Brevet FR2963021A1 — publié le 20120127

B10029FR 1 La présente invention est relative à un catalyseur enzymatique hétérogène constitué d'un monolithe de silice macroporeux incorporant une enzyme immobilisée par l'intermédiaire d'un agent de couplage, à un procédé de préparation de ce catalyseur enzymatique, à l'utilisation de ce catalyseur pour la réalisation de réactions chimiques par catalyse enzymatique hétérogène en flux continu et à un procédé de catalyse enzymatique hétérogène en flux continu mettant en oeuvre ledit catalyseur. Etant donné que les carburants dérivés du pétrole sont des sources d'énergie non renouvelable et que leur utilisation génère une accumulation de dioxyde de io carbone, de polluants et de composés potentiellement cancérigènes dans l'environnement, des efforts considérables ont été déployés pour développer des carburants « verts » alternatifs, c'est-à-dire des carburants renouvelables, biodégradables et non toxiques. Dans ce contexte, le biodiesel (esters méthyliques ou éthyliques d'acides gras), carburant naturel obtenu à partir de végétaux ou 15 d'huiles végétales usagées, a suscité une attention considérable au cours des dix dernières années. Le biodiesel est obtenu par transestérification des triglycérides des huiles végétales avec un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol. Les triglycérides des huiles sont des esters de glycérol (encore désigné sous le nom de glycérine) et d'acides gras R-COOH. 20 A titre d'exemple, la réaction de transestérification des triglycérides des huiles par le méthanol peut être représentée par le schéma réactionnel suivant : H3C-OCO-CH2 HO-CH2 R-OCO-CH3 H3C-OCO-CH + 3 CH3OH HO-CH + R-OCO-CH3 I I H3C-OCO-CH2 HO-CH2 R-OCO-CH3 Triglycérides Méthanol Glycérol Esters méthyliques Il est existe deux grands types de procédé de production de biodiesel : les procédés de catalyse en phase homogène, mettant en oeuvre des catalyseurs 25 solubles dans le milieu réactionnel et les procédés de catalyse en phase hétérogène mettant en oeuvre des catalyseurs non solubles dans le milieu réactionnel. A l'heure actuelle, la production de biodiesel est principalement réalisée par catalyse en phase homogène. Elle consiste à réaliser la transestérification des triglycérides en présence de catalyseurs acides tels que des acides minéraux (HC1, 30 H2SO4) ou des acides sulfoniques, ou bien des catalyseurs basiques tels que des hydroxydes, des alcoolates, des savons de métaux alcalins ou alcalino-terreux ou bien encore des amines de la famille des guanidines par exemple. Une plus grande réactivité est généralement obtenue en milieu basique. Les catalyseurs acides sont B10029FR 2 moins souvent utilisés du fait de leur moindre réactivité (ils sont environ 4000 fois moins rapides que les catalyseurs basiques) et des risques élevés de corrosion des installations industrielles. Ces procédés peuvent être mis en oeuvre en flux discontinus ou en flux continus. Bien que les procédés de production de biodiesel par catalyse en phase homogène alcaline soient peu chers à mettre en oeuvre et très réactifs, ils présentent cependant l'inconvénient majeur d'être très consommateurs en énergie. De plus, la présence à la fois d'eau et d'acides gras dans le milieu réactionnel génère une réaction partielle de saponification entraînant une perte de l'efficacité catalytique (H. Fukuda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2001, 92, 405-416). Récemment, des procédés de transestérification enzymatique mettant en oeuvre une lipase ont été présentés comme une alternative intéressante pour la synthèse du biodiesel car ces procédés permettent de s'affranchir des inconvénients rencontrés avec le procédé de catalyse homogène (M.S. Antczak et al., Renewable Energy, 2009, 34, 1185-1194). Les lipases permettent de catalyser l'hydrolyse des huiles végétales de façon spécifique et en conditions douces, d'une part en libérant du glycérol et d'autre part, en présence d'un alcool à chaine courte, de favoriser la formation d'esters à chaînes linéaires. De plus, à l'issue de la réaction, il est facile de récupérer le glycérol, qui est le sous produit de la réaction de transestérification, et la purification des esters d'acides gras est simple à réaliser. Le principal obstacle à l'industrialisation de ces procédés est le coût de production des enzymes, ainsi que le contrôle rigoureux des paramètres réactionnels pendant la réaction de transestérification. Une des solutions à ce problème consiste à immobiliser les enzymes sur un support solide. On parle alors de catalyse enzymatique hétérogène. La catalyse enzymatique hétérogène consiste à réaliser la transestérification des triglycérides des huiles végétales en présence d'un catalyseur insoluble dans le milieu réactionnel. La catalyse enzymatique hétérogène présente des avantages significatifs en matière de respect de l'environnement. En particulier, elle répond aux critères associés aux nouveaux concepts de « chimie verte », car la pureté des produits obtenus, associée à des rendements de synthèse élevés, conduit à une disparition pratiquement totale de rejets polluants. De plus, l'absence de sels dans les produits de réaction, n'impose pas, à la différence de la catalyse en phase homogène, des traitements coûteux de purification, et élargit les possibilités de débouchés industriels. B10029FR 3 Il a par exemple déjà été proposé, notamment par Chen G. et al., Biodiesel. Appl., Biochem. Biotech., 2006, 132 (1-3), 911-921, un procédé de conversion d'huiles de cuisson en biodiesel par une lipase de Rhizopus orzyae immobilisée sur un support solide. Les auteurs