Brevet FR2967072A1 — publié le 20120511

La présente invention concerne le domaine technique des virus et des semences vaccinales influenza. Plus précisément, l'invention concerne des procédés pour améliorer la production des virus influenza et des semences vaccinales influenza. La grippe est une infection respiratoire virale fréquente, observée partout dans le monde, évoluant par bouffées épidémiques hivernales dans les régions tempérées, due aux virus influenza. Elle reste de nos jours la deuxième cause de mortalité infectieuse après les pneumonies. Les virus influenza responsables de pathologies chez l'homme sont les virus influenza de type A et B. Alors que les virus influenza de type B circulent sous forme de lignage, les virus influenza de type A sont classés en sous types viraux en fonction des propriétés antigéniques des deux glycoprotéines majeures de surface, l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). Les virus influenza présentent entre 300 et 700 glycoprotéines à leur surface associée à un ratio théorique NA/HA de un pour dix. Les virus circulants chez l'homme et responsables des épidémies saisonnières sont les virus A (HiN1) et A (H3N2). Le principal réservoir des virus influenza étant le réservoir animal (aviaire et porcin), des virus animaux peuvent franchir la barrière d'espèce et infecter l'homme. Des virus comme le virus aviaire hautement pathogène A (H5N1) et le virus A (H1N1) responsable de la pandémie de 2009 peuvent entrainer de graves problèmes de santé publique. La vaccination est, pour l'instant, le seul moyen efficace pour protéger les populations des virus influenza. Le vaccin dit saisonnier permet d'acquérir une immunité contre les virus circulants saisonniers A (H1N1), A (H3N2) et les virus B. Il est défini chaque année par l'OMS à partir des souches prototypes de l'année antérieure. La réponse immunitaire de l'hôte est principalement de type humorale avec synthèse d'anticorps neutralisants qui sont dirigés contre les protéines HA et NA. En raison d'une dérive antigénique importante de ces deux protéines, en particulier pour les virus de type A, la composition vaccinale doit être réévaluée annuellement. La culture des virus influenza constitue un élément critique dans le domaine de la production de vaccins, mais également dans le domaine de la recherche fondamentale et biomédicale sur les virus influenza. Les virus influenza réassortant vaccinaux sont principalement cultivés dans le système d'oeufs de poule embryonnés. On estime actuellement qu'un oeuf permet la production d'une dose de vaccin trivalent (Hampson et al. Influenza Other Respi Viruses. 2008 Nov. 2(6), 191-2). Le procédé de production de vaccin sur oeufs nécessite une échelle de temps incompressible de 5 à 6 mois. Pour faire face à la demande croissante de vaccins contre les souches circulantes saisonnières, mais également à la demande - difficilement prévisible - de vaccins contre une (ou plusieurs) souches émergentes potentiellement pandémiques, la disponibilité des oeufs peut s'avérer être un facteur limitant, d'autant plus que des risques de pandémies aviaires dans les élevages persistent. En outre, les volailles elles-mêmes sont susceptibles d'être affectés par des virus influenza ce qui pourrait causer des difficultés d'approvisionnement si des élevages destinés à la production de virus étaient eux-mêmes concernés par une pandémie de virus influenza. Dans ce contexte et d'un point de vue économique, la recherche et la mise au point de nouveaux procédés optimisés de production des semences vaccinales sont légitimes (réduction de temps et/ou réduction des coûts). Des stratégies alternatives pour l'obtention des doses vaccinales se sont développées ces dernières années. En effet, l'utilisation de lignées cellulaires pour l'amplification des réassortants vaccinaux permet entre autre de ne plus être dépendant du système « oeuf » (quantité d'oeuf potentiellement insuffisante pour la gestion d'une pandémie), réduit les modifications des antigènes de surface régulièrement observées dans la production allantoïque et entrainerait moins de risques d'allergies. Cependant, à l'heure actuelle, peu d'industriels ont choisi ce nouveau mode de production car le procédé industriel est foin d'être aussi performant que celui en système allantoïque. En effet, tant la production de virus que la production d'antigènes viraux (HA et NA) en culture cellulaire se heurtent à des difficultés en termes de rendement et donc de quantité de virus ou d'antigènes produits. De nombreuses équipes de recherche développent actuellement des systèmes cellulaires de production de virus, pour compléter voire substituer le modèle de production sur oeuf. Ces systèmes cellulaires sont généralement permissifs pour un nombre plus large de souches virales que dans le système allantoïque et peuvent être rapidement mis en place à l'échelle de l'industrialisation (Barrett et al. Curr Opin Mol Ther. 2010 Feb;12(1):21-30). De plus, ces systèmes peuvent être couplés avec les techniques de génétique inverse, qui permettent de produire des virus recombinants (semences vaccinales) de manière rapide et flexible, mais également optimisés pour leur propriétés virologiques (réplication, expression d'antigène...etc). Pour des raisons de sécurité sanitaire et réglementaires, les lignées cellulaires choisies doivent être sélectionnées pour leur capacité à produire du virus avec des hauts titres, dans des milieux synthétiques dépourvus de protéines d'origine animale (milieux synthétiques sans sérum d'origine animal). Des systèmes cellulaires de production en cellules en suspension ont également été décrits (Le Ru et al. Vaccine. 