Brevet FR2975704A1 — publié le 20121130

La présente invention se rapporte à une nouvelle bilirubine oxydase, à son procédé de préparation ainsi qu'à son utilisation notamment pour le dosage de la bilirubine et pour la mise en oeuvre de biopiles enzymatiques utilisant l'oxygène comme combustible. La bilirubine oxydase ou BOD (E.C. 1.3.3.5.) est une enzyme qui catalyse la réaction d'oxydation de la bilirubine en biliverdine : bilirubine + V2 02 - biliverdine + H2O La BOD présente quatre sites de liaison à des atomes de cuivre ; ces quatre atomes de cuivre sont nécessaires à la bonne activité de l'enzyme, il a en effet été montré que l'absence d'un cuivre de la protéine CotA de Bacillus subtilis (protéine à activité bilirubine oxydase commercialisée, en tant que BOD, par la Société Genzyme Diagnotics) suffisait à réduire l'activité de l'enzyme (tableau 3 de l'article de Durao et al. dans J Biol Inorg Chem. 2008 Feb;13(2):183-93). On peut remarquer que la présence, dans la séquence d'une enzyme, de sites de liaison à quatre ions cuivre tels que ceux présents dans les BOD ne permet pas de déduire son activité enzymatique ; en effet, il existe différentes enzymes qui partagent la caractéristique de posséder de tels sites (comme les laccases par exemple). La bilirubine est une substance jaune formée dans le sang par la décomposition de l'hémoglobine, il s'agit d'un des principaux pigments produits dans le foie. La BOD présente un intérêt pour diverses applications telles que le dosage de la bilirubine permettant par exemple le diagnostic d'un excès de bilirubine dans le sang ; elle peut encore servir pour la préparation de biopiles enzymatiques où elle va capter les électrons de la cathode en réduisant l'oxygène en eau (voir la représentation schématique de biopile enzymatique où la BOD est fixée dans un polymère redox à la cathode à la Figure 1A) ou comme biocapteur à oxygène. Il existe de nombreuses sources de BOD ; cette enzyme peut être produite à partir de microorganismes tels que ceux du genre Bacillus [Bacillus subtilis dont la CotA présente une activité bilirubine oxydase, voir Sakasegawe et al. 2006 Applied and Environmental Microbiology 72, N°1, 972-975 ; Bacillus licheniformis (US 4,770,997)], ou de mycètes, parmi eux, ceux du genre Penicillium [Penicillium janthinellum (Demande de Brevet EP 0 295 101)], Trachyderma (US 4,600,689), Myrothecium (Tanaka et al. 1982 Agric. Biol. Chem. 46, 2499-2503) ou encore Schizophyllum, Coprinus, Trametes, Coriolus, Pholiota, Pleurotus, Lenzites ou Fomitopsis (US 4,677,062). Cette enzyme peut également être extraite de plantes telles que du genre Alfalfa (US 5,624,811), Solanacées, Musacées et Liliacées (EP 0 140 004) ou encore Composées telles que l'artichaut (EP 0 247 846). Paimi ces enzymes, les BOD présentant les propriétés enzymatiques, en particulier l'activité et la stabilité, les plus avantageuses ont été retenues pour être commercialisées ; il s'agit de la CotA à activité bilirubine oxydase de Bacillus subtilis (elle est vendue en tant que BOD par la Société Genzyme Diagnotics et sera désignée BOD dans ce qui suit) et de la BOD Myrothecium verrucaria (vendue par les Sociétés Sigma-Aldrich et Amano). Les inventeurs ont maintenant identifié une nouvelle BOD produite par Magnaporthe oryzae qui est beaucoup plus active à pH acide (inférieur à 5) et, en particulier, à température inférieure à 50°C que les BOD disponibles dans le commerce. Selon un premier objet, l'invention se rapporte à la BOD de Magnaporthe oryzae de SEQ. ID. N°1 ; cette enzyme correspond à une protéine prédite déduite du séquençage du génome de Magnaporthe oryzae (traduite à partir du gène ayant le numéro d'accession A4QV27 dans la base de données UniProt, ce gène complet a pour séquence SEQ. ID. N°2) à l'exception des 24 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale de la protéine ; en particulier, la bilirubine oxydase purifiée (pureté > 95%) selon l'invention présente un pourcentage d'identité d'au moins 80%, et par ordre de préférence croissant au moins 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, par rapport à la BOD de Magnaporthe oryzae de SEQ. ID. N°1 ; elle catalyse la réaction d'oxydation de la bilirubine en biliverdine et est liée à quatre atomes de cuivre. La BOD de SEQ. ID. N°3 est également un objet de la présente invention, la BOD de SEQ. ID. N°3 diffère de la BOD de SEQ. ID. N°1 en ce qu'elle comporte un acide aminé additionnel, une sérine, en position N-terminale ; cette BOD est obtenue en exprimant dans la levure Pichia pastoris la molécule d'acide nucléique de SEQ. ID. N°4 (correspondant à la SEQ. ID. N°2 à l'exclusion du fragment codant pour les des 24 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale) clonée dans le vecteur d'expression pFD55. La BOD de SEQ. ID. N°5, qui correspond au polypeptide codé par la SEQ. ID. N°2 et qui comporte les 24 acides aminés de l'extrémité N-teiniinale, est également un objet de la présente invention. De façon générale, les inventeurs ont constaté que les modifications de séquences introduites à l'extrémité N-teiminale, qu'il s'agisse d'ajout d'acides aminés ou de substitution, délétion ou insertion au sein de l'extrémité N-terminale dans la limite du maintien d'une identité d'au moins 80% avec la SEQ. ID. N°1, n'affectaient pas les propriétés enzymatiques de la BOD selon l'invention. L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de la BOD de Magnaporthe oryzae (SEQ. ID. N°1) comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Le pourcentage d'identité peut être calculé par l'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402). Les programmes BLAST sont mis en oeuvre sur la fenêtre de comparaison constituée de la totalité de la SEQ. ID. N°2 indiquée comme séquence de référence. Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X% d'identité avec une séquence de référence est défini, dans la présente invention, comme un peptide dont la séquence peut inclure jusque 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles dudit peptide de référence, en l'occurrence son activité enzymatique d'oxydation de la bilirubine. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Une séquence protéique SEQ. ID. N°5 prédite à partir du séquençage systématique du génome de Magnaporthe oryzae est décrite dans la base de données UniProt (numéro d'accession A4QV27) ; il convient de souligner que les informations présentées dans la base de données UniProt sont prédictives et putatives, elles ne résultent pas de l'isolement et de la caractérisation expérimentales de protéines de Magnaporthe oryzae. En outre, pour cette protéine prédite, la base de données UniProt n'indique aucune activité enzymatique particulière. La nouvelle BOD selon l'invention présente des propriétés améliorées par rapport aux BOD disponibles dans le commerce issues de Myrothecium verrucaria ou de Bacillus subtilis. En particulier, la BOD de Magnaporthe oryzae présente des propriétés enzymatiques (activité, efficacité catalytique k°at et affinité du substrat pour l'enzyme KM) de catalyse de l'oxydation de certains substrats supérieures à la BOD de Bacillus subtilis (voir la partie expérimentale qui suit). Le tableau I ci-dessous présente l'efficacité catalytique k°at, c'est-à-dire, le nombre de molécules de substrat converties en produit par molécule d'enzyme et par unité de temps, et la constante de Michaelis KM qui représente l'affinité du substrat (ABTS) pour les BOD de B. subtilis et de Magnaporthe oryzae. BOD kcat (pour ABTS) KM Magnaporthe oryzae 668 s t 42,8 µM B. subtilis 322 s i 124 gM Tableau I : propriétés enzymatiques des BOD de M oryzae et B. subtilis Les propriétés enzymatiques décrites pour la BOD de M verrucaria par Kataoka et al. (2005, Protein Expression and Purification, 41, 77-83) à pH 6,5 sont un kcat de 115 s-1 et un KM de 250 gM. En outre, la BOD de Magnaporthe oryzae présente également de bonnes propriétés enzymatiques d'oxydation de la bilirubine. La présente invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique codant pour la BOD selon l'invention ; de préférence, il s'agit d'une molécule d'acide nucléique de séquence choisie parmi la SEQ. ID. N°2 ou 4, de façon préférentielle, il s'agit de la SEQ. ID. N°4 codant pour la BOD de Magnaporthe oryzae clivée au niveau des 24 premiers acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale de la protéine. La molécule d'acide nucléique codant pour la BOD selon l'invention peut être clonée dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide, puis transformée dans un hôte approprié tel qu'une bactérie, une levure ou encore une culture cellulaire. Par vecteur d'expression, on entend un vecteur possédant une région peiniettant l'insertion d'une séquence nucléotidique codante entre les signaux indispensables à son expression, notamment, un promoteur (constitutif ou inductible), un site de fixation des ribosomes, un signal de terminaison de transcription et, éventuellement, un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique. La présente invention se rapporte encore à un vecteur d'expression comprenant ladite molécule d'acide nucléique et à une cellule hôte transformée avec ledit vecteur d'expression et exprimant une BOD selon l'invention. L'introduction du vecteur d'expression dans la cellule hôte peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier, par modification de la perméabilité membranaire de la cellule hôte, par exemple en présence d'ions calcium, ou par électroporation. Après culture des cellules hôtes transformées pour exprimer la BOD selon l'invention, lesdites cellules peuvent être récupérées par centrifugation, lysées afin de libérer les enzymes dont ladite BOD selon l'invention. Selon une variante préférée de l'invention, la BOD selon l'invention est produite par la levure Pichia pastoris. Pour permettre la surproduction et la sécrétion de la BOD dans le milieu de culture de la levure Pichia pastoris, la molécule d'acide nucléique de SEQ. ID. N°4 codant pour la BOD de séquence SEQ. ID. N°3 est introduit par recombinaison homologue dans le génome de la levure, au niveau du gène AOX1. Pour cela, le plasmide pFD55, une fois linéarisé par digestion avec l'enzyme pmel, est introduit dans la levure par électroporation et les clones positifs sont sélectionnés sur milieu YPD + agar contenant de la zéocine à 100gg/ml. A partir d'un clone isolé sur boite de Pétri, une préculture de 200 mL de milieu YPD supplémentée en zéocine (100 µg/mL) est ensemencée. Après une nuit sous agitation à 220 rpm et à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10 minutes à 4000 rpm et le culot est repris dans 200 ml d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant ImM de CuSO4 dans un Erlenmeyer de 5L est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2 heures avant d'ajouter 0,5% de méthanol pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant 5 jours afin d'obtenir le maximum d' enzymes. Pour la mise en oeuvre de cette méthode, on peut, sans caractère limitatif, utiliser le matériel suivant : - vecteur pour l'expression dans Pichia pastoris (pFD55): plasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la BOD de Magnaporthe oryzae en phase avec le facteur de sécrétion a-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur AOX1 inductible au méthanol. - souche de levure Pichia pastoris GS 115 utilisée pour la production de la BOD selon l'invention après intégration de la cassette issue du vecteur pFD55 contenant le promoteur AOX1, le peptide signal a-factor et la séquence ADN codant la BOD de Magnaporthe oryzae. - Milieux de culture : Milieu riche YPD (pour levure) 1% yeast extract 2% bacto-peptone 2% glucose pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu minimum MMH (pour levure) : 1,34% yeast nitrogen base 1% Casamino acid 0,4% histidine 4* 10-5 % Biotine pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu riche LB (pour bactérie) : Tryptone 10 g/L Extrait de levure 5 g/L NaCl 5 g/L H2O distillée qsp IL pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C. Selon une autre