Brevet FR2969926A1 — publié le 20120706

La présente invention concerne le domaine technique des virus influenza. Plus précisément, l'invention concerne l'utilisation de certains polysaccharides, en tant que médicament pour le traitement, préventif ou curatif, d'un virus influenza. La grippe est une infection respiratoire due aux virus influenza. Elle est observée partout dans le monde et réapparait chaque année en vagues épidémiques hivernales De nos jours, c'est la deuxième cause de mortalité infectieuse après les pneumonies. Les virus influenza responsables de pathologies chez l'homme sont les virus influenza de type A et B. Alors que les virus influenza de type B circulent sous forme de lignage, les virus influenza de type A sont classés en sous types viraux en fonction des propriétés antigéniques des deux glycoprotéines majeures de surface, l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). Les virus circulants chez l'homme et responsables des épidémies saisonnières sont les virus A (H1N1) et A (H3N2). La vaccination est, pour l'instant, le seul moyen efficace pour protéger les populations des virus influenza. Néanmoins, des solutions alternatives, sous la forme de médicaments anti-viraux font l'objet de nombreuses investigations. Le document WO 2009/027057 décrit l'utilisation des Carraghénanes dans une composition pharmaceutique pour la prophylaxie et le traitement des maladies virales respiratoires causées par les orthomyxovirus, et en particulier par les virus influenza A et B. La demande de brevet US 2010/0015248 propose une composition pour le traitement des rhumes et de l'influenza, qui comprend un mélange d'acétominophène, de diphénylhydramine, de dextrométhorphane, arabinogalactane, de vitamine C, de zinc, d'extrait d'huile d'olive, de resveratrol et d'extrait de baies de sureau. Il est précisé, dans ce document, que l'arabinogalactane, la vitamine C et le zinc sont présents pour stimuler le système immunitaire. L'extrait d'huile d'olive, le resveratrol et l'extrait de baies de sureau sont utilisés en tant qu'agents anti-viraux. L'acétominophène, la diphénylhydramine et le dextrométhorphane, quant à eux, sont utilisés pour soulager les symptômes influenza. Le document WO 98/11778 décrit des compositions médicamenteuses pour le traitement de différentes maladies virales comprenant un inhibiteur de l'infection microbienne à l'origine de la maladie à traiter, sous la forme d'un isolat de différentes plantes. Le virus influenza est cité parmi une liste de différentes infections virales, mais l'invention est plutôt dirigée sur le traitement du virus de l'herpes auquel se rapportent tous les exemples et résultats. Dans ce contexte, la présente invention repose sur la mise en évidence par les inventeurs, et ceux de façon totalement inattendue, que certains polysaccharides particuliers présentaient une activité anti-virale contre les virus influenza. L'invention a donc pour objet des polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour leur utilisation en tant que médicament dans le traitement préventif ou curatif d'une maladie causée par un virus influenza. Le terme « traitement » désigne toute mesure thérapeutique prophylactique ou suppressive d'une maladie due à un virus influenza conduisant à un effet clinique souhaitable ou à tout effet bénéfique, incluant notamment la suppression ou la diminution d'un ou plusieurs symptômes, la régression, le ralentissement ou la cessation de la progression de la maladie qui y est associée. Les maladies causées par un virus influenza sont généralement appelées grippes. En particulier, l'invention concerne des polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour leur utilisation en tant qu'agent anti-viral contre le virus influenza dans un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'un virus influenza. En d'autres termes, la présente invention concerne l'utilisation d'un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement, préventif ou curatif, d'un virus influenza. Au sein du médicament, le polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates joue le rôle d'ingrédient actif, c'est-à-dire qu'il est utilisé pour son activité anti-virale contre les virus influenza. Selon un mode de réalisation particulier, dans le médicament ou la composition pharmaceutique contenant au moins un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, l'activité anti-virale contre les virus influenza est assurée au moins à 70%, de préférence au moins à 90%, et préférentiellement au moins à 95% par les arabinogalactanes, apiogalacturonanes ou hétéroglycanes sulfates présents. Selon un mode de réalisation particulier, ledit médicament ou composition pharmaceutique contenant au moins un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates ne contient pas d'autre composé, que le ou les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, présentant une activité anti-virale significative. Par composé présentant une activité anti-virale significative, on entend un composé qui entraine une inhibition significative de la réplication du virus cible. Par exemple, une inhibition d'au moins 25%, de préférence d'au moins 50%, et préférentiellement d'au moins 80% à une concentration de 250 pg/mL, dans un test d'inhibition de la réplication du virus influenza cible, tels que ceux notamment décrits au paragraphe 1 des exemples ci-après. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence que des polysaccharides appartenant à la famille des arabinogalactanes, des apiogalacturonanes ou des hétéroglycanes sulfates avaient une influence sur le cycle de réplication des virus influenza et permettaient d'inhiber l'infection de cellules sensibles à l'infection. Il a également été démontré que ces sucres permettaient d'inhiber l'entrée des virus influenza, à l'intérieur de pseudoparticules virales (PPV). L'activité inhibitrice des polysaccharides appartenant à la famille des arabinogalactanes, des apiogalacturonanes ou des hétéroglycanes sulfates s'est montré équivalente, voire supérieure aux Carraghénanes déjà décrits dans la littérature pour ce type d'activité. Par contre, d'autres polysaccharides de la famille des ulvanes se sont montrés inactifs, mettant en évidence les propriétés spécifiques des polysaccharides sélectionnés dans le cadre de l'invention. Les arabinogalactanes sont des polysaccharides sulfatés solubles dans l'eau composés d'unités Galactose liées entre elles par des liaisons glycosidiques Beta 1-3. Cette chaine principale peut présenter des branchements de motifs Arabinose ou Galactose par des liaisons glycosidiques Alpha 1-6. Ces motifs peuvent présenter plusieurs motifs Arabinose et/ou Galactose liés entre eux par des liaisons glycosidiques 1-3 ou 1-6. Les Arabinoses ou Galactoses peuvent présenter des sulfatations sur des groupements alcools secondaires. Le rapport arabinose/galactose appartient, de préférence, à la gamme allant de 3/7 à 2/1, et correspond, par exemple à 1/1, 1/2 ou 2/1. Dans le cadre de l'invention, seront de préférence utilisés des arabinogalactanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 1000 à 2. 