2010 May 7;28(21):3661-71). Les lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires telles que les lignées MDCK, Vero, BHK21, CHO, HEK 293 et PERC6 n'ont pas permis, jusqu'à ce jour, d'obtenir des rendements de production adéquats pour les industriels. Un des enjeux économiques majeur est de pouvoir réduire le coût et les délais de fabrication d'une dose vaccinale (plus de doses par production et/ou réduction du temps d'obtention de la même quantité de doses). Linvention repose sur l'observation inattendue qu'une action antagoniste à l'activité de Mdm2 et plus particulièrement inhibitrice de l'interaction p53-Mdm2 a un impact sur le cycle réplicatif des virus influenza Dans ce contexte, la présente invention propose un nouveau procédé de production des virus et semences vaccinales influenza caractérisé en ce que la production est réalisée en présence d'un antagoniste de la protéine Mdm2, et en particulier d'un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53. Avant de décrire de manière plus détaillée l'invention, certaines définitions des termes utilisés dans le cadre de l'invention vont être données. Par « virus influenza », on entend désigner tous les virus influenza, et notamment les virus influenza humains, aviaires, équins, porcins et félins. Lesdits virus influenza peuvent être sélectionnés parmi les sous-types A, B et C. En particulier, le virus influenza peut être de sous-type A et notamment correspondre aux souches H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N7 et H9N2, et en particulier les virus A (HiN1) et A (H3N2). Parmi les souches HIN1, on peut plus particulièrement citer: A/Porto Rico/8/34 (également nommée A/PR/8/34), A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/95, A/Johannesburg/282/96, A/Texas/36/91, A/California/969/09 A(H1N1)sov. Parmi les souches H3N2, on peut plus particulièrement citer : A/Panama/2007/99, A/Moscow/10/99, A/Johannesburg/33/94. Parmi les sous-types B du virus de l'influenza, on peut citer, à titre d'exemples, les sous-types B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/i/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98. Bien que tous les virus influenza, quelque soit leur origine soient visés par l'invention, l'invention trouve tout son intérêt pour les virus influenza humains et notamment circulant dans la population humaine. Selon un mode de réalisation particulier, le virus influenza est choisi parmi les virus A (HIN1) humains et les virus A (H3N2) humains. Dans le cadre de l'invention, le terme « virus » englobe les virus sauvages, les isolats viraux primaires obtenus à partir d'un individu infecté, les virus recombinants, les virus atténués, les virus réassortis, ainsi que les virus produits par génétique inverse. Les « semences vaccinales » qui sont utilisées pour la production de vaccin, sont, le plus souvent, obtenues par réassortiment génétique ou par génétique inverse et constituent donc un exemple particulier de virus au sens de l'invention. Actuellement, le processus classique de production de vaccin repose dans un premier temps sur l'obtention par réassortiment génétique avec la souche A/PR8/34 (HIN1), de semences vaccinales sur oeuf, pour chacune des 3 souches prototypes annuelles déterminées par l'OMS pour chaque virus influenza. La plupart des fabricants de vaccin utilisent de manière usuelle ces virus réassortants dérivant principalement du virus parental A/PR/8/34. Ainsi, chaque semence vaccinale est issue d'un processus de réassortiment génétique entre la souche prototype et le virus A/PR8/34 (H 1N1) qui possède des capacités réplicatives d'intérêt en oeuf. Les particules virales des virus influenza sauvage (également nommés virus prototypes qui correspondent aux virus qui circulent dans la nature) contiennent huit segments de gène distincts constitués d'une chaîne unique d'ARN, chacun des gènes codant une à trois protéines déterminées du virus : HA, NA, M1, M2, NP, NS1, NEP, PB1, PB1F2, PB1N40, PB2 et PA. Les semences vaccinales obtenues par réassortiments correspondent à un i0 réassortant vaccinal qui comporte au minimum les segments de gènes codant pour HA et NA de la souche prototype sur le fond génétique d'un virus prototype adapté pour la production à grande échelle, qui actuellement correspond à la souche parentale A/PR/8/34 (composition « 6+2 »). Les réassortants vaccinaux obtenus avec les 3 souches prototypes annuelles, 15 nommés semences vaccinales, issus de ce réassortiment génétique peuvent ensuite être amplifiés sur oeuf ou en culture cellulaire. Aujourd'hui, le système oeuf est très largement utilisé à l'échelle industrielle. D'autres techniques pour la production de semences vaccinales, développées ces dernières années, reposent également sur la génétique inverse. La 20 production des semences vaccinales par génétique inverse n'est, cependant, pas un procédé enregistré et agréé par l'OMS. Quelle que soit la technique utilisée pour 1a production des semences vaccinales, les vaccins correspondent, le plus souvent, aux antigènes HA et NA qui sont purifiés à partir des productions de semences vaccinales en 25 cellules allanto ques ou issues d'une culture cellulaire in vitro. Dans un vaccin, ces glycoprotéines peuvent être associées ou non à des adjuvants. Actuellement, les doses vaccinales sont définies par une quantité d'antigène HA fixe (15 microgrammes /sous-type viral/dose). Une détection positive de l'antigène NA est nécessaire pour la validation des lots vaccinaux. 