Brevet FR2968302A1 — publié le 20120608

PROCEDES DE FONCTIONALISATION ET REACTIFS UTILISES DANS DE TELS PROCEDES UTILISANT UN ANHYDRIDE ISATOÏQUE OU UN DE SES DERIVES, MOLECULES BIOLOGIQUES AINSI TRAITEES ET KITS La présente invention concerne de nouveaux procédés notamment de fonctionnalisation, de marquage, de capture ou de séparation de molécules biologiques, et plus précisément d'acides ribonucléiques (ARN) naturels ou synthétiques ou d'acides nucléiques chimèriques ADN/ARN synthétiquee. Dans la suite du texte le terme « fonctionnalisation » ou les termes apparentés (« fonctionnaliser » par exemple) seront utilisés et pourront vouloir dire aussi bien marquage, capture, séparation ou inhibition de molécules biologiques. Elle concerne également des molécules biologiques ainsi traitées ou marquées, ainsi que des kits utilisables dans le domaine du diagnostic moléculaire utilisant la détection et l'analyse des acides nucléiques. L'état de la technique montre que de nombreuses méthodes existent pour fonctionnaliser avec des groupements d'intérêt des nucléotides, des oligonucléotides ou des acides nucléiques naturels ou amplifiés. Une première méthode consiste à fixer le groupement d'intérêt sur la base, que celle-ci soit naturelle ou modifiée. Une deuxième méthode propose de fixer le groupement d'intérêt sur le sucre, là encore qu'il soit naturel ou modifié. Une troisième méthode a pour objet la fixation du groupement d'intérêt sur le phosphate. Le groupement d'intérêt sur la base a été notamment 30 utilisé dans l'approche de marquage des acides nucléiques par incorporation de nucléotides directement marqués. De manière générale, la fonctionnalisation au niveau du sucre est bien plus neutre que celle réalisée sur le -1- phosphate, ce qui a un impact sur la sensibilité ou sur la base, ce qui joue sur 1a spécificité. En fait l'homme du métier, qui doit effectuer une fonctionnalisation d'un nucléotide ou d'un analogue de nucléotide ou d'un acide nucléique, est enclin à effectuer cette fixation sur la base ou sur le sucre qui lui offrent plus de commodité et d'alternatives. C'est d'ailleurs ce qui ressort de l'étude de nombreux documents sur le marquage notamment, tels que EP-A-0.063.879, EP-A-0.097.373, EP-A- 0.302.175, EP-A-0.329.198, EP-A-0.567.841, US-A-5,449,767, US-A-5,328,824, WO-A-93/16094 ou DE-A-3.910.151 pour la base ou EP-B-0.063.879 ou EP-B-0.286.898 pour le sucre. De manière plus spécifique, la fonctionnalisation sur le sucre est souvent utilisée dans le cas des sondes nucléiques préparées par synthèse chimique. Il existe toutefois un besoin pour des groupements d'intérêt qui soient spécifiques au niveau de la position de fixation, et en particulier qui n'affectent pas les propriétés d'hybridation des bases impliquées dans la formation de la double hélice, par l'intermédiaire des liaisons hydrogènes, et qui soient également spécifiques des ARN, enfin de fonctionnaliser indifféremment les ribonucléotides, les oligoribonucléotides, des acides nucléiques ARN naturels ou préparés par transcription, les acide nucléiques comprenant à la fois au moins une partie ARN et au moins une partie ADN, par transcription inversée ou par amplification enzymatique. Dans le cas du marquage et afin de rendre les cibles détectables sur les puces à ADN, il est nécessaire d'y fixer préalablement un marqueur. Il s'agit d'une étape importante, car elle, seule, permet de détecter la présence des acides nucléiques et d'établir un diagnostic. Il importe donc que la technologie de marquage soit extrêmement reproductible, robuste et sensible. Ceci est directement corrélé à 1a qualité et à l'efficacité du réactif chimique de marquage. De plus, dans les technologies de fonctionnalisation chimique, le groupement d'intérêt ne doit pas affecter les 5 propriétés d'hybridation des acides nucléiques. La Demanderesse a par le passé déposé un certain nombre de demandes de brevet sur des molécules comprenant un composé diazo : - brevet EP-B-1.383.732 déposé le 3 mai 2002, et délivré le 10 17 février 2010, - demande EP05/739660.8 déposée le 24 mars 2005, - demande EP08/805961.3 déposée le 9 juin 2008, et - demande FR08/55190 déposée le 29 juillet 2008. A titre d'information les groupements d'intérêt à base de 15 fonction diazo ne sont pas chémo-spécifiques de l'ARN ni régio-spécifiques d'une position particulière. Ils fonctionnalisent donc de façon indifférenciée l'ADN ou l'ARN. De plus, la fonction diazo est difficilement compatible avec une conjugaison avec certaines cyanines, comme le Cy5 par 20 exemple. Or il est important de pouvoir être plus spécifique dans le mécanisme de fonctionnalisation, par exemple pour le marquage : A) Dans le cas de puces à ADN mesurant les niveaux 25 d'expression d'ARNm, l'ARN et lui seul doit être marqué. Or, dans un échantillon biologique complexe, ADN et ARNm peuvent être présents et donc marqués concomitamment. En utilisant un marqueur non chémo-spécifique cela peut conduire à l'augmentation du bruit de fond, lors de l'hybridation. B) Le marqueur, utilisé généralement en large excès, doit être détruit ou éliminé avant de mettre en contact les acides nucléiques marqués avec les sondes immobilisées sur la puce. En effet, dans le cas contraire, on risquerait alors de marquer les sondes, ce qui conduirait à un résultat impossible à interpréter. Le fait d'avoir un marqueur spécifique de l'ARN permettrait donc d'éviter ce problème de marquage des sondes du à un excès de marqueur non hydrolysé. C) En raison des effets stériques, il est moins perturbant pour l'hybridation entre une sonde oligonuclétidique et une cible constituée d'acides nucléiques de marquer sur les extrémités du brin d'ARN cible (5' ou 3') plutôt qu'en interne. Or les techniques de marquage commerciales ne permettent pas une telle régio-spécifité du marquage. A notre connaissance, seules les techniques chimiques d'oxydation au périodate apportent ce degré de spécificité mais elles sont sévèrement impactées par la complexité du protocole de marquage (plus de trois à quatre réactifs et deux à trois purifications avant de disposer d'ARN marqué) voir à ce sujet . - « An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe" par Ru-Qiang Liang Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 2 el7 dans Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 22 4535-4532, ou bien « Chemical methods of DNA and RNA fluorescent Labeling » Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 22 4535-4532. par Dmitri Proudnikov. En fait, la fonctionnalisation réglo-spécifique des extrémités 3' de l'ARN ne peut être obtenue qu'à partir de techniques enzymatiques extrêmement spécifiques. De telles techniques sont utilisées par exemple par Affymetrix (Santa Clara, USA) ou par Agilent Technologies (Santa Clara, USA) avec le marquage spécifique d'ARNs en 3' avec la T4 RNA Ligase et un substrat de type pCp-Marqueur ou par d'autres techniques enzymatiques décrites dans certaines références : - Huang Z. "Selective labeling and detection of specific RNAs in an RNA mixture" Analytical Biochemistry 2003 129-133, - Martin G. "Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast 10 polys (A) polymerase and various nucleotides RNA 1998 22-- 230, ou - Huang Z. "A simple method for 3'-labeling of RNA" Nucleic Acids Research 1996 4360-4361. Le problème des techniques enzymatiques est leur 15 sensibilité au type de substrat (taille et séquence de l'ARN à marquer) et bien sûr leur coût associé à la fois au substrat mais surtout à l'enzyme. De plus, le développement récent de la détection des microARNs (petits oligomères d'ARN) qui peuvent être des 20 marqueurs de pathologies nécessite des technologies de marquage intégrables, pratiques et surtout régio--spécifiques des ARNs et notamment de l'extrémité 3' pour limiter au maximum les effets d'encombrement stérique particulièrement marqués sur des duplex de petite taille. De plus ces petits 25 oligomères se marquent très mal par les techniques enzymatiques justement en raison de leur taille comme décrit par F. Natt dans la reference : Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 7 e52. Il y a donc un grand intérêt à disposer de technologies de 30 fonctionnalisation chimique de faible coût qui en plus d'être spécifiques de l'ARN le seraient également de l'extrémité 3', et cela en toute indépendance de la taille et de la séquence du substrat à marquer. D) Bien que la technologie de marquage diazo soit une excellente technique, la nature des étapes de synthèse conduisant à ces molécules n'est pas compatible avec la nature chimique de certains fluorophores (Cy5 par exemple qui est instable en présence d'hydrazine). La technologie diazo est donc préférentiellement utilisée avec de la biotine en tant que groupement d'intérêt. Or il y a un réel besoin de disposer de groupements d'intérêt directs portant un fluorophore, afin de s'affranchir d'étapes supplémentaires, telles que l'étape de détection des composés biotinylés par une molécule de streptavidine fluorescente. Il importe donc de disposer d'une technologie versatile ou le groupement réagissant avec les acides nucléiques (l'anhydride isatoïque par exemple) est chimiquement compatible avec une conjugaison avec divers groupements comme le Cy3 ou le Cy5 par exemple. E) Enfin, la chémo-sélectivité de l'ARN vis-à-vis de l'ADN peut aussi avoir des applications en préparation d'échantillon également appelée « sample prep », telles que la sélection des ARNs sans utiliser une ADNase, la capture sélective d'ARN dans un milieu contenant de l'ADN, la décontamination, l'inhibition sélective de l'amplification, etc. En 1982 Moorman (Moorman JACS 1982 104 6785-6786) a publié l'utilisation de l'anhydride isatoïque pour sa réactivité sélective avec les sérines de la chymotrypsine, ce qui conduit à l'inactivation de la protéine. Cette publication est l'une des premières qui démontre la réactivité de l'anhydride isatoïque sur les groupements hydroxyles d'une biomolécule, en milieu aqueux. Toutefois et curieusement alors que l'on s'attendrait à avoir une réactivité préférentielle avec les fonctions amines présentent sur la protéine, ces dernières -6- étant plus nucléophiles, il est apparu que les fonctions alcool réagissent d'abord. En 1983, Hiratsuka (Hiratsuka BBA 1983 742 496-508) publie l'un des premiers articles sur la réactivité de l'anhydride isatoïque ou de l'anhydride isatoïque méthylé sur des ribonucléosides libres (5' triphosphate ou 5'-OH). Ceci afin de synthétiser des substrats fluorescents d'enzymes pour l'étude de ces dernières. En effet l'anhydride isatoïque, une fois ouvert, devient fluorescent. Il faut cependant, pour éviter toute confusion, faire la différence entre la fluorescence intrinsèque de l'anhydride isatoïque ouvert, qui devient une molécule d'anthranylate (Excitation : 335-350 nm et Emission : 427-446 nm), et la fluorescence que l'on apporte par conjugaison avec un fluorophore. On trouve en effet une multitude d'articles citant le marquage d'ARN par l'anhydride isatoïque, mais utilisant la fluorescence intrinsèque de l'antranylate pour le détecter). Leurs conclusions sont les suivantes : l'anhydride isatoïque ne réagit pas sur les amines exocycliques des bases, malgré une nucléophilie décrite habituellement pour être bien supérieure à celle des 2'-OH, l'anhydride isatoïque n'est pas connu pour réagir sur les 5'-OH, l'anhydride isatoïque réagit préférentiellement (cinétiquement) sur le 2'-OH par rapport au 3'-OH (thermiquement favorisé). Cependant, en raison de la migration entre les positions 2' et 3' des groupements acyl, un mélange de l'ordre de 90% d'ester en 3' est obtenu. Ovodov en 1990 (Ovodov, FEBS 1990 270 111-114), par des recherches basées sur des travaux de Khorana de 1963 (Stnark, Journal of the American Chemical Society 1963 75 2546 et Knorre Biokhimiya 1965 1218-1224), décrit l'acylation d'ARNs messager en milieu aqueux avec de l'anhydride acétique (DMF 50, acétate de sodium à 1M, pH 7, 2 à 3 heures à température ambiante) pour protéger l'ARN vis-à-vis de l'action des ARNases. 11 décrit un niveau d'acylation de 70-75o suffisant pour inhiber l'action des ARNases. En 1993 Servillo (Servillo Eur. J.Biochem. 1993 583-589) publie un article démontrant le « marquage » spécifique en 3', d'ARN de transfert, après incubation avec de l'anhydride isatoïque (Molecular Probes, Eugene, USA) en milieu aqueux et à un pH de 8,8 pendant 3 heures et à température ambiante. 11 démontre, par diverses techniques, une fonctionnalisation absolument régio-spécifique en 3'. Par hydrolyse totale avec de l'ARNase A et de l'ARNase T2, il montre la présence d'un seul nucléoside fluorescent. Avec l'inhibition de la phosphodiestérase, il démontre un marquage total en position 3', correspondant à un marquage régio-spécifique sans mentionner de marquage en 5'. En 2000 paraît le premier article, d'une série en cours, de K. M. Weeks sur l'acylation sélective des hydroxyles en 2' de l'ARN. Cette série d'articles pondère les résultats de Servillo en terme de la régio-spécificité de l'acylation puisque Weeks décrit cette fois une acylation sélective de la position 2'OH de l'ARN. Elle couvre la littérature sur la technique SHAPE (Sélective 2'-Hydroxyl Acylation and Primer Extension) et comporte notamment les articles : K.A. Wilkinson, S.M. Vasa, K.E. Deigan, S.A. Mortimer, M.C. Giddings and K.M. Weeks, Influence of nucleoside identity on ribose 2'-hydroxyl reactivity in RNA. RNA 15, 1314-1321 {2009). - K.E. Deigan, T.W. Li, D.H. Mathews and K.M. Weeks, Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 97-102 (2009). S.A. Mortimer and K.M. Weeks, Time-resolved RNA SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 130, 16178-16180 (2008). C.M. Gherghe, S.A. Mortimer, J.M. Krahn, N.L. Thompson and K.M. Weeks, Slow conformational dynamics at C2'-endo nucleotides in RNA. J. Am. Chem. Soc. 130, 8884-8885 (2008). S.A. Mortimer and K.M. Weeks, A fast acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007). K.A. Wilkinson, E.J. Merino and K.M. Weeks, Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols 1, 1610-1616 (2006). K.A. Wilkinson, E.J. Merino and K.M. Weeks, RNA SHAPE chemistry reveals non-hierarchical interactions dominate equilibrium structural transitions in tRNAAsp transcripts. J. Am. Chem. Soc. 127, 4659-4667 (2005). E.J. Merino, K.A. Wilkinson, J.L. Coughlan and K.M. Weeks, RNA structure analysis at single nucleotide resolution by Selective 2'-Hydroxyl Acylation and Primer Extension (SHAPE). J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005). S.I. Chamberlin and K.M. Weeks, Mapping local nucleotide flexibility by selective acylation of 2'- amine substituted RNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 216-224 (2000). L'auteur utilise des dérivés de l'anhydride isatoïque (anhydride isatoïque N-méthylé, anhydride isatoïque, anhydride -9- nitro isatoïque N-méthylé, anhydride nitro isatoïque qu'il fait réagir sur des ARN de transfert ou de courts oligoribonucléotides modèles (milieu aqueux, pH 8, température ambiante ou 37°C, durant quelques heures). Seuls les 2'-OH peu contraints, c'est-à-dire peu engagés dans des structures secondaires ou tertiaires, sont acylés, car ils sont plus accessibles et moins prés d'un squelette phosphate diester. Ils deviennent donc plus réactifs. Ensuite cet ARN partiellement acylé est soumis à une transcription in vitro qui génère des fragments d'ADN plus ou moins longs, l'élongation s'arrêtant à chaque fois qu'un volumineux 2'-0-anthranylate, c'est-à-dire une molécule d'anhydride isatoïque ouverte qui s'est fixée sur le 2'-OH du sucre, est rencontré. Après séquençage ou analyse de ces fragments par électrophorèse capillaire, on peut établir une cartographie de la structure tertiaire des ARN messagers ainsi soumis à cette technique. Il s'agit du principe de la technique SHAPE (Selective 2'-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension). En 2008 un article de Li, « Aptamers that recognize drugresistant HIV-1 reverse transcriptase » Na Li, Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 21 6739-6751, cite les travaux de Weeks pour marquer spécifiquement les 2'-OH en interne qui seraient les plus accessibles et décrire ainsi une cartographie structurale de l'ARN en question. En 2007, Thomas Cech (Cech T. R. RNA 2007 536-548) utilise également cette technique pour étudier la structure d'ARNs cristallisés. L'état de la technique comporte également des brevets. Le brevet US-B-7,244,568 porte sur l' acylation sélective, plus ou moins partielle, des 2'-OH de l'ARN avec des groupements hydrophobes (butyryl ou pentanoyl à partir des anhydrides correspondants). L'ARN devient ainsi suffisamment hydrophobe pour être extrait sélectivement par un solvant organique, ou être sélectivement immobilisé (par exemple sur une phase inverse, de la silice, une membrane, etc.). Il est décrit également une phase solide activée par un chlorure d'acide ou un anhydride qui permet de sélectivement immobiliser les molécules d'ARN par rapport aux molécules d'ADN. Cette phase peut être réalisée par de l'anhydride isatoique immobilisé ou le BCPB (Benzyl chloride immobilisé sur polystyrène). Enfin il est également décrit une technique pour doser des ARN adsorbés sur une phase solide : les 2'-OH des ARN immobilisés sont mis en réaction avec de l'anhydride isatoïque, la fluorescence intrinsèque générée permet de doser l'ARN immobilisé. Des études plus poussées démontre que dans les conditions prônées par ce brevet, l'ADN est fonctionnalisé de la même manière car les anhydrides, qu'il utilise, ne sont pas chémospécifique et attaquent aussi bien les amines exocycliques des bases que les groupements hydroxyles du sucre. Le brevet EP-B-1.196.631, propose des agents acylants compatibles avec une acylation régiospécifique de l'ARN en milieu aqueux. Ces agents acylants ne doivent pas apporter une trop grosse gène stérique afin de maintenir les propriétés d'hybridation de l'ARN ainsi modifié. Ce sont principalement des agents acylants permettant l'introduction d'un groupement acétyl ou formyl qui sont utilisés. L'ARN ainsi modifié partiellement sert ensuite de matrice pour une réaction de polymérisation, il peut servir également de sonde dans une réaction de Northern blot. L'idée est de maintenir les propriétés d'hybridation (l'ARN modifié reste substrat d'une réaction d'élongation), tout en détruisant