Brevet FR2968305A1 — publié le 20120608

La présente invention vise à proposer un procédé de préparation d'hydrogels à base d'un polysaccharide réticulé, et de préférence d'acide hyaluronique ou de l'un de ses sels. Naturellement présent dans la peau, l'acide hyaluronique est connu pour ses propriétés viscoélastiques ainsi que sa très grande propension à absorber l'eau. Ses propriétés expliquent en grande partie l'élasticité de la peau. Ses biocompatibilité, tolérance et défaut de toxicité sont tels que depuis plus de 10 ans, cette molécule a des applications dans les domaines médicaux et cosmétiques, et en particulier pour le comblement des rides. Ainsi, l'injection dans le derme d'un hydrogel réticulé de polysaccharide au niveau des rides à traiter permet d'amoindrir, voire d'effacer l'affaissement local de la structure du derme qu'est une ride. D'une manière générale, le polysaccharide, et plus particulièrement l'acide hyaluronique, est mis en oeuvre sous une forme réticulée compte tenu de la résistance accrue de cette forme particulière à la dégradation et à la chaleur. Ces gels réticulés de polysaccharides peuvent être obtenus par différents procédés de préparation. D'une manière générale, ces procédés requièrent deux étapes principales, la première consistant à hydrater le polysaccharide considéré pour le transformer en un gel aqueux et la seconde visant à réticuler ledit gel aqueux en présence d'un agent apte à induire sa réticulation. Les procédés de réticulation classique pour l'acide hyaluronique sont habituellement réalisés à une température de l'ordre de 40 °C, voire 50 °C, sur une durée inférieure à 3 heures, ce qui permet d'obtenir une réticulation satisfaisante du gel de polysaccharide. C'est pourquoi ce mode de préparation est couramment utilisé dans l'industrie. A titre illustratif de ces procédés, peuvent notamment être cités les procédés décrits dans US 2006/0105022, qui comprend l'utilisation d'un mélange comprenant au moins 10 % d'acide hyaluronique, un agent réticulant et de l'eau dans des conditions acides ou basiques, dans WO 2006/056204, qui comprend une étape de traitement du gel d'acide hyaluronique réticulé avec du divinylsulfone et dans US 2007/0036745, qui conduit à un gel cohésif à partir d'un polymère d'hyaluronane réticulé avec du divinylsulfone (DVS). Pour des raisons évidentes, l'amélioration des propriétés mécaniques des hydrogels pour des applications dans les domaines médicaux et cosmétiques relève d'un objectif constant. La présente invention vise précisément à proposer un procédé permettant l'obtention de gels réticulés présentant des propriétés mécaniques particulièrement avantageuses. Contre toute attente, les inventeurs ont constaté qu'un mode de préparation original de gels réticulés permet d'améliorer significativement les propriétés desdits gels, en comparaison des propriétés manifestées par ceux obtenus au moyen d'un procédé classique. Ainsi, la présente invention concerne, selon un premier de ses aspects, un procédé de préparation d'un gel réticulé d'au moins un polysaccharide ou un de ses sels, comprenant au moins les étapes consistant à : a) disposer, à une température inférieure à 35 °C, d'un gel aqueux 15 comprenant au moins un polysaccharide sous une forme non réticulée associé à au moins un agent réticulant époxydique bi- ou multi-fonctionnel ; b) maintenir au moins une heure le mélange de l'étape a) à une température inférieure à 35 °C ; c) stimuler la cinétique de la réaction de réticulation du mélange obtenu 20 à l'issu de l'étape b) et, le cas échéant ; d) récupérer ledit gel réticulé formé, Plus précisément, l'invention résulte de l'observation inattendue, par les inventeurs, que la mise en oeuvre de deux cinétiques différentes consécutives, la première étant particulièrement lente et la seconde significativement plus rapide, pour la réalisation 25 de la réticulation, permet l'obtention de gels de polysaccharide réticulés présentant des propriétés viscoélastiques significativement améliorées en comparaison de gels obtenus au moyen de procédés classiques mettant en oeuvre une unique cinétique pour la réalisation de la réticulation. Comme il ressort de l'exemple 3 ci-après, les propriétés viscoélastiques 30 originales manifestées par les gels réticulés obtenus via la mise en oeuvre d'un procédé de l'invention ne peuvent aucunement être reproduites avec un gel obtenu selon un procédé de réticulation classique, c'est à dire mettant en oeuvre, pour la réalisation de ladite réaction de réticulation, une unique cinétique réalisée à une température supérieure à 40 °C et ce, même lorsque cette unique cinétique de réaction est réalisée sur des temps prolongés. Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de l'invention peut en outre comprendre une étape e) d'arrêt de la réticulation consistant à exposer le gel réticulé à des conditions propices à l'arrêt de sa réticulation, cette étape pouvant être réalisée antérieurement, conjointement ou postérieurement à l'étape de récupération d). Selon une variante de réalisation préférée, l'étape e) est réalisée antérieurement à l'étape d). Avantageusement, le gel réticulé obtenu à l'issue de la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention est un gel monophasique et plus particulièrement un gel viscoélastique majoritairement élastique, c'est-à-dire diminué, voire dénué, de la faculté de s'écouler en l'absence de contraintes autres que son propre poids. Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne l'utilisation d'un gel réticulé obtenu par mise en oeuvre d'un procédé tel que défini précédemment, pour le comblement durable des défauts de volume de la peau, et notamment le comblement des rides. I) Procédé Un procédé de l'invention requiert, dans un premier temps, de disposer d'un gel 20 aqueux comprenant au moins un polysaccharide sous une forme non réticulée associé à un agent réticulant époxydique bi- ou multi-fonctionnel. Par « non réticulé », au sens de la présente invention, on entend désigner un gel aqueux de polysaccharides non réticulé ou faiblement réticulé, c'est-à-dire un gel dont l'angle de déphasage 8, mesuré en rhéologie dynamique à 1Hz, est supérieur à 40° lorsqu'il 25 est soumis à un contrainte supérieure à 1Pa. Plus précisément, le gel aqueux considéré en étape a) peut être au préalable obtenu par mise en présence, au sein d'un réceptacle approprié : (i) d'un milieu aqueux ; (ii) d'au moins un polysaccharide, ou un de ses sels, sous une forme non 30 réticulée ; (iii) d'au moins un agent réticulant époxydique bi- ou multi-fonctionnel; et homogénéisation du mélange ainsi obtenu, l'ordre d'ajout dans le réceptacle desdits composés (i), (ii) et (iii) étant indifférent. Selon une première variante de réalisation, ce gel aqueux peut être formé par introduction au sein du réceptacle, du milieu aqueux et du polysaccharide, avec homogénéisation simultanée et/ou consécutive du mélange ainsi formé, puis ajout de l'agent réticulant avec homogénéisation simultanée et/ou consécutive. Selon une seconde variante de réalisation, ce gel aqueux peut être obtenu par introduction, au sein du réceptacle, du milieu aqueux, du polysaccharide et de l'agent réticulant, avec homogénéisation simultanée et/ou consécutive du mélange ainsi formé. Cette seconde variante de réalisation est avantageuse en ce qu'une seule étape d'homogénéisation est mise en oeuvre. Avantageusement, cette étape de formation du gel aqueux peut être réalisée à une température inférieure à 35 °C, de préférence à une température allant de 15 à 25 °C, et mieux à une température ambiante. Quelque soit le mode de réalisation considéré, la formation d'un gel aqueux tel que considéré en étape a) implique au moins une homogénéisation. Cette opération, réalisée ou non en présence de l'agent réticulant, a plus particulièrement pour but d'hydrater et d'homogénéiser parfaitement le polysaccharide dans le milieu aqueux et, le cas échéant, l'agent réticulant, et ainsi de contribuer à l'optimisation des qualités du gel réticulé attendu. En effet, pour des raisons évidentes, l'homogénéité du gel réticulé est étroitement liée au caractère homogène du gel avant réticulation. L'homogénéisation est considérée comme satisfaisante lorsque la solution obtenue présente une coloration homogène, sans agglomérat, et une viscosité uniforme. Elle peut avantageusement être réalisée dans des conditions opératoires douces pour prévenir une dégradation des chaines du polysaccharide. Cette étape est d'autant plus importante lorsque le polysaccharide présente un haut poids moléculaire. L'hydratation d'un tel composé a alors en effet tendance à engendrer la formation d'une solution de haute viscosité au sein de laquelle l'apparition d'agglomérats est couramment observée. La durée de cette étape d'homogénéisation dépend de la nature du polysaccharide, et plus particulièrement de son poids moléculaire, de sa concentration, des conditions opératoires au sein du milieu aqueux ainsi que du dispositif d'homogénéisation utilisé. L'ajustement de la durée d'homogénéisation adéquate pour obtenir un gel aqueux de polysaccharide suffisamment homogène relève des connaissances générales de l'homme du métier. De préférence, une étape d'homogénéisation selon la présente invention peut se dérouler sur une durée inférieure à 200 minutes, de préférence inférieure à 150 minutes, 10 voire comprise entre 15 et 100 minutes. Comme il ressort de ce qui précède, le gel aqueux de l'étape a) est soumis à deux cinétiques différentes consécutives de réticulation, illustrées respectivement par les étapes b) et c) du procédé de l'invention. 