Brevet FR2972114A1 — publié le 20120907

La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B à l'aide d'un facteur X modifié. L'hémophilie A comme l'hémophilie B regroupe deux types d'hémophilie, l'hémophilie constitutionnelle et l'hémophile acquise. L'hémophilie constitutionnelle de type A est une maladie hémorragique caractérisée par un déficit quantitatif ou qualitatif en FVIII résultant d'une anomalie du gène du FVIII. L'hémophilie constitutionnelle de type B est également une maladie hémorragique mais caractérisée par un déficit quantitatif ou qualitatif en FIX résultant d'une anomalie du gène du FIX. L'hémophilie acquise de type A ou B se définit par l'apparition d'auto anticorps dirigés contre ces FVIII ou FIX. L'hémophilie se traduit par un déficit de la coagulation sanguine en réponse à une hémorragie. Les hémophiles de type A ou B non traités présentent des symptômes tels que des saignements excessifs en cas de blessure et parfois même des hémorragies spontanées. L'activité biologique des facteurs VIII ou IX s'évalue en pourcentage de la normale. L'individu normal étant considéré comme ayant 100% d'activité. Si l'activité est indétectable (inférieure à 1%), il s'agit d'une hémophilie sévère, si l'activité est comprise entre 1 et 5%, l'hémophilie est dite modérée; au-delà et jusqu'à 30% l'hémophilie est mineure. Les patients atteints d'hémophilie A et B peuvent être traités par des concentrés comprenant respectivement du FVIII ou du FIX qui peuvent être des dérivés plasmatiques ou des produits issus du génie génétique. Ces concentrés peuvent être administrés à l'occasion de chaque hémorragie, dans ce cas, il convient de commencer le traitement le plus rapidement possible, à l'apparition des premiers signes. Le traitement peut également être administré de façon prophylactique, régulièrement 2 à 3 fois par semaine de façon à prévenir les hémorragies. Cependant, ce type de traitement peut donner lieu à l'apparition d'anticorps dirigés contre le FVIII ou le FIX appelés inhibiteurs. La présence de tels anticorps rend alors inefficace les administrations de facteurs VIII ou IX. Ces anticorps sont des immunoglobulines de classe G à prédominance IgG4. Ils se développent tôt des les premières administrations, souvent avant la dixième. Certains patients restent de faibles répondeurs (titre d'anticorps La présente invention répond à ce besoin, elle a pour objet une composition pharmaceutique comprenant un facteur X activé (FXa) modifié ledit FXa modifié (GDXa) étant non thrombogène et pouvant se lier à 25 l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI) mais ne possédant pas de site de liaison aux phospholipides pour la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B. La composition selon l'invention peut également être utilisée pour la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez des patients 30 hémophiles présentant des anticorps anti facteur VIII (FVIII) ou facteur IX (FIX). Les anticorps sont apparus soit à la suite d'un traitement par des facteurs FVIII ou FIX ou spontanément comme dans l'hémophilie acquise. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un facteur Xa modifié (GDXa) pour la 35 préparation d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B, ledit patient présentant ou non des anticorps anti FVIII ou FIX. La présente invention a également pour objet une méthode de traitement préventif d'un syndrome hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B par administration d'un facteur Xa modifié (GDXa). La présente invention a également pour objet une méthode de traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B par administration d'un facteur Xa modifié (GDXa). Dans le cadre de la présente invention, la mention du facteur FXa fait référence au facteur X activé obtenu par activation du Facteur X natif naturellement présent dans le plasma ou à l'état isolé dans sa forme originelle, non modifiée. Ce terme englobe les FX isolés à partir du plasma mais également les FX produits de façon recombinante ou obtenus par synthèse chimique qui ont été