30 Dans le cadre de l'invention, on entend par « antagoniste de Mdm2 », une molécule capable d'interagir avec Mdm2 et de bloquer, au moins pour partie, son activité biologique. En particulier, dans le cadre de l'invention, l'antagoniste de Mdm2 utilisé se comportera comme un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53. Un « inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53 » peut être défini comme un composé qui prévient l'interaction entre les protéines p53 et Mdm2. De tels composés, qui sont par exemple des desoxynucléotides antisens ciblant Mdm2, ou plus largement développés, des molécules de faibles poids moléculaires, peptidiques ou non peptidiques, se lient à l'interface entre p53 et Mdm2 et préviennent leur association. La protéine suppressive de tumeur p53 joue un rôle central dans la régulation du cycle cellulaire, l'apoptose, la réparation de l'ADN et de nombreuses voies métaboliques. Par sa position centrale, p53 est la protéine la plus fréquemment mutée dans les tumeurs chez l'homme. En effet, près de 50% des cancers présentent des mutations du gène p53, résultant en l'inactivation ou la perte de la protéine. Plus largement, les fonctions de p53 sont la plupart du temps inhibées dans les cancers. En conditions normales, l'activité et la quantité de p53 sont étroitement régulées par la protéine Mdm2 (Murine double minute 2, ou appelée également Hdm2). Cette protéine ubiquitaire est une E3 ubiquitine ligase, entre autre capable d'interagir directement avec p53, la formation du complexe entre les deux protéines constituant une étape d'une boucle d'autorégulation : lorsque p53 est activée, elle se lie au promoteur P2 de Mdm2 et induit la transcription et l'expression de Mdm2. En retour, Mdm2 est, quant à elle, capable de se lier à p53 et de l'inhiber par différents mécanismes (inhibition activité transactivatirce de p53, délocalisation de p53 hors du noyau et dégradation de p53 via le protéasome) (Freedman et al. Cell Mol Lee 5ci. 1999 ]an. 55(1), 96-107). Tout antagoniste de Mdm2, et en particulier tout inhibiteur de l'interaction entre Mdm2 et p53 peut être utilisé dans le cadre de l'invention. Les propriétés les plus connues de ces composés sont l'induction de l'activité de la protéine p53, mais aussi l'inhibition de la prolifération cellulaire. L'interaction entre les protéines p53 et Mdm2 implique les régions aminoterminales des deux partenaires. Ces régions d'interaction ont été déterminées par les méthodes de double hybride (levures) mais aussi par des expériences immunoprécipitation. Elles correspondent, sur p53, à la région 1 à 41/52 et sur Mdm2 à la région 1/19 à 118/202. Des expériences de mutagenèse dirigée ont montré plusieurs résidus sur p53 importants dans l'interaction avec Mdm2: Leu14, Phe19, Leu22 et Trp23 (Klein C, et al. Br. J. Cancer. 2004 Oct 18;91(8):1415-9). La principale méthode pour évaluer l'efficacité de composés inhibiteur de l'interaction entre les protéines p53 et Mdm2 consiste à calculer une concentration inhibitrice à 50% (CI50 ou IC50 en anglais) et indirectement une constante dinhibition (Ki, via l'équation de Cheng-Prusoff), en réalisant une courbe de réponse, en fonction du paramètre biologique que l'on cherche à inhiber, à savoir l'interaction p53/Mdm2. Par exemple, il est possible de calculer les CI50 par mesure de résonance plasmonique de surface (SPR, de l'anglais « surface plasmon resonance », Biacore), en faisant rentrer en compétition la molécule inhibitrice avec Mdm2 : différentes concentration de composés sont incubées avec de la protéine Mdm2 recombinante et injectées dans une chambre (SPR) avec une puce sur laquelle est greffée de la protéine p53 recombinante, comme décrit par Vassilev et al. dans Science. 2004 Feb 6;303(5659):844-8. D'autres tests basés sur des techniques de mesures de fluorescence peuvent également être utilisés (Kane et al. Anal Biochem. 2000 Feb 1;278(1):29-38, Lu et al. J Med Chem. 2006 Jun 29;49(13):3759-62). Dans le cas de la famille de molécules telle que la Nutlin-3, les composés ont une CI50 d'environ 100-300nm (Vassilev et al. 2004, supra). Dans le cas de la molécule NSC66811, la constante Ki est de 120nM (Lu et al. 2006, supra). Dans de telles expériences de compétition, il est possible d'introduire comme contrôle un peptide naturel dérivé de p53, et notamment le peptide correspondant aux résidus 13 à 29 de p53 et de SEQ ID N°1: PLSQETFSDLWKLLPEN-NH2 tel que décrit par Lu et al. 2006, supra dont la constante Ki mesurée et donnée dans cette publication est de 6670nM. Sont notamment considérés comme des inhibiteurs de l'interaction Mdm2/p53 dans le cadre de l'invention, les composés qui présentent un Ki ou une IC50 inférieur à ce peptide, sur au moins un des tests de compétition décrits dans Vassilev et a/. 