Brevet FR2977589A1 — publié le 20130111

Culture et détection d'une Archaea méthanogène La présente invention concerne une nouvelle Archaea isolée et établie en culture, un milieu de culture de ladite Archaea, un procédé de préparation dudit milieu de culture et des procédés de culture et de détection de ladite Archaea. Les Archaea sont des procaryotes constituant un des quatre domaines de la vie au côté des eukarya, des bactéries et des virus géants à ADN [16]. Initialement isolées de l'environnement et en particulier des environnements extrêmes qui leur ont valu leur nom de extrêmophiles, les Archaea ont ensuite été détectées chez différents animaux invertébrés et vertébrés comprenant notamment les oiseaux et les mammifères. Chez les mammifères, ce sont les Archaea méthanogènes capables de détoxifier l'hydrogène avec synthèse du méthane qui ont été essentiellement détectées et ces Archaea ont donc une importance considérable actuellement puisqu'il est considéré que l'émission de méthane par les bovins de rapport constitue la source essentielle de destruction de la couche d'ozone dans l'environnement. Chez l'homme également, les analyses méta génomiques ont montré la présence de signatures ADN spécifiques de plusieurs espèces d'Archaea qui appartiennent essentiellement aux deux phyla Euryarcheaota et aux Archaea halophiles ; plus particulièrement, les séquences détectées chez l'homme indiquent la présence de Methanosarcina, Thermop/asma, Crenarchaeaota, et des Archaea halophiles ainsi qu'un dernier ordre de méthanogènes 1 à 6). Parmi toutes ces Archaea, seules trois espèces d'Archaea ont été isolées chez l'homme : Methanobrevibacter smithü [7J, Methanosphaera stadtmaniae [8], et Methanobrevibacter ora/is [9] et seuls M. smithii et M. stadtmanae ont été isolées à partir du tube digestif. Chez l'homme, ces Archaea méthanogènes participent à l'homéostasie de la flore digestive en détoxifiant l'hydrogène avec production de méthane et participent donc à la régulation du pH. Egalement, certaines Archaea sont impliquées en pathologie orale en infection polymicrobienne au cours des parodontopathies. Il a été montré que le portage digestif d'Archaea méthanogènes était constant chez tous les individus [12], et les travaux antérieurs par études métanogénomiques et par analyses moléculaires de la flore digestive humaine, montraient une prévalence d'Archaea d'environ 30 % des individus testés et une variété de séquences ADN explicitée ci-dessus. Pour isoler M. smithii, les auteurs (7) ont utilisé un échantillon de matières fécales inoculées dans du milieu 1 de Balch (composition indiquée dans le Tableau 3 ci-après) [10], sous une atmosphère de H2-CO2 (80 : 20) pressurisée à 2 atmosphères (202.6 kPa), sous agitation. Après 2 à 3 h, des échantillons de 0.5 ml de l'atmosphère ont été analysés pour détecter la présence de méthane par chromatographie en phase gazeuse. Des isolats producteurs de méthane et fluorescents pour le facteur-420 (comme déterminé par microscopie en épifluorescence) ont été sous-cultivés sur le milieu 1 de Balch additionné de 2 % d'agar jusqu'à ce qu'une culture pure ait été obtenue; les critères de pureté étaient la morphologie uniforme des cellules, la production de méthane, la fluorescence factor-420 de toutes les cellules et l'absence de croissance dans un milieu complexe (SMS) contenant des hydrates de carbone sans substrat pour la méthanogenèse. Pour isoler M. stadtmanae, les auteurs (9) ont utilisé un milieu de culture E1 (Tableau 4) modifié par l'addition de fluide de rumen à 30% (v/v), de clindamycine et de céphalothine, respectivement, de 0.4% méthanol et d'une atmosphère composée de N2,80% et CO2, 20% . La culture a été maintenue par des transferts mensuels (10% vol.) dans le même milieu. Une morphologie sphérique brillante par fluorescence du facteur 420 était le morphotype dominant. Au jour 60, la culture a été sous-cultivé dans le milieu 1 de Balch modifié par ajout de fluide de rumen, NH4C1, cepthalothin et clindamycine (7) avec du méthanol sous une atmosphère de 80% H2 : et CO2, 20%. Une culture pure d'une Archaea sphérique-méthanogène, a été obtenue. Pour isoler M. ora/is, les auteurs ont utilisé sensiblement le même milieu de culture que celui utilisé pour isoler M. smithii (9). Les Archaea constituent des microorganismes d'intérêt médical et vétérinaire compte tenu de leur rôle en physiologie et éventuellement en pathologie . Le but de la présente invention était donc d'isoler et d'établir en culture une nouvelle Archaea dont l'existence avait été présumée dans la flore digestive chez l'homme par des travaux antérieurs (12). Pour ce faire, les inventeurs ont déterminé les milieux et conditions spécifiques d'isolement et culture de ladite Archaea ce qui leur a ainsi permis de disposer suffisamment d'ADN de ladite Archaea pour en déterminer la séquence complète du gène 16S ADNr et confirmer ainsi sa spécificité et la nouveauté de ladite Archaea. Plus précisément la présente invention fournit une nouvelle Archaea isolée et établie en culture, comprenant la séquence spécifique du gène 16S ADNr (ADN ribosomal) SEQ. ID. n°1 dans le listage de séquences que les inventeurs ont dénommée Methanomassi/iicoccus /uminyensis Plus particulièrement la présente invention a pour objet une Archaea déposée à la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne), conformément au Traité de Budapest, sous le numéro DSM 24529 le 23 Juin 2011, par l'Université de la Méditerranée, faculté de médecine Timone, Marseille, France. Cette nouvelle Archaea n'a pas pu être isolée et établie en culture à l'aide des milieux et conditions de culture précédemment décrites pour les Archaea précédemment isolées et établies en culture, y compris pour les Archeae méthanogènes. La présente invention a également pour objet un milieu de culture stérilisé utile pour la culture d'une Archaea