activés. Le facteur Xa ou facteur Xa (FXa) natif fait référence, dans le cadre de la présente invention à une protéine de type sérine protéase intervenant dans la coagulation et qui est produite sous une forme inactive le facteur X (FX). L'activation du facteur X de la coagulation est une étape clef dans la coagulation du sang et l'arrêt des hémorragies. Son activation est nécessaire pour les étapes de propagation et d'amplification de la coagulation. Son activation est également nécessaire pour l'arrêt de l'activation de la coagulation par l'intermédiaire de son interaction avec le TFPI. Le FX est activé soit par le facteur IX activé et son cofacteur, le facteur VIII activé ou par le facteur VII activé et son cofacteur, le facteur tissulaire (TF). Le FXa forme le complexe prothrombinase, lequel est lié aux membranes avec le facteur V activé et est le composant actif dans le complexe prothrombinase qui catalyse la conversion de la prothrombine en thrombine. La thrombine catalyse quant à elle, la conversion du fibrinogène en fibrine qui conduit à la formation des caillots dans le sang et à l'arrêt des saignements. L'activité du FXa peut être appelée « activité procoagulante ». Leytus et al., (Biochemistry, 1986, 25 :5098-5102) ainsi que Venkateswarlu et al., (Biophysical Journal, 2002, 82 :1190-1206) décrivent le facteur X et les différents domaines présents dans ce polypeptide. Un clivage catalytique de la chaine lourde permet l'activation du FX en FXa. Le FXa comporte une chaine légère dont un exemple est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID No. 1 et une chaine lourde dont un exemple est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID No. 2. Dans le cadre de la présente invention, le terme FXa modifié désigne des FXa ne pouvant plus se lier aux phospholipides, ne possédant plus d'activité procoagulante ou une activité procoagulante réduite. Dans le cadre de la présente invention, un tel facteur est nommé GDXa. L' « activité procoagulante » est définie comme la capacité d'un facteur à causer la coagulation sanguine ou la formation de caillots. Une activité procoagulante réduite signifie que l'activité est réduite d'au moins 50%, de préférence au moins 90% et de façon encore plus préférée de plus de 95% par rapport à l'activité du FXa natif. Le facteur Xa modifié selon l'invention, GDXa, est dépourvu de son domaine y-carboxyglumatic acide (Gla) de liaison aux phospholipides. Les 45 premiers acides aminés de la chaine légère (résidus 1-45 de SEQ ID No. 1) représentent le domaine Gla car il contient 11 résidus modifiés de façon post traductionnelle (acide y-carboxyglutamique). Une digestion par la chymotrypsine permet de supprimer les résidus 1-44 permettant de générer un FXa dépourvu de son domaine de fixation aux phospholipides ou GDXa (pour Gla Domainless FXa). Un tel GDXa peut également comprendre d'autres modifications en plus de l'absence de son domaine Gla. Un tel FXa modifié conserve des propriétés de liaison au facteur Va mais ne possède pas d'activité procoagulante. Un exemple de GDXa est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID No. 3 pour sa chaine légère et par SEQ ID No. 2 pour sa chaine lourde. Cette absence d'activité procoagulante peut être définie par son incapacité à activer la coagulation quand il est ajouté à du plasma en absence de facteur tissulaire, ce qui le différencie du facteur Xa natif. Le GDXa peut être obtenu par clivage du facteur X par protéolyse ménagée par la chymotrypsine et activation par une protéase spécifique selon 30 l'une des méthodes usuelles telle celle décrite par Skogen et al., (1984). Le GDXa peut être produit par synthèse chimique, soit sous la forme d'une seule séquence, soit sous la forme de plusieurs séquences qui sont ensuite liées les unes aux autres. Cette synthèse peut se faire en phase 35 solide ou en solution. Ces techniques sont plus particulièrement décrites par Atherton and Shepard in "Solid phase peptide synthesis" (IRL press Oxford, 1989) et par Houbenweyl (in "Methoden der organischen Chemie" [Methods in Organic Chemistry] published by E.Wunsch Vol. 15-1 and 11, Stuttgart, 1974), ainsi que dans les articles suivant: P. E. Dawson et al. (Science 1994; 266(5186), pp776-779); G G Kochendoerfer et al. (1999; 3(6), pp 665-671 ); P E Dawson et al. (2000, 69, Annu. Rev. Biochem., pp 923-960). Le GDXa est non thrombogène, son absence d'activité procoagulante peut être définie par un test mesurant la génération de thrombine (Hemker et al., Thrombosis and Haemostasis. 