Brevet FR2969761A1 — publié le 20120629

Procédé de dosage d'anticorps dirigés contre le facteur Vlll L'invention concerne un procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile. L'invention se rapporte également à un procédé de suivi d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile. L'hémophilie est une anomalie constitutionnelle de la coagulation sanguine en rapport avec un déficit d'un des facteurs de la coagulation. Ces défauts sont dus à une déficience d'un des facteurs suivants : XII, XI, IX ou VIII, ou à la présence d'anticoagulants contre l'un de ces facteurs. Les manifestations cliniques de la maladie sont proportionnelles au déficit du facteur de la coagulation. Elles correspondent aux hémorragies qui peuvent atteindre chaque organe, en particulier les articulations (hémarthroses) et les muscles (hématomes). La maladie peut être sévère avec manifestations dès la première année de vie ou légère avec très peu de manifestations. Il existe plusieurs types d'hémophilie en rapport avec le facteur de coagulation déficitaire : ^ l'hémophilie A (hémophilie classique) correspond à une mutation du gène du facteur VIII ^ l'hémophilie B (ou Christmas disease) correspond à une mutation du gène du facteur IX - l'hémophilie C (ou Maladie de Rosenthal) correspond à une mutation du gène du facteur XI. En particulier, l'hémophilie A est due à une déficience en facteur VIII du fait de la mutation du gène ou du promoteur correspondant. Le facteur VIII (ou facteur antihémophilique A) est présent dans le plasma à l'état de traces, et joue un rôle de cofacteur dans la cascade de la coagulation. L'analyse de la molécule facteur VIII montre qu'elle est constituée de trois domaines distincts A, B, C. Le domaine A de 330 AA est fait de trois exemplaires A1, A2, A3. Le domaine B de 983 AA est unique. Le domaine C fait de deux segments C1, C2 de 150 AA chacun. La séquence des différents domaines, de N- en C-terminal, est A1-A2-B-A3-C1-C2. Les traitements actuels de l'hémophilie A ne guérissent pas, mais consistent en l'administration par voie intraveineuse de facteur VIII (FVIII) humain permettant d'obtenir une activité coagulante suffisante pour arrêter, voire prévenir, l'hémorragie. Cependant, les injections répétées de facteur VIII chez un patient induisent la production d'alloanticorps qui inhibent l'action du facteur VIII, aussi appelés « inhibiteurs de facteur VIII » ou « anticorps inhibiteurs de facteur VIII » (Sahud et al, Haemophilia 2007, 13, 317-322, ELISA system for detection of immune responses to factor VIII : a study of 246 samples and correlation with the Bethesda assay). Ces anticorps inhibiteurs de facteur VIII sont actuellement éliminés soit en induisant un protocole de tolérance immune, qui consiste en l'injection de doses massives de facteur Vlll durant des périodes longues, soit en épurant le sang du patient par dialyse (Astermark Thromb Res 2010 nov ; Guillet Brit J Haematol 2001. 114 p837). Une telle méthode est très lourde pour le patient, nécessite du temps et est relativement coûteuse. Il existe donc un besoin de disposer d'une méthode alternative d'élimination des anticorps inhibiteurs de facteur VIII, qui soit efficace, facile à mettre en place, rapide, et moins invasive pour le patient. Par ailleurs, pour qu'un traitement soit efficace, il est judicieux que ce dernier soit adapté au patient. On sait que les anticorps inhibiteurs de facteur VIII développés par un même patient sont de plusieurs idiotypes (Fulcher, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985. 82 p7728). Par idiotype, on entend une conformation caractéristique de la partie variable d'une immunoglobuline (Ig), qui est propre à ce clone d'Ig et qui permet la reconnaissance spécifique d'un antigène. Aussi, il est intéressant de connaître la nature précise du ou des principaux anticorps inhibiteur(s) de facteur VIII chez un patient donné, afin de traiter ce dernier de façon personnalisée, i.e. avec le ou les anticorps anti-idiotypique(s) dirigé(s) contre le principal anticorps inhibiteur ou les principaux anticorps inhibiteurs de facteur VIII. Comme indiqué ci-après, on entend par « principal anticorps inhibiteur de facteur VIII », l'anticorps inhibiteur présent en quantité la plus grande ou qui possède l'affinité et/ou la spécificité la plus forte pour le facteur Vlll. C'est pourquoi la Demanderesse s'est attachée à la mise au point d'un nouveau procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile. Ce procédé permet d'identifier facilement et rapidement les anticorps inhibiteurs antifacteur VIII chez un patient selon leur idiotype ; le traitement des patients s'en trouve donc grandement facilité. La présente invention a donc pour objet un procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile (ci-après « procédé d'identification »), comprenant les étapes successives suivantes : a) le dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, des anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur Vlll humain ; b) l'identification du ou des anticorps inhibiteurs principaux dirigés contre le facteur VIII humain ; et c) la sélection et/ou la préparation d'au moins un anticorps anti-idiotypique dirigé contre au moins un anticorps