Brevet FR2970415A1 — publié le 20120720

L'invention a pour objet l'utilisation de la Simalikalactone E (SkE) comme agent anticancéreux, plus particulièrement pour la prévention et/ou le traitement de cancers épithéliaux et hématologiques. La Simalikalactone E est un Quassinoïde isolé d'une Simaroubaceae amazonienne, Le. la plante Quassia amara réputée pour son efficacité antiparasitaire et sa faible toxicité (Vigneron et al., Journal of Ethnopharmacology (2005), Vol. 98, pp. 351-360 ; Bertani et al., Journal of Ethnopharmacology (2005), Vol. 98, pp. 45-54). La Simalikalactone E a été décrite dans la Demande de brevet FR n°09 02959 pour son activité antipaludique in vitro contre Plasmodium falciparum, in vivo par voie orale contre Plasmodium murin, et également contre les formes hépatocytaires et gamétocytaires de ce même parasite chez l'homme. Il a été identifié que la Simalikalactone E inhibe 50% de la croissance de Plasmodium falciparum en culture à des doses comprises entre 24 et 68 nM, indépendamment de la sensibilité à la chloroquine de la souche testée. Elle inhibe 50% de la croissance des cellules de mammifère Vero à une dose de 6574 nM, ce qui lui confère un index de sélectivité supérieur à 100. La Simalikalactone E réduit également le taux de gamétocytes de 50% à une concentration sept fois inférieure à celle obtenue avec la primaquine, la molécule de référence pour cette activité. In vivo, sur un modèle murin de paludisme, la Simalikalactone E inhibe 50% de la croissance de Plasmodium vinckei petteri à des doses de 0,5 et 1 mg/kg/jour par voie intrapéritonéale et par voie orale, respectivement (la chloroquine, molécule de référence, inhibe 50% de la croissance de Plasmodium vinckei petteri à une dose de 3mg/kg/jour par voie intrapéritonéale). Une étude préclinique chez la souris a par la suite permis d'identifier les doses de Simalikalactone E tolérées : lmg/kg/j par voie orale pendant 4 jours dans le test antimalarique suppressif de 4 jours de Peters (Cachet N. et al., Antimicrobial Agents Chemotherapy (2009) Vol. 53, No. 10, pp. 4393-4398). Cette étude a également démontré une action cytotoxique modérée de la Simalikalactone E sur certaines lignées cellulaires. Toutefois, il n'est fait aucune mention d'un quelconque effet anti-tumoral in vitro ou in vivo de la Simalikalactone E. Et il convient également de noter que la démonstration d'une activité cytotoxique d'un composé donné même vis-à-vis de lignées cellulaires tumorales n'implique en rien un effet anti-tumoral, ce composé pouvant s'avérer inactif in vivo ou bien présenter une cytotoxicité incompatible avec son administration à un être vivant. De manière surprenante, les Inventeurs ont pu constater que la Simalikalactone E se révèle être un inhibiteur sélectif de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/Erk, voie de signalisation fréquemment altérée dans les cancers. La voie de signalisation Ras/Raf/MEK/Erk est activée dans 20% des cancers connus, Le. les cancers du sein, de la prostate, du pancréas, des poumons, de la thyroïde, et plus de 50% des leucémies aiguës. Par exemple, la molécule Ras est mutée dans 15% des cancers humains, et plus particulièrement N-ras (Q61L) est muté dans 15 à 30% des mélanomes et B-raf dans 60% des mélanomes et dans 30 à 50% des cancers de la thyroïde. La Simalikalactone E a de ce fait un effet plus marqué dans les lignées de cellules cancéreuses dans lesquelles ces voies sont constitutivement activées, telles que les lignées de mélanomes et d'hémopathies malignes. Les Inventeurs ont établi que la Simalikalactone E possède de puissants effets anti-prolifératifs et inducteur de mort cellulaire in vitro, plus particulièrement sur les cellules tumorales dans lesquelles la voie Erkl/2 est suractivée, ce mécanisme étant lié à une inhibition de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/Erk. Le ciblage de la voie Erkl/2 est un enjeu majeur en cancérologie, dans la mesure où des mutations activatrices ou des suractivations de cette voie sont couramment retrouvées dans les cancers humains. C'est notamment le cas de B-raf dans le mélanome qui conduit à une suractivation de la voie Erkl/2. De même, dans la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC), la tyrosine kinase p210 BCR-ABL