Brevet FR2967165A1 — publié le 20120511

Méthode de dépistage du cancer colorectal La présente invention concerne une méthode de dépistage du cancer colorectal chez un sujet comprenant une étape de mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi NPY, PENK et leurs fragments ou variants dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet. Le cancer colorectal est une maladie très répandue qui représente 10,5% des cancers dans le monde, et est en forte progression (25000 nouveaux cas par an dans les années 1970, 40000 nouveaux cas par an dans les années 2000 en France). L'espérance de vie des malades reste faible, et est évaluée à moins de 50% à 5 ans tous stades confondus. C'est une maladie fréquente, grave et coûteuse qui relève dans la plupart des pays d'une action de dépistage systématique des personnes à risque moyen (asymptomatique de plus de 50 ans). Hémoccult est le test actuellement le plus utilisé pour le dépistage du cancer colorectal. Ce test consiste en la recherche de sang occulte dans les selles. Le dépistage comporte alors deux étapes: réalisation du test Hemoccult sur trois échantillons de selles consécutives pour détecter la détection de sang occulte, suivi, en cas de positivité de celui-ci, d'une coloscopie pour détecter des tumeurs colo-rectales. On reconnaît deux limites à ce test : les faux positifs (50%) entraînant des coloscopies inutiles, et les faux négatifs, laissant échapper à la coloscopie des malades porteurs de tumeurs. Le degré de positivité du test dans la population asymptomatique de 50 à 75 ans est de 2 à 3%. Sa valeur prédictive positive, en référence à une coloscopie, est de 50%. Ainsi, dans les conditions actuelles du dépistage, près de 50% des coloscopies réalisées sont normales. D'autre part, près de 50% des sujets porteurs d'une tumeur colique, bénigne ou maligne, ne sont pas identifiés comme tels par cette stratégie de dépistage. Ce test (Hemoccult) est critiquable puisqu'il n'est pas spécifique et peu sensible. De plus, en raison des réticences à manipuler les selles, une partie des personnes cibles renonce à subir un tel test de dépistage. Il existe donc aujourd'hui un besoin pour un test spécifique, sensible, non invasif, permettant la détection chez un sujet d'une prédisposition ou d'un risque de cancer colorectal. Des études récentes ont mis en lumière l'intérêt de la détection de la méthylation comme marqueur diagnostic ou pronostic de différents cancers. On entend par "diagnostic" la détermination d'une affection d'une personne atteinte par une pathologie donnée, et par "pronostic" on entend le degré de gravité et l'évolution ultérieure d'une pathologie. La méthylation est un mécanisme de contrôle naturel qui régule l'expression génique de l'ADN. Par exemple, une méthylation anormale de certains gènes peut diminuer l'expression génique et être associée au développement de cancers. Il est aujourd'hui admis que l'hyperméthylation des îlots CpG présents au niveau des promoteurs de gènes suppresseurs de tumeurs joue un rôle fondamental dans l'initiation et la progression des pathologies cancéreuses. La demande de brevet FR 2 927 091 décrit un kit de dépistage du cancer colorectal basé sur la détection de l'hyperméthylation d'un marqueur. Cependant, ce test 20 se base sur un unique marqueur et ne présente pas une sensibilité acceptable. De façon surprenante, les inventeurs ont réussi à mettre en oeuvre un test moléculaire permettant d'identifier plusieurs marqueurs d'intérêt dont l'hyperméthylation est spécifique des cancers colorectaux. Après de longues recherches, les inventeurs ont mis au point une méthode permettant d'analyser dans les effluents biologiques l'ADN provenant de cellules tumorales intestinales. Il est ainsi possible d'étudier les anomalies fonctionnelles de cet ADN. Ces recherches ont permis de mettre en lumière de nouveaux marqueurs spécifiques des cancers colorectaux. L'invention se rapporte donc à un test moléculaire se basant sur le concept de Methylation Specific PCR (MSP) en mode multiplex, soit MSPM. La MSPM présente pour intérêt majeur la diminution du nombre de PCR à mettre en oeuvre par rapport au mode monoplex. Ainsi, le mode multiplex permet un gain de temps, car il est plus rapide que plusieurs monoplex, et est économiquement avantageux. L'utilisation de la technique MSPM présente également un intérêt indéniable lorsque l'échantillon biologique choisi pour la mise en oeuvre du test génétique est le sang, puisque la quantité d'ADN circulant dans le sang est relativement faible. Par "PCR Multiplex", on entend une forme de PCR, généralement une PCR quantitative permettant l'amplification simultanée de plusieurs cibles d'intérêt en une seule étape, en utilisant une ou plusieurs amorces spécifiques. Cette technique est très avantageuse pour déterminer