Brevet FR2977674A1 — publié le 20130111

Méthode améliorée de détection et / ou de Quantification d'un analyte présent à la surface d'une cellule [invention concerne une méthode améliorée de détection et/ ou de quantification d'un ana!ytedans unéchantillon. Etat de la techniuue L'immunohistochimie est le nom d'une méthode de localisation de protéines dans les cellules d'une coupe de tissu, par (a détection d'antigènes au moyen d'anticorps. 10 L'irnrnunohisbochirnie exploite !e fait qu'un anticorps se lie spécifiquement à des antigènes dans /es tissus biologiques. Les anticorps peuvent être d'origine po!ydona/eou monoclonale, les anticorps monoclonaux étant plus spécifiques par essence. 15 Un couple anticorps-antigène peut être visualisé de plusieurs façons. Dans la plupart des cas, un anticorps est conjugué à une enzyme générant des produits fortement colorés en présence d'un substrat chromogène (phosphatase alcaline, peroxydase de raifort notamment) ou bien unOuorophore (FIT[,TRITC,AMCA, DAB etc...). L'analyse densitornétrique du signal obtenu avec les méthodes chromogéniques ou de 20 fluorescence peu{ fournir des données serni-quantitatives ou quantitative respectivement, et permet de corréler !e niveau du signal mesuré avec !e niveau d'expression de protéines ou de localisation. Elle permet une détection serniquæntitabve basée sur l'observation au microscope par un anatorno-pathologiste qui classe la coupe en « négative ^nu ^ positive» ( 1f, 2+ ou ]f). 25 Unnrnunoh)stochirnie est largement utilisée pour !e diagnostic et/ou !e suivi de cancers par détection de cellules anormales telles que celles trouvées dans les tumeurs cancéreuses. Des marqueurs spécifiques sont ainsi aujourd'hui connus pour divers cancers, tels que l'Antigène carcino-embryonnaire (CEA), utilisé en cas de 30 cancer du côlon, CD15at CD50, utilisés pour !a rnæ!ad!e de Hodgkin, !'A/phafoetoproiéine, utilisée dans /a cadre de carcinomes hépaioce!!u/aires, [D117, marqueur des tumeurs stroma/es gastro-intestinales et Ki-67, un des indices de prolifération tumorale. Ces marqueurs moléculaires sont caractéristiques de certains évènements cellulaires tels que la prolifération ou la mort cellulaire (apoptose). 35 2 Urnrnunohistochinnie est aussi largement utilisée en recherche fondamentale pour comprendre la distribution et la localisation de biomarqueurs et de protéines exprimés dans !es différentes parties d'un tissu biologique. Deux approches sont utilisées en irnrnunohistochinnie: une méthode directe et une méthode indirecte. La méthode directe ne comporte qu'une seule étape de coloration et est basée sur l'utilisation d'un anticorps marqué qui réagit directement avec l'antigène dans les coupes de tissus. Bien que cette technique soit simple et rapide, sa sensibilité est faible en raison de l'absence d'amplification du signal. La méthode indirecte consiste à utiliser un anticorps primaire non marqué, spécifique de !'antigène d'intérêt, et un anticorps secondaire marqué reconnaissant les IgGde /'espèce animale dans laquelle l'anticorps prirnainea été préparé. Cette méthode est plus sensible que !es stratégies de détection directe en raison de l'amplification du signal due à la liaison de plusieurs anticorps secondainesà chaque anticorps primaire. îS Les techniques classiques d'irnrnunohistochinnie nécessitent plusieurs étapes avant /a coloration finale de l'antigène tissulaire, et de nombreux problèmes potentiels peuvent affecter !æ résultat de /a procédure. Les problèmes les plus fréquemment rencontrés sont un bruit de fond trop important, un marquage insuffisant de l'antigène et des 20 problèmes d'autof!uorescence. Pour réduire }e bruit de fond lié à !a fixation non-spécifique de !'anticorps primaire ou secondaire sur des protéines présentes dans l'échantillon, ces derniers sont généralement incubés avec un tampon qui bloque les sites réactifs auxquels l'anticorps primaire ou secondaire peut se lier. Les tampons de blocage les plus fréquemment utilisé sont: le sérum normal, du lait en poudre non 25 gras, de l'albumine sérique bovine (BSA) ou de la gélatine, et d'autres tampons aux formulations particulières sont également disponibles dans le commerce. L'invention permet de résoudre ces problèmes, en particulier elle réduit dnsstiquenlent (e bruit de fond observé lorsque les approches classiques d'irnrnunohistochinnie sont 30 mises en oeuvre, à savoir lorsqu'un seul anticorps est utilisé pour détecter la protéine d'intérêt. Description 35 L'invention a pour objet une méthode utilisant de manière avantageuse un couple de partenaires de FRET pour quantifier des protéines présentes dans un échantillon de tissu. Par « couple de partenaires de FRET »on entend un couple constitué d'un composé fluorescent donneur d'énergie /d-après ^cornposé fluorescent donneur ») et d'un composé accepteur d'énergie (ci-après « composé accepteur »); lorsqu'ils sont à proximité !'un de !'