Brevet FR2970264A1 — publié le 20120713

PROCEDE ET FRAGMENTS DE NUCLEOTIDES POUR LA DETECTION ET/OU LA QUANTIFICATION D'HOTES DE LEGIONELLES, KIT ASSOCIE DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION [0001]L'invention se rapporte au domaine de la prévention des risques de contamination des réseaux d'eaux chaudes sanitaires, notamment par des légionelles. L'invention se rapporte plus précisément à une détection basée sur une analyse de séquences de nucléotides. [0002]0n entend par « légionelles » les bactéries du genre Legionella, telles que 10 Legionella pneumophila. [0003]L'expression « nucléotides » s'entend comme comprenant tous les éléments essentiels d'un monomère d'acide nucléique, tel que de préférence l'ADN ou l'ARN. L'expression peut également s'entendre comme un dérivé non naturel comprenant par exemple une base modifiée chimiquement. 15 ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE [0004]Ainsi, on connaît par le document WO 2004/024944, un procédé de détection et de quantification de bactéries dans un mélange complexe ou dans de l'eau. Le procédé comprend au moins une étape d'amplifications multiples de séquences de légionelles, simultanées mais préférentiellement séparées dans 20 l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles spécifiques et exclusives. Ce procédé n'est cependant pas pleinement satisfaisant car il est orienté vers l'amplification et l'identification de séquences spécifiques à une seule espèce de légionelles. De plus il ne prend pas en compte les hôtes de légionelles, capables de favoriser la prolifération de ces bactéries. 25 [0005] Il n'existe pas de procédé connu capable de quantifier des amibes hôtes à légionelles. EXPOSE DE L'INVENTION [0006]L'invention vise à remédier aux inconvénients de l'état de la technique et notamment à proposer un procédé de détection et/ou de quantification d'au moins un hôte de légionelles dans un échantillon, le procédé comprenant - au moins une étape d'amplification par réaction de polymérisation en chaîne à partir d'un ou plusieurs couples d'amorces de nucléotides d'hôtes susceptibles de s'hybrider sur des séquences conservées desdits hôtes, et - une étape de détection et/ou de quantification d'un ou plusieurs fragments amplifiés desdites séquences conservées. [0007]Selon un premier aspect, au moins un desdits couples d'amorces de nucléotides d'hôtes est spécifique d'au moins une espèce d'hôtes de légionelles. [0008] Préférentiellement, ladite au moins une étape d'amplification comprend au moins une amplification par multiplexage. [0009]Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, au moins un desdits couples d'amorces de nucléotides d'hôtes est spécifique d'au moins deux espèces d'hôtes de légionelles. [0010]Avantageusement, lesdites séquences conservées sont des séquences du gène de l'ARN ribosomal desdits hôtes de légionelles, et préférentielement du gène de l'ARNr 18S. [0011]Selon un mode de réalisation préféré, lesdits couples d'amorces sont sélectionnés dans le groupe comprenant : -Amo_1400_F (SEQ ID NO 1) et Amo_1540_R (SEQ ID NO 2), -Vahl_560_F (SEQ ID NO 3) et Vahl_730_R (SEQ ID NO 4), -Amo_SYB_F (SEQ ID NO 5) et Amo_SYB_R (SEQ ID NO 6), - Vahl_SYB_F (SEQ ID NO 8) et Vahl_SYB_R (SEQ ID NO 9), -Tet_SYB_F (SEQ ID NO 10) et Tet_SYB_R (SEQ ID NO 11), -Vahl_Taq_F (SEQ ID NO 13) et Vahl_Taq_R (SEQ ID NO 14), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires. [0012]Selon un aspect avantageux, l'étape de détection et/ou de quantification d'un ou plusieurs fragments amplifiés est réalisée grâce à des moyens de marquage sélectionnés dans le groupe comprenant des nucléotides radioactifs, du Bromure d'Etidium, du SYBR Green ou Gold, du jaune d'Oxazole, de l'orange de Thiazole, du PicoGreen. [0013]Avantageusement, lesdits couples d'amorces sont sélectionnés dans le groupe comprenant : -Amo SYB F (SEQ ID NO 5) et Amo SYB R (SEQ ID NO 6), - Vahl SYB F (SEQ ID NO 8) et Vahl SYB R (SEQ ID NO 9), -tet SYB F (SEQ ID NO 10) et Tet SYB R (SEQ ID NO 11), ou toute séquence présentant au moins 800/0 d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires. [0014]Selon un autre aspect avantageux, les moyens de marquage comprennent des couples sondes associée aux couples de nucléotides. [0015]Préférentiellement, lesdits