Brevet FR2963351A1 — publié le 20120203

La présente invention concerne le domaine technique général des particules constituées de polymères biodégradables. Plus précisément, la présente invention concerne des particules chargées positivement formées d'un complexe polyélectrolyte de chitosane et d'un polymère anionique, ainsi qu'un procédé de préparation de telles particules. De nos jours, les particules, au sens général du terme, sont utilisées dans un grand nombre d'applications, en chimie, cosmétique, agro-alimentaires, sciences de la vie ... Pour des applications biologiques, et/ou cosmétiques, et, notamment, dans le but de minimiser l'impact de l'utilisation de telles nanoparticules, ces dernières années, de nombreux travaux ont portées sur l'élaboration de particules à partir de matières premières issues de la biomasse (polysaccharides, protéines) et en particulier, de polymères biodégradables. Dans le cadre de précédents travaux, certains des inventeurs de la présente demande de brevet se sont intéressés à la fabrication de particules par formation de complexes polyélectrolytes de polymères issus de la biomasse. Notamment, la publication de Schatz et al. dans Langmuir 2004, 20(18), 7766-7778 a démontré qu'il était possible de former des particules microniques et submicroniques par l'addition d'une solution aqueuse d'un polycation (ou polyanion) à une solution aqueuse d'un polyanion (ou polycation), sous simple agitation, l'ordre d'addition n'étant pas un facteur limitant. En 2008 (Drogoz et al. Biomacromolecules, 2008, 9(2), 583-591), ils ont également démontré que de telles particules pouvaient être associées à une protéine et présentaient un pouvoir adjuvant dans une application vaccinale. Néanmoins, leurs travaux plus récents (Weber et al. Journal of Biomedical Materials research Part A, 2010, 93A(4), 1322-1334) sur la préparation de particules par formation de complexes polyélectrolytes entre le chitosane (polycation) et le sulfate de dextrane (polyanion) ont mis en évidence que de telles particules ne présentaient pas une stabilité satisfaisante dans un milieu riche en sels et/ou présentant un pH correspondant au pH physiologique. Il convient de rappeler que le chitosane, est un dérivé partiellement voire totalement désacétylé de la chitine. Le chitosane est donc un copolymère de N-acétyl glucosamine et de glucosamine liés par une liaison glysosidique de type 13 ->1, 4. Ses différentes formes sont notamment caractérisées par leur degré d'acétylation (DA) et par leur masse molaire moyenne en poids (Mw). Le sulfate de dextrane est, quant à lui, un polymère dont les unités répétitives sont du glucose dont certaines fonctions hydroxyle sont sulfatées. Ces deux polymères sont représentés ci-dessous. n 100-DA DA chitosan R=QH or OSOe dextran sulfate En milieu aqueux, notamment légèrement acide, le chitosane se trouve sous une forme polycationique, par protonation de ces fonctions NH2 et le chitosane est donc qualifié de polycation. Le chitosane est d'ailleurs disponible sous la forme de différents sels, notamment sous sa forme chlorhydrate. Les conclusions de cette publication de 2010 relient la stabilité des particules au degré d'acétylation du chitosane et soulignent que le chitosane avec un DA ? 50% conduit à des interactions hydrophobes prédominantes et favorise l'association des chaines polymères. Parmi les essais réalisés, un seul mené avec un chitosane de DA égal à 51% et de Mw égale à 150 000 g/mol et un sulfate de Dextran de Mw égale à 10 000 g/mol conduit à des particules présentant une stabilité pendant au moins 6 jours. Mais, lorsque le sulfate de dextrane utilisé présente une Mw de 500 000 g/mol, la stabilité est inférieure à 24h. Or, il est clair qu'un tel problème de stabilité est un facteur limitant pour grand nombre d'applications, et notamment pour les applications biologiques (thérapeutique, diagnostique, cosmétique ...). Cette floculation entraine des variations de propriétés colloïdales et donc une altération des capacités de transport, d'encapsulation, d'adsorption des principes actifs, ainsi que des modifications des interactions de ces particules avec leur environnement (par exemple : cellules/organes/tissus.) D'autres équipes ont également constaté le défaut de stabilité de particules à base de chitosane ou de dérivés du chitosane : - la demande de brevet WO 2008/093195 qui décrit des particules