les structures secondaires par la présence du groupe en 2' et en rendant l'ARN ainsi modifié résistant vis-à-vis des nucléases. De plus l'exemple 22 indique que le marquage fluorescent de l'ARN est envisagé, mais uniquement par adjonction de l'anhydride isatoïque méthylé, il s'agit donc d'une fluorescence intrinsèque. Le brevet EP-B-1.196.631 propose un polynucléotide comprenant ARNm, ARNr ou ARN viral, pour lequel plus de 25 % des riboses sont modifiés de manière covalente au niveau des positions 2'-OH. De plus il concerne une méthode pour produire des oligo- et polynucléotides double brin à partir d'un brin d'acide nucléique de départ, à partir d'une pluralité de mononucleotides (UTP, dTTP et/ou dUTP, ATP et/ou dATP, GTP et/ou dGTP, et CTP et/ou dCTP), en présence de polymérase et éventuellement d'amorces permettant la formation d'un brin d'acide nucléique complémentaire à l'acide nucléique de depart. La demande de brevet WO-A-2004/013155 décrit 1a modification chimique de l'ARN dans un mélange, de type faeces, sang, etc., afin de différencier l'ADN de l'ARN. C'est l'anhydride acétique qui est le réactif capable de faire cette différenciation. On hydrolyse ensuite la fonction ester afin de régénérer l'ARN biologiquement actif. Pour cela cette demande propose de protéger l'utilisation de bases organiques « peu » agressives pour l'ARN (lysine, diamines etc.), associé à un protocole de déprotection. De l'ensemble de ces documents, on note que seule la fluorescence intrinsèque de l'anhydride isatoïque une fois ouvert est utilisée. De plus l'utilisation de cette molécule et de ces dérivés pour d'autres applications n'est pas décrite comme le propose la présente invention. En ce qui concerne la fluorescence de l'anhydride isatoïque, il est peu intéressant de n'avoir que la fluorescence de l'anhydride isatoïque pour pouvoir détecter les ARNs. Ainsi cette fluorescence est faible comparée à d'autres composés fluorescents et pas forcément compatible avec la longueur d'onde des lasers utilisés de façon courante dans les automates de détection. De plus, avec la fluorescence intrinsèque de l'anhydride isatoïque ouvert, les applications sont limitées à de la détection monoplex et non multiplex comme c'est de plus en plus le cas en biologie moléculaire. Par exemple, le marquage pour des applications dans le domaine des puces à ADN n'est pas possible avec ces brevets car l'utilisateur ne pourra pas différencier une détection d'un premier type d'acides nucléiques de celle d'un second type d'acides nucléiques, tous les deux marqués avec l'anhydride isatoïque. Dans l'état de la technique, il y a globalement quatre utilisations différentes de l'anhydride isatoïque. Tout d'abord il s'agit d'exploiter les propriétés de fluorescence intrinsèques d'esters de l'acide anthranylique pour étudier le mécanisme de certaines enzymes. Deuxièmement l'utilisation des propriétés acylantes de l'anhydride isatoïque pour inhiber de manière régio-sélective la polymérisation des acides nucléiques, il ne s'agit donc que d'introduire un substituant volumineux en 2' dans des conditions les plus douces possibles et cela de façon plus ou moins ménagée. Troisièmement l'état de la technique utilise l'anhydride isatoïque pour empêcher leur dégradation lors d'une étape d'extraction. Finalement et quatrièmement, il s'agit d'extraire sélectivement l' ARN acylé par rapport à l'ADN non acylé. Il y alors une idée de réversibilité de la fonction ester de manière à régénérer une fonction 2'OH libre et donc un ARN fonctionnel. L'idée de conjuguer la molécule d'anhydride isatoïque à de la biotine ou à un Cy3 pour des applications dans le marquage des ARNm pour hybridation sur au moins deux spots différents ou sur puce à ADN n'est donc pas évidente car la conjugaison avec un groupement d'intérêt peut entraîner une modification des propriétés acylantes et même de la stabilité de l'anhydride isatoïque, propriétés qui sont difficilement prévisibles. En particulier, la conjugaison de l'anhydride isatoïque au groupement d'intérêt doit se faire par le biais d'atomes et de liaisons qui peuvent entraîner une très forte déstabilisation de la structure, une très grande difficulté dans la synthèse, une mauvaise solubilité dans l'eau, une perte des propriétés physico-chimiques du groupement d'intérêt par atténuation de la fluorescence une très mauvaise réactivité vis--à-vis de l'ARN, une très grande instabilité des duplex formés entre l'ARN marqué et l'ADN (sondes de capture notamment par gène stérique trop importante ou par le fait que les hybrides ARN fonctionnalisés / ADN ne soient plus des substrats de polymérase. Les inventeurs ont par ailleurs compris l'intérêt de la fonctionnalisation d'ARNs par les composés d'anhydride isatoïque afin de permettre leur capture par des molecules de reconnaissance portées ou non par un support solide. La présente invention propose d'utiliser l'anhydride isatoïque non pas pour sa fluorescence intrinsèque mais pour sa capacité à se fixer spécifiquement sur l'ARN et à permettre la liaison avec un groupement d'intérêt, tel que défini plus loin. La présente invention consiste donc à utiliser une molécule d'anhydride isatoïque, qui est connue depuis très longtemps (JOC 1959 Staiger 24 1214) pour sa capacité à réagir avec les nucléophiles (amines, thiols et alcools primaires ou secondaires) pour donner, après ouverture du cycle, et départ de CO2 des dérivés de l'acide anthranilique (voir la Figure 1). L'attaque de nucléophiles sur l'anhydride isatoïque a été largement étudiée car elle permet la formation directe d'intermédiaires cruciaux pour la synthèse de nombreux hétérocycles d'intérêt thérapeutique. En effet, les dérivés de l'acide anthranilique peuvent ensuite se réarranger pour donner lieu à une multitude d'hétérocycles d'intérêt pharmaceutique. Combinée à une réactivité vis--à-vis des électrophiles (substitution sur le cycle benzénique) les anhydrides isatoïque donne ainsi accès à de très nombreux analogues et dérivés utilisés dans des domaines d'applications très divers : agrochimie, industrie pharmaceutique, industrie chimique et cosmétique. Sa nature assez particulière fait qu'il s'agit d'une molécule relativement stable, qui peut être vendue stockée à sec et à température ambiante, qui ne réagit qu'en présence de nucléophiles, préférentiellement à chaud (60-80°C) et le plus souvent en présence d'une base. Ces propriétés, ainsi que l'état de l'art sur la réactivité de l'anhydride isatoïque vis-à-vis des alcools (voir ci-dessus), ont amené les inventeurs à penser à l'utilisation de cette molécule pour marquer et détecter des ARN, notamment via une puce à ADN. Ainsi, il existe peu de méthodes permettant de fonctionnaliser ou de marquer sélectivement l'ARN et cela en toute indépendance de la taille et de la séquence du substrat. Or, il se trouve que la différence majeure entre l'ADN et l'ARN est due à la présence d'un groupement hydroxyle en position 2' (voir Figure 2). Ce groupement 2'-hydroxyl du ribose des ARN n'a jamais été utilisé pour marquer des ARN dans des applications de puces à ADN ou dans des applications de tri sélectif ARN versus ADN. Les inventeurs ont donc utilisé cette fonction pour y faire réagir une molécule d'anhydride isatoïque rendue détectable ou fonctionnalisée par sa conjugaison à un fluorophore ou à une biotine (ou à une molécule d'intérêt). De cette manière l'ARN sera marqué sélectivement en présence d'ADN. Par définition, un groupement d'intérêt est une molécule qui : - est une molécule réactive ou un groupement réactif capable de réagir avec une autre molécule réactive ou un autre groupement réactif dans certaines conditions (exemple d'un nucléophile et d'un électrophile, d'un alcyne avec un azide, d'un maléimide avec un thiol, d'un diène avec un alcène, etc.), et/ou - possède une fluorescence qui lui est propre et qui est différente de celle de l'anhydride isatoïque ouvert (ester anthranilique), et/ou - est un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable et éventuellement réversible, du type biotine/streptavidine, molécule hydrophobe ou hydrophile/support hydrophobe ou hydrophile, antigène/anticorps, etc., et/ou - est une molécule de marquage pour une réaction directe choisie parmi les molécules suivantes : une enzyme qui produit un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta-galactosidase, la glucose--6-phosphate déshydrogénase, - les chromophores, comme colorants, ou les composés fluorescents, luminescents, - les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, l'ampérométrie, la voltamétrie, l'impédance, - les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, et les molécules radioactives. - est une molécule de marquage pour une réaction indirecte constituée par un couple ligand/récepteur du type : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, - antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, - molécule électrophile/molécule nucléophile, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide, ligand hydrophobe/phase solide hydrophobe, ou 20 - ligand/métal de coordination. Par molécule de liaison, il faut comprendre un anhydride isatoïque ou ses dérivés. A noter que lorsque l'anhydride isatoïque est ouvert après réaction avec un nucléophile, il porte alors le nom d'anthranylate. 25 Par dérivés de l'anhydride isatoïque, il faut comprendre tous composés organiques comportant une partie correspondant à l'anhydride isatoïque et portant sur la partie aromatique ou sur la partie hétérocyclique de ce dernier au moins un radical, tel qu'un groupement chimique ou organique. 30 Le terme fonctionnalisation correspond à l'action de greffer un groupement d'intérêt par liaison covalente ou non sur un acide nucléique. Par bras de liaison, on définit un bras espaceur de nature organique permettant de relier la molécule de liaison et le groupement d'intérêt. Il peut comporter une fonction succeptible d'être clivée par un moyen physico-chimique, photo-chimique, enzymatique, chimique, thermique, etc. Par moyen ou molécule de reconnaissance ou de capture, on définit une molécule immobilisée ou non sur un support solide ayant une forte affinité pour le groupement d'intérêt. La définition d'un ARN est un polymère naturel ou synthétique constitué d'au moins deux unités ribonucléotidiques successives modifiées ou non. Le terme ADN est défini par un polymère naturel ou synthétique constitué d'au moins deux unités désoxyribonucléotidiques successives modifiées ou non. Il est également possible d'utiliser des simples brins chimériques constitués d'au moins un segment d'ADN et au moins un segment d'ARN. Par inhibition, on entend l'incapacité de l'ARN excessivement fonctionnalisé par un dérivé de l'anhydride isatoïque à être amplifié par une technologie d'amplification de matériel génétique (NASBA, PCR, etc.) Par définition le mot sucre est un composé ribose ou désoxyribose. La présente invention concerne un procédé de fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) qui comprend les étapes suivantes : a) disposer d'au moins : une molécule de liaison constituée par un anhydride 30 isatoïque ou un de ses dérivés, un groupement d'intérêt, et un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté : en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou - en positions) 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide à l'extrémité 3' terminal de l'ARN, et c) obtenir un anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt. Selon un premier mode de réalisation, il s'agit d'un procédé de marquage d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) qui comprend les étapes suivantes : a) disposer d'au moins : - une molécule de liaison constituée par un anhydride isatoïque ou un de ses dérivés, ayant une fluorescence 15 intrinséque, un groupement d'intérêt, ayant un signal de fluorescence intrinséque, mais différent du signal émis par la molécule de liaison, ou n'ayant pas de signal de fluorescence intrinsèque, et 20 - un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté : - en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, 25 et /ou en positions 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et c) obtenir un anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt. 30 Selon un second mode de réalisation, il s'agit d'un procédé de capture ou de séparation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) qui comprend les étapes suivantes : a) disposer d'au moins . -19_ une molécule de liaison constituée par un anhydride isatoïque ou un de ses dérivés, un groupement d'intérêt constitué par un ligand complémentaire d'un anti ligand, et - un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, b} faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté : - en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, 10 et/ou en positions 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et c) obtenir un anthranylate, reliant à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt, 15 d) capturer ou séparer l'ARN par l'intermédiaire d'une réaction ligand -- anti--ligand. Quelque soit le mode de réalisation du procédé et selon une variante de réalisation, le bras de liaison est associé à la molécule de liaison avant que ledit bras de liaison soit 20 associé au groupement d'intérêt. Quelque soit le mode de réalisation du procédé et selon une autre variante de réalisation, le bras de liaison est associé à la molécule de liaison après que ledit bras de liaison soit associé au groupement d'intérêt. 25 Dans les deux cas de figures précédents, la molécule de liaison est préalablement associée à l'ARN. La présente invention concerne un procédé de capture sélectif d'au moins une molécule d'ARN utilisant au moins une 30 molécule de liaison, un groupement d'intérêt, constitué par un ligand complémentaire d'un anti-ligand, et un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, la molécule de liaison étant constituée par un anhydride isatoïque ou un de ses dérivés, qui se fixe par liaison -2a- covalente au niveau d'un groupement hydroxyle porté en position : en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou en position 2' et 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et/ou - en position 3' du ribose dudit nucléotide terminal en position 3' de l'ARN. IO La présente invention concerne également un procédé de séparation de molécules d'ARN par rapport à d'autres constituants biologiques, notamment des molécules d'ADN consistant à : - appliquer le procédé de capture, tel que décrit ci-dessus, à 15 un échantillon biologique contenant des acides nucléiques indifférenciés (ARN et ADN), les groupements d'interét étant associées à au moins un support solide facilement séparables du reste de l'échantillon biologique, et - séparer les molécules de liaison portant les molécules d'ADN 20 du reste de l'échantillon biologique. La présente invention concerne encore un réactif de fonctionalisation, de formule (1) . R2 -- 25 X R~ dans lequel : - RI représente H ou un groupement d'intérêt, -21- - R2 représente H ou un groupement d'intérêt pouvant être : a. un marqueur ou un précurseur de marquage, ou b. un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., 5 afin de former un complexe stable, - si R1 est représenté par H, R2 est représenté par un groupement d'intérêt, et vice-versa, et - X est un bras de liaison, qui relie le groupement d'intérêt à la molécule de liaison. 10 Lorsque le réactif est un réactif de capture ou de séparation, tel que décrit ci-dessus, le moyen de capture ou de séparation est constitué par un support solide, tel que particules de polymère ou de silice, magnétiques ou non, ou un filtre ou bien par la paroi interne d'un récipient. 15 Lorsque le réactif est un réactif de fonctionalisation, tel que décrit ci-dessus, dans lequel le bras de liaison X est : une simple liaison covalente reliant un atome de la molécule de liaison et un atome du groupement d'intérêt, ou - un bras de liaison organique, tel qu'une simple liaison 20 covalente entre la molécule de liaison et le groupement d'intérêt ou un simple atome de carbone, éventuellement substitué, un enchaînement d'au moins deux atomes de carbone, contenant éventuellement des structures aromatiques et/ou des hétéro-atomes (oxygène, soufre, azote, etc.). 25 Dans ce dernier mode de réalisation du réactif de fonctionalisation, le bras de liaison X comporte une fonction ou une liaison capable d'être clivée par un moyen physico- chimique, photo-chimique, thermique, enzymatique et/ou chimique permettant la séparation de la molécule de liaison 30 par rapport à l'ARN dans des conditions de lumière, de température, enzymatiques ou chimiques particulières. La présente invention concerne aussi une molécule biologique d'ARN fonctionnalisée susceptible d'être obtenue par le procédé, tel que décrit précédemment. La présente invention concerne toujours un kit de détection d'une molécule d'ARN cible comprenant un réactif, tel que décrit précédemment. La présente invention concerne enfin un procédé de fonctionalisation selon es procédés évoqués plus haut, qui comprend l'étape supplémentaire suivante entre les étapes a) et b) consistant à hydrolyser le groupement monophosphate terminal en position 3' de chaque brin d'ARN à fonctionaliser. L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description détaillée qui est exposée ci-dessous en regard des figures annexées, à savoir : La Figure .1 décrit la réaction de l'anhydride isatoïque avec un nucléophile. La Figure 2 montre une réaction de marquage d'une molécule d'acide ribonucléique par une molécule de liaison portant un groupement d'intérêt selon l'invention. La Figure 3 présente la synthèse de dérivés de l'anhydride isatoïque selon l'exemple 1. La Figure 4 décrit la synthèse de dérivés de l'anhydride isatoïque selon l'exemple 2. La Figure 5 décrit le principe du clivage enzymatique d'un ORN fonctionnalisé par le Cy3 IA Me (13) et de la détection de tous les adduits nucléosidiques possibles La Figure 6 propose la caractérisation et l'identification par LC-MS des différents adduits nucléosidiques formés lors de l'hydrolyse enzymatique d'un ORN marqué par le composé 13. La Figure 7 montre la masse des nucléosides et dinucléotides acylés ou non que l'on peut détecter à partir de la séquence décrite et selon l'exemple 3. La Figure 8 montre les spectrogrammes de masse (Maldi Tof) de la fonctionnalisation d'un ORN de 27 bases en fonction de la concentration en anhydride isatoïque modifié (Cy3 IA Me 13). La Figure 9 présente le suivi réactionnel par HPLC entre un ODN ou un ORN mis en réaction avec le composé 13. La Figure 10 présente les intensités de fluorescence (RFU) détectées lors de l'hybridation de 4 ORN biotinylés par le composé 9 sur une puce à ADN Affymetrix. La Figure 11 présente les intensités de fluorescence 15 (RFU) suite à la détection sur une puce à ADN de 4 ORN de 60 bases biotinylés avec le composé 11 (Puce Affymetrix). La Figure 12 présente les intensités de fluorescence (RFU) suite à la détection sur une puce à ADN d'IVT biotinylés 20 avec le composé 9 (Puce Affymetrix). La Figure 13 est une photographie des puces à ADN sur lames de verres AGILENT, lors de la détection de l'hybridation d'IVT hybridés et fonctionnalisés par le composé Cy3 IA Me 13. La Figure 14 représente l'histogramme des intensités médianes de la fluorescence détectée sur une puce à lame de verre Agilent en fonction de la classe des séquences (IVT fonctionnalisés avec le composé Cy3 IA Me 13). 