée ou lyophilisée obtenue selon le procédé de la revendication 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies comprises dans le groupe consistant en les polyneuropathies démyélinisantes, la sclérose en plaques, le syndrome myasthénique de Lambert-Eaton, les dermatomyosites, un traitement substitutif dans le cas de déficits immunitaires primitifs tels que les agammaglobulinémies congénitales et les hypogammaglobulinémies congénitales, le déficit immunitaire commun variable, le déficit immunitaire combiné sévère, le syndrome de Wiskott Aldrich, le myélome ou la leucémie lymphoïde chronique avec hypogammaglobulinémie secondaire sévère et infections récurrentes, les infections récurrentes chez l'enfant infecté par le VIH , le traitement de déficits immunitaires primitifs avec hypogammaglobulinémie ou atteinte fonctionnelle de l'immunité humorale, le traitement de déficits immunitaires secondaires de l'immunité humorale, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou le myélome avec hypogammaglobulinémie et associés à des infections à répétition, l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques avec hypogammaglobulinémie associée à une infection, le traitement immunomodulateur du purpura thrombopénique idiopathique (PTI) chez l'adulte et l'enfant en cas de risque hémorragique important ou avant un acte médical ou chirurgical, de la rétinochoroïdite de Birdshot, du syndrome de Guillain-Barré, de la neuropathie motrice multifocale (NMM), des polyradiculonévrites inflammatoires démyélinisantes chroniques (PIDC), et de la maladie de Kawasaki. R:\32500\32510 LFB\32510FR111103 - rev amendées.doc