Brevet FR2968999A1 — publié le 20120622

L'invention concerne de nouveaux systèmes optimisés de type nanoémulsions et leur utilisation comme agents de contraste notamment en IRM. Dans le domaine de l'imagerie diagnostique, un grand nombre de recherches ont concerné des nanosystèmes lipidiques de type émulsion. Typiquement les émulsions utilisées sont sous forme de vésicules préparées à l'aide de constituants lipidiques (huile en particulier) et de tensioactifs servant d'interface entre la phase aqueuse et le noyau lipidique de la nanoparticule. Les émulsions lipidiques huile dans eau incorporent une phase huileuse formant des gouttelettes lipidiques dispersées en solution aqueuse. Une première catégorie d'émulsions décrite notamment dans WO 03/062198 ou US 6 676 963 est celle de nanoémulsions fluorées, comprenant, intégrées à l'intérieur des vésicules lipidiques, des composés fluorés. Le coeur lipidique est formé d'une huile fluorée, et entouré d'une couche de tensioactif (tensioactif, lécithine par exemple). Ces émulsions fluorées peuvent comprendre en outre un nombre très élevé de complexes de métaux paramagnétiques, en particulier de lanthanides. On connaît ainsi des émulsions fluorées pour IRM incorporant des chélates capables de complexer des lanthanides en particulier le gadolinium. Les chélates utilisés sont notamment des dérivés du DTPA, DOTA, DO3A, HPDO3A et autres chélates largement décrits dans l'art antérieur. Ces chélates hydrophiles sont rendus amphiphiles en leur greffant une zone lipophile telle qu'un phospholipide, ce qui permet de les intégrer dans la couche lipidique que forme le tensioactif de la composition. Plusieurs milliers (5000 à 100 000 environ) de ces complexes sont intégrés dans la membrane lipidique de ces vésicules, ce qui permet d'obtenir une relaxivité (signal IRM) élevée pour une détection de la zone physiologique étudiée. La partie hydrophile du chélate amphiphile est représentée par le chélate lui-même, la partie hydrophobe était elle représentée par la zone lipophile qui est greffée sur ce chélate appelée queue lipophile. Ainsi, cette partie hydrophile est localisée à la surface externe des nanogouttelettes, en contact avec la phase aqueuse de la solution de nanogouttelettes. En outre, afin d'obtenir un signal spécifique de zones pathologiques, par exemple associées à une surexpression d'un marqueur de ces zones (récepteurs par exemple), des molécules de ciblage (ou biovecteurs ou ligands de ciblage, peptide par exemple ayant une affinité pour le récepteur) ont été greffées sur les nanogouttelettes de ces émulsions fluorées. Toutefois, malgré des avancées prometteuses, ces agents de contraste fluorés et vectorisés décrits n'ont pas encore démontré totalement leur efficacité clinique, et nécessitent un savoir-faire de fabrication à l'échelle industrielle bien spécifique pour l'utilisation de composés fluorés, en particulier pour l'incorporation des biovecteurs. Une deuxième catégorie d'émulsions est celle des nanoémulsions pour l'imagerie de fluorescence, ne comprenant typiquement pas de composés fluorés, et utilisant des nanocristaux d'oxydes métalliques. Le document WO2010/018222 décrit de telles nanoémulsions comprenant : - une solution aqueuse - une phase lipidique dispersée (huile) formant des nanogouttelettes lipidiques dans la solution aqueuse, les nanogouttelettes incorporant des nanocristaux typiquement d'oxydes métalliques ayant - un tensioactif (phospholipides par exemple) pour stabiliser les nanogouttelettes. Les huiles suggérées par le WO2010/018222 (désignées lipides de solubilisation dans ce document) sont des huiles saturées ou des huiles insaturées (soja, lin, palme, tournesol Une huile saturée préférée présentée en détail est la Suppocire® (Gattefosse), huile saturée qui comprend une quantité très faible de glycérides en C8-C10 (moins de 2%). Cette huile solide à température ambiante, fluide à température corporelle, est autorisée chez l'homme, mais ne peut être utilisée pour former une composition de produit de contraste injectable à administration intra veineuse (qui doit être fluide à température ambiante). La teneur en phase lipidique dispersée de ces émulsions est très variable, indiquée comme comprise entre 20 et 40%. Les exemples indiquent une quantité élevée de tensioactifs (de l'ordre de 20% en poids de composition). Il est fait mention de l'ajout possible, en plus des nanocristaux et non à leur place, de chélates de lanthanides. Ces émulsions comprennent nécessairement en outre un co-tensioactif (myrj® notamment) destiné à améliorer le contrôle de la taille et de la stabilité physico-chimique dans le temps (au moins 6 mois) des nanoémulsions. En effet sans ce co-tensioactif, les propriétés ne sont pas satisfaisantes comme l'expliquent en détail les auteurs de ce document. Une troisième catégorie d'émulsions est celle des nanoémulsions essentiellement thérapeutiques (encapsulation de médicaments), sans coeur fluoré, et dont certaines variantes sont décrites comme utilisables pour de l'imagerie IRM. Le document US 2007/0148194 décrit de telles émulsions pouvant incorporer des chélates de lanthanides en particulier de gadolinium. Ces émulsions huile/eau comprennent : - une solution aqueuse - une phase lipidique dispersée (huile) formant des nanogouttelettes lipidiques dans la solution aqueuse - des tensioactifs (phospholipides par exemple) pour stabiliser les nanogouttelettes. Ce document décrit spécifiquement l'utilisation d'huile riche en acides oméga 3 et 6 notamment (acide linoléique en particulier). Les huiles utilisées sont des huiles insaturées riches en acides gras à longue chaîne (acides en C18). Le taux d'acides gras à courtes chaînes (C8 et CIO notamment) est très faible. La teneur en phase lipidique dispersée de ces émulsions est très variable, indiquée comme comprise entre 5 et 40%, et la gamme possible de tensioactifs est très large (0,5 à 15% en poids de la composition). Ce document ainsi que sa procédure d'examen accessible au public insistent sur l'importance d'utiliser ces huiles insaturées ayant une concentration d'au moins 20% en acides gras polyinsaturés oméga 3, pour obtenir l'effet biologique recherché, et plus exactement le passage des barrières biologiques des organes sans effet toxique pour les organes ou les tissus. Toutefois, ces compositions utilisant des huiles polyinsaturées posent plusieurs problèmes techniques : - les huiles polyinsaturées oméga 3 et/ou oméga 6 ne sont pas bien adaptées pour des formulations pharmaceutiques injectables d'agents de contraste - les huiles insaturées sont sensibles à l'oxydation, d'où d'une part un problème de stabilité de l'émulsion dans la durée, notamment pour une conservation de plusieurs mois (typiquement pendant 3 ans pour les agents de contraste injectables), et d'autre part un risque (lié à la présence d'oxygène) d'altération du comportement paramagnétique du produit pour les examens d'imagerie médicale IRM. De plus, une quantité de tensioactif de plus de 3% de la composition en poids, et notamment de l'ordre de 3% à 5% se traduit par : - la formation dans la composition, en plus des nanogouttelettes, de micelles (nanoparticules dépourvues de coeur huileux) dont le retrait nécessiterait pour une production à l'échelle industrielle de centaines de tonnes de produit de contraste, des étapes de séparation et de purification complexes et coûteuses et donc une chute du rendement industriel - un risque d'une quantité trop élevée de chélates de lanthanides administrée au patient, avec les risques de tolérance dus aux lanthanides libres en solution que veut absolument éviter l'homme du métier - la difficulté voire l'impossibilité d'incorporer aux nanoparticules une quantité appropriée de chélates et de ligands de ciblage biologique dont le coût est très élevé : les tensioactifs lipides amphiphiles ont un pouvoir tensioactif plus fort que les biovecteurs amphiphiles et vont préférentiellement former la couche autour de l'huile (et/ou la couche de lipides amphiphiles tensioactifs se forme à partir de ces lipides avant même que les biovecteurs n'aient le temps de s'intégrer au sein de cette couche). Encore plus précisément : - lorsque la quantité totale de tensioactifs (tensioactif type lipoïde ou analogue, chélate amphiphile, ligand de ciblage amphiphile) formant des nanogouttelettes est atteinte, les composés amphiphiles de la solution viennent former rapidement des micelles, et la solution contient alors beaucoup plus de micelles que de nanogouttelettes - le prix de revient industriel des nanoémulsions est pour environ au moins 80 à 90% représenté par le ligand de ciblage rendu amphiphile, on comprend donc qu'une perte de ligands de ciblage génère des surcoûts industriels beaucoup trop importants - si la quantité de lipides amphiphiles tensioactifs (composés non vectorisés) est trop importante, les ligands de ciblage amphiphiles ne peuvent s'intégrer de manière satisfaisante dans la couche amphiphile autour de l'huile, ce qui génère une perte d'affinité très importante et rend le produit inapproprié pour un ciblage spécifique du territoire pathologique. D'ailleurs, ce document US 2007/0148194 décrit l'utilisation de molécules pharmaceutiques utilisées comme médicament de traitement thérapeutique, et non comme agent de vectorisation de la nanoémulsion pour une imagerie moléculaire spécifique. Ce document antérieur distingue d'une part le médicament thérapeutique (paclitaxel par exemple), et l'agent de contraste (chélate de lanthanide). Selon la compréhension du demandeur de ce document au vu de l'état de la technique, de telles nanoémulsions n'atteignent pas le territoire biologique cible à l'aide de ligands de ciblage. Ces nanoémulsions antérieures arrivent de manière non spécifique, jusqu'à la zone tumorale, typiquement par mécanisme de diffusion désigné EPR et connu de l'homme du métier (décrit par exemple dans H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, K. Hori, Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics : A review, J. Control. Release, 65 (2000) 271-284) : les nanosystèmes encapsulant les médicaments arrivent par diffusion sanguine jusqu'aux zones tumorales qui sont très vascularisées. Les nanoémulsions du demandeur sont très avantageusement biovectorisées car destinées au contraire à l'imagerie moléculaire diagnostique : les nanogouttelettes de la nanoémulsion présentent, incorporés au niveau de la couche formée par les tensioactifs, un ou plusieurs biovecteurs ou ligands de ciblage spécifiques qui viennent reconnaître spécifiquement par interaction moléculaire (affinité cible/ligand) la cible biologique (récepteur, enzyme ...) dont l'expression est modifiée dans la zone pathologique. Ces ligands de ciblage sont également désignés pharmacophores ou ligands de reconnaissance par l'homme du métier. Or un problème technique très difficile à résoudre est précisément d'incorporer de manière appropriée et stable dans la durée un ou plusieurs ligands de ciblage pour l'imagerie moléculaire, en quantité suffisante pour obtenir une spécificité du marquage, mais pas trop élevée pour éviter des prix de revient industriels trop élevés. Au vu de cet art antérieur complexe, on voit la difficulté d'obtenir des nanoémulsions vectorisées pour IRM, à la fois chimiquement industrialisables et stables, et biologiquement performantes. Un raisonnement consistant à partir notamment du document US 2007/0148194 et dire qu'il suffisait de faire varier des teneurs en tensioactifs serait un raisonnement a posteriori une fois l'invention identifiée, de nombreuses possibilités s'étant en fait présentées à l'homme du métier pour améliorer l'art antérieur. Le demandeur a réussi à obtenir des nanoémulsions de lanthanides, sous forme de nanogouttelettes vectorisées et résolvant les problèmes techniques de l'art antérieur. En particulier le demandeur a réussi à sélectionner des compositions optimisées comprenant suffisamment de tensioactif pour stabiliser la taille des