selon l'invention comprenant un milieu de base de culture d'Archaea méthanogène, caractérisé en ce qu'il comporte en outre : a- du méthanol, et b- un sel de tungstène et/ou un sel de sélénium. Les inventeurs émettent l'hypothèse sans être liée par cette théorie, que le méthanol intervient ici comme accepteur d'électrons et les sels de tungstène et sélénium comme cofacteur d'une enzyme intervenant dans le transfert d'électrons. De préférence, ledit milieu de culture comprend : a- du méthanol, et b- un sel de tungstène et un sel de sélénium. Selon d'autres caractéristiques particulières : - le méthanol est présent à une concentration de 1 à 100 mM, de préférence 10 à 50mM;et - ledit sel de tungstène est un tungstate de sodium, et - ledit sel de sélénium est un sélénite de sodium, et - ledit sel de tungstène est présent à une concentration 0,3 à 3 M, de préférence 0,5 à 1,5 M; et - ledit sel de sélénium est présent à une concentration de 0,2 à 2 M, de préférence 0,5 à 1 M. Dans les valeurs de concentration ci-dessus : 1 .M = 1 mol/I Plus particulièrement, ledit milieu de base de culture d'Archaea comprend au moins : - plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisie parmi un extrait de levure, un sel d'acétate et une peptone trypsique, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate, - une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, - au moins un sel de chacun des métaux K, Mg, Na et Ca, - une substance réductrice, plus particulièrement choisie parmi la cystéine-HCI et Na2S, - une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 8, - des oligoéléments, de préférence des sels choisis parmi des sels de B, Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Ni et Mo, de préférence encore des oligoéléments de Widdel, - des vitamines, de préférence les vitamines du milieu de Balch, et - de préférence, une substance colorante de contrôle de l'anaérobie, de préférence la résazurine. Les oligoéléments de Widdel sont listés au tableau 6 et comprennent : FeCIZ, CoCIZ, MnCIZ, ZnCIZ, H3BO3, Na2MoO4, NiCIZ et CuCIZ. Les vitamines du milieu de Balch comprennent la biotine, acide folique, hydrochlorure de pyridoxine, hydrochlorure de thiamine, riboflavine, acide nicotinique, pantothénate de DL-calcium, vitamine B12, Acide p-aminobenzo que, acide lipoique. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture selon l'invention contient undit milieu de base comportant les espèces suivantes : KH2PO4, MgSO4, NaCl, NH4CI, CaCl2.2H20, NaCOOCH3 (Na acétate), cystéine, extrait de levure, trypticase peptone, NaOH, Na2S, NaHCO3 ( Na carbonate), NaHCOZ (Na formate),Na2SeO3, Na2WO4.5H2O et de préférence résazurine, des oligoéléments de widdel, des vitamines de Balch, le pH étant ajusté à 7.5 avec du KOH. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture comporte outre ledit milieu de base: a- du méthanol à la concentration de 10 à 100 mM, de préférence 40 mM, et b- un sel de Nat SeO3 à une concentration de 1 à 10 mg/I, de préférence 2 mg/L, et c- un sel de Na2WO4 .5H20 à la concentration de 1 à 10 mg/I, de préférence 4mg/L. Le milieu de culture selon l'invention peut se trouver à l'état liquide auquel cas il comporte de l'eau distillée ou dans un état lyophilisé apte à être régénéré par ajout d'eau distillée ou encore à l'état solide, notamment sous forme gélosée, plus particulièrement par ajout d'agar, plus particulièrement agar à 2% final. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture stérilisé selon l'invention caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles: 1- on stérilise dans un autoclave un dit milieu de culture d'Archaea incomplet ne contenant pas les composants susceptibles d'être dégradés dans un autoclave comprenant le méthanol, lesdites vitamines, les sels de sodium labiles comprenant NaHCO3, NaHCOZ et NaZS, de préférence dans un autoclave à une température supérieure de 120°C pendant au moins 15 mn, ou une température de 110°C pendant au moins 45 minutes, et 2- on chasse l'oxygène, de préférence en portant ledit milieu de culture à ébullition sous une atmosphère d'azote, et 3- on place ledit milieu de culture stérilisé incomplet sous une atmosphère d'anaérobie, et 4- On le refroidit à température ambiante et on ajoute dans ledit milieu de culture incomplet, lesdits composants susceptibles d'être dégradés par stérilisation dans un autoclave comprenant le méthanol, les dites vitamines, sels de sodium labiles comprenant NaHCO3, NaHCO2 et NaZS. La présente invention a également pour objet un procédé de culture d'une Archaea avec un milieu de culture selon l'invention dans lequel on réalise les étapes successives suivantes : 1- on inocule un échantillon biologique susceptible de contenir une dite Archaea dans ledit milieu de culture en anaérobie, de préférence sous atmosphère d'azote, et 2- on place ledit milieu de culture sous une atmosphère d'anaérobiose et contenant au moins 50% d'hydrogène à une pression inférieure à 2 atm, et 3- on réalise une incubation à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C pour atteindre une phase exponentielle de croissance avec dégagement de méthane en au moins 5 jours, de préférence en pas plus de 15 jours, de préférence encore pas plus de 10 jours. De préférence, à l'étape 2 ledit milieu de culture est placé sous une atmosphère composée HZ/CO2 dans une proportion volumique de 80/20 à une pression de 1 atm. Les milieux et procédé de culture ci-dessus ont permis d'établir en culture ladite Archaea c'est-à-dire que celle-ci peut ainsi être sous cultivée indéfiniment. Plus particulièrement, il est possible d'obtenir une culture en phase exponentielle de croissance en pas plus de 15 jours, de préférence de 5 à 10 jours, cette phase de croissance se caractérisant par: (1) une production de méthane d'au moins 10 pM, tel que déterminé par chromatographie en phase gazeuse ,et (2) une