comportant un acide ribonucléique, du chitosane et un polyanion et qui présentent un potentiel zéta négatif, rapporte que des particules à base de chitosane chargées positivement en surface sont instables en présence de sels et de protéine (page 3 lignes 20-25) et propose donc de réaliser des particules anioniques, - la demande de brevet WO 2006/064331 indique que les complexes polyélectrolytes à base de chitosane sont instables en présence de sels (page 2, lignes 10-20) et au pH physiologique à cause de l'instabilité du chitosane au pH physiologique (page 3, lignes 2-4) et propose des complexes polyélectrolytes associant un polyanion non pas à du chitosane mais à un dérivé quaternaire du chitosane tel que le N-triméthylchitosane, le N-triéthylchitosane ou le N- tripropylchitosane, - le brevet US 7,381,716, quant à lui, propose des particules cationiques à base de chitosane et de polyacide glutamique, dont la stabilité n'est démontré qu'en eau déionisée. De plus, la Figure 7a de ce document, qui représente des photographies par microscopie de fluorescence de particules obtenues, montre la formation d'agrégats, en milieu de culture cellulaire. Il convient également de noter que dans les exemples, il est précisé que le chitosane utilisé est de Mw basse et de DA= 150/0. II convient également de citer la demande de brevet US 2008/0254078 qui décrit des nano et microparticules formées d'un système binaire chitosane/polysaccharide polyanionique porteur de groupement carboxyméthyl, sulfate ou carboxy plus sulfate. Aucune donnée n'est précisée concernant le DA du chitosane utilisé et la seule donnée précise dans les exemples sur la Mw du chitosane utilisé est très faible et correspond à 6 000 g/mol. Bien qu'un des buts de cette demande de brevet soit de fournir des particules stables, la stabilité dans le temps des particules obtenues n'est pas démontrée. Dans ce contexte, il existe donc un besoin pour des particules à base de chitosane présentant une stabilité améliorée et pour un procédé de 10 préparation de telles particules. Aussi, la présente invention propose des particules chargées positivement formées d'un complexe polyélectrolyte de chitosane et d'un polymère anionique dans lesquelles le chitosane présente un degré d'acétylation (DA) appartenant à la gamme allant de 35 à 49% et une masse 15 molaire moyenne en poids (Mw) appartenant à la gamme allant de 55 à 150 kg/mol. Notamment, le chitosane présente un degré d'acétylation (DA) appartenant à la gamme allant de 45 à 48% et une masse molaire moyenne en poids (Mw) appartenant à la gamme allant de 70 à 130 kg/mol. De telles particules présentent une stabilité satisfaisante dans les conditions 20 physiologique de pH ou de concentration en sel monovalent, tel que NaCl. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne des particules chargées positivement formées d'un complexe polyélectrolyte de chitosane et d'un polymère anionique caractérisées en ce que le chitosane est sélectionné de manière à ce que les particules restent stables à température 25 ambiante sans agitation particulière dans des milieux aqueux contenant des concentrations physiologiques de sel (donc, au moins égale à 150 mM de sel monovalent) ou ayant un pH physiologique (c'est-à-dire proche de 7,4), à un taux de solide (masse de polymères ramenée à 100mL de dispersion) compris entre 0,01% et 5%, préférentiellement entre 0,1% et 2%. En 30 particulier, la stabilité des particules est constatée à température ambiante, lorsqu'elles sont redispersées, après centrifugation, à un taux de solide (masse totale de polymères ramenée à 100mL de dispersion) compris entre 0,01% et 5%, préférentiellement entre 0,1% et 2% dans de l'eau contenant 150 mM de NaCl ou dans un tampon PBS de pH = 7,4, pendant une durée au moins égale à 20 jours, de préférence au moins égale à 45 jours. Par température ambiante, on entend une température appartenant à la gamme 18-25°C, et notamment égale à 22°C. Les particules sont considérées stables quand la variation de leur diamètre moyen par rapport à Do (diamètre moyen des particules mises en dispersion dans le milieu, juste après élaboration) est inférieure ou égale à 40%, préférentiellement inférieure à 30% et encore plus préférentiellement inférieure à 20%. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de particules ci-dessus définies comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'une solution aqueuse de chitosane, et, en particulier, d'un chitosane présentant un degré d'acétylation (DA) appartenant à la 15 gamme allant de 35 à 49% et une masse molaire moyenne en poids Mw appartenant à la gamme allant de 55 à 150 kg/mol, b) disposer d'une solution aqueuse de polymère anionique, c) additionner l'une de ces solutions à l'autre solution, de manière à obtenir une solution colloïdale de particules chargées positivement 20 formées d'un complexe polyélectrolyte de chitosane et du polymère anionique. La description qui va suivre, va permettre de mieux comprendre l'invention. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence, qu'il 25 était possible d'obtenir des particules à base de chitosane présentant une très grande stabilité et, notamment une stabilité pendant une durée au moins égale à 20 jours, de préférence au moins égale à 45 jours, lorsque les particules sont dispersées à un taux de solide de 0,01% à 5%, et préférentiellement de 0,1% et 2% (masse totale de polymères ramenée à 30 100mL de dispersion) dans de l'eau contenant 150 mM de NaCl ou dans une solution de PBS (saline phosphate tamponnée, de l'anglais « Phosphate buffered Saline », comme par exemple le PBS InvitrogenTM/GIBCO® PBS pH 7,4 1X lot 712299), en formant un complexe polyélectrolyte dont la charge globale est positive, par association d'un polyanion et d'un chitosane présentant un DA et une Mw particuliers. Le choix d'un chitosane présentant un degré d'acétylation (DA) appartenant à la gamme allant de 35 à 49 %, notamment dans la gamme allant de 44 à 48 % et une masse molaire moyenne en poids Mw appartenant à la gamme allant de 55 à 150 kg/mol, de préférence dans la gamme allant de 70 à 130 kg/mol permet d'atteindre de telles stabilités. Les exemples ci-après détaillent les techniques de mesure du DA et de la Mw, prises comme référence, dans le cadre de l'invention. Tout type de polymère anionique présentant, par exemple des fonctions sulfate, carboxyméthyle, acide carboxylique et sulfate, peut être utilisé. De tels polymères pourront notamment appartenir à la famille des polysaccharides. A titre d'exemple, le polymère anionique peut être choisi parmi l'acide hyaluronique, le sulfate de dextrane, le sulfate de cellulose, le sulfate de chondroitine, le sulfate d'héparane, le sulfate de dermatane, le sulfate de kératane, les alginates, les pectines, le carboxyméthyl dextrane, la carboxyméthylamylose, la carboxyméthylcellulose, la carboxyméthyl betacyclodextrine, l'héparine, le polystyrène sulfonate, les homo ou copolymères synthétiques hydrosolubles linéaires ou ramifiés à base - d'au moins un monomère anionique possédant soit une fonction carboxylique (ex: acide acrylique, acide méthacrylique, et leurs sels..), soit une fonction acide sulfonique (ex: acide 2-acrylamido- 2-méthylpropane sulfonique (AMPS) et leurs sels..) - et éventuellement d'un ou plusieurs monomère(s) non-ionique bien connus par l'homme de métier. Le sulfate de dextrane est, néanmoins, préféré. Idéalement, la masse molaire moyenne des polyanions n'est pas un facteur limitant la stabilité. Un polymère anionique, et notamment du sulfate de dextrane, présentant une molaire moyenne en poids appartenant à la gamme allant de 5 à 5000 Kg/mol, de préférence, à la gamme allant de 5 à 1000 Kg/mol est, par exemple utilisé. Les particules selon l'invention sont chargées positivement. En particulier, le rapport entre le nombre de charges du chitosane et le nombre de charges du polymère anionique n+/n- appartient à la gamme allant de 1,05 à 5, de préférence à la gamme allant de 1,5 à 3. Les particules selon l'invention sont essentiellement sphériques. Il peut s'agir de particules microniques, submicroniques ou nanométriques. Notamment, les particules présentent un diamètre moyen appartenant à la gamme allant de 50 nm à 50 pm, de préférence à la gamme allant de 150 nm à 5 pm. Le diamètre moyen des particules peut être mesuré selon diverses méthodes connues de l'homme de l'art. Dans le cadre de l'invention, il correspond au diamètre moyen hydrodynamique obtenu par la méthode de diffusion quasi-élastique de la lumière et le traitement des données selon la méthode des cumulants. Un ensemble de particules est également caractérisé par un indice de polydispersité qui correspond à la formule suivante 1221(G)2 où 12 est le second cumulant de la fonction de corrélation issue de