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé fluorescent donneur, ces composés émettent un signal de FRET (acronyme Par « Signal de fRE7w on entend tout signal mesurable représentatif d'un FRET entre 10 un composé fluorescent donneur et un composé accepteur. Un signal de FRET peut donc être une variation de !'intensité ou de /o durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur lorsque ce dernier est fluorescent. Lorsque !e signal de FRET est mesuré en temps résolu (ce qui est toujours le cas lorsque des chélates ou cryptatesde terres rares sont utilisés), on parle deTA' 1S FRET. L'invention consiste en une méthode de quantification d'une protéine d'intérêt exprimée à !o surface d'une cellule ou bien présente dans un échantillon de tissu, comprenant les étapes suivantes : 20 (i) mise en contact de cellules ou d'un échantillon de tissu exprimant ladite protéine avec un premier et un deuxième ligand, chacun de ces ligands étant capables de sa lier de manière spécifique à un domaine de ladite protéine, et ces ligands étant respectivement marqués par un composé donneur et un composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de FRET ; 25 (ii) lavage des cellules ou de l'échantillon de tissu ; (iii) mesure du signal de FRET émis par le milieu de mesure. Par «méthode de quantification » on entend une méthode de quantification relative, c'est-à-dire que !e signal mesuré us être différent d'un échantillon à l'autre, en 30 fonction de la quantité de protéine d'intérêt présente dans l'échantillon. Cette technique se distingue des méthodes classiques d'irnrnunohistnch!rnie dans !a mesure où elle met en oeuvre deux ligands (en particulier deux anticorps) spécifiques de !a protéine d'intérêt, et non pas un seul comme dans !es méthodes de !'art 35 antérieur. Elle comprend également une étape de lavage qui n'est généralement pas mise en oeuvre lorsque !a technique de FRET est utilisée puisque cette approche permet des mesures en milieu homogène. Cette méthode, combinée au fait que !e 4 signal de FRET ne sera émis que lorsque ces ligands ou anticorps) sont à proximité !'un de l'autre, résulte en un rapport signal / bruit bien meilleur que celui observé avec les protocoles classiques, à savoir ceux mettant en ceuvre un seul ligand ou anticorps. 5 Lorsque la rnéthode est mise en oeuvre sur un échantillon de tissu, elle nécessite des étapes de préparation de cet échantillon sous forme de sections de ZU à 50prn d'épaisseur. Ces étapes de préparation sont celles qui sont classiquement mises en oeuvre dans /e domaine de l'homme du métier, è savoir l'immunohistochimie. Elles peuvent consister en particulier en la fixation de l'échantillon par un traitement avec 10 du forrna!déhyde, son inclusion dans de !a paraffine, en particulier sous forme de blocs qui peuvent être ensuite découpés au microtome (de préférence avec une épaisseur d'environ 20 à 50prn). Le traitement de ces sections au xylène pour enlever la paraffine, leur rinçage à !'éthanol puisà !'eau sont également des techniques connues de l'homme du métier, de rnêrne que /a régénération des épitopeg par !a technique HIER (acronyme del'expression anglaise « heatinducedeptitopenecovery»). De manière alternative, /a méthode selon l'invention peut également être mise en ceuvre sur des cryosections, également préparées selon les techniques classiques. La méthode peut également être mise en oeuvre sur des cellules adhérentes, ou même sur des cellules en suspension. Dans ce dernier cas néanmoins, au moins une étape de centrifugation sera nécessaire pour réaliser l'étape de lavage. I/ peut être intéressant de normaliser !e signal de FRET par !a quantité de matériel biologique (cellules ou tissu) présent dans !e milieu de mesure. La méthode se/on /'invention comprend ainsi, dans une mise en oeuvre particulière, !'incubation des cellules ou de l'échantillon de tissu avec un agent de marquage fluorescent de l'ADN (par exemple !e HoechsL 33342), préalablement à /'étape de lavage, et !e signal de FRET sera normalisé par !e signal correspondant à la luminescence de cet agent de marquage. Dans une mise en oeuvre préférée, le premier et le deuxième ligand sont des anticorps reconnaissant !a protéine d'intérêt. Le terme «anticorps » doit ici être pris au sens large et comprends toute protéine de !a famille des Immunoglobulines ou bien comportant un domaine d'une immunoglobuline, ainsi qu'un site de liaison spécifique à [a protéine d'intérêt. Les anticorps peuvent donc être des fragments Fah, Fab', des anticorps simple chaîne, des domaines variables de chaînes lourdes ou légères d'immunoglobulines. L'homme du métier est à rnênne de fabriquer des anticorps spécifiques de !æ protéine S dont il souhaite déterminer l'expression en utilisant !es techniques classiques. De nombreux anticorps sont également disponibles dans le commerce. L'homme du rnëber veillera à sélectionner des anticorps reconnaissant des épitopes différents sur la protéine d'intérêt, cela pour permettre leur fixation sinnu!tanéeà cette protéine. 