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 3 000 à 1,1 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 500/0, de préférence de 5 à 40 % des groupements sulfates. Les apiogalacturonanes sont des polysaccharides qui peuvent être sulfatés, solubles dans l'eau formés par une chaine linéaire d'unités Acide Galacturonique liées entre elles par des liaisons glycosidiques alpha 1-4. Cette chaine principale peut présenter des motifs Apiose liés par des liaisons glycosidiques Beta 1-2. Ces motifs peuvent présenter plusieurs motifs Apiose liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-5. Dans le cadre de l'invention, seront de préférence utilisés des apiogalacturonanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 10 000 à 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 50 000 à 700 000 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 20%, de préférence de 4 à 12 % des groupements sulfates. Les hétéroglycanes sulfatés utilisés dans le cadre de l'invention sont des 30 polysaccharides solubles dans l'eau formés par une chaine linéaire d'unités Galactose liées en alpha 1-3 et terminal, d'unités xylose liées en 1-4 et d'unités arabinose liées en 1-4. Les unités Galactose peuvent présenter des sulfatations en C6 et les unités arabinose des sulfatations en C3. Dans le cadre de l'invention, seront de préférence utilisés des hétéroglycanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 500 000 à 5.106 g/mol et, par exemple d'environ, 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 5 à 30%, de préférence de 13 à 22 % des groupements sulfates. Les arabinogalactanes, apiogalacturonanes et hétéroglycanes sulfates utilisés dans le cadre de l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou seront, de préférence, extraits d'une source naturelle telles que des algues ou des plantes. En particulier, ils peuvent correspondre : - à un extrait de Codium fragile, Codium vermilara, Echinea purpurea, Echnea angustifolia, Echinea pallidae, Echinea vegetalis, Echinea atribactilus, pimpnella anisum, myroxylon, arctostaphylos, carum, capsicum, eugenia mytacea, coriandrum, inula, allium, gentiana, junipeerus, calendula, origanum, mentha labiate, commiphora, plantago, rosmarinus, ruta, lapsita, artemisa, sage, mentha, parthenium, integrifolium, eucalyptum, ou asteriacea comprenant des arabinogalactanes, - à un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des 20 apiogalacturonanes, - à un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates. Toute méthode d'extraction bien connue de l'homme du métier pourra être utilisée. En particulier, les méthodes d'extraction des sucres complexes 25 par des solvants aqueux ou organiques, suivis ou non de purification par précipitation sélective, interactions ioniques, filtration, etc... pourront être mises en oeuvre. Il est, par exemple, possible d'utiliser les méthodes d'extraction à partir de Codium fragile, en milieu aqueux à température ambiante pour préserver 30 les arabinogalactanes sulfatés. Notamment, les méthodes détaillées dans les exemples ci-après, ou des méthodes analogues, pourront être utilisées. Les polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, et en particulier ceux précédemment décrits, peuvent être utilisés pour le traitement, curatif ou préventif, de tout type de virus influenza. Par « virus influenza », on entend désigner tous les virus influenza, et notamment les virus influenza humains, aviaires, équins, porcins et félins. Lesdits virus influenza peuvent être sélectionnés parmi les types A, B et C. En particulier, le virus influenza peut être de type A et notamment correspondre aux souches de sous-type H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N1, H7N7 et H9N2. Selon un mode de réalisation particulier, le virus influenza est choisi parmi les virus de type B, A-H5N1, A-H7N1 et A-H3N2. La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques administrables aux animaux et, en particulier à l'homme, comprenant, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable selon notamment la Pharmacopée Européenne 7ème édition, : - soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara, Echinea purpurea, Echnea angustifolia, Echinea pallidae, Echinea vegetalis, Echinea atribactilus, pimpnella anisum, myroxylon, arctostaphylos, carum, capsicum, eugenia mytacea, coriandrum, inula, allium, gentiana, junipeerus, calendula, origanum, mentha labiate, commiphora, plantago, rosmarinus, ruta, lapsita, artemisa, sage, mentha, parthenium, integrifolium, eucalyptum, ou asteriacea comprenant des arabinogalactanes, - soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes, - soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates. Les excipients présents dans les médicaments et compositions pharmaceutiques selon l'invention sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra-veineuse, intracartilage, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, les polyssacharides peuvent être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement des maladies ci-dessus. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale, telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intracartilage ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, pommades ou lotions. Le médicament ou composition contient, en général, une quantité thérapeutiquement efficace de polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates. Par « quantité thérapeutiquement efficace », on désigne toute quantité d'une composition qui améliore un ou plusieurs des paramètres caractéristiques de l'affection traitée. Afin d'obtenir l'effet souhaité, la dose de polysaccharide varie, par exemple, entre 0,001 et 100 mg par kg de poids du corps et par jour. Néanmoins, dans le cadre de l'invention, les compositions pharmaceutiques incluent également les compositions homéopathiques. Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures. Les compositions pharmaceutiques contenant un polysaccharide conformément à l'invention, peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau. Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparabène et du propylparabène comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût. Il est possible que les médicaments ou compositions comprenant au moins un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates soient à usage humain ou vétérinaire. Notamment, dans le cas du traitement des poulets, le polysaccharide pourra se trouver dans un additif alimentaire. D'une façon générale, les mêmes variantes s'appliquent mutatis mutandis aux médicaments, compositions et utilisations mettant en oeuvre les polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates. Selon un mode de réalisation particulier, les médicaments et compositions antivirales contre le virus influenza, selon l'invention ne contiennent pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau, en particulier lorsqu'ils ou elles contiennent un arabinogalatane tel que précédemment défini. Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne également l'utilisation d'un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates dans une composition alimentaire dans laquelle ledit polysaccharide est utilisé pour lutter à titre préventif ou curatif, contre une maladie causée par un virus influenza. Selon un mode de réalisation particulier, la composition alimentaire comprend : - soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara, Echinea purpurea, Echnea angustifolia, Echinea pallidae, Echinea vegetalis, Echinea atribactilus, pimpnella anisum, myroxylon, arctostaphylos, carum, capsicum, eugenia mytacea, coriandrum, inula, allium, gentiana, junipeerus, calendula, origanum, mentha labiate, commiphora, plantago, rosmarinus, ruta, lapsita, artemisa, sage, mentha, parthenium, integrifolium, eucalyptum, ou asteriacea comprenant des arabinogalactanes, - soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes, - soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates. Selon un autre mode de réalisation particulier pouvant être combiné au 15 précédent, la composition alimentaire ne contient pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau. Toutes les variantes de réalisation, en ce qui concerne notamment les définitions précédemment décrites en relation avec les médicaments et les compositions pharmaceutiques des sucres, des extraits et méthodes 20 d'extraction pour les obtenir et des virus influenza ciblés s'appliquent mutatis mutandis aux compositions alimentaires. Par composition alimentaire, on entend par exemple tout type d'alicament, de produits alimentaires sous la forme de yaourt ou breuvage lacté notamment, destinés à l'homme ou à l'animal. 25 Les exemples ci-après, en référence aux Figures annexées, permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. 30 1. Procédés de production et caractérisation uhysicochiminue des polysaccharides testés Arabinogalactane extrait de Codium Fragile L'obtention des extraits de Codium Fragile présentés dans l'invention consiste, dans une première étape, en la dépigmentation des algues broyées par un solvant organique, notamment l'éthanol. Le résidu dépigmenté est ensuite extrait, à température ambiante, en milieu aqueux pendant quelques heures à 24h. L'extrait ainsi obtenu peut être amélioré en utilisant des procédés de purification des polysaccharides, comme la précipitation sélective avec des solvants organiques comme l'éthanol et/ou par interaction ionique, et/ou la dialyse par ultrafiltration. L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'arabinogalactane sulfaté (Marina Ciancia et al. 2007 - International Journal of Biological Macromolecules 41 (2007) 641-649), à savoir une chaine linéaire de Galactoses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-3. Cette chaine principale peut présenter des branchements de motifs Arabinoses ou Galactoses par des liaisons glycosidiques Alpha 1-6. Ces motifs peuvent présenter plusieurs Arabinose et/ou Galactoses liés entre eux par des liaisons glycosidiques 1-3 ou 1-6. Les Arabinoses ou Galactoses peuvent présenter des sulfatations sur des groupements alcools secondaires. La composition en monosaccharides des extraits obtenus dans le cadre de cette invention est confirmée par des dosages de monosaccharides par la technique de chromatographie HPAEC PAD suite à une hydrolyse acide totale. Les extraits présentent de l'Arabinose et du Galactose (3/7 à 1/1). Les signaux caractéristiques des liaisons glycosidiques de l'arabinogalactane sont mis en évidence par de la Résonnance Magnétique Nucléaire du Proton. Des dosages des groupements sulfates par méthode du Chlorure de Baryum permettent d'apprécier le taux de sulfatation des extraits entre 18 et 30% en masse. La chromatographie d'exclusion stérique (Size exclusion Chromatography - SEC) des polymères permet d'estimer la masse moléculaire moyenne des polysaccharides d'arabinogalactanes sulfatés présents dans les extraits. Celle-ci, en fonction des échantillons appartient à la gamme allant d'environ 3 000 à environ 1,1.106g/mol. Processus d'obtention des extraits Codium Fragile Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 1. L'algue peut être dépigmentée. 50 g de Codium Fragile en Poudre peuvent être dépigmentés par 4 lavages successifs avec un solvant organique comme l'éthanol. Chaque lavage consiste à mettre en suspension les 50 g de poudre d'algue dans un litre d'éthanol pur et d'agiter 2h à 400 rpm avec une température de 20°C. Après chaque lavage, le résidu d'extraction est isolé par filtration sur papier Whatman. Cette opération est renouvelée trois fois. Suite à ces étapes de dépigmentation, le résidu d'extraction est séché une nuit à l'étuve 40°C. Le résidu de dépigmentation peut être extrait en milieu aqueux. Le résidu correspondant aux 50 g de Codium Fragile dépigmentés est remis en suspension dans 1L d'eau déionisée, agité pendant 16 h à 600 rpm et à température ambiante. Après 16h, l'extrait soluble est isolé par centrifugation (7000 rpm 4°C 40 minutes environ). Cet extrait aqueux est appelé extrait aqueux A. L'échantillon extrait n°98 est obtenu par dessalage de l'extrait aqueux A par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 10 kDa. Le dessalage est obtenu après diafiltration avec le passage de 6 volumes d'eau déionisée, soit 6L. Le rétentat d'ultrafiltration correspond à l'échantillon n°98. L'échantillon extrait n°79 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°98 par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 0,2 pm. Cette ultrafiltration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°79. L'extrait aqueux A peut aussi être traité par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 0,2 pm. Cette ultrafiltration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°141. L'algue peut être directement extraite avec un solvant aqueux. 50 g de Codium Fragile en Poudre sont mis en solution dans 1 L d'eau déionisée avec une agitation de 400 rpm, à température ambiante une nuit. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 60 minutes). Cet extrait aqueux est appelé extrait aqueux B. Les échantillons extraits n°109 et 238 sont obtenus par précipitation par un solvant organique, comme l'éthanol. Pour cela, l'extrait aqueux B est précipité avec 50% v/v d'éthanol pur. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes). L'échantillon extrait n°242 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°109 ou 238 par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 0,2 pm. Cette ultrafiltration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°242. L'échantillon extraits n°152 est obtenu par hydrolyse acide, notamment avec de l'acide chlorydrique des échantillons extraits n°109 ou 238 suivie d'une sélection de la masse moléculaire sur deux membranes d'ultrafiltration 3 et 10 kDa. La sélection de masse est réalisée par une première ultrafiltration tangentielle sur membrane de 10 kDa réalisée à 10 g/L avec une diafiltration de 10 volumes avec de l'eau déionisée. Le permeat est ensuite passé par ultrafiltration tangentielle sur une membrane de 3 kDa, avec une première phase de concentration d'un facteur 10, puis une diafiltration de 10 volumes avec de l'eau déionisée. Le rétentat de cette deuxième ultrafiltration tangentielle sur membrane de 3 kDa constitue l'échantillon extrait n°152. Les échantillons extraits n°237 et 239 sont obtenus par traitement à la bentonite de l'extrait aqueux B suivi d'une précipitation à l'éthanol. L'extrait aqueux B issu de l'extraction de 50 g de Codium Fragile dans 1 L d'eau est traité par l'ajout de 10g de bentonite préalablement remis en suspension dans 100 ml d'eau déionisée. La solution est agitée, puis laissée au repos 1 h environ à température ambiante. La phase soluble est isolée par centrifugation (8000 rpm 4°C 15 minutes). La phase soluble isolée est précipitée par un solvant organique, notamment avec de l'éthanol à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes) et constitue les échantillons extraits n°237 et 239. L'échantillon extrait n°240 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°237 ou 239 par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 0,2 pm. Cette ultrafiltration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°240. Caractérisation des extraits de Codium Fragile : Les extraits obtenus présentent majoritairement la structure décrite de l'arabinogalactane sulfaté (Marina Ciancia et al. 2007 - International Journal of Biological Macromolecules 41 (2007) 641-649), à savoir une chaîné linéaire de Galactoses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-3. Cette chaine principale peut présenter des branchements de motifs Arabinose ou Galactose par des liaisons glycosidiques Alpha 1-6. Ces motifs peuvent présenter plusieurs motifs Arabinose et/ou Galactose liés entre eux par des liaisons glycosidiques 1-3 ou 1-6. Les Arabinoses ou Galactoses peuvent présenter des sulfatations sur des groupements alcools secondaires. Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en oeuvre pour confirmer la présence de l'arabinogalactane sulfaté dans les extraits utilisés pour cette invention -Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N. -Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage tubidimétrique des sulfates suivant la méthode du Chlorure de Baryum. 5 -Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA. -Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton. -Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères. Dosages Colorimétriques Echantillon Sucres Protéines Sulfates Extrait Réducteurs (2) (3) (1) 79 45 5 28 98 47 10 24 109 50 8 23 141 38 7 18 152 42 8 19 237 41 2 30 238 34 9 26 239 38 2 28 240 41 2 26 242 46 5 26 (1)Sucres réducteurs exprimés en % p/p eq Gal 10 (2)Protéines exprimées en % p/p eq BSA (3)Sulfates exprimés en % S03 p/p5 Profil des Monosaccharides Monosaccharides Echantillon Ac Ac Extrait Fuc Rha Ara Gal Glc Man XyI Gal Glc 79 1 0 17 18 0 1 1 0 0 98 1 0 15 16 1 2 1 0 0 109 141 1 0 13 13 1 1 0 0 0 152 2 0 37 33 9 4 2 0 0 237 0 0 12 7 1 1 0 0 0 238 0 0 15 11 2 1 1 0 0 239 1 0 19 10 2 2 0 0 0 240 1 0 24 13 0 0 1 0 0 242 1 0 22 14 0 1 1 0 0 Masse Moléculaire des polysaccharides 15 Echantillon Extrait Estimation par SEC 79 98 900 000 g/mol 109 600 000 g/mol 141 400 000 g/mol 152 3 000 à 10 000 g/mol 237 50 000 g/mol 238 700 000 g/mol 239 1 100 000 g/mol 240 950 000 g/mol 242 1 100 000 g/mol RMN du proton Les signaux observés correspondent aux signaux caractéristiques des structures décrites des arabinogalactanes. Apiogalacturonane de Zostera marina : L'obtention des extraits de Zostera marina présentés dans l'invention consiste dans une première étape en la dépigmentation de la plante par un solvant organique, notamment l'éthanol. Le résidu dépigmenté est ensuite extrait à chaud en milieu aqueux pendant quelques heures à 24h. Le résidu d'extraction subit une seconde extraction en milieu acide, notamment en milieu TFA. Le polysaccharide d'extraction est obtenu par précipitation suivant le pH du filtrat obtenu précédemment. Ce polysaccharide peut être amélioré en utilisant des procédés de purification des polysaccharides comme la précipitation sélective avec des solvants organiques comme l'éthanol, et/ou la dialyse par ultrafiltration. L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'apiogalacturonane (Véronique BRUDIEUX- 2007 Thèse de doctorat - Université de Limoges - Extraction, modification enzymatique et caractérisation chimique de nouvelles structures pectiques. Application de la relation structure / activité à la dermocosmétique.), à savoir une chaîne linéaire d'Acides Galacturoniques liés entre eux par des liaisons glycosidiques alpha 1-4. Cette chaîne principale peut présenter en ramification des motifs Apiose liés par des liaisons glycosidiques Beta 1-2. Ces motifs peuvent présenter plusieurs Apioses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-5. La composition en monosaccharides des extraits obtenus dans le cadre de cette invention est confirmée par des dosages de monosaccharides par la technique de chromatographie HPAEC PAD suite à une hydrolyse acide totale et par la technique de chromatographie en phase gazeuse après dérivation des monosaccharides par acétylation. Les extraits présentent de l'Acide Galacturonique et de l'Apiose. Les signaux caractéristiques des liaisons glycosidiques de l'apiogalacturonane sont mis en évidence par de la Résonnance Magnétique Nucléaire du Proton, notamment la chaîne d'Acide Galacturonique en alpha 1-4 après hydrolyse acide partielle des Apioses. Des dosages des groupements sulfates par méthode du Chlorure de Baryum permettent d'évaluer le taux de sulfatation des extraits entre 4 et 12 % en masse. La SEC des polymères permet d'estimer la masse moléculaire moyenne des polysaccharides d'arabinogalactanes sulfatés présents dans les extraits qui varie de 50 000 à 700 000 g/mol. Processus d'obtention des extraits de Zostera marina Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 