Brevet FR2970568A1 — publié le 20120720

La présente invention a pour objet un nouveau complexe comprenant au moins un ligand immobilisé sur un adhésif enduit sur l'une des faces du support. L'utilisation de ligands immobilisés sur un support est courante, notamment dans le domaine des tests diagnostiques ou dans le domaine des biotechnologies. Ces systèmes permettent l'utilisation d'un grand nombre de molécules, comme dans le cas des puces utilisées pour l'analyse ADN ou ARN. L'immobilisation de ligands sur un support a été largement décrite (Sambrook et al. 1989). Les méthodes d'immobilisation peuvent s'avérer difficiles, coûteuses, longues et partiellement efficaces. Elles reposent sur l'adsorption, les liaisons ioniques ou covalentes ou encore le piégeage des ligands dans une matrice de type gel ou polymère. Des méthodes ont été développées, ainsi la demande de brevet WO 2005/114417 décrit l'utilisation d'une couche de protéines globulaires appliquées sur un support adhésif, un agent réticulant étant ensuite appliqué sur la couche de protéines globulaires, les catalyseurs protéiques étant immobilisés en surface par réaction avec l'agent de réticulation. Le document WO 03/072752 décrit des puces de protéines réalisées sur un substrat rigide sur lequel se trouve une couche hydrophobe et polymérique de polyvinylidene difluoride (PVDF) permettant l'immobilisation des protéines à l'état sec, une haute densité de spots et ayant un ratio signal sur bruit élevé. La présente invention permet de palier les inconvénients décrits ci- dessus grâce à l'utilisation d'un complexe comprenant un support disposant d'au moins deux faces dont l'une est pourvue d'une enduction d'un adhésif et d'au moins un ligand immobilisé sur ladite surface adhésive. Dans le cadre de la présente invention, le ligand déposé sur la surface adhésive peut être de nature protéique : protéine, oligopeptide, polypeptide, anticorps, de nature nucléique : ADN, ARN, oligonucléotide (Le. primer), il peut s'agit également de sucres (ol igosaccharides ou polysaccharides) ou encore de petites molécules, éventuellement de synthèse comme des toxines, des pesticides, des hormones, des herbicides, des fongicides, ou des neurotransmetteurs. Ainsi lorsque le ligand est de type protéique, aucun prétraitement de la surface adhésive n'est nécessaire. Le support utilisé peut être constitué par une plaque de verre, de plastique, un film de polyester ou tout autre matériau pouvant être enduit d'un adhésif. Dans une mise en oeuvre particulière de l'invention, le support est 5 pourvu d'une enduction d'un adhésif sur deux de ses faces (Figure 1). L'adhésif est un polymère adhésif commun pouvant présenter une surface activée. On citera à titre d'exemple les adhésifs non réactifs comme les copolymères styrène-butadiene, les gommes nitriles, le poly(vinyl acétate) et 10 ses polymères, les polyvinyl acetals, les adhésifs sensibles à la pression comme les polyacrylates, les gommes silicone, les poly(vinyl ether) ou encore les adhésifs réactifs comme adhésifs polyurethane à deux composants, les adhésifs epoxy, les acryliques anaérobies, ou encore les cyanoacrylates. Par exemple, les matériaux suivant ont été utilisés : 15 - 3M 7966WDL (adhésif 3MTM 200MP), - 5 Stars Double Sided Display Tape Polypropylene. Les ligands sont choisis afin d'interagir spécifiquement avec des anti ligands définis. Suivant la nature du substrat et la stratégie d'immobilisation 20 (par affinité, covalente...), les ligands peuvent être fonctionnalisés afin d'obtenir une meilleure immobilisation. Différents ligands peuvent être matricés simultanément sur un même support et la conception de la matrice peut de plus inclure plusieurs réplicas d'une même sonde (Figure 1). 