couples d'amorces et de sondes sont sélectionnés dans le groupe comprenant : -Amo_SYB_F (SEQ ID NO 5), Amo_SYB_R (SEQ ID NO 6) et Taq_Amo_probe (SEQ ID NO 7) ; -Tet_SYB_F (SEQ ID NO 10), Tet_SYB_R (SEQ ID NO 11) et Taq_Tetra_probe (SEQ ID NO 12) ; -Vahl_Taq_F (SEQ ID NO 13), Vahl_Taq_R (SEQ ID NO 14) et Vahl_Taq_probe (SEQ ID NO 15) ; ou toute séquence présentant au moins 800/0 d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires. [0016]De manière intéressante, l'étape d'amplification comprend une sous-étape d'hybridation réalisée à une température comprise entre 48 et 65 degrés Celsius. [0017]Avantageusement, le procédé selon l'invention commence par une étape 20 d'extraction de nucléotides de l'échantillon, qui comprend une lyse cellulaire mécanique et/ou chimique. [0018] Préférentiellement, l'étape d'extraction de nucléotides commence par une première sous-étape de filtration de l'échantillon, et une sous-étape de refroidissement à -80°C avant la sous-étape de lyse cellulaire mécanique et/ou 25 chimique. [0019] Un autre objet de l'invention consiste en un fragment de nucléotides pour la détection et/ou la quantification d'au moins un hôte de légionelles dans un échantillon, la séquence desdits fragments de nucléotides étant choisie parmi SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 15 ou toute séquence présentant au moins 800/0 d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires. [0020]L'invention a également pour objet, un kit de détection et/ou de quantification d'au moins un hôte de légionelles dans un échantillon qui comprend 5 des moyens de mise en oeuvre du procédé précédemment décrit. [0021]Pour ce faire est proposé un kit de détection et/ou de quantification d'au moins un hôte de légionelles dans un échantillon, le kit comprenant - un ou plusieurs couples d'amorces de nucléotides d'hôtes susceptibles de s'hybrider sur des séquences conservées desdits hôtes, - au moins un moyen d'amplification 10 avantageusement par multiplexage, par réaction de polymérisation en chaîne à partir desdits un ou plusieurs couples d'amorces de nucléotides d'hôtes, et - au moins un moyen de détection et/ou de quantification d'un ou plusieurs fragments amplifiés desdites séquences conservées caractérisé en ce que au moins un desdits un ou plusieurs couples d'amorces de nucléotides d'hôtes est spécifique 15 d'au moins une espèces d'hôtes de légionelles. [0022]Avantageusement, le kit selon l'invention comprend des moyens d'extraction de nucléotides de l'échantillon permettant de réaliser une lyse cellulaire mécanique et/ou chimique. [0023] Préférentiellement, le kit selon l'invention comprend au moins un fragment 20 de nucléotides dont la séquence est choisie parmi SEQ ID NO 1 à 15, ou toute séquence présentant au moins 800/0 d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES [0024] D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à 25 la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées, qui illustrent : - la figure 1, un arbre phylogénétique Neighbor Joining réalisé à partir d'un alignement de séquences de gènes d'ARNr18S d'hôtes de légionelles et de champignons ; - la figure 2, la photographie d'une électrophorèse sur gel pour la détection d'amplicons issus d'une PCR multiplexe effectuée à partir des séquences SEQ ID NO 5,6,8,9,10,11 ; - la figure 3, des courbes de fluorescence lors de la calibration de la gPCR par une première gamme étalon issue d'un échantillon d'ADN d'Acanthamoeba ; - la figure 4, des courbes de fusion des amplicons de la première gamme étalon dans la gPCR de la figure 3 ; - la figure 5, des courbes de fluorescence lors de la calibration de la gPCR par une deuxième gamme étalon issue d'un mélange d'ADN d'amibes hôtes à Iégionelles ; - la figure 6, des courbes de fusion des amplicons de la deuxième gamme étalon dans la gPCR de la figure 5 ; - la figure 7, une droite de régression exprimant le Ct (Cycle Threshold) en fonction de la concentration d'ADN de départ dans la gPCR des figures 5 et 6; - la figure 8, des courbes de fluorescence lors de la calibration de la gPCR par une troisième gamme étalon issue d'ADN extraits d'un mélange de cultures d'amibes hôtes de Légionelles ; - la figure 9, des courbes de fusion des amplicons