Brevet FR2976950A1 — publié le 20121228

OBTENTION DE PLANTES AYANT UNE TOLERANCE AMELIOREE A UN STRESS HYDRIQUE La présente invention concerne un procédé d'obtention de plantes tolérantes à un stress hydrique. Le stress hydrique correspond à une situation de déficit hydrique (état de sécheresse ou de déshydratation) ou d'excédent hydrique (état de submersion). Le « déficit hydrique » correspond à une situation 10 où la quantité d'eau transpirée par une plante est supérieure à la quantité d'eau absorbée par ladite plante. Le déficit hydrique est l'un des stress abiotiques les plus importants pour les plantes. Il peut affecter leur croissance et leur reproduction, conduisant ainsi à une perte 15 de rendement. Par conséquent, il est important d'identifier des gènes qui possèdent la capacité d'améliorer la tolérance des plantes au déficit hydrique. La sphingosine kinase (SphK) est une enzyme qui 20 phosphoryle la sphingosine (Sph) pour donner la sphingosine-1-phosphate (S1P) (voir pour revue LE STUNFF et al., J Oeil Biochem., 2004, 92:882-99). Chez les mammifères, la sphingosine-1-phosphate (S1P) et ses dérivés sont considérés comme les représentants 25 d'une nouvelle classe de messagers lipidiques régulant de nombreux processus biologiques, tels que la prolifération cellulaire (SPIEGEL et MILSTIEN, Biochem Soc Trans., 2003, 31:1216-1219). Deux gènes codant pour des SphK ont été clonés chez les mammifères, SphKl et SphK2, et la levure, LCB4 et 30 LCB5. Chez les plantes, des données relativement récentes ont montré que la SphK est impliquée dans la chaîne de transduction du signal ABA (acide abscissique) . - NG et al. (Nature, 2001, 410:596-9) ont montré 35 pour la première fois, par une analyse par spectrométrie de masse, la présence de S1P dans les feuilles de Commelina communis. Ils ont aussi montré que la teneur en S1P augmente dans les feuilles de C. communis soumises à 11 jours de déficit hydrique. En outre, l'incubation de lambeaux d'épiderme de C. communis en présence de S1P exogène entraîne des oscillations calciques dont l'amplitude et la période sont dépendantes de la concentration de S1P appliquée. Corrélativement, il a été observé qu'une fermeture partielle des stomates était associée à ces oscillations. - COURSOL et al. (Nature, 2003, 423:651-4 et Plant Physiol., 2005, 137:724-37) ont montré la présence d'une activité SphK dans les protoplastes de cellules de garde d'Arabidopsis thaliana. Cette activité SphK est stimulée in vivo par l'ABA et inhibée in vitro et in vivo par le N,N-diméthylsphingosine (DMS). Les auteurs ont aussi montré que la S1P inhibe l'ouverture des stomates et induit leur fermeture via la sous-unité a (GPAl) de la protéine G hétérotrimérique d'A. thaliana, ce qui suggère un mécanisme d'action conservé chez les mammifères et les plantes. - IMAI et NISHIURA (Plant Cell Physiol , 2005, 46:375-80) ont montré chez A. thaliana, que le gène AtLCBK1 (At5g23450), codant une SphK, est exprimé de manière similaire dans les racines, les tiges et les feuilles, et un peu plus fortement exprimé dans les fleurs. Le gène ne semble pas induit par l'ABA ou un stress de type « 1ow-humidity » (le couvercle des boîtes de pétri contenant les plantes était enlevé et l'humidité de l'air maintenu entre 45-50%). - WORRALL et al. (Plant J., 2008, 56:64-72) ont montré, à l'aide de plantes d'A. thaliana surexprimant le gène At5phK1 (At4g21540) ou dans lesquelles un ADN-T a été inséré dans le gène AtSphKl, que AtSphK1 est impliquée dans la voie de signalisation ABA dans les cellules de garde et dans le contrôle de la germination. Les SphK comprennent 5 domaines conservés, notés Cl, C2, C3, C4 et C5, de leur extrémité N-terminale vers leur extrémité C-terminale (voir Sugiura et al., J Biol Chem., 2002, 277:23294-300 et pour revue LIU et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 2002, 71:493-511). La région contenant les domaines Cl, C2 et C3 présente de très fortes homologies avec le domaine catalytique des diacylglérol kinases (DAG kinase). Par ailleurs, tous les membres de la famille connus à ce jour possèdent un motif hypothétique de fixation de l'ATP (GDGxxxExxNGxxxR, où x peut être tout acide aminé ; SEQ ID NO : 17) au niveau de leur domaine C2. Les céramides kinases (CerK) qui phosphorylent uniquement les céramides (lipides dérivés de la Sph) en céramide-l-phosphates, possèdent également ces 5 domaines conservés. Néanmoins, il existe des différences d'acides aminés au niveau des domaines Cl, C2, C3 et C5 qui permettent de distinguer les CerK des SphK (SUGIURA et al., 2002, cité ci-dessus). Par exemple, le domaine C5 des SphK comprend le motif conservé de séquence xxV(S/I)DGE (SEQ ID NO : 18) alors que celui des CerK comprend le motif conservé de séquence WNxDGE (SEQ ID NO : 19). En outre, les CerK possèdent un domaine PH (« pleckstrin homology ») en position N-terminale qui est absent chez les SphK (SUGIURA et al., 2002, cité ci-dessus). A titre d'exemple, la sphingosine kinase 1 (GRMZ2G088549 P02) de maïs (Zea mays), représentée en tant que séquence SEQ ID NO : 1, comprend les 5 domaines conservés Cl à C5 aux positions suivantes : Cl, positions 114 à 142 ; C2, positions 171 à 192 ; C3, positions 201 à 219 ; C4, positions 254 à 282 ; et C5, positions 421 à 441. Le Tableau I ci-après décrit différents contigs ou loci contenant un ou plusieurs gènes codant pour une SphK, connus ou identifiés par les inventeurs chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. 