Brevet FR2964671A1 — publié le 20120316

La présente invention concerne le domaine de la cristallisation de substances inorganiques ou organiques, et en particulier la cristallisation de molécules, notamment de macromolécules, telles que des protéines. La compréhension des propriétés physico-chimiques de macromolécules telles que les protéines s'appuie généralement sur la connaissance de la structure atomique de ces macromolécules. Afin d'étudier cette structure, on a essentiellement recours à des techniques de diffraction aux rayons X et de cristallographie neutronique. La diffraction aux rayons X permet ainsi d'obtenir la structure tridimensionnelle des molécules à étudier, celle aux neutrons apporte des informations complémentaires sur les états de protonation des protéines et de leurs ligands, sur les positions et les orientations des molécules de l'eau et sur les réseaux de liaisons hydrogène. En effet, pour la compréhension des processus biologiques, il est important de connaître précisément le positionnement des atomes d'hydrogène, comment ils sont transférés entre les molécules de protéine, les molécules du solvant et les substrats. Ces techniques de diffraction nécessitent que les macromolécules à étudier se trouvent sous la forme cristalline, et plus avantageusement sous la 20 forme de monocristaux de bonne qualité et de volume suffisant. Dans le cadre de la présente invention, on entend par monocristal de bonne qualité, un monocristal présentant : - une faible mosaïcité, - un pouvoir de diffraction important (à savoir inférieur à 1,5 25 angstrdm), - un volume important, à savoir compris entre 0,001 mm3 pour la diffraction aux rayons X, et 1 mm3 pour la diffraction aux neutrons. On entend aussi dans le cadre de la présente invention par 30 macromolécules, des molécules ayant un poids moléculaire de plusieurs milliers de Daltons à plusieurs centaines de milliers de Daltons. Il peut s'agir de séquences d'acides nucléiques d'ADN ou d'ARN, de fragments de virus, de protéines, de complexes de protéines, de complexes protéine-ARN, de complexes protéine-ligand, ou encore de polypeptides. De plus, la présente invention peut être appliquée avec succès à la cristallisation de plus petites molécules telles que des sucres, des antibiotiques, ou encore d'autres composés d'intérêt pharmaceutique. Pour obtenir des monocristaux de bonne qualité et de volume important, il est essentiel de contrôler la cristallisation des macromolécules (à savoir la cristallogénèse), car c'est la cristallogénèse qui va gouverner les propriétés physico-chimiques du cristal ainsi obtenu. La cristallogénèse se décompose en deux étapes : - une première étape, dite de nucléation, consistant en l'apparition de germes cristallins à partir d'une solution de cristallisation. - une deuxième étape, dite de croissance, consistant en la croissance cristalline des germes de cristaux obtenus lors de la nucléation. La nucléation peut être perturbée par l'apparition : - d'une phase solide ou liquide indésirable, par exemple un précipité amorphe ou une démixtion (une séparation liquide-liquide), ou - d'une phase cristalline/polymorphe indésirable. Le polymorphisme est la capacité d'une molécule à exister sous plusieurs formes cristallines. Or, dans le domaine pharmaceutique, l'approbation de normalisation d'un médicament est souvent soumise à l'exigence d'une seule forme cristalline ou d'un seul polymorphe d'une molécule donnée. La croissance peut aboutir à la formation de cristaux de faible diffraction, voire même à la formation de polycristaux, ce qui entrave sérieusement la résolution de la structure tridimensionnelle des macromolécules. Afin d'éviter ces problèmes précités, de longues et onéreuses recherches permettent d'obtenir des conditions optimales de la cristallisation des macromolécules. Pour ce faire, il est essentiel de connaître : - le comportement des molécules en solution avant la nucléation, à savoir : - la nature de leurs interactions (attractives/répulsives), - les associations moléculaires : les paramètres de taille et de masse des particules formées en solution (monomère, dimère,...), - la polydispersité (c'est-à-dire la présence d'une ou de plusieurs populations de particules formées en solution). - le comportement des germes cristallins une fois formés et présents dans une solution de molécule à cristalliser, et cela en fonction des différents paramètres que sont : a) la température, b) la concentration de la molécule à cristalliser, c) la concentration des agents de cristallisation et/ou des additifs. Dans le cadre de la présente invention, on entend par agent de cristallisation des agents qui favorisent la cristallisation de la molécule à cristalliser. Il peut s'agir de : - sels, tels que le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, le phosphate de potassium ; - composés organiques, tels que l'isopropanol et le 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD) ; - des polyéthylène glycol, tels que le PEG 4000, le PEG 6000, ou 20 encore le PEG 8000. Dans le cadre de la présente invention, on entend par additif, des composés permettant d'augmenter la stabilité de la molécule à cristalliser et/ou l'homogénéité de sa conformation. Il peut s'agir de détergents, d'agents réducteurs, de substrats, et de cofacteurs tels que les n-alkyl-8-glucosides ou 25 n-alkyl-maltosides, le dithiotreitol (DTT), des lipides, des sous-unités ou des groupes prosthétiques. Il est souvent nécessaire de réaliser un diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser qui est établi en fonction de ces trois paramètres a) à c) précités. 30 Un exemple de diagramme de phases est représenté sur la figure la pour le cas d'une molécule à cristalliser ayant une solubilité directe. Par molécule à cristalliser ayant une solubilité directe, on entend que la solubilité de la molécule à cristalliser augmente avec l'accroissement de la température. Sur l'axe de l'abscisse de ce diagramme figure la température (exprimée en °C) et sur l'axe de l'ordonnée figure la concentration de la molécule à cristalliser présente en solution (exprimée en mg/mL). On distingue sur ce diagramme quatre zones A à D qui sont établies et déterminées par une observation (par exemple au moyen d'un microscope optique) en temps réel de l'évolution du contenu de la solution de la molécule à cristalliser, dans laquelle ont été disposés des germes de cristaux de la molécule à cristalliser : - Zone A : La zone métastable, dans laquelle la solution est faiblement sursaturée, et peut se maintenir ainsi très longtemps sans formation de cristaux, mais les cristaux ensemencés