Brevet FR2971517A1 — publié le 20120817

La présente invention concerne le domaine technique des milieux de culture cellulaire, et en particulier des milieux de culture de cellules épithéliales. La Triiodo-L-thyronine (T3) sodique correspond au nom IUPAC : sel de sodium de l'acide (2S)-2-amino-3- [4-(4-hydroxy-3-iodo-phénoxy)- 3,5-diiodo-phényl]propanoique et au numéro CAS : 55-06-1. La T3 est utilisée dans différentes spécialités pharmaceutiques : des comprimés contenant de la T3 sont notamment commercialisés pour le traitement d'urgence ou de courte durée de l'hypothyroïdie ou dans le traitement d'appoint d'autres affections de la thyroïdie. La société Goldshield commercialise un lyophilisat de T3 sodique de Dextran 110 et d'hydroxyde de sodium qui doit être reconstitué dans de l'eau PPI, juste avant administration par voie parentérale. La T3 a également été préconisée pour son intérêt dans des milieux de 15 culture comme le milieu de Green permettant de cultiver en série des cellules épithéliales. De telles applications sont notamment décrites dans : - Safer 3D, Crawford TM, Fraser LM, Hoa M, Ray S, Chen TC, Pensons K, Holick MF. Thyroid hormone action on skin: diverging effects of topical versus intraperitoneal administration : Thyroid, 2003 Feb; 13 (2) : 20 159-65). - Simon M, Green H. Enzymatic cross-linking of involucrin and other proteins by keratinocyte particulates in vitro. Cell. 1985 Mar;40(3):677-83. - Formanek M et al In J Oral Maxillofac. In vitro approaches for 25 determining mechanisms of toxicity and carcinogenicity by asbestos in the gastrointestinal and respiratory tracts. Urg. 1996, Apr 25 (2) : 157-160 - Mossman BT. Environ Health Perspect. 1983 Nov;53:155-61. Review. La composition du milieu Green est donnée dans la TABLEAU 1 ci-30 après : TABLEAU 1 Concentrations Volume pour un volume final de milieu aliquots milieu final de 100 ml de 500 ml DMEM /glutamax Gibco 58 ml 290 ml HAM F12 Gibco 30 ml 150 ml Sérum de Veau 10 ml 50 ml FetalClone II Hyclone Hydrocortisone Upjohn 0,2 mg/mi 0,4 pglml 200 pl 1 ml Umulinee Lilly 100 Ullml 0,12 Ullml 120 pl 600 pl Isuprele Abbott 0,2 mg/mi 0,4 pglml 200 pl 1 ml Tri lodo Thyronine 2 x 90'6 M 2 x 10.9 M 100 pl 500 pl Adénine Sigma 2,43 mg/mi 24,3 pglml 1 ml 5 ml Pénicilline G 1 MU Panpharma 200 000 100 Ullml 50 pl 250 pl Ullml Streptomycine poudre pour 200 mg/ml 100 pg/ml 50 pl 250 pl préparation injectable en 1g Panpi Amphotéricine B 1 mg/mi 1 pglml 100 pl 500 pl Bristol Myers Squibb EGF* Austral biologicals 10 pglml 10 nglml 100 pl 500 pl Dans le cadre d'études internes, la demanderesse a tout d'abord développée une solution prête à l'emploi de T3 sodique dans une solution saline tamponnée avec des phosphates (PBS de l'anglais « phosphate buffered saline »). Une telle solution ne s'est pas montrée satisfaisante, en termes de stabilité. Dans ce contexte, la présente invention se propose de fournir une solution aqueuse de T3 sous la forme d'un sel de sodium, qui soit prête à l'emploi pour supplémenter un milieu de culture donné. Une telle solution se doit d'être stable, dans des conditions de température, notamment appartenant à la gamme 2-8°C, voire même à température ambiante (25°C), afin de faciliter son stockage et son utilisation. La composition proposée dans le cadre de l'invention se doit également 15 de pouvoir être préparée facilement et à un coût de revient non prohibitif. 2 Le but de la composition selon l'invention étant de supplémenter des milieux de culture plus simples, déjà connus ou qui seront développés dans le futur, ses composants autres que la T3 sodique doivent être compatibles avec un milieu de culture cellulaire, et en particulier un milieu de culture de cellules épithéliales. La présente invention a pour objet une composition pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales, comprenant de la Triiodo-L-thyronine (T3) sodique, un hydroxyde alcalin, un alcool en C1-C3 et de l'eau. A titre d'exemple d'hydroxyde alcalin, on peut citer les hydroxydes de lithium, sodium, potassium, rubidium, césium ou francium. L'hydroxyde