Brevet FR2962445A1 — publié le 20120113

PROCEDE DE DETECTION ET D'IDENTIFICATION DIRECTE D'UN MICROORGANISME DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE DILUÉ DANS UN BOUILLON D'ENRICHISSEMENT La présente invention concerne, de façon générale, le domaine de l'analyse par exemple l'analyse biologique. Plus spécifiquement, la présente invention concerne un procédé de détection directe et en temps réel d'un microorganisme dans un échantillon dilué ou en suspension dans un bouillon d'enrichissement, à l'intérieur d'un conteneur fermé. L'analyse microbiologique nécessite des techniques précises et dont le temps d'obtention du résultat doit être le plus court possible. Dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. L'approche est similaire pour la santé animale. Dans le domaine agroalimentaire, la problématique est identique. Elle distingue cependant : - les microorganismes pathogènes et leurs toxines dont la recherche s'applique aux matières premières, produits intermédiaires, produits finis commercialisés, - les microorganismes non pathogènes, utilisés comme indicateurs-qualité du processus de production, des matières premières aux produits finis, tout au long de la chaîne, et - les bactéries d'intérêt technologique telles les ferments. La détection rapide et précise de contaminations présumées permet de les contrôler et d'engager ainsi des actions correctives. Techniquement, l'analyse microbiologique peut mettre en oeuvre une ou plusieurs phases de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement, une ou plusieurs phases de détection, une ou plusieurs phases d'énumération des microorganismes. Pour des applications particulières telles le contrôle microbiologique agroalimentaire, une phase de confirmation peut également être requise, afin de répondre aux normes en vigueur dans ce domaine. A l'heure actuelle, il n'existe pas de méthodes pour détecter un microorganisme cible dans une quantité d'échantillon initial importante, sans faire appel à un protocole d' enrichissement. La phase de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement fait appel à des milieux de culture, sélectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Les milieux sont souvent utilisés dans des conteneurs du type sac en plastique stérile, dans lesquels ils sont mis en contact avec les échantillons biologiques ou environnementaux, à fins de remise en suspension et enrichissement des microorganismes recherchés. Cette phase est nécessaire afin de répondre aux besoins qui est de révéler la présence initiale potentielle d'au moins un microorganisme cible dans une quantité d'échantillon très variable et éventuellement très grande, e.g. 25 grammes (g) à 375 g dilué dans 225 à 3375 millilitres (ml) dans le milieu de culture. A l'issue de cette étape d'enrichissement, un aliquote (de 5 microlitres (µl) à 5 ml) est prélevé nécessairement pour mettre en oeuvre l'étape de détection des microorganismes cibles. Or, dans cet aliquote, il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante de microorganismes cibles pour s'assurer de leur détection systématique. La phase de détection se base historiquement sur la culture des microorganismes sur milieux gélosés, pour la mise en évidence des caractères métaboliques des microorganismes recherchés. On utilise classiquement des substrats enzymatiques spécifiques. Ces substrats enzymatiques sont généralement composés de deux parties, une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, appelée également partie cible, et une seconde partie faisant office de marqueur, appelée partie marqueur, généralement constituée par un chromophore ou un fluorophore. Par le choix de ces substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme ou de discriminer différents groupes de microorganismes. Ainsi, l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence sera la signature d'un genre ou d'un type de microorganismes. A cet égard, l'utilisation de milieux chromogènes permet la détection et l'identification simultanées des germes recherchés. Elle simplifie le processus et diminue sensiblement le délai d'obtention du résultat. On citera à titre d'exemple concret les milieux ChromlD® de la demanderesse. Ces milieux chromogènes sont basés sur la détection de caractères métaboliques spécifiques des germes recherchés comme par exemple l'activité enzymatique beta-glucuronidase pour Escherichia coli. Les immuno-essais constituent une autre des technologies utilisées pour le test de détection. Ils font appel aux caractéristiques immunogènes des microorganismes recherchés. De façon non exhaustive, on peut citer les techniques ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), par compétition ou de type sandwich. Enfin, les techniques de biologie moléculaire, basées sur les caractères génomiques des microorganismes recherchés, sont également mise en oeuvre pour détecter et identifier les microorganismes cibles. On citera à titre d'exemple les techniques d'amplification classiques telles la PCR (Polymerase Chain Reaction) et la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), qui peuvent être couplées à des techniques de détection en temps réel connues de l'homme du métier. Toutefois, l'utilisation de ces techniques nécessitent d'ouvrir le sac à l'issue de la phase de pré-enrichissement/enrichissement afin de récupérer un aliquote de l'homogénat et de réaliser l'étape de détection. La phase de confirmation, quant à elle, est plus particulièrement attachée à l'analyse microbiologique dans le domaine agroalimentaire. En effet, lorsque le résultat des méthodes développées précédemment est positif, il est nécessaire de confirmer la présence du pathogène recherché. Ceci impose un test complémentaire et l'utilisation d'un principe de détection différent de celui utilisé lors de la première analyse. Les techniques décrites supra sont à loisir utilisées