10 D'autres ligands peuvent être utilisés en lieu et place des anticorps. Ainsi dans une mise en oeuvre particulière de !'invention, /e premier ligand est un ligand connu de /a protéine d'intérêt et n'est pas un anticorps, et !e deuxième ligand est un anticorps. L'homme du métier veillera !à encore à ce que !e site de liaison du premier ligand soit différent du site de liaison de l'anticorps. Si /a protéine d'intérêt est un récepteur 16 couplé aux protéines G, l'homme du métier pourra se référer à !a base de donnée publiée par Okunn et al.(GLIDA: GPCR ligand database for chernical gennrnics drug discnverydatabase and too/s update. Nuci Ac/dsRes., 36(supp!_1), D907-912) pour trouver des ligands utilisables dans la méthode selon l'invention. 20 La protéine d'intérêt peut être toute protéine exprimée par les cellules présentes dans !e milieu de mesure. De préférence, lorsque !a protéine est composée de plusieurs sous unités ou bien lorsque elle se présente sous !a forme d'u!igornènes, !es deux ligands, de préférence les deux anticorps, se lient à des domaines distincts sur !a rnênne chaîne polypeptidique. La méthode est particulièrement adaptée à /'étude de 25 protéines nnernbranaines, te/!es que les récepteurs, en particulier les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les récepteurs è activité tyrosine kinase (RTK, tels que par exennp!e: E5FR, HER2, HER3,HER4). Elle peut également être mise en oeuvre avec les canaux ioniques. 30 Dans une mise en oeuvre préférée, la protéine d'intérêt est différente d'un récepteur exprimé de manière constitutive et exclusive sous forme d'homodimères. Dans !e cas où !a protéine d'intérêt est /e récepteur EGFR (HER1) !'un des ligands marqués par les partenaires de FRET est un anticorps anti-EGFRet !'autre ligand est 35 E[SF ou un anticorps ænU-EGFR (les anticorps ænU-EGFR étant disponibles dans {e 6 L'invention concerne aussi un nécessaire de réactifs pour mettre en oeuvre la méthode selon l'invention. Ce nécessaire de réactifs contient un premier et un deuxième ligand, chacun de ces ligands étant capable de se lier de manière spécifique à un domaine d'une protéine nnernbnanæire d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués 5 par un composé donneur et un composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de FRET. De manière préférée, !as ligands sont des anticorps spécifiques du récepteur EGFR. Marduaaes des anticorps par des composés donneurs ou accepteurs d'énerdie 10 Le marquage d'un ligand ou d'un anticorps par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation da groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme «fonctionna/isée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur 15 le composé à marquer, en l'occurrence, le ligand. Typiquement, !e groupe réactif présent sur !e composé fluorescent donneur ou accepteur est un groupe é!ectrophi!e ou nudénphi!e qui peut former une liaison covalente !orsqu'il est mis en présence d'un groupe nudéophi!e ou é!ectrophi!e 20 approprié, respectivement. A titre d'exemples, les couples de groupes é!ectrophi!es/nudéophi!es et /e type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous : Groupe électrophile Groupe nucléophile Type de liaison halogénures d'acyle amines/anilines carboxamides 'anhydrides amines/anilines carboxamtdes 7 halogénure d'aryle thiols thiophénols carbodiimides acides carboxyliques N-acylurées ou anhydrides esters activés* amines/anilines carboxamides mido esters amines/anilines amidines isocyanates amines/anilines urées sulfonate esters amines/anilines alkyl amines halogénures de sulfonyle amines/anilines sulfonamides * : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Yæst : / un groupe partant, choisi parmi !es groupes succ/nirnidy(oxy ('{)C«H*NOz), su!fosucdnirnidy/nxy(-0C*HaNOrSDzH) ; 5 ° un groupe ary!oxy substitué ou non par au moins un substituant é!ectrophi!e hel que !es groupes nitro, fluoro, ch!oro, cyano, trifluorornéthy/e, formant ainsi un aryle ester activé ; o un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride -OCORa ou -(}CNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou 10 différents et sont choisis parmi les groupes alkyles en C1-C6, perfluoroalkyles en Cz-Cu, a/koxyen C/-Ca, cydohexy!e ; w !e 3-dirnêthy/anninopropyle, ou !e N-rnorphn!inoéthy!e. Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce 15 comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe 0HS (N-hydroxysucdnirnidy!e), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les 8 anticorps marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMI) qui représente le nombre moyen de molécules de marqueur greffés au ligand. Lorsque !e ligand est da nature protéique, il peut être avantageux d'utiliser l'un des ~ groupes fonctionnels naturellement présent dans les protéines: le groupe amino terminal, /e groupe carboxy!