l'analyse des données par la méthode des cumulants et (q2 le taux moyen de déclin. Un indice de polydispersité inférieure ou égale à 0,05 est caractéristique d'une population resserrée (dispersion isodisperse) en taille tandis qu'un indice compris entre 0,05 et 0,15 est représentatif d'une dispersion de tailles élargie (dispersion polydisperse) (Coombes, A. G. A.; Scholes, P. D.; Davies, M. C.; Ilium, L.; Davis S. S. Biomaterials 1994, 15, 673). De manière avantageuse, les particules selon l'invention, présente un indice de polydispersité appartenant à la gamme allant de 0,01 à 0,25, de préférence, à la gamme allant de 0,05 à 0,2. Un tel indice de polydispersité peut être directement obtenu grâce au procédé selon l'invention, sans la mise en oeuvre d'une étape de filtration ou d'un autre procédé de fractionnement. Les particules selon l'invention peuvent être obtenues par addition d'une solution aqueuse du chitosane ou du polymère anionique sur une solution aqueuse de l'autre polymère (chitosane ou polymère anionique), les dites solutions étant, par exemple, à un pH appartenant à la gamme allant de 2 à 9, préférentiellement à la gamme allant de 3 à 8. De façon avantageuse, une au moins des dites solutions (voire les deux) contient un sel monovalent au plus à une concentration 400 mM, préférentiellement au plus à une concentration de 150 mM, par exemple sous la forme de NaCl. La présence d'un tel sel permet de stabiliser la force ionique du milieu lors du procédé d'élaboration des particules. Pour réaliser la formation de particules conformes à l'invention, le chitosane et le polymère anionique sont solubilisés séparément, par agitation, dans une solution contenant un sel monovalent à une concentration comprise, par exemple, entre 0,05 et 150mM, préférentiellement entre 10 et 70 mM et, encore plus préférentiellement, entre 30 et 60 mM. Le chitosane est mis en solution par protonation de ses fonctions amine par le biais d'une solution contenant, entre autre, un acide fort ou faible (acide chlorhydrique ou acide acétique notamment). Il est également possible d'utiliser un acétate ou chlorhydrate de chitosane. Chaque polyélectrolyte est dissous à une concentration massique (m/v) comprise, par exemple, entre 0,01 % à 0,5 %, préférentiellement entre 0,05% et 0,3% et encore plus préférentiellement entre 0,05 % et 0,2 %. Après dissolution, le pH de chaque solution est, de préférence, ajusté à une valeur comprise entre 2 et 8, préférentiellement entre 3 et 6. Ensuite, les solutions sont, le plus souvent, purifiées par passage sur un filtre, par exemple de porosité 0,22pm, ce qui permet d'envisager une stérilisation par filtration. Les particules sont formées en mélangeant, sous agitation, les deux solutions, dont les volumes respectifs ont été préalablement fixés par rapport à la valeur souhaitée de R représentant le rapport entre les charges positives et négatives respectivement du polycation et du polyanion. La dispersion ainsi obtenue peut, ensuite, être centrifugée, par exemple pendant une durée comprise entre 10 minutes et 90 minutes, préférentiellement entre 30 minutes et 70 minutes. La vitesse de centrifugation est, par exemple, comprise entre 600 g et 20000 g (g correspondant à l'attraction terrestre), préférentiellement entre 4000 g et 15000 g et encore plus préférentiellement entre 6000 g et 12000 g. Enfin, les particules peuvent ensuite être redispersées dans le milieu désiré, à un taux de solide, notamment compris entre 0,1% et 5%, préférentiellement entre 0,5% et 3% et encore plus préférentiellement entre 0,8% et 2%. L'ensemble du procédé peut être réalisé à température ambiante et sous pression atmosphérique. Les particules selon l'invention peuvent se présenter sous la forme d'une poudre obtenue, par exemple, après une étape de lyophilisation, ou encore sous la forme d'une solution colloïdale en phase aqueuse, présentant, par exemple, un pH appartenant à la gamme allant de 2 à 9, préférentiellement appartenant à la gamme allant de 4 à 8, et notamment à un taux de solide (masse totale de polymères ramenée à 100mL de solution colloidale) appartenant à la gamme allant de 0,01 % à 5 0/0 préférentiellement appartenant à la gamme allant de 0,1 % à 2 %. Une telle solution colloïdale pourra contenir un ou plusieurs sels, par exemple du chlorure de sodium (NaCI), avec une concentration totale en sels, de préférence, au plus de 