Brevet FR2971711A1 — publié le 20120824

-1- Domaine de l'invention L'invention se situe dans le domaine de la cosmétique et des ingrédients actifs pour la cosmétique. La présente invention a pour objet un extrait de petit épeautre (Triticum monococcum) obtenu par hydrolyse de farine ou de graines d'épeautre à l'aide d'au moins deux protéanes autres que la papaïne. La présente invention a également pour objet une composition cosmétique comprenant ledit extrait de petit épeautre. La présente invention a également pour objet l'utilisation cosmétique d'un extrait de petit épeautre (Triticum monococcum), en tant qu'agent activateur de l'expression des protéines de la matrice extracellulaire. L'agent actif peut être utilisé seul ou en association avec d'autres agents actifs. L'invention concerne encore l'utilisation d'une composition cosmétique comprenant un extrait de petit épeautre pour augmenter l'expression des protéines de la matrice extracellulaire, retarder l'apparition et/ou lutter contre les signes cutanés du vieillissement liés à la dégradation de la matrice extracellulaire, et en particulier les rides, le relâchement et la perte de volume cutané et la déshydratation de la peau et enfin, à des méthodes de soin cosmétiques destinées à retarder l'apparition et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement. Arrière-plan de l'invention La peau est un organe de recouvrement composé de plusieurs couches (derme, jonction dermo-épidermique, épiderme). Le derme est le tissu de soutien de la peau et se compose d'eau, de fibres d'élastine et de fibres de collagène (70 % des fibres dermiques), enveloppées dans une matrice interstitielle de protéoglycannes ou glycosaminoglycanes. Les fibroblastes sont la principale composante cellulaire du derme et sont à l'origine de la synthèse des fibres de collagène et des fibres d'élastine. Les glycosaminoglycanes assurent la structuration des fibrilles de collagène et d'élastine et le stockage de l'eau, grâce à leur exceptionnelle hygroscopie. L'acide hyaluronique est le glycosaminoglycane le plus abondant de la peau, et le constituant majeur du derme mais est également présent autour des kératinocytes dans l'épiderme. Les complexes de glycosaminoglycanes et de collagène sont des acteurs majeurs de la souplesse et de la fermeté de la peau. 2971711 -2- La peau, comme tous les autres organes, est soumise au processus physiologique complexe du vieillissement. On distingue le vieillissement intrinsèque ou chronologique et le vieillissement extrinsèque. Le vieillissement intrinsèque est la conséquence d'une sénescence génétiquement programmée et d'altérations biochimiques dues à des facteurs 5 endogènes. Au niveau de la peau, il se caractérise par un ralentissement de la régénération des cellules et des matrices extracellulaires, aboutissant à une diminution de l'épaisseur du derme, des fibres de collagène moins nombreuses et désorganisées, une structure altérée des fibres élastiques du derme papillaire, ayant comme conséquences cliniques et fonctionnelles une sécheresse, une laxité de la peau et l'apparition de ridules et de rides. 10 Le vieillissement extrinsèque, quant à lui, est dû à des agressions environnementales telles que la pollution, le soleil, les maladies, les habitudes de vie, etc. Des extraits de petit épeautre obtenus par hydrolyse ainsi que leurs utilisations cosmétiques pour procurer des effets antioxydants ou protecteurs vis-à-vis des agressions extérieures et lutter ainsi contre le vieillissement extrinsèque photo-induit ont déjà été 15 décrits dans les brevets FR2873918 et FR2925332. Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que de tels extraits de petit épeautre étaient de bons agents activateurs de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire et pouvaient être utilisés comme nouveaux agents actifs pour lutter contre l'apparition les signes cutanés du vieillissement ayant pour origine la dégradation de la matrice extracellulaire. Les inventeurs ont 20 également trouvés que de nouveaux extraits de petit épeautre, obtenus par hydrolyse à l'aide d'au moins deux protéases différentes de la papaïne, avaient les mêmes propriétés sur la peau, tout en ayant l'avantage d'être plus homogènes, plus tables, et présentant moins de risque de réactions allergiques en dermato-cosmétique. 25 Exposé de l'invention Les inventeurs ont mis en évidence que des extraits de petit épeautre étaient de bons agents activateurs de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire. En conséquence, ces extraits sont adaptés pour lutter les signes cutanés du vieillissement ayant pour origine la dégradation de la matrice extracellulaire. 30 Les extraits selon l'invention se caractérisent par le fait qu'ils : - augmentent l'expression des collagènes de type I et III - augmentent l'expression de la fibronectine, - augmentent l'expression de l'acide hyaluronique 2971711 -3- - réduisent les signes de sénescence des fibroblastes On entend par « extrait de petit épeautre » ou « agent actif activateur des protéines de la matrice extracellulaire », tout extrait capable d'augmenter la quantité de collagène, de fibronectine et d'acide hyaluronique présente dans la cellule, ou sécrétée soit en 5 augmentant la synthèse protéique par modulation directe ou indirecte de l'expression génique, soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager. Le terme « extrait», désigne toute substance ou mélange de substances, ou préparation isolée, obtenue après hydrolyse de matière végétale. 