Brevet FR2962298A1 — publié le 20120113

Procédé de transformation du blé La présente invention concerne des procédés améliorés de transformation de plantes et plus particulièrement du blé permettant d'insérer de façon stable des grands fragments d'ADN 5 intacts en simple copie dans le génome du blé. De nos jours, la transformation génétique est devenue un outil incontournable pour étudier le génome des plantes. Elle se révèle particulièrement utile pour étudier et valider les fonctions de gènes préalablement identifiés par des études de cartographie génétique, ou encore pour étudier les mécanismes de régulation de l'expression des gènes. Depuis les 10 premiers essais de transformation de plantes les techniques ont beaucoup évolué, et même si le blé demeure une plante difficile à transformer, il est actuellement possible d'obtenir des blés exprimant différents transgènes, de manière stable, avec une bonne efficacité. L'étape suivante dans l'amélioration des techniques de transgénèse consiste à essayer d'introduire dans le génome des plantes de grands fragments d'ADN intacts. L'intérêt de cette 15 technologie est de pouvoir étudier en une seule étape de transformation des caractères multigéniques tels que des résistances aux maladies ou des processus métaboliques complexes. Il serait également particulièrement intéressant de pouvoir étudier dans leur contexte natif des gènes accompagnés de leurs éléments de régulation, qui peuvent parfois se trouver très éloignés de la région contenant la séquence codante. Un autre intérêt consiste à 20 pouvoir introduire des fragments d'ADN génomique de grande taille (clones BACs) identifiés par des études de cartographie dans le but d'accélérer les projets de clonage positionnel en évitant d'avoir à sous cloner les inserts en fragments plus petits. Il serait particulièrement intéressant de pouvoir disposer de telles technologies chez le blé qui est une des céréales les plus cultivées au monde. Cependant, bien que plusieurs études 25 décrivent l'insertion stable de fragments d'ADN de taille supérieure à 50Kb chez plusieurs variétés de plantes (tabac : Hamilton et al. 1996 ; Mullen et al.1998 ; Tomate : Frary et al. 2001 ; riz : Phan et al. 2006 ; Chen et al. 1998 ; pomme de terre : Ercolano et al. 2004), les succès de cette technologie demeurent encore très limités, et à notre connaissance, aucune transformation de cette sorte n'a été réalisée chez le blé à ce jour. 30 En effet, l'amélioration génétique des plantes cultivées peut contribuer à une agriculture plus respectueuse de l'environnement et à une meilleure productivité. Depuis une vingtaine d'années, un des outils permettant d'obtenir une amélioration génétique est la transgénèse. A ce jour, tous les ADN utilisés pour la transgénèse végétale, qu'ils soient d'origine intra ou interspécifiques, résultent de reconstructions réalisées à partir de plusieurs fragments d'origines différentes. De ce fait, les plantes résultantes sont qualifiées d'OGM (Organismes Génétiquement Modifiés). L'autoclonage consiste à transférer un fragment d'ADN natif (par exemple un fragment d'ADN génomique contenant un gène complet et ses régulations) au sein de la même espèce ou d'une espèce voisine sexuellement compatible sans reconstruction préalable, sans utiliser de marqueur de sélection et sans ajouter ou modifier une seule base par rapport à la séquence native. La plante résultante, bien que génétiquement modifiée, n'est pas a priori un OGM car la modification génétique induite ne diffère en rien d'une duplication de gène ou d'une insertion d'ADN chloroplastique, événements aujourd'hui clairement décrits. A ce jour, néanmoins, la notion d'autoclonage ne s'applique en Europe, par définition, qu'aux micro-organismes. L'amélioration génétique des plantes par autoclonage permettrait donc d'obtenir des plantes impossibles à obtenir par des techniques de sélection classiques, pour lesquelles on peut attendre un gain génétique significatif, sans franchir la barrière des espèces ou utiliser d'ADN recombinant. Cependant, des techniques de transformation appropriées permettant d'insérer de 15 façon stable des grands fragments d'ADN intacts en simple copie n'ont pas été décrites à ce jour. Plusieurs techniques sont actuellement utilisées pour réaliser la transformation génétique chez les plantes, chacune présentant des avantages et des inconvénients. La transformation par Agrobactérium est la technique la plus couramment utilisée, notamment 20 pour transférer des BACs entiers (BiBACs) contenant de grands inserts d'ADN. Elle est particulièrement utilisée pour la cartographie génétique et le clonage positionnel de gènes qui nécessite de déterminer, par complémentation fonctionnelle dans quel(s) clone(s) se situe le(s) gène(s) étudié(s). Cette technique reste cependant assez difficile à utiliser chez le blé, avec de très faibles rendements de transformation, ce qui est incompatible avec des études à haut 25 débit. D'autre part, il a été démontré récemment que les évènements de transformation obtenus par cette technique pouvaient se révéler instables, des réarrangements pouvant intervenir dans le génome de la plante hôte après transformation, ou même dans le génome de l'agrobactérie, avant la transformation. Un autre inconvénient majeur de cette technologie est la présence non désirée de fragments d'ADN bactérien dans le génome de la plante 30 transformée, ce qui est incompatible avec la notion d'autoclonage (i.e. transfert de séquences intègres provenant uniquement de la même espèce ou d'une espèce sexuellement compatible). Pour pallier à ces inconvénients, de nouvelles techniques de biolistique utilisant des cassettes minimales ont été développées récemment. Ces cassettes ne contiennent que le gène d'intérêt, son promoteur et une séquence terminateur, qui sont directement accolées sur les micro- particules. Des plantes transgéniques ont été obtenues par cette technique chez le riz, la pomme de terre, le raisin et dernièrement chez le blé (Fu et al. 2000 ; Romano et al. 2003 ; Vidal et al. 2006 ; Yao et al. 2006 ; Gadaleta et al. 2008). Ces procédés ne permettent cependant pas d'obtenir des évènements d'insertion simples sans réarrangement des segments d'ADN intégrés. La présente invention concerne un procédé de transformation par biolistique avec des segments d'ADN déphosphorylés permettent d'obtenir des plantes transgéniques avec un unique évènement d'intégration et une plus grande stabilité de l'expression du transgène. Grâce à ces procédés il est maintenant possible d'insérer de grands fragments d'ADN intacts, en une seule copie fonctionnelle dans le génome du blé notamment pour reproduire le plus fidèlement possible la complémentation allélique dans son contexte natif, transférer un gène avec l'ensemble de ses séquences régulatrices ou transférer plusieurs transgènes en une seule étape (étude des caractères multi-géniques comme par exemple les résistances aux maladies ou bien encore l'étude de voies métaboliques). RESUME DE l'INVENTION L'invention se rapporte à des procédés d'obtention de plants de blé transformés comprenant le bombardement de cellules de blé avec des particules chargés avec de l'ADN puis la régénération de plants de blé à partir desdites cellules de blé dans lesquels les particules sont chargées avec un fragment d'ADN linéaire déphosphorylé. De préférence, les particules sont chargées avec moins de ing d'ADN/µg de particules et de préférence moins de 0,01ng d'ADN/µg de particule. De préférence, les cellules sont bombardées avec 100 µg de particules. Dans des modes de réalisation préférés, les cellules de blé sont des embryons immatures. Dans un mode de réalisation, le fragment ADN comprend au moins une cassette d'expression. De préférence, le fragment d'ADN a une taille supérieure ou égale à 40kb. Dans un autre mode de réalisation, le fragment