la présence de délétions, mutations, polymorphismes ou hyperméthylations de plusieurs marqueurs. Par opposition, l'expression "PCR Monoplex" fait référence à une forme de PCR, généralement une PCR quantitative, permettant l'amplification d'une seule cible d'intérêt. Par "méthylation spécifique PCR", on entend une technique classique de l'art antérieur permettant de mesurer le degré de méthylation d'un gène. Cette technique se base sur le principe de la PCR quantitative. Typiquement, cette technique repose sur le traitement avec le bisulfite de sodium de l'échantillon d'ADN à étudier. Ce traitement permet de transformer chacune des cytosines non méthylées en uraciles dans l'ADN traité. L'échantillon ainsi traité subit ensuite une PCR avec des amorces spécifiques des gènes à traiter. La détermination de la nature des amorces spécifiques dépend de la séquence nucléotidique à amplifier. Dans le cadre de cette invention, la méthylation spécifique PCR est préférentiellement mise en oeuvre en mode multiplex, on parle alors de Methylation Specific PCR en mode multiplex, soit MSPM. Ainsi, l'invention concerne une méthode de dépistage du cancer colorectal chez un sujet, comprenant une étape de mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi les gènes NPY, PENK et leurs fragments ou variants dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet. Par "dépistage du cancer colorectal", on entend la détection d'une prédisposition à développer un cancer colorectal, mais aussi la détection d'un cancer colorectal déjà installé chez un sujet. Par "méthylation" on entend l'addition d'un groupement méthyl au niveau du carbone 5 d'une cytosine dans un dinucléotide CpG. Ces dinucléotides sont peu fréquents dans la structure de l'ADN, sauf dans les "îlots" CpGs. Ces îlots sont typiquement représentés au niveau de la région promotrice des gènes. Ainsi, lorsqu'on parle de méthylation d'un gène, on fait référence à la méthylation de la région promotrice dudit gène. La présence d'un groupement méthyle en un site précis empêche l'interaction entre le gène et les facteurs de transcription. Typiquement, les groupes méthyles empêchent les facteurs de transcription de se fixer sur le site d'amplification et au promoteur, et à l'ARN polymérase de se fixer sur le site d'initiation. Aussi, la méthylation de la région promotrice a pour conséquence la répression de la transcription de l'ADN. L'expression "méthylation d'un gène" englobe la méthylation des îlots CpG de la séquence nucléotidique du gène mais également la méthylation des séquences nucléotidiques du promoteur du gène auquel cette expression s'applique. Par "gène NPY", on entend le gène qui code pour le neuropeptide Y ou NPY. Par "gène PENK", on entend le gène qui code pour la neuropeptide 5 proenképhaline A ou PENK. Ces deux neuropeptides sont impliqués dans la prise alimentaire, l'absorption des nutriments et l'équilibre de la dépense énergétique de l'organisme. Ce sont des neuropeptides régulateurs des fonctions digestives qui peuvent également réguler la prise alimentaire et le comportement neuro-digestif. 10 Par "fragment d'un gène", on entend une séquence dudit gène d'une longueur d'au moins 50 paires de bases, préférentiellement d'une longueur comprise entre 60 à 110 paires de bases. Par "variant d'un gène", on entend une séquence d'acide nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus 15 préférée d'au moins 98 % par rapport audit gène ou à un fragment dudit gène. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides nucléiques ou au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard 20 et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par "variants présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins 98 %", on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, de façon plus préférée au moins 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de dépistage du cancer colorectal selon l'invention comprend une étape de mesure du degré de méthylation d'au moins une des séquences polynucléotidiques choisie parmi SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. La séquence SEQ ID N°1 correspond à un fragment de la séquence du gène NPY. Quant à la séquence SEQ ID N°2, elle correspond à un fragment de la séquence du gène PENK. Par "sujet", on entend un individu sain ou susceptible d'être atteint d'un cancer ou en quête de dépistage, de diagnostic ou de suivi. Par "échantillon biologique", on entend un échantillon contenant de la matière biologique. Plus préférentiellement, on entend tout échantillon contenant du matériel génétique, tel que des acides nucléiques. Cet échantillon peut provenir d'un prélèvement biologique effectué chez un être vivant (patient humain, animal, végétal). Préférentiellement, les échantillons biologiques selon l'invention