codée par la translocation t(9;22), anomalie responsable de la maladie, induit une suractivation de la voie Erkl/2. Par ailleurs, certaines lignées de LMC résistantes aux ITK (Clivec°, Sprycel®, LAMA Nilo-S et Nilo-R) présentent une exacerbation de la voie Erkl/2 due à une augmentation de l'expression et de l'activité de la Src kinase Fyn (Fenouille N. et al., Cancer Research (2010), 70 (23)). L'invention a donc pour objet la Simalikalactone E répondant à la formule 1 ci-dessous : OH 2s 1 SkE avec comme indication la prévention et/ou le traitement de cancers, et plus particulièrement les cancers épithéliaux et hématologiques, la Simalikalactone E inhibant de manière efficace la voie Erk1/2, et de ce fait la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/Erk. L'invention a donc pour objet la Simalikalactone E avec comme indication la prévention et/ou le traitement de cancers épithéliaux choisis parmi les mélanomes, les cancers du sein, de la prostate, de l'ovaire, du rein, de l'intestin, du colon, du pancréas, du poumon, de la thyroïde et les cancers ORL. L'invention a également pour objet la Simalikalactone E avec comme indication la prévention et/ou le traitement de cancers hématologiques choisis parmi les hémopathies malignes, et plus particulièrement les Syndromes MyéloProlifératifs (SMP) dont la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC), les Syndromes MyéloDysplasiques (SMD), le Myélome Multiple (MM), les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM), les Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL), l'utilisation de Simalikalactone E convenant plus particulièrement pour la prévention et/ou le traitement de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC), des Syndromes MyéloDysplasiques (SMD), du Myélome Multiple (MM), des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL). Les formes d'administration appropriées incluent les formes administrables par voie orale telles que les comprimés, les gélules molles ou dures, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, par voie topique par exemple sous forme de crèmes, gels, pommades ou lotions, par voie intraveineuse, ou par voie sous-cutanée. On peut préparer une composition solide sous forme de comprimés, par mélange du principe actif, la Simalikalactone E, avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables, tels que, par exemple, la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la silice, la gomme arabique, le mannitol, la cellulose microcristalline, l'hydroxypropyl-méthylcellulose, ou des composants analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique ou d'autres matières adaptées à l'enrobage. Les comprimés peuvent être réalisés par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, telles que la compression directe, la granulation sèche, la granulation humide ou la fusion à chaud. On peut également préparer une composition sous forme de gélules en mélangeant les ingrédients actifs avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures. Les doses journalières de Simalikalactone E sont avantageusement les suivantes : de 10 à 50 mg/kg/j de Simalikalactone E. En particulier, ces doses conviennent à une administration par voie orale. II peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient au traitement. Le médicament de l'invention est destiné à être administré pendant préférentiellement 1 à 60 jours consécutifs, et de préférence de 20 à 40 jours, en une ou plusieurs prises quotidiennes, de préférence une seule prise par jour. La présente Invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant la Simalikalactone E en tant que principe actif en association avec un autre principe actif anticancéreux, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les principes actifs anticancéreux associés à la Simalikalactone E sont choisis parmi les principes actifs bien connus de l'homme du métier en fonction de la pathologie anticancéreuse à traiter. La Simalikalactone E peut être isolée à partir de feuilles matures de Quassia amara en employant un protocole qui comprend les étapes suivantes : les feuilles matures de Quassia amara sont broyées et extraites par du méthanol. Cet extrait est dissous dans un système biphasique à base de n-heptane, acétate