de la troisième gamme étalon dans la gPCR de la figure 8 ; - la figure 10, une droite de régression exprimant le Ct en fonction de la concentration d'ADN de départ dans la gPCR des figures 8 et 9. [0025] Pour plus de clarté, les éléments identiques ou similaires sont repérés par des signes de référence identiques sur l'ensemble des figures. DESCRIPTION DETAILLEE DES MODES DE REALISATION [0026]En se référant à la figure 1, l'arbre phylogénétique NeighborJoining (1000 répétitions de bootstrap) permet de visualiser la proximité phylogénétique entre différentes espèces d'hôtes de Iégionelles connues, et d'autres espèces microbiennes telles que les champignons. L'arbre a été réalisé à partir de l'alignement contenant les séquences des gènes d'ARNr18S. La matrice de l'alignement final contient des séquences d'amibes, de Tetrahymena et de champignons (58 séquences Acanthamoeba, 5 Balamuthia, 2 Saccharomyces, 8 Echinamoeba, 10 Hartmannella, 35 Tetrahymena, 12 Naegleria, 3 Vahlkampfiia). [0027] Un analyse de l'arbre phylogénétique illustré sur la figure 1 montre que des zones consensus à l'ensemble des hôtes de légionelles sont également partagées par une grande majorité des eucaryotes (champignons ou mêmes eucaryotes supérieurs) ceci est lié au fait que les hôtes de légionelles ne constituent pas un groupe monophylétique. Ainsi, on peut isoler cinq grands ensembles phylogénétiques : - le groupe vahlkampfiidae -vahl- comprenant les espèces Naelgleria -Nae ssp.-, et vahlkampfia -vahl ssp- ; - le groupe Champignons -fung- comprenant notamment saccharomices cerevisae - sacch- ; - le groupe Amebozoa -Amz- comprenant les espèces Acanthamoeba -Ac ssp-, 15 Balamuthia -Bal ssp-, Hartmannella -Hart ssp- et Echinamoeba -Ech ssp- ; - le groupe Cil iata -Cil- comprenant les espèces Tetrahymena -Tet ssp-. [0028]Aux vues de cet arbre phylogénétique, une analyse in silico est effectuée notamment sur la base d'un alignement de séquence (ClustalX 2.0 ; Jalview), des recherches de région consensus à l'oeil, des BLASTn des régions consensus (18- 20 28 bases), des amplifications in silico et des recherches de dimères (Clone Manager). Cette analyse a permis de concevoir des jeux d'amorces. [0029] L'analyse a été réalisée sur des séquences d'ARNr 18S telles que SEQ ID NO 16 à 20 pour réaliser des amplifications de fragments de nucléotides détectables et/ou quantifiables. 25 [0030]Ainsi, l'invention vise à amplifier des fragments de nucléotides d'au moins un gène de l'ARNr 18S tels que ceux dont la séquence est choisie parmi SEQ ID NO16à20. [0031]Les amorces et/ou sondes obtenues suite à cette analyse sont des séquences SEQ ID NO 1 à 15. [0032]Ainsi, le procédé selon l'invention est particulièrement adapté à la détection d'hôtes à légionelles tels que : dans la famille des Vahlkampfiidae : les genres Naegleria -Nae sp- et Vahlkampfia -Vahl spp- ; dans le groupe des Amoebozoa : les espèces Acanthamoeba -Ac. Spp-, Hartmannella -Hart spp- et Echinamoeba -Ech spp- ; et dans le groupe des ciliata : l'espèce Tetrahymena - Tet spp-. [0033]Le procédé selon l'invention vise de préférence à réaliser une amplification par multiplexage et avantageusement en temps réel (gPCR multiplexe) pour amplifier : -au moins une séquence consensus des espèces du genre Naegleria -Nae spptelle que le gène de l'ARN 18S de Naegleria fowleri (SEQ ID NO 16) ou Naegleria australiensis (S E Q ID NO 17), et/ou Vahlkampfiia -Vahl spp- ; et/ou - au moins une séquence consensus des espèces Acanthamoeba -Ac spp- telle que le gène de I'ARNr 18S d'Acanthamoeba castellanii (SEQ ID NO 18 ou 19), Hartmannella -Hart spp- et/ou Echinamoeba -E ch s p p- ; et/ou - au moins une séquence consensus des espèces Tetrahymena (Tet spp) telle que le gène de TARN 18S de Tetrahymena limacis (SEQ ID NO 20). [0034]Selon un premier mode de réalisation on commence par une étape d'extractions de nucléotides d'un échantillon d'eau, qui comprend avantageusement une lyse cellulaire chimique. De préférence, un kit d'extraction de nucléotides peut être utilisé tel que le « High pure PCR template preparation kit » disponible dans le commerce sous la marque Roche®. Ces extractions ont été effectuées sur des cultures d'amibes (Hartmannella vermiformi CCAP H1, Acanthamoeba castellanii