400 mM. Une telle solution colloidale contenant des sels et/ou au pH physiologique (7,4), est stable, à température ambiante, pendant une durée suffisamment longue, notamment d'au moins 20 jours, autorisant son utilisation dans des applications biologiques notamment. Une durée de stabilité plus longue peut être obtenue, notamment pour son stockage, à une température inférieure. Pour l'obtention d'une telle dispersion colloïdale, les particules peuvent subir une ou plusieurs opérations, notamment pour atteindre le taux de solide souhaité. Les particules pourront être séparées de la phase aqueuse dans laquelle elles sont obtenues, lavées et redispersées dans une autre phase aqueuse, ou encore la solution colloïdale obtenue pourra être concentrée, afin d'atteindre le taux de particules désiré. Les particules selon l'invention pourront inclure un composé d'intérêt ou un agent actif. A titre d'exemple d'agent actif, on peut citer, notamment, les composés présentant un intérêt en thérapeutique (molécule organique active), les protéines, les acides nucléiques, les hormones, les vitamines, les composés présentant un intérêt en cosmétique tels que les parfums par exemple, les aromes... Ledit composé d'intérêt ou principe actif sera associé aux particules par encapsulation au cours de la synthèse des particules (le composé d'intérêt étant ajouté soit à la solution de polyanion soit à la solution de polycation), par adsorption à l'interface de particules préformées ou encore par diffusion à l'intérieur de particules préformées. A titre d'exemples d'application, les particules selon l'invention pourront être utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique, cosmétique, dermatologique ou alimentaire. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. Les techniques de référence dans le cadre de l'invention, pour déterminer les caractéristiques des polymères et des particules, sont également données. Détermination des Masses Molaires La masse moléculaire moyenne en poids (Mw) et l'indice de polydispersité (Ip) des polymères sont déterminés par chromatographie d'exclusion stérique couplée en ligne avec un réfractomètre différentiel (Waters 410) et avec un système multiangle de diffusion de la lumière (MALLS, Dawn, DSP), longueur d'onde opérationnelle de 632,8 nm). Les données de diffusion de lumière sont analysées par l'équation de Raleigh- Debye. Les incréments d'indice de réfraction (dn/dc) sont déterminés pour chaque échantillon avec un interféromètre (NFT Scan Ref) à la longueur d'onde de 632,8 nm. Conditions d'analyses chromatographiques pour le chitosane : des colonnes TSK 3000 et 6000 sont utilisées dans un système HPLC (de l'anglais « high performance liquid chromatography ») avec pour éluant le tampon suivant : Acide acétique (0,2M) / Acétate d'ammonium (0,15M) pH 4,5 qui a été préalablement dégazé. Le débit est de 0,5 mL.min"1. Conditions d'analyses chromatographiques des polyanions : Une colonne (aquagel-OH 5Polymer Laboratories) est utilisée et l'éluant est une 25 solution aqueuse de NaNO3 0,1M pH7. Tout polymère étant constitué d'une distribution de chaînes de longueur variable, on définit la masse molaire moyenne en poids par la formule suivante connue de l'homme de l'art : E n où x désigne le degré de polymérisation ; nx le nombre de macromolécules de degré de polymérisation x ; Mx la masse de telles macromolécules. Cette grandeur est déterminée par diverses méthodes connues de l'homme de l'art. Détermination des densités de charges des polyélectrolytes Détermination pour le chitosane : Elle repose sur la détermination du Degré d'Acétylation (DA) qui représente le pourcentage d'unités N-acétyl glucosamine dans la chaîne macromoléculaire. Le DA est déterminé par Résonance Magnétique Nucléaire du Proton (RMN 1H) en l'intensité du signal de résonance des protons des groupes méthyle avec celle des protons du cycle (H2-H6), située entre 3 et 4 ppm. Le degré d'acétylation est alors déterminé par la relation suivante : Cette méthode est connue sous le nom de méthode de Hirai (Hirai A. et al. Polym Bull. 1991, 26, 87). Détermination de la densité de charge pour les polysulfates : Elle repose sur un dosage colorimétrique du nombre de fonctions sulfate au moyen du bleu de toluidine en utilisant un spectrophotomètre UV/VIS (mQuant, Biotech instrument). Une gamme étalon en sulfate de dextrane est réalisée en décrivant une