d'ADN est un ADN génomique natif comprenant au moins un gène et ses éléments de régulation. De préférence, le fragment d'ADN est un ADN génomique natif issu du blé ou d'une espèce sexuellement compatible. De préférence, le fragment d'ADN ne comprend pas de marqueur de sélection. De préférence, les plants de blé obtenus après régénération sont criblés par PCR et/ou par Southern blot pour la présence dudit fragment d'ADN dans leur génome. De préférence, les plants de blé obtenus après régénération sont criblés lorsqu'ils ont atteint au moins le stade plantule à trois feuilles. DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention concerne des procédés de transformation de plantes, plus particulièrement du blé permettant l'intégration dans le génome de grands fragments d'ADN 10 intacts. Les données expérimentales montrent que des réarrangements du fragment d'ADN introduit dans le génome ne sont pas observés ou du moins sont très peu fréquents lorsque la transformation est effectuée par bombardement avec des particules chargées de fragments d'ADN linéarisés et déphosphorylés. En outre, les procédés selon la présente invention permettent l'insertion d'une seule copie dudit fragment d'ADN. 15 Par la transformation d'une plante, on entend l'introduction stable d'un fragment d'ADN étranger dans le génome de cette plante. L'invention se rapporte donc à un procédé d'obtention de plantes transformés comprenant le bombardement de cellules avec des particules chargées avec de l'ADN puis la régénération de plants à partir desdites cellules caractérisé en ce que les particules sont 20 chargés avec un fragment d'ADN linéaire déphosphorylé. De préférence, le procédé selon l'invention est appliqué au blé. Par plantes ou plants transformés, on entend des plantes comprenant des cellules dans le génome duquel un fragment d'ADN exogène a été introduit de façon stable. Les procédés de transformation selon l'invention s'appliquent à toutes les plantes 25 pouvant être transformées par biolistique et plus particulièrement au riz (Oryza sativa), au maïs (Zea mays), au tabac (Nicotiana tabacum) et au blé. De préférence, les procédés de la présente invention se rapportent à la transformation du blé. Le terme « blé » désigne de façon générale des céréales appartenant au genre Triticum. En particulier, on citera Triticum aestivum (blé tendre), Triticum durum (blé dur) et Triticale 30 turgidocereale (triticale, une espèce dérivée du blé) pour ce qui est des espèces d'intérêt agronomique. Dans les procédés de la présente invention, la transformation est effectuée par bombardement de cellules végétales avec des particules chargées d'un fragment d'ADN. Selon l'invention, ce fragment d'ADN est un fragment d'ADN linéaire et déphosphorylé.5 Selon la présente invention, on entend par "ADN" une chaine polynucléotidique et de préférence une chaine polynucléotidique double brin. Le terme « ADN » désigne également des chaines polynucléotidiques modifiées. Lorsque l'ADN utilisé pour la transformation provient d'un ADN circulaire tel que par 5 exemple un vecteur ou un plasmide, l'ADN est linéarisé avant la transformation. Cette linéarisation est typiquement effectuée avec des enzymes de restriction. Le fragment D'ADN utilisé pour la transformation est un fragment d'ADN déphosphorylé. L'expression « déphosphorylé » désigne un ADN ayant été traité avec une enzyme de type phosphatase. Ces enzymes catalysent la déphosphorylation des extrémités 5' 10 d'un fragment d'ADN. Cette déphosphorylation est typiquement effectué avec une phosphatase alkaline ou l'antartic phosphatase. Le fragment d'ADN mis en ouvre dans les procédés selon la présente invention est donc un fragment d'ADN linéaire et déphosphorylé. Ce fragment est introduit dans le génome de le plante ou des cellules végétales à transformer par biolistique. 15 Les techniques de transformation par biolistique sont bien connues de l'homme du métier. Toute méthode appropriée pourra être employée dans les procédés de la présente invention. Typiquement, les cellules végétales à transformer sont bombardées avec des microparticules chargées ou enrobées d'ADN. Ces microparticules sont par exemple des microbilles d'or ou de tungstène dont le diamètre est de l'ordre du micron. Au contraire de la 20 transformation avec Agrobacterium tumefaciens, la transformation par biolistique ne nécessite pas la présence de séquences exogènes pour permettre l'intégration du fragment d'ADN dans le génome des cellules végétales. Avantageusement, les procédés selon la présente invention mettent en ouvre une faible quantité d'ADN pour la transformation par biolistique. Cette faible quantité d'ADN combinée 25 à la linéarisation et à la déphosphorylation du fragment d'ADN permet d'insérer ledit fragment d'ADN en une seule copie dans le génome. De préférence, les particules sont chargées, pour chaque tir, avec moins de 100 ng et plus de 1 ng d'ADN pour 100 µg de particules. Les procédés de la présente invention comportent donc le bombardement de 30 cellulesvégétale. Par « cellules végétales », on entend toute cellule végétale, tout tissu végétal ou encore tout organe dérivé d'une plante. Toute cellule, tissu ou organe permettant la régénération d'une plante peut être utilisée dans les procédés de transformation selon la présente invention. De préférence, les cellules végétales sont des cellules de blé. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules végétales proviennent d'embryons immatures. Dans d'autres modes de réalisation, les cellules végétales sont des apex, des fragments de feuilles, des protoplastes, des chloroplastes, des embryons matures, ainsi que des tissus issus de culture in vitro. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules de blé proviennent d'embryons immatures. Dans d'autres modes de réalisation, les cellules de blé sont des apex, des fragments de feuilles, des protoplastes, des chloroplastes, des embryons matures, ainsi que des tissus issus de culture in vitro. Après le bombardement avec le fragment d'ADN linéarisé et déphosphorylé, un plant 10 est régénéré à partir des cellules ou du tissu bombardé. Cette étape de régénération de plants est effectuée selon les techniques habituelles. Dans certains modes de réalisation de l'invention, le fragment d'ADN mis en oeuvre pour la transformation comprend une cassette d'expression. Par « cassette d'expression », on entend un ADN recombinant comprenant les éléments nécessaires à l'expression d'une 15 séquence. Cette expression comprend la transcription et éventuellement la traduction de ladite séquence. Avantageusement, ces cassette d'expression comprennent à la fois des éléments permettant l'expression par une cellule hôte ou un organisme hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Typiquement, ces cassettes d'expression comprennent dans le sens de la transcription: 20 - un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; - un polynucléotide; - une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte. Tout type de séquence promotrice peut être utilisé dans les cassettes d'expression selon l'invention. De préférence, les cassettes d'expression de la présente invention permettent 25 l'expression de polynucléotides ou de polypeptides dans les plantes, les graines, les tissus végétaux et les cellules végétales et plus particulièrement pour l'expression dans les plantes du genre Triticum. Ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier. Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression des polypeptides ou des polynucléotides. On 30 peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans la cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. Les procédés de la présente invention permettent d'insérer un fragment d'ADN de grande taille dans le génome d'une plante et plus particulièrement d'une plante du genre Triticum. Cette insertion s'effectue en conservant le fragment d'ADN intact et en évitant tout réarrangement ou toute délétion au sein de ce fragment. Les procédés de la présente invention permettent d'obtenir des plantes, notamment du blé, transformées de façon stable par intégration d'un fragment d'ADN autologue dans leur génome. Par transformation stable, on entend que l'insertion du fragment d'ADN autologue est conservée dans la descendance. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, le fragment d'ADN à une taille supérieure ou égale à 20, 40, 50, 100, 200, 300, 400 ou 500kb. Avantageusement, les procédés de la présente invention permettent d'insérer dans le génome d'une plante, plus particulièrement d'une plante du genre Triticum, un fragment d'ADN génomique natif comprenant au moins un gène et ses éléments de régulation. En effet, il devient possible de transformer une plante avec un fragment génomique complet plutôt que d'avoir recours à des cassettes d'expression. De préférence, le fragment d'ADN inséré dans le génome est un ADN génomique autologue c'est-à-dire un ADN génomique natif issu de la plante transformée ou d'une espèce sexuellement compatible. Cet ADN génomique natif ne comprend pas de séquence nucléotidique exogène qui ne serait pas présente dans la plante ou dans une espèce sexuellement compatible. De préférence, la plante transformée est le blé et le fragment génomique inséré dans le génome est un ADN génomique autologue c'est-à-dire un ADN génomique natif issu du blé ou d'une espèce sexuellement compatible. Cet ADN génomique natif ne comprend pas de séquence nucléotidique exogène qui ne serait pas présente dans le blé ou dans une espèce sexuellement compatible. Les procédés selon la présente invention permettent donc d'obtenir des plantes transformées ne comportant aucune séquence exogène aux plantes du genre Triticum ou aux 30 plantes sexuellement compatibles avec le blé. De façon particulièrement avantageuse, le fragment d'ADN ne comprend pas de marqueur de sélection. Dans un mode de réalisation, le fragment d'ADN a des extrémités rases. Classiquement un marquer de sélection tel que par exemple un gène de résistance à un herbicide est utilisé pour sélectionner les cellules ou les plantes transformées. Dans les procédés selon la présente invention, le taux de transformation ou le taux d'insertion du fragment d'ADN dans le génome est suffisamment élevé pour ne pas nécessiter l'utilisation d'un tel marqueur de sélection. Ainsi, l'introduction d'un marqueur de sélection exogène n'est pas nécessaire. Lorsque le fragment d'ADN mis en oeuvre dans les procédés de la présente invention ne comporte pas de marqueur de sélection, les plants obtenus après régénération sont avantageusement criblés par PCR et/ou par Southern blot pour détecter la présence dudit fragment d'ADN dans leur génome. Pour le blé, ce criblage est préférentiellement effectué sur des plants régénérés ayant atteint au moins le stade trois feuilles. Les procédés selon la présente invention permettent donc d'obtenir des plants, notamment des plants de blé, transformés par autoclonage. L'autoclonage consiste à transférer un fragment d'ADN natif (par exemple un fragment d'ADN génomique contenant un gène complet et ses régulations) au sein de la même espèce ou d'une espèce voisine sexuellement compatible sans reconstruction préalable, sans utiliser de marqueur de sélection et sans ajouter ou modifier une seule base par rapport à la séquence native. FIGURES Figure 1 : Méthodologie d'obtention de plantes de blé autoclonées EXEMPLES Exemple 1 : transformation du blé - Déphosphorylation - 11_tg de fragment D'ADN - 1 µl d'Antartic Phosphatase - 51..ti de tampon 10X (tampon 1X450mM Bis Tris-Propane, lmM MgC12, 0,1 mM ZnC12, pH 6,0 à 25°C) 4 Incubation 2 heures à 37°C 4 L'enzyme est inactivée 5 minutes à 65°C - Mise en culture des embryons immatures Il faut travailler de façon stérile, sous une hotte de culture. - Récolter une quinzaine d'épis dont les embryons font environ lmm. - Récupérer les grains et les mettre dans un bécher contenant une solution d'hypochlorite de sodium à 20% dans de l'eau avec une goutte de teepol. Agiter avec un barreau aimanté pendant 20 minutes sous la hotte de culture. - Rincer avec de l'eau distillée stérile. - Se placer sous une loupe et couper la pointe du grain (axe embryonnaire) avec un angle de 30 à 35° à l'aide d'un scalpel. - Les placer face axe embryonnaire sur le milieu plasmolysant (MSE3 15% de maltose). Une vingtaine d'embryons sont déposés au centre d'une boîte de façon à former une petite pastille. - Préparer au maximum 10 boîtes pour une série de tirs. - Laisser dans le noir à 24°C pendant 2 à 4 heures. - Préparation des billes d'or pour le tir - Peser 250 mg de billes et les laver à l'eau distillée stérile. - Centrifuger, éliminer le surnageant et laver à l'éthanol 70%. - Centrifuger, éliminer le surnageant et reprendre le culot dans 5 ml d'éthanol 100%. - Aliquoter par 20 pl dans des tubes eppendorf stériles (conservation à -20°C). - Prendre un tube par série de tir et soniquer 1minute à la cuve à ultrasons. - Ajouter l'ADN (10 µl) et vortexer légèrement. - Dans le bouchon mélanger 50 µl de CaC12 2,5M et 20 µl de spermidine 0,1M et enfin refermer le bouchon puis vortexer 15 minutes à 1 500 tpm. - Centrifuger 20 secondes et éliminer le surnageant. - Laver avec 200 µl d'éthanol 100% puis centrifuger. - Jeter le surnageant et reprendre le culot dans 100 µl d'éthanol 100%. Garder dans la glace. Utiliser 10 µl par tir et toujours homogénéiser avant chaque prélèvement. - Bombardement 1. Matériel utilisé : - Le canon à particule Dupont pds 1000® - Disques de rupture 900 PSI - Bouteille HE, 1500 PSI - Macro-carriers - Micro-carriers 5 10 15 20 25 30 2. Stériliser les macro-carriers en les trempant rapidement dans l'éthanol 100% et les disques de rupture dans l'isopropanol, laisser sécher. 3. Les échantillons à bombarder sont placés au troisième cran en partant du bas. 4. Voir la procédure d'utilisation du canon Dupont®. Exemple 2 : milieux de culture Le milieu : Murashige et Skoog (MS) réf MO222 (duchefa) Les quantités sont données pour 1 litre Utilisation d'eau osmosée * les produits rajoutés après que le milieu Milieu plasmolysant MS micro+macro+vitamines Maltose Asparagine Thiamine HCL Agar *2-4-D (lmg/ml) pH 5,7 avec KOH Milieu de callogénèse (MSE3) MS micro+macro+vit Sucrose Asparagine Thiamine HCL Agar 8g *2-4-D (lmg/ml) pH 5,7 avec KOH Milieu de régénération sans MS micro+macro+vit Sucrose Asparagine Thiamine HCL Agar *IAA ait été autoclavé 4,4g 100g 0,150g 0,04g 8g 2,5m1 4,4g 60g 0,150g 0,04g 2,5m1 sélection (MSR) 4,4g 20g 0,150g 0,04g 8g 0,5m1 *BAP 1ml pH 5,7 avec KOH Exemple 3 : Transformation avec une cassette PMI - Matériels et Méthodes Construction du transgène La cassette PMI, contenant le promoteur ubiquitine, le gène PMI et le terminateur nopaline synthétase (Tnos), a été purifiée par digestion enzymatique (double digestion Notl et HindIII). La cassette pmi est alors déphosphorylée comme décrit ci-dessus pour empêcher les concatémerisations (association des molécules entre elles) et donc les insertions multiples. L'intégrité de la cassette est vérifiée sur un mupid à 1% d'agarose. Transformation des embryons Des extractions d'embryons sont réalisées suivant le protocole énoncé ci-dessus. Des épis de blé sont récoltés puis égrainés. Les grains sont stérilisés et coupés à l'aide d'un scalpel pour récupérer les embryons immatures. Ces derniers sont placés sur un milieu plasmolysant. Le bombardement des embryons immatures (50 par boite) par les particules d'or recouvertes de la cassette PMI (20ng/µl par boite) est décrit ci-dessus. Régénération des plantules Après avoir effectuée la transformation, les embryons sont placés 24 heures sur milieu plasmolysant puis 15 jours sur milieu de callogénèse (MSE3) en chambre de culture au noir, à 27°C. Les cals, bombardés avec la cassette PMI, sont placés sur milieu MSR sans sélection. Ils sont placés à la lumière, à 22°C pendant un mois avec un repiquage sur un milieu neuf après 15 jours. Analyse des plantules Extraction d'ADN : Des morceaux de feuilles des plantules régénérées (MSR sans sélection), sont prélevés sous une hotte puis mis dans des tubes numérotés. Chaque tube contient un mélange de matériel vivant (10 à 20 mg) prélevé sur quatre plantules. Ces mêmes plantes sont placées sur un milieu d'enracinement (MSO) à la lumière, à 19°C pendant environ 3 semaines. Les échantillons sont broyés avec un pilon dans 140 pI de tampon d'extraction (0,1M tris base ; 0,05M EDTA ; 0,5M NaCl ; 0,02M bisulfite de sodium). Les tubes sont mélangés par inversion, percés avec une aiguille, placés au bain marie (94°C, 1h) et centrifugés (10 mn, 14 000 rpm). 