Brevet FR2976504A1 — publié le 20121221

PROCEDE ET DISPOSITIF POUR LA PREPARATION DE GELS D'AGAROSE. L'invention concerne un procédé et un dispositif pour la préparation de gels d'agarose destinés notamment à la réalisation de plaques de gels utilisées pour la séparation de macromolécules par électrophorèse. Un gel d'agarose est obtenu à partir d'une poudre d'agarose que l'on dissout dans un liquide tampon tel que du TAE (tris/acétate/EDTA), du TBE (tris/borate/EDTA) ou du SB (sodium borate). Le rapport entre la masse d'agarose et le volume de tampon définit la concentration du gel final et donc ses caractéristiques de sélection des macromolécules. Les concentrations en agarose sont typiquement comprises entre 0,1 et 5%. Pour dissoudre la poudre d'agarose dans le tampon, il faut chauffer le mélange à une température d'environ 90°C et l'agiter. Les procédés connus de préparation de ces gels consistent généralement à déposer l'agarose et le tampon en proportions voulues dans un flacon de type "Erlenmeyer", que l'on place ensuite dans un four à micro-ondes ou dans un récipient contenant de l'eau bouillante (chauffage du type bain-marie) et à agiter de temps en temps le flacon. L'agarose est totalement dissous lorsque les grains, initialement visibles, ont complètement disparu. II faut ensuite mettre la solution sous agitation, par exemple à l'aide d'un barreau magnétique, et laisser refroidir ou placer le flacon dans un bain à environ 50°C. Éventuellement, il est possible de refroidir plus rapidement la solution en laissant couler un filet d'eau froide sur le flacon et en agitant constamment. Il est particulièrement important de refroidir l'agarose en dessous de 60°C pour que l'opérateur ne se brûle pas et pour des problèmes de compatibilité thermique avec certains composants des moules, en particulier un peigne, dans lesquels la solution d'agarose est coulée. C'est dans ces moules que le gel va se solidifier en se refroidissant, pour former des plaques de gel destinées à la séparation de macromolécules. Ces procédés connus de préparation dans un four à micro-ondes et/ou au bain-marie sont longs et peuvent être dangereux car il se produit fréquemment des micro-ébullitions dans un four à micro-ondes et l'opérateur risque d'être brûlé lors des différentes manipulations, ce qui l'oblige à porter en général des gants spéciaux pour se protéger des risques de brûlures. La présente invention a notamment pour but d'éviter ces 10 inconvénients des procédés connus, de faciliter la préparation des gels d'agarose et de réduire le temps de préparation. Elle a pour objet un procédé et un dispositif qui permettent de dissoudre et d'agiter l'agarose dans le tampon puis de refroidir et d'agiter le mélange pour l'amener rapidement dans les conditions optimales de coulée 15 dans un moule. Elle propose à cet effet un procédé consistant à préparer un mélange sur-concentré d'agarose dans un liquide tampon, à chauffer le mélange sur-concentré avec de la vapeur de tampon jusqu'à la dissolution complète de l'agarose, puis à refroidir la solution obtenue par injection de 20 liquide tampon froid sous pression pour obtenir un gel ayant une concentration en agarose et une température prédéterminées. L'injection de la vapeur de tampon directement dans le mélange sur-concentré a pour premier effet de chauffer ce mélange à coeur en limitant l'échauffement des parois du flacon. 25 Elle a pour deuxième effet de réaliser une agitation homogène et au coeur du mélange pour favoriser la dissolution des grains d'agarose et l'homogénéité de la solution obtenue. L'injection de liquide tampon froid sous pression dans la solution chauffée a pour effet de réduire et ajuster la concentration et de refroidir la 30 solution pour l'amener dans les conditions optimales de coulée. Les injections de vapeur de tampon et de liquide tampon froid sont réalisées avantageusement au moyen de tubes plongeurs dont les extrémités sont immergées au coeur de la solution. Avantageusement, l'injection de vapeur et l'injection de tampon froid 5 sont réalisées au moyen d'un même tube plongeur connecté soit à un bloc de chauffe de liquide tampon, soit à un circuit de tampon froid. L'invention propose également