Brevet FR2966604A1 — publié le 20120427

La Fièvre Catarrhale Ovine (FCO) ou Maladie de la Langue Bleue (BT pour « Blue Tongue ») est une maladie virale infectieuse, mais non contagieuse, transmise par certaines espèces de moucherons piqueurs (genre Culicoïdes). Elle est causée par un virus appartenant au genre des Orbivirus (Reoviridae) et couramment appelé « virus de la Bluetongue » ou BTV. Les signes cliniques d'une infection à BTV sont extrêmement variables. Chez le mouton, ils sont généralement aigus et caractérisés par de la fièvre, des lésions buccales, un amaigrissement, une boiterie, avec un taux de mortalité des moutons infectés d'environ 20 à 50% [1, 2]. Les symptômes sont moins apparents chez les bovins et plus de 90% des animaux infectés par le BTV ne présentent pas ou peu de signes cliniques. Cependant, l'infection bovine est un facteur important de l'épizoologie du BTV de part leur fonction de réservoir viral. Présente dans le monde entier sur une large bande couvrant l'Amérique du Nord et du Sud, l'Afrique, l'Asie du sud et l'Australie du nord, la maladie remonte depuis plusieurs décennies vers l'Europe du Sud dans des zones restées jusqu'alors indemnes. Le point de départ fut observé en 1998 avec l'arrivée du BTV-9 en Grèce. Puis des incursions de BTV-8 furent rapportées presque simultanément en Belgique, en France, en Allemagne et en Hollande au mois d'août 2006, conduisant à la plus grande épizootie affectant les troupeaux ovins et bovins jamais enregistrée en Europe. Les raisons de ce changement radical dans l'épidémiologie de la fièvre catarrhale sont complexes mais semblent liées à l'extension du territoire colonisé par son vecteur principal, Culicoides imicola, l'apparition de nouveaux vecteurs de types Culicoïdes ainsi qu'au réchauffement climatique. Maladie strictement animale, la FCO n'affecte pas l'Homme et n'a aucune incidence sur la qualité des denrées mais provoque d'importantes pertes économiques pour les éleveurs et la collectivité [3]. De façon directe, la FCO provoque une réduction de la production par le déclenchement d'avortement chez les femelles infectées ou encore par un retard de croissance, voire le décès des animaux. Ces conséquences économiques sont d'autant plus importantes dans le cas de l'épizootie récente que le sérotype 8 de la maladie s'avère très pathogène pour les races bovines et ovines européennes, notamment pour les bovins. Ainsi, au 1" juillet 2008 en France, la direction générale de l'alimentation (DGLA) évaluait les mortalités à 65000 bovins et 32000 petits ruminants avec des proportions pouvant atteindre les 30% d'un élevage. Mais c'est indirectement que l'impact économique de la FCO est le plus important avec la mise en place d'embargos et d'une restriction de l'export des bovins ainsi que les mesures de contrôle associées. A titre d'exemple, le cours du «broutard» représentant habituellement un volume d'échange de 900 millions d'euros par an a chuté de 10% au cours de l'année 2007. De même, les dépenses de la France relatives à l'indemnisation des éleveurs et la surveillance de la FCO en France s'établissaient à plus de 35 millions d'euros en 2008 [4]. Dés lors, une stratégie de vaccination a été mise en place par les pays membres de l'Union Européenne et la Suisse dans le but de réduire les pertes dans les élevages d'animaux domestiques, contenir toute propagation de la maladie et faciliter le marché des animaux de rentes. Dans la situation de crise de l'époque, des vaccins basés sur une atténuation du virus vivant, aussi appelés vaccins atténués ou vaccins MLV (Modified-Live Virus) ont été importés et utilisés contre le BTV de sérotype 2, 4, 9 et 16 dans le sud de l'Europe (Corse, Portugal, Îles Baléares et Italie). Cependant, les risques associés à l'utilisation de ces derniers restent importants (symptômes d'infection, réversion de virulence, etc...) et une alternative préférable est l'utilisation de vaccins basés sur une inactivation totale du virus, vaccins dits inactivés [5]. Actuellement, différents vaccins inactivés anti-BTV8 sont disponibles en Europe (BLUEVAC 8, CZ Veterinaria S.A.; Zulvac® 8, Fort Dodge Animal Health et BTVPUR® AlSap 8, Merial) et d'autres sont en cours de développement en Inde et en Chine contre les autres sérotypes. Le diagnostic de la fièvre catarrhale peut être effectué par un isolement et une identification du virus, par une détection de séquences spécifiques de l'ARN viral ou par la mise en évidence dans le sérum d'anticorps spécifiques d'antigènes viraux. Cependant, la nécessité d'une phase d'amplification du virus rend la technique d'isolement viral complexe et longue. La détection de l'ARN génomique du BTV par RT-PCR bien que plus rapide reste une méthode coûteuse. Les tests sérologiques, plus faciles et moins onéreux, sont dés lors les plus couramment utilisés. Cette famille de tests comprend la fixation du complément, l'immunodiffusion, l'immunofluorescence, l'hémolyse en gel et le dosage d'immunoadsorption enzymatique (enzyme linked immunosorbent assay ou ELISA). Le test ELISA est essentiellement utilisé pour la détection d'anticorps anti-BTV groupe-spécifique [6]. Il est basé sur la détection d'anticorps dirigés contre une région particulière de la protéine de capside VP7 très immunogène et fortement conservée entre les 24 sérotypes du BTV. Des anticorps anti-VP7 peuvent être mis en évidence chez les ruminants dés le 7ème jour après infection et 10 à 40 jours après vaccination en fonction des animaux testés et des vaccins utilisés. Malheureusement, il a été démontré que les anticorps ainsi détectés ne sont pas forcément neutralisants. Ainsi, un statut sérologique anti-VP7 positif pour des animaux naturellement infectés peut co-exister avec un état contagieux. De plus, une séroconversion anti-VP7 est également observée après vaccination des bovins à l'aide de vaccins commerciaux. Dans ce contexte, les tests ELISA actuels basés sur la VP7 ne peuvent pas différencier les animaux naturellement infectés des animaux vaccinés (DIVA pour « Differentiating Infected Vaccinated Animals ») et le seul moyen d'être sûr du statut sanitaire d'un animal reste de vérifier l'absence de génome viral dans le sang par RT-PCR. De nouveaux tests sérologiques, plus économiques et plus faciles à réaliser, sont donc nécessaires aux études épidémiologiques du BTV et afin de coordonner les futures campagnes de vaccinations. Ceci est justement l'objet de la présente invention. Pour répondre à ce besoin, la présente Demanderesse a chercher à construire un test sérologique spécifique permettant de distinguer un animal infecté par le BTV d'un animal vacciné par virus, de préférence pour le sérotype 8, ce dernier étant largement répandu. La Demanderesse a mis en évidence de manière surprenante que la détection d'anticorps dirigés contre la protéine de capside VP2 du BTV-8 permettait de différencier un animal infecté spécifiquement par le BTV-8 d'un animal vacciné contre un tel virus, ce test permettant en en effet en outre de la caractéristique ou propriété « DIVA » d'identifier chez l'animal infecté par le BTV la présence spécifique du sérotype 8, mais également pour la vaccination d'identifier que l'animal est vacciné contre le sérotype 8. Cette protéine VP2 est codée par le segment 2 du génome viral (Seg- 2) et forme des trimères de type « triskelion » (triple spirale entrelacée). Par son association à la vimentine, la protéine VP2 est impliquée dans le trafic intracellulaire et la sécrétion des particules virales matures [7]. Il a également été démontré que son interaction avec une glycoprotéine membranaire jouait un rôle essentiel dans la phase d'attachement cellulaire [8]. Au niveau diagnostique, la protéine VP2 est surtout connue comme déterminant sérotypique majeur du virus de la FCO [9]. En effet, elle est la cible d'anticorps neutralisants spécifiques de sérotype du virus de la fièvre catarrhale. Sur cette base, une classification a été établit permettant la discrimination de 24 souches de référence (BTV-1 à -24). Cette classification sérotypique s'est révélée être en parfaite adéquation avec la classification phylogénétique basée sur l'analyse des variations de la séquence Seg-2 codant pour la protéine VP2 [10]. La présente Demanderesse a généré des anticorps monoclonaux 10 dirigés contre de la protéine VP2 du BTV-8. Les épitopes reconnus par ces anticorps monoclonaux présentent comme caractéristiques : - d'être spécifiques du sérotype 8 du BTV, notamment vis-à-vis des infections par BTV du sérotype 1 et, le cas séchéant des sérotypes 2, 4, 9 , 10 ou 16, et, le cas échéant encore des autres sérotypes de BTV connus. 15 - de ne pas être impliqués dans la phase d'attachement cellulaire du virus (anticorps monoclonaux non neutralisants) - d'être reconnus par les anticorps d'animaux naturellement infectés par le BTV-8 - de n'être pas ou peu reconnus par les anticorps d'animaux 20 vaccinés à l'aide d'un vaccin inactivé mono- ou polyvalent contenant le BTV-8. Dans un contexte de vaccination massive des cheptels européens, un test sérologique basé sur cette protéine VP2 et utilisant les anticorps monoclonaux associés constitue une avancée majeure dans le diagnostic de la FCO. Il permettra 25 de différencier un animal infecté spécifiquement par le BTV-8 d'un animal vacciné contre un tel virus, et en outre de différencier les deux principaux sérotypes (BTV-1 et BTV-8) qui affectent la France, l'Espagne et le Portugal (et plus faiblement la Grèce et l'Italie), permettant de ce fait d'évaluer la propagation du virus sous couvert vaccinal par la méthode rapide à mettre en oeuvre et adaptée à un grand 30 nombre d'échantillons. La Demanderesse a mis en évidence qu'il était possible d'utiliser de la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, pour la préparation, la sélection et la production d'anticorps monoclonaux, ainsi que des test associés, permettant de différencier un animal 35 infecté spécifiquement par le BTV-8 d'un animal vacciné contre un tel virus, tout en établissant un diagnostic sérologique spécifique du virus de la fièvre catarrhale de sérotype 8 (BTV- 8) pour les animaux infectés, spécificité notamment vis-à-vis des infections par BTV du sérotype 1 et, le cas échéant vis à vis des autres sérotypes de BTV connus tels que notamment le sérotype 2, 4, 9 , 10 ou 16. Ce test est adapté à l'analyse d'échantillons biologiques d'animaux dont le statut sanitaire vis-à-vis de cette infection est inconnu. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation de la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, pour la préparation d'un réactif ou d'un kit « DIVA-BTV-8 » destiné à différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8. Dans un mode de réalisation préférée, ladite protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou composition ou composé la comprenant, est choisie parmi : - une protéine VP2 isolée et, le cas échéant purifié, du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques; - une protéine VP2 recombinante, de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 ou l'un de ses fragments antigéniques; ou - un virus BTV-8, ou l'un de ses fragments contenant la protéine VP2 ou l'un de ses fragments antigéniques, caractérisé en ce que : - ledit fragment antigénique de la protéine VP2 est un fragment capable de se fixer spécifiquement sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315 ; ou - l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé sous le numéro I- 4314 ou l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé sous le numéro I-4315 est dirigé spécifiquement contre ledit fragment antigénique de la protéine VP2. Sous un autre mode de réalisation également préféré, ledit réactif ou kit comprend, de préférence séparément dudit réactif contenant ladite protéine VP2, un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine VP2, pour la préparation d'un réactif destiné au diagnostic in vitro d'une infection par un virus BTV-8 chez l'animal. - ledit anticorps ou fragment d'anticorps est choisi parmi les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les anticorps chimériques, ou leurs fragments fonctionnels, en particulier les fragments Fab, (Fab')z, Fab', Fv, scFv, scFv-Fc des anticorps précédents. Les fragments d'anticorps monoclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur un épitope de la protéine VP2 de BTV-8 et sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes bien connues de l'homme de l'art. Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière les fragments d'anticorps monoclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc.... En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow et al., 1998) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps monoclonaux utilisés selon la présente invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine VP2 de BTV-8, ou un de ses fragments, comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux dénommé 6C3 Id Vet et 10E9 Id Vet selon l'invention. Ladite protéine VP2 de BTV-8, ou un de ses fragments antigéniques, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la séquence de l'ADNc codant pour la protéine VP2 de BTV-8 ou par synthèse peptidique à partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la protéine VP2 de BTV-8, de préférence la protéine VP2 de BTV-8 de séquence SEQ ID NO :1. Les anticorps monoclonaux utilisables selon l'invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisée la protéine VP2 de BTV-8 ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux dénommé 6C3 Id Vet et 10E9 Id Vet selon l'invention. L'utilisation ou les méthodes ci-après selon la présente invention peuvent mettre en oeuvre un anticorps anti-VP2-BTV-8 ou un de ses fragments, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps chimériques ayant les mêmes CDRs (« CDR» pour Régions Déterminant la Complémentarité que l'anticorps monoclonal anti-VP2-BTV-8 tel que défini ci-avant. Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps monoclonal chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Sont également compris dans l'invention, les utilisations ou méthodes de détection ou de diagnostic dans lesquelles les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, ou encore les protéines VP2-BTV-8 ou leurs épitopes/fragments antigéniques sont obtenus par recombinaison génétique (protéines recombinantes) ou par synthèse chimique. L'invention comprend également les utilisations ou méthodes de détection ou de diagnostic dans lesquelles les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, ou encore les protéines VP2-BTV-8 ou leurs épitopes/fragments antigéniques sont marqués. Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments ou encore les protéines VP2-BTV-8 ou leurs épitopes/fragments antigéniques, peuvent être également, marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, ou encore les protéines VP2-BTV-8 ou leurs épitopes/fragments antigéniques, incluent par exemple des anticorps ou antigènes dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la 13-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, l'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylénediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylénetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluoréscéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate. D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine. Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou l'antigène VP2 ou un de leurs fragments, on peut également cités les marqueurs radioactifs tels que 14c 36C1 57co 58co 58cr, 152Eu 59Ee 13H 1251, 1211, 32p ou 35s qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à scintillations etc.... Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les anticorps monoclonaux anti-VP2-BTV-8 utilisés selon la présente invention sont choisis parmi : - l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315 ou - ledit anticorps 6C3 Id Vet ou 10E9 Id Vet, ou un de ses fragments 15 fonctionnels, couplé à un marqueur. De préférence encore, le réactif ou le kit est destiné à une méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 chez est un ruminant, de préférence un bovin, un ovin ou un 20 caprin. Sous un second aspect, la présente invention a pour objet une méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 à partir d'un échantillon biologique dudit animal, caractérisée 25 en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et 30 b) la mise en évidence ou la révélation des complexes antigène-anticorps formés ou susceptibles de s'être formés en (a) entre ladite protéine VP2 de BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-VP2 susceptible d'être présent dans le dit échantillon biologique de l'animal. Selon un mode de réalisation préféré : - à l'étape b), les complexes antigène-anticorps susceptibles d'être formés en (a) sont des complexes antigène-anticorps susceptibles de s'être formés entre ladite protéine VP2 de BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-VP2 de BTV-8 susceptible d'être présent dans le dit échantillon biologique de l'animal. Selon un mode de réalisation également préféré : - l'étape b) est réalisée par une méthode d'immunodosage par compétition, de préférence par un ELISA en compétition mettant en oeuvre un anticorps, ou l'un des fragments fonctionnels, capable de reconnaître spécifiquement la protéine VP2 du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques. Selon un mode de réalisation également préféré, la méthode in vitro de détection ou de diagnostic selon la présente invention est caractérisée en ce que : - soit ladite protéine VP2 du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques, mis en oeuvre à l'étape a), ou - soit ledit anticorps capable de reconnaître spécifiquement la protéine VP2 du virus BTV-8 mis en oeuvre à l'étape b), est marqué, de préférence à la peroxydase. Selon un mode également préféré, - ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode d'immunodosage par compétition, de préférence par un ELISA en compétition est un anticorps marqué, de préférence à la peroxydase. Selon un mode de réalisation particulièrement préférée : - ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode d'immunodosage par compétition, de préférence par un ELISA en compétition en compétition est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315. Selon un mode de réalisation également préféré : - l'étape b), une réaction de compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV-8, de préférence un signal représentant 0 à 20 %, de manière plus préférée 0 à 15 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. Selon un mode de réalisation également préféré, l'invention a pour objet une méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon la présente invention, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine VP2 d'un virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, ladite protéine VP2 étant préalablement capturée par immunocapture sur une phase solide revêtue d'un anticorps anti-VP2-BTV-8 de type polyclonal, ou, de type monoclonal ou tel que défini dans les revendication 3 à 5 ; b) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine VP2, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-VP2 susceptible d'être présent dans ledit échantillon, cette révélation étant réalisée par une méthode d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps anti-VP2, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence marqué, tel que défini dans l'une des revendications 3 à 6 . Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition en deux étapes ou en une étape, ou tout immunodosage d'anticorps par compétition connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les méthodes d'immunodosages par compétitions mises en oeuvre dans les méthodes selon l'invention, la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être immobilisé ou marqué, il en est de même pour l'anticorps anti-VP2-BTV-8. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles. On peut citer par exemples les cupules de microplaques. Dans une méthode d'immunodosage en une étape, on revêt une cupule de microplaque d'anticorps anti-VP2-BTV-8 tel que décrit ci-avant, non marqué. Puis on ajoute successivement à la cupule l'échantillon biologique à tester et l'antigène VP2-BTV-8 préalablement marqué. Cette étape étant suivie d'une étape d'incubation et de lavage de la cupule avant l'étape suivante de détection et/ou de quantification du marqueur. Une telle méthode dite ELISA par compétition en une étape (par opposition à la méthode d'ELISA par compétition en deux étapes, telle que décrites notamment dans les exemples ci-après) fait également partie de la présente invention. A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio-immunologique (RIA) ou équivalent. Selon un mode de réalisation également préféré : - ledit échantillon biologique préalablement prélevé chez l'animal ou obtenu à partir de l'animal est un échantillon de fluide biologique, de préférence choisi parmi le plasma, le sérum, du jus de viande ou encore un échantillon de sang total de l'animal, le sérum étant le plus préféré. Sous un autre aspect, la présente invention concerne également un kit ou trousse de réactifs pour la détection ou le diagnostic d'une infection d'un animal par un virus BTV, ledit kit comprenant : a) un composé ou composition comprenant la protéine de capside VP2 du virus 5 BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2 ; b) un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine VP2, le cas échéant marqué, de préférence ledit anticorps est polyclonal, monoclonal ou chimérique, 10 c) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; et d) le cas échéant, les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. 15 La présente invention concerne également un kit ou trousse de réactifs pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8, ledit kit comprenant : a) un composé ou composition comprenant la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2 ; 20 b) un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine VP2, le cas échéant marqué, de préférence ledit anticorps est polyclonal, monoclonal ou chimérique ; c) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction 25 immunologique ; et d) le cas échéant, les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. De préférence, dans le kit ou la trousse de réactifs selon l'invention : 30 a) ledit composé ou ladite composition comprenant la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou ledit fragment antigénique de ladite protéine VP2, est choisi parmi : - une protéine VP2 isolée et, le cas échéant purifié, du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques; - une protéine VP2 recombinante, de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 ou l'un de ses fragments antigéniques; ou - un virus BTV-8, de préférence inactivé, ou l'un de ses fragments contenant la protéine VP2 ou l'un de ses fragments antigéniques ; ou - un support solide, telle qu'une cupule de microplaque, sur lequel est fixée ou adsorbée ladite protéine VP2-BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques telle que définie ci-dessus dans la revendication, et caractérisé en ce que : - ledit fragment antigénique de la protéine VP2 est un fragment capable de se fixer spécifiquement sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315 ; ou - l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé sous le numéro I-4314 ou l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé sous le numéro I-4315 est dirigé spécifiquement contre ledit fragment antigénique de la protéine VP2 ; et b) ledit un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine VP2, le cas échéant marqué est choisi parmi l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la CNCM, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315, ou l'un de ses fragments fonctionnels. Sous un dernier aspect, l'invention concerne également un procédé de sélection d'un anticorps pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8, le cas échéant utilisable dans une méthode d'ELISA en compétition, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante: a), le cas échéant la sélection d'un hybridome obtenu après immunisation d'un animal avec un antigène choisi parmi un composé ou une composition comprenant la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, tel que défini dans la revendication 16 a); b) la mise en contact dudit anticorps à tester avec la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et c) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (b) entre ladite protéine VP2, ou l'un de ses fragments antigéniques, et ledit un anticorps testé, et dans laquelle étape la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) est réalisée par une méthode ELISA en compétition mettant en oeuvre un anticorps, ou l'un des fragments fonctionnels, ledit un anticorps étant choisi parmi l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la CNCM, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures. Les figures dont les légendes sont ci-après, ainsi que les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant en limiter la portée. LEGENDES DES FIGURES - La figure 1 est une évaluation de la réponse immune anti-VP2 et anti-VP7 des souris immunisées. Test de réactivité des sérums immuns murins post-immunisation sur la protéine VP2 BTV-8 ou VP7 recombinante. - La figure 2 représente un test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-VP2 « 6C3 » et « 10E9 ». Test de réactivité des anticorps 6C3 et 10E9 couplé à la péroxydase et à concentration constante (5µg/mL) sur la protéine VP2 BTV-8 recombinante à différentes concentrations. - La figure 3 représente une compétition des anticorps monoclonaux anti-VP2 « 6C3 » et « 10E9 ». Test de compétition pour la reconnaissance de la protéine VP2 BTV-8 recombinante entre les anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 non couplés et l'anticorps monoclonal 6C3 (A) ou 10E9 (B) couplé à la péroxydase. - La figure 4 est une évaluation de la sensibilité et de la spécificité du test cELISA VP2-BTV8. Détection de la présence d'anticorps dirigés contre la protéine VP2 de BTV-8 dans un panel de sérums bovins naïfs (n=66) ou infectés par le BTV-8 (n=67) par technique d'ELISA de compétition du test cELISA VP2-BTV8. Les résultats sont représentés sous forme de distribution des échantillons en fonction du pourcentage de la valeur obtenue pour chaque échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). - La figure 5 représente la validation du caractère sérotypedifférenciant du test cELISA DIVA-BTV8. Evaluation des sérums d'animaux infectés par le BTV de sérotype 1, 8 ou 10, ou vaccinés à l'aide d'un vaccin atténué monovalent BTV-2, -4, - 9 ou -16 par un test ELISA de compétition classique (ID Screen® Bluetongue Competition, IDVET) basé sur la reconnaissance de la protéine VP7 du BTV (A.) et le test cELISA VP2-BTV8 basé sur la reconnaissance de la protéine VP2 du BTV-8 (B.) Les valeurs sont représentées en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N) en fonction du type d'infection à BTV. - La figure 6 représente la validation du caractère sérotype- différenciant du test cELISA DIVA-BTV8. Evaluation des sérums d'animaux infectés ou vaccinés (JO et J+45) contre le BTV de sérotype 8 par un test ELISA de compétition classique (ID Screen® Bluetongue Competition, IDVET) basé sur la reconnaissance de la protéine VP7 du BTV (A.) et le test cELISA VP2-BTV8 basé sur la reconnaissance de la protéine VP2 du BTV-8 (B.) Les valeurs sont représentées en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N) en fonction du type d'infection à BTV. EXEMPLES Exemple 1 : Matériels et réactifs 1.1 Préparation de l'antigène VP2 natif Une monocouche de cellules Véro à 80 % de confluence dans une flasque de 75 cm2 (MEM, 0.5 % SVF, 50 µg/mL de gentamycine + 100 U de pénicilline + 100 µg/mL de streptomycine) a été infectée par la souche BTV-8 avec une m.o.i de 0,5 (10106 TCID50/mL). Les cellules ont ensuite été décrochées et séparées du milieu de culture par centrifugation de 10 min à 1000 rpm quand le pourcentage de lyse observé est supérieur à 70 %. Le culot cellulaire est repris au 1/100e du volume initial à l'aide de tampon de lyse (Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, Tx100 0,5 %, Inhibiteurs de protéase). La suspension a été incubée 1 h à + 4°C, soniquée 5 min. sur glace puis centrifugée 20 min. à 2200 x g. Le surnageant contenant l'antigène VP2 natif a été récupéré et conservé à -20 °C. 1.2 Préparation de l'antigène VP2 recombinant. 1.2.1 Construction des vecteurs d'expression de la protéine VP2-15 BTV8 recombinante. i. Séquence codante pour la protéine VP2-BTV8 (voir SEQ ID N°:2) La séquence correspondant au segment complet Seg-2 du génome viral et codant pour la protéine VP2 du BTV-8 (isolat NET2006/04) a été utilisée pour la construction des vecteurs d'expression (Mann S., et coll. Virology. 