visualisation au microscope à fluorescence de microorganismes sphériques d'une taille de 0,5 à 1 pm, et auto fluorescents à 420 nm. Plus particulièrement, on réalisera les sous-cultures par repiquage de 1/5 à 1/10 de la culture en dite phase de croissance. Il y a lieu d'observer que, dans les milieux et conditions de culture selon la présente invention, certaines Archaea isolées et cultivées à ce jour et notamment M. smithii ne peuvent pas être établies en culture. En revanche, il est possible que d'autres Archaea que M. /uminyensis puissent être isolées et établies en culture avec les milieux et conditions de culture selon la présente invention. Enfin, la présente invention a également un procédé de détermination de la présence d'une Archaea dans un échantillon biologique, de préférence dans un échantillon de selles animales ou humaines selon l'invention ou d'une Archaea cultivée selon le procédé de l'invention caractérisé en ce que l'on extrait l'ADN dudit échantillon biologique et on détecte et de préférence on quantifie spécifiquement l'ADN de ladite Archaea par amplification enzymatique du type PCR de préférence du type PCR en temps réel avec un couple d'amorces et de préférence une sonde de séquences tirées du gène 16S ADNr de séquence SEQ.ID N°1. Plus particulièrement, ledit couple d'amorces et de préférence ladite sonde présentent les séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr: Amorce 5' directe :SEQ.ID. N° 2 = 5'-GTTCGTAGCCGGTCTGGTAA-3' Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 3 = 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3' Sonde : SEQ.ID. N° 4 = 5'-TCGGGAAGCTTAAC 1 I I CCGACTTCC-3. Plus particulièrement encore, on réalise au préalable une amplification enzymatique du type PCR spécifiquement de l'ADN de toutes Archaea contenues dans ledit ADN extrait de l'échantillon avec un couple d'amorces consensus de séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr Amorce 5' directe :SEQ.ID. N° 5 =5'-AGCCGCCGCGGTAAYAC-3' Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 6 = 5'-CYGGCGTTGAVTCCAATT-3'. Ces amorces universelles de toutes Archaea ont été initialement déterminées par les inventeurs pour permettre d'identifier et déterminer le gène 16S de l'ADNr de 10 ladite Archaea. La présente invention a donc aussi pour objet un kit de détection d'une Archaea selon l'invention pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend : - un dit milieu de culture de préférence lyophilisé ou sous forme solide, et 15 -des réactifs de mise en oeuvre d'une amplification enzymatique d'ADN de type PCR, et - des oligonucléotides constituants des dites amorces et sonde tirées de SEQ.ID.N°1, de préférence choisies parmi SEQ.ID.N°2 à 6. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la 20 lumière des exemples détaillés qui vont suivre. Exemple 1 : Technique moléculaire pour la détection de la gêne ribosomal 16S partiel de la nouvelle Archaea Methanomassi/iicoccus /uminyensis Les inventeurs ont tout d'abord mis au point une technique moléculaire basée sur la détection du gène ribosomal 16S en utilisant une technique de PCR suivie 25 d'un clonage des produits d'amplification et du séquençage des clones. Pour ce faire, l'ADN procaryote a été extrait selon une procédure décrite dans WO 2010/130914 comme suit : approximativement 1 gramme de selles ont été resuspendues dans 10 ml de tampon et filtrées (Diagnostica-Fumouze-Division d'Orion, Levallois Perret, France). Le filtrat (250 ml) a été transféré dans un tube Eppendorf stérile contenant 0.3 g de billes en verre traitées à l'acide (#106 millimètre ; Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) et agitées pour réaliser une lyse mécanique à l'aide de l'instrument BIO 101 FastPrep (Qbiogene, Strasbourg, France) utilisé niveau 6.5 (à vitesse maximale) pendant 90 secondes. Le surnageant a été incubé durant la nuit à 56°C avec 180 ml de tampon T1 du kit de tissu de NucleoSpinH (Macherey Nagel, Hoerdt, France) et 25 ml de protéinase K (20 mg/ml). Après un deuxième cycle de lyse mécanique comme décrit ci-dessus, le filtrat a été incubé pendant 15 minutes à 100°C. L'ADN total a été alors extrait en utilisant le kit NucleoSpinH selon les recommandations du fabricant. L'ADN extrait a été élué dans 100 pl de tampon d'élution (15) [Dridi B et al 2009]. Pour ce faire les inventeurs ont déterminé une paire d'amorces PCR consensus ( SEQ.ID.N° 5 et 6 et tableau 1 ) permettant d'amplifier par PCR un fragment du gène 16S ADN ribosomal de toute Archaea après avoir aligné les séquences du gène 16S ADN ribosomal de 20 organismes EuryArchaeaota. Le programme d'amplification PCR comportait 95°C pendant 15 min, suivi de 45 cycles de 95°C pendant 30 secondes et 60°C pendant 1 min. Tous les échantillons d'ADN ont été examinés deux fois. Les résultats ont été exprimés en nombre de copies des gènes de 16 S ADNr par gramme de selles. La quantification de plasmide a été effectuée en insérant un fragment chimérique de nucléotide dans le plasmide de l'ACP II (kit de clonage de TA (pCRII) Invitrogen, Carlsbad, CA, Etats-Unis). Le fragment chimérique contenait des cibles de PCR en temps réel pour le gène rpoB de M. smithii et de M. stadtmanae permettant la quantification de ces deux Archaea ainsi qu'un fragment du gène 16S de l'ADN r de Streptomyces sudanensis SD504 (numéro d'accession de GenBank EF515876) comme témoin interne pour garantir l'absence d"inhibition de la PCR. Les produits d'amplification PCR ont été clonés dans des bactéries Escherichia coi/ JM109 compétentes en utilisant le vecteur pGEM-T Easy Vector System (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) et 100 colonies recombinantes ont été vérifiées pour la présence d'un insert en utilisant les amorces PCR universelles M13d/M13r (Tableau 1). Les produits de PCR ont été purifiés et séquencés en utilisant le kit BigDye terminator et le séquenceur 3130 (Applied BioSystem). Des témoins négatifs ont été utilisés pour chaque analyse. Les séquences ont été analysées utilisant le programme Seqscape (Applied BioSystem), et les valeurs de similitude étaient déterminées en utilisant le programme en ligne de BLAST de NCBI. Lors de ce travail, les inventeurs ont identifié dans quatre échantillons sur 20 échantillons analysés (soit dans 89 clones) une séquence partielle du gène 16S ADNr de 461-bp déposée par les inventeurs dans GenBank sous le numéro GenBank F3823135. Cette séquence n'a que 78.8% de similarité avec la séquence homologue du gène 16S ADNr de M. smithii. Cette similarité a été comparée en alignant la séquence F3823135 avec la région correspondante de la séquence de l'ADN 16S de M. smithii disponible dans GenBank sous le numéro U55233. L'alignement a été fait en utilisant le programme en ligne MULTALIN du pôle bioinformatique lyonnais (http://npsapbil.ibcp.fr/cgi bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_multalinan.html). En utilisant la même technique de comparaison, les inventeurs ont observé que la séquence originale GenBank F3823135 déterminée par les inventeurs présentait un pourcentage de similarité de 98.7% avec une séquence déposée antérieurement dans GenBank sous l'intitulé "human faeces clone E18_1652" et sous le numéro (F3752571); et présentait 98% de similarité de séquence avec une séquence déposée antérieurement dans GenBank sous l'intitulé "human faeces clone E20 16S1" et le numéro d'accession F3752572, ces deux séquences correspondant à un travail publié (6) par Mihajlovski et a/., 2010. Cette séquence a été identifiée comme étant une séquence de l'ADN ribosomale 16S partielle décrite dans la littérature comme représentative d'un nouvel ordre, d'une nouvelle famille, d'un nouveau genre et d'une nouvelle espèce d'Archaea détectée indépendamment par deux équipes de recherche en Irlande (1,14) et en France (5,6) sans pouvoir être isolée et cultivée. Les inventeurs ont en outre réalisé une analyse phylogénétique de la séquence partielle qu'ils ont déterminée en utilisant une analyse en maximum de vraisemblance et en traçant l'arbre phylogénétique par le logiciel PhyML. Cette analyse phylogénétique a indiqué que cette nouvelle séquence était comprise dans un groupe de séquences déposées dans GenBank par différents auteurs qui avaient obtenu ces séquences à partir de selles de différents animaux et d'autres sources environnementales, correspondant à des Archaea non cultivées et non-isolées, mais indiquant qu'il s'agissait d'un nouvel ordre d'Archaea (Figure). A partir de la mise en évidence de cette séquence indicative partielle du gène 16S ADNr d'une nouvelle espèce d'Archaea, les inventeurs ont développé une PCR en temps réel spécifique de ce clone après avoir déterminé des amorces et une sonde spécifiques de M. /uminyensis ( SEQ.ID.N° 2-4 et Tableau 1), leur permettant de déterminer la prévalence de ce clone dans un grand nombre d'échantillons de selles (500). La spécificité de ces amorces et sondes a été vérifiée expérimentalement en incorporant de l'ADN extrait à partir d'un représentant bactérien de 43 espèces de microbes habitants communs d'intestin et des microbes pathogènes entériques, y compris M. stadtmanaeet M. smithiien tant que témoins positifs ( Tableau 2). Le protocole de PCR en temps réel était le suivant. Des amorces et sondes Taqman utilisées pour la gPCR en temps réel de l'ADN bactérien total avec les amorces consensus et sondes décrites dans Dridi B. et al., PIoS ONE, 2009; 4; e7063 des amorces et sonde « all bacteria » et reprises au tableau 1. Des analyses par PCR en temps réel ont été exécutées avec un système de MX3000TM (Stratagène, Amsterdam, Pays-Bas) utilisant le kit PCR de sonde de QuantiTect (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec 5pmol de chaque amorce et de sonde marquée avec FAM ou VIC, et 5 pl d'ADN dans un volume final de 25 pl. Le nombre de copies du gène rDNA 16S a été mesuré dans une analyse duplex, et la détection d'ADN bactérien total a été employée dans la gPCR en temps réel comme témoin d'extraction de l'ADN. Ainsi, les inventeurs ont pu démontrer la présence de cette séquence du gène ribosomal 16S dans 4 % seulement des prélèvements de selles qu'ils ont analysés par PCR selon le protocole suivant: 15 min à 95°C, suivi par 50 cycles comprenant 95°C pendant 30 s, 56°C pendant 45 s et 72°C pendant 1 min; suivie d'une étape finale d'élongation de 5-min à 72°C. La séquence complète du gène 16S ADNr de la nouvelle Archaea SEQ.ID.N°1 n'a pu être déterminée qu'après l'isolement et la mise en culture pure de cette nouvelle Archaea selon l'exemple 2 ci-après et détermination de la séquence de son génome comme décrit à l'exemple 3 ci-après. Exemple 2 : Culture de l'Archaea Methanomassi/iicoccus /uminyensis Les inventeurs ont sélectionné trois échantillons de selles ne présentant pas de Methanosphaera stadtmanae et présentant par technique de PCR en temps réel, un rapport optimum entre Methanobrevibacter smithii (en concentration la plus faible possible) mesuré par le nombre de cycles de PCR en temps réel le plus grand possible et le plus petit nombre de cycles de détection de PCR en temps réel pour la nouvelle Archaea non isolée. Au cours de ce travail, les amorces, les sondes (Eurogentec, Seraing, Belgique) de M. smithii et M. stadtmanae mises en oeuvre étaient déjà décrites (15) et son sont récapitulés dans le tableau 1. La spécificité desdites amorces et sondes a été ensuite également vérifiée expérimentalement en incorporant l'ADN extrait à partir d'un représentant bactérien de 43 espèces des habitants communs d'intestin et des microbes pathogènes entériques du tableau 2. Le même protocole que précédemment a été mis en oeuvre pour réaliser une PCR en temps réel. Les amorces et les sondes Taqman utilisées pour la gPCR en temps réel de l'ADN