variante, Escherichia coli peut être choisie comme micro-organisme hôte, les plasmides qui peuvent alors être utilisés sont notamment les plasmides pBluescript, pUC18, pET, pGEX, pGS, pMAL-c2 ou similaires. Selon cette variante de préparation de la BOD selon l'invention, la BOD 20 est avantageusement exprimée par une bactérie E. coli transformée avec un vecteur d'expression pET21a codant pour une enzyme accolée à une étiquette 6HIS en position C- terminale. Ce procédé est rapide et simple ; en effet, l'induction de l'expression de la BOD de Magnaporthe oryzae dans la bactérie E. coli s'effectue en 4 à 24 heures. En outre, l'étiquette 6HIS permet la purification de la BOD de Magnaporthe oryzae par chromatographie d'affinité sur une résine nickel en une seule étape pour l'obtention d'une enzyme pure. Pour la mise en oeuvre de ce procédé de préparation, l'homme du métier choisira la cellule hôte en fonction du vecteur d'expression utilisé. De préférence, lorsque le vecteur d'expression pET21a est utilisé, on choisira une cellule hôte exprimant la T7 RNA polymérase telles que les souches d 'E. coli BL21 DE3, BL21-SI, BL21 pLys, Novablue(DE3) ou BL21 Star. La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation d'une BOD selon l'invention comprenant les étapes de : 25 30 a) préparation de cellules hôtes, exprimant la BOD selon l'invention ; b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ; c) récupération du milieu de culture et élimination des cellules hôtes, par exemple par centrifugation ; d) traitement du milieu de culture obtenu à l'étape c) par chromatographie d'interactions hydrophobes ; e) récupération de ladite BOD purifiée. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé selon l'invention est tel que : - la souche de levure Pichia pastoris utilisée est la souche GS115 ; - le vecteur d'expression dans Pichia pastoris (pFD55) est le plasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la BOD de Magnaporthe oryzae en phase avec le facteur de sécrétion a-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur AOX1 inductible au méthanol ; - la culture réalisée à l'étape b) comprend au moins une étape de culture en phase liquide, sous agitation, à une température comprise entre 18 et 37°C, de préférence 25°C, au cours de laquelle, l'expression de la BOD est induite par l'ajout de méthanol ; l'induction par ajout de méthanol pouvant éventuellement être renouvelée. Lorsque le procédé est mis en oeuvre selon ces conditions préférées, il 20 permet la production de la BOD avec un temps d'induction court, de l'ordre de 3 à 7 jours ; la purification de la BOD est réalisée en une seule étape de chromatographie d'interactions hydrophobes et la BOD ainsi produite comporte bien les quatre atomes de cuivre nécessaires à son activité (voir la partie 5 de l'exemple). Lorsque la BOD selon l'invention est produite par une souche telle 25 qu'Escherichia coli, alors le procédé de préparation d'une BOD selon l'invention comprend les étapes de : a) préparation de cellules hôtes, exprimant la BOD selon l'invention ; b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ; 30 c) lyse des cellules hôtes ; d) traitement du lysat obtenu à l'étape c) par chromatographie d'affinité ; e) récupération de ladite BOD purifiée. Il est également possible de produire une BOD en présence d'agents dénaturants comme l'urée, le chlorure de guanidium, le SDS, le triton... ; la BOD ainsi produite sera alors dépourvue de cuivre et pourra être activée par l'ajout d'atomes de cuivre. L'invention se rapporte également à l'utilisation de la BOD de Magnaporthe oryzae selon l'invention pour doser la bilirubine en solution, c'est-à-dire mesurer la concentration en bilirubine dans un échantillon, notamment un échantillon biologique. Par échantillon biologique, on entend un fluide biologique tel que du 10 sang, du sérum, de la lymphe, de la bile, de l'urine, du liquide céphalo-rachidien, de la sueur... La présence dans l'organisme de bilirubine est normale, elle provient de la dégradation de l'hémoglobine et il se forme environ 200 à 230 mg de bilirubine par jour chez un adulte sain. Chez un individu en bonne santé, la bilirubine est captée par le foie 15 puis dégradée, sa concentration ne doit donc pas dépasser certains seuils et le dosage de la bilirubine est utile pour détecter des pathologies telles que : - les cas d'hémolyse importante : anémies hémolytiques congénitales ou acquises, hémolyses médicamenteuses, toxiques ou infectieuses, accident transfusionnel... ; - les captations ou conjugaisons hépatiques insuffisantes : Maladie de 20 Gilbert, Maladie de Criggler Najajr, prise de Rifampicine (antibiotique antituberculeux) ; - les affections hépatiques et biliaires : les différents types d'hépatite (virale, toxique, médicamenteuse), les différents types de cirrhose, les anomalies métaboliques rares (maladie de Rotor, de Dubin Johnson) ; - les affections biliaires , 25 - la lithiase biliaire ; - les pancréatites ; - le cancer du pancréas ou des voies biliaires. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation de la BOD selon la présente invention pour mesurer la concentration en bilirubine dans un échantillon liquide, 30 en particulier, un échantillon biologique. Selon une première variante, le principe du dosage de la bilirubine avec la BOD repose sur la mesure du changement de couleur de l'échantillon provoqué par la dégradation de la bilirubine. La bilirubine présente un pic d'absorption (Xrax) de la lumière à 440 nm ; lorsqu'elle est dégradée enzymatiquement par une BOD, l'absorbance à Xmax de l'échantillon dans lequel elle est présente diminue ; cette diminution permet de quantifier la bilirubine initialement présente dans l'échantillon par comparaison avec la diminution d'absorbante à 440 nm de solutions étalons contenant des teneurs connues en bilirubine mesurées dans les mêmes conditions expérimentales. La présente invention se rapporte également à un kit de dosage de bilirubine en solution caractérisé en ce qu'il comprend une BOD selon l'invention. Typiquement, le kit de dosage contient également les réactifs nécessaires 10 à la mise en oeuvre du test de dosage de la bilirubine, en particulier : - les tampons ; - les solutions standards de bilirubine permettant la réalisation de courbes d'étalonnage, et - les instructions d'utilisation nécessaires pour effectuer le dosage. 