30 La Figure 15 représente les chromatogrammes à 260 nm du processus de fonctionnalisation/capture et clivage/élution 25 sélectifs de l'ARN et à partir d'un mélange ORN/ODN comme décrit dans l'exemple 11. La Figure 16 montre le déroulement d'un protocole de fonctionnalisation, capture, clivage et élution d'un transcrit 5 ARN soumis à l'action du composé 5 Biot PEG4 (SS) IA Me (24). La Figure 17 montre le profil éléctrophorétique d'un transcrit HIV non fonctionnalisé et fonctionnalisé avec différentes concentrations de la molécule 5 Biot PEG4 (SS) IA Me (24). 10 La Figure 18 montre la même chose que la Figure 17 mais sous une autre représentation graphique (type gel). La Figure 19 montre le profil éléctrophorétique correspondant au surnageant d'un transcrit HIV non fonctionnalisé et fonctionnalisé avec différentes 15 concentrations de la molécule 5 Biot PEG4 (SS) IA Me (24) mis en présence de particules magnétiques recouvertes de streptavidine. La Figure 20 montre le profil éléctrophorétique d'un transcrit HIV non fonctionnalisé et fonctionnalisé avec 20 différentes concentrations de la molécule 5 Biot PEG4 (SS) IA Me (24) mis en présence de particules magnétiques recouvertes de streptavidine puis élué par clivage chimique du lien disulfure (SS) La Figure 21 représente une superposition de gammes de 25 transcrits HIV (1000, 100, 50, 10 et 1 copie(s)) fonctionnalisés avec la molécule (24) à différentes concentrations (15, 30, 120 et 180 mM), capturés sur particules magnétiques recouvertes de streptavidine puis élués par clivage chimique au DTT et amplifiés par NASBA. Enfin la Figure 22 représente le schéma réactionnel de la fonctionnalisation de l'ARN selon la présente invention à l'aide d'un anhydride isatoïque particulier. Dans les exemples décrits ci-après, les abréviations 5 suivantes seront utilisées : - ACN : Acétonitrile, - Ar : aromatique, - CCM : chromatographie sur couche mince, - CDC13 : Chloroforme deutéré, 10 - d : doublet, - DCM : dichlorométhane, - dd : doublet dédoublé, - DMF : diméthylformamide, - DMSO-d6 : diméthylsulfoxide, 15 - DMSO-d6 : diméthylsulfoxide deutéré, - Eau MilliQ : Eau ultrapure (Millipore, Molsheim, France), . Eq : équivalents, - HPLC : chromatographie liquide haute performance, - IA : anhydride isatoïque, 20 - IVT : transcrits in vitro - M : multiplet, - m : massif, - Me : méthyl, - McOH : méthanol, 25 . Nb exp : Nombre de répétition de l'expérience, - nd : non déterminé, - NMO : N-méthylmorpholine, - NP1 : Nucléase Pl, - ODN : Oligo-deoxyribonucléotide, 30 - ORM : Oligo-ribonucléotide, ^ PA :Phosphatase alcaline, - PBS lx : Phosphate Buffered Saline = (0.01 M PO4r 0.0027 M KC1, 0.137 M NaCl, pH-7.4 à 25°C ref SIGMA 4417, Saint Louis, USA), - q : quadruplet, + Rdt : rendement, + Rf ou TR : temps de rétention, - RMN : résonance magnétique nucléaire, - rpm : tours par minute, + s : singulet, + SS : lien disulfure, - t : triplet, - TEAAc : Triéthyl ammonium acétate, - Tf : taux de fonctionnalisation, - TA : Température ambiante, - UV : ultraviolet. Les conditions générales pour l'analyse et la synthèse des composés chimiques utilisées dans les exemples ci-après sont décrites ci-dessous: Les analyses LC-MS ont été effectuées avec une chaîne HPLC WATERS Alliance 2795 équipée d'un détecteur à barrette de diodes PDA 996 (Waters), d'un détecteur par spectrométrie de masse ZQ 2000 (Waters), d'un logiciel Empower version 2 et d'une colonne WATERS XTerra MS C18 (4,6 x 30 2,5 pM) utilisée avec un débit de 1 ml/minute à 30°C (détection à 260 nm ou en max plot)_ Le spectromètre de masse ZQ 2000 possède une source d'ionisation Electrospray. Les ionisations ont été réalisées en mode positif avec une tension de cône de 20V et une tension au niveau du capillaire de 3,5kV. Plusieurs types de gradients pour les analyses HPLC ont été 30 utilisés: Conditions Eluant A Eluant Eluant C Gradient - 27 - B (Formiate linéaire d'ammonium AF) 97% de A /1% de 1 Eau ACN AF 500 mm B à 62% de A / milliQ pH 7 36% de B en 10 min avec 2% de l'éluant C en isocratique 2 Eau ACN AF 500 mm 97% de A /1% de milliQ pH 7 B à 34% de A /64% de B en 18 min avec 2% de l'éluant C en isocratique 3 Eau ACN AF 500 mm 98% de A / 0% milliQ pH 7 de B à 24% de A /74% de B en 18 min avec 2% de l'éluant C en isocratique 4 TEAAC ACN/Eau - 85% de A /14% 50mM 50/50 de B à 45,5% de avec 50 A / 54,5% de B mM de en 23 minutes TEAAc Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Brüker 200 ou 500 MHz (pour la molécule 13 seulement) . Les déplacements chimiques (5) sont donnés en ppm par rapport au pic du solvant pris comme référence interne (CDC13 : 7,24 ppm ; DMSO--d6 : 2,49 ppm ; D20 : 4,80 ppm à 25°C). Les spectres sont décrits avec les abréviations ci-dessus : s, d, t, q, qu, m et M. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en hertz (Hz) _28_ Les spectres d'absorbance ont été enregistrés sur un spectrophotomètre UV- Visible Varian, modèle Cary 300 Bic). Les analyses par fluorescence ont été effectuées sur un fluorimètre Varian, modèle Cary Eclipse(Varian, Santa Clara, CA, USA). Les analyses par chromatographie ionique ont été réalisées sur un chromatographe DIONEX ICS 1000 (Sunnyvale, CA, USA) en mode cationique sur une colonne IonPac CS12A (Sunnyvale, CA, USA). Les analyses par chromatographie sur couche mince ont été réalisées sur des plaques de silice ALUGRAM0 MACHEREY-NAGEL SIL G/UV254 4 x 8 cm (Duren, Allemagne) avec une détection UV à 254 nm ou des CCM phase inverse (Macherey Nagel, Duren, Allemagne, Alugram RP-18W 40x80 mm). La purification des produits a été effectuée par chromatographie sur gel de silice Silica gel 60 FLUKA (40-63 }lm). Les conditions de séparation par chromatographie « flash » (sous pression argon) respectent strictement les conditions décrites par Clark Still et al (Clark Still, W. ; Kahn, M. ; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43, 2923-2925) soit une hauteur fixe de silice de 15 cm poussée à un débit de 5 cm/minutes, le diamètre de la colonne dépendant de la quantité et des Rf des produits à purifier. La purification de certains produits hydrophilles a été réalisée par chromatographie sur gel de silice, Silica gel RP-18 MERCK (40-63 pm). Les analyses par chromatographie sur couche mince ont été réalisées sur des plaques de silice 18 F259 MERCK et visualisées sous UV à 254 nm ou directement à l'oeil nu. Préambule aux exemples 1 et 2 _ Descriptif général de la synthèse des composés qui seront décrits dans les exemples 1 et 2 La conjugaison de l'anhydride isatoïque ou de ses dérivés à un groupement d'intérêt suppose une réaction chimique entre l'anhydride isatoïque, muni d'une fonction réactive, et la molécule d'intérêt, elle également, étant munie d'une fonction réactive. A noter qu'il est particulièrement important de préserver l'intégrité de la partie anhydride isatoïque durant ce couplage. L'homme du métier connaît une multitude de façon de conjuguer ainsi deux molécules entre elles afin d'obtenir une nouvelle molécule ayant des propriétés communes aux deux. Exemple 1 : Synthèse de dérivés alkylës de l'anhydride isatoïque conjugués à un groupement d'intérêt porté par le cycle aromatique dans un mode particulier de l'invention, l'anhydride isatoïque est conjugué à un groupement d'intérêt, par exemple un marqueur tel que Cy3, biotine, biotine munie d'une groupement labile, qui est couplé à la molécule de liaison qui est l'anhydride isatoïque par l'intermédiaire du cycle aromatique, comme cela est bien représenté à la Figure 3. Ainsi, nous avons choisi de relier l'anhydride isatoïque et la molécule d'intérêt par la partie aromatique de l'anhydride 25 isatoïque, avec un bras de liaison de type amide. Cela en mettant en réaction (méthode 1): le 5--amino IA (1) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) avec un acide carboxylique (biotine, dotée ou non d'un bras hydrophile (3) ou chemolabile (22)), ou Cy3-000H 30 (4)) avec un réactif de couplage (l'isobutyl chloroformate). -30- - De manière à obtenir les composés (6), (23) ou (7). Le groupement 5-amino de l' anhydride isatoique étant peu nucléophile, nous avons préféré utiliser la méthode 1 plutôt que de réaliser le couplage peptidique directement par réaction entre (méthode 2) : - le 5-amino IA (1) - et un ester activé de la molécule d'intérêt. La méthode 1 permet d'accéder aux conjugués de l'anhydride isatoique (Biot PEG4 IA (6), Cy3 IA (7) ou Biot PEG4 SS IA (23) avec un bien meilleur rendement que le couplage direct du 5-amino IA avec la biotine PFP (2) tel que nous l'avons fait pour accéder au composé Biot IA (5) (méthode 2). Le dérivé biotinylé (3) a été choisit car c'est un composé hydrophile facilement détectable avec une molécule de 15 streptavidine fluorescente. Le dérivé biotinylé (22) a été choisit car c'est un composé hydrophile facilement détectable avec une molécule de streptavidine et de plus muni d'un lien chémolabile disulfure (SS) qui permet de libérer dans le milieu la molécule d'ARN 20 qui a été capturée. La Cyanine 3 Cy3--COOH (4) a été choisie comme exemple de groupement d'intérêt car c'est un fluorophore très utilisé dans les applications biomédicales ou de diagnostic moléculaire en raison de sa photo stabilité, et de ses 25 propriétés de fluorescence à des longueurs d'onde bien éloignées de l'auto fluorescence de certains constituants biologiques «(excitation = 545 nm et Àer,ission = 570 nm). Cette molécule a été synthétisé en suivant la voie de synthèse décrite par Waggoner et al. (Waggoner A.S., Mujumdar R.B., 30 Ernst Z.A., Mujumdar S.R., Lewis C.J. Cyanine Dye Zabeling -31- Reagents: Sulfoindocyanine Succinimidyl Esters, Bioconjugate Chemistry, 1993, 4, 105-11). A noter qu'il est entendu que l'homme du métier saurait utiliser d'autres réactions classiques de chimie organique pour coupler l'anhydride isatoïque a toute autre molécule d'intérêt par l'intérmédiaire de liaisons et de groupements situés à diverses positions sur le cycle aromatique. Il est donc également entendu que nous ne nous limitons pas à la position 5 et que d'autres positions de substitutions peuvent être utilisées et même servir à moduler la réactivité de l'anhydride isatoïque vis à vis de nucléophiles. Afin d'augmenter la réactivité de ces composés vis à vis des 2' OH de l' ARN nous avons introduits divers groupements sur le -NH- intracyclique de l'anhydride isatoïque par alkylation avec des composés halogénés ou réactifs vis à vis de cette fonction, ce qui permet un gain de réactivité, suite à une alkylation de cette position. Les composés 5Biot IA Me (9), 5Biot PEG4 Me (11), 5Biot PEG4 SS IA Me (24) ou le Cy3--IA Me {13) on ainsi été obtenus par réaction des composés précurseurs correspondant avec l'iodure de méthyle. Il est a noter que d'autres composés alkylants peuvent être utilisés de manière à augmenter la réactivité de l'anhydride isatoïque vis à vis de groupements nucléophiles (hydroxyles de l'ARN en l'occurrence) mais également pour apporter une fonctionnalité supplémentaire (solubilité, stabilité du duplex, marquage, etc.) tout en maintenant une bonne réactivité vis à vis de nucléophiles. Les composés 5Biot IA 503- 10, 5Biot PEG4 503-12 ou le Cy3--IA 503- 14 ont ainsi été obtenus par réaction des composés précurseurs correspondant avec la sultane 8. Il est entendu qu'un très grand nombre de composé eléctrophiles peuvent ainsi être mis en réaction avec le groupement NH de l'anhydride isatoïque ou ses dérivés de -32- manière à en moduler les propriétés. Il est entendu qu'un grand nombre de réactions et de réactifs permettent d'alkyler les dérivés de l'anhydride isatoïque sur le NH. Exemple 1.1 Synthèse l'ester de la biotine et du 5 pentafluorophénol (2) La biotine (5 g ; 23,1 mmol ; 1,0 eq) est mise en suspension dans le DMF anhydre (50 mL) et la pyridine (2,07 mL ; 25,4 mmol ; 1,1 eq). Après 5 minutes d'agitation, le 10 pentafluorophenyl trifluoroacétate (PFP-TFA : 4,621 mL, soit 7,50 g ; 25,4 mmol ; 1,1 eq) est additionné. Au bout d'une nuit d'agitation, la réaction est terminée. Les solvants sont évaporés à l'évaporateur rotatif. Le résidu d'évaporation est repris avec 100 mL d'éther éthylique pour être mis en 15 suspension, puis essoré sur fritté. Le résidu est rincé avec un minimum d'éther. Masse obtenue = 7,106 g soit un rendement de 810. Eluants CCM phase normale : DCM/MeOH : 90/10. M+H : 411,1 g.mol`1 20 RMN 1H (200MHz, DMSO): 1,2 à 1,8 (m, 6H, 7-8-9) ; 2,3 à 2,9 (m, 4H, 5-10) ; 3.05 (q ,1H, 6) ; 4,00 et 4,40 (M, 2H, 3--4) ; 6.2 et 6.5 (s, 2H, 1-2). Exemple 1.2 : Synthèse de l'anhydride 5-biotine-isatoïque (5) L'anhydride 5-amino-isatoïque 1 (500 mg ; 2,81 mmol ; 1,0 eq) est mis en solution dans un mélange de DMF (14 mL) et de triéthylamine (3,15 mL ; 22,4 mmol ; 8,0 eq). La solution obtenue, de couleur brun foncé, est agitée pendant 5 min à TA avant d'ajouter en une fois l'ester de la biotine et du pentafluorophénol (2) (1,6125 g ; 3,93 mmol ; 1,4 eq). La réaction est laissée sous agitation pendant 16 h. Les solvants sont évaporés à sec puis co--évaporés deux fois avec de l'acétonitrile anhydre à l'évaporateur rotatif. Le résidu d'évaporation est repris dans du DMF (21,2 mL) et de la triéthylamine (4,80 mL ; 33,92 mmol ; 8,0 eq) puis agité pendant 16 h. De l'acide chlorhydrique (38 mL ; 1 M ; 15,8 eq) à 2°C est ajouté au mélange avant d'être agité puis centrifugé à 7000 tr/min pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et le culot est repris trois fois de suite dans de l'eau (68 mL), agité, centrifugé et le surnageant est à nouveau éliminé. Le pH du surnageant doit être égal à 7. Le culot est ensuite séché plusieurs fois de suite à l'éther éthylique afin de faciliter le séchage à l'étuve sous vide à température ambiante. Le produit est repris dans un minimum de DMF auquel est additionné une spatule de silice RP18, ce mélange est évaporé puis co-évaporé deux fois à l'acétonitrile avant d'être déposé sur une colonne chromatographique de 3 cm de diamètre pour 10 cm de haut montée en phase inverse (silice Merck LiChroprep RP-18 (40-63um) ref :1.13900.1000). Les produits sont élués avec un mélange acétonitrile/DMF : 90/10. Masse obtenue = 557 mg soit un rendement de 32%. -34- M+H : 405,1 g.mol-1 RMN 1H (200MHz, DMSO) : 1,3 à 1,8 (m, 6H, 7-8-9) ; 2,34 (t, 2H, 10) ; 2.6 (d ,2H, 5) ; 2,9 (dd ,1H, 6) ; 3,15 (M ,1H, 10) ; 4,10 et 4,40 (M, 2H, 3-4) ; 6.47 et 6.39 (s, 2H, 1-2) ; 7,13 (d ,1H, 14) ; 7,85 (dd ,1H, 13) ; 8,30 (s ,1H, 12). Exemple 1.3 Synthèse de l'anhydride 1-Mèthyl-5 biotine- isatoïque (9) Le produit (5) (522 mg ; 1,29 mmol ; 1,0 eq) est dissout dans de DMF (10 mL). Le carbonate de potassium (375 mg 2,71 mmol ; 2,1 eq) est mis en suspension dans ce mélange et agité 5 minutes à température ambiante avant d'additionner de l'iodure de méthyle (105 pl ; 1,68 mmol ; 1,3 eq). Après 1h20 d'agitation le milieu réactionnel est filtré sur un frité de porosité 3. Au filtrat est ajouté une spatule de silice RP18 avant d'être évaporé à sec puis co-évaporé 2 fois à l'acétonitrile. La poudre obtenue est déposée sur une colonne chromatographique de diam. 3 cm et de hauteur 10cm montée en phase inverse (silice Merck LiChroprep RP-18 (40-63pm) ref :1.13900.1000).Les produits sont élués avec deux mélanges, d'abord eau/ACN/DMF : 79/20/1 puis eau/ACN/DMF : 69/30/1. Le produit (9) est récupéré avec le second éluant. Masse obtenue = 65 mg soit un rendement de 12% M+H : 419,1 g.mol_1 RMN 1H (200 MHz, DMF) : 1,6 à 2,1 (m, 6H, 7-8--9) ; 2,7 (t, 2H, 10) ; 2,9 à 3,3 (m ,6H, 5-6-15) ; 3,5 (M ,1H, 10) ; 4,5 et 4,8 (M, 2H, 3-4) ; 6.5 et 6.6 (s, 2H, 1-2) ; 7,7 (d ,1H, 14) ; 8,2 (d ,1H, 13) ; 8,8 (s ,1H, 12) Exemple 1.4 Synthèse de l'anhydride 1-propylsulfone-5-biotine-isatoïque (10) 16 17 `Sa,H18 Le produit 5 {50 mg ; 123,6 }mol ; 1,0 eq) est dissout dans du DMF (1,2 mL ; 100mM). Le carbonate de potassium (63,6 mg ; 408 }mol ; 3,3 eq) est mis en suspension dans ce mélange. Après deux minutes d'agitation au vortex à 1000 tour par minute, le dispositif est placé en chambre froide à +4°C, avant d'additionner de la propane sultone (142 pl ; 161 pmol ; 1,3 eq). Après 22 heures d'agitation, le milieu réactionnel est centrifugé et le surnageant récupéré. Le culot est relavé deux fois avec du DMF. Au surnageant est ajouté une spatule de silice RP18 avant d'être évaporé à sec puis co-évaporé 2 fois à l'acétonitrile. La poudre obtenue est déposée sur une colonne chromatographique d'un diamètre de 1 cm et d'une hauteur de 10 cm, montée en phase inverse silice Merck (40-63pm) ref :1.13900.1000). Les produits deux mélanges, d'abord ACN/DMF : 100/0 puis ACN/DMF : 80/20, ACN/DMF : 60/40, ACN/DMF : 0/100. Le produit (10) est récupéré avec l'éluant ACN/DMF : 90/10. LiChroprep RP-18 sont élués avec ACN/DMF : 90/10 Masse obtenue = 23 mg soit un rendement de 35%. M+H : 527,1 g.mol_1 RMN 1H (200MHz, DMSO): 1,3 à 1,75 (m, 6H, 7-8-9) ; 1,90 (qu, 2H, 16) ; 2,31 (t, 2H, 10) ; 2,48 (M, 2H, 15) ; 2.65 (M ,2H, 5) ; 2, 85 (dd ,1H, 6) ; 3,15 (M ,1H, 10) ; 4,00 et 4,40 (M, 2H, 3-4) ; 6.47 et 6.38 (s, 2H, 1-2) ; 7,64 (d ,1H, 14) ; 7,90 (dd ,1H, 13) ; 8,42 (sd ,1H, 12) ; 10,22 (s, 1H, 18) Exemple 1.5 Synthèse de l'anhydride 5-biotinehexylethylèneglycol-isatoïque (6) 12 13 16 17 20 21 H HN 7 9 11 14 15 18 19 22 24 10 L'anhydride 5-amino-isatoïque (1) (663 mg ; 3,72 mmol ; 1,0 eq) est dissout dans du DMF {18,6 mL ; 200 mM) séché coévaporé deux fois dans de l'acétonitrile poux être finalement repris dans 18,6 mL de DMF. Puis la N-méthylmorpholine NMO (409 pl ; 3,72 }mol ; 1,0 eq) et l'isobutylchloroformate (482 pl ; 3,72 pmol ; 1,0 eq) sont ajoutés au milieu après avoir refroidi à 0°c dans un bain de glace. Après 5 minutes la Biot-EG4-COOH (3) (1,831 g ; 3,72 mmol ; 1,0 eq, QuantaBio design, Powell USA, ref: 10199) est additionné sous forme de poudre. Afin d'augmenter le rendement de la réaction des ajouts successifs de réactifs sont ajoutés au cours du temps comme résumé dans le tableau 1 ci-dessous. Composé (1) NMO Isobutyl Composé (3) chloroformate T=Omin 0,663g/1,0eq 0,409mL/1,0eq 0,482mL/1,0eq 1,831g/leq T=120min 1,326g/2,0eq 0,818mL/2,0eq 0,964mL/2,0eq 1,831g/1eq T=165min 1,642g/2,5eq 1,022mL/2,5eq 1,205mL/2,5eq 1,831g/1eq T=205min 1,899g/3,0eq 1,227mL/3,0eq 1,446mL/3,0eq 1,831g/1eq Tableau 1 : détail des ajouts successifs de réactifs à la réaction permettant d'accéder au composé 6 Dans un premier temps le milieu réactionnel est trituré 5 fois dans l'acétone et 2 fois dans l'éther afin d'obtenir une poudre marron. Dans un deuxième temps La poudre obtenue est déposée sur une colonne chromatographique d'un diamètre de 4. cm et d'une hauteur de 11 cm, montée en phase inverse(silice Merck LiChroprep RP-18 (40-63pm) ref :1.13900.1000). Les produits sont élués avec un mélange, eau/DMF : 50/50. Dans un dernier temps les éluants d'interêt sont évaporés et triturés à l'éther éthylique. Masse obtenue = 447 mg soit un rendement de 18%. 