Brevet FR2963832A1 — publié le 20120217

La présente invention concerne en premier lieu le domaine de l'hémostase chez l'homme, et plus particulièrement un procédé de quantification in vitro de l'effet potentialisateur du fibrinogène sur la capacité de l'organisme à générer de la thrombine après activation de la coagulation, capacité essentielle à l'apparition plus ou moins rapide et efficace d'un caillot sanguin. L'hémostase est l'ensemble des phénomènes vasculaires et sanguins qui permettent l'arrêt d'une hémorragie et le maintien du sang à l'état fluide dans les vaisseaux. Elle est sollicitée en cas d'effraction de la barrière vasculaire comme lors d'un traumatisme ou d'une coupure. Son dérèglement s'accompagne de la survenue d'hémorragie avec écoulement du sang hors des vaisseaux ou à l'inverse de la survenue de thrombose (thrombose veineuse comme une phlébite, une embolie pulmonaire, ou thrombose artérielle comme un infarctus du myocarde, un accident vasculaire cérébral). Ces manifestations peuvent être modérées, graves ou fatales, justifiant la recherche et la prise en charge d'une anomalie de l'hémostase dans de telles situations et la recherche de traitements correspondants. Pour cela la connaissance et la quantification des réactions mises en jeu au cours de l'hémostase est nécessaire. Le fibrinogène est une molécule glycoprotéique allongée formée de 6 chaînes deux à deux identiques liées par des ponts disulfures en position NH2-terminale : 2 chaînes Aa, 2 chaînes B5 et 2 chaînes y. Il est soluble dans le plasma et joue un rôle central à tous les niveaux de l'hémostase : 1/ il se fixe sur la glycoprotéine de membrane plaquettaire GPa2B/53, et participe par ce biais à l'agrégation des plaquettes en formant des ponts moléculaires entre elles; 2/ l'activation de l'ensemble des protéines coagulantes conduit à la transformation du fibrinogène en fibrine; les monomères de fibrine qui sont générés s'organisent en fibres de fibrine, insolubles; elles constituent un filet tridimensionnel fixé à la paroi vasculaire, le substratum du caillot, qui emprisonne les cellules sanguines; cette étape est en partie seulement évaluée par la capacité du fibrinogène à coaguler; 3/ les fibres de fibrine sont coupées de façon retardée par la plasmine, enzyme générée à la surface de la fibrine, ce qui conduit à la dégradation du caillot. La transformation du fibrinogène en fibrine est réalisée par le clivage et départ des deux peptides NH2 terminaux des chaînes Aa puis des deux peptides NH2 terminaux des chaînes B13, avec réarrangement moléculaire et précipitation de la molécule ainsi modifiée. Elle va pouvoir s'associer à d'autres molécules ainsi transformées pour former un réseau de fibres qui précipitent. Ce réseau constitue la structure insoluble du caillot sanguin, en incorporant dans ses mailles des cellules sanguines comme les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes. Ces clivages de la molécule de fibrine sont effectués par la thrombine qui est produite à partir d'une molécule précurseur, la prothrombine, lors de l'apparition d'activateurs adéquats réunis dans certaines circonstances, comme une lésion tissulaire ou une activation des cellules sanguines ou une activation des cellules de la paroi vasculaire. Ceci se produit lors d'agression tissulaire comme un écrasement, une coupure, un coup, ou spontanément en pathologie avec apparition de thrombose (phlébite, embolie pulmonaire, infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral,...). De ces données, il peut être déduit que l'évaluation de l'interaction entre la thrombine et le fibrinogène est importante à connaître et à déterminer afin de rechercher des dysfonctionnements possibles de la coagulation ou des traitements agissant sur cette interaction. La thrombine qui apparaît lors d'une activation de la coagulation peut être générée par deux systèmes, le système de la voie intrinsèque et le système de la voie extrinsèque, impliquant différents activateurs et selon différentes modalités de mise en jeu. Sa concentration évolue au cours du temps de façon variable, dépendant des concentrations respectives en les différents activateurs, les autres molécules de régulation (cofacteurs comme les facteurs VIII et V et inhibiteurs comme l'antithrombine). Cette concentration peut être mesurée de façon ponctuelle, mais elle peut être également suivie au cours du temps, mettant en évidence une phase d'apparition avec croissance de la concentration, puis une phase de disparition avec décroissance de la concentration. Ainsi peut être évaluée la cinétique de formation de thrombine appelée également génération de thrombine. Il s'agit d'un principe de mesure ancien, avec quantification séquentielle de la thrombine disponible. Différentes techniques ont été depuis décrites et sont disponibles sur le marché. Elles sont utilisables à partir du plasma mais aussi parfois à partir du sang total. Elles évaluent l'apparition du site actif de la thrombine par clivage d'un substrat chromogène spécifique à ce site, par clivage d'un substrat fluorogène spécifique, par l'apparition de complexe thrombine-antithrombine, par l'apparition d'un caillot de fibrine détecté de façon mécanique ou optique, par l'effet de la thrombine sur les plaquettes. Dans des situations pathologiques comme les hémophilies ou d'autres déficits constitutionnels, cette génération est insuffisante par déficit d'un facteur de la coagulation, et aboutit à des hémorragies lors de lésion tissulaire. Dans des situations pathologiques comme les maladies thromboemboliques veineuses, cette génération peut être augmentée et associée à des thromboses inattendues, voire récidivantes, tout comme lors de thromboses artérielles. Ainsi l'étude de la génération de thrombine peut mettre en évidence un dysfonctionnement de l'hémostase, tant au niveau d'une insuffisance avec risque d'hémorragie, qu'au niveau d'une efficacité accrue avec risque de thrombose. L'intérêt de repérer ce genre d'anomalie est de proposer une prévention adaptée pour éviter une nouvelle thrombose chez les sujets présentant l'anomalie, de proposer à ces mêmes sujets un allongement de la durée du