Brevet FR2977799A1 — publié le 20130118

UTILISATION DE SURNAGEANTS DE CULTURE DE MICRO-ALGUES POUR LEURS PROPRIETES ANTIBACTERIENNES, NOTAMMENT DANS LE TRAITEMENT DES INFECTIONS CUTANEES DOMAINE TECHNIQUE L'invention a pour objet un extrait correspondant au surnageant d'une culture de micro-algues, en particulier de la cyanobactérie Nostoc. De manière remarquable, un tel extrait présente une activité antibactérienne, notamment vis-à-vis des bactéries Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis. Un tel extrait a donc des applications cosmétiques et pharmaceutiques, et peut servir à l'hygiène cutanée, en particulier pour la prévention ou le traitement des infections cutanées telles que l'acné. ETAT DE LA TECHNIQUE L'acné est une dermatose inflammatoire des follicules pilo-sébacés dont la prévalence est estimée à 30% chez l'homme, et 24% chez la femme, quelque soit l'âge. Elle concerne 20 90% des adolescents, apparaissant vers l'âge de 13 ans chez les garçons, 12 ans chez les filles, pour disparaitre avant 20 ans. Trois mécanismes intercurrents existent au cours de l'acné. Le premier, condition sine qua non, est l'hypersécrétion de sébum. Une kératinisation de la partie profonde du 25 follicule sébacé survient alors, entrainant une obstruction de ce dernier, ce qui a pour conséquence la rétention de sébum (comédogenèse). Enfin, la flore anaérobie folliculaire (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis) prolifère. Cette flore, en particulier Propionibacterium acnes, est à l'origine de l'hydrolyse des triglycérides et autres acides gras, l'induction d'anticorps, l'activation du complément, ou encore le 30 chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles, provoquant ainsi un contexte inflammatoire. 30% des patients nécessitent une prise en charge médicale. Parmi les traitements de choix, les antibiotiques sont très couramment utilisés, soit par voie topique (érythromycine, 35 clindamycine), soit par voie systémique (tétracycline, minocycline, doxycycline). L'utilisation d'antibiotiques a conduit à l'apparition de résistances. Ainsi, une étude épidémiologique européenne a démontré que 80% des souches de Propionibacterium acnes isolées à partir de patients étaient résistantes à au moins un antibiotique (Br. J. Dermatol. (2005) 153 : 467-478).15 De manière générale, il apparait donc important de trouver de nouveaux produits qui puissent être efficaces contre la composante bactérienne de l'acné, et pouvant être utilisés dans le traitement de l'acné. En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention réside dans la mise au point d'une solution efficace pour le traitement prophylactique et curatif des infections bactériennes, notamment causée par les bactéries Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis impliquées dans l'acné. De manière tout à fait surprenante, le Demandeur a constaté que des milieux de culture de micro-algues présentaient des propriétés bactéricides tout à fait intéressantes, notamment vis-à-vis des bactéries Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis. Plus précisément, le Demandeur a mis en évidence l'intérêt des surnageants de culture des 15 micro-algues du genre Nostoc. Certes, des recherches de plus en plus nombreuses s'intéressent aux micro-algues, en tant que nouvelles sources d'activités biologiques. Cependant, ces recherches sont principalement centrées sur la biomasse, et en particulier sur les actifs solubles dans des 20 solvants apolaires. En revanche, peu d'études s'intéressent aux milieux dans lesquels sont cultivées ces micro-algues, et dans lesquels sont potentiellement excrétés des principes actifs. Ainsi, le document CN101822630 décrit l'utilisation de biomasse de Nostoc pour retenir 25 l'eau, et son utilisation comme composé hydratant pour la cosmétique. Le document CN101647759 décrit l'utilisation de polysaccharides extraits de biomasse de Nostoc pour maintenir l'humidité dans les produits cosmétiques. 