2. Le premier procédé permet d'obtenir l'échantillon extrait n°138. La plante marine, Zostera marina en poudre est lavée à l'eau. 40 g de poudre de Zostera marina sont mis en solution dans 1 L d'eau déionisée, 5 heures environ à 95°C sous agitation de 500 rpm. Le résidu du lavage est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 20 minutes). Le culot obtenu est alors extrait en milieu acide, par exemple avec du TFA. Le résidu du lavage est remis en solution dans 1L de TFA 0.5 N, agité à 500 rpm pendant 2 heures environ à 25°C. La fraction soluble est isolée par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). La fraction soluble ainsi isolée est neutralisée à pH 7,5, un précipité apparait. Le précipité est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). Ce précipité est remis en solution avec iL d'eau déionisée. Cette solution est ensuite précipitée avec de l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 60% v/v final. Le précipité formé est isolé par centrifugation (7000 rpm, 4°C, 10 minutes). Le précipité est remis en solution à raison de 10 g/L pour être dessalé par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 650 Da. Une diafiltration de 10 volumes est réalisée avec de l'eau déionisée. Le rétentat obtenu est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°138. Le second procédé concerne une extraction de Zostera marina avec de l'oxalate après une dépigmentation avec un solvant organique tel que l'éthanol. 50 g de Zostera marina en poudre sont mis en suspension dans iL d'éthanol pur. Le mélange est porté à 78°C sous agitation de 500 rpm pendant 5 heures environ. Le résidu de dépigmentation est isolé par filtration sur filtre Büchner de 20-25 pm et séché à l'étuve 40°C une nuit. La plante marine dépigmentée est alors remise en solution dans iL d'oxalate d'ammonium 1% sous agitation de 750 rpm à 70°C pendant 2 heures environ. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minute). La fraction extraite peut être dessalée par ultrafiltration tangentielle sur membranes de 10 kDa. Une diafiltration de 10 volumes environ est réalisée avec de l'eau déionisée. Le rétentat est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°158. Le troisième procédé concerne une extraction de Zostera marina avec du carbonate de sodium à 3% après une dépigmentation avec un solvant organique tel que l'éthanol. 50 g de Zostera marina en poudre sont mis en suspension dans iL d'éthanol pur. Le mélange est porté à 78°C sous agitation de 500 rpm pendant 5 heures environ. Le résidu de dépigmentation est isolé par filtration sur filtre Büchner de 20-25 pm et séché à l'étuve à 40°C une nuit. La plante marine dépigmentée est alors remise en solution dans 1L de carbonate de sodium à 3% sous agitation de 500 rpm à 70°C pendant 2 heures environ. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes), puis neutralisé avec de l'acide chlorhydrique. Le produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (6000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C une nuit environ. Le précipité séché peut ensuite être dessalé par ultrafiltration tangentielle sur membranes de 10 kDa. Une diafiltration de 10 volumes environ est réalisée avec de l'eau déionisée. Le rétentat est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°160. Le rétentat peut aussi être précipité par un solvant organique tel que l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation 6000 rpm 4°C 5 minutes environ. Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C une nuit environ. Le précipité séché constitue l'échantillon extrait n°161. Caractérisation des extraits de Zostera marina : Les extraits ainsi obtenus présentent majoritairement la structure décrite de l'apiogalacturonane (Véronique BRUDIEUX- 2007 Thèse de doctorat - Université de Limoges - Extraction, modification enzymatique et caractérisation chimique de nouvelles structures pectiques. Application de la relation structure / activité à la dermocosmétique), à savoir une chaine linéaire d'acides galacturoniques liés entre eux par des liaisons glycosidiques alpha 1-4. Cette chaine principale peut présenter des motifs d'apiose liés par des liaisons glycosidiques Beta 1-2. Ces motifs peuvent présenter plusieurs Apioses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-5. Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont 15 pu être mises en oeuvre pour confirmer la présence de l'apiogalacturonane dans les extraits utilisés pour cette invention : -Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N ou H2SO4 2N. 20 -Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage par turbidimétrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum. -Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N ou H2SO4 2N. 25 -Identification du monosaccharide apiose par la technique de chromatographie en phase gazeuse après dérivation des monosaccharides par acétylation. -Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton. -Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères. 30 Dosages Colorimétriques Echantillon Sucres Protéines Sulfates Extrait Réducteurs (2) (3) (1) 158 44 4 5 160 19 26 4 161 31 16 0 138 58 2 0 (4)Sucres réducteurs exprimés en % p/p eq Gal 5 (5)Protéines exprimées en % p/p eq BSA (6)Sulfates exprimés en % S03 p/p Profil des Monosaccharides Monosaccharides Echantillon Extrait Fuc Gal Glc Man Apiose Ac Ac Ac Ac Gal Gul Glc Man 158 3 2 0 1 3 5 14 3 33 160 3 1 1 1 3 3 12 3 28 161 2 1 0 0 3 4 18 2 37 138 0 1 0 0 18 18 0 1 0 10 Masse Moléculaire des polysaccharides Echantillon Estimation par SEC Extrait 158 90 000- 400 000 g/mol 160 150 000 - 400 000 g/mol 161 90 000 - 200 000 g/mol 138 490 000 g/mol RMN du proton Les spectres RMN du proton des échantillons n°158, 160 et 161 laissent apparaitre la structure caractéristique de l'apiogalacturonane avec la présence des deux monosaccharides apiose et acide galacturonique en quantités équivalentes. La présence d'acide mannuronique et d'acides guluronique suggère la présence d'alginates. Pour l'échantillon extrait n°138, les spectres RMN du proton mettent en évidence les signaux caractéristiques de l'apiose. Après hydrolyse partielle au TFA, les spectres de RMN du proton mettent en évidence les signaux caractéristiques de la chaîne principale d'acides galacturoniques liés en alpha 1-4. Cet extrait présente le polysaccharide d'apiogalacturonane. Hétéroglycane sulfaté extrait de Caulerpa racemosa : L'obtention des extraits de Caulerpa racemosa présentés dans l'invention consiste dans une première étape en la dépigmentation des algues broyées par un solvant organique, notamment l'éthanol. Le résidu dépigmenté est ensuite extrait à chaud en milieu aqueux pendant quelques heures à 24h. L'extrait ainsi obtenu peut être amélioré