25 Pour les ligands protéiques, aucun prétraitement de la surface de l'adhésif n'est nécessaire, et les ligands peuvent être déposés (étape de spotting) directement sur la surface. Pour les ligands oligonucléotidiques, une étape de prétraitement de 30 surface à l'aide d'un agent de réticulation multifonctionnel (le glutaraldéhyde de préférence) peut être mise en oeuvre afin d'améliorer l'activité des ligands immobilisés. Ainsi selon un autre aspect, l'invention a pour objet un complexe comprenant un support dont l'une des faces est pourvue d'une enduction d'un 35 adhésif, ladite surface adhésive étant fonctionnalisée, par exemple par l'action d'un agent de réticulation. Dans une mise en oeuvre particulière, le ligand est également fonctionnalisé. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des complexes décrits ci-dessus. Dans une mise en oeuvre particulière de l'invention, les ligands sont dilués dans un tampon, par exemple, un tampon salin (sélectionné suivant la nature des biomolécules utilisées en tant que ligands) et déposés à la surface du support enduit en utilisant par exemple un spotter piezoélectrique de type non-contact ou par immersion du support enduit dans une solution comprenant les ligands. Lorsque les ligands en solution sont déposés sous la forme de gouttes, la taille des gouttes déposées et par conséquent la taille des spots formés sur la surface (50-1000 pm), la densité des spots (1-25 par mm2) et le format de la matrice peuvent être modifiés en fonction du champ d'application recherché et de la nature des biomolécules. Une étape de fonctionnalisation du support peut être mise en oeuvre avant le dépôt des ligands, comme par exemple le traitement de la surface adhésive par un agent de réticulation comme le glutaraldéhyde. Selon le champ d'application considéré, une étape de post- traitement peut être mise en oeuvre après les étapes de dépôt du ligand et éventuellement de séchage à température ambiante. Cette étape de post traitement peut consister à chauffer (par exemple à 163°C pendant une minute), laver (tampons salins...) et/ou saturer (pour diminuer le bruit de fond) le complexe. Les complexes selon l'invention peuvent être utilisés pour la préparation de dispositifs notamment d'analyse. De tels dispositifs comprennent un support substantiellement rigide comprenant au moins un puits délimitant une cavité interne comprenant au moins deux ouvertures, l'une d'entre elles au moins étant scellée par le complexe selon l'invention. De tels dispositifs peuvent prendre la forme de plaques de 12, 24 ou 96 puits ou encore de réseaux microfluidiques couramment utilisés dans le 35 domaine des tests diagnostiques ou dans le domaine des biotechnologies. Le procédé de préparation de tels dispositifs consiste à sceller le complexe selon l'invention au support de façon à fermer au moins une desdites ouvertures de la cavité, la surface adhésive comportant les ligands étant orientée vers l'intérieur de la cavité. La surface adhésive modifiée avec les ligands peut être facilement assemblée avec des matériaux de types variés dans le but de générer des outils analytiques prêts à l'usage (Figures 2 et 3). Par exemple, le support adhésif peut être assemblé avec une plaque 96-puits sans fond afin de générer une plaque à fond solide 10 classiquement utilisée à des fins analytiques. Le support adhésif peut également être interfacé avec divers réseaux microfluidiques, composés de canaux, cellules de flux ou mixeurs. La partie microfluidique assemblée peut être constituée de n'importe quel matériau disponible pour ce genre d'application (verre, silicium, plastiques, et 15 autres matériaux polymériques). La présente invention a encore pour objet, un procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand comprenant la mise en oeuvre d'un dispositif ou d'un complexe tels que décrits ci-dessus. Ledit complexe ou 20 dispositif est mis en contact avec un échantillon susceptible de contenir un anti ligand dans des conditions permettant l'interaction entre le ligand et l'anti ligand, optionnellement une molécule de détection marquée est ajoutée et enfin les signaux générés par l'interaction entre le ligand et l'anti ligand sont détectés et/ou quantifiés. 