inhibiteur principal identifié à l'étape b). Par « étapes successives », on entend que les étapes a), b) et c) ci-dessus se déroulent dans un ordre chronologique ; cela n'exclut pas l'introduction d'étape(s) supplémentaire(s) intercalaire(s). La présente invention a également pour objet un procédé de suivi d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile (ci-après « procédé de suivi »), comprenant une étape de dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, de l'anticorps antiidiotypique obtenu à l'étape c) ci-dessus. Par « anticorps dirigé contre le facteur VIII humain », on entend un anticorps qui reconnaît et se fixe spécifiquement à un épitope du facteur VIII humain. Par « épitope du facteur VIII humain », on entend le site de fixation de l'anticorps au facteur VIII humain. L'épitope peut être constitué d'un domaine dudit facteur VIII humain (A1, A2, A3, B, Cl ou C2), d'au moins un fragment d'un domaine, ou d'au moins un fragment du facteur VIII. Par exemple, l'anticorps dirigé contre le facteur VIII humain peut être un anticorps qui reconnaît et se fixe spécifiquement au domaine Al du facteur VIII humain. Par « anticorps anti-idiotypique » dans l'ensemble de la présente demande, on entend un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'idiotype d'un anticorps donné. Un anticorps anti-idiotypique A est donc un anticorps anti-anticorps qui reconnaît et se fixe de façon spécifique, à un anticorps B au niveau de la conformation caractéristique de sa partie variable, qui lui est propre. L'échantillon de patient utilisé dans les procédés selon l'invention est de préférence un échantillon sanguin. Il peut être constitué de sang, de plasma, ou de sérum. Par plasma, on entend le sang débarrassé de ses plaquettes, de ses globules blancs (leucocytes) et de ses érythrocytes. Par sérum, on entend le plasma débarrassé de la fibrine. Le procédé d'identification selon l'invention permet de choisir le meilleur traitement thérapeutique possible, en vue de supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile. Bien évidemment, le procédé selon l'invention est un procédé in vitro. Il comprend une étape a) de dosage spécifique des anticorps inhibiteurs anti-facteur Vlll humain. Par « dosage spécifique » des anticorps anti-facteur VIII humain, on entend un dosage qui quantifie précisément et avec une bonne affinité les anticorps inhibiteurs antifacteur Vlll humain. Ce dosage est de préférence un dosage immunologique (ou immunodosage). Parmi les dosages immunologiques utilisables, on peut citer les immunodosages classiquement utilisés, avec ou sans compétition, comme décrits par exemple dans « The Immunoassay Handbook », David Wild, 2005. De préférence, le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des fragments de facteur VIII humain. Les fragments de facteur VIII humain peuvent être choisis parmi les fragments A1, A2, A3, B, Cl et C2 humains. Un tel dosage comprend ainsi le mélange des fragments de facteur VIII humain avec l'échantillon du patient - qui comprend les anticorps inhibiteurs anti-facteur VIII humain -, puis la révélation des complexes formés fragments de facteur VIII humain/anticorps inhibiteurs anti-facteur Vlll humain. De façon préférée, le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes : i) la préparation de fragments de facteur VIII humain, lesdits fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ; ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les fragments fixés en i) ; iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes fragments de facteur VIII humain/anticorps inhibiteurs anti-facteur VIII humain. De préférence, l'incubation se fait pendant un temps compris entre 30 min et 16h, et à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence comprise entre 20°C et 38°C ; iv) le lavage des complexes formés en iii) ; v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué. Le marquage peut se faire à l'aide d'un composé radioactif (radiomarquage), par une enzyme (enzymoimmunoassay ou ELISA), par fluorescence (fluoroimmunoassay), ou par luminescence (Iuminoimmunoassay). L'anticorps secondaire peut être un anticorps anti-IgG humain, par exemple un anticorps de chèvre anti-IgG humain. Selon un mode de réalisation de l'invention, les fragments préparés à l'étape a) peuvent être porteurs d'une étiquette qui permet de les purifier et de les fixer, notamment sur une plaque ou au fond d'un puits. Alternativement, le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur Vlll humain (ou « anticorps anti-facteur Vlll humain »), ou des fragments de ces anticorps. En effet, lesdits anticorps anti-idiotypiques peuvent être présents sous forme complète ou sous forme de fragments. Les fragments sont choisis parmi les formats qui comprennent au moins les 6 CDR, tels que les Fab, (Fab')2 et Fv.. Lesdits anticorps anti-idiotypiques peuvent être naturels ou recombinants. Un tel dosage comprend ainsi le mélange des anticorps anti-idiotypiques, ou leurs fragments, dirigés contre les anticorps anti-facteur VIII humain avec l'échantillon du patient - qui comprend les anticorps anti-facteur VIII humain -, puis la révélation des complexes formés anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments/anticorps