indiquent que dans les conditions les plus optimales, le taux de conversion en esters méthylique est de 88-90 %. La nature du support solide sur lequel la lipase est immobilisée n'est pas indiquée dans cet article. Plus récemment, Li et al., Process Biochem., 2009, 44 (6), 685-688, ont proposé un procédé de conversion enzymatique d'huiles de cuisson en biodiesel en milieu solvant organique utilisant une lipase de Penicillium expansum adsorbée dans un io gel de silice. Les auteurs indiquent cependant que la présence de l'eau issue de la réaction d'estérification nuit à l'obtention d'un taux élevé en esters méthyliques. Les différents systèmes catalytiques enzymatiques actuellement proposés sont constitués d'un support solide généralement poreux (matrices polymères, silice colloïdale, silicate de calcium, zéolithes, zirconium, kaolinite, verre poreux, 15 alumine, etc...), sur lequel une enzyme est immobilisée. Les supports solides des catalyseurs mis en oeuvre en catalyse hétérogène sont notamment des zéolites acides, des hétéropolyacides, des résines échangeuses ions et des acides sulfoniques immobilisés sur des supports solides, des zircones sulfatées et des oxydes métalliques mixtes. Le plus souvent, les catalyseurs solides dans lesquels le support 20 solide est une zéolithe se présentent sous la forme de poudre et doivent être dispersés dans le milieu réactionnel dans lequel ils doivent être présents pour catalyser une réaction. Compte tenu de la petite taille des particules, la récupération de ces catalyseurs dans le milieu réactionnel est une étape contraignante. Les autres supports solides utilisables en catalyse hétérogène ne donnent par ailleurs pas 25 entièrement satisfaction d'un point de vue de leur résistance mécanique et à la température. Afin d'atteindre des niveaux de production élevés, notamment en biodiesel, il est important de pouvoir faire fonctionner ces catalyseurs hétérogènes en flux continu. 30 Or, tous les supports solides sur lesquels il est possible d'immobiliser des enzymes ne sont cependant pas compatibles avec un procédé de catalyse hétérogène en flux continu. Par ailleurs, les supports utilisables en flux continu ne permettent pas toujours d'atteindre des taux de conversion élevés et stables dans le temps. En effet, la première condition sine qua none est d'avoir un matériau 35 monolithique. La seconde condition est que ce matériau ait une macroporosité interconnectée de façon à permettre l'écoulement du milieu réactionnel. La B10029FR 4 troisième condition est que les propriétés mécaniques du monolithe supportent le flux imposé et la température sur longue durée. Il existe donc un besoin pour un catalyseur enzymatique hétérogène : - qui soit utilisable dans un procédé de catalyse en flux continu (ne nécessitant pas d'étape de régénération intermédiaire), notamment pour catalyser la production de biodiesel par transestérification des triglycérides d'acides gras présents dans les huiles végétales ; - qui soit utilisable sur une longue durée sans perte significative de l'activité catalytique ; io - qui puisse être préparé selon un procédé simple à mettre en oeuvre, - qui permettent l'utilisation d'enzymes non purifiées avec une très grande efficacité catalytique. Ce but atteint par le catalyseur enzymatique hétérogène qui fait l'objet de la présente invention et qui va être décrit ci-après. 15 La présente invention a pour objet un catalyseur enzymatique hétérogène caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 µm et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits macropores étant 20 interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée une enzyme, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'enzyme immobilisée est une enzyme non purifiée. En effet, ainsi que cela est démontré dans 25 les exemples illustrant la présente demande, l'utilisation d'un tel monolithe rend possible la mise en oeuvre d'une enzyme non purifiée pour la catalyse en flux continu d'une réaction chimique, et tout particulièrement, lorsque l'enzyme est une lipase, d'une réaction de transestérification des triglycérides d'acides gras. Au sens de la présente invention, on entend par « enzyme non purifiée », 30 tout matériel protéique comprenant au moins une enzyme non isolée, n'ayant subi aucune étape de purification. On entend par « monolithe », un objet solide ayant une dimension moyenne d'au moins 1 mm. B10029FR Dans ce monolithe, les parois des macropores ont généralement une épaisseur de 0,5 à 40 µm, et de préférence de 2 à 25 µm. La surface spécifique du monolithe est généralement de 200 à 1000 m2/g environ, préférentiellement de 100 à 300 m2/g environ. 5 Selon l'invention, la liaison assurant la fixation de l'agent de couplage avec la silice est une liaison iono-covalente. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'agent de couplage est choisi parmi les silanes choisis dans le groupe constitué par le y-glycidoxypropyltriméthoxysilane ; les liquides ioniques silylés tels que par exemples le chlorure de 1-méthyl-3-(3-triéthoxysilylpropyl)imidazolium, 1'hexafluorophosphate de 1-méthyl-3-(3-triéthoxysilylpropyl)imidazolium ; les silanes de formule Si(OR2)3R3 dans laquelle R2 représente un groupement alkyle en C1-C2, et R3 représente un groupement -(CH2OH-CH2OH)q CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)gCH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10. Parmi de tels silanes, le y-glycidoxypropyltriméthoxysilane, également connu sous la dénommination « Glymo », est particulièrement préféré. La nature de l'enzyme pouvant être immobilisée sur le monolithe de silice par l'intermédiaire de l'agent de couplage n'est pas critique à partir du moment où elle comporte au moins un groupement fonctionnel apte à réagir avec un groupement fonctionnel complémentaire porté par l'agent de couplage pour former une liaison iono-covalente. Lorsque l'agent de couplage utilisé est un liquide ionique silylé, il s'agit de liaisons électrostatiques. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'enzyme est choisie 25 parmi : i) les hydrolases (classe E.C. 3 de la classification établie par la Commission des Enzymes, Bruxelles), telles que les estérases (E.C. 3.1), et en particulier les hydrolases d'esters carboxyliques (E.C. 3.1.1) telles que les lipases (E.C. 3.1.1.3 ou triacylglycérol acylhydrolases) ; les amino-acylases (E.C. 3.5.1.14), les amidases 30 (E.C. 3.5.1.4 ; E.C. 3-5-1-3 ou oméga-amidase ; E.C. 3-5-1-11 ou pénicillineamidase) ; les nitrilases (classe E.C. 3.5.5.1.) qui catalysent l'hydrolyse des nitriles en acides carboxyliques ; ii) les lyases (classe E.C. 4) comprenant notamment les carboxy-lyases (E.C. 4.1.1), les aldéhydes-lyases (E.C. 4.1.2.) telles que les oxynitrilases (classes B10029FR 6 E.C. 4-1-2-10 et E.C. 4-1-2-37) catalysant la synthèse de cyanohydrines chirales ; et les hydro-lyases (E.C. 4.2.1) ; iii) les isomérases (E.C. 5) comprenant notamment les épimérases et les racémases (E.C. 5.1.), et en particulier les épimérases et les racémases de la classe E.C. 5.1.1. catalysant la formation d'énantiomères d'amino-acides ; et iv) les oxydoréductases (E.C. 1) comprenant notamment les glucose oxydases (E.C. 1.1.3.4) telles que la glucose oxydase d'Aspergillus piger et les peroxydases (E.C. 1.11.1) telles que la peroxydase de raifort. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, le io catalyseur hétérogène est destiné à être utilisé dans un procédé de production de biodiesel par transestérification de triglycérides d'acides gras et l'enzyme est choisie parmi les lipases d'origine microbienne ou végétale, et en particulier, parmi les lipases de Candida Rugosa, Candida antartica, Aspergillus piger, Aspergillus oryzae, Thermomyces Lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor 15 miehei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Penicillium roqueforti, Penicillium expansum, Rhizopus arrhizus et les lipases de germe de blé. La quantité d'enzymes immobilisée au sein du catalyseur conforme à l'invention peut être déterminée par analyse thermogravimétrique et par analyse élémentaire. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la quantité 20 d'enzyme immobilisée varie de 1 à 40 % massique environ et plus préférentiellement de 3 à 20 % massique environ par rapport à la masse totale du catalyseur. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un catalyseur enzymatique hétérogène conforme à l'invention et tel que défini ci- 25 dessus, ledit procédé comportant les étapes suivantes : 1) une première étape de préparation d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 µm et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits pores étant 30 interconnectés, ladite première étape comprenant les sous-étapes suivantes : la) la préparation d'une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une solution aqueuse de tensioactif, lb) l'ajout d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de 35 l'émulsion, B10029FR 7 1c) l'introduction du mélange réactionnel dans un moule, 1 d) le repos du mélange réactionnel dans le moule jusqu'à la condensation dudit précurseur de silice sous la forme dudit monolithe, 1 d) le lavage dudit monolithe, en flux continu, avec un solvant organique ; 2) une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par imprégnation du monolithe alvéolaire, en flux continu, par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique ; et 3) une troisième étape d'immobilisation d'au moins une enzyme sur l'agent io de couplage par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par imprégnation du monolithe ainsi fonctionnalisé, en flux continu, par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme. Selon une forme particulière et préférée de l'invention, le moule utilisé lors de la première étape est lui-même confiné à l'intérieur d'un dispositif permettant la 15 circulation d'un liquide en flux continu, tel que par exemple une colonne de chromatographie. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les flux continus mentionnés aux étapes 2) et 3) dudit procédé sont des flux continus ascendants de façon à optimiser la répartition de l'agent de couplage, puis de l'enzyme dans 20 l'ensemble du volume des macropores du monolithe de silice alvéolaire. Au cours des étapes 2) et 3), la vitesse du flux varie de préférence de 0,02 à 0,1 mL/min. L'étape 2) de fonctionnalisation est de préférence réalisée à température ambiante, et pendant une durée de 24 heures et encore plus préférentiellement 25 pendant une durée d'environ 72 heures. L'étape 3) d'immobilisation est de préférence réalisée à température ambiante, et pendant une durée de 72 heures et encore plus préférentiellement pendant une durée d'environ 120 heures (5jours). Eventuellement, cette étape peut être réitérée deux fois. Dans ce cas, le procédé comprend en outre, avant la 30 réalisation de l'étape 3) pour la seconde fois, une étape supplémentaire d'imprégnation du monolithe en flux continu par une solution d'un aldéhyde, tel que par exemple le glutaraldéhyde. Cette étape entraîne la fixation de l'aldéhyde sur les groupements aminés de l'enzyme préalablement fixée sur l'agent de B10029FR 8 couplage et permet l'immobilisation subséquente d'une deuxième couche d'enzymes. Selon l'invention, le ou les précurseur(s) de silice sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane (TMOS), le tetraéthoxyorthosilane (TEOS), le diméthyldiéthoxysilane (DMDES), les mélanges du DMDES avec le TEOS ou le TMOS, les mélanges du TMOS ou du TEOS avec le y-glycidoxypropyltriméthoxysilane, et les mélanges du DMDES ou du y-glycidoxypropyltriméthoxysilane avec un silicate. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le précurseur de silice io est le TEOS. La concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice au sein de la solution aqueuse est, de préférence, supérieure à 10 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. Cette concentration varie plus préférentiellement de 17 à 35 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. 15 La phase huileuse de l'émulsion préparée à l'étape 1) est de préférence constituée par un ou plusieurs composés choisis parmi les alcanes linéaires ou ramifiés ayant au moins 12 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le dodécane et l'hexadécane. La phase huileuse peut en outre être constituée par une huile de silicone de faible viscosité, c'est-à-dire inférieure à 400 centipoise. 20 La quantité de phase huileuse présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour la matrice de silice, étant entendu que plus la fraction volumique huile/eau sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également. 25 De manière générale, la phase huileuse représente de 60 à 90 % en volume par rapport au volume total de l'émulsion. Cette quantité d'huile permet d'obtenir une matrice de silice dans laquelle le diamètre moyen des macropores varie de 1 à 100 µm environ. Le composé tensioactif peut être un tensioactif cationique choisi notamment 30 parmi le bromure de tetradécyltriméthylammonium (TTAB), le bromure de dodécyltriméthylammonium ou le bromure de cétyl-triméthylammonium. Lorsque le composé tensioactif est cationique, le milieu réactionnel est porté à un pH inférieur à 3, de préférence inférieur à 1. Le bromure de tetradécyltriméthylammonium est particulièrement préféré. B10029FR 9 Le composé tensioactif peut enfin être un tensioactif non ionique choisi parmi les tensioactifs à tête éthoxylée, et les nonylphénols. Parmi de tels tensioactifs, on peut en particulier citer les copolymères blocs d'éthylèneglycol et de propylèneglycol vendus par exemple sous les dénominations commerciales Pluronic® P123 et Pluronic® F127 par la société BASF. Lorsque le composé tensioactif est non ionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10 ou inférieur à 3, de préférence inférieur à 1 et contient en outre, de préférence, du fluorure de sodium afin d'améliorer la condensation des précurseurs de l'oxyde de silice. La quantité totale de tensioactif présente au sein de l'émulsion peut également être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir dans l'empreinte de silice. Cette quantité est également variable en fonction la nature du tensioactif utilisé. De manière générale, la quantité de tensioactif varie de 1 à 10 % en masse, 15 de préférence de 3 à 6 % en masse, par rapport à la masse totale de l'émulsion. L'étape de condensation du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice est effectuée avantageusement à une température proche de la température ambiante. La durée de cette étape peut varier de quelques heures (2 à 3 heures) à quelques semaines (2 à 3 semaines) en fonction du pH du milieu réactionnel. 20 Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le solvant organique utilisé pour le lavage de la matrice de silice obtenue à la fin de la première étape est choisi parmi le tetrahydrofurane, l'acétone et leurs mélanges. Le solvant de la solution d'agent de couplage utilisé lors de l'étape 2) de fonctionnalisation est un solvant organique, de préférence choisi parmi le 25 chloroforme, le toluène et leurs mélanges. De façon préférentielle, ledit solvant est le chloroforme. La quantité d'agent de couplage dans la solution utilisée pour l'étape de fonctionnalisation peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores du monolithe de silice et de la quantité d'enzyme que l'on souhaite immobiliser. De 30 manière générale, cette quantité peut varier de 0,02 M à 0,5 M, et de préférence de 0,05 M à 0,2 M. Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, on utilise une solution d'agent de couplage à 0,05 M dans le chloroforme. Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'invention, 35 le monolithe fonctionnalisé par l'agent de couplage, tel qu'obtenu à l'issue de B10029FR 10 l'étape 2) de fonctionnalisation, est lavé, sous flux continu, avec un solvant organique tel que par exemple le tetrahydrofurane, le chloroforme ou l'acétone, puis ensuite à l'eau distillée. Egalement de manière préférée, à la fin de l'étape 3) d'immobilisation, le 5 monolithe est de préférence lavée, en flux continu, avec de l'eau distillée. Le catalyseur enzymatique hétérogène conforme à la présente invention peut être utilisé pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène en flux continu. La nature des réactions chimiques susceptibles d'être catalysées par le catalyseur conforme à l'invention variera bien entendu en fonction io de la nature de l'enzyme non purifiée qui est immobilisée. Ainsi lorsque l'enzyme non purifiée est une lipase, le catalyseur conforme à l'invention est utilisé pour catalyser l'hydrolyse de triglycérides d'acides gras, des réactions d'estérification entre un acide et un alcool, des réactions de transestérification entre un ester et un alcool, des réactions d'inter-estérification 15 entre deux esters ou des réactions de transfert d'un groupement acétyle d'un ester sur une amine ou sur un thiol. En particulier, lorsque l'enzyme est une lipase, ledit catalyseur peut être utilisé par exemple pour catalyser : - la synthèse du butyloléate qui est un lubrifiant pour les biodiesels ; 20 - l'hydrolyse des dérivés de l'ester glycérolinoléique pour conduire à des savons ou à des détergents : - des réactions de trans-estérification de triglycérides d'acides gras par un alcool, lesdites réactions étant impliquées dans la synthèse de biodiesels à faible viscosité. 