traitement anticoagulant prenant en compte l'anomalie de façon spécifique afin d'éviter une récidive, de rechercher des sujets apparentés présentant cette anomalie alors qu'ils n'ont pas encore manifesté de thrombose pour leur proposer une attitude préventive. En cas de maladie hémorragique comme une hémophilie modérée, l'intérêt est de proposer un traitement plus important que ne le justifierait l'abaissement modéré du taux de facteur coagulant pour éviter une hémorragie. Pour les raisons qui précèdent, il est admis qu'une évaluation de la capacité à générer de la thrombine peut être recherchée en cas de maladie thrombotique et en cas de maladie hémorragique. Par ailleurs, pour les mêmes raisons, les traitements visant à réduire ou à majorer la coagulation peuvent être évalués également sur leur capacité à modifier la génération de thrombine. La mise à disposition d'une mesure quantifiant l'effet potentialisateur du fibrinogène sur la génération de thrombine autoriserait la recherche de molécules potentialisant ou déprimant la génération de thrombine, et l'identification de molécules variantes de fibrinogène. Or actuellement, lors d'une étude de la coagulation, seule est mesurée la quantité du fibrinogène, et une évaluation globale de la thrombine générée ne permet pas de faire apparaître un effet spécifique du fibrinogène. Les Inventeurs ont réalisé qu'il était possible d'identifier et de quantifier de façon spécifique l'intervention d'un fibrinogène particulier à étudier dans la cinétique de génération de thrombine, afin de vérifier l'effet potentialisateur de ce fibrinogène indépendamment de sa concentration plasmatique telle qu'elle est mesurée par les techniques d'activité de l'art antérieur. Ces techniques font intervenir la capacité du fibrinogène à être transformé en caillot par une quantité constante de thrombine déjà existante et non générée au cours de l'expérience (selon Clauss) ou la quantité de fibrine formée à un état stable de la coagulation (méthodes dites dérivées). Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet un procédé de quantification de l'effet potentialisateur du fibrinogène sur la génération de thrombine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) extraire le fibrinogène dont l'effet potentialisateur est à tester à 25 partir d'un échantillon le contenant, b) préparer un milieu réactionnel qui comprend les composés nécessaires à la génération de thrombine mais qui est dépourvu de fibrinogène, c) ajouter le fibrinogène à tester extrait à l'étape a) au milieu 30 réactionnel préparé à l'étape b), d) activer la coagulation dans le mélange ainsi obtenu à l'étape c), e) mesurer la génération de thrombine et déterminer la variation éventuelle de génération de thrombine par rapport à celle d'un échantillon de référence. En particulier, le procédé de l'invention comprend uniquement les 5 étapes a) à e) mentionnées ci-dessus. La présente invention permet ainsi de quantifier les propriétés de potentialisation du fibrinogène sur la génération de thrombine dans des conditions maîtrisées, alors que les techniques coagulométriques actuelles mesurant le fibrinogène ne permettent pas de réaliser cela. 10 Selon l'invention, l'extraction du fibrinogène dont l'effet potentialisateur est à tester peut être réalisée à partir de tout échantillon le contenant. De préférence, le fibrinogène à tester est extrait à partir d'un échantillon biologique, c'est-à-dire issu d'un sujet chez qui l'effet potentialisateur du fibrinogène est à étudier. Un tel échantillon biologique 15 peut consister en tout liquide ou fluide biologique, de préférence circulant, susceptible de contenir du fibrinogène. Par exemple, le fibrinogène à tester peut être extrait à partir de sang, et en particulier du plasma, mais également à partir d'autres liquides tels que le liquide articulaire, le liquide céphalo-rachidien. En particulier, un agent anticoagulant, de préférence le 20 citrate, est ajouté à l'échantillon contenant le fibrinogène à étudier lors du prélèvement. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le fibrinogène à tester est extrait du plasma. Le fibrinogène à tester peut également être extrait d'un échantillon non issu d'un sujet, comme par exemple à partir d'une culture cellulaire capable de synthétiser du 25 fibrinogène in vitro, et en particulier à partir du surnageant d'une telle culture. L'échantillon contenant le fibrinogène à tester peut être utilisé de suite, ou bien conservé, notamment congelé, jusqu'à l'extraction du fibrinogène. Toute méthode permettant d'extraire le fibrinogène à tester peut 30 être utilisée dans le cadre de la présente invention du moment qu'elle permet la séparation du fibrinogène de la prothrombine et des autres molécules intervenant dans la génération de thrombine. Par exemple, l'extraction lors de l'étape a) du fibrinogène à tester peut être réalisée par précipitation ou par chromatographie d'adsorption. La méthode décrite dans FR 2798469 constitue un mode de réalisation tout particulièrement préféré du procédé selon l'invention. La précipitation du fibrinogène peut notamment être réalisée à l'aide d'un agent précipitant choisi parmi le sulfate d'ammonium, la glycine, l'éthanol, le polyéthylène glycol et la bêta alanine, et de préférence à l'aide de glycine. Le précipité est ensuite récupéré, par exemple par centrifugation, puis lavé. Pour ce faire, la glycine peut notamment être utilisée à une concentration finale d'environ 1,5 M (M pour mol/L). La glycine peut aussi être utilisée pour laver le précipité obtenu, et en particulier une solution de glycine à 3 M par exemple. Une solution de bêta alanine à une concentration finale comprise de préférence dans une gamme allant de 1 M à 3 M peut également être utilisée, ou bien le sulfate d'ammonium à une concentration finale pondérale comprise de préférence dans une gamme allant de 10 à 30 %, ou encore l'éthanol à une concentration finale comprise de préférence dans une gamme allant de 0,7 M à 2,0 M. Par chromatographie d'adsorption, l'extraction du fibrinogène peut par exemple être réalisée à l'aide d'anticorps anti-fibrinogène ou de fragments de fibrine immobilisés