nanoparticules, mais pas trop pour éviter l'incorporation insuffisante des ligands. Dans les émulsions essentiellement thérapeutiques de l'art antérieur, le composé thérapeutique est essentiellement encapsulé à l'intérieur de la nanogouttelette, souvent en mélange avec les glycérides de l'huile. Dans les nanoémulsions du demandeur, le ligand de reconnaissance doit pouvoir se loger au sein de l'interface huile/eau, en s'ancrant dans la membrane/pellicule amphiphile des tensioactifs. Il n'était pas du tout évident pour l'homme du métier de trouver les bons composés et les bons rapports de quantités entre les tensioactifs, l'huile, et les ligands, qui permettent d'obtenir des nanoémulsions efficaces en imagerie moléculaire et sans une perte de ligands de ciblage très onéreux. A cet effet l'invention concerne selon un premier aspect une composition de nanoémulsion huile dans eau pour IRM, comprenant : - une phase aqueuse, représentant 70 à 90% en poids de la composition, avantageusement 75 à 85%, plus avantageusement de 78 à 82% - une phase lipidique comprenant une huile, représentant 9,5 à 29,5% en poids de la composition, avantageusement 14 à 24,5%, plus avantageusement 17 à 21%, - un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et lipidique, le tensioactif comprenant au moins un chélate de métal paramagnétique amphiphile et éventuellement un lipide amphiphile ; - la teneur totale en tensioactif en poids par rapportau poids total de l'huile de la phase lipidique étant comprise entre 4 et 10%, avantageusement entre 5 et 8 % ; - la teneur totale en tensioactif en poids par rapport au poids total de la composition étant comprise entre 0,35 et 2,95%, avantageusement entre 0,5 et 2 % ; - l'huile comprenant au moins 70% en poids, avantageusement au moins 80%, de façon 20 avantageuse au moins 95%, notamment au moins 97 %, d'acides gras saturés en C6-C18, avantageusement en C6-C14, plus avantageusement en C6-C10. Très avantageusement la phase lipidique est constituée par l'huile. Très avantageusement le tensioactif comprend en outre au moins un ligand de ciblage amphiphile. 25 Avantageusement, la nanoémulsion ne comprend pas de nanocristaux métalliques. Les acides gras saturés se trouvent avantageusement sous la forme de triglycérides d'acides gras saturés. Avantageusement, l'huile comprend au moins 70%, de préférence au moins 80, 90, 95, 97 % d'acides gras saturés en C6-C10. L'homme du métier comprend que le tensioactif à l'interface est représenté par 30 l'ensemble des tensioactifs utilisés, c'est à dire comme expliqué en détail dans la demande : des lipides amphiphiles présents ou non selon les modes de réalisation, des molécules de chélates amphiphiles, des ligands de ciblage amphiphiles s'ils sont présents, et le cas échéant d'autres composés tels que des dérivés pégylés (lipides couplés à des PEG). De par leur structure amphiphile, les molécules de ligands de ciblage amphiphiles jouent un rôle de tensioactif étant précisé que leur quantité est faible par rapport aux autres composés amphiphiles utilisés. Il est précisé que compte tenu notamment du volume injectable aux patients, de l'ordre de 10 à 50 ml, l'huile est utilisée à un taux suffisamment élevé, d'au moins 9,5%, afin d'avoir une solution suffisamment concentrée et un signal en IRM suffisant. Il est nécessaire d'avoir une concentration adaptée pour la durée d'injection, le moment de l'acquisition du signal et le traitement associé des données par le praticien. Une solution trop diluée la rendrait inutilisable pour les examens d'imagerie médicale. La concentration en émulsion de la composition diagnostique injectée au patient est avantageusement comprise entre 0,1 à 20 ml/Kg de poids corporel. Pour un volume d'agent de contraste injecté de l'ordre de 5 à 50 ml, la concentration de l'agent de contraste est avantageusement de l'ordre de 0,1 à 20 ml/Kg de poids corporel, notamment 1 à 10 et typiquement 5 ml/Kg de poids corporel. Avantageusement, la quantité de chélate de lanthanide est de l'ordre de 1 à 100 µMol Gd/Kg notamment 1 à 10 µMol Gd/Kg, ce qui permet d'obtenir une bonne qualité du signal en IRM. Les produits (nanoémulsions) vectorisés du demandeur ont une taille des particules suffisamment petite pour leur permettre de circuler dans les milieux biologiques sans dégradation du produit, jusqu'à la cible du ligand de ciblage fixé aux goutelettes. La taille est typiquement de 30 à 300 nm, avantageusement 50 à 250 nm, notamment 100 à 200 nm, en particulier 150 à 200 nm. Avantageusement, les nanogouttelettes comprennent chacune un nombre de ligands de ciblage de l'ordre de 100 à 5000, notamment 500 à 3000, notamment 1800 à 2500 (par exemple 2000) ce qui permet le ciblage efficace selon l'affinité et la multivalence du ligand de ciblage. Les résultats biologiques obtenus grâce aux nouvelles nanoémulsions du demandeur montrent de plus que les ligands de ciblage sont avantageusement répartis sur l'ensemble de la surface externe des nanogouttelettes, ce qui se traduit par une multivalence optimisée des ligands de ciblage. Les ligands de ciblage amphiphiles représentent avantageusement 0,01 à 10% en poids du poids total des tensioactifs, avantageusement 0,05 à 5%, notamment 0,05 à 1 %. Le produit de contraste injecté ayant les compositions de nanoémulsions décrites ont une affinité avantageusement de l'ordre de 0,1 à 100 nM, notamment 1 à 50 nM, avantageusement 1 à 10 nM (l'affinité par ligands de ciblage amphiphile, autour de 0,1 à 100 µM est multipliée par le nombre de ligands de ciblage par nanoparticule). Avantageusement la composition comprend 0,001 à 0,1 % en poids de ligand de ciblage amphiphile par rapport au poids total de la composition, notamment 0,01 à 0,1%. Les nanoémulsions du demandeur ont en outre l'avantage de pouvoir contrôler le type et la quantité de ligands de ciblage, et notamment de pouvoir incorporer des ligands de ciblage différents. Par exemple une nanogouttelette comprendra : - un ligand de ciblage amphiphile qui permet l'accession à une zone physiologique pathologique, par exemple un ligand de ciblage de passage à travers la BHE (barrière hémato encéphalique) - un autre ligand amphiphile de ciblage qui permet ensuite le ciblage d'un marqueur biologique cible surexprimmé par certaines cellules de cette zone pathologique Les interactions moléculaires entre le ligand de ciblage et le marqueur biologique cible permettent la captation des nanogouttelettes au niveau de la zone pathologique, et l'imagerie IRM qui en résulte permet de localiser précisément la zone pathologique. Dans le cadre de la présente invention, on entend par le terme « acide gras » désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d'au moins 6 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 atomes de carbone et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 atomes de carbone. On parle au contraire d'acide gras à courte chaîne pour une longueur de 6 à 10 atomes de carbone, en particulier 8 ou 10 atomes de carbone. L'homme du métier connaît la nomenclature associée et en particulier utilise : - Cn-Cp pour désigner une fourchette d'acides gras en Cn à Cp - et Cn+Cp, le total des acides gras en Cn et des acides gras en Cp Par exemple : - les acides gras ayant entre 14 et 18 atomes de carbone s'écrivent acides gras en C14-C18 - le total des acides gras en C16 et des acides gras en C18 s'écrit C16 +C18 Très avantageusement, l'huile comprend moins de 10% en poids, de préférence moins de 5% en poids d'acides gras insaturés, en particulier moins de 5% en poids, et de préférence moins de 2%, moins de 1% en poids d'acides gras insaturés en C14-C18 ou en C14-C22. Par exemple l'huile est le MIOLYOLe O 0 ~OH R-0 0 \r-O R c (R = chaîne alkyle en C8+C10)>95% P03040 , ou l'un des ses dérivés connus, par exemple le MIGLYOL 810® ou MIGLYOL 812® (caprylic/capric triglyceride), MIGLYOL 818® (caprylic/capric/linoleic triglyceride), le MIGLYOL 612® (glyceryl trihexanoate), d'autres dérivés MIGLYOL propylène glycol dicaprylate dicaprate. Par exemple le Miglyol 812® a la composition suivante : Acide Caproïque (C6) : max 2 % en poids Acide Caprylique (C8) : 50 à 65 % en poids Acide Caprique (Cio) : 30 à 45 % en poids Acide Laurique (C12) : max 2 % en poids Acide Miristique (C14) : max 1 % en poids Acide Linoleique (C18) : - Selon des variantes, l'huile de la phase lipidique est un mélange d'huiles comprenant chacune au moins 70% en poids, de préférence au moins 80, 90, 95% d'acides gras saturés de 6 à 10 atomes de carbone. On rappelle que le terme «tensioactif» fait référence dans le cadre de la présente invention à des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés. De préférence, les acides gras saturés des huiles de la phase lipidique utilisées par le demandeur se trouvent sous forme de mono, di ou triglycérides, de préférence triglycérides. De manière préférée, l'huile de la phase lipidique des émulsions du demandeur comprend des acides gras saturés dans les proportions suivantes (%poids/poids) : - en C6-C18 > 70%, de préférence > 80% de préférence >95%, et encore de préférence > 98% - ou en C6-C14 > 70%, de préférence > 80% de préférence >95%, et encore de préférence > 98% 9 - ou en C8+C10 > 70%, de préférence > 80% de préférence >95%, et encore de préférence > 98% - ou en C8 compris entre 40 et 70% de préférence 50 à 65% et/ou en C10 compris entre 20 et 50% de préférence 30 à 45%, le total C8+C10 étant supérieur à 80%. Selon des réalisations préférées, la nanoémulsion huile dans eau selon l'invention a pour composition en poids : 1) 70 à 90% en poids de phase aqueuse, avantageusement 75 à 85%, plus 10 avantageusement de 78 à 82% 2) 9,5 à 29,5% en poids de phase lipidique comprenant une huile, avantageusement 14 à 24,5%, plus avantageusement 17 à 21 %; 3) 0,38 à 2,95% en poids de tensioactif (c'est-à-dire représentant 4 à 10% en poids de la phase lipidique), avantageusement 0,5 à 2% en poids, le tensioactif comprenant 50 à 95% 15 en poids de lipide amphiphile, 49 à 49,9% en poids de chélate de métal paramagnétique amphiphile, avantageusement 5 à 30% en poids de chélate de métal paramagnétique amphiphile, 0,1 à 5% en poids de ligand de ciblage amphiphile. Avantageusement la partie chélate, du chélate de métal paramagnétique amphiphile est un 20 chélate macrocyclique choisi parmi : DOTA, DO3A, HPDO3, BTDO3A, PCTA et tout dérivé connu de ces chélates, notamment décrit par exemple dans Mini Reviews in Medicinal Chemistry,2003,vol 3,n°8, DOTAM, DOTMA, DOTA-GA, AAZTA, HOPO et leurs multimères et dérivés sur lequel est greffé une chaîne hydrophile. 