en utilisant des procédés de purification des polysaccharides comme la précipitation sélective avec des solvants organiques comme l'éthanol et/ou par interaction ionique, et/ou la dialyse par ultrafiltration. L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'Hétéroglycane sulfaté (CHATTOPADHYAY Kausik et al. 2006 - Carbohydrate polymers 2007, vol. 68, no3, pp. 407-415), à savoir des Galactoses liés en alpha 1-3 et terminal, des xyloses liés en 1-4 et des arabinoses en 1-4. Les Galactoses peuvent présenter des sulfatations en C6 et les arabinoses des sulfatations en C3. La composition en monosaccharides des extraits obtenus dans le cadre de cette invention est confirmée par des dosages de monosaccharides par la technique de chromatographie HPAEC PAD suite à une hydrolyse acide totale. Les extraits présentent de l'Arabinose, du Galactose et du Xylose (10/10/0,5 à 13/13/1). Les signaux caractéristiques des liaisons glycosidiques de xyloarabinogalactane sont mis en évidence par de la Résonnance Magnétique Nucléaire du Proton. Des dosages des groupements sulfates par méthode du Chlorure de Baryum permettent d'évaluer le taux de sulfatation des extraits entre 22 et 13 % en masse. La SEC des polymères permet d'estimer la masse moléculaire moyenne des polysaccharides d'arabinogalactanes sulfatés présents dans les extraits à environ 106 g/mol. Processus d'obtention des extraits de Caulerpa racemosa Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 3. Une extraction en phase aqueuse est faite sur l'algue en poudre. 70 g de Caulerpa Racemosa en poudre sont mis en suspension dans iL d'eau déionisée, agités une nuit, sous agitation à 650 rpm et à 80°C. L'extrait soluble est ensuite isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). Cet extrait est appelé l'extrait aqueux. Les échantillons extraits n°162 et 234 sont obtenus par précipitation à froid de l'extrait aqueux par un solvant organique, comme l'éthanol. Pour cela l'extrait aqueux est précipité avec 50% v/v d'éthanol pur préalablement mis à -20°C. Le précipité est isolé par centrifugation (4000 rpm, 4°C, 10 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C une nuit. L'extrait aqueux peut aussi être traité à la bentonite pour améliorer sa purification, puis précipité avec un solvant organique, notamment l'éthanol. L'extrait aqueux issu de l'extraction de 70 g de Caulerpa racemosa dans 1 L d'eau est traité par l'ajout de 6,5 g de bentonite préalablement remis en suspension dans 65 ml d'eau déionisée. La solution est agitée, puis laissée au repos 1 h environ à température ambiante. La phase soluble est isolée par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 15 minutes). Le produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à -20°C, jusqu'à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C une nuit. Le résidu de précipitation constitue l'échantillon extrait n°233. Caractérisation des extraits de Caulerpa racemosa Les extraits ainsi obtenus présentent majoritairement la structure décrite de l'Hétéroglycane sulfaté (CHATTOPADHYAY Kausik et al. 2006 - Carbohydrate polymers 2007, vol. 68, no3, pp. 407-415), à savoir des Galactoses liés en alpha 1-3 et terminal, des xyloses liés en 1-4 et des arabinoses en 1-4. Les Galactoses peuvent présenter des sulfatations en C6 et les arabinoses des sulfatations en C3. Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en oeuvre pour confirmer la présence de l'hétéroglycane sulfaté dans les extraits utilisés pour cette invention : -Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N. -Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage par turbidimétrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum. -Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA. -Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton. -Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères. Dosages Colorimétriques Echantillon Sucres Protéines Sulfates Extrait Réducteurs (2) (3) (1) 162 48 4 13 233 50 3 22 234 50 5 21 (1)Sucres réducteurs exprimés en % p/p eq Gic (2)Protéines exprimées en % p/p eq BSA (3)Sulfates exprimés en % S03 p/p Profil des Monosaccharides Monosaccharides Echantillon Ac Ac Extrait Fuc Rha Ara Gal Glc Man XyI Gal Gic 162 0 0 11 13 17 10 1 0 0 233 0 0 13 13 14 3 1 0 0 234 0 0 11 13 12 9 1 0 0 Masse Moléculaire des polysaccharides Echantillon Estimation Extrait par SEC 162 106g/mol 233 234 RMN du proton Les signaux observés correspondent aux signaux caractéristiques des structures décrites des Hétéroglycanes sulfatés. 15 Ulvanes - Extraits de Ulva armoricana Processus d'obtention des extraits d'Ulva armoricana Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 4. L'algue Ulva armoricana broyée est traitée par extraction en phase 20 aqueuse. 70 g d7Jlva armoricana sont mis en suspension dans un litre d'eau10 déionisée, à 95°C pendant 12 heures environ avec une agitation de 850 rpm. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 45 minutes). Le produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 60% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (4000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C une nuit. L'extrait précipité est ensuite purifié sur membranes d'ultrafiltration tangentielle. Dans un premier temps l'extrait précipité est remis en solution à 5 g/L et diafiltré par 10 volumes d'eau déionisée sur une membrane de 300 kDa. Le permeat de cette ultrafiltration est concentré par 10 sur une deuxième membrane d'ultrafiltration tangentielle de 100 kDa, puis diafiltré par 10 volumes d'eau déionisée. Le rétentat de cette deuxième ultrafiltration est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°244. Le perméat est lyophilisé après concentration pour donner l'échantillon extrait n°245. Caractérisation des extraits d'Ulva armoricana : L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'ulvane (Marc Lahaye, Carbohydrate Research 1998), à savoir une chaine 20 formée de motifs parmi les quatre motifs suivants : -Ulvanobiuric 3-sulfate type A acid: 3(1,4)-D-GIcA-a (1,4)-L-Rha 3 sulfate -Ulvanobiuric 3-sulfate type B acid: 3(1,4)-L-IdoA-a (1,4)-L-Rha 3 sulfate -Ulvanobiose 3-sulfate acid: 3(1,4)-D-Xyl-a (1,4)-L-Rha 3 sulfate -Ulvanobiose 2', 3 disulfate acid: 3(1,4)-D-Xyl 2-sulfate-a(1,4)-L-Rha 3 25 sulfate Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en oeuvre pour confirmer la présence de l'ulvane sulfaté dans les extraits utilisés pour cette invention : -Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS 30 après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N. -Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage par turbidimétrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum. -Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA. Dosages Calorimétriques Echantillon Sucres Protéines Sulfates Extrait Réducteurs (2) (3) (1) 244 36 1 17 245 23 14 5 (1)Sucres réducteurs exprimés en % p/p eq Gal 10 (2)Protéines exprimées en % p/p eq BSA (3)Sulfates exprimés en % SO3 p/p Profil des Monosaccharides Monosaccharides Echantillon Rha Xyl GIc Ac Ac Ac Extrait Gal Glu Idu 244 28 3 5 2 10 9 245 5 2 14 0 2 1 Carraghénane - Extraits d'Agardhiella tenera Processus d'obtention des extraits d'Agardhiella tenera Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons 20 testés sont présentés schématiquement Figure 5. 