30 Le document FR 2 932 086 décrit l'utilisation de forskoline extraite de la biomasse de microalgues, dont Nostoc commune, pour une utilisation comme agent antivieillissement dans les produits cosmétiques. Le document JP2004238519 décrit des extraits de microalgues dont ceux de Nostocales, 35 pour leurs propriétés antioxydantes et absorbeurs d'ultraviolets utilisables dans des compositions alimentaires et cosmétiques. La demande de brevet WO 01/00789 décrit l'utilisation d'extraits ou molécules lipophiles de la biomasse d'une souche de Nostoc pour obtenir des actifs aux propriétés antifongiques, antibactériennes, insecticides, anti-nématodes, et antimicrobiennes. Le document JP11228437 décrit l'obtention d'inhibiteurs de hyaluronidase et d'agents antimicrobiens obtenus à partir de la biomasse de microalgues dont des Nostocales. Le document JP7242689 décrit l'obtention d'un antifongique extrait d'algues bleu-vert comme Nostoc commune par extraction à l'aide de solvants apolaires à partir de la biomasse. Le brevet US 4,946,835 décrit la purification de l'antifongique dioxadiazacyclohexadecenetetrone, à partir de la biomasse de cyanobactéries (Nostoc sp.). La demande de brevet WO 00/75282 décrit l'obtention d'un extrait thermostable de milieu de culture de micro-algues présentant une activité anti-oxydante et pro-cicatrisante. DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention est basée sur la découverte de propriétés inattendues du milieu de culture dans lequel les microalgues sont cultivées, et qui peut dans certaines conditions être une source d'actifs d'intérêt en pharmacie, en dermatologie et en cosmétique. L'objet de la présente invention est une nouvelle utilisation de milieux de culture dans lesquels ont été cultivées des micro-algues, en tant que sources d'agents antibactériens utilisables pour la prévention et le traitement des infections cutanées. De manière tout à fait surprenante, le Demandeur a constaté et démontré que le milieu de culture dans lequel des micro-algues sont cultivées présentait des propriétés antimicrobiennes vis-à-vis de certaines bactéries. Ainsi et selon un premier aspect, la présente invention concerne un extrait possédant des propriétés antibactériennes, obtenu à partir d'un surnageant de culture d'une micro-algue. Dans le cadre de l'invention, on entend par surnageant de culture, le milieu de culture dans lequel a été cultivé la micro-algue, après séparation d'avec la micro-algue. Dans un cas particulier, ledit extrait correspond au surnageant de culture d'une micro-algue. Dans le cadre de l'invention, on entend par « micro-algue », une algue procaryotique ou eucaryotique présentant une taille de l'ordre du micromètre. Une algue est un organisme autotrophe capable de se développer uniquement à partir d'éléments simples comme le gaz carbonique, l'eau, les sels minéraux, par photosynthèse. Parmi les micro-algues procaryotiques, les cyanobactéries sont privilégiées. Parmi les cyanobactéries, la classe des cyanophycées ou micro-algues bleues est privilégiée. A l'intérieur de cette classe, une micro-algue de l'ordre des Nostocales, en particulier de la famille des Nostocaceae, et encore plus avantageusement du genre Nostoc, est avantageusement choisie. Dans le genre Nostoc, une souche présentant une portion de son ARN 16s de séquence SEQ ID NO :1 est avantageusement mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention. Selon un autre aspect, la présente invention vise le procédé d'obtention d'un tel extrait. Celui-ci comporte avantageusement les étapes suivantes : - culture d'une micro-algue dans un milieu de culture adapté ; - séparation des micro-algues et du milieu de culture ; - récupération du milieu de culture pour l'obtention de l'extrait. Avantageusement et pour mieux se différencier de l'art antérieur, la culture n'a pas subi de sursaturation en oxygène. Un milieu adapté pour la culture d'une micro-algue est avantageusement un milieu BG11, 25 également référencé ATCC Medium 616. Conviennent également les milieux suivants : - ATCC Medium 617 ou BG-11 for Marine Blue-Green Algae : correspond à un milieu ATCC Medium 616 modifié ; - ATCC Medium 819 ou Blue-green Nitrogen-fixing Medium: correspond à un milieu ATCC Medium 616 sans NO3; 30 Le milieu BG11 peut être d'origine commerciale (Sigma), ou bien reconstitué comme suit : NaNO3 1,5 g K2HPO4 3l mg MgSO4, 7H20 75 mg CaC12, 2 H20 36 mg Acide citrique, 1 H2O 36 mg EDTA disodique 1 mg Na2CO3 20 mg Citrate de fer ammoniacal 6 mg Solution de sels métalliques 1 mL Eau ultrapure (bi-distillée) qsp 1 L Avec, pour la solution de sels métalliques, la composition suivante : H3BO4 715 mg MnC12, 4H2O 452 mg ZnSO4, 7 H20 56 mg Na2MoO4, 7 H20 97 mg CuSO4, 5 H20 20 mg Cu(NO3)2, 6 H20 12,5 mg Eau ultrapure (bi-distillée) qsp 250 mL Un tel milieu est avantageusement ajusté à un pH neutre. De manière adaptée, il est également stérilisé, par exemple par autoclavage. Le temps de culture de la micro-algue peut varier de plusieurs jours à plusieurs semaines, voire plusieurs mois. La culture est stoppée lorsque la densité