pour la confirmation. L'identification complète et précise d'un microorganisme dans un échantillon nécessite donc l'enchaînement de plusieurs étapes : enrichissement, détection et confirmation. La standardisation des tests utilisés en routine a permis l'automatisation des méthodes de détection qui restent cependant longues à mettre en oeuvre. Un inconvénient de l'état de la technique est en effet que ces étapes sont réalisées de manière séquentielle et nécessitent un grand nombre de manipulations chronophages, impactant ainsi le temps nécessaire au rendu des résultats. Par ailleurs, les techniques décrites supra nécessitent une ou plusieurs ouverture(s) des sacs d'enrichissement à fins de prélèvement des aliquotes. Or, ceci est d'autant plus dommageable que le nombre d'échantillons négatifs lors du screening (notamment en industries agro-alimentaires) est important. Il est donc intéressant pour le manipulateur de ne pas avoir à ré-ouvrir les conteneurs, pour connaître le résultat de positivité/négativité de l'échantillon considéré. Eu égard aux problèmes techniques soulevés par l'état de la technique considéré ci-dessus, un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir un procédé simplifié pour la détection, l'identification et la confirmation des microorganismes présents dans des échantillons, en particulier agroalimentaires. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé pour la détection l'identification et la confirmation des microorganismes, qui limite les manipulations de l'échantillon contenu dans le conteneur, limitant de ce fait les risques de contamination, soit du personnel manipulant l'échantillon, soit de l'échantillon lui-même. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé pour la détection et l'identification des microorganismes, qui permet de diminuer le temps nécessaire à l'analyse de l'échantillon. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé pour la détection, l'identification et la confirmation des microorganismes sur le volume total de l'échantillon au cours de l'enrichissement, permettant d'augmenter manifestement la sensibilité, voire la spécificité, de mesure. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant d'augmenter considérablement la cadence d'analyse des échantillons. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant de faire de la multi-détection. Un autre objectif de la présente invention est d'améliorer la traçabilité de l'analyse du fait de la réduction drastique des étapes de manipulation des échantillons. Un autre objectif est de fournir un biocapteur électrochimique apte à être utilisé dans un procédé de détection et d'identification de microorganismes. Ces objectifs parmi d'autres sont résolus par la présente invention, qui concerne en premier lieu un procédé de détection, d'au moins un microorganisme présent dans un échantillon placé dans un conteneur fermé, ladite méthode comprenant essentiellement les étapes suivantes : a) Mettre en contact dans le conteneur, ledit échantillon, un milieu de culture et un support apte à capturer le ou les microorganismes à détecter, b) Fermer le conteneur, c) Placer le conteneur dans des conditions aptes à permettre la croissance du ou des microorganisme(s), d) Détecter à l'intérieur dudit conteneur fermé, à l'aide d'un moyen de détection, la présence du ou des microorganisme(s) fixé(s) sur le support de 15 capture. Avantageusement, au moins un partenaire de liaison, spécifique ou non spécifique, du ou des microorganismes est fixé sur le support de capture. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, le partenaire de liaison spécifique est pris dans le 20 groupe comprenant : les anticorps, les fragments Fab, les fragments Fab', les protéines de phages recombinantes ou non, les phages ou tout autre ligand bien connu de l'homme du métier. Avantageusement, le moyen de détection est pris dans le groupe comprenant : les 25 moyens de détection électriques et notamment électrochimiques, les moyens de détection optiques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques, les moyens de détection mécaniques, les moyens de détection magnétiques. Le support de capture peut être un support traditionnel. On citera notamment les supports particulaires tels que les billes magnétiques. Il peut être tout simplement un 30 support inerte, tel une plaque de matériau plastique ou de la fibre de verre. Un tel support de capture est alors connecté au moyen de détection. Alternativement, le support de capture peut ne faire qu'un avec le moyen de détection. C'est le cas, par exemple, quand le support de capture est constitué par un biocapteur électrochimique, une fibre optique. Selon un mode particulier de réalisation, il est tout à fait envisageable de coupler les moyens de détection afin de réaliser d'une part la détection et d'autre part, d'effectuer simultanément ou subséquemment la confirmation. Par exemple, il est possible de réaliser la détection du ou des microorganismes cibles au moyen d'un biocapteur électrochimique. Si la fixation des microorganismes cibles est effectuée au moyen de partenaires de liaison spécifiques, l'étape de détection constitue alors une étape d'identification. Une analyse optique des microorganismes fixés spécifiquement sur le biocapteur au niveau de la zone d'analyse, par un dispositif de détection optique permet alors de confirmer l'identification des microorganismes. Si le dispositif de détection optique est un spectromètre Raman, une analyse du spectre Raman par comparaison avec une base de données de spectres de référence correspondants aux différents microorganismes cibles, permet alors de confirmer l'identification dudit microorganisme. Selon un autre mode de réalisation particulier, il est possible de réaliser la détection et la confirmation avec la même technologie. Ainsi, si le moyen de détection est un moyen optique tel qu'un moyen de