sont choisis parmi tous les effluents obtenus à partir d'un sujet humain, par exemple le sang total, le plasma, le sérum, la lymphe, les urines, la salive, les selles, ou la sueur. Par "matériel nucléique", on entend toute séquence d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou ribonucléique (ARN). Préférentiellement, l'échantillon biologique est soumis à une étape d'extraction du matériel nucléique avant l'étape de mesure du degré de méthylation. Cette extraction du matériel nucléique s'effectue selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Par exemple, cette extraction peut être effectuée par lyse cellulaire des cellules issues de l'échantillon biologique. Cette lyse peut être de nature chimique, physique, thermique. Cette lyse cellulaire est généralement suivie d'une étape de purification permettant de séparer et concentrer les acides nucléiques d'autres débris cellulaires. Pour la mise en oeuvre de cette extraction et cette purification, les kits commerciaux de type QIAGEN et Zymo Research peuvent être utilisés. Bien entendu, les techniques pertinentes diffèrent en fonction de la nature de l'échantillon biologique testé. Les connaissances de l'homme du métier lui permettent aisément d'adapter ces étapes de lyse et de purification audit échantillon biologique testé. Préférentiellement, la méthode selon l'invention comprend en outre une étape de mesure du degré de méthylation du gène Wifl, un de ses fragments ou variants dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de dépistage du cancer colorectal selon l'invention comprend une étape de mesure du degré de méthylation de la séquence polynucléotidique SEQ ID N°3. La séquence SEQ ID N°3 correspond à un fragment de la séquence du gène Wifl. Plus préférentiellement, la mesure du degré de méthylation du gène Wifl ou un de ses fragments ou variants s'effectue simultanément à la mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi NPY, PENK et leurs fragments ou variants dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet. Le gène Wifl est un inhibiteur de la voie Wnt. L'élément initiateur de la carcinogénèse colorectale est l'inactivation du gène APC dont la protéine joue un rôle relatif au contrôle de la prolifération, de l'apoptose et de la migration des cellules épithéliales intestinales. Cette inactivation provoque l'activation de certaines voies de signalisation, telles que celle de la WNT/Béta-caténine et la formation d'adénomes précoces. Il est connu que Wifl est l'un des gènes impliqués dans l'inhibition de la voie de signalisation Wnt. Aussi, l'hyperméthylation du gène Wifl s'accompagne de la levée d'inhibition de cette voie. Préférentiellement, la méthode selon l'invention comprend en outre une étape de mesure du degré de méthylation d'un gène de ménage. Préférentiellement, cette étape de mesure du degré de méthylation du gène de ménage s'effectue de manière simultanée à la mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi NPY, PENK et leurs fragments ou variants et/ou de manière simultanée à la mesure du degré de méthylation du gène Wifl ou un de ses fragments ou variants. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de dépistage du cancer colorectal selon l'invention comprend une étape de mesure du degré de méthylation de la séquence SEQ ID N°4. La séquence SEQ ID N°4 correspond à un fragment de la séquence du gène de l'albumine. Par "gène de ménage", ou "gène ménager" ou "gène constitutif", ou encore "housekeeping gene", on entend un gène constitutionnel qui code principalement pour des protéines essentielles aux fonctions cellulaires de base. De manière préférée, l'expression des gènes de ménage selon l'invention est ubiquitaire et stable entre les différents tissus. Préférentiellement le gène de ménage est choisi parmi les gènes codant pour l'albumine, la beta actine, l'alpha actine, beta microglobuline, préférentiellement l'albumine. Ces gènes de ménage présentent un intérêt majeur dans le contexte de l'invention. En effet, le degré de méthylation des gènes NPY, PENK et Wifl ou leurs fragments ou variants est exprimé par rapport à la méthylation d'un gène de ménage dont l'expression est stable. Typiquement, dans le cadre de la présente invention, la mesure du degré de méthylation des gènes d'intérêt se fait selon les techniques classiques de l'art antérieur. De manière préférée, cette mesure s'effectue selon la technique de "Methylation Specific PCR". Typiquement, pour l'amplification du gène Wifl, on utilise l'amorce sens SEQ ID N°9, cette séquence comptant 19 bases et présentant 3 sites CpG, et l'amorce antisens SEQ ID N°10, cette amorce comptant 24 bases et présentant 2 sites CpG. La sonde TagMan-MGB SEQ ID N°11 compte 16 bases et 2 sites CpG. Typiquement, pour l'amplification du gène NPY, on utilise l'amorce