25 Selon des réalisations préférées, la nanoémulsion lipidique a pour composition en poids : 1) 70 à 90% en poids de phase aqueuse, avantageusement 75 à 85%, plus avantageusement de 78 à 82% 2) 9,5 à 29,5% en poids de phase lipidique comprenant une huile, avantageusement 14 à 24,5%, plus avantageusement 17 à 21 %; 30 3) 0,38 à 2,95% en poids de tensioactif, le tensioactif comprenant 95 à 99,95 % de chélate de métal paramagnétique amphiphile et 0,05 à 5% de ligand de ciblage amphiphile. Dans cette réalisation, le chélate assure un rôle de tensioactif suffisant permettant de ne pas utiliser de lipide amphiphile tensioactif. Le chélate de métal paramagnétique amphiphile est alors avantageusement le chélate PCTA amphiphile ou l'un de ses dérivés connus, notamment décrit dans WO2006100305 en particulier les composés de formule I page 52 à 55 de ce document. Selon des réalisations préférées, la nanoémulsion huile dans eau a pour composition en poids : 1) 70 à 90%, de préférence 75 à 85%, avantageusement 78 à 82%, notamment 79 à 81 % de phase aqueuse 2) 9,5 à 29,5%, de préférence 14 à 24,5%, avantageusement 17 à 21% d'huile (la phase lipidique étant constituée par une huile), l'huile comprenant au moins 70% en poids, de préférence au moins 80, 90, 95% d'acides gras saturés en C6-C14, de préférence en C6-C10 3) 0,38 à 2,95%, avantageusement 0,5 à 1,5% de tensioactifs totaux étant précisé que les total des pourcentages de 1), 2) et 3) est égal à 100% ; Selon des réalisations les tensioactifs totaux comprennent en poids : 3.1) 0 à 90% de lipides amphiphiles 3.2) 9,99 à 99,99 %, avantageusement 10 à 40% de chélates de métal paramagnétique amphiphiles 3.3) 0,01 à 10%, avantageusement 0,05 à 5% de ligands de ciblage amphiphiles 3.4) 0 à 30% de dérivé amphiphile pégylé. En particulier, les réalisations suivantes sont avantageuses : % en poids de % en poids % en poids de tensioactif % en poids de tensioactif phase aqueuse d'huile par rapport à l'huile par rapport à la (1) (2) (3) composition totale (4) 70-90 9,5 - 29,5 4 à 10 % de (2) [0,38 - 2,95] % (*) 75-85 14-24,5 4 à 10 % de (2) [0,56 - 2,5] % 78-82 17-21 4 à 10 % de (2) [0,68 - 2,1] % 75-85 14-25 5 à 8 % de (2) [0,7 - 2] % 78-82 17-21 5 à 8 % de (2) [0,85 - 1,68] % Etant précisé que le total (1) + (2) + (3) = 100% (*) la gamme [0,38 - 2,95] correspond à 0,04*9,5 = 0,38 % et 0,1*29,5= 2,95 Ces gammes sont préférées notamment dans la mesure où elles permettent d'obtenir une taille des nanoparticules comprise entre 150 et 300 nm, et en particulier autour de 150 à 200 nm. La taille et la stabilité des particules sont très satisfaisantes, ainsi que la viscosité (de l'ordre de 2 à 3 mPa). Leur comportement est newtonien, ce qui constitue un avantage important pour des solutions pharmaceutiques injectables. Le demandeur a pu constater qu'au delà de 30% en poids d'huile dans la composition, celle-ci adopte un comportement trop rhéofluidifiant et/ou une viscosité (la viscosité devenant alors supérieure à des valeurs de 4 à 5 mPa) non adaptées pour l'injection intraveineuse. De plus les formulations obtenues sont iso-osmolaires, ce qui évite des désagréments pour le patient lors de l'injection. En outre la quantité de chélates de lanthanides et la quantité de ligands de ciblage greffés aux nanoparticules sont très bien adaptées pour l'imagerie IRM. La composition est de plus capable de supporter la stérilisation à la chaleur, typiquement par autoclavage. L'invention concerne aussi un agent de contraste comprenant une composition telle que décrite précédemment. On a par exemple les gammes de proportions suivantes des constituants (% en poids). Phase Phase Teneur (%) Teneur (%) Teneur % Teneur % Teneur % aqueuse de lipidique en en lipides en chélates en lipides en ligands la (huile + tensioactifs amphiphiles de métal pégylés des de ciblage composition tensioactif) de l'huile des paramagné- tensioactifs amphiphiles (a) en % de la (c) tensioactifs tique des composition amphiphiles tensioactifs (b) des tensioactifs 25 75 à 85, de 14 à 24,5, 5 à 10, de 70 à 95 4,95 à 25 0 0,05 à 5 préférence de préférence 5 78 à 82, de préférence à 8, de préférence 17 à 21, de préférence 6 80 préférence 20 75 à 85, de 14 à 24,5, 5 à 10, de 55 à 90 4,95 à 25 5 à 15 0,05 à 5 préférence de préférence 5 78 à 82, de préférence à 8, de préférence 17 à 21, de préférence 6 80 préférence 20 75 à 85, de 14 à 24,5, 5 à 10, de 0 90 à 99,95 0 à 5 0,05 à 5 préférence de préférence 5 78 à 82, de préférence à 8, de préférence 17 à 21, de préférence 6 80 préférence 20 Le total dans le tensioactif des teneurs en lipides amphiphiles, chélates de métal paramagnétique amphiphiles, lipides pégylés, ligands de ciblage amphiphiles, est de 100%. Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, les stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique, les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement lipophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan, les lipides polymérisés, les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose, les tensioactifs peuvent être utilisés seuls ou en mélanges. Le lipide amphiphile est incorporé dans la couche formée à l'interface stabilisant la phase dispersée, où il est susceptible de se coupler par exemple avec un composé réactif présent dans la phase aqueuse. Avantageusement le lipide amphiphile est un phospholipide, de préférence choisi parmi : phosphatidylcholine dioléoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distéaroylphosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine, sphingomyéline, phosphatidylsérine, phosphatidylinositol ou la lécithine. La lécithine est un lipide amphiphile préféré. Avantageusement le lipide amphiphile est un lipoïde, notamment l'EPC® (Ethyl Phospho Choline et ses dérivés connus notamment de Avanti Polar Lipids) ou le lipoide S75® 0 R1 Â0 0 RyO~.' O I O O / C O R1 Â0 RyO~/O-P O~~NH3 Il O O OH O~/OF0- /1 O O mix (R et R1= alkyle en C8+ C10) >95% Phosphatidylcholine (+LPC) : 68 à 73 % en poids Phosphatidylethanolamine : 7 à 10 % en poids Lysophosphatidylcholine : On pourra utiliser pour la phase amphiphile, en plus du chélate de métal paramagnétique et du lipide amphiphile, de manière non obligatoire, et en particulier afin d'agir sur le caractère furtif du produit dans l'organisme, des lipides pégylés c'est à dire porteurs de groupes oxyde de polyéthylène (PEG), tels que le polyéthylèneglycol/phosphatidyléthanolamine (PEG-PE). Par « polyéthylèneglycol » PEG, au sens de la présente C C demande, on désigne de façon générale, des composés comprenant une chaîne -CH2-(CH2-O-CH2)k-CH2OR3 dans laquelle k varie de 2 à 100 (par exemple 2, 4, 6, 10 ou 50), et R3 est choisi parmi H, alkyle ou -(CO)Alk, le terme "alkyle" ou "alk" désignant un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, ayant environ de 1 à 6 atomes de carbone dans la chaîne. Le terme « polyéthylèneglycol » tel qu'employé ici englobe notamment les composés aminopolyéthylèneglycols. On citera notamment les PEG 350, 750, 2000, 3000, 5000, modifiés par ajout de groupements amphiphiles pour s'insérer au sein de la couche de tensioactif de la nanoparticule, notamment : - 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)- 350] - 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-550], - 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-750] On utilisera notamment le lipide pégylé : O H O \ O NH4(v) O La phase aqueuse est avantageusement de l'eau ou une solution aqueuse 20 pharmaceutiquement acceptable telle qu'une solution saline, une solution tampon. Par chélate de métal paramagnétique amphiphile on entend au sens de la présente invention que le chélate qui est en général hydrophile a été modifié chimiquement de manière à présenter une queue lipophile qui puisse s'ancrer au sein de la couche de 25 tensioactifs de la nanoparticule et de manière à former une composition lipidique suffisamment stable pour une utilisation diagnostique satisfaisante. On aura par exemple, de manière non limitative, un choix des groupements lipophiles greffés sur le chélate de métal paramagnétique tel que la valeur HLB (la balance hydrophile / lipophilie) du chélate amphiphile ainsi obtenu soit de l'ordre de 12 à 20. 30 En plus du lipide amphiphile, les chélates de métal paramagnétique amphiphiles utilisés par le demandeur jouent le rôle de tensioactif, tout en ayant l'avantage d'apporter une quantité très élevée d'entités signal à la nanoparticule. Avantageusement le nombre de chélates de lanthanide par nanogouttelette est d'au moins 1000 et typiquement au moins 5000, 10 000, 20 000, 50 000 à 100 000. On décrit plus précisément à titre d'exemples des chélates pouvant être utilisés, dans la mesure ou comme décrit plus haut ils comprennent au moins un groupe lipophile d'ancrage à la nanoparticule lipidique (queue lipophile). Le demandeur décrit les chélates utilisables, étant précisé que les chélates particulièrement avantageux pour ses nouvelles émulsions sont des chélates macrocycliques. En effet des nanosystèmes lipidiques utilisant des chélates macrocycliques sont significativement moins exposés que les chélates linéaires à un risque de transmétallation au zinc en particulier, qui s'accompagne d'un risque de libération non souhaitée de lanthanide, en particulier du gadolinium Gd3+ toxique. On pourra utiliser les chélates macrocycliques notamment de formule suivante (illustration avec le gadolinium Gd, d'autres lanthanides étant aussi appropriés) sur lesquels seront greffés la queue lipophile afin de les rendre amphiphiles. R avec : M-M1-M2 forme un noyau pyridine ou M1 et M2 sont absents et M représente une liaison ou M est N-R et Ml et M2 représentent un atome d'hydrogène ou un méthyle avec R est choisi indépendamment parmi CH2CO2- ou H ou CHX-CO2-, avec au moins un R étant CHXCO2- et X étant l'endroit où se greffe la queue lipophile On pourra utiliser notamment un chélate macrocyclique parmi 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetic acide (DOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triacetic acide (DO3A), 10-(2-hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7- triacetic acide (HPDO3A), (MCTA), (DOTMA), 3,6,9,15- tetraazabicyclo [9.3.1]pentadeca-1(15),11,13-triene-3,6,9-triacetic acide (PCTA). On pourra aussi utiliser des dérivés dans lesquels un ou plusieurs groupes carboxyliques sont sous forme d'un sel, ester, amide correspondant ; ou un composé correspondant dans lequel un ou plusieurs groupes carboxyliques sont remplacés par un groupe phosphonique et/ou phosphinique. On peut aussi utiliser un chélate parmi : DOTA gadofluorines, DO3A, HPDO3A, BTDO3A, DOTAM, DOTMA, DOTAGA, AAZATA, HOPO, TETA, TRITA, HETA, DOTA-NHS, M4DOTA, M4DO3A, PCTA et leurs dérivés. On pourra utiliser un chélate linéaire connu choisi parmi : EDTA, DTPA diéthylènetriaminopentaacétique acide, N- [2- [bis(carboxyméthyl)amino] -3 -(4-ethoxyphenyl)propyl] -N- [2- [bis(carboxyméthyl)amino] éthyle] -L-glycine (EOB-DTPA), N,N-bis [2- [bis (carb oxyméthyl) amino ] éthyle] -L- glutamique acide (DTPA-GLU), N,N- bis[2-[bis(carboxyméthyl)amino]éthyle]-L-lysine (DTPA-LYS), des dérivés mono- ou bis- amide du DTPA, tels que N,N-bis[2- [carboxyméthyl[(méthylcarbamoyl)méthyle]amino]éthyle] glycine (DTPA-BMA), 4- carb oxy-5, 8, 1 1 -tris(carb oxyméthyl) - 1 -phenyl-2- oxa-5, 8, 1 1 -triazatridec an- 1 3 - oic acide (BOPTA), De manière plus large, le ou les chélates de métal paramagnétique formant l'entité signal pourront répondre à la formule du document WO01/60416 ou WO03/062198 (page 23 à 4 E7 A2' E\Ae~-E\A7 Ea \Es \Ee A~ A5 A8 As f Es \A'-E. E6-A6 A EtA \ la A8 Es A_\ E7 A7 25). On pourra utiliser en particulier les composés DOTA, NOTA, DO3A, AAZTA, HOPO, ainsi que leur multimères et dérivés connus notamment : ''A2 HN NH, Y O)--N N p (} N K-~ N A X o o o Y X )-HN f 'N X O O O X o OX o N/-I Xo t-N'jT >r Y> o, , and avec X un groupe capable de coordiner un cation métallique, de préférence O-, OH, NH2, OP03-, NHR avec R une chaîne aliphatique. On citera aussi les chélates rappelés dans W003/011115 pages 8 à 11. 