mesure de fluorescence intrinsèque, il est particulièrement avantageux de réaliser la détection des microorganismes cibles par apparition de fluorescence intrinsèque. La réponse est alors une réponse oui (présence de fluorescence)/non (absence de fluorescence). Si fluorescence il y a, une analyse spectrale du signal de fluorescence par comparaison avec une base de données de spectres de référence correspondants aux différents microorganismes cibles, permet alors d'identifier ledit microorganisme et par la-même, confirmer la détection de la présence dudit microorganisme. Préférentiellement, la détection du ou des microorganisme(s) est réalisée en temps réel. Néanmoins, alternativement, la détection du ou des microorganisme(s) peut être réalisée à l'issue de l'étape de croissance du ou desdits microorganisme(s) . Selon un mode particulier du procédé selon l'invention, le conteneur est un sac d'homogénéisation. Il peut également s'agir de conteneurs plus traditionnels tels que flacons, bouteilles ou piluliers. Selon un autre mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, le moyen de détection est connecté avec un système d'analyse des données. De façon avantageuse, la connexion entre le moyen de détection et le dispositif d'analyse des données est une connexion filaire ou une connexion sans fil. Un autre objet de l'invention concerne un biocapteur électrochimique pour la détection d'au moins un microorganisme présent dans un échantillon placé dans un conteneur fermé. Ledit biocapteur comprend un support comportant : - au moins une électrode de détection, revêtue d'au moins un polymère électroactif, sur lequel est fixé par l'une de ses extrémités au moins un oligonucléotide simple brin ou double brin, la deuxième extrémité dudit oligonucléotide étant liée à au moins un partenaire de liaison du ou des microorganismes à détecter, spécifique ou non spécifique ; - au moins une contre-électrode. Avantageusement, le polymère électroactif est pris dans le groupe comprenant le polypyrrole, le polyacéthylène, la polyazine, le poly(p-phénylène), le poly(p-phénylène vinylène), le polypyrène, le polythiophène, le polyfurane, le polysélénophène, la polypyridazine, le polycarabazole, la polyalinine. Selon un mode particulier de réalisation, le polymère électroactif comporte au moins un médiateur électrochimique. Un tel médiateur électrochimique est pris dans le groupe comprenant le ferrocène, la quinone et les dérivés de ceux-ci ou tout autre médiateur bien connu de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation alternatif, le médiateur électrochimique se retrouve sous forme libre dans le milieu de culture. Un tel médiateur peut être par exemple le couple ferricyanure/ferrocyanure[Fe(CN)6]3-/4-, le couple chlorure d'iridium [IrC16]3-/4-, le ruthénium hexamine [Ru(NH3)6]3+/2+ De façon préférentielle, la liaison entre l'oligonucléotide et le partenaire de liaison 5 du ou des microorganismes est réalisé au moyen d'au moins un couple de liaison biotinestreptavidine ou biotine-avidine. Lorsque l'oligonucléotide est simple brin, une biotine est fixée sur l'extrémité 3' dudit nucléotide, l'extrémité 5' permettant la fixation de ce dernier sur le polymère électroactif, notamment par liaison covalente. En utilisant un partenaire de liaison 10 également biotinylé, il est ensuite aisé de fixer celui-ci à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide au moyen d'une molécule de streptavidine ou d'avidine. Lorsque l'oligonucléotide est double brin, le premier brin est fixé, notamment par liaison covalente au polymère électroactif par son extrémité 5'. Le second brin quant à lui est biotinylé à son extrémité 5', permettant la fixation du partenaire de liaison également 15 biotinylé, au moyen d'une molécule de streptavidine ou d'avidine. Avantageusement, le partenaire de liaison est pris dans le groupe comprenant : les anticorps, les fragments Fab, les fragments Fab', les protéines de phages recombinantes ou non, les phages. 20 Les buts et avantages de la présente invention seront mieux compris à la lumière de la description détaillée qui suit, en lien avec le dessin dans lequel : - La figure 1 représente un sac de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement en combinaison avec un biocapteur électrochimique, selon un premier mode de réalisation. 25 - La figure 2 représente une vue de face du biocapteur électrochimique, selon le premier mode de réalisation. - La figure 3A est une représentation de la surface du capteur électrochimique en absence de microorganisme. - La figure 3B est une représentation de la surface du capteur électrochimique en 30 présence de microorganismes. - La figure 4 est une représentation schématique d'un système d'analyse du sac pré-enrichissement/enrichissement avec biocapteur électrochimique, selon le premier mode de réalisation. - La figure 5 est un graphique de mesures par spectrométrie d'impédance obtenues lors de la détection d'E. coli O157:H7 dans un échantillon alimentaire. - La figure 6 est un graphique de mesures par spectrométrie d'impédance obtenues lors de la détection de Listeria innocua dans un échantillon alimentaire. Selon un premier mode de réalisation de la présente invention, le procédé de détection, voire d'identification de microorganisme consiste à mettre en oeuvre un sac d'homogénéisation en plastique et stérile, classiquement appelé sac Stomacher® ®. Un tel sac est référencé 10 en figure 1. Ce sac 10 est constitué de deux feuilles de plastiques sensiblement rectangulaires, 12 et 14, solidarisées l'une à l'autre par 3 de leurs côtés, de manière à définir un espace intérieur destiné à recevoir le milieu de culture et l'échantillon à analyser. Il comporte accessoirement un filtre 16 de forme sensiblement rectangulaire et relié aux feuilles 12 et 14 par un côté, séparant l'espace intérieur en deux. Le sac comporte enfin un biocapteur 18. Ce biocapteur est un biocapteur électrochimique, représenté en détails en figure 2. Le biocapteur 18 est pris en sandwich entre les feuilles 12 et 14, de sorte qu'une partie 181 correspond à la zone de détection se trouve dans l'espace intérieur du sac 10, alors qu'une partie correspondant à la zone de connexion se trouve à l'extérieur du sac, de manière à permettre la connexion de la puce avec un dispositif d'analyse des données. Ceci est explicité infra. En figure 2, est représenté le biocapteur électrochimique 18 en détails. Comme explicité ci-dessus, le biocapteur 18 est constitué d'une zone d'analyse 181 et d'une zone de connexion. 