sens SEQ ID N°12, cette séquence comptant 20 bases et présentant 3 sites CpG, et l'amorce antisens SEQ ID N°13, cette amorce comptant 23 bases et présentant 4 sites CpG. La sonde TagMan-MGB SEQ ID N°14 compte 18 bases et 3 sites CpG. Typiquement, pour l'amplification du gène PENK, on utilise l'amorce sens SEQ ID N°15, cette séquence comptant 21 bases et présentant 3 sites CpG, et l'amorce antisens SEQ ID N°16, cette amorce comptant 21 bases et présentant 2 sites CpG. La sonde TagMan-MGB SEQ ID N°17 compte 18 bases et 3 sites CpG. Typiquement, pour l'amplification du gène de l'albumine, on utilise l'amorce sens SEQ ID N°18, cette séquence comptant 22 bases et présentant aucun site CpG, et l'amorce antisens SEQ ID N°19, cette amorce comptant 22 bases et présentant aucun site CpG. La sonde TagMan-MGB SEQ ID N°20 compte 17 bases et aucun site CpG. Par "degré de méthylation" ou "taux de méthylation", on entend le pourcentage du nombre de sites CpG méthylées du gène cible par rapport à un standard. Par gène cible, on entend un gène pour lequel on veut mesurer le degré de méthylation. Dans le cadre de la présente invention, ces gènes cibles sont Wifl, NPY, PENK, l'albumine et leurs fragments ou variants. Par standard, on entend la séquence sauvage dudit gène cible ou bien la séquence d'un gène de ménage. Le calcul du degré de méthylation se fait selon les techniques de quantification bien connues de l'homme du métier. Cette quantification peut être absolue ou relative. De manière préférée, son calcul se fait selon la technique dite du AACt. Cette méthode utilise une formule arithmétique pour exprimer le degré de méthylation d'un gène cible, en normalisant avec un gène de référence. Tout d'abord, les différences ACt entre les valeurs du Ct du gène cible et du gène de référence sont déterminées pour l'échantillon à analyser et l'ADN standard. L'ADN standard est typiquement un ADN universellement méthylé. Il permet la normalisation des degrés de méthylation des gènes. Un tel ADN est par exemple commercialisé par la société Zymo Research sous la référence commerciale D5011. Suite à la modification par un kit approprié, tel que le kit commercial EZ DNA Methylation (réf. D5002, Zymo Research), cet ADN standard est utilisé comme référentiel. Les valeurs des Ct obtenues sur les gènes Albumine, Wifl, NPY et PENK correspondent par défaut à 100% de copies méthylées. ACtéchantillon= Ct (cibleéchantillon) - Ct (référenceéchantillon) ACtsta d,d = Ct (ciblestandard) - Ct (référencestandard) Ensuite, le AACt entre le standard et l'échantillon est calculé : AACt = ACtstandard - ACtéchantillon La méthode de calcul des AACt présume que les efficacités d'amplification par PCR des 2 gènes sont égales à 100%. Ainsi, en d'autres termes, cette méthode de calcul présume que la concentration en produits est doublée à chaque cycle de la phase exponentielle de la PCR. On en déduit donc que le degré de méthylation normalisé d'un gène cible est déterminé par la formule 2 44Ct= 2 (Ctgene - Ct albumine) standard - (Ctgène - Ctalbumine) échantillon Cette méthode donne un degré de méthylation relatif en fonction du contrôle positif utilisé (ADN standard). Elle tient en outre compte des variations du nombre de copies du gène de référentiel utilisé. Ces variations sont nécessairement dues aux 2967165 IL variations de quantité d'ADN ayant servi à la mise en oeuvre de la PCR. Ainsi, les résultats ne sont pas biaisés par la nature du gène de référence. De manière préférée, le gène de référence est un gène de ménage. De manière encore plus préférée, il s'agit du gène de l'albumine. 5 Préférentiellement, la méthode de l'invention comprend la mesure simultanée des degrés de méthylation : - des gènes NPY et PENK ou leurs fragments ou variants respectifs, et/ou - des gènes NPY et Wifl ou leurs fragments ou variants respectifs, et/ou - des gènes PENK et Wifl ou leurs fragments ou variants respectifs. 10 Plus préférentiellement, la méthode de l'invention comprend la mesure simultanée des degrés de méthylation : - des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2; et/ou - des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°3; et/ou - des séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. 