25 Enfin la présente invention a pour objet un procédé de catalyse enzymatique hétérogène mettant en oeuvre ledit catalyseur. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il est réalisé par passage d'un milieu réactionnel liquide en flux continu ascendant au travers dudit catalyseur hétérogène. La vitesse du flux peut varier en fonction de la nature de l'enzyme 30 immobilisée dans le catalyseur. De façon générale, la vitesse du flux varie de 0,02 à 0,2 mL/min. Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, le procédé de catalyse hétérogène est un procédé de production de biodiésel, alors B10029FR 11 milieu réactionnel comprend des triglycérides d'acides gras et l'enzyme incorporée dans le catalyseur hétérogène est une lipase. La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée. EXEMPLES Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent sont listées ci-après : - Bromure de tetradécyltriméthylammonium à 98 % (TTAB) : société Fluka ; - Tetraéthoxyorthosilane à 98 % (TEOS) : société Fluka ; - Dodécane à 99 % : société Fluka ; - Agent de couplage : y-glycidoxypropyltriméthoxysilane vendu sous la dénomination commerciale Glymo par la société Sigma Aldrich (St-Louis, MO) ; - Lipase de Candida Rugosa, E.C.3.1.1.3, Type VII, à 700 U/mg, Société Sigma Chemical (St Louis, MO) ; - Lipase de Thermomyces Lanuginosus, solution à au moins 100000 U/g, société Sigma Aldrich (St. Louis, MO) ; - Acide oléique, trilinoléate de glycéryle (98 %), linoléate d'éthyle (> 98%), acide linoléique (> 99 %), n-heptane, éthanol, 1-butanol, Société Sigma Aldrich (Paris, France). Les autres produits chimiques et solvants utilisés dans les exemples étaient tous de grade analytiques ou de grade HPLC. Ces matières premières ont été utilisées telles que reçues des fabricants, sans 25 purification supplémentaire. B10029FR Caractérisations : La macroporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope électronique à balayage vendu sous la référence JSM-840A par la société JEOL, fonctionnant à 10 kV. Les échantillons ont été revêtus d'or ou de carbone avant leur caractérisation. La macroporosité a été quantifiée par des mesures d'intrusion de mercure, à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics Autopore IV, pour atteindre les caractéristiques des cellules macroscopiques composant le io squelette du monolithe. Les mesures de surface spécifique et les caractérisations à l'échelle mésoscopique ont été faites par des techniques d'adsorption-désorption d'azote à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics ASAP 2010 ; le dépouillement étant fait par les méthodes de calcul B.E.T ou B.J.H. 15 La mésoporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope vendu sous la référence H7650 par la société Hitachi, ayant une tension d'accélération de 80 kV, et couplé à une caméra vendue sous la référence Orius 11 MPX par la société Gatan Inc. 20 Des analyses par chromatographie liquide haute performance (High Performance Liquid Chromatography » : HPLC) ont été réalisées sur un système équipé de pompes à solvants 600 à injection manuelle (Waters, Milford, MA, USA), en régime isocratique, et en utilisant de l'acétonitrile comme phase mobile. Les composés ont été séparés sur une colonne de chromatographie Atlantis dC18 25 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm) avec une colonne de garde Atlantis dC18 (Waters). Les colonnes ont été utilisées à température ambiante. Le logiciel Empower® (Waters) a été utilisé pour l'acquisition et le traitement des données. Les standards ont été dissous dans le méthyléther de t-butyle (MTBE). Toutes les solutions ont été filtrées au travers d'une membrane de 0,45 µm et dégazées avant usage. Le débit de 30 la phase liquide a été fixé à 1 ml/min et le volume des échantillons injectés était de 20 µl. Les réactions catalysées d'estérification ont été suivies à l'aide d'un réfractomètre vendu sous la référence 410 par la société Waters (Milford, MA, USA). Pour la détection des produits issus des réactions catalysées d'hydrolyse et de trans-estérification, le système a été équipé d'un détecteur ultraviolet (UV) à 35 barrettes de diodes (WAT996, Waters, Milford, MA, USA). Les mesures ont été réalisées à une longueur d'onde de 204 nm, ce qui correspondait à l'absorbance 12 B10029FR 13 maximum. Le gradient d'élution suivant a été utilisé : (Solvant A : acétonitrile, solvant B : MTBE) : A/B : 100/0 (v/v) isocratique pendant 4 min., A/B : 70/30 (v/v) gradient pendant 2 min., A/B : 70/30 (v/v) puis A/B : 100/0 (v/v) gradient pendant 5 min. La colonne a été équilibrée dans les conditions données ci-dessus pendant 10 minutes. Exemple 1 Préparation d'un monolithes de silice intégrant une lipase de Candida Rugosa Dans cet exemple on illustre la préparation d'un monolithe de silice et l'immobilisation d'une lipase de Candida Rugosa dans les macropores de ce io monolithe. 1) Première étape : Synthèse du monolithe de silice (MSi). 