gamme de concentration en fonctions sulfate de 7.10-5 à 1,4.10-4 M dans un tampon acétate de sodium 10mM pH 4. Le Bleu de Toluidine est ajouté à chaque solution à la concentration de 10-4 M. Le Bleu de Toluidine fait un complexe avec le polymère qui précipite, le point équivalent du dosage correspond à l'augmentation de l'absorbance à 645 nm due au Bleu de Toluidine en excès. Détermination du diamètre moyen des particules Le diamètre moyen des particules est déterminé par diffusion quasi élastique de la lumière en utilisant par exemple l'appareil Zetasizer HS 3000 de la compagnie Malvern et le système expert associé. Les mesures fournissent diamètre moyen hydrodynamique Dh obtenu par la méthode de diffusion quasi-élastique de la lumière et le traitement des données selon la méthode des cumulants et l'indice de polydispersité PDI correspond à la formule suivant µ2/(G)2 où 1.12 est le second cumulant de la fonction de corrélation issue de l'analyse des données par la méthode des cumulants et (G)2 le taux moyen de déclin. Un indice de polydispersité inférieure ou égale à 0,05 est caractéristique d'une population resserrée (dispersion isodisperse) en taille tandis qu'un indice compris entre 0,05 et 0,15 est représentatif d'une dispersion de tailles élargie (dispersion polydisperse) (Coombes, A. G. A.; Scholes, P. D.; Davies, M. C.; Ilium, L.; Davis S. S. Biomaterials 1994, 15, 673) Protocole de contrôle de la stabilité colloïdale Une fois récupérées dans le milieu souhaité, les particules sont analysées par diffusion quasi-élastique de la lumière. Le diamètre moyen Do des particules est déterminé quelques minutes après la redispersion de ces dernières (le milieu sera soit une solution aqueuse de chlorure de sodium à 150mM, soit un tampon PBS InvitrogenTM/GIBCO® PBS pH 7,4 iX lot 712299). Ensuite, la dispersion est stockée à température ambiante sans agitation. Le diamètre des complexes est contrôlé régulièrement. Les particules sont considérées stables quand la variation du diamètre moyen par rapport à Do (diamètre moyen des particules dans le milieu de stockage après élaboration) est inférieure ou égale à 40%, préférentiellement inférieure à 30% et encore plus préférentiellement inférieure à 20%. a) Protocole Opératoire pour l'hydrolyse du chitosane, permettant 30 de contrôler la masse molaire du chitosane L'hydrolyse du chitosane est réalisée par désamination nitreuse. Le chitosane est dissous dans un tampon acide acétique 0,2M/acétate d'ammonium 0,15 M à 0,5 % en masse (m/v). Après dissolution totale du chitosane, un volume précis d'une solution de nitrites de sodium à une concentration initiale égale à 10 g/L est ajouté afin d'obtenir un rapport molaire nitrite / unité glucosamine égal à 0,1. La durée d'hydrolyse est déterminée par rapport à la masse molaire désirée du chitosane. La réaction est arrêtée par précipitation du chitosane, en ajoutant de l'ammoniaque diluée pour atteindre un pH compris entre 9 et 11. Le polymère subit alors une série de 6 lavages avec de l'eau déionisée par des cycles lavage-centrifugation (20 min à 10 000g à 4°C) jusqu'à l'obtention d'un pH neutre. Après la dernière centrifugation, l'eau est éliminée et le chitosane lyophilisé. b) Protocole Opératoire pour la réacétylation du chitosane permettant de contrôler la degré d'acétylation du chitosane Ce procédé est adapté des travaux de Vachoud et al. (L. Vachoud, N. Zydowicz, A. Domard Carbohydrate Research 302, 169-177, 1997). Le chitosane est mis en solution dans un volume V d'eau à une concentration égale à 1% en masse auquel est ajouté 4g/L d'acide acétique. Après dissolution du chitosane, un volume de 1,2-propanediol (Sigma-aldrich) correspondant à 80% de V est ajouté progressivement sous agitation. L'agitation est maintenue pendant 30 minutes puis le mélange est dégazé pendant 1 heure à température ambiante. Un mélange correspondant à 20% de V de 1,2-propanediol et de Xg d'anhydride acétique, conformément à l'équation (1) ci-dessous, est ensuite ajouté à la solution. La réaction se déroule pendant 12 heures. Enfin, le polymère réacétylé est récupéré après avoir subi les même étapes de précipitation, de lavages avec de l'eau déionisée (15 lavages) et de lyophilisation que précédemment au paragraphe a). mchitosane x (1 %eau) x (DA1- DAo) x Manhydride acétique X = ( _( ) Mnon acétylé X (1 - D4) + Macétylé X DAo 1 avec mchitosane, la masse de chitosane