15 Plus préférentiellement, la méthode de l'invention comprend la mesure simultanée des degrés de méthylation d'une part des gènes Wifl et d'un gène de ménage ou leurs fragments ou variants respectifs, et d'autre part des gènes NPY et PENK ou leurs fragments ou variants respectifs. Préférentiellement, le gène de ménage est l'albumine. Les inventeurs ont effectivement démontré que la mise en oeuvre d'une MSP multiplex 20 sur les gènes Wifl et albumine ou leurs fragments ou variants d'un coté, et les gènes NPY et PENK ou leurs fragments ou variants de l'autre, augmente la sensibilité du test de dépistage du cancer colorectal. Ainsi, la mesure simultanée des degrés de méthylation sur deux des gènes choisis parmi NPY, PENK, Wifl et leurs fragments ou variants permet de récupérer des sujets dépistés comme négatifs selon les techniques classiques de l'art antérieur et pourtant atteints d'un cancer colorectal. Préférentiellement, la méthode de l'invention comprend en outre une étape de comparaison des degrés de méthylation à une valeur seuil. Lorsque la somme des degrés de méthylation d'une combinaison de deux gènes choisis dans le groupe constitué de NPY et PENK ou leurs fragments ou variants respectifs, NPY et Wifl ou leurs fragments ou variants respectifs, et PENK et Wifl ou leurs fragments ou variants respectifs, est supérieure à cette valeur seuil, on estime que le sujet, à partir duquel l'échantillon testé a été prélevé, est positif pour le cancer colorectal. De manière préférée, la méthode de l'invention comprend en outre une étape de comparaison des degrés de méthylation d'une part des gènes Wifl et d'un gène de ménage, ou leurs fragments ou variants et d'autre part des gènes NPY et PENK ou leurs fragments ou variants à une valeur seuil, ladite valeur seuil étant déterminée en fonction des besoins en termes de spécificité et de sensibilité. Pour l'obtention d'un test acceptable, cette valeur seuil est d'environ 2% Ainsi, il convient de comparer d'une part le degré de méthylation des gènes Wif 1 et d'un gène de ménage à une valeur seuil, et d'autre part le degré de méthylation des gènes NPY et PENK à ladite valeur seuil. Par "sensibilité", on entend la proportion de tests positifs chez les sujets atteints de cancer colorectal. Par "spécificité", on entend la proportion de tests négatifs chez les sujets non atteints de cancer colorectal. Par "cut-off", ou "valeur seuil", on entend la valeur limite du degré de méthylation des gènes cibles au dessus duquel l'échantillon, et donc le sujet dont celui-ci provient, est considéré comme positif pour le diagnostic du cancer colorectal selon la méthode de l'invention. Les inventeurs ont mis en oeuvre de fastidieuses études sur un groupe de 246 sujets, dont 23 présentaient un cancer colorectal déclaré, 44 présentaient un cancer d'un autre type et 179 étaient sains. La mise en oeuvre de test génique multiplex sur des combinaisons de gènes cibles à partir de sérum des sujets a permis aux inventeurs de déterminer une valeur seuil au dessus de laquelle le sujet est correctement dépisté comme étant positif au cancer colorectal, avec une sensibilité et une spécificité donnée. La sensibilité et la spécificité du test de dépistage sont donc dépendantes de la valeur seuil choisie. Aussi, il convient d'adapter cette valeur seuil en fonction de la sensibilité et spécificité adéquates. Les valeurs de la sensibilité et de la spécificité pertinentes sont fonctions de plusieurs critères, généralement dépendants de la population à diagnostiquer. Préférentiellement, cette valeur seuil est comprise entre 1 et 5%, préférentiellement entre 1 et 3,5%, préférentiellement entre 1,5 et 3%, préférentiellement entre 2 et 3%, et encore plus préférentiellement cette valeur seuil est de 2%. Les inventeurs ont montré qu'une valeur seuil de 2% permet une sensibilité de 65,2% et une spécificité de 95% du test de dépistage. Si l'on diminue cette valeur seuil, la sensibilité augmente mais la spécificité diminue. Par une approche pas à pas, les inventeurs ont réussi à identifier la valeur seuil la plus pertinente pour le développement d'un test sensible au marqueur génique du cancer colorectal et suffisamment spécifique pour écarter les faux positifs et faux négatifs. Ainsi, en fonction de la population visée et des prédispositions de ladite population au cancer colorectal, le test de l'invention peut être mis en oeuvre avec des valeurs seuils différentes, et ainsi une sensibilité et une spécificité modifiées. En effet, si la population visée est une population à risque et dont les sujets sont susceptibles de développer un cancer colorectal, il est possible de modifier la valeur seuil pour moduler la sensibilité et la spécificité du test. Préférentiellement la méthode de l'invention utilise un échantillon biologique choisi parmi le sang total, le plasma sanguin, l'urine et les selles dudit sujet. Plus préférentiellement, ledit échantillon biologique est choisi parmi le sang total, le plasma et l'urine dudit sujet. La méthode de l'invention est donc très avantageuse puisqu'elle s'affranchit de la nécessité d'effectuer des tests sur les selles du sujet. Aussi, la méthode de l'invention est non invasive et non rédhibitoire pour le sujet cherchant à effectuer un test de dépistage du cancer colorectal. Préférentiellement, la méthode de l'invention comprend en outre une étape d'investigation du colon