bactérien total ont été adaptées de la méthode précédemment décrite par Palmer et collaborateurs. Des analyses par PCR en temps réel ont été exécutées avec un système de MX3000TM (Stratagène, Amsterdam, Pays-Bas) utilisant le kit PCR de sonde de QuantiTect (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec 5pmol de chaque amorce et de sonde marquée avec FAM ou VIC, et 5 pl d'ADN dans un volume final de 25 pl. Le nombre de copies du gène 16S ADNr a été mesuré dans une analyse duplex, et la détection d'ADN bactérien total a été employée dans la gPCR en temps réel comme témoin d'extraction de l'ADN. Les inventeurs ont ensuite utilisé ces trois prélèvements de selles pour tenter l'isolement et la culture de la nouvelle espèce d'Archaea méthanogène qu'ils ont 20 appelée Methanomassi/iicoccus /uminyensis Les milieux et conditions de culture d'Archaea décrites dans la littérature , notamment pour les 3 espèces humaines M. smithii , M. stadtmanae et M. ora/is entre autres n'ont pas permis de cultiver la nouvelle espèce. Une partie des nombreux différents essais de culture de ladite Archaea sont 25 rapportés ci-après. Les tentatives d'isolement de Methanomassi/iicoccus /uminyensis ont commencé par l'inoculation de 200 pL des prélèvements de selle en question dans un milieu de base comprenant des constituants décrits séparément dans la littérature pour des Archaea précédemment isolées contenant en g/L :KH2PO4 (0.3), K2HPO4 (0.3), MgCl2 30 x 6H2O (0.5), KCI (0.1), NaCl (1) NH4CI (1), CaCl2 x 2 H2O (0.1), cystéine-HCI (0.1), extrait de levure (1), solution d'oligo-éléments de Balch (2.5 ml/L), resazurine (0.001 g/L) et de l'eau distillée (qsp); le pH a été ajusté à 7 avec du KOH (10 M) avant autoclavage. Le milieu a été porté à ébullition sous N2 gaz pour éliminer le maximum d'oxygène et refroidit à température ambiante. Le milieu a été distribué dans des tubes Hungate de 5 mL ou dans des flacons en anaérobiose sous N2/CO2 (80:20, v/v) à la pression atmosphérique. Les tubes et/ou flacons sont ensuite autoclavés pendant 45 minutes à 110 °C. Après autoclavage, le milieu est supplémenté par du NaHCO3 (4 g/L), du Na2S x 9H2O (0.5 g/L), du Na-formate (2 g/L) et de 10 ml/L d'une solution filtrée à l'aide d'un filtre à 0,22 pm pour la stériliser, de vitamines de Balch (Balch et al., 1979) (10). Cette première façon de cultiver les Archaea méthanogénes a été infructueuse, puisqu'un faible dégagement de méthane n'a été observé qu'après deux mois de culture sans atteindre de phase exponentielle de croissance. A partir de ce milieu de base, les inventeurs ont testé un très grand nombre de différentes conditions de culture en tentant l'ajout de différents substrats avant ou après autoclavage. A titre illustratif, les conditions se rapprochant au milieu de l'établissement d'une culture étaient les suivantes : Condition 1 : Acétate ajouté à la concentration de 20 mM. Condition 2 : Méthanol ajouté à la concentration de 40 mM. Condition 3 : Méthanol ajouté à la concentration de 40 mM + H2/CO2 (80/20) à une pression de 2 bars car c'est la pression optimale de la majorité des méthanogènes utilisant ce substrat : H2/CO2 (80/20)- Condition 4 : H2/CO2 (80/20) à une pression de 2 bars sans méthanol. Aucune production de méthane n'a été enregistrée dans les conditions 1, 2 et tandis qu'une légère production de méthane a été détectée par chromatographie en phase gazeuse un mois après l'inoculation pour les conditions 3 et 4 sans que la culture évolue de façon remarquable. Les tubes correspondant à cette production de méthane ont été ensuite repiqués dans des roll tubes contenant le même milieu de base avec les mêmes substrats des conditions 2 et 3 c'est-à-dire en présence de méthanol que les inventeurs suspectaient alors d'être une substance nécessaire à la croissance, solidifiés avec 0.08g d'agar. Ces tubes ont été préparés selon la technique d'Hungate (13) []. Une faible production de méthane a été observée 3 mois après inoculation dans les tubes sous la condition 2 avec apparition de quelques colonies blanches de forme irrégulière. Plusieurs colonies ont été repiquées en milieu liquide, mais la production de méthane est restée faible et n'était détectable que plusieurs semaines après le repiquage correspondant à un très faible inoculum, trop faible pour permettre par exemple le dépôt de la souche dans des collections de dépôt. Il a donc été nécessaire de réaliser d'autres modifications dans le milieu de base, d'une part, et dans les substrats de supplémentation après autoclavage ou conditions de culture, d'autre part. Après un grand nombre essais avec des changements des milieux de culture et des changements de conditions de culture, les inventeurs ont pu déterminer un milieu de culture et des conditions de culture de l'Archaea Methanomassi/iicoccus /uminyensis, permettant d'obtenir une souche (clone B10T) déposée sous le numéro DSM 24529, vérifiant les conditions d'admissibilité et de viabilité dans une collection de dépôt de microorganismes selon le traité de Budapest (DSMZ Allemagne). En particulier cette souche permettait une production de méthane rapide et importante qui démarre 48 heures après inoculation et atteint son maximum entre le 5ème et le 10ème jour. Les inventeurs ont fait varier la pression et le milieu gazeux de culture. Mais surtout il a été nécessaire de compléter le milieu de base par l'addition de Sélénite et tungstate de sodium avant autoclave et addition de Méthanol (40mM) après autoclave. Les inventeurs ont donc commencé par utiliser un milieu de base contenant des constituants de bases communs à toutes les Archaea méthanogènes cultivées précédemment. Les essais ont amené les inventeurs à tester un milieu de base tiré du milieu 119 (http://www.dsmz.de, tableau 4) qui est un milieu spécifique au genre Methanobrewbacter, à titre de milieu de base, la production de méthane était