5,0 g de TEOS ont été ajoutés à 16,0 g d'une solution aqueuse de TTAB à 35 % massique préalablement acidifiée par 7 g d'une solution d'acide chlorhydrique concentré à 37 %. On a laissé l'hydrolyse se dérouler sous agitation 15 pendant environ 5 minutes jusqu'à obtention d'un milieu hydrophile monophasique (phase aqueuse de l'émulsion). On a ensuite ajouté à cette phase aqueuse, 35,0 g de dodécane (phase huileuse de l'émulsion) au goutte à goutte et sous agitation. Le mélange a été transféré dans un récipient cylindrique en Téflon ® (L = 251,0 mm ; r = 9,65 mm) servant de moule macroscopique, ledit récipient étant lui-même 20 confiné dans une colonne de chromatographie en acier de longueur utile 300 mm et de diamètre interne 19 mm vendue par la société Interchim (Montluçon, France). On a ensuite laissé l'émulsion se condenser sous forme d'un monolithe de silice pendant 1 semaine à température ambiante. Le monolithe de silice ainsi synthétisé a ensuite été lavé pendant 4 jours par circulation en flux continu d'un mélange 25 tetrahydrofurane/acétone (50/50: v/v) à raison de 0,1 mL/min afin d'extraire la phase huileuse du monolithe. Le monolithe ainsi obtenu présentait les caractéristiques morphologiques suivantes : - porosité : 94 % 30 - densité du monolithe : 0,07 g.cm 3 - densité du squelette de silice : 1,23 g.cm 3 - Surface spécifique : 210 m2.g 1 (BET) et 190 m2.g 1 (B.J.H.). B10029FR 14 Les résultats des mesures d'intrusion au mercure effectuées sur ce monolithe sont présentés sur la figure 1 annexée sur laquelle, le volume différentiel des pores (en unités arbitraires) est fonction du diamètre des pores (en nm). On peut constater que le monolithe obtenu est exempt de micropores. 2) Deuxième étape : Fonctionnalisation du monolithe de silice par un agent de couplage de type silane Le monolithe de silice obtenu ci-dessus à l'étape précédente a ensuite été fonctionnalisé par du Glymo. Pour ce faire, on a fait passer à travers la colonne de chromatographie io contenant le monolithe obtenu ci-dessus à l'étape précédente, en flux continu et en circuit fermé, 200 ml d'une solution de Glymo à 0,05 M dans le chloroforme à une vitesse de 0,1 mL.min-1 pendant 3 jours. Le monolithe a ensuite été lavé au chloroforme, puis à l'acétone, et enfin à l'eau en flux continu à une vitesse de 0,5 mL.mn-1. 15 On a obtenu ainsi un monolithe de silice dont la surfaces des macropores est fonctionnalisée par du Glymo (MSi-Glymo). 3) Deuxième étape : Immobilisation de la lipase dans les macropores du MSi-Glymo 500 mg de lipase non purifiée de Candida Rugosa (1CR) ont été dispersés 20 dans 200 ml d'eau distillée et mélangés pendant une heure à température ambiante jusqu'à obtention d'une solution. L'immobilisation de la lipase dans les macropores du monolithe MSi-Glymo obtenu ci-dessus à l'étape précédente a ensuite été réalisée par mise en circulation, en circuit fermé et en flux ascendant, de la solution de lipase, à une vitesse de 0,lmL.mn 1 pendant 5 jours à température ambiante. 25 La colonne de chromatographie imprégnée de la solution de lipase a ensuite été laissée au repos pendant 1 mois à 4°C. La colonne de chromatographie renfermant le monolithe a ensuite été lavée, en flux continu ascendant, avec de l'eau distillée, pour éliminer totalement les lipases qui n'auraient pas été immobilisées dans les macropores du monolithe. Le suivi de l'élimination totale 30 des lipases a été effectué par la méthode de Bradford, qui est un dosage colorimétrique des protéines, basé sur le changement d'absorbance (la mesure se fait à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (complexation) avec les acides aminées aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides B10029FR 15 aminés présent dans la ou les protéines (M.M. Bradford, Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254). La colonne de chromatographie a ensuite été lavée par de l'heptane sous flux continu à une vitesse de 0,1 mL.mn-1. On a obtenu un catalyseur hétérogène conforme à l'invention (MSi-Glymo-1RC), c'est-à-dire un monolithe de silice alvéolaire comportant des macropores et des mésopores, exempt de micropores, et dont les macropores renfermaient une lipase immobilisée par l'intermédiaire du Glymo. Exemple 2 Préparation d'un monolithes de silice intégrant une lipase de Thermomvices Lanuginosus Dans cet exemple on illustre la préparation d'un monolithe de silice et l'immobilisation d'une lipase de Thermomyces Lanuginosus dans les macropores de ce monolithe. 4 g de lipase non purifiée de Thermomyces Lanuginosus (1TL) ont été dispersés dans 200 ml d'eau distillée et mélangés pendant une heure à température ambiante jusqu'à obtention d'une solution. L'immobilisation de la lipase dans les macropores d'un monolithe MSi-Glymo tel qu'obtenu ci-dessus à l'issue de l'étape 2) de l'exemple 1 a ensuite été réalisée par mise en circulation, en circuit fermé et en flux ascendant, de la solution de lipase, à une vitesse de 0,1 mL.mn-1 pendant 5 jours à température ambiante. La colonne de chromatographie imprégnée de la solution de lipase a ensuite été laissée au repos pendant 2 semaines à 4°C, puis lavée à l'eau jusqu'à disparition de l'absorbance selon la méthode de Bradford pour éliminer totalement les lipases non immobilisées. La colonne de chromatographie renfermant le monolithe a ensuite été imprégnée par circulation en circuit fermé de 200 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 5 % (poids/volume), sous flux continu ascendant à une vitesse de 0,1 mi-mn-1 pendant 3 jours à température ambiante. La colonne de chromatographie contenant le monolithe a ensuite à nouveau été imprégnée par une nouvelle solution de lipase 1TL (4 g de lipase pour 200 mL d'eau distillée) dans les