2008;377(2):308-18). Séquence nucléotidique (GenBank AM498052.2, GI:195972621) (SEQ ID NO :2) Séquence amino-acide correspondante (GenBank CAM57243.2) 30 (SEQ ID NO :1) ü. Vecteur de clonage de la protéine VP2-BTV8 recombinante La séquence complète de l'ADN correspondant à la région Seg-2 du 35 BTV-8 a été amplifiée et les sites de restriction PacI et AscI ont été ajoutés aux extrémités 5' et 3' terminales, respectivement. Le gène synthétique obtenu a été 20 25 cloné dans le vecteur plasmidique pGA15 (kanR) après digestion PacI/AscI. Le plasmide a été purifié (Pure Yie1dTM Plasmid Midiprep, Promega) à partir de bactéries transformées (E.coli K12 XL10 gold) et la concentration a été déterminée par spectroscopie UV à 260 nm. Vecteur d'expression de la protéine VP2-BTV8 recombinante Le plasmide codant pour la protéine VP2 du BTV-8 a été utilisé afin de construire un vecteur viral d'expression de type baculovirus. Brièvement, le 10 plasmide a été digéré par les enzymes de restriction BamHI/ EcoRI. Les extrémités ont été rendues franches par l'action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase puis digérées par l'enzyme de restriction Sali. Les fragments ainsi obtenus ont été inséré dans le vecteur d'expression pFastBacHTb (Invitrogen) préalablement ouvert par les enzymes de restriction Sali puis XhoI et les extrémités rendues franches par 15 l'action du fragment de Klenow de l'ADN polymérase. Une séquence du site de reconnaissance à la protéase TEV (soulignée, clivage entre Q et G) a ainsi été positionné entre le partenaire de fusion 6His (en vert) et le début du gène codant pour la VP2 BTV-8 (en rouge). La protéine de fusion résultante est composée de 997 aa et a une taille théorique de 115,5 kDa. Son pI théorique est de 6,47. La 20 séquence du gène 6His-VP2 cloné dans pFastBacHTb est représentée par la séquence SEQ ID NO :3 (Séquence nucléique) et SEQ ID NO :4 (Séquence d'acide aminé encodé par SEQ ID NO :3). Les vecteurs d'expression recombinants ont été transformés dans la 25 souche E. coli DHlOBac. L'ADN bacmidique a été extrait des colonies positives puis transfecté dans les cellules d'insectes Sf9. Les surnageants cellulaires ont été récoltés sept jours après la transfection. La présence des protéines 6His-VP2 a été testée sur gel SDS-PAGE par Western-blot à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-6Histidines. Les surnageants positifs ont été amplifiés (50 mL), titrés par la 30 méthode « plaque assay », puis stockés à 4 °C et -80 °C. 1.2.2 Production et de purification de la protéine de fusion VP2 BTV-8.5 Un stock viral du baculovirus recombinant a été préparé afin de réaliser une production de 4 litres de cellules Sf9 à 1.5 106 cellules/ml. A la fin de la production, les cellules ont été centrifugées, lavées au PBS puis stockées à -80 °C. Les culots cellulaires Sf9 ont été repris dans un tampon de lyse (50 mM Tris pH 7.9, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole additionné d'un cocktail d'antiprotéases). Les cellules ont alors été lysées sous l'action d'un broyeur de cellules mécanique (2 passes à 1000 bars). Après centrifugation du lysat cellulaire, le surnageant a été récupéré, filtré et passé au travers d'une colonne Nickel de 1 mL (HisTrap HP - GE Healthcare) en utilisant un pilote de purification de la gamme ÀKTA. Après une étape de lavage de la colonne dans le même tampon contenant 60 mM d'imidazole, les protéines ont été éluées à une concentration d'imidazole de 250mM. Les protéines récoltées lors de l'élution ont été analysées sur gel SDSPAGE puis quantifiées par la méthode BCA grâce à une gamme étalon de BSA de concentration connue. La concentration de la protéine VP2 BTV-8 ainsi purifiée a été déterminée par mesure de la densité optique à 280 nm, puis la protéine a été stockée à -20 °C après ajout de glycérol (1:1 ; voUvol). 1.3 Banques de sérums 1.3.1 Sérums d'animaux naïfs Les sérums des animaux naïfs ont été collectés courant de l'année 2006 auprès de l'abattoir d'Alès (France), avant toute incursion de FCO en France. 1.3.2 Sérums d'animaux infectés par le BTV Les sérums des animaux infectés par le BTV proviennent de plusieurs zones de campagne de prélèvement. 30 Sérums Ovins : Les sérums ovins BTV-8 positifs ont été prélevés en Belgique en Décembre 2007. 35 Les sérums ovins BTV-1 positifs ont été fournis par l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT, Toulouse, France) en décembre 2008. 25 Les sérums ovins BTV-2, -4, -9 et -16 positifs ont été fournis par le Centre de Recherche Agronomique pour le Développement des Pays du Sud (CIRAD, UMR15 « Contrôle des Maladies Animales Exotiques et Emergentes », Montpellier, France) et correspondent à des animaux vaccinés à l'aide d'un vaccin atténué, donc réplicatif, monovalent (Onderstepoort Biological Products) - Sérums Bovins : Les sérums bovins BTV-8 positifs ont été fournis par l'Association 10 Régionale de Santé et d'Identification Animales (ARSIA, Belgique) et sont relatifs à l'épisode épidémique de 2007 dans la région de Liège (Belgique). Les sérums bovins BTV-1 positifs ont été fournis par l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT, Toulouse, France) en août 2008. Le sérum bovin BTV-10 positif a été fourni par Veterinary 15 Diagnostic Technology, Inc. (Wheat Ridge, Colorado 80033 USA) et correspond à un sérum positif contrôle caractérisé par technique d'immunodiffusion en gel d'agarose (AGID) 20 1.3.3 Sérums d'animaux vaccinés BTV à l'aide d'un vaccin inactivé Les sérums bovins exempts d'infection naturelle et vaccinés contre 25 BTV-8 (BTVPUR® AlSap 8, Merial) correspondent à une campagne de vaccination et de prélèvements effectuée par les services vétérinaires (Clinique Vétérinaire Dr. Pierrard et Dr. Pekus, (Sainte-Menehould, 51800, FRANCE) entre avril et juin 2008. Les sérums sont issus de prélèvements effectués avant (JO) et après 0+45) vaccination de terrain à l'aide du vaccin inactivé BTV-8 (BTVPUR® AlSap 8, 30 Merial) selon le protocole du fabricant. 1.4 Réactifs des tests ELISA Sauf indication contraire, les réactifs utilisés dans le cadre de la 35 technique ELISA sont des éléments entrants dans la composition des kits commerciaux de la société IDVET. Afin de définir les termes utilisés, les différentes solutions utilisées sont identifiées ci-dessous : Solution de Lavage : Solution SL (du test IDScreen® ou solution de lavage de type PBST (0.01 M PBS contenant 0.05 % Tween-20, pH 7.2) Solution de Saturation : Solution ST (solution de saturation à base 5 de PBST contenant 3 % de BSA) Solution de Révélation : Solution SR ( « Solution de Révélation » du test IDScreen® ou solution de révélation à base de 3,3',5,5'-tétramethylbenzidine (TMB)) Solution d'Arrêt : Solution SA (« Solution d'Arrêt » du test 10 IDScreen® ou solution d'arrêt à base d'acide sulfurique 0,5 M). Solution de dilution des sérums : DL18 ou solution SL contenant 2 % de lait écrémé. 15 Solution de dilution de l'anticorps monoclonal conjugué à la péroxydase : DL19 ou solution SL De telles solutions sont bien connues de l'homme de l'art et sont décrites notamment dans le « Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les 20 animaux terrestres (2009) (OIE) ou dans les manuels standards tels que par exemple « Antibodies A Laboratory Manual » (Ed Harlow et David Lane, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory). Les données ont été obtenues par lecture de la densité optique à 25 450nm à l'aide d'un spectrophotomètre multicanaux (Sunrise, Tecan). Exemple 2 Description des anticorps monoclonaux 30 2.1 Préparation de l'inoculum BTV-8 : Des cellules de la lignée Vero (ATCC, CCL-81) ont été cultivées et portées à 80 % de confluence en milieu MEM contenant 10 % de sérum de veau foetal (SVF), 50 µg/mL de gentamycine + 100 U de pénicilline + 100 µg/mL de 35 streptomycine (Gibco). Le milieu de culture a été remplacé par du milieu d'infection (MEM + 0,5 % SVF + 50 µg/mL de gentamycine + 100 U de pénicilline + 100 µg/mL de streptomycine) et les cellules ont été infectées par la souche BTV-8. Trois jours après infection, le milieu d'infection a été éliminé, les cellules ont été lavées à l'aide PBS et 10 mL de PBS contenant 10 % de saccharose ont été ajoutés. La boîte de culture a subit un cycle de congélation/décongélation rapide -70 °C/+37 °C. Le virus BTV-8 natif contenu dans le lysat cellulaire ainsi récupéré a été déterminé par dilution limite et détection des P.F.0 par immunofluorescence indirecte sur cellules Vero et à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris anti-VP7 BTV (IDVET) et un anticorps anti-IgG de souris couplé à la fluorescéine (Sigma). 2.2 Immunisation des souris Des souris femelles adultes de souche BALB/c ont été immunisées par voie intrapéritonéale à l'aide du stock viral précédemment obtenu BTV-8 (106 PFU de BTV-8/injection) à raison de 0,5 mL contenant 50 % (vol/vol) d'adjuvant complet de Freund. Les souris ont été resensibilisées au 14ème et 35'' jour à l'aide d'une dose identique de BTV-8 contenant 50 % (vol/vol) d'adjuvant incomplet de Freund. Enfin, une inoculation de BTV-8 (106 PFU de BTV-8/injection) a été effectuée au 3'' mois post-infection avant l'étape de fusion cellulaire et la recherche d'anticorps anti-BTV dans les surnageants d'hybridomes. 2.3 Etablissement des hybridomes et clonage 2.3.1 Test des sérums de souris immunisées La présence d'anticorps murins anti-VP7 et anti-VP2 du BTV8 a été vérifiée par méthode ELISA indirect. Des plaques 96 puits ont été sensibilisées à l'aide des protéines recombinantes VP7 et VP2 du BTV-8 puis incubées à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée. La solution ST a ensuite été éliminée et 50 µL/puit de sérum de souris immunisée ont été déposés en titration. Après 5 h d'incubation à 37°C, les plaques ont été lavées trois fois à l'aide de la solution SL et 50 µL/puit d'anticorps anti-IgG souris couplé à la péroxydase (SIGMA, A4416 au 1/1200e) ont été ajoutés et incubés 30 min. supplémentaires à température ambiante. Après lavages, 100µL/puit de solution SR ont été ajoutés. La réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA et les valeurs d'absorbance à 450nm ont été mesurées. Les résultats obtenus montrent que les souris immunisées à l'aide du virus BTV-8 ont déclenché une réponse humorale contre ce dernier avec la présence d'une forte réponse anti-VP7. Bien que plus faible, une réponse contre la protéine VP2 du BTV-8 est aussi présente et justifie le passage à l'établissement et la sélection des hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux à partir de ces animaux. 2.3.2 Préparation des splénocytes à la fusion Les souris ont été sacrifiées puis les rates de chaque animal ont été retirées en conditions d'asepsie et placées dans une boîte de Pétri contenant 10 mL de milieu sans sérum (DMEM + 50 µg/mL de gentamycine + 100 U de pénicilline + 100µg/mL de streptomycine). Après dilacération à l'aide d'un scalpel, les agrégats spléniques résiduels ont été dissociés par aspiration-refoulement à la pipette et la suspension obtenue a été passée sur tamis cellulaire. La suspension cellulaire ainsi obtenue a été centrifugée 5 min. à 500 x g. et le surnageant a été éliminé. Une lyse des hématies a été effectuée par 5 min. d'incubation à température ambiante après reprise du culot cellulaire dans 5 mL de solution de chlorure d'ammonium. La réaction a été arrêtée par ajout de 40 mL de milieu sans sérum et 5 min. à 500 x g. Le surnageant a été retiré et le culot contenant les splénocytes a été lavé deux fois supplémentaires (40 mL milieu sans sérum, centrifugation 5 min. à 500 x g) puis repris dans 10 mL de DMEM sans sérum et la concentration déterminée par comptage sur cellule de Malassez. 