dudit sujet. Préférentiellement, cette étape d'investigation correspond à une coloscopie optique. Alternativement, cette étape d'investigation correspond à une coloscopie virtuelle, également appelée "coloscanner". La technique de coloscanner repose sur l'étude du colon par scanner et reconstruction en 3 dimensions de l'image interne du tube digestif. . Cette coloscopie permet de vérifier la présence de cancer colorectal chez le sujet considéré comme positif pour le diagnostic du cancer colorectal selon la méthode de l'invention. Préférentiellement, la détection du tissu cancéreux est par la suite confirmée par examen histologique.20 EXEMPLE Sélection des gènes candidats 1. Matériel biologique et extraction de l'ADN génomique Dans une étude menée chez l'homme en dehors du contexte de dépistage, les inventeurs ont recueilli les selles, le sang, les urines avant la coloscopie et procédé à l'extraction de l'ADN dans ces effluents. De l'ADN extrait du tissu a également été obtenu sur muqueuse normale et pathologique (polypes adénomateux, cancer) soit par biopsie endoscopique au cours de la coloscopie soit à partir de la pièce chirurgicale. Ces sujets relevaient d'une coloscopie suite à une consultation spécialisée (donc il s'agit d'une population ayant des troubles fonctionnels ou une anémie sans étiologie évidente). Cette étude avait comme objectif de valider un test moléculaire fécal en comparaison au test Hemoccult. Au total, 648 patients ont été inclus, et les inventeurs ont analysés 577 prélèvements différents. Plusieurs marqueurs moléculaires (mutations ponctuelles, méthylation) ont été étudiés. Les inventeurs ont privilégié l'approche relative à la méthylation des marqueurs et ont ainsi mis en oeuvre une stratégie de sélection de plusieurs gènes qui ont servi à concevoir un test multiplex (NPY, PENK). Les prélèvements biologiques (sang, urines, selles), avant l'examen coloscopique, et tissulaires (muqueuse normale, polypes adénomateux, cancer invasif) ont été soumis à une extraction d'ADN par le kit QiAmp midi kit (Qiagen). Il s'agissait de l'ADN de selles provenant de sujets normaux (N=10), sujets avec cancer (N=10). 16 2. Puce de méthylation La puce de méthylation « Goldengate », commercialisée par la société Illumina (USA), permet d'analyser la méthylation de 1505 sites CpG qui correspondent à 807 gènes dont 28,6% contiennent un site CpG par gène, 57,3% contiennent deux sites CpG par gène et 14,1% contiennent au moins trois sites. Les échantillons d'ADN ont été traités par une solution de bisulfite de sodium, par le kit EZ DNA Methylation (réf. D5002, Zymo Research), puis marqués par deux sondes de fluorescence ciblant distinctement les formes méthylées (béta) et non méthylées (alpha) des brins d'ADN et soumis à l'amplification génique (PCR). Le degré de méthylation du gène étudié a été établi sur la valeur du rapport (béta) / (alpha+béta) allant de 0 (non méthylé) à 1 (totalement méthylé). A chaque valeur communiquée correspondait une valeur p désignant la probabilité d'une mauvaise estimation du degré de méthylation. L'analyse bioinformatique descriptive a été effectuée sur la valeur seuil p ou=20% avec une valeur p 4. Amplification génique en temps réel par la technique MSP Les amorces et les sondes TagMan-MGB (Applied Biosystems) ont été générées en tenant compte de la modification de l'ADN. Le tableau ci-dessous regroupe les séquences des amorces et sondes correspondant au gène de « ménage » : Albumine ainsi que celles de fragments des 3 gènes NPY, PENK et Wifl (respectivement SEQ ID N°1, 2 et 3). Le tableau qui suit indique les séquences nucléotidiques des produits d'amplifications du gène de ménage et des gènes cibles. 5 Séquences nucléiques pour PCR-Méthylation Spécifique NPY ADN non modifié (SEQ ID N°1): 5' CGCGGCGAGGAAGCTCCATAAAAGCCCTGTCGCGACCCGCTCTCTGCACCCCATCCG CTGGCTCTCACCCCTCGGAGACGCTCGCCCGACAGCAT3' ADN modifié : Amplicon de 95 bases (SEQ ID N°5) 5' CGCGGCGAGGAAGTTTTATAAAAGTTTTGTCGCGATTCGTTTTTTGTATTTTATTCG TTGGTTTTTATTTTTCGGAGACGTTCGTTCGATAGTAT3' PENK ADN non modifié(SEQ ID N°2) : 5' CGGGTAGACGTTTTTAAATTCGTTTAGTAAAGATAAGTTTCGGGTAAATTTATTTAC GTTGACGTTGTTCGGATGGAGTAGGTTAATTGGAAAAGTCGGGTTTAGATACG 3' ADN modifié : Amplicon de 110 bases (SEQ ID N°6) 5' CGGGTAGACGTTTTTAAATTCGTTTAGTAAAGATAAGTTTCGGGTAAATTTATTTAÇ GTTGACGTTGTTCGGATGGAGTAGGTTAATTGGAAAAGTCGGGTTTAGATACG3' Wifl ADN non modifié (SEQ ID N°3) : 5' TCTGACGGCGCCAGGTTGCGTAGGTGCGGCACGAGGAGTTTTCCCGGCAGCGAGGA GGTCCTGAGCAGC3' ADN modifié : Amplicon de 69 bases (SEQ ID N°7) 5' TTTGACGGCGTTAGGTTGCGTAGGTGCGGTACGAGGAGTTTTTTCGGTAGCGAGGA GGTTTTGAGTAGT3 Albumine ADN non modifié (SEQ ID N°4): 5'GGGATGGAAAGAATCCTATGCCTGGTGAAGGTCAAGGGTTCTCATAACCTACAGA GAATTTGGGGTCAGCCTGTCC3' ADN modifié : Amplicon de 77 bases (SEQ ID N°8) 5'GGGATGGAAAGAATTTTATGTTTGGTGAAGGTTAAGGGTTTTTATAATTTATAGAG