y grossissent ; - Zone B : La nucléation n'a pas lieu et les cristaux ensemencés sont dissous : il s'agit de la zone dite « zone de sous-saturation » ; - Zone C : L'excès de la molécule à cristalliser se sépare de la solution de la molécule à cristalliser sous la forme de germes de cristaux (ou autrement dit de nucléis). Les cristaux ensemencés y grossissent : il s'agit d'une zone dans laquelle la nucléation est spontanée. - Zone D : Les structures formées sont désordonnées. Il s'agit d'agrégats et/ou de précipités. Cette zone est dite « zone de précipitation», dans laquelle la sursaturation est tellement importante que la formation des agrégats et des précipités y est favorisée avant la formation des cristaux. Les zones A, C et D forment ensemble la zone dite «zone de sursaturation ». La zone de métastable est limitée par deux courbes de natures différentes. La frontière inférieure (à savoir la frontière entre la zone A et la zone B) est la courbe de solubilité, correspondant aux points d'équilibre thermodynamique entre la solution de la molécule à cristalliser et les cristaux. L'emplacement de cette courbe de solubilité sur le diagramme de phases est fixe et il est de nature thermodynamique. Une solution à cristalliser se situant sur cette courbe de solubilité demeure stable. Sur cette courbe de solubilité, la probabilité pour qu'un événement de nucléation se produise est nulle et le temps d'induction pour la nucléation est infini. La limite supérieure de la zone métastable (à savoir la frontière entre la zone A et la zone C) est aussi dénommée « limite de métastabilité » ou « courbe de supersolubilité ». A la différence de la courbe de solubilité, son emplacement sur le diagramme de phases est de nature cinétique. Il dépend du taux de progression de la sursaturation. Sur cette courbe de supersolubilité, la probabilité pour qu'un événement de nucléation se produise est de 1, et le temps d'induction pour la nucléation est nul car la nucléation est instantanée. Le temps d'induction de la nucléation étant fonction de la sursaturation, toute solution à cristalliser se situant dans la zone métastable du diagramme de phases peut nucléer spontanément. Plus haute est la sursaturation, plus court est le temps d'induction de la nucléation. Un autre diagramme de phases de la molécule à cristalliser peut être établi en fonction de la concentration de la molécule à cristalliser (axe de l'ordonnée) et de la concentration en agent de cristallisation et/ou d'additif (axe de l'abscisse). Un tel exemple de diagramme est représenté sur la figure 1 b. On y distingue les quatre mêmes zones A à D telles que décrites pour la figure la. La détermination de la courbe de solubilité de différentes molécules à cristalliser a fait l'objet de nombreuses études, parmi lesquelles on peut citer celle de A.F. Ducruix, M.M. Riès-Kautt, Methods (1990), 1(1) 25- 30 intitulée « Solubility diagram analysis and the relative effectiveness of different ions on protein crystal growth » ; Il existe plusieurs techniques de cristallisation, parmi lesquelles : - la diffusion de vapeur (en goutte suspendue, assise ou sandwich), - la dialyse, - la libre diffusion d'interface, ou encore - le batch : technique de cristallisation où la molécule à cristalliser est mélangée avec des agents de cristallisation et/ou des additifs appropriés, créant ainsi une solution homogène. 35 La technique du batch est très utilisée pour la cristallisation de petites molécules, du fait de sa rapidité et de sa simplicité de mise en oeuvre. Cependant, seule une étroite gamme de concentrations de la molécule à cristalliser, ainsi que de l'agent de cristallisation peuvent être échantillonnés au cours d'une même expérimentation de manière à rassembler les conditions opératoires permettant de favoriser la nucléation et/ou la croissance du cristal. La cristallisation par dialyse implique la mise en place de la molécule à cristalliser dans un dispositif qui est scellé au moyen d'une membrane de dialyse. Cela permet alors à l'eau et à des agents de cristallisation et/ou des additifs de diffuser de part et d'autre de la membrane de dialyse tout en conservant la molécule à cristalliser dans le dispositif. Le dispositif est placé dans un conteneur approprié qui renferme les agents de cristallisation et/ou les additifs. Cette technique par dialyse tient compte aussi bien des effets «salting in » (à basse force ionique, la solubilité de la molécule à cristalliser augmente lorsque la force ionique augmente) et « salting out » (à haute force ionique, la solubilité de la molécule à cristalliser diminue lorsque la force ionique augmente), que du pH. De plus, on connaît du document WO 2006/099890 A1, un procédé de cristallisation en batch d'une macromolécule reposant sur un contrôle de température systématique de la solution de la macromolécule à cristalliser dans laquelle ont été disposés des cristaux de ladite macromolécule, de manière à ce que les cristaux se situent toujours dans la zone métastable, et ce afin qu'au cours d'une évolution contrôlée de la température de la solution de la macromolécule à cristalliser, les cristaux se développent et grossissent. Néanmoins, ce procédé de cristallisation se limite uniquement au contrôle : - d'un seul paramètre de cristallisation qui est la température, - d'une des deux étapes cruciales à la cristallisation, à savoir la croissance des cristaux ensemencés dans la solution de la macromolécule à cristalliser. De plus, les cristaux obtenus à l'issue de ce procédé de cristallisation ne sont pas récupérables par des méthodes traditionnelles, telles que le montage des cristaux dans des boucles utilisées en cristallographie. Pour faciliter l'extraction des cristaux, un micromanipulateur est utilisé afin de monter les cristaux dans des capillaires en quartz. 5 10 15 20 25 30 35 La présente invention se propose d'améliorer les procédés de cristallisation de molécules, en particulier de macromolécules, en fournissant un dispositif de cristallisation qui comporte une cellule de cristallisation permettant : - de mettre en oeuvre un procédé permettant aussi de contrôler in situ un deuxième paramètre de cristallisation qui est la concentration des agents de cristallisation et/ou des additifs, - de mettre en oeuvre un procédé permettant aussi de contrôler in situ la nucléation, - de mettre en oeuvre un procédé permettant de mesurer in situ la concentration de la molécule à cristalliser en solution et ainsi de déterminer le diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser, - de diminuer le volume de l'échantillon de la molécule à cristalliser utilisé dans une seule expérimentation avec la possibilité de le réutiliser ultérieurement. En effet, l'échantillon n'est pas consommé au cours du procédé selon l'invention et les conditions de cristallisation peuvent être changées de façon réversible, - d'obtenir des cristaux de meilleure qualité et de volume plus important que ceux obtenus par les dispositifs de cristallisation actuellement connus, - d'obtenir des cristaux de la phase cristalline/polymorphe souhaitée, tout en présentant en outre l'avantage de pouvoir récupérer aisément lesdits cristaux à l'issue de la cristallisation. La cellule de cristallisation d'une molécule à cristalliser selon l'invention comprend : - une chambre de cristallisation dans laquelle est ménagée une cavité destinée à recevoir une première solution S1 contenant la molécule à cristalliser et ses germes de cristaux, ladite cavité comportant un fond optique et une ouverture en regard dudit fond optique, - une membrane de dialyse destinée à recouvrir l'ouverture de ladite cavité de la chambre de cristallisation, - un réservoir destiné à venir s'emboîter sur ladite chambre de cristallisation de manière à créer un compartiment étanche formé d'une part par le réservoir et d'autre part par la chambre de cristallisation, ledit compartiment étant destiné à être rempli d'une deuxième solution S2 dite solution de cristallisation qui contient au moins un agent de cristallisation et/ou un additif et ledit réservoir étant conçu de manière à ce que la concentration de la solution S2 puisse varier de façon contrôlée dans ledit compartiment. Par variation de façon contrôlée, on entend que la concentration de la solution S2 peut être ajustée précisément par l'opérateur réalisant la cristallisation, et ce à l'aide de moyens tels que des moyens de contrôle et de variation de la concentration des composés dont est constituée la solution S2 qui sont raccordés à ladite cellule de cristallisation et qui font partie du dispositif de cristallisation décrit ci-après. Grâce à la cellule de cristallisation selon l'invention, une optimisation de la nucléation et de la croissance cristalline peut être obtenue en combinant des contrôles précis de la température et de la concentration en agents de cristallisation et/ou d'additifs avec une méthode de dialyse. Les contrôles précités sont basés sur des concepts physico-chimiques d'après les diagrammes de phases de la molécule à cristalliser qui sont déterminés expérimentalement et qui ont été évoqués ci-dessus. De plus, grâce à la cellule de cristallisation selon l'invention, on obtient des cristaux bien ordonnés, de taille raisonnable et dans des conditions expérimentales aisément reproductibles. Selon l'invention, la membrane de dialyse peut être en cellulose (par exemple en cuprophane, à savoir une cellulose régénérée), en cellulose modifiée telle que l'acétate de cellulose, l'hémophane, ou encore en cellulose modifiée synthétiquement. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la membrane est une membrane synthétique, par exemple en polysulfone, en polyamide polyacrylonitrile, en copolymères d'acrylonitrile et sulfonate de sodium de methallyl, en polyméthylmétacrylate (PMMA), en ethylènevinylalcool (EVOH) ou encore en polycarbonate (PC). Une membrane en cellulose présente les propriétés suivantes : finesse, pores de petit diamètre permettant l'élimination de substances de poids moléculaire faible, un faible coût, une forte réactivité chimique (du fait des groupes hydroxyle), une faible biocompatibilité. La cellulose modifiée présente les propriétés suivantes : une réactivité chimique moindre, une bonne biocompatibilité, une substitution des groupes hydroxyle, une augmentation de la taille des pores, une augmentation de la perméabilité hydraulique, une élimination de substances de plus grand poids moléculaire. Les membranes synthétiques présentent les propriétés suivantes : une réactivité chimique faible (car dépourvues de groupes hydroxyle), une bonne biocompatibilité, une taille des pores élevée, une perméabilité hydraulique, une élimination de substances de poids moléculaire important. De manière préférée, le fond optique de la cellule de cristallisation est en polycarbonate. Il peut aussi être en verre ou en quartz. L'invention concerne aussi l'utilisation de la cellule de cristallisation d'une molécule à cristalliser telle que décrite ci-dessus pour la cristallisation de molécules de plusieurs milliers de Daltons à plusieurs centaines de milliers de Daltons. Il peut s'agir de séquences d'acides nucléiques d'ADN ou d'ARN, de fragments de virus, de protéines, de complexes de protéines, de complexes protéine-ARN, de complexes protéine-ligand, ou encore de polypeptides. La solution de cristallisation peut contenir des agents de cristallisation et/ou des additifs tels que décrits ci-dessus. Un autre objet de l'invention est un dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser qui comprend : - au moins une cellule de cristallisation d'une molécule à cristalliser telle que décrite ci-dessus ; - au moins un moyen d'acquisition d'images, - au moins un moyen de contrôle et de variation de la température dudit dispositif de cristallisation et/ou au moins un moyen de contrôle et de variation de la concentration en agent de cristallisation et/ou d'additif de la solution S2. Le dispositif de cristallisation peut en outre comprendre au moins un moyen de mesure de la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1. Le dispositif de cristallisation peut en outre comprendre au moins un moyen de caractérisation de la molécule à cristalliser en termes de taille/masse et de la distribution des tailles de particules de la molécule à cristalliser se formant/diffusant dans la solution S1 De manière préférée, le moyen d'acquisition d'images peut consister en un microscope optique. Avantageusement, le moyen de contrôle et de variation de la température est basé sur la technologie Peltier. Il peut s'agir d'une Cellule à Effet Peltier (CEP), appelée aussi module thermoélectrique. Avantageusement, un moyen de contrôle et de variation de la concentration en agent de cristallisation et/ou d'additif de la solution S2 de la cellule de cristallisation consiste en une pompe péristaltique à multicanaux qui est reliée au réservoir de la cellule de cristallisation. De manière préférée, le dispositif de cristallisation comprend en outre un système de mesure de l'absorbance UV et un système de diffusion de la lumière dans la chambre de cristallisation. La mesure de l'absorbance UV permet de déterminer la courbe de solubilité telle que définie ci-avant. La diffusion de la lumière permet de caractériser le rapport taille/masse et la distribution des tailles de particules de la molécule à cristalliser se formant et/ ou diffusant dans la solution S1. La nucléation peut ainsi être détectée. En effet, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 qui correspond à cet événement (la nucléation) est ensuite mesurée par la mesure d'absorbance UV ; ce qui permet d'identifier la limite supérieure de la zone métastable (à savoir la ligne entre la zone A et la zone C des diagrammes de phases des figures fig.1 a et fig.1 b). Dans ce mode de réalisation, le fond optique de la cellule de cristallisation est de préférence en quartz. Dans un mode de réalisation de l'invention, le dispositif de cristallisation comprend en outre un micromanipulateur permettant d'extraire les cristaux de la cellule de cristallisation. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif de cristallisation comprend un ordinateur équipé d'un logiciel permettant de spécifier la température, les concentrations en agents de cristallisation et/ou en additifs, ainsi que le pH de la solution de cristallisation S2 de la cellule de cristallisation. Dans un mode de réalisation de l'invention, le dispositif de cristallisation comporte une pluralité de cellules de cristallisation selon l'invention qui sont disposées sur un carrousel semi-automatisé. L'invention concerne aussi un procédé de cristallisation s'effectuant au moyen du dispositif de cristallisation tel que décrit ci-dessus. Selon un premier mode de réalisation du procédé de cristallisation, la concentration P en agents de cristallisation et/ou additifs demeure constante et l'on a recours au diagramme de phases de la molécule à cristalliser établi en fonction de la concentration en ladite molécule à cristalliser et de la température tel que représenté à la figure 1 a. Plus précisément, le procédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser selon ce premier mode de réalisation comprend les étapes suivantes : a) On dispose : - d'une première solution S1 de ladite molécule à cristalliser dans la chambre de cristallisation d'une cellule de cristallisation telle que décrite ci-dessus, et ce à une première température Tl et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser dans la solution S1, de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la température ; - d'une deuxième solution S2, dite solution de cristallisation, dans le compartiment de la cellule de cristallisation, ladite solution de cristallisation S2 contenant au moins un agent de cristallisation et/ou un additif à une concentration P constante, de manière à ce que l'agent de cristallisation et/ou l'additif diffuse dans la solution S1 et de telle sorte qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser. b) on augmente la température de la cellule de cristallisation à une température T2 de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser. c) On laisse grossir les germes de cristaux à la température T2 jusqu'à l'obtention d'un premier point d'équilibre El (tel que figurant sur la figure la), où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte étant alors la concentration C2. d) On abaisse la température de la chambre de cristallisation à une température T3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de cristallisation se situent toujours dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser. e) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la température T3 jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 (tel que figurant sur la figure la) où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte étant alors la concentration C3. f) On répète les étapes c) à e) jusqu'à l'obtention de cristaux de la taille souhaitée de la molécule à cristalliser. g) On récupère les cristaux obtenus à l'issue de l'étape f). La figure 1 a représente le mode de réalisation du procédé selon l'invention dans lequel à l'étape a), la molécule à cristalliser se trouve sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la température et de la concentration de la molécule à cristalliser. A l'étape f), on entend par taille souhaitée, une taille de l'ordre de 0,1 mm si les cristaux sont destinés à de la cristallographie aux rayons X, et de l'ordre de 1,0 mm si les cristaux sont destinés à de cristallographie aux neutrons. Les cristaux sont aisément récupérés à l'étape g) du procédé selon l'invention, du fait que la solution de cristallisation S2, ainsi que le réservoir de la cellule de cristallisation sont aisément retirés. Puis, à l'aide d'un scalpel chirurgical, une incision peut être effectuée sur la membrane suivant l'ouverture de la chambre de cristallisation pour la retirer au moyen d'une pince. De cette manière, les perturbations mécaniques de l'échantillon contenant la molécule à cristalliser sont minimisées. Ensuite, les cristaux sont montés directement dans des boucles de tailles appropriées en fibre utilisées conventionnellement en cristallographie. Toute cette procédure peut être effectuée en visualisant la cellule de cristallisation sous un microscope optique que peut comprendre le dispositif de cristallisation selon l'invention. Selon un deuxième mode de réalisation du procédé de 5 cristallisation, la température T de la cellule de cristallisation est maintenue constante et l'on a recours au diagramme de phases de la molécule à cristalliser établi en fonction de la concentration en ladite molécule à cristalliser et de la concentration en agents de cristallisation et/ou d'additifs tel que représenté à la figure 1 b. Plus précisément, le procédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser selon ce deuxième mode de réalisation comprend les étapes suivantes : a) On dispose : - d'une première solution Si de ladite molécule à cristalliser dans la chambre de cristallisation d'une cellule de cristallisation telle que décrite ci-dessus, et ce à une température constante T de la cellule de cristallisation et à une concentration Cl en la molécule à cristalliser, de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et/ou additif ; - d'une deuxième solution S2, dite solution de cristallisation contenant au moins un agent de cristallisation et/ou un additif à la concentration P1 dans le compartiment de la cellule de cristallisation, de manière à ce que l'agent de cristallisation et/ou l'additif 30 diffuse dans la solution Si, de telle sorte qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser. b) On diminue la concentration de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif à une concentration P2, de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone 35 métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser. 10 15 20 25 c) On laisse grossir les germes de cristaux à la concentration P2 de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif jusqu'à l'obtention d'un premier point d'équilibre El (tel que figurant sur la figure 1 b), où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte étant alors la concentration C2. d) On augmente la concentration de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif à une concentration P3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de cristallisation se situent toujours dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser, e) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la concentration P3 de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 (tel que figurant sur la figure 1 b) où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte est concentration C3, f) On répète les étapes c) à e) jusqu'à l'obtention de cristaux de taille souhaitée de la molécule à cristalliser. g) On récupère les cristaux obtenus à l'issue de l'étape f). La figure 1 b représente le mode de réalisation du procédé selon l'invention dans lequel à l'étape a), la molécule à cristalliser se trouve sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et/ou additif. A l'étape f), on entend par taille souhaitée, une taille de l'ordre de 0,1 mm si les cristaux sont destinés à de la cristallographie aux rayons X et de l'ordre de 1,0 mm si les cristaux sont destinés à de cristallographie aux neutrons. Selon un troisième mode de réalisation du procédé de cristallisation, on a recours à un diagramme de phases de la molécule à cristalliser établi en fonction de : - la concentration en ladite molécule à cristalliser, - la concentration en agents de cristallisation et/ou d'additifs, et - la température. Ce diagramme de phases est donc un diagramme en trois dimensions. Ainsi, selon ce troisième mode de réalisation, on peut agir simultanément sur les paramètres de température et de concentration en agents de cristallisation et/ou d'additifs. Les conditions du procédé de cristallisation selon ce troisième mode de réalisation sont les mêmes que celles détaillées pour le premier et le deuxième modes de réalisation dudit procédé, à la différence que l'on agit simultanément sur les deux paramètres précités. Ainsi, à l'étape a) du procédé de cristallisation selon ce troisième mode de réalisation, la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée du diagramme de phases en trois dimensions. Puis, pour contrôler la croissance ordonnée des cristaux, on recherche les conditions permettant de se situer dans la zone métastable de ce diagramme de phases en trois dimensions. De plus, la connaissance du diagramme de phases et le contrôle précis des paramètres de cristallisation tels que la température et la concentration en agent de cristallisation et/ou additifs tels que décrits dans la présente invention permet, au cours du procédé de cristallisation selon l'invention, de diminuer le nombre de cristaux et leurs défauts macroscopiques, ainsi que de sélectionner la nucléation et/ou la croissance de la phase souhaitée. De plus, le procédé de cristallisation selon l'invention présente l'avantage de pouvoir induire les phénomènes physiques suivants : - le mûrissement cinétique, - la transition des phases. Si dans une solution d'une molécule à cristalliser, il y a plusieurs cristaux de la même phase et qu'ils ont été formés à des moments différents, ils ont des tailles différentes. A température constante, un petit cristal a une solubilité plus grande qu'un grand cristal. La conséquence du mûrissement d'Ostwald (phénomène isotherme) réside dans le fait qu'au cours du temps (plusieurs semaines ou mois), les petits cristaux disparaissent au profit de gros cristaux. Si l'on impose des fluctuations contrôlées de température et/ou de concentration en agent de cristallisation et/ou additif, le mûrissement cinétique s'installe et entraîne la disparition plus rapide des cristaux les plus petits. Il en est de même pour les défauts macroscopiques des cristaux tels que les cristaux satellites collés sur des monocristaux. En induisant des fluctuations contrôlées de température et/ou de concentration en agent de cristallisation et/ou additif, ces satellites peuvent être complètement dissous au profit de la croissance de gros monocristaux. Les fluctuations contrôlées de température et/ou de concentration en agent de cristallisation et/ou additif peuvent être aussi à l'origine du phénomène de transition des phases (disparition d'une phase au profit d'une autre phase). Ces phases peuvent être des polymorphes, des solvates, des solides microcristallins d'autres phases et des liquides amorphes. Avantageusement, la molécule à cristalliser est telle que choisie parmi des séquences d'acides nucléiques d'ADN ou d'ARN, de fragments de virus, de protéines, de complexes des protéines, de complexes protéine-ARN, de complexes protéine-ligand, ou encore de polypeptides. A titre d'exemples de protéines cristallisées dans le cadre de l'invention, on peut citer la pyrophosphatase inorganique de levure et l'urate oxydase de Aspergillus flavus qui peut être co-cristallisée en présence de différents inhibiteurs tels que 8-azaxanthine, 9-méthyle acide urique, 8-nitroxanthine, ainsi que son substrat naturel : l'acide urique. Le procédé de cristallisation selon l'invention présente tout son intérêt non seulement dans la recherche fondamentale, mais aussi du fait que les structures tridimensionnelles de macromolécules biologiques, particulièrement celles des protéines sont cruciales pour le développement de nouveaux composés pharmaceutiques. En effet, beaucoup de cibles de médicaments sont des protéines membranaires intégrales qui sont expérimentalement particulièrement exigeantes. Avec de telles cibles difficiles à produire, les méthodes d'automatisation de cristallisation existantes sont souvent inefficaces. Grâce au procédé de cristallisation selon l'invention, il est possible de «façonner» la taille du cristal, sa qualité de diffraction et sa phase cristalline tout en réduisant significativement le temps, l'effort et la quantité de la molécule à cristalliser exigée pour la détermination de sa structure. De plus, le procédé de cristallisation selon l'invention est parfaitement adapté pour la cristallisation de molécules très diversifiées, à savoir aussi bien pour des molécules de poids moléculaire important que pour des molécules de poids moléculaire faible, telles que des composés pharmaceutiques. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description détaillée qui est exposée ci-dessous au regard du dessin annexé. La figure la représente un diagramme de phases d'une molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la température. La figure 1 b représente un diagramme de phases d'une molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et/ou additif. La figure 2 représente une vue schématique en perspective d'une cellule de cristallisation selon l'invention. La figure 3 représente une vue schématique en perspective d'une partie d'un dispositif de cristallisation selon l'invention qui comprend une pluralité de cellules de cristallisation telle que représentée à la figure 2. Sur la figure 2 est représentée une cellule de cristallisation 1 selon l'invention. Cette cellule de cristallisation 1 comprend : - une chambre de cristallisation 2, dans laquelle est ménagée une cavité 3 destinée à recevoir une première solution S1 de la molécule à cristalliser, ladite cavité 3 comporte un fond optique 4 et une ouverture 5 en regard dudit fond optique 4, - une membrane de dialyse 6 destinée à recouvrir l'ouverture 5 de la cavité 3 de la chambre de cristallisation 2, - un réservoir 7 destiné à venir s'emboîter sur la chambre de cristallisation 2, de manière à créer un compartiment 8 étanche formé d'une part par le réservoir 7 et d'autre part par la chambre de cristallisation 2, ledit compartiment 8 étant rempli d'une deuxième solution S2 dite solution de cristallisation. Le compartiment 8 a un volume de plusieurs centaines de fois celui de la chambre de cristallisation 2. La solution S1 contient une protéine à cristalliser, qui est solubilisée dans un tampon. Il s'agit de la pyrophosphatase inorganique de levure. Le tampon est le MES (ou autrement dit le 2-(N-Morpholino)Ethane Sulfonic Acid), à concentration de 30 mM ; ce qui permet de maintenir un pH de la solution de cristallisation à 6. La solution de cristallisation S2 est une solution comprenant 15% de MPD, et 0,5mM de NaH2PO4, 1 mM de MnCl2, et 30mM de tampon MES de pH 6. Si la molécule à cristalliser est de l'urate oxydase, le tampon à utiliser est le Tris (ou autrement dit le trishydroxymethyl aminoethane ou 2-amino-2hydroxyméthyl-1,3-propanediol) à une concentration de 100mM, de manière à avoir un pH 8,5. La solution S2 est une solution comprenant 5% de PEG8000, 100mM de NaCl, et 100 mM de tampon Tris de pH 8,5. La chambre de cristallisation 2 est réalisée en acier inoxydable. Elle peut aussi être en verre ou en quartz. Sur la figure 2, la cavité 3 ménagée dans la chambre de cristallisation 2 a un volume de 5 pL. Dans le cadre de la présente invention, ce 10 volume peut être avantageusement compris entre 5 et 200pL. De manière préférée, la membrane de dialyse 6 est maintenue en place sur la chambre de cristallisation 2 au moyen d'un anneau élastique, non représenté sur la figure 2, qui sert aussi de joint et qui est inséré dans une rainure (non représentée sur la figure 2) que comporte la membrane de dialyse 15 6. La membrane de dialyse 6 de la cellule de cristallisation 1 est une membrane semi-perméable en cuprophane. Ainsi, du fait des caractéristiques énumérées ci-dessus de la membrane de dialyse 6 de la cellule de cristallisation 1, les agents de 20 cristallisation, additifs et tampon détaillés ci-dessus et présents dans la solution de cristallisation S2 peuvent diffuser de manière réversible de part et d'autre de la membrane de dialyse 6 en fonction de leur approvisionnement dans le compartiment 8. La molécule à cristalliser présente dans la solution de cristallisation S1 ne diffuse pas au travers de la membrane de dialyse 6. 25 Par effet d'osmose et d'agitation moléculaire, les agents de cristallisation, les additifs et le tampon de la solution de cristallisation S2 traversent la membrane de dialyse 6, tandis que les molécules cristallisées de la solution de cristallisation S1 sont retenues dans la chambre de cristallisation 2. Il s'établit un équilibre osmotique de part et d'autre de la membrane de dialyse 6 entre les composés présents dans la solution de cristallisation S2 et les composés présents dans la solution S1 qui consistent non seulement en la molécule à cristalliser mais aussi en les agents de cristallisation et additifs précités qui ont diffusé au travers de la membrane de dialyse 6. De plus, la diffusion des composés de la solution de cristallisation S2 au travers la membrane de dialyse 6 permet d'obtenir de manière contrôlée 30 35 des cristaux de la molécule à cristalliser, puisque grâce à cette diffusion contrôlée, les cristaux présents dans la solution S1 peuvent se situer à la frontière entre les zones C et A des diagrammes de phases tels que représentés aux figures la et lb. Ainsi le procédé de cristallisation selon l'invention permet de contrôler à la fois la nucléation spontanée en se situant à la limite supérieure de la zone métastable, et la croissance des cristaux en se situant dans la zone métastable. La membrane de dialyse 6 procure l'avantage à la cellule de cristallisation 1 de pouvoir aisément faire varier et de manière réversible les composés de la solution S1, de par la possibilité de la diffusion de manière réversible des agents de cristallisation, additifs et tampons précités de la solution S2 au travers de ladite membrane de dialyse 6, et ce aisément en retirant ou en faisant varier le contenu de la solution de cristallisation S2 au fur et à mesure du procédé de cristallisation de la molécule à cristalliser, plus précisément sous des conditions optimales de cristallisation (à savoir provoquant la nucléation et/ou la croissance de cristaux) qui sont déterminées à l'aide des diagrammes de phases de la molécule à cristalliser tel que représentés aux figures la et lb. En effet, le réservoir 7 de la cellule de cristallisation 1 est conçu de manière à ce que la concentration de la solution de cristallisation S2 puisse varier dans le compartiment 8, et ce par exemple au moyen d'une pompe péristaltique à multicanaux, non représentée sur la figure 2, qui est reliée au réservoir 7. Ainsi, grâce à la cellule de cristallisation 1, on peut aisément étudier toute combinaison de concentration des composés de la solution de cristallisation S2, de température, de telle que sorte que la quantité de la molécule à cristalliser dans la solution S1 puisse rester constante durant toute la cristallisation. La cellule de cristallisation 1 selon l'invention permet l'exploration de la multitude des conditions de cristallisation avec le même échantillon de molécule à cristalliser. Cela procure l'avantage d'obtenir des cristaux de la taille, de la qualité de diffraction et de la phase cristalline souhaitées, et ce de manière économique (en particulier pour le matériel) et avec un gain de temps considérable comparé aux techniques actuelles. Les cristaux de la solution S1 sont en effet exposés en permanence à des conditions optimales de cristallisation par approvisionnement des composés de la solution de cristallisation S2 au travers la membrane de dialyse 6. Telle que représentée à la figure 2, le fond optique 4 de la cellule de cristallisation 1 est en polycarbonate. Des images de la cristallisation s'effectuant dans ladite cellule de cristallisation 1 peuvent être recueillies avec un moyen d'acquisition d'images (non représenté sur la figure 3) que comprend le dispositif de cristallisation selon l'invention. Une partie du dispositif de cristallisation 9 est représentée de manière schématique sur la figure 3. Dans un mode avantageux de l'invention, le moyen d'acquisition d'images comporte : - un microscope inversé, - un appareil photographique digital, - un ordinateur équipé d'un logiciel permettant le traitement des images acquises par l'appareil photographique. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le moyen d'acquisition d'images comporte une caméra vidéo. D'autres moyens de contrôle de la cristallisation dans la cellule de cristallisation 1 peuvent être envisagés. Il s'agit par exemples de techniques de laser, de mesures de la turbidité, d'interféromètres, de diffraction, d'ultrasonographie, de scintillation, de polarisation, de strioscopie, d'ellipsométrie, de spectrographie Raman, d'holographie. L'évolution de la cristallisation est suivie et l'on peut orienter in situ le choix des paramètres que sont la température et la nature des composés de la solution de cristallisation S2. Le dispositif de cristallisation comprend aussi au moins un moyen de contrôle de la température non représenté sur la figure 3. Ce moyen de contrôle de la température peut être une Cellule à Effet Peltier. Avantageusement et tel que représenté à la figure 3, le dispositif de cristallisation selon l'invention comprend une pluralité de cellules de cristallisation 1. 20 25 30 De manière préférée, le dispositif de cristallisation est semiautomatisé. Pour ce faire, il comporte un carrousel 12 tel que représenté sur la figure 3. Le carrousel 12 comprend un support métallique 13 qui comprend une pluralité de puits 19 conçus de manière à ce qu'une cellule de cristallisation 1 puisse y être disposée dans chacun de ces puits 19. Les puits 19 sont disposés sur deux cercles concentriques de diamètres différents. Le support métallique 13 permet d'assurer un contact thermique entre la cellule de cristallisation 1 et les éléments Peltier (non représentés). Le dispositif de cristallisation comprend un adaptateur pour microscope 10 qui permet d'adapter le dispositif de cristallisation à tout type de microscope. Sur la figure 3 sont aussi représentés : - un moyen de connexion 11 à un dispositif électronique de contrôle de la température non représenté. Un câble électrique (non représenté) peut s'insérer au niveau de ce moyen de connexion 11 de manière à connecter le carrousel 12 à un contrôleur électronique de température. - un emplacement 15 est prévu pour disposer les éléments Peltier (non représentés), - un moteur 14 d'entraînement du carrousel 12, - un moyen de déplacement transversal 16 du carrousel 12 permettant la visualisation de l'ensemble des puits 19, - un moyen de connexion 17 à un circuit d'eau froide (non représenté), - un moyen de connexion 18 à un circuit d'air sec qui permet d'éviter la condensation d'eau sur les parois de la cellule de cristallisation 1 lors de la cristallisation à basse température (typiquement de l'ordre de 5°C). L'évolution de la taille des cristaux est mesurée à l'aide du dispositif d'acquisition d'images, par exemple en prenant des photographies des cristaux environ toutes les 20 à 30 minutes quand la croissance des cristaux débute, puis toutes les 2 à 3 heures, lorsqu'elle est sur le point de s'achever. Les photographies peuvent être analysées à l'aide d'un logiciel d'analyses d'images spécialement adapté. Il est à noter que l'ensemble des étapes du procédé de cristallisation tel que décrit ci-dessus peut s'étaler sur une durée atteignant deux mois, en particulier si l'on souhaite disposer de volumes importants de cristaux de la molécule à cristalliser qui sont nécessaires en cristallographie des protéines aux neutrons. Pour la cristallographie aux rayons X, une durée d'une à deux semaines est suffisante. Aussi, le choix des températures au cours de ces étapes dépend de la nature des molécules à cristalliser et de leur stabilité thermique. A titre d'exemple, la cristallisation des protéines est un processus très délicat qui dépend d'un grand nombre de variables environnementales (par exemple la concentration de la protéine et d'agent de cristallisation, la température, le pH) et des facteurs cinétiques qui sont difficilement contrôlables. A titre d'exemple, dans le cas de l'oxydase d'urate, l'intervalle de températures optimal est compris entre 5°C et 28°C. Au dessus de 28°C (par exemple à 30°C), la protéine ne demeure pas stable suffisamment longtemps et elle commence à se dégrader. REVENDICATIONS1. Cellule de cristallisation (1) d'une molécule à cristalliser comprenant : - une chambre de cristallisation (2) dans laquelle est ménagée une cavité (3) destinée à recevoir une première solution S1 contenant la molécule à cristalliser et ses germes de cristaux, ladite cavité (3) comportant un fond optique (4) et une ouverture (5) en regard dudit fond optique (4), - une membrane de dialyse (6) destinée à recouvrir l'ouverture (5) de ladite cavité (3) de la chambre de cristallisation (2), - un réservoir (7) destiné à venir s'emboîter sur ladite chambre de cristallisation (2) de manière à créer un compartiment (8) étanche formé d'une part par le réservoir (7) et d'autre part par la chambre de cristallisation (2), ledit compartiment (8) étant destiné à être rempli d'une deuxième solution S2 dite solution de cristallisation qui contient au moins un agent de cristallisation et/ou un additif et ledit réservoir (7) étant conçu de manière à ce que la concentration de la solution S2 puisse varier façon contrôlée dans ledit compartiment (8). 2. Cellule de cristallisation (1) d'une molécule à cristalliser selon la revendication 1, caractérisée en ce que la membrane de dialyse (6) est une membrane en cellulose ou une membrane synthétique. 25 3. Cellule de cristallisation (1) d'une molécule à cristalliser selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que le fond optique (4) est en polycarbonate, en quartz ou en verre. 