182. La zone d'analyse comporte huit électrodes de travail 20, disposées autour d'une électrode centrale, appelée contre-électrode, 22. Par ailleurs, la zone d'analyse comporte une électrode de référence 24, sous forme d'un anneau ouvert positionnée autour de la contre-électrode 22. L'ensemble de ces électrodes, sont reliées indépendamment à dix bornes de connexion 26, au moyen de pistes conductrices 28. Les bornes de connexion sont réalisées dans le même matériau que les électrodes de travail. Ce matériau est préférentiellement de l'or. Néanmoins, tout autre matériau conducteur bien connu de l'homme du métier, peut être utilisé, comme le carbone, le platine ou le diamant. Le matériau constituant le support des électrodes est un matériau polymère, tel que du polyimide. Il peut toutefois être envisagé d'utiliser n'importe quel autre matériau présentant des propriétés équivalentes et bien connu de l'homme du métier. Il est à noter que la configuration d'électrodes présentées en figure 2, n'est qu'une configuration parmi d'autres, et n' est nullement limitative de l'étendue de la protection conférée par la présente demande de brevet. Les figures 3A et 3B représentent une électrode de travail en coupe transversale, au niveau microscopique, respectivement en absence ou présence de microorganismes. Au niveau des électrodes de travail, on remarque une superposition de trois couches. La première de ces couches 30 est la couche de polymère constituant le support du biocapteur. La couche intermédiaire 32 est la couche de matériau conducteur, typiquement de l'or. Enfin, la couche 34 est une couche de polymère conjugué électroactif. Un tel polymère est par exemple un polypyrrole. De tels polymères sont bien connus pour leur caractère conducteur et électroactif. Il est également connu que les polypyrroles conservent leur conductivité et leur électroactivité lorsque certains cycles pyrrole sont substitués en position 3 ou 4 avec des groupements fonctionnels. Des polymères portant ce type de groupements fonctionnels sont décrits dans WO-Al - 95/29199, Garnier et al. (Synthetic Metals, 100: 89-94,1999) Ho-Hoang et al. (Synthetic Metals, 62 : 277- 280,1994), Ho-Hoang et al. (J. Mater. Chem., 6 (7), 1107- 1112,1996), et Korri-Youssoufi et al. (Materials Science and Engineering, CI 5, 265- 268,2001). Différentes molécules peuvent ainsi être greffées sur les groupements fonctionnels portés par un monomère de polypyrrole. Ainsi, WO-Al-95/29199 décrit la synthèse d'un polypyrrole obtenu par électro-oxydation à un potentiel supérieur ou égal à 0,8V/ECS. La synthèse du polypyrrole par oxydation électrochimique conduit à la formation d'un film électroactif à la surface de l'électrode, plus précisément sur un substrat conducteur ou sous la forme d'un film auto-supporté. Il s'agit d'une méthode d'immobilisation indirecte des oligonucléotides dans le polypyrrole. Les monomères de pyrroles substitués en position 3 du noyau pyrrole avec des groupements fonctionnels sont dilués dans une solution de monomères non substitués, lesquels immobiliseront les groupements fonctionnels lors de leur électrocopolymérisation par inclusion dans la chaîne des motifs fonctionnels. Dans une deuxième étape, un anti-ligand tel qu'un oligonucléotide, un polynucléotide ou un peptide est couplé chimiquement sur les groupements fonctionnels du polymère précurseur. Le polymère ainsi obtenu conserve ses propriétés conductrices et électroactives. Ces polymères peuvent donc être utilisés pour détecter un analyte interagissant spécifiquement avec l'anti-ligand greffé sur le polymère par la mesure d'une différence de potentiel ou d'une variation de courant: WO-Al-00/77523 décrit également le couplage chimique d'un anti-ligand, tel qu'un oligonucléotide, sur un polymère précurseur portant des groupements fonctionnels. Il peut également s'agir d'une méthode d'immobilisation directe des oligonucléotides dans le polypyrrole par électrocopolymérisation. Les monomères de pyrroles substitués en position 3 du noyau pyrrole avec des oligonucléotides sont dilués dans une solution de monomères non substitués, lesquels immobiliseront les oligonucléotides directement lors de leur électrocopolymérisation par inclusion dans la chaîne des motifs fonctionnels. Sur cette couche de polymère électro-actif est greffé un double-brin d'acide nucléique 36, par l'extrémité 5' d'un de ces brins, le brin complémentaire portant une molécule de biotine 38 à son extrémité 5', de sorte qu'une liaison à une molécule antiligand 40 comportant également une biotine 42 est possible par le biais d'une molécule de streptavidine 44. La molécule anti-ligand 40 représentée sur les figures 3A et 3B est un anticorps. Il peut s'agir indifféremment d'un ou plusieurs anticorps monoclonal(aux) ou polyclonaux. Il peut également s'agir d'un fragment d'anticorps, tel qu'un fragment Fab, Fab'2, ainsi que tout anticorps obtenu par modification ou recombinaison génétique, et spécifique d'un microorganisme particulier. Alternativement, la molécule anti-ligand peut être un phage ou une protéine de phage recombinante, se fixant spécifiquement aux microorganismes cibles. De telles protéines et leur utilisation pour la capture de bactéries ont été décrites entre autres, dans