AATTTGGGGTTAGTTTGTTT 3' 19 Le tableau ci-dessous indique les séquenles des amorces sens, des amorces antisens et des sondes TagMan utilisées. Amorce Sens Amorce Antisens Sonde TagMan-MGB Wifl SEQ ID N°9 SEQ ID N°10 SEQ ID N° 11 TTTGAC( GC STTAGGTT ACTACTCAAAACCTCCT SAC C GTAC AGGAGTTTT G TACS' T°m=70°C 16 bases 2 CpG T°m=58.4°C 19 bases 3 T°m=58.1°C 24 bases 2 CpG CpG NPY SEQ ID N°12 SEQ ID N°13 SEQ ID N°14 S S 'S. G S AGGAAGTTT ATACTATCS ~AACS~AAC TC ATTS: CTTTTTTGTA TATA TCC T°m=68°C 18 bases 3 CpG T°m=59°C 20 bases 3 CpG T°m=58.4°C 23 bases 4 CpG PENK SEQ ID N°15 SEQ ID N°16 SEQ ID N°17 CCGGTAGA S TTTTTA C TATCTAAACCS. CACTTTT S~TTGAC TTGTT S GA AATTC C T T°m=52.3°C 21 bases 3 T°m=52.2°C 21 bases 2 CpG T°m=70°C 18 bases 3 CpG CpG Albumine SEQ ID N°18 SEQ ID N°19 SEQ ID N°20 GGGATGGAAAGAATTT AAACAAACTAACCCCAAATT AGGGTTTTTATAATTTA TATGTT CT T°m=63°C 17 bases 0 CpG T°m=52.9°C 22 bases 0 T°m=52.7°C 22 bases 0 CpG CpG L'amplification est réalisée en plaques 96 puits scellées par un film de qualité optique, compatible gPCR (ABgene). 5,8 µl d'ADN modifié (10 ng ADN standard et ADN de patients) sont additionnés à la concentration finale de 400 nmol de chaque amorce (sens et antisens) et à la concentration finale de 250 nmol de sonde TagMan-MGB et de 1X de solution PCR (Applied Biosystems). Le volume réactionnel est de 20 g Les conditions d'amplification sont les suivantes: - Hot start : 94°C pendant 15 minutes; - Up to 48 cycles : 94°C pendant 15 secondes, étape de dénaturation; - 60°C pendant 60 secondes, étapes d'hybridation (annealing) et d'élongation. L'ADN standard est un ADN qui est universellement méthylé (réf. D5011, Zymo Research). Suite à la modification par le kit EZ DNA Methylation (réf. D5002, Zymo Research), il est utilisé par MSP comme référentiel. Les valeurs des Ct obtenues sur les fragments des gènes Albumine, Wifl, NPY et PENK correspondent par défaut à Z00% de copies méthylées. a) Pourcentage de méthylation selon la méthode de delta-delta Ct Le degré de méthylation est quantifié selon la méthode de AACt= 2-(ngè"- ctalbumine)échantin°n + (ccgène-ccaibumine)scanaa Cette méthode donne une valeur relative du degré de méthylation en fonction du contrôle positif utilisé (ADN standard). Elle tient compte des variations du nombre de copies du gène Albumine qui ne peuvent être dues qu' à une variation de quantités d'ADN ayant servi pour la réalisation de la MSP. 5 b)Phase évaluation du Test moléculaire MSPM sur ADN tissulaires La réalisation de la phase d'évaluation a fait appel à 32 ADN tissulaires humains incluant 16 ADN tumoraux et 16 ADN tissus autologues dits « normaux ». cut off = 20% MSP monoplex Sensibilité Spécificité Wifl 68.75% 100% NPY 100% 93.75% PENK 75% 93.75% MSP multiplex NPY + PENK (duplex) 100% 93.75% Wifl + PENK (duplex) 75% 100% Win+ NPY (duplex) 100% 100% Combinaison de MSP multiplex = 2 duplex par run Wifl + albumine 100% 100% NPY+PENK c) Détermination par « Méthylation Spécifique PCR » des performances du Test génique sur ADN sérique Les inventeurs ont développé une MSP en mode multiplex à partir de l'ADN tissulaire. 10 Les très bonnes performances du test multiplex affichées en termes de spécificité et de sensibilité sur prélèvements tissulaires ont conduits à procéder à la validation sur un échantillonnage sérique. i. Matériel biologique Nous avons évalué la pertinence du Test génique multiplex sur un 5 échantillonnage de 246 sérums issus de patients hospitalisés soumis au protocole de test multiplex. ii. Extraction de l'ADN sérique: choix du kit d'extraction Les inventeurs ont évalué la pertinence du Kit d'extraction d'ADN commercialisé par la société Qiagen, Kit QiAmp midi kit, et le Kit ZR Serum (réf. D3013) 10 commercialisé par la société Zymo Research. Le Kit ZR Serum est celui qui a été retenu. Le volume de 4 ml de sérum (8-10 ml de sang total) est recommandé pour obtenir une quantité suffisante de molécules nucléiques nécessaire à la mise en oeuvre de 4 MSP, correspondant à 2 duplex réalisés en combinaison [(Wifl+Albumine) et (NPY+PENK)]. d) Validation 15 La phase de validation du Test multiplex a été réalisée sur un premier échantillonnage de 246 sérums. Parmi ces 246 sérums, 23 sont issus d'individus présentant un cancer colique ou rectal, 44 sont issus d'individus présentant un autre type de cancer, et 179 sont issus d'individus non atteints de cancer. Les performances, affichées en termes de Spécificité et de Sensibilité, de la MSP multiplex ciblant les 3 gènes candidats mis en association (2 20 MSP duplex) sont indiquées dans le tableau ci-dessous. Le duplex 1 correspond à une MSP Multiplex de Wifl et de l'albumine tandis que le duplex 2 correspond une MSP Multiplex de NPY et de PENK. cut off = 3% cut off = 2% Test génique multiplex sérique Sensibilité Spécificité Sensibilité