Brevet FR2963361A1 — publié le 20120203

La présente invention concerne un procédé de production d'agents biocatalytiques par Culture Continue Solide (CCS) se pratiquant sur support solide absorbant biodégradable ou non biodégradable, tant d'origine naturelle que synthétique, lesdits agents biocatalytiques étant des microorganismes adaptés à l'amendement des sols, à la dépollution des effluents riches en matières grasses, au traitement biocide contre les larves dans les captages d'eau ou les plans d'eau ouverts ou encore la réalisation de la métabiose ou du compostage de la matière organique solide ou la production d'enzymes. L'invention a également trait au support solide biodégradable ou non biodégradable pouvant être d'origine végétale ou synthétique, chargé en agents biocatalytiques, obtenu à partir dudit procédé et désigné par le terme « biomasse microbienne ». L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé continu de culture dite solide, par croissance et prolifération de microorganismes sur un support solide absorbant, hydrophile et biodégradable ou non biodégradable, non immergé, qu'ils colonisent, circulant dans un incubateur spécifique, réunissant les conditions permettant le développement de la souche en culture. La biomasse microbienne est adsorbée sur ledit support solide quand il est fibreux, ou absorbée et adsorbée quand il est poreux. Une sporulation conservatoire totale est obtenue par la création de conditions limitantes de stress voire pré létales avant le séchage de la biomasse microbienne obtenue. Cette technologie est générique et trouve son application dans des secteurs socio économiques très divers nécessitant des inoculations par des microorganismes à spécificité dédiée. Elle peut être destinée à la fabrication d'inoculas aux applications multiples. L'observation des techniques utilisées pour le traitement des milieux précités à savoir sol arable, effluents riches en matières grasses, eau infestée de larves et matière organique fermentescible solide nous conduit aux constats à suivre. Dans le premier cas, pour amender les sols arables, des apports réguliers d'azote sont indispensables pour obtenir des rendements satisfaisants. Mais, ils doivent être maîtrisés au plus juste, d'une part pour des raisons d'économie et surtout afin d'éviter les risques de fuites d'excès de nitrates vers la profondeur, avec pour conséquence par exemple la pollution de la nappe phréatique. L'apport excessif d'engrais dans les sols peut provoquer un déséquilibre en termes de quantité, entre les composants existentiels dans le sol, pouvant conduire au lessivage vers les cours d'eau. C'est le phénomène de l'eutrophisation. -2- Pour éviter cet apport excessif d'engrais azotés, on peut procéder à la bactérisation des sols ou des graines. La bactérisation des sols arables consiste à apporter des microorganismes fixateurs d'azote diatomique de l'air aux sols et aux cultures agronomiques, éventuellement une partie des éléments nutritifs, nécessaires à l'obtention de rendements économiques et durables. Pourtant l'utilisation de bactéries en agronomie s'est heurtée au problème de leur non persistance, une fois réintroduites dans les sols. De ce fait, elles ne peuvent contribuer efficacement à la réduction des niveaux d'intrants, notamment l'azote minéral, que pendant un temps restreint. Des procédés permettant de régénérer le sol (WO 9 010 079) utilisent les microorganismes fixés sur un support qui est enfoui dans le sol. La plupart des supports utilisés sont de type minéral (brevets US 4 286 061, CA 2 107 350, FR 2 525 629, WO 9 015 136, FR 2 590 904, EP 0 228 626), mais aussi de type organique (brevets US 2008/199 959, WO 2008/111 803, CN 101 475 932) ou un mélange de polymère et de support organique (brevets FR 2 647 119, US 5 595 893, EP 0 594 125). Les supports d'origine minérale contribuent à un apport de minéraux supplémentaires dans le sol, ce qui peut avoir des inconvénients, tout comme les supports polymériques. Des supports solides biodégradables faits d'acétate de cellulose, de la résine, de la gélatine, etc., peuvent également être utilisés (EP 0 594 125). Ces supports présentent des pores dans lesquelles est incorporé le milieu nutritif adapté au type de microorganisme choisi. Le support chargé en milieu nutritif est ensuite séché avant d'introduire les microorganismes dans les pores. La taille des pores est un facteur limitant quant à la quantité de la biomasse portée par chaque support poreux. Toutefois, le procédé revendiqué dans ledit document n'est pas continu. Des souches isolées et produites en masse traditionnellement ont donné des inoculas de très faible rendement ou de rendement aléatoire dans les sols amendés. Les recours à divers supports poreux, solides ou organiques, afin de protéger ces bactéries une fois réintroduites dans les sols, ne semblent pas avoir pu permettre une plus grande efficacité de ce type d'inoculation. Le support solide poreux imaginé pour une meilleure protection des microorganismes (brevet EP 0 594 125) présente malheureusement l'inconvénient d'être limité en quantité de biocatalyseur pouvant être contenue dans les pores. Dans le deuxième cas, un séparateur à graisses destiné à la rétention des matières solides, des liquides contenant des matières organiques de type graisses, huiles ou fécules contenues dans les eaux usées, est obligatoire dans le cadre de pose de réseaux de canalisations. Cette obligation résulte du règlement sanitaire local ou départemental, ainsi que du Code de la Santé Publique. 