Ac, Naegleria lova Na), de Tetrahymena Tet, ainsi que sur un échantillon d'eau filtrée M2A. [0035] Les amorces et sondes obtenues sont décrites dans le tableau 1 (SEQ ID NO 5 à 15). Certaines de ces amorces sont adaptées à une approche gPCR de type Taqman, en combinaison avec les sondes correspondantes, mais de préférence, toutes ces amorces sont utilisées dans une approche gPCR au SYBR Green. Amorce Noms SEQ Séquences Tm Taill /Sonde ID e sens Amo_SYB_ 5 GAATACDTTAGCATGGG 59 24 F ATAATRG Amoeb antisen Amo_syb_ 6 CDRATCSCTGGTCGGC 58 21 ozoa s R ATMGT Sonde Taq_Amo_ 7 AATCAAGAACGAAAGTT 67 35 probe AGGGGATCG sens Vahl_SYB_ 8 TAATACTGYTGTAGTTA 63 25 F AAACGCCC antisen Vahl_SYB_ 9 ATTTCACCTCTMGCSYC 62 24 Vahlka s R ATRGT mpfiida sens Vahl_Taq_ 13 CYGAAACTTAAAGGAAT 58 22 F TGACG e antisen Vahl_Taq_ 14 TCTCGYTCGTTAWCTGA 58 23 s R ATTAAC Sonde Taq_Vahl_ 15 CAGGAGTGGAGTCTGC 68 20 probe GGCT sens tet_Syb_F 10 TCATCTAAGTTTCTGCC 64 25 CTATCAGC Tetrahy antisen TetSybR 11 CTGCCGAACCGTAGTT 64 23 mena s _ _ GTAGTAG sonde Taq_Tetra_ 12 TCACGGGTAACGGAGA 70 28 Probe ATTAGGGTTCGA Tableau 1 :Amorces et sondes pour l'amplification des séquences des gènes ARNr 18S d'hotes de légionelles. [0036]Le jeu Amo_Syb_R et Amo_Syb_F : est destiné à amplifier les gènes de I' A R N r 1 8S des amibes Amoebozoa (Acanthamoeba, Hartmannella, et Echinamoeba) ; le jeu Vahl_Syb_F et Vahl_Syb_R est destiné à amplifier les gènes de l'ARNr18S des amibes de la famille des Vahlkampfiidae (Naegleria et Vahlkampfia) ; le jeu Vahl_Taq_F et Vahl_Taq_R : est destiné à détecter les gènes de l'ARNr18S des amibes de la famille des Vahlkampfiidae (Naegleria et Vahlkampfia) ; et le jeu Tet_Syb_F et Tet_Syb_R est destiné à amplifier les gènes de l'ARNr18S des espèces du genre Tetrahymena. [0037]En se référant à la figure 2, une PCR multiplexe a été réalisée avec les amorces Amo_Syb (SEQ ID NO 5 et 6), Vahl_Syb (SEQ ID NO 8 et 9) et tet_Syb (SEQ ID NO 10 et 11). Les amorces sont avantageusement utilisées à une concentration de 0,5 pmol.L-1. La température d'hybridation est de préférence fixée à 55°C. Les cinq échantillons d'ADN (H1, Ac, Na, Tet, M2A) ont été testés. La piste L correspond aux témoins de masse moléculaire, et la piste T- au témoin négatif. [0038]Comme on peut le voir sur la figure 2, les résultats sont concluants pour H1, Na, et Tet, pour lesquels on observe une bande de forte intensité et de bonne taille (petite bande surnuméraire juste en dessous de la bande principale pour Na et H1, probablement dû à l'utilisation d'amorces dégénérées). De très bons résultats sont également observés pour l'échantillon d'eau filtrée (M2A) où on observe deux bandes comme attendu, à savoir une bande Amoebozoa et une bande Tetrahymena. [0039]Selon un deuxième mode de réalisation, des amorces telles que décrites dans le tableau 3 ci-dessous (SEQ ID NO 1 à 4) ont été utilisées pour amplifier le gène des ARNr18S les amibes Amoebozoa et Vahlkampfiidae : Le jeu Amo 1400 F/Amo 1540 R (SEQ ID NO 1 et 2) amplifie un fragment de 130 pb du gène de I'ARNr18S des organismes Amoebozoa Acanthamoeba spp.),ou 50 pb pour Hartmannella spp. et Echinamoeba spp. Le jeu Vahl_560_F/Vahl_730_R (SEQ ID NO 3 et 4) amplifie un fragment de 150 pb des organismes de la famille des Vahlkampfiidae (Naegleria spp. et Vahlkampfia spp.). Dans ce mode de réalisation, la concentration optimale de ces amorces en duplex est de 0,5 pM ; et la température d'hybridation préférée est de 62°C pour avoir une bonne amplification des cibles, mais également afin de s'affranchir de toute amplification de cibles non désirées comme les champignons (tests sur Saccharomyces cerevisiae et Sordaria macrospore). SE Taille Amorces Noms Q ID Séquences (pb) Amoebozo Amo1400_ ATGCCGACCA a sens _F 1 RSGATYMGGA G 21 antisens Amo_1540_ 2 CAAGSTGCYM 20 R GGGGAGTCAT Vahlkampf sens Vahl 560 F 3 AGGTAGTGAC 24 iidae - - AAGMYRTAGY GACT antisens Vahl 730 R 4 GGGCGTTTTA 25 ACTACARCAG TATTA Tableau 2 :Amorces et sondes pour l'amplification des gènes d'ARN 18S d'hotes de légionelles [0040] Les amorces décrites dans le tableau 3 sont préférentiellement utilisées en gPCR. [0041]Aux fins de calibration de la gPCR selon une première variante du deuxième mode de réalisation, un échantillon d'ADN de concentration connue (extrait à