plus importante que celle obtenue avec le premier milieu de base mais encore insuffisante. En particulier, les inventeurs ont testé l'ajout d'une solution de Sélénite et tungstate de sodium sur plusieurs milieux de base précédent sous différents milieux atmosphère gazeuse et pression notamment à 1, 2 et 2,5 bars. Seuls les milieux additionnés de Sélénite et tungstate de sodium sous une atmosphère contenant plus de 500/0 d'hydrogène à une pression inférieure à 2 bars ont donné une production de méthane détectable en seulement 7 jours après inoculation. Le milieu 119 complémenté par du méthanol et les sels de tungstène et sélénium et conditions de culture ci-dessus permettait d'établir la nouvelle Archaea en culture. Le milieu de culture optimal dérivé du milieu 119 contenait en g/L: KH2PO4 (0.5), MgSO4 x 7H2O (0.4), NaCl (5), NH4CI (1), CaCl2 x 2 H2O (0.05), Na-acétate (1.6), cystéine-HCI (0.5), extrait de levure (1), trypticase peptone (1), solution d'oligo-éléments de Widdel (1 ml/L), 2 mL/L de solution de Sélénite-Tungstate (NaOH 0.4 g/L, Na2SeO3 2 mg/L, Na2WO4.5H2O 4 mg/L), resazurine (0.001 g/L) et de l'eau distillée (qsp); le pH est ajusté à 7.5 avec du KOH (10 M) avant autoclavage. Le milieu est porté à ébullition sous N2 gaz pour éliminer le maximum d'oxygène et refroidit à température ambiante. Le milieu est distribué dans des tubes Hungate de 5 ml ou dans des flacons en anaérobiose obtenue par le mélange N2/CO2 (80:20, v/v) à la pression atmosphérique. Le rajout d'un mélange N2+CO2 dans des cultures de microorganismes permet, de façon connue, d'établir l'anaérobiose et fournir le CO2 aux anaérobies qui le métabolisent comme source de carbone. Les tubes et/ou flacons sont ensuite autoclavés pendant 45 minutes à 110 °C. Après autoclavage, le milieu est supplémenté par du NaHCO3 (4 g/I), du Na2S x 9H2O (0.5 g/L), du Na-formate (2 g/I) et de 10 ml/I d'une solution de vitamines de Balch (Balch et al., 1979); enfin, le méthanol est rajouté (40 mM) avec un mélange gazeux composé de H2/CO2 (80/20) à une pression de 1 bar seulement constituant l'atmosphère à la surface de la culture Le mélange gazeux composé par du H2/CO2 (80/20) à 1 bar de pression est introduit dans la culture en barbotage par une aiguille stérile jusqu'à disparition totale des bulles, le contenu du tube est alors à 1 bar de pression de H2/CO2 (80/20). Une fois inoculé (100/0 vol), le milieu est incubé à 37°C sous agitation. La production de méthane démarre 48 heures après inoculation et la phase exponentielle de croissance est atteinte entre le 7ème et 10ème jour après l'inoculation. Cinq souches de cette Archaea ont été établies en culture dans des conditions autorisant leur dépôt en collection, à savoir la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne) sous le numéro DSM 24529 dans les conditions de viabilité et accessibilité conformes au traité de Budapest. Cette souche peut être cultivée et sous-cultivée par repiquage de manière indéfinie dans le temps, par repiquage de 1/5ème d'une culture, chaque sous-culture arrivant en phase exponentielle avec dégagement de méthane d'au moins 10 pM et possibilité de visualisation au microscope des Archaea de forme sphériques de 0,5 à 1 microns au bout d'au plus 15 jours, en pratique au bout de 5 jours. Le dégagement de méthane peut être quantifié par une méthode appropriée par chromatographie en phase gazeuse, notamment telle que décrite dans BARREDO et al. [18]26 Ladite Archaea présente une morphologie sphérique de plus petite taille que 15 les autres Archaea M.smithii et M.stadtmanae. Exemple 3 : Séquence du gène 16S de l'ADNr complet de M. /uminyensis La nouvelle souche d'Archaea M. /uminyensisa été inoculée dans un volume de 250 mL du milieu de culture liquide et cultivée jusqu'à obtention d'une culture visible à l'oeil nu sous forme d'un trouble du milieu, l'ADN a été ensuite extrait comme 20 précédemment décrit [15] à partir du culot obtenu par centrifugation de la culture à 13,000 rpm pendant 15 min à température ambiante. Le séquençage de l'ADN génomique de M. /uminyensis a été réalisé par pyroséquençage à l'aide d'un appareil 454-Roche GSFLX comme décrit précédemment [17]. Les inventeurs ont pu ensuite extraire des contigs de la séquence complète du génome de M. /uminyensis, la 25 séquence complète SEQ. ID. n°1 du gène 16S rADN de M. /uminyensis, de 1 434 pb, telle que décrite dans le listage de séquences annexé à la description. Tableau 1 : Organisme(a) Cible Séquence (5'-3') des amorces et sondes (bp) M. sinithi/ 16S rDNA Smit.16S-740F, 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTC-3' 123 M. stadtmanae 16S rDNA Smit.16S-862R, 5'-CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' FAM (MGB) 97 Smit.16S FAM, 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG-3' Stadt 16SF, 5'-AGGAGCGACAGCAGAATGAT-3' M. /uminyensis 16S rDNA Stadt_16SR, 5'-CAGGACGCTTCACAGTACGA-3' FAM (Tagman) 79 Stadt_16SFAM, 5'-TGAGAGGAGGTGCATGGCCG-3' B10-dir, 5'-GTTCGTAGCCGGTCTGGTAA-3' bacteria consensus 16S rDNA B10-rev, 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3' VIC (Tagman) 327 B10-VIC, 5'-TCGGGAAGCTTAACTTTCCGACTTCC-3' Bact 8FM, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' Bact515R, 5'-TTACCGCGGCKGCTGGCAC-3' VIC (Tag man) Bact338K, 5'-CCAKACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' Archaea consensus(b) 16S rDNA TArchaea2-dir, 5'-AGCCGCCGCGGTAAYAC-3' 461 T Insert amplification(`) 16S rDNA Trrchaea-rev2, 5'-CYGGCGTTGAVTCCAATT-3' N730 M13d, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' M 13r, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' Tableau 2 : Liste des microbes testés Espèces Bacteroides fragi/is Salmon//a enterica arizonae Streptococcus pyogenes Lactococcus p/antarum Shige//a boyd// Streptococcus ga//o/yticus Enterococcus faeca/is Klebs/e//a oaytoca Pseudomonas aeruginosa Streptococcus entericus Staphy/ococcus