2004, Kane et aL 2000, Lu et aL 2006 supra. De manière plus générale, un composé présentant, sur le test de compétition décrit dans Lu et al. 2006 supra et dans le supporting information 3M060023, un Ki inférieur à 10 pM, de préférence inférieur à 5 pM, et encore plus préférentiellement inférieur à 1 pM, seront préférés. A titre d'exemples d'« inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53 »pouvant être utilisés dans le cadre de l'invention, on peut citer les dérivés d'imidazoline, (et en particulier ceux décrits dans US 6734302, WO 03/051359, WO 2007/082805, WO 2007/063013, EP 1463501, WO 2006/097261, US 2008/0255119 et WO 2008/130614), les dérivés d'imidazole (et en particulier ceux décrits dans WO 2008/130614 et WO 2008/119741), les dérivés d'oxindole (et en particulier ceux décrits dans US 7576082 et WO 2008/034736), les dérivés de spiroindolinone (et en particulier ceux décrits dans EP 1856123, 3. Med. Chem. 2006, 49, 3432-5, US 60/781958, US 7495007, WO 2007/104714 et WO 2008/141975), les dérivés de quinoline, et notamment d'isoquinoline (et en particulier ceux décrits dans WO 2008/034039, US2009/0068144 et ChemMedChem 2008, 3, 1118-28), les dérivés de bisarylsulfonamide (et en particulier ceux décrits dans EP 1519932), les dérivés de benzodiazépine (et en particulier ceux décrits dans 1 Med. Chem. 2005, 48, 909-12, EP 1443937, US 7115598), les dérivés de pipéridine (et en particulier ceux décrits dans US 7060713 et WO 2008/005268), les dérivés d'acide phénoxyacétique ou de phénoxyméthyltetrazole (et en particulier ceux décrits dans EP 0947494), les dérivés de chalcone (et en particulier ceux décrits dans Biochemistry, 2001, 40, 336-44 et US 7514579), les dérivés de tetrazole (et en particulier ceux décrits dans US 2008/0262200), les dérivés de disulfide (et en particulier ceux décrits dans US 2009/008553), les dérivés de diaminoaryle (et en particulier ceux décrits dans WO 2006/032631, WO 2007/107543 et WO 2007107545) ou encore les dérivés peptidiques (et en particulier ceux décrits par Bottger et aL dans Research Paper, 7(11), 1997, 860-9) décrits comme inhibiteurs de la protéine Mdm2 dans l'art antérieur. Une revue de tels inhibiteurs est donnée dans les publications de Lutz Weber dans Expert Opin. Ther. Patents 2010, 20(2), 179-190 et de Shangary et al dans Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2009;49:223-41, auxquelles on pourra se référer pour plus de détails. A titre d'exemples plus précis, on peut citer : - la Nutlin-3, (±)-4-[4,5-bis(4-chlorophényl)-2-(2-isopropoxy-4-méthoxy-phényl)-4, 5-dihydro-imidazole-l-carbonyl]-pipérazin-2-one, décrite par Vassilev et al. Science. 2004 Feb 6, 303(5659), 844-8 de formule : 0 o CC --cH3 H3C qui fait l'objet de deux essais cliniques de phase I, en oncologie, - la molécule NSC66811 (2-méthyl-7-[phényl(phényiamino)méthyl]-8-quinolinol) de formule : NH OH - et les molécules de formule suivante :15 OH avec X, Y, RI, R2, R3r R4 et R5 tels que décrits dans la demande de brevet 5 WO 2008/119741 I 296 7072 12 o cr cf et CFg De telles molécules sont connues pour leur application dans le traitement du cancer, mais leur utilisation pour améliorer quantitativement la production de virus influenza n'a jamais été envisagée. L'apport de (invention réside dans l'utilisation d'un antagoniste de Mdm2, et de préférence d'un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53, pour la production de virus ou de semences vaccinales influenza. Toutes techniques connues pour leur production peuvent être utilisées. La production des virus ou semences vaccinales influenza est réalisée dans un système cellulaire, en présence d'un antagoniste de Mdm2, et en particulier d'un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53. Plusieurs paramètres qui seront ajustés par l'homme du métier peuvent avoir une influence sur l'effet de l'antagoniste de Mdm2, et en particulier de l'inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53 : quantité d'inhibiteur, moment de l'adjonction de l'inhibiteur, quantité initiale de virus au moment de l'infection, temps de production. Par exemple, l'antagoniste de Mdm2, et en particulier l'inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53, sera utilisé à une concentration de 0,1 à 100 pM. Notamment, lorsqu'un dérivé d'imidazole , telle que la Nutlin-3, sera utilisé, une concentration de l'ordre de 1 pM à 10 pM sera, de préférence, choisie, et lorsqu'un dérivé de quinoline, tel que le NSC66811, sera utilisé, une concentration de l'ordre de 0,5 pM à 5 pM sera, de préférence, choisie. Le système cellulaire sélectionné (oeuf ou culture cellulaire) est infecté avec un virus ou une semence vaccinale influenza. L'adjonction de l'antagoniste de Mdm2, et en particulier de l'inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53 peut se faire, avant, après ou en même temps que l'infection. La production des virus, et en particulier des semences vaccinales, peut, notamment, être réalisée en cellules allantoïques dans un oeuf de poule embryonné ou encore in vitro en culture cellulaire. Les cellules utilisées peuvent être tout type de cellules appropriées pour la culture cellulaire, la réplication, la production de virus et la production d'antigènes viraux. Avantageusement, les cellules sont choisies parmi les cellules de mammifères d'origine humaine ou animale, les cellules aviaires ou les cellules d'insectes. Parmi les cellules de mammifères, on citera en particulier les cellules de culture dérivées de cellules humaines, de cellules de porc ou de chien. Ces cellules peuvent notamment être dérivées de cellules d'épithélium pulmonaire (ex : carcinome humain poumon A549 humaine CCL-185) ou d'épithélium intestinal (Caco-2 ATCC HTB-37). Parmi les cellules de mammifères, on citera également les cellules suivantes : ^ les cellules d'épithélium pulmonaire de porc S3PL dont notamment la lignée PTA-3256 déposée à l'ATCC (US2004/0142450 et W02009/059411), 0 les cellules MDCK de chien, ^ BHK21 CCL-10 Mesocricetus auratus (hamster), ^ les cellules humaines HOS dont notamment la lignée CRL-1543. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules sont des cellules aviaires adaptées â la culture cellulaire telles que par exemple : o CCL-141 Anas platyrhynchus domesticus, o CRL-12135 Gallus gallus Con A - C1- VICK, o CRL-12203 Gallus gallus UMNSAH/DF-1, o CRL-12357 Gallus gallus ConA-B1-VICK, a CRL-1590 Gallus gallus SL-29, o CRL-1708 Coturnix coturnix japonica QT6, o CRL-1962 Coturnix coturnix japonica QM7 (Quail muscle clone 7), o CRL-2111 Gallus gallus (chicken) DT40, o CRL-2112 Gallus gallus (chicken) DT95, o CRL-8135 Meleagris gallopavo (turkey) MDTC-RP19, et o et la lignée QM7 de myoblastes déposée â l'ATCC (CRL-1632) décrite dans le document US2005/0084503. D'autres lignées cellulaires aviaires sont connues de l'homme du métier et peuvent être utilisées. Il peut notamment s'agir de cellules embryonnaires aviaires. Les lignées cellulaires EB66 et EBx ont été décrites dans le W003/076601 et le W02008/129058. Lohr et al. décrivent l'établissement de lignées cellulaires aviaires AGEI.CR et AGEI.CR.pIX pour la propagation ou la réplication virale. W02009/004016 décrit également des cellules aviaires immortalisées pour la production virale et leurs procédés de préparation. Selon un mode de réalisation particulier, ces cellules sont choisies parmi les cellules MDCK, Vero, A549 et de manière générale parmi les lignées de cellules aviaires utilisées pour la production de virus influenza. Les cellules MDCK sont par exemple décrites dans US2006/0188977 et EP1862537. On citera en particulier les lignées suivantes : MDCK-SF101 (ATCC PTA-6501), MDCK-SF102 (ATCC PTA-6502) et MDCK-SF103 (ATCC PTA-6503). Les cellules sont, par exemple, choisies parmi les cellules : o les cellules Vero notamment la lignée CCL-81 Cercopithecus aethiops Vero ; o les cellules CHO notamment les lignées CRL-12444 Cricetulus griseus (Chinese hamster) et CHO DP-12 clone#1933 aIL8.92 NB 28605/12 ; o les cellules MDCK notamment la lignée CCL-34 Canis familians MDCK (NBL-2), 0 les cellules COS notamment les lignées CRL-1650 Cercopithecus aethiops, COS-i CRL-1651 Cercopithecus aethiops et COS-7 ; o les cellules CV1 notamment les lignées CCL-70 Cercopithecus aethiops CV-1, o les cellules HeLa, et 0 les cellules Hep-2. L'utilisation de lignées cellulaires CV-1, CV-C, Vero et BSC-1 pour la production virale est par exemple décrite dans US 6,303,371. Dans des modes de réalisation avantageux, les cellules sont choisies parmi CHO, MDCK, COS, CV-1, Vero, BHK21, PERC6, A549, HEK, HeLa, AGELCR, AGEI.CR.pIX, EB66, EBx et Hep-2. Avantageusement, les cellules sont choisies parmi les lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires pour la production virale en culture cellulaire â des fins médicales. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de production de virus influenza selon (invention comprend les étapes suivantes : a) l'infection avec un virus influenza, et en particulier avec des semences vaccinales influenza, d'un système cellulaire qui peut être soit un Oeuf de poule embryonné, soit des cellules d'une lignée cellulaire dans un milieu de culture cellulaire; b) l'incubation du système cellulaire de production sélectionné et infecté â l'étape a) dans des conditions permettant la réplication dudit virus influenza, et en particulier des semences vaccinales influenza; c) la récolte du virus influenza entier, et en particulier des semences vaccinales, produits, notamment, dans le surnageant de culture et/ou dans lesdites cellules en culture. Dans le cas d'un système oeuf, la culture se fait in vivo, alors que dans le cas d'une lignée cellulaire, elle est réalisée in vitro. L'utilisation d'un antagoniste de Mdm2, et en particulier d'un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53 peut être mise en ceuvre dans la production de toute sorte de virus influenza, notamment d'un virus sauvage, d'un isolat viral primaire obtenu à partir d'un individu infecté, d'un virus recombinant, d'un virus atténué, d'un virus réassorti, ou d'un virus produit par génétique inverse. Selon un mode de réalisation particulier, la production peut être réalisée en système cellulaire, in vitro. L'infection des cellules d'une lignée cellulaire avec le virus influenza sélectionné est réalisée dans un milieu de culture cellulaire qui est, de préférence, un milieu sans sérum, et de manière encore plus préféré, dépourvu de protéines d'origine animale (milieu synthétique calibré). Selon un mode particulier de mise en eeuvre, la culture des cellules infectées est réalisée en présence d'une enzyme protéolytique dans le milieu de culture, dans des conditions suffisantes pour assurer la propagation du virus dans la culture. La dite enzyme protéolytique est, par exemple, sélectionnée parmi la trypsine, la chymotrypsine, la thermolysine, la pepsine, la pancréatine, la papaïne, la pronase, la subtilisine A, l'élastase, la furine et la carboxypeptidase. De façon avantageuse, cette enzyme est une enzyme recombinante et n'est donc pas d'origine animale. Le procédé selon l'invention peut être appliqué à la production de virus influenza réassortants, du fait du caractère fragmenté des virus influenza. Dans ce cas, le système cellulaire sélectionné est infecté, avec au moins deux souches de virus influenza, ce qui conduit à la production d'un mélange de segments dérivés des deux souches de virus dans une seule cellule hôte. Durant l'assemblage des virus, toutes les combinaisons de fragments sont théoriquement possibles. Les nouvelles combinaisons sont appelées réassortants. Des réassortants particuliers peuvent être sélectionnés par suppression ou élimination des autres virus, par exemple au moyen d'anticorps. C'est selon ce type de procédé que les semences vaccinales sont générées. Pour plus de détails sur ces techniques, on pourra se référer à Kilnourne E.D. in Plotkin SA and Mortimer E.A. Eds, Vaccines 1994. Le procédé selon l'invention peut également être appliqué à la production de virus influenza par génétique inverse. En particulier, des plasmides d'expression peuvent être transfectés dans les cellules et permettent ainsi la production de virus recombinant (J Gen Virol. 