mêmes conditions que précédemment. La colonne de chromatographie a ensuite été lavée à l'eau distillée jusqu'à disparition de l'absorbance selon la méthode de Bradford pour éliminer totalement B10029FR 16 les lipases non immobilisées, puis avec de l'heptane (0,1 mL.mn-t en flux continu ascendant), pendant 3 jours. On a obtenu un catalyseur hétérogène conforme à l'invention (MSi-Glymo-1TL), c'est-à-dire un monolithe de silice alvéolaire comportant des macropores et des mésopores, exempt de micropores, et dont les macropores renfermaient une lipase immobilisée par l'intermédiaire du Glymo. Exemple 3 Estérification de l'acide oléique par le 1-butanol, en présence d'un catalyseur enzymatique conforme à l'invention io Dans cet exemple on a réalisé une réaction catalysée d'estérification de l'acide oléique (1) par le 1-butanol (2) selon le schéma réactionnel suivant : H3C.. ~~(CH2)7 OH (1) (CH2)7 11 I{ O + H3COH (2) Cette réaction conduit à la formation de l'ester butylique de l'acide oléique (3). 15 Un milieu réactionnel contenant 23,0 mmol.L-t d'acide oléique (1) et 46,0 mmol.L-t de 1-butanol (2) dans l'heptane a été préparé. Le milieu réactionnel a été passé en flux continu ascendant, à 37°C, dans la colonne de chromatographie équipée du catalyseur MSi-Glymo-1CR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1, et à une vitesse initiale de 0,05 mL.mn-t pendant 20 jours, 20 puis à une vitesse de 0,1 mL.mn-t pendant 25 jours, et enfin à une vitesse de 0,05 mL.min-t pendant 5 jours. La formation de l'ester (3) a été suivie par HPLC. La réaction d'estérification a ainsi été conduite en continu pendant une durée totale de 50 jours. La figure 2 annexée représente une photographie de l'ensemble du dispositif 25 réactionnel (figure 2a), du catalyseur solide conforme à l'invention au bout de 60 jours de réaction en flux continu : à l'intérieur de son moule et de la colonne de chromatographie (2b et 2c) et du catalyseur solide après 50 jours de catalyse en flux continu, après l'avoir sorti de son moule (2d). On constate qu'après 50 jours d'utilisation en flux continu, l'intégrité du monolithe est conservée. H3C,, ~~(CH2) CH3 (CH2)7 (3) Heptane, 37°C B10029FR 17 La figure 3 annexée représente des photographies prises en MEB du catalyseur en coupe après 50 jours de réaction en flux continu, lavage à l'eau distillée et lyophilisation (grossissement x 200 : 3a ; grossissement x 800 : 3b et grossissement x 1500: 3c). On constate également que la structure macroporeuse du monolithe est préservée. Sur les figures 3a et 3b, on peut observer les macropores interconnecté du monolithe. Sur la figure 3c, la flèche blanche représente la jonction cellulaire interne, tandis que la flèche noire en trait pointillé représente la jonction cellulaire externe. Les résultats d'estérification obtenus sont reportés sur la figure 4 annexée. La figure 4a présente le taux de formation de l'ester butylique de l'acide oléique (3), exprimé en pourcentage, en fonction du temps en jours. La figure 4b présente l'activité enzymatique du catalyseur (en tmol.min l.mg 1) en fonction du temps en jours. Les résultats présentés sur cette figure montrent qu'au bout de 50 jours de réaction, l'activité de l'enzyme est encore égale à 50 % de l'activité initiale, ce qui est sans précédent pour un catalyseur enzymatique utilisé en flux continu. Exemple 4 Transestérification de triglycérides d'acide linoléique contenus dans de l'huile de carthame brute en présence d'un catalyseur enzymatique conforme à l'invention Dans cet exemple on a réalisé la transestérification des triglycérides d'acide 20 linoléique (4) contenus dans l'huile de carthame brute (Carthamus tinctorius) par l'éthanol (2) selon le schéma réactionnel suivant : Heptane, 40°C puis 50°C OH H3C CH3 + HO OH (6) (5) Cette réaction conduit à la formation de l'ester éthylique de l'acide linoléique (5) et de glycérol (6). Une telle réaction est utilisée pour la production de 25 biodiesels qui sont des esters méthyliques ou éthyliques d'huiles végétales. Un milieu réactionnel contenant 38 % massique d'huile de carthame, 12 % massique d'éthanol et 50 % massique d'heptane a été préparé. B10029FR 18 Le milieu réactionnel a été passé en flux continu ascendant, à 40°C les 10 premiers jours, puis à 50°C les jours suivants, dans la colonne de chromatographie équipée du catalyseur MSi-Glymo-1TL tel que préparée ci-dessus à l'exemple 2, et à une vitesse de 0,05 mL.mn-1. La formation de l'ester (5) a été suivie par HPLC. La réaction d'estérification a ainsi été conduite en continu pendant une durée totale de 60 jours. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 5 annexée sur laquelle le taux de conversion en ester (5) exprimé en pourcentage est fonction du temps en jours. io Ces résultats montrent que le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-1TL peut être utilisé en flux continu pour catalyser la transestérification des triglycérides de l'huile de carthame avec un taux de conversion qui est encore de 20 % au bout de 60 Jours. L'ensemble des résultats présentés dans ces exemples démontre que les 15 catalyseurs enzymatiques hétérogènes conformes à l'invention permettent de catalyser diverses réactions chimiques en flux continu, avec des rendements supérieurs aux rendements habituellement obtenus dans l'art antérieur. REVENDICATIONS1. Catalyseur enzymatique hétérogène caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 µm et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits macropores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée une enzyme, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique. 2. Catalyseur selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme immobilisée est une enzyme non purifiée. 