et fixant le fibrinogène à extraire. L'étape d'extraction du fibrinogène à tester peut être réalisée dans des microtubes à centrifugation, par exemple à fond conique et supportant de fortes accélérations. Le milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène préparé à l'étape b) du procédé selon l'invention peut consister en un simple mélange des différents facteurs nécessaires à la génération de thrombine, à l'exception du fibrinogène. Ces facteurs sont notamment la prothrombine, des activateurs de la coagulation tels que le facteur tissulaire ou l'acide ellagique, des cofacteurs tels qu'un support réactionnel comme des phospholipides, des proenzymes qui vont agir en cascade comme les facteurs XII, XI et IX ou le facteur VII, du facteur X, des cofacteurs comme les facteurs V et VIII, du calcium sous forme ionique. Ces facteurs sont disponibles dans le commerce ou peuvent être préparés à partir de plasma, ou synthétisés par recombinaison génétique. Ce milieu réactionnel peut également être obtenu à partir d'un échantillon biologique issu d'un sujet, de préférence d'un sujet sain ou tout du moins ne souffrant d'aucune maladie ou d'aucun trouble de la coagulation connu. Le milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène préparé à l'étape b) est de préférence obtenu à partir d'un échantillon biologique le contenant. Un tel échantillon biologique est de préférence le sang ou en particulier le plasma. Dans ce cas, le milieu réactionnel tel que défini dans la présente invention, à savoir comprenant les composés nécessaires à la génération de thrombine mais dépourvu de fibrinogène, peut notamment être obtenu par déplétion en fibrinogène de l'échantillon biologique choisi. N'importe quel procédé de déplétion en fibrinogène peut être utilisé pour obtenir le milieu réaction selon la présente invention, à condition que l'ensemble du fibrinogène puisse être éliminé afin d'obtenir une déplétion totale en fibrinogène, c'est-à-dire que la quantité de fibrinogène ne puisse pas être mesurable par les techniques classiques ou négligeable par rapport à l'apport en fibrinogène à tester, et en particulier inférieure à 0,2 g/L. En effet, il importe que le milieu réactionnel soit dépourvu de fibrinogène pour permettre une mesure dépendant spécifiquement du fibrinogène à tester, mais contienne les molécules autres essentielles à la réaction. Pour réaliser la déplétion en fibrinogène, on utilisera de préférence un ou des moyens qui permettent de séparer le fibrinogène de son environnement naturel sans activation de la molécule et sans activation du milieu environnant le fibrinogène avec des enzymes comme la thrombine. A ce titre, on évitera d'utiliser des procédés de déplétion par addition d'enzymes de clivage du fibrinogène, telle que la reptilase par exemple, qui peuvent laisser subsister des fibrinopeptides. En particulier, on utilisera des moyens physiques ou mécaniques qui permettent d'isoler le fibrinogène sans clivage. Parmi ceux-ci, on peut notamment citer la précipitation et les techniques d'adsorption du fibrinogène, comme celles mentionnés ci-dessus concernant les procédés d'extraction du fibrinogène. De préférence, la déplétion en fibrinogène d'un échantillon le contenant est réalisée sans apport d'élément diluant. En particulier, le milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène préparé à l'étape b) peut être obtenu par addition d'un composé à l'état sec permettant la précipitation du fibrinogène sans dilution de l'échantillon le contenant, puis élimination du précipité obtenu. Un composé à l'état sec selon la présente invention est un composé 10 qui contient moins de 1 % de liquide, et en particulier de solvant et notamment d'eau. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention, le composé permettant la précipitation du fibrinogène pour être éliminé est de préférence la glycine à l'état sec. Dans ce cas, la 15 glycine est de préférence utilisée à une concentration supérieure ou égale à 2,5 M. En particulier, elle peut être avantageusement utilisée dans une quantité comprise dans la gamme allant de 190 mg à 225 mg de glycine pour 1 mL d'échantillon le contenant, et en particulier de plasma. Par exemple, on peut préparer un plasma déplété en fibrinogène par addition de 20 0,225 g de glycine à l'état sec dans 1 mL de plasma. Le précipité ainsi obtenu et contenant le fibrinogène est éliminé, de préférence par centrifugation. Le surnageant est alors collecté, correspondant au milieu réactionnel déplété en fibrinogène. Il va être utilisé pour mesurer la thrombine générée après mélange avec le fibrinogène à tester. 25 Le milieu réactionnel peut être obtenu par addition d'une quantité d'échantillon biologique définie dans un récipient comme un tube contenant une quantité préétablie de glycine, tube dont la paroi porte une marque définissant le volume total du mélange à atteindre pour respecter le rapport de précipitation initialement défini comme optimal pour la réaction de 30 précipitation. Lors de l'étape c), le fibrinogène à tester qui a été extrait à l'étape a) est ajouté au milieu réactionnel préparé à l'étape b). De préférence, la quantité de fibrinogène à tester qui est ajoutée dans le milieu réactionnel lors de l'étape c) est d'au moins 0,5 mg/mL de milieu réactionnel. L'activation de la coagulation peut être réalisée par toute technique bien connue du domaine, et notamment par ajout d'un mélange d'activateurs de la coagulation et de calcium. Lors d'un suivi cinétique de la génération de thrombine, on attendra de préférence de dépasser la fin de la génération possible de thrombine, comme par exemple 60 minutes. La thrombine générée peut être mesurée par n'importe quel procédé connu dans le domaine. Par exemple, on peut utiliser un substrat spécifique au site actif de cette thrombine, et suivre sa production en continu au cours du temps. En particulier, la génération de thrombine peut être évaluée à l'aide du potentiel thrombinique (ETP, mesuré par l'aire sous la courbe), du pic de génération maximale, du délai avant génération (ou « lag time »), du temps d'obtention du pic de génération maximale, du temps de fin de génération. De