15 La réticulation a pour but la création de ponts entre les chaines de polysaccharides, et notamment d'acide hyaluronique, permettant l'obtention d'un réseau tridimensionnel solide et dense à partir d'une solution visqueuse. i) Conditions de réalisation de l'étape b) 20 L'étape b) implique de maintenir, sur une durée au moins égale à une heure, le mélange de l'étape a) à une température inférieure à 35 °C. Ainsi, l'étape b), au regard les conditions environnementales dans lesquelles elle est réalisée, n'est compatible qu'avec une cinétique lente de réticulation. De préférence, l'étape b) est réalisée à une température allant de 15 à 25 °C, et 25 mieux à température ambiante. La cinétique lente de réticulation considérée en étape b) peut notamment être caractérisée par la vitesse de disparition, au sein du mélange obtenu à l'issue de l'étape a), en agent réticulant époxydique. Ainsi, la vitesse moyenne de disparition en agent réticulant époxydique au 30 cours de l'étape b) est inférieure à 5 ppm/min, de préférence inférieure à 2 ppm/min, pour une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g. De préférence, l'étape b) se déroule sur une durée supérieure à une heure, de préférence supérieure à deux heures. ii) Conditions de réalisation de l'étape c) L'étape c) implique en revanche une stimulation de la réaction de réticulation. Ainsi, par « stimuler », on entend désigner, au sens de la présente invention, une augmentation significative de la cinétique de la réaction de réticulation. Les conditions particulières à retenir pour induire une stimulation de la réaction de réticulation peuvent dépendre de la nature du polysaccharide, de son poids moléculaire, du milieu aqueux et de la nature de l'agent réticulant. D'une manière générale, cette stimulation peut être acquise par mise en présence du mélange obtenu à l'issu de l'étape b) avec un élément déclenchant, ou encore stimulant, tel que par exemple le chauffage, l'exposition sous UV, voire la mise en contact dudit mélange avec un matériau de type catalyseur. Le choix d'un tel élément déclenchant relève des connaissances générales de l'homme du métier. Ainsi, un élément déclenchant peut être réalisé par : - immersion du réceptacle comprenant le mélange obtenu à l'issue de l'étape b) dans un bain contenant un fluide chaud ; - exposition de celui-ci à des rayonnements de certaines longueurs d'ondes de type UV, par exemple, à des rayonnements micro-ondes ou encore à infrarouge ; - l'irradiation au moyen de rayons ionisants, à l'image du procédé décrit dans le document US 2008/0139796 ; et - la réticulation enzymatique ; Dans le cadre de la présente invention, cet élément déclenchant est avantageusement figuré par une élévation thermique imposée au mélange obtenu à l'issu de l'étape b). Une température particulièrement adaptée à l'étape c) dépend de la nature du polysaccharide considéré. Dans le cas où le polysaccharide est l'acide hyaluronique, une température particulièrement adaptée à l'étape c) est comprise entre 35 °C et 60 °C, de préférence entre 45 et 55 °C, et mieux entre 48 et 52 °C. Comme pour l'étape b) précédemment décrite, la cinétique rapide de réticulation considérée en étape c) peut notamment être caractérisée par la vitesse de disparition, au sein du mélange obtenu à l'issue de l'étape b), en agent réticulant époxydique. Ainsi, la vitesse moyenne de disparition en agent réticulant au cours de l'étape c) est supérieure à 5 ppm/min, de préférence supérieure à 7 ppm/min, pour une concentration en acide hyaluronique de 20 mg/g. Le degré de réticulation dépend également de la durée de réticulation imposée au mélange obtenu à l'issu de l'étape b). Plus le temps sera long, plus il sera important, avec toutefois un optimum à ne pas dépasser, sous risque de dégrader le polysaccharide. Ainsi, l'étape c) peut être réalisée sur une durée allant de 30 à 300 minutes, préférentiellement de 100 à 200 minutes, et mieux de 150 à 190 minutes. Avantageusement, les conditions de réticulation sont ajustées pour obtenir un rendement maximal de réticulation, c'est-à-dire l'obtention d'un taux de réticulation effectif maximum pour un minimum d'agent réticulant utilisé. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les étapes b) et c) de réticulation sont réalisées en milieu basique, le réceptacle contenant le mélange obtenu à l'issue de l'étape a) étant maintenu pendant une heure à température ambiante puis placé dans un bain thermostaté porté à une température de l'ordre de 50 à 55 °C, pendant une durée au moins égale à 1 heure, et de préférence comprise entre 1H30 et 3H30 heures. Comme exposé précédemment, l'arrêt de la réticulation (étape e)) peut intervenir antérieurement, conjointement ou postérieurement à l'étape de récupération du gel d). Une telle étape, selon un procédé conforme à l'invention, requiert d'exposer le gel réticulé ou en cours de réticulation, voire le réceptacle le contenant, à des