15 M+H : 652,3 g . mol-1 RMN 1H (200MHz, DMSO) : 1,1 à 1,8 (m, 6H, 7-8-9) ; 2,07 (t, 2H, 10) ; 2,5 à 3 (m, 7H, 5-6-11-20) ; 3 à 3,6 (m ,16H, 12 à 19) ; 4,1 et 4,3 (M, 2H, 3-4) ; 6.4 et 6.4 (s, 2H, 1-2) ; 7,1 20 (d ,1H, 24) ; 7,8 (dd ,1H, 23) ; 8,3 (sd ,1H, 22) ; 10,2 (s, 1H, 21) ; 11,7 (s, 1H, 25) Exemple 1.6 Synthèse de l'anhydride 1-méthyl-5-biotine- hexyléthylèneglycol-isatoïque (11) 25 H 12 13 16 17 x/200 HN N~~000^/O II 11 14 15 18 19 21 22 Le produit 6 {200 mg ; 307 }mol ; 1,0 eq) est dissout dans du DMF (3,05 mL) auquel est rajouté du carbonate de potassium (89,1 mg ; 644 pmol ; 2,1 eq). Le milieu hétérogène est agité 5 minutes à température ambiante avant d'additionner l'iodure de méthyle (25 pl ; 400 pmol; 1,3 eq). Après 90 minutes d'agitation, la réaction est filtrée sur papier filtre puis le filtrat est évaporé à sec avant d'être solubilisé dans 500 pl de DMF. La solution est déposée sur une colonne chromatographique montée en phase inverse d'un diamètre de 2 cm et de hauteur 10 cm. Le produit est élué avec ACN : 1000. Les fractions sont évaporées à sec puis le solide obtenu est triturédans l'éther éthylique. Masse obtenue = 240,4 mg soit un rendement de 1000. M+H : 666, 3 g . mol-1 RMN 1H (200MHz, DMSO) : 1,1 à 1,7 (m, 6H, 7-8-9) ; 2,05 (t, 2H, 10) ; 2,5 à 3 (m, 7H, 5-6-11-20); 3 à 3,7 (m ,16H, 12 à 19) ; 3,9 (M, 3H, 25) ; 4,1 et 4,3 (M, 2H, 3-4) ; 6.38 et 6.44 (s, 2H, 1-2) ; 7,4 (d ,1H, 24) ; 7,9 (dd ,1H, 23) ; 8,4 (sd ,1H, 22) ; 10,2 (s, 1H, 21) Exemple 1.7 : Synthèse de l'anhydride 5-Cy3 isatoïque (7) Dans un ballon de 10 mL sous argon à 0°C (bain de glace), 249 mg de Cy3--COOH 4 (0,8 mmoles; 1 éq) sont mis en solution dans 3 mL de DMF. 87 pL de N-méthyl morpholine (0,794 mmoles; 1 éq) ainsi que 104 pL d' isobutyl chloroformate (0,798 mmoles; 1 éq) sont ensuite ajoutés et la réaction est laissée sous agitation à 0°C. Après 15 min, 213,1 mg de l'anhydride 5-amino isatoïque (1,196 mmoles; 1,5 éq) sont additionnés et le milieu réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante. Le suivi LC-MS (conditions 1) montre que la réaction est instantanée. Après 20 minutes de réaction, 1 éq de N-méthyl morpholine /isobutyl chloroformate sont alors ajoutés et la réaction est laissée sous agitation pendant 10 minutes afin de transformer en carbamate la totalité de l'anhydride 5-amino isatoïque. Le milieu réactionnel est ensuite évaporé, repris dans de l'éther éthylique, filtré sur fritté et enfin lavé à trois reprises avec 15 mL d'acétone afin d'éliminer l'excès d'anhydride isatoïque transformé en carbamate. Le solide rose ainsi obtenu est ensuite purifié sur une colonne de gel de silice C18 en utilisant un gradient d'éluant (H2O/DMF 75:25 puis H2O puis H20/DMF 50:50) puis séché sous vide afin d'éliminer le DMF résiduel. Le produit final est obtenu sous forme de poudre rose avec un rendement de 50 ô (339 mg; 0,4 mmoles). M+H = 791,9 g.mol-1, CCM : (H2O/DMF 8/2; révélation UV) Rf = 0,5 -40- LC/MS: condition 1: Tr = 7,4 min; A max absorption = 266,4; 518,4 et 552,5 nm; [M+H]+: 791,5. ~H RMN (500MHz, DMSO-d6) : b 1,31 (t, 3H, (3' -CH3, Jv -CH3-a' -CH2. 7Hz) ; 1,44 (m, 2H, y-CH2) ; 1,66 (m, 2H, 8-CH2) ; 1,70 (s, 12H, 2xC (CH3) 2) ; 1,77 (m, 2H, 0-CH2) ; 2,32 (t, 2H, E-CH2i J~ cx2-s-cx2 = 7Hz) ; 3,98 (m, 2H,) ; 4,15 (m, 4H, a-CH2 et a' -CH2) ; 6,52 (2d, 2H, a-CH et a'-CH vinyliques, Ja_CH-p-CH = Ja'-CH-g-CH = 13, 5Hz) ; 7,10 (d, 1H, ArH de IA, J = 8,5Hz); 7,40 (dd, 2H, H7 et H7', JH7-H4 = 4, 5Hz, JH7-H6 - 8,5Hz); 7,68 (m, 2H, H6 et H6') ; 7,76 (dd, 1H, ArH de IA, J = 2Hz, J = 8,5Hz); 7,81 (dd, 2H, H4 et H4', JH4_H5 = 1Hz, JH4_H7 = 5Hz) ; 8,29 (d, 1H, ArH de IA, J 2Hz); 8,35 (t, 1H, P-CH vinylique, Jp-CH a-CH - J 13-CH-ix' -CH 13, 5Hz) , 11,64 (s, 1H, ArS03H) . Exemple 1.8 : Synthèse de l'anhydride 1-mëthyl 5-Cy3-isataïque 15 (13} K+ -pas Dans un ballon de 25 mL, 500 mg du conjugué Cy3-IA 7 (0,63 mmoles; 1 éq) sont mis en solution dans 2,6 mL de DMH. 175 mg de K2CO3 (1,26 mmoles ; 2 éq) ainsi que 198 pL d'iodométhane 20 (3,16 mmoles ; 5 éq) sont ensuite ajoutés et la réaction est laissée sous agitation à température ambiante. Le suivi LC-MS montre que le produit de départ est totalement consommé au bout de lh. Après lh de réaction, le milieu réactionnel est évaporé à sec puis purifié sur une colonne de gel de silice -41- C18 en utilisant un gradient d'éluant (2--propanol/DMF 95:5 puis 2-propanol/DMF 50:50) puis séché sous vide afin d'éliminer le DMF résiduel. (Le produit n'étant pas soluble dans mélange 2-propanol/DMF 95:5, un dépôt solide est préparé dans le DMF). Le produit final est obtenu sous forme de poudre rose avec un rendement de 95 % (505 mg; 0,6 mmoles). Une analyse par chromatographie ionique a montré que le produit est obtenu sous forme de mono sel de potassium. M+H = 843 g.mol-1, CCM: (H20/DMF 8/2 ; révélation UV) Rf = 0,1 LC/MS: condition 1: Tr - 7,8 min ; A max absorption = 267,6; 518,4 et 551,2 nm; [M+H]+: 805,6. 1H RMN (500MHz, DMSO-d6) : ô 1,31 (t, 3H, (3' -CH3, Jv-CH3-a'-CH2 - 7Hz) ; 1,44 (m, 2H, y-CH2) ; 1,68-1,71 (m, 14H, S-CH2 + 2XC (CH3) 2) ; 1,79 (m, 2H, I3-CH2) ; 2,34 (t, 2H, s-CH2, JE-CH2-s-CH2 = 7Hz) ; 3,45 15 (s, 3H, NCH3) ; 4,16 (m, 2H, a-CH2 et a' -CH2) ; 6,66 (2d, 2H, cc-CH et a'-CH vinyliques, Ja-CH-i3-CH = Jar-CH-R-CH = 13, 5Hz) ; 7,42 (m, 3H, ArH de IA + H7 et H7') ; 7,68 (m, 2H, H6 et H6') ; 7,76 (m, 3H, ArH de IA + H4 et H4'); 8,36 (m, 2H, ArH de IA + P-CH vinylique). 20 Exemple 1.9 Synthèse de l'acide 3-(2-(2-(3-biotine-dPEG3- propanamido)éthyl)disulfanyl) propanoïque (22) 0 H H 25 La NHS-S-S-dPEG9-biotin (1,390 g; 1,849 mmol; Quanta Biodesign, Powell, USA ref: 10194) est mise en solution dans 17,56 mL de DMF {52 mM) et introduite dans un ballon de 100 mL. 17,56 mL 2968302. d'eau sont ajoutés et le milieu est placé à 75°C sous réfrigérant. Après 4 heures à cette température, le suivi LC-MS indique que la NHS-S-S-dPEG9-biotin a été complètement hydrolysée. 5 Après évaporation à sec, on obtient une huile jaunâtre visqueuse que l'on co-évapore à trois reprises avec un mélange ACN/DMF : 5 mL / 3 mL afin d'éliminer l'eau restante puis que l'on triture trois fois avec de l'éther pour le sécher et éliminer le DMF résiduel. 10 Le produit est repris dans 2 mL d'un mélange dichlorométhane / méthanol / acide acétique : 79/20/1 et déposé sur une colonne chromatographique montée en phase normale (silica gel 60, Fluka, ref : 60737) ; l'élution est effectuée avec le même mélange. Les fractions contenant l'acide 3- (2- (2- (3-biotiné-dPEG3-propanamido)éthyl)disulfanyl) propanoïque sont rassemblées et co-évaporées avec un mélange toluène/DMF : 10mL/5mL afin de les débarrasser de l'acide acétique restant puis évaporées à sec. Masse obtenue : 1,02 g soit un rendement de 84%. M+H = 655,2 g.mol-1 Exemple 1.10 . Synthèse de l'anhydride 5-(3-(2-(2-(biotine-25 dPEG3-propanamido) éthyl) disulfanyl)) propanamido) isatoïque (23) H H H L'acide 3-(2-(2-(biotine-dPEG3-propanamido)éthyl)disulfanyl) propanoïque 22 (486 mg ; 0,741 mmol ; 1,0 eq) est repris dans 30 7.42 mL de DMF (solution à 100 mm) et introduit dans un ballon bicol de 25 mL placé sous argon. Le ballon est refroidi à 0°C dans un bain de glace puis la N-méthylmorpholine (106 pL ; 0,965 mmol ; 1,3 eq) et l'isobutyl chloroformate (126 pL ; 0,965 mmol ; 1,3 eq) sont ajoutés au milieu. Après 15 minutes sous agitation à 0°C, l'anhydride 5-amino isatoïque 1 (172 mg ; 0,965 mmol ; 1,3 eq) en solution à 200 mM dans le DMF (4.82 mL) est introduit à température ambiante. Après 1 heure à température ambiante, le ballon est replacé dans un bain de glace et un second ajout de N-méthylmorpholine (106 pL ; 0,965 mmol ; 1,3 eq) et d'isobutyl chloroformate (126 pL ; 0,965 mmol ; 1,3 eq) est effectué. Après 15 minutes à 0°C, le bain de glace est retiré et 2,41 mL de la solution-mère d'anhydride 5-amino isatoique à 200 mM dans le DMF (86 mg ; 0,482 mmol ; 0,65 eq) sont ajoutés. Après 20 minutes supplémentaires sous agitation à température ambiante, la ballon est replacé dans un bain de glace et un dernier ajout de N-méthylmorpholine (106 pL ; 0,965 mmol ; 1,3 eq) et d' isobutyl chloroformate (126 pL ; 0,965 mmol ; 1,3 eq) est effectué. Après 15 minutes à 0°C, le bain de glace est retiré et la réaction laissée sous agitation pendant 30 minutes supplémentaires. Le milieu est évaporé à sec après ajout d'une spatule de silice phase inverse (silice RP18/40-63 pm, Merck LiChroprep) puis co- évaporé a trois reprises avec un mélange acétonitrile/DMF : 50/50, jusqu'à l'obtention d'une poudre marron très sèche. Le solide est alors déposé sur une colonne chromatographique de diamètre 2,5 cm et de hauteur 15 cm, montée en phase inverse (silice RP18/40-63 pm, Merck LiChroprep) et élué avec les mélanges successifs suivants : DMF/eau : 50/50 puis DMF/eau : 60/40, puis DMF/eau : 75/25 et enfin DMF/eau : 80/20. Enfin, le milieu est évaporé à sec et co-évaporé à trois reprises avec 7 mL d'acétonitrile. Le produit se présente sous la forme de cristaux orange. -44- Masse obtenue : 220 mg soit un rendement de 360. M+H = 815,3 g.mo1-1 RMN 1H (200 MHz, DMSO) . 1,0 à 1,75 (m, 7H, 11-11-12 + 1E non attribué); 2,08 (t, 2H, 13); 2,32 (t, 2H, 30) ; 2,75 à 2,85 (m, 4H, DMSO + 38) ; 2,86 (s, 8H, DMF) ; 2,82 à 2,98 (m, 9H, 6-8-17 + 2H non résolus) ; 3,02 à 3,44 (m, 11H, massif non résolu) ; 3,45 à 3,55 (m, 12H, 20-21-23-24-26-27 soit la chaîne PEG) ; 3,55 à 3,65 (m, 4H, 18-29) ; 4,22 (2m, 2H, 3-4) ; 6,43 (2s, 2H, 1-5) ; 8,0 (m, 3H, 32-15 + 1H non résolu). Exemple 1.11 . Synthèse de l'anhydride N-méthyl 5-(3-(2-(2-15 (biotine-dPEG3-propanamido) éthyl) disulfanyl)) propanamido) isatoïque (24) 0 18 0 0 Il -N~17 23 25 30 b 34 3s 14 N H aa a2 as S~ So SN 16 S 21 24 26 H 31 33 37 39 43 H 47 51 H 28 45 13 20 L'anhydride 5-(3-(2-(2-(biotine-dPEG3-propanamido)éthyl) disulfanyl)) propanamido) isatoïque 23 (50 mg ; 0,061 mmol 1,0 eq ; 2,49 mL de solution à 24,2 mM dans le DMF) est placé dans un ballon de 25 mL sous agitation dans un bain de glace. Le carbonate de potassium (9,3 mg ; 0,067 mmol ; 1,1 eq) en 25 suspension dans le DMF est ajouté immédiatement et le milieu laissé sous agitation à 0°C pendant 5 minutes. L'iodométhane (15,2 pL ; 0,244 mmol ; 4,0 eq) est alors introduit dans le milieu et la réaction laissée sous agitation à 0°c pendant 45 minutes. 30 Afin de débarrasser le produit obtenu du carbonate de potassium restant, celui-ci est déposé sur une colonne 12 19 chromatographique de diamètre 1 cm et de hauteur 10 cm, montée en phase inverse (silice RP18/40-63 }gym, Merck LiChroprep) et élué avec 100% d'acétonitrile. Après évaporation à sec du milieu, le produit est trituré à 5 quatre reprises avec 5 mL d'éther. Le produit se présente alors sous la forme de paillettes jaunes. Masse obtenue : 55,7 mg (l'excès de masse est dû à la présence de DMF piégé dans le produit final). M+H : 829, 3 .mol-1 RMN 1H {200 MHz, DMSO) : 1,2 à 1,75 (m, 6H, 23-24-25); 2,085 (t, 2H, 26) ; 2,338 (t, 2H, 43) ; 2,5 à 2,7 (m, 2H, 51) ; 2,75 à 2,95 (m, 24H, 55-19-47-50 + 16H non attribués - possiblement 15 dus au DMF) ; 3,05 à 3,30 (m, 6H, 19 et 5H non attribués) ; 3,3 à 3,7 (m, 41H, 21-46 et 30-31-33-34-36-37-39-40-42 (chaîne PEG) + 20H non attribués possiblement dus à l'eau résiduelle) ; 4,150 et 4,319 (m, 2H, 16-17) ; 6,418 (d, 2H, 14-18) ; 7,477 (d, 1H, 11) ; 7,887 (t, 1H, 45) ; 7,976 (m, 3H, 20 13 + 2H non attribués possiblement dus au DMF) ; 8,091 (t, 1H, 28) ; 8,363 (d, 1H, 12) ; 10,389 (s, 1H, 9). NB : un total de 95 protons au lieu des 58 attendus pour cette molécule sont détectés. Les protons supplémentaires forment 25 trois massifs principaux et correspondent à l'eau et au DMF respectivement. Exemple 2 : Synthèse de dérivés de l'anhydride isatoïque 30 conjugués à un groupement d'intérêt porté par l'azote intracyclique de l'anhydride isatoïque 10 Il est illustré dans cet exemple, l'évaluation d'un autre site de fonctionnalisation de l'anhydride isatoïque, qui ne serait pas sur le cycle aromatique. Nous avons choisi pour cela d'utiliser la réaction d'alkylation du NH intracyclique de l'anhydride isatoïque, décrite précédemment, pour y conjuguer une molécule d'intérêt. Ainsi cette position peut être alkylée par un dérivé electrophile d'un composé d'intérêt, comme un dérivé halogéné de la biotine par exemple comme il est décrit sur la Figure 4. L'iodoacetyl-LC--Biotine 17 ou le composé biotinylé 20 est mis en réaction avec l'anhydride isatoïque 1 en présence de K2CO3 ou de DIPEA pour former, par alkylation du -NH-, le composé biotinylé 18 ou 21. Cette méthode ne se limite pas à l'anhydride isatoïque non substitué, il est en effet possible de moduler la réactivité de la partie anhydride isatoïque vis-à-vis de nucleophiles (comme par exemple les hydroxyles 2'OH) en substituant de façon appropriée le cycle aromatique. Il est ainsi décrit dans la référence de Weeks 2008 JACS pages 8884 qu'un nitro IA Me a une réactivité environ 40 fois supérieure à celle de l'IA Me en raison de l'effet attracteur du NO2. L'homme du métier à ainsi une notion très précise des groupements substituants à utiliser pour augmenter ou abaisser ainsi la réactivité de l'anhydride isatoïque. De façon à illustrer l'effet de la substitution de la partie aromatique sur la réactivité de l'anhydride isatoïque, il est décrit dans cet exemple la synthèse du composé N(Biot PEG2) acétamido IA (19) par réaction de la iodoacétyl-PEG2-Biotine (17), avec le 5-acétamido IA (16) (synthétisé par acétylation du 5-amino IA 15). A noter qu'il serait également possible que l'anhydride isatoïque couplé à la molécule d'intérêt soit synthétisé par construction d'un antranylate convenablement fonctionnalisé puis par fermeture de l'anhydride isatoïque avec un équivalent du phosgène. Exemple 2.1 Synthèse de l'anhydride 1-biotineéthylèneglycol-isatoïque (18) 23 21 22 12 15 1~\/NH 18 H 13 14 17 11 7 9 L'anhydride isatoïque 15 (45,1 mg ; 276,6 umol ; 3,0 eq) est 10 dissout dans du DMF (460 pl ; 600 mM). Le carbonate de potassium (38,2 mg ; 276,6 umol ; 3,0 eq) est mis en suspension dans ce mélange. Après 5 minutes d'agitation au vortex à 1000 tr/min, le dispositif est placé en chambre froide â 4°C avant d'additionner l'iodoacétyl-PEG2-biotine 17 (50 mg ; 92,2 pmol ; 1,0 eq, Pierce-Thermoscientific, Whaltham, USA) en solution dans le DMF (730 pl ; 126 mM ; 1,3 eq). Après 90 minutes, l'iodoacétyl-PEG2-biotine a disparu, la réaction est terminée. Le tube est centrifugé et le surnageant récupéré. Le culot est lavé deux fois avec 200 pl de DMF. Les surnageants sont assemblés et une spatule de silice RP18 est ajoutée avant d'évaporer à sec le solvant. La poudre obtenue est purifiée par chromatographie en phase inverse sur une colonne d'un diamètre de 1 cm et d'une hauteur de 10 cm. L'éluant est un mélange eau/ACN/DMF :79/20/1. Masse obtenue = 11,8 mg soit un rendement de 22 % (pureté d'environ 60 %) M+H : 578,2 g.mol Exemple 2.2 . Synthèse de l'anhydride 5-acétamido-isatoïque 5 (16) L'anhydride 5-amino-isatoïque (740 mg ; 4,15 mmol ; 1,0 eq) est dissout du DMF (21 ml ; 200 mM) et agité pendant deux minutes avant d'additionner de l'anhydride acétique (395 pl ; 10 9,15 mmol ; 1,0 eq). Après 3 heures et 40 minutes, la réaction est terminée. Le produit formé est précipité dans 210 ml d'eau puis essoré sur un fritté de porosité 3. Le résidu obtenu est ensuite séché à l'étuve. Masse obtenue = 753 mg soit un rendement de 82,4 15 M+H : 221,0 g.mol-1 Exemple 2.3 Synthèse de l'anhydride 1-biotine-diethylèneglycol-5-acetamido-isatoïque {19) N 20 191y0 7 9 6 12 15 16 NQQ---'-"-,NH 18 8 10 H 13 14 17 11 20 L'anhydride 5-acétamido-isatoïque (49,5 mg ; 224,8 pmol ; 2,5 eq) est pesé dans flacon de 8 ml, auquel le carbonate de _49_ potassium ( 82, 1 mg ; 594 }mol ; 6,6 eq) est rajouté. A ce mélange est ajouté le DMF (2,65 ml ; 100 mM). Le milieu est agité deux minutes puis placé à -25°C. Parallèlement une solution de iodoacétyl-PFG2-Biotine (Pierce-Thermoscientific, Whaltham, USA) {48,6 mg ; 89,6 }mol ; 1,0 eq) est préparée dans le DMF (895 pl). La solution iodoacétyl-PFG2-Biotine est ajoutée dans le milieu réactionnel et agité au vortex pendant 16 heures à 800 tr/min à 4°C en chambre froide. Le milieu réactionnel est filtré sur papier et le filtrat est purifié par chromatographie phase inverse avec dépôt solide. La colonne a un diamètre de 1 cm et une hauteur de 10 cm. L'éluant est un mélange eau/ACN : 80/20. Masse obtenue = 15 mg soit un rendement de 10,5 ô (pureté inférieure à 50 m. MI-H : 635.2 g.mol-1 Exemple 2.4 Synthèse de la N- (biotine-dPEG3--propyl) -6-bromohexanamide (20) 15 28 11 13 H 17 21 23 27 H 10 12 1114 18, 18 20 24 28 28 0 Dans un ballon de 50 mL, 317 mg d'acide 6-bromo caproïque (1,624 mmol ; 1,3 eq) sont co-évaporés deux fois successives avec 5mL de DMF. L'acide 6-bromo caproïque est repris dans 20 mL de DMF (81,2 mM) et transféré dans un ballon bicol de 100 mL sous argon. La N-méthylmorpholine (316 pL ; 2,873 mmol ; 2,3 eq) et l' isobutyl