120 µl du surnageant sont transférés dans de nouveaux tubes avec de l'isopropanol (120 µl) et de l'acetate d'amonium 7,5M (15 µl). Les échantillons sont posés 5 mn dans la glace, centrifugés (10 mn, 4°C, 14 000 rpm) puis vidés par retournement. On ajoute de l'éthanol 70% (400 µl). Après centrifugation (5 mn, T° ambiante, 14 000 rpm), le surnageant est retiré et les culots sont séchés à l'étuve (quelques heures) puis repris dans 20 µl de TE 10/0,1 (fris EDTA). Analyse PCR : Un pré-screening PCR est nécessaire afin d'éviter un trop grand nombre d'analyse par southern blot. Une analyse par PCR est réalisée avec l'ADN extrait afin de vérifier l'intégration de la cassette PMI dans le génome des plantes après régénération. On utilise 50 ng d'ADN génomique total et une TaqDNA polymérase (Qiagen). La réaction de PCR est réalisée dans les conditions préconisées par le fournisseur. Le témoin négatif est réalisé avec la même quantité d'ADN d'une plante non transformée, tandis que le témoin positif est réalisé en mélangeant l'ADN d'une plante positive (transformée avec le gène PMI) et 3 plantes non transformées. Le produit d'amplification est visualisé sur un gel d'agarose à 2% coloré au BET. Analyse par Southern blot : L'ADN génomique des plantes est extrait à partir de jeunes plantes de blé utilisant une méthode modifiée au cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). 15 microgrammes d'ADN sont digérés toute la nuit à 37°C par EcoRV. Les contrôles négatifs sont obtenus avec de l'ADN de Triticum aestivum Bobwhite S26. Les fragments d'ADN génomique sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0.7% et transférés dans des conditions salines et alcalines sur une membrane de nylon (Biorad) selon les instructions du fournisseur. La sonde utilisée est spécifique de la séquence complète de la cassette contenant le promoteur, la séquence codante et le terminateur. L'hybridation southern est réalisé dans les conditions décrites par Barret et al. (1998). - Résultats Les plantules sont analysées par PCR après seulement 3 semaines de régénération. Chaque échantillon est constitué du mélange de l'ADN de 4 plantes préalablement identifiées. 14 échantillons sont déposés sur un gel d'agarose puis coloré au BET. On détecte la présence du transgène par une bande d'environ 550bp. Les analyses montrent que 10 mélanges sur 14 sont positifs et indiquent la présence de l'ADN du transgène dans les échantillons. Seules les plantes (soit 40 plantes) correspondant aux mélanges positifs sont conservées, afin de les analyser individuellement par Southern. L'analyse par Southern blot des 40 plantes montrent que seulement une seule d'entre elles sur la dizaine attendue est positive. Il semble que le screening réalisé à ce stade du développement des plantules soit trop précoce, car de l'ADN ayant servi à bombarder les embryons est encore présent. Des analyses par PCR à un stade plus tardif (stade trois feuilles des plantules) ont montré l'absence d'ADN résiduel. Les expérimentations ont été conduites sur 100 embryons immatures de blé, 56 plantules ont été régénérées et une seule plante a été détectée comme positive. On peut donc estimer l'efficacité de transformation sans sélection à environ 1%. Exem.le 4 : Obtention de blés trans éni. ues avec une insertion sim.le et une ex.ression stable par biolistique - Construction des ADN avec les gènes bar et pmi BAR: Préparation du plasmide : Les cassettes « bar » utilisées pour la transformation sont constituées du promoteur ubiquitine de maïs, de la région codant pour le gène bar et du terminateur nos. Cette séquence est amplifiée par PCR à partir du plasmide PAHC25 (Christensen and Quaire, 1996) à l'aide des amorces désignées ci-dessous contenant les séquences du promoteur et du terminateur auxquels on ajoute les sites de recombinaison attB ainsi que les sites de restriction AatII : 5'[GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGACGTCACATGAAGCTTGCTGCAGTG]3' (SEQ ID NO 3) 5' [GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGACGTCC GAATTCTCATGTTTGACAG] 3' (SEQ ID NO :4). Le fragment PCR obtenu est alors introduit par recombinaison entre les sites attB du vecteur GATEWAY pDONRP2R-P3 (Invitrogen). Le plasmide est extrait et purifié à l'aide d'un kit (Qiagen®) suivant les instructions du fournisseur. Ce plasmide pDONRP2RP3 contenant la cassette avec le promoteur ubiquitine, le gène bar et le terminateur nos est appelé « pubiBAR ». Préparation de cassettes purifiées: La cassette contenant le gène bar est extraite par digestion enzymatique avec une endonucléase AatIII, puis séparée de la séquence plasmidique sur un gel d'agarose 0.5%. Ce gel de séparation est réalisé avec deux rangées de puits : le premier sert à charger les échantillons et le second sert à récupérer l'ADN au moment du passage de la cassette. L'ADN étant détecté sous UV en présence de BET. La préparation de cassettes ainsi récupérée est alors purifiée par 2 lavages au 2-butanol, et un lavage à l'éther, ceci permet d'éliminer le BET. Enfin, l'ADNest concentré par précipitation à l'éthanol, puis repris dans du TE (Tris 10mM, EDTA lmM) à une concentration de 500ng/µl, il est appelé « cassettes bar ». Déphosphorylation des cassettes: La déphosphorylation des cassettes contenant le gène bar est réalisée à l'aide de l'antartic phosphatase (New England BioLabs®, Beverly, 14 USA) suivant les instructions du fournisseur. L'enzyme est ensuite désactivée à 65°C pendant 5 minutes puis éliminée par précipitation de l'ADN. Le fragment d'ADN obtenu est appelé « cassettes bar dephosphorylées ». PMI : Préparation du plasmide : Un fragment de pNOV2820 contenant le gène manA dérivé d'E. coli aussi appelé pmi par Wright et al. (2001), a été placé sous promoteur ubiquitine et terminateur nos dans pAHC17 (Christensen and Quail, 1996). Ce plasmide est extrait et purifié dans les mêmes conditions que celles décrites pour pubiBAR et il est appelé pubiPMl. Préparation et déphosphorylation de cassettes purifiées : Les cassettes contenant le gène pmi sont produites par une double digestion enzymatique du plasmide pubiPMl avec deux endonucléases de restriction HindIll et Notl. La purification et la déphosphorylation des cassettes sont réalisées dans les mêmes conditions que celles décrites pour les cassettes contenant le gène bar, décrites ci-dessus. Les fragments d'ADN obtenus sont appelés respectivement « cassettes pmi » et « cassettes pmi déphosphorylées ». Préparation de cassettes par PCR : Afin de comparer l'efficacité de transformation entre une cassette produite par digestion enzymatique et une cassette amplifiée par PCR, la cassette contenant le gène pmi sous le contrôle du promoteur ubiquitine et du terminateur nos, est amplifiée avec les amorces suivantes : 5'[GTGCAGCGTGA000GGTCGTG]3' (SEQ ID NO : 5)-5'[CGAATTCGGTA000AATTCCC]3' (SEQ ID NO : 6). La réaction PCR est réalisée avec une Taq DNA polymérase (Qiagen) selon le protocole décrit par Barret et al. 1998. L'ADN