Brevet FR2964978A1 — publié le 20120323

Les substrats faisant l'objet de la présente invention résultent d'un couplage, également dénommé greffage, d'un fluorophore sur un sucre ; dans la présente description, on entend par fluorophore un dérivé fluoré d'une coumarine sulfonatée. Différentes méthodes de fabrication de telles coumarines sulfonatées sont connues, 5 par exemple par le brevet anglais GB9723365 au nom de MOLECULAR PROBES qui décrit la synthèse de dérivés de la 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarine. C'est ainsi qu'en utilisant le procédé décrit dans ce brevet, la 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-sulfomethylumbelliferone a pu être synthétisée. Le brevet GB9723365 décrit aussi des composés résultant d'un remplacement du 10 groupe hydroxyle par un reste de sucre, ce dernier étant donc greffé sur la coumarine sulfonate. La reproduction du procédé de greffage décrit dans le brevet précité n'est pas valable pour tous les sucres et l'un des objectifs de la présente invention est précisément de fournir un procédé de greffage reproductible avec différents sucres et différentes coumarines substituées. 15 Un exemple va être donné à titre purement indicatif aux fins d'illustrer le procédé de greffage précité. Dans cet exemple, c'est la 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-sulfomethylumbelliferone qui sera utilisée comme fluorophore, et le sucre sera le cellobiose, produit de dégradation de la cellulose. 20 Le procédé selon l'invention s'applique à d'autres coumarines sulfonatées que la 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-sulfomethylumbelliferone ; de même le cellobiose n'est pas le seul sucre pouvant être greffé à une coumarine sulfonatée et on pourra ainsi choisir le sucre parmi les sucres suivants : cellobiose, xylobiose, maltose, saccharose, glucose, xylose, galactose, arabinose, xylane, glucane, xylotriose, maltotriose, cellotriose. 25 La première étape du procédé selon l'invention consistera à protéger le sucre par acétylation au niveau de ses huit groupements hydroxyle et à bromer en conséquence l'a-D-cellobiose-octoacétate. 1. Bromation de 1' a-D-cellobiose-octoacétate sur son carbone anomérique : La réaction est effectuée en milieu anhydre et dans la glace à 0°C. 30 Dans un ballon rodé en verre : - Solubiliser 1 g d'a-D-cellobiose-octoacétate dans 12,5m1 de CH2C12 anhydre. - Addition de 15ml (goutte à goutte rapide) de HBr 30% acide acétique. - Agitation magnétique pendant 5h00 à 0°C. - Addition de 25m1 CH2C12 : agitation magnétique pendant 10 min. - Petit à petit, sous agitation magnétique, addition d'un volume de K2CO3, en faisant très attention au dégagement de CO2, jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de CO2 qui séchappe ; laisser sous agitation magnétique 20min. - Extraction liquide-liquide (avec une ampoule à décanter) en ajoutant un volume de H2O+ un volume de CH2C12. - Récupération de la phase organique (CH2C12). - Déshydratation et séchage par addition de quelques spatules de MgSO4. - Filtration et collecte dans un ballon rodé. - Concentration dans un Rotavap. - Analyse RMN 1H. Obtention d'un solide blanc cassé. Masse d'a-D-cellobiose-octoacétate bromé obtenue : 650mg. Rendement de l'étape de bromation : 61,5 %. Le produit ainsi obtenu est instable, et il convient soit de l'utiliser directement, soit de le conserver à -20°C. 2. Greffage du fluorophore sur le sucre protégé et bromé : La réaction se fait en milieu anhydre et dans l'obscurité totale (ballon entouré de papier aluminium). Dans un ballon rodé en verre : - Utilisation de 1 éq. de fluorophore pour 4 éq. de sucre protégé, bromé - 40 mg de fluorophore + 150 mg de Ag2CO3 solubilisé dans 5ml de DMF anhydre. - Addition (2ml/5min) de 350mg de sucre protégé, bromé solubilisé dans 10 ml de DMF anhydre. - Agitation magnétique toute la nuit à température ambiante. - Suivi de la réaction par analyse LCMS. - Filtration sous vide (filtre Buchner) avec un verre frité + celite (environ 2cm). - Concentration dans un Rotavap Carboglace. 