2.3.3 Préparation des cellules myélomateuses à la fusion Des cellules de myélome SP2/0-Ag14 (ATCC,CRL-1581) ont été utilisées pour la fusion avec les splénocytes des souris immunisées. Ces cellules ont la particularité d'être résistantes à la 8-azaguanine à une concentration de 20 µg/mL et sensibles à l'hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) car dépourvues de l'enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transférase. Ces cellules myélomateuses ont été maintenues en culture dans un milieu complet DMEM/HEPES/pyruvate (DMEM + 10% SVF + 10 mM HEPES + 1 mM pyruvate de sodium + 100 U de pénicilline + 100µg/mL de streptomycine) et passées tous les 3 jours avant utilisation pour la fusion. Le jour de la fusion, 20 mL de suspension ont été lavés une fois à l'aide de milieu de DMEM sans sérum préchauffé à 37 °C et centrifugés 5 min. à 400 x g. Le culot cellulaire a été repris dans 10 mL et la concentration déterminée par comptage sur cellule de Malassez. 2.3.4 Préparation des hybridomes sécréteurs d'anticorps L'obtention des hybridomes a été réalisée sur la base des protocoles décrits par Galfre et coll. (Nature, 1977 ; 266:550-2) et Yokoyama W.M. et coll. 10 (Current Protocols in Immunology, 1995 ; 2.5.1-2.5.17) et est décrite ci-dessous. Brièvement, 0,5 g de polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000) ont été mis à fondre à 60°C au bain-marie puis placé à 37°C après ajout de 0,5 mL de DMEM sans sérum. Les suspensions cellulaires de splénocytes et de cellules 15 myélomateuses ont été ramenées à la même concentration cellulaire finale pour un volume final de 10mL de milieu sans sérum. Les deux suspensions ont ensuite été rassemblées dans un seul tube (ratio cellulaire « SP2/0-Ag14 » / « splénocytes » de 1 :1). Le mélange a été centrifugé 5 min. à 800 x g pendant 5 min. puis le surnageant a été soigneusement éliminé. 20 Le PEG 50 % a été délicatement ajouté à l'aide d'une pipette Pasteur sur le culot cellulaire sous agitation lente en bain-marie à 37 °C et sur une durée totale d'une minute. Le mélange a été soumis à agitation une minute supplémentaire puis 10 mL de milieu de culture sans sérum (préchauffé à 37 °C) ont été ajouté goutte-à-goutte sur 2 min. supplémentaires. Les cellules ont ensuite été centrifugées 25 5 min. à 400 x g, le surnageant éliminé puis le culot remis en suspension dans 10 mL puis 200 mL de milieu complet (DMEM + 20 % de SVF + 10 mM HEPES + 1 mM pyruvate de sodium + 100 U/ml pénicilline + 100 µg/ml streptomycine). La suspension cellulaire (2,5.106 cell/mL) a été distribuée dans des plaques de culture 96 puits à raison de 100 µL/puit et incubée à 37 °C (5% CO2). Le lendemain, 50 30 µL/puit de milieu de sélection des hybridomes (milieu complet + HAT 1X) ont été ajoutés et la moitié du milieu de culture a été remplacé par ce même milieu de sélection tous les 2 jours pendant 2 semaines. Le surnageant de chaque hybridome obtenu a été évalué comme décrit ci-après et les hybridomes sécréteurs d'anticorps sélectionnés ont été 35 amplifiés puis clonés par technique de dilution limite. Les anticorps monoclonaux correspondant ont ainsi pu être produits par purification sur colonne d'affinité des5 surnageants de culture et conformément à la technique décrite par Eaton et coll. (1988). 2.3.5 Evaluation et sélection des hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux Un test d'identification des hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine VP7 a été effectué en première instance. Les hybridomes positifs à ce test ont été écartés et les hybridomes restants ont été testés en ELISA de compétition pour leurs capacités à reconnaître la protéine VP2 du virus BTV-8, propriété sérotype-spécifique, puis à distinguer les animaux naturellement infectés par le BTV-8 des animaux vaccinés à l'aide de vaccins inactivés mono- ou multivalent contenant le BTV-8. - Identification des hybridomes sécréteurs d'anticorps 15 monoclonaux anti-BTV8 et non anti-VP7 Le surnageant des hybridomes a été déposé à raison de 50 µL/puit sur des plaques 96 puits sensibilisées à l'aide de protéine VP7 recombinante ou de virus BTV-8 natif puis incubées 2 h à 37°C. Après trois lavages, 100 µL/puit 20 d'anticorps anti-IgG souris couplé à la péroxydase ont été ajoutés et incubés 30 min. supplémentaires à température ambiante sous agitation. Après lavages, 100 µL/puit de solution SR ont été ajoutés et la réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs d'absorbance à 450nm ont été relevées. Des plaques non sensibilisées ont été utilisées comme contrôles négatifs 25 dans cette expérience. Les hybridomes dont les surnageants ont donné un signal positif sur les plaques non sensibilisées, ainsi que ceux s'étant révélé négatifs pour la présence d'anticorps anti-BTV8 et positifs pour la présence d'anticorps anti-VP7 ont été écartés. 30 Les hybridomes ainsi retenus sont sécréteurs d'anticorps monoclonaux anti-BTV8 dont les épitopes ne sont pas portés par la protéine virale VP7. - Identification des hybridomes sécréteurs d'anticorps 35 monoclonaux anti-BTV8 sérotype-spécifique et à potentiel DIVA Les anticorps anti-BTV-8 sécrétés par les hybridomes précédemment sélectionnés ont été évalués dans un test ELISA de compétition impliquant des sérums de bovins naïfs, naturellement infectés par la BTV-1 ou le BTV-8, ou vaccinés contre le BTV-8 à l'aide d'un vaccin inactivé commercial. Les sérums ont été déposés à raison de 50µL/puit (dilution au 'A en solution SL + 2 % lait écrémé) sur des plaques 96 puits sensibilisées à l'aide de virus BTV-8 natif, puis incubées 2 h à 37 °C. Après trois lavages, le surnageant des hybridomes a été ajouté à raison de 50 µL/puit et la plaque incubée à 37 °C. Après trois lavages, 100 µL/puit d'anticorps anti-IgG souris couplé à la péroxydase ont été ajoutés et incubés 30 min. supplémentaires à température ambiante sous agitation. Après lavages, 100 µL/puit de solution SR ont été ajoutés et la réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs d'absorbance à 450nm ont été mesurées et le pourcentage de compétition de l'anticorps monoclonal du surnageant vis-à-vis des anticorps de l'échantillon à été calculé sur la moyenne des valeurs obtenues pour les sérums d'animaux naïfs. Les hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux correspondant à l'ensemble des attentes suivantes ont été retenus : - Caractéristique sérotype 1/8 différenciant : Pourcentage de compétition le plus fort lors de l'utilisation de sérums d'animaux naturellement infectés par le BTV-8, et faible, voire nul, lors de l'utilisation de sérums d'animaux naturellement infectés par le BTV-1. - Caractéristique DIVA : Pourcentage de compétition élevé, voire maximal, lors de l'utilisation de sérums d'animaux vaccinés contre le BTV-8 à l'aide d'un vaccin inactivé commercial. Les hybridomes ainsi retenus sont sécréteurs d'anticorps monoclonaux anti-BTV8, sérotype 1-8 différenciant, à caractère DIVA et dont les épitopes ne sont pas portés par la protéine virale VP7. 2.4 Caractérisation des anticorps monoclonaux anti-BTV8, sérotype 1-8 différenciant et à caractère DIVA A l'issu de cette triple sélection des hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux, deux candidats potentiellement intéressant ont été retenus. Ces hybridomes ainsi que les anticorps monoclonaux associés ont été identifiés « 6C3 » et « 10E9 » et des expériences de caractérisation complémentaire ont été effectuées. Ces deux hybridomes ont fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM Institut Pasteur, Paris, France) sous les numéros d'ordre CNCM I-4314 et I-4315, respectivement. 2.4.1 Test de réactivité des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 sur la protéine VP2 BTV-8 recombinante Le caractère sérotype 1-8 différenciant des anticorps monoclonaux précédemment identifiés laisse à penser que leurs épitopes respectifs sont probablement portés par le déterminant sérotypique majeur du virus de la FCO qu'est la protéine VP2. Afin de vérifier cette hypothèse, un test de réactivité des anticorps 6C3 et 10E9 sur la protéine recombinante VP2 du BTV-8 a été entrepris. Les anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 couplés à la péroxydase ont été déposés à raison de 100 µL/puit (5 µg/mL, solution SL + 2 % lait écrémé) sur une plaque sensibilisée à l'aide de VP2 BTV-8 recombinante et en concentration croissante de 0 à 56 µg/mL. Après 30 min. d'incubation à température ambiante, la plaque a été lavée 3 fois, 100 µL/puit de solution SR ont été ajoutés, puis la réaction a été arrêtée après 15 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été enregistrées. Les résultats obtenus ont montré que les anticorps 6C3 et 10E9 sont bien dirigés contre la protéine VP2 du BTV-8 et que ces deux anticorps monoclonaux présentent des comportements différents avec une plus grande réactivité de l'anticorps 6C3 aux faibles concentrations d'antigène par rapport à l'anticorps 10E9. L'ensemble de ces résultats indique que les épitopes reconnus par les anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 sont portés par la protéine VP2 du BTV-8 et que dans nos conditions d'utilisation l'anticorps 6C3 témoigne d'une meilleure affinité que le 10E9 pour la protéine VP2 recombinante. 2.4.2 Isotypage des anticorps monoclonaux Les anticorps 6C3 et 10E9 ont été soumis à un test d'isotypage par méthode ELISA à l'aide du kit ISO2 « Monoclonal Antibody Isotyping Reagents » (SIGMA) et selon les recommandations du fabricant. Les liquides d'ascites induits par chacun des hybridomes ont été dilués en solution SL et 100 µL ont été déposés sur une plaque préalablement sensibilisée. Après 90min. d'incubation à 37°C, la plaque a été lavée et 100 µL d'anticorps anti-IgGl, -IgG2a, -IgG2b, -IgG3, -IgA ou -IgM de souris ont été déposés. La plaque a été révélée à l'aide de 100 µL de substrat de la péroxydase après une incubation supplémentaire de 30 min. à 37 °C et lavages. La réaction a été arrêtée après 10 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA et les valeurs d'absorbance à 450nm ont été relevées. Les résultats obtenus ont montrés que les anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 sont d'isotype IgG2b et IgGl, respectivement. 