partir d'une suspension cellulaire à 106 cellules/m1 d'Acanthamoeba castellanii) est dilué en séries de 10. On réalise donc une première gamme étalon notée GE sur la figure 3 : GE1 (21 ng/pl) ; GE2 (2ng/pl) ; GE3 (2.10-'ng/pl) ; GE4 (2.10-2ng/pl). Chaque dilution a été quantifiée et un témoin négatif (NTC :no template control) a été i n t é g r é. Les amorces Amo_1400F/1540R et Vahl_530F/760R sont préférentiellement utilisées à une concentration de 0.5 pM final. La température d'hybridation des amorces est fixée de préférence à 62°C. Le kit utilisé pour réaliser la gPCR est le LightCycler Fast Start DNA MasterP'Us SYBR Green 1 avec l'appareil LightCycler 1.5 (disponibles dans le commerce sous la marque Roche®). La figure 3 illustre l'évolution de la fluorescence F1 en fonction du temps (nombre de cycles) lors de cette gPCR. On observe à l'issue de la réaction que la droite de régression (non représentée) est linéaire (R2 = 1). [0042] L'efficacité (E) de la PCR établie par la formule (E = 10(-''pente) -1) avec une pente de la droite de régression calculée de : -3,983 ; d'où une efficacité de 1,78 (78%). Cette efficacité plutôt faible peut s'expliquer par le fait que l'on utilise deux jeux d'amorces qui contiennent de nombreuses bases dégénérées. Néanmoins, la quantification semble juste et linéaire pour tous les points. L'utilisation une concentration d'amorces de 0.27pM entraîne une efficacité de la gPCR à 65 %. [0043]En se référant à la figure 4, les courbes de fusion sont illustrées par l'évolution de la dérivée de la fluorescence -dF1/dt- en fonction de la température -T°C-. Les échantillons positifs montrent tous des pics à 94°C. [0044]Une gamme étalon est réalisée selon une première variante du deuxième mode de réalisation sur les ADN de chaque espèce d'amibes (Acanthamoeba castellani, Hartmannella vermiformis CCAP., Echinamoeba exudans, Naegleria lova). Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. [0045]D'autre part, une extraction d'ADN a été effectuée sur des kystes d'Acanthamoeba et de Vahlkampfia, afin de déterminer l'efficacité de la gPCR (et de l'extraction) sur les formes kystiques des amibes. Des cultures de kystes d'Acanthamoeba et de Vahlkampfia ont ainsi été effectuées. Une série de dilutions a été effectuée sur les extraits d'ADN et la gPCR dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. La droite de régression est linéaire et le seuil de détection a été déterminé à un cycle pour les deux genres. Acanthamoeba Hartmannella Echinamoeba Naegleria Kystes_Acanthamo eba Pente - 4.061 - 3.906 - 3.706 - 2.704 - 4.360 Efficacité 76% 80% 86% 134% 69 R2 1 1 1 0.96 1 Tableau 3 : Récapitulatif des efficacités d'amplification pour l'ensemble des amibes hôtes à Légionelles, pour une température d'hybridation des amorces 10 fixée à 60°C. [0046] L'efficacité est plus importante pour Hartmannella et Echinamoeba. Ceci peut s'expliquer par la longueur des séquences ciblées (50 pb pour Hartmannella et Echinamoeba contre 130 pour Acanthamoeba). Par ailleurs, l'efficacité la plus forte est retrouvée pour une amplification de gène codant l'ARNr18S de 15 Naegleria, ce qui pourrait être expliqué par une plus grande quantité de copies de gènes au sein des génomes de ces organismes. Acanthamo Kystes Hartm Echinam Naegle Vahlkampfi eba Acantha annell oeba ria a (kystes) moeba a Efficacité 76 69 80 86 134 ND 60°C Efficacité 108 64 86 83 101 71 62°C Tableau 4 : Comparaison des efficacités d'amplification en % pour chaque cible amibienne, à 60°C et à 62°C.(ND :Non déterminé) [0047]Le tableau 5 ci-dessous montre l'ensemble des extractions d'ADN 20 effectuées, les seuils de détection dans les différents échantillons ainsi que le seuil de détection équivalent à une cellule. ADN de I Nombre de I Nombre I Ct de I Ct I Efficacit départ cellules de détection détection é (2 pl extraites cellules 1 cellule gPCR) (200p1) gPCR (2 pl) amoeba Acanth- 42 ng 2,105 2000 18.78 31.34 108% amoeba Acanth- 24 ng 2,104 200 22.16 31.34 108% (K)moeba)a 8 ng 2,104 200 21,765 33,09 64% mananella rt- 40 ng 4,8,1 o4 480 23,16 31,32 86% Echin- 6 8 ng ND ND 22,86 31,23 83% amoeba ' Naegleria 34 ng 1,8,104 180 28,675 38 1010/0 (K) fhlkam 8 ng 2,105 2000 21,54 33,46 710/0 (K) fhlkam 2ng 3,104 150 24 33,46 710/0 Saccharo- 