d'éthyle, méthanol, eau. La phase inférieure est recueillie et son volume est réduit de moitié par évaporation sous pression réduite. Cette solution est extraite avec de l'acétate d'éthyle. L'acétate d'éthyle est évaporé. Le résidu obtenu est dissout dans du chloroforme et lavé à l'aide d'une solution aqueuse légèrement basique. La phase organique est recueillie, séchée et concentrée sous pression réduite. Cet extrait est dissout dans de l'acétate d'éthyle et lavé à l'eau. La phase organique est évaporée sous pression réduite et le résidu obtenu est élué par de l'acétate d'éthyle à travers une colonne de silice. L'extrait obtenu est purifié suivant le protocole suivant : l'extrait est fractionné par chromatographie de partage centrifuge en utilisant un système Arizona H composé de n-heptane, acétate d'éthyle, méthanol, eau, en mode ascendant. Des échantillons de 25 mL sont recueillis. Les échantillons comprenant la Simalikalactone E sont rassemblés et purifiés par chromatographie sur colonne de silice éluée par des mélanges cyclohexane/acétate d'éthyle de polarité croissante. La Simalikalactone E est éluée par le mélange cyclohexane/acétate d'éthyle 50/50. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples mettant en évidence les propriétés anti-tumorales de la Simalikalactone E, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la Figure 1 représente l'effet de la Simalikalactone E sur la croissance et la viabilité de lignées cellulaires leucémiques K562-Ima-S et K562-Ima-R, - la Figure 2 représente l'effet de la Simalikalactone E sur la croissance et la viabilité de cellules de mélanomes A375 et McWo, - la Figure 3 représente l'effet de la Simalikalactone E sur la viabilité de cellules primaires humaines CD34+ de patients atteints de LMC, - les Figures 4 et 5 montrent l'effet de la Simalikalactone E sur la phosphorylation de la kinase Erkl/2. PARTIE EXPERIMENTALE A- Protocole d'obtention de la Simalikalactone E Les feuilles de Quassia amara ont été récoltées à Rémire-Montjoly en Guyane Française. Un spécimen (GB3012) a été récolté et son identification botanique a été confirmée à l'herbier de Cayenne en Guyane. La Simalikalactone E a été isolée de Quassia amara en employant le protocole suivant : 1 kg de feuilles matures séchées de Quassia amara sont broyées et extraites durant 24 heures avec 6 L de méthanol, ceci deux fois, pour donner 200 g d'extrait. 50 g de cet extrait sont dissous dans 2 L d'un système biphasique composé de n-heptane, acétate d'éthyle, méthanol, eau dans les proportions 3/2/3/2. La phase la plus lourde est concentrée jusqu'à 500 mL, et 500 mL d'eau y sont ajoutés. Cette solution est extraite avec 1 L d'acétate d'éthyle. L'acétate d'éthyle est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est dissout dans 1,5 L de chloroforme et lavé quatre fois à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,001 M. La phase organique est recueillie, séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous pression réduite pour donner 3,3 g d'extrait. Cet extrait est dissout dans 500 mL d'acétate d'éthyle et lavé avec 500 mL d'eau. La phase organique est évaporée sous pression réduite et le résidu obtenu est élué rapidement par l'acétate d'éthyle à travers une courte colonne de silice. On obtient après évaporation de l'acétate d'éthyle 1,0 g d'extrait. Cet extrait est fractionné par chromatographie de partage centrifuge (appareil Kromaton, équipé d'un rotor de 1 L), en utilisant un système Arizona H composé de n-heptane, acétate d'éthyle, méthanol, eau dans les proportions 1/3/1/3, en mode ascendant, à une température de 16°C. Le flux de solvant est de 25 mL/min, la vitesse du rotor est de 1000 t/min, et est changée au cours de l'élution pour maintenir une pression de 40 bars. L'extrait (1,0 g) est dissout dans 40 mL de système Arizona H, filtré et injecté. Des échantillons de 25 mL sont recueillis. Les échantillons sont rassemblés pour donner la fraction F1 (120 mg). Cette fraction est purifiée par chromatographie sur colonne de silice éluée par des mélanges cyclohexane/acétate d'éthyle de polarité croissante. La Simalikalactone E (10 mg) est éluée par le mélange cyclohexane /acétate d'éthyle 50/50. Le rendement à partir de la plante est de 0,004%. La Simalikalactone E a été