chloroformate (212 pL ; 1,624 mmol ; 1,3 eq) sont ensuite ajoutés au milieu après avoir refroidi à O °C dans un bain de glace. Après 5 minutes à o°C sous agitation, la Biotin-dPEG3-NH3+-TFA (0,7 g ; 1,249 mmol ; 1,0 eq, Quanta Biodesign, Powell, USA, ref : 10193) en solution dans 6,235 mL s 32 34 ss -50- de DMF (200 mM) est ajoutée au milieu à température ambiante. Après 30 minutes sous agitation, le contenu du ballon est évaporé à sec et co-évaporé à deux reprises avec 10 mL d'acétonitrile. On obtient alors 1,332g d'une huile jaunâtre et très visqueuse, reprise dans 30 mL de dichlorométhane. La phase organique est lavée à deux reprises avec 20 mL de HC1 à 10 mM afin d'évacuer 1a Biotin-dPEG3-NH3+-TFA- résiduelle, puis à deux reprises avec 20 mL de solution de NaHCO3 saturée, et enfin à deux reprises avec 20 mL de NaCl (saumure). Après évaporation du dichlorométhane, on obtient 434 mg d'un solide qui est repris dans 3 mL de dichlorométhane et déposé sur une colonne chromatographique d'un diamètre de 3 cm et d'une hauteur de 15 cm, montée en phase normale (silica gel 60, Fluka, réf : 60737, Saint Louis , USA). Les produits sont élués avec un mélange dichlorométhane / méthanol : 80/20 à la vitesse de 5 cm/min, ce qui permet de se débarrasser de l'un des trois coproduits formés au cours de la réaction. On obtient 306 mg d'une huile jaunâtre très visqueuse après évaporation à sec. Celle-ci est triturée à l'éther à trois reprises jusqu'à obtenir une poudre blanche. Masse obtenue : 120 mg soit un rendement de 15%. M+H : 623,3 g.mol l Analyse RMN 1H (200 MHz, DMSO) : 1,25 à 1,9 (m, 18E, 10-11-12-32-33-34-35-17-27) ; 2,07 (t, 4H, 13-32) ; 3,0 à 3,2 (m, 5H, 8-16-28) ; 3,25 à 3,60 (m, 14H, 18-20-21-23-24--26-36) ; 4,1 à 4,4 (m, 2H, 3-4) ; 6,4 (2s, 2H, 2-5) ; 7,8 (m, 2H, 15-29). Exemple 2.5 Synthèse de l'anhydride N-(N-(biotine-dPEG3-propyl)-6-bromohexanamide) isatoïque (21} 30 H La N-(biotine-dPE03-propyl)-6-bromohexanamide ((20) ; 280 mg ; 0,449 mmol ; 1,0 eq) et l'anhydride isatoïque (15) ; 110 mg ; 0,674 mmol ; 1,5 eq) sont coévaporés à deux reprises au DMF et repris dans 2 mL de DMF. Les deux réactifs sont introduits dans un ballon de 25 mL et le milieu est évaporé à sec. Le ballon est placé sous réfrigérant et chauffé à 120 °C avant ajout de la N-éthyldiisopropylamine (768 pL ; 5,467 mmol ; 12,2 eq). Le milieu vire rapidement au jaune vif. Après 45 minutes à 120°C, le pH du milieu est ramené de 9 à une valeur comprise entre 5 et 6 par des ajouts successifs d'HC1 à 0.015N, afin d'éviter l'ouverture de l'anhydride isatoïque favorisée en milieu basiqueLe produit est ensuite déposé sûr une colonne de diamètre de 1,5 cm et de hauteur 15 cm montée en phase inverse (silice RP18/40-63 pm, Merck LiChroprep). L'élution est effectuée avec les mélanges suivants : ACN/eau : 10/90, puis ACN/eau : 25/75 et enfin ACN/eau : 50/50. Masse obtenue : 37 mg soit un rendement de 11,6%. M+H : 706,3 g.mol-1 Exemple 3 : Démonstration de la réactivité d'un dérivé de l'anhydride isatoïque conjugué à la cyanine 3 (Cy3 IA Me, 13), vis-à-vis d'un oligoribonucléotide (ORN) modèle de 27 bases. Mesure de la réglo-spécificité de l'acylation et du taux de fonctionnalisation Nous évaluons la réactivité de dérivés de l'anhydride isatoïque vis-à-vis de l'ARN et démontrons donc la fonctionnalisation sélective d'un ORN modèle de 27 bases (seq : 5'-AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU-ACA-3' Eurogentec, Liège, Belgique). Pour cela une quantité fixe d'ORN est mise en réaction avec un dérivé de l'anhydride isatoïque conjugué à une molécule d'intérêt (Cy3 IA Me (13)), dans diverses conditions de température, de durée, de milieu réactionnel_ Un suivi HPLC de la réaction à 260 nm permet de détecter la disparition du pic correspondant à l'ORN initial et l'apparition de pics correspondants à l'ORN acylé. Ces produits ont un temps de rétention supérieur et ont un spectre d'absorption correspondant à la fois à celui de l'ORN et à celui du marqueur fluorescent. L'apparition de ces pics est donc en soit même la démonstration de la fonctionnalisation de l'ORN. Cependant pour plus de précision sur le site de fonctionnalisation et pour évaluer précisément le taux de fonctionnalisation (Tf) la population d'ORN (marquée et non marquée) est séparée de l'excès de marqueur par précipitation à l'acétone/perchlorate de lithium ou par pérméation de gel (NAP 5' , GE Health Care. Puis, les ORN ainsi obtenus sont soumis à une hydrolyse à la nucléase P1 (Aldrich, Saint Louis, USA) et à la phosphatase alcaline (Aldrich, Saint Louis, USA) afin d'hydrolyser les liaisons phosphate diester de l'ORN. Une analyse LC-MS (chaîne chromatographique couplée à un spectromètre de masse) de ce mélange permet alors de caractériser et d'identifier plusieurs populations comme décrit sur la Figure 5: les ribonucleosides non marqués les adduits mono-nucléosidiques marqués qui se différencient très nettement par un temps de rétention -53- plus élevé et par un spectre UV caractéristique des acides nucléiques et du marqueur (dans le cas du Cy3 par exemple) - des dinucléotides acylés en 2' qui en raison du groupement antranylate substitué par le groupement d'intérêt en 2' ne peuvent être clivés par la nuclease P1. La résistance aux nucléases du lien phosphate diester, quand un groupement volumineux est introduit en 2', est bien connue de l'homme du métier. - des trinucléotides ou quadrinucléotides 2'OH per-acylés qui peuvent théoriquement se former mais qui sont statistiquement très peu représentés (car il faudrait alors qu'il y ait deux ou trois acylations du 2'OH consécutives), ne sont pas recherchés. A noter que le dérivé 5'0 acylé n'est que très peu représenté et n'est pas visible comme décrit par Servillo (Eur. J.Biochem. 1993 583-589. La détection de ces différents adduits nucléosidiques ou nucléotidiques marqués permet de démontrer la fonctionnalisation, sur les hydroxyles en 2' et sur l'extrémité de l'ORN (position 3' et 2'). Le taux de de fonctionnalisation de l'ORN (Tf) est évalué par la mesure: - de l'aire correspondant aux adduits mono-nucléosidiques 25 terminaux (fonctionnalisés en 2' et en 3') et de l'aire correspondant aux di-nucléotides acylés (fonctionnalisés en interne sur le 2'OH) - comparée à l'aire des pics correspondant aux quatre ribonucléosides. 2968302 La régio-spécificité externe/interne de l'acylation est évaluée par la mesure de la proportion relative des aires correspondant aux : - mono-nucléosides terminaux acylés en 2' et en 3' 5 et di-nucléotides acylés en interne sur le 2'OH qui sont aisément repérables par HPLC. La mesure du taux de de fonctionnalisation de l'ORN et de la régio-spécificité externe/interne de l'acylation sont décrit sur la Figure 6 {Tracé A : ORN natif de 27 bases. Tracé B : 10 ORN fonctionnalisé avec le composé 13 et précipité. Tracé C : ORN fonctionnalisé avec ledit composé 13, précipité et hydrolysé enzymatiquement. Tracé D : Aggrandissement du tracé C avec la recherche des aduits nucléosides ou nucléotides fonctionnalisés (le pic 1 correspond respectivement aux 15 dinucléotides acylés (42%),les pics 2 et 3 aux nucléosides acylés en 2' ou en 3' (58o) et le pic 4 aux nucléosides acylés en 2' et en 3'. Le * représente un dinucléotide ou un nucléoside fonctionnalisé avec une molécule de Cy3-NMe anthranylate. L'ensemble des pics 1, 2, 3 et 4 permet de 20 mesurer le taux de fonctionnalisation). Mode opératoire : Dans une expérience type, l'équivalent de 8 nmol d'un ORN de 27 bases (5`-AAC-CGC-AGU-GAC-ACC-CUC-AUC-AUU- ACA-3' (Eurogentec, Liège, Belgique) en solution dans l'eau sont préalablement séchés à l'évaporateur centrifuge (ROT 60, Jouan, St Herblain, France) dans un tube Ependorf en plastique de 2 mL. On rajoute alors au résidu sec 40 pl d'eau, afin de solubiliser l'ORN, puis 20 pl d'une solution tamponnée (dans l'exemple une solution tampon de Triéthyl ammonium d'acétate, pH 7, 1M Aldrich, St Louis, USA réf :09748-100m1) et enfin 20 Hl d'une solution d'un dérivé de l'anhydride isatoïque fonctionnalisé avec un groupement d'intérêt à 120 mM dans le DMSO (soit la molécule Cy3 1A Me (13)) dans cet exemple). Le mélange est mis à incuber 60 minutes à 65°C dans une étuve sur un portoir pré-équilibré en température. Une injection en HPLC (conditions 3) permet de contrôler la formation d'une certaine quantité d'ORN acylé comme décrit sur la Figure 6. Pour éliminer les sels et l'excès de marqueur, le mélange est ensuite purifié sur gel Sephadex NAP 5 (GE Health Care, Uppsala, Suède» et/ou triple précipitation dans 1,2 mL d'un mélange Acétone/LiC104 180 mM 75/25. Pour finir le culot est séché à l'acétone et est évaporé à l'évaporateur centrifuge (ROT 60, Jouan, St Herblain, France). Le résidu est alors repris dans 33 pl d'une solution H20/DMSO 85/15 et une injection HPLC (conditions 3)est pratiquée afin de vérifier la bonne élimination du marqueur. On ajoute au mélange 2 pl de nucléase Pl (réf. : N8630 Sigma-Aldrich, St Louis , USA) en solution à 1 U/pl dans son tampon : acétate de sodium 20 mM pH 5,5; ZnC12 1 mM; NaCl 50 mM et 1 Hl de phosphatase alcaline à 7 u/pl dans l'eau (Réf. P7923-2KU Sigma-Aldrich, St Louis , USA). Le milieu est laissé à température ambiante pendant 4 à 6 heures. Une injection est alors réalisée en HPLC (conditions 3) afin de vérifier l'hydrolyse totale de l'ORN et afin d'analyser la nature des fragments obtenus conformément à ce qui a été décrit précédemment et comme décrit sur la Figure 6. 1- Résultats : L'analyse LC-MS d'un chromatogramme caractéristique de cet exemple permet d'identifier les différents types de produits répertoriés ci-dessous (Conditions HPLC 3): Les ribonucléosides Cytosine (C), Uracyl (U), Guanine (G) et Adénine (A) non acylés (Rt de 1,5 - 5 min) facilement identifiables par spectrométrie de masse et par leur profil UV. Leur présence s'explique par le fait que l'ORN ne subit qu'une acylation ménagée qui n'acyle pas tous les nucléosides. La nucléase Pl peut alors cliver les liens entre nucléosides non acylés. - Les dinucléotides acylés en 2' qui, étant insensibles à l'action de la nucléase Pl, possède un temps de rétention plus élevé (Rt de 11,8 - 12,5 min). Ils sont identifiables par spectrométrie de masse et par UV grâce à la bande d'absorption caractéristique de l'anthranylate , du nucléoside et du Cy3 (respectivement 260, 360 et 550 nm). La séquence de l'ORN servant de modèle étant la suivante : 5'-AAC-CGC-AGU-GAC-ACCCUC-AUC-AUU-ACA-3', il est important de comprendre qu'après marquage ménagé et hydrolyse de l'ORN, on peut seulement obtenir un certain nombre de dimères qui sont dépendants de 1a séquence. Ainsi, en se déplaçant sur la séquence de l'ORN, il est prévisible de détecter les dimères 2'-acylés : 5'-AA, AC, CC, CG, GC, CA, AG, GU, UG, GA, AC, CA, AC, CC, CC, CU, UC, CA, AU, UC, CA, AU, UU, UA, AC et CA-3'._La paire de bases GG ne pouvant être trouvée dans la séquence, elle ne sera effectivement pas trouvée en LC-MS. 3- Le riboadénine acylée en 2', en 3' ou sur les deux positions 2' et 3', qui possède un temps de rétention encore plus élevé (Rt de 12,7 - 13,8 min), car ne possédant pas de lien phosphate diester. Ces adduits sont identifiables par spectrométrie de masse et par UV grâce à la bande d'absorption caractéristique du nucléoside, de l'anthranylate et du Cy3 (respectivement 260, 360 et 550 nm). Le fait que l'on ne détecte qu'un seul type de nucléoside marqué (rA seulement) indique que le lien phosphate diester est parfaitement stable si le groupement 2'--OH est acylé avec un dérivé de l'anhydride isatoïque. En effet, s'il était sensible à l'hydrolyse par la nucléase P1 on formerait les quatre adduits nucléosidiques marqués en raison du marquage aléatoire sur l'ensemble de la chaîne oligo-ribonucléotidique. La présence de l'adduit rA acylé s'explique donc par le marquage du nucléoside situé à l'extrémité 3' de l'ORN (rA) qui est détaché du reste de la chaîne lors de l'hydrolyse avec la NPI. Une recherche spécifique, par spectrométrie de masse, de la masse de tous ces fragments additionnée de la masse de l'anthranylate lié au Cy3 permet effectivement de démontrer leur formation comme indiqué sur les Figures 6 et 7. S Le taux de fonctionnalisation est évalué en UV à 260 nm par intégration des massifs correspondants aux dinucléotides acylés et aux nucléosides-acylés) par rapport aux massif correspondant aux quatre ribonucléosides. On évalue de la même manière le ratio de la population des dinucléotides-acylés par 10 rapport à la population des nucléosides- acylés afin dévaluer le pourcentage de fonctionnalisation sur l'extrémité 3'terminale. Remarque Les valeurs de taux de fonctionnalisation, présentées dans le cadre de cette invention, tiennent compte 15 du facteur de correction qu'il faut apporter en fonction du coefficient d'extinction molaire à 260 nm de chacun des nucléosides et selon qu'il s'agit de nucléosides ou de dinucléotides. Ainsi les aires mesurées sont corrigées en fonction . des epsilon molaires à 260 nm de rC, rU, rG et rA au niveau nucléosides non acylés, d'une valeur moyenne des epsilon molaires à 260 nm de 5'AA, AC, CC, CG, GC, CA, AG, GU, UG, GA, AC, CA, AC, CC, CC, CU, UC, CA, AU, UC, CA, AU, UU, UA, AC et CA 3' au niveau dinucléotides acylés, et de l'epsilon molaires à 260 nm de rA au niveau des mononucléosides acylés (voir Tableau 2). 20 25 Epsilon moyen des mononucléosides et dinucléotides Epsilon molaire Epsilon pondéré en fonction de la (mol-` - l - cm-' ) séquence de l' ORN {mol-i 1 cm i ) rA 13700 rC 7300 rG 10800 rU 8400 AA 27400 27400 AC*9 21000 189000 CC*3 18100 54300 UG*2 19200 38400 CC*3 14600 43800 AG*2 24500 49000 UU 16800 16800 AU*3 22100 66300 UC*3 15700 47100 Total dimères = 27 Moyenne Epsilon dinucléctide 19707 pondérée Tableau 2 : Valeur des epsilons molaires des différents mono- nucléosides et di-nucléotides acylés formés lors de l'hydrolyse enzymatique d'un ORN fonctionnalisé par le Cy3 IA 5 Me (13) Discussion et conclusion : On évalue le taux de fonctionnalisation corrigé à 4,5% et la réglo-spécificité externe/interne de l'acylation à 58/42 (voir Tableau 3 dans l'exemple 5 ci--après au niveau de l'entrée 7). Cela signifie 10 que dans ces conditions environ cinq nucléosides seront marqués en moyenne toutes les 100 bases, soit un marqueur toutes les 20 bases. Cela est parfaitement en accord avec les taux de marquage recommandés pour respecter un compromis entre un nombre de marqueur suffisant pour une bonne détection et 15 une hybridation non impactée par un trop grand nombre de groupements encombrants. De même un ratio de 58/42 indique que l'extrémité 3' est trente-six fois plus réactive que les positions en 2' (0, 58x1) / (0, 42/26) . Ceci est en accord avec les données de la littérature qui démontre une réactivité supérieure de l'extrémité 3' (Nawrot Nucleosides and Nucleotides 1998 815-829). Avec cet exemple, nous démontrons la fonctionnalisation d'un ORN par un dérivé fluorescent de l'anhydride isatoïque. Exemple 4 : Démonstration, par une technique de spectrométrie de masse MALDI Tof, de la fonctionnalisation par le Cy3 IA Me (13} d'un ORN de 27 bases. Objectif . Nous démontrons qu'un ORN mis en réaction avec un dérivé de l'anhydride isatoïque, le Cy3 IA Me (13), conduit bien à un ORN acylé portant plusieurs adduits Cy3-anthranylates. Mode opératoire: On suit exactement le même protocole que dans l'exemple 3 mais l'ORN est fonctionnalisé soit avec 15 mM soit avec 30 mM de Cy3 IA Me (13) afin de donner respectivement des taux de fonctionnalisation corrigés de 2,6 et de 4,2%. Une partie des ORN fonctionnalisés et non hydrolysés est mélangée avec un mélange d'acide 3-hydroxy picolinique et de citrate de diammonium en proportions 9/1 puis analysé par spectrométrie de masse MALD1 TOF (Bruker, Billerica, Massachusetts, USA). L'analyse des spectrogrammes permet alors de détecter des adduits M+H à 8519,21 ; 9281,14 et 10043,07 dalton qui correspondent respectivement à l'ORN et à l'ORN fonctionnalisé une et deux fois avec un adduit anthranylate-Cy3 (Figure 8). -6o- 5 Les chiffres sont exprimés en Dalton. Le tracé 1 correspond à l'analyse de l' ORN seul et les tracés 2 et 3 correspondent au même ORN fonctionnalisé avec respectivement 15 et 30 mM du composé 13. Résultats et conclusion : Ceci est la preuve directe que les dérivés de l'anhydride isatoïque réagissent sur l'ORN et que le nombre d'adduits IO dépend de la concentration en réactif de fonctionnalisation. La nature chimique d'un ORN étant strictement la même qu'un brin d'ARN nous pouvons être certain qu'un brin d'ARN sera fonctionnalisé de la même manière comme cela est démontré par ailleurs dans les exemples 9 et 12 de cette demande 15 d'invention. Exemple 5 : Démonstration de la réactivité d'autres dérivés de l'anhydride isatoïque conjugués à des molécules d'intérêt, vis-à-vis d'un oligoribonucléotide «MM) modèle de 27 bases. 