le brevet EP-B-1 356 080. Il est précisé que la structure représentée aux figures 3A et 3B n'est qu'un exemple parmi d'autres et n'est nullement constitutive d'une limitation de l'invention. En effet, à titre de variante, il peut être envisagé de fixer la molécule anti-ligand directement sur l'électrode sans utiliser le double brin d'acide nucléique. Afin de réaliser l'analyse, le biocapteur électrochimique, solidaire du sac d'homogénéisation, est mis en contact avec l'échantillon dispersé, le milieu de culture et d'un médiateur électrochimique, tel que le couple ferricyanure - ferrocyanure. En absence de microorganismes, il se produit un échange d'électron entre le polymère conjugué électro-actif et ledit système redox présent dans le milieu réactionnel. Ceci est matérialisé sur la figure 3A. L'échange électronique est transformé en courant électrique et mesuré par spectroscopie électrochimique, à l'aide d'un potentiostat, tel qu'explicité infra. Lorsque l'échantillon contient des microorganismes 44, ceux-ci sont capturés par les molécules anti-ligands 40. La présence de microorganismes au voisinage de l'électrode, entraîne un encombrement stérique, qui perturbe et diminue le flux électronique entre l'électrode modifiée par le polymère conjugué électro-actif et ledit système redox présent dans le milieu réactionnel. Cette modification est alors mesurée par impédancemétrie et caractérisée par la résistance de transfert de charge, résistance, dont la valeur augmente lorsque la bactérie est capturée (résultat positif). Le système de mesure des résultats d'analyse est représenté schématiquement en figure 4, selon un premier mode de réalisation. Comme on peut le voir sur cette figure, le sac 10, par l'intermédiaire de son biocapteur 18, est connecté à un potentiostat 50. Cette connexion est réalisée grâce à un connecteur 52, connecté à la zone de connexion 182 du biocapteur 18. Le connecteur 52 se prolonge par un câble 54, relié au potentiostat 50. Le potentiostat est, quant à lui, relié à un système informatique 56 apte à enregistrer et analyser les données d'impédancemétrie. Aux fins de détection des microorganismes, le sac d'homogénéisation 10 est préférentiellement incubé le temps de permettre la croissance desdits microorganismes. Cette incubation peut être classiquement réalisée dans une étuve à une température comprise entre 25 et 45°C. Le temps d'incubation peut varier de 3 à 72 heures en fonction de la quantité initiale de microorganismes présents dans l'échantillon et du type de microorganisme à détecter. Selon un premier mode de réalisation, la mesure d'impédance peut être réalisée en point final. En effet, le sac d'homogénéisation est incubé le temps considéré comme nécessaire et suffisant à la croissance des microorganismes, puis il est sorti de l'étuve d'incubation et connecté au système de mesure d'impédance décrit supra. La mesure d'impédance est alors réalisée et le résultat est comparé à une valeur d'impédance de référence. Une telle mesure d'impédance est possible dans la mesure où une ou plusieurs électrodes de travail 20 sont recouverte(s) du polymère conjugué électro-actif et/ou d'une molécule anti-ligand non spécifique du microorganisme à détecter. La mesure d'impédance au niveau de cette ou ces électrode(s) constitue la valeur d'impédance de référence. Dans la mesure où la différence entre la valeur d'impédance au niveau des électrodes de détection (électrodes sur lesquelles sont fixées directement ou indirectement les molécules anti-ligands du microorganisme cible) et la valeur d'impédance de référence est supérieure à une valeur seuil, la détection des microorganismes est effective. Selon un deuxième mode de réalisation, en pointillés, à savoir par mesures ponctuelles d'impédance au cours de l'incubation. Dans ce cas, le sac d'homogénéisation est sorti de l'étuve d'incubation et connecté au système de mesure d'impédance, pendant le temps nécessaire à ladite mesure, puis remis à incuber. L'intervalle entre deux mesures peut être compris entre 30 secondes à 2 minutes. Ce deuxième mode de réalisation présente comme principal avantage, par rapport au premier mode de réalisation, de permettre de détecter la présence des microorganismes après un temps d'incubation plus court. Enfin dans un troisième mode de réalisation qui est le mode de réalisation préférentiel, il est prévu de disposer à l'intérieur de l'étuve d'incubation d'un moyen de connexion du biocapteur au système de mesure d'impédance. Il peut s'agir d'un système de connexion filaire ou sans fil. Un tel mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet de réaliser une mesure à intervalle régulier à l'intérieur des sacs d'homogénéisation sans avoir à manipuler ces derniers. Par ailleurs, la mesure à intervalle régulier d'impédance permet de réaliser une détection en temps réel des microorganismes. Associé à un système d'alerte informatique du personnel technique lorsqu'une détection est réalisée, ce dernier n'est alors plus contraint par le flux de travail consistant à faire des mesures successives dans le temps. Il doit alors uniquement intervenir quand un microorganisme est détecté dans un sac. Un moyen de connexion filaire est constitué par tout moyen permettant de connecter deux dispositifs électroniques entre eux, afin de permettre la transmission de données. En particulier, un moyen de connexion filaire peut être un système de connexion de type série (norme RS 485, RS 232), de type USB (Universal Serial Bus), de type réseau (Ethernet), de type parallèle (GPIB) ou tout autre moyen équivalent. Un moyen de connexion sans fil est un dispositif d'émission - réception d'ondes radioélectriques. Il peut s'agir par exemple d'un système Wifi (norme 802.1 lb), Bluetooth (norme 802.15) ou encore ZigBee (norme 802.15.4). Selon une alternative, le moyen d'acquisition de données peut être un lecteur RFID (Radio Frequency Identification), une carte Labjack ou tout autre moyen bien connu de l'homme du métier. 