caractérisée par spectrométrie de masse, spectroscopie RMN, infra rouge, et par son pouvoir rotatoire. Des cristaux ayant été obtenus à partir du méthanol deutéré, un cliché de rayon X de la molécule a également été obtenu. Ses caractéristiques physico-chimiques sont les suivantes : APCIMS, 579 (MH+), 561 (MH+-HZO). I H NMR (CDC13, 500 MHz), 8 6,19 (m, 1H, H-15), 6,17 (s, 1H, H-3), 5,19 (dd, J = 2,6, 11,7 Hz, 1H, H-6), 4,75 (d, J = 5,1 Hz, 1H, H-11), 4,70 (d, J= 2,6 Hz, 1H, H-7), 4,65 (d, J= 7,4 Hz, 1H, H-17a), 4,19 (s, 1H, H-1), 3,83 (s, 1H, H-12), 3,70 (d, J= 7,4 Hz, 1H, H-17b), 3,37 (d, J= 11,5 Hz, 1H, H-5), 2,51 (m, 1H, H-24), 2,48 (m, 1H, H-19), 2,45 (m, IH, H-14), 2,43 (m, 1H, H-9), 2,08 (s, 3H, H-30), 1,79 (m, 2H, H-21a, H-26a), 1,61 (m, 1H, H-26b), 1,53 (m, 1H, H-21b), 1,45 (s, 3H, H-28), 1,35 (s, 3H, H-29), 1,21 (d, J= 7,0 Hz, 3H, H-20), 1,19 (d, J= 7,0 Hz, 3H, H-25), 1,01 (t, J= 7,4 Hz, 3H, H-22), 0,99 (t, J= 7,4 Hz, 3H, H-27). 13C NMR (CDC13, 125 MHz), 8 196,5 (C-2), 176,2 (C-23), 175,2 (C-18), 166,5 (C-16), 163,0 (C-4), 126,5 (C-3), 82,8 (C-7), 81,8 (C-1), 80,0 (C-13), 79,8 (C-12), 74,2 (C-11), 70,9 (C-17), 69,1 (C-6), 67,3 (C-15), 52,7 (C-14), 50,4 (C-10), 46,1 (C-8), 45,9 (C-5), 41,3 (C-24), 41,3 (C-19), 41,1 (C-9), 27,2 (C-26), 26,7 (C-21), 26,1 (C-30), 22,8 (C-28), 16,7 (C-20), 15,6 (C-25), 12,5 (C-29), 11,7 (C-22), 11,5 (C-27). IR (KBr, cm-l) : 2965, 2926, 2855, 1766, 1738, 1722,1667. [a]p26 = +94°(c = 0,35, CHC13). B- Activité biologique B I- Matériel et Méthodes Les drogues utilisées ont prépalablement diluées 1000 fois dans du DMSO pur (concentration finale en DMSO : 0,1%). BI -1. Mesure de viabilité cellulaire XTT : Ce test mesure l'activité de la succinate déshydrogénase mitochondriale qui représente un index de la viabilité cellulaire. Cet enzyme transforme le XTT en formazan orange. Au jour 0, les cellules K562-Ima-S (sensibles à Ima), K562-Ima-R (résistantes à Ima), A375 ou McWo sont ensemencées à raison de 15 000 cellules/puits (100 µl) dans des microplaques de 96 puits et stimulées avec des concentrations croissantes de Simalikalactone E [50-500 nM]. Après 24 ou 48 heures, 50 µl de tétrazolium (réactif XTT) est ajouté à chaque puits et une lecture de la densité optique à 490 nm est réalisée toutes les 30 minutes pendant 2 à 4 heures. Les valeurs obtenues qui sont un index du métabolisme mitochondrial permettent d'évaluer le pourcentage de cellules vivantes. Chaque condition est systématiquement réalisée en triplicate. B1-2. Mesure de la mort cellulaire : La caractérisation du type de mort cellulaire impliqué dans l'effet de la Simalikalactone E est réalisée selon les protocoles suivants : - l'apoptose (mort cellulaire de type I) est étudiée grâce à des dosages d'activité caspases, protéases à cystéines impliquées dans ce type de processus. L'apoptose est également quantifiée par co-marquage annexine V/iodure de propidium, les cellules externalisant l'annexine V au niveau de leur mitochondrie étant des cellules en cours d'apoptose, - la mort autophagique (mort cellulaire de type II) est analysée par des dosages d'activité cathepsines, ces protéases étant quant à elles impliquées dans la dégradation du matériel intracellulaire inclus dans les vésicules (autophagolysosomes). La mort cellulaire de type II peut également être mise en évidence par imagerie en microscopie électronique, et des westerns blot (transferts de protéines) sont enfin réalisés en utilisant des anticorps spécifiques de l'induction d'apoptose (clivage de PARP et des caspases) ou de la mort autophagique (conversion de LC3-I en LC3-II et activation des cathepsines). B1-3. Analyse du cycle cellulaire Les cellules sont incubées pendant 24 et 48 heures en absence ou en présence de la Simalikalactone E (250 nM). Elles sont ensuite centrifugées, lavées avec une solution tampon phosphate PBS, puis suspendues à nouveau dans une solution d'éthanol à 70%. Les cellules sont ensuite lavées avec une solution tampon phosphate PBS et marquées en présence de Ribonucléase A (RNAse A) et d'iodure de propidium. L'analyse du cycle cellulaire est réalisée à l'aide d'un cytofluorimètre (Macsquant Analyser, Miltenyi Biotec). Le pourcentage de cellules K562-Ima-S présentes dans chacune des phases du cycle cellulaire (GO/Gl, S, M et