15 La présente invention se rapporte encore à un procédé de dosage de la bilirubine en solution dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mesure de l'absorbance à X,inax = 440 nm dudit échantillon liquide avant réaction enzymatique ; 20 b) introduction dans ledit échantillon liquide d'une BOD selon l'invention ; c) mesure l'absorbance à 1,,,ax = 440 nm dudit échantillon liquide après réaction enzymatique ; d) calcul de la différence d'absorbances mesurées aux étapes a) et c) et comparaison de cette différence avec des différences d'absorbances mesurées pour des solutions 25 standards ayant une teneur en bilirubine connue ; e) détermination de la concentration initiale en bilirubine dudit échantillon liquide. Selon une autre variante, le dosage de la bilirubine dans un échantillon liquide est réalisé par une méthode électrochimique qui met en oeuvre une électrode incluant la BOD selon l'invention. 30 Ainsi, la présente invention se rapporte également à des électrodes à BOD comprenant un matériau conducteur tel qu'un métal conducteur, notamment, du platine, du cuivre, de l'argent, de l'aluminium, de l'or ou de l'acier ou du carbone, comme du carbone vitreux, des fibres de carbone, des fibres de nanotubes de carbone ou encore en diamant... ledit matériau conducteur est recouvert d'un dépôt comprenant au moins une BOD selon l'invention ; ledit dépôt pouvant en outre comprendre un polymère redox pour améliorer la conduction électrique entre l'enzyme et l'électrode ainsi que la stabilité du système. Le polymère redox peut être par exemple choisi parmi les polymères à base de ferrocène, d'osmium et de ruthénium et les polymères conducteurs tels que par exemple le polypyrrole et la polyananilline. Les méthodes d'immobilisation de la BOD sur ledit matériau conducteur peuvent être choisies parmi les méthodes classiques à la disposition de l'homme du métier qui comprennent notamment l'inclusion de la BOD dans une matrice polymérique, l'adsorption de la BOD à la surface de la membrane polymérique, la fixation par liaison covalente, l'électrodéposition (Gao et al., Chenu Int. ED. 2002, 41, N°5, 810-813) ou encore la technique décrite dans la Demande de Brevet américain US 2009/0053582. Selon une variante de réalisation, l'électrode à BOD sur laquelle est immobilisée la BOB est également recouverte d'une membrane qui évite le détachement de ladite enzyme de l'électrode. Selon les applications envisagées, ladite membrane peut être constituée de nafion, de cellulose ou de tout matériau biocompatible, c'est-à-dire compatible avec un environnement physiologique. La présente invention se rapporte ainsi également à un biocapteur de bilirubine constitué d'une électrode à BOD selon l'invention. De façon générale, un biocapteur consiste en une électrode sur laquelle est immobilisé un biorécepteur capable de reconnaître une cible biologique ; la fixation de la cible biologique sur le biorécepteur conduit à des modifications physico-chimiques de la membrane et la production d'un signal électrique par un transducteur électrochimique (ampérométrique, potentiométrique, conductimétrique,...) accolé à l'électrode. Dans le cas présent, le biorécepteur est une BOD selon l'invention et la cible biologique est la bilirubine. La présente invention se rapporte encore à un procédé de dosage de la bilirubine en solution dans un échantillon liquide avec un biocapteur de bilirubine selon l'invention. Selon une variante d'utilisation du biocapteur de bilirubine, ce dernier est implanté sous la peau d'un individu et permet d'enregistrer la concentration en bilirubine du sang dudit individu. La présente invention se rapporte aussi à un capteur à oxygène constitué d'une électrode selon l'invention. L'électrode à BOD selon l'invention peut encore être avantageusement utilisée à titre de cathode dans une biopile enzymatique ; la Figure 1A représente schématiquement le principe de fonctionnement d'une biopile enzymatique. Les biopiles enzymatiques selon l'invention sont des dispositifs comprenant une électrode à BOD à titre de cathode et une anode où une réaction d'oxydation d'un substrat se produit (catalysée par l' « enzyme X ») ; à titre d'illustration, le substrat peut être du glucose et l'« enzyme X » la glucose oxydase, une telle pile présente un intérêt particulier lorsque la biopile est implantée chez un individu pour une application médicale ; le substrat peut aussi être choisi, par exemple, parmi des nitrites, nitrates, sulfures, urates, ascorbates, glutamates, pyruvates, lactates, de la cellulose... si une application en dépollution est envisagée, le choix de l'enzyme se fera alors en fonction du substrat à dégrader, à titre d'exemple, les enzyme suivantes peuvent être utilisées, le type de substrat qu'elles peuvent dégrader est mentionné entre parenthèse : la glucose oxydase (glucose ou tous sucres étant oxydés par cette enzyme), la lactate oxydase (lactate), la pyruvate oxydase (pyruvate), l'alcool oxydase (alcool), la cholestérol oxydase (cholestérol), la glutamate oxydase (glutamate), la pyranose oxydase (pyranose), la choline oxydase (choline), la cellobiose déshydrogénase (cellobiose), la glucose déshydrogénase (glucose ou tous les sucres étant oxydés par cette enzyme), la pyranose déshydrogénase (pyranose), la fructose déshydrogénase (fructose), l'aldéhyde oxydase (aldéhyde), la gluconolactone oxydase (gluconolactone), l'alcool déshydrogénase (alcool), 1'ascorbate oxydase (oxygène ou ascorbate) ou encore la sulfure dioxygénase (sulfure). Le procédé d'oxydation et de réduction concomitant aux électrodes de la biopile produit un courant électrique. La Figure IB illustre plus spécifiquement une biopile enzymatique à glucose ; une