5 Comme exemples de chélates macrocycles de métal paramagnétique amphiphiles très avantageux, on peut citer les structures suivantes dérivés des coeurs PCTA et DOTA. o 20 o o Les formules sont présentées dans la demande notamment dans les exemples détaillés avec des groupes de liaison entre le chélate et la chaîne carbonée lipophile (ou queue lipophile). Un grand nombre de groupes de liaison sont utilisables, par exemple : rien ou une simple liaison, les groupes alkyle ou alkylène C1-10, par exemple C1-6 alkylène, PEG par exemple CH2-(CH2-O-CH2)k-CH2 avec k =1 à 50 notamment là 10, (CH2)3- NH, NH-(CH2)2-NH, NH-(CH2)3-NH, , (CH2),,, (CH2)ri CO-, -(CH2)'NH-CO- avec n = 2 à 10 , (CH2CH2O)q(CH2)r CO- , (CH2CH20)q(CH2)rNH-CO- avec q = 1-10 et r=2-10, (CH2)'-CONH - , (CH2)ri CONH - PEG, (CH2)'-NH- HOOC-CH2-O-(CH2)2-0-(CH2)2-0-CH2-000H ; HOOC-(CH2)2-CO2-(CH2)2-OCO-(CH2)2-COOH ; HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH; HOOC-(CH2)'-COOH; NH2-(CH2)'-NH2, avec n=0-20; NH2-(CH2)n CO2H ; NH2-CH2 - (CH2-O-CH2)ri CO2H avec n=1 à 10, Pl-l-P2, identiques ou différents, P1 et P2 étant choisis parmi O, S, NH, rien, CO2, NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH-, NHSO2-, squarate avec 1 = alkyle, alkoxyalkyle, polyalkoxyalkyle (PEG), alkyle interrompu par un ou plusieurs squarates ou par un ou plusieurs aryles, avantageusement phényles, alcényle, alcynyle, alkyle interrompus par un ou plusieurs groupes choisis parmi -NH-, -0-, - CO-, -NH(CO)-, -(CO)NH-, -O(CO)-, ou -(OC)O- ). Comme exemples de chélates de métal paramagnétique de type DTPA amphiphiles on utilisera ceux des exemples détaillés ou d'autres tels que : On rappelle que pour obtenir des chélates macrocycliques particulièrement préférés pour les nouvelles nanoémulsions, du type DO3A, BT-DO3A, HP-DO3A,DOTA, DOTAM, DOTMA, DOTA-GA, et autres chélates macrocycliques porteurs de chaînes carbonées, on utilisera par exemple le 1,4,7,10-tetraazacyclododécane ou dérivés, préparés comme cela est connu de l'homme du métier, à partir de la diéthylène triamine ou d'autres dérivés polyazotés linéaires. On rappelle que le 1,4,7,10-tetraazacyclododécane est habituellement obtenu à partir de dérivés bicycliques ou de composés tétracycliques (tels que le 2a,4a,6a,8a-décahydrotétraazacyclopenta[fg] acénaphthylène). Ces composés tétracycliques sont eux-même obtenus typiquement dans un procédé comprenant une étape d'addition à la diéthylène triamine d'agents connus tels que le benzotriazole ou des composés (R1R2) CH- CH (R3R4), des composés mono ou dicarbonylés R1C(=O) - C(=O)R2, des composés CSNH2 - CSNH2, avec Rl à R4 étant notamment H, OH, CH3, un alkyle en C1-C3, un halogène. Cette addition conduit à des composés à trois cycles connus tels que le 3H,6H-2a,5,6,8a-Octahydro-tétraazaacénaphthylène, obtenu par exemple à partir du glyoxal (et décrit notamment dans Tetrahedron Letters, vol 22, n°18, 1980, pp1711-1714 ), composés à trois cycles auxquels sont ensuite greffés des agents bialkylant variés [Xl - A - Xl] avec Xl représentant un groupe partant ( par ex halogènes, tosyl, mesyl etc ...), comprenant typiquement deux groupes partants. Les agents bialkylants connus sont typiquement le dichloroéthane ou le dibromoéthane. Le demandeur a d'ailleurs constaté qu'il était très avantageux d'utiliser des agents bialkylant [Xl - A - X2] comprenant des groupes partants Xl et X2 différents (halogènes, tosyl, mesyl etc ...), tels que le bromo chloro éthane, et le bromo chloro propane. En effet, le rendement de la réaction de bialkylation est significativement amélioré à l'échelle industrielle. Un procédé de préparation très avantageux de macrocycles polyazotés dont le 1,4,7,10-tetraazacyclododécane et le 1,4,8,11-tétraaza cyclotétradécane (cyclam), est un procédé comprenant les étapes successives suivantes : 1) addition à un composé à trois cycles azotés fusionnés, notamment à l'un des composés suivants : - 3H,6H-2a,5,6,8a-Octahydro-tétraaza-acénaphthylène, - octahydro-1,3 a,6 a, 9-tetraazaphénalène, - 5a,8b diméthyl- octahydro-2a,5,6, 8 a-tetraaza-ac énaphtylène - 9a,9b-diméthyl- octahydro-1,3a,6a,9-tetraazaphénalène - octahydro-2a,5,6,8a- tetraaza-acénaphtylène d'un agent bialkylant [Xl - A - X2] comprenant deux groupes partants Xl et X2 différents et choisis de préférence parmi halogène, tosyl, mesyl, A étant de préférence un alkylène linéaire ou ramifié, de préférence A étant CH2-CH2, Xl et X2 étant de préférence un halogène Cl ou Br, par exemple [Xl - A - X2] étant C1CH2- CH2Br pour obtenir des composés à quatre cycles azotés fusionnés, par exemple les composés : - 2a,4a,6a,8a- décahydrotétraazacyclopenta[fg]naphtylène - 8b-méthyl 2a,4a,6a,8a- décahydrotétraazacyclopenta[fg]acenaphthylène - 8b,8c diméthyl 2a,4a,6a,8adécahydrotétraazacyclopenta[fg] acenaphthylène - 9b,9c-diméthyl décahydro - 2a,4a,7a,9a tetraaza cyclopenta [cd]phénalène - décahydro - 2a,4a,6a,8 a tetraaza cyclopenta [fg] acenaphthylène - 10b,1 Oc-diméthyl décahydro - 3a,5a,8a,10a tetraaza pyrène - décahydro - 3a,5a,8a,10a tetraaza pyrène 2) hydrolyse, par exemple comme décrit dans l'art antérieur par addition d'une solution aqueuse d'acide chlorydrique, de manière à obtenir le 1,4,7,10- tetraazacyclododécane ou le cyclam ou leurs dérivés substitués sur au moins un carbone du cycle par un groupement aliphatique notamment alkyle ou alkyle-aryle, éventuellement substitués ou interrompus par OH, O, N , CONH, NHCO, - OCO-alkyl, -COO-alkyl 3) le cas échéant alkylation, par des agents alkylants appropriés connus notamment de EP 499 501 ou EP 287 465, par exemple en utilisant l'acide chloroacétique, l'acide bromoacétique, le bromoacétate de terbutyle et l'acide trifluoracétique, le cas échéant en présence d'une base telle que NaOH ou KOH ou LiOH ; de manière à obtenir les dérivés DO3A, BT-DO3A, HP-DO3A,DOTA, DOTAM, DOTMA, DOTA-GA le cas échant substitués sur au moins un carbone du cycle polyazoté. On rappelle que les métaux paramagnétiques incluent les lanthanides de nombre atomique 58-70 et les métaux de transition de nombre atomique 21-29, 42 or 44, par exemple scandium, titane, vanadium, chrome. Avantageusement le métal paramagnétique est choisi parmi les éléments : manganèse, fer, cobalt, nickel, cuivre, molybdène, ruthénium, cérium, praseodymium, neodymium, prométhium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, et ytterbium. On préfère particulièrement les éléments Gd(III), Mn(II), europium, dysprosium, avantageusement Gd. Dans le cas d'une utilisation en imagerie multimodale (par exemple IRM + PET) ou en médecine nucléaire (imagerie SPECT et/ou PET), les chélates peuvent être utilisés pour complexer un radioélément tel que le Technecium, l'Indium, le Gallium. L'invention concerne aussi les compositions décrites précédemment pour leur utilisation pour le diagnostique, avantageusement de maladies, notamment cancéreuses, neurodégénératives et/ou vasculaires et en particulier cardiovasculaires. Selon un autre aspect, le demandeur a réussi à montrer que l'utilisation dans la fabrication des nanoémulsions selon l'invention d'au moins un solvant, avantageusement le chlorophorme et/ou le méthanol, est très avantageuse pour améliorer la stabilisation du nanosystème, la relaxivité des chélates de lanthanides, le temps de demi-vie du produit. L'invention concerne ainsi également la préparation d'une émulsion du demandeur comprenant l'utilisation d'un solvant, avantageusement le chlorophorme et/ou le méthanol. Grâce à l'utilisation de tels solvants, la relaxivité par chélate pour un chélate de métal paramagnétique amphiphile de type q=1 (DOTA, HPDO3A par exemple) passe d'une valeur de 10 à environ 15 mM-is-i. Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de préparation d'une nanoémulsion huile dans eau selon l'invention comprenant les étapes : - préparation d'une phase lipidique comprenant o éventuellement un premier tensioactif lipide amphiphile o une huile comprenant au moins 70% en poids, de préférence au moins 80, 90, 95, 97 % d'acides gras saturés en C6-C18, avantageusement en C6-C14, et très avantageusement en C6-C10 o un chélate de métal paramagnétique amphiphile o éventuellement un ligand de ciblage amphiphile dissolution éventuelle de la phase lipidique dans un solvant ou un mélange de solvants puis élimination du ou des solvants - dispersion de la phase lipidique dans une solution aqueuse de manière à former une nanoémulsion huile dans eau - récupération de la nanoémulsion obtenue. Avantageusement la phase lipidique est obtenue en mettant ses composants dans un solvant approprié puis en évaporant le solvant. Les émulsions du demandeur sont des mélanges lipidiques hétérogènes obtenus de manière appropriée, avantageusement par agitation mécanique et/ou addition d'agents émulsifiants. Par exemple, on mélange mécaniquement la phase lipidique représentée par l'huile et les chélates rendus amphiphiles et les éventuels tensioactifs lipides amphiphiles et/ou ligands de ciblage amphiphile, avec des solvants organiques tels que le chloroforme. Après évaporation du solvant (de manière à former un film lipidique), la phase lipidique est remise en suspension en milieu aqueux (tel que du PBS ou la solution aqueuse de la demande), pour obtenir une émulsion qui subit typiquement une sonication et une microfluidisation. La nanoémulsion obtenue est alors utilisée pour l'administration au patient, le cas échéant après incorporation d'additifs pharmaceutiques variés. Les émulsions obtenues peuvent être lyophilisées avec le cas échéant utilisation d'agents anti agglutination. La composition formant l'agent de contraste est administrée de préférence en intravasculaire, selon le patient examiné, par exemple à raison de 0,1 mg à 1 g de composé chélate de métal paramagnétique amphiphile et de 1 à 50 micromoles d'ion de métal paramagnétique par kg de patient. Le demandeur a préparé de nouvelles émulsions, de préférence de lanthanides, ayant des compositions chimiques spécifiques, dont l'efficacité et la tolérance in vivo sont significativement améliorées. Selon des réalisations préférées les nanoémulsions lipidiques du demandeur sont vectorisées à l'aide de ligands de ciblage (également désignés pharmacophores ou biovecteurs de ciblage). La nanoémulsion comprend au moins un ligand de ciblage d'une zone pathologique ancré à la nanoparticule, typiquement à l'aide d'un groupe d'ancrage du ligand. Ce groupe d'ancrage constitue la partie lipophile du ligand de ciblage. Avantageusement le nombre de ligands par nanoparticule est d'au moins 1000 et typiquement de l'ordre de 1000, 2000, 5000, 10 000. Le biovecteur amphiphile s'écrit avantageusement sous la forme : Bio - L - Lipo dans laquelle : - Bio est la partie de ciblage biologique hydrophile localisée à la surface externe des nanogouttelettes - Lipo est un groupe lipophile permettant l'insertion du ligand de ciblage au sein de la couche de tensioactif - L est un groupe de liaison reliant Bio et Lipo, avantageusement choisi parmi : - rien ou une simple liaison, C1-6 alkylène, PEG par exemple CH2-(CH2-O-CH2)k-CH2, (CH2)3-NH, NH-(CH2)2-NH, NH-(CH2)3-NH, (CH2),,, (CH2)'-CO-, -(CH2)'NH-CO- avec n = 2 à 10 , (CH2CH2O)q(CH2)r CO- , (CH2CH2O)q(CH2)rNH-CO- avec q = 1-10 et r=2-10, (CH2)ri CONH - , (CH2)ri CONH - PEG, (CH2)ri NHHOOC-CH2-O-(CH2)2-0-(CH2)2-O-CH2-COOH ; HOOC-(CH2)2-CO2-(CH2)2-OCO-(CH2)2-COOH ; HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH; HOOC-(CH2)'-COOH; NH2-(CH2)'-NH2, avec n=0-20; NH2-(CH2)n CO2H ; NH2-CH2 - (CH2-O-CH2)ri CO2H avec n=1 à 10, squarate 30 P1-1-P2, identiques ou différents, P1 et P2 étant choisis parmi O, S, NH, rien, CO2, NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH-, NHSO2-, squarate avec 1 = alkyle, alkoxyalkyle, polyalkoxyalkyle (PEG), alkyle interrompu par un ou plusieurs squarates ou par un ou plusieurs aryles, avantageusement phényles, alcényle, alcynyle, alkyle interrompus par un ou plusieurs groupes choisis parmi -NH-, -0-, -CO-, -NH(CO)-, -(CO)NH-, -O(CO)-, ou -(OC)O- ) Les liaisons covalentes entre Bio et L sont avantageusement de type -CONH-, - COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS-NH-, -C-S-, -N-NH-CO-, -CO- NH-N-, -CH2-NH-, - N-CH2-, -N-CS-N-, -CO-CH2-S-, -N-CO-CH2-S-, -N-CO-CH2-CH2-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-O-, -O-N=CH- ou répondant aux formules suivantes : N H A titre de ligands de ciblage préférés Bio, on citera les ligands de ciblage des cibles biologiques dont l'expression est modifiée dans une zone pathologique (tumeur par exemple), par rapport à la zone saine. On utilise avantageusement comme pharmacophore ou ligand de ciblage au moins un ligand choisi parmi : les peptides (avantageusement de moins de 20 acides aminés, plus avantageusement de 5 à 10 acides aminés), les pseudopeptides, les peptidomimétiques, les acides aminés, les agents de ciblage d'intégrines (peptides et pseudopeptides, peptidomimétiques notamment), les glycoprotéines, les lectines, la biotine, les dérivés ptéroïques ou aminoptéroïques, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les anticorps ou fragments d'anticorps, l'avidine, les stéroïdes, les oligonucléotides, les séquences d'acide ribonucléique, les séquences d'acide désoxyribonucléique, les hormones, les protéines éventuellement recombinantes ou mutées, les mono- ou polysaccharides, les composés à squelette benzothiazole, benzofurane, styrylbenzoxazole/thiazole/imidazole/quinoline, et