SubGl) est déterminé. B2- Résultats B2-1. Inhibition de la croissance et réduction de la viabilité de différentes lignées tumorales cellulaires Les lignées tumorales K562-Ima-S et K562-Ima-R sont incubées pendant 48 heures avec des concentrations croissantes de la Simalikalactone E (0, 100 ou 250 nM) en absence ou en présence d'une concentration maximale efficace (50 µM) de z-Vad-fmk (Zvad) un inhibiteur pan-caspase (inhibiteur d'apoptose). Les résultats sont présentés à la Figure 1. Les deux lignées leucémiques sont sensibles à l'effet de la Simalikalactone E et l'effet de la Simalikalactone E n'est pas modifié en présence de l'inhibiteur de caspase, ce qui démontre que la perte de viabilité des cellules en présence de Simalikalactone E ne requiert pas l'apoptose. Des cellules de mélanomes A375 et McWo sont ensuite traitées en présence de doses croissantes de Simalikalactone E. 48 heures plus tard, les cellules sont soumises à un test XTT. Les cellules A375 sont porteuses de la mutation V600E sur l'oncogène B-raf ce qui se traduit par une activation constitutive de la voie Erk. De façon intéressante les cellules A375 sont beaucoup plus sensibles à la Simalikalactone E que les cellules McWo qui ne possèdent pas la mutation de B-raf. Les résultats sont présentés à la Figure 2. B2-2. Inhibition de la viabilité de cellules primaires humaines CD34+ de patients atteint de LMC Les cellules primaires de patients atteints de LMC (CD34+ Bcr-Abl+ purifiées) sont incubées en présence de concentrations variables de Simalikalactone E pendant 48 heures, puis la viabilité cellulaire est quantifiée grâce à un test colorimétrique XTT. L'imatinib (Ima) est utilisé comme contrôle positif de l'induction de mort des cellules Bcr-Abl+. Les résultats sont présentés à la Figure 3. La Simalikalactone E à une concentration de 500 nM s'avère aussi efficace que l'imatinib pour inhiber le métabolisme cellulaire. L'effet demi-maximal est obtenu pour une dose de 100 nM de Simalikalactone E. B2-3. Inhibition de la phosphorylation de la kinase Erkl/2 Les cellules K562-Ima-S (A) et K562-Ima-R (B) sont traitées pendant des durées de temps variables avec 250 nM de Simalikalactone E. Les cellules sont ensuite lysées et des extraits protéiques sont préparés pour une analyse en western blot. Enfin, les membranes sont incubées en présence des différents Anticorps anti-PARP, LC3b, p-Erkl/2, Erkl/2 et HSP60. La Figure 4 montre que la Simalikalactone E inhibe la phosphorylation de la kinase Erkl/2 aussi bien dans les cellules sensibles que résistantes à l'imatinib, sans modifier l'expression globale de la protéine Erk. Cet effet de la Simalikalactone E se produit en absence d'apoptose (pas de clivage de PARP) et d'autophagie (pas de modification de LC3). Des cellules K562-Ima-S sont ensuite traitées pendant 1 heure en présence de 250 nM de Simalikalactone E ou 10 µM d'U0126 (inhibiteur spécifique de MEK1/2, la kinase responsable de la phosphorylation et de l'activation de l'Erkl/2). Les cellules sont ensuite lysées et des extraits protéiques préparés pour une analyse en western blot. Les membranes sont alors incubées en présence des anticorps p-Erkl/2, Erkl/2 et HSP60. La Figure 5A montre que la Simalikalactone E à une concentration de 250 nM est aussi efficace que l'U0126 à une concentration 40 fois plus forte, l'U0126 étant l'inhibiteur de MEK1/2 actuellement le plus utilisé pour bloquer l'activité de l'Erkl/2 in vitro. Dans l'expérience présentée à la Figure 5B, des cellules HEK-Rafl-ER inductibles ont été utilisées. Ces cellules expriment la kinase Raf sous le contrôle du récepteur des oestrogènes. L'expression de Raf peut donc être induite en présence de tamoxifène. Les cellules sont pré-incubées pendant 30 minutes avec des doses croissantes de Simalikalactone E ou d'U0126, puis traitées avec 1µM de tamoxifène pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite lysées et des extraits protéiques sont préparés pour une analyse en western blot. Les membranes sont finalement incubées en présence des différents anticorps (p-Erkl/2, Erkl/2 et HSP60). La Simalikalactone E et l'U0126 inhibent la phosphorylation de l'Erkl/2 dépendante de Rafla Ces résultats montrent que la Simalikalactone E bloque la voie Erkl/2 au niveau ou en amont de MEK1/2.