25 Dans un tel procédé l'anti ligand qui peut provenir d'un échantillon biologique tel du sérum, du sang, ou du plasma, un échantillon environnemental comme un prélèvement d'eau, de gaz, d'air, de sol ou un échantillon provenant de l'industrie agroalimentaire comme de la nourriture. 30 En supplément de l'étape critique que constitue l'interaction ligand/anti ligand, une ou plusieurs étapes peuvent être ajoutées selon les impératifs inhérents aux stratégies de marquage et de détection de l'interaction (Figure 4). Dans ce cas, e.g. si une étape supplémentaire de marquage est 35 requise (e.g. interaction entre le groupement biotine d'une cible et une molécule de streptavidine), deux stratégies peuvent être utilisées : - un protocole en deux étapes : 1) Incubation de la solution d'anti ligand (interaction ligand/anti ligand). 2) Incubation d'une solution de molécules marquées (e.g. conjugué streptavidine). - un protocole une étape : 1) Incubation d'une solution unique pré-mélangée contenant à la fois les anti ligands et les molécules marquées. En fonction de l'application et des exigences, différentes méthodes de détection peuvent être mises en oeuvre, par exemple : - La colorimétrie en utilisant un marqueur comme par exemple : - Système indicateur avec Phosphatase alcaline / BCIP ; - Système indicateur avec Peroxydase du raifort - ABTS ; - Particules d'or... - La chimiluminescence en utilisant un marqueur comme suit : - Peroxydase du raifort - système avec substrat chimiluminescent. - Phosphatase alcaline - système avec substrat chimiluminescent. La radiographie ou la détection et/ou quantification de radioactivité peuvent également être utilisés. Description des fiqures Fiqure 1 : représentation schématique du complexe selon l'invention, présentant (A) le support (S) dont une surface est enduite d'adhésif (ad) sur lequel sont immobilisés des ligands (L) ; (B) le support (S) dont deux faces sont enduites d'adhésif (ad) les ligands (L) étant immobilisés sur l'une des deux faces. Fiqure 2 : représentation schématique de l'assemblage de dispositifs selon l'invention (A) : un réseau microfluidique, (B) une plaque 96-puits. Fiqure 3 : représentation schématique de l'assemblage d'un réseau microfluidique selon l'invention. Fiqure 4 : représentation schématique du procédé de détection d'un anti ligand dans un échantillon. Fiqure 5 : Courbe présentant la corrélation entre l'intensité du signal détecté et la concentration en oligonucléotide (anti ligand) dans l'échantillon. Fiqure 6 : Courbe présentant la corrélation entre l'intensité du signal détecté et la concentration en CRP (anti ligand) dans l'échantillon. Fiqure 7 : Courbe présentant la corrélation entre l'intensité du signal détecté et la concentration en CRP (anti ligand) dans l'échantillon. Exemples Exemple 1. Matrice d'oligonucléotides sur plaques adhésives de microtitration (pour la détection quantitative d'anti ligand) En utilisant un couple d'oligonucléotides synthétiques de séquences complémentaires en tant que ligand et anti ligand, il a été montré que la présente invention peut être appliquée à l'analyse et à la détection quantitative de séquences d'oligonucléotides. Les ligands ont été spottés sur la surface du support adhésif et hybridés avec un oligonucléotide de séquence complémentaire (anti ligand). Un système révélateur de type biotine - streptavidine Phosphatase Alcaline a été utilisé pour la révélation colorimétrique du signal. Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration en anti ligand a été démontrée (Figure 5). - Spotting des sondes Prétraitement Un support 3M 7966WDL a été pré-traité à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde 10/0 dans un tampon phosphate 0,1 M pH 5 pendant 1 heure à 37°C. Les supports ont alors été lavés avec de l'eau distillée afin d'être prêts à l'emploi pour l'immobilisation des sondes. Spotting Les ligands (oligonucléotides synthétiques (SEQ ID No. 1, modification amino en 5') ont été dilués dans du tampon acétate salin (acétate 0,1 M, KCI 0,1 M, bleu de bromophénol 0,25mg/mL pH=5,5) afin d'atteindre une concentration finale de 50 pmol.L-1. Cette solution a été spottée à la surface d'un adhésif 3M 7966WDL à l'aide d'un spotter piézoélectrique (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). Le substrat a été séché à l'air libre et à température ambiante. Les spots produits ont un diamètre d'environ 100 pm et la densité de spots varie de 1 à 25 spots par mm2. Post-traitement Après le matriçage des ligands et le séchage du support à température ambiante, le post-traitement a été effectué comme suit : les supports sont chauffés à 163°C durant 1 minute, puis lavés par addition de tampon PBS et ensuite incubés à 37°C pendant 15 minutes avec du tampon PBSTA (phosphate 0,1 M, NaCl 0,5M, pH=7,4, Tween20 0,1\% v/v, BSA 1\0/0 w/v) afin de saturer la surface. - Assemblage Les adhésifs spottés sont ensuite assemblés avec une plaque 96-puits sans fond afin de générer une plaque à fond solide d'utilisation classique. Les propriétés adhésives du support sont ici essentielles afin de permettre un assemblage facile réalisé en exerçant une faible pression sur les deux parties apposées l'une contre l'autre (Figure 2). - Essai Des solutions d'anti ligands (SEQ ID No. 2) à différentes concentrations mélangées avec le conjugué Phosphatase Alcaline - 30 Streptavidine (1 pg.mL-1) ont été préparées dans un tampon PBSTA. 200pI de la solution résultante ont été déposés dans chaque puits, puis l'ensemble a été incubé sur la surface spottée pendant 30 minutes à 37°C. Les supports adhésifs ont alors été lavés à température ambiante avec 1 mL de solution PBS. 35 - Révélation 25 100 pL d'une solution de BCIP/NBT (4-bromo-5-chloroindolyl phosphate/ nitro-blue tetrazolium) ont été ajoutés dans les puits de la plaque et incubés à 37°C afin de révéler le signal (environ 30 minutes). Les puits ont ensuite été lavés avec 1 mL de PBS. Une fois les fonds de puits secs, l'acquisition d'une image a été effectuée à l'aide d'un scanner horizontal de bureau (HP). Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration d'anti ligand a été démontré (Figure 5). Exemple 2. Matrice de protéines sur plaque adhésive pour immunoessai de type sandwich appliqué au diagnostic point-of-care Dans le cas où les supports adhésifs sont fonctionnalisés avec des microarrays de protéines (ligands), la présente invention permet la mise en oeuvre de tests sérologiques quantitatifs, pouvant être utilisés pour des applications de type diagnostic point-of-care. Afin d'évaluer la fiabilité d'un tel essai quantitatif, le système suivant fut utilisé : des anticorps anti-CRP ont été immobilisés sur le support dans le but de servir de sondes pour la détection de CRP en utilisant les anticorps biotinylés ciblés correspondants. Un système révélateur de type biotine - streptavidine Phosphatase Alcaline a été utilisé pour la révélation colorimétrique du signal. Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration en anticorps cible (anti ligand) a été démontrée (Figure 6). -Spotting des ligands Spotting Une solution d'anticorps anti-CRP à une concentration de 500 pg.mL-' dans un tampon acétate (acétate 0,1 M, KCI 0,1 M, bleu bromophenol 0,25 mg/mL pH=5,5) a été spottée sur la surface d'un adhésif de type 3M 7966WDL à l'aide d'un spotter piézoélectrique (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). Aucun prétraitement de la surface n'est requis. La surface a été séchée pendant 30 minutes à température ambiante. Les spots produits ont un diamètre de l'ordre de 100 pm de diamètre et la densité de spots peut varier de 1 à 25 par mm2. Post-traitement Suite au matriçage du microarray et au séchage à température ambiante, le post-traitement s'effectue comme suit : les supports sont chauffés à +163°C durant 1 minute, puis lavés par addition de tampon PBS et ensuite incubés à 37°C pendant 15 minutes avec du tampon PBSTA (phosphate 0,1 M, NaCl 0,5M, pH=7,4, Tween20 0,1\% v/v, BSA 1\0/0 w/v) afin de saturer la surface. - Assemblage Les adhésifs spottés sont ensuite assemblés avec une plaque 96-puits sans fond afin de générer une plaque à fond solide d'utilisation classique. Les propriétés adhésives du support sont ici essentielles afin de permettre un assemblage facile réalisé en exerçant une faible pression sur les deux parties apposées l'une contre l'autre (Figure 2). - Essai Des solutions mélangées de protéine cible (CRP), de conjugué biotine-anticorps (plusieurs concentrations) et de conjugué Phosphatase Alcaline- Streptavidine (1 pg.mL-1) ont été préparées dans du tampon PBSTA. 200 pL de la solution résultante ont été déposés dans chaque puits, puis l'ensemble a été incubé 30 minutes à 37°C. Les supports adhésifs ont ensuite été lavés à température ambiante avec 1 mL de solution PBS. - Révélation 100 pL d'une solution de BCIP/NBT (4-bromo-5-chloroindolyl phosphate/nitro-blue tetrazolium) ont été ajoutés dans les puits de la plaque et incubés à 37°C afin de révéler le signal (environ 30 minutes). Les puits ont ensuite été lavés avec 1 mL de PBS. Une fois les fonds de puits secs, l'acquisition d'une image a été effectuée à l'aide d'un scanner horizontal de bureau (HP). Des exemples 35 d'images résultantes sont présentés à la Figure 6. Exemple 3. Matrice de protéines sur support adhésif pour immunoessai de type sandwich appliqué au diagnostic point-of-care dans un système microfluidique assemblé -Spotting des ligands Spotting Une solution d'anticorps anti-CRP à une concentration de 500 pg.mL-' dans un tampon acétate (acétate 0,1 M, KCI 0,1 M, bleu bromophenol 0,25 mg/mL pH 5,5) a été spottée sur la surface d'un adhésif de type 3M 7966WDL à l'aide d'un spotter piézoélectrique (BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer). Aucun prétraitement de la surface n'est requis. La surface a été séchée pendant 30 minutes à température ambiante. Les spots produits ont un diamètre de l'ordre de 100 pm de diamètre et la densité de spots peut varier de 1 à 25 par mm2. Post-traitement Suite au matriçage du microarray et au séchage à température ambiante, le post-traitement s'effectue comme suit : les supports sont chauffés à +163°C durant 1 minute, puis lavés par addition de tampon PBS et ensuite incubés à 37°C pendant 15 minutes avec du tampon PBSTA (phosphate 0,1M, NaCl 0,5 M, pH 7,4, Tween20 0,1\% v/v, BSA 1\0/0 w/v) afin de saturer la surface. - Assemblage Le support adhésif de protéines matricées a été assemblé avec un système microfluidique préconçu constitué de micro-canaux en PVC/3M 7966WDL ou bien de micro-canaux de verre obtenus par etching. Les propriétés adhésives du support sont ici essentielles afin de permettre un assemblage facile réalisé en exerçant une faible pression sur les deux parties apposées l'une contre l'autre (Figure 3). - Essai35 Des solutions mélangées de protéine cible (CRP, anti ligand), de conjugué biotine-anticorps (plusieurs concentrations) et de conjugué streptavidine - Phosphatase alcaline (1 pg.mL-1) ont été préparées dans du tampon PBSTA. 50 pL de la solution résultante ont été injectés dans le réseau microfluidique (Figure 7), puis l'ensemble a été incubé une heure à 37°C. Le système microfluidique assemblé a ensuite été lavé avec 200 pL de tampon PBS. - Révélation 50 pL d'une solution de BCIP/NBT (4-bromo-5-chloroindolyl phosphate/ nitro-blue tetrazolium) ont été injectés dans le système microfluidique assemblé et incubés à 37°C afin de révéler le signal (environ 30 minutes). Les canaux ont ensuite été lavés avec 1 mL de PBS. Une fois l'ensemble séché, l'acquisition d'une image du système microfluidique assemblé a été effectuée à l'aide d'un scanner horizontal de bureau (HP). Une corrélation entre l'intensité du signal mesuré et la concentration d'anti ligand a été démontrée (Figure 7).20 REVENDICATIONS1. Complexe comprenant : - un support pourvu d'au moins deux faces dont l'une est pourvue d'une enduction d'un adhésif, - au moins un ligand ledit ligand étant immobilisé sur la surface adhésive. 