introduite ; %eau, la quantité d'eau 30 contenue dans le chitosane (déterminé par ATG) ; Manhydride acétique, la masse molaire de l'anhydride acétique ; DA1, le DA final ; DAo, le DA initial ; Milon acétylé, la masse molaire du motif non acétylé et Macétylé, la masse molaire du motif acétylé. Exemple de réacétylation Pour préparer 5 g de chitosane de degré d'acétylation 40%, 5 g de chitosane (DA= 6% ; Mw= 470 000 g/mol) sont solubilisés dans 500 mL d'une solution d'acide acétique. Une fois le polymère dissous, 400 mL de 1,2-propanediol sont ajoutés progressivement au mélange. Après 30 minutes d'agitation, le système est dégazé à l'air pendant 1h. Ensuite, 20 mL de 1,2-propanediol i0 contenant 0,95g d'anhydride acétique sont ajoutés au milieu réactionnel. Exemple 1 (chitosane DA 44%, Mw 70 kg/mol + sulfate de dextrane de 500 kg/moll 106 mg d'un chitosane (France chitine, lot 113) dont le degré 15 d'acétylation (DA) et la masse molaire moyenne en poids (Mw) sont respectivement égaux à 44% et 70 kg/mol sont mis en solution sous agitation magnétique dans 93g d'eau (Eau d'irrigation, Versol) contenant 105 pL d'acide acétique glacial (Sigma-aldrich) et 273 mg de chlorure de sodium (NaCl, Sigma-aldrich). 32mg du sel de sodium de sulfate de dextrane 20 (« Dextran sulfate sodium sait » de Leuconostoc spp, Sigma-aldrich) dont la masse molaire moyenne minimale en poids est égale à 500 kg/mol sont solubilisés dans 30,35 g d'eau contenant 87 mg de NaCl. L'agitation des solutions est maintenue pendant 16h. Afin d'ajuster le pH des solutions à 4, 100pL d'une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH, Sigma-aldrich) à 0,1 M 25 et 5 pL d'acide chlorhydrique (Sigma-aldrich) à 0,01M sont ajoutés respectivement à la solution de chitosane et à la solution de sulfate de dextrane (DS). Le pH des solutions est contrôlé à l'aide d'un pHmètre Hanna HI 207. Les pH des solutions de chitosane et de DS sont respectivement égaux à 4 et 4,4. Ces solutions sont purifiées à l'aide d'une seringue et d'un 30 filtre 0,22 pm (Millipore, MILLEX®GP, 0.22pm). Ensuite sont prélevées 15 g de la solution de chitosane et 3,9 g de la solution de DS. Le rapport des charges entre le chitosane et le sulfate de dextrane est égal à 2 (correspondant à une ionisation totale des deux polyélectrolytes). La solution de DS est ajoutée sur la solution de chitosane sous forte agitation magnétique. La dispersion ainsi obtenue est centrifugée à 10000 g pendant 60 minutes (Centrifugeuse BECKMAN, J2-21, rotor JA-20). Une fois le surnageant éliminé, les nanoparticules sont redispersées dans 300 pL de PBS InvitrogenTM/GIBCO® PBS pH 7.4 1X lot 712299. Le diamètre moyen des particules Do est déterminé par diffusion quasi-élastique de la lumière (NanoZS®, Malvern Instruments). II est égal à 340 nm et l' indexe de polydispersité (PDI) est égal à 0,17. La stabilité colloïdale des nanoparticules élaborées dans l'exemple 1 est évaluée en suivant l'évolution du diamètre des particules au cours du temps. Ces dernières sont stockées dans le PBS, à température ambiante (22°C) sans agitation dans un eppendorf de 2mL (Eppendorf) et leur diamètre moyen est mesuré à intervalle régulier. Le tableau suivant expose l'évolution du diamètre moyen et du PDI des nanoparticules pendant 63 jours. Durée de stockage Diamètre moyen PDI (jours) (nm) 0 (Do) 340 0,17 17 399 0,25 29 408 0,23 63 457 0,24 Exemple 2 (chitosane DA 44°/o, Mw 70 kg/mol + sulfate de dextrane de 5 kg/moll Les nanoparticules sont élaborées suivant le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1. La composition de la solution de chitosane est identique à celle de l'exemple 1. 32,3 mg de sel de sodium de sulfate de dextrane (« Dextran sulfate sodium sait » from Leuconostoc spp, Sigmaaldrich) dont la masse molaire moyenne est égale à 5 kg/mol sont solubilisés dans 30,2g d'eau contenant 87mg de NaCl. Le diamètre (Do) et le PDI des particules obtenues après redispersion dans du PBS sont respectivement égaux à 327 nm et 0,13. La stabilité colloïdale des nanoparticules élaborées à l'exemple 2 est évaluée suivant la même méthode qu'à l'exemple 1. Le tableau suivant expose l'évolution du diamètre moyen et du PDI des nanoparticules pendant 63 jours. Durée de Diamètre PDI stockage (jours) moyen (nm) 0 (Da) 400 0,13 17 400 0,08 29 383 0,09 63 353 0,19 Exemple 3 (chitosane DA 48%, Mw 130 kg/mol + sulfate de dextrane de 500 kg/molj Les nanoparticules sont élaborées suivant le même protocole que celui 10 décrit dans l'exemple 1. 