35 40 Tableau I : Espèce Locus ou contig Protéine pleine longueur partielle (plong) ou (par) A. thaliana At5g23450 At4g21540 At4g21534 At2g46090 Z. mays GRMZM2G088549 T02 (SEQ ID NO: 2) SEQ ID NO: 1 (plong) GRMZM2G057475 T04 (SEQ ID NO: 4) SEQ ID N0: 3 (plong) GRMZM2G345725 TOI (SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 5 (plong) GRMZM5G812553 T02 (SEQ ID NO: 8) SEQ ID N0: 7 (plong) GRMZM5G800975 TOI (SEQ ID N0: 10) SEQ ID NO: 9 (par) GRMZM2G074665 T01 (SEQ ID N0: 12) SEQ ID NO: 11 (par) GRMZM2G428730 T01 (SEQ ID N0: 14) SEQ ID NO: 13 (par) GRMZM2G111086 T01 (SEQ ID NO: 16) SEQ ID N0: 15 (par) Les inventeurs ont mis en évidence de manière inattendue, chez le maïs, que la modulation de l'expression de la sphingosine kinase 1 (SphKl ; SEQ ID NO : 1), c'est-à-dire la surexpression du gène ZmSphK1 (GRMZ2G088549) codant cette SphKl ou l'inhibition de l'expression du gène ZmSphKl, induit une tolérance augmentée à un stress hydrique par rapport aux plantes de maïs sauvages (non transgéniques). La présente invention a donc pour objet un procédé pour augmenter la tolérance d'une plante à un stress hydrique, de préférence à un déficit hydrique, caractérisé en ce que l'on module l'expression, dans ladite plante, d'une sphingosine kinase (SphK) de plante. On entend par « moduler l'expression d'une SphK », la modification de l'expression d'une SphK par rapport à une plante de type sauvage, soit par surexpression de ladite SphK soit par inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de ladite SphK. Le choix par l'homme du métier de surexprimer ou d'inhiber l'expression de ladite SphK pour augmenter la tolérance d'une plante à un stress hydrique peut être fonction du résultat obtenu en termes de cinétique de desséchement, de taux d'enroulement foliaire (mesurés par exemple selon la 4 méthode décrite dans les Exemples ci-dessous) ou de rendement, en conditions de stress hydrique. Par exemple, si une plante dans laquelle ladite SphK est surexprimée présente un rendement (e.g., biomasse sèche, poids des grains, teneur en protéines) supérieur en conditions de stress hydrique par rapport à ladite plante dans laquelle l'expression et/ou l'activité de ladite SphK est inhibée, alors l'homme du métier choisira de surexprimer ladite SphK. Si les résultats sont inverses alors, l'homme du métier choisira d'inhiber l'expression et/ou l'activité de ladite SphK. La mesure du rendement et les conditions de stress hydrique sont bien connues de l'homme du métier pour chaque variété végétale. A titre d'exemple, pour le maïs, la mesure du rendement en conditions de stress hydrique peut être effectuée par la mesure de la biomasse à la floraison des plantes dans les conditions de « scénario de stress hydrique » décrites dans les Exemples ci-dessous. On entend par « sphingosine kinase » ou « SphK » une enzyme (EC 2.7.1.91) capable de phosphoryler la sphingosine (Sph) pour donner la sphingosine-1-phosphate (S1P) et comprenant de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale les 5 domaines conservés Cl à C5 décrits par Sugiura et al., 2002 et LIU et al., 2002 (cités ci-dessus), et, de préférence, dont le domaine C5 comprend le motif conservé de séquence xxV(S/I)DGE (SEQ ID NO : 18). L'activité enzymatique d'une sphingosine kinase peut être mesurée en utilisant la méthode décrite par COURSOL et al. (Plant Physiol., 2005, 137: 724-37). Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, ladite SphK possède au moins 45% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité avec la séquence peptidique codée par le gène ZmSphK1 de maïs de séquence SEQ ID NO : 1. Sauf précision contraire, l'alignement entre deux séquences peptidiques et le calcul du pourcentage d'identité sont effectués sur toute la longueur des séquences peptidiques en utilisant les paramètres suivants : matrice (Matrix) . EBLOSUM62, pénalité d'insertion/délétion (Gap penalty) . 10,0 et pénalité d'extension (Extend penalty) : 0,5. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, la séquence de ladite SphK est choisie dans le groupe constitué par les séquences d'acides aminés suivantes : SEQ ID NO : 1 (ZmSphK1), SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 7 et SEQ ID N0: 20 (AtSphKl), de préférence la séquence SEQ ID NO : 1. La présente invention s'applique à toutes les plantes monocotylédones ou dicotylédones, et notamment aux plantes sensibles au déficit hydrique. De préférence, elle s'applique au blé, riz et maïs, de préférence encore au maïs. La surexpression (augmentation de l'expression) dans une plante d'une SphK telle que définie ci-dessus, peut être effectuée par la modification du génome de ladite plante. Cette modification du génome peut notamment s'effectuer par transformation génétique de ladite plante par une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour ladite SphK, associé à des séquences de régulation en cis de son expression. La surexpression de ladite SphK peut également être obtenue par modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite SphK, par exemple en remplaçant son promoteur endogène par un promoteur plus fort, permettant un niveau de transcription plus élevé, ou bien en adjoignant au promoteur endogène des séquences activatrices de la transcription, de type « amplificateur », ou de la traduction. Selon une modalité de ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise une cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour une SphK telle que définie ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ledit promoteur peut être un promoteur hétérologue. Dans ce cas, on peut utiliser par exemple : - des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur de la gluténine de haut poids moléculaire spécifique de l'endosperme (VERDAGUER et a1., Plant Mol Biol., 31:1129-1139, 1996), le promoteur de l'ARN 35S (ODELL et al., Nature, 313:810-812, 1985) ou 19S (KAY et al., Science, 236:1299-1302, 1987) du CaMV, le promoteur de l'actine 1 du riz (McELROY et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), le promoteur de l'ubiquitine 3 du riz ou du maïs (SIVAMANI et QU, Plant Mol Biol., 60:225-239, 2006), - des promoteurs spécifiques des feuilles, tels que le promoteur de la petite sous-unité de la Rubisco, le promoteur de la phosphoénolpyruvate carboxylase, - des promoteurs spécifiques des racines, tels que le promoteur RCc3 du riz (Demande Internationale WO 2009/016104), le promoteur antiquitine du riz (Demande Internationale WO 2007/076115), ou - des promoteurs localement inductibles par le stress (sécheresse, salinité), tels que le promoteur rd29 d'Arabidopsis (YAMAGUCHI-SHINOZAKI et SHINOZAKI, Mol. Gen. Genet., 236: 331-340, 1993). On peut également utiliser des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus dans un vecteur hôte. Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants tels que décrits ci-dessus peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc. On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription, les séquences de tête (séquences « leader ») et les sites de polyadénylation. Ces séquences peuvent être celles qui sont naturellement associées au gène codant une SphK telle que définie ci-dessus, ou bien peuvent être des séquences hétérologues. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. A titre d'exemples de séquences de ce type fréquemment utilisées chez les plantes, on citera parmi les plus répandues, le terminateur de l'ARN 35S du CaMV et le terminateur du gène de la nopaline synthase. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences « enhancer » de la transcription et de la traduction). Parmi les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules ou organismes transformés. Il s'agit notamment de gènes rapporteurs, conférant aux cellules ou organismes transformés un phénotype aisément reconnaissable, ou bien de gènes marqueurs de sélection : seules les cellules ou organismes exprimant un gène marqueur de sélection déterminé, sont viables dans des conditions données (conditions sélectives). Des gènes rapporteurs fréquemment employés sont par exemple celui de la beta-glucuronidase (GUS), celui de la luciférase, ou celui de la « green fluorescent protein » (GFP). Des gènes marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistance à un antibiotique, ou également, dans le cas des plantes ou des cellules végétales, à un herbicide. Il existe une très grande variété de gènes marqueurs de sélection parmi lesquels l'homme du métier peut effectuer son choix en fonction des critères qu'il aura lui-même déterminés. Selon ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on peut également utiliser des cellules-hôtes transformées par un polynucléotide codant pour une SphK telle que définie ci-dessus, ce qui inclut en particulier les cellules hôtes transformées par une cassette d'expression ou un vecteur recombinant tels que décrits ci-dessus. On entend par « cellule ou organisme transformé par un polynucléotide », toute cellule ou organisme dont le contenu génétique a été modifié par transfert dudit polynucléotide dans ladite cellule ou ledit organisme, quelle que soit la méthode de transfert qui a été utilisée, et que l'information génétique apportée par ledit polynucléotide soit intégrée dans l'ADN chromosomique ou demeure extra-chromosomique. Les cellules hôtes peuvent être des cellules procaryotes ou eucaryotes. Dans le cas de cellules procaryotes, il peut notamment s'agir d'Agrobactéries telles qu'Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizobium. Dans le cas de cellules eucaryotes, il peut s'agir notamment de cellules végétales, issues de plantes monocotylédones ou dicotylédones. Les plantes transgéniques peuvent être obtenues par transformation génétique par au moins un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus. Ces plantes transgéniques comprennent dans leur génome au moins une copie d'un transgène contenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus. On définit ici comme plante transgénique une plante transformée chez laquelle l'information génétique exogène apportée par un polynucléotide transformant est intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique, sous forme de transgène, et peut ainsi être transmise aux descendants de ladite plante. Cette définition englobe donc également les descendants des plantes résultant de la transgénèse initiale, dès lors qu'ils contiennent dans leur génome une copie du transgène. Différentes méthodes d'obtention de plantes transgéniques sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier. Généralement, ces méthodes impliquent la transformation de cellules végétales, la régénération de plantes à partir des cellules transformées, et la sélection des plantes ayant intégré le transgène. De nombreuses techniques de transformation de cellules végétales germinales ou somatiques (isolées, sous forme de cultures de tissus ou d'organe, ou sur la plante entière), et de régénération des plantes sont disponibles. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante concernée. A titre d'exemples non limitatifs de méthodes utilisables dans le cas des plantes dicotylédones, il est possible de citer les protocoles décrits par GUIS et al. (Scientia Horticulturae 84 : 91-99, 2000) pour le melon, par HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot. 44 : 1837-1845, 1993) pour la tomate, par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Rep. 3 : 178-181, 1986), par TROLINDER et GOODIN (Plant Oeil Rep. 6 : 231-234, 1987) pour le cotonnier, par VAN DER MARK et al. (J. Genet Breeding 44 : 263-268, 1990) ou par MARCHANT et al. (Ann. Bot. 81 : 109-114, 1998) pour les rosiers. Dans le cas des plantes monocotylédones, on peut citer par exemple les protocoles décrits par HIEI et al. (The Plant Journal, 6, 271-282, 1994) ou ISHIDA et al. (Nature biotechnology, 14, 745-750, 1996) pour le maïs, ou par RASCO-GAUNT et al. (J. Exp. Bot. 52 : 865-874, 2001) pour le blé. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide codant une sphingosine kinase telle que définie ci-dessus, pour induire chez une plante une tolérance à un stress hydrique. L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité d'une SphK telle que définie ci-dessus peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes. De manière particulièrement avantageuse, cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de ladite SphK, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de cette SphK. La mutagenèse du gène codant pour ladite SphK peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. A titre d'exemple, pour le maïs, on citera la mutagenèse insertionnelle : on produit un grand nombre d'individus dérivant d'une plante active pour la transposition d'un élément transposable (élément AC ou Mutator), et on sélectionne, par exemple par PCR, les plantes chez lesquelles une insertion s'est effectuée dans le gène de ladite SphK. Cette séquence exogène peut aussi être un ADN-T (fragment du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens). On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre l'enzyme moins active que la protéine sauvage. Les allèles mutés du gène de ladite SphK peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène. Dans ce cadre, on peut notamment utiliser des techniques de type « TILLING » (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes ; McCALLUM et al, Plant Physiol., 123, 439-442, 2000). On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant un gène codant pour ladite SphK. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARN sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite SphK, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents (pour revue sur les techniques d'inhibition antisens voir par exemple : WATSON et GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (HIATT, A, ed) New York : Marcel DEKKER, 255-281, 1992 ; CHICAS et MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001 ; pour revue concernant plus spécifiquement l'utilisation des ARNs interférents voir HANNON, Nature, 418, 244-251, 2002). Selon ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression d'un SphK telle que définie ci-dessus. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, des ARN interférents (ARN double brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des micro-ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides) (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008 ; SCHWAB et a1., Methods Mol Biol., 592, 71-88, 2010 ; WEI et al., Funct Integr Genomics., 9, 499-511, 2009) ou des ribozymes ciblant un gène codant pour une SphK telle que définie ci-dessus. De préférence, ledit polynucléotide capable d'inhiber l'expression de ladite SphK est un ARN interférent 5 (ARNi). A titre d'exemple non limitatifs d'un tel ARNi, on peut utiliser celui de séquence SEQ ID NO : 21. Selon une modalité de mise en oeuvre préférée, la construction d'ADN recombinant est choisie parmi : - une construction d'ADN comprenant un fragment 10 d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc du gène codant pour une SphK telle que définie ci-dessus, - une construction d'ADN de 200 à 1000 pb, comprenant un fragment du l'ADNc du gène codant pour une SphK 15 telle que définie ci-dessus, ou un polynucléotide complémentaire, qui lorsqu'elle est transcrite forme un ARN en épingle à cheveux (« hairpin RNA ») ciblant ledit gène ; - une construction d'ADN, capable, lorsqu'elle est transcrite, de former un micro-ARN ciblant un gène codant pour 20 une SphK telle que définie ci-dessus. De manière avantageuse, ladite construction d'ADN recombinant comprend un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins 50 nucléotides consécutifs du 25 polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 1. Ces constructions peuvent être notamment : - des cassettes d'expression, comprenant une ou plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur 30 approprié. Ces cassettes d'expression peuvent également comprendre, avantageusement, d'autres éléments de régulation, en particulier des éléments de régulation de la transcription tels que terminateurs, amplificateurs, etc. - des vecteurs recombinants, comprenant une ou 35 plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, ou avantageusement une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Des constructions d'ADN recombinant conformes à ce mode de mise en oeuvre de l'invention peuvent également comprendre d'autres éléments, par exemple un ou plusieurs marqueurs de sélection. L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à ce mode de mise en oeuvre de l'invention. A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs 10 utilisables dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, on citera ceux décrits ci-dessus. A titre d'exemples non-limitatifs d'autres éléments de régulation de la transcription utilisables dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, on citera des 15 terminateurs, tels que le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase ou le terminateur 3'CaMV. A titre d'exemples non-limitatifs de gènes marqueurs de sélection utilisables dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, on citera notamment des gènes 20 conférant une résistance à un antibiotique (HERRERA-ESTRELLA et al., EMBO J., 2, 987-995, 1983) tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine, ou à un herbicide (EP 0 242 246) tels que le glufosinate, le glyphosate ou la bromoxynil, ou le gène NPTII qui confère la 25 résistance à la kanamyine (BEVAN et al., Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984). La transformation des plantes peut s'effectuer par de nombreuses méthodes, connues en elles-mêmes de l'homme du métier, telles que celles décrites ci-dessus. 30 La présente invention a également pour objet une cellule végétale comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet une 35 plante transgénique contenant un transgène comprenant une construction d'ADN recombinant ou une cassette d'expression telles que définies ci-dessus. La présente invention a également pour objet les plantes susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à ce mode de mise en oeuvre de l'invention. Lesdites plantes peuvent porter des mutations inhibant la SphK telle que définie ci-dessus ou exprimer un polynucléotide capable d'inhiber l'expression de ladite SphK. Bien entendu, la présente invention englobe les descendants, notamment les hybrides issus d'un croisement impliquant au moins une plante selon l'invention, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes directement obtenues par le procédé selon la présente invention. Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc.) obtenu à partir des cellules transformées ou des plantes transgéniques selon la présente invention fait également partie de l'objet de la présente invention. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes transgéniques, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs et les fruits. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'obtention de maïs transgéniques surexprimant une SphK telle que définie ci-dessus ou dont l'expression d'une SphK telle que définie ci- dessus est inhibée, et la mise en évidence du rôle de ladite SphK dans la résistance au déficit hydrique, ainsi que des figures annexées . Figure 1 : carte des vecteurs binaires pBI0S1301 (A) utilisé pour l'obtention de plantes transgéniques dont 30 l'expression de SphK est inhibée, et pBI0S1314 (B) utilisé pour l'obtention de plantes transgéniques surexprimant ZmSphK1. Figure 2 : graphique représentant le cumul des apports d'engrais sur la culture de maïs. Les rampes stressées 35 ont reçu en fin d'expérimentation près d'1/3 d'engrais en moins comparativement à la condition optimale d'irrigation (rampes irriguées). Les apports en condition optimale d'irrigation corrèlent avec l'évapotranspiration potentielle (ETP) relevée au moyen de l'évapotranspiromètre (ET-Gage). Figure 3 : graphique représentant le suivi du potentiel hydrique du sol pour le pilotage de l'irrigation (moyenne des 6 sondes par rampe). Plus le potentiel hydrique augmente, plus la réserve utile du sol s'épuise. La rampe irriguée reste bien à zéro garantissant une irrigation optimale couvrant 100% de l'évapotranspiration réelle (ETR). Au seuil 40-50 Cbar soit environ 10 jours après l'arrêt de l'irrigation, apport de 50% de l'ETR pour les rampes sous contrainte hydrique pendant 15 à 20 jours (période de stress). En phase de récupération, rapide retour aux conditions optimales (retour à la valeur 0). Figure 4 : graphique représentant la cinétique de dessèchement des plantes transgéniques dans lesquelles l'expression du gène SphK1 est inhibée par ARN interférences (lignées ARNi) ou surexprimant la SphK (lignées surexpresseur) évaluées sur la plate-forme de phénotypage. T RRS : lignée ARNi ; T RCP : lignée surexpresseur ; NT RRS : témoin ARNi (ségrégant sauvage) ; NT RCP témoin surexpresseur (ségrégant sauvage). Figure 5 : graphique représentant un agrandissement du graphique de la Figure 4 au temps 8h. EXEMPLE 1 : OBTENTION DE MAÏS TRANSGENIQUES DANS 25 LESQUELLES L'EXPRESSION DE LA SPHINGOSINE KINASE 1 EST MODULEE PAR SUREXPRESSION OU PAR INHIBITION PAR ARN INTERFERENCE 1) Clonage et transformation génétique du maïs L'expression du gène SphK1 a été modulée chez des plantes de maïs transgéniques, soit par inhibition par ARN 30 interférence soit par surexpression. La stratégie de clonage GatewayO a été utilisée pour introduire dans les vecteurs de transformation une cassette d'expression contenant le gène d'intérêt. Le gène synthétique codant la protéine ZmSphKl de 35 mals (contenant les 5 domaines catalytiques Cl à C5 (GRMZM2G088549 P02) de séquence SEQ ID NO : 22 (séquence synthétique optimisée pour l'expression dans le maïs) contenant les sites de recombinaison attLl et attL2 a été introduit par une réaction de recombinaison LR dans le vecteur binaire de destination GATEWAY pBIOS886, générant ainsi le vecteur pBIOS1314 (voir Figure 1A). Le gène codant ZmSphK1 est noté « SynSphKZmMod » sur la carte du vecteur pBIOS1314. Le vecteur pBIOS886 est dérivé du vecteur pSB12 (KOMARI et al., Plant J., 1996, 10:165-174) contenant le gène bar de Streptomyces hygroscopicus conférant la résistance à l'herbicide bialaphos (WHITE et a1., Nucleic Acids Res., 1990, 18:1062) sous le contrôle du promoteur pActin, le gène codant une GFP (Green Fluorescente Protein) sous le contrôle du promoteur du CsVMV suivi par l'intron FAD2, le promoteur CsVMV et l'intron active suivie d'une cassette GATEWAY et d'une séquence de polyadénylation provenant du gène Sac66 d'Arabidopsis (JENKINS et al., plant Oeil Environ., 1999, 22:159-167,). Pour l'inhibition par ARN interférence, les cibles choisies sont les domaines catalytiques C4 et C5. La séquence RNAi (SEQ ID NO°: 21 ; séquence pour l'inhibition dans le maïs) contenant les sites de recombinaison attL1 et attL2 a été introduite par une réaction de recombinaison LR dans le vecteur binaire de destination GATEWAY pBIOS893, générant ainsi le vecteur pBIOS1301 (voir Figure 1B). La séquence de l'ARNi est notée « ZmSphK partial » sur la carte du vecteur pBIOS1301. Le vecteur pBIOS893 est dérivé du vecteur pSB12 (KOMARI et al., Plant J., 1996, 10:165-174,) contenant le gène bar sous le contrôle du promoteur pActin, le gène codant une GFP sous le contrôle du promoteur du CsVMV suivi par l'intron FAD2, le promoteur CsVMV et l'intron actine suivie de 2 cassettes GATEWAY orientées en sens inversé et séparées par l'intron tubuline de riz et d'une séquence de polyadénylation provenant du gène Sac66 d'Arabidopsis (JENKINS et al., Plant Cell Environ., 1999, 22:159-167). Les vecteurs pBIOS1301 et pBIOS1314 ont ensuite été transférés, indépendamment l'un de l'autre, dans la souche 35 d'Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB1) selon la méthode décrite par KOMARI et al., 1996 (cité ci-dessus). Le cultivar de maïs A188 a ensuite été transformé par cette souche d'agrobactérie contenant soit le vecteur pBI0S1301 soit le vecteur pBI0S1314, selon la méthode décrite par ISHIDA et al., 1996 (cité ci-dessus). Le matériel végétal génétiquement modifié (transformant) est sélectionné : la présence de l'ADN-T et le nombre de copies du transgène sont déterminés par PCR quantitative (gPCR). En outre, la présence du gène rapporteur GFP dans les deux vecteurs ayant servi à l'obtention des plantes transgéniques a permis de trier les graines transgéniques des ségrégants sauvages non transgéniques. Les transformants sélectionnés sont ensuite régénérés en plantes. Les plantes transgéniques sont analysées selon des méthodes de routine : nombre de copies intégrées du transgène, intégrité de l'ADN-T. L'expression complète de l'ARNm et le niveau d'expression du gène d'intérêt sont déterminés par PCR quantitative. 