est récupéré par précipitation à l'éthanol et repris dans du TE (Tris 10 mM, EDTA 1mM), puis ajusté à différentes concentrations (500, 50, 5 et 1 ng/µl). L'ADN ainsi obtenu est appelé PAC (PCR Amplified Cassettes). - Matériel végétal et protocole de transformation Le génotype de blé utilisé pour toutes les expérimentations est Triticum aestivum cv. Bobwhite S26. Les plantes mères produisant les embryons immatures nécessaires à la transformation sont produites dans une chambre de culture sous conditions contrôlées (16 heures de jour à 18°C et 8 heures de nuit à 15°C). Les embryons immatures sont prélevés entre 12 et 14 jours après floraison. Ils sont ensuite stérilisés et isolés pour le bombardement. Les expériences de transformation, les étapes de régénérations et de sélection (bar) sont réalisées dans les conditions décrites par Pellegrineschi et al. (2002). La sélection des évènements de transformation obtenus avec le gène pmi est réalisée selon le protocole décrit par Wright et al. (2001). - Analyse des plantes transgéniques Analyse par Southern blot L'ADN génomique des plantes est extrait à partir de jeunes plantes de blé utilisant une méthode modifiée au cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Tassy et al., 2006). 15 microgrammes d'ADN sont digérés toute la nuit à 37°C avec les enzymes appropriées (EcoRI et HindIll respectivement pour les évènements bar et pmi). Le nombre de copies insérées dans le génome de la plante est estimé avec deux contrôles positifs. Ces témoins sont réalisés en digérant les plasmides avec la même enzyme que les échantillons. Une quantité d'ADN correspondant à 1 et 5 copies est utilisée en tenant compte de la taille du plasmide et de celle du génome du blé (5.103 et 32.109 paires de bases). Les contrôles négatifs sont obtenus avec de l'ADN de Triticum aestivum Bobwhite S26. Les fragments d'ADN génomique sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0.7% et transférés dans des conditions salines et alcalines sur une membrane de nylon (Biorad) selon les instructions du fournisseur. Les sondes d'ADN A et B pour les gènes bar et pmi, respectivement sont utilisées pour l'analyse de toutes les plantes transgéniques. La sonde A (1398 bp) est spécifique de la séquence 5' du promoteur ubiquitine de la cassette contenant le gène bar et la sonde B est spécifique de la séquence complète de la cassette contenant le promoteur, la séquence codante et le terminateur. L'hybridation southern est réalisée dans les conditions décrites par Barret et al. (1998). Analyse de l'expression du gène bar La résistance des plantes à l'herbicide est testée sur la base d'un protocole détaillé par Weeks et al. (1993). La traitement à la phosphinotricine (PPT) est appliqué en pulvérisant une solution contenant 150 mg.l-1 de PPT and 0.1% de Tween sur des plantules au stade trois feuilles. L'expression du gène bar est obtenue en comparant la nécrose après 4 jours à une plante témoin Bobwhite S26 non transformé. Analyse de la descendance (T1 et T2) L'ADN génomique est extrait à partir de jeunes feuilles utilisant une méthode modifiée au cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Tassy et al., 2006). La détection du gène bar est réalisée par PCR en utilisant 50 ng d'ADN génomique total et une TaqDNA polymérase (Qiagen) et la combinaison des amorces suivantes : 5'[GTGCAGCGTGA000GGTCGT]3' (SEQ ID NO : 7) - 5'[CCTGTTGTCAAAATACTCAATTGTCC]3' (SEQ ID NO : 8). La réaction de PCR est réalisé dans un volume final de S0µ1 contenant 1X de tampon (Qiagen) avec 1.5 mM MgC12, 150 µM de dNTP, 20 pmole de chaque amorce, 1 unité de Taq polymérase (Qiagen). Le programme permettant l'amplification est réalisé grâce à un thermocycleur MJ research PCR avec un cycle à 94°C/3 min, 35 cycles à 94°C/30 s, 55°C/30 s, 72°C/30 s et une extension finale de 72°C/5 min. Le produit d'amplification est visualisé sur un gel d'agarose à 3% coloré au BET. - Résultats Différentes constructions avec deux marqueurs de sélection différents ont été testées pour étudier l'impact de la déphosphorylation de l'ADN ainsi que la quantité d'ADN utilisé sur la transformation génétique du blé. Au total, 7687 embryons immatures ont été bombardés (2406 avec le gène bar et 5281 avec le gène pmi) et 292 plantes transgéniques ont été régénérées et analysés (50 et 242 pour les gène bar et pmi, respectivement). Pour chaque marqueur, on a utilisé deux construits différents les cassettes contenant le gène (purifiée après digestion enzymatique) et les cassettes déphosphorylées. Les résultats obtenus sont comparés avec ceux obtenus en utilisant les plasmides pubiBAR et pubiPMl. Pour le gène pmi, deux autres paramètres ont été testés, l'utilisation de cassettes produites par PCR (PAC) et la quantité d'ADN (de 500ng/µl à ing/µl) utilisée pour la transformation. La présence d'ADN plasmidique dans les plantes transgéniques a été analysée par hybridation southern avec une sonde correspondant à la séquence des vecteurs pDONRP2R-P3n' et pAHC17 pour bar et pmi, respectivement. Les seuls échantillons qui montrent une hybridation positive sont les plantes ayant été transformées avec le plasmide entier. Il n'y a aucune présence de séquence plasmidique dans les évènements de transformation obtenus avec les cassettes, les cassettes déphosphorylées ou les PACs. Ce résultat permet donc d'affirmer que l'utilisation de cassettes pour la transformation génétique du blé par biolistique permet d'obtenir des plantes transgéniques sans contamination de séquence plasmidique. La déphosphorylation des cassettes permet d'obtenir des évènements avec des profils d'intégration simple, une expression stable et héritable La déphosphorylation des cassettes a été utilisée pour prévenir la réassociation des fragments d'ADN et ainsi éviter la formation de concaténères ce qui induit alors la production d'événements de transformation présentant de multiples copies du transgène. 292 plantes transgéniques ont été produites, les profils d'intégration ont été comparés avec les plantes obtenus en utilisant le plasmide entier ou les cassettes non déphosphorylées. 16, 13, et 21 plantes transgéniques ont été produites respectivement avec le pubiBAR, les cassettes bar et les cassettes déphosphorylées bar, tandis que 1l, 8, et 10 plantes ont été obtenus avec pubiPMl, cassettes pmi et cassettes déphosphorylées pmi, respectivement. Les profils d'intégration de ces différentes plantes ont été étudiés par hybridation southern sur l'ADN génomique extrait à partir de jeunes feuilles des plantes T0. Une digestion EcoRI est choisie pour l'ADN des plantes issues d'une transformation avec les constructions contenant le gène bar, l'enzyme coupe l'ADN en position 1398 bp, générant des fragments de longueur différente en fonction du site d'insertion. L'hybridation est réalisée avec la sonde A, dans ce cas, un seul fragment hybridé indique une seule insertion en une seule copie dans le génome. L'ADN génomique des plantes transgéniques obtenues avec les constructions contenant le gène pmi est digéré avec HindIII et l'hybridation est réalisée avec la sonde B correspondant à la cassette entière. Dans ce cas un seul fragment hybridé indique que le transgène n'est inséré qu'à un seul endroit dans le génome, afin d'estimer le nombre de copies, l'intensité du signal est comparé à celle du témoin correspondant à une ou à cinq copies. Les plantes transgéniques ne présentant qu'un seul fragment et une intensité comparable au témoin représentant une seule copie est considéré comme un évènement simple. La comparaison des résultats obtenus avec les deux gènes bar et pmi pour une même concentration (500ng/µl) montre que les plantes produites avec les plasmides ont le taux le plus faible d'évènements présentant un profil d'insertion simple (25% et 9% pour pubiBAR et pubiPMl, respectivement). Le pourcentage d'évènements simples augmente de 38 à 50% pour les cassettes bar et cassettes pmi. Le nombre d'évènements simples le plus élevé est obtenu avec les cassettes déphosphorylées avec 57% pour le gène bar et 60% pour le gène pmi. La différence observée entre les évènements obtenus avec cassettes déphosphorylées et les plasmides est significative (z2=9.4; a Afin d'étudier la stabilité du transgène, l'expression du transgène pour les plantes transgéniques obtenus avec le gène bar (pubiBAR, les cassettes bar et les cassettes déphosphorylées bar) a été testée. L'expression de la résistance au bialaphos a été testée sur 40 lignées Tl en vaporisant l'herbicide sur les feuilles des plantules. 