conditions propices à l'arrêt de celle-ci, ou encore à des conditions capables de stopper la formation de liaisons entre les différentes chaines de polysaccharides. Selon une variante de réalisation préférée, l'étape e) est réalisée antérieurement à l'étape d). Par exemple, au regard des conditions thermiques qui auront été appliquées pour stimuler le processus de réticulation, l'arrêt de la réticulation peut être réalisé : - par simple retrait du réceptacle du bain thermostaté, puis par refroidissement jusqu'à un retour à température ambiante; - en plaçant le réceptacle dans un bain d'eau froide, de préférence à une température inférieure à la température ambiante, jusqu'à ce que la température à l'intérieur dudit réceptacle soit proche de la température ambiante ; voire - en extrayant le gel dudit réceptacle. Dans le cas d'une réticulation par rayonnement, celle-ci est stoppée via l'arrêt 10 de l'exposition dudit gel aux rayonnements. Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de l'invention peut en outre comprendre au moins une étape consistant à faire circuler le mélange obtenu à l'issu de l'étape a), voire obtenu à l'issue de l'étape b), à travers au moins un dispositif apte à 15 retenir toute particule de diamètre supérieur à 100 microns. Cette étape spécifique, également appelée dans la suite de la description « étape d'extrusion» intervient par conséquent postérieurement à l'étape a) et antérieurement à l'étape b) et/ou postérieurement à l'étape b) et antérieurement à l'étape c). Comme il ressort des exemples ci-après, l'effet avantageux lié à cette étape 20 d'extrusion se traduit par l'obtention d'un gel réticulé manifestant des propriétés viscoélastiques encore améliorées. Le choix du type et du dispositif d'extrusion relève des connaissances générales de l'homme du métier. Avantageusement, l'étape d'extrusion est réalisée par mise en oeuvre d'au 25 moins un dispositif comprenant au moins un filtre. L'homme du métier saura définir les caractéristiques adaptées en termes de porosité, géométrie, résistance et capacité de rétention d'un tel filtre de manière à ce que ce dernier permette le passage du mélange obtenu à l'issue de l'étape à), voire à l'issue de l'étape b), tout en retenant des particules de diamètre supérieur à 100 microns. 30 Dans la suite de la présente description, le dispositif comprenant au moins un filtre mis en oeuvre pour la réalisation de l'étape d'extrusion pourra être également désigné par l'expression « dispositif d'extrusion ». Avantageusement, l'étape d'extrusion est réalisée au moyen d'au moins un dispositif comprenant au moins un filtre de porosité allant de 2 à 100 microns, de préférence de 5 à 50 microns, mieux de 8 à 30 microns, et plus particulièrement de porosité de 10 microns. Avantageusement, la vitesse linéaire d'extrusion du mélange obtenu à l'issu de l'étape a) et/ou b) à travers le(s) dispositif(s) d'extrusion est lente, de manière à ne pas dégrader les chaines de polysaccharide lors de leur passage. Ainsi, la vitesse linéaire d'extrusion du(es)dit(s) mélange(s) obtenu(s) à l'issue de l'étape a et/ou b) à travers le(s) dispositif(s) d'extrusion est comprise entre 1 et 100 cm/min, de préférence entre 1 et 4 cm/min. Selon encore un autre mode de réalisation particulier, un procédé de l'invention peut être réalisé au moins en partie au sein d'un réceptacle spécifique à paroi déformable, tel que par exemple une poche. En effet, les propriétés de déformabilité d'un tel réceptacle et son caractère hermétique permettent de réaliser les différentes étapes d'un procédé de l'invention, et notamment les étapes d'homogénéisation et de réticulation, dans des conditions optimales qui conduisent à l'obtention d'un gel réticulé encore amélioré, c'est-à-dire présentant des propriétés d'injectabilité supérieures à celles manifestées par un gel obtenu selon un procédé mettant en oeuvre un réceptacle conventionnel type pot ou cuve. Le gel réticulé obtenu à l'issu du procédé de l'invention tel que décrit précédemment n'est généralement pas directement injectable, au regard notamment de sa trop forte concentration en polysaccharide et/ou de la présence éventuelle de résidus d'agent réticulant, ou encore de ses conditions physiologiques et/ou de pH incompatible avec une utilisation dans les domaines d'applications considérés ci-dessus. En outre, le gel obtenu à l'issue du procédé de l'invention peut notamment présenter une rigidité trop élevée pour être injecté en l'état chez un patient. Par conséquent, plusieurs étapes additionnelles, connues de l'homme du 30 métier, sont susceptibles d'être mis en oeuvre pour l'obtention d'un hydrogel injectable. Plus particulièrement, une étape de neutralisation et d'expansion de ce gel est requise pour lui conférer ses qualités d'implant. Les chaines du réseau de polysaccharide sont alors étirées, hydratées, tandis