15 L'algue Agardhiella tenera broyée est traitée par extraction en phase aqueuse après une dépigmentation avec un solvant organique tel que l'éthanol. 200 g de Agardhiella tenera en poudre sont mis en suspension dans iL d'éthanol pur. Le mélange est porté à 78°C sous agitation de 500 S rpm pendant 3 heures environ. Le résidu de dépigmentation est isolé par filtration sur filtre Büchner de 20-25 pm et séché à l'étuve 40°C une nuit. L'algue ainsi dépigmentée est alors remise en solution dans 10 litres d'eau déionisée, à 37°C pendant 6 heures environ avec une agitation de 850 rpm. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 30°C, 30 minutes). Le 10 produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 67% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (4000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C formant l'échantillon extrait n°164. La partie soluble résultant de la 15 première étape de précipitation est reprise avec une addition d"éthanol à - 20°C pour atteindre 83% v/v final d'éthanol. Le précipité est isolé par centrifugation (4000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C formant l'échantillon extrait n°165. A la partie 20 soluble résultant de la deuxième étape de précipitation on ajoute de l'éthanol à -20°C pour atteindre 92% v/v final d'éthanol. Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C formant l'échantillon extrait n°166. 25 Caractérisation des extraits d'Agardhiella tenera : Ces extraits ainsi obtenus présentent majoritairement la structure décrite des Carraghénane. Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en oeuvre pour confirmer la présence des Carraghénanes dans 30 les extraits utilisés pour cette invention : -Dosage calorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N. -Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage par turbidimétrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum. -Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton. -Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères. Dosages Colorimétriques Echantillon Sucres Protéines Sulfates Extrait Réducteurs (2) (3) (1) 164 46 2 25 165 42 2 25 166 42 2 26 (1)Sucres réducteurs exprimés en % p/p eq Gal (2)Protéines exprimées en % p/p eq BSA (3)Sulfates exprimés en % S03 p/p Masse Moléculaire des polysaccharides Echantillon Estimation Extrait par SEC 164 500 000 g/mol 165 550 000 g/mol 166 490 000 g/mol RMN du proton Les spectres RMN du proton mettent en évidence les signaux caractéristiques des structures du Carraghénane. 20 2. Activités a.Neutralisation de la réplication de virus influenza L'identification d'échantillons actifs repose sur l'évaluation de la capacité des molécules à bloquer la réplication virale du virus de la grippe sur un système cellulaire permissif à ce dernier. L'évaluation a été conduite vis-à-vis des virus influenza de type A et B, susceptibles d'induire des épidémies dans la population humaine. i). Mode opératoire Les virus A/Brisbane/10/2007 H3N2, et B/Florida/4/06 ont été utilisés dans les tests de neutralisation. Ces derniers représentent antigéniquement les souches circulantes des saisons hivernales 2008-2009 pour l'hémisphère sud et nord. Elles ont été sélectionnées pour entrer dans la composition vaccinale des hivers correspondants. Trois concentrations d'échantillons sont réalisées en milieu d'infection (250pg/mI ; 25pg/ml ; 2,5pg/ml). Chaque concentration est mise en contact avec un volume égal d'une quantité standardisée de virus. Ce mélange est déposé à raison de 4 cupules par concentration, dans des plaques 96 puits recouvertes de cellules MDCK. Des témoins négatifs sont réalisés afin de vérifier l'absence d'effet cytopathique des cellules MDCK non infectées. Un contrôle de la quantité de virus utilisé dans le test est également déposé. Après 48 heures d'incubation, le % de neutralisation est déterminé par la mise en évidence du virus dans le surnageant de culture par un test enzymatique. Dans cet essai la neuraminidase virale hydrolyse son substrat, le (2'(4 Methylumbelliferyl)-a D N-acetyl neuraminic acid) et libère de l'acide sialique et une molécule fluorescente le 4-methylumbelliferone. La quantité de 4-methylumbelliferone libérée est déterminée par une mesure fluorimétrique. La quantité mise en évidence est rapportée à la quantité du témoin positif.30 ii). Résultats Six familles de sucre ont été testées ci-dessous : Trois familles correspondant aux familles d'intérêt : -Arabinogalactane (Codium fragile) -Apiogalcturonane (Zostera marina) -Hétéroglycane Sulfaté (Caulerpa racemosa) Deux autres familles à titre de comparaison : -Carraghénanes (Agardhiella t) connus pour leur activité contre le virus influenza -Ulvane (Ulva a) Les résultats d'activité biologique des polysaccharides testés sont présentés Figures 6 et 7. Les polysaccharides 79, 98, 109, 141, 237, 239, 240, et 242 appartiennent à la famille des arabinogalactanes. Le polysaccharide 138 appartient à la famille des apiogalacturonanes. Les polysaccharides 233 et 234 appartiennent à la famille des hétéroglycanes sulfatés. Les polysaccharides 164 à 166, appartiennent à la famille des carraghénanes, et enfin les ulvanes sont représentés par les polysaccharides 244 et 245. Les polysaccharides, à l'exception des ulvanes ont démontré une forte activité biologique vis-à-vis des virus de type B. L'ensemble des molécules inhibent plus de 70% de la réplication pour une concentration de 250pg/ml. La concentration qui permet d'inhiber 50% de la réplication virale est comprise entre 25 et 250pg/ml pour l'apiogalacturonane 138 et est inférieure à 2,5pg/ml pour l'ensemble des arabinogalactanes et des hétéroglycanes sulfatés. L'activité biologique vis-à-vis des virus de type A est beaucoup plus réduite. Cependant, les polysaccharides arabinogalactanes et les hétéroglycanes sulfates qui présentent une activité vis-à-vis de ce type sont plus efficaces que les Carraghénanes témoins. Ainsi les arabinogalactanes 79, 98, 109, 141 inhibent entre 25 et 75 % de la réplication virale lorsqu'ils sont utilisés à 250pg/ml. Les résultats d'activité biologique d'autres polysaccharides sont présentés sur les Figures 8 et 9. Le polysaccharide 152, appartient à la famille des arabinogalactanes, les