3. Catalyseur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit monolithe a une surface spécifique de 200 à 1000 m2/g. 4. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent de couplage est choisi parmi les silanes choisis dans le groupe constitué par le y-glycidoxypropyltriméthoxysilane ; les liquides ioniques silylés et les silanes de formule Si(OR2)3R3 dans laquelle R2 représente un groupement alkyle en C1-C2, et R3 représente un groupement -(CH2OH-CH2OH)q CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)gCH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10. 5. Catalyseur selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent de couplage est le y-glycidoxypropyltriméthoxysilane. 6. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi les hydrolases, les lyases, les 25 isomérases et les oxydoréductases. 7. Catalyseur selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'enzyme est une hydrolase choisie parmi les estérases. 8. Catalyseur selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'enzyme est une estérase choisie parmi les hydrolases d'esters carboxyliques, les amino-30 acylases, les amidases et les nitrilases. 9. Catalyseur selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi les lipases de Candida Rugosa, Candida antartica, Aspergillus piger, Aspergillus oryzae, Thermomyces Lanuginosus, Chromobacterium viscosum,B10029FR 2 0 Rhizomucor miehei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Penicillium roqueforti, Penicillium expansum, Rhizopus arrhizus et les lipases de germe de blé. 10. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la quantité d'enzyme immobilisée varie de 1 à 40 % massique par rapport à la masse totale du catalyseur. 11. Procédé de préparation d'un catalyseur enzymatique hétérogène tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, ledit procédé comportant les étapes suivantes : 1) une première étape de préparation d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 µm à 100 gm et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits pores étant interconnectés, ladite première étape comprenant les sous-étapes suivantes : la) la préparation d'une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une solution aqueuse de tensioactif, lb) l'ajout d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de l'émulsion, 1c) l'introduction du mélange réactionnel dans un moule, ld) le repos du mélange réactionnel dans le moule jusqu'à la condensation dudit précurseur de silice sous la forme dudit monolithe, 1d) le lavage dudit monolithe, en flux continu, avec un solvant organique ; 2) une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par imprégnation du monolithe alvéolaire, en flux continu, par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique ; et 3) une troisième étape d'immobilisation d'au moins une enzyme sur l'agent de couplage par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par imprégnation du monolithe ainsi fonctionnalisé, en flux continu, par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le moule utilisé lors de la première étape est lui-même confiné à l'intérieur d'un dispositif permettant la circulation d'un liquide en flux continu.B10029FR 2 1 13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que les flux continus mentionnés aux étapes 2) et 3) dudit procédé sont des flux continus ascendants. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'au cours des étapes 2) et 3), la vitesse du flux varie de 0,02 à 0,1 mL/min. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que l'étape 3) d'immobilisation est réitérée deux fois et en ce que le procédé comprend en outre, avant la réalisation de l'étape 3) pour la seconde fois, une étape supplémentaire d'imprégnation du monolithe, en flux continu, par une solution d'un aldéhyde. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que le ou les précurseur(s) de silice sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane, le tetraéthoxyorthosilane, le diméthyldiéthoxysilane, les mélanges du diméthyldiéthoxysilane avec le tetraéthoxyorthosilane ou le tetraméthoxyorthosilane, les mélanges du tetraméthoxyorthosilane ou du tetraéthoxyorthosilane avec le y-glycidoxypropyltriméthoxysilane, et les mélanges du diméthyldiéthoxysilane ou du y-glycidoxypropyltriméthoxysilane avec un silicate. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications I l à 16, caractérisé en ce que le monolithe fonctionnalisé par l'agent de couplage, tel qu'obtenu à l'issue de l'étape 2) de fonctionnalisation, est lavé, sous flux continu, avec un solvant organique. 18. Utilisation d'un catalyseur enzymatique hétérogène tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène en flux continu. 19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'enzyme est une lipase, pour catalyser l'hydrolyse de triglycérides d'acides gras, des réactions d'estérification entre un acide et un alcool, des réactions de transestérification entre un ester et un alcool, des réactions d'inter-estérification entre deux esters ou des réactions de transfert d'un groupement acétyle d'un ester sur une amine ou sur un thiol. 20. Utilisation selon la revendication 19, pour catalyser : la synthèse du butyloléate ;B10029FR 22 - l'hydrolyse des dérivés de l'ester glycérolinoléique pour conduire à des savons ou à des détergents ; - des réactions de trans-estérification de triglycérides d'acides gras par un alcool, lesdites réactions étant impliquées dans la synthèse de biodiesels à faible 5 viscosité.