que le pH est ramené à celui du derme. Une étape de protection et de redensification du gel est également susceptible d'être réalisée afin d'améliorer encore les qualités de l'implant, selon le savoir-faire de l'homme de l'art. Le gel doit être formulé physiologiquement grâce à la présence de sels en quantités équivalentes à celles du milieu injecté. Pour une pureté encore améliorée, une étape de purification complémentaire peut être, en outre, réalisée. Au final, l'hydrogel ainsi obtenu peut être rempli en seringues dans des conditions d'atmosphère contrôlées, lesdites seringues pouvant ensuite subir une étape de stérilisation, de préférence par voie thermique. II) Polysaccharide Par « polysaccharide », on entend tout polymère constitué de plusieurs oses liés entre eux par des liaisons 0-osidiques et ayant pour formule générale : -[Cx(H2O)y)]n-. Un polysaccharide conforme à l'invention est plus particulièrement sélectionné au regard des propriétés que l'on souhaite voir manifester par le gel réticulé obtenu selon l'invention. Plus particulièrement, un tel polysaccharide doit présenter une bonne biocompatibilité. Ainsi, un polysaccharide ou sel de polysaccharide physiologiquement acceptable peut être d'origine naturelle ou synthétique. Les polysaccharides convenant à l'invention peuvent notamment être choisis parmi le sulfate de chondroïtine, le kératane, le sulfate de kératane, l'héparine, le sulfate d'héparine, le xanthane, la carraghénine, l'acide hyaluronique, le chitosane, la cellulose et ses dérivés, l'alginate, l'amidon, le dextrane, le pullulane, le galactomannane et leurs sels biologiquement acceptables. Les sels de polysaccharides conformes à l'invention sont plus particulièrement choisis parmi les sels physiologiquement acceptables, tels que le sel de sodium, le sel de 30 potassium, le sel de zinc, le sel d'argent et leur mélange, de préférence le sel de sodium. De préférence, un polysaccharide ou sel de polysaccharide selon l'invention présente un haut poids moléculaire, de préférence un poids moléculaire supérieur ou égal à 100 000 Da, voire même supérieur à 3 MDa selon l'application considérée. Un polysaccharide particulièrement préféré est l'acide hyaluronique ou l'un de 5 ses sels, de préférence le hyaluronate de sodium (NaHA). Comme précité, le mélange de l'étape a) du procédé selon l'invention résulte de l'association d'au moins un gel aqueux de polysaccharide sous une forme non réticulée, ou un de ses sels, avec au moins un agent réticulant époxydique. 10 Or, ledit gel aqueux de polysaccharide peut lui-même résulter d'une mise en contact préalable entre ledit polysaccharide, ou un de ses sels, avec un milieu aqueux. Par « milieu aqueux », au sens de la présente invention, on entend tout milieu liquide contenant de l'eau et qui a la propriété de dissoudre un polysaccharide ou un de ses sels. 15 La nature du milieu aqueux est plus particulièrement conditionnée au regard du type de réticulation envisagée mais également du type de polymère utilisé. A ce titre, un milieu aqueux susceptible de convenir peut être soit acide, soit basique. Un milieu aqueux particulièrement préféré est un milieu alcalin, de préférence 20 l'hydroxyde de sodium (NaOH), plus particulièrement une solution d'hydroxyde de sodium à pH supérieur à 12. III) Agent réticulant énoxvdique Par « agent réticulant », on entend tout composé capable d'induire une 25 réticulation entre les différentes chaines de polysaccharide. Le choix de cet agent réticulant au regard du polysaccharide à réticuler relève clairement des compétences de l'homme de l'art. Un agent réticulant conforme à l'invention est choisi parmi les agents réticulants époxydiques bi- ou multi-fonctionnel, tels que le butanediol diglycidyl éther 30 (BDDE), le diépoxy-octane ou le 1,2-bis-(2,3-époxypropyl)-2,3-éthylène, et leurs mélanges. De préférence, un agent réticulant conforme à l'invention est le butanediol diglycidyl éther. L'ajustement de la quantité en agent réticulant pour la réalisation de la réaction de réticulation relève également des compétences de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l'invention met en oeuvre du hyaluronate de sodium en un milieu alcalin avec le butanediol diglycidyl éther à titre d'agent réticulant. Dans toute la description, y compris les revendications, l'expression « comportant 10 un » doit être comprise comme étant synonyme de « comportant au moins un », sauf si le contraire est spécifié. Les expressions « compris entre... et ... » et « allant de ... à ... » doivent se comprendre bornes incluses, sauf si le contraire est spécifié. Les exemples et figures qui suivent sont présentés à titre illustratif et non 15 limitatif de l'invention. FIGURES : - Figure 1 : illustre les propriétés viscoélastiques de gels d'acide hyaluronique via la mesure de leur module élastique G' (en Pa). 