alcalin a pour fonction d'aider à la solubilisation de la T3 sodique dans une solution aqueuse. Selon un mode de réalisation particulier, l'hydroxyde alcalin est de l'hydroxyde de sodium. De façon avantageuse, le rapport (m/m) T3 sodique/hydroxyde de sodium dans la composition appartient à la gamme allant de 0,17/100 à 3,40/100, et est de préférence égal à 0,34/100. A titre d'exemples d'alcool en C1-C3 (c'est-à-dire comprenant de 1 à 3 atomes de carbone), on peut citer le méthanol, l'éthanol, le rrpropanol ou 1'1So-propanol. La fonction de l'alcool est de stabiliser la solution obtenue, en combinaison avec l'hydroxyde alcalin. Selon un mode de réalisation particulier pouvant être combiné aux précédents, l'alcool est le méthanol. De façon avantageuse, le rapport (m/v) T3 sodique/méthanol appartient à la gamme allant de 0,068/100 à 5,440/100, et est de préférence égal à 0,272/100. La composition selon l Invention se présente sous la forme d'une solution aqueuse. De façon avantageuse, le rapport (m/v) T3 sodique/eau appartient à la gamme allant de 0,068/100 à 5,440/100, et est de préférence égal à 0,272/100. Compte tenu de son application, la composition selon l'invention est stérile et apyrogène. Pour obtenir une composition stérile, l'ensemble des composants utilisés peuvent être stériles et/ou une étape de filtration stérilisante en système clos pourra être mise en oeuvre. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que précédemment définie pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales. LInvention a également pour objet un procédé de culture de cellules épithéliales, dans lequel on ajoute, à un milieu de culture initial, une composition telle que précédemment définie, puis on cultive des cellules épithéliales, dans le milieu de culture modifié obtenu. La composition selon l'invention est, par exemple, ajoutée en quantité telle pour avoir dans le milieu de culture modifié obtenu, une concentration en T3 sodique appartenant à la gamme allant de 0,68 pg/L à 27,2 pg/L, de préférence, pour avoir une concentration égale à 1,36 pg/L. Le milieu de culture initial peut être tout milieu de culture utilisé pour la culture de cellules épithéliales. A titre d'exemple, on peut citer un milieu qui après avoir été supplémenté avec la composition selon l'invention correspond sensiblement au milieu Green. De tels milieux comprennent, en général : - au moins un oligo ou polysaccharide, par exemple choisi parmi glucose, fructose, galactose, mannose au moins un sel minéral, par exemple choisi parmi sels de sodium, potassium, calcium, magnésium, fer, zinc, cobalt, cuivre - au moins un acide aminé naturel, au moins une vitamine et/ou un agent antioxydant, par exemple choisi parmi la biotine, le pantothénate de calcium, le chlorure de choline, l'acide folique, l'inositol, la nicotinamide, la pyridoxine, la riboflavine, la thiamine et la vitamine B12, éventuellement au moins un facteur de croissance, par exemple choisi parmi l'EGF (facteur de croissance épidermique de l'anglais « Epidermai Growth Factor ») et l'adénine éventuellement un ou plusieurs antibiotiques, antifongiques ou agents antibactériens. La composition selon l'invention pourra être utilisée pour supplémenter des milieux de culture de cellules épithéliales. Cette composition est adaptée à la culture en série des kératinocytes, comme des cellules épidermiques humaines, des kératïnocytes de tératomes. La culture en série de cellules épithéliales pourra notamment être réalisée pour produire des colonies et éventuellement un épithélium squameux stratifié. Le procédé selon l'invention permet, notamment, de produire des cellules épidermiques qui peuvent être utilisées dans le traitement des brûlures ou encore pour tester les effets sur la peau d'actifs pharmaceutiques, dermatologiques ou cosmétiques. Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif. Les Figures 1 et 2 étudient la stabilité de différentes compositions au cours du temps. Deux solutions diluées de T3 sodique prêtes à l'emploi ont été préparées et testées pour évaluer la stabilité de la T3 sodique comme suit : 1. Fabrication d'une solution concentrée de T3 sodique dans un flacon 15 verre brun, â l'abri de la lumière : Composition qualitative et quantitative T3 sodique 68 mg NaOH 0,02M 7,5 ml Eau ppi quantité suffisante pour 500 ml 20 C = 200 pM soit 136 mg/L Lors de la fabrication, la verrerie est protégée de la lumière. Dans un bécher en verre contenant 68 mg de T3 sodique, 7,5 ml d'une solution de NaOH 0,02M sont ajoutés. La poudre de T3 sodique est dissoute par sonication puis transférée dans une fiole jaugée de 0,5 L. Le bécher est rincé 25 plusieurs fois â l'eau pour préparation injectable (ppi) puis l'eau de rinçage est transférée dans la fiole complétée jusqu'au trait de la jauge avec de l'eau PPi- 2. A partir de la solution concentrée aqueuse précédente (0,2 mM), on réalise une solution diluée (solution finale) dans le PBS (Phosphate Buffered 30 Saline) et dans une solution méthanolique d'hydroxyde de sodium (préparée avec 800 mg de NaOH dans 1000 ml d'eau ppi et 1000 ml de méthanol R),: La formule de fabrication de la solution diluée de T3 dans le PBS est donnée ci-dessous. Formule de fabrication de la solution diluée de T3 sodique dans le PBS: 10 mL de la solution concentrée (concentration T3 sodique :136 mg/L) + 990 mL PBS C = 2 pM soit 1,36 mg/L La formule de fabrication de la solution diluée de T3 dans la solution méthanolique d'hydroxyde de sodium est donnée ci-dessous. Formule de fabrication de la solution diluée de T3 sodique dans la solution méthanolique de NaOH: 10 mL de la solution concentrée aqueuse (concentration T3 sodique :136 mg/L) + 495 mL Solution NaOH 0,2 mM: + 495 mL méthanol C = 2.10-6 mol/L = 1,36 mg/L 3. Etude de stabilité des solutions diluées - 10 flacons de chaque dilution ont été conservés à +4°C pour dosage à 20 Jour 0, Jour 7, Jour 14, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois; 6 mois; 9 mois; 12 mois - 9 flacons de chaque dilution ont été conservés à -25°C pour dosage à Jour 7, Jour 14, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois; 6 mois; 9 mois; 12 mois. 25 4. Dosage de la T3 (High-performance liquid chromatography-UV) Paramètres utilisés pour l'HPLC : - Colonne : Atlantis dc18 (3 pm, 2,1x150 mm) - Température du four : 40°C 30 - Volume injecté : 20 pL 10 15 - Eluant : tampon phosphate 100 mM et acétonitrile (70/30 ; v/v) pH=5,6. - Diluant : utilisé pour la gamme et les dilutions des échantillons : Solution méthanolique d'hydroxyde de sodium 800 mg de NaOH R 1000 ml d'eau R 1000 ml de méthanol R - Débit : 1.5 ou 2 mL/min . Longueur d'onde de détection UV : 226 nm Gamme d'étalonnage : La gamme d'étalonnage est réalisée dans la solution méthanolique d'hydroxyde de sodium R : les concentrations allant de 0 mg/L à 5 mg/L. Chaque flacon de la solution concentrée est utilisé pour deux dosages (à +4°C dans le PBS et dans la solution méthanolique de NaOH ensuite à -25°C dans le PBS et dans la solution méthanolique de NaOH): Jour 0: 2 dosages Jour 7: 4 dosages Jour 14: 4 dosages 1 mois: 4 dosages 2 mois: 4 dosages 3 mois: 4 dosages 4 mois: 4 dosages 6 mois: 4 dosages 9 mois: 4 dosages 12 mois: 4 dosages Pour doser la T3 dans la solution concentrée aqueuse, des dilutions au 1/100è' dans la solution méthanolique d'hydroxyde de sodium puis dans le PBS sont effectuées au moment du dosage pour chaque solution, la gamme d'étalonnage allant de 0 mg/L à 5 mg/L. On obtient ainsi une solution méthanolique aqueuse à 1,36 mg/L et une solution avec le PBS à 1,36 mg/L. - Chaque flacon de la solution diluée est utilisé pour un dosage : Jour 0: 2 dosages Jour 7: 4 dosages Jour 14: 4 dosages 1 mois: 4 dosages 2 mois: 4 dosages 3 mois: 4 dosages 4 mois: 4 dosages 6 mois: 4 dosages 9 mois: 4 dosages 12 mois: 4 dosages Aucune dilution n'est nécessaire pour la solution diluée : la concentration attendue est de 1,36 mg/L. Les résultats sont présentés sur les Figures 1 et 2. La Figure 1 présente l'étude de la variation de la concentration de solutions aqueuses concentrées de T3 (concentration initiale :136 mgr) au cours du temps de stockage. Les solutions