2.4.3 Compétition des anticorps monoclonaux anti-VP2 BTV-8 Les anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 sont déposés à des concentrations croissantes de 0 à 10 µg/mL (solution SL + 2 % lait écrémé) à raison de 100 µL/puit sur une plaque présensibilisée à l'aide de VP2 BTV-8 recombinante. Après 2h d'incubation à température ambiante, 100 µL d'anticorps monoclonal 6C3 ou 10E9 couplé à la péroxydase et à une concentration constante (75 ng/mL ou 500 ng/mL en solution SL + 2 % lait écrémé, respectivement) sont ajoutés pour 30 min. d'incubation supplémentaire. Après 3 lavages en solution SL, 100 µL/puit de solution SR ont été ajoutés, puis la réaction a été arrêtée après 15 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été enregistrées. Les résultats obtenus ont montré une chute, suivie d'une extinction du signal, pour le couple contrôle 6C3/6C3-HRP (Fig.3 A.) et le couple 10E9/10E9-HRP (Fig. 3 B.). Ce profil caractéristique d'un effet de compétition entre deux anticorps confirme qu'un anticorps monoclonal couplé ou non à la péroxydase reconnaît le même épitope sur la protéine VP2. Au contraire, aucun effet de compétition n'est observable entre les anticorps monoclonaux 10E9 et 6C3-HRP (Fig. 3 A.) ou leurs réciproques (Fig. 3 B.). Les anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 reconnaissent donc des épitopes distincts de la protéine VP2 du BTV-8. 2.4.4 Western-blot anti-BTV8 et anti-VP2 BTV-8 recombinante à 35 l'aide anticorps 6C3 et 10E9 2.4.5 Evaluation du potentiel séroneutralisant des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 Aucun potentiel séroneutralisant n'a pu être mis en évidence pour les 5 anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9. 2.4.6 Evaluation du potentiel sérotype 1-8 différenciant des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 10 Les potentiels sérotype 1-8 différentiants des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 ont été comparés sur la base de sérums de bovins naïfs ou naturellement infectés par le BTV-1 ou BTV-8. Pour ce faire, les sérums ont été dilués au 'A en solution SL contenant 2 % de lait écrémé et déposé sur une plaque présensibilisée à l'aide de VP2 BTV-8 15 recombinante à raison de 100µL/puit. Des sérums d'animaux naïfs ont été utilisés comme contrôles négatifs et le sérum BTV-8 a été dilué de façon supplémentaire au 1/20e et au 1/40e afin d'évaluer la limite de détectabilité. Après 45 min. d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée 3 fois en solution SL et 100 µL d'anticorps monoclonal 6C3 ou 10E9 à une concentration de 0,2 ou 0,04 µg/mL (en 20 solution SL + 2 % lait écrémé) ont ajoutés pour 45 min. d'incubation supplémentaires à 37 °C. Après 3 lavages en solution SL, 100 µL/puit d'anticorps anti-IgG de souris couplé à la péroxydase on été ajoutés. La plaque a été incubée 30min à température ambiante, lavée trois fois et 100 µL de solution SR ont été ajoutés. La réaction a été arrêtée après 15 min. par l'ajout d'un volume identique de 25 solution SA et les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été enregistrées. Les résultats ont été représentés en unités de densité optique à 450 nm (Tableau 1A.) et en pourcentage de compétition établit sur la moyenne des valeurs des contrôles négatifs (Tableau 1B.). D.O. 450nm SIN (0/0) 6C3 10E9 6C3 10E9 0,2 µg/mL 0,04 µg/mL 0,2 µg/mL 0,04 µg/mL 0,2 µg/mL 0,04 µg/mL 0,2 µg/mL 0,04 µg/mL Type de 0 611 0 333 0 681 0 352 18 11 20 14 sérum ~- ~- ~- ~ 57 30 70 49 1978 0937 2443 1221 2640 1455 2849 1516 76 47 82 60 3,334 2,378 3,01 1,742 96 77 87 69 && 5$ X Tableau 1: Comparaison des potentiels sérotype BTV-1/-8 différenciants des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9. ELISA de compétition VP2 BTV-8 à l'aide de sérums de bovins naifs ou naturellement infectés par le BTV-1 ou BTV-8, et des anticorps monoclonaux anti-VP2 BTV-8 6C3 et 10E9. Les résultats ont été représentés en unités de densité optique à 450 nm O.) et pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (B.). Comme précédemment, les résultats obtenus (Tableau 1) ont montrés une perte de signal de détection de la VP2 BTV-8 recombinante plus importante avec l'anticorps monoclonal 10E9 qu'avec l'anticorps monoclonal 6C3 suite à une dilution de 0,2 à 0,04 itg/mL de ces derniers (point « sans sérum »). Ceci témoigne d'une plus grande affinité de l'anticorps 6C3 pour la protéine VP2 BTV-8. Concernant le sérum BTV8 positif, les valeurs obtenues de 18 à 11 % et de 20 et 14 % de compétition avec le sérum BTV-8 pour les anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 à des concentrations de 0,2 à 0,04µg/mL, respectivement, ont mis en évidence un meilleur blocage par les anticorps sériques de la fixation du 6C3 sur la VP2 BTV-8 que celle du 10E9. Les résultats obtenus avec les dilutions complémentaires du sérum BTV-8 positif ont confirmé cette différence, témoignant ainsi d'une meilleure sensibilité avec l'utilisation de l'anticorps monoclonal 6C3. De la même façon, les valeurs obtenues pour le sérum BTV-1 positif ont montré un plus faible blocage avec l'utilisation de l'anticorps monoclonal 6C3 qu'avec le 10E9. Enfin les résultats ont mis en évidence une répartition des sérums naïfs contrôles plus homogène avec l'utilisation de l'anticorps monoclonal 6C3 qu'avec le 10E9. Les anticorps monoclonaux anti-VP2 BTV-8 étudiés ici sont donc tous les deux utilisables dans un test sérologique de type ELISA de compétition sérotype 1-8 différenciant. Cependant, l'anticorps monoclonal 6C3 présente une meilleure affinité pour la protéine VP2 BTV-8 recombinante produite selon notre procédé de fabrication, et son utilisation par rapport à celle du 10E9 améliore la détectabilité et la spécificité du test. 2.4.7 Potentiel DIVA BTV8 des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 Les potentiels DIVA BTV des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9 ont été comparés sur la base de sérums de bovins naïfs, naturellement infectés par le BTV-1 ou BTV-8, ou vaccinés contre le BTV-8 à l'aide d'un vaccin inactivé commercial. Pour ce faire, les sérums ont été dilués au en solution SL contenant 2 % de lait écrémé et déposé sur une plaque présensibilisée à l'aide de VP2 BTV-8 recombinante à raison de 100 µL/puit. Après 45 min. d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée 3 fois en solution SL et 100 µL d'anticorps monoclonal 6C3 ou 10E9 à une concentration prédéfinie et optimale (en solution SL + 2 % lait écrémé) ont ajoutés pour 45 min. d'incubation supplémentaires à 37 °C. Après 3 lavages en solution SL, 100 µL/puit d'anticorps anti-IgG de souris couplé à la péroxydase on été ajoutés. La plaque a été incubée 30 min à température ambiante, lavée trois fois et 100 µL de solution SR ont été ajoutés. La réaction a été arrêtée après 15 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA et les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été enregistrées. Les résultats ont été représentés en unités de densité optique à 450 nm. Les valeurs sont représentées en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). D.O. 450nm S/N (%) 6C3 10E9 6C3 10 E9 BTV-1 BTV-8 Vaccinés BTV-8 0 294 0 611 0 566 1,968 1.27598 90 2,001 44 99 10 1.567 s iE 1,387 78 98 0 401 0 509 0 530 37 86 15 30 28 95 94 90 28 36 Tableau 2 : Comparaison des potentiels sérotrpe BTV-1/-8 différenciant et DIVA BTV-8 des anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9. ELISA de compétition VP2 BTV-8 à l'aide de sérums de bovins naifs, naturellement infectés par le BTV-1 ou -8, ou vaccinés contre le BTV-8, et des anticorps monoclonaux anti-VP2 BTV-8 6C3 et 10E9. Les résultats ont été représentés en unités de densité optique à 450 nm (gauche) et en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (droite). Les résultats obtenus ont montrés un chute du pourcentage de signal entre les sérums d'animaux naturellement infectés par le BTV-1 et ceux infectés par le BTV-8 de 70,2 points de moyenne (94,5 % sur BTV-1 et 24,3% sur BTV-8) pour l'anticorps 6C3 et de seulement 54,4 points (88 % sur BTV-1 et 33,7 % sur BTV-8) pour l'anticorps 10E9. Comme précédemment, un meilleur différentiel BTV-1/BTV-8 sur les sérums des animaux naturellement infectés est donc observable avec l'utilisation de l'anticorps monoclonal 6C3 au lieu du 10E9. Concernant les sérums d'animaux vaccinés contre le BTV-8, des pourcentages moyens de signal de 91,6% et 96,6% ont été obtenus pour les anticorps 6C3 et 10E9, respectivement. L'écart des pourcentages observé entre les animaux naturellement infectés par le BTV-8 et les animaux vaccinés contre celui- ci est donc de 67,3 points en moyenne avec l'utilisation de l'anticorps 6C3 et de 62,9 points avec celle de l'anticorps 10E9. Ceci témoigne d'un caractère DIVA BTV-8 fort et semblable des deux anticorps monoclonaux anti-VP2. L'ensemble de ces résultats a permis de mieux caractériser les 25 anticorps monoclonaux 6C3 et 10E9. Ces anticorps sont respectivement d'isotype IgG2b et IgGl, dirigés contre des épitopes portés par la protéine VP2 du virus de la fièvre catarrhale de sérotype 8 et de façon surprenante ne sont pas neutralisants envers celui-ci. Ces épitopes sont fortement reconnus par les anticorps d'animaux naturellement infectés par le BTV-8 mais pas par ceux infectés par le virus BTV-1. Dés lors, l'utilisation des anticorps monoclonaux 6C3 ou 10E9 dans un test sérologique de type ELISA de compétition lui confère un fort potentiel sérotype 1-8 différenciant. De façon surprenante, ces épitopes sont peu ou pas reconnus par les anticorps d'animaux vaccinés contre le BTV-8 à l'aide d'un vaccin inactivé commercial. L'utilisation des anticorps monoclonaux 6C3 ou 10E9 dans un test sérologique de type ELISA de compétition confère donc également un fort potentiel DIVA BTV-8. Bien que les deux anticorps monoclonaux soient utilisables dans la mise au point d'un test sérologique de type compétition aux propriétés DIVA BTV-8 et sérotype 1-8 différenciant, l'ensemble des données obtenues montre de meilleurs résultats avec l'utilisation de l'anticorps 6C3 dans nos conditions d'utilisation. 