20 - Figure 2 : illustre l'évolution des modules élastiques G' (Pa) d'hydrogels obtenus à la suite d'une étape de réticulation caractérisée par une première étape de maintien, pendant deux heures, d'un mélange entre un gel aqueux d'acide hyaluronique 12 % avec du BDDE à température ambiante suivi d'une seconde étape d'incubation dudit mélange à 52 °C sur des durées différentes. 25 - Figure 3 : illustre l'évolution des modules élastiques G' (Pa) d'hydrogels obtenus à la suite d'une étape de réticulation caractérisée par une unique étape d'incubation d'un mélange entre un gel aqueux d'acide hyaluronique 12 % avec du BDDE à 52 °C sur des durées différentes. EXEMPLES : Exemple 1 Pour chacun des gels réticulés décrits ci-après, 10 g d'acide hyaluronique (1.5MDa), 73 g de soude 1 % et 1,2 g de butanediol diglycidyl éther (BDDE) sont mis en oeuvre. Les conditions particulières appliquées pour chaque gel sont les suivantes : Produit A (témoin) Le protocole de préparation est comme suit : 1. Homogénéisation à température ambiante du mélange « acide hyaluronique + soude 1 %» pendant 1H30 environ pour l'obtention d'une solution visqueuse parfaitement homogène ; 2. Ajout de l'agent réticulant (BDDE) et nouvelle homogénéisation à température ambiante pendant 20 min environ ; 3. Incubation 3 heures à 52 °C de la solution visqueuse acide hyaluronique/soude 1 %/BDDE; et 4. Neutralisation, gonflement et homogénéisation du solide obtenu (solution d'acide hyaluronique réticulé) dans une solution de Tampon Phosphate acidifiée, de façon à obtenir un hydrogel à 20 mg/g en acide hyaluronique à un pH proche de la neutralité. Produit B (conforme à l'invention) Il s'agit du même protocole que celui décrit pour le produit A mais réalisé avec une étape intermédiaire, entre les étapes 2 et 3, durant laquelle le mélange obtenu a l'issue de l'étape 2 est maintenu à température ambiante pendant 2 heures. Cette étape intermédiaire pourra également être désignée, dans la suite de la présente description, par l'expression « étape de repos ». Le temps total de contact « Acide hyaluronique/BDDE » avant incubation à 52 °C est donc de 2H2O environ. Produit C (conforme à l'invention) Il s'agit du même protocole que celui décrit pour le produit A mais réalisé, après l'étape 2 d'ajout du BDDE et 15 min d'homogénéisation, avec une étape d'extrusion suivie de l'étape intermédiaire de 2 heures à température ambiante appliquée au produit B, puis l'étape 3 d'incubation à 52 °C pendant 3 heures. Cette étape d'extrusion est réalisée au moyen d'un tamis circulaire de type grille d'extrusion, présentant un maillage de 10 microns. Le temps total de contact « Acide hyaluronique/BDDE » avant incubation à 52 °C est également de 2H2O environ. L'ensemble des produits A, B et C est conditionné en seringues. Les mesures des propriétés viscoélastiques de ces trois produits sont réalisées à l'aide d'un rhéomètre (Haake RS6000) équipé d'une géométrie cône/plan (1°/diamètre 35mm). Un balayage en contrainte est effectué, le module élastique G'(en Pa) et l'angle de déphasage ô (°) sont mesurés pour une contrainte de 5 Pa. Résultats La figure 1 ci-après représente les valeurs des modules élastiques G' (en Pa) mesurées. A titre indicatif, la valeur de l'angle de déphasage ô (°) est indiquée en haut de chaque colonne, à droite de la valeur de G'. Le déphasage mesuré est minime ce qui traduit un caractère principalement élastique de ces gels. Au regard des résultats de la figure 1, et notamment du produit B, on constate un effet significatif sur l'augmentation de G' lorsque la réaction de réticulation est réalisée via un procédé de l'invention, c'est-à-dire la mise en oeuvre de deux cinétiques différentes consécutives pour la réalisation de la réaction de réticulation. Cet effet est encore amélioré en présence de l'étape d'extrusion réalisée par la mise en oeuvre d'un dispositif comprenant un filtre de porosité 10 microns. Exemple 2 : Evaluation, à différentes étapes, de la quantité en agent réticulant dans un gel d'acide hyaluronique soumis à un procédé conforme à l'invention. Plusieurs hydrogels réticulés sont préparés en parallèle selon un procédé de l'invention via la mise en oeuvre d'un réceptacle spécifique, à savoir une poche déformable telle que définie précédemment. Une solution d'acide hyaluronique 12 % dans du NaOH 1 % est ainsi préparée. Après hydratation de l'acide hyaluronique, une solution de BDDE diluée au 1/5 dans du NaOH 1 % est ajoutée. La quantité totale de BDDE utilisée correspond ainsi à une teneur théorique 5 équivalente à 1,8 mg/g dans un hydrogel à 20 mg/g en acide hyaluronique. Plusieurs fractions A, B et C sont ensuite préparées à partir du mélange obtenu ci-dessus. La fraction A correspond à un gel d'acide hyaluronique maintenu pendant 1 heure, préalablement à l'étape d'incubation décrite ci-après, à