2 des 11 lignées transgéniques Ti (18%) montrent une résistance au bialaphos, tandis que 54% (7/13) des lignées transformées avec les cassettes bar ont montré une résistance. Les lignées transformées avec les cassettes déphosphorylées montrent une résistance de 56% (9/16). La différence entre les évènements obtenus avec le plasmide et ceux obtenus avec les cassettes déphosphorylées est significative (z2=3.9; a=0.05), alors que la même observation entre le plasmide et les cassettes n'est pas significative (z2=3.2). Ces résultats prouvent que la 18 transformation par biolistique du blé en utilisant des cassettes déphosphorylées permet d'obtenir une majorité de plantes transgéniques avec des profils d'insertion simple et une bonne expression du transgène. Nos expérimentations montrent également que les évènements obtenus sans séquence plasmidique (cassettes et cassettes déphosphorylées) montrent une augmentation significative (z2=4.4; a=0.05) du taux d'expression dans la descendance par rapport à ceux produits avec le plasmide entier. Stabilité du transgène au cours des générations (Ti et T2) Afin d'étudier la stabilité de l'insertion du transgène (bar), nous avons sélectionné 4 évènements obtenus avec le plasmide, 4 et 7 évènements obtenus respectivement avec les cassettes et les cassettes déphosphorylées. De 9 à 25 grains Ti sont génotypés pour chaque évènement de transformation. Après l'extraction de l'ADN génomique, la présence du transgène est vérifiée par PCR. Les résultats montrent que toutes les plantes analysées transmettent le transgène. Une analyse statistique (x) montre que sur les 15 évènements choisis, 13 présentent une ségrégation 3 :1 indiquant que le transgène est intégré à un simple locus et présente une ségrégation de type mendélienne. La plante n°6 obtenue avec des cassettes déphosphorylées présentant une ségrégation non mendélienne, ceci pouvant être expliqué par la présence du transgène à plusieurs loci. Les plantes 1 et 3 obtenues avec les cassettes déphosphorylées montrent une ségrégation mendélienne en génération Tl. Pour ces deux évènements, la génération T2 est également analysée par PCR afin de détecter la présence du transgène. Ces résultats montrent que le gène est héritable de façon stable en T2. L'utilisation de cassettes par amplification augmente la complexité des profils d'insertion Dans les expérimentations avec le gène pmi, nous avons utilisé deux méthodes différentes pour produire les cassettes : la digestion enzymatique suivie de la récupération sur gel d'agarose après électrophorèse (cassette pmi) et la production par PCR (PAC). La transformation a été réalisée avec ces deux construits. 8 et 12 plantes ont été produites respectivement avec les cassettes pmi et les PACs. L'analyse Southern avec la sonde B montre qu'avec une concentration de 500 ng/µl, 50% des évènements sont simples avec les cassettes pmi alors que seulement 8% montrent un profil d'insertion simple avec les PAC (x =5.06;a=0.05). Ce résultat est comparable avec les plantes obtenues avec le plasmide entier pubiPMl (8%). En conclusion de ces résultats, on peut dire que l'utilisation de ces cassettes produites par PCR n'améliore pas les conditions de transformation par biolistique. On peut expliquer ce résultat par la présence aux extrémités de la séquence d'ADN de polyA liée à la Taq polymérase, ce qui pourrait induire des réarrangements ou des recombinaisons de l'ADN. L'efficacité de transformation n 'est pas affectée par l'utilisation de cassettes déphosphorylées Les toutes premières expérimentations de transformation par biolistique ont été réalisées avec des séquences circulaires de plasmides. Dans ce travail, nous avons utilisé des fragments d'ADN linéaire afin de produire à terme des plantes sans marqueur de sélection. Nous avons calculé les efficacités de transformation pour toutes les expériences réalisées avec le gène pmi. Le taux d'efficacité est estimé en divisant le nombre de plantes produites par le nombre total d'embryons immatures bombardés. Pour une concentration standard de 500 ng/µ1, le taux moyen d'efficacité est de 2.5% si on tient compte de toutes les expérimentations. Les efficacités de transformation sont presque les mêmes pour le plasmide (2%) les cassettes pmi (2.1%), les cassettes déphosphorylées (2.5%) et les PACs (2.7%), indiquant que l'utilisation de cassettes déphosphorylées ne modifient pas l'efficacité de transformation. La transformation avec de faibles quantités d'ADN induit des plantes avec des profils d'insertion simple Afin d'étudier la relation entre la complexité des profils d'insertion des plantes transgéniques et la quantité d'ADN utilisée pour la transformation, nous avons transformé des embryons immatures de blé avec des cassettes pmi à 500 ng/µl, 50 ng/µl et 5 ng/µl d'ADN ; des cassettes déphosphorylées à 500 ng/µl et 5 ng/µl d'ADN ; et des PAC à 500 ng/µl, 50 ng/µl, 5 ng/µl et 1 ng/µl d'ADN. Les profils d'insertion sont étudiés par Southern blot sur de l'ADN génomique extrait à partir des feuille des plantes TO obtenues. On estime alors le nombre d'évènements simples, ces résultats montrent que le taux d'évènements simples augmente pour les PAC de 8 à 46% en passant respectivement de 500 à 1 ng/µl d'ADN utilisé pour la transformation (z2=4.4; a=0.05), avec des taux intermédiaires de 13 et 25% respectivement pour 50 et 5 ng/µl et une efficacité moyenne de 2.7%. Au contraire de ces résultats, les cassettes montrent une augmentation non significative du taux d'évènements simples (z2 L'autoclonage décrit ci-dessous consistant à transférer un gène de blé dans le blé. Nous avons choisi de transformer un blé agronomique (variété Courtot) avec un gène d'intérêt agronomique «pinA ». Ce gène permet l'expression d'une protéine appelée la puroindoline A qui, lorsqu'elle est exprimée a un effet sur la dureté du grain, facilitant l'analyse phénotypique des plantes transgéniques. - Réalisation du transgène : Pin A Préparation du plasmide Le fragment d'ADN utilisé pour la transformation génétique par biolistique contient la séquence codante du gène choisi (pinA) ainsi que ses régulations endogènes (promoteur et terminateur). Cette séquence (2675 bp) est amplifiée par PCR à partir de la banque BAC de la variété Renan à l'aide des amorces désignées ci-dessous contenant les séquences du promoteur et du terminateur auxquels on ajoute les sites de recombinaison attB: 5' [GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGTTTGC GGGGACC CGACT] 3' (amorce 3) 5'[GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCTCCAAAAGCAATTTCCG]3' (amorce 4). La réaction PCR est réalisée avec l'Advantage Genomic LA Polymérase selon les instructions du fournisseur. Le fragment PCR obtenu est alors introduit par recombinaison entre les sites attB du vecteur GATEWAY pDONR221(Invitrogen). Le plasmide est extrait et purifié à l'aide d'un kit (Qiagen) suivant les instructions du fournisseur. Préparation de fragments d'ADN purifiées et déphosphorylées La séquence d'intérêt présente à ses extrémités deux sites permettant une coupure enzymatique et libérant un fragment de 2538bp. Une double digestion Dral et Sapl est réalisée à 37°C pendant une heure. L'utilisation