telle biopile enzymatique consiste en deux électrodes modifiées par l'immobilisation d'enzymes. Une glucose oxydase (GOx) est fixée sur l'anode (1) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur «I» et une bilirubine oxydase (BOD) est fixée sur la cathode (2) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur «II ». En fonctionnement, à l'anode, les électrons sont transférés du glucose présent dans le fluide physiologique vers la GOx, puis de la GOx au polymère conducteur «1» et du polymère conducteur «1» vers l'anode. A la cathode, les électrons sont transférés de la cathode vers le polymère conducteur «II », puis vers la BOD et enfin de la BOD à l'oxygène présent dans le fluide physiologique. Il est à noter qu'une biopile peut aussi éventuellement fonctionner en modifiant les électrodes avec leurs enzymes respectives et en rajoutant des médiateurs solubles, tels que le ferrocèneméthanol pour l'anode et le ferricyanure de potassium pour la cathode, et en rajoutant le cas échéant une membrane séparant l'anode et la cathode. Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une BOD selon l'invention pour dégrader la bilirubine présente dans un échantillon, notamment un échantillon biologique. En effet, la présence de bilirubine dans un échantillon est susceptible de fausser la détection d'autres substances (comme le glucose ou le cholestérol sanguin) en particulier lorsque ces autres substances sont détectées par une méthode colorimétrique. De façon générale, les BOD selon l'invention trouvent de nombreuses applications industrielles, notamment dans les industries textile et papetière et dans le domaine alimentaire, afin, par exemple, d'améliorer la stabilité et/ou de la qualité d'aliments, telles que des boissons, ou encore d'aliments contenant des huiles végétales par désoxygénatation. Plus spécifiquement, les BOD peuvent être utilisées pour des applications liées à la dépollution, à titre d'exemple, on peut citer la décoloration et la détoxification des eaux usées et la dégradation de xénobiotiques ; comme réactifs de synthèse organiques ; pour la préparation de compositions antimicrobiennes ; pour la fabrication d'articles en bois et de cartons détoxifiés ou encore pour la production de détergent (Morozova et al. Biochemistry (Most.) 2007 Oct;72(10):1136-50) et pour la décoloration de colorants utilisés en milieux industriels ; en particulier pour la décoloration des textiles et le blanchiment de la pate à papier. La BOD selon l'invention peut également être utilisée pour dimériser l'acide phénolique (Koschorreck, K., et al. 2008. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 79 : 217-224) et présente ainsi un intérêt pour la synthèse de pigments et de colorants utilisés dans des applications textiles et alimentaires (R. Mustafa et al. Food Research International. Volume 38, Issues 8-9, October-November 2005, Pages 995-1000) ; cette réaction de dimérisation peut également être utilisée pour la préparation de composés antioxydants, comme par exemple, les dimères d'acide férulique (Garcia-Conesa MT, et al. Redox Rep. 1997 Oct-Dec;3 (5-6):319-23). La BOD selon l'invention peut encore être utilisée comme réactif dans une composition de teinture d'oxydation des fibres kératiniques, telle qu'une composition de coloration capillaire, comprenant, dans un milieu approprié pour la teinture, au moins une base d'oxydation, une BOD selon l'invention et, optionnellement, un donneur pour ladite BOD (tel qu'un substrat comme la bilirubine). Les différents ingrédients, autres que la BOD, utilisables dans ladite composition sont décrits dans la Demande Internationale WO 99/15138 ; à titre d'exemple, la ou les bases d'oxydation peuvent être choisies parmi les paraphénylènediamines, les bases doubles, les paraaminophénols, les orthoaminophénols et les bases d'oxydation hétérocycliques. La BOD selon l'invention peut avantageusement être utilisée pour le traitement de pâte à papier pour son action sur la dégradation de la lignine et/ou pour produire un papier qui présente une meilleure résistance à l'humidité (voir la Demande Internationale WO 00/68500). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres 10 dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles Figures La Figure lA représente schématiquement le principe de fonctionnement d'une biopile enzymatique ; la Figure 1B représente une biopile enzymatique à glucose. 15 La Figure 2 représente la carte plasmidique du vecteur pFD55. La Figure 3 représente l'activité catalytique de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction de la concentration d'ABTS. La Figure 4 représente l'activité catalytique de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction de la concentration de Bilirubine non-conjuguée. 20 La Figure 5 représente l'activité catalytique de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction de la concentration de Bilirubine conjuguée. La Figure 6 représente l'activité relative de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction du pH sur l'oxydation des différents substrats. La Figure 7 représente le test d'activité de la BOD de Magnaporthe 25 oryzae en fonction de la température sur l'oxydation de dABTS. La Figure 8 représente le test de stabilité de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction de la température sur l'oxydation de la bilirubine conjuguée. La Figure 9 représente le pourcentage de décoloration du Rémazol Brillant Blue R par la BOD de Magnaporthe oryzae à 37°C dans un tampon phosphate- 30 citrate 50 mM pH 7. La Figure 10 représente la courbe de calibration pour la mesure de cuivre via le test biquinoline. EXEMPLE 1. Matériels 1.1 Souche bactérienne d'Escherichia coli DH5a : supE44, AlacUl69, ((M0 lacZDM15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl (Hanahan, 1983). Cette souche est utilisée pour l'amplification de plasmides lors des étapes de construction des vecteurs d'expression protéique. 