styrylpiridine et composés dérivés, et leurs mélanges. Les peptides, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les agents de ciblage d'intégrines (peptides et pseudopeptides, peptidomimétiques notamment), les agents de ciblage de récepteurs cellulaires ou d'enzymes (notamment de ciblage de kinases, notamment tyrosine kinase ; de métalloprotéases ; de caspases ...) sont particulièrement préférés. Selon des réalisations avantageuses, Bio est choisi parmi la liste suivante (les documents et références entre parenthèses sont des exemples et non une liste limitative) : 1) Les ligands ciblant des récepteurs VEGF et angiopoiétine (décrits dans WO 01/97850), les polymères tels que polyhystidine (US 6,372,194), les polypeptides ciblant la fibrine (WO 2001/9188), les peptides de ciblage d'intégrines (WO 01/77145, WO 02 26776 pour alphav beta3, WO 02/081497, par exemple RGDWXE), les pseudopeptides et peptides de ciblage de métalloprotéases MMP (WO 03/062198, WO 01/60416), les peptides ciblant par exemple le récepteur KDR/Flk-1 dont R-X-K-X-H et R-X-K-X-H, ou les récepteurs Tie-1 et 2 (WO 99/40947 par exemple), les glycosides de sialyl Lewis (WO 02062810 et « Müller et al, Eur. J. Org. Chem, 2002,3966-3973), les antioxydants tels que l'acide ascorbique (WO 02/40060), les ligands de ciblage de la tuftsine (par exemple US 6,524,554), de ciblage de récepteurs à protéine G GPCR en particulier la cholécystokinine (WO 02/094873), les associations entre antagoniste d'intégrine et mime de la guanidine (US 6 489 333), les quinolones ciblant alphav beta3 ou 5 (US 6,511,648), les benzodiazépines et analogues ciblant des intégrines (US A 2002/0106325, WO01/97861), les imidazoles et analogues (WO 01/98294), les peptides RGD (WO 01/10450), les anticorps ou fragments d'anticorps (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inductible par TNF ou IL (US 6,261,535), les molécule de ciblage modifiées par interaction avec la cible (US 5,707,605), les agents de ciblage de dépôts amyloïdes (WO 02/28441 par exemple), les peptides clivés cathepsines (WO 02/056670), les mitoxantrone ou quinone (US 6,410,695), les polypeptides ciblant des cellules épithéliales (US 6,391,280), les inhibiteurs de cystéines protéines (WO 99/54317), les ligands de ciblage décrits dans : US 6,491,893 (GCSF), US 2002/0128553, WO 02/054088, WO 02/32292, WO 02/38546, WO20036059, US 6,534,038, WO 0177102, EP 1 121 377, Pharmacological Reviews (52, n°2, 179 ; facteurs de croissance PDGF, EGF, FGF...), Topics in Current Chemistry (222, W.Krause, Springer), Bioorganic & Medicinal Chemistry (11, 2003, 1319-1341 ; dérivés tétrahydrobenzazépinones ciblant alpha v beta3). 2) Les inhibiteurs d'angiogenèse, notamment ceux testés en essais cliniques ou déjà commercialisés, notamment : - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des récepteurs FGFR ou VEGFR tels que SU101, SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, des composés azacycles (WO 00244156, WO 02059110) ; - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des MMP tels que le BB25-16 (marimastat), le AG3340 (prinomastat), le solimastat, le BAY12-9566, le BMS275291, le metastat, le neovastat ; - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des intégrines tels que le SM256, le SG545, des molécules d'adhésion bloquant le EC-ECM (tels que le EMD 121-974, ou la vitaxine) ; - des médicaments à mécanisme d'action antiangiogenèse plus indirect tels que le carboxiamidotriazole, le TNP470, la squalamine, le ZD0101 ; - les inhibiteurs décrits dans le document WO 99/40947, les anticorps monoclonaux très sélectifs pour la liaison au récepteur KDR, les analogues de la somatostatine (WO 94/00489), les peptides de liaison à la sélectine (WO 94/05269), des facteurs de croissance (VEGF, EGF, PDGF, TNF, MCSF, interleukines); des biovecteurs de ciblage de VEGF décrits dans Nuclear Medicine Communications, 1999, 20 ; - les peptides inhibiteurs du document WO 02/066512. 3) Des ligands de ciblage capables de cibler des récepteurs : CD36, EPAS-1, ARNT, NHE3, Tie-1, 1/KDR, Fit-1, Tek, neuropiline-1, endogline, pléientropine, endosialine, Axl., alPi, a2ssl, a4P1, a5pl, eph B4 (éphrine), récepteur laminine A, récepteur neutrophiline 65, récepteur leptine OB-RP, récepteur chimiokine CXCR-4 (et autres récepteurs cités dans le document WO99/40947), LHRH, bombésine/GRP, récepteurs gastrine, VIP, CCK. 4) Des ligands de ciblage de type inhibiteurs de tyrosine kinase. 5) Les inhibiteurs du récepteur GPIIb/IIIa connus choisis parmi : (1) le fragment fab d'un anticorps monoclonal du récepteur GPIIb/IIIa, Abciximab, (2) les petites molécules peptidiques et peptidomimétiques injectées en intraveineuse telles que l'eptifibatide et le tirofiban. 6) Des peptides antagonistes de récepteurs au fibrinogène (EP 425 212), des peptides ligands de récepteurs IIb/IIIa, des ligands du fibrinogène, des ligands de la thrombine, des peptides capables de cibler la plaque d'athérome, les plaquettes, la fibrine, des peptides à base d'hirudine, des dérivés à base de guanine ciblant le récepteur IIb/IIIa. 7) D'autres ligands de ciblage ou fragments biologiquement actifs de ligands de ciblage connus de l'homme du métier comme médicaments, à action anti-thrombotique, anti agrégation plaquettaire, antiathérosclérotique, antiresténotique, anticoagulante. 8) D'autres ligands de ciblage ou fragments biologiquement actifs de ligands de ciblage ciblant alpha v beta3, décrits en association avec des DOTA dans le brevet US 6 537 520, choisis parmi les suivants : mitomycine, tretinoine, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicine, carboquone, pentostatine, nitracrine, zinostatine, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicine, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acetate, ketanserin, doxifluridine, etretinate, isotretinoine, streptozocine, nimustine, vindesine, flutamide, drogenil, butocin, carmofur, razoxane, sizofilan, carboplatine, mitolactol, tegafur, ifosfamide, prednimustine, picibanil, levamisole, teniposide, improsulfan, enocitabine, lisuride, oxymetholone, tamoxifen, progesterone, mepitiostane, epitiostanol, formestane, interferon-alpha, interferon-2 alpha, interferon-beta, interferon-gamma, colony stimulating factor-1, colony stimulating factor-2, denileukin diftitox, interleukin- 2, leutinizing hormone releasing factor. 9) certains ligands de ciblage ciblant des types particuliers de cancers, par exemple des peptides ciblant le récepteur ST associé au cancer colorectal, ou le récepteur tachykinine. 10) des ligands de ciblage utilisant des composés de type phosphines. 11) des ligands de ciblage de P-sélectine, E-sélectine ; par exemple, le peptide de 8 acides aminés décrit par Morikawa et al, 1996, 951, ainsi que différents sucres. 12) l'annexine V ou des ligands de ciblage ciblant les processus apoptotiques. 13) tout peptide obtenu par des technologies de ciblage telles que le phage display, modifié éventuellement par des acides aminés non naturels (http//chemlibrary.bri.nrc.ca), par exemple des peptides issus de banques phage display : RGD, NGR, CRRETAWAC, KGD, RGD-4C, XXXY*XXX, RPLPP, APPLPPR. 14) d'autres ligands de ciblage peptidiques connus de ciblage de plaques d'athérome, cités notamment dans le document WO 2003/014145. 15) des vitamines. 16) des ligands de récepteurs hormonaux dont les hormones et les stéroïdes. 17) des ligands de ciblage ciblant des récepteurs opioïdes. 18) des ligands de ciblage ciblant des récepteurs TKI. 19) des antagonistes LB4 et VnR. 20) des composés nitriimidazoles et benzylguanidines. 21) des ligands de ciblage rappelés dans Topics in Current Chemistry, vol.222, 260-274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals, notamment : - des ligands de ciblage de récepteurs peptidiques surexprimés dans les tumeurs (récepteurs LHRH, bombésine/GRP, récepteurs VIP, récepteurs CCK, récepteurs tachykinine par exemple), notamment les analogues de somatostatine ou de bombésine, des peptides dérivés octréotide éventuellement glycosylés, les peptides VIP, les alpha-MSH, les peptides CCK-B - des peptides choisis parmi : des peptides cycliques RGD, fibrine-chaîne alpha, CSVTCR, tuftsine, fMLF, YIGSR (récepteur : laminine). 24) des oligosaccharides, des polysaccharides et des dérivés d'oses, des dérivés ciblant les récepteurs Glut (récepteurs d'oses). 25) des ligands de ciblage utilisés pour des produits de type smart. 26) des marqueurs de la viabilité myocardique (tétrofosmine et hexakis2méthoxy-2méthylpropylisonitrile). 27) des traceurs du métabolisme des sucres et des graisses. 26) des ligands de récepteurs de neurotransmetteurs (récepteurs D, 5HT, Ach, GABA, NA). 27) des oligonucléotides. 28) le facteur tissulaire 29) des ligands de ciblage décrits dans WO 03/20701, en particulier le PK11195 ligand du récepteur périphérique aux benzodiazépines. 30) des peptides liant la fibrine, notamment les séquences peptidiques décrites dans WO 03/11115. 31) des inhibiteurs d'agrégation de plaques amyloïdes (décrits par exemple dans WO 02/085903). 32) des pharmacophores composés de ciblage de la maladie d'Alzheimer, en particulier les composés comprenant les squelettes de type benzothiazole, benzofuranes, styrylbenzoxazoles/thiazoles/imidazoles/quinoline, styrylpiridines. 33) des pharmacophores composés de ciblage obtenus à partir de squelettes chimiques à activité pharmacologique décrits dans US2007098631, notamment les formules des pages 4 à 10 et pages 13 -14 (incorporé par référence), notamment les composés du tableau page 4 dans la colonne intitulée « scaffolds and derivatives » : biphenyl; arylpiperidine; arylpiperazine; 1,4 dihydropyridine dihydropyrimidone; 1,4 benzodiazepine-2-one; 1,5 benzodiazepine-2-one; 1,4-benzodiazepine-2,5 diones; pyrrolo2,1-c 1,4 benzodiazepines 5,11 diones; 1,4 benzothiazepine-5-ones; 5,11-dihydrobenzo pyrido 3,2b 1,4 diazepine-6-ones benzopyrane; chromone; benzopyranone; coumarine, pyranocoumarine; benzopiperazinones; quinazolinone; quinazolindione; quinoxalinone; imidazoquinoxaline; indole; benzimidazole, benzofurane, benzothiophene. 34) des composés de ciblage d'intégrines notamment ayant une affinité supérieure à 10 000, 100 000 ou plus, notamment des composés non peptidiques mimétiques de peptides RGD, et en particulier des composés tetrahydro naphtyridine décrits par exemple dans : J Med. Chem., 2003, 46, 4790-4798, Bioorg. Med. Chem. Letters, 2004, 14, 4515-4518, Bioorg. Med. Chem. Letters, 2005, 15, 1647-1650. En particulier pour ces composés naphtyridine, le demandeur utilise tout composé de naphtyridine connu de l'art antérieur (notamment ceux de WO2009/114776), l'utilisation des composés naphtyridine comme biovecteur pour imagerie médicale étant décrite dans WO2007/042506 page 13 lignes 30-34. La partie de Bio du ligand de ciblage pour la reconnaissance de la cible en milieu biologique et se trouve du côté de la surface externe des nanogouttelettes. Elle est ancrée dans la couche de tensioactif approprié à l'aide de la partie Lipo du ligand. On présente quelques exemples de ligands de ciblage selon l'invention (pharmacophores ou petites molécules organiques de ciblage ci après : peptides, dérivés de l'acide folique, dérivés naphtyridine), rendus amphiphiles pour l'ancrage à la surface externe de la nanoparticule. La demande présente des exemples illustratifs et non limitatifs de leur synthèse. 