15 EXEMPLES Exemple 1: Préparation des électrodes d'analyse du biocapteur Réactifs : Le perchlorate de lithium (LiC1O4), le chlorure de sodium (NaCl), l'hydroxyde de sodium (NaOH), l'hexacyanoferrate de potassium (III) (K3Fe (CN)6), l'hexacyanoferrate 20 de potassium (II) trihydraté (K4Fe(CN)6; 3H2O), le Tween 20, le tampon phosphate (BPS), le sérum albumine bovine (BSA), le tris(hydroxymethyl)aminométhane (TRIS), l'acide maléique, l'ADN de Saumon et le Denhardt 50X proviennent de la société Sigma-Aldrich. Le tampon de lavage pH 7.2 est du PBS 0,01M, NaCl 0,5M et 0,05 % Tween. 25 Le tampon d'hybridation est du PBS 0,01M, NaCl 0,5M, Denhardt 2X et l'ADN de Saumon à 10 .ig/mL. Le tampon de greffage du partenaire de liaison est le tampon TRIS-MALEATE BSA pH 6.2 constitué de TRIS 24,23 g/L, d'acide maléique 23,2 g/L, d'hydroxyde de sodium 6 g/1 et de BSA 5 g/L. 30 Le 3-(2-hydroxyethyl)pyrrole ou PyOH et le 3-(phtalimide ethanoate)pyrrole ou PyNHP sont fournis par EZUS Lyon.10 Des oligonucléotides synthétiques comportant 20 nucléotides et portant un groupe amino à l'extrémité 5' sont fixés de manière covalente par substitution des groupes NHP. Le monomère fonctionnel est le suivant : Pyr-5'TTTTTTTTTTGAATCCTCAGTTTTTCAACG3'. L'oligonucléotide complémentaire porte un groupe biotine à l'extrémité 5'. Sa séquence est la suivante : 5'CGTTGAAAAACTGAGGATTC3'. Biocapteur et matériel de détection électrochimique : Les mesures de détection électrochimique sont réalisées avec un potentiostat 10 BioLogic de Sciences Instruments, contrôlé par ordinateur. Le capteur utilisé est issu de la technologie des circuits imprimés (PCB). Le dépôt d'or sur les électrodes est un dépôt galvanique par électrolyse à partir d'un bain à base d'or. Les électrodes sont composées d'une multicouche époxy, cuivre, nickel et or. 15 Préparation des électrodes : Aux fins de lavage des électrodes, la zone d'analyse des capteurs est trempée dans une solution eau distillée/éthanol 1:1, pendant une minute dans un bain à ultrasons. Après lavage, les capteurs sont nettoyés et activés électrochimiquement. Pour ce faire, une goutte de 30 µL de NaOH 0.2 M dans l'eau distillée est déposée sur la zone 20 d'analyse du capteur, de manière à mouiller l'intégralité des électrodes. Le capteur est connecté à un potentiostat et plusieurs cycles de saut de potentiel en oxydation et en réduction sont imposés par chronoampérométrie. Le but de cette étape est de générer des bulles d'oxygène à l'interface avec les électrodes de manière à supprimer tout contaminant organique et/ou inorganique. Le capteur est ensuite rincé avec de l'eau 25 distillée. La surface des électrodes de travail est modifiée par électrodéposition de copolymère. Ainsi toutes les électrodes sont recouvertes d'une goutte de solution d'électropolymérisation 100 mM de PyOH et 25 µM de PyODN (rapport de concentration 30 1/4000) et 0.5 M LiCLO4. La réaction est ensuite électroconduite par application d'un potentiel fixe de 0.8V/pseudo référence or, imposé par chronoampérométrie. La polymérisation est interrompue une fois que la charge imposée de 11 mC/cm2 est atteinte. Le copolymère est formé simultanément sur toutes les électrodes de travail. Les électrodes sont rincées ensuite à l'eau distillé. L'étape suivante consiste dans l'hybridation. Le capteur est recouvert avec une goutte de 30 µL de solution tampon en présence de 100 nM d'ODN cible biotinylé. L'hybridation est réalisée à 37 °C pendant 30 minutes. Après une étape de lavage au tampon PBS, le capteur est trempé dans une solution de streptavidine 100 µg/mL dans le tampon PBS pendant 15 minutes avec agitation. La molécule anti-ligand est ensuite fixée en mettant le capteur en contact avec une solution de molécule anti-ligand à 1 µg/mL dans le tampon TRIS-maléate BSA. Dans les exemples suivants, la molécule anti-ligand est soit une protéine recombinante de phage pour la détection d'E.coli 0157 ou un fragment Fab' pour la détection de Listeria spp. Exemple 2: Détection d'E. coli 0157 :H7 dans un échantillon alimentaire 15 Un biocapteur fonctionnalisé avec des protéines recombinantes de phage spécifique d'E .coli 0157, tel que décrit supra et solidarisé à un sac d'homogénéisation est incubé avec un échantillon alimentaire. Deux sacs comportant les biocapteurs sont incubés avec des préparations 20 d'enrichissements positifs. Deux sacs comportant les biocapteurs sont incubés avec les préparations d'enrichissements négatifs et deux sacs comportant les biocapteurs sont incubés avec une préparation d'enrichissement non contaminée de manière à mesurer le bruit de fond de la matrice alimentaire. 25 Préparation d'enrichissements positifs 25 g de viande crue ayant au minimum 5 % de matières grasses sont placés de manière aseptique dans le sac Stomacher® ® avec filtre et mis en contact avec E.coli 0157:H7 ATCC 43888. Le sac est placé 24 heures à 2-8°C pour stresser la souche. Ensuite, 225 mL d'eau peptonée tamponnée (ref 42043 bioMérieux) préchauffés 30 24 heures à 41,5°C et 5 mM de sonde redox [Fe(CN)6]3-/4- sont ajoutés à l'échantillon. La croissance des bactéries E.coli 0157 :H7 en présence de 5 mM de sonde redox [Fe(CN)6]3-/4- a été préalablement vérifiée. Il a été confirmé que la présence de cette sonde redox ne ralentissait pas la croissance bactérienne au sein d'un milieu de culture. Après homogénéisation de la suspension, un support de capture fonctionnalisé est placé dans le sac Stomacher® ® . Ce protocole est répété afin de tester deux suspensions positives, au moyen de deux sacs comportant un support fonctionnalisé. Un dénombrement sur boite de Pétri, à partir des deux suspensions positives a 10 permis d'évaluer, avant incubation dans le sac Stomacher® ® , une concentration moyenne en E.coli O157:H7 ATCC 43888 à 0,92 UFC/g de viande crue. La préparation est alors incubée à 41,5°C pendant 3 heures. 