2963361 -3- Pour ne pas avoir à collecter et retirer les graisses et les autres matières organiques dudit séparateur ainsi que des colonnes par des opérations fastidieuses et coûteuses de vidange ou d'hydrocurage, des procédés de dégradation des graisses in situ ont été mis au point. Par exemple dans le brevet FR 2 783 527 (AB7), il est décrit un procédé de solubilisation et de dégradation des 5 graisses dans le traitement des eaux usées. Il consiste à mettre en présence dans le milieu - au moins une lipase qui va assurer l'hydrolyse des graisses, - au moins de l'urée et de l'uréase qui potentialisent l'action de la lipase par alcalinisation continue du milieu et formation de tensioactifs dispersants des graisses et - au moins des agents bactériens fixés sur brique concassée, devant produire des enzymes 10 lipolytiques pour compléter l'hydrolyse des graisses. Mais ce procédé présente l'inconvénient de nécessiter une surveillance régulière pour apporter les éléments d'hydrolyse, ainsi que l'élimination par nettoyage de la brique concassée après épuisement de la souche bactérienne, car autrement elle pourrait devenir encombrante. Dans le brevet FR 2 788 532 (AB7), on procède également par hydrolyse des graisses, 15 mais la lipase est adsorbée sur du talc par simple interaction hydrophobe. A la fin de l'activité de la lipase, le talc, de par sa grande densité, va s'accumuler sur le fond du dispositif et provoquer un encombrement. Il faut donc l'évacuer ou le remettre en suspension, ce qui va engendrer un coût de traitement relativement élevé. Le dispositif de traitement biologique des effluents aqueux décrit dans le brevet FR 20 2 882 550 est déjà une amélioration des procédés précédents. Il s'agit d'un dispositif de culture non immergée de microorganismes comprenant : - un support fibreux poreux susceptible d'être colonisé par lesdits microorganismes et - un répartiteur de solution nutritive relié à des moyens d'alimentation en solution nutritive, ledit répartiteur comportant au moins un orifice d'écoulement de la solution nutritive sur le support 25 poreux. Le répartiteur de solution nutritive doit être réalimenté régulièrement, ce qui est une contrainte liée au dispositif. L'ensemencement se fait in situ, ce qui rend difficile le captage et la fixation des microorganismes sur le support et rend de ce fait aléatoire la colonisation du support fibreux et/ou poreux. 30 D'autres dispositifs permettant de traiter des graisses ou plus généralement des matières organiques font intervenir différentes souches de microorganismes (brevets FR 2 757 843, FR 2 884 246, WO 02 094 181, JP 2004 242 553, JP 2009 220 080, JP 2008 220 225). Les microorganismes sont sélectionnés pour leur aptitude à dégrader les produits à traiter. De plus, 2963361 -4- certains systèmes de réactivation permettent d'accentuer la sélection des souches les plus performantes à l'épuration des milieux à traiter. En effet, s'il est possible de sélectionner les microorganismes standards plutôt les plus efficients pour un type d'effluent donné, chaque effluent possède sa propre particularité liée à son mode d'exploitation. 5 II est connu par exemple que les bactéries lipolytiques mises en jeu dans les procédés utilisés ne permettent pas une hydrolyse complète des acides gras à longues chaînes, ce qui entraîne une surcharge néfaste en matières organiques au niveau du bassin d'aération. De plus, nombre de bactéries ne conservent pas, en se multipliant, les propriétés qui ont été initialement conférées lors de leur création par manipulation génétique. Il est ainsi nécessaire d'effectuer des 10 apports en bactéries neuves supplémentaires, conséquents et coûteux, pour conserver l'efficacité du procédé. Dans le troisième cas, les captages d'eau et les plans d'eau ouverts sont souvent infestés de larves d'insectes, tels les moustiques, qu'il faut détruire. Pour cela, plusieurs procédés sont pratiqués en fonction de la nature du milieu à traiter. 15 Le procédé le plus ancien et le plus connu est celui qui consiste à former un film sur la surface de l'eau, qui va contribuer à noyer les larves. En effet, les larves, plus denses que l'eau et normalement suspendues dans celle-ci, se trouvent privées de leurs moyens de support habituels, à savoir la tension de surface sur un anneau de poils entourant les ouvertures trachéales à l'extrémité arrière dirigée vers le haut, formant un tube à air. Une modification de la surface de l'eau 20 par la présence d'un film supprime la tension de surface avec comme conséquence la noyade des larves qui coulent. Ce film est obtenu par épandage de gasoil ou de certains alcools sur l'eau. Si le gasoil est désormais interdit, les alcools ne sont pas toujours efficaces à cause de leur assimilation par certaines espèces de larves comme celles du Culex quinquefasciatus, courantes au Texas, tel décrit dans le brevet FR 1 558 077. 25 Pour plus d'efficacité, les brevets US 4 650 792 et US 2004/0185079 Al décrivent des procédés utilisant des granulés flottants chargés de larvicides, en général des organophosphorés, des carbonates et autres composants chimiques incompatibles avec la préservation de l'environnement. Ils présentent malheureusement un pouvoir toxique sur les vertébrés et les invertébrés. 30 Les brevets FR 2 756 462 et FR 1 558 077 préconisent d'autres procédés basés sur l'utilisation des « entomopathogènes spécifiques des moustiques », c'est-à-dire des larvicides biologiques pour moustiques comprenant des spores d'espèces microbiennes portant des toxines, par exemple Bacillus thuringiensis variété Israelensis (Bti), et Bacillus sphaericus. Même si 2963361 -5- présentement seuls ces deux Bacillus sont très exploités, beaucoup d'autres sont en cours d'étude et montrent leur efficacité comme le Bacillus thuringiensis medellin (Btmed), Bt jegathesan (Btjeg), Bt var. morrisoni et Clostridium bifermentansmalaysia (Cbm). Les bactéries citées ne sont donc que des exemples non exhaustifs. 5 Dans le cas du Bti, la souche H-14 (Bt H-14) génère des cristaux protéiques (deltaendoxine) qui, ingérés par la larve, provoquent sa mort par perforation de son tube digestif. Les spores et les cellules végétatives du Bti ne sont aucunement impliquées dans le processus insecticide (Becker et Margalit 1993). Ceci implique que la quantité de Bacilles à mettre en jeu doit être importante et leur développement dans le milieu doit être aisé. 10 Dans le quatrième cas, on peut citer la méthanisation qui se déroule en quatre étapes biochimiques, avec un démarrage délicat qui nécessite un ensemencement. Il existe classiquement trois classes de procédés de méthanisation * les procédés discontinus : ils fonctionnent selon des cycles de 10 à 40 jours et sont bien adaptés aux déchets à forte teneur en matière sèche (>15%), 15 * les procédés semi-continus : on retire périodiquement une fraction du digestat que l'on remplace par du substrat frais. Le temps de séjour varie de 10 à 20 jours, * les procédés continus : ils sont surtout réservés aux déchets en teneur en matière sèche inférieure à 10%. Pour les effluents liquides, les procédés à biomasse fixée permettent une amélioration sensible des performances du traitement. 