32 HN I NHz HN O HO IxI` p ll\ H,Ny ~H N N H O O H o NH, O OyOH H n OH OH H2N O H OH H H N O OON O 45 H^o,o. -O Comme expliqué dans la demande, les ligands de ciblage cités sont essentiellement à vocation d'imagerie diagnostique. On peut toutefois préparer des nanoémulsions comprenant en outre des ligands également à but de traitement thérapeutique. Les nanogouttelettes comprendront alors d'une part un ligand de ciblage pour atteindre la cible biologique (la zone pathologique), et d'autre part un ligand utilisé comme médicament pour le traitement thérapeutique. L'invention concerne ainsi aussi les compositions décrites précédemment, lorsqu'elles incorporent un ligand thérapeutique, pour leur utilisation pour le traitement de maladies, notamment cancéreuses, neurodégénératives, vasculaires, en particulier cardiovasculaire. Selon des réalisations, le tensioactif comprend en outre au moins un agent de furtivité amphiphile, avantageusement un dérivé PEG, un dérivé de type ganglioside (résidus osidiques estérifiés typiquement par l'acide sialique ou le NAC), un polysaccharide (notamment le dextran ou l'un de ses dérivés connus). Ces agents de furtivité sont intégrés sans altérer l'affinité de la nanoparticule pour la cible biologique. La composition formant l'agent de contraste est administrée de préférence en intravasculaire, selon le patient examiné, par exemple à raison de 0,1 mg à 1 g de composé chélate amphiphile et de 1 à 50 micromoles d'ion de métal paramagnétique par kg de patient. Les compositions lipidiques obtenues sont le cas échéant formulées à l'aide d'additifs connus rappelés par exemple dans US 6 010 682, notamment pour une administration par injection intraveineuse. On citera notamment des agents épaississants, des saccharides ou polysaccharides, le glycérol, le dextrose, le chlorure de sodium ou des antimicrobiens. Avantageusement grâce aux compositions selon l'invention on peut obtenir une augmentation de la relaxivité par ion. On obtient typiquement les caractéristiques suivantes, pouvant varier selon les compositions précises des émulsions et leur procédé de préparation : index de polydispersité : 0,2 à 0,3 [Gd3+] = 2 à 10 mM de préférence 3 à 7 mM concentration en particules : 50 à 100 nM r1 (mM J S -1 Gd-1) : 5 à 40, de préférence 10 à 40 - r2 (mM -1S -1Gd-1) : 20 à40 rl(mM -15-1 particule-1) : 106 à 4x106 nombre de ligands de ciblage : 50 à 10000, notamment 1000 à 5000, avantageusement 1500 à 2500 Au global, le demandeur a réussi à obtenir de nouvelles nanoémulsions pour l'IRM : - suffisamment stables chimiquement pour être produites et conservées une longue durée (plusieurs mois à plusieurs années), en particulier sans problème de coalescence entre elles des gouttelettes lipidiques - suffisamment stables in vivo pour ne pas être dégradées - adaptées sur le plan de la pharmacocinétique - suffisamment efficaces en terme de signal pour l'imagerie clinique (IRM en particulier) chez le patient - capables d'incorporer des ligands de ciblage de zones pathologiques à la surface des nanogouttelettes, en quantité appropriée et sans perte d'affinité gênante avec leur cible biologique. L'invention concerne aussi : - un produit de contraste, de préférence pour IRM, comprenant les compositions des nanoémulsions de la demande - les nanoémulsions du demandeur pour leur utilisation dans le diagnostique notamment de maladies cancéreuses, inflammatoires, neurodégénératives et/ou cardiovasculaires. Le demandeur a par ailleurs étudié des procédés destinés à récupérer des lanthanides, pour des raisons de coût et de préservation de l'environnement, lors de la synthèse d'agents de contraste et notamment d'émulsions de lanthanides, comme cela se fait pour des produits de contraste iodés. Par exemple, pour les produits de contraste iodés, des procédés de récupération d'iode existent, soit par oxydation catalytique (en présence de cuivre notamment et à une température par exemple de 150°C), soit par oxydation thermique avec combustion des effluents de fabrication des produits iodés. Par exemple l'oxydation thermique est réalisée par incinération, les effluents, préalablement mélangés ou non mélangés à une solution de métal alcalin, sont injectés au contact de la flamme à plus de 800°C d'un incinérateur, une solution de métal alcalin pouvant de manière optionnelle également être injectée au contact de flamme, les fumées issues de l'incinération desdits effluents sont ensuite absorbées/passées dans une solution aqueuse avantageusement de soude par exemple à environ 70-90°C ; après éventuel refroidissement, la solution obtenue contenant typiquement des ions iodures et éventuellement chlorures et sulfates, est additionnée d'un agent oxydant, eau oxygénée par exemple, en milieu acide par exemple à pH inférieur à 1 ou 2 et à une température de 10 préférence de 10 à 40°C notamment autour de 20°C. L'iode en solution obtenue après oxydation est ensuite récupérée par différents types de traitements possibles, par exemple un traitement mécanique (décantation, absorption sur supports, précipitation, filtration ...) ou un traitement chimique de conversion en composés iodés valorisables. De manière analogue, des procédés de récupération sont intéressants pour récupérer du gadolinium à partir des effluents gadolinés issus de la synthèse des produits de contraste gadolinés, utilisant par exemple des traitements acides adaptés et/ou des résines dédiées. L'invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent. Exemple 1 : synthèse de dérivé chélates amphiphiles selon l'invention dans lequel le chélate est un DTPA Schéma de synthèse global : Int 1 NH, 0 N O ,---,. N^~O O HOOC) HN HOOC N(`J O N_,.COOH GdCI3 CH3OH/CH3ONa pH=7 N H DMF Int 2 Int 3 Int 4 y 15 Etapel : Ouverture du DTPA bis anhydride par l'octadécvlamine : Int 1 NH2 o o HOOC J HN HOOC /--' \-N (\J O NJ COOH HOOC '-N O N M (g/mol) m (g) n (mmol) eq V (mL) Octadécylamine 269,52 10 37,2 2,2 (Int 1) DTPA 357,32 6 16.8 1 bisanhydride (Int 2) DMF 240 Le DTPA bis anhydride est mis en suspension dans le DMF. La suspension est chauffée à 50°C et il y a passage en solution. L'octadécylamine est ajouté en une seule fois. La réaction est maintenue 1 nuit à 50°C. Durant la réaction, on voit la dissolution lente de l'amine dans le DMF puis la précipitation du produit désiré. Le milieu réactionnel est refroidi puis filtré sur fritté. Le précipité est lavé une fois au DMF puis abondamment au méthanol. 13,5 g de poudre jaune-blanche sont obtenus avec un rendement de 90%. L'analyse de spectrométrie de masse se fait par infusion de l'échantillon en ES+. Le produit peut être dissout dans le méthanol ou le toluène en rajoutant du TFA. Etape 2 : Complexation du ligand en milieu organique Int 2 Int 3 DMF 50°C I15 HOOC \--H N O N O GdCl3 N NGd II % O CH3OFUCH3ONa ÇN1 N pH=7 O~ H ° I nt 4 Int 3 M (g/mol) m (g) n (mmol) eq V (mL) Ligand Int 3 896,36 13,4 15 1 GdC13, 6H20 371 6,67 18 1,2 McONa/MeOH 2,68 400 MeOH 600 Le ligand (Int3) est mis en suspension dans le méthanol. Le GdC13,6H20 est ajouté. Il y a solubilisation instantanément. Le pH de la solution est ajusté à 7 à l'aide d'une solution de méthanolate de sodium dans le méthanol. La solution est portée au reflux pendant 45 min. Le méthanol est évaporé et le résidu repris à l'eau. La poudre est lavée abondamment à l'eau. 15 g de produit brut sont obtenus avec un rendement de 96%. L'analyse de spectrométrie de masse se fait par infusion de l'échantillon en ES+. Le produit peut être dissout dans le méthanol avec du dichlorométhane. Purification : Le produit est purifié par chromatographie flash sur gel de silice. On purifie 15 g avec une phase éluante composée de 90/10 en méthanol-dichlorométhane. Après purification, 10 g de produit pur sont obtenus (poudre blanche grasse). Rendement de purification = 67% Exemple 2 : Synthèse de chélates amphiphiles selon l'invention dans lequel le chélate est un dérivé de PCTA Exemple 2.1 : DSPE - PCTA Schéma de synthèse : Int 2 Intl OH EDCl/NHS DMSO DSPE Int 3 OH HzN 0 N~ NEt3 OH ^,O O N P H 0 Int 4 Première étape : OH Me' DMSO O- O Int2 576 mg de l'Int 1 sont mis en suspension dans 3mL de DMSO. Les agents activants sont introduits, 1,1 eq d'EDCI soit 219 mg et 1,1 eq de NHS soit 131mg. Au bout d'une nuit, il y a passage en solution (l'ester s'est formé). Etape 2 : Couplage de l'ester activé avec le phospholipide DSPE Int 3 Int2 OH O O HzN^-- 0 OH N ^O~P~* O H MC1148 Int 4 La DSPE (leq, 711 mg) sont dissous dans un minimum de pyridine à 90°C. Une fois solubilisée, la solution est coulée lentement sur la solution de DMSO contenant l'ester activé ; la réaction est laissée 10 min à 90°C puis on laisse réagir en laissant tomber la température pendant 1 nuit. Le milieu réactionnel est précipité dans l'eau froide et est centrifugé. Le culot est lavé à l'eau puis à nouveau centrifugé. Le culot est repris au méthanol puis évaporé à sec. On obtient environ 400mg de produit brut avec un rendement de 50% environ. Purification : Purification par chromatographie flash sur gel de silice (cartouches de 30g). On utilise dans un premier temps une phase éluante constituée de DCM-MeOH 88-12 avec acide formique pour éliminer la DSPE résiduelle puis on décroche le produit voulu avec le mélange quaternaire suivant : DCM/MeOH/eau/acide formique 65/25/4/1 Exemple 2.2 : autres exemples de chélates amphiphiles selon l'invention dans lequel le chélate est un PCTA Exemple 19 de WO2006100305 b) Complexe de gadolinium de l'ester 3-[(2-{3,4-dioxo-2-[3-(3,6,9-tris-carboxyméthyl- 3,6, 9,15-tétraaza-bicyclo[9.3.1]pentadéca-1(14),11(15),12-trièn-13-yl) -propylamino]- cyclobut-1-énylamino} -éthoxy)-hydroxy-phosphoryloxy]-2-octadécanoyloxy-propylique 5 de l'acide Octadécanoique Selon le mode opératoire de l'étape a) de l'exemple 18 de WO2006100305, au départ de 500mg du composé préparé à l'étape a) de l'exemple 12 de WO2006100305 et 520mg 10 de DSPE. m= 350 mg m/z : ES- 1417 Exemple 20 de WO2006100305 a) Complexe de gadolinium de l'acide 2-(3,9-Bis-carboxymethyl-3,6,9,15-tetraaza-15 bicyclo[9.3.1]pentadeca-1(14),11(15),12-trien-6-yl) -5-hexadécanoylamino-pentanoique Selon le mode opératoire de l'étape a) de l'exemple 6 de WO2006100305 au départ du composé obtenu à l'étape c) de l'exemple 13 de WO2006100305 (300mg) et 150mg du chlorure de l'acide palmitique.m= 230mg 20 m/z : ES- 829 Exemple 21 de WO2006100305 a) Complexe de gadolinium de l'ester 3-({2-[5-(3,9-bis-carboxyméthyl-3,6,9,15-tétraazabicyclo[9.3.1]pentadéca-1 (14),11(15), 12-trièn-6-yl)-5-carboxy-pentanoylamino]- 25 éthoxy}-hydroxy-phosphoryloxy)-2-héxadecanoyloxy-propylique de l'acide Hexadécanoique NH O-P-O OH Selon le mode opératoire de l'étape a) de l'exemple 8 de W02006100305, au départ de 100mg du composé préparé à l'étape d) de l'exemple 15 de W02006100305 et 120mg 5 de DPPE. m= 80 mg m /z : ES- 1293 Exemple 5 de W02006100305 a) Complexe de gadolinium de l'ester de l'acide Octadécanoique 3-({2-[4-(3,9-biscarboxyméthyl-3,6,9, 15-tétraaza-bicyclo[9.3.1]pentadéca-1(14),11(15), 12-trien-6-yl)-4-10 carboxy-butyrylamino]-éthoxy}-hydroxy-phosphoryloxy)- 2-octadécanoyloxy-propylique yo N N Gd" N O NH O-P-OO O 200 mg du composé obtenu à l'étape c) de l'exemple 3 de W02006100305 sont dissous dans 10 ml de Diméthylformamide. A cette solution sont ajoutés 204 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide et 40mg de N-hydroxysuccunimide. Le mélange est agité 1h à 15 température ambiante et une solution de 250 mg de 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DSPE, AVANTI® Polar Lipids, Inc.) dans 5 ml de pyridine est ajoutée. Le milieu réactionnel est agité 20h à température ambiante puis précipité dans 50 ml d'éthanol .Le produit est ensuite purifié sur gel de silice. m= 190mg. m /z : ES- 1335 20 Exemple 6 de W02006100305 a) Complexe de gadolinium de l'acide 2-(3,9-Bis-carboxyméthyl-3,6,9,15-tétraazabicyclo [9.3.1 ]p entadéca-1(14),11(15),12-trien-6-yl)-4 -(4-octadéc-9 - ènoylamino-phényl)-butyrique H 500mg du composé obtenu à l'étape j) de l'exemple 1 de W02006100305 sont dissous dans 30 ml de DMSO anhydre. 