préférence, la génération de thrombine est évaluée par la mesure de l'aire sous la courbe, traduction du potentiel thrombinique ou ETP exprimé en nM d'équivalent thrombinique. Afin de mettre en évidence et de quantifier l'effet potentialisateur du fibrinogène à tester sur la génération de thrombine, la variation éventuelle de génération de thrombine est déterminée par rapport à celle d'un échantillon de référence. La quantité de thrombine générée peut être comparée à celle obtenue à partir d'un milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène et sans addition du fibrinogène à tester, à celles obtenues à partir de plusieurs milieux réactionnels additionnés de quantités variables de fibrinogène contrôle, permettant ainsi d'obtenir une gamme de valeurs de référence, ou bien additionnés d'un ou de plusieurs fibrinogènes de comparaison traités dans les mêmes conditions et en même temps que celles utilisées pour le fibrinogène à tester. En particulier, l'échantillon de référence mentionné à l'étape e) peut est constitué du milieu réactionnel préparé à l'étape b) dans lequel on ajoute lors de l'étape c), à la place du fibrinogène à tester, une quantité équivalente de solution de dilution dans laquelle est contenu le fibrinogène à tester une fois extrait à l'étape a). Pour ce faire, le milieu réactionnel préparé à l'étape b) est complété de manière à remplacer le volume du fibrinogène à tester qui a été ajouté dans l'échantillon test, c'est-à-dire le milieu réactionnel dans lequel est ajouté le fibrinogène à tester. Des exemples de solutions de dilutions qui peuvent être utilisées sont notamment des solutions tampon, comme par exemple une solution Tris NaCl. L'échantillon de référence peut également être un échantillon contenant un fibrinogène contrôle ou un fibrinogène de comparaison. Selon la présente invention, un fibrinogène contrôle peut être un fibrinogène extrait à partir d'un échantillon issu d'un sujet normal, c'est-à-dire sain, et en particulier ne souffrant d'aucune maladie ou d'aucun trouble de la coagulation connu. II peut également consister en un fibrinogène de synthèse, préparé par des procédés naturels ou biologiques, comme par exemple par culture cellulaire in vitro, ou par des procédés chimiques. La mesure de l'effet potentialisateur du fibrinogène selon l'invention est reproductible, ce qui permet son utilisation à des fins de recherche voire de diagnostic. Ainsi, le fibrinogène d'un patient peut être extrait pour rechercher un fonctionnement anormal dans la potentialisation de génération de thrombine. Une augmentation de ce potentiel pourra se traduire par un risque accru d'évènement thrombotique, et une diminution par un risque accru d'évènement hémorragique, avec incitation à des traitements préventifs correspondants. Lorsque l'échantillon de référence mentionné à l'étape e) est un échantillon contenant un fibrinogène contrôle, la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) permet alors d'évaluer le risque de pathologies ou troubles de la coagulation. La comparaison de la génération de thrombine mesurée pour le fibrinogène à tester et pour le fibrinogène contrôle peut être réalisée à partir de mesures faites en parallèle avec le fibrinogène à tester et le fibrinogène contrôle, ou bien par comparaison de la mesure effectuée sur le fibrinogène à tester avec des valeurs mesurées antérieurement en ce qui concerne le fibrinogène contrôle, à condition que les mesures aient été réalisées dans des conditions expérimentales au moins équivalentes, voire identiques. Parmi les pathologies ou troubles de la coagulation dont le risque peut être évalué par la mise en oeuvre du procédé selon I1nvention, on peut notamment citer les maladies thrombotiques et les maladies hémorragiques telles que la thrombose veineuse (phlébite ou embolie pulmonaire) inattendue ou récidivante, la thrombose artérielle inattendue (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral), une hémorragie spontanée (intratissulaire comme un hématome, un hémopéritoine, une hémorragie intracérébrale, ou extériorisée comme une épistaxis, une hémorragie urinaire, une hémorragie digestive) ou induite par une lésion tissulaire (comme une plaie cutanée, un traumatisme, un acte chirurgical). En particulier, le risque de maladies thrombotiques est augmenté lorsque la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) est une augmentation de la génération de thrombine par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle. De préférence, ces maladies sont choisies parmi la thrombose veineuse (phlébite ou embolie pulmonaire) inattendue ou récidivante, la thrombose artérielle inattendue (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral. Dans ce cas, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'augmentation de la génération de thrombine est d'au moins 5 %, de préférence d'au moins 10 %, par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle. De même, le risque de maladies hémorragiques est augmenté lorsque la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) est une diminution de la génération de thrombine par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle. En particulier, le procédé permet d'évaluer le risque d'hémorragie spontanée spontanée (intratissulaire comme un hématome, un hémopéritoine, une hémorragie intracérébrale, ou extériorisée comme une épistaxis, une hémorragie urinaire, une hémorragie digestive) ou induite par une lésion tissulaire (comme une plaie cutanée, un traumatisme, un acte chirurgical). Dans ce cas, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la diminution de la génération de thrombine est d'au moins 30 %, de préférence d'au moins 40 %, par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle. Lorsque l'échantillon de référence mentionné à l'étape e) est un échantillon contenant un fibrinogène de comparaison, la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) du procédé permet également d'évaluer l'efficacité d'un traitement visant à réduire ou majorer la coagulation. Selon la présente invention, un fibrinogène de comparaison peut être un fibrinogène issu du même sujet mais correspondant à