polysaccharides 158, 160 et 161 à la famille des apiogalacturonanes, et le polysaccharide 162 à la famille des hétéroglycanes sulfatés. L'ensemble de ces polysaccharides présentent une forte activité vis-à-vis du virus de type A puisque pour une concentration de 250pg/mI, le pourcentage d'inhibition est compris entre 75 et 100%. La concentration permettant d'inhiber 50% de la réplication virale est comprise entre 2,5 et 25pg/ml. Les polysaccharides 152 et 162 se caractérisent également par une forte activité vis-à-vis du virus de type B, avec une concentration permettant d'inhiber 50% de la réplication virale inférieure à 2,5pg/ml. Bien que cette concentration soit comprise entre 2,5pg/ml et 25 pg/ml, les polysaccharides 158, 160 et 161 ont également une forte capacité d'inhibition des virus B. iii) à titre de comparaison l'activité de l'inuline, du rhamnose et de l'acide Acide glucuronique cité comme agent actif dans la demande WO 98/11778 ont été testés. Leurs activités sont présentées sur les Figures ci- dessous. Comme le montrent les résultats présentés sur les Figures 10 à 15, aucun de ces composés ne présente d'activité significative contre les deux virus influenza testés. b. Pseudoaarticules rétrovirales i) L'importance des pseudoparticules rétrovirales La capacité des glycoprotéines de surface des virus enveloppés à être incorporées sur des particules virales provenant des rétrovirus, a été décrite il y a longtemps et est appelée "pseudotypage". Brièvement, il est possible 25 de contrôler l'incorporation de certaines glycoprotéines d'enveloppe de différents virus à la surface de rétrovirus recombinants dépourvus de leurs propres glycoprotéines et véhiculant un génome défectif doté d'un gène marqueur (dans le cas présent, la GFP ou « green fluorescent protein »). De tels virus hybrides, ou pseudo-particules rétrovirales (PPV), autorisent donc 30 l'infection de cellules selon les récepteurs et routes suivies par les virus parentaux dont on utilise les glycoprotéines d'enveloppe. La liste des glycoprotéines capables de s'incorporer à la surface des particules20 rétrovirales et de former des PPV fonctionnelles (i.e. PPV capable d'infecter des cellules), est impressionnante (Sandrin V, et al. (2003) Targeting retroviral and lentiviral vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 281:137-78) et inclut de nombreux virus provenant de familles très éloignées. Le concept de pseudotypage a abouti à plusieurs applications dans les différents secteurs de la recherche biothérapeutique, et plus particulièrement, dans la recherche des antiviraux. En effet, en mimant les propriétés d'entrée cellulaires des virus parentaux dont les glycoprotéines sont originaires, les PPVs permettent des nombreuses études fondamentales dans des conditions basses de confinement (L2, voire L1) même pour les virus de la classe 4, dû au fait que de tels hybrides sont défectueux pour la réplication. L'infection par les PPV est limitée à la seule étape d'entrée cellulaire et d'intégration du génome recombinant, et induit l'insertion du marqueur génétique grâce aux propriétés de la particule rétrovirale utilisée (Nègre D, et al. (2000) Characterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells. Gene Ther. 7:1613-23.). Par la suite, la mesure quantitative de l'expression consécutive du gène marqueur GFP par le biais de technique de cytofluorimétrie permet de déterminer très précisément la capacité infectieuse des PPV. Les PPVs sont donc particulièrement adaptées pour identifier des composés qui ont un effet antiviral dû à une interférence avec les fonctions des glycoprotéines de surface, comme par exemple, les inhibiteurs d'entrée cellulaire. ii) Le choix d'antigène Dans les études décrites ci-dessous, des particules rétrovirales pseudotypégs avec les glycoprotéines de surface de quatre différentes souches du virus influenza ont été utilisées. A la surface de ces PPV, les deux glycoprotéines majeurs du virus influenza ont été incorporées : l'hémagglutinin (HA) et la neuraminidase (NA) (Bosch V, et al. (2001) Inhibition of release of lentivirus particles with incorporated human influenza virus haemagglutinin by binding to sialic acid-containing cellular receptors. J Gen Virol. 82:2485-94 et Sandrin V, et al. (2002) Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ tells derived from human and nonhuman primates. Blood. 100:823- 32). Cela a permis obtenir une conformation entièrement fonctionnelle de ces glycoprotéines à la surface des PPV, en termes de l'entrée virale. Dans ces études, deux des souches virales représentent l'influenza aviaire hautement pathogène: l'influenza A H5N1 et H7N1. Les constructions génétiques qui permettent l'expression des glycoprotéines de ces deux virus influenza aviaire ont été décrites auparavant: « Fowl Plague Virus » (A/FPV/Rostock/34, H7N1, Ohuchi et al. (1994) Rescue of vector expressed fowl plague virus hemagglutinin in biologically active form by acidotropic agents and coexpressed M2 protein. J Virol 68:920-926, Hatziioannou T, et al. (1998) Incorporation of fowl plague virus hemagglutinin into murine leukemia virus particles and analysis of the infectivity of the pseudotyped retroviruses. J Virol. 72:5313-7 et Hatziioannou T, et al. (1999) Retroviral display of functional binding domains fused to the amino-terminus of influenza haemagglutinin. Human Gene Therapy 10:1533-44) et H5N1 (A/Thailand/1(KAN-1)/2004 ; Puthavathana et al., (2005) Molecular characterization of the complete genome of human influenza H5N1 virus isolates from Thailand. J Gen Virol 86:423-433 et Szécsi ], et al. (2006) Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virol J 3:70). L'intérêt spécifique d'utiliser FPV est que des essais standardisés d'infection/challenge sont disponibles chez la volaille et pourront être utilisés pour tester la protection conférée par les sucres candidats. Le développement de PPV avec des glycoprotéines provenant du virus H5N1 est très pertinent de nos jours, étant donné le risque actuel de pandémie . De plus, des PPV qui incorporent à leur surface des glycoprotéines de deux souches humaines du virus influenza qui circulent régulièrement dans la population ont été développées : l'influenza A H3N2 et une souche influenza B. Ceci a permis d'identifier des composés qui, dans le future, peuvent protéger la population humaine en cas d'épidémie causée par ces virus. Iii) La production des particules rétrovirales pseudotypées avec des glycoprotéines du virus influenza. Pour produire des particules virales pseudotypées avec des glycoprotéines de virus influenza, le mécanisme d'assemblage de ces glycoprotéines sur des particules rétrovirales (Flu-PPV, Sandrin V, Cosset FL. (2006) Intracellular versus cell surface assembly of retroviral pseudotