Brevet FR2966733A1 — publié le 20120504

La voie de signalisation Hedgehog (Hh) joue un rôle important dans la croissance et la structuration au cours du développement embryonnaire. La voie de signalisation Hh chez les mammifères met en jeu de nombreux effecteurs dont au moins les protéines de la famille Hh codées par trois gènes distincts Shh (Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) et Desert Hedgehog (Dhh), les protéines responsables de la sécrétion et du transport des protéines Hh, dont Dispatched (Disp), Shifted, qui agit à longue distance et est requise pour l'accumulation des protéines Hh, - les protéines réceptrices du signal Hh : Patched (Ptc), Hedgehog interacting protein (Hip) ; - Smoothened (Smo) responsable de la transmission du signal Hh à l'intérieur de la cellule réceptrice. Il est généralement admis dans l'art antérieur que Smo est constitutivement inhibée par Ptc en l'absence de protéines Hh et que la liaison du ligand Hh sur son récepteur Ptc engendre l'activation de Smo qui à son tour va activer les facteurs de transcription à doigts de zinc les facteurs Gli. Les troubles de la voie de signalisation Hh induisent chez l'homme des malformations congénitales et des troubles tels que le syndrome de Gorlin et l'holoprosencéphalie Par exemple une expression ectopique de Sonic Hedgehog (Shh), l'un des orthologues de Hh chez les mammifères, induite expérimentalement dans la partie antérieure du bourgeon de membre engendre une polydactylie préaxiale. Ce qui est confirmé par le fait que dans la plupart des modèles murins génétiques de polydactylie préaxiale (tels que extra toes (Xt), sasquatch (Ssq)), une expression ectopique de Shh est observée dans la partie antérieure du bourgeon de membre. Ainsi, des mutations affectant la voie Shh en la stimulant seraient impliquées dans de nombreux cas de polydactylie préaxiale humaine. De même les individus porteurs d'un allèle défectueux du gène PTCH1, conduisant à une réduction d'activité de la protéine correspondante, présentent un ensemble de défauts morphologiques, notamment au niveau des doigts, du 5 10 15 20 25 30 faciès, des dents, des côtes, englobés sous le nom de syndrome de Gorlin. L'holoprosencéphalie, un défaut de développement de la ligne médiane caractérisé par la séparation incomplète du cerveau antérieur ventral en deux hémisphères cérébraux ainsi que par des anomalies crânio-faciales telles qu'une incisive médiane unique, une fente des lèvres ou du palais, une structure nasale ressemblant à un proboscis ou une cyclopie, serait la conséquence d'un défaut de la voie de signalisation Hh au niveau de la ligne médiane, qui dans la plupart des cas seraient liées à des mutations non-sens, faux-sens, des délétions et des insertions dans le gène. Chez les adultes, des études récentes suggèrent un rôle de la voie de signalisation Hh dans l'auto-renouvellement des cellules souches et la mobilisation des cellules souches endogènes pour la réparation et la régénération après une lésion et-/ou maladie du système nerveux. II a également été montré que les mutations qui augmentent l'activité globale de la voie Hh sont impliquées dans le développement des tumeurs survenant dans de nombreux tissus comme le poumon, l'cesophage, l'estomac, le pancréas, les voies biliaires, le sein, la prostate et le cerveau. Nombre de ces tumeurs ont été décrites comme contenant des cellules souches cancéreuses qui présentent une activation de la voie Hh aberrante tout en ayant conservé les propriétés d'auto-renouvellement, représentant ainsi un réservoir infini pour le maintien de la masse tumorale. La protéine Patched est une protéine membranaire qui traverse 12 fois la membrane et interagit avec la protéine Hh au niveau des deux larges boucles extracellulaires. Les homologies de sa séquence avec celles des transporteurs bactériens de la famille RND (résistance, nodulation, division) suggèrent que cette protéine pourrait avoir une fonction de transporteur. De plus, Patched possède un domaine sensible au stérol, et des travaux récents montrent que certains oxystérols dérivés du cholestérol activent la voie Hh. Cependant à la connaissance de la demanderesse, le rôle de transporteur de la protéine Patched n'a jamais été démontré. 10 15 20 25 30 En effet, de manière surprenante et après de long travaux, la Demanderesse a pu montrer par plusieurs approches sur différents modèles cellulaires (voir les exemples), qu'une augmentation de la concentration en cholestérol intracellulaire peut activer le récepteur Smoothened et la voie Hedgehog, et d'autre part, que la protéine humaine Patched, connue comme répresseur de la voie de signalisation Hh et comme récepteur de la protéine Hedgehog, interagit avec le cholestérol et permet l'efflux de cholestérol. Par efflux de cholestérol, on entend ici que sous l'influence de la protéine Patched, le cholestérol intracellulaire est transporté à l'extérieur de la cellule. En l'absence de la protéine Hh, la protéine membranaire Patched est présente au niveau de la membrane plasmique des cellules, la concentration intracellulaire en cholestérol diminue avec l'augmentation de l'efflux de cholestérol induit par Patched, et la voie Hh est réprimée par inhibition du récepteur membranaire Smoothened responsable de la transmission du signal. Une diminution de la concentration intracellulaire en cholestérol conduirait donc à une inhibition de la voie Hh par inhibition du récepteur membranaire Smoothened. A l'inverse, quand la protéine Hh est sécrétée dans le milieu extracellulaire, elle interagit avec Patched, le complexe Patched/Hh est alors internalisé et dégradé. La disparition de la protéine Patched au niveau de la membrane plasmique a pour conséquence l'arrêt de l'efflux de cholestérol et donc l'augmentation de la concentration du cholestérol intracellulaire, ce qui entraîne la levée de l'inhibition du récepteur Smoothened et donc la transmission du signal aux facteurs de transcription et au noyau. Une augmentation de la concentration intracellulaire en cholestérol conduirait donc à une stimulation de la voie Hh par activation du récepteur membranaire Smoothened. Ainsi les différents résultats obtenus par la demanderesse conduisent à proposer que la protéine Patched serait un transporteur transmembranaire et serait impliquée dans l'efflux de cholestérol, et/ou de ses dérivés oxystérols. Ainsi une régulation de l'activité de la protéine Patched permettrait de réguler la concentration intracellulaire de cholestérol, activateur du récepteur Smoothened et donc de réguler la voie Hh. 10 15 20 25 30 La découverte de cette nouvelle activité de la protéine Patched permet d'envisager de nouvelles voies de traitement des maladies liées aux troubles de la voie de signalisation Hh, comme par exemple l'apparition des malformations congénitales (l'inhibition des voies Hh activées de manière inappropriée pourrait permettre la prévention des polydactylies préaxiales humaines), du syndrome de Gorlin (la stimulation de l'activité de la protéine Patched pourrait permettre la prévention des défauts morphologiques, notamment au niveau des doigts, du faciès, des dents, des côtes, englobés sous le nom de syndrome de Gorlin), ou encore l'holoprosencéphalie (HPE). Cela permet également d'envisager de nouveaux traitements des lésions et /ou maladies du système nerveux par la stimulation de l'auto-renouvellement des cellules souches et/ou de la mobilisation des cellules souches endogènes pour améliorer la réparation et la régénération des tissus nerveux lésés. Cela permet aussi d'envisager de nouvelles stratégies dans le traitement des cancers liés à une suractivation de la voie de signalisation Hh par diminution voire inhibition de l'activité globale de la voie Hh afin d'inhiber le développement des tumeurs, particulièrement au niveau du poumon, de l'cesophage, de l'estomac, du pancréas, des voies biliaires, du sein, de la prostate et du cerveau. Ainsi l'invention a pour objet premier une méthode in vitro de régulation de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour réguler la concentration intracellulaire en cholestérol. Par modulateur on entend ici aussi bien un activateur qu'un inhibiteur. Ainsi selon une variante de l'invention la méthode est une méthode in vitro d'activation de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un activateur de l'activité de la protéine Patched pour diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol. Et selon une autre variante de l'invention la méthode est une méthode in vitro d'inhibition de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) caractérisée en ce que l'on met en contact des cellules et un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol. 10 15 20 25 30 Mais des applications thérapeutiques sont également envisageables. Ainsi l'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la concentration intracellulaire en cholestérol. Selon une variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol. Et selon une autre variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la concentration intracellulaire en cholestérol pour moduler la croissance et la structuration au cours du développement embryonnaire. Selon une variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour prévenir la polydactylie préaxiale, particulièrement chez l'humain. Et selon une autre variante, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol pour prévenir les défauts morphologiques, notamment au niveau des doigts, du faciès, des dents, des côtes, englobés sous le nom de syndrome de Gorlin. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour prévenir l'holoprosencéphalie. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol pour stimuler la réparation et/ou la régénération des cellules du système nerveux après une lésion et-/ou une maladie dudit système nerveux. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un activateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour inhiber le développement des tumeurs survenant dans de nombreux tissus, avantageusement dans le poumon, l'oesophage, l'estomac, le pancréas, les voies biliaires, le sein, la prostate et le cerveau et donc réduire la masse tumorale. Selon l'invention le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched est avantageusement présent dans le médicament à des doses physiologiquement efficaces. Selon l'invention ledit médicament peut être formulé pour la voie digestive ou 10 parentérale. Les médicaments selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, qu'il soit actif sur la même pathologie ou sur une pathologie différente, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet 15 atteint de l'une des pathologies précédemment citées. Selon l'invention, le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched peut être utilisé dans le médicament, en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est à dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques. 20 On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. 25 Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc. De façon préférentielle, on utilise des huiles végétales. 30 Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-cérébrale, intra-thécale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. L'administration par voie orale est préférée. L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain. En général la dose journalière du composé sera la dose minimale pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus, prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec le modulateur (activateur ou inhibiteur) de l'activité de la protéine Patched, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples de réalisation de l'invention qui suivent ainsi qu'à l'observation des figures parmi lesquelles La figure 1 représente la quantification du cholestérol par chromatographie en phase gazeuse en présence ^ ou en l'absence ^ de protéine Shh dans des cellules NIH3T3 ou HT29 : 1A : dans la cellule 1B dans le milieu extracellulaire. La figure 2 représente les résultats de l'étude de la stabilisation de Smo par le cholestérol. La figure représente un western blot anti-Smo réalisé sur des extraits de membrane préparés à partir de cellules NIH3T3. Control : cellules non traitées par Shh 10 15 20 25 30 Shh : cellules traitées pendant 6 h avec 30nM de Shh Purm : cellules traitées pendant 6 h avec 10pM de purmorphamine Chol : cellules traitées pendant 3 h avec 2,5pM de cholestérol Shh + lova : cellules traitées pendant 6 h avec 30nM de Shh et 10 pg/ml d'un inhibiteur de la synthèse du cholestérol la lovastatine La figure 3 représente les résultats des expériences conduites pour déterminer le lien existant entre la protéine Patched et le cholestérol et pour savoir si Patched a la capacité de transporter le cholestérol. 3A : Western-blot sur des extraits membranaires de levures S. Cerevisiae exprimant (2) ou non (1) la protéine Patched humaine. 3 B : Fixation du cholestérol à la protéine Patched humaine : Du thiocholestérol a été couplé sur une des cellules d'écoulement d'une puce BlAcore et l'interaction de la protéine Patched purifiée avec le cholestérol de la cellule d'écoulement est mesuré. Des concentrations croissantes de Shh pure (1,5, 7,5, 15 nM) ont été incubées avec la protéine Patched humaine purifiée avant l'injection sur les cellules d'écoulement activée ou non. Le % d'inhibition de la fixation du cholestérol est porté en fonction de la concentration en Shh (nM) (courbe exponentielle obtenue avec le Softway Origine avec un R2 compris entre 0,99 et 0,97 et un Ki entre 0,83 et 1 pour les différentes expériences réalisées). Sensorgramme résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle, obtenu après injection de 50 pl de protéine Patched humaine pure ; ^ ^ ^ ^ Sensorgramme résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle, obtenu après injection de 50 pl de protéine Patched humaine pure incubée avec 50 pl de protéine Shh pure ; ---- Sensorgramme résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle, obtenu après injection de 50 pl de protéine Shh pure. 10 15 20 25 30 3C : mesure de l'efflux de Bodipy-cholestérol : Des levures contrôle ou exprimant la protéine Patched humaine ont été cultivées jusqu'à une densité optique de 7, puis centrifugée et concentrée à une densité optique de 10 par resuspension dans un tampon à pH 7 avant une incubation de 2 h avec 2,5 pM de Bodipy-Cholestérol (Bo-Chol). Après dilution et de centrifugation, les cellules ont été resuspendues dans du tampon. Après 20 min, les levures ont été centrifugées et la fluorescence Bodipy du surnageant a été mesurée. La figure 4 représente les résultats des expériences conduites afin de déterminer si la protéine Patched endogène des fibroblastes de souris NIH3T3 favorise ou non l'efflux de cholestérol. A. Des cellules NIH3T3 ont été cultivées jusqu'à confluence dans des boites de 24 puits, incubées pendant 2 heures avec 2,5pM de Bo-Chol, puis lavées avec du PBS. Puis 250 pL de tampon à pH 7.4 contenant (^) ou non (D) 30 nM de pure Shh sont ajoutés aux puits et la fluorescence Bodipy est mesurée sur 200pL de surnageant après une l heure d'incubation (Figure 4A). B. Des cellules NIH 3T3 ont été cultivées sur une lamelle et incubées 30 min avec 2,5 uM Bo-Chol. Après lavage, du tampon contenant ou non 30 nM de Shh a été ajouté dans les puits pendant 3 heures. Puis les cellules ont été fixées aux lamelles avec une solution de paraformaldéhide (PFA) à 4% et observées au microscope DeltaVision (ex = 450-490 nm, em = 500-550 nm, obj x 40). La figure 5 représente les résultats des expériences conduites afin de localiser la protéine Patched et le Bo-Chol dans les cellules en présence ou non de la protéine Shh. Des cellules NIH3T3 ont été incubées 30 min avec 2,5 pM de Bo-Chol, puis lavées. Elles ont ensuite été incubées pendant 3 heures avec ou sans 30 nM de Shh. Les cellules ont alors été lavées, fixées, perméabilisées et incubées avec un anticorps anti-Patched couplé à la rhodamine. La fluorescence de Bodipy (A) et de la rhodamine (B) ont été alors analysés par microscopie confocale à disque rotatif. La fusion entre les images obtenues avec Bodipy et avec la rhodamine est présentée dans la colonne (C). 10 15 20 25 30 Exemples Matériels et méthodes Analyse par chromatographie en phase gazeuse du cholestérol et des oxystérols. Les lipides totaux des cellules ou des milieux de culture ont été extraits selon une méthode dérivée de celle de Folch et col. (J. Biol. Chem. 1957 ; 226: 497-509) telle que modifiée par Grandgirard et col. J. Chromatogr. A. 2004 ; 1040: 239-50). Les lipides ont été saponifiés pendant 16 heures, à température ambiante, sous atmosphère d'argon, dans l'obscurité, avec 1M d'hydroxyde de potassium méthanolique. La fraction non saponifiée a été extraite avec l'ester méthylique de tertbutyle. Ensuite, un aliquot de cette fraction a été transformé en triméthylsilyléthers et injecté dans un appareil de chromatographie en phase gazeuse pour quantifier le cholestérol. Les oxystérols ont été purifiés sur cartouches de silice (LC-Si SPE 3 ml; Supelco, Sigma Aldrich, L'Isle d'Abeau Chesnes, France) selon la méthode de Lai et col. (Journal of Agriculture and Food Chemistry 1995; 43 : 1122-1126) modifié comme suit : le cholestérol et les autres contaminants ont été éliminées à l'aide de 35ml d'un mélange Hexane - ester méthylique de tert-butyle (90:10, v / v) et de 15 ml d'un mélange Hexane - ester méthylique de tert-butyle (80:20, v / v). Les oxystérols ont ensuite été récupérées à l'aide de 5ml d'acétone. Après l'évaporation de l'acétone, les échantillons ont été transformés en dérivés de triméthylsilyle avec de la pyridine et un mélange de N,O,bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide-trimethyl chlorosilane (99:1, v / v) à 60°C pendant 30 min. Les composants volatiles ont été évaporés sous azote et le résidu obtenu est dissous dans de l'hexane et analysés par chromatographie en phase gazeuse comme suit. Le cholestérol et les oxystérols ont été analysés en utilisant un chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard 5890 Série II (Agitent, Massy-Palaiseau, France) équipé d'un détecteur à ionisation de flamme à 300°C. Ils ont été quantifiés à l'aide de 5a-cholestane comme standard interne. La colonne utilisée était une "DB5-MS fused silica capillary 10 15 20 25 30 column" (épaisseur de film : 0,25 pm, 30 m x 0,25 mm de diamètre) (J & W Scientific, Folsom, CA, USA). Le gaz porteur était l'hélium. Après 1 min à 50°C, la température du four a été porté à 275°C à raison de 20°C / min, puis à raison de 1 °C / min jusqu'à atteindre 290°C. Les données de chromatographie ont été traitées en utilisant le logiciel Galaxie (Varian, Les Ulis, France). Culture cellulaire et préparation de membranes La lignée cellulaire de fibroblastes de souris NIH 3T3 a été maintenue dans un milieu de culture DMEM (Invitrogen, USA) complété avec 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine à 37°C en atmosphère à 5% CO2 saturée en eau. Les cellules ont été cultivées en monocouche à confluence 90-100% et soumises à pas plus de 20 passages cellulaires avec repiquage tous les 4/5 jours. Pour les expériences de quantification des protéines exprimées par les membranes, les cellules NIH-3T3 ont été cultivées en boîtes de Pétri de 100 mm Lorsque les cultures sont parvenues au stade de monocouches subconfluentes les boîtes de Pétri ont été mises sur la glace et toutes les étapes subséquentes pour préparer des extraits de membrane ont été réalisées à 4 °C. Les monocouches cellulaires sont rincées deux fois avec du