cellulaire est optimale. En pratique, la culture est avantageusement menée de 21 jours (3 semaines) à 55 jours (8 semaines). Afin de réaliser la photosynthèse, la culture nécessite de la lumière. Celle-ci peut être apportée par un éclairage, par exemple par cycles de 12 heures sur 24. Des lampes sont avantageusement utilisées pour assurer cet éclairage contrôlé. La culture est avantageusement réalisée en conditions d'aérobiose, sans apport supplémentaire de gaz. L'étape suivante consiste à séparer les micro-algues du milieu de culture. Celle-ci est 20 avantageusement réalisée par centrifugation. Les conditions de la centrifugation doivent assurer la décantation des micro-algues, sans toutefois affecter leur structure. Les conditions de centrifugation sont avantageusement de 10 minutes à 300g, afin de séparer la biomasse du surnageant de culture. 25 Le surnageant de culture ainsi séparé peut alors être récupéré, notamment par transvasement ou aspiration. Il peut alors être utilisé en tant que tel comme extrait à propriétés antibactériennes ou subir des traitements ultérieurs. A noter que l'ingrédient essentiel du milieu de culture initial étant l'eau, on se trouve en présence d'une fraction hydrosoluble. 30 De manière privilégiée, pour éliminer les éventuels débris cellulaires, le milieu de culture ainsi séparé et récupéré peut être soumis à une filtration, avantageusement sur une membrane cellulosique de porosité 0,22 µm. L'extrait peut subir d'autres étapes de traitement telles que concentration, purification ou lyophilisation. L'activité antibactérienne recherchée peut être suivie au cours de ces différentes étapes pour s'assurer qu'elle n'est pas affectée par les traitements mis en oeuvre. Un tel extrait peut être incorporé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique, avantageusement à hauteur de 0,1 à 10% en poids de la composition, encore plus avantageusement de 0,5 à 10%. Il peut alors être mélangé à des excipients classiques acceptables en cosmétique ou en pharmacie. Une composition cosmétique ou pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous différentes formes telles que lotion, crème, gel, ...Des compositions à usage topique sont plus particulièrement visées par la présente invention. 20 Dans le cas particuliers des gels à usage topique, on utilise de préférence un ou plusieurs agents humectants, un ou plusieurs agents gélifiants, et/ou un ou plusieurs conservateurs. Les compositions selon l'invention peuvent également contenir une ou plusieurs autres substances actives, en plus de l'extrait décrit ci-dessus. A titre d'exemple, on peut 25 associer un agent anti-acnéique connu tel que l'adapalène. On peut également utiliser en association des agents antibactériens tels que le peroxyde de benzoyle, l'érythromycine, ou encore la clindamycine. Dans le cadre de l'invention, il a été montré qu'un tel extrait, qui présente l'intérêt d'être 30 obtenu par un procédé extrêmement simple, présentait des propriétés antibactériennes, notamment vis-à-vis des bactéries Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis. En d'autres termes, la présente invention rapporte, pour la première fois, la sécrétion par 35 les micro-algues, dans leur milieu de culture, de molécules présentant une activité antibactérienne. 15 L'activité antibactérienne selon l'invention peut être mesurée à l'aide d'un test relativement simple : L'extrait à tester est ajouté dans un milieu de culture adapté à la bactérie d'intérêt, avantageusement à une concentration finale de 10%, ledit milieu contenant typiquement 100 000 bactéries par millilitre desdites bactéries. Ensuite, la culture est menée dans des conditions adaptées à la bactérie d'intérêt, avantageusement pendant plusieurs heures, voire plusieurs jours. En pratique, pour la bactérie Propionibacterium acnes, l'extrait est ajouté dans du milieu anaérobie liquide en conditions d'anaérobiose. La culture est incubée à 37°C. Pour la bactérie Staphylococcus epidermidis, l'extrait est ajouté dans du milieu liquide par exemple TS, en conditions d'aérobiose. La culture est incubée à 37°C. L'extrait peut être dilué à différentes concentrations de manière à établir une gamme, afin 15 de déterminer la concentration minimale nécessaire pour inhiber la croissance bactérienne. La croissance bactérienne est évaluée visuellement, ou par mesure de l'absorbance à 595 nm. Ainsi et selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation de l'extrait décrit ci-20 dessus comme agent antibactérien, avantageusement à l'encontre des bactéries Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis. Par conséquent, l'extrait faisant l'objet de l'invention peut être utilisé dans la prévention et le traitement des infections induites par Propionibacterium acnes et Staphylococcus 25 epidermidis. Plus généralement, l'invention vise un extrait selon l'invention ou une composition le contenant pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des infections cutanées ou des dermatoses ayant une composante bactérienne, en particulier l'acné. Pour ces applications thérapeutiques, l'extrait est avantageusement administré par voie topique. 