2000 Dec;81(Pt 12):2843-7). Une autre technique moins répandue consiste à utiliser des transcrits modifiés des ARN viraux du virus influenza qui sont transcrits in vitro à partir de construction d'ADNc en présence de protéines, notamment, NP, PB1, PB2 et PA purifiées. Les ribonucléoparticules synthétiques ainsi produites sont ensuite transfectées dans des cellules préalablement infectées avec un virus influenza. Pour plus de détails sur cette dernière technique, on pourra se référer à Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. $ë, 1990, 3802-3805, â Enami et Paiese, J. Virol. 1991, 65, 2511-2513 (1991) et â Luytjes, Cell. 1989, 59, 1107-1113. Dans le cadre de l'invention, selon un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé de préparation d'un virus influenza, et en particulier d'une semence vaccinale selon l'invention peut comprendre une étape d'inactivation du virus récolté. L'inactivation peut être réalisée selon toute technique connue, et, par exemple, grâce à un traitement avec du formaldéhyde, de la béta-propiolactone, de l'éther, de l'éther avec un détergent (tel que le Tween-80), du bromure de cétyl-triméthylammonium (CTAB) du Triton N102, du deoxycholate de sodium ou du tri(Nbutyl)phosphate. Le procédé de production de virus et en particulier de semence vaccinale selon l'invention peut être inclus dans un procédé de fabrication de vaccin. Dans ce cas, le procédé de préparation d'un vaccin selon l'invention comprend une étape de production de protéines antigéniques de surface (HA et NA) â partir d'un virus entier d'influenza produit. Dans ce cas, il peut être nécessaire de traiter le milieu, notamment le surnageant, contenant le virus entier obtenu, avec un enzyme de digestion des acides désoxyribonucléiques (ADN), par exemple des enzymes DNases ou nucléases. Il est également possible d'ajouter un détergent cationique, tel qu'un sel de cétyl-triméthyl ammonium ou de myristyl-triméthyl ammonium, la lipofectine ou la lipofectamine. La récolte du virus ou des protéines de surface, s'accompagne le plus souvent d'une concentration et/ou purification et est réalisée selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, mettant en ceuvre notamment l'ultrafiltration ou la centrifugation (comme décrit, par exemple, dans Furminger, in Nicholson, Webster and Hay (Eds.), Textbook of influenza, chapitre 24 pp324-332). Le vaccin obtenu grâce au procédé selon l'invention peut correspondre à des pathogènes tués (également nommés inactivés) ou à des pathogènes vivants atténués. Le vaccin peut, par exemple, correspondre au surnageant de culture obtenu après la production du virus ou encore aux protéines antigéniques de surface susceptibles d'être obtenues à partir du virus produit conformément au procédé selon l'invention. Les exemples ci-après, en référence aux Figures annexées, permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. La Figure 1 présente des photographies de tapis cellulaire A549 non infecté et infecté par le virus H3N2 en présence ou en absence de Nutlin-3. Les Figures 2 à 7 présentent les quantités observées de copies de génome viral M/mL dans le surnageant de culture (M pour le segment de génome viral codant les protéines virales M1 et M2), avec différentes conditions de culture et après différents temps d'infection. Pour l'ensemble des exemples suivants, Les expériences ont été réalisées à une température de 370C. Le milieu de culture utilisé est le DMEM (Ref 41966 GIBCO), supplémenté en trypsine (lug/mL SIGMA) lors des infections. 1) Effet de la Nutlin-3 sur les effets cytopathiques induits par influenza - test réalisé sur les cellules A549 avec le virus H3N2 25 A/Moscow/10/99 Les cellules A549 (ATCC, American Type Culture Collection CCL185) sont des cellules issues de carcinome pulmonaire, elles présentent des caractéristiques similaires (cellules épithéliales polarisées issues du tractus respiratoire humain) aux cellules épithéliales alvéolaire de type II (Lieber et 30 al. Int J Cancer. 1976 Jan 15;17(1):62-70). Plusieurs études ex-vivo sur des tissus pulmonaires de patients infectés ont montré que ce type de cellules épithéliales constituaient vraisemblablement le site primaire d'infection des virus influenza (Nichons et aL Nat Med. 2007 Feb;13(2):147-9, van Riel et al. Science. 