un dispositif de préparation d'un gel d'agarose par exécution du procédé décrit ci-dessus, comprenant un flacon de mélange d'agarose et un réservoir de liquide tampon, caractérisé en ce 10 qu'il comprend des moyens d'injection sélective de vapeur de tampon et de liquide tampon dans le mélange contenu dans le flacon. Selon d'autres caractéristiques de l'invention : - les moyens d'injection comprennent au moins un tube plongeur relié par une pompe et une électrovanne au réservoir de liquide tampon 15 d'une part et/ou à des moyens de production de vapeur de tampon d'autre part, - le tube plongeur comprend à son extrémité supérieure une poignée équipée d'un commutateur-interrupteur de commande d'injection de vapeur de tampon et de liquide tampon, 20 - la poignée du tube plongeur est reliée à un tuyau d'amenée de vapeur de tampon ou de liquide tampon, et à un câble de commande de la pompe et de l'électrovanne, - l'extrémité inférieure du tube plongeur comporte un embout, amovible ou non, formé avec des trous gicleurs inclinés par rapport à l'axe 25 du tube. Dans le dispositif selon l'invention, un circuit de distribution de vapeur de tampon et un circuit de distribution de liquide tampon froid, sont sélectionnés au moyen d'une vanne 3 voies. L'entrée de la vanne 3 voies est connectée à un réservoir de tampon froid par l'intermédiaire d'une 30 pompe. Au repos, la vanne 3 voies est fermée de façon étanche. Dans une position d'ouverture, la vanne conduit le tampon vers le bloc de chauffe et le tube plongeur, et dans une autre position d'ouverture, le tampon froid est directement envoyé vers le tube plongeur. De façon générale, le procédé et le dispositif selon l'invention permettent de simplifier et sécuriser la préparation des gels d'agarose. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 est une vue schématique du principe d'un dispositif selon l'invention; - la figure 2 est une vue schématique en perspective d'un tube plongeur faisant partie de ce dispositif; - la figure 3 est une vue en perspective d'une réalisation pratique du dispositif selon l'invention; Le dispositif de préparation de gels d'agarose selon l'invention représenté en figure 1 comprend essentiellement un corps de chauffe (1) du type électrique alimenté en liquide tampon à partir d'un réservoir (2) au moyen d'une pompe (3) et d'une électrovanne (4) à trois voies. La solution d'agarose (22) est en général préparée dans un flacon de type "Erlenmeyer" (21). Un tube plongeur (5) servant à l'injection sélective dans le flacon (21) de vapeur de tampon et de liquide tampon, comprend à son extrémité supérieure une poignée (6) équipée d'un commutateur interrupteur (7), et à son extrémité inférieure un embout amovible (8). Un tuyau souple (9) et un câble électrique (10) placés à l'intérieur d'une même gaine souple et isolante (11) relient la poignée (6) au circuit de tampon et à la pompe (3) et à l'électrovanne (4), respectivement. Le tuyau souple (9) est relié par un raccord en "Y" et deux clapets anti-retour (14) et (15) à une sortie (13) du bloc de chauffe et à une sortie (42) de l'électrovanne (4), respectivement. Le câble (10) est raccordé au commutateur interrupteur (7) à trois positions, à savoir une position repos centrale sans contact, et deux positions à maintenir manuellement (71) et (72). La position (71) commande la mise en route de la pompe (3) et le basculement de l'électrovanne (4) en position (41) pour l'alimentation du tube plongeur (5) en vapeur de tampon, produite par le boc de chauffe (1) et fournie par la sortie (13) de celui-ci. La position (72) commande la mise en route de la pompe (3) et le basculement de l'électrovanne (4) en position (42) pour l'alimentation du tube plongeur (5) en liquide tampon froid. Lorsque le commutateur interrupteur (7) est ramené dans sa position centrale, l'électrovanne (4) est dans sa position repos de fermeture étanche. L'extrémité de l'embout amovible (8), ou du tube (5) s'il n'y a pas d'embout amovible, comprend plusieurs trous gicleurs (16) (par exemple de 3 à 5) inclinés par rapport à l'axe longitudinal du tube d'un angle par exemple compris entre 15 à 60° pour favoriser l'agitation et le mélange de la solution (22) et