4. Utilisation d'une cellule de cristallisation (1) d'une molécule à cristalliser 30 selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour la cristallisation de séquences d'acides nucléiques d'ADN ou d'ARN, de fragments de virus, de protéines, de complexes de protéines, de complexes protéine-ARN, de complexes protéine-ligand, ou de polypeptides. 35 5. Dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser comprenant : 10 15 20- au moins une cellule de cristallisation (1) d'une molécule à cristalliser selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ; - au moins un moyen d'acquisition d'images, - a u moins un moyen de contrôle et de variation de la température dudit dispositif de cristallisation et/ou au moins un moyen de contrôle et de variation de la concentration en agent de cristallisation et/ou d'additif de la solution S2. 6. Dispositif de cristallisation selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il 10 comprend en outre au moins un moyen de mesure de la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1. 7. Dispositif de cristallisation selon la revendication 5 ou la revendication 6 caractérisé en en ce qu'il comprend en outre au moins un moyen de 15 caractérisation de la molécule à cristalliser en termes de taille/masse et de la distribution des tailles de particules se formant et/ou diffusant dans la solution S1. 8. Dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser selon l'une 20 quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le moyen de contrôle et de variation de la température est une Cellule à Effet Peltier. 9. Dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 caractérisé en ce que le moyen de 25 contrôle et de variation de la concentration en agent de cristallisation et/ou d'additif de la solution de cristallisation S2 consiste en une pompe péristaltique à multicanaux qui est relié au réservoir (7). 10. Dispositif de cristallisation d'une molécule à cristalliser selon l'une 30 quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte une pluralité de cellules de cristallisation (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 qui sont disposées sur un carrousel semi-automatisé. 11. Procédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser caractérisé en ce 35 qu'il comprend les étapes suivantes : a) On dispose :- d'une première solution S1 de ladite molécule à cristalliser dans la chambre de cristallisation (2) d'une cellule de cristallisation (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et ce à une première température Ti et à une concentration Cl de la molécule à cristalliser dans la solution S1, de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la température ; - d'une deuxième solution S2, dite solution de cristallisation, dans le compartiment (8) de la cellule de cristallisation (1), ladite solution de cristallisation S2 contenant au moins un agent de cristallisation et/ou un additif à une concentration P constante, de manière à ce que l'agent de cristallisation et/ou l'additif diffuse dans la solution S1 et de telle sorte qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser. b) on augmente la température de la cellule de cristallisation (1) à une température T2 de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser. c) On laisse grossir les germes de cristaux à la température T2 jusqu'à l'obtention d'un premier point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte étant alors la concentration C2. d) On abaisse la température de la chambre de cristallisation (2) à une température T3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de cristallisation (2) se situent toujours dans la zone métastable du diagramme de phases de la molécule à cristalliser. e) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la température T3 jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte étant alors la concentration C3. f) On répète les étapes c) à e) jusqu'à l'obtention de cristaux de la taille souhaitée de la molécule à cristalliser. g) On récupère les cristaux obtenus à l'issue de l'étape f).35 12. Procédé de cristallisation d'une molécule à cristalliser caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) On dispose : - d'une première solution S1 de ladite molécule à cristalliser dans la chambre de cristallisation (2) d'une cellule de cristallisation (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et ce à une température constante T de la cellule de cristallisation (1) et à une concentration C1, de telle sorte que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone de nucléation spontanée ou sur la limite supérieure de la zone métastable du diagramme de phases de ladite molécule à cristalliser établi en fonction des paramètres de la concentration de la molécule à cristalliser et de la concentration en agent de cristallisation et/ou additif ; - d'une deuxième solution S2, dite solution de cristallisation contenant au moins un agent de cristallisation et/ou un additif à la concentration P1 dans le compartiment (8) de la cellule de cristallisation (1), de manière à ce que l'agent de cristallisation et/ou l'additif diffuse dans la solution S1, de telle sorte qu'apparaissent des germes de la molécule à cristalliser. b) On diminue la concentration de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif à une concentration P2, de telle sorte que la nucléation est arrêtée et que la molécule à cristalliser se trouve dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser. c) On laisse grossir les germes de cristaux à la concentration P2 de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif jusqu'à l'obtention d'un premier point d'équilibre E1, où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte étant alors la concentration C2. d) On augmente la concentration de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif à une concentration P3, de telle sorte que les cristaux présents dans la chambre de cristallisation (2) se situent toujours dans la zone métastable dudit diagramme de phases de la molécule à cristalliser, e) On laisse grossir les germes de cristaux et les cristaux à la concentration P3 de l'agent de cristallisation et/ou de l'additif jusqu'à l'obtention d'un deuxième point d'équilibre E2 où la taille des cristaux demeure constante, la concentration de la molécule à cristalliser dans la solution S1 atteinte est concentration C3,f) On répète les étapes c) à e) jusqu'à l'obtention de cristaux de taille souhaitée de la molécule à cristalliser. g) On récupère les cristaux obtenus à l'issue de l'étape f).