2006 Apr 21;312(5772):399). Ces cellules sont donc considérées comme pertinentes pour étudier les virus influenza et sont, par conséquent, très largement utilisées dans le domaine de la recherche fondamentale sur les virus influenza. L'observation et le suivi des effets cytopathiques induits par le virus au cours du temps permet généralement une première évaluation du degré d'infection du tapis cellulaire. L'effet cytopathique induit par le virus se caractérise notamment par la fusion des cellules infectées entre-elles, formant des structures cellulaires multinuclées (syncytia). En microscopie photonique, l'observation de la quantité et de l'ampleur de ces structures sur le tapis cellulaire permet d'obtenir une estimation du degré d'infection. La comparaison des effets cytopathiques obtenus en présence ou en absence de Nutlin-3 (10pM), dans les mêmes conditions d'infection (MOI (multiplicité d'infection)= 2.10-3), a révélé des différences importantes, observables dès 24hpi (heures post infection) comme mis en évidence Figure 1 avec comme référence les cellules non infectées (MOCK). En absence de Nutlin-3, les cellules A549 présentent un effet cytopathique caractéristique d'une infection avancée, avec de nombreux agrégats cellulaires et de nombreuses structures syncytiales. En comparaison, les cellules traitées par la Nutlin-3 (molécule ajoutée 14h avant l'infection et conservée ensuite lors de l'infection) présentent un effet cytopathique plus marqué, avec notamment la présence de structures syncytiales d'infection beaucoup plus importantes. 2) Effet de la Nutlin-3 sur la production virale - test réalisé sur les cellules A549 avec le virus H3N2 A/Moscow/10/99 La quantification des virus produits et relargués au cours de l'infection, par détermination du titre infectieux (DITC50/mL) dans le surnageant au cours du temps indique une quantité beaucoup plus importante de progéniture virale en présence de Nutlin-3 (gain d'un Iog10 d'écart dès 24hpi, Figure 2A). Afin d'avoir une idée plus précise, la quantification du nombre de copies de génome viral M/mL de surnageant a ensuite été réalisée, par extraction des ARN viraux et quantification par RT-gPCR en temps réel (Figure 2B). A 48hpi, 6,66x106 copies M/mL ont été mesurées en absence de Nutlin-3, contre 2,44x108 copies M/mL en présence de Nutlin-3, soit un gain de plus de 36 fois en termes de producton virale. Le même calcul réalisé à 72hpi indique un gain de 88 fois en faveur des conditions d'utilisation de Nutlin-3. 3) Effet de la Nutlin-3 sur les titres de virus produits après un ou plusieurs cycles réplicatifs viraux, à partir de différentes quantités initiales de virus inoculés - Evaluation de l'effet d'un prétraitement et des différentes concentrations de Nutlin-3 a) Test réalisé sur des cellulés A549 avec le virus H3N2 A/Moscow110199 Les cellules A549 ont été infectées par différentes quantités de virus (MOI 0,01, 0,1 et 1), en présence ou en absence de Nutlin-3, et la quantité de copies M/mL de surnageant a été mesurée par RT-gPCR après un seul cycle viral (10hpi) ou après plusieurs cycles viraux (28hpi). Les cellules ont été mises en présence de Nutlin-3, soit 14h avant l'infection (T = - 14h), soit immédiatement lors de l'infection (T = Oh) (Figure 3). Dans tous les cas, l'addition de Nutlin-3 se fait en une seule fois. A l'échelle de temps d'un seul cycle viral (10hpi), le génome viral dans le surnageant n'a pu être quantifié que dans les conditions d'infection avec des MOI de 0,1 et de 1. On observe des quantités de copies M/mL de surnageant supérieures lorsque les cellules sont en présence de Nutlin-3. Par exemple, lorsque le traitement est démarré à T=O, en présence de Nutlin-3, il est mesuré 11 à 50 fois plus de copies de génome dans le surnageant de cellules infectées que le contrôle sans Nutlin-3, respectivement pour des MOI de 0,1 et de 1 (Figure 3). Une expérience similaire a été réalisée avec une MOI de 10-3, en modifiant le moment ou le prétraitement est réalisé (14h versus 10h avant infection). A 48hpi, la Nutlin-3 permet d'obtenir 1,5 ; 5,7 et 40 fois plus de copies M/mL de surnageant que le contrôle pour des concentrations respectives de 0,1 ; 1 et 10 pM (Figure 4). b) Test réalisé sur des cellules MDCK avec le virus H3N2 A/Moscow/10199 La lignée MDCK (ATCC n° CCL-34) est la lignée la plus largement utilisée pour la production de virus influenza en laboratoire. C'est une lignée cellulaire qui est également enregistrée et avec laquelle des lots de vaccin ont été produits par Novartis et Solvay. Les résultats présentés Figure 5 indiquent qu'à une MOI initiale de 10-3, la molécule Nutlin-3 à différentes concentration (0,1 ; 1 et 10 pM), avec un prétraitement 14h avant l'infection, augmente de manière forte le titre viral (copies génome M/mL) dans les surnageants cellulaires après plusieurs cycles viraux consécutifs. A 24hpi, on obtient jusqu'à 19 fois plus de copies de génome M/mL en présence de Nutlin-3 par rapport au contrôle. Ces données complémentaires confirment les résultats obtenus avec la lignée cellulaire A549. 4) Effet d'une autre molécule antagoniste de Mdm2 (NSC668I1) sur la réplication virale - test réalisé sur les cellules A549 20 avec le virus H3N2 A/Moscow/10/99 La molécule NSC66811 (2-méthyl-7-[phényl(phénylamino)méthyl]-8-quinolinol, Merck Biosciences) de formule : NH OH est connue pour interagir avec Mdm2 et ainsi également bloquer 25 l'interaction p53/Mdm2 (effet similaire à celui de la Nutlin-3). Cette molécule a été utilisée à des concentrations de 2 et 20 pM avec une MOI de 10-3. Les résultats obtenus à 48 hpi sont présentés Figure 6 et montrent que la molécule NSC66811 permet d'obtenir des résultats tout à fait similaires à ceux précédemment décrits pour la molécule Nutlin-3. Ainsi, à 48hpi, une concentration de NSC66811 de 2pM permet d'obtenir environ 6 fois plus de copies de génome M dans le surnageant par rapport au contrôle. De manière similaire, à 72hpi, une concentration de NSC66811 de 20pM permet d'obtenir environ 5 fois plus de copies de génome M dans le surnageant par rapport au contrôle. 