1.2 Vecteur pFD55 : Plasmide pPICZa contenant la séquence ADN de SEQ. ID N°2 codant pour la BOD de Magnaporthe oryzae en phase avec le facteur de sécrétion a-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur AOX1 inductible au méthanol. La carte plasmidique du plasmide pPICZa est représentée à la Figure 2. 1.3 Souche de la levure Pichia pastoris GS 115 : souche de levure Pichia pastoris utilisée pour la production de la Bilirubine oxydase après intégration de la cassette issue du vecteur PFD55 contenant le promoteur AOX1, le peptide signal a-factor et la séquence ADN codant la BOD de Magnaporthe oryzae. 1.4 Milieux de culture Milieu riche YPD (pour levure) : 1% yeast extract 2% bacto-peptone 2% glucose pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu minimum MMH (pour levure) : 1,34% yeast nitrogen base 1% Casamino acid 0,4% histidine 4*10-5 % Biotine pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C Milieu riche LB (pour bactérie) : Tryptone 10 g/L Extrait de levure 5 g/L NaCl 5 g/L H20 distillée qsp IL pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C 2. Techniques de génie génétique 2.1 Transformation des bactéries supercompétentes Les bactéries DM5a supercompétentes sont préparées à l'aide de la méthode SEM (Simple and Efficient Method) selon le protocole décrit par moue et al. (moue et al. 1990. Gene 96:23-28). 2.2 Transformation de la levure Pichia pastoris L'ADN est introduit dans la levure Pichia pastoris GS 115 par electroporation sur un 10 Eppendorf Eporator (Eppendorf, France). 2.3 Préparation de l'ADN Un kit de purification d'ADN plasmidique (Quiagen) est utilisé pour les préparations d'ADN en petite et grande quantité. 2.4 Séquençage de l'ADN double brin 15 L'ADN double brin est séquencé par la société Millegen (Toulouse, France) selon des techniques classiques. 2.5 Construction du vecteur d'expression de la BOD Le gène correspondant à la séquence codant la Bilirubine oxydase de Magnaporthe oryzae (accesion A4QV27) clivée au niveau des 24 premier acides aminés positionnés à 20 l'extrémité N-terminale de la protéine a été synthétisé par la société Genecust Europe (Luxembourg). Les sites de restriction Nhel (SEQ. ID. N°6 : gctagc) et NotI (SEQ. ID. N°7 : gcggccgc) ont été respectivement ajoutés en 3' et 5' de la séquence pour faciliter le clonage. Le plasmide pPICZa ainsi que le gène synthétisé ont alors été traités avec les deux 25 enzymes de restrictions Nhel et Notl et les produits de digestion ont été purifiés sur gel avec le kit « nucleospin ». Le gène de la BOD est alors ligué dans le plasmide par co-incubation avec la T4 DNA Ligase à 37°C sur la nuit. Les plasmides néoformés (pFD55) sont alors sélectionnés et amplifiés par transformation 30 de bactéries DH5a sur boite contenant de la zéocine à 25gg/ml. 2.6 Intégration de la séquence codant la bilirubine oxydase dans le génome de Pichia pastoris Pour permettre la surproduction et la sécrétion de l'enzyme dans le milieu de culture de la levure Pichia pastoris, le gène correspondant est introduit par recombinaison homologue au niveau du gène AOX1. Pour cela, le plasmide pFD55, une fois linearisé par digestion avec l'enzyme pmeI, est introduit dans la levure par électroporation et les clones positifs sont sélectionnés sur milieu YPD + agar contenant de la zéocine à 100 gg/ml. 3. Production, purification et caractérisation de la BOD de Magnaporthe oryzae 3.1 Production de la BOD L'enzyme BOD est produite par la levure Pichia pastoris via une induction au méthanol. Pour ce faire, une préculture de 200 mL de milieu YPD supplémentée en zéocine (100 µg/mL) est ensemencée par la souche GS115 ayant intégré la cassette contenue sur le plasmide pFD55. Après une nuit sous agitation à 220 rpm à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10 minutes à 4000 rpm et le culot est repris dans 200 ml d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant 1 mM de CuSO4 dans un Erlenmeyer de 5L est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2 heures avant d'ajouter 0,5% de méthanol pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant 5 jours afin d'obtenir le maximum d'enzymes. Pour récupérer les protéines sécrétées, la culture de 2L est centrifugée et le surnageant contenant l'enzyme d'intérêt est concentré sur une cellule d'agitation avec une membrane YM10 d'un seuil de coupure de 10kDa pour atteindre un volume de 4-5 ml final. 3.2 Purification de la BOD par chromatographie d'interactions hydrophobes Une fois concentré, 1,7 M d'ammonium sulfate est ajouté au 4-5 ml du surnageant de culture avant d'être filtré sur filtre de 0,22 µm pour être injecté sur une colonne d'interactions hydrophobes, une PhenylHP de 60 ml (GE Healthcaré ), couplée au système AKTA purifier (GE Healthcare ), équilibrée dans un tampon Potassium phosphate 50 mM, (NH4)2SO4 1,7 M, pH 6. L'élution est réalisée par un gradient de 0% à 100% d'un tampon Potassium phosphate 50 mM pH 6 sous un débit de 2,5 mL/min. Les fractions contenant la protéine BOD sont identifiées par un test d'activité à l'ABTS (acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulphonique) et sont rassemblées, concentrées et stockées dans un tampon Potassium phosphate 50 mM pH 6 par centrifugation sur membrane Amicon YM10. A ce stade, la protéine BOD est pure et peut être conservée à -20°C sous forme soluble. En comparant avec les autres BOD disponibles commercialement, il convient de souligner un réel avantage d'utilisation de cette protéine vis-à-vis du protocole de purification. En effet, une seule étape de purification est nécessaire pour l'obtention d'une enzyme pure en opposition avec les successions de chromatographie (size exclusion, échangeuse anionique ou cationique, hydrophobe...) utilisées pour les autres bilirubine oxydases connues. 3.3 Caractérisation de l'enzyme 3.3.1 Mesure de la concentration La concentration en enzyme d'une solution est calculée à partir d'une gamme BSA selon la technique Bradford (Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54). 