15 Préparation des enrichissements négatifs Contrôle négatif : à partir du même numéro de lot de viande crue, 25 g sont placés de manière aseptique dans un sac Stomacher® ® avec filtre et mis en contact avec Bacillus cereus ATCC 27522 . Le sac est placé 24 heures à 2-8°C pour stresser la souche. Ensuite, 225 mL d'eau peptonée tamponnée (ref 42043 bioMérieux) préchauffés 20 24 heures à 41,5°C et 5 mM de sonde redox [Fe(CN)6]3-/4- sont ajoutés à l'échantillon. Après homogénéisation de la suspension, un support de capture fonctionnalisé est placé dans le sac. Ce protocole est répété afin de tester deux suspensions négatives, au moyen de deux sacs comportant un support fonctionnalisé. 25 Dans les deux suspensions, le taux de contamination par Bacillus cereus ATCC 27522, avant incubation dans le sac Stomacher® ® , est évalué à 1,32 UFC/g de viande crue (mesure théorique). La préparation est alors incubée à 41,5°C pendant 3 heures. Mesure du bruit de fond généré par la matrice : le même protocole sans bactéries, est répété. La préparation est incubée à 41,5°C pendant 6 heures. 30 Le but de cet essai est de vérifier s'il est possible de détecter E. coli 0157 :H7 après 3 heures d'incubation / enrichissement. Résultats obtenus: Pour chaque sac, la mesure d'impédance est réalisée directement, sans étape de lavage du biocapteur. Les graphes Nyquist (-Im(z) vs. Re(z)) obtenus à 200 mV dans une échelle de 10 fréquence comprise entre 1 Hz to 100 kHz sont regroupés sur la figure 5. Le spectre d'impédance électrochimique obtenu après 6 heures d'incubation de la préparation de viande crue dans le sac Stomacher® sans contamination et celui obtenu après 3 heures d'incubation de la préparation de viande crue avec contamination négative montrent la même résistance de transfert d'électrons Kt (diamètre des demi-cercles), les 15 valeurs sont respectivement égales à 116 et 115 kf2. La résistance au transfert d'électrons est donc attribuée au bruit de fond de la matrice, qui est identique à la résistance au transfert d'électrons à la croissance des bactéries non cibles. Après 3 heures d'enrichissement de la préparation de viande crue avec 20 contamination positive, par E. coli O157:H7 (0,92 UFC/g de viande crue), la valeur de résistance au transfert d'électron est de 719 kQ, soit environ six fois supérieure à celle obtenue avec la contamination négative et permet donc une détection nette de E. coli 0157:H7. La valeur Rit moyenne obtenue avec l'intégralité des sacs d'homogénéisation, les 25 valeurs de déviation standard et de coefficient de variation, sont regroupées dans le tableau 1, ci dessous. Les valeurs indiquées sont les valeurs brutes de résistance de charge correspondant au diamètre du demi cercle du signal d'impédance. 30 Bruit de fond matrice Contamination Contamination (sans contamination) negative positive B.cereus E. coli (1,32 CFU/g) (0,92 UFC/g) Moyenne Rit (kS2) 109 90 708 Déviation standard 9 8 25 Coefficient variation 8 9 4 (%) Nombre de mesures 16 7 16 Tableau 1 Exemple 3 : Détection de Listeria innocua dans un échantillon alimentaire 5 Un biocapteur fonctionnalisé avec des fragments Fab' spécifiques de Listeria, tel que décrit supra et solidarisé à un sac d'homogénéisation est incubé avec un échantillon alimentaire. Un sac comportant les biocapteurs est incubé avec une préparation 10 d'enrichissement positif. Un sac comportant les biocapteurs est incubé avec une préparation d'enrichissement négatif. Préparation de l'enrichissement positif 25 g de viande crue ayant au minimum 5 % de matières grasses sont placés de 15 manière aseptique dans un sac Stomacher® avec filtre et mis en contact avec Listeria innocua ATCC 33090. Le sac est placé 22 heures à 2-8°C pour stresser la bactérie. Ensuite, 225 mL bouillon Listeria XPress (ref. 42626 bioMérieux) préchauffés 18 heures à 30°C et 5 mM de sonde redox [Fe(CN)6]3-/4- sont ajoutés à l'échantillon. La croissance des bactéries Listeria innocua en présence de 5 mM de sonde redox 20 [Fe(CN)6]3-/4- a été préalablement vérifiée. Il a ainsi été confirmé que la présence de cette sonde redox n'inhibait pas la croissance bactérienne au sein d'un milieu de culture. Après homogénéisation de la suspension, deux supports de capture fonctionnalisés sont placés dans le sac Stomacher® . Un dénombrement sur boite de Pétri a permis d'évaluer la concentration en Listeria innocua ATCC 33090, avant incubation dans le sac Stomacher®, à 0,48 UFC/g de viande crue. La préparation est alors incubée à 30°C pendant 6 heures. Préparation de l'enrichissement négatif Contrôle négatif : à partir du même numéro de lot de viande crue, 25 g sont placées de manière aseptique dans un sac Stomacher® avec filtre et mis en contact avec 10 Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Le sac est placé 22 heures à 2-8°C. Ensuite, 225 mL bouillon Listeria XPress (ref. 42626 bioMérieux) préchauffés 18 heures à 30°C et 5 mM de sonde redox [Fe(CN)6]3-/4- sont ajoutés à l'échantillon. Après homogénéisation de la suspension, deux supports de capture sont placés dans le sac Stomacher® . La concentration en Staphylococcus aureus ATCC 6538P est de 15 4,10' UFC/g de viande crue (mesure théorique) , avant incubation dans le sac Stomacher® . La préparation est alors incubée à 30°C pendant 6 heures. 