20 L'objectif à ce jour est l'obtention du biogaz par fermentation dite sèche, ou encore solide, des matières premières renouvelables en optimisant le mélange de substrats ainsi que la durée du processus, afin de rendre le procédé économiquement et écologiquement compétitif. Ceci suppose une bonne biomasse microbienne de démarrage, du point de vue tant qualitatif que quantitatif. Dans tous ces cas, l'une des solutions pour améliorer le rendement biocatalytique 25 consisterait à rendre les souches plus persistantes et donc plus efficaces dans leur milieu de destination. Le brevet WO12003/046156 décrit par exemple des conditions d'isolement de bactéries du sol à l'aide de protocoles d'adaptation aux milieux d'isolement, ou rétention, capables d'assurer l'entretien et la survie des souches bactériennes les plus aptes de persistance active en milieux édaphiques (c'est-à-dire de sols arables). Il en résulte ainsi une bactérisation satisfaisante des sols 30 une fois les souches réintroduites, grâce à leurs propriétés de résistance acquises par les conditions de culture. La culture se fait sur des biofilms en milieu liquide, avec sélection naturelle des cellules, cas de l'Azobacter vinelandii. 2963361 -6- Cette technique de présélection peut être appliquée à la préparation d'inoculas de souches microbiennes destinées à d'autres milieux, afin qu'elles acquièrent toutes les qualités recherchées à savoir : résistance aux conditions du milieu, redémarrage rapide à partir des formes de réserve, grande vitesse de développement, stabilité génétique et persistance catalytique. De même, la 5 biocénose peut être exploitée selon le procédé de l'invention. Ainsi, selon des modes de réalisation de l'invention, les microorganismes sont choisis parmi: * les souches d'Azobacteriaceae, de Pseudomonaceae, de Rhizobiaceae, qui font partie des bactéries du sol, 10 * le Klebsiella oxytoca qui est une bactérie capable de dégrader les graisses notamment celles se trouvant dans les effluents et appareillages d'épuration dans des canalisations d'évacuation des eaux usées domestiques et d'usines, * les Bacillus thuringiensis (Bt) et autres Bacillus sphaericus dans les captages d'eau, ainsi que * la Biocénose de différents milieux, 15 * les bactéries de la métabiose à savoir les hydrolytiques, les acétogènes et les méthanogènes. * les microorganismes producteurs d'enzymes comme, toujours sans être exhaustif, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Aspergillus piger et Aspergillus oryzae. Il est connu que les microorganismes fixés sur support présentent une capacité de multiplication, donc une vitesse de croissance plus importante en comparaison avec ceux conduits 20 en milieu liquide. Cela est dû à une meilleure stabilité et une meilleure protection contre les agressions venant des agents extérieurs et du milieu lui-même. Il existe différents types de conduites de culture : la culture discontinue (batch), la culture semi-continue (fed-batch) et la culture continue. Il est connu que cette dernière est souvent utilisée notamment pour la production de biomasse microbienne sensible à l'inhibition due au substrat de la 25 fermentation qui doit être alimenté en quantité juste suffisante de Milieu Nutritif (MN) et des facteurs de croissance pendant toute la durée du cycle de ladite production de la biomasse microbienne. Mais elle est pratiquée sur milieu liquide, avec les inconvénients déjà présentés liés à ce mode de culture. L'invention FR 2 919 304 présente un procédé de production de spores de 30 microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide (fermentation en milieu solide « FMS »), ledit milieu solide comportant un support solide absorbant, de faible densité et pratiquement non fermentable, imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un 2963361 -7- stress choisi parmi un stress hydrique, un stress en oxygène et/ou un stress en température. Cette FMS se réalise malheureusement en situation « statique », c'est-à-dire en un seul cycle de production se terminant par la production de spores. En ce qui nous concerne, nous optons pour la Culture Continue que nous pratiquons sur 5 un support solide non immergé. Un apport séquentiel du MN en quantité juste suffisante, induit un aspect de renouvellement de celui-ci et de culture continue. On obtient ainsi plusieurs cycles de croissance et de prolifération intrasupport puis périphériques. Avantageusement, on optimise jusqu'à plus de 200% à 300% le rendement en terme de quantité de la biomasse microbienne portée par le support. De même, le rendement biocatalytique de ladite biomasse est 5 à 7 fois 10 meilleur dans le milieu d'activité de destination. Nous utilisons pour cela le terme « Culture Continue Solide (CCS) ». Préalablement, la composition du MN, spécifique pour chaque souche de microorganismes, est préparée selon les méthodes conventionnelles connues de l'homme de l'art. Ledit MN est stérilisé selon les modes classiques connus (autoclave, chauffage, etc.). 