10 On entend par « signes de sénescence des fibroblastes » le profil d'expression de marqueurs biochimiques associés au phénotype de sénescence cellulaire. On entend par peau, l'ensemble des tissus de recouvrement constituant la peau, les muqueuses et les phanères, y compris les cheveux, les cils et les sourcils. 15 Ainsi, l'invention a pour objet premier l'utilisation d'un extrait de petit épeautre (Triticum monococcum), en tant qu'agent actif activateur de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire de la peau, dans une composition cosmétique. La composition cosmétique comprend en outre un milieu physiologiquement adapté. 20 Plus particulièrement l'extrait de petit épeautre est utilisé en tant qu'agent actif pour augmenter la synthèse des collagènes I et III et de la fibronectine par les fibroblastes de la peau humaine. Ainsi, selon ce mode de réalisation de l'invention, l'extrait de petit épeautre est utilisé en tant qu'agent actif pour augmenter la densité du derme, et donc la fermeté de la peau, de 25 retarder ou réduire le relâchement des traits du visage, la perte de volume du derme, l'amincissement de la peau, l'atonie, les ridules, les rides profondes et l'atrophie dermique. Ledit extrait de petit épeautre est encore utilisé en tant qu'agent actif pour augmenter l'expression de l'acide hyaluronique, à la fois par les fibroblastes et par les kératinocytes. Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, ledit extrait de petit épeautre est 30 utilisé pour augmenter la capacité de toutes les couches de la peau à retenir l'eau et retarder ou réduire la déshydratation de la peau liée au vieillissement intrinsèque et en particulier à la diminution de la quantité de glycosaminoglycanes dans les matrices extracellulaires. 2971711 -4- Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ledit extrait de petit épeautre est encore utilisé en tant qu'agent actif pour retarder l'apparition ou diminuer la sénescence des cellules de la peau. On entend par l'expression «retarder l'apparition ou diminuer la sénescence des 5 cellules du derme» que, selon cet aspect avantageux de l'invention, l'extrait de l'invention diminue l'expression de marqueurs de sénescence dans des fibroblastes humains dont la sénescence a été induite par extinction du gène FOXO3a. L'agent actif selon l'invention est un extrait aqueux d'épeautre et plus particulièrement 10 un extrait aqueux de graines de petit épeautre ou engrain (Triticum monococcum). Le petit épeautre est un blé diploïde, très ancien, contenant un taux particulièrement élevé en protéines (Vallega 1992) mais aussi en caroténoïdes, en phosphore et en potassium (Abdel-Aal et al., 1995 ; Mtuz et al., 2000). En outre, les protéines de T. monococcum, semblent contenir peu de gluten, responsable des maladies coeliaques (Favret et al. 1984, 1987). 15 Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'extrait selon l'invention. Selon une forme particulière de l'invention, cet extrait peut être obtenu par extraction de protéines d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des fragments 20 peptidiques biologiquement actifs. De très nombreuses protéines trouvées dans les plantes sont susceptibles de contenir des fragments peptidiques biologiquement actifs au sein de leur structure. L'hydrolyse ménagée permet de dégager ces fragments peptidiques. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de les hydrolyser 25 ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les fragments peptidiques ensuite. Dans une première étape, les graines sont broyées à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être "délipidée" à l'aide d'un solvant organique classique (comme par exemple un alcool, l'hexane ou de l'acétone). Selon l'invention, les 30 graines utilisées ne sont pas soumises à une fermentation préalable. Avantageusement, l'extrait selon l'invention est réalisé à partir de farines complètes ou raffinées issues de ces graines. On réalise ensuite l'extraction des protéines de la plante suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié; le broyat de graines ou la farine est mis en suspension dans dans 2971711 -5- environ 10 volumes d'une solution aqueuse et la fraction soluble, contenant les protéines, les glucides et éventuellement des lipides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. La température d'extraction est comprise entre 4 et 80°C; préférentiellement l'opération sera réalisée à froid. 5 Cette solution brute est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des composés peptidiques solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique. Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée avantageusement par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes 10 protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation d'amylases et d'endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, Alcalase®, etc.). Après filtration, l'extrait est purifié soit par précipitation des molécules de fort poids moléculaire par l'ajout d'alcool ou de sels soit par filtration. Au cours de cette filtration le retentât est écarté et le filtrat (dialysât) est conservé. 15 A la fin de l'extraction, l'extrait obtenu est une solution aqueuse titrant à au moins 5 g/L en matière azoté et comprenant des composés peptidiques de poids moléculaires inférieurs à 15 kDa. L'extrait est alors dilué dans de l'eau ou dans tout mélange de solvant contenant de l'eau, puis stérilisée par ultrafiltration. 