20 Le but de cet essai est de vérifier s'il est possible de détecter les bactéries du genre Listeria après 6 heures d'incubation/enrichissement. Résultats obtenus : Pour chaque sac, la mesure d'impédance est réalisée directement, sans étape de 25 lavage du biocapteur. Les graphes Nyquist (-Im(z) vs. Re(z)) obtenus à 200 mV dans une échelle de fréquence comprise entre 1 Hz to 100 kHz sont regroupés sur la figure 6. Le spectre d'impédance électrochimique obtenu après 6 heures d'incubation de la préparation de viande crue dans le sac d'homogénéisation avec contamination négative 30 (Staphylococcus aureus à 4,10' CFU/g) (Figure 6 ligne discontinue) montre une valeur de résistance au transfert d'électron est de 13 kS2. Après 6 heures d'enrichissement de la préparation de viande crue avec contamination positive, par Listeria innocua ATCC 33090 (0,48 UFC/g de viande crue avant incubation) (figure 6 ligne continue), la valeur de résistance au transfert d'électron est de 45 kS2, soit environ trois fois supérieure à celle obtenue avec la contamination négative. Ce résultat montre clairement qu'il est possible de détecter la présence de bactéries Listeria innocua présentes dans un échantillon alimentaire avec des fragments Fab' spécifiques fixés sur un biocapteur électrochimique en contact avec un milieu d'enrichissement contenant ledit échantillon sans étape de lavage du capteur, ni amplification du signal. La valeur Rit moyenne obtenue avec l'intégralité des sacs d'homogénéisation, les valeurs de déviation standard et de coefficient de variation, sont regroupées dans le tableau 2, ci dessous. Les valeurs indiquées sont les valeurs brutes de résistance de charge correspondant au diamètre du demi cercle du signal d'impédance. Contamination Contamination negative positive S. aureus L. innocua (4,107 CFU/g) (0,48 UFC/g) Moyenne Rct (kS2) 15 45 Déviation standard 1 8 Coefficient variation 5 17 (%) Nombre de mesures 16 12 Tableau 2 REVENDICATIONS1. Procédé de détection, d'au moins un microorganisme présent dans un échantillon placé dans un conteneur fermé, ladite méthode comprenant essentiellement les étapes suivantes : a) Mettre en contact dans le conteneur, ledit échantillon, un milieu de culture et un support apte à capturer le ou les microorganismes à détecter, b) Fermer le conteneur, c) Placer le conteneur dans des conditions aptes à permettre la croissance du ou des microorganisme(s), d) Détecter à l'intérieur dudit conteneur fermé, à l'aide d'un moyen de détection, la présence du ou des microorganisme(s) fixé(s) sur le support de capture. 2. Procédé selon la revendication 1, comportant une étape supplémentaire e) consistant à confirmer la détection du ou des microorganismes détecté(s). 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étape e) de confirmation est réaliser à l'aide d'un moyen de détection, identique ou différent du moyen de détection utilisé pour l'étape de détection. 4. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le moyen de détection est pris dans le groupe comprenant : les moyens de détection électriques, notamment électrochimiques, les moyens de détection optiques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques, les moyens de détection mécaniques, les moyens de détection magnétiques. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, le support de capture du ou des microorganisme(s) constitue également le moyen de détection. 6. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes, dans lequel au moins un partenaire de liaison spécifique ou non spécifique du ou des microorganismes est fixé sur le support de capture. 7. Procédé de détection selon la revendication précédente, dans lequel le partenaire de liaison spécifique est pris dans le groupe comprenant : les anticorps, les fragments Fab, les fragments Fab', les protéines de phages recombinantes ou non, les phages. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la détection du ou des microorganisme(s) est réalisée en temps réel. 9. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la 10 détection du ou des microorganisme(s) est réalisée à l'issue de l'étape de croissance du ou desdits microorganisme(s). 10. Procédé de détection selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le conteneur est un sac d'homogénéisation, un flacon, une bouteille, un pilulier. 11. Procédé de détection selon l'une des revendications 10, dans lequel le moyen de détection est connecté avec un système d'analyse des données. 12. Procédé de détection selon l'une des revendications 10 ou 11, dans lequel la 20 connexion entre le support de capture ou le moyen de détection et le dispositif d'analyse des données est une connexion filaire ou une connexion sans fil. 13. Biocapteur électrochimique, pour la détection d'au moins un microorganisme présent dans un échantillon placé dans un conteneur fermé, ledit biocapteur comprenant un 25 support comportant : - au moins une électrode de détection, revêtue d'au moins un polymère électroactif, sur lequel est fixé par l'une de ses extrémités au moins un oligonucléotide simple brin ou double brin, la deuxième extrémité dudit oligonucléotide étant liée à au moins un partenaire de liaison du ou des 30 microorganismes à détecter, spécifique ou non spécifique ; - au moins une contre-électrode. 15 14. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel le polymère électroactif est pris dans le groupe comprenant le polypyrrole, le polyacéthylène, la polyazine, le poly(p-phénylène), le poly(p-phénylène vinylène), le polypyrène, le polythiophène, le polyfurane, le polysélénophène, la polypyridazine, le polycarabazole, la polyalinine. 15. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel le polymère électroactif comporte au moins un médiateur électrochimique. 16. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel le médiateur 10 électrochimique est pris dans le groupe comprenant le ferrocène, la quinone et le dérivés de ceux-ci . 17. Biocapteur selon l'une des revendications 13 à 16, dans lequel la liaison entre l'oligonucléotide et le partenaire de liaison du ou des microorganismes, est réalisé au 15 moyen d'au moins un couple de liaison biotine-streptavidine ou biotine-avidine. 18. Biocapteur selon l'une des revendications 13 à 17, dans lequel le partenaire de liaison est pris dans le groupe comprenant : les anticorps, les fragments Fab, les fragments Fab', les protéines de phages recombinantes ou non, les phages.5