æbe terminal, !es groupes carbuxy!abes des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arg/n/nes, /es groupes thio!s des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indo/esdes tryptophanes, les groupes thiuéthersdes méthionines, !es groupes IO innidazo/es des histidines. Si !e ligand ne comporte pas de groupe foncbonnel à l'état naturel, de tels groupes peuvent être introduits. Des méthodes d'introduction de groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kess!er, Nonisotopic probing, 0otiing and Sequencing, 15 Zndedidnn, L.]. Kricka (1995), Ed.Acadernicpress Ltd., Londres, p. 66-72. Une autre approche pour le marquage d'un ligand par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans le ligand, par exemple un groupe NHS ou un groupe nna!éinnide, et de !e mettre en présence d'un fluorophone portant un groupe 20 fonctionnel qui réagira avec /e groupe réactif pour former une liaison covalente. Il est important de vérifier que !e ligand marqué conserve une affinité suffisante pour son nëcepteur; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité du ligand marqué pour 25 le récepteur. Couples de partenaires de FRET Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie. 30 Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que !e spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre 35 d'absorption de l'accepteur. En æccunj avec !a théorie de FÜrster, !e FRET est un processus qui dépend de !a distance séparant les deux molécules, donneur et 9 accepteur: lorsque ces molécules sontà proximité l'une de /'autre, un signal de FRET sera émis. La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à !a portée de l'homme du métier. Dcscouples donneur-accepteur utilisables pour étudier (es phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakovvicz (Prindp!es of fluorescence speciroscopy, Znd edihnn, K1uvver acadernic/p!enurn pubUshers, NY (1899)), auquel l'homme du métier pourra se référer. 10 Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et 6 ms), en particulier les chélates ou cryptates de ternes rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET (en langue anglaise, « Tinne 15 Reso!ved FRET») en s'affranchissant du phénomène d'autofluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour /a mise en oeuvre de !a méthode selon ('invention. Les complexes de dysprosium (Dy3f), de samarium (Srn3f), de neodyrne /Nd]f\, 20 d\/tterbiurn (Yb3f) ou encore d'erbium (Er3f) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptates d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés. De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont 25 actuellement commercialisés par /es sociétés PerkinBrner, Invitrogen et Cisbio Bioassays. Des exemples de chélates nu cryptates de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont : 30 ° Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans !es brevets EP O 180 492, EP 0 321 353, EP O 601 113 et dans !a demande internationale VVO 01/96 877. Les cryptates de terbium (Tb]f) et d'europium (Eu3f) sont particulièrement appropriés aux fins de iæ présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés 35 par !a société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptatesd'europiunn deformules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NHz) : TrisBiPy-Eu H o N N H2 Py-BiPy-Eu 11 H Tuuz~~m8~~=~^~m ~ ~-K~~tr~û&84~D4~-~ uu /uu Pv/~BiP",-tetraacid E"" ° Les chélates de lanthanides décrits notamment dans !es brevets US 4 761 481, US S 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US S 116989, US4 761 481, US 48O1 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP O 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté &sl que !a herpyridine. [}es chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer. 10 e Des complexes de lanthanides constitués d'un agent ché!æb]nt, b8l quæ !e tétnsazæcyc/ododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et æ/. dans 8iorno!. Chenn, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and chæracte,isation of high!y ernissive and kinetically stable 15 !anLhanide complexes suitab!e for usage in ce!!u!o", peuvent également être utilisés. 12 On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/10580. o Les crypLahesde lanthanides décrits dans !es brevets EP 1 1549Q1 et EP 1 154 990 sont également utilisables. o Le cryptatede terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer viaungroupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) : et dont !a synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89). o Le cryptatede terbium Lunni4-Tb de la société Lurniphoe, commercialisé par Cisbio 15 Biomssays. o Le quantum dye de !a société Research Organics, de formule ci-dessous /qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) : H"N---(CH2) HN WH ~~ N /N-s> HN 10 13 ° Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme !e ruLhéniurn(ll) Lhs(2,2"bipyridine). 