20 L'extrait est avantageusement dilué dans un ou plusieurs solvants physiologiquement adaptés, tels que l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. On entend par «physiologiquement adapté» que le solvant choisi est approprié pour entrer en contact avec la peau sans provoquer de réactions de toxicité ou 25 d'intolérance. Ainsi, après dilution, l'extrait de petit épeautre a une teneur en composés peptidiques comprise entre 1,5 et 3,5 g/1. L'extrait de petit épeautre obtenu selon l'invention est analysé qualitativement et quantitativement pour ses caractéristiques physico-chimiques et sa teneur en composés 30 peptidiques. On entend par « composés peptidiques », les fragments de protéines, les peptides et les acides aminés libres présents dans le mélange. Les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. 2971711 -6- Après cette étape de dilution, l'extrait peut être encapsulé ou inclus dans un vecteur cosmétique tels que les liposomes ou toute autre microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur 5 physiologiquement adapté. Selon une forme particulièrement avantageuse de la présente invention, l'extrait de petit épeautre est obtenu par un procédé mettant en oeuvre au moins deux protéases autre que la papaïne : 10 Il est ainsi possible de préparer un extrait de petit épeautre contenant un taux de composés peptidiques plus élevé par rapport au poids sec et dont les composés peptidiques ont un poids moléculaire inférieur à 5 kDa, en réalisant d'une part une hydrolyse par combinaison de plusieurs protéases et d'autre part en purifiant les composés solubles obtenus par des filtrations et des ultrafiltrations sur des membranes présentant un faible 15 seuil de coupure. L'utilisation d'hydrolysats peptidiques de bas poids moléculaires, et concentré en composés peptidiques par rapports aux extraits de l'art antérieur, présente de nombreux avantages en cosmétique. Outre le fait de générer des composés peptidiques qui ne préexistaient pas dans le mélange protéique de départ, l'hydrolyse et la purification décrite 20 dans le procédé ci-dessous permettent d'obtenir des mélanges plus stables, plus facilement standardisables et présentant moins de risque de réactions allergiques en dermatocosmétique. Selon cette forme particulièrement avantageuse, objet de l'invention, l'extrait de petit épeautre est obtenu par le procédé suivant : 25 a) Extraction par mise en contact de graines broyées ou de farine de petit épeautre (Triticum monococcum) avec une solution aqueuse, sous agitation, b) Hydrolyses à l'aide d'au moins deux protéases, c) Purification par au moins une étape de filtration, d) Séparation des composés de bas poids moléculaires par ultrafiltration. 30 Plus particulièrement, l'hydrolyse peut être réalisée à l'aide des protéases bromélaïne et Alcalase®. L'action conjointe de ces 2 protéases permet de générer des fragments peptidiques plus petits et de nature différentes que ceux générés lors de l'action par de la papaïne. En effet, 2971711 -7- bien que la bromélaine et la papaine soient toutes les 2 des endoprotéases (Cys-protéase), l'action complémentaire de l'alcalaseO qui est une exo-protéase permet l'hydrolyse des protéines par d'autres sites de coupure, conduisant ainsi à des peptides ou des composés peptidiques de nature et différentes de ceux obtenus par hydrolyse avec la papaine. 5 L'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide montre une bande à 24 kDa, correspondant aux enzymes inactivées, puis des peptides de poids moléculaire inférieur à 5 kDa. Le profil de répartition des composés peptidiques de l'extrait obtenu selon l'invention est complètement différend de celui d'un extrait obtenu par exemple par hydrolyse à l'aide de la papaïne. 10 Selon une forme préférée de l'invention, l'extrait est purifié à l'étape d) par ultrafiltration sur des filtres ayant un seuil de coupure de 5 kDa, de façon à éliminer tous les composés de poids moléculaire supérieur à 5 kDa. L'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide montre que tous les composés 15 peptidiques ont un poids moléculaire inférieur à 5 kDa. L'extrait de petit épeautre selon l'invention est dilué dans de l'eau ou dans tout mélange contenant de l'eau, puis l'extrait dilué est stérilisé par ultrafiltration. L'extrait selon l'invention est avantageusement dilué dans un ou plusieurs solvants 20 physiologiquement adaptés, tels que l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. On entend par «physiologiquement adapté» que le solvant choisi est approprié pour entrer en contact avec la peau sans provoquer de réactions de toxicité ou d'intolérance. 25 Ainsi, après dilution, l'extrait de petit épeautre a une teneur en composés peptidiques comprise entre 1,5 et 3,5 g/1. Les compositions cosmétiques utilisées selon l'invention contiennent l'extrait de petit épeautre en tant qu'agent actif activateur à une concentration comprise entre 0,0001 % à 30 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % environ par rapport au poids total de la composition finale. Cette gamme de concentrations représente la quantité nécessaire d'agent actif pour obtenir l'effet moléculaire recherché, à savoir, activer l'expression des collagènes de type I et III, de la fibronectine et de l'acide hyaluronique. 2971711 -8- De manière préférée, la composition utilisée selon l'invention se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu physiologiquement adapté pour la peau. Par « physiologiquement adapté », on entend des milieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères humains, sans risque 5 de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, de réponse allergique et autres effets secondaires. On entend par « application topique », le fait d'appliquer ou d'étaler l'agent actif selon l'invention, ou une composition le contenant, à la surface de la peau. Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, 10 hydro-alcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples, de gel aqueux ou anhydre, de colloïde. Ces compositions peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, 15 d'un sérum, d'une pommade, d'une crème, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick, ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau. Ces compositions peuvent également être adaptées à des applications sur le cuir chevelu et/ou les cheveux, et notamment se présenter sous forme de 20 shampooing, après-shampooing, lotion traitante pour les cheveux, masques capillaire, etc. L'ensemble de ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des co-solvants (éthanol, glycérol, alcool benzylique, humectant...), 25 des épaississants, des diluants, des émulsionnants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des huiles essentielles, des oligo-éléments, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, des filtres chimiques ou minéraux, des agents hydratants ou des eaux thermales etc. On peut, par exemple, citer des polymères 30 hydrosolubles de type polymère naturel, tels que les polysaccharides, ou polypeptides, des dérivés cellulosiques de type méthylcellulose ou hydroxypropylcellulose, ou encore des polymères synthétiques, polaxamères, carbomères, siloxanes, PVA ou PVP, et notamment les polymères vendus par la société ISP (International Specialty Products). 2971711 -9- Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, être présents à des concentrations allant de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. 5 Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids 10 total de la composition. Selon une autre forme de l'invention, les compositions utilisables pour l'invention seront appropriées à une administration orale. Ainsi les compositions pourront notamment se présenter sous forme de comprimés, capsules, gélules, pâtes à mâcher, poudres à 15 consommer telles quelles ou à mélanger extemporanément avec un liquide, sirop, gels, et toute autre forme connue de l'homme du métier. Elles contiendront des excipients de formulation appropriés, tels que colorants, édulcorants, aromatisants, agents de charge, liants, conservateurs. 20 Il est bien entendu que l'agent actif selon l'invention peut être utilisé seul ou bien en association avec d'autres agents actifs. Avantageusement, les compositions utilisables selon l'invention contiennent, en outre, au moins un autre agent actif destiné à renforcer l'action de l'agent actif selon l'invention, dans le domaine de la prévention et de l'amélioration des signes cutanés du vieillissement, 25 ou encore un autre agent actif permettant d'élargir la gamme de propriétés de la composition considérée. On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : les agents régénérants, anti-âges, antirides, apaisants, anti-radicalaires, anti-glycation, hydratants, antibactériens, antifongiques, kératolytiques, myorelaxants, desquamants, raffermissants, 30 les agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique ou la microcirculation ou la pousse des ongles ou la pousse des cheveux, les agents modulant la différenciation ou la pigmentation de l'épiderme, les agents inhibant les métallo-protéinases, ou encore les écrans ou filtres solaires. 2971711 -10- Dans un mode plus particulier de réalisation, la composition selon l'invention comprendra, outre l'extrait selon l'invention, - au moins un composé activateur du cytochrome c et/ou, - au moins un composé hydratant, tel qu'un composé activateur des aquaporines et/ou, 5 - au moins un composé activateur des sirtuines et/ou, - au moins un composé qui augmente l'adhésion cellulaire et/ou, - au moins un composé qui augmente la production de protéines matricielles telles que le collagène, fibronectine, laminine, glycosaminoglycanes et/ou, - au moins un composé modulateur de l'activité du protéasome et/ou, 10 - au moins un composé modulateur du rythme circadien et/ou, - au moins un composé modulateur des protéines HSP et/ou, - au moins un composé qui augmente l'énergie cellulaire et/ou, - au moins un composé modulant la pigmentation de la peau et/ou, - au moins un composé activateur du coenzyme Q10 et/ou, 15 - au moins un composé améliorant la fonction barrière, tel qu'un composé activateur de la transglutaminase ou de la HMG-CoA réductase et/ou, - au moins un composé protecteur de la mitochondrie. Lesdits composés ci-dessus peuvent être d'origine naturelle, comme des extraits peptidiques de plantes, ou encore d'origine synthétique, comme des peptides. 20 Indépendamment de leurs fonctions, les autres agents actifs associés à l'agent actif selon l'invention dans la composition pourront avoir des structures chimiques très diverses. On peut citer de manière non limitative, les peptides, la vitamine C et ses dérivés, les vitamines du groupe B, la DHEA (dihydroépiandrostérone), les phytostérols, l'acide 25 salicylique et ses dérivés, les rétinoïdes, les flavonoïdes, les amines de sucres, les azoles, les sels métalliques, les extraits peptidiques d'origine végétale ou encore les polymères. L'invention a enfin pour objet une méthode de soin cosmétique destiné à retarder et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement ayant pour origine les dégradations de la matrice 30 extracellulaire, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau à traiter une composition selon l'invention. Par signes cutanées du vieillissement, on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement intrinsèque et en particulier les signes ayant pour origine les dégradations de la matrice extracellulaire. Parmi ces signes on 2971711 -11- peut citer, le ralentissement de la régénération des cellules ou leur entrée en sénescence, la diminution de l'épaisseur du derme, des fibres de collagène moins nombreuses et désorganisées, la diminution de la quantité de glycosaminoglycanes, l'altération des fibres élastiques du derme papillaire. Toutes ses modifications biologiques ont comme 5 conséquences cliniques et fonctionnelles la sécheresse de la peau, le relâchement de la peau, la perte d'hydratation, l'atonie, l'apparition de rides profondes et de ridules, la perte de fermeté et de tonicité, l'atrophie dermique. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des 10 exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. Exemple 1 : Préparation d'un extrait de petit épeautre (Triticum monococcum) La farine de petit épeautre (Triticum monococcum) est mise en solution dans 10 volumes d'eau en présence de 2 % de POLYCLARO 10 (polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble). Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 8 avec une solution aqueuse de 15 soude 1 M. Après ajustement du pH, une amylase (hasidase0) est ajoutée dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 50°C. On ajoute ensuite une protéase (papaïne à 2 %), que l'on laisse agir 2 heures sous agitation à 50°C. On procède ensuite à l'inactivation des enzymes par chauffage de la solution à 80°C pendant 2 heures. Après 20 centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à un extrait brut de petit épeautre est récupérée. Le procédé de purification de l'extrait brut commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0,2 µm) afin d'obtenir une solution brillante et limpide, qualifié d'extrait 1. 25 A cette étape, l'extrait 1 de petit épeautre est caractérisé par une couleur jaune clair et par un extrait sec titrant de 70-75 g/kg, un taux de composés peptidiques de 10 à 15 g/1 et un taux de sucres de 60 à 65 g/1. La nature protéique de l'extrait 1 est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NuPAGEO Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). L'extrait protéique de 30 petit épeautre est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGEO LDS. Une solution de NuPAGEO Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les 2971711 -12- protéines réduites ne se réoxydent durant l' électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE® MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie® R-250. Dans ces conditions, on observe une bande à 24 kDa, 5 correspondant aux enzymes inactivées, puis des composés peptidiques de poids moléculaire inférieur à 15 kDa. L'extrait 1 est ensuite purifié par ultrafiltration à l'aide de la cassette Pellicon® 2 Biomax 30 kDa afin d'éliminer toutes traces d'enzymes. En fin de purification, on obtient un extrait peptidique jaune-orangé, brillant et limpide. On procède à une phase de dilution 10 afin d'obtenir un extrait peptidique caractérisé par une teneur en composés peptidiques de 1,5 à 3,5 g/1. Cet extrait correspond une forme de l'agent actif utilisable selon l'invention. Exemple 2: Préparation d'un extrait de petit épeautre (Triticum monococcum) comprenant des peptides de bas poids moléculaires La farine de petit épeautre (Triticum monococcum) est mise en solution dans 10 15 volumes d'eau en présence de 2 % de POLYCLAR® 10 (polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble). Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 8 avec une solution aqueuse de soude 1 M. Après ajustement du pH, deux protéases (bromélaïne et Alcalase®) sont ajoutées dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 50°C. On procède 20 ensuite à l'inactivation des enzymes par chauffage de la solution à 80°C pendant 2 heures. Après centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à un extrait brut de petit épeautre est récupérée. Le procédé de purification de l'extrait brut commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0,2 µm) afin 25 d'obtenir une solution brillante et limpide, qualifié d'extrait 1. A cette étape, l'extrait 1 de petit épeautre est caractérisé par une couleur jaune clair et par un extrait sec titrant de 20-25 g/kg, un taux de composés peptidiques de 10 à 15 g/1 et un taux de sucres de 5 à 10 g/1. Le profil protéique de l'extrait 1 est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur 30 gel de polyacrylamide NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). L'extrait protéique de petit épeautre est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE® LDS. Une solution 2971711 -13- de NuPAGEO Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites ne se réoxydent durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGEO MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l'aide de 5 Bleu de Coomassie0 R-250. Dans ces conditions, on observe une bande à 24 kDa, correspondant aux enzymes inactivées, puis des protéines inférieures à 5 kDa. L'extrait 1 est ensuite purifié par ultrafiltration à l'aide de la cassette Pellicon0 2 Biomax 5 kDa afin d'éliminer toutes traces d'enzymes. En fin de purification, on obtient un extrait peptidique jaune-orangé, brillant et limpide, qui a un poids sec compris entre 6 et 10 10 g/kg, une concentration en composés peptidiques comprise entre 4 et 7 g/1 et une concentration en sucres comprise entre 1 et 3 g/1. On procède à une phase de dilution afin d'obtenir un extrait peptidique caractérisé par une teneur en composés peptidiques de 1,5 à 3,5 g/1. Cet extrait, qualifié d'extrait 2, correspond à une forme possible de l'agent actif selon l'invention. -15 L'extrait 2 est analysé en chromatographie liquide haute pression (HPLC) à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'extrait 2 est une Nucleosi10 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn), permettant de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0,2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié). Dans ces conditions chromatographiques, plusieurs 20 fractions peptidiques ont pu être isolées, ayant toute un poids moléculaire inférieur à 5 kDa. Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier leurs pics moléculaires. Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet activateur de l'extrait de petit épeautre sur l'expression du collagène I dans des fibroblastes humains 25 Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 1 sur l'expression du collagène I dans les fibroblastes humains par immuno-blot. Protocole : Des fibroblastes humains en culture sont traités par l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 1 à une concentration finale de 1 % pendant 48 heures. Les cellules sont lysées dans du RIPA buffer (Thermo Scientific) contenant des 30 inhibiteurs de protéases (Ha1tTM Protease Inhibitor Cocktail and EDTA, Thermo Scientific). La suspension cellulaire est centrifugée à 12000 g pendant 30 minutes à 4°C et le surnageant est récupéré. La concentration en protéine du surnageant est déterminée par le 2971711 -14- BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Une quantité de 20 µg de protéines est déposée sur un gel SDS-PAGE en gradient 4-12 % et transférée sur une membrane de nitrocellulose en utilisant le système iBlot® Dry Blotting System (Invitrogen). La détection immunologique est réalisée à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du 5 Collagène I (Rockland, Ref : 600-401-103-0.5), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à une peroxydase (Immunotech, Réf : 115-036-062). Une solution de révélation chimioluminescente (SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate, Thermo Scientific) est ensuite appliquée et les images sont prises en utilisant le système Chemi-Imager (Alpha Innotech Corporation). 10 Résultats : Dans les conditions testées, on observe une luminescence plus intense pour les échantillons traités comparés aux conditions contrôle. Conclusions : L'extrait de petit épeautre selon l'exemple 1 stimule l'expression du collagène I dans les fibroblastes humains dermiques. Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet activateur de l'extrait de petit épeautre selon 15 l'exemple 2 sur l'expression du collagène I, du collagène III, du pro-collagène et de l'acide hyaluronique dans des biopsies de peau Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 sur l'expression des protéines de la matrice extracellulaire suivantes : collagène I, collagène III, pro-collagène, fibronectine et acide hyaluronique dans la peau humaine. 20 Pour cela des marquages spécifiques ont été réalisés sur des échantillons de peaux humaines cultivés ex vivo. Protocole : Des échantillons de peau humaine sont mis en culture à l'interface air/liquide. L'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 est appliqué topiquement sur les échantillons à des concentrations finales de 0,5 %, 1 % ou 3 %, puis les échantillons sont 25 incubés durant 24, 48 et/ou 72 heures à 37°C. Ces échantillons de peau sont ensuite fixés avec du formaldéhyde puis inclus dans de la paraffine ou fixés et inclus dans de l'OCT puis congelés à -20° C. Des coupes de 4µm d'épaisseur sont alors réalisées (6 µm pour les coupes à froid). Les marquages du collagène I et du collagène III, sur les échantillons inclus en 30 paraffine, sont effectués après démasquage des sites spécifiques. Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène I 2971711 -15- (Rockland, Ref : 600-401-103-0.5), d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène III (Rockland, Ref : 600-401-105-0.5), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf : A21206). Pour le marquage de l'acide hyaluronique, les cellules sont incubées en présence d'une protéine biotinylée spécifique 5 (Coger, Réf : 4007631A), puis en présence de streptavidine couplée à un fluorochrome (Invitrogen, Réf : 532354). L'immunomarquage du pro-collagène, sur les échantillons inclus dans de l'OCT, est effectué après une fixation de 10 minutes à l'acétone froid. L'immunomarquage est réalisé à l'aide d'un anticorps polyclonal de rat spécifique du pro-collagène (Millipore, Réf : 10 MAB1912) puis d'un anticorps secondaire anti-rat, couplé à un marqueur fluorescent (Invitrogen, A11006). Les cellules sont alors examinées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope). Résultats : Les observations microscopiques montrent une fluorescence plus intense au 15 niveau du derme des échantillons de peau traités avec l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2. Dans le cas de l'immunomarquage de l'acide hyaluronique, on observe également une augmentation de la fluorescence au niveau de l'épiderme des échantillons de peau traités avec l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2. Conclusions : L'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 stimule l'expression du 20 collagène I, du collagène III, du pro-collagène dans le derme et stimule l'expression de l'acide hyaluronique dans le derme et l'épiderme humains. Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet activateur de l'extrait de petit épeautre selonl'exemple 2 sur l'expression des ARNs messagers du collagène I par PCR en temps réel 25 Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 sur l'expression des ARNs messagers du collagène I dans les fibroblastes humains. Pour cela, l'expression du collagène I a été étudiée par PCR en temps réel. Protocole : Des fibroblastes humains en cultures sont traités avec l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 à des concentrations finales de 0,5 % et 1 % pendant 24, 48 et 30 72 heures. Les ARNs totaux sont extraits à l'aide d'un kit d'extraction (QIAGEN), puis reverse transcrit avec un kit spécifique contenant des inhibiteurs de RNase (Applied 2971711 -16- Biosystems). Une PCR en temps réel est réalisée dans un thermocycleur à l'aide d'un TagMan Gene Expression Assay spécifique du Collagène I (Applied Biosystem, Hs99999901_sl) et d'un TagMan Gene Expression Assay spécifique du 18S utilisé comme contrôle endogène (Applied Biosystem, Hs00164004_ml). La quantification relative de 5 l'expression des ARNs messager du Collagène I est réalisée par la méthode comparative des Ct (le Ct, threshold cycle, est l'intersection entre la courbe d'amplification et la ligne seuil). Résultats/Conclusion : L'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 augmente le niveau d'expression des ARNs messagers du Collagène I dans les fibroblastes humains. 10 Exemple 5 : Mise en évidence de la réversion de la sénescence celullaire induite chez des fibroblastes, par l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 Le but de cette étude est de déterminer l'influence l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 sur des fibroblastes sénescents, dont la sénescence a été induite par l'extinction du gène FOXO3a. Ces cellules surexpriment la bêta-galactosidase, en relation avec leur état 15 sénescent. FOXO3a est un facteur de transcription de type Forkhead impliqué dans la longévité cellulaire. Dans la peau, la régulation négative de FOXO3a accélère la sénescence des fibroblastes humains normaux (Hyun Kyoung K . et al. J. of Gerontol., 2005, vol. 60A n°1, pages 4-9). Cette propriété a été mise à profit pour induire la sénescence dans des 20 fibroblastes humains en éteignant l'expression de FOXO3a par un ARN interférant (siRNA) spécifique. Protocole : Des fibroblastes humains en culture sont rendus sénescents par un traitement avec un siRNA spécifique de FOXO3a à une concentration finale de 25 nM en utilisant la 25 technique de transfection par la LipofectamineTM RNAiMAX (Invitrogen, Ref : 13778-075). Des contrôles non traités sont réalisés. Les fibroblastes sont en parallèle traités par l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 à une concentration finale de 1 % pendant 48 heures. Les cellules sont rincées et fixées dans un tampon de fixation (0,2 % glutaraldéhyde, 2 % 30 formaldéhyde). Les cellules sont ensuite incubées à 37°C sans CO2 pendant 24 heures avec une solution de X-Gal à lmg/mL dans 40 mM d'acide citrique/phosphate (pH 6), 5 mM 2971711 -17- K3FeCN6, 5 mM K4FeCN6, 150 mM NaCl and 2 mM MgC12. Les cellules sont alors examinées au microscope à lumière blanche (Nikon Eclipse E600 microscope). Résultats : Les cellules sénescentes ayant une activité 13-galactosidase spécifique sont 5 colorées en bleu. Les cellules traitées avec le siRNA spécifique de FOXO3a montrent une augmentation de l'activité (3-galactosidase liée à l'induction de la sénescence, se traduisant par une augmentation du nombre de cellules colorées en bleue. Les cellules traitées avec les siRNA spécifique de FOXO3a et l'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2 à 1 % montrent une diminution de l'activité 13-galactosidase, se traduisant par une diminution du 10 nombre de cellules colorées en bleue. Conclusion : L'extrait de petit épeautre selon l'exemple 2e diminue le phénotype de sénescence induite dans des fibroblastes humains. Exemple 6 : Préparation de compositions 1 - Crème de jour antiâge Noms commerciaux Noms INCI % massique PHASE A MONTANOV 68 Cetearyl Alcohol (and) Cetearyl 5,00 Glucoside HUILE DE JOJOBA Simmondsia Chinensis (Jojoba) Seed 3,00 Oil HUILE DE VASELINE Paraffinum Liquidum (Minerai Oil) 2,00 SQUALANE Squalane 3,00 CERAPHYL 368 Ethylhexyl palmitate 4,00 CERAPHYL 41 C12-C15 A1ky1 Lactate 3,00 RAPTTHIX A-60 Sodium polyacrylate (and) 0,30 Hydrogenated Polydecene (and) Trideceth -6 PHASE B GLYCERINE Glycerin 5,00 ALLANTOÏNE Allantoin 0,10 EAU DEMWERALISEE Aqua (Water) qsp 100 PHASE C OPTIPHEN I Phenoxyethanol (and) caprylyl glycol i 1 PHASE D 2971711 -18- Noms commerciaux Noms INCI % massique AGENT ACTIF SELON 5 % EXEMPLE 1 PHASE E PARFUM Parfum (Fragrance) I qsp Mode Opératoire : Peser les ingrédients de la phase grasse et chauffer à 70°C sous agitation. Préparer la phase B et la chauffer à 70°C. Emulsionner la phase A dans la phase B. Ajouter la phase C vers 50°C sous agitation. En dessous de 30°C, additionner le principe actif (Phase D). 5 Parfumer et refroidir jusqu'à température ambiante. 2 - Crème hydratante W/O Noms commerciaux Noms INCI % massique PHASE A ARLACEL P 135 PEG-30 Dipolyhydroxystearate 2,00 Isononanoate CERAPHYL 375 Isostearyl Neopentanoate 3,00 PANALANE L-14E Hydrogenated Polyisobutene 3,00 CERAPHYL ODS Octyldodecyl Stearate 9,00 CERAPHYL 368 Ethylhexyl Palmitate 3,00 PHASE B EAU DEMINERALISEE Aqua (Water) qsp 100 ATLAS G-2330 Sorbeth-30 4,00 SULFATE DE Magnesium Sulfate 0,70 MAGNESIUM 7 H2O AGENT ACTIF SELON 2 % EXEMPLE 2 PHASE C LIQUAPAR MET Phenoxyethanol (and) Methylparaben 0,50 (and) ethylparaben (and) propylparaben PHASE D PARFUM Parfum (Fragrance) qsp Mode Opératoire : 10 Peser la phase A et chauffer à 75°C sous agitation. Préparer la phase B et la chauffer à 75°C. Emulsionner la phase B dans la phase A sous forte agitation rotor-stator. 