un état différent. Dans cette application particulière, le fibrinogène de comparaison correspond au fibrinogène avant traitement et le fibrinogène à tester correspond au fibrinogène après traitement. La comparaison peut également être effectuée entre le fibrinogène à tester qui correspond à un stade X+n du traitement alors que le fibrinogène de comparaison correspond au stade X du traitement. Sur cette base, le procédé selon l'invention peut également trouver une application particulière pour étudier l'évolution d'une maladie en comparant la mesure effectuée sur un fibrinogène à tester correspondant à un stade Z avec celle effectuée sur un fibrinogène de comparaison correspondant à un stade antérieur au stade Z. De préférence, lorsque l'effet du fibrinogène à tester est comparé à celui d'un fibrinogène contrôle ou d'un fibrinogène de comparaison dans des tests faits en parallèle, la mesure de la thrombine générée est effectuée en utilisant le même milieu réactionnel dans lequel est ajouté soit le fibrinogène à tester, soit le fibrinogène contrôle ou le fibrinogène de comparaison. Le procédé de l'invention trouve également une application particulière pour la recherche d'une modification de l'interaction du fibrinogène avec la thrombine, comme cela peut être attendu dans des anomalies du fibrinogène, ou avec des sous-types moléculaires du fibrinogène, et sans que la mesure habituelle du fibrinogène ne permette d'établir ni de suspecter cela. La recherche de molécules à visée thérapeutique interférant avec cette étape peut également être envisagée par l'utilisation de cette quantification, comme des molécules diminuant cette potentialisation ou des molécules majorant cette potentialisation. De la même façon, le procédé selon l'invention permet de mettre en évidence la capacité de molécules d'agir dans le sens d'une diminution ou d'un accroissement de l'effet du fibrinogène sur la génération de thrombine afin de déterminer leur intérêt thérapeutique. Selon un deuxième aspect, la présente invention a également pour objet un kit ou trousse, caractérisé en ce qu'il comprend : - le ou les réactifs permettant d'extraire le fibrinogène à tester à partir d'un échantillon le contenant, - le ou les réactifs permettant de préparer un milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène, - un échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle dont les caractéristiques de potentialisation sur la génération de thrombine ont été établies précédemment, et - éventuellement le ou les réactifs permettant de doser le fibrinogène à tester, et/ou d'activer la coagulation, et/ou de mesurer la génération de thrombine. Ce kit permet notamment la quantification de l'effet potentialisateur du fibrinogène sur la génération de thrombine. Pour une extraction du fibrinogène par précipitation, les réactifs permettant d'extraire le fibrinogène à tester sont de préférence constitués d'une solution de précipitation du fibrinogène, d'une solution de lavage du précipité et d'une solution de dilution du précipité obtenu. Pour une extraction du fibrinogène par chromatographie d'adsorption, les réactifs permettant d'extraire le fibrinogène à tester sont de préférence constitués d'un milieu d'adsorption du fibrinogène, d'un tampon de lavage, et d'un tampon d'élution.. Ces réactifs peuvent être conditionnés sous une forme prête à l'usage et mis à disposition dans un récipient, comme des microtubes à centrifugation, permettant à la fois l'adsorption des protéines susceptibles de contaminer la préparation, puis la récupération par centrifugation du surnageant contenant le fibrinogène à tester, ou la précipitation du fibrinogène, puis la collecte de ce précipité par centrifugation, puis le lavage de ce précipité par la solution de précipitation, puis la dissolution de ce précipité dans la solution de dilution, ou l'adsorption du fibrinogène à tester, puis sa récupération par des centrifugations dans le même contenant en présence des différentes solutions de lavage et d'élution. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention, le réactif permettant de préparer un milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène est constitué de glycine à l'état sec. Le kit selon l'invention contient également un échantillon contenant un fibrinogène contrôle permettant de juger du comportement du fibrinogène à tester vis-à-vis de sa capacité à moduler la génération de thrombine après activation de la coagulation. Dans le cadre de la présente invention, l'ensemble de modes de réalisation préférés mentionnés ci-dessus pour le procédé de quantification sont également applicables pour le kit. La présente invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent et qui se réfèrent aux figures annexées dans lesquelles : La figure 1 représente le potentiel thrombinique (ETP) mesuré et 25 exprimé en nM par rapport à la concentration de fibrinogène à tester ajouté au milieu réactionnel déplété en fibrinogène. La figure 2 représente la relation entre la variation de potentiel thrombinique du fibrinogène de haut poids (HMWF) pré et post opératoire estimé par immunoblot (aire sous la courbe-axe des abscisses) et la variation 30 de potentiel thrombinique du fibrinogène pré et post opératoire mesuré selon le procédé de l'invention (aire sous la courbe-axe des ordonnées). EXEMPLES METHODES Étude de la coagulation : Le taux de fibrinogène plasmatique a été déterminé par technique coagulométrique de Clauss réalisée à l'aide du réactif Fibriprest® (Diagnostica Stago). La détection du caillot était effectuée sur analyseur ACLTop® (International Laboratory, Paris, France), système à détection optique, et sur analyseur STA-R® (Diagnostica Stago, Asnières, France), système à détection mécanique. Extraction du fibrinogène à tester : Le plasma est obtenu à partir de sang total prélevé sur anticoagulant (citrate 0,11 M; un volume pour 10 volumes final) par centrifugation 30 minutes à 2500 g, puis conservé congelé en aliquotes de 1 mL. Un volume de 0,8 mL de glycine 3 M est mélangé au même volume de plasma puis le mélange est incubé 10 minutes à +4°C. Le précipité formé extemporanément est recueilli par une