ont été conservées soit (i) à 4°C puis diluées au moment du dosage au 1/100eme dans une solution méthanolique d'hydroxyde de sodium (6) ou dans une solution de PBS (0), soit (ii) à -25°C puis diluées au 1/100eme au moment du dosage dans une solution méthanolique d'hydroxyde de sodium (^) ou dans une solution de PBS (^). La Figure 2 présente l'étude de la variation de la concentration de solutions diluées de T3 (concentration initiale :1,36 mg.1"1) au cours du temps de stockage. Les solutions de T3 ont été conservées soit (i) à 4°C (- : solvant méthanol/hydroxyde de sodium) et (O : solvant : PBS), soit (ii) à - 25°C (^ : solvant méthanol/hydroxyde de sodium) et (^ : solvant : PBS). L'étude de stabilité réalisée pendant un an de la solution méthanolique de NaOH conforme à l'invention, versus le PBS, a montré que la solution selon l'invention est plus stable.30 . Supplémentation d'un milieu de culture Composition du milieu de culture modifié de cellules épithéliales {ECCM) Produit Fournisseur Concentration Quantité dans le milieu pour 100 ml final de milieu DMEM/Glutamax Invitrogen / 64 ml HAM F12 Invitrogen / 23 ml Sérum de veau Thermo Fisher / 10 ml foetal II Hyclone Hydrocortisone Serb 0,4 pg/ml 200 pl Umuline Rapide Lily France 0,12 UI/ml 120p1 Sélénium Aguettant 0,033 pg/ml 340p1 Isuprel Hospira France 0,4 pg/ml 200 pl T3 Pharmacie 2x10"9M 100 pl HEH EGF Austral 10 ng/ml 100 pl Biologicals Pénicilline Panpharma 100 UI/ml 10 µl Streptomycine Panpharma 100 µg/ml 10 µl Amphotéricine B BMS 1 µg/m1 20 µl La culture de cellules épithéliales a été réalisée avec succès dans ce 5 milieu et aucun signe de toxicité de la composition selon l'invention in vitro n'a été mis en évidence. REVENDICATIONS1- Composition pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales comprenant de la Triiodo-L-thyronine(T3) sodique, un hydroxyde alcalin, un alcool en C1-C3 et de l'eau. 2 - Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'hydroxyde alcalin est de l'hydroxyde de sodium. 3 - Composition selon la revendication 2 précédentes caractérisée en ce que le rapport (m/m) T3 sodique/hydroxyde de sodium appartient à la gamme allant de 0,17/100 à 3,40/100, et est, de préférence, égal à 0,34/100. 4 - Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'alcool en C1-C3 est le méthanol. 5 - Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que le rapport 15 (m/v) T3 sodique/méthanol appartient à la gamme allant de 0,068/100 à 5,440/100, et est, de préférence, égal à 0,272/100. 6 - Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le rapport (m/v) T3 sodique /eau appartient à la gamme allant de 0,068/100 à 5,440/100, et est, de préférence, égal à 0,272/100. 20 7 - Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est stérile et apyrogène. 8 - Utilisation d'une composition selon l'une des revendications précédentes pour supplémenter un milieu de culture de cellules épithéliales. 9 - Procédé de culture de cellules épithéliales dans lequel on ajoute, à un 25 milieu de culture initial, une composition selon l'une des revendications 1 à 7, puis on cultive des cellules épithéliales dans le milieu de culture modifié obtenu. 10 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la composition selon l'une des revendications 1 à 7 est ajoutée en quantité telle 30 pour avoir dans le milieu de culture modifié obtenu, une concentration en T3 sodique appartenant à la gamme allant de 0,68 pg/L à 27,20 pg/L, et de préférence une concentration égale à 1,36 pg/L. 11- Procédé selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que le milieu de culture initial comprend au moins un sucre, au moins un sel inorganique, au moins un acide aminé naturel et au moins une vitamine et/ou un agent anti-oxydant. 12 - Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé en ce que le milieu de culture initial comprend au moins un facteur de croissance. 13 - Procédé selon l'une des revendications 9 à 12 caractérisé en ce que le milieu de culture initial comprend au moins un agent choisi parmi les agents antibiotiques, antifongiques et antibactériens.10