34 Test ELISA de compétition DIVA VP2-BTV8 sérotype différenciant 2.5 Principe du Test ELISA de compétition DIVA VP2-BTV8 sérotype différenciant Le test sérologique décrit dans ce document permet la détection d'anticorps dirigés contre le virus de la fièvre catarrhale de sérotype 8 (BTV-8). Il différencie d'une part les animaux naturellement infectés par le sérotype 8 de ceux qui sont naturellement infectés par les autres sérotypes (ex : BTV-1, -2, -4, -9, -10, -16), ou vaccinés contre ce sérotype à l'aide d'un vaccin inactivé mono- ou multivalent. Cette méthode est un test d'immunoadsorption enzymatique (enzyme linked immunosorbent assay ou ELISA) de type compétition (cELISA) et utilise, des anticorps monoclonaux couplés à une enzyme (péroxydase) et un substrat synthétique (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) pour détecter des anticorps spécifiques du BTV-8 après infection. Les échantillons à tester sont incubés en présence de l'antigène du BTV-8. Si les échantillons contiennent des anticorps dirigés contre l'antigène, les anticorps se lient à celui-ci. Cet antigène est par la suite mis en présence d'anticorps monoclonaux marqués. S'il n'a pas été complexé précédemment par les anticorps de l'échantillon alors l'antigène fixera les anticorps monoclonaux marqués. Au contraire, s'il est déjà engagé dans un complexe immun avec les anticorps de l'échantillon, l'antigène ne fixera pas les anticorps monoclonaux marqués. La mesure de l'activité enzymatique résultante permet d'estimer la quantité d'anticorps monoclonaux liée à l'antigène non complexé par les anticorps de l'échantillon. La quantité d'anticorps dirigés contre l'antigène BTV-8 présents dans l'échantillon à tester peut donc être déterminée par calcul de la différence. Les résultats obtenus sont exprimés en unité de densité optique à 450 nm ou en pourcentage de compétition (de l'anticorps monoclonal vis-à-vis des anticorps de l'échantillon) par rapport au contrôle négatif. Par le terme « échantillons » sont considérés tous fluides biologiques 35 porteurs d'un intérêt sérodiagnostic tels que par exemple le jus de viande, le plasma, le sérum, le lait, etc... La mise au point du test a été effectuée sur des panels de sérums de différentes espèces de ruminants (ovins, bovins, caprins). L'antigène BTV-8 utilisé dans ce test est la protéine de capside VP2 5 du BTV-8, et plus particulièrement les épitopes portés par la protéine VP2 et présentant les caractéristiques suivantes : - être spécifiques du sérotype 8 du virus de la fièvre catarrhale (BTV-8), - ne pas être impliqués dans les phases virales adsorption et 10 pénétration (anticorps monoclonaux non neutralisants), - être reconnus par les anticorps d'animaux naturellement infectés par le BTV-8 - être peu, ou pas, reconnus par les anticorps d'animaux vaccinés à l'aide d'un vaccin inactivé mono- ou multivalent contenant le BTV-8. Les anticorps monoclonaux utilisés dans ce test sont les anticorps notés « 6C3 » (CNCM I-4314) et sont couplés de manière directe et covalente à la peroxydase de raifort. Leur préparation, leur sélection et leur production a été décrite précédemment dans ce document. 20 2.6 Protocole du test ELISA de compétition DIVA VP2-BTV8 sérotype différenciant 25 Les réactifs utilisés dans le cadre de la technique ELISA sont des éléments entrants dans la composition des kits commerciaux de la société IDVET. Afin de définir les termes utilisés, les différentes solutions utilisées sont identifiées ci-dessous : Solution de Lavage : Solution SL 30 Solution de Saturation : Solution ST Solution de Révélation : Solution SR Solution d'Arrêt : Solution SA Solution de dilution des sérums : DL18 Solution de dilution de l'anticorps monoclonal conjugué à la 35 péroxydase : DL19 15 Les données ont été obtenues par lecture de la densité optique à 450nm à l'aide d'un spectrophotomètre multicanaux (ex : Sunrise, Tecan) Le protocole retenu pour la réalisation de l'essai est décrit ci-après : La protéine VP2 recombinante du BTV-8 a été déposée dans des plaques 96 puits à une dilution en PBS optimale prédéterminée puis incubée à température ambiante sur la nuit. Après lavage afin d'enlever l'excès d'antigène non fixé, une saturation des plaques a été effectuée à l'aide de 200µL de solution ST. La solution de saturation a ensuite été éliminée et 50µL/puit de sérums d'animaux naïfs, infectés ou vaccinés ont été déposés après dilution au 'A en solution en DL18. Après lh d'incubation à 37 °C, les plaques ont été lavées trois fois à l'aide de solution SL et 100µL/puit d'anticorps monoclonal murin anti-VP2 couplé à la péroxydase ont été ajoutés et incubés 30 min. supplémentaires à température ambiante. Après 3 lavages en solution SL, 100 µL/puit de solution SR ont été 20 ajoutés, puis la réaction a été arrêtée après 15 min. par l'ajout d'un volume identique de solution SA. Les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été enregistrées. Les valeurs sont représentées en pourcentage de la valeur obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). 25 2.7 Evaluation de la spécificité et de la sensibilité du test: Discrimination des animaux naturellement infectés par le BTV8 des animaux naïfs. Afin de déterminer le pouvoir discriminant du test cELISA VP2-BTV8 entre des animaux naïfs ou infectés par le BTV, un panel de sérums bovins 30 naïfs (n= 66) ou naturellement infectés par le BTV8 (n= 67) ont été testés en ELISA de compétition afin de comparer leurs séroconversions anti-VP7 et anti-NS 1. La détection d'anticorps anti-VP7 a été réalisée à l'aide du kit commercial ID Screen® Bluetongue Competition d'IDVET selon le protocole associé. Les valeurs d'absorbance à 450nm ont été relevées et représentées en pourcentage de la valeur 35 obtenue pour l'échantillon sur la moyenne des contrôles négatifs (S/N). 15 Les résultats obtenus montrent que l'ensemble des sérums d'animaux naïfs présente un pourcentage de blocage du signal compris entre 60 et 130 %. Au contraire, les sérums d'animaux infectés présentent une répartition comprise entre 0 et 15 % de blocage. La spécificité et la sensibilité de ce test sont donc satisfaisantes et permettent une distinction nette entre les animaux naïfs et ceux qui sont naturellement infectés par le BTV-8. 2.8 Evaluation du potentiel BTV8-différenciant du test : Discrimination des animaux naturellement infectés par le BTV8 de ceux infectés 10 par d'autres sérotypes du BTV. Le caractère sérotype 1-8 différenciant a été un critère de sélection des hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux anti-BTV8 à la base de ce test sérodiagnostic. IDVET a souhaité évaluer, et valider le cas échéant, cette propriété 15 de différenciation entre le sérotype 8 et les autres principaux sérotypes du BTV rencontrés en Europe et aux Etats-Unis, à savoir le BTV-1, -2, -4, -9, -16 et le BTV-10, respectivement. Pour ce faire, la réponse sérologique anti-VP7 (Fig. 5A.) et anti-VP2 BTV8 (Fig. 5B.) d'animaux (bovins et ovins) naïfs ou infectés par les différents 20 sérotypes d'intérêt a été évaluer à l'aide d'un test BTV de compétition classique sérotype non-différenciant (ID Screen® Bluetongue Competition, IDVET) et du test cELISA VP2-BTV8. Les résultats obtenus ont montré que l'ensemble des animaux testés 25 été positifs lors d'une évaluation par test ELISA de compétition classique (anti-VP7). Dans cette approche diagnostique, aucune distinction relative au sérotype du BTV responsable de l'infection n'a donc pu être mise en évidence. Au contraire, les résultats obtenus dans le test ELISA de compétition VP2-BTV8 ont montré que seuls les animaux infectés par le sérotype 8 du BTV présentés un blocage du signal 30 élevé (S/N de 5 %) et donc un statut positif. Les autres sérotypes n'engendrant que de faibles blocages du signal (S/N > 75 %). Ce test cELISA VP2-BTV8 est donc capable de différencier les animaux infectés par le BTV-8 des animaux infectés par le BTV-1 mais aussi des autres sérotypes tels que -2, -4, -9, -16 ou -10. 35 2.9 Evaluation du potentiel DIVA BTV-8 du test: Discrimination entre les animaux naturellement infectés par le BTV-8 et ceux vaccinés contre ce virus. Les études sur l'anticorps 6C3 ont montré le potentiel DIVA de cet anticorps. Dans le but de vérifier le maintien de cette caractéristique dans le test cELISA VP2-BTV8, un panel de sérums bovins (n=46) obtenu avant (JO) et après vaccination 0+45) contre le BTV-8 à l'aide d'un vaccin inactivé a été testé. Le protocole de vaccination a été effectué conformément aux recommandations du fabricant et ces sérums ont été analysés à l'aide d'un test ELISA de compétition classique (ID Screen® Bluetongue Competition, IDVET) et du test cELISA VP2-BTV8. Afin d'évaluer le potentiel discriminant entre les animaux vaccinés et les animaux naturellement infectés par le BTV-8, un panel de sérums d'animaux naturellement infectés a également été analysé à l'aide de ces deux tests. Les résultats obtenus à l'aide du test ELISA de compétition classique (Fig.6.A.) montrent que la répartition des échantillons d'animaux vaccinés passe de 80 à 130 % de la valeur moyenne des contrôles négatifs, avec un maximum à 90-100 %, avant vaccination (JO) à une répartition entre 0 et 15 %, avec un maximum à 5-10 %, après vaccination contre le BTV-8 et ceci pour l'ensemble des animaux étudiés. Ces dernières valeurs sont très proches de celles obtenues avec les sérums d'animaux naturellement infectés qui présentent quant à eux une répartition comprise entre 0 et 10 %, avec un maximum à 0-5 %. Ces résultats mettent en évidence une séroconversion vaccinale anti- VP7 du BTV-8 forte conduisant au passage d'un statut séronégatif avant vaccination à un statut séropositif fort après vaccination empêchant toute distinction entre les animaux vaccinés et les animaux naturellement infectés par le BTV-8. Avec l'utilisation du test cELISA VP2-BTV8 la répartition des échantillons d'animaux vaccinés (Fig.6.B.) est différente de celle décrite précédemment pour un test cELISA classique. En effet, elle passe de 50 à 130 % de la valeur moyenne des contrôles négatifs, avec un maximum à 100-110 %, avant vaccination (JO) à une répartition entre 30 et 130 %, avec un maximum à 70-80 %, après vaccination contre le BTV-8. Ces dernières valeurs sont ainsi clairement distinctes de celles obtenues avec les sérums d'animaux naturellement infectés qui présentent une répartition comprise entre 0 et 15 %, avec un maximum à 5-10 %. Ce test cELISA VP2-BTV8 met donc en évidence une séroconversion vaccinale anti-VP2 plus modérée que celle observable lors d'une infection naturelle et permet ainsi de distinguer les animaux vaccinés des animaux 5 naturellement infectés par le BTV-8. 