aureus Geme//a morbi//orum Corynebacterium jeikeium Enterococcus ga//inarum Bacteroides thetaiotaomicron Streptococcus ora/is Enterococcus faecium Streptococcus aga/actiae Acinetobater haemo/yticus K/uyvera ascorbata Klebs/e//a pneumoniae Mycobacterium avium Enterobacter cancerogenus Yersinia entero/itica Enterobacter cloacae Mycobacterium tubercu/osis Pro videncia stuartii Ha/obacter/um sp Proteus mirabi/is Methanosarc/na acetivorans Propiombacterium acnes Su/fo/obus so/fataricus Bifdobacterium Aeropyrum pern/x Escherichia hermanii Methanobrevibacter ora/is Citrobacter freundii Methanobrevibater smithii Citrobacter koseri Methanosphaera stadtmanae Escherichia col/ Camp//obacter jejuni Salmon//a enterica enterica Tableau 3, : Composition du milieu 1 de Balch (a) 50m1 (b) 50m1 (c ) 10m1 ( d) 10m1(e) 0.002g (0 5g (g) 2,5g (h)) 2,5g (i) 2g a) 2g (k) 0,5g (1) 0,5g Les ingrédients sont rajoutés à de l'eau distillée pour avoir un volume final de 1 litre. La cystéine et le Na2S sont rajoutés après barbotage du milieu avec un mélange gazeux 80%N2-20%CO2, la phase gazeuse finale du tube est composée d'un mélange 80%H2-20%CO2. (a) :)Contient 6g de KH2PO4 par litre d'eau distillée. (b) :Contient en gramme par litre d'eau distillée: KH2PO4 (6), «NH4)2504 (6), NaCI (12), MgSO4.7H2O (2,6), CaC12.2H2O (0,16). (c) Contient en gramme par litre d'eau distillée (pH ajusté à 7 avec KOH) : acide nitriloacétique (1,5), MgSO4.7H2O (3), MnSO4.2H2O (0,5), NaCl (1), FeSO4.7H2O (0,1), CoSO4 ou CaCl2 (0,1), CaC12.H2O (0,1), ZnSO4 (0,1), CuSO4.5H2O (0,01), Na2Mo04.2H2O (0,01) ; dissoudre l'acide nitriloacétique avec du KOH (pH 6,5) puis rajouter les autres minéraux. (d) : Contient en milligramme par litre d'eau distillée les vitamines suivantes : biotine (2), acide folique (2), hydrochloride de pyridoxine (10), hydrochloride de thiamine (5), riboflavine (5), acide nicotinique (5), pantothénate de DL-calcium (5), vitamine B12 (0,1), Acide p-aminobenzo que (5), acide lipoique (5). (e) :FeSO4 7H2O; (f) : NaHCO3; (g) :Na acétate; (h) : Na formate; (i) :extrait de levure DIFCO; (j) : trypticase BBL; (k) : hydrochlorure de L-cystéine; (1) :Na2S, 9H2O 20 Tableau 4 : Milieu 119 Quantité par litre de H20 KH2PO4 0,5 g MgSO4 x 7H2O 0,4 g NaCl 5 g NH4CI 1 g CaCIZ x 2 H20 0,05 g Na-acétate 1,6 g Cystéine-HCI 0,5 g Extrait de levure 1 g Trypticase peptone 1 g Resazurine 0,001 g Solution d'oligo-éléments de Widdel 1 mL NaHCO3 4 g Na2S x 9H2O 0,5 g Na-formate 2 g Vitamines de Balch 10 mL 21 Tableau 5 : Milieu E1 Quantité par litre de H20 KH2PO4 0,3 g K2HPO4 0,3 g NaCl 1 g NH4CI 1 g CaCIZ x 2 H20 0,1 g KCI 0,1 g MgCIZ x 6 H20 0,5 g Extrait de levure 1 g Cystéine-HCI 0,1 g resazurine 0,001 g Solution d'oligo-éléments de Balch 2,5 mL NaHCO3 4 g Na2S x 9H2O 0,5 g Na-formate 2 g Vitamines de Balch 10 mL Méthanol 40 mM Tableau 6 : Solution d'oligo-éléments de Widdel Quantité pour 1 litre d'eau distillée HCI 25% 10 mL FeCIZ x 4HZO 1,5 g CoCIZ x 6H2O 190 mg MnCIZ x 4H2O 100 mg ZnCIZ 70 mg H3BO3 62 mg Na2MoO4 x 2H2O 36 mg NiCIZ x 6H2O 24 mg CuCIZ x 2H2O 17 mg Références bibliographiques 1. 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Mihajlovski A, Dore J, Levenez F, Alric M, Brugere JF (2010) Molecular evaluation of the human gut methanogenic Archaeal microbiota reveals an ageassociated increase of the diversity. Envir Microbiol Rep 2: 272-280. 7. Miller TL et al. Appl Environ Microbio% 1982; 43.227-232. 8. Miller TL and Wolin MJArch Microbiol. 1985 ; 141:116-122. 9. Ferrari A et a/. Curr Microbio/ 1994; 29 :7--12. 10. Balch WE et al. Microbiol Rev. 1979 ; 43 : 260-296. 12. Dridi B, Raoult D, Drancourt M: Archaea as emerging organisms in complex human microbiomes. Anaerobe 2011, 17: 56-63.. 23 13. Hungate, R. E. & Macy, J. (1973). The Roll-Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. Bull Ecol Res Comm 17, 123-125 14. Grabarse W, Mahlert F, Shima S, Thauer RK, Ermler U. Comparison of three methyl-coenzyme M reductases from phylogenetically distant organisms: unusual 5 amino acid modification, conservation and adaptation. J Mol Biol. 2000;303:329-44. 15. Dridi B, Henry M, El Khéchine A, Raoult D, Drancourt M. High prevalence of Methanobrevibactersmithn and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PLoS One. 2009;4(:e7063). 16. Boyer M, Madoui MA, Gimenez G, La Scola B, Raoult D. Phylogenetic and 10 phyletic studies of informational genes in genomes highlight existence of a 4 domain of life including giant viruses. PLoS One. 2010;5:e15530. 17. Raoult, D., S. Audic, C. Robert, C. Abergel, P. Renesto, H. Ogata, B. La Scola, M. Suzan and J. M. Claverie 2004. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science 306: 1344-1350. 15 18. Barredo MS, Evison LM. Effect of propionate toxicity on methanogenenriched sludge, Methanobrevibacter smithii, and Methanospirillum hungatii at different pH values. Appl Environ Microbiol. 1991 3un;57(6):1764-9. REVENDICATIONS1. Archaea Methanomassi/iicoccus /uminyensis isolée et établie en culture, comprenant la séquence spécifique du gène 16S de l'ADN ribosomal SEQ. ID. n°1 du listage de séquences ou une séquence complémentaire. 2. Archaea selon la revendication 1, telle que déposée à la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne) sous le numéro DSM 24529. 3. Milieu de culture stérilisé utile pour la culture d'une Archaea selon la revendication 1 ou 2, comprenant un milieu de base de culture d'Archaea méthanogène caractérisé en ce qu'il comporte en outre : a- du méthanol, et b- un sel de tungstène et/ou un sel de sélénium. 4. Milieu de culture selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend : a- du méthanol, et b- un sel de tungstène et un sel de sélénium. 5. Milieu de culture selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le méthanol est présent à une concentration de 1 à 100 mM, de préférence 10 à 50 mM. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que ledit sel de tungstène est présent à une concentration de 0,3 à 3 M, de préférence 0,5 à 1,5 M. 7. Milieu de culture selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que ledit sel de sélénium est présent à une concentration de 0,2 à 2 M, de préférence 0,5à1M. 8. Milieu de culture selon l'une des revendications 3 à 7 caractérisé en ce que ledit milieu de base comprend au moins :- plusieurs sources de carbone et d'azote , de préférence choisies parmi un extrait de levure, un sel d'acétate et une peptone trypsique, - une source de phosphore , de préférence un sel de phosphate, - une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, - au moins un sel de chacun des métaux K, Mg, Na et Ca, - une substance réductrice, plus particulièrement choisie parmi la cystéine-HCI et Na2S - une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 8, - des oligoéléments, de préférence des sels choisis parmi des sels de B, Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Ni et Mo, de préférence encore des oligoéléments du milieu de WIddel, - des vitamines, de préférence les vitamines du milieu de Balch, et - de préférence, une substance colorante de contrôle de l'anaérobie , de préférence la résazurine. 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce qu'il contient ledit milieu de base comporte les espèces suivantes : KH2PO4, MgSO4, NaCl, NH4CI, CaCl2.2H20, Na COOCH3 cystéine, extrait de levure, trypticase peptone, NaOH, Na2S, NaHCO3 , Na HCO2, Na2SeO3, Na2WO4.5H20 ,des oligoéléments de widdel, des vitamines de Balch et de préférence résazurine; le pH étant ajusté à 7.5 avec du KOH. 10. Milieu de culture selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte outre ledit milieu de base: a- du méthanol à la concentration de 10 à 100 mM, de préférence 40 mM, et b- un sel de Nat SeO3 à une concentration de 1 à 10 mg/I, de préférence 2 mg/L, et c- un sel de Na2WO4 .5H20 à la concentration de 1 à 10 mg/I, de préférence 4mg/L. 11. Procédé de préparation d'un milieu de culture stérilisé selon l'une revendications 3 à 10, caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles: 1- on stérilise dans un autoclave undit milieu de culture d'Archaea incomplet ne contenant pas les composants susceptibles d'être dégradé dans un autoclave comprenant le méthanol, lesdites vitamines ,les sels de sodium labiles comprenant Na HCO3, Na HCO2 et Na2S, de préférence dans un autoclave une température supérieure à 100°C pendant au moins 15 mn, et 2- on chasse l'oxygène, de préférence en portant ledit milieu de culture à ébullition sous une atmosphère d'azote, et 3- on place ledit milieu de culture stérilisé incomplet sous une atmosphère d'anaérobie, et 4- On le refroidit à température ambiante et on ajoute dans ledit milieu de culture incomplet, lesdits composants susceptibles d'être dégradé par stérilisation dans un autoclave comprenant le méthanol, les dites vitamines, sels de sodium labiles comprenant Na HCO3, Na HCO2 et Na2S. 12. Procédé de culture d'une Archaea avec un milieu de culture selon l'une des revendications 3 à 10 dans lequel on réalise les étapes successives suivantes : 1- on inocule un échantillon biologique susceptible de contenir une dite Archaea dans ledit milieu de culture en anaérobie, de préférence sous atmosphère d'azote, et 2- on place ledit milieu de culture sous une atmosphère d'anaérobiose et contenant au moins 50% d'hydrogène à une pression inférieure à 2 atm, et 3- on réalise une incubation à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C, pour atteindre une phase de croissance exponentielle avec dégagement de méthane en 'au moins 5 jours, de préférence pas plus de 15 jours. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que à l'étape 2 ledit milieu de culture est placé sous une atmosphère composée H2/CO2 dans une proportion volumique de 80/20 à une pression de 1 atm. 14. Procédé de détermination de la présence d'une Archaea dans un échantillon biologique, de préférence dans un échantillon de selles animales ou humaines selon la revendication 1 ou 2 ou d'une Archaea cultivée selon le procédé de l'une des revendications 11 ou 12 caractérisé en ce que l'on extrait l'ADN dudit échantillon biologique et on détecte et de préférence on quantifie spécifiquement l'ADN de ladite Archaea par amplification enzymatique du type PCR de préférence du type PCR en temps réel avec un couple d'amorces et de préférence une sonde, de séquences tirées du gène 16S ADNr de séquence SEQ.ID N°1. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce qu' on met en oeuvre undit couple d'amorces et de préférence une dite sonde de séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr: Amorce 5' directe :SEQ.ID. N° 2 = 5'-GTTCGTAGCCGGTCTGGTAA-3' Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 3 = 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3' Sonde : SEQ.ID.N°4 = 5'-TCGGGAAGCTTAAC 1 I 1 CCGACTTCC-3' 16. Procédé selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce que on réalise au préalable une amplification enzymatique du type PCR de préférence du type PCR en temps réel , spécifiquement de l'ADN de toutes Archaea contenues dans ledit ADN extrait de l'échantillon avec un couple d'amorces consensus de séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr : Amorce 5' directe :SEQ.ID. N° 5 =5'-AGCCGCCGCGGTAAYAC-3' Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 6 = 5'-CYGGCGTTGAVTCCAATT-3'. 17. Kit de détection d'une Archaea selon l'une des revendications 1 ou 2 pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisé en ce qu'il comprend :- un dit milieu de culture de préférence lyophilisé ou solide, et - des réactifs de mise en oeuvre d'une amplification enzymatique d'ADN de type PCR, et - des oligonucléotides constituants des dites amorces et sonde tirées de 5 SEQ.ID.N°1, de préférence choisies parmi SEQ.ID.N°2 à 6.