20 Mesure du taux de fonctionnalisation. Objectif : Démontrer la réactivité d'autres dérivés de l'anhydride isatoïque conjugué à une molécule d'intérêt c'est-à-dire : 25 - le 5Biot IA 5, le 5Biot IA Me 9, le 5Biot IA S03- 10, le 5Biot PEG4 IA 6, le 5Biot PEG9 IA Me 11 30 le Cy3 IA 7, - le Cy3 IA Me 13, -61- le N(Biot PEG2) IA 18, le N(Biot PEG2) acétamido IA 19, le N(Biot PEG4) IA 21 le 5Biot PEG4 SS IA 23, et - le 5Biot PEG4 SS IA Me 24, vis-à-vis d'un ORN modèle de 27 bases, ce en suivant le protocole de marquage décrit dans l'exemple 3. Mode opératoire : Brièvement ; on incube un ORN de 27 bases (8 nmoles) pendant 1 heure à 65°C en solution avec l'un ou l'autre des composés 5, 9, 10, 6, 11, 7, 13, 18, 19, 21, 23, ou 24 à 30 mM en présence de TEAAc pH 7 à 250 mM et de DMSO à 25 % dans le mélange. L'ORN marqué est ensuite purifié et traité comme dans l'exemple 3. On en tire le Tableau 3 ci-dessous, qui indique le taux de fonctionnalisation et la régio-spécificité externe/interne de l'acylation , en fonction des différents dérivés de l'anhydride isatoïque. La solubilité de certains de ces composés a également été déterminée en suivant le même protocole que dans la précédente demande de brevet déposée par la Demanderesse et publiée sous le numéro : WO-A-2010/012949. Entrée Composés Pureté Solubilité Tf Regio- Nb HPLC (o) dans l'eau (*) spécificité exp (Max plot) (mM) externe / interne(**) 1 5Biot IA 5 52 1 1,2 - 1 2 5Biot IA Me 95 0 2,6 55/45 4 9 3 5Biot IA 60 nd 1,6 60/40 2 S03 10 4 5Biot PEG4 85 19 3,3 62/38 2 IA 6 SBiot PEG4 85 50 4 60/40 1 IA Me 11 6 Cy3 IA 7 97 » 100 2,6 61/39 1 7 Cy3 IA Me 13 96 » 100 4,5 58/42 2 8 N(Biot 43 nd 3,4 56/44 1 PEG2)IA 18 9 N(Biot PEG2) 42 nd 1,2 50/50 1 acétamido IA 19 10 N(Biot PEG4) 25 nd 0,7 49/51 2 IA 21 11 SBiot PEG4 94 nd 3,1 52/48 3 SS IA 23 12 SBiot PEG4 85 nd 2,8 62/38 3 SS IA Me 24 (*) = Tf corrigé (%) comme décrit dans l'exemple 3 (**) = Ratio non corrigé entre l'aire correspondant aux mononucléosides acylés et celle correspondant aux dinucléotides acylés (s) comme décrit dans l'exemple 3 Tableau 3 : Taux de fonctionnalisation corrigé et régio- spécificité externe/interne de l'acylation d'un ORN de 27 bases ayant réagit avec différents dérivés de l'anhydride isatoïque. Discussion et conclusion : On démontre comme dans le cas du composé Cy31AMe 13 de l'exemple 3, que d'autres dérivés de l'anhydride isatoïque diversement conjugués à des molécules d'intérêt réagissent avec un ORN pour donner après hydrolyse des nucléosides ou des di-nucléotides acylés. On démontre ainsi 1a fonctionnalisation de l'ORN avec un Tf compris entre 0,7 et 4,5 ce qui nous le rappelons est amplement suffisant pour des applications de marquage par exemple puisque l'on cherche seulement à avoir de un à quelques marqueurs toutes les 100 bases. On démontre, d'une façon générale, que la méthylation de l'azote intracyclique de l'anhydride isatoïque double le rendement de fonctionnalisation (entrées 1 et 2) dans le cas de la biotine et (entrées 6 et 7) dans le cas du Cy3. Dans d'autres cas, le rendement n'est pas doublé mais au moins amélioré (entrées 4 et 5) dans le cas de la biotine PEG4. Curieusement ce n'est pas le cas pour les dérivés 5 Biot PEG4 SS TA et 5 Biot PEG4 SS IA Me. Nous expliquons cela par la nature du groupement d'intérêt porté par l'IA qui aurait un effet sur sa réactivité. On démontre également que, d'une façon générale, et quels que soient les dérivés de l'anhydride isatoïque le ratio mononucléosides marqués/dinucléotides marqués reste proche de 60/40 (entrées 1 à 12). Cela prouve que l'extrémité 3' terminale est beaucoup plus réactive que les groupements 2'-OH en interne et que les molécules d'intérêt conjuguées à l'anhydride isatoïque ne modifient pas la régio-spécificité. La plus grande réactivité de l'extrémité 3' terminale est attribuée à la présence du cis-diol 2', 3'. A noter que ce ratio est légèrement surévalué en faveur du marquage interne car nous n'apportons pas la correction des epsilons dans ce calcul. A titre d'information et de façon générale une régio- sélectivité de l'acylation externe/interne de 60/40 non corrigée devient égale à 70/30 après correction de l'Epsilon. Par contre la conjugaison d'une molécule d'intérêt sur le -NH- intracyclique de l'anhydride isatoïque, comme décrit dans l'exemple 2, semble montrer une augmentation du marquage en interne (entrées 8, 9 et 10). Il apparaît donc que le site de conjugaison de la molécule d'intérêt à l'anhydride isatoïque ait un impact sur la réglo-spécificité de l'acylation, de même -64- que sa taille et sa charge (basé sur des résultats non communiqués dans cette demande de brevet). Exemple 6 : Démonstration de la chémo-sélectivité ARN vs ADN de dérivés de l'anhydride isatoa.que conjugués à un groupement d'intérêt (5-biot IA Me 9, Cy3 IA Me 13 ou 5-Biot PEG4 SS IA Me) Objectif : Afin de démontrer la sélectivité de fonctionnalisation de l'ARN vis--à-vis de l'ADN, un test comparatif a été effectué entre un ODN de 53 bases et un ORN de 27 bases soumis à l'action d'un des dérivés de l'anhydride isatoïque, 5-biot IA Me 9, Cy3 IA Me 13 ou 5-Biot PEG4 SS IA Me 24. Mode opératoire : 8 nmoles d'ODN de 53 bases : Seq . 5'-AATTCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-GTG-CTA-TGT-CAC-TTC-CCC--TTG-TTCTCT-CA-3 ' (Eurogentec, Liège, Belgique) ou 8 nmoles d'un ORN de 27 bases : Seq : 5' -AAC-CGC-AGU--GAC-ACC--CUC--AUC-AUU-AGA-3' , Eurogentec, Liège, Belgique) sont mis en réaction avec les composés 9 ou 13 ou 24 à 30 mM dans un mélange DMSO/tampon TEAAc (250 mM pH 7) 25/75 pendant 1h à 65°C. Après précipitation à l'acétone et hydrolyse avec la nucléase Pl et la phosphatase alcaline, les fragments hydrolysés sont analysés par LC-MS, comme décrit dans l'exemple 3. Un exemple des chromatogrammes de suivi de la réaction de l'ADN ou de l'ORN avec le composé 13, est représenté sur la Figure 9 où les tracés A, B et C représentent respectivement l'ORN, l'ORN fonctionnalisé avec le composé 13 et précipité, et l'ORN fonctionnalisé avec 13, précipité et hydrolysé. Les tracés D, E et E reppésentant la même chose mais avec l'ODN Résultats et conclusion : Le taux de fonctionnalisation corrigé de l'ORN est évalué à 4,5 % avec le marqueur 13, à 2,6 % avec le marqueur 9, et à 2,8% avec le marqueur 24 alors que celui de l'ODN est évalué à o,1% dans les trois cas. Dans ces conditions expérimentales, l'ADN est très peu fonctionnalisé ce qui confirme la sélectivité de fonctionnalisation des dérivés de l'anhydride isatoïque pour l'ARN et l'absence de réactivité sur les bases. En effet si les bases réagissaient sur les dérivés de l'anhydride isatoïque, on aurait la formation d'adduits nucléosidiques anthranylates après réaction avec l'ODN. A noter que les 0,1 % de fonctionnalisation de l'ODN proviennent d'une très faible réactivité des extrémités 5'-OH et 3'-OH de l'ADN (voir à ce propos Nawrot Nucleosides and Nucleotides 1998 815-829). Cet exemple démontre la chémo-spécificité de dérivés de l'anhydride isatoïque conjugués à des molécules d'intérêt pour un ORN par rapport à un ODN. La présence de groupements 2'-OH sur l'ORN, alors qu'il n'y en a pas sur l'ODN, est à l'origine de la réaction chémo-spécifique sur l'ORN. Exemple 7 : Démonstration de la détection sur puce à ADN Affymetrix d'oligoribonucléotides fonctionnalisés par le 5Biot 25 IA Me (9) ou par le 5Biot PEG4 IA Me (11) Objectif : Nous démontrons que des oligoribonucléotides biotinylés par réaction avec le 5Biot IA Me (9) ou par le 5Biot PEG4 IA Me (11) deviennent détectables sur une puce à 30 ADN (GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array, ref 900470, Affymetrix, St Clara, USA). Mode opératoire : Quatre oligo-ribonucléotides synthétiques de 30 bases (Eurogentec, Seraing, Belgique), correspondant respectivement à une partie des séquences des gènes de ménage DAP3_P2, GAPDH P15, HSA P12 et LYS3 P7 détectés par une puce à ADN U133 Plus 2.0 (Affymetrix, St Clara, USA) sont chacun mis en solution dans l'eau à 6 NM (24 pM au total). On prend 42 pl de la solution des quatre ORN qui sont alors mélangés à 42 pl d'une solution de phosphate de potassium (pH7, 1M) de 42 pl d'eau ultrapure et de 42 pl des composés 5Biot IA Me (9) ou 5Biot PEG4 lA Me (11) en solution dans le DMSO à 120 mM. On laisse incuber 60 min dans une étuve à 65°C, puis 5 min dans de la glace. De manière à éliminer l'excès de réactif on ajoute 0.3 vol d'acétate de sodium 3M puis 0,7 volume d'isopropanol pur. On agite par vortex et on centrifuge immédiatement 30 min à 14000rpm à +4°c. Le surnageant est retiré et le culot est rincé avec 50 pL d'éthanol à 70%. On centrifuge à nouveau 15 min à +4°C (14000 rpm. Le surnageant est retiré et le culot est séché 5 min à l'évaporateur rotatif (Jouan, St Herblain, France) sans chauffer. Le résidu est repris par 70 pl d'eau ultrapure. L'hybridation et la detection des ORN fonctionnalisés se fait conformément au protocole decrit dans le kit Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array (ref 900470) et dans le manuel : GeneChip® Expression Analysis. Technical Manual With Specific Protocols for Using the GeneChip® Hybridization, Wash, and Stain Kit P/N 702232 Rev. 3. Les ORN fonctionnalisés et mélangés au tampon d'hybridation sont déposés sur la puce Genome U133 Plus 2.0 Array à une concentration variant entre 7 nM et 70 pM dans un volume de 200 pl. L'hybridation se fait pendant 16h à 45°C sur la -b7- station fluidique FS 450 (Affymetrix, Santa Clara, USA). Après rinçage, la détection des ORN biotinylés est effectuée par complexation avec la streptavidine couplée à la phycoérythrine suivie d'une mesure de la fluorescence détectée à l'aide du scanner GeneChip® Scanner 3000 et du GeneChip® Operating Software (Affymetrix, Santa Clara, USA). Les intensités de fluorescence (RFU) recueillies après fonctionnalisation avec le 5Biot IA Me (9) sont représentées sur la Figure 10, celles avec le 5Biot PEG4 IA Me (11) sur la Figure 11. Résultats et conclusion : On constate que les intensités de fluorescence induites par les 2 molécules sont très similaires et très largement supérieure au bruit de fond généré par des ORN non fonctionnalisés (de l'ordre de 30 RFU, non représenté sur les Figures 10 et 11). La différence entre les quatre gènes provient des différences d'affinité des ORN pour leur cible. Ces expériences démontrent qu'il est possible de transférer un groupement biotine sur un ORN par réaction entre ce dernier et une molécule d'anhydride isatoïque biotinylé. La présence de biotine sur l'ORN permet alors de le détecter, s'il y a eu une hybridation spécifique avec la cible complémentaire correspondante, immobilisée sur un support solide. La démonstration de l'utilité et de l'efficacité de dérivés de l'anhydride isatoïque pour le marquage des acides ribo-25 nucléiques, dans une technologie de puces à ADN, est faite. Exemple 8 : Démonstration de la détection sur puce à ADN Affymetrix de transcrits ARN biotinylés par le 5Biot IA NE (9) 30 Objectif : Nous voulons ici faire une démonstration similaire à celle de l'exemple 7 mais en utilisant cette fois un -68- échantillon biologique correspondant à la réalité d'un test sur puce à ADN. Un panel d'ARN transcrits in vitro sera donc utilisé. Ti s'agit des ARN complémentaires aux ARNm présents dans les ARN totaux issus d'un échantillon biologique. Les transcrits in vitro obtenus de cett manière seront alors biotinylés par réaction avec le SBiot IA Me (9) et seront détectés sur une puce à ADN (GeneChip Human Genome UI33 Plus 2.0 Array, ref 900470, Affymetrix, St Clara,, USA). Mode opératoire : Les transcrits in vitro sont générés par transcription in vitro de l'ARN total extrait d'échantillons sanguins à l'aide du kit MessageAmp II (Référence AM 1751, AMBION, Austin, Texas). Brièvement, après extraction de l'ARN total des cellules sanguines, une première étape de transcription inverse par l'enzyme T7 Polymérase est réalisée afin de générer le brin d'ADN complémentaire à l' ARNm (ADNc). Le brin d'ARN est ensuite digéré par la RNAse H avant de former le double brin d'ADNc par le biais d'une ADN polymérase. Enfin, l'ARN antisens (transcrits in vitro) est obtenu à partir de l'ADNc grâce à la transcriptase T7. On mélange 17,6 pl d'une solution de transcrits in vitro d'ARN (à 568 ng/pl) obtenu précédemment, 9,4 pl d'eau ultrapure et 3 ul de Zn(OAc)2 pH 6,5 à 100 mM. Cette solution est alors incubée 15 minà 70°C puis mise immédiatement dans de la glace. On prélève alors 30 pl de cette solution à laquelle on rajoute 30 pl d'une solution de phosphate de potassium (pH 7, 1M), 30 pl d'eau ultrapure et de 30 pl du composé 5Biot IA Me (9) en solution dans le DMSO à 120 mM. On laisse incuber 60 min dans une étuve à 65°C, puis on met 5 min dans de la glace. L'excès de réactif est alors enlevé de la même manière que dans l'exemple 7 par précipitation à l'isopropanol. De même que le dépôt sur puce Affymetrix (GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array, réf 900470, Affymetrix, St Clara, USA), la détéction et la mesure de la fluorescence. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 12. Résultats et conclusion : Par rapport à l'exemple 7 précédent, il y a sur cette puce beaucoup plus de gènes détectés car les cibles biotinylées correspondantes sont cette fois présentes en totalité (IVT marqués). On constate que les intensités de fluorescence observées sont très largement supérieures au bruit de fond généré par des cibles IVT non fonctionnalisés (de l'ordre de 30 RFU, non représenté sur la Figure 10). La différence d'intensité entre les différents gènes provient de la fréquence respective de ces gènes dans l'échantillon. Cette expérience démontre, à partir d'un vrai échantillon biologique, qu'il est possible de transférer un groupement biotine sur un panel de brins d'ARN par réaction entre ces derniers et une molécule d'anhydride isatoïque biotinylé (9). La présence de biotine sur les brins d'ARN permet alors de les détecter s'il y a eu une hybridation spécifique avec la cible complémentaire. La démonstration de l'utilité et de l'efficacité des 25 anhydrides isatoïque biotinylés pour le marquage de brins d'ARN naturels est ainsi faite. Exemple 9 : Démonstration de la détection sur puce à ADN Agilent de transcrits ARN rendus fluorescents par réaction 30 avec le Cy3 IA Me (13) Objectif : Nous réalisons ici une démonstration similaire à celle de l'exemple 8, mais en utilisant cette fois la molécule Cy3 IA Me (13) pour l'étape de fonctionnalisation. Afin de transférer sur l'ARN une molécule de Cy3 fluorescente. Les transcrits fluorescents ainsi obtenus sont hybridés et détectés directement sur une puce a ADN Agilent (St Clara, USA), sans utilisation de molécule de streptavidine fluorescente. Mode opératoire : Les transcrits in vitro sont générés de la même façon que ce qui est décrit dans l'exemple 8. Nous avons utilisé dans cette exemple quatre concentrations en molécule de fonctionnalisation Cy3 IA Me (13) afin de déterminer la concentration la plus appropriée pour une détection des IVT fonctionnalisés la plus sensible. On reprend 6 ug de transcrits in vitro dans un volume total de 20 dal d'une solution à 10 mM de Zn(OAc)2 pH 6,5. La solution est incubée pendant 15 min à 70°C afin de fragmenter partiellement l'ARN jusqu'à obtenir une majorité de fragments d'une taille comprise entre 25 et 200 bases. Après cette incubation la solution est immédiatement mise dans de la glace. Une purification à l'isopropanol est ensuite effectuée afin d'éliminer l'acétate de zinc. Pour cela on rajoute 6 uL d'acétate de sodium 3M (soit 30% en volume) et 14 uL d' isopropanol (soit 704 en volume). On agite par vortex et on centrifuge 30 min à 14000 rpm (20800 g) à 4°C. On élimine le surnageant et on rince le culot d'ARN avec 50 uL d'éthanol à 70%. On centrifuge 15 min à 14000 rpm (20800 g) à 4°C puis on élimine le surnageant et on sèche sous vide à l'évaporateur rotatif avant de reprendre le résidu dans 11 uL d'eau. -71- On mélange 11 pl de la solution de transcrit avec 4 pl d'une solution de NaHCO3 500 mM pH 8-8,5, et avec 5 pl d'une solution de Cy3 IA Me (13) à 120, 240, 360 ou 480 mM dans le DMSO pour obtenir des solutions à, respectivement, 30, 60, 90 ou 120 mM en réactif de fonctionnalisation. Ces solutions sont incubées à 65°C pendant une heure. L'excès de réactif de fonctionnalisation ainsi que celui des différents sels sont éliminés par précipitation à l'isopropanol puis par précipitation à l'acétone. Pour cela, on ajoute 6 pL d'acétate de sodium 3 M (soit 30% en volume) et 14 pL d'isopropanol (soit 70% en volume) à la solution de fonctionnalisation. On agite par vortex et on centrifuge 30 min à 14000 rpm (20800 g) à 4°C. Le surnageant est éliminé puis le culot est rincé avec 50 uL d'éthanol à 70%. On centrifuge à nouveau 15 min à 14000 rpm (20800 g) à 4°C et on élimine le surnageant. On rajoute au culot 280 pL d'eau, 18 uL de LiC104 3 M et 900 pL d'acétone. On agite par vortex, on centrifuge et on élimine le surnageant. On rajoute à nouveau au culot 280 pL d'eau 18 pL de LiC104 3 M et 900 pL d'acétone. On agite par vortex, on centrifuge et on élimine le surnageant. On rince le culot avec 50 pL d'éthanol à 70% puis on centrifuge 15 min à 14000 rpm (20800 g) à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est séché sous vide à l'évaporateur rotatif avant de reprendre le culot dans 20 uL d'eau (soit [transcrits in vitro] théorique = 625 ng/pL).) Afin de déterminer la quantité de transcrits in vitro fonctionnalisés récupérée après ces différents traitements, 1,2 pl de chaque solution finale sont dosés par spectrophotométrie UV à 260 nm (Nanodrop 100, Thermo Scientific Waltham, USA)). Un dosage est également effectué à 0 nm afin de connaître le taux de fonctionnalisation en Cy3 des transcrits in vitro (o de molécules de Cy3 pour 100 nucléosides). Cette valeur est également connue sous le nom de DoL (Degree of Labeling) et se calcule avec l'équation suivante: DoL (en o) = 100 x (340 x [Cy3]) / (1000 x [ARN]). Le détail de cette équation est décrit dans le protocole du kit Cy3-ULS réf. EA-023 commercialisé par Kreatech (Amsterdam, Pays Bas). Le Tableau 4 ci-dessous décrit les valeurs de DoL trouvées suite à la fonctionnalisation d'IVT avec différentes concentrations en molécule Cy3 IA Me (13). Concentration en Cy3 IA Me Dosage Cy3 à Dosage IVT Nanodrop DoL (en (13, mM) dans 550 nm en à 260 nm(en ng/pL) ~) la solution pmo l /pL 30 6,7 271 0,8 60 13,1 255 1,7 90 12,3 207 2 120 15,2 192 2,7 Tableau 4 : Valeur de DoL obtenues après fonction d'un panel de transcrits in vitro avec différentes concentration en molécule 13 Une analyse avec un appareil d'électrophorèse capillaire Bio Analyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, USA) utilisant une puce RNA Nano 6000 permet de donner un profil des ARN fragmentés et fluorescents et de s'assurer que la majorité des fragments sont compris entre 25 et 200 bases. Suite à cela une certaine quantité d'IVT fonctionnalisé est déposée sur une puce à ADN Agilent Technologies (Santa Clara, USA)afin de détecter l'hybridation des transcrits fluorescents avec les sondes immobilisées sur les lames de verre. On suit pour cela le protocole décrit dans les kits de chez Agilent 73 - Technologies : « SurePrint G3 Human GE 8x60K Kit réf. G4851A » OU « Who1e Human Genome Microarray Kit, 4x44K réf. G4112F ». Brièvement ; 1,65 pg d'IVT fonctionnalisés sont repris dans 110 311 de tampon d'hybridation et déposé sur une puce lame de verre Agilent BMX 1. Cette puce a été réalisée à façon pour bioMérieux et comprend les séquences correspondantes à 352 gènes sous la forme d'oligonucléotides de 60 bases. Ces gènes correspondent, avec un format différent, à une sélection de gènes que l'on trouve sur la puce à ADN U133 Plus 2.0 vendue par Affymetrix et décrite dans les exemples 6 et 7. On y trouve de la même manière une sélection de gènes très faiblement, faiblement, moyennement et fortement