1993 ; 70 : 617-624, cf. exemple 4). La capacité de liaison au TFPI du GDXa est définie à l'aide de tout test bien connu de l'homme du métier. Un tel test est décrit à l'exemple 3, il met en oeuvre un substrat chromogénique permettant de déterminer le pourcentage d'inhibition du FXa et GDXa par le TFPI. Dans un autre aspect de l'invention le GDXa est dépourvu de son domaine Gla mais également du domaine EGF1 (Epidermal Growth Factor 1). Une telle mise en oeuvre de l'invention peut être représentée par une composition comprenant un GDXa représenté par SEQ ID No 4 pour sa chaine légère et par SEQ ID No. 2 pour sa chaine lourde. Dans un autre aspect de l'invention le GDXa est dépourvu de son domaine Gla mais également du domaine EGF2 (Epidermal Growth Factor 2), un exemple d'un tel GDXa est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID No 5 pour sa chaine légère et par SEQ ID No. 2 pour sa chaine lourde. Dans un autre aspect de l'invention le GDXa est dépourvu de son domaine Gla mais également des domaines EGF1 et EGF2, un exemple d'un tel GDXa est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID No 6 pour sa chaine légère et par SEQ ID No. 2 pour sa chaine lourde. Selon un autre aspect de l'invention, le GDXa est constitué uniquement par la chaine lourde du FXa. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, un tel FXa est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID No 2. Dans un aspect encore différent, le GDXa est constitué de variants moléculaires présentant des mutations. Ainsi, différentes mutations ont été introduites dans le gène codant pour le GDXa permettant de garder une activité de génération de thrombine et réduisant l'activité enzymatique sur petits substrats peptidiques des mutants. Ces mutations peuvent être introduites par utilisation du kit QuickChange (Stratagene) et en suivant les recommandations du fabricant et selon la publication Wang & Malcolm (1999) - BioTechniques, 26 : 680-682. Ces mutations peuvent porter sur l'arginine 142 de la chaine lourde du GDXa (numérotation selon SEQ ID No. 2) qui peut être mutée pour donner tout autre acide aminé, préférentiellement la phénylalanine (par exemple SEQ ID No 7), la glycine (par exemple SEQ ID No 8), l'isoleucine (par exemple SEQ ID No 9) ou la tyrosine (par exemple SEQ ID No 10). Cette mutation peut porter sur le remplacement de la séquence peptidique du FXa humain Arg-Gln-Ser-Thr-Arg-Leu (139-143 de la chaine lourde) par la séquence équivalente provenant du FXa bovin : Arg-Leu-Ser-Ser-Thr-Leu (par exemple SEQ ID No 11). Similairement la lysine 82 de la chaine lourde (numérotation selon SEQ ID No. 2) peut également être remplacée par un acide aminé tel que la tyrosine (par exemple SEQ ID No 12). La séquence nucléotidique codant pour le GDXa peut être synthétisée par voie chimique (Young L and Dong Q., 2004,-Nucleic Acids Res., Apr 15;32(7), Hoover,D.M. and Lubkowski,J. 2002,. Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285). La séquence nucléotidique codant pour le GDXa peut être également amplifiée par PCR en utilisant des amorces adaptées. Le GDXA peut également être produit par des techniques de génie génétique bien connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique codant pour le facteur X humain peut ainsi être cloné dans un vecteur d'expression ; la partie de la séquence nucléotidique codant pour le peptide signal, le propeptide et domaine Gla est délétée, un peptide signal est fusionné, comme celui du TIMP-1 (Crombez et al., 2005). Le facteur X modifié ainsi produit peut être activé soit par le complexe TF-FVIIa, soit par tout