70 mg d'un chitosane dont le DA et la masse molaire (Mw) sont respectivement égaux à 48 % et 130 kg/mol sont mis en solution, sous agitation magnétique, dans 60,12 g d'eau (Eau d'irrigation, Versol) contenant 80 pL d'acide acétique glacial et 180 mg de NaCl. 55 mg de sel de sodium de sulfate de dextrane (« Dextran sulfate sodium sait » de 15 Leuconostoc spp, Sigma-aldrich) dont la masse molaire minimale moyenne est égale à 500 kg/mol sont solubilisés dans 50 g d'eau contenant 146,5 mg de NaCi. Ensuite sont prélevées : 15 g d'une solution de chitosane et 3,7 g d'une solution de DS. Le rapport des charges entre le chitosane et le sulfate de dextrane est égal à 3. Les nanoparticules obtenues après redispersion 20 dans du PBS ont un diamètre moyen et un PDI respectivement égaux à 407 nm et 0,19. La stabilité colloïdale des nanoparticules élaborées dans l'exemple 3 est évaluée suivant la même méthode que l'exemple 1. Le tableau suivant expose l'évolution du diamètre moyen et du PDI des nanoparticules pendant 91 25 jours.5 Durée Diamètre PDI de stockage moyen (nm) (jours) a 407 0,19 (Do) 10 398 0,15 28 368 0,15 45 382 0,17 91 375 0,17 Exemple 4 (chitosane DA 48%, Mw 130 kg/mol + sulfate de dextrane de 5 kg/moll Les nanoparticules sont élaborées suivant le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1. 36,5 mg d'un chitosane identique à l'exemple 3 sont mis en solution, sous agitation magnétique, dans 30 g d'eau (Eau d'irrigation, Versol) contenant 35 pL d'acide acétique glacial et 89,3 mg de NaCl. 34,5 mg de sel de sodium de sulfate de dextrane (Sigma-aldrich dont la masse molaire moyenne est égale à 5 kg/mol sont solubilisés dans 30 g d'eau contenant 85,9 mg de NaCl. Ensuite sont prélevées : 15 g d'une solution de chitosane et 2,4 g d'une solution de DS. Le rapport des charges entre le chitosane et le sulfate de dextrane est égal à 3. Les nanoparticules obtenues après redispersion dans du PBS ont un diamètre moyen et un PDI respectivement égaux à 415 nm et 0,17. La stabilité colloïdale des nanoparticules élaborées dans l'exemple 4 est évaluée en suivant la même méthode qu'à l'exemple 1. Le tableau suivant expose l'évolution du diamètre moyen et du PDI des nanoparticules pendant 111 jours. Durée Diamètre PDI de stockage moyen (nm) (jours) 0 (D0: 415 0,17 5 430 0,19 19 407 0,16 47 376 0,13 65 370 0,13 111 375 0,1720 Exemple 5 (chitosane DA 48%, Mw 130 kg/mol + héparine) Les nanoparticules sont élaborées suivant le protocole décrit dans l'exemple 1. 36,2 mg d'un chitosane dont le DA et la masse molaire sont respectivement égaux à 48 et 130 kg/mol sont mis en solution sous agitation magnétique dans 32,2 g d'eau (Eau d'irrigation, Versol®) contenant 30 pL d'acide acétique glacial et 95 mg de NaCl. 32.2 mg d'héparine de sodium (« Heparin sodium sait » from porcine intestinal mucosa , product number H4784, Sigma-aldrich) de 9 à 12 kg/mol sont solubilisés dans 32,02g d'eau contenant 89 mg de NaCl. Ensuite sont prélevées : 15 g d'une solution de chitosane et 4,5 g d'une solution d'héparine. Le rapport des charges entre le chitosane et le polyanion est égal à 2. Les nanoparticules obtenues après redispersion dans une solution (Eau Versol® lot 3007088) contenant 150mM de NaCI ont un diamètre moyen et un PDI respectivement égaux à 440 nm et 0,17. La stabilité colloïdale des nanoparticules élaborées est évaluée suivant la même méthode que l'exemple 1. Le tableau suivant expose l'évolution du diamètre moyen et du PDI des nanoparticules pendant 20 jours. Durée de Diamètre PDI stockage moyen (nm) (jours) 0 (Do) 440 0,17 4 425 0,13 14 427 0,10 272 0,18 20 Exemples comparatifs Les exemples rapportés ci-dessous ont été obtenus selon le mode opératoire de l'exemple 1. Seules les propriétés du chitosane (masse molaire et DA), ainsi que la masse molaire des sulfates de dextrane ont été variés comme stipulé dans le Tableau ci-dessous. Aucune de ces formulations ne conduit à des colloïdes stables, et dans de nombreux cas, il n'y a même pas formation de particules. DA 5 30 45 45 47 51 71 Chitosane My, 130 120 39 180 290 150 200 Chitosane (kg/mol) Mw 500 500 500 500 500 500 500 Sulfate de 10 5 5 10 dextrane (kg/mol) Stabilité à Pas de formation de particules *NON *NON 20 jours PBS ou *150 mM NaCl Réponse notification d'irrégularités du 29 Septembre 2010