2) Evaluation de la tolérance des plantes transgéniques au déficit hydrique 5 évènements de transformation « ARN interférence » (désignés RRS ci-après) et 4 évènements de transformation « surexpresseur » (désignés RCP ci-après) ont été évalués sur la plate-forme de phénotypage (voir ci-dessous). Les plantes transgéniques évaluées sur la plate-forme de phénotypage sont des plantes de première génération (croisement du transformant primaire avec la lignée récurrente A188) à l'exception des lignées RRS-004a et RRS-014a qui sont de deuxième génération (deux croisements successifs depuis le transformant primaire avec la lignée A188). Ces plantes transgéniques sont donc hémizygotes pour le transgène (caractère dominant de la transformation génétique). Les témoins (« RRS » et « RCP) utilisés dans l'expérimentation correspondent aux ségrégants sauvages issus de ce même croisement. Le Tableau II ci-dessous montre le détail en termes de profil moléculaire des évènements de transformation (ARN interférence ou surexpression) évalués sur la plate-forme de phénotypage. Evènement Nombre de copies Nombre Modulation de loci RRS-06a 1 copie tronquée côté RB 1 ARNi (« Ri gh t Border ») de l' ADN-T RRS-lla 1 copie tronquée côté RB 1 ARNi et LB (« Left Border ») de l' ADN-T RRS-15a 1 copie tronquée côté RB 1 ARNi RRS-19a 1 copie tronquée côté RB 1 ARNi RRS-22a 1 copie tronquée côté RB 1 ARNi RCP-07a 1 1 surexpression RCP-09a 1 1 surexpression RCP-15a 1 1 surexpression RCP-26a 1 1 surexpression 2.1 Dispositif utilisé La plate-forme de phénotypage est mise en place dans un compartiment complet d'une serre. Ce compartiment dispose d'une surface au sol d'environ 56 m2 et permet d'accueillir 270 plantes réparties sur 5 rampes (54 plantes par rampe). Un tel dispositif - où les plantes sont cultivées en pot d'une contenance de 5 litres - équivaut à une densité de culture d'environ 48 500 pieds / ha. Dans ce dispositif, deux rampes extérieures constituent le traitement en "condition optimale d'irrigation" et trois rampes intérieures constituent le traitement "partiellement sous contrainte hydrique". Pour chaque entrée (c'est-à-dire chaque évènement de transformation), les effectifs sont de 13 plantes : 5 plantes cultivées en condition optimale d'irrigation et 8 plantes cultivées en partie sous contrainte hydrique. 2.2 Conditions de culture Au sein du compartiment de culture la température, 20 l'humidité et le rayonnement solaire sont régulés. Les conditions appliquées sont les suivantes : - Photopériode : - Jour durant 16h (6h à 22h) avec complément photosynthétique (lampe à sodium 400W) lorsque le rayonnement extérieur est inférieur à 100W/m2 et avec ombrage lorsque le rayonnement extérieur est supérieur à 500 W/m2. - Nuit durant 8h (22h à 6h). - Température : 24°C jour et 19°C nuit calés sur les horaires de la photopériode. Le respect de ces conditions est assuré par un chauffage lorsque la température est inférieure à 19°C la nuit ou 24°C le jour, par un système d'ouvrants en toiture lorsque la température dépasse 25°C et par une ventilation mécanique lorsque la température de l'enceinte dépasse 26°C. Le système d'ombrage permet également de réguler la température en limitant l'effet de serre. - Humidité : 85% d'humidité relative régulée par brumisation nocturne. Ces différentes conditions assurent une croissance optimale du maïs. Les conditions de culture sont suivies et enregistrées à l'aide de différents équipements : - une mini station météo au centre du compartiment de culture enregistre la température et l'humidité relative au cours du temps. Le rayonnement intérieur est également connu à partir du rayonnement extérieur (mesuré par une sonde externe) corrigé par application d'un coefficient correcteur correspondant aux propriétés du verre de la serre ; - quatre enregistreurs de température, d'humidité et de rayonnement lumineux (HOBOO) sont placés aux quatre coins du compartiment de culture, au dessus du couvert végétal et avec un pas de temps d'enregistrement de 1 heure ; - une station météo, modèle "La Crosse Technology WS9010" équipée de 4 capteurs enregistre également les températures et humidité relative au centre et aux quatre coins du compartiment de culture ; et - un évapotranspiromètre, appelé ET-Gage, placé au sein du compartiment de culture permet de suivre l'évapotranspiration potentielle (ETP) tout au long de la culture. L'ensemble de ces outils permet de s'assurer des bonnes conditions de culture et de quantifier les gradients au 5 sein du compartiment de culture. 2.3 Régime hydrique et scénario de stress hydrique appliqué La culture des plantes est réalisée par fertiirrigation (apport d'engrais dans l'eau d'irrigation). Un 10 programmateur précis à la seconde permet d'apporter à chaque plante une quantité précise d'engrais. Une pompe de type Dosatron, placée en amont des rampes où est appliqué le stress, permet d'assurer pendant la phase de stress un apport complet en engrais au niveau des 15 plantes. En condition optimale d'irrigation, les apports ont été ajustés en cours de culture en vue de couvrir l'évapotranspiration réelle des plantes (ETR). Une étude préliminaire en serre a permis de modéliser l'ETR de la lignée 20 A188 utilisée pour la transformation végétale au stade physiologique des plantes dans les conditions de culture. Pour les plantes cultivées partiellement sous contrainte hydrique, le choix du scénario de stress est le suivant : 25 1. irrigation optimale jusqu'à 50% de feuilles visibles afin d'assurer une bonne implantation de la culture (c'est-à-dire, apport de 100% de l'ETR), 2. au-delà de ce stade, arrêt de l'irrigation jusqu'à épuisement de la réserve facilement utilisable (RFU = 30 2/3 de la réserve utile), 3. une fois la RFU « épuisée », apport journalier couvrant 50% de l'ETR (apport de moitié comparativement à la condition irriguée) ; cette étape correspondant à la phase de stress hydrique, et 35 4. à la floraison, retour aux conditions optimales d'irrigation en couvrant 100% de l'ETR (phase de récupération des plantes). Pour "piloter" l'irrigation, des sondes tensiométriques Watermark® sont installées sur les 3 rampes de stress et l'une des rampes irriguées (6 sondes par rampe). Ces sondes permettent de suivre le potentiel hydrique du sol et ainsi de déclencher à l'épuisement de la RFU le retour à l'irrigation à hauteur de 50% de l'ETR. Une étude préliminaire en serre a permis de relier la valeur de potentiel hydrique du terreau utilisé correspondant à l'épuisement de 2/3 de la RU (Réserve Utile). La valeur correspond à un potentiel compris entre 40 et 50 Cbar. Le cumul des apports en solution nutritive sur l'ensemble du dispositif est représenté à la Figure 2. Le suivi du potentiel hydrique du sol est représenté à la Figure 3. 