PBS froid puis rapidement rincés à l'eau froide. Les cellules sont ensuite incubées avec 1 ml de tampon Tris 100 mM hypotonique contenant 1 mM EDTA et un cocktail d'inhibiteurs de phosphatase (Complete, Roche) pendant 5min avant d'être récoltées dans un microtube 1,5 ml et brisées par passages successifs à travers une aiguille 4 / 10. Après 10 minutes de centrifugation à 5000g afin de culoter les noyaux, le surnageant est centrifugé à 18 000g pendant 1 h et le culot de membranes obtenu a été resuspendu dans 80-100 pL de tampon hypotonique (HB) contenant un cocktail d'inhibiteurs de phosphatase et conservé à -80 °C jusqu'à ce que les études de caractérisation des protéines par western blot soient réalisées. Le contenu en protéines des culots a été quantifié par la méthode de 10 15 20 25 30 Bradford (kit Bio-Rad). Culture de levures et la préparation des membranes La souche K699 de S. cerevisiae (Mata, ura3, et leu 2-3) a été transformée avec le plasmide YEpPMAhPtc-MAP (Joubert et col.. 2009, BBA Biomembrane, 1788: 1813-1821; 2010, Methods in Molecular Biology, Humana 1 Press, Mus-Veteau (Ed.), 601: 87-103 ) par la procédure de l'acétate de lithium et étalées dans des boites de culture contenant un milieu minimal et un mélange d'acides aminés sans leucine. Les clones ont été pré-cultivés à 30°C jusqu'à une densité optique à 600 nm (DO600) de 3 sur un milieu minimum (MM) (0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, 0,3 mM adénine, 0,5 mM uracile, 0,3 mM tyrosine et d'un mélange d'acides aminés dépourvu de leucine) additionné de 2% de D-glucose. Cette préculture est ensuite diluée à une D0600 de 0,1-0,2 dans un milieu complet (e)drait de levure, bactopeptone, adénine) à 2% de D-glucose et cultivée à 18°C sous agitation à 200 tr / min jusqu'à une DO600 de 5-7. Pour la préparation des membranes, toutes les mesures ont été effectuées à 4°C. Les levures ont été lavées à l'eau froide, remises en suspension dans 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1 mM PMSF et 4 mM benzamidine, et brisé deux fois par agitation au vortex pendant 15 min en présence de perles de verre (425 à 600 pm, Sigma). Les levures non cassées et les perles de verre ont été éliminées par centrifugation pendant 5 min à 2000 g. Les membranes ont été collectées par centrifugation du surnageant obtenu pendant 1 h à 100 000 g. Le culot a été lavé deux fois dans le même tampon sans EDTA et remis en suspension â 5 mg / ml dans un tampon de solubilisation contenant 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 10% de glycérol, 1 mM PMSF et 4 mM benzamidine. Electrophorèse sur gel et western blot Les protéines contenues dans les échantillons ont été séparées par électrophorèse sur gel SDS/polyacrylamide 8% (8% SDS-PAGE) et transférées 10 15 20 25 30 sur membrane de nitrocellulose (Amersham) en utilisant des techniques standards. Les membranes de nitrocellulose ont d'abord été bloquées 1 h à température ambiante dans un tampon de blocage (20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 450 mM NaCl, 0,1% Tween-20, 4% de lait écrémé), puis mises en contact pendant la nuit à 4°C avec soit un anticorps monoclonal de souris anti-HA (obtenu au laboratoire à partir d'hybridomes, dilution 1:20 (Joubert et col. 2009)), soit des anticorps polyclonaux de lapin anti-PTC (dilution 1:1000) et anti-Smo (dilution 1:3000) (Joubert et col. 2009). Les membranes de nitrocellulose ont ensuite été lavées deux fois dans le tampon de blocage. Des anticorps secondaires polyclonaux de chèvre, antisouris (dilution 1:5000) ou anti-lapin (dilution 1:3000) couplés à la peroxydase de raifort (Dako) ont ensuite été appliqués pendant 2 h à 4°C. La révélation des réactions a été réalisée en utilisant le kit ECL (Millipore), et un système de détection de chimioluminescence pour le Western blot Fusion FX7® (Vilber-Lourmat). Le Bodipy-cholestérol provient de la société Avanti (Topfluor, Avanti). Les aliquots à 5 mM de BodCH dans le DMSO ont été stockés congelés. Mesure de l'efflux du BodCH - NIH3T3 : pour les expériences d'efflux de BodCH, des cellules NIH 3T3 ont été ensemencées sur dans les puits de plaques 24 puits à raison de 250pL/puits de Bo-chol à 2,5pM (société Avanti (Topfluor, Avanti), aliquoté à 5 mM dans le DMSO stockés congelés) en milieu de culture pendant 2 heures à 37°C. Après double rinçage avec 500pL de tampon NaCI (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4) pour éliminer les molécules fluorescentes non fixées, les efflux ont été initiés par l'addition de 250pL de tampon en l'absence ou en présence de 30 nM de Shh. Les cellules ont été incubées pendant l h à 37°C sous agitation à 50 tr / min et les surnageants prélevés. Après une centrifugation (5mn à 6800g) pour éliminer tout fragment de cellule, la lecture de la fluorescence (exc 490-10nm ; em 520-20nm) a été 10 15 20 25 30 réalisée sur 200 pL de surnageant dans un lecteur de plaque (FLUOstar, Labtech). A la fin des expériences, le Bo-Chol restant dans les cellules a été déterminé en comptant le reste de fluorescence dans les cellules après solubilisation avec du SDS 0,5%. - Levure : des levures exprimant hPtc ont été pré-cultivées à 30°C jusqu'à une D0600 de 3 sur un milieu minimal (0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, 0,3 mM adénine, 0,5 mM uracile, 0,3 mM tyrosine et d'un mélange d'acides aminés dépourvu de leucine) additionné de 2 % de D-glucose. Cette préculture est ensuite diluée à D0600 de 0,2 dans un milieu complet (extrait de levure, bactopeptone, adénine), 2% de D-glucose (ou 2% de galactose pour les vecteurs YEpGAL) et cultivées à 18°C sous agitation (200 tr/min) jusqu'à une D0600 de 3-6. Simultanément la souche K699 de Saccharomyces cerevisiae (Mata, ura3, et leu 2-3) a été cultivée en milieu complet pour effectuer des mesures de contrôle d'efflux dans les mêmes conditions. Pour les mesures d'efflux, les cellules de deux cultures en croissance exponentielle (DO600 : 3-6) de K699 et de clones exprimant PTC ont été simultanément recueillies par centrifugations (5mn, 3000g), lavées 4 fois à l'eau et finalement remises en suspension avec soin à une D0600 de 10 dans du tampon 50 mM NaOH-Hepes (pH 7,0). pm de Bo-Chol ont ensuite été ajoutés aux cellules pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Les cellules sont ensuite lavées rapidement et 1,6 mL de suspensions de levures à D0600 de 10 ont ensuite été incubés à température ambiante pendant 20min en microtubes Eppendorf de 2 mL sous agitation. Les mesures d'efflux de Bo-Chol ont été réalisées en triple sur 250pL de suspension de levure. Après centrifugation (10 000g, 3mn), la lecture de la fluorescence (exc 490-10nm ; em 520-20nm) a été réalisée sur 200 pL de surnageant dans un lecteur de plaque (FLUOstar, Labtech). À la fin de l'expérience, la fluorescence restant dans la levure a été déterminée après une exposition à un tampon 0,5% SDS, 50 mM NaOH-Hepes (pH 7,0). 5 15 20 25 30 Purification de hPtc et hSmo hPtc a été produit dans la levure S. cerevisiae et purifiée comme décrit par Joubert et col. en 2009. Après la solubilisation des préparations de membranes de levures avec 1% de dodécyl-R-D-maltoside, la purification des protéines a été réalisée par le biais d'une résine Sepharose calmoduline.. Résonance plasmonique de surface (SPR) Les mesures de SPR ont été réalisées sur un Biacore 3000 (Biacore / GE Healthcare Uppsala, Suède) avec une puce CM5 Biacore / GE Healthcare. Une solution mère de thiocholesterol dans le DMSO (1 mg / mL) a été préparée et diluée 1:50 dans du tampon borate de sodium pH 8,5 pour le couplage covalent des thiols sur la puce d'un capteur CM5. La cellule de mesure 2 (Fc2) a été activée avec 200 mM de N-éthyl-N-(3-diméthylaminopropyl) - carbodiimide (EDC) et 50 mM de N-hydroxysuccinimide (NHS), et 100 pL (50 pg) de thiocholesterol ont été injectés à 10 pL/min. Le couplage a été complété par injection de cystéine. La surface a été désactivée avec de l'éthanolamine. La cellule de mesure 1 (FC1) a été activée et désactivée, et utilisée comme une cellule d'écoulement de référence. Les surfaces sont ensuite lavées avec trois injections de 50 mM NaOH (15 pL à 5 pL/min). Les expériences sur hPtc purifiée ont été effectuées à 10°C. Le tampon de purification de hPtc a été utilisé comme tampon de course au cours des expériences. 50 pL de hPtc purifiée ont été injectés à la fois sur la référence (FC1) et la cellule d'écoulement couplée au Thiocholesterol (FC2) à un débit de 10 pL/min. La différence entre les sensorgrammes enregistrés sur FC2 et FC1 a été mesurée. La surface du capteur à puce a été régénérée deux fois avec 20 pL de NaOH 50 mM, SDS 0,05% à 20 pL/min. Les expériences sur hSmo purifiée ont été effectuées à 10°C. Les différences entre les sensorgrammes enregistrées sur chaque cellule d'écoulement couplé au Thiocholesterol et sur Fc1 ont été signalées et analysés en utilisant un logiciel BiaEva. Quantification des protéines 10 15 20 25 30 Les protéines ont été quantifiées à l'aide du kit de dosage de protéines Bio-Rad. Exemple 1 : Un traitement par la protéine Sonic Hedgehog augmente la concentration intracellulaire en cholestérol. Afin de savoir si l'activation induite par la voie Hh entraîne une modification dans le contenu des stérols cellulaires et afin d'identifier les stérols touchés, une analyse du contenu en stérols de deux lignées cellulaires Shh sensibles, des fibroblastes de souris NIH3T3 et des cellules de la lignée cellulaire humaine d'adénocarcinome du côlon grade II HT29, cultivées en présence et en l'absence de Shh pure dans le milieu de culture, a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse (GC) et par spectrométrie de masse. La quantification du cholestérol contenu dans les milieux extracellulaires et dans les extraits cellulaires totaux a montré que le traitement