centrifugation de 10 minutes à 16°C et à 20000 g en tube conique. Après élimination du surnageant, le précipité restant dans le tube est lavé à trois reprises par la glycine, en centrifugeant 10 minutes de la même manière. Le précipité est dissout à l'issue du dernier lavage dans un volume de tampon de dissolution (tris 0,05 M; NaCl 0,1 M; pH 7,4) identique au demi-volume de plasma traité, et homogénéisé par agitation au vortex. La solution obtenue ainsi est riche en fibrinogène. Sa concentration en protéines est déterminée par la technique de Bradford. Pour son étude dans le système de génération de thrombine, il est dilué dans le même tampon de manière à obtenir une solution à 1 g/L. Méthode d'électrophorèse utilisée : Elle suit les recommandations du constructeur, utilisant les gels de polyacrylamide 7°h et 3-8% NuPage® Tris Acetate, le tampon échantillon, le tampon de migration, l'agent réducteur, la solution de coloration "Colloidal Coomassie Stain", le marqueur de poids moléculaire du même constructeur (Invitrogen, Cergy Pontoise, France). Le dépôt est de 1 pg de protéine par bande attendue pour une coloration par bleu de Coomassie. 15 Obtention du milieu réactionnel déplété en fibrinogène : Une quantité de plasma de référence nécessaire à la manipulation pour une étude de génération de thrombine est dispensé dans un tube conique de 5 mL comme par exemple un volume de 1 mL. Une quantité adéquate de glycine est ensuite ajoutée directement sur le plasma en agitant, comme 0,225 g de glycine pour 1 mL de plasma. Le mélange est placé sur un agitateur automatique pendant 5 minutes. Il est ensuite centrifugé 10 minutes à 4000 g. Le surnageant obtenu présente une concentration en fibrinogène non détectable (inférieur à 0,2 g/L sur l'analyseur STA-R®). Il est utilisé directement comme milieu réactionnel (déplété en fibrinogène) pour les manipulations de génération de thrombine. Mesure de la thrombine générée : La quantité de thrombine générée après activation de la coagulation en présence d'un mélange de milieu réactionel dépourvu de fibrinogène, de phospholipidiques, d'un substrat fluorogène spécifique du site actif de la thrombine, de calcium et du fibrinogène à tester est suivie au cours du temps à l'aide d'un fluoromètre Fluoroskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Thermolabsystems OY, Helsinki, Finland). L'activation de la coagulation, le support phospholipidique, le substrat fluorogène spécifique du site actif de la thrombine et le calcium sont des réactifs commercialisés par la société Thrombinoscope BV (Maastricht, Pays-Bas). La réaction est réalisée dans une plaque 96 puits PS-Microplate (Greiner Bio-one, Courtaboeuf, France). Dans chaque puits est apporté 20 pL d'un mélange activateur de la coagulation & phospholipides (réactif PPP-Reagent), 40 pL de milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène (défibriné comme indiqué au paragraphe précédent), et 40 pL d'une solution à 1 g/L du fibrinogène à étudier. La réaction est déclenchée par l'injection de 20 pL d'un mélange de substrat et de calcium réalisé extemporanément selon les préconisations du constructeur (mélange FluCa effectué à partir des solutions Fluo-Buffer & Fluo-Substrate). Le volume final de réaction est de 120 pL. L'évolution de la fluorescence est suivie à partir de ce moment, correspondant à l'apparition de fluorophore témoin de l'hydrolyse induite par le site actif de la thrombine générée. Cette apparition est traduite en courbe d'intensité cinétique. La quantité de thrombine générée est évaluée selon les recommandations du constructeur Thrombinoscope BV par la mesure de l'aire sous la courbe, traduction du potentiel thrombinique ou ETP, exprimé en nM d'équivalent thrombinique. Les résultats obtenus correspondent à la valeur moyenne calculée à partir de manipulations effectuées systématiquement en triple. RÉSULTATS Obtention de fibrinogène : La solution de fibrinogène obtenue présente une concentration protéique supérieure à 1 g/L. Pour 35 plasmas traités possédant un taux moyen de 3,1 g/L, la concentration moyenne obtenue est de 1,9 g/L. La qualité du fibrinogène obtenu par précipitation est vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide et coloration par bleu de Coomassie, et par électrophorèse en gel de polyacrylamide avec transfert sur membrane de nitrocellulose et révélation par un anticorps antifibrinogène. Une échelle de poids moléculaire permet le calcul du poids moléculaire apparent des bandes colorées ou immunomarquées. Dans les conditions utilisées, il n'a pas été retrouvé de bande contaminante autre que celles attendues pour le fibrinogène en conditions réductrices (bandes Aa, B(3 et ? de poids moléculaire 66, 54 et 49 kDa) et non réductrices (bandes HMWF, LMWF et LMWF' de poids moléculaire 340, 305 et 270 kDa). Effet de la défibrination du milieu réactionnel : Dans les conditions mentionnées, la technique de défibrination permettant d'obtenir le milieu réactionnel à partir d'un échantillon de plasma a permis de passer d'une concentration moyenne de fibrinogène de 3,7 g/L à une quantité non mesurable (inférieure à 0,2 g/L) sur 4 mélanges de plasmas traités 8 fois, alors que les concentrations moyennes en facteur II, facteur V et facteur VII&X passent respectivement de 107 à 67 %, 103 à 75 %, 130 à 91 %. L'utilisation de quantités plus faibles de glycine de 0,2 g et 0,188 g pour 1 mL de plasma (soit des concentrations finales d'environ 2,66 M et 2,5 M) permet une déplétion comparable en fibrinogène en conservant des taux de facteur Il à 65 %, V à 84 %, VII&X à 76 %. Pour des concentrations inférieures, il persiste dans le plasma du fibrinogène détectable : les concentrations résiduelles de fibrinogène sont de 0,19 g/L et 0,39 g/L et 2,6 g/L pour des quantités de glycine additionnées de respectivement 0,175 g (n=6) et 0,15 g (n=6) et 0,075 g (n=4). Effet de l'addition d'une solution de fibrinogène à 1 g/L sur le potentiel thrombinique : Au cours de 8 manipulations différentes, l'apport de 40 pL de fibrinogène à tester purifié à la concentration de 1 g/L au milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène a conduit de façon