autre enzyme clivant la liaison entre l'arginine 234 et l'isoleucine 235 (numérotation selon Swiss-Prot : P00742.2). Alternativement, le GDXa peut être produit directement par insertion d'une séquence de clivage reconnue par les furines ou toute autre enzyme intracellulaire, directement en amont de l'isoleucine 235 ; une séquence codant pour ces acides aminés tels que arginine-lysine- arginine permet un clivage par les furines (Nakayama et al., 1997). Pour améliorer le clivage, une séquence arginine-lysine-arginine- arginine-lysine- arginine peut être introduite. L'ADN codant pour un tel FX modifié est inséré dans un plasmide d'expression et inséré dans une lignée cellulaire ad hoc pour sa production (par exemple la lignée HEK-393E), la protéine ainsi produite étant ensuite purifiée par chromatographie. Ces techniques sont décrites en détail dans les manuels de référence : Molecular cloning : a laboratory manual, 3ième édition- Sambrook and Russel eds., (2001) et Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al. eds (2007). Ainsi, les GDXa peuvent être également représentés par leur séquences nucléotidiques codant pour les GDXa cités ci-dessus, ainsi de telles séquences sont représentées par les identifiants de séquence suivant : SEQ ID No 15 à SEQ ID No 18 pour les chaines légères et par SEQ ID No. 14 pour la chaine lourde. Un tel facteur modifié est bien connu de l'art antérieur (Morita et Jackson, 1986 ; Skogen et al., 1984, Padmanabhan et al., 1993. J. Mol. Biol., 232 : 947-966 ou US2009/2298119). La composition pharmaceutique selon la présente invention peut être formulée sous toute forme galénique nécessaire à son administration. En particulier, s'agissant d'administration par voie systémique, la composition selon l'invention peut être formulée sous forme de poudre lyophilisée stérile pour injection. Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent également être administrées par voie nasale ou parentérale. Elles pourront donc comprendre, en plus des principes actifs, tout adjuvant de formulation pharmaceutiquement acceptable, connu de l'homme du métier et qui est nécessaire à la préparation de la composition pharmaceutique sous la forme souhaitée et notamment tout excipient capable de stabiliser la protéine GDXa lyophilisée après reconstitution par une solution aqueuse pour son injection ultérieure. Dans le cas d'un accident hémorragique, la composition pharmaceutique selon la présente invention pourra être administrée à une concentration 10 à 20 fois plus faible que le FVIIa recombinant (Novoseven®), lequel est administré selon une posologie allant de 90 à 270 µg/kg et par dose administrée. Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant le GDXa non thrombogène et pouvant se lier au TFPI mais ne pouvant pas se lier aux phospholipides pour une administration au patient atteint d'hémophilie A ou B avec ou sans inhibiteur de 4.5 à 27 µg/kg par dose administrée. Cette administration peut être faite par voie systémique, nasale ou parentérale. Légendes des figures Figure 1 : Détermination de la Vmax et du Km du facteur Xa et du GDXa Figure 2 : Inhibition du Xa et du GDXa par le TFPI Figure 3 : Génération de thrombine en présence de GDXa. Figure 4 : Génération de thrombine en présence de FXa Figure 5 : correction de la génération de thrombine par le rVlla et GDXa La présente invention sera illustrée par les exemples suivants. Exemples Exemple 1 : Préparation du Facteur Xa modifié Le plasmide pTT5 est ouvert par digestion à l'aide des enzymes HindIll 20 BamHl et les gènes codant pour le peptide signal du TIMP1 avec les sites de restrictions HindIll et Nhel et du FX dépourvu du domaine Gla avec les sites de restrictions Nhel et BamHl sont insérés, générant le plasmide pTT5-TIMX (pTT5 spTIMP1 gla less FX). La séquence codant pour le FX dépourvu du domaine Gla selon l'invention avec les sites de restrictions Nhel et BamHl a été 25 obtenue par synthèse chimique (GenScript Corporation) Puis un site de reconnaissance pour les furines a été introduit en amont de l'Isoleucine N-terminale de