par Shh conduit à une augmentation significative du cholestérol intracellulaire (Fig. 1A) et à une diminution de la quantité de cholestérol dans le milieu extracellulaire (Fig. 1B) pour les deux lignées cellulaires. Ces résultats indiquent que le traitement Shh a modifié les concentrations en cholestérol intra- et extra-cellulaire de ces deux lignées cellulaires. L'augmentation de 15 à 18% de la quantité de cholestérol intracellulaire induite par le traitement Shh est surprenante puisque la concentration de cholestérol cellulaire est bien connue pour être étroitement contrôlée (Brown MS et Golstein JL, J. of Lip. Res. 2009). Exemple 2 : Des variations de concentration en cholestérol affectent la stabilisation de Smoothened à la membrane plasmique. Afin de savoir si la variation de la concentration en cholestérol a un effet sur la voie Hh et à quel niveau, l'effet du traitement de fibroblastes NIH3T3 avec du cholestérol ou de la lovastatine, un inhibiteur de la biosynthèse du cholestérol, a été analysé. De la protéine Shh pure, de la purmorphamine agoniste de Smo, du cholestérol et un mélange Shh/lovastatine ont été ajoutés dans les cultures cellulaires six heures avant la récolte et la préparation des membranes. La quantité de Smo endogène stabilisé au niveau de la membrane plasmique des cellules est augmentée en présence de cholestérol dans le milieu de culture 10 15 20 25 30 comme lorsque les cellules ont été traitées avec de la protéine Shh pure ou de la purmorphamine (Fig. 2). A l'inverse, le traitement à la lovastatine inhibe fortement la stabilisation de Smo à la surface cellulaire normalement induite par la présence de la protéine Shh dans le milieu. La stabilisation de Smo au niveau de la membrane plasmique des cellules est une étape critique de l'activation de la voie Hh chez la drosophile et chez les mammifères. Ce résultat suggère que le cholestérol est nécessaire à la stabilisation de Smo au niveau de la membrane plasmique des cellules et par conséquent nécessaire pour l'activation de la voie Hh. Exemple 3 : La protéine Patched humaine exprimée dans la levure fixe le cholestérol et favorise son efflux Afin de déterminer le lien existant entre la protéine Patched et le cholestérol et de savoir si Patched a la capacité de transporter le cholestérol, un modèle fonctionnel d'expression de la protéine Patched humaine (hPtc) dans la levure Saccharomyces cerevisiae a été mis au point. II a permis de montrer que la purification de la protéine issue de cette expression est possible et que hPtc est capable de se lier à la protéine Shh (son ligand naturel) aussi bien dans les membranes de levure que dans une solution de tensioactif après purification (Joubert et col. 2009). La capacité de la protéine hPtc à se lier au cholestérol a d'abord été étudiée par résonance plasmonique de surface (SPR). Des levures exprimant hPtc ont été cultivées. La fraction membranaire a été préparée (Fig. 3A) et la protéine hPtc purifiée. La protéine hPtc purifiée a été injectée sur une puce de capteur Biacore dont une cellule d'écoulement a été couplée de façon covalente à du thiocholestérol et l'autre juste activée sans thiocholestérol pour l'étude de la fixation non-spécifique (contrôle). Le sensorgramme enregistré (résultant de la différence entre la fixation à la cellule d'écoulement couplée au thiocholestérol et le contrôle) montre une liaison claire de hPtc au cholestérol (Fig. 3B). Puis de la protéine hPTC pure a été incubée avec de la protéine Shh pure et le mélange a été injecté sur les cellules d'écoulement. Une diminution de fixation de la protéine hPtc au cholestérol est observée. La liaison de la protéine hPtc au cholestérol diminue avec la concentration 10 15 20 25 30 en protéine Shh. Une constante d'inhibition (Ki) de 0,83 + / - 0,2 nM a pu être calculée (Fig. 3B), correspondant à l'affinité de la protéine Shh pour la protéine hPtc (Joubert et col. 2009). Ces résultats montrent que la protéine Patched se lie directement au cholestérol et que l'interaction de la protéine Shh avec la protéine hPtc perturbe cette liaison à travers un changement de conformation ou l'obstruction du site de liaison du cholestérol. La capacité de transport du cholestérol par la protéine hPtc a ensuite été étudiée. Des levures de contrôle et des levures exprimant hPtc ont été incubées avec un dérivé fluorescent de cholestérol, le BOPIDY-cholestérol (Bo-Chol). La mesure de la fluorescence de Bo-Chol dans le milieu après lavage des cellules et la remise en suspension ont montré que la présence de la protéine hPtc augmente considérablement l'efflux de Bo-Chol de la levure (Fig. 3C). Ces résultats montrent que la protéine Patched humaine, exprimée dans S. cerevisiae est capable de se lier au cholestérol et de favoriser son efflux de la cellule. Exemple 4 : La Protéine Patched endogène favorise l'efflux de cholestérol dans des fibroblastes de souris Afin