3. Purification du substrat protégé par chromatographie d'adsorption : La phase stationnaire utilisée est de la silice standard et le solvant utilisé est : 20% de méthanol et 80% de CH2C12 - La colonne fait entre 10 et 15cm et le diamètre moyen est de 3-4cm 5 - Analyse des fractions par LCMS - Analyse RMN 1H du produit Obtention d'un solide couleur ivoire. Masse d'a-D-cellobiose-octoacétate-coumarine-sulfonate obtenue : 40mg Rendement du couplage : 4,8 % 10 4. Déprotection des fonctions « acétate » du substrat : La réaction se fait en milieu anhydre et dans la glace à 0°C. Dans un ballon rodé en verre : - 40mg de substrat protégé solubilisé dans 7,5ml de méthanol anhydre. - Addition (goutte à goutte) de 16mg de CH3NaO (méthoxyde de sodium) dans 15 5m1 de méthanol anhydre. - Agitation magnétique à température ambiante pendant 1h. - Suivi de la réaction par analyse LCMS. - Neutralisation par addition d'une solution d'acide citrique (une spatule dans 50m1 de H20). 20 - Agitation magnétique pendant 20 minutes - Concentration dans un Rotavap à 45°C Obtention d'une huile jaune et translucide. 5. Purification du substrat cellulase : Une première purification est effectuée sur cartouche C8 ou C18 (10cm ; Interchrom ; 25 Puriflash silice 50C) afin d'éliminer un maximum de sels - Solvant utilisé : H2O - Le substrat cellulase sort immédiatement de la colonne La purification principale s'effectue sur HPLC avec deux solvants : H2O et Acétonitrile, en prenant bien soin que les solvants utilisés soient dépourvus de TFA. 30 Méthode HPLC : - Omin -- l Omin ; 1,5m1/min : 100% H20 - l Omin -+ 19min ; 1,5m1/min : 90% H2O et 10% Acétonitrile - 19min - 23min ; 1,5ml/min : 0% H20 et 100% Acétonitrile - 23min - 25min ; 1,5ml/min : 100% H20 et 0% Acétonitrile Caractéristiques de la colonne : - Colonne Hypersil ; Gold Phenyl - Thermofisher - Longeur : 250 mm - Diamètre : 4,6mm Les injections sont de 8(411 et le produit sort uniquement dans la phase H20 dans l'intervalle : Omin -* 10min.), suivi de très près par la coumarine libre présente en 10 solution. - Analyse des fractions par LCMS - Concentration par lyophilisation (méthode douce) - RMN 1H Obtention d'un solide blanc. 15 Masse de 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-sulfomethylumbelliferyl- (3-D-cellobioside : 8mg Rendement de la déprotection : 29,6 % Rendement total de la synthèse : 0,88 %. Les étapes 3. et 5. du procédé qui vient d'être décrit sont optionnelles ; elles permettent pourtant d'améliorer la qualité du substrat ainsi synthétisé. 20 Comme cela a déjà été mentionné, le procédé qui vient d'être décrit peut être reproduit en utilisant d'autres coumarines sulfonatées et/ou d'autres sucres. Les substrats ainsi obtenus trouvent notamment leur application pour la détection d'activités glycoside hydrolases ou glycosidases sur des extraits enzymatiques purifiés ou non ou sur des microorganismes. 25 Il sera par exemple possible d'effectuer le dosage fluorescent d'activités xylanase et/ou cellulase et/ou cellobiase et/ou glucosidase et/ou xylosidase d'extraits enzymatiques, ou bien d'effectuer le criblage par fluorescence selon leurs activités glycoside hydrolases ou glycosidases d'enzymes ou de microorganismes. De façon plus particulière, les nouveaux substrats selon l'invention permettront la 30 détection d'activités glycoside hydrolases ou glycosidases sur des extraits enzymatiques purifiés ou non ou sur des microorganismes compartimentés dans des gouttelettes aqueuses en suspension dans une phase huile (émulsion) produites par agitation mécanique. Il sera ainsi possible de réaliser le criblage par FACS selon leurs activités xylanase et/ou cellulase et/ou cellobiase et/ou glucosidase et/ou xylosidase d'enzymes ou de microorganismes compartimentés dans des gouttelettes aqueuses en suspension dans une phase huile. De façon encore plus particulière, les substrats selon l'invention permettront la détection d'activités glycoside hydrolases ou glycosidases sur des extraits enzymatiques purifiés ou non ou sur des microorganismes compartimentés dans des gouttelettes aqueuses en suspension dans une phase huile (émulsion) produites par un dispositif microfluidique. Dans cette hypothèse, il sera possible de réaliser par exemple le criblage selon leurs activités xylanase et/ou cellulase et/ou cellobiase et/ou glucosidase et/ou xylosidase d'enzymes ou de microorganismes compartimentés dans des gouttelettes aqueuses en suspension dans une phase huile crée par un dispositif microfluidique. 