la chaine lourde permettant la sécrétion du GDXa directement dans le milieu de culture pour purification. Le GDXa produit est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID No. 3 pour sa chaine légère et par SEQ ID 30 No. 2 pour sa chaine lourde. Exemple 2 : caractéristiques que GDXa La mesure du Km et du Vmax pour le Xa et le GDXa est mesurée en incubant une même quantité d'enzyme (0.2 nM) avec des concentrations 35 croissantes de substrat (S1025). Les valeurs obtenues sont pour le Xa,15 Km=0.65±0.06 mM et Vmax=0.117±0.004 mM/mn et pour le GDXa, Km=0.81±0.07 mM et Vmax=0.091±0.003 mM/mn (Figure 1) Exemple 3 : Inhibition du Xa et du GDXa par le TFPI Une même quantité de Xa et de GDXa (0.1 nM) est incubée 30 mn en présence de concentrations croissantes de TFPI. A la fin de l'incubation, l'activité enzymatique résiduelle est mesurée à l'aide d'un substrat chromogénique S1025 (Figure 2) Exemple 4 : correction de la génération de facteur Ila chez des sujets atteints d'hémophilie A La génération de thrombine est réalisée selon la méthode décrite parHemker (Hemker HC, Wielders S, Kessels H, Béguin S. Continuous registration of thrombingeneration in plasma, its use for the determination of the thrombinpotential. Thrombosis and Haemostasis. 1993; 70: 617-24.). L'activation de la coagulation est réalisée par 1 pM de facteur tissulaire humain recombinant (FT) et de 4 mM de phospholipides procoagulants (PL), en présence de 30 ug/ml de Corn Trypsinlnhibitor (CTI) qui bloque l'activation de la phase contact de la coagulation et permet de s'assurer que la seule activation de la coagulation dépend donc du FT. La génération de thrombine est réalisée sur du plasma normal (NP) et du plasma d'hémophile A (HP). Le plasma d'hémophile ne génère pas de thrombine. L'addition de 5 nM de GDXa normalise la génération de thrombine. Par contre, en l'absence de TF, le GDXa n'active plus la génération de thrombine démontrant la dépendance stricte de la présence du FT pour avoir une génération de thrombine dans le plasma d'hémophile avec le GDXa (Figure 3). Exemple 5 : comparatif entre le facteur Xa et le GDFXa selon 30 l'invention sur la génération de thrombine chez des sujets atteints d'hémophilie A. A la différence du GDXa, le Xa active la coagulation même en l'absence de FT (Figure 4). La génération de thrombine est mesurée selon la même méthode 35 que celle décrite dans l'exemple 4. Exemple 6 : comparatif entre le GDFXa et le facteur Vlla (rVlla, Novoseven®) selon l'invention sur la génération de thrombine chez des sujets atteints d'hémophilie A. La Figure 5 montre que le GDXa est beaucoup plus efficace que le 5 rVlla (Novoseven®) pour corriger la génération de thrombine. Il faut au moins 500 nM de rVlla pour corriger selon : ALJAMALI MN, KJALKE M, HEDNER U, EZBAN M, TRANHOLM M. Thrombingeneration and platelet activation induced by rFVlla (NovoSeven®) and NN1731 in a reconstituted cell-based model mimicking haemophilia conditions. Haemophilia. 10 2009; 15: 1318-26. REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique comprenant un facteur Xa dépourvu de domaine Gla (GDXa) - ledit GDXa étant non thrombogène et pouvant se lier au TFPI mais ne pouvant pas se lier aux phospholipides - pour la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit GDXa comprend une délétion du domaine EGF1, une délétion du domaine EGF2 ou une délétion des domaines EGF1 et EGF2. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le GDXa présente une chaine lourde intacte. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le GDXa est représenté par, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 ou SEQ ID No. 6 pour sa chaine légère et par SEQ ID No. 2 pour sa chaine lourde. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le GDXa est codé par les séquences nucléiques SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 ou SEQ ID No. 18 pour sa chaine légère et par SEQ ID No. 14 pour sa chaine lourde. 6. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 5 pour une administration par voie systémique, nasale ou parentérale.