température ambiante 10 (TA). La fraction B à un gel d'acide hyaluronique maintenu pendant 2 heures, préalablement à l'étape d'incubation décrite ci-après, à température ambiante. Enfin, la fraction C à un gel d'acide hyaluronique maintenu pendant 1 heure, préalablement à l'étape d'incubation décrite ci-après, à température ambiante, cette étape 15 de repos étant en outre associée à une étape d'extrusion au travers d'un tamis de maillage del0µm. Après les différents traitements décrits ci-dessus, les fractions A, B et C sont incubées pendant 3 heures à 52 °C. Les solides respectivement obtenus à l'issue de cette étape d'incubation 20 (solutions d'acide hyaluronique réticulé) sont alors neutralisés, mis à gonfler et homogénéisés dans une solution de Tampon Phosphate pH 7,3 de façon à obtenir un hydrogel à 20 mg/g en acide hyaluronique. Afin de suivre la quantité consommée de l'agent réticulant à différentes étapes 25 du procédé de l'invention, un dosage du BDDE est effectué à différentes étapes. Ainsi, les prélèvements Tl et T2 correspondent à des prélèvements de gel effectués après respectivement le maintien, préalablement à l'étape d'incubation pendant 3 heures à 52 °C, des mélanges d'acide hyaluronique et de BDDE à température ambiante pendant 1 et 2 heures. 30 Les prélèvements Tl et T2 subissent ensuite les mêmes étapes de neutralisation, gonflement et homogénéisation que celles décrites ci-dessus pour les fractions A, B et C, de façon à obtenir des hydrogels à 20mg/g en acide hyaluronique. Les prélèvements A, B et C correspondent à des prélèvements de gel effectués sur les fractions correspondantes après incubation 3 heures à 52 °C et transformation en hydrogel à 20 mg/g. Résultats Le tableau 1 ci-dessous présente les quantités en agent réticulant mesurées ainsi que les valeurs des modules élastiques (G' en Pa) des hydrogels obtenus. A titre indicatif, les valeurs de la viscosité complexe M I* et de l'angle de déphasage 8 sont également mentionnées. Tableau 1 Prélèvements : BDDE (mg/g) G' (Pa) (Pa,$) 8 (0) T1 1,53 NR* (solutions majoritairement visqueuses et faiblement élastiques du fait de l'absence de réticulation, 8> 45 » T2 1 43 Fraction A 0,20 136 22 5 (maintien à TA pendant 1 H) Fraction B 0,17 174 28 5 maintien à TA pendant 2 H) Fraction C 0,20 159 25 5 (maintien à TA pendant 1 H, avec en outre une étape d'extrusion à travers un filtre de 10 µm) * :Non Réalisé. (Il est à noter que les teneurs résiduelles de BDDE mesurées correspondent à 15 des gels non stérilisés et non purifiés.) Les teneurs mesurées en agent réticulant (BDDE) dans les prélèvements T 1 et T2 sont du même ordre de grandeur. La faible diminution de la teneur en BDDE observée par rapport à la teneur théorique indiquée précédemment s'explique par une cinétique lente de la réaction de réticulation, le cas échéant, associée à une dégradation du BDDE du fait 20 de l'instabilité des fonctions époxydes. En revanche, la diminution de la teneur en BDDE est largement accentuée après l'étape d'incubation à 52 °C pendant 3 heures, cette consommation importante du BDDE correspondant ainsi à une cinétique rapide de la réaction de réticulation. 10 Par rapport aux propriétés mécaniques des gels obtenus (fractions A, B et C), il est intéressant de constater que (i) le déphasage mesuré est minime ce qui traduit un caractère principalement élastique de ces gels, (ii) le module élastique G' le plus élevé est obtenu pour le gel issu de la fraction B, c'est-à-dire avec une étape de maintien à température ambiante de 2 heures avant incubation à 52 °C et (iii) la fraction C extrudée avant réticulation, voit son module élastique G' augmenter significativement en comparaison du même hydrogel non extrudé (Fraction A). Les points (ii) et (iii) ci-dessus corroborent ainsi les effets avantageux alloués à la mise en oeuvre de deux cinétiques différentes consécutives pour la réalisation de la réaction de réticulation, mais également à l'étape d'extrusion, dans le cadre d'un procédé de réticulation d'un gel réticulé conforme à l'invention. Exemple 3 : Un mélange du gel aqueux de polysaccharide et de l'agent réticulant identique 15 à celui décrit en exemple 2 ci-dessus est préparé. Deux essais sont alors mis en oeuvre : - Dans le premier cas, plusieurs fractions A, B, C et D sont préparées à partir du mélange ci-dessus. La réaction de réticulation est réalisée en laissant lesdites fractions pendant 2h00 à température ambiante avant de les placer à 52 °C pour des durées 20 différentes. - Dans le deuxième cas, plusieurs fractions A', B', C' et D' sont également préparées. A la différence des fractions A, B, C et D, elles sont directement incubées à 52 °C pour des durées différentes. Les temps d'incubation à 52 °C pour les différentes fractions considérées sont 25 les suivants : ^ Fractions A et A' : 2h40 ^ Fractions B et B' : 2h50 ^ Fraction C et C' : 3h00 ^ Fraction D et D' : 3h10 30 Les gels d'acide hyaluronique réticulés obtenus à l'issue des étapes d'incubation sont ensuite neutralisés, mis à gonfler et homogénéisés dans une solution de Tampon Phosphate pH 7,3 (TP), de façon à obtenir des hydrogels à 20 mg/g en acide hyaluronique. Les caractérisations et analyses qui suivent sont effectuées à partir des hydrogels ainsi obtenus. Résultats Le tableau 2 ci-dessous présente les valeurs des modules élastiques G' (en Pa) des hydrogels obtenus. A titre indicatif, les valeurs de la viscosité complexe M I* et de l'angle de déphasage 8 sont également mentionnées. Tableau 2 i=5Pa G' (Pa) hg * (Pa.