de vérifier si la protéine Patched possède la même fonction dans le système endogène, des fibroblastes de souris NIH3T3 ont été cultivées dans des plaques 24 puits à confluence, puis incubés deux heures avec du Bo-Chol et lavés. Du tampon PBS contenant ou non de la protéine Shh pure a été ajouté et la fluorescence du surnageant de chaque puits a été mesurée une heure après. Les quantités de Bo-Chol étaient significativement plus faibles dans les puits contenant la protéine Shh (Fig. 4A), suggérant que le traitement par la protéine Shh réduit l'efflux du Bo-Chol. Des cellules cultivées sur des lamelles ont été incubées avec du Bo-Chol, lavées, suspendues une heure dans du tampon PBS contenant ou non de la protéine Shh, fixées et observées par microscopie à fluorescence en utilisant le système DeltaVision (figure 4B). La quantification de la fluorescence BODIPY contenues dans les cellules a montré que les cellules en suspension dans un tampon contenant une protéine Shh représentent 58% de la fluorescence contenue dans les cellules en suspension dans un tampon contenant une 10 15 20 25 30 protéine Shh. Ces résultats montrent que Shh modifie la quantité de Bo-Chol dans les cellules et dans le milieu extracellulaire, de manière concomitante. Ces résultats sont compatibles avec une fonction d'efflux de cholestérol pour la protéine Patched dans des fibroblastes de souris : - en l'absence de la protéine Shh, Patched est au niveau de la membrane plasmique et favorise l'efflux de Bo-Chol ; - en présence de Shh, Patched est internalisée dans les endosomes et ne favorise pas l'efflux de Bo-Chol, expliquant ainsi que la quantité de Bo-Chol a diminué dans le milieu extracellulaire et augmenté dans le milieu intracellulaire. Ceci est en accord parfait avec les variations des concentrations de cholestérol mesurées par chromatographie en phase gazeuse sur des fibroblastes de souris et des cellules d'adénocarcinome du côlon (Fig. 1). Exemple 4 : La protéine Patched et le Bo-Chol sont co-localisés au niveau de la membrane plasmique des cellules en l'absence de Shh Des fibroblastes de souris NIH3T3 ont été cultivés sur des lamelles, incubés avec du Bo-Chol, puis avec un milieu contenant (+) ou non (-) de la protéine Shh. Après trois heures, les cellules ont été fixées, perméabilisées, incubées avec un anticorps anti-Patched et observées par microscopie confocale. En l'absence de la protéine Shh (-Shh) le Bo-Chol est concentré au niveau de la membrane plasmique des cellules (A). En l'absence de la protéine Shh (-Shh), Patched (détectée avec un anticorps marqué à la rhodamine (B)) est concentrée au niveau de la membrane plasmique et co-localisée avec Bo-Chol (C). La co-localisation entre Patched et Bo-Chol est moins évidente en présence de la protéine Shh, les cellules présentant outre Patched et Bo-chol au niveau de la membrane, une concentration encore élevée de Bo-Chol dans le cytoplasme de la cellule. Ces résultats sont en accord avec une activité de fixation et d'efflux du cholestérol pour Patched. 10 15 20 25 30 REVENDICATIONS1.) Utilisation d'un modulateur de l'activité de la protéine Patched pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la concentration intracellulaire en cholestérol. 2.) Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le modulateur de l'activité de la protéine Patched est un activateur de l'activité de la protéine Patched et que le médicament est destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol. 3.) Utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le médicament est destiné à prévenir la polydactylie préaxiale, particulièrement chez l'humain. 4.) Utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le médicament est destiné à prévenir l'holoprosencéphalie. 5.) Utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le médicament est destiné à diminuer la concentration intracellulaire en cholestérol pour inhiber le développement des tumeurs survenant dans de nombreux tissus, avantageusement dans le poumon, l'oesophage, l'estomac, le pancréas, les voies biliaires, le sein, la prostate et le cerveau et donc réduire la masse tumorale. 6.) Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le modulateur de l'activité de la protéine Patched est un inhibiteur de l'activité de la protéine Patched et que le médicament est destiné à augmenter la concentration intracellulaire en cholestérol. 7.) Utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce que le médicament est destiné à prévenir le syndrome de Gorlin. 8.) Utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce que le médicament est destiné à stimuler la réparation et/ou la régénération des cellules du système nerveux après une lésion et4ou une maladie dudit système nerveux. 9.) Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le médicamentest destiné à moduler la croissance et la structuration au cours du développement embryonnaire.