Spécificité 246 sérums dont: 56,5% 98,3% 65,2% 95% -23 cancers colorectaux -44 autres cancers -179 non cancers Il apparaît que la spécificité et la sensibilité sont dépendantes de la valeur seuil choisie initialement. Ainsi une valeur seuil (ou cut off) de 3% permet une sensibilité de 56,5% et une spécificité de 98,3%, tandis qu'une valeur seuil de 2% permet une sensibilité de 65,2% et une spécificité de 95%. Ainsi, il convient d'adapter la valeur seuilen fonction de la population d' individus à diagnostiquer. e) Comparatif des performances : Test multiplex versus Test monoplex La phase de validation du Test multiplex selon l'invention a permis de déterminer les performances de ce test en termes de Sensibilité (65,2 %) (15 cancers colorectaux CCR dépistés sur un total de 23) et de 95 % en termes de Spécificité. Le tableau ci-dessous présente les résultats des 15 individus souffrant d'un cancer colorectal et positifs en mode multiplex et en mode de combinaison de multiplex, comparés aux résultats obtenus en mode monoplex. MSP Monoplex MSP Multiplex (Duplex) Combinaison de MSP Multiplex (duplex 1 + duplex 2) ID NPY PENK Wifl Cut off =2% NPY+ NPY+ PENK+ PENK Wifl Wifl CCR1 65.33 11.35 12.79 + + + + (+) (+) (+) CCR2 3.16 2.84 5.57 + + + + (+) (+) (+) CCR3 38.03 4.40 100.63 + + + + (+) (+) (+) CCR4 46.37 9.89 15.19 + + + + (+) (+) (+) CCR5 0 0.12 2.72 - + + + (-) (-) (+) CCR6 56.07 105.85 0.07 + + + + (+) (+) (-) CCR7 1.59 1.14 0.87 + + + + (-) (-) (-) CCR8 40.55 2.68 19.57 + + + + (+) (+) (+) CCR9 20.92 2.3 6.37 + + + + (+) (+) (+) CCR10 54.33 8.87 39.24 + + + + (+) (+) (+) CCR11 0 0 4.40 - + + + (-) (-) (+) CCR12 7.22 0 1.92 + + - + (+) (-) (-) CCR13 2.31 0.59 6.13 + + + + (+) (-) (+) CCR14 4.44 0 0 + + - + (+) (-) (-) CCR15 1.43 0.81 0.25 + - - + (-) (-) (-) Le duplex 1 correspond à une MSP Multiplex des fragments de Wifl et de l'albumine, tandis que le duplex 2 correspond une MSP Multiplex des fragments de NPY et de PENK. Les inventeurs démontrent ainsi que la réalisation de la MSP multiplex (duplex) 5 augmente la valeur de la sensibilité du test (récupération de sujets atteints de cancer colorectal classés comme négatifs en MSP monoplex). Les inventeurs ont également démontré que la combinaison de MSP multiplex (notamment la combinaison du duplex 1 avec le duplex 2) offre des résultats encore améliorés. Les 15 individus atteints de cancer colorectal sont tous positifs au test. REVENDICATIONS1. Méthode de dépistage du cancer colorectal chez un sujet, comprenant une étape de mesure du degré de méthylation d'au moins un des gènes choisi parmi NPY, PENK et 5 leurs fragments ou variants dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits fragments sont choisis parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. 10 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape de mesure du degré de méthylation du gène Wifl ou de ses fragments ou variants dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit fragment est la 15 séquence SEQ ID N°3. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape de mesure du degré de méthylation d'un gène de ménage, préférentiellement le gène de l'albumine ou un de ses fragments ou variants. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit fragment est la séquence SEQ ID N°4. 20 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure simultanée des degrés de méthylation: - des gènes NPY et PENK ou leurs fragments ou variants respectifs, et/ou - des gènes NPY et Wifl ou leurs fragments ou variants respectifs, et/ou - des gènes PENK et Wifl ou leurs fragments ou variants respectifs. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure simultanée des degrés de méthylation: - des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2; et/ou - des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°3; et/ou - des séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure simultanée des degrés de méthylation d'une part des gènes Wifl et un gène de ménage ou leurs fragments ou variants respectifs, et d'autre part des gènes NPY et PENK ou leurs fragments ou variants respectifs. 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape de comparaison desdits degrés de méthylation à une valeur seuil, ladite valeur seuil étant comprise entre 1,5 et 3%. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée ne ce que ladite valeur seuil est de 2%. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit échantillon biologique est choisi parmi le sang total, le plasma sanguin, l'urine et les selles dudit sujet. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ledit échantillon biologique est choisi parmi le sang total, le plasma et l'urine dudit sujet. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape d'investigation du colon dudit sujet, suivi d'une étape 10 d'examen histologique.