40 REVENDICATIONS1. Utilisation de la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, pour la préparation d'un réactif ou d'un kit « DIVA-BTV-8 » destiné à différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou composition ou composé la comprenant, est 10 choisie parmi : - une protéine VP2 isolée et, le cas échéant purifié, du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques; - une protéine VP2 recombinante, de préférence de séquence d'acide aminé SEQ ID NO :1 ou l'un de ses fragments antigéniques; ou 15 - un virus BTV-8, ou l'un de ses fragments contenant la protéine VP2 ou l'un de ses fragments antigéniques, caractérisé en ce que : - ledit fragment antigénique de la protéine VP2 est un fragment capable de se fixer spécifiquement sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé 20 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315 ; ou - l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé sous le numéro I- 25 4314 ou l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé sous le numéro I-4315 est dirigé spécifiquement contre ledit fragment antigénique de la protéine VP2. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit réactif ou kit 30 comprend, de préférence séparément dudit réactif contenant ladite protéine VP2, un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine VP2-BTV-8. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit anticorps ou fragment d'anticorps est choisi parmi les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les anticorps chimériques, ou leurs fragments fonctionnels, en particulier les fragments Fab, (Fab')z, Fab', Fv, scFv, scFv-Fc des anticorps précédents. 5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que ledit anticorps est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que ledit anticorps ou fragment d'anticorps est couplé à un marqueur. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou composition ou composé la comprenant, est fixée ou adsorbée sur un support solide, de préférence sur une cupule de microplaque. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit animal est un ruminant, de préférence un bovin , un ovin ou un caprin. 9. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 à partir d'un échantillon biologique dudit animal, 30 caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et b) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine VP2, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-VP2 susceptible d'être présent dans le dit échantillon. 10. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'étape b) est une étape de révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine VP2, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-VP2-BTV-8 susceptible d'être présent dans le dit échantillon. 11. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce qu'à l'étape b), la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) est réalisée par une méthode ELISA en compétition mettant en oeuvre un anticorps, ou l'un des fragments fonctionnels, capable de reconnaître spécifiquement la protéine VP2 du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques. 12. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon la revendication 1l, caractérisée en ce que ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode ELISA en compétition est un anticorps marqué, de préférence à la peroxydase 13. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ledit anticorps mis en oeuvre à l'étape b) dans la méthode ELISA en compétition est l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous lenuméro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315. 14. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 5 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que : - soit ladite protéine VP2 du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques, mis en oeuvre à l'étape a), ou - soit ledit anticorps capable de reconnaître spécifiquement la protéine VP2 du virus 10 BTV-8 mis en oeuvre à l'étape b), est marqué, de préférence à la peroxydase. 15. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon l'une des revendications 8 à 14, 15 caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est un échantillon de fluide biologique, de préférence choisi parmi le plasma, le sérum ou un échantillon de sang total de l'animal, le sérum étant le plus préféré. 16. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 20 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon l'une des revendications 9 à 15, caractérisée en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec la protéine VP2 d'un virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, ladite protéine VP2 25 étant préalablement capturée par immunocapture sur une phase solide revêtue d'un anticorps anti-VP2-BTV-8 de type polyclonal, ou, de type monoclonal ou tel que défini dans les revendication 3 à 5 ; b) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) entre ladite protéine VP2, ou l'un de ses fragments antigéniques, et un anticorps anti-VP2 susceptible 30 d'être présent dans ledit échantillon, cette révélation étant réalisée par une méthode d'immunodosage en compétition mettant en oeuvre un anticorps anti-VP2, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence marqué, tel que défini dans l'une des revendications 3 à 6 . 17. Méthode in vitro pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8 selon l'une des revendications 9 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape b), une réaction de compétition observée et résultant par une diminution importante du signal obtenu pour l'échantillon testé comparé au signal obtenu pour un contrôle négatif est significatif de la présence d'un échantillon émanant d'un animal infecté par BTV-8, de préférence un signal représentant 0 à 20 %, de manière plus préférée 0 à 15 % du signal obtenu pour ledit contrôle négatif. 18. Kit ou trousse de réactifs pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8, ledit kit comprenant : a) un composé ou composition comprenant la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2 ; b) un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine VP2, le cas échéant marqué, de préférence ledit anticorps est polyclonal, monoclonal ou chimérique ; et, le cas échéant, c) les réactifs nécessaires à la réaction. 19. Kit ou trousse de réactifs selon la revendication 18, caractérisé en ce que : a) ledit composé ou ladite composition comprenant la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou ledit fragment antigénique de ladite protéine VP2, est choisi parmi : - une protéine VP2 isolée et, le cas échéant purifié, du virus BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques; - une protéine VP2 recombinante, de préférence de séquence d'acide aminé SEQ 30 ID NO :1 ou l'un de ses fragments antigéniques; ou - un virus BTV-8, de préférence inactivé, ou l'un de ses fragments contenant la protéine VP2 ou l'un de ses fragments antigéniques ; ou - un support solide, telle qu'une cupule de microplaque, sur lequel est fixée ou adsorbée ladite protéine VP2-BTV-8, ou l'un de ses fragments antigéniques telle que définie ci-dessus dans la revendication, et caractérisé en ce que : - ledit fragment antigénique de la protéine VP2 est un fragment capable de se fixer spécifiquement sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou sur l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315 ; ou - l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé sous le numéro I-4314 ou l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé sous le numéro I-4315 est dirigé spécifiquement contre ledit fragment antigénique de la protéine VP2 ; et b) ledit un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou contre un fragment antigénique de ladite protéine VP2, le cas échéant marqué est choisi parmi l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la CNCM, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315, ou l'un de ses fragments fonctionnels. 20. Procédé de sélection d'un anticorps pour différencier un animal vacciné contre le virus BTV-8 d'un animal infecté par un virus BTV-8, le cas échéant utilisable dans une méthode d'ELISA en compétition, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante: a), le cas échéant la sélection d'un hybridome obtenu après immunisation d'un animal avec un antigène choisi parmi un composé ou une composition comprenant la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, tel que défini dans la revendication 18 a); b) la mise en contact dudit anticorps à tester avec la protéine de capside VP2 du virus BTV-8, ou un fragment antigénique de ladite protéine VP2, ou d'une composition ou composé comprenant une telle protéine ou un tel fragment, et c) la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (b) entre ladite protéine VP2, ou l'un de ses fragments antigéniques, et ledit un anticorps testé, et dans laquelle étape la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) est réalisée par une méthode ELISA en compétition mettant en oeuvre un anticorps, ou l'un des fragments fonctionnels, ledit un anticorps étant choisi parmi l'anticorps sécrété par l'hybridome dénommé 6C3 Id Vet déposé à la CNCM, le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4314 ou par l'hybridome dénommé 10E9 Id Vet déposé à la CNCM le 21 Juin 2010 sous le numéro I-4315, ou l'un de ses fragments fonctionnels, le cas échéant marqué.10