50 Le chélate de terbium DTPA'cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont !a synthèse est décrite dans !e brevet américain US 5 622 821. lO IS IO ^ Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et o/ (Journal of Luminescence 1997, 75: 149-169) : NCS T6.W 1 ~0!6 14 De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi porrn! : un cryptmhe d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; !es chélates et 5 les cryptates d'europium et de terbium étant particulièrement préférés Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Srn3+), de néodyme (Nd3+), d'vLterbiurn (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont également des complexes de ternes rares appropriés aux fins de l'invention. 10 Les composés fluorescents accepteurs peuvent être choisis dans !e groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; !es molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), !es squaroines, les coumarines, les proflavines, 15 !es acridines, !es fluorescéines, !es dérivés du boron-dipyrrornéthène (commercialisés sous !a dénomination « Bodipy»), !es fluorophores connus sous la dénomination «AtLo», les Ouorophores connus sous !a dénomination «DY^, les composés connus sous !a dénomination ^A!exa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les 20 rhodamines, !es cyanines, !es squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, !es fluorescéines, !es dérivés du boron-dipyrrornéthène, !e nitpobenzoxadiazo!e. Les expressions « !es cyanines" e{ ^ les rhodamines » doivent être respectivement 25 comprises oornrnæ ^ !es dérivés de cyanine^ et « !es dérivés de rhodamine ». [hornrne du métier connaît cesdifférents Muorophores, disponibles dans le commerce. Les composés «A!exa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés ^Atto» sont commercialisés par !a société AtLo-hec ; !es composés « DY» sont ]O commercialisés par la société Dyornics ; les composés « [y» sont commercialisés par !a société Arnersharn B!osciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros. Les protéines fluorescentes suivantes peuvent également être ub!isées en tant que composé fluorescent accepteur : !es protéines Ouorescentescyans (Arn[yæn1, Midnri' Ishi Cyan, rnTFP1), les protéines fluorescentes vertes (E(5FP, AcGFP, TurboGFP, Ennæna!d, Azarni Green, Zs(Sreen), !es protéines fluorescentes jaunes (EYFP, Topaz, 15 Venus, noOLhne, YPet, PhiYFP, ZsYeUow1, Banana), les protéines fluorescentes oranges et rouges (Oronge kusibari, rn{}range, idtornato, DsRed, OsRed2, DsRed- Express, DsRed'Monorner, rnTangerine, AsRed2, nnRFP1, ]Red, rnCherry, rnStrawberry, HcRed1, nnRaspberry, HcPed-Tandem, rnP!inn, AO143), !es protéines fluorescentes dans !e rouge lointain (noKæte, nnKaLe2, tdKaLushka2). Aux fins de l'invention, !es dérivés de cyonines ou de !a Ouorëscëine sont préférés comme composés fluorescents accepteurs. Exemples Exemple 1 Des cellules NIH/3T3 (fibroblastes de souris n'exprimant pas le récepteur EGFR humain) ont été transfectées de manière stable à !'aide d'un plasmide contenant !a lS séquence codant pour hE(5FR, e{ sélectionnées dans un milieu contenant de la purornycine. La !ignée obtenue, exprimant !e récepteur hEGFR, sera par !a suite nommée Pl. De manière similaire (à l'exception du milieu de sélection qui contenait de !'hygrornycine\, une lignée exprimant !e récepteurHER2 humain a été préparée (ci-après !ignée ^ H2 »). IO La tumeur obtenue par xenogreffes de cellules P1 sur une souris et fixée dans !e fornna!déhvde selon un protocole classiquement utilisé a été ensuite incluse dans de la paraffine. Les blocs ainsi obtenus ont été coupée au microtome (épaisseur ~ 50 prn) et !es sections FFPE (Fornnæ!déhyde Fixed Pæraffin Ernbeded) ainsi obtenues ont été 35 conservées dans un tube type eppendodfà 4vC jusqu'à utilisation. A une section contenue dans un tube eppendnrfonL été ajoutés 1,2 mL de substitut de Xylène et après 5 min d'incubation, !e tube a été centrifugé (16 000 RCF) et le surnageant éliminé par pipetage. Le rnênne processus a été renouvelé une fois, puis 30 1,2 mL d'Ethanol absolu ont été æjouùës. Après 3 min d'incubation !e tube o ëLë centrifugé (16 000 RCF) et !e surnageant éliminé par pipetæge. Le même processus a été renouvelé une fois, puis 1,2 mL d'Ethanol à 9596 ont été ajoutés. Après 3 min d'incubation !e tube a été centrifugé (16 000 R[F) et !e surnageant éliminé par pipebage. Ensuite, 1,2 mL d'Ethanol à 50% ont été ajoutés, et après 3 min 35 d'incubation !e tube æ été centrifugé (16 000 RCF) et le surnageant éliminé par pipebage. 