160 ng 4,10' 4,105 > 41 > 41 76% (à myces 60°C) Tableau 5 : nombre de cellules extraites et utilisées en gPCR, seuils de détection et efficacité de la gPCR par organisme. [0048] L'analyse de l'ensemble des essais précédents montre qu'une température d'hybridation des amorces à 62°C semble idéale, à la fois pour détecter et quantifier l'ADN d'amibes de façon efficace, de s'affranchir de la détection d'ADN fongique, et également d'empêcher la dimérisation des amorces. Echantillons 60°C 62°C M2A 29,93 30,91 M2B 31,55 37,3 M2C 35,5 ND M2D 37,41 >41 M2E 31,83 ND M2F 32,65 35,57 M2G 34,93 38,55 M2H >41 >41 Saccharomyce 39,57 >41 s Tableau 6: Comparaison des seuils de détection de 8 échantillons environnementaux et un échantillon d'ADN de Saccharomyces en fonction de deux températures d'hybridation (60°C ; 62°C). [0049] Dans le tableau 6 ci-dessus, on peut remarquer que l'augmentation de la température d'hybridation augmente sensiblement la durée de détection des copies du gène de l'ARNr18S (par exemple, M2A est détecté 1 cycle plus tard, quand on utilise une température de 62°C comparativement à 60°C). Certains échantillons ne sont plus détectés (exemple : M2D). Une explication possible à ce délai des Ct, peut venir du fait que les amorces ne dimérisent plus entre elles et que par conséquent la fluorescence globale sera plus faible, et donc sera détectée plus tard. [0050] Les étapes d'extraction sont préférentiellement optimisées afin d'obtenir les meilleurs rendements à partir d'échantillons environnementaux. Pour cela, des échantillons d'eau (200 ml) ont été filtrés sur filtre de nitrocellulose de 0,2 pm. A l'issue de la filtration, les filtres ont été découpés en 2 parties égales à l'aide de scalpels stériles, puis placés à -80°C. [0051]Deux principaux procédés d'extraction peuvent être réalisés : l'un comprenant une lyse mécanique à l'aide de billes de verre, et l'autre comprenant une lyse chimique, à l'aide d'un tampon fourni dans le kit d'extraction « High pure PCR template preparation kit ». Ces deux procédés permettent d'obtenir des rendements d'extraction très proches, après dosage spectrophotométrique (par un appareillage disponible dans le commerce sous la marque Nanodrop®). Ces méthodes ont été testées sur deux échantillons d'eau filtrée B4 et BM4. les quantités d'ADN extraites par ces méthodes sont mentionnées dans le tableau 7 ci-dessous. billes de verre Lyse chimique Échantillon B4 17,75 ng/pl 16 ng/pl Echantillon BM4 16,65 ng/pl 15,3 ng/pl Tableau 7 : Comparaison des deux méthodes d'extraction sur deux filtres, issus de la filtration d'eaux de deux échantillons B4 et BM4. [0052] Le procédé comprenant une lyse chimique serait néanmoins privilégié, car l'utilisation de billes de verre (0,3g) pourrait apporter des risques de contamination supplémentaires pour lesquels nous voudrions nous affranchir totalement. Cette étape utilise une étape de centrifugation supplémentaire pour sédimenter les billes. Le volume récupéré après cette étape peut être variable, ce qui peut poser problème pour une standardisation de la méthode à l'ensemble des échantillons. [0053]Selon une deuxième variante du deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, la calibration de la quantification comprend un mélange direct d'ADN de chaque souche précédemment extraits, une dilution en série de 10, puis une quantification de l'ADN total. Dans cette variante, la concentration d'ADN extrait pour chaque souche a été standardisée (ici à 4ng/pl) avant d'effectuer le mélange. 5pl de chaque suspension d'ADN standardisée ont ainsi été utilisés pour effectuer le mélange (ADN de Acanthamoeba [trophozo'ites et kystes], Hartmannella, Echinamoeba, Naegleria, et Vahlkampfia). L'ADN du mélange (quantifié par dosage spectrophotométrique à l'aide du nanodrop® à 4 ng/pL) a été dilué en série de 10, puis une gPCR a été effectuée (conditions normales, température d'hybridation de 62°C). Il correspondrait théoriquement à une quantité de 20000 cellules totales. La figure 5 montre l'évolution de la fluorescence F1 dans cette gPCR. Le résultat de l'étalonnage par mélange de l'ADN des différentes amibes est mentionné dans le tableau 8 ci-dessous. Echantillon Concentration d'ADN Concentration Ct de départ d'ADN calculée (ng/réaction) (ng/réaction) Mélange ADN amibe 8 7,33 22,49 Mélange ADN amibe 8.10 1 8,865,10 1 26,05 10.1 Mélange ADN amibe 8.10 2 8,466,10 2 30,01 10.2 Mélange ADN amibe 8 10-3 7,445.10-3 34,11 NTC 0 0 Tableau 8 : Récapitulatif des résultats de gPCR obtenus sur les mélanges d'ADN 20 d'amibes hôtes à Légionelles. [0054]Les résultats calculés par le LightCycler sont très proches de ceux déterminés précédemment (tableau 8). La quantification semble donc être juste. De plus, on peut détecter l'équivalent génomique correspondant à 8.10-3 ng d'ADN, ce qui correspondrait à 20 cellules : le seuil de détection est donc très faible (et pourrait se situer même en deçà de cette limite : 1 cellule), ce qui par conséquent est très intéressant pour des quantifications futures. [0055]Comme on peut le voir sur la figure 6, l'analyse des courbes de fusion permet de visualiser trois pics pour les courbes GE1 et GE2 : aux alentours de 82°C pour GE1, aux alentours de 83°C pour GE2, un autre vers 94°C pour GE1 et GE2. Ces pics correspondraient ainsi aux produits d'amplification les plus courts (à 82°C et 83°C, pour Hartmannella et Echinamoeba par exemple) et les plus longs (94°C pour Acanthamoeba et Naegleria par exemple). La figure 7 illustre la droite de régression permettant de déterminer la concentration d'ADN initiale. Cette droite correspond à l'évolution du nombre de cycles -GY- en fonction du logarithme de la concentration -Log C-. [0056]Selon une troisième variante du deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, la calibration de la quantification comprend un mélange de cultures de chaque souche avant l'extraction d'ADN de ce mélange de cultures. Pour ce faire, chaque souche d'amibe est cultivée sur un milieu NNA-coli (Non Nutrient Agar additionné d'une suspension d'Escherichia coli), puis récupérée dans un tampon amibe. Chaque culture cellulaire est ensuite standardisée à une concentration cellulaire équivalente. Ici, toutes les cultures ont été diluées à 7.104 cellules par ml (4 cultures : Hartmannella vermiformis CCAP, Vahlkampfia sp., Naegleria lova, Acanthamoeba castellannii). 50 pl de chaque suspension sont ensuite assemblés, puis une extraction (par kit ROCHE®) est effectuée sur les 200 pl du mélange (ce qui correspond à 3500 cellules de chaque souche). 2.5 ng/pl ont ainsi pu être extraits dans 200p1 de volume d'élution final. [0057]La composition du tampon amibe est la suivante : un litre : 1g de citrate de sodium ; 10ml de MgSO4:7 H2O 0,4M ; 8 ml de CaC12:2H2O 0,05M ; 10 ml de Na2HPO4:2H2O 0,25M ; 10 ml de NH42Fell(SO4)2:6H2O 5mM. [0058] L'ADN extrait est ensuite dilué en séries de 10, puis la gPCR est effectuée. La figure 8 montre l'évolution de la fluorescence dans cette gPCR. La figure 10 illustre la droite de régression permettant de déterminer la concentration d'ADN initiale. Le résultat de l'étalonnage après mélange des différentes cultures d'amibes est mentionné dans le tableau 9 ci-dessous. Echantillon Concentration d'ADN Concentration d'ADN Ct de départ calculée (ng/réaction) (ng/réaction) Mélange culture 5 4,661 22,5 amibe Mélange culture 5.10-1 5,239.10-1 26,11 amibe 10-1 Mélange culture 5.10-2 5,659.10-2 29,79 amibe 10-2 Mélange culture 5.10-3 4,495.10-3 33,97 amibe 10-3 Mélange culture 5.10-4 5.032.10-4 37,59 amibe 10-4 NTC 0 0 >41 Tableau 9: Récapitulatif des résultats de gPCR obtenus sur les mélanges de cultures d'amibes hôtes à Légionelles. [0059]Le profil obtenu par l'analyse des courbes de fusion de la figure 9 (mélange de cultures) est identique à celui présenté à la figure 6 (mélange d'ADN). Les courbes GE 3-5 de la figure 9 montrent en plus un seuil de détection entre 10-3M 10-4M de concentration du mélange de culture. [0060]La droite de régression est linéaire (R2=1) jusqu'au dernier point de la gamme. Cela signifie que l'on peut quantifier l'équivalent génomique correspondant à 5.10-4 ng d'ADN (équivalent 1 cellule) conformément à la droite de régression de la figure 10. [0061]Aux vues de ces résultats il apparaît que les deux méthodes ci-avant permettent de quantifier de façon précise les amibes par PCR. La première méthode, pour laquelle les ADN standardisés ont été mélangés, avant la réaction de gPCR semble cependant la plus adéquate, principalement par le fait que les