30 EXEMPLES DE REALISATION L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples qui suivent, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci n'ont toutefois aucune portée limitative. 5 La figure 1 représente le suivi de l'absorbance au cours du temps d'une culture de Propionibacterium acnes en absence du milieu de culture dans lequel ont proliféré les cyanobactéries du genre Nostoc, ou en présence de 10% de ce milieu de culture. Un contrôle d'activité bactériostatique/bactéricide est effectué en parallèle, par ajout de 34 10 µg/mL de chloramphénicol. La figure 2 représente le suivi de l'absorbance au cours du temps d'une culture de Staphylococcus epidermidis en absence du milieu de culture dans lequel ont proliféré les cyanobactéries du genre Nostoc, ou en présence de concentrations croissantes de ce milieu de culture. Un contrôle d'activité bactériostatique/bactéricide est effectué en 15 parallèle, par ajout de 25 µg/mL de gentamicine. 1/ Choix de la souche de micro-algues : Une collection de 112 micro-algues a initialement été criblée afin de rechercher des 20 activités antibactériennes potentielles contre Staphylococcus aureus. Parmi cette collection, des extraits issus de 6 microalgues présentaient une activité antibactérienne. La souche présentant une activité optimale a été sélectionnée pour son activité antibactérienne sur culture de Staphylococcus epidermidis. Des pré-cultures de micro-algues sont réalisées en petit volume (10 mL) en milieu BG11. Le milieu BG11 peut être d'origine commerciale (Sigma), ou bien reconstitué comme suit : NaNO3 1,5 g K2HPO4 3l mg MgSO4, 7H20 75 mg CaC12, 2 H20 36 mg Acide citrique, 1 H2O 36 mg EDTA disodique 1 mg Na2CO3 20 mg Citrate de fer ammoniacal 6 mg Solution de sels métalliques 1 mL Eau ultrapure (bi-distillée) qsp 1 L 8 25 30 Avec, pour la solution de sels métalliques, la composition suivante : H3BO4 715 mg MnC12, 4H2O 452 mg ZnSO4, 7 H20 56 mg Na2MoO4, 7 H20 97 mg CuSO4, 5 H20 20 mg Cu(NO3)2, 6 H20 12,5 mg Eau ultrapure (bi-distillée) qsp 250 mL Ajuster à pH 7,1 puis autoclaver 20 minutes à 121°C. Après un temps suffisamment long (de 3 à 8 semaines), les tubes dans lesquels chacune des micro-algues a été cultivée sont centrifugés, et le milieu de culture est prélevé. Les milieux de culture sont ajoutés à une concentration finale de 10% dans du milieu 10 anaérobie liquide TS contenant 100 000 bactéries du genre Staphylococcus epidermidis par millilitre, en conditions d'aérobiose. Les cultures sont incubées à 37°C. Après 16 à 18 heures, les cultures sont observées visuellement ; alternativement, l'absorbance à 595 nm peut être mesurée. Les cultures qui sont devenues troubles, ou dont l'absorbance à 595 nm a augmentée par rapport au démarrage de l'expérience, ne présentent pas d'activité 15 antibactérienne contre Staphylococcus epidermidis en aérobie. Par contre, les cultures qui sont restées claires (identiques au milieu TS + 10% milieu BG11) contiennent un milieu de culture qui présente une activité antibactérienne contre Staphylococcus epidermidis. Ainsi, le Demandeur a pu identifier un milieu de culture d'une micro-algue du genre 20 Nostoc, aux propriétés antibactériennes contre Staphylococcus epidermidis en conditions de culture aérobie. Cette souche de Nostoc a la particularité d'avoir une séquence d'ADN codant une portion de l'ARN 16S comme suit : 25 GTGAGGGAGGAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAATAACTCAA TGAAGGTACTTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCA GGTGGCAATGTAAGTCTGCTGTCAAAGAATGAGGCTCAACCTTATCAAGGCA GTGGAAACTACGTAGCTAGAGTACGGTCGGGGTAGAAGGAATTCCTGGTGTA 30 GCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGTTCTGC TAGACCTGTACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTA GATACC (SEQ ID NO : 1).5 2/ Obtention d'un extrait du milieu de culture de micro-algues : L'algue est cultivée dans un milieu de type BG11. L'éclairage est assuré