de ces deux sites d'enzymes de restriction situés à l'intérieur du fragment d'ADN permet de libérer un fragment strictement identique à l'ADN natif de blé duquel il est issu. Le fragment d'ADN est séparé de la séquence plasmidique sur un gel d'agarose à 0.7%. IL est récupéré puis purifié, précipité et déphosphorylé, avant d'être utilisée pour le bombardement des embryons immatures de la variété Courtot. Exemple 6 : Méthodologie permettant d'insérer de façon stable des grands fragments d'ADN intègres et en simple copie dans le génome du blé tendre - Principe de la méthode (expérience pilote) 1) Récupérer à partir de clones BACs un fragment d'ADN de grande taille, de séquence aussi éloignée que possible du génome du blé (afin de pouvoir le détecter facilement dans cette espèce) 2) Encadrer ce fragment par deux gènes rapporteurs, qui permettront un premier screening des plantes et une première étape de vérification de l'intégralité du fragment 3) Transformer du blé par biolistique en utilisant ces cassettes « grand fragment » 4) Analyser les plantes pour vérifier le nombre, l'intégrité et la fonctionnalité des insertions - Matériel et méthode 1) Constructions moléculaires Principe : - Faire une première construction, à l'aide du système Gateway (Invitrogen), d'une cassette contenant les deux gènes rapporteurs séparés par un site de clonage multiple qui permettra d'introduire le grand fragment d'ADN et encadrée par des sites enzymatiques qui permettront de sortir la cassette du plasmide, - Introduire cette cassette « gènes rapporteurs » dans un plasmide permettant de recevoir des inserts de grande taille (pBeloBACs) Le grand fragment d'ADN sera ensuite introduit dans ce BAC par ligation classique dans le polylinker. Choix de l'insert : Pour réaliser la cassette d'insertion grand fragment, nous avons choisi d'utiliser un fragment d'ADN d'Arabidopsis thaliana, qui ne présente aucune homologie avec l'ADN de blé (vérification par blast NCBI), et cela dans le but d'éviter une cross-hybridation lors des analyses par Southern. Ce fragment d'ADN devra pouvoir être sorti intact de l'ADN de la plante transformée. Nous avons utilisé le clone F12K22 (43985 pb. Gene bank accession AC079732), fourni par 1'ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center). La séquence d'ADN génomique contenue dans ce clone peut être sortie par l'enzyme Not I, et elle ne comporte pas de sites enzymatiques Asc I, ces deux sites pourront donc être utilisés lors de la construction et du clonage de la cassette grands fragments. Choix des gènes rapporteurs : Nous avons choisi d'utiliser le gène PMI (phosphomannose isomerase), qui nous permettra une première sélection des plantules lors de la régénération sur milieu sélectif, et le gène rapporteur GUS, qui permettra de vérifier la présence de l'autre extrémité de la cassette par un test histochimiques sur les feuilles et les racines des plantules. Choix du vecteur Il faut trouver un vecteur qui possède un site unique de restriction, n'étant pas déjà présent dans la cassette grand fragment. Comme la majorité des vecteurs de clonage pour grands fragments possèdent un site unique Notl qui se trouve dans la cassette, nous avons choisi de modifier un de ces vecteurs (pBe1oBAC11 fourni par NEB) en substituant le site Notl par un site Ascl. Réalisation de la construction : - Les gènes PMI et GUS sont récupérés par amplification PCR à partir de plasmides existant au laboratoire et clonés respectivement dans les entrées 1 et 3 du système Gateway en rajoutant un site enzymatique Ascl à chaque extrémité, suivant les instructions du fournisseur. Ces deux gènes seront séparés par un site Notl, cloné dans l'entrée Gateway N° 2. La cassette résultante « gènes rapporteurs » est excisée par digestion Ascl, puis introduite par ligation dans le vecteur pBe1oBAC11 modifié, de façon à obtenir une première construction « gènes rapporteurs ». -L'insert grand fragment 40Kb est obtenu en réalisant une extraction du clone BAC F12K22 à l'aide du kit Qiagen large construct, suivie d'une digestion par Notl, puis purifié par élèctrophorèse sur gel d'agarose en champs pulsé, avec les conditions suivantes : appareil Biorad CHEF Mapper, tampon TBE 0.5X, autoalgorythme 5-50Kb- 1% agarose gel - 14°C-20h30. Cet insert est ensuite introduit par ligation classique dans le site Notl de la cassette « gènes rapporteurs », dans le but d'obtenir le vecteur BAC final, avec l'insert complet PMI-40Kb-GUS. Cette construction est amplifiée avec le kit Qiagen large construct, puis l'insert est libéré par digestion Ascl, purifié par électrophorèse en champs pulsé et finalement déphosphorylé, en suivant la procédure mise au point au laboratoire (Tassy et al.). C'est cet insert déphosphorylé (cassette GF40Kb), qui sera utilisé pour la transformation du blé par biolistique. 2) Transformation Matériel végétal Pour réaliser les transformations, nous avons choisi Triticum Aestivum cv. Bobwhite S26, qui est la variété modèle couramment utilisée au laboratoire et qui donne les meilleurs rendements de transformation. Les plantes mères, donneuses d'embryons immatures sont cultivées en chambres climatisées sous conditions contrôlées : photopériode de 16 h de jour et 8 h de nuit, et températures respectives de 24°C et 15°C. Les embryons immatures sont récoltés environ 15 jours après floraison, quand ils ont atteint un diamètre de 1 à 1.2 mm. Les grains sont stérilisés dans un bain d'hypochlorite de sodium 20% pendant 15-20 mn puis rincés à l'eau distillée stérile. Les embryons immatures sont extraits stérilement sous une hotte à flux laminaire. Transformation Le protocole de transformation par biolistique est celui décrit par Pellegrineschi et al. (2002), avec quelques modifications mineures. Le système de sélection utilisé est la sélection PMI décrite par Wright et al. (2001) 3) Analyse des plantes transformées Test d'expression GUS : L'expression du gène rapporteur GUS est vérifiée sur des fragments de racines et de feuilles des plantules en phase de régénération. Les tissues sont coupés en petits morceaux et incubés 24 h à 37°C dans une solution X-Gluc, selon le protocole décrit par Jefferson et al. (1987) Analyses Southern : L'ADN génomique est extrait à partir de jeunes feuilles, suivant le protocole CTAB, modifié au laboratoire (Tassy et al. 2006). 15µg d'ADN sont digérés avec les enzymes de restriction appropriées, les fragments obtenus sont séparés sur gel d'agarose, puis transférés sur une membrane de nylon (Millipore), selon les instructions du fournisseur. Les sondes permettant de détecter la présence de l'insert sont marquées à l'aide d'un traceur radioactif (32P dCTP), en utilisant un kit (megaprime DNA labelling system, GE healthcare), suivant la procédure décrite par Barret et al. (1998) Analyse PCR : L'ADN utilisé pour les tests PCR est extrait des jeunes feuilles de plantes Ti, selon le même 30 procédé que décrit précédemment. La présence des deux gènes rapporteurs est détectée par PCR. - RESULTATS Fonctionnalité de la cassette gènes rapporteurs Nous avons dans un premier temps vérifié que les deux gènes rapporteurs étaient bien fonctionnels dans la construction. Pour cela, nous avons réalisé une première série de transformations sur 200 embryons bombardés avec la cassette gènes rapporteurs seule. Après sélection sur milieu PMI, nous avons obtenu 9 plantules, démontrant ainsi la fonctionnalité de la partie PMI de la cassette, avec une efficacité de transformation de 4.5%. Un test d'expression Gus a ensuite été réalisé sur ces 9 plantules, et 3 se sont révélées positives, ce qui nous permet de conclure que l'extrémité Gus de la cassette est également fonctionnelle. Production des plantes transgéniques avec la cassette GF40Kb Nous avons ensuite réalisé des expériences de transformation en utilisant la cassette GF40Kb entière, comprenant l'insert 40Kb