2. Complexe selon la revendication 1 caractérisé en ce que le ligand est choisi parmi les protéines, peptides, anticorps, acides nucléiques, sucres ou oligosaccharides, les toxines, pesticides, hormones, herbicides, fongicides, neurotransmetteurs. 3. Complexe selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'adhésif est choisi parmi adhésifs sensibles à la pression comme les polyacrylates, les gommes silicone, les polyvinyl ethers, ou les adhésifs non réactifs comme les copolymères styrène-butadiene, les gommes nitriles, le poly(vinyl acétate) et ses polymères, les polyvinyl acetals, ou les adhésifs réactifs comme adhésifs polyurethane à deux composants, les adhésifs epoxy, les acryliques anaérobies, ou encore les cyanoacrylates. 4. Complexe selon l'une des revendications précédentes, ladite surface adhésive étant fonctionnalisée, par exemple par l'action d'un agent de réticulation 5. Complexe selon la revendication 4 dans lequel le ligand est fonctionnalisé. 6. Complexe selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'un adhésif est également enduit sur une autre face du support. 7. Dispositif d'analyse comprenant un support rigide comprenant au moins un puits délimitant une cavité interne comprenant au moins deux ouvertures, au moins une desdites ouvertures de la cavité étant scellée par le complexe selon l'une des revendications 1 à 6.. Dispositif selon la revendication 7 choisi parmi les plaques d'analyse, par exemple des plaques 12, 24 ou 96-puits ou des réseaux microfluidiques. 9. Utilisation d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un dispositif d'analyse selon l'une des revendications 7 ou 8. 10. Procédé de préparation d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 6 comprenant les étapes suivantes : a) Dilution du ligand dans une solution adaptée par exemple un tampon salin ; b) Dépôt du ligand en solution à la surface de l'adhésif. 11. Procédé de préparation selon la revendication 10 comprenant une étape de prétraitement de la surface adhésive, par exemple par un agent de réticulation cornrne le glutaraldéhyde. 12. Procédé de préparation d'un complexe selon la revendication 10 ou 11 comprenant une étape supplémentaire c) de séchage du liquide ainsi déposé par exemple à température ambiante. 13. Procédé de préparation selon l'une des revendications 10 à 12 comprenant une étape supplémentaire (d) de chauffage, lavage et/ou de saturation. 14. Procédé de préparation d'un dispositif selon la revendication 7 ou 8 comprenant l'étape consistant à sceller le complexe selon l'une des revendications 1 à 6 au support de façon à fermer au moins une desdites ouvertures de la cavité, la surface adhésive comportant le ligand étant orientée vers l'intérieur de la cavité. 15. Procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand comprenant les étapes : a) Disposer d'un dispositif selon la revendication 7 ou 8 ou d'un complexe selon l'une des revendications 1 à 6, b) Mettre en contact le dispositif ou le complexe avec un échantillon susceptible de contenir un anti ligand dans desconditions permettant l'interaction entre le ligand et l'anti ligand, c) Optionnellement ajouter une molécule de détection marquée, d) Détection et/ou quantification des signaux générés par l'interaction entre le ligand et l'anti ligand. 16. Procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand selon la revendication 15 dans lequel l'anti ligand provient d'un échantillon biologique tel du sérum, du sang, ou du plasma, un échantillon environnemental comme un prélèvement d'eau, de gaz, d'air, de sol ou un échantillon provenant de l'industrie agroalimentaire comme de la nourriture. 17. Procédé de détection et/ou de quantification d'un anti ligand selon l'un des revendications 15 ou 16 par colorimétrie, fluorescence, chimiluminescence, radiographie ou détection de radioactivité.