5) Effet de la sur-expression de Mdm2 sur la réplication virale - test réalisé sur les cellules A549 avec le virus H3N2 A/Moscow/10/99 L'effet de la sur-expression de Mdm2 sur la production virale a également été étudié. Les résultats présentés Figure 7 qui donnent le nombre de copies à 48hpi et 72hpi, avec une MOI initiale de 10-3 montrent que le virus H3N2 se réplique moins efficacement lorsque la protéine Mdm2 est surexprimée. (pcdNA-Hdm2). Ce résultat confirme que l'effet des molécules testées sur la production des virus influenza est bien lié à leur action antagonistique sur la protéine Mdm2. 6) Conclusions L'ensemble des expériences présentées en 1), 2), 3), 4) et 5) montre un net effet de la Nutlin-3 ou d'une autre molécule (NSC66811) antagoniste de Mdm2 sur la production virale des virus influenza, sur deux systèmes cellulaires différents (A549/MDCK). Le lien fonctionnel entre le mode d'action des deux molécules testées (inhibiteur de I interaction p53-Mdm2) et leurs propriétés modulatrices de la production cellulaire des virus influenza est supporté par les résultats obtenus en condition de surexpression de Mdm2. REVENDICATIONS1-Procédé de production d'un virus influenza, et notamment de semences vaccinales, caractérisé en ce que la production est réalisée en présence d'un antagoniste de Mdm2. 2 - Procédé de production d'un virus influenza selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'antagoniste de Mdm2 est un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53. 3 - Procédé de production d'un virus influenza selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le virus influenza est choisi parmi les sous-types A, B et C, et notamment les virus influenza de sous-type A correspondant aux souches H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N7 et H9N2, et en particulier le virus A H3N2. 4 - Procédé de production d'un virus influenza selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la production est réalisée dans un système cellulaire à l'exclusion de l'homme qui est infecté avec un virus influenza et en ce que l'antagoniste de Mdm2 est ajouté, avant, après ou en même temps que l'infection. 5 - Procédé de production d'un virus influenza selon l'une des revendication 1 à 4 caractérisé en ce que la production est réalisée en 20 cellules allantoïques dans un oeuf de poule embryonné. 6 - Procédé de production selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la production est réalisée in vitro en culture cellulaire. 7 - Procédé de production d'un virus influenza selon la revendication 6 caractérisé en ce que la production est réalisée in vitro dans une lignée 25 cellulaire choisie parmi les lignées CHO, MDCK, COS, CV-1, Vero, BHK21, PERC6, A549, HEK, HeLa, AGEI.CR, AGEI.CR.pDÇ EB66, EBx et Hep-2. 8 - Procédé de production d'un virus influenza selon l'une des revendications précédentes comprenant les étapes suivantes : a) l'infection avec un virus influenza, et en particulier avec des semences vaccinales 30 influenza, d'un système cellulaire qui peut être soit un oeuf de poule embryonné, soit des cellules d'une lignée cellulaire dans un milieu de culture cellulaire; b) l'incubation du système cellulaire de production sélectionné etinfecté à l'étape a) dans des conditions permettant la réplication dudit virus influenza, et en particulier des semences vaccinales influenza; c) la récolte du virus influenza entier, et en particulier des semences vaccinales, produits dans le surnageant de culture et/ou dans lesdites cellules en culture. 9 - Procédé de production d'un virus influenza selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend l'inactivation du virus récolté à l'étape c). - Procédé de production d'un virus influenza selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le virus est un virus sauvage, un isolat viral primaire obtenu à partir d'un individu infecté, un 10 virus recombinant, un virus atténué, un virus réassorti, ou un virus produit par génétique inverse. 11 - Procédé de production selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'antagoniste de Mdm2 est un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53 choisis parmi les dérivés d imidazoline, d imidazole, d'oxindole, de spiroindolinone, de quinoline et notamment d'isoquinoline, de bisarylsulfonamide, de benzodiazépine, de pipéridine, d'acide phénoxyacétique oude phénoxyméthyltetrazole, de chalcone, de tetrazole, de disulfide, de diaminoaryle ou un dérivé peptidique. 12 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'antagoniste de Mdm2 est un inhibiteur de l'interaction entre la protéine Mdm2 et la protéine p53 choisi parmi : - la Nutlin-3, (±)-4-[4,5-bis(4-chlorophényl)-2-(2-isopropoxy-4- méthoxy-phényl)-4,5-dihydro-imidazole-l-carbonyl]-pipérazin-2-one de formule : C# c}-° cHa H$ - la molécule NSC66811 (2-méthyl-7-[phényl(phénylamino)méthyl]-8-quinolinol) de formule : 0 CI 0 NH OCHà25- et les molécules de formule suivante :~NjéoHN 13 - Procédé de préparation d'un vaccin contre un virus influenza 5 caractérisé en ce qu'il comprend la production d'un virus influenza par un procédé selon l'une des revendications 1 â 12. 14 - Procédé de préparation d'un vaccin selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il comprend la production de protéines antigéniques de surface â partir d'un virus entier d'influenza produit selon le procédé de l'une 10 des revendications 1 â 12.15 - Procédé selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce que le vaccin obtenu correspond à des pathogènes tués ou â des pathogènes vivants atténués.