concentrations d'ADN de chaque souche amibienne ont été calibrées avant la manipulation. Cette méthode sera utilisée par la suite pour quantifier les amibes dans les réseaux d'eau chaude sanitaires. [0062]De nombreuses combinaisons peuvent être envisagées sans sortir du cadre de l'invention ; l'homme de métier choisira l'une ou l'autre en fonction des contraintes économiques, ergonomiques, dimensionnelles ou autres qu'il devra respecter.5 REVENDICATIONS1 Procédé de détection et/ou de quantification d'au moins un hôte de légionelles dans un échantillon, le procédé comprenant - au moins une étape d'amplification par réaction de polymérisation en chaîne à partir d'un ou plusieurs couples d'amorces de nucléotides d'hôtes susceptibles de s'hybrider sur des séquences conservées desdits hôtes, et - une étape de détection et/ou de quantification d'un ou plusieurs fragments amplifiés desdites séquences conservées caractérisé en ce que au moins un desdits un ou plusieurs couples d'amorces de nucléotides d'hôtes est spécifique d'au moins une espèce d'hôtes de légionelles. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite au moins une étape d'amplification comprend au moins une amplification par multiplexage. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que au moins un desdits couples d'amorces de nucléotides d'hôtes est spécifique d'au moins deux espèces d'hôtes de légionelles. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que lesdites séquences conservées sont des séquences du gène de l'ARN ribosomal 18S desdits hôtes de légionelles. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que lesdits couples d'amorces sont sélectionnés dans le groupe comprenant : - Amo_1400_F (SEQ ID NO 1) et Amo_1540_R (SEQ ID NO 2), - Vahl_560_F (SEQ ID NO 3) et Vahl_730_R (SEQ ID NO 4), -Amo_SYB_F (SEQ ID NO 5) et Amo_SYB_R (SEQ ID NO 6), - Vahl_SYB_F (SEQ ID NO 8) et Vahl_SYB_R (SEQ ID NO 9), - Tet_SYB_F (SEQ ID NO 10) et Tet_SYB_R (SEQ ID NO 11), - Vahl_Taq_F (SEQ ID NO 13) et Vahl_Taq_R (SEQ ID NO 14), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'étape de détection et/ou de quantification d'un ou plusieurs fragments amplifiés estréalisée grâce à des moyens de marquage sélectionnés dans le groupe comprenant des nucléotides radioactives, du Bromure d'Etidium, des SYBR Green ou Gold, du jaune d'Oxazole, de l'orange de Thiazole, du PicoGreen. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'étape de détection et/ou de quantification d'un ou plusieurs fragments amplifiés est réalisée grâce à des moyens de marquage comprenant des sondes associées aux couples d'amorces de nucléotides. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que lesdits couples d'amorces et sondes sont sélectionnés dans le groupe comprenant : -Amo_SYB_F (SEQ ID NO 5), Amo_SYB_R (SEQ ID NO 6) et Taq_Amo_probe (SEQ ID NO 7), - Tet_SYB_F (SEQ ID NO 10), Tet_SYB_R (SEQ ID NO 11) et Taq_Tetra_probe (SEQ ID NO 12), - Vahl_Taq_F (SEQ ID NO 13), Vahl_Taq_R (SEQ ID NO 14) et Vahl_Taq_probe (SEQ ID NO 15), ou toute séquence présentant au moins 800/0 d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que l'étape d'amplification comprend une sous-étape d'hybridation réalisée à une température comprise entre 48 et 65 degrés Celsius. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il commence par une étape d'extraction de nucléotides de l'échantillon, qui comprend une sous-étape de lyse cellulaire mécanique et/ou chimique. 13. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que l'étape d'extraction de nucléotides commence par une première sous-étape de filtration de l'échantillon, et une sous-étape de refroidissement à -80°C avant la sous-étape de lyse cellulaire mécanique et/ou chimique. 14. Kit de détection et/ou de quantification d'au moins un hôte de Iégionelles dans un échantillon comprenant des moyens de mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 11. 15. Fragment de nucléotides pour la détection et/ou la quantification d'au moins un hôte de Iégionelles dans un échantillon, la séquence dudit fragment étantsélectionnée dans le groupe comprenant SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 15 et toute séquence présentant au moins 800/0 d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires.5