par des lampes Grolux Sylvania Aquastar 18W, par cycles de 12 heures sur 24. Au bout de 21 à 55 jours, lorsque la densité cellulaire est optimale, les algues sont séparées du milieu de culture par centrifugation. Le milieu de culture est alors filtré, par exemple sur une membrane cellulosique de porosité 0,22 µm, afin de retenir les débris cellulaires. Le milieu de culture obtenu peut ainsi être utilisé tel quel comme ingrédient, ou bien déshydraté par lyophilisation. Le milieu de culture obtenu peut être dessalé ou non. 3/ Activité du surnageant de cultures de microal2ues sur les affections cutanées : L'efficacité des surnageants de culture de micro-algues est testé sur deux microorganismes : Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis. Le milieu de culture de la souche Nostoc de l'exemple 1 est ajouté dans du milieu 20 anaérobie liquide contenant 100 000 bactéries du genre Propionibacterium acnes par millilitre, en conditions d'anaérobiose. La culture est incubée à 37°C. La croissance bactérienne est suivie au cours du temps par mesure de l'absorbance à 595 nm. Sur la figure 1, on constate que le milieu de culture de l'exemple 1 inhibe totalement la 25 prolifération de Propionibacterium acnes pendant au moins 70 heures. Le milieu de culture de la souche Nostoc de l'exemple 1 est ajouté dans du milieu TS liquide contenant 100 000 bactéries du genre Staphylococcus epidermidis par millilitre, en conditions d'aérobiose. La culture est incubée à 37°C. La croissance bactérienne est 30 suivie au cours du temps par mesure de l'absorbance à 595 nm. Sur la figure 2, on constate que le milieu de culture de l'exemple 1 inhibe totalement la prolifération de Staphylococcus epidermidis pendant au moins 24 heures. 35 En conclusion, on constate donc que le milieu de culture de l'exemple 1 présente une activité bactériostatique sur Staphylococcus epidermidis et Propionibacterium acnes. 10 15 4/ Gel topique anti-acnéen : Exemple de composition d'un gel topique anti-acnéen : Glycérine 12 g Cyclopentasiloxane/Cyclotetrasiloxane/Dimethiconol 2 g Octydodecanol 2 g Carbomère 974P 0,5 g Gomme Xanthane 0,3 g Hydroxyde de sodium 0,25 g Surnageant de culture de Nostoc selon l'exemple 2 10 g Eau Qsp l00 g 5/ Produit cosmétique : Exemple de composition d'une crème cosmétique anti-acnéenne : Cire d'abeille 11 g Ethoxydiglycol 4 g Octydodecyl myristate 10 g Isostéaryl Isostéarate 9 g Hydroxyde de sodium 0,4g Surnageant de culture de Nostoc selon l'exemple 2 1 g Eau, conservateur, parfum Qsp 100 g10 REVENDICATIONS1/ Extrait possédant des propriétés antibactériennes obtenu à partir du surnageant de culture d'une micro-algue. 2/ Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce que la micro-algue est une cyanobactérie, avantageusement du genre Nostoc. 3/ Extrait selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'ARN 16s de la micro-algue 10 comprend la séquence SEQ ID NO : 1. 4/ Extrait selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la culture n'a pas subi de sursaturation en oxygène. 15 5/ Extrait selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est obtenu à l'aide du procédé suivant : - culture de la micro-algue dans un milieu de culture adapté ; - séparation de la micro-algue et du milieu de culture ; - récupération du milieu de culture pour l'obtention de l'extrait. 20 6/ Extrait selon la revendication 5, caractérisé en ce que la culture est réalisée pendant une durée allant de 21 à 55 jours. 7/ Extrait selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la séparation de la micro-25 algue et du milieu de culture est réalisée par centrifugation. 8/ Extrait selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le milieu de culture est ensuite soumis à une filtration, avantageusement sur une membrane cellulosique de porosité 0,22 µm. 9/ Composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant un extrait selon l'une des revendications 1 à 8. 10/ Composition cosmétique ou pharmaceutique selon la revendication 9 caractérisée en 35 ce que l'extrait représente de 0,1 à 10% en poids de la composition. 11/ Extrait selon l'une des revendications 1 à 8 ou composition selon les revendications 9 et 10 pour son utilisation comme agent antibactérien, avantageusement à l'encontre des bactéries Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis. 3012/ Extrait selon l'une des revendications 1 à 8 ou composition selon les revendications 9 et 10 pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des infections cutanées, en particulier l'acné.