$) U (°) 174.5 27.9 5.1 186.9 29.9 5.7 174.0 27.8 5.5 152.2 24.3 4.8 A' 119.2 19.1 7.1 B' 126.5 20.3 6.4 C' 125.8 20.1 6.3 D' 122.7 19.6 5.7 Les figures 2 et 3 ci-après illustrent les résultats figurant dans le tableau 2 ci-dessus. 15 L'optimum d'efficacité de l'étape d'incubation à 52 °C sur la réticulation se situe donc à environ 3 heures avec ou sans étape préalable de maintien à température ambiante du mélange entre le gel aqueux de polysaccharide et l'agent réticulant. Les hydrogels obtenus par un procédé mettant en oeuvre une étape de maintien à température ambiante pendant 2 heures, préalablement à l'étape d'incubation à 52 °C, 20 présentent des propriétés viscoélastiques significativement supérieures aux valeurs maximales observées pour les hydrogels obtenus par un protocole dénué de cette étape de maintien à température ambiante. Ces résultats démontrent que l'effet bénéfique lié à la présence, pour la réalisation de la réaction de réticulation, d'une étape de maintien, à température ambiante, 25 et sur un temps prolongé, d'un mélange entre un gel aqueux de polysaccharide et un agent 10 A B C D réticulant ne peut pas simplement être reproduit par un allongement du temps de la réticulation à 52 °C. En effet, l'optimum de G' mesuré pour les hydrogels obtenus selon un procédé de réticulation de l'invention n'est jamais atteint par les hydrogels obtenus selon un procédé de réticulation classique, et ce quelque soit la durée de l'étape d'incubation à 52 °C. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un gel réticulé d'au moins un polysaccharide ou un de ses sels, comprenant au moins les étapes consistant à : a) disposer, à une température inférieure à 35 °C, d'un gel aqueux comprenant au moins un polysaccharide sous une forme non réticulée associé à au moins un agent réticulant époxydique bi- ou multifonctionnel, b) maintenir au moins une heure le mélange de l'étape a) à une 10 température inférieure à 35 °C ; c) stimuler la cinétique de la réaction de réticulation du mélange obtenu à l'issu de l'étape b) et, le cas échéant ; d) récupérer ledit gel réticulé formé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le 15 polysaccharide est l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les étapes a) et b) sont réalisées à une température allant de 15 à 25 °C, et mieux à température ambiante. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée sur une durée supérieure à 1 heure, de préférence 20 supérieure à 2 heures. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le mélange obtenu à l'issue de l'étape a) est obtenu par mise en présence, au sein d'un réceptacle approprié : (i) d'un milieu aqueux ; 25 (ii) d'au moins un polysaccharide, ou un de ses sels, sous une forme non réticulée ; (iii) au moins un agent réticulant époxydique bi- ou multi-fonctionnel ; et homogénéisation du mélange ainsi obtenu, l'ordre d'ajout dans le réceptacle desdits composés (i), (ii) et (iii) étant indifférent. 30 6. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'étape d'homogénéisation se déroule sur une durée inférieure à 200 minutes, de préférence inférieure à 150 minutes, voire comprise entre 15 et 100 minutes. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape c) est réalisée par voie thermique, à une température comprise entre 35 et 60 °C, de préférence entre 45 et 55 °C, et mieux entre 48 et 52 °C. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'étape c) est réalisée sur une durée allant de 30 à 300 min, préférentiellement de 100 à 200 min, et mieux de 150 à 190 min. 9. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent réticulant est le butanediol diglycidyl éther (BDDE). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre du hyaluronate de sodium en un milieu alcalin, et le butanediol diglycidyl éther (BDDE), à titre d'agent réticulant. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gel réticulé est un gel monophasique viscoélastique majoritairement élastique. 12. Utilisation d'un gel réticulé obtenu par mise en oeuvre d'un procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour le comblement durable des défauts de volume de la peau, et notamment le comblement des rides.