230 mg de triéthylamine sont ajoutés puis 400mg de chlorure de l'acide Oléique (ALDRICH® ). Le mélange est agité 6h à température ambiante et précipité dans l'éthanol. Le produit est ensuite purifié sur gel de silice.m=300 mg. m/z:ES-917 Exemple 8 de W02006100305 a) Complexe de gadolinium de l'ester 2-héxadécanoyloxy-3-(hydroxy-{2-[2-(3,6,9-triscarboxyméthyl-3,6,9, 15-tétraaza-bicyclo [9.3.1]p entadéca- 1 (15),11,1 3 -trien- 12-yloxy)-acétylamino]-éthoxy} -phosphoryloxy)-propylique de l'acide Hexadécanoique Exemple 3 : Synthèse de chélates amphiphiles selon l'invention dans lequel le chélate est un dérivé DOTA Les protocoles de l'exemple 2 sont utilisés de manière appropriée pour des chélates de type DOTA, notamment DOTA - DSPE. Exemple 33 de W02010066815 e) Synthèse du (4,7-bis -carb oxymethyl- 10- doctadecylcarb amoylmethyl- 1,4,7,1 Otetraazacyc lo do de- 1 -yl)- ac etic acid Dans un ballon de 25mL, 40mg de l'intermédiaire obtenu en d) de W02010066815 (0,037mmol ; léquiv) sont dissous dans 4mL d'acide trifluoroacétique. et lmL de CH2C12 pendant 5h. Après évaporation du mélange de solvants, le solide jaune (32mg) est précipité dans l'éther diéthylique puis filtré sur fritté. C52HI01N507 ; MALDI-TOF mode positif m/z 908,76 Les exemples suivants illustrent la synthèse de ligands de ciblage amphiphiles, avec utilisation de certains linkers, l'homme du métier sait adapter les protocoles pour d'autres linkers par exemple alkyle C1-ClO, PEG, alkylène C1-C10 - PEG - alkylène Cl-C10, squarate, alkylène-PEG-alkylène. Exemple 4 : synthèse d'un ligand de ciblage amphiphile selon l'invention dans lequel la partie Bio est unpeptide RGD linéaire Exemple 4.1 Etape 1 "Y"2 IxI HN HO O H H 100mg (0,15mmol) de peptide H-Gly-(D)-Phe-(L)-Val-(L)-Arg-Gly-(L)Asp-NH2 (HGfVRGD-NH2) acheté chez Bachem sont dissous sous argon dans 3m1 de DMSO séché sur tamis. 2311l de 3,4-Diethoxy-3-cyclobutene-1,2-dione (0,15mmol ; léquiv) et 2511l de 25 triéthylamine sont ajoutés. Le milieu réactionnel est laissé une nuit à 40°C avant d'être 4320 précipité dans 40m1 d'éther diéthylique. Après filtration, on obtient 98mg d'une poudre blanche (Rendement : 84%) C34H48N10011 ; m/z = 773 (ES+) Etape 2 "Y"2 IxI HN1 HO ` O ` N` H H O OH ^~O, O 45 5H O 95mg de l'intermédiaire obtenu en a) (0,12mmo1; léquiv) et 430mg (0,15mmo1, 1,25 eq) de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)- 2000] (ammonium sait) sont dissous dans 3 mL de DMSO séché sur tamis en présence de 25µl de triéthylamine. Le milieu réactionnel est agité 48h à température ambiante avant d'être précipité dans 40m1 d'éther diéthylique. Après filtration, on obtient 400mg d'une poudre blanche. Le produit ainsi obtenu est ensuite purifié par flash sur cartouche C4 avec un gradient formiate d'ammonium 10mM pH6 / Methanol. On obtient 260mg d'une poudre blanche (Rendement : 62%). C164H3o5N12064P ; MALDI-TOF: Mode positif m/z = 3501 Exemple 4.2 : Int 1 Int 2 45 1 HzN EtOH Int 3 EtOH NEt3 HzN Int 4 1 HNyNH, HN O HO}II` p N ll\ HzN ) N N O H O H Int 5 Exemple 5 : Synthèse d'un ligand de ciblage amphiphile selon l'invention dans lequel la partie Bio est HN NH,un peptide RGD cyclique o r° o OH H Ô5 Même mode opératoire que pour l'exemple 4 en partant de 90mg de peptide cyclique RGDfK acheté chez Bachem. C163H302N11O63P ; MALDI-TOF: Mode positif m/z = 3456 Exemple 6 : Synthèse d'un ligand de ciblage amphiphile selon l'invention 5 dans lequel la partie Bio est un peptidomimétique du RGD ; exemple de composé naphtyridine Schéma de synthèse : H O''^/IrNNCbz 0 H N 'NCbz Int 1 Int 2 NCbz 0 Int 3 Int 4 0 H 0 N~\H OEt Int 5 0 0 w p 0 V` HzN 4, - 45 N/~~O.P.O H Ô 0 0 0 0 0 /--/~-H r _ 1 0 101 N~~N N5 H^~0 P'0 0 H H 4 5 Int 6 10 Première étape : 1g de l'int 1 est dissout dans 5 ml de CH2C12. 5m1 de TFA sont ajoutés au milieu. Laisser 3h à TA puis évaporer à sec. Reprendre dans 2*40 ml d'éther iso, récupérer une huile que l'on sèche par évaporation. M0bt = 0,8 g ; Rdt = 90% ; MALDI-TOF: Mode positif m/z = 564 Deuxième étape : Réactifs Quantités Solvants Int 2 641,031 M = 0,564g (0,001m) Naphtyridine sous-traitée M =0,235g (0,00023m) HOBT M= 0,131g DIPEA M= 0,286g DMF V=10m1 EDCI V= 0,2m1 Int3 641.032 Dissoudre l'acide dans le DMF puis introduire HOBT et EDCI et laisser 1h sous argon. Rajouter l'int 2 et la DIPEA ; laisser 18h à TA sous argon. Après évaporation l'huile est reprise dans CH2C12 et lavée par une solution diluée de Na2CO3 ; après évaporation, obtention d'une huile. Mobt = 0,600 g; Rdt =77%; M/Z = 780 Troisième étape : Réactifs Quantités Solvants Int 3 641,032 M = 0,6g (0.0077m) Pd/C 10% 1 pointe de spatule MeOH V=30m1 Int4: 641,034 Dissoudre l'int 3 dans le méthanol et introduire la solution dans l'autoclave de 125 ml ; rajouter le catalyseur et laisser 3h sous pression d'hydrogène (P= 5 bars). Après filtration du catalyseur et évaporation, obtention d'une huile que l'on lave par 50 15 ml d'éther iso. Mobt = 0,300 g ; Rdt =60% ; HPLC = 90% ; M/Z = 646 Quatrième étape : 47 Réactifs Quantités Solvants Int 4 641,034 M = 0,300g (0.000442m) DMSO V=10ml Diethyl squarate M= 0,286g IntS: 641,037 TEA V= 0,25m1 Dissoudre l'int 4 dans le DMSO puis rajouter le diethyl squarate et la TEA ; Laisser 1 nuit à TA sous argon. Verser dans de l'ether : obtention d'une pate blanche. Mobt = 0,330 g ; Rdt =97%; M/Z = 770 Cinquième étape : Réactifs Quantités Solvants Int 5 641,037 M = 0,330g (0,00043m) DSPE-PEG2000 M =1,07g (0,000385m) solution saturée de Na2CO3 M= 0,131g DMSO V=10ml Int6: 641,040 Dissoudre l'int 5 dans le DMSO, rajouter 3 gouttes de solution saturée en Na2CO3 : obtention d'une solution A. Introduire la solution DSPE à la solution A : obtention d'un milieu trouble qui est agité 24h. Rajouter 1,5m1 d'eau et laisser encore 24h à TA : le milieu devient homogène. Après évaporation de l'eau, le résidu est lavé par 3*50 ml d'éther (permet d'éliminer le DMSO) : la pâte obtenue est solubilisée dans 50 ml de CH2C12 et le trouble est éliminé par filtration. Le produit est purifié par une silice, éluant CH2C12. Après avoir rassemblé et évaporé les fractions conformes : obtention de cristaux. REMARQUE : Le produit obtenu est sous la forme acide par coupure de l'ester de méthyle par la présence de Na2CO3 . Mobt = 0,170 g ;Rdt =17% ; M/Z = 3484 (ester de METHYL PM=3498) Exemple 7 : Synthèse d'une émulsion contenant le composé de l'exemple 1 et du PEG-2000 10 g de Miglyol®, 420 mg de Lipoïd S75® (Lipoïd GMBH), 30 mg de DSPE-PEG-2000 (Lipoïd) et 150 mg du composé de l'exemple 1 sont dissous dans un mélange chloroforme/méthanol (90/10). Ceci représente un taux de 6% massique de tensioactifs totaux par rapport à la masse d'huile utilisée. Ce mélange est passé à l'évaporateur rotatif afin d'éliminer les solvants. On obtient une phase huileuse parfaitement homogène. 40 ml d'eau à 2,5 % m/m de glycérol sont ajoutés puis pré-émulsionnés à l'aide d'unUltraturax. La pré-émulsion est ensuite finalisée au microfluidiseur (Microfluidics M-110-S) en recyclant pendant 3 à 4 minutes, ce qui correspond à environ 25 passages dans la cellule. Le taux massique de tensioactifs totaux par rapport à la solution finale est de 1,18% (0,6/50,6) Le pH est contrôlé puis ajusté à -7. L'émulsion est filtrée sur 0,45 µ. De la Gentalline est ajoutée à raison de 7 11l/100 ml afin de garantir la conservation. Le diamètre hydrodynamique (Zetasizer de chez Malvern) de l'émulsion obtenue est de 190 nm. Exemple 8 : Synthèse d'une émulsion contenant le composé de l'exemple 2 3 g de Miglyol®, et 180 mg du composé de l'exemple 2.1. sont dissous dans un mélange Chloroforme / méthanol (90/10). Ceci représente un taux de 6% massique de tensioactifs totaux par rapport à la masse d'huile utilisée. Ce mélange est passé à l'évaporateur rotatif afin d'éliminer les solvants. On obtient une phase huileuse parfaitement homogène. 27 ml d'eau à 2,5 % m/m de glycérol sont ajoutés puis pré-émulsionné à l'aide d'unUltraturax. La pré-émulsion est ensuite finalisée au microfluidiseur (Microfluidics M-110-S) en recyclant pendant 3 à 4 minutes, ce qui correspond à environ 25 passages dans la cellule. Le taux massique de tensioactifs totaux par rapport à la solution finale est de 0,6% (0,18/30,18) Le pH est contrôlé puis ajusté à -7. L'émulsion est filtrée sur 0,45 µ. De la Gentalline est ajoutée à raison de 7 11l/100 ml afin de garantir la conservation. Le diamètre hydrodynamique (Zetasizer de chez Malvern) de l'émulsion obtenue est de 160 nm. Exemple 9 : synthèse d'une émulsion contenant le composé de l'exemple 3 et du PEG-5000 (émulsion à 20% d'huile) 10 g de Miglyol®, 420 mg de Lipoïd S75® (Lipoïd GMBH), 30 mg de DSPE-PEG-5000 (Lipoïd) et 150 mg du composé de l'exemple 3 sont dissous ans un mélange chloroforme/méthanol (90/10). Ceci représente un taux de 6% massique de tensioactifs totaux par rapport à la masse d'huile utilisée. Ce mélange est passé à l'évaporateur rotatif afin d'éliminer les solvants. On obtient une phase huileuse parfaitement homogène. 40 ml d'eau à 2,5 % m/m de glycérol sont ajoutés puis pré-émulsionnés à l'aide d'unUltraturax. La pré-émulsion est ensuite finalisée au microfluidiseur (Microfluidics M-110-S) en recyclant pendant 3 à 4 mn , ce qui correspond à environ 25 passages dans la cellule. Le taux massique de tensioactifs totaux par rapport à la solution finale est de 1,2%.(0,6/50,6) Le pH est contrôlé puis ajusté à -7. L'émulsion est filtrée sur 0,45 µ. De la Gentalline est ajoutée à raison de 7 µU100 ml afin de garantir la conservation. Le diamètre hydrodynamique (Zetasizer de chez Malvern) de l'émulsion obtenue est de 210 nm. Exemple 10 : Synthèse d'une émulsion sectorisée RGD contenant du DSPEPEG-2000 et du composé de l'exemple 1 (émulsion à 20% d'huile) 20 10 g de Miglyol®, 400 mg d'Egg phosphatidylcholine (EPC, Lipoïd GMBH), 110 mg de DSPE-PEG-2000 (Lipoïd), 210 mg du composé de l'exemple 1 et 60 mg du composé de l'exemple 4.1 sont dissous dans un mélange chloroforme/méthanol (90/10). Ceci représente un taux de 7,8 % massique de tensioactifs totaux par rapport à la masse d'huile 25 utilisée. Ce mélange est passé à l'évaporateur rotatif afin d'éliminer les solvants. On obtient une phase huileuse (phase lipidique constituée d'huile) parfaitement homogène. 40 ml d'eau à 2,5 % m/m de glycérol sont ajoutés puis pré-émulsionnés à l'aide d'un Ultraturax. 30 La pré-émulsion est ensuite finalisée au microfluidiseur (Microfluidics M-110-S) en recyclant pendant 3 à 4 mn, ce qui correspond à environ 25 passages dans la cellule. Le taux massique de tensioactifs totaux par rapport à la solution finale est de 1,54%. Le pH est contrôlé puis ajusté à -7. L'émulsion est filtrée sur 0,45 µ. De la Gentalline est ajoutée à raison de 7 11l/100 ml afin de garantir la conservation. Le diamètre hydrodynamique (Zetasizer de chez Malvern) de l'émulsion obtenue est de 168 nm. Un suivi du diamètre de l'émulsion est réalisé par diffusion dynamique de la lumière (Zetasizer de chez Malvern) pendant un an avec une conservation de l'émulsion à 4°C. Le diamètre hydrodynamique à 1 an est de 170 nm. Exemple 11 : Synthèse d'une émulsion vectorisée RGD contenant du composé de l'exemple 1, du DSPE-PEG-2000 et de la rhodamine (émulsion à 20% d'huile) 10 g de Miglyol®, 330 mg de Lipoïd S75® (Lipoïd GMBH), 30 mg de DSPE-PEG-2000 (Lipoïd) et 150 mg du composé de l'exemple 1, 90 mg du composé de l'exemple 4 et 2 mg de DSPE-rhodamine sont dissous dans un mélange chloroforme / méthanol (90/10). Ceci représente un taux de 6% massique de tensioactifs totaux par rapport à la masse d'huile utilisée. Ce mélange est passé à l'évaporateur rotatif afin d'éliminer les solvants. On obtient une phase huileuse parfaitement homogène. 40 ml d'eau à 2,5 % m/m de glycérol sont ajoutés puis pré-émulsionnés à l'aide d'unUltraturax. La pré-émulsion est ensuite finalisée au microfluidiseur (Microfluidics M-110-S) en recyclant pendant 3 à 4 mn, ce qui correspond à environ 25 passages dans la cellule. Le taux massique de tensioactifs totaux par rapport à la solution finale est de 1,2% Le pH est contrôlé puis ajusté à -7. L'émulsion est filtrée sur 0,45 µ. De la Gentalline est ajoutée à raison de 7 11l/100 ml afin de garantir la conservation. Le diamètre hydrodynamique (Zetasizer de chez Malvern) de l'émulsion obtenue est de 206 nm. Exemple 12 : Synthèse d'une émulsion vectorisée RGD contenant du composé de l'exemple 1, du DSPE-PEG-2000 et de la rhodamine. 