anti-facteur VIII humain. De façon préférée, le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes : i) la préparation des anticorps anti-idiotypiques, ou leurs fragments, dirigés contre les anticorps anti-facteur Vlll humain, lesdits anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ; ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments fixés en i) ; iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments/anticorps anti-facteur VIII humain. De préférence, l'incubation se fait pendant un temps compris entre 30 min et 24h, et à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence comprise entre 20°C et 38°C ; iv) le lavage des complexes formés en iii) ; v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué. Le marquage peut se faire à l'aide d'un composé radioactif (radiomarquage), par une enzyme (enzymoimmunoassay ou ELISA), par fluorescence (fluoroimmunoassay), ou par luminescence (Iuminoimmunoassay). L'anticorps secondaire peut être un anticorps anti-IgG humain, par exemple un anticorps de chèvre anti-IgG humain. De préférence, le dosage réalisé dans l'étape a) est un dosage ELISA. De préférence, le dosage ELISA utilise comme enzyme de marquage une enzyme choisie parmi la phosphatase alcaline, la péroxydase, la P-galactosidase et la glucose 6-phosphate déshydrogénase. A la fin de l'étape a), la quantité de chaque anticorps anti-facteur VIII humain est déterminée. On obtient donc un profil, pour chaque patient, des différents anticorps anti-facteur Vlll. A partir de ce profil, on identifie dans l'étape b) le ou les anticorps dirigé(s) contre le facteur VIII humain dit « principal(aux) ». Le patient peut en effet présenter un seul anticorps principal, ou plusieurs anticorps principaux. Par anticorps principal identifié à l'étape b), on entend un anticorps anti-facteur Vlll humain qui est présent en quantité la plus grande dans l'échantillon dudit patient ou qui possède l'affinité et/ou la spécificité la plus forte. L'affinité d'un anticorps pour un antigène est définie par la constante d'équilibre K, qui est le rapport (concentration des complexes antigène/anticorps) / [(concentration d'anticorps)*(concentration d'antigène)]. La spécificité d'un anticorps pour un antigène correspond à la propriété que possède un anticorps de se lier à cet antigène, en tenant compte de l'éventuelle réactivité croisée dudit anticorps pour d'autres antigènes. Plus la réactivité croisée est faible, plus la spécificité est forte. C'est à partir de cet anticorps principal, dirigé contre le facteur VIII, qu'un anticorps anti-idiotypique va pouvoir être sélectionné En effet, une fois l'anticorps principal identifié, l'anticorps anti-idiotypique dirigé contre cet anticorps principal est sélectionné. La préparation de l'anticorps anti-idiotypique aura été faite selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier, par exemple par injection chez la souris du domaine Fab de l'anticorps principal en présence d'adjuvants et par génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre cet idiotype. Des anti-idiotypes de chacun des domaines du facteur VIII auront été préalablement sélectionnés sur leur capacité à bloquer les inhibiteurs en nombre et en qualité (Giles et al Blood 2004, 103 p2618). A titre d'anticorps anti-idiotypiques utilisables selon l'invention, on peut citer : - les anticorps décrits dans la demande WO 2007/051926, qui sont dirigés contre les anticorps inhibiteurs du domaine C2 du facteur VIII humain. De préférence, on utilise l'anticorps EMAB565, qui est susceptible d'être produit par le clone R565, déposé le 25 octobre 2005 sous le numéro 13510 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) ; - les anticorps décrits dans la demande EP 1 749 537, qui sont dirigés contre les anticorps inhibiteurs du domaine A2 du facteur VIII humain. De préférence, on utilise l'anticorps susceptible d'être produit par le clone 30D1, déposé sous le numéro 1-3450 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) ; ou encore - les anticorps décrits dans la demande WO 2007/096536, qui sont dirigés contre les anticorps inhibiteurs du domaine Cl du facteur VIII humain. De préférence, on utilise l'anticorps 18E6, qui est susceptible d'être produit par le clone 1866, déposé le 24 janvier 2006, sous le numéro 1-0550 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, 20 rue du Docteur Roux, 70724 Paris cedex 10). Le procédé d'identification selon l'invention permet de sélectionner l'anticorps anti- idiotypique adapté à chaque patient, et ainsi de personnaliser le traitement afin de l'alléger. La présente invention a également pour objet le procédé de suivi. Ce procédé permet de contrôler la biodisponibilité de l'anticorps anti-idiotypique administré au patient. L'invention a également pour objet l'utilisation de l'anticorps anti-idiotypique obtenu dans le procédé d'identification pour le traitement de l'hémophilie. De préférence, le dosage de cet anticorps anti-idiotypique dans le procédé de suivi comprend, comme réactifs, des anticorps entiers anti-facteur VIII humain ou des fragments d'anticorps anti-facteur VIII humain, tels que des Fab dirigés contre le facteur Vlll humain. Les fragments d'anticorps anti-facteur