2.4 Mesure de la cinétique de dessèchement Pertinence du caractère mesuré Le comportement des plantes vis-à-vis de la transpiration est étudié grâce au suivi en continu de la baisse de la teneur en eau relative (RWC : Relative Water Content) de plantules à un stade jeune (4 feuilles visibles). L'objectif est d'étudier la réponse en termes de contrôle stomatique des plantes lors d'un arrêt brutal de l'alimentation Un d'un déficit mais limite la de production tardive des en eau. contrôle stomatique très rapide à l'apparition hydrique permet d'économiser l'eau disponible capacité d'assimilation du CO2 donc le potentiel de la plante. En revanche, une fermeture assez stomates permet le maintien de l'activité photosynthétique de la plante assurant le maintien du potentiel de production au risque de se dessécher plus rapidement (Khalfaoui, L'amélioration des plantes pour l'adaptation aux milieux arides, 1991, Paris : John Libbey. Eurotext, p. 51-63). Méthode . Les mesures sont réalisées sur des plantules entières au stade 4 feuilles visibles. Les plantes utilisées au cours de cette mesure sont des plantes issues d'un semis en excès par rapport aux besoins de la plate-forme (3 graines semées par pot). Les effectifs pour la mesure de dessèchement sont de 5 plantes par évènement de transformation et témoins sauvages. Les plantes sont coupées au niveau du collet, immergées pendant 24 heures à 4°C à l'obscurité (pour saturer les cellules en eau) puis placées dans une enceinte climatique lumineuse régulée à 30°C. Un suivi du poids des plantules est alors réalisé selon le calendrier détaillé dans le Tableau III ci-dessous : Tableau III : Calendrier des pesées des plantules conditionnées à 30°C en pleine lumière. Le poids à HO correspond au poids à pleine turgescence. En fin de jour 3, les plantules sont placées dans une étuve à 80°C pendant 24h00 afin d'obtenir par une dernière pesée la valeur de poids sec. Jour Durée Heure 1 HO 09h00 1 HO+l 10h00 1 H0+2 11h00 1 H0+4 13h00 1 H0+8 17h00 2 H0+24 09h00 2 H0+32 17h00 3 H0+48 9h00 3 H0+56 17h00 4 H0+96 09h00 A l'instant t, la teneur en eau relative des plantes est ensuite calculée selon la formule mathématique suivante : (Pt-Ps) / (PTurg- Ps) x 100. 2.5 Mesure de l'enroulement foliaire Pertinence du caractère mesuré : L'enroulement foliaire est un symptôme caractéristique du déficit hydrique. Il permet à la plante de limiter les pertes en eau par une réduction de la surface transpirante et de limiter sa consommation en eau par une 25 réduction de la quantité de lumière reçue. Lors d'un déficit hydrique, le mécanisme d'enroulement s'explique par la diminution de volume des cellules bulliformes, liée à une ~- Poids pleine turgescence (PTurg) r-- Poids à l'instant t (Pt) ~-- Poids sec (Ps) 20 perte de turgescence et donc à une fuite d'eau plus rapide que celle des tissus environnants, soit en direction de l'atmosphère, soit en direction du mésophylle (Bois et al., C. R. Acad. Sci. Paris, 1987, 305:449-452). L'enroulement des feuilles de maïs correspond au symptôme tardif d'une déficience en eau. La feuille, dans ce cas, intercepte moins d'énergie, et sa nouvelle morphologie entraîne une augmentation de la résistance de la couche limite rendant plus difficiles les pertes d'eau par transpiration. Méthode : La notation de l'enroulement foliaire est effectuée quotidiennement dès l'apparition des premières plantes enroulées et ce jusqu'à la disparition de ce phénomène lors du retour aux conditions optimales d'irrigation. Dès lors qu'une 15 plante a une feuille enroulée, celle-ci est notée comme enroulée. Chaque jour, toutes les plantes de la plate-forme sont annotées. 3 Résultats 3.1 Cinétique de dessèchement des lignées ARN 20 interférence (ARNi) et surexpresseur Les résultats obtenus pour les lignées ARNi et surexpression sont présentés aux Figures 4 et 5. a) Pour les lignées ARNi : Tous les évènements de transformation présentent 25 une cinétique de dessèchement plus rapide comparativement au témoin (ségrégant sauvage NT RRS) et à la lignée conventionnelle A188. Cette différence est la plus discriminante après 8 heures de dessèchement à 30°C. L'évènement RRS-06a est l'évènement qui de tous 30 dessèche le plus vite, 30% plus vite comparativement au témoin. A l'inverse l'évènement RRS-30a est celui qui dessèche le moins vite, seulement 8% de différence avec le témoin à 8 heures. Par ailleurs, il est à noter que les plantes 35 témoins dessèchent également plus vite que les plantes de la lignée conventionnelle A188 (différence de 10% à 8 heures). 10 b) Pour les lignées surexpresseur : Les résultats des cinétiques de dessèchement pour ces lignées sont variables : - la lignée transgénique RCP-15a est celle qui 5 dessèche le plus rapidement ; après 8 heures elle présente un dessèchement de 2,6% supérieur au témoin (NT RCP) ; - la lignée transgénique RCP-07a se comporte comme le témoin ; - les lignées RCP-09a et RCP-26a se dessèchent 10 moins vite que le témoin avec respectivement une différence de 2,8% et 12% à 8 heures. La lignée RCP-26a est celle qui se dessèche le moins vite. Elle se dessèche notamment moins vite que la lignée conventionnelle A188 (5% de moins à 8 heures). c) Conclusion . 15 Ces résultats montrent que d'une manière générale l'inhibition de l'expression du gène SphKl augmente la vitesse de dessèchement. A l'inverse le dessèchement semble ralenti par la surexpression de ce même gène. Cette tendance inverse est nette par comparaison de 20 la lignée ARNi qui dessèche le moins rapidement (RRS-30a) avec la lignée surexpresseur qui dessèche le plus rapidement (RCP-15a). Les cinétiques de dessèchement ne se croisent pas : l'ensemble des lignées ARNi dessèchent donc plus vite que l'ensemble des lignées surexpresseur. 