assurer une parfaite homogénéité du gel. Pendant la préparation du gel, l'opérateur peut avantageusement remuer le tube dans le flacon pour agiter la solution (22). Cette solution est initialement préparée à température ambiante et à une concentration par exemple double de la concentration finale désirée. L'injection de vapeur de tampon à une température de 100°C environ pendant une durée de 30 à 60 secondes va amener rapidement la température à coeur du mélange aux environs de 80 à 95°C et réaliser la dissolution des grains d'agarose et l'homogénéité du mélange. Typiquement, le débit de vapeur de tampon est de 10 à 1000 cm3 par seconde pour un volume de gel à préparer de l'ordre de 10 à 100 ml, la pompe (3) fournissant un débit de liquide tampon de l'ordre de 1 à 10 ml par seconde Ensuite, on injecte du liquide tampon froid dans la solution par le tube (5) et l'embout amovible (8) pour la refroidir à coeur jusqu'à une température nominale d'utilisation (par exemple 50 à 60°C) tout en réduisant sa concentration en agarose jusqu'à la valeur voulue, généralement repérée par le volume final de la solution. Si la solution est trop refroidie, une injection complémentaire de vapeur de tampon permet de remonter sa température à la valeur souhaitée. L'expérience et l'étalonnage du dispositif permettent à l'opérateur d'optimiser la concentration initiale pour obtenir directement les bons 10 paramètres de mélange final en un minimum de temps. Une réalisation pratique du dispositif selon l'invention, a été représentée à titre d'exemple en figure 3. Elle comprend un socle allongé dont une zone d'extrémité (17) comporte des moyens de réception et de chauffage du flacon (21). Cette zone (17) comprend également les moyens 15 de production de vapeur de tampon. Une zone d'extrémité opposée (18) comprend des moyens de réception du réservoir (2) de liquide tampon, et est raccordée à une zone latérale (19) comprenant des moyens de réception du tube plongeur (5), au repos. Un interrupteur de commande (20) du type marche-arrêt est prévu par exemple sur un côté du socle. 20 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un gel d'agarose, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer un mélange sur-concentré d'agarose et de liquide tampon, à chauffer ce mélange par injection de vapeur de tampon pour dissoudre les grains d'agarose dans le tampon, puis à injecter dans la solution obtenue du liquide tampon froid pour l'ajuster à la concentration voulue et la refroidir à une température d'utilisation comprise entre 50 et 60°C. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à injecter la vapeur de tampon à coeur dans le mélange pour l'homogénéiser et limiter les échauffements du flacon contenant le mélange. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste également à agiter le mélange tout au long de la préparation du gel. 4. Dispositif de préparation d'un gel d'agarose par exécution du procédé selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant un flacon (21) de mélange d'agarose et un réservoir (2) de liquide tampon, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (5, 8) d'injection sélective de vapeur de tampon et de liquide tampon dans le mélange contenu dans le flacon (21). 5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que les moyens d'injection comprennent un tube plongeur (5) relié par une pompe (3) et une électrovanne (4) au réservoir (2) de liquide tampon d'une part et à des moyens (1) de production de vapeur de tampon d'autre part. 6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que le tube plongeur (5) comprend à son extrémité supérieure une poignée (6) équipée d'un commutateur-interrupteur (7) de commande d'injection de vapeur de tampon et de liquide tampon. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que la poignée (6) du tube plongeur est reliée à un tuyau (9) d'amenée de vapeurde tampon ou de liquide tampon, et à un câble (10) de commande de la pompe (3) et de l'électrovanne (4). 8. Dispositif selon la revendication 5, 6 ou 7, caractérisé en ce que l'extrémité inférieure du tube plongeur (5) comporte un embout amovible (8) formé avec des trous gicleurs (16) inclinés par rapport à l'axe du tube.