15 Le terme « biochargé » fait référence au support chargé en microorganismes. Lesdits microorganismes pouvant être des bactéries, des levures, des fungi. Le procédé selon l'invention repose sur une combinaison conceptuelle entre un inoculum obtenu par les méthodes d'amélioration des caractéristiques déjà énoncées et un mode de culture non immergée ou culture en milieu solide, concrétisée sous forme de culture colonisant de façon 20 continue un support solide absorbant biodégradable ou non biodégradable. Ce concept de culture continue solide va permettre l'obtention à terme de spores, de kystes ou autres formes de résistance conservatoire, redémarrant rapidement en donnant des microorganismes présentant une bonne adaptation aux conditions du milieu de destination finale et donc d'ensemencement. On obtient une grande vitesse de développement et une stabilité génétique offrant une grande 25 persistance biocatalytique de la souche. Ledit procédé est réalisable dans un incubateur spécifique (figure 1) permettant d'aller en continu de l'ensemencement de l'inocula à une série de cycles de croissance/prolifération donnant la biomasse microbienne, puis à la sporulation et enfin à un séchage optimisé de ladite biomasse. Trois formes de supports solides ont été retenues dans le cadre du procédé selon 30 l'invention : * la forme filaire matérialisée par une corde tressée faite de fibres biodégradables, de grosseur variable, avec possibilité de biodégradabilité différentielle entre le coeur (moins rapidement 2963361 -8- biodégradable) de ladite corde et sa périphérie (plus rapidement biodégradable) pour la gestion de sa durée de vie. Cette forme peut aussi être obtenue avec des fibres non biodégradables ; * la forme bidimensionnelle plane matérialisée par une bande faite de fibres biodégradables non tissées, de largeur et d'épaisseur variables, avec, comme dans la forme précédente, la possibilité 5 d'avoir une biodégradabilité différentielle entre le coeur (moins rapidement biodégradable) de ladite bande et sa périphérie (plus rapidement biodégradable) pour la gestion de sa durée de vie. Cette forme peut aussi être obtenue avec des fibres non biodégradables ; * la forme bidimensionnelle granulée matérialisée par des granulés lignocellulosiques ou des granulés synthétiques fortement poreux, de dimensions favorisant une surface spécifique 10 importante pour un poids donné de matière. Dans la présente invention, lesdits supports solides biodégradables de la première et de la deuxième forme sont constitués par des fibres lignocellulosiques et/ou d'autres polymères biodégradables, tressées en corde ou non tissées en feutre découpé en lanière, en bande ou en panneau. La section de la corde est ronde de diamètre allant à titre d'exemple non exhaustif 15 jusqu'à 200 mm, ou parallélépipédique avec une épaisseur allant à titre d'exemple non exhaustif de 5 mm à 100 mm pour une largeur variable. Ces supports peuvent être non biodégradables lorsqu'ils sont constitués de fibres non biodégradables. Ledit support doit avoir une capacité de rétention d'eau et de liquide de 50 à 85% pour permettre un développement microbien intrasupport important. 20 Dans le cas du feutre en non tissé, les paramètres d'aiguilletage sont variables en fonction de la densité voulue qui conditionne la capacité de rétention de liquide. Le support fibreux n'est pas directement fermentescible par les microorganismes en culture, mais favorise leur adsorption sur les fibres. Lesdites fibres utilisées, lorsqu'elles sont végétales, peuvent être du lin (Linum usitatissimum), du jute (Corchorus capsularis ou C. olitorius), 25 du chanvre (Cannabis sativa), du sisal (Agave sisalana), du kenaf (Hibiscus cannabinus), du coco (Cocos nucifera), du coton naturel ou non-recyclé (Gossypium hirsutum ou Gossypium barbadense), du bois (divers genres et espèces : Pinus sylvestres, Picea ables...). La durée de vie de ces supports varie de quelques mois à 2-3 ans selon leur structure qui dépend de : - la quantité de fibres (en g/m2) ; la durée de vie augmente avec la quantité de fibreslm2; 30 - la nature des fibres (longueur, diamètre, origine, traitements subis...) ; les fibres lignocellulosiques ayant un taux de lignine élevé se dégraderont moins vite que les fibres cellulosiques ; 2963361 -9- - des paramètres d'aiguilletage pour les non-tissés ou les feutres, et de tressage pour les cordes ; ces paramètres conditionnent la densité du produit, sa résistance à l'étirement et son opacité ; - la conception structurelle de la corde ou de la bande, à savoir uniformément biodégradable, 5 avec biodégradabilité différentielle ou non biodégradable. Les fibres peuvent aussi être en polymères de synthèse biodégradables comme le polycaprolactone, certains polyesters, polyhydroxyalkonates, du polyuréthane ou encore du PLA (acide polylactique), ou en polymères de synthèse non biodégradables choisis parmi le polyéthylène, le polyamide, le polyester, le polyéther, ou un mélange de certaines de ces fibres 10 Dans la présente invention, lesdits supports solides biodégradables de la troisième forme sont constitués par des matériaux lignocellulosiques poreux, concassés en granulés comme la rafle de maïs ou d'autres granulés de polymères biodégradables d'origine naturelle ou synthétique. La granulométrie varie de 600 pm à 4 mm. La culture continue sur support solide selon le procédé de l'invention se déroule en 15 plusieurs temps : stérilisation du support préchargé en MN, * ensemencement des microorganismes par pulvérisation de l'inoculum sur le support fibreux et/ou poreux, ce qui permet un contact direct et intime des cellules microbiennes avec le support sur laquelle elles adhèrent, 20 * apport séquentiel du MN ainsi que des facteurs vitaux et de croissance, * production microbienne par croissance et prolifération avec remplissage intrasupport des pores, des interstices et des cavités du support favorisées par le renouvellement séquentiel du MN ainsi que des facteurs vitaux et de croissance, * production microbienne par croissance et prolifération périphériques sur les fibres et la 25 surface du support favorisées à la fois par la saturation rapide des cavités, interstices et pores par les microorganismes et l'apport séquentiel de MN neuf ainsi que des facteurs vitaux et de croissance, * création des conditions limitantes de stress voire pré létales permettant l'obtention rapide des formes de résistance conservatoire ou la sporulation des cellules microbiennes, 30 * sporulation conservatoire, 2963361 -10- * apport de facteurs de croissance de réserve sur la biomasse microbienne sporulée, en évitant de créer toute condition revivifiante, * séchage du support ainsi biochargé, * vérification de la stabilité et de la relance de l'activité biocatalytique après sporulation, 5 * conditionnement des agents biocatalytiques supportés ou biomasse microbienne. La culture continue sur support solide selon le procédé de l'invention est réalisée dans un incubateur selon la figure 1 avec les étapes suivantes * ensemencement dans la zone 1 de l'inoculum