25 3.2 Enroulement foliaire Les notations de l'enroulement ont été faites plante à plante, du premier jour de l'enroulement jusqu'au retour aux conditions d'irrigation optimale. Dès lors qu'une feuille est enroulée la plante est notée comme enroulée. 30 a) Pour les lignées ARNi : Toutes les lignées présentent au final un enroulement maximal avec 100% de plantes enroulées. Les premiers signes d'enroulement sont visibles dès 8 jours après l'application du stress pour les lignées les plus précoces. Le 35 Tableau IV présente le nombre de jours écoulés depuis le stade 50% de feuille visible (stade d'application du stress hydrique) où 100% de plantes enroulées est visible. Tableau IV : Suivi du taux d'enroulement des plantes des lignées ARNi soumises à un stress hydrique. Une plante est notée comme enroulée dès lors que l'une de ses feuilles s'enroule. Nombre de jours après Lignées RRS Comparaison par application du stress (ARNi) rapport au témoin hydrique où 100% des (en jours) plantes sont enroulées 15 RRS-11a -4 18 RRS-15a -1 18 RRS-19a -1 19 Témoin RRS 19 RRS-06a 0 19 RRS-22a 0 Il ressort du Tableau IV, que les lignées ARNi s'enroulent soit plus vite et plus longtemps que le témoin soit de manière identique. b) Pour les lignées surexpresseur : Toutes les lignées surexpresseur présentent avant la fin d'application du stress hydrique un taux d'enroulement de 100. Les premiers signes d'enroulement apparaissent après 8 jours de stress pour les lignées les plus précoces (3 des 4 lignées) et après 10 jours pour le témoin. Le Tableau V ci-dessous présente le nombre de jours suivant l'application du stress où 100% des plantes sont visiblement enroulées. Tableau V : Suivi du taux d'enroulement des plantes des lignées surexpresseur soumises à un stress hydrique au cours du temps. Une plante est notée comme enroulée dès lors que l'une de ses feuilles s'enroule. Nombre de jours après Lignées RCP Comparaison par application du stress (surexpresseur) rapport au témoin hydrique où 100% des (en jours) plantes sont enroulées 15 Témoin RCP 15 RCP-26a 0 18 RCP-15a +3 22 RCP-09a +7 25 RCP-07a +10 Tout comme pour les lignées ARNi, les lignées surexpresseur et leur témoin présentent un taux d'enroulement maximal lors de la phase de stress hydrique. Seule la lignée RCP-26a s'enroule à 100 aussi longtemps que le témoin, les autres lignées s'enroulent à no% de manière plus tardive avec un retard plus marqué pour la lignée RCP-07a (10 jours plus tard que le témoin). c) Conclusion . L'observation de l'enroulement de plantes cultivées sous contrainte hydrique montre une différence nette de comportement entre les plantes ARNi et les plantes surexprimant le gène SphK1. Certaines lignées ARNi présentent un enroulement foliaire plus précoce que les plantes sauvages, les lignées surexpresseur montrent elles une tendance inverse avec un enroulement plus tardif comparativement au témoin. Ces résultats tendent à montrer que l'inhibition du gène SphKl pourrait accélérer la réduction de la surface foliaire transpirante par un enroulement plus précoce des feuilles. REVENDICATIONS1) Procédé pour augmenter la tolérance d'une plante à un déficit hydrique, caractérisé en ce que l'on module 5 l'expression, dans ladite plante, d'une sphingosine kinase (SphK) de plante. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite SphK possède au moins 45% d'identité avec la séquence SEQ ID N0: 1. 10 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite plante est le maïs et ladite SphK possède la séquence SEQ ID NO : 1. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on augmente 15 l'expression dans ladite plante de ladite SphK. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite plante de ladite SphK. 20 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que : - l'augmentation de l'expression dans ladite plante de ladite SphK est effectuée par transformation génétique de ladite plante par une ou plusieurs copies d'un polynucléotide 25 codant pour ladite SphK, associé à des séquences de régulation en cis de son expression, ou par modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite SphK, ou - l'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité dans ladite plante de ladite SphK est 30 obtenue par mutagenèse du gène codant pour ladite SphK, ou par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de ladite SphK, ou par l'expression d'ARN sens, antisens ou double-brin ou de l'ADNc de cette protéine, ou par l'utilisation d'ARNs interférents. 35 7) Construction d'ADN recombinant, caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide codant pour un ARN antisens, un ARN interférent, un micro-ARN ou un ribozymeciblant un gène codant pour une SphK telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8) Construction d'ADN selon la revendication 7 sous le contrôle d'un promoteur approprié. 9) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une construction d'ADN telle que définie à la revendication 7 ou au moins une construction d'ADN telle que définie à la revendication 8. 10) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une construction d'ADN telle que définie à l'une quelconque des revendications 7 ou 8, ou une cassette d'expression telle que définie à la revendication 9. 11) Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression telle que définie à la revendication 9 ou un vecteur recombinant tel que défini à la revendication 10. 12) Plante transgénique, caractérisée en ce qu'elle contient un transgène comprenant une construction d'ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, ou une cassette d'expression selon la revendication 9. 13) Utilisation d'un polynucléotide isolé codant une SphK telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour induire chez une plante une tolérance à un déficit hydrique.25