2971711 -19- Homogénéiser quelques minutes. Refroidir brutalement à l'aide d'un bain d'eau glacée sous vive agitation. Ajouter la phase C aux environs de 50°C et additionner le parfum (phase D) à 40°C. Poursuivre le refroidissement jusqu'à température ambiante. REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait de petit épeautre (Triticum monococcum) dans une composition cosmétique comprenant en outre un milieu physiologiquement adapté, en tant qu'agent actif activateur de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire de la peau, pour lutter contre l'apparition des signes cutanés du vieillissement ayant pour origine la dégradation de la matrice extracellulaire. 2. Utilisation d'un extrait de petit épeautre selon la revendication 1, en tant qu'agent actif stimulant la synthèse des collagènes de type I et III, de la fibronectine et de l'acide hyaluronique par les cellules cutanées. 3. Utilisation d'un extrait de petit épeautre selon la revendication 1, en tant qu'agent actif pour retarder l'apparition ou diminuer la sénescence des cellules de la peau. 4. Utilisation d'un extrait de petit épeautre selon l'une des revendications précédentes, en tant qu'agent actif pour augmenter la densité du derme et l'élasticité de la peau, et pour retarder ou réduire le relâchement des traits du visage, la perte de volume du derme, l'amincissement de la peau, l'atonie, les ridules, les rides profondes. 20 5. Utilisation d'un extrait de petit épeautre selon l'une des revendications précédentes, en tant qu'agent actif pour augmenter la capacité de toutes les couches de la peau à retenir l'eau et pour retarder ou réduire la déshydratation de la peau liée au vieillissement. 25 6. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit extrait de petit épeautre contient entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés peptidiques. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit extrait de petit épeautre contient entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés peptidiques de poids moléculaire 30 inférieur à 5 kDa. 8. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit extrait de petit épeautre est un extrait aqueux dilué dans un ou plusieurs solvants physiologiquement adaptés, tels que l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le 35 butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. 2971711 -21- 9. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit extrait de petit épeautre est présent à une concentration comprise entre 0,0001 % à 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % environ 5 par rapport au poids total de la composition cosmétique finale. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite composition contient en outre, au moins un autre agent actif. 10 11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'autre agent actif est choisi parmi les agents régénérants, anti-âges, antirides, apaisants, anti-radicalaires, antiglycation, hydratants, antibactériens, antifongiques, kératolytiques, myorelaxants, desquamants, raffermissants, les agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique ou la microcirculation ou la pousse des ongles 15 ou la pousse des cheveux, les agents modulant la différenciation ou la pigmentation de l'épiderme, les agents inhibant les métallo-protéinases, ou encore les écrans ou filtres solaires. 12. Extrait de petit épeautre (Triticum monococcum) obtenu par le procédé suivant : a) Extraction par mise en contact de graines broyées ou de farine de petit épeautre (Triticum monococcum) avec une solution aqueuse, sous agitation, b) Hydrolyses successives à l'aide d'au moins deux protéases, c) Purification par au moins une étape de filtration, d) Séparation des composés de bas poids moléculaires par ultrafiltration. 13. Extrait de petit épeautre selon la revendication 12 caractérisée en ce que les protéases sont la bromélaïne et l'Alcalase®. 14. Extrait de petit épeautre selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'il ne comprend que des composés peptidiques de poids moléculaire inférieur à 5 kDa. 15. Extrait de petit épeautre selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il est dilué dans un ou plusieurs solvants physiologiquement adaptés, tels que l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. 2971711 -22- 16. Composition cosmétique comprenant un extrait de petit épeautre selon l'une des revendications 12 à 15, à une concentration comprise entre 0,0001 % à 20 % environ, et préférentiellement entre 0,05 % et 5 % environ par rapport au poids total de la 5 composition cosmétique finale. 17. Composition cosmétique selon la revendication précédente, caractérisée en ce que ladite composition contient en outre, au moins un autre agent actif. 10 18. Composition cosmétique selon la revendication précédente, caractérisée en ce que l'autre agent actif est choisi parmi les agents régénérants, anti-âges, antirides, apaisants, anti-radicalaires, anti-glycation, hydratants, antibactériens, antifongiques, kératolytiques, myorelaxants, desquamants, raffermissants, les agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique ou la 15 microcirculation ou la pousse des ongles ou la pousse des cheveux, les agents modulant la différenciation ou la pigmentation de l'épiderme, les agents inhibant les métalloprotéinases, ou encore les écrans ou filtres solaires. 19. Méthode de soin cosmétique destinée à retarder et/ou traiter les signes cutanés du 20 vieillissement ayant pour origine les dégradations de la matrice extracellulaire, caractérisée en ce que l'on applique topiquement sur la peau à traiter une composition comprenant au moins un extrait de petit épeautre, tel que défini dans l'une des revendications 16 à 18.