10g de Miglyol, 330 mg d'Egg phosphatidylcholine (EPC, Lipoïd GMBH), 30 mg de DSPE-PEG-2000 (Lipoïd), 150 mg du composé de l'exemple 1, 90 mg du composé de30 l'exemple 5 et 2 mg de DSPE-rhodamine sont dissous dans un mélange chloroforme / méthanol (90/10). Ceci représente un taux de 6 % massique de tensioactifs totaux par rapport à la masse d'huile utilisée. Ce mélange est passé à l'évaporateur rotatif afin d'éliminer les solvants. On obtient une phase huileuse parfaitement homogène. 40 ml d'eau à 2,5 % m/m de glycérol sont ajoutés puis pré-émulsionné à l'aide d'unUltraturax. La pré-émulsion est ensuite finalisée au microfluidiseur (Microfluidics M-110-S) en recyclant pendant 3 à 4 mn, ce qui correspond à environ 25 passages dans la cellule. Le taux massique de tensioactifs totaux par rapport à la solution finale est de 1,2%. Le pH est contrôlé puis ajusté à -7. L'émulsion est filtrée sur 0,45 µ. De la Gentalline est ajoutée à raison de 7 µl/100 ml afin de garantir la conservation. Le diamètre hydrodynamique (Zetasizer de chez Malvern) de l'émulsion obtenue est de 206 nm. Exemple 13 : Mesures de relaxivité Les mesures de relaxivité sont réalisées sur des Relaxomètres Minispec à 20 et 60 MHz. La solution mère est diluée sur 6 points de gamme dans l'eau milli Q afin de pouvoir étudier la linéarité des vitesses de relaxation en fonction de la concentration. La gamme de concentration va de 0,1 à 2,5 mM en Gd. La mesure de relaxivité est effectuée à 37°C. Le dosage de Gd est réalisé par ICP-AES sur tous les points de la gamme. Emulsion 20MHz 60MHZ rl (mMisi) r2(mMisi) rl (mMisi) r2(mMisi) Exemple 7 16 19 14 20 Exemple 8 39 43 29 52 Exemple 9 18 22 16 20 Exemple 10 23 25 24 35 Exemple 12 27 28 24 34 Exemple 14 : tests de toxicité de l'émulsion de l'exemple 10 Test in vivo Sur Souris swiss d'environ 25g : Injection IV caudale vigile manuelle à 2mL/min en isovolume (200µl/animal soit 6,67m1/kg). A 24h : anesthésie à l'isoflurane, prélèvement sublingual pour bilan hématologie sur l'automate MS4 puis exsanguination avec seringue + aiguilles héparinées. Symptomatologie: Pas de létalité constatée ni de signes cliniques délétères à la dose et délai testés. Hématologie : bilan hématologique normal. Evolution du poids des souris après injection : pas de variation pondérale significative. in vitro : test MTT sur L929 à 24h. La CEL50 est supérieure à la dose testée qui est de 3 mM en Gd. 15 Exemple 15 : Mesure de l'IC50 La mesure d'IC50 des émulsions est réalisée sur des cellules HUVEC surexprimant av[33 par des mesures de compétitions avec de l'Echistatine 1251 20 La suspension des HUVEC est distribuée dans une plaque 96 puits à fond conique, à raison de 2.105 cellules dans 50 µL en tampon de binding. Cinquante µL des solutions de concentration croissante d'échistatine ou des produits RGD sont ajoutés par puits. Le contrôle positif est réalisé par l'ajout de tampon de binding sans compétiteur. L'ensemble des points de concentration est réalisé en duplicat. La plaque est incubée 2 h à 25 température ambiante sous agitation. Cinquante µL de la solution d'échistatine-125I-SIB à 3 nM sont alors distribués dans chaque puits et la plaque est de nouveau incubée 2 h à température ambiante sous agitation. Les mélanges réactionnels sont transférés dans des ampoules contenant 200 µL d'un coussin de densité composé de paraffine et de dibutylphtalate (10/90). Les microtubes sont ensuite centrifugés à 12 000 rpm pendant 3 30 min. Les tubes sont finalement congelés dans l'azote liquide, puis sectionnés afin de compter le culot cellulaire et le surnageant au compteur gamma. Une courbe de compétition est alors tracée où la fixation relative de l' échistatine125I-SIB est déterminée par l'équation suivante : 10 Fixation relative de 1'échistatine-I125-SIB = Radio'ac.tleé fi> e are p.és,e e et gour cfsr~ Radff,ci.tëdef rh :'31ivncc~itcE C 12 X 100 10 Les données sont analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prisme 5.0 qui détermine les valeurs IC50 pour chaque produit à partir de la courbe de compétition. Composé IC50 (nM de ligand de IC50 (nM d'émulsion) ciblage) Exemple 4.1 300 Exemple 5 1 Exemple 6 0,4 Exemple 10 4 500 2 Exemple 11 13 500 2,1 D'excellentes affinités (IC50) ont été obtenues : - avec des peptides RGD cyliques - avec des peptidomimétiques dont les composés naphtyridine .......................................................................... .......................................................................... ............................................................. . Emulsion TensioactifsEPCDSPE- chélate ligand DiamètreIC50 (nM de ;totaux PEG2000DTPA RGD (nm) nanoparticules) peptide RGD 8 mmol/10068% 5% 25% 2% =168 0,0034 cylique g d'huile peptidomimétiques 18 mmol/10068% 5% 25% 2% 1157 0,0030 g d'huile Les pourcentages indiquent le pourcentage des différents tensioactifs par rapport au tensioactif total. REVENDICATIONS1. Composition de nanoémulsion huile dans eau pour IRM, comprenant : - une phase aqueuse, représentant 70 à 90% en poids de la composition, avantageusement 75 à 85%, plus avantageusement de 78 à 82% - une phase lipidique comprenant une huile, représentant 9,5 à 29,5% en poids de la composition, avantageusement 14 à 24,5%, plus avantageusement 17 à 21%, - un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et lipidique, le tensioactif comprenant au moins un chélate de métal paramagnétique amphiphile et éventuellement un lipide amphiphile ; - la teneur totale en tensioactif en poids par rapport au poids total de l'huile de la phase lipidique étant comprise entre 4 et 10%, avantageusement entre 5 et 8 % ; - la teneur totale en tensioactif en poids par rapport au poids total de la composition étant comprise entre 0,35 et 2,95%, avantageusement entre 0,5 et 2 % ; - l'huile comprenant au moins 70% en poids, avantageusement au moins 80%, de façon avantageuse au moins 95%, notamment au moins 97 %, d'acides gras saturés en C6-C18, avantageusement en C6-C14, plus avantageusement en C6-C10. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le tensioactif comprend en outre au moins un ligand de ciblage amphiphile, représentant avantageusement 0,01 à 10% en poids du poids total de tensioactif, avantageusement 0,05 à 5 %, notamment 0,05 à 1 %. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le tensioactif représente 5 à 8% en poids de l'huile. 4. Composition selon la revendication 1 à 3, caractérisée en ce que les acides gras saturés se trouvent sous la forme de triglycérides d'acides gras saturés. 5. Composition selon la revendication 1 à 4, caractérisée en ce que l'huile comprend des acides gras saturés dans les proportions suivantes (% en poids/poids) : - en C6-C18 > 70%, avantageusement > 80%, plus avantageusement >95%, encore plus avantageusement > 98%- ou en C6-C14 > 70%, avantageusement > 80%, plus avantageusement >95%, encore plus avantageusement > 98% - ou en C8+C10 > 70%, avantageusement > 80%, plus avantageusement >95%, encore plus avantageusement > 98%. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le tensioactif comprend : 50 à 95% en poids de lipide amphiphile, 49 à 49,9% en poids de chélate de métal paramagnétique amphiphile, avantageusement 5 à 30% en poids, 0,1 à 10% en poids de ligand de ciblage amphiphile. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le tensioactif comprend 95 à 99,95% en poids de chélate de métal paramagnétique 15 amphiphile et 0,05 à 5% en poids de ligand de ciblage amphiphile. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le chélate de métal paramagnétique du chélate amphiphile est un chélate macrocyclique choisi parmi : DOTA, DO3A, HPDO3, BTDO3A, PCTA, DOTAM, DOTMA, DOTA- 20 GA, AAZTA, HOPO, ainsi que leurs multimères et leurs dérivés. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le ligand de ciblage amphiphile est de formule Bio - L - Lipo, dans laquelle : - Bio est la partie de ciblage biologique hydrophile 25 - Lipo est un groupe lipophile permettant l'insertion du ligand de ciblage au sein de la couche de tensioactif - L est un groupe de liaison reliant Bio et Lipo, avantageusement choisi parmi : - rien ou une simple liaison, squarate, C1-6 alkylène, PEG par exemple CH2-(CH2-O-CH2)k-CH2 avec k=l à 10, (CH2)3-NH, NH- 30 (CH2)2-NH, NH-(CH2)3-NH, (CH2)' avec n = 2 à 10, (CH2)ri CO- avec n = 2 à 10, -(CH2)'NH-CO- avec n = 2 à 10, (CH2CH2O)q(CH2)r CO- avec q = 1-10 et r=2-10, (CH2CH2O)q(CH2)rNH-CO- avec q = 1-10 et r=2-10, (CH2)'-CONH - , (CH2)'-CONH - PEG avec n=0-20, (CH2)ri NHHOOC-CH2-O-(CH2)2-0-(CH2)2-O-CH2-COOH avec n=0-20; HOOC- 10(CH2)2-CO2-(CH2)2-OCO-(CH2)2-COOH ; HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH; HOOC-(CH2)ri COOH avec n=0-20; NHz-(CH2)ri NHz, avec n=0-20; NHz-(CH2)ri CO2H avec n=1 à 10; NH2-CH2 - (CH2-O-CH2)n-CO2H avec n=1 à 10, P1-1-P2, identiques ou différents, P1 et P2 étant choisis parmi O, S, NH, rien, CO2, NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH-, NHSO2-, squarate avec 1 = alkyle, alkoxyalkyle, polyalkoxyalkyle (PEG), alkyle interrompu par un ou plusieurs squarates ou par un ou plusieurs aryles, avantageusement phényles, alcényle, alcynyle, alkyle interrompus par un ou plusieurs groupes choisis parmi -NH-, -0-, -CO-, -NH(CO)-, - (CO)NH-, -O(CO)-, ou -(OC)O- . 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que 15 Bio est choisi parmi : les peptides, avantageusement de moins de 20 acides aminés, plus avantageusement de 5 à 10 acides aminés, les pseudopeptides, les peptidomimétiques, les acides aminés, les agents de ciblage d'intégrines, les glycoprotéines, les lectines, la biotine, les dérivés ptéroïques ou aminoptéroïques, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les anticorps ou fragments d'anticorps, l'avidine, les stéroïdes, les 20 oligonucléotides, les séquences d'acide ribonucléique, les séquences d'acide désoxyribonucléique, les hormones, les protéines éventuellement recombinantes ou mutées, les mono ou polysaccharides, et les composés à squelette benzothiazole, benzofurane, styrylbenzoxazole/thiazole/imidazole/quinoline, ou styrylpiridine. 25 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisée en ce que le lipide amphiphile est un phospholipide, avantageusement choisi parmi la phosphatidylcholine la dioléoylphosphatidylcholine, la dimyristoylphosphatidylcholine, la dipalmitoylphosphatidylcholine, la distéaroylphosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la sphingomyéline, la phosphatidylsérine, le 30 phosphatidylinositol, la lécithine. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisée en ce que le tensioactif comprend en outre un agent de furtivité amphiphile, avantageusement un dérivé PEG, un dérivé ganglioside ou un polysaccharide. 10 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que le métal paramagnétique du chélate de métal paramagnétique amphiphile est choisi parmi : manganèse, fer, cobalt, nickel, cuivre, molybdène, ruthénium, cérium, praseodymium, neodymium, prométhium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, et ytterbium ; avantageusement parmi Gd(III), Mn(II), europium et dysprosium. 14. Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 10 1 à 13 comprenant les étapes : - préparation d'une phase lipidique comprenant o éventuellement un premier tensioactif lipide amphiphile o une huile comprenant au moins 70% en poids, avantageusement au moins 80%, plus avantageusement au moins 95 % d'acides gras saturés 15 en C6-C18, avantageusement en C6-C14, plus avantageusement en C6- C10 o un chélate de métal paramagnétique amphiphile o éventuellemen un ligand de ciblage amphiphile - dispersion de la phase lipidique dans une solution aqueuse de manière à former 20 une nanoémulsion huile dans eau - récupération de la composition de nanoémulsion obtenue. 22. Composition selon la revendication 1 à 13 pour son utilisation dans le diagnostique, avantageusement de maladies cancéreuses, inflammatoires, neurodégénératives et/ou 25 cardiovasculaires. 23. Utilisation de la composition selon la revendication 1 à 13 pour la préparation d'une composition diagnostique, avantageusement de maladies cancéreuses, inflammatoires, neurodégénératives et/ou cardiovasculaires.