systématique à une augmentation du potentiel thrombinique par rapport à ce même milieu réactionnel additionné du même volume de tampon Tris NaCl. La valeur moyenne de l'ensemble des essais réalisés passe de 1050 nM (n=8, écart- type= 37) à 1454 nM (n=32, écart-type= 165). L'augmentation est de 39,6 % par individu en moyenne, variant entre 20 et 70 %. Comparaison entre la défibrination extemporanée du milieu réactionnel et la défibrination préalable au stockage du milieu réactionnel congelé : La défibrination d'un plasma a été effectuée à 6 reprises le jour de la manipulation pour mesure du potentiel thrombinique et à 6 reprises avant cette manipulation avec un stockage du plasma défibriné sous forme congelée. La mesure du potentiel thrombinique a été alors réalisée en parallèle pour les deux types de milieux réactionnels ainsi obtenus. Les valeurs moyennes obtenues étaient respectivement de 1664 et 1656 nM (écart-types de 146 et 172), non significativement différentes statistiquement. Pour des raisons de commodité, les manipulations retenues ont été ensuite effectuées à l'aide de milieu réactionnel défibriné extemporanément. Essai de reproductibilité intra-essai : La valeur moyenne d'une mesure répétée 6 fois le jour même à l'aide d'un milieu réactionnel identique et d'un fibrinogène contrôle identique obtenu à partir d'un autre contrôle a été trouvée à 1846 nM, avec un écart-type de 82, ce qui permet de calculer un coefficient de variation de 0,04. Essai de reproductibilité inter-essai : La valeur moyenne d'une mesure répétée 13 jours différents à l'aide d'un milieu réactionnel identique et d'un fibrinogène contrôle identique obtenu à partir d'un autre contrôle a été trouvée à 1392 nM, avec un écart-type de 85, ce qui permet de calculer un coefficient de variation de 0,06. Courbe dose réponse : L'introduction de quantité variable de fibrinogène à volume constant dans le milieu réactionnel a été obtenue en faisant varier la concentration de la solution ajoutée de fibrinogène de 0 à 1,5 g/L. Elle permet de mettre en évidence une relation directe entre la thrombine générée et la quantité de fibrinogène. Ceci est figuré sur la figure 1, où plusieurs manipulations indépendantes effectuées avec des concentrations variables de fibrinogène sont rapportées. Vérification de l'absence d'interférence induite par la présence d'héparine dans le plasma permettant la préparation de fibrinogène : Après ajout de différentes quantités d'héparine dans un plasma test (concentrations finales de 0,2 UI/mL, 0,5 UI/mL et 1 UI/mL), le fibrinogène est extrait de ce plasma. Le potentiel thrombinique mesuré avec ces différentes solutions de fibrinogène n'est pas corrélé à la concentration d'héparine présente dans le plasma initial. Vérification de l'absence d'interférence de l'activité procoagulante présente dans le plasma permettant la préparation de fibrinogène : Pour cela, il a été utilisé des plasmas de sujets surveillés pour un traitement anticoagulant. Plus le traitement est efficace, plus le complexe prothrombinique exprimé en pourcentage est bas, et plus l'activité procoagulante présente dans le plasma sera faible. La mesure du potentiel thrombinique en présence de fibrinogène purifié à partir de plasma de sujets surveillés pour un traitement anticoagulant antivitamine K ne diffère pas statistiquement de la mesure effectuée dans les mêmes conditions avec le fibrinogène de sujets sans effet anticoagulant détectable. Dans le premier cas, le fibrinogène a été purifié à partir de plasma dont le temps de Quick exprimé en complexe prothrombinique était de 23 % en moyenne (variant entre 5 % et 34 %, pour 11 observations), avec un potentiel thrombinique moyen de 1483 nM (± 65). Dans le second, le complexe prothrombinique était égal ou supérieur à 100 % (10 observations) et le potentiel thrombinique moyen était mesuré à 1453 nM (±77). Etude de la modification de l'effet de potentialisation du fibrinogène sur la génération de thrombine après chirurgie : Le fibrinogène est présent au niveau plasmatique sous différentes formes. Il est admis que la forme synthétisée est la forme de haut poids moléculaire (340 kDa ou HMWF) qui possède l'extrémité COOH-terminale native sur chacune des deux chaînes Aa. Les deux autres formes sont minoritaires (représentant environ 30 % de l'ensemble) et ne possèdent qu'une extrémité native pour le fibrinogène de bas poids (305 kDa ou LMWF), ou aucune extrémité native pour le fibrinogène de très bas poids (290 kDa ou LMWF'). La disparition de l'extrémité COOH-terminale native des chaînes Aa est secondaire au clivage d'un fragment de 34 kDa par une action enzymatique non identifiée à ce jour, et survenant une fois que le fibrinogène synthétisé a atteint le compartiment plasmatique. Au cours d'une réaction inflammatoire comme celle survenant après chirurgie, la proportion de fibrinogène HMWF augmente par rapport aux formes de bas poids. Or après chirurgie un risque de thrombose est craint. Par exemple après chirurgie de fracture de hanche, cette affection survient dans 35 % des patients sans prévention standard dans l'étude rapportée par Eriksson BI et Lassen MR en 2003. Avec les schémas de prévention actuels, il existe malgré tout un risque thrombotique résiduel, trouvé à 1,4 % par exemple après prévention par fondaparinux rapporté dans cette même étude. Ce risque a été trouvé à 5,6 % des patients hospitalisés pour raison médicale et survenant dans les 15 jours suivants cette hospitalisation malgré un traitement préventif par fondaparinux par exemple. L'hétérogénéité de la molécule de fibrinogène qui apparaît après chirurgie a donc été utilisée comme modèle d'application du procédé selon l'invention. Pour ce faire, des plasmas provenant de prélèvements réalisés sur des sujets immédiatement avant chirurgie et dans les 3 à 5 jours après ont été recueillis. Ces prélèvements pré et postopératoires étaient appariés. Les échantillons sélectionnés parvenaient au laboratoire d'hématologie dans le cadre de la surveillance habituelle des patients. Le plasma restant (fond de tube) était collecté si la concentration en fibrinogène sur le premier prélèvement était normale, comprise