Vlll humain sont notamment choisis parmi les formats qui comprennent au moins les 6 CDR, tels que les Fab, (Fab»2 et Fv. Lesdits anticorps anti-facteur Vlll humain et leurs fragments peuvent être naturels ou recombinants. Ils peuvent comprendre une étiquette qui permet notamment de les purifier. Ils peuvent être produits en système procaryote ou eucaryote. Par « Fab », on entend un anticorps dont la région constante, y compris la région charnière, a été enzymatiquement clivée, ou qui a été produit sans cette région ; le Fab conserve un des deux sites de liaison à l'antigène. Les fragments Fab consistent en une chaîne légère qui est liée de façon covalente à une portion de la chaîne lourde appelée Fd. Par « Fab dirigé contre le facteur VIII humain », on entend un Fab qui reconnaît et se fixe spécifiquement à un épitope du facteur Vlll humain. Par « Fv », on entend la portion N-terminale d'un fragment Fab consistant en les domaines variables d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère. Un tel dosage comprend ainsi le mélange des anticorps entiers anti-facteur Vlll humain ou des Fab dirigés contre le facteur VIII humain avec l'échantillon du patient sous traitement - qui comprend les anticorps anti-idiotypiques -, puis la révélation des complexes formés anticorps ou Fab anti-facteur Vlll humain/anticorps anti-idiotypiques. De façon préférée, le dosage spécifique des anticorps anti-idiotypiques comprend les étapes suivantes : i) la préparation des anticorps entiers anti-facteur Vlll humain ou des Fab dirigés contre le facteur Vlll humain, lesdits anticorps entiers ou Fab étant fixés de manière covalente sur une plaque ou sur des billes, les billes étant de préférence des billes de polystyrène ; ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les anticorps entiers ou les Fab fixés en i) ; iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes anticorps entiers ou Fab anti-facteur VIII humain/anticorps anti-idiotypiques. De préférence, l'incubation se fait pendant un temps compris entre 30 min et 24h, et à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence comprise entre 20°C et 38°C ; iv) le lavage des complexes formés en iii) ; v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué. Le marquage peut se faire à l'aide d'un composé radioactif (radiomarquage), par une enzyme (enzymoimmunoassay ou ELISA), par fluorescence (fluoroimmunoassay), ou par luminescence (Iuminoimmunoassay). L'anticorps secondaire peut être un anticorps anti-IgG humain, par exemple un anticorps de chèvre anti-IgG humain.25 REVENDICATIONS1. Procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile, comprenant les étapes successives suivantes : a) le dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, des anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur Vlll humain ; b) l'identification des anticorps inhibiteurs principaux dirigés contre le facteur VIII humain ; et c) la sélection et/ou la préparation d'au moins un anticorps anti-idiotypique dirigé contre au moins un anticorps inhibiteur principal identifié à l'étape b). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) est un dosage immunologique. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des fragments de facteur Vlll humain. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes : i) la préparation de fragments de facteur VIII humain, lesdits fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ; ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les fragments fixés en i) ; iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes fragments de facteur VIII humain/anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur Vlll humain ; iv) le lavage des complexes formés en iii) ; v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain ou des fragments de ces anticorps. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 5, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes : i) la préparation des anticorps anti-idiotypiques, ou leurs fragments, dirigés contre les anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain, lesdits anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ; ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments fixés en i) ; iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments /anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur Vlll humain ; iv) le lavage des complexes formés en iii) ; v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'anticorps principal de l'étape b) est l'anticorps inhibiteur dirigé contre le facteur VIII humain présent en quantité la plus grande dans l'échantillon dudit patient ou qui possède l'affinité et/ou la spécificité la plus forte. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) est un ELISA. 9. Procédé de suivi d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire 25 dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile, comprenant une étape de dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, de l'anticorps anti-idiotypique obtenu à l'étape c) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. Anticorps anti-idiotypique obtenu à l'étape c) selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 8 pour son utilisation pour le traitement de l'hémophilie.20