exprimés dans une cellule humaine. L'hybridation à se fait sur un dispositif Agilent (réf. G2545A) à 65°C, pendant 17h avec une vitesse de rotation de 10 rpm. Après lavage de l'excès de transcrits fonctionnalisés non hybridés, la mesure des spots fluorescents se fait sur un scanner TECAN LS 200 (Mnnedorf, Suisse) équipé d'un filtre adapté à la détection du Cy3. Les images brutes obtenues sont visibles sur la Figure 13 et après retraitement et mise en correspondance des intensités de fluorescence mesurées avec la fréquence d'expression des gènes on peut tracer l'histogramme visible sur la Figure 14. Ce dernier correspond à l'intensité médiane des spots observée pour les contrôles négatifs et pour quatre groupes de séquences classés en fonction de leurs niveaux d'intensité sur puce Affymetrix (très faible, faible, moyen et fort) soit 1a méthode de référence). Résultats et conclusion : Le contrôle négatif correspond à l'intensité médiane obtenue pour des transcrits in vitro non fonctionnalisés. Il est de l'ordre de 20 RFU soit un résultat tout à fait acceptable correspondant au « fond ». Les intensités des signaux des séquences de la classe «Très faiblement exprimé» ne sont pas supérieures à celles correspondantes au fond. Ce résultat est cohérent puisque les mêmes observations apparaissent pour la méthode de référence sur la puce Affymetrix. En revanche, les séquences faiblement présentes sont bien détectées et les résultats pour les autres groupes de séquences sont équivalents à ceux obtenus avec la puce Affymetrix de l'exemple 8. L'augmentation du DoL n'améliore pas la dynamique du signal. Ainsi, il est inutile de marquer les transcrits in vitro à des DoL supérieurs à 1,6 %. En conclusion, un DoL de 0,8 % obtenu avec le marqueur Cy3--IA Me (13) dans ces conditions, est satisfaisant pour accéder à de bons résultats sur puce. Ces puces démontrent ainsi l'hybridation spécifique de transcrits in vitro fonctionnalisés avec le composé Cy3-IA Me {13). Elles démontrent également qu'il est possible de détecter directement des brins d'ARN fonctionnalisés avec la molécule 13 sans utiliser de molécules de streptavidine fluorescente. On démontre à nouveau l'intérêt et l'efficacité de l'anhydride isatoïque couplé à une molécule d'intérêt pour détecter l'hybridation de brins d'ARN rendus fluorescents. Exemple 10: Démonstration de l'augmentation du taux de fonctionnali.sation d'un panel d'ARN totaux soumis à l'action30 de la phosphatase alcaline puis mis en réaction avec le Cy3-IA Me 13. Objectif : Nous démontrons qu'un panel de brins d'ARN, partiellement fragmentés par une solution d'acétate de zinc, voit sa réactivité augmenter avec la molécule Cy3-IA Me 13 quand il y a eu un traitement préliminaire à la phosphatase alcaline. Mode opératoire : Le panel de brins d'ARN est l'ARN MAQC (Référence Stratagene : #74000). Cet ARN total (ribosomaux et messagers) est directement extrait de dix lignées de cellules humaines d'origine différente: cerveau, sein, Lymphocyte H, col de l'utérus, foie, liposarcome, macrophage, peau, testicule, Lymphocyte T. Le protocole de fonctionnalisation est le même que celui décrit dans l'exemple 9, c'est-à-dire : - 12 pg d'ARN MAQC est incubé ou non avec une solution d'acétate de Zinc. - Le mélange est précipité à l'isopropanol. - On rajoute ou non au mélange 7 unités de phosphatase alcaline (P7923-2KU Sigma-Aldrich) et on laisse l'hydrolyse des extrémités phosphorylées se poursuivre pendant 4 heures à température ambiante. - On ajoute alors au mélange la molécule Cy3-IA Me 13 à 15 mM dans un tampon NaHCO3 (100 mM/DMSO 75/25 pH 8-8,5) pour un volume total de 80 pl. Le mélange est incubé pendant lh à 65°C. - Le mélange est à nouveau précipité à l'isopropanol puis 30 deux fois à l'acétone avant de mesurer le DOL comme décrit dans l'exemple 9. Les valeurs obtenues sont consignées dans le Tableau 5 ci- dessous Entrée 10 rnM Zn(OAc)2 Hydrolyse PA Dol, (en %) 1 0 min 0 1,7 2 0 min 4h 1,5 3 15 min 0 1,7 4 15 min 4h 2,5 Tableau 5 : Valeurs de DOL obtenues après clivage, traitement 5 à la phosphatase alcaline (PA) et fonctionnalisation de l'AM MAQC Résultats et conclusion : Avec ou sans traitement à la phosphatase alcaline, il n'y a 10 pas de différences de DOL (qui est l'équivalent du taux de fonctionnalisation) quand l'ARN MAQC n'est pas clivé (entrées 1 et 2). Après clivage seulement, le DOL n'augmente pas plus (entrée 3) sans doute car les extrémités 3'phosphate générées n'étant pas 15 réactives il ne peut y avoir plus de fonctionnalisation. Par contre, la combinaison du clivage de 15 min et de l'hydrolyse à la phosphatase alcaline des extrémités 3'phosphate générées augmente le DOL de 106% (entrée 4). Sans doute car les extrémités 3'terminales se retrouvant sous forme 20 de diol 2',3' la réactivité s'en trouve augmentée d'autant. On démontre donc qu'il est possible d'augmenter le taux de fonctionnalisation par traitement des fragments d'ARN clivés à 1a phosphatase alcaline. Il s'agit aussi d'une preuve 25 indirecte qui montre la réactivité bien supérieure de l'extrémité 2',3' diol terminale de l'ARN par rapport aux hydroxyles 2' internes à 1a molécule. Exemple 11: Démonstration d'un procédé sélectif de fonctionnalisation par le composé 24, de capture, de clivage du lien disulfure et d' élution d'un ORN de 27 base en mélange avec un ODN de 27 bases. Objectif . Nous démontrons qu'il est possible, en partant d'un mélange 10 ORN/ODN mis en réaction avec le 5Biot PEG4 (SS) IA Me (24), de : - fonctionnaliser sélectivement l'ORN, - de le capturer à l'aide de particules magnétiques recouvertes de streptavidine et d'éventuellement de récupérer l'ODN pour d'autres applications, 15 - de cliver le lien SS entre l'ORN immobilisé et les particules, et - d'éluer sélectivement l'ORN exempt d'ODN. Mode opératoire : 20 On dispose d'un ODN 27-mers (réf. Eurogentec 21438-DNA lot #2177673, Sequence : 5'-AAC-CGC-AGT-GAC-ACC-CTC-ATC-ATT-ACA-3' } en solution à 650 uM dans l'eau et d'un ORN 27-mers (réf. Eurogentec 21437-RNA lot #2177672, Sequence : 5'-AAC-CGC-AGU- 25 GAC-ACC-CÜC-AUC-AUU-ACA-3') en solution à 952 uM dans l'eau. 15,4 uL d'ODN et 17,5 uL d'ORN sont mélangés et complétés avec 67,1 uL d'eau ultrapure. Après injection en HPLC, l'intégration des pics en UV à 260 nm correspondant respectivement à l'ORN et à l' ODN indique que le 30 mélange comprend 44% d'ORN et 56% d'ODN (Injection 1, conditions HPLC n°4, Figure 15). Etape de fonctionnalisation : 80 uL du mélange (8 nmoles) sont évaporés à sec et repris dans: 10 uL d'eau, 5 pL d'anhydride -78- isatoïque Biot PEG4(SS)IA Me (24); 2.4 mmoles), en solution à 480 mM dans le DMF, et 5 pL de tampon Triéthyl ammonium acétate en solution à 1 M dans l'eau. Le milieu est placé à l'étuve à 65°C pendant une heure. Etape de precipitation . Le milieu subit alors une triple précipitation au perchlorate de lithium LiC104 et à l'acétone afin de le débarrasser du BiotPEG4 (SS) IA Me résiduel : 18 pL de LiC104 en solution à 3M dans l'eau et 262 pL d'eau sont ajoutés au milieu. Après agitation par vortex, 900 pL d'acétone sont ajoutés, puis le milieu est agité à nouveau et centrifugé (5 minutes à 13000 rpm à température ambiante). Le surnageant est alors retiré précautionneusement et le même procédé est répété à deux reprises supplémentaires avec 18 pL de LiC104 et 282 pL d'eau. Enfin, on lave le milieu avec 900 pL d'acétone avant agitation et centrifugation. La plus grande partie du surnageant est retirée avec précaution avant séchage à l'évaporateur rotatif. On répète alors les étapes de fonctionnalisation et de précipitation décrites ci-dessus à partir du résidu sec repris dans 10 pl d'eau. Le mélange ORN/ODN est alors repris dans 33 pL d'eau et 5 pL 25 de la solution sont alors injectés en HPLC (Injection 2, conditions HPLC n°4, Figure 15). Dans un tube de 250 pL sont introduits successivement : - 250 pg (soit 50 pL de solution) de particules magnétiques recouvertes de streptavidine Merck MagPrep-25 (Merck, 30 Darmstadt, Allemagne), lavées deux fois au préalable avec 200 pL de tampon PBS (0.01 M PO4-, 0.0027 M KC1, 0.137 M NaCl, pH-7.4 à 25°C ref Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA). - 10 pL de PBS et 4.0 pL de mélange ORN/ODN précipité ayant réagit avec le composé Biot PEG4 (SS) IA Me (24). -79- - Le milieu est laissé sous agitation douce à température ambiante pendant 10 minutes. Après magnétisation des particules, le surnageant est retiré précautionneusement et une fraction est injectée en HPLC (Injection 3, conditions HPLC n°4, Figure 15). Les particules sont alors lavées à deux reprises avec 200 pL de PBS. 20 pL de dithiothréitol (DTT) en solution à 100 mm dans le PBS sont alors ajoutés au milieu, qui est laissé sous agitation douce à 40°C pendant une heure. Après magnétisation, le surnageant est injecté en HPLC (Injection 4, conditions HPLC n°4, Figure 15). Résultats et conclusion : On peut observer sur l'injection 1 le mélange initial à 44% d' ORN (RT = 3 min) et 56% d' ODN (RT = 4 min). On observe sur l'injection 2 que seul l'ORN initial a été fonctionnalisé (95%) par le BiotPEG4(SS)IA Me puisque qu'il a pratiquement disparu au profit d'un massif situé entre 9 et 22 min et correspondent à l'ORN acylé et biotinylé. On constate par contre que l'ODN est toujours present et n'a pas réagi. L'injection 3 démontre que le surnageant est constitué majoritairement de l'ODN, l'ARN fonctionnalisé ayant été capture presque totalement. Le rendement de capture spécifique est estimé dans ce cas à 37% mais il est evident qu'un aj ôut supplémentaire de particules magnétiques recouvertes de streptavidine permettrait de capturer la totalité de cet ARN biotinylé. Enfin, on observe sur l'injection 4 la disparition totale des pics correspondant à l'ORN et à l'ODN. Le massif qui correspondait à l'ORN acylé et biotinylé (RT - 9-32 min) a so - également disparu au profit d'un massif de temps de retention compris principalement entre 4,5 et 18 min issu du clivage du lien disulfure (SS) et correspondant donc à la perte de 1a partie biotine. Comme pour l'injection 2, la largeur du massif S provient de la fonctionnalisation aléatoire au niveau de 1'ORN. Ceci induit la formation d'une multitude d'adduits de temps de rétention différents. Au total 1'ORN a été libéré du support avec un rendement de 18% par rapport à la quantité mise en jeu au départ. 11 est possible de jouer avec les taux 10 de fonctionnalisation pour optimiser ce rendement. A titre indicatif, dans des conditions optimisées, le rendement du processus de fonctionnalisation / capture / élution avoisine les 50%. 15 Une hydrolyse totale de TARN biotinylé par des groupements anthranylate SH comme indiqué sur l'injection 4 a été soumis à une hydrolyse totale par la Nucléase P1 et la phosphatase alkaline. Nous avons alors montré qu'en plus des quatre 20 ribonucléosides naturels on pouvait observer les adduits nucléosidiques et nucléotidique anthranylate SH à hauteur de 5% du mélange total. Aucune trace de désoxyribonucléosides ou nucléotides n'a été observée. 25 Cette expérience confirme la spécificité du processus de fonctionnalisation / capture / clivage / élution et donc la possibilité, à partir d'un mélange ORN/ODN, de trier sélectivement l'un ou l'autre de ces composés en fonction de l'usage que l'on veut en faire. L'ARN acylé libéré est exempt 30 d'ARN comme le démontre l'hydrolyse totale. Exemple 12 : Démonstration d'un procédé sélectif de fonctionnalisation, capture, clivage et élution de transcrits HIV WT (Wi1d Type) de 1083 nucléotides mis en réaction avec le composé 5 Biot PEG4 (SB) TA Me (24) Objectif : Nous démontrons dans cet exemple qu'il est possible de : - fonctionnaliser sélectivement une population de brins d'ARN amplifiable (transcrit HIV WT de 1083 nucléotides) par le composé 5 Biot PEG4 (SS) IA Me (24), - capturer sélectivement cette population à l'aide de particules magnétiques recouvertes de streptavidine, - cliver chimiquement et spécifiquement le lien reliant l'ARN immobilisé à la particule, - éluer sélectivement les ARNs transcrits HIV ayant subit le procédé comme cela est décrit sur la Figure 16. Mode opératoire : On dispose d'un ARN transcrit HIV de 1083 nucléotides, dont la séquence partielle (insert pG30) est dans le kit HIV bioMérieux (Nuclisens EasyQ® HIV-1 v2.0, ref 285033, bioMérieux, Marcy l'Étoile, France). Ce transcrit en solution dans l'eau à 3.27*1012 copies/pL (1,94 25 ug/pL) est produit en interne. Fonctionnalisation : Dans cinq tubes « PCR » en polypropylène de 250 HL on 30 introduit les réactifs suivants comme indiqués dans le Tableau 6 ci-dessous: ARN transcrit H1V Tampon TEAAc pH7 5BiotPEG4 (SS) IA Me (24) -82- à 1,94 pg/pL à 480mM dans le DME Exp. vol. (pL) conc. (M) vol. (pL) Ci (mM) vol. (pL) Cf (mM) #1 2 1 1 0 1 0 #2 2 1 1 60 1 15 #3 2 1 1 120 1 30 #4 2 1 1 480 1 120 #5 2 2 0,5 480 1,5 180 Tableau 6 : Récapitulatif des conditions expérimentales de fonctionnalisation (Ci : concentration de la solution--mère de Biot PEG4 (SS) IA Me (24), Cf : concentration en 5 BiotPEG4(SS)lA Me {24) dans le mélange réactionnel) Pour chacune des expériences du Tableau 6, le volume total du mélange réactionnel est de 4 pL et la concentration finale en TEAAc de 250mM. L'expérience #1 fait office de témoin. Les tubes remplis sont mis à incuber au thermocyler (Thermoelectron Corporation, Milford, MA, USA) pendant 1 h à 65°C. Elimination de l'excès de réactif biotinylant 5 Biot PEG4 (SS) 15 IA Me (24) avec le kit Nuclisens easyMAG : Cette étape consiste à éliminer l'excès de 5 Biot PEG4 (SS) IA Me (24) n'ayant pas réagi avec l'ARN. Pour ce faire, on utilise le kit d'extraction Nuclisens easyMAG de bioMérieux. 20 Après incubation, les échantillons fonctionnalisés sont repris dans 100 pL de tampon d'extraction 1 (réf. bioMérieux : 280131, lot Z012EB1EB) et transférés dans des tubes en polypropylène de 1,5 mL préalablement autoclavés. Une quantité 25 de 800 pL de ce même tampon est alors ajoutée avant agitation et légère centrifugation. Un volume de 50 pL (soit 1 mg) de particules de silice magnétique easyMAG (MagSil, réf. bioMérieux : 280133 lot ZO11EA1MS) est alors ajouté dans chaque échantillon. Après incubation pendant 10 minutes à température ambiante sous agitation douce par vortex, les tubes sont placés sur un portoir magnétique et le surnageant retiré. Les 500 pL de tampon d'extraction 1 sont ajoutés avant agitation, légère centrifugation, magnétisation et élimination du surnageant. Puis on ajoute successivement 900 pL de tampon d'extraction 2 (réf. : 280131, bioMérieux, Lyon, France), 500uL de tampon d'extraction 2 et 500 pL de tampon d'extraction 3 (réf. : 280132, bioMérieux, Lyon, France), avec systématiquement entre chaque ajoût une agitation, une légère centrifugation, une magnétisation et une élimination du surnageant. Enfin, 20 pL de tampon d'extraction 3 sont ajoutés et les tubes sont placés au thermomixer à 70°C pendant 5 min (agitation 1400 rpm). L'éluat est dosé au Nanodrop ND-3300 (NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, DE, USA) et injecté au BioAnalyzer sur puce Agilent RNA Nana 6000 (Agitent, Santa Clara, USA) pour contrôler son profil éléectrophorétique. Capture : Dans cinq tubes en polypropylène de 250 pL neufs (type PCR), on introduit 100 pg (20 pL de solution) de particules MagPrep-25 streptavidine (Merck, Darmdstat, Allemagne) lavées au préalable à deux reprises avec 200 pL de PBS lx (0,01 M PO4 0,0027 M KC1, 0,137 M NaCl, pH = 7,4 à 25°C, réf. SIGMA 4417). On y ajoute 5 pL d'une solution de PBS 4x -1- 0.4% SDS (Sodium dodécyl sulfate, afin de limiter l'adsorption non spécifique des ARNs non fonctionnalisés, puis 15 pL de l'éluat issus de la purification par silice easyMAG. Chacun des tubes est agité à basse vitesse (vortex) pendant 10 minutes à température ambiante. Les tubes sont placés sur un portoir aimanté Dynal MPC 9600 (Dynal, Norvège) et le surnageant prélevé précautionneusement pour dosage au Nanodrop S (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) et injection au BioAnalyzer Nano 6000 (Agilent, Santa Clara, USA) afin de mesurer un taux de capture. Elution : 10 Le contenu des tubes utilisés à l'étape précédente est lavé avec 100 pL de solution PBS 4x + 0,4% SDS puis lavé à deux reprises avec 100 pL d'une solution de PBS lx (0,01 M PO4r 0,0027 M KC1, 0,137 M NaCl, pH-7,4 à 25°C, réf. SIGMA 4417). 15 Les surnageants sont retirés précautionneusement après magnétisation et 8 pL de dithiothréitol (DTT) à 100 mM dans le PBS 1x pH 7,4 (réf. SIGMA 4417) sont ajoutés à chacun des tubes. Les tubes sont ensuite séparés et placés 1h au thermomixer (Eppendorf, Hambourg, Allemagne)à 40°C (agitation 20 300 rpm). Enfin, les tubes sont placés sur le portoir aimanté et les surnageants prélevés pour injection au BioAnalyzer afin de mesurer un rendement d'élution. Résultats: 25 Fonctionnalisation : Après fonctionnalisation de l'ARN avec différentes concentrations de BiotPEG4(SS)IA Me (24), on observe sur les 30 électrophorégrammes donné par le BioAnalyzer un déplacement vers la droite de l'ARN fonctionnalisé ainsi qu'un élargissement des pics, en comparaison à l'ARN témoin non fonctionnalisé. Ceci s'explique par la présence des résidus anthranylates qui conduisent à un accroissement de la masse de l'ARN et donc à un profil de migration modifié comme cela est représenté sur les Figures 17 ou 18 (où la ligne L correspond à une échelle de taille des acides nucléiques et où les lignes 1, 2, 3, 4 et 5 correspondent respectivement au transcript fonctionnalisé avec la molecule 24 à 15, 30, 60, 120 ou 180 mM). Plus l'ARN est fonctionnalisé, plus il est déplacé vers la droite ou vers le haut, ce qui traduit une augmentation du taux de fonctionnalisation. Capture : Après capture des transcrits ARN fonctionnalisés, avec différentes concentrations de BiotPEG4 (SS) IA Me (24), de l'ARN est détecté uniquement dans le surnageant du témoin et en très faible quantité dans le surnageant de l'expérience #2 (fonctionnalisation avec 15 mM BiotPEG4(SS)IA Me (24)) comme cela est représenté sur les électrophorégrammes de la Figure 19. Ceci indique que l'ARN est capturé totalement quand il a été suffisamment biotinylé. Le témoin de l'expérience 1 n'étant pas biotinylé n'est donc pas capturé. Elution : Après élution des transcrits immobilisés à l'étape précédente, de l'ARN est détecté de façon significative dans tous les échantillons, excepté dans le témoin comme attendu. Ce dernier n'ayant pas été fonctionnalisé ni capturé, il n'est donc pas élué. On démontre par la même occasion qu'il n'y a pas d'élution non spécifique due à de l'ARN non biotinylé qui se serait adsorbé sur les particules. La quantité d'ARN éluée est dépendante du taux de fonctionnalisation comme cela est représenté sur la Figure 20. On constate que l'ARN ainsi élué à un temps de rétention inférieur à celui de l'ARN fonctionnalisé, cela est dü à la coupure du lien SS, qui permet de diminuer le poids moléculaire de la molécule. Les rendements respectifs du processus et de chacune de ses 5 différentes étapes sont résumés dans le Tableau 7 ci-dessous : Expériences % ARN récupéré après taux de taux rendement élimination de l'excès capture d'élution global de réactif 24. et 35% 6% nd 0% #2 320 77% 40% 10% #3 34% 1000 53% 18% #4 310 100% 45% 14% #5 30% 100% 43% 13% Tableau 7 : Récapitulatif des rendements obtenus lors des IO différentes étapes de fonctionnalisation, de capture et d'élution d'un transcrit HIV mis en réaction avec le composé 5BiotPEG4 (SS) IA Me {24) Toutes les concentrations ont été mesurées par intégration des 15 signaux de fluorescence obtenus au BioAnalyzer. Le taux de capture est défini comme le ratio entre la quantité d'ARN ayant été immobilisée sur les particules Streptavidine MagPrep--25 Merck (évaluée par dosage de l'ARN dans le surnageant) et la quantité d'ARN récupéré après 20 fonctionnalisation et précipitation. Le taux d'élution est déduit des rendements de chacune des étapes et du rendement global. On obtient des rendements globaux compris entre 10% et 18% 25 pour les différentes concentrations de BiotPEG4(SS)IA Me, sachant que l'on récupère entre 30% et 35% du matériel après purification avec le kit Nuclisens easyMAG. A partir d'une -s7- concentration en BiotPEG9(SS)IA Me (24) de 30 mM et au-delà, la capture est totale avec 100Ng de particules Streptavidine MagPrep-25 (Merck). L'adsorption non spécifique de l'ARN non fonctionnalisé (témoin) sur les particules Streptavidine MagPrep-25 est de 60 mais cet ARN est éliminé lors des lavages et n'est pas élué lors du traitement au DTT 100 mM. La manipulation a été dupliquée pour chacune des concentrations avec des résultats similaires. Conclusion: Des ARNs transcrits HZV ont été fonctionnalisés avec le composé BiotPEG4(SS)IA Me (24) à différentes concentrations, purifiés avec le kit Nuclisens easyMAG®, capturés sélectivement sur des particules magnétiques Streptavidine MagPrep-25 (Merck) et élués par clivage de la liaison disulfure. Seul l'ARN ayant été fonctionnalisé est détecté au BioAnalyzer (puce Agitent RNA Nano 6000) à la fin de ce processus. Jusqu'à 18% de l'ARN de départ a été extrait avec succès par cette méthode. Ceci démontre sans ambiguité qu'une fonctionnalisation spécifique de l'ARN et son élution après capture sur particules magnétiques est réalisable. Exemple 13 : Amplification NASBA de transcrits HIV fonctionnalisés sélectivement avec le composé BiotPEG4(SS)IAMe (24), capturés avec des particules magnétiques recouvertes de Streptavidine et élués avec une solution de DTT 100 mM. Objectif : Nous démontrons la capacité des transcrits préparés dans l'exemple 12 à être ultérieurement amplifiés lors d'une réaction d'amplification, dans le cas présent il s'agit de la technique d'amplification NASBA, mais ceci est réalisable avec d'autres techniques telles que la PCR, TMA, 3SR, etc. Nous montrons également que la présence d'un résidu anthranylate sur l'ARN ne gène pas l'amplification. Mode opératoire : Dans l'exemple 12 précédent, 4 pg d'un transcrit HIV WT (1083 nucléotides, production interne, lot bioMérieux. 841470301, C=3,27E12 copies/pl), a été biotinylé avec différentes concentrations du composé (24) (0 mM, 15 mM, 30 mM, 120 mM, 180 mM, soient les expériences #1-7 du Tableau 6). Ce transcrit a alors été capturé sur particules magnétiques Streptavidine Merck MagPrep 25 puis après rinçage, les particules ont été soumises à un traitement au DTT 100 mM dans le PBS 1X pH 7 à 40°C pendant une heure afin de cliver le lien disulfure (SS) et d'éluer les transcrits dotés de groupements anthranylates -SH, comme représenté sur la Figure 16. Nous avons évalué la capacité de ces transcrits à être amplifiés par la technologie NASBA. Cette évaluation a été réalisée en comparatif avec une gamme de transcrit HIV_WT « nus » non fonctionnalisés. L'amplification est réalisée sur un intrument NucliSENS EasyQ (bioMérieux, Lyon, France) et avec un kit NucliSENS EasyQ HIV- 1 V2.0 (bioMérieux, Lyon, France, réf. 285033, lot. 09122106). Le logiciel utilisé est NucliSENS EasyQ Director et le protocole est QL1-60 1.0 (bioMérieux, Lyon, France). Après fonctionnalisation avec le composé 24, capture et élution dans 8 pl de DTT 100 mM, comme décrit dans l'exemple 12, les transcrits des expériences #2-5 du Tableau 7 ont été dosés sur puce RNA 6000 NANO avec le bioanalyzer AGILENT (Santa Clara, USA) et ont été dilués dans les concentrations suivantes : 1000 copies, 100 copies, 50 copies, 10 copies, 1 copie, 0 copie dans 15 Un transcrit HIV_IC (contrôle interne de même séquence amplifiée que le transcrit WT (wild type) mais détecté par une balise moléculaire (molecular beacon) portant un autre fluorophore) dilué à 360 copies est ajouté dans le volume de 15 pl et sera présent dans tous les puits où se passent les amplifications. Ce transcrit sert à contrôler le bon fonctionnement de l'amplification. Les essais sont réalisés en triplicata. L'expérience #1 correspond à un transcrit qui n'a pas été fonctionnalise (0 mM du compose (24) mals qui a néanmoins subi toutes les étapes du protocole de fonctionnalisation, capture et élution. Il s'agit donc du témoin de l'adsorption et de l'élution non spécifique d'un transcrit non fonctionnalisé. La quantité d'ARN contenue dans cet échantillon étant inférieure au seuil de détection du bioAnalyzer, elle est dosée par l'amplification NASBA Le Tableau 8, ci-dessous indique les valeurs du dosage des éluats de chaque transcrit des expériences et-5 (volume total = 8 ul). Concentration en Concentration en Quantité totale éluée Rendement total composé 24 (m M) transcrit fonctionnalisé en pg (dans les Bpi) fonctionnalisation! 1 capturé et élué (en capturelélution des copies/pl) transcrits HIV 0 6,7E+04 0,0000003 0,00001% 15 7,6E+10 0,3609520 9,30289%° 1,4E+11 0,6649116 17,13690% 120 1, 0E+11 0,4844356 12,48545% 180 9,8E+10 0,4654381 11,99583% Tableau 8 Valeurs de dosage des transcrits élués produits dans l'exemple 12 Exp. #1 #2 #3 #4 #5 Six Accuspheres ENZ II (kit NucliSENS EasyQ HIV-1 V2.0, réf. 285033, bioMérieux, Lyon, France) sont déposées dans un tube en polypropylène de 1,5 ml. Un volume de 270 pl de ENZdiI H (kit NucliSENS EasyQ HIV-1 V2.0, réf. 285033, bioMérieux, Lyon, France) est ajouté sur les Accusphères et on attend 15 minutes pour la dissolution complète de celles-ci. Les douze Accusphères PRM H (kit NucliSENS EasyQ HIV-1 V2.0, réf. 285033, bioMérieux, Lyon, France) sont déposées dans un tube en polypropylène de 1,5 ml 1080 pl de PRMdi 1 H (kit NucliSENS EasyQ HIV-1 V2.0, réf. 285033, bioMérieux, Lyon, France) est ajouté sur ces Accusphères et le mélange est immédiatement agité par vortex jusqu'à dissolution complète des Accusphères. Après dissolution complète dans les deux tubes (mix ENZ II et mix PRM H), ces mélanges sont centrifugés avec une centrifugeuse de paillasse. L'amplification NASBA est réalisée dans des barrettes de 8 puits de 0,2 m1 couverte par leur bouchon. Le volume de 15 pl de mélange de transcrits à chaque concentration (entre 1000 et 1 copies) est déposé au fond de chaque puits. On ajoute 20 pl de mix PRM H. Les barrettes sans bouchon sont déposées sur un incubateur NucliSENS EasyQ Incubator (bioMérieux, Lyon, France) en suivant le protocole RNA NASBA pendant 2 minutes à 65°C (dénaturation des ARNs) puis 2 minutes à 41°C (température de l'amplification). Pendant ce temps, 5 pl de mix ENZ II sont déposés dans les bouchons des barrettes. Les barrettes sont alors bouchées, centrifugées à la centrifugeuse de paillasse, puis agitées 3 secondes, et à nouveau centrifugées à la centrifugeuse de paillasse, avant d'être déposées sur le portoir de l'instrument NucliSENS EasyQ (bioMérieux, Lyon, France). En parallèle, on réalise la même opération avec une gamme de transcrits HIV WT non fonctionnalisés de 1000 à 1 copies. L'amplification commence alors. Après 60 minutes, les résultats sont exportés au format .xml et analysés sous le logiciel SpotFire (Tibco Softaware -91- Inc., Palo Alto, USA) avec l'algorithme T2, tels que l'on peut les voir sur la Figure 21. Résultats et conclusion : Comme représenté sur le Tableau 8, on constate que l'échantillon témoin représentant l'adsorption et l'élution non spécifique (exp #l) ne contient pratiquement pas de transcrits et, en moyenne, il en contient 1 million de fois moins que les échantillons correspondant aux expériences #2-5. On peut donc dire que le procédé de fonctionnalisation, capture, clivage et élution d'un transcrit HIV, mis en réaction avec le composé (24), est un procédé spécifique à l'ARN puisqu'un transcrit ARN n'ayant pas réagit avec le composé (24) mais ayant suivit les mêmes étapes n'est élué qu'avec une concentration 1 million de fois inférieure. Il est donc évident que les réactions d'amplification NASBA observées sur la Figure 21 ne peuvent venir que du transcrit HIV WT fonctionnalisé, capturé et élué selon le processus décrit dans l'exemple 12. Nous observons (non représenté) une amplification du contrôle interne à 360 copies en tous points conforme aux attentes, ce qui signifie que le tampon d'élution (PBS lx pH 7 et DTT 100 mM), dilué à la concentration nécessaire pour réaliser la gamme de transcrits de 1000 à 1 copie(s), n'inhibe pas l'amplification NASBA. La Figure 21 représente une superposition de gammes de transcrits HIV (1000, 100, 50, 10 et 1 copie(s)) fonctionnalisés avec la molécule 24 à différentes concentrations (15, 30, 120 et 180 mM), capturés sur particules magnétiques recouvertes de streptavidine puis élués par clivage chimique au DTT et amplifiés par NASBA. Une -92- comparaison avec une gamme de transcrits non biotinylés est faite. Pour des concentrations de 15 et 30 mM, l'amplification NASBA n'est pas impactée. Par contre, à partir de 120 mM, on observe un début d'inhibition de l'amplification qui se confirme avec une concentration de 180 mM de marqueur, avec un décalage dans le temps de plus en plus important du démarrage de l'amplification. Ceci s'explique par le fait que plus l'ARN est fonctionnalisé, plus les motifs anthranylates peuvent gêner l'hybridation et/ou le processus d'élongation de la polymérase. D'une manière générale le processus d'amplification NASBA est conservé mais on observe une augmentation de la quantité minimale de transcrit détectée quand la concentration en réactifs de fonctionnalisation (24) augmente, comme cela est indiqué dans le Tableau 9 ci-dessous. Concentration en Nombre de copies composé 24 (mM) minimales détecté 0 10 15 10 30 10 120 100 180 1000 Tableau 9 : Nombre de copies minimum de transcrits HIV fonctionnalisé, capturé, élué et détecté en fonction de la concentration en réactif de fonctionnalisation (24) Il est donc bon de modérer la fonctionnalisation de l'ARN de manière à éviter l'inhibition de l'amplification, et ce même si la fonctionnalisation est possible même à de forte concentration. Dans un mode de réalisation de l'invention, 50 mM en composé (24) reste une limite supérieure préférentielle à utiliser dans les conditions que nous avons dans cette exemple. -93- Ceci est la démonstration que des ARNs peuvent subir un processus de fonctionnalisation, capture et élution, tout en gardant leur capacité à être amplifiés par une réaction de polymérisation enzymatique. En remarque complémentaire, il convient de noter qu'un fort taux de fonctionnalisation est également intéressant. Ainsi, cette situation permet d'inhiber l'amplification de l'ARN sans toucher à celle de l'ADN. Ceci peut trouver des applications dans des approches de décontamination de solutions polluées par de l'ARN. REVENDICATIONS1.Procédé de fonctionnalisation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) qui comprend les étapes suivantes : 5 a) disposer d'au moins : une molécule de liaison constituée par un anhydride isatoïque ou un de ses dérivés, - un groupement d'intérêt, et un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le 10 groupement d'intérêt, b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté : - en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou 15 - en position(s) 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide à l'extrémité 3' terminal de l'ARN, et c) obtenir un anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt. 20 2. Procédé de marquage d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) qui comprend les étapes suivantes : a) disposer d'au moins . - une molécule de liaison constituée par un anhydride isatoïque ou un de ses dérivés, ayant une fluorescence 25 intrinséque, un groupement d'intérêt, ayant un signal de fluorescence intrinséque, mais différent du signal émis par la molécule de liaison, ou n'ayant pas de signal de fluorescence intrinsèque, et 30 un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté :- en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou en positions 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et _ obtenir un anthranylate reliant, à l'aide du bras de liaison, l'ARN au groupement d'intérêt. 3. Procédé de capture ou de séparation d'au moins une molécule d'acide ribonucléique (ARN) qui comprend les étapes suivantes . a) disposer d'au moins . - une molécule de liaison constituée par un anhydride isatoïque ou un de ses dérivés, - un groupement d'intérêt constitué par un ligand 15 complémentaire d'un anti ligand, et - un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, b) faire réagir la fonction anhydride de la molécule de liaison avec au moins un groupement hydroxyle porté : 20 - en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou - en positions 2' et/ou 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et c) obtenir un anthranylate, reliant à l'aide du bras de 25 liaison, l'ARN au groupement d'intérêt, d) capturer ou séparer l'ARN par l'intermédiaire d'une réaction ligand - anti-ligand. 4. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, 30 dans lequel le bras de liaison est associé à 1a molécule de liaison avant que ledit bras de liaison soit associé au groupement d'intérêt. . Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le bras de liaison est associé à la molécule de liaison après que ledit bras de liaison soit associé au groupement d'intérêt. 6. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 4 à 5, dans lequel 1a molécule de liaison est préalablement associée à l'ARN. 7. Procédé de capture sélectif d'au moins une molécule d'ARN utilisant au moins une molécule de liaison, un groupement d'intérêt, constitué par un ligand complémentaire d'un anti--ligand, et un bras de liaison reliant la molécule de liaison avec le groupement d'intérêt, la molécule de liaison étant constituée par un anhydride isatoïque ou un de ses dérivés, qui se fixe par liaison covalente au niveau d'un groupement hydroxyle porté en position : - en position 2' du ribose d'un des nucléotides de l'ARN, et/ou en position 2' et 3' du ribose du nucléotide terminal en position 3' de l'ARN, et/ou - en position 3' du ribose dudit nucléotide terminal en position 3' de l'ARN. 8. Procédé de séparation de molécules d'ARN par rapport à d'autres constituants biologiques, notamment des molécules d'ADN consistant à : - appliquer le procédé de capture, selon la revendication 7, à un échantillon biologique contenant des acides nucléiques indifférenciés (ARN et ADN), les groupements d'interêt étant associées à au moins un support solide facilement séparables du reste de l'échantillon biologique, et - séparer les molécules de liaison portant les molécules d'ARN du reste de l'échantillon biologique. - 97 -. Réactif de fonctionalisation, de formule (1) : 0 R2- X É R~ dans lequel : - Rl représente H ou un groupement d'intérêt, . R' représente H ou un groupement d'intérêt pouvant être : a. un marqueur ou un précurseur de marquage, ou b. un ligand pouvant être reconnu par une molécule de reconnaissance ou une surface, ou une particule, etc., afin de former un complexe stable, - si R1 est représenté par H, Rz est représenté par un groupement d'intérêt, et vice-versa, et - X est un bras de liaison, qui relie le groupement d'intérêt à 15 la molécule de liaison. 10. Réactif de capture ou de séparation, selon la revendication 9, pour lequel le moyen de capture ou de séparation est constitué par un support solide, tel que 20 particules de polymère ou de silice, magnétiques ou non, ou un filtre ou bien par la paroi interne d'un récipient. 11. Réactif de fonctionalisation, selon la revendication 9, dans lequel le bras de liaison X est : 25 - une simple liaison covalente reliant un atome de la molécule de liaison et un atome du groupement d'intérêt, ou- un bras de liaison organique, tel qu'une simple liaison covalente entre la molécule de liaison et le groupement d'intérêt ou un simple atome de carbone, éventuellement substitué, un enchaînement d'au moins deux atomes de carbone, contenant éventuellement des structures aromatiques et/ou des hétéro-atomes (oxygène, soufre, azote, etc.). 12. Réactif de fonctionalisation, selon la revendication 11, dans lequel le bras de liaison X comporte une fonction ou une liaison capable d'être clivée par un moyen physico-chimique, photo-chimique, thermique, enzymatique et/ou chimique permettant la séparation de la molécule de liaison par rapport à l'ARN dans des conditions de lumière, de température, enzymatiques ou chimiques particulières. 13. Molécule biologique d'ARN fonctionnalisée susceptible d'être obtenue par le procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 14. Kit de détection d'une molécule d'ARN cible comprenant un réactif, selon l'une des revendications 9 à 12. 15. Procédé de fonctionalisation selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 8, qui comprend l'étape supplémentaire suivante entre les étapes a) et b) consistant à hydrolyser le groupement monophosphate terminal en position 3' de chaque brin d'ARN à fonctionaliser. 30