1,5 mL de tampon 10 rnM TRIS'HC! f EDTA (pH9) ont été ajoutés puis !e 16 tube fermé et chauffé au bain marie pendant 20 min. Après refroidissement (10 'n le tube o été centrifugé (16 OOO RCF) et le surnageant éliminé par pipetage. La section dont !es ëpihopes d'EGFR ont été régénérés par traitement thermique (en 5 Anglais : HIER pour Heat [nduced Ep!topeRecovery) a été remise en suspension dans un tampon d'incubation constitué de 180 pLde tampon HEPES 50 rnM pH7 contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases, l 0/0 de BSA, et une concentration finale de 50 nM d'un anbcorpsAb15 spécifiqued'E(SFR (Therrnu Fisher) rnærquëà l'aide de cryptate Lunni4O Tb (Ab15-Lunni4Tb®, Osbio Bioassays) et de 50 nM d'un anticorps REGFO1 10 également spécifique de EGFR (Cisbio Bioassays) et marqué à !'aide du Muorophore accepteur d2 (Cisbio 8ioassoys), qui émets à 665 nrn (REGF01-d2). Après 16h d'incubation à 20»C, 20pLd'une solution de Hoechst 33342 à 20 pg/ nnL dans du tampon ont été ajoutés, puis après 15 min d'incubation, le tube a été centrifugé (16 000 R[F), !e surnageant éliminé par pipetage. Le culot a été remis en suspension dans 308 pLde tampon HEPES SO rnM contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéoses et 0,1 °6 de GSA, et !e tube æ été centrifugé (16 000 RCF). Le cycle de !avage/cenLrifugaMondans !e même tampon a été répété deux fois, et les surnageant éliminés. Après sonicabon (5s à 209/o d'intensité sur sonicateur Branson) permettant une homogénéisation, 100pLdu !ysatobtenu ont été pipehësdans !es puits B3 et B4 d'une microplaque noire (96 puits). Un échantillon de ^contrô!e négatif » (n'exprimant pas !e récepteur E(SFR) a été préparé de manière similaire mais à partir d'une tumeur elle-même obtenue par xenogreffesde cellules H2 surunesouris. 100pLdu !ysotobtenu ont été pipetés dans chacun des puits B1 et BZ de !a rnicrop!aque noire de façon à constituer un témoin négatif. [}ans !es puits adjacents ont été déposés également du tampon seul (BT: blanc tampon) et 100pL de solutions diluées du mélange d'anticorps REGF01-d2 Ab15-Lurni4Tb® (tampon d'incubation) obtenus par dilution en cascade au Yz (dans !e tampon HEPES 0,196 8SA) de façon à obtenirune gamme de concentration finale en anticorps marqués allant de 0,16 ny4 à s nM (puits A3 à Al2). On a ensuite mesuré successivement en mode fluorescence (« prompt fluorescence * délai = O ; durée de mesure après délai = 20 ps\ sur un appareil TECAN Saphir 2 en excitant l'accepteur (d2) à 640 nrn et en lisant !a fluorescence émise à 665 nrn, puis !a fluorescence en mode temps résolu simultanément à 620 nm (Lumi4Tb@ 665 nm (délai = 60 ps ; durée de la mesure après délai = 400 ps) sur un appareil Pherastar (excitation par lampe flash) après excitation à 340 nm. Les mesures en mode fluorescence à 665 nm (F665) des puits de la gamme (0,16 nM à 5 nM) permettent d'obtenir une droite étalon reliant la fluorescence corrigée pour chaque puits par soustraction de la fluorescence du tampon seul {B665) : F665c = F665-B665 (voir figure 1) Par interpolation on obtient la concentration en anticorps liés au matériel biologique. Tableau 1 Cellules H2 Cellules P1 (hEGFR) (pas d'hEGFR) F665c 28 070 28 080 45 370 45 200 Ac-d2 2,8 2,8 4,6 4,6 (nM) Le rapport du signal spécifique (fixation REGF01-d2 sur EGFR) sur le signal du contrôle négatif est de 4,6 / 2,8 = 1,64, ce qui est un rapport signal/bruit relativement faible. De la même façon les mesures en mode TRF à 620 nm des puits de la gamme (0,16 nM à 5 nM) permettent d'obtenir une droite étalon reliant la fluorescence corrigée pour chaque puits par soustraction de la fluorescence du tampon seul (B620) : E620c =E620-B620 (voir figure 2). Tableau 2 Cellules H2 Cellules Pl (hEGFR) (pas d'hEGFR) E620c 33 930 33 300 115 500 114 100 Ac~umi4 Tb 0,80 0,79 2,73 2,70 (nM) Le rapport du signal spécifique (fixation Ab15-Lumi4Tb R sur EGFR) sur le signal du contrôle négatif est de 2,72 / 0,8 = 3,4, ce qui est également relativement mauvais. On mesure la plaque en mode TRF simultanément à 620 nm (luminescence du 25 donneur Lumi4Tb®) et 665 nm (luminescence de l'accepteur d2). 18 Pour !a gærnrne de ca!ibration on obtient !es valeurs suivantes, reportées dans !e tab!eau3. Tableau 3 0,16 / 0\63 ! 1,25 2, E620 6 650 13 200 27 270 53 600 106 450 210 700 E665 / 609 150 ~ 236O / 4630 ~ 926O ~ 18250 5 On trace !e graphe représentant E665 = h,E620>, et on obtient une droite dont !a pente permet de calculer !a contribution de l'émission résiduelle du terbium à 665 nm à partir du signal mesuré à 620 nm pour les échantillons H2 et Pl qui est nommé B665 dans le tableau suivant. 10 On calcule !e signal de FRET restitué à 665 nm en calculant !a différence entre le signal à 665 nm (E665c) et l'émission résiduelle du terbium dans le canal 665 nm : ù665 = E665c-BG6S. Dans !e tableau ci-dessous H460ccorrespond à !æ fluorescence à 460nm du composé 15 Hoechst 33342, mesurée en mode fluorescence classique. Tableau 4 Cellules H2 Cellules Pl (hEGFR) (pasd'hE(SFR) E665 4040 4060 169 700 164 200 E665c 3O75 390U 16956O 64 060 B665 2920 286O 994O 9 8100 A665 960 1035 15963O 15425O H'#60c 3Z300 ~4 100 76~O 6027O A665N 297 303 27 699 25 593 A665N moyen 300 26 646 Le rapport du signal spécifique obtenu selon !'invention (fixation RE(SF01-d2et Ab15-Lurni4Tb® sur E(SFR) sur !e signal du contrôle négatif est de 26646 / lOO = 89, ce qui 20 est excellent. Cet exemple montre que la méthode selon l'invention permet d'obtenir un excellent rapport signal / bruit (facteur 89) alors que l'utilisation d'un seul anticorps marqué ne 19 permets d'obtenir qu'un facteur de 3,42, au mieux, entre le signal spécifique et le bruit de fond. ExernpleZ 5 Dans !es puits d'une plaque de rn!croUtrabon (plaque noire 96 puits fond plat) des cellules de !a lignée A431 (ATCC/CAL-1555 exprimant environ I103 récepteurs E(SFA par cellule (Sch!essinger 2004 PNAS, 929) ont été distribuées à une densité de 25 OOO cellules par puits et incubées une nuit à 37 °C en milieu OMEM de façon à obtenir un tapis de cellules adhérentes. 