20 25 30 REVENDICATIONS1) Nouveaux substrats fluorescents résultant d'un greffage d'un fluorophore constitué d'un dérivé fluoré d'une coumarine sulfonatée sur un sucre. 2) Nouveaux substrats fluorescents selon la revendication 1 caractérisés en ce que ledit fluorophore est une 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarine. 3) Nouveaux substrats fluorescents selon la revendication 2 caractérisés en ce que ladite 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarine est la 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-sulfomethyl umbelliferone. 4) Nouveaux substrats fluorescents selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisés en ce que le sucre greffé à ladite coumarine est choisi parmi les sucres suivants : cellobiose, xylobiose, maltose, saccharose, glucose, xylose, galactose, arabinose, xylane, glucane, xylotriose, maltotriose, cellotriose. 5) Nouveaux substrats fluorescents selon la revendication 4 caractérisés en ce que le sucre greffé à ladite coumarine est le cellobiose. 6) Nouveaux substrats fluorescents selon la revendication 5 caractérisés en ce que ledit cellobiose est l'a-D-cellobiose. 7) Nouveaux substrats fluorescents selon les revendications 3 et 6 caractérisés en ce qu'ils consistent en le 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-sulfomethylumbelliferyl- 13-D-cellobioside. 8) Procédé d'obtention de nouveaux substrats fluorescents selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il consiste à : a. protéger le sucre au niveau de ses groupements hydoxyle, b. bromer ledit sucre ainsi protégé, c. greffer le fluorophore sur ledit sucre protégé et bromé, d. purifier le substrat obtenu à l'étape c, e. déprotéger ledit substrat en restituant les groupements hydroxyle, f. purifier le substrat fluorescent obtenu à l'étape e. 9) Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'étape c. est suivie d'une purification du substrat obtenu lors de ladite étape c. 10) Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'étape f. est suivie d'une purification du substrat fluorescent obtenu'lors de ladite étape. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 caractérisé en ce que la protection du sucre se fait par acétylation. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11 caractérisé en ce que la bromation se fait en milieu anhydre à 0°C. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12 caractérisé en ce que le greffage se fait en milieu anhydre et dans l'obscurité totale. 14) Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que ledit greffage se fait dans du DMF comme solvant. 15) Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14 caractérisé en ce que ledit greffage se fait à raison d'un équivalent fluorophore pour 4 équivalents sucre protégé bromé. 16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 15 caractérisé en ce que la déprotection se fait en milieu anhydre à 0°C. 17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 16 caractérisé en ce que le fluorophore utilisé est la 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-sulfomethylumbelliferone. 18) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 17 caractérisé en ce que le sucre utilisé est l'a-D-cellobiose. 19) Détection d'activités glycoside hydrolases ou glycosidases sur des extraits enzymatiques purifiés ou non ou sur des microorganismes caractérisée en ce que ladite détection se fait grâce à l'un des substrats fluorescents selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 20) Détection d'activités glycoside hydrolases ou glycosidases sur des extraits enzymatiques purifiés ou non ou sur des microorganismes selon la revendication 19 caractérisée en ce que lesdits extraits ou microorganismes sont compartimentés dans des gouttelettes aqueuses en suspension dans une phase huile. 21) Détection d'activités glycoside hydrolases ou glycosidases sur des extraits enzymatiques purifiés ou non ou sur des microorganismes selon la revendication 20 caractérisée en ce que lesdites gouttelettes aqueuses sont produites par un dispositif microfluidique.