par pulvérisation à l'aide des buses (3) sur le support fibreux (Si) ou granulé (S2), préalablement chargé avec du MN et stérilisé; 10 * apport du MN par pulvérisation à l'aide des buses (4) et des facteurs vitaux gazeux par soufflage à l'aide des souffleurs (5), le tout par séquences permettant d'en optimiser la quantité délivrée sur le support qui n'est ainsi jamais noyé, et permettant un renouvellement constant dudit MN qui ne se charge pas en toxines, pour la croissance et la prolifération continues des microorganismes dans la zone Z1 ; 15 * production microbienne par croissance, prolifération avec saturation intrasupport des pores, des interstices et des cavités du support, puis croissance et prolifération périphériques, dans la zone Z1 ; * apport, à la fin de la prolifération des microorganismes, d'éléments de conditionnement limitant stressant et pré létal liquides par pulvérisation à l'aide des buses (7) et/ou gazeux par 20 soufflage à l'aide des souffleurs (9) dans la zone Z2 ; sporulation de la biomasse microbienne dans la zone Z2 ; * apport par pulvérisation des futurs facteurs de croissance sur les spores et les autres formes de vies latentes et conservatoires à l'aide des buses (8) dans la zone Z2 en évitant de créer toute condition revivifiante, par maîtrise de l'activité hydrique, de l'apport gazeux et de la 25 température ; * séchage de la biomasse microbienne sporulée dans la zone Z3, favorisé par apport d'air conditionné par soufflage à l'aide des souffleurs (10) ; conditionnement en zone Z4, hors de l'incubateur. La continuité du procédé selon l'invention est réalisée grâce : 2963361 -11- - au système de déplacement du support dans l'incubateur (Fig,1) constitué d'un transporteur souple (1) à surface plane ajourée de type tapis grille, mû et supporté par des éléments d'entraînement (2) dont au moins l'un est motorisé et - à l'apport séquentiel et optimum en MN et autres facteurs vitaux correspondant aux 5 besoins de la biomasse microbienne en chaque phase de croissance et de prolifération. Ledit incubateur est organisé en zones cloisonnées (Z1, Z2 et Z3). La vitesse de déplacement du transporteur est modulable en fonction du temps de séjour souhaité par rapport au cycle de développement de la souche de microorganismes en culture. Chaque zone dispose d'un système d'évacuation des gaz produits (6). 10 Les supports, quelle que soit leur forme, se déplacent sans contrainte ni de traction, ni de poussée dans l'incubateur, posés sur le transporteur de manière stable. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, l'inoculum est ensemencé dès l'entrée du support dans l'incubateur par pulvérisation à l'aide de buses (3) sur le support solide fibreux ou granulé non immergé, mais ayant été préalablement chargé en MN et stérilisé. Ce mode 15 d'ensemencement assure avantageusement le contact des cellules microbiennes avec le support. Les cellules microbiennes de l'inoculum interceptées par ledit support vont disposer du MN absorbé dans le support pour leur première croissance. Ledit support est ensuite pulvérisé de façon séquentielle et contrôlée de MN en quantité optimale par les buses (4) pour éviter de le noyer pendant tout le processus de croissance et de 20 prolifération. Cette pulvérisation séquentielle du MN assure très avantageusement un apport dudit MN neuf permanent aux nouvelles cellules issues de la multiplication et permet ainsi une meilleure croissance pour une multiplication à meilleur rendement. Le renouvellement séquentiel du MN en quantités juste adéquates évite son effet inhibiteur sur la biomasse microbienne et offre une assurance nutritive de bonne qualité. 25 Selon un aspect du procédé de l'invention, l'apport des différents éléments gazeux vitaux pour la souche en culture va favoriser prioritairement la prolifération intrasupport dans les pores, les interstices et les cavités chargés en MN au début de la culture. Selon un autre aspect avantageux du procédé de l'invention, le MN et les autres éléments vitaux apportés de façon séquentielle vont favoriser la prolifération périphérique sur les fibres et la 30 surface après saturation des pores, des interstices et des cavités du support, ce qui a pour conséquence d'augmenter considérablement la quantité totale de la biomasse microbienne produite. Sur les fibres et à la surface des granulés, les microorganismes vont se développer en - 12 - étant adsorbés, c'est-à-dire sans contrainte ni limite d'espace vital comme cela est déploré dans le cas de la culture classique dans les supports solides poreux tels que généralement utilisés. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les éléments vitaux gazeux sont apportés par les accessoires de soufflage (5) sur le support solide qu'ils traversent. Selon l'une des caractéristiques de l'invention, la biomasse microbienne colonise en premier le support suivant un gradient allant de la surface vers l'intérieur de celui-ci après l'ensemencement de l'inoculum, puis va proliférer à la surface lorsque la densité intrasupport sera devenue trop forte. Selon la souche concernée, on peut observer la formation d'une succession de couches périphériques de gelée bactérienne sur ledit support. Selon un aspect avantageux du procédé de l'invention, la biomasse microbienne périphérique prend bien racine dans les pores, les interstices et les cavités du support où elle s'est développée prioritairement, ce qui la rend solidaire au support. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, la partie du support arrivée en bout de cycles de prolifération, suffisamment biochargée, passe dans la zone Z2 de l'incubateur où il n'y a plus d'apport de MN, mais où sont créées par contre les conditions limitantes de stress voire pré létales spécifiques pour la sporulation des microorganismes en présence, soit par aspersion de liquide adéquate, à effet stressant connu par l'homme de l'art, par les buses (7), soit par apport gazeux, toujours à effet stressant connu par l'homme de l'art, par les souffleurs (9), ou les deux combinés. La sporulation conservatoire s'installe sans connaître de phase létale massive comme cela est généralement le cas. Selon le procédé de l'invention, la biomasse microbienne ainsi sporulée, en prenant soin de rester dans les conditions limitantes de stress voire pré létales, est aspergée par les buses (8) de facteurs de croissance qui seront disponibles en prévision du futur redémarrage dans le milieu de destination : sols, effluents riches en matières grasses, captages d'eau, plans d'eau ouverts ou encore matière organique solide, support de production enzymatique. Selon un aspect avantageux de l'invention, l'apport supplémentaire de facteurs de croissance va permettre de revivifier rapidement les spores dans le milieu de destination et accélérer la croissance des cellules. On peut également vérifier ainsi rapidement la stabilité de l'activité biocatalytique de la biomasse microbienne sporulée et séchée. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, la biomasse sporulée pulvérisée de futurs facteurs de croissance passe immédiatement en zone de séchage (Z3). Les conditions de séchage, connues de l'homme de l'art, sont particulièrement adaptées à chaque souche de microorganismes. Elles permettent d'abaisser drastiquement l'activité hydrique de la biomasse 2963361 - 13 - microbienne sporulée, ce qui explique que les spores ne puissent pas profiter pendant cette phase desdits facteurs de croissance pour se réactiver. L'air conditionné déshydraté favorisant ce séchage y est apporté par les souffleurs (10). Le déplacement du support dans l'incubateur étant continu, les différentes étapes du 5 procédé s'appliquent de manière séquentielle en donnant au système un fonctionnement globalement continu. Selon un aspect avantageux de l'invention, les biomasses microbiennes supportées et séchées sont obtenues avec un rendement supérieur de 200% à 300% à partir du procédé selon l'invention. 10 Lesdites biomasses sont particulièrement appropriées pour la bactérisation de divers milieux comme les sols, les dispositifs et autres colonnes d'évacuation d'effluents graisseux, les captages d'eau et les plans d'eau ouverts, les matières organiques solides ou même dans le cas de la production d'enzymes. Lesdites biomasses redémarrent rapidement dans leur milieu de destination avec une 15 persistance biocatalytique assurée. Est également revendiquée une biomasse microbienne supportée obtenue selon le procédé de l'invention et présentant cinq caractéristiques principales qui s'expriment en - plus grande quantité de biomasse, de 200% à 300%, grâce à la prolifération des cellules en état absorbé et surtout adsorbé, ne subissant ainsi aucune restriction d'espace pour leur 20 développement ; - culture continue et contrôlée pour de grandes possibilités industrielles, ladite culture pouvant être arrêtée lorsque l'on estime la quantité de biomasse suffisante ; - passage rapide des spores en cellules viables grâce à l'hydrophilie du support qui assure une bonne activité hydrique aux dites cellules et à la présence des substrats et facteurs de croissance ; 25 - adaptation parfaite aux conditions du milieu de destination impliquant une grande persistance biocatalytique ; - adaptabilité du procédé d'obtention à diverses souches pour le traitement de différents milieux correspondants ou pour la réalisation de différents objectifs. Les exemples ci-dessous permettront de comprendre le procédé de l'invention. Ces 30 exemples non exhaustifs sont cités à titre illustratif sans toutefois limiter la portée de l'invention. 2963361 - 14 - Exemple 1: Culture de Azotobacter vinelandii sur corde de chanvre tressée, destinée à l'apport en azote dans le sol agricole. Composition du milieu nutritif stérilisé 5 Dans 5 litres de milieu nutritif on a : KH2PO4 5 010-3 M K2HPO4 2,3 t10-3 M CaCl2, 2 H2O 6,8 010-4 M MgSO4, 7 H2O 4,05110-4 M 10 CuCl2, 2 H2O 10-8 M MnCl2, 4 H2O 2,25110-7 M CoCl2, 6 H2O 2,43110-8 M ZnSO4, 7 H2O 5,3110-8 M FeCI3, 6 H2O 5110-6 M 15 EDTA 10-4 M Glucose 5,5 010-2 M Production de la biomasse : On dispose d'une corde de fibres de chanvre (Cannabis sativa) tressées de manière assez lâche, de 10 mm d'épaisseur et 50 mm de largeur, qui est assemblée bout à bout sur une longueur 20 de 10 m. Elle pèse 600 g pour un volume de 0,0050 m3 ou 5 dm3. La corde est pulvérisée de milieu nutritif, soit au total 2,50 dm3, puis stérilisée à 115°C pendant 15 minutes dans un stérilisateur à vapeur. Elle est bobinée dans un dérouleur fermé, muni d'un orifice par lequel on passe un bout de ladite corde. On la fixe par le bout au tapi grille de transport (1) de l'incubateur (Figure 1). La vitesse de déplacement du tapi est réglée en fonction du 25 temps de séjour du support voulu dans l'incubateur, soit 96 heures pour la zone 1. On règle la température à 30°C, puis on met en marche le système d'entraînement du dispositif. La corde support entre progressivement dans la zone d'ensemencement où elle est pulvérisée par segments de 30 cm avec 1,8 g d'inoculum de Azotobacter vinelandii dans 0,105 dm3 de milieu nutritif. A la fin de ce 1er segment, le support entre progressivement dans la partie de la 30 zone Z1 présentant des conditions favorables au développement de Azotobacter vinelandii par pulvérisation séquencée de MN et apport permanent d'air, particulièrement enrichi en azote selon les modalités bien connues de l'homme de l'art, est soufflé à travers le support par des souffleurs. Le support est juste humecté sans jamais être noyé. 2963361 - 15 - L'apparition de la gelée périphérique sur le support indique qu'il y a bien développement de Azotobacter vinelandii d'abord en intrasupport, puis de manière périphérique. A la fin de la zone Z1, on aura produit la quantité maximale de biomasse bactérienne de Azotobacter vinelandii, le support passe alors progressivement dans la zone Z2 des conditions de 5 sporulation. On diminue drastiquement le taux d'azote tout en relevant celui d'oxygène. Les cellules bactériennes s'enkystent, ce qui est la forme connue de sporulation de Azotobacter vinelandii. Alors que la biomasse intrasupport est coincée dans les interstices et les cavités, la biomasse périphérique, grâce à la gelée, reste fortement adsorbée sur les fibres. Puis le support ainsi biochargé, après une pulvérisation supplémentaire de facteurs de 10 croissance de réserve, entre progressivement en zone Z3 de