10 Après deux lavages par 100pLde PBS, 50pLde tampon KREBS ont été ajoutés par puits. [Tampon Knebs/HEPES rnrno!/L: NaC! 99 ; KC!4,69 ; Ca[!z 1,87 ; MgSO+ 1,2 ; K2HPO4 1,03 |NaHCO3 25 ; Na-HEPES 20 +g!ucose 11,1 rnM + 0,196 B5ApH 7,4]. Dans !es puits Al à A4 aucun autre réactif n'a été ajouté (blanc tampon). Dans !es 15 puits A9 à Al2 ont été ajoutés 10pLd'EGF 1pM dans du KREBS (pour saturer les sites de liaison à !'EGF), puis dans !es puits A5à Al2 un mélange d'anticorps Ab1O'd2 (anti-EGFRAb1OTherrno Fisher5cientific marqué par du d2-NHS Cisbio Bioæssoysà un RMF = 1,8) et d'EGF-Lurni4 Tb (Osbio Bioæssays). Le volume de choque puits a été complété à 100pL par du tampon KREBS de façon à obtenir une concentration finale 20 dans !es puits de 5 nM en Ab10-d2 et 5 nM en EGF'Lurni4Tb. Dans des puits de !a nnêrne plaque de nnicrotitraUon, une gamme étalon a été constituée par dilution dans du tampon KREBS d'une solution mère contenant E(5FLurni4TbetAb1U-d2 (dilution en cascade au Y2 de façon à obtenir des concentrations finales en Ac de 1 nM à 0,031 nM). Une lecture en mode temps résolu a été effectuée sur un appareil PhenastarF5 (BMG) en utilisant les paramètres suivants : Nombre de flashes par puits 300 Module optique: HTRF Excitation nm) 337 Ernission A (nrn\ 665 Ernission B(nnn) 620 Début de l'Intégration [psi: 60 Durée de l'Intégration [ps]: 400 Hauteur de focalisation 3.9 [rnrn]: 10 000 Ratio multiplicateur: 20 Source Lumineuse: lampe flash Les valeurs d'émission E620cobtenues (après soustraction de la valeur du blanc B620 mesuré sur !es puits Al et A2 contenant uniquement du tampon) ont été reportées dans le tableau suivant. 0,031 ~ 0,06 3 ~ 0,125 ~ 0,25 ~ 0, 634 ! 930 ! 1490 ~ ~050 ) 5 500 ~ 1O 85O Le graphe E620c = f (EGF-Lurni4 Tb) o permis d'obtenir la correspondance entre E620c et !a concentration en nM de !'EGF-Lurni 4Tb (voir figure 3). lO La plaque a été incubée 4 heures à IOoC (à l'obscurité), avant l'ajout de 10 pL de Hoechst 33342 (solution 2rng/rnl en DMSO prédiluée extemporanément au 1/100è' dans du KREBB) dons !es puits A3 à Al2 et incubation pendant 1 heure supplémentaire à 20«[. Tous !es puits ont alors été lavés par4 fois 100pL de tampon KREBS et 100pL du rnênne tampon ajouté dans chaque puits. Une lecture de 15 fluorescence en temps résolu a été effectuée avec !es nn&nnes paramètres que ci-dessus. Tableau 6 Pas d'EGF ajouté U f EGF y100nM final) E620c 870 4 710 390 3 280 1 180 340 770 910 3 810 1 050 moyen EGF- Lumi4Tb 0,348 0,096 n ^ Les pu itsdans lesquels de !'E(SF (100 nM final) a été ajouté pour saturer !es sites de 20 liaison des récepteurs EGFR exprimés par !es cellules (puits A9 à Al2), ont permis d'obtenir une valeur de fluorescence E620c (moyenne = 1050 UFA) qui représente le bruit de fond correspondantà !a fixation non spécifique de !'EGF marqué au Lumi4 Tb sur !es cellules. Grâce à !m droite d'étalonnage il æ pu être évalué que !a fixation d'EGFLurni4 Tb est de !'ordre de 0,096 nM. La fixation spécifique d'EGF-Lurni4 Tb sur !es 25 cellules (puits A5à A@\ est de l'ordre de 0,348 nM . Le rapport signal/bruit lorsque un 21 seul ligand du récepteur d'intérêt est utilisé (EGF-Lumi4Tb) est donc de 3,6 ce qui est relativement faible. Pour tenir compte de !a variabilité du nombre de cellules dans !es puits (due 5 notamment au décollement des cellules suite aux lavages) une normalisation utilisant le signal du Hnechst 33342a été effectuée en divisant le signal E620c par la valeur de Ouorescenceà 460nrn mesurée en mode fluorescence ^classique ^ pour le complexe Hoechst/ADN dans chaque puits (et en multipliant par 100 000 pour obtenir des nombres entiers). 10 Tableau 7 H460c i 67 380 ~ QA 330 7959O ~ 1O6300 ~ 82 990 ~09 800 ! 74 400 ! 88 000 E620N 750 4 740 4 250 090 420 1 220 040 E620N moyen ~ 446O ~ 1 180 Le rapport signal/bruit est de 3,78 après normalisation des valeurs par !e signal du Hoæchst 33342, ce qui est également relativement faible. 15 Mesure de la fixation de l'Anticorps marqué (AblO-d2): D'après !o fiche technique du fabriquant, !Y\b1Osefixe surun épitope proche du site de liaison de !'EGFR car cet anticorps perturbe !a liaison de !'EGF sur !'EGFA. L'ajout d'EGF en excès doit également perturber la fixation de l'anticorps ce qui permet d'estimer la liaison non spécifique de cet anticorps en ajoutant un excès d'EGF. 20 Des mesure de fluorescence ont été effectuées en mode fluorescence en excitant !'accepteur à 640 nrn et en mesurant son émission (« prompt fluorescence ») à 680 nrn (compte-tenu de !a largeur de bande des filtres on est en droit d'assimiler les mesures faites avec un filtre ^66S nrn^ et *68O nrn» comme étant, dans les deux 25 cas, une mesure correspondant au canal ^ accepteur ») No. de flashes par puits 100 Module Optique: FI 640 680 Excitation (nm) 640 Ernission (nno) 680 Gain 2459 ZZ Les mesures E680caprès soustraction du blanc tampon rneauréà 680 nm ont permis d'obtenir !es concentrations en nM d'anbcorps fixé sur !es cellules en utilisant une gamme de ca!ibnzhon d\Ab1O-d2 (1nM à 0,031 nM)Tableau 8 6 7 0 1 2 pas d'EGF 'muté U f-EGF (100wM fima E680c 02 800 ! 