entre 2 et 4 g/L, et supérieure à 4 g/L après chirurgie. Après collecte, le plasma a été traité par la glycine de manière à extraire le fibrinogène, qui a ensuite été analysé par électrophorèse, transfert sur membrane de nitrocellulose et marquage par un antisérum antifibrinogène. Ce même fibrinogène a été analysé en parallèle quant à son potentiel de génération de thrombine dans le système indiqué préalablement. Avant purification, le fibrinogène plasmatique passe en moyenne de 3 ,1 g/L ± 0,6 à 6,7 g/L ± 0,6 pour les 35 couples d'échantillons pré et postopératoires. Après purification, la concentration protéique mesurée passe de 1,8 g/L ± 0,5 à 4 g/L ± 0,4. Le rendement brut de la purification est d'environ 60 %, identique pour les échantillons pré et postopératoires. Les formes de haut poids HMWF quantifiées par immunoblot augmentent après chirurgie, passant de 63 % ± 4,6 à 68,6 % ± 5, alors que les formes LMWF baissent de 27,2 % ± 3,7 à 21,8 % ± 4,9. Aucune modification n'est repérable pour les formes LMWF' (9,8 % ±4,1 versus 9,5 % ± 4,5). La comparaison du potentiel thrombinique en présence des fibrinogènes préopératoire et postopératoire retrouve une élévation très significative (p REVENDICATIONS1. Procédé de quantification de l'effet potentialisateur du fibrinogène sur la génération de thrombine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) extraire le fibrinogène dont l'effet potentialisateur est à tester à partir d'un échantillon le contenant, f) préparer un milieu réactionnel qui comprend les composés nécessaires à la génération de thrombine mais qui est dépourvu de fibrinogène, g) ajouter le fibrinogène à tester extrait à l'étape a) au milieu réactionnel préparé à l'étape b), h) activer la coagulation dans le mélange ainsi obtenu à l'étape c), i) mesurer la génération de thrombine et déterminer la variation éventuelle de génération de thrombine par rapport à celle d'un échantillon de référence. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon de référence mentionné à l'étape e) est constitué du milieu réactionnel préparé à l'étape b) dans lequel on ajoute lors de l'étape c), à la place du fibrinogène à tester, une quantité équivalente de solution de dilution dans laquelle est contenu le fibrinogène à tester une fois extrait à l'étape a). 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon de référence mentionné à l'étape e) est un échantillon contenant un fibrinogène contrôle, et que la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) permet d'évaluer le risque de pathologies ou troubles de la coagulation. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le risque de maladies thrombotiques est augmenté lorsque la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) est une augmentation de la génération de thrombine par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle.- 24 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'augmentation de la génération de thrombine est d'au moins 5 %, de préférence d'au moins 10 %, par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le risque de maladies hémorragiques est augmenté lorsque la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) est une diminution de la génération de thrombine par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la diminution de la génération de thrombine est d'au moins 30 %, de préférence d'au moins 40 %, par rapport à l'échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon de référence mentionné à l'étape e) contient un fibrinogène de comparaison et que la nature de la variation de génération de thrombine déterminée à l'étape e) permet d'évaluer l'efficacité d'un traitement visant à réduire ou majorer la coagulation. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'extraction lors de l'étape a) du fibrinogène à tester est réalisée par précipitation ou par chromatographie d'adsorption. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la précipitation est réalisée à l'aide d'un agent précipitant choisi parmi le sulfate d'ammonium, la glycine, l'éthanol, le polyéthylène glycol et la bêta alanine. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la chromatographie d'adsorption est réalisée à l'aide d'anticorps antifibrinogène ou de fragments de fibrine immobilisés et fixant le fibrinogène à extraire. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène préparé à l'étape b) est obtenu par addition d'un composé à l'état sec permettant laprécipitation du fibrinogène sans dilution de l'échantillon le contenant, puis élimination du précipité obtenu. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le composé permettant la précipitation du fibrinogène pour être éliminé est la glycine à l'état sec. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la glycine est utilisée dans une quantité comprise dans la gamme allant de 190 mg à 225 mg de glycine pour 1 mL d'échantillon le contenant. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la quantité de fibrinogène à tester qui est ajoutée dans le milieu réactionnel lors de l'étape c) est d'au moins 0,5 mg/mL de milieu réactionnel. 16. Kit ou trousse caractérisé en ce qu'il comprend : - le ou les réactifs permettant d'extraire le fibrinogène à tester à partir d'un échantillon le contenant, - le ou les réactifs permettant de préparer un milieu réactionnel dépourvu de fibrinogène, - un échantillon de référence contenant un fibrinogène contrôle dont les caractéristiques de potentialisation sur la génération de thrombine ont été 20 établies précédemment, et - éventuellement le ou les réactifs permettant de doser le fibrinogène à tester, et/ou d'activer la coagulation, et/ou de mesurer la génération de thrombine. 17. Kit ou trousse selon la revendication 16, caractérisé en ce que les 25 réactifs permettant d'extraire le fibrinogène à tester sont constitués d'une solution de précipitation du fibrinogène, d'une solution de lavage du précipité et d'une solution de dilution du précipité obtenu. 18. Kit ou trousse selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le réactif permettant de préparer un milieu réactionnel dépourvu 30 de fibrinogène est constitué de glycine à l'état sec.