séchage. Le conditionnement peut intervenir en zone Z4 lorsque le support biochargé séché aura été progressivement traité et débité en petites particules défibrées pouvant être incorporées dans le sol par épandage. Exemple 2 : Culture de Klebsiella oxytoca sur bande de feutre de jute, pour le traitement des 15 colonnes à effluents graisseux. Composition du milieu nutritif Dans 5 litres de milieu nutritif (MN) on a : - 2,02 g/1 de KNO3 - 5,65 g/l de KH2PO4 20 - 0,5 g/1 de NaCI - 2,46 g/I de MgSO4, 7 H2O - 82 mg/l de EDTA, 2 H2O - 1,25 mg de ZnCl2 - 0,75 mg de MnCl2, 4 H2O 25 - 7,5 mg de H3BO3 - 5 mg de CoSO4, 7 H2O - 0,25 mg de CuCl2, 2 H2O - 0,75 mg de NiCl2, 6 H2O - 0,75 mg de Na2MoO4, 2 H2O 30 - 7 mg de FeC13, 6 H2O Production de la biomasse: On dispose d'une bande de feutre de jute (Corchorus capsularis) de 10 mm d'épaisseur et 100 mm de largeur, pour une longueur de 10 m. Elle pèse 1400 g pour un volume de 0,010 m3 ou 10 dm3. 2963361 - 16 - On procède comme dans l'exemple 1, mais avec 5 dm3 de MN pour la stérilisation du support. De même, la quantité d'inoculum pulvérisée est de 2,8 g de Klebsiella oxytoca dans 0,2 dm3 de MN. On utilise l'incubateur de type Fig. 1 dont les réglages de vitesse de déplacement du support tiennent compte du cycle de vie de K. oxytoca. 5 A la fin de la culture en zone Z1, de la sporulation en zone Z2 finissant par l'apport supplémentaire de facteurs de croissance de réserve et après séchage en zone Z3, la bande biochargée est conditionnée comme telle ou fendue en bandes de 50 mm de largeur puis conditionnée. La bande ainsi biochargée est utilisable pour la dégradation des graisses par exemple dans une colonne d'évacuation d'effluents aqueux chargés de matières organiques et lipidiques. 10 Exemple 3: Culture de Bacillus thuringiensis (souche 344) sur particules de rafles de maïs pour traitement de réserve d'eau infestée de larves. Composition du milieu nutritif Dans 5 litres de solution on a la composition de l'exemple 1 corrigé avec ce qui suit : 15 -0,002gdeFeSO4 - 0,02 g de ZnSO4 - 0,2 g de MnSO4 - 0,3 g de MgSO4 Production de la biomasse: 20 On dispose de granulés de rafles de mais prégonflés par addition d'eau puis séchés, présentant ainsi 72% de volume en plus par rapport au granulé de base. On les prend à 4 mm de diamètre. Les granulés sont stérilisés comme dans l'exemple 1 après pulvérisation du MN. Dans l'incubateur, le granulé est déposé sur la bande convoyeuse en fine couche. Puis le procédé se déroule comme dans l'exemple 1. La vitesse de déplacement de la bande 25 porteuse est réglée en tenant compte du cycle de vie de B. thuringiensis. A la fin de la culture en zone Z1, de la sporulation en zone Z2 et après séchage en zone Z3, les granulés biochargés séchés sont conditionnés en zone 4. Ils peuvent être utilisés comme tels ou préalablement réduits en plus petite granulométrie. Ils sont jetés dans l'eau à traiter dans laquelle Bacillus thuringiensis va se remettre à se développer 30 en se libérant du granulé. 2963361 -17- Exemple 4: Culture de Bacillus amyloliquefaciens (souche B155) sur particules de luffa pour production d'a-amylase. Composition du milieu nutritif : on dispose d'un milieu synthétique décrit et mis au point par Vidyarhi et al., 2002. il se compose de : 1,5% farine de soja, 0,5% dextrose, 0,5% farine de maïs, 5 0,1% KH2PO4, 0,1% K2HPO4, 0,03% MgSO4.7H2O, 0,002% FeSO4.7H2O, 0,002% ZnSO4,7H2O et 0,1% CaCO3; pH : 7,0 ± 0,1. Ce milieu est stérilisé à 121°C pendant 20 minutes, mais sans dextrose ni MgSO4 qui sont stérilisés à part. Production de la biomasse microbienne : On dispose comme support de luffas sèches (fruit de cucurbitacée des régions chaudes, à 10 la chair très spongieuse) épluchées et débitées en morceaux 5 x 5 cm. Ce support est préalablement lavé avec une solution acide (HCI), rincé et de nouveau lavé avec une solution alcaline (NaOH). Au support ainsi lavé on ajoute le Milieu Nutritif (MN) sans dextrose ni MgSO4 avant stérilisation (autoclavage à 110°C pendant 30 minutes). Après refroidissement à 50°C, le support est introduit dans l'incubateur déjà décrit dans les 15 exemples précédents. La température dans l'incubateur est réglée à 50°C. Le dextrose et le MgSO4 sont ajoutés sur le support avant l'apport de l'inoculum (2.10' /g de luffa) de Bacillus amyloliquefaciens (souche B155) avec une humidité de 70% environ. De l'air est soufflé à raison de 2,0 à 5,0 I/min. avec un taux d'oxygène de 20% et le MN est pulvérisé de manière séquentielle pour garder à la fois le bon niveau d'humidité et d'apport 20 nutritionnel nécessaire à la croissance de Bacillus amyloliquefaciens (souche B155). La culture dure 48 heures en zone Z1 (déjà nommée dans les exemples précédents), cycles de croissance et prolifération. La biomasse microbienne passe dans la zone Z2 dans laquelle il n'y a plus d'apport de MN et où l'air est modifié par la diminution du taux de 02 par compensation avec un taux plus élevé de 25 N2 avec un débit de 31/min. Les bactéries sont certes stressées, mais on ne les conduit pas à la sporulation. Elles sont sorties de l'incubateur pour passage dans une presse pour extraction d'enzymes. 30 REVENDICATIONS1) - Procédé continu de production d'agents biocatalytiques par Culture Continue Solide sur support solide absorbant biodégradable ou non biodégradable, caractérisé en ce qu'il se déroule en une succession d'opérations de : a. Stérilisation du support préchargé de milieu nutritif, b. Ensemencement de l'inoculum sur ledit support stérilisé, c. Apport séquentiel du milieu nutritif ainsi que des facteurs vitaux et de croissance, d. Production microbienne par croissance, prolifération avec saturation intrasupport des pores, des interstices et des cavités du support, puis croissance et prolifération périphériques, e. Création des conditions limitantes de stress voire pré létales à la fin de la prolifération, f. Sporulation conservatoire, g. Apport de futurs facteurs de croissance sur la biomasse microbienne sporulée toujours sous conditions limitantes de stress voire pré létales, h. Séchage de la biomasse microbienne sporulée, i. Vérification de la stabilité et de la relance de l'activité biocatalytique après sporulation, Conditionnement des agents biocatalytiques ainsi supportés. 2) - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support solide absorbant biodégradable ou non biodégradable est d'origine naturelle ou synthétique, ou encore un mélange des deux, ledit support n'étant pas directement fermentescible par les microorganismes mis en culture. 3) - Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit support est de forme filaire, de forme bidimensionnelle plane, constitué de fibres lignocellulosiques choisies parmi les fibres de lin, de jute, de chanvre, de sisal, de kenaf, de coco, de coton et de bois, ou de fibres polymères de synthèse biodégradables choisies parmi le polycaprolactone, certains polyesters, le polyuréthane, l'acide polylactique (PLA), ou encore polymères de synthèse non biodégradables 2963361 - 19 - choisies parmi le polyéthylène, le polyamide, le polyester, le polyéther, ou un mélange de certaines de ces fibres. 4) - Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support biodégradable de 5 forme filaire ou de forme bidimensionnelle plane présente une biodégradabilité différentielle entre le coeur dudit support et sa périphérie. 5) - Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le support est de forme bidimensionnelle granulée, constitué de matériaux poreux concassés ou mis en forme de granulés, 10 de type polymérique biodégradable ou non biodégradable, d'origine naturelle ou synthétique, ou encore un composite de ces deux types de polymères. 6) - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le support solide absorbant biodégradable possède une capacité de rétention d'eau et de liquide de 50 à 15 85%. 7) - Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite Culture Continue Solide est réalisée dans un incubateur horizontal compartimenté en trois zones successives correspondant à des phases d'activités successives 20 a) Zone 1 d'ensemencement de l'inoculum de la souche et de production des microorganismes, b) Zone 2 de sporulation puis addition de futurs facteurs de croissance, c) Zone 3 de séchage du support biochargé en spores ou en kystes ou encore en d'autres formes de résistance conservatoire. 25 8) - Procédé selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le déplacement du support biochargé dans l'incubateur se fait de façon continue de la première à la dernière zone, par un dispositif constitué d'un élément transporteur souple de surface plane et ajourée, pouvant recevoir toutes les formes de supports de culture, mû par un jeu d'éléments d'entraînement dont au moins 30 un est motorisé. 9) - Procédé selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'inoculum est ensemencé par pulvérisation sur le support. 2963361 - 20 - 10) - Procédé selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu nutritif ainsi que les facteurs vitaux et de croissance spécifiques à la souche en culture sont apportés de manière séquentielle, en quantité juste suffisante, les éléments vitaux gazeux étant apportés par soufflage. 5 11) - Procédé selon les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la production continue de microorganismes est une succession de cycles de croissance et de prolifération d'abord intrasupport, suivis en continuité par des cycles de la colonisation périphérique dudit support. 12) - Procédé selon les revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la biomasse microbienne 10 supportée produite est mise en état de sporulation ou de résistance conservatoire par création de conditions limitantes de stress voire pré létales spécifiques à la souche. 13) - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'apport de futurs facteurs de croissance sur les spores est réalisé sous conditions limitantes de stress voire pré 15 létales spécifiques à la souche. 14) - Procédé selon les revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le séchage de la biomasse microbienne sporulée est fait, selon des conditions ménageant les spores, par soufflage d'air conditionné déshydraté. 15) - Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis parmi les bactéries, les levures ou les fungi. 16) - Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il est adaptable à 25 divers microorganismes choisis parmi les souches d'Azobacteriaceae, de Pseudomonaceae, de Rhizobiaceae, de bactéries du genre Klebsiella oxytoca, Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, de la Biocénose de différents milieux, des bactéries de la métabiose à savoir les hydrolytiques, les acétogènes ou les méthanogènes, des microorganismes producteurs d'enzymes comme Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Aspergillus piger et Aspergillus oryzae. 30 17) - Biomasse microbienne obtenue selon le procédé de l'invention caractérisée en ce qu'elle présente quatre caractéristiques principales qui s'expriment en 20 2963361 -21- a) plus grande quantité produite de 200% à 300% par rapport à la biomasse microbienne obtenue par les procédés classiques, b) culture continue et contrôlée pour de grandes possibilités industrielles, c) régénérescence rapide des spores en microorganismes viables, 5 d) grande persistance biocatalytique de 5 à 7 fois plus par rapport à la biomasse microbienne obtenue par les procédés classiques. 18) - Biomasse microbienne selon la revendication 17, caractérisée en ce que les microorganismes cultivés sont choisis parmi les souches d'Azobacteriaceae, de Pseudomonaceae, 10 de Rhizobiaceae, de bactéries du genre Klebsiella oxytoca, Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, de la Biocénose de différents milieux, des bactéries de la métabiose à savoir les hydrolytiques, les acétogènes ou les méthanogènes, les microorganismes producteurs d'enzymes comme Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Aspergillus piger et Aspergillus oryzae. 15 19) - Biomasse microbienne selon les revendications 15 et 18, caractérisée en ce qu'elle est utilisable pour le traitement des sols arables, des effluents et appareillages d'épuration dans des canalisations d'évacuation des eaux usées domestiques et d'usines, des captages et autres plans d'eau, ou pour la réalisation de la métabiose des matières organiques solides et la production d'enzymes.