105900 ! 71 500 ! 91 500 ! 54 7~` ~^ `~~ E680c moyen 92 950 59 180 AblO-d2 ! 6,74 ~ 4,29 ! Le rappo/tsignaVbruit lorsque un seul ligand du récepteur d'intérêt est utilisé (Ab1O-d2) est donc de 1,58, ce qui est relativement faible Mesure de la fixation des sondes fluorescentes par lFR-FRET : 10 De façon analogue, !es signaux à 620 nrn et à 665nm ont été mesurés en mode temps résolu dons !es puits contenant des dilutions d'EGF-Lurni4 Tb et dY\b1O-d2 (1ny4 à 0,031 nM). Tableau 9 5 634 ! 930 ~ 149O ~ 3 050 13 ~ 43 ~ 106 ~ 220 ~ 466 ~ 1210 15 La droite de corrélation entre E665c e{ E620c permet d'obtenir !a contribution de l'émission du terbium dans !e cana! 665nrn : E665 = 0.102 x E620, ce qui permet d'obtenir les valeurs B665 correspondant à la contribution de l'émission du terbium. rassemblés dans le tableau suivant, dans lequel A665 = E665c - B665. Tableau 10 Pas d'EGF ajouté ! fEGF y100n Üna E665c 2 060 2 390 600 1 860 390 4-80 290 320 B665 0 345 5 120 137 79 9 A665 1 660 910 260 20 270 340 215 223 moyen 1 588 262 Les résultats des mesures à 665nrn en temps résolu (paramètres ci dessus) ont été 20 23 Dans ce cas le signal obtenu à 665nnn représente le signal émis parl'accepteur (Ab1O-d2) excité par FRET avec !e donneur (EGF-Lunni4Tb). Le rapport signal/bruit lorsque !a méthode selon !'invention est mise en oeuvre, c'est- 5 à-dire en utilisant deux ligands marqués par des partenaires de FRET, est de 6,0, cc qui plus élevé que ce qui est observé avec le ligand marqué seul ou l'anticorps marqué seul. Pour tenir compte de !a variabilité du nombre de cellules dans !es puits, une 10 normalisation utilisant le signal du Hoechst3]342 a été effectuée en divisant le signal A665 par !a valeur de fluorescence mesurée à 460nm en mode fluorescence «classique » pourle complexe Hoechst/ADN dans chaque puits (et en multipliant par 100 000 pour obtenir des nombres entiers). Tableau 11 , T Pas d'EGF ajoute 6 7 ! 8 9 660 ! 1910 ! 1260 ! 1 67 380 99 330 1 79 590 1 0 -- 4~ ." . 2463 ~ 1923 ~ 1583 ~ 1 520 ! 270 i 6 300 82 990 ~ ~ . l4jU ! ]Z5 EGF y100nM fima 15 Le rapport signal/bruit esialors de 6,24, donc plus élevé que ce qui est observé avec le ligand marqué seul ou l'anticorps marqué seul. Exemple 3 20 Dans !es puits d'une plaque de rnicrotitnation (plaque noire 96 puits fond plat) des cellules de !a lignée A431 (ATC[/CRL-1555 exprimant environ 2.103 récepteurs E{SFR par cellule (Gch!essinger 2004 PNAS, 929) ont été distribuées à une densité de 25 000 cellules par puits et incubées une nuità 37 »[en milieu DMEM de façon à obtenir un tapis de cellules adhérentes. 25 On a lavé par 2x 100pL PBS puis ajouté 50pL de tampon KREBS par puits. [TarnponKrebs/HEPES nnrnoVL: NæO9Q ; KO4,69; [aC!z 1,87 ; MgSC4 1,2 ; K2HPO4 1,03 ;NaH[03 25 ; Na'HEPES 20 +g!ucose 11,1 rnM + 0,1% 8SApH7,4] 24 Dans !es puits B1 à 84 aucun autre réactif n'a été ajouté (blanc tampon). Dans !es puits B5à B8 a été ajouté un mélange d'anbcorpsAb1O-d2 (anti-E(SFRAb1OThernno Fisher Scientific marqué par du d2-NHS Cisbio Bioassays) et du [etuxinnab-Lunni4Th (ant/'EGFR) et !e volume complété à 100pL par du tampon KREBS de façon à obtenir une concentration finale dans !es puits de 5 nM en Ab1O'd2 et 5 nM en Cetuxinnab-Lumi4 Tb. Dans des puits de !a rnêrne plaque de nnicrodtration, une gamme étalon a été constituée par dilution dans du tampon KRE8S d'une solution mère contenant EGF- 10 Lurn!4Tb etAb1U-d2 (dilution en cascade au Y2 de façon à obtenir des concentrations finales en Ac de 1 nM à 0,031 nM). Une lecture en mode temps résolu o été effectuée sur un appareil PherasLarFS (BMG) en utilisant les paramètres suivants : Nombre de flashes par puits 300 Module optique: HTRF Excitation (nm) 337 Ennission A (nrn) 665 Ernission B (nnn) 620 Début de l'Intégration [psi: 60 Durée de l'Intégration [psi: 400 Flauteur de focalisation [m 3,9 Ratio multiplicateur: 10 000 Source Lumineuse: lampe flash 15 Pour évaluer !a fixation non spécifique des anticorps à !a surface des cellules, des cellules CHO (Chines Hamster Ovary) ont été incubées avec la même solution d'anticorps marqués, !es puits ont été lavés et !a fluorescence mesurée dans les mêmes conditions. ZU Après lavage, !e signal moyen émis parCetuxinnab-Lurni4Tb seul est de 24 033 UAF (unités arbitraires de fluorescence) pour !es cellules A431 et de 1 170 UFA pour !es cellules CHO, soit un rapport signal/bruit de 21. Lorsque !a méthode selon l'invention est mise en oeuvre et que l'on mesure !e signa! 25 de FRET, on obtient un rapportsigna!/bruit bien meilleur, d'environ 520.