3.3.2 Tests enzymatiques Les tests enzymatiques sont effectués à l'aide d'un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0.1M citrate/phosphate à 37°C dans un volume de 3 mL en suivant l'oxydation de différents substrats à une longueur d'onde donnée en fonction du temps. L'activité spécifique de l'enzyme est exprimée en !moles de substrats oxydés par minute et par mg de protéine. Les substrats utilisés dans cette étude sont : l'ABTS (C420nm = 36 mM-1 cm 1), la bilirubine non conjuguée (E450nm = 32 mM-1 cm 1) et la bilirubine conjuguée (E440nm 25 mM-' cm-1). 3.4 Etude des propriétés enzymatiques de la BOD de Magnaporthe oryzae 3.4.1 Détermination des constantes cinétiques (kcat) et de Michaelis (KM) à l'état stationnaire 3.4.1.1 ABTS Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0,1M citrate/phosphate pH 4. La concentration en ABTS varie dans le test de 0 à 4 mM. Le test est déclenché par l'ajout d'enzyme. Les points expérimentaux sont analysés par régression non linéaire selon le modèle de Michaelis-Menten à l'aide du logiciel Sigma-plot 6.0 selon l'équation : kss = kcat * [S] (KM + [S]) Résultats kcat = 664 s-1 et Km = 428 JaM L'activité catalytique de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction de la concentration d'ABTS est illustrée à la Figure 3. A titre de comparaison, la BOD de Myrothecium verrucaria produite dans Pichia pastoris présente vis-à-vis de l'ABTS à pH 6.5 un kcat de 164 si pour un K1 de 340 tM (Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle ofprotein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54). 3.4.1.2 Bilirubine non conjuguée Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon Tris- HC1 50 mM pH 8,5. La concentration en bilirubine varie dans le test de 0 à 100 µM. Le test, déclenché par l'ajout d'enzyme, consiste à suivre l'oxydation de la bilirubine non conjuguée à 450 nm par changement colorimétrique (8450,,,,, = 32 mM-1.cm-1). Comme le montre la Figure 4, l'oxydation de ce substrat ne suit pas un processus de Michaelis-Menten et il n'est donc pas possible de déterminer les constantes habituelles. Seule la valeur de l'Activité spécifique maximale peut être donnée avec une valeur calculée de 32 U/mg. A titre de comparaison, les BOD issues du champignon Myrothecium verrucaria et de la bactérie Bacillus subtilis présentent une Activité spécifique maximale respective de 24 U/mg et 28 U/mg pour ce même substrat (Kataoka, K., et al., Migh-level expression of Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase in Pichia pastoris, and its facile purification and characterization. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 77-83 et Sakasegawa, S., et al., Bilirubin oxidase activity of Bacillus subtilis CotA. Appl Environ Microbiol, 2006. 72(1): p. 972-5.ù). 3.4.1.3 Bilirubine conjuguée Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon citrate-phosphate 50 mM pH 3.6. La concentration en bilirubine varie dans le test de 0 à 100 µM. Le test, déclenché par l'ajout d'enzyme, consiste à suivre l'oxydation de la bilirubine conjuguée à 440nm par changement colorimétrique (844on,n = 25 mM-1 cm 1). Les points expérimentaux sont analysés par régression non linéaire selon le modèle de Michaelis-Menten à l'aide du logiciel Sigma-plot 6.0 selon l'équation ci-dessous : kss = kcat * [S] / (KM + [Si) Cette enzyme présente ainsi les constantes cinétiques suivantes vis-à-vis de la bilirubine conjuguée : kcat = 28 s-t et KM= 18,5 µM. L'activité catalytique de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction de la concentration de 30 Bilirubine conjuguée est représentée à la Figure 5. 3.4.2 Etude de l'activité enzymatique en fonction du pH 3.4.2.1 ABTS L' étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 3 à 7 dans un tampon 0.1M citrate/phosphate en utilisant l'ABTS à 1 mM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotomètre Varian. L'activité est suivie par l'oxydation de l'ABTS aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 420 nm. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. 3.4.2.2 Bilirubine non conjuguée L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 7 à 8.5 dans un tampon Tris-HC1 0.2M en utilisant la bilirubine non-conjuguée à 30 µM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotomètre Varian. L'activité est suivie par l'oxydation de la bilirubine aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 450nm (E45onn, = 32 mM' cm'). Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. 3.4.2.3 Bilirubine conjuguée L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 3 à 7 dans un tampon 0,1 M citrate/phosphate en utilisant la bilirubine conjuguée à 25 µM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotomètre Varian. L'activité est suivie par l'oxydation de la bilirubine aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 440 nm (E45onm = 25 mM' cm'). Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. La Figure 6 représente graphiquement l'activité relative de la BOD de Magnaporthe oryzae en fonction du pH sur l'oxydation des différents substrats. 3.4.3 Etude de l'activité enzymatique en fonction de la température L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction de la température est réalisée dans un tampon 0,1 M citrate/phosphate pH 4 en présence de 0,5 mM d'ABTS. La température varie de 15 à 80°C. Le suivi de l'activité s'effectue sur un spectrophotomètre Varian CARY UV Biomelt régulé en température. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats de l'oxydation de l'ABTS en fonction de la température par la BOD de Magnaporthe oryzae sont représentés en activité relative sur le graphe de la Figure 7. 3.4.4 Stabilité de l'enzyme en fonction de la température L' enzyme est préincubée à une concentration de 0,15 mg/ml dans un bain à sec à 60°C et à 37°C dans un tampon Potassium phosphate 50 mM pH 6. A des temps réguliers, des prélèvements de 5µL sont effectués et l'activité résiduelle de l'enzyme incubée à ces températures est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian à 440 nm dans un tampon 0,1M citrate/phosphate pH 3,8 à 37°C, en présence de 50 µM de bilirubine conjuguée. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats de l'oxydation de la bilirubine conjuguée en fonction de la température par la BOD de Magnaporthe oryzae sont représentés en activité relative sur le graphe de la Figure 8. 3.4.5 Activité de décoloration du Rémazol Brillant blue R L'efficacité de décoloration du Rémazol Brillant Blue R (RBBR) par la BOD de Magnaporthe oryzae a été mesurée dans un tampon Phosphate-citrate 50 mM pH 7 en présence ou non d'ABTS à 10 µM. Une solution de RBBR à 80 mg/L est préincubée à 37°C avec ou sans ABTS et l'enzyme est ajoutée à TO à une concentration de 10µg/ml. L'absorbance à 592 nm (maximum d'absorption du RBBR) est mesurée à des temps réguliers afin de suivre l'activité de décoloration de l'enzyme. Après seulement 20 minutes, plus de 94% du RBBR est décoloré en présence d'ABTS 10 µM à 37°C. Ce résultat démontre clairement l'excellent potentiel de cette enzyme pour la décoloration de colorants utilisés dans l'industrie textile par exemple. La Figure 9 représente le pourcentage de décoloration du Rémazol Brillant Blue R par la BOD de Magnaporthe oryzae à 37°C dans un tampon phosphate-citrate 50 mM pH 7. 3.5 Dosage des quatre cuivres pour la BOD de Magnaporthe oryzae produite dans Pichia pastoris La détermination de la présence des 4 cuivres s'effectue par un test biquinoline en utilisant une gamme étalon pour mesurer la concentration molaire en cuivre (tableau 1) (Felsenfeld, G., The determination of cuprous ion in copper proteins. Arch Biochem Biophys, 1960. 87: p. 247-5). échantillon Solution de Tampon Biquinoline Volume total Concentration de cuivre imidazole (solution 3) (~gL) cuivre dans (solution 2) (solution 1) (µL) l'échantillon (g) (µL) (µM) 1 0 1200 1800 3000 0 2 0 1200 1800 3000 0 3 120 1080 1800 3000 12.59 4 120 1080 1800 3000 12.59 5 240 960 1800 3000 25.18 6 240 960 1800 3000 25.18 7 360 840 1800 3000 37.77 8 360 840 1800 3000 37.77 9 480 720 1800 3000 50.36 10 480 720 1800 3000 50.36 11 600 600 1800 3000 62.95 12 _ 600 1800 3000 62.95 600 BOD_1 450 i 750 1800 3000 6.1 (1.5µM) BOD_2 450 750 1800 3000 6.3 (1.55µM) Tableau 1: Protocole expérimental pour le test biquinoline nécessaire au dosage du cuivre de la BOD. Chaque mesure, basée sur un dosage colorimétrique à 546 nm, est réalisée en duplicata. La Figure 10 représente la courbe de calibration pour la mesure de cuivre via le test biquinoline. Cette technique a permis de montrer la présence de 6,1 }zM de cuivre pour un échantillon protéique de BOD de 1,5 µM soit un ratio de 4,06 et confirme bien la présence des quatre ions cuivre associés à l'enzyme.10 REVENDICATIONS1. Bilirubine oxydase (BOD) purifiée caractérisée en ce qu'elle présente un pourcentage d'identité d'au moins 80% par rapport à la BOD de Magnaporthe oryzae de SEQ. ID. N°1 ; en ce qu'elle catalyse la réaction d'oxydation de la bilirubine en biliverdine et en ce qu'elle est liée à quatre atomes de cuivre. 2. Bilirubine oxydase (BOD) purifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les BOD de SEQ. ID. N°1, 3 et 5. 3. Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une BOD selon la revendication 1 ou la revendication 2. 4. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, de séquence choisie parmi la SEQ. ID. N°2 et 4. 5. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 3 ou 4. 6. Cellule hôte exprimant une BOD selon la revendication 1, 15 caractérisée en ce qu'elle est transformée avec un vecteur d'expression selon la revendication 5. 7. Procédé de préparation d'une BOD selon la revendication 1 comprenant les étapes de : a) préparation de cellules hôtes selon la revendication 6 ; 20 b) mise en culture de cellules hôtes préparées à l'étape a) ; c) récupération du milieu de culture et élimination desdites cellules hôtes dans le cas des protéines sécrétées ou lyse des cellules hôtes ; d) traitement du milieu ou lysat obtenu à l'étape c) par chromatographie d'interactions hydrophobes ; 25 e) récupération de ladite BOD purifiée, caractérisé en ce que ladite cellule hôte préparée à l'étape a) est une souche de levure Pichia pastoris transformée avec le vecteur pFD55 et en ce que l'expression de la BOD est induite par l'ajout de méthanol. 8. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 pour mesurer la 30 concentration en bilirubine dans un échantillon liquide. 9. Kit de dosage de bilirubine, caractérisé en ce qu'il comprend une BOD selon la revendication 1. 10. Procédé de dosage de la bilirubine en solution d'un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :a) mesure de l'absorbance à = 440 nm dudit échantillon liquide avant réaction enzymatique ; b) introduction dans ledit échantillon liquide d'une BOD selon la revendication 1 ; c) mesure l'absorbance à = 440 nm dudit échantillon liquide après réaction enzymatique ; d) calcul de la différence d'absorbances mesurées aux étapes a) et c) et comparaison avec des différences d' absorbances mesurées pour des solutions standards ayant une teneur en bilirubine connue ; e) détermination de la concentration en bilirubine dudit échantillon liquide. 11. Utilisation d'une BOD selon la revendication 1 pour dégrader la bilirubine présente dans un échantillon. 12. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 comme réactif dans une composition de teinture d'oxydation des fibres kératiniques. 13. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 pour le traitement de pâte à papier. 14. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 pour la décoloration de colorants utilisés en milieux industriels. 15. Electrode à BOD comprenant un matériau conducteur recouvert d'un dépôt comprenant au moins une BOD selon la revendication 1. 16. Biocapteur de bilirubine, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode selon la revendication 15. 17. Capteur à oxygène, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode selon la revendication 15. 18. Biopile enzymatique comprenant une anode sur laquelle est 25 immobilisée une enzyme catalysant une réaction d'oxydation et une électrode selon la revendication 15 à titre de cathode.