d'ADN génomique d'Arabidopsis entre les deux gènes rapporteurs PMI et GUS. La taille totale de cette cassette est de 53 Kb. 800 embryons ont été bombardés, et après culture sur milieu sélectif PMI, nous avons obtenu 24 plantules (efficacité de transformation de 3%). Un test d'expression Gus a été réalisé sur ces 24 plantules, et 9 d'entre elles (38%) se sont révélées positives. Nous avons considéré que ces 9 plantes étaient susceptibles d'avoir intégré la cassette entière, dans la mesure où les deux extrémités étaient présentes et nous les avons cultivées en serre (plantes T0-1 à T0-9). Analyse moléculaire des plantes transgéniques TO L'ADN génomique des plantes TO a été extrait, puis analysé par Southern. Nous avons choisi d'utiliser 3 enzymes de restriction différentes afin de déterminer l'intégrité et le nombre de copies de la cassette GF40Kb. a) Vérification de la présence de la cassette Pour déterminer la présence de la cassette complète, nous avons utilisé l'enzyme Xhol pour digérer l'ADN génomique, et la cassette GF40Kb comme sonde, ce qui a donné un profil spécifique que nous avons pu comparer avec le profil de la cassette GF40Kb digérée par Xhol. 6 des 9 plantes présentaient un profil correct identique à celui de la cassette. b) Vérification de l'intégrité de la cassette Pour vérifier que la cassette est restée intacte lors de son intégration, nous avons digéré l'ADN génomique avec l'enzyme Ascl, qui ne coupe pas dans la cassette, et nous avons utilisé comme sonde un fragment de 10Kb de l'insert Arabidopsis. Si la cassette a été intégrée de façon intacte, on attend 1 ou plusieurs bandes d'une taille supérieur ou égale à 50Kb. 2 des plantes TO analysées présentent ce type de profil. c) Estimation du nombre de copies Nous avons utilisé l'enzyme Hindili, qui coupe les extrémités GUS et PMI de la cassette, puis nous avons hybridé successivement avec une sonde GUS ou PMI. Dans ce cas de figure, chaque insertion donnera une bande de taille différente, et le nombre de bandes donnera le nombre d'insertions.4 plantes TO présentent un profil avec 1 seule bande. Stabilité et ségrégation de l'insert Pour étudier la transmission de la cassette à la descendance, nous avons choisi les 2 plantes présentant une insertion simple de la cassette entière (plantes 5' et 21). Les plantes TO ont été autofécondées, puis nous avons semé 15 grains de chaque pour obtenir la génération Tl. Nous avons réalisé des tests histochimiques Gus, des analyses PCR avec des amorces Gus et Pmi ainsi que des analyses par Southern sur chacune des plantes Tl obtenues. Dans le cas de la lignée transgénique 5', les 15 grains ont donné des plantules et 12 de ces plantules ont présenté des résultats positifs pour les PCR Gus et Pmi. Ces résultats sont compatibles avec la ségrégation d'un site unique d'insertion. En ce qui concerne la lignée transgénique 21, seules 6 graines ont levé, ce qui est insuffisant pour conclure sur la ségrégation. PLANTES GF40 T1 Semi graines T1 des plantes TO présentant les profils Southern les plus intéressants N° plante expression GUS B2 + + + PCR GUS PCR PMI B10 B14 ............................... .............................. ............................... .............................. ............................... .............................. ............................... .............................. ............................... ségrégation C1(21) + pas levé + + 13+/15 14+/15 pas levé pas levé pas levé pas levé pas levé pas levé Tableau : Analyse de la présence et de la fonctionnalité des gènes rapporteurs dans les plantes Tl Pour les analyses Southern, l'ADN des plantes Tl a été extrait dans les mêmes conditions que celui des plantes TO, et une digestion par XhOl a été réalisée avec comme sonde la cassette GF40kb, de façon a pouvoir comparer les profils obtenus avec ceux des plantes TO et déterminer si il y a eu ou non des réarrangements. Nous avons analysé 6 plantes de chacun des deux évènements. Dans le cas de l'événement 5', les profils de digestion obtenus pour les plantes Tl sont les 10 mêmes que ceux de la plante TO, ce qui suggère que la cassette a été transmise intacte. C3 C5 C7 C9 C11 C13 C15 Dans le cas de l'événement 21, 2 plantes Tl présentent un profil différent de celui de la plante TO, ce qui signifie que pour ces 2 plantes, il y a eu réarrangement chromosomique au niveau de la cassette lors de la transmission. En résumé, nous avons développé une technologie permettant d'insérer de façon stable par biolistique un grand fragment d'ADN linéaire en 1 copie unique chez le blé, et c'est à notre connaissance la première fois que l'intégrité d'un tel fragment dans le génome de la plante hôte est démontrée. L'originalité de ce processus est que nous avons réalisé une unique construction contenant l'intégralité du grand fragment d'ADN, dans sa configuration native, et que cette construction a ensuite été dephosphorylée, suivant une technique développée au laboratoire, ce qui a permis d'obtenir des évènements de transformation présentant une copie unique de la cassette. REFERENCES Barret P, Brinkman M and Beckert M. (2008) A major locus expressed in the male gametophyte with incomplete penetrance is responsible for in situ gynogenesis in maize. Theor Appl Genet. 117:581-594. Chen L., Marmey P., Taylor NJ., Brizard JP., Espinoza C., D'Cruz P., Huet H., Zhang S., De Kochko A., Beachy RN., Fauquet CM. (1998) Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants. Nature Biotechnology 16: 1060-1064 25 Ercolano MR., Ballvora A., Paal J., Steinbiss HH., Salamini F., Gebhardt C. 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Procédé d'obtention de plants de blé transformés comprenant le bombardement de cellules de blé avec des particules chargés avec de l'ADN puis la régénération de plants de blé à partir desdites cellules de blé caractérisé en ce que les particules sont chargées avec un fragment d'ADN linéaire déphosphorylé. 2. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon la revendication 1 caractérisé en ce que les particules sont chargées avec moins de ing d'ADN/µg de particules et de préférence moins de 0,01ng d'ADN/µg de particule. 3. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon l'une des revendications 1-2 caractérisé en ce que les cellules sont bombardées avec 100 µg de particules. 4. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon l'une des revendications 1-3 caractérisé en ce que les cellules de blé sont des embryons immatures. 5. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon l'une des revendications 1-4 caractérisé en ce que le fragment ADN comprend au moins une cassette d'expression. 6. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon l'une des revendications 1-5 caractérisé en ce que le fragment ADN a une taille supérieure ou égale à 40kb. 7. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon l'une des revendications 1-4 et 25 6 caractérisé en ce que le fragment d'ADN est une ADN génomique natif comprenant au moins un gène et ses éléments de régulation. 8. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon la revendication 7 caractérisé en ce que le fragment d'ADN est un ADN génomique natif issu du blé ou d'une 30 espèce sexuellement compatible. 9. Procédé d'obtention de plants de blé transformés selon l'une des revendications 1-8 caractérisé en ce que le fragment d'ADN ne comprend pas de marqueur de sélection.20 10. Procédé d'obtention de plants transformés selon la revendication 9 dans lequel les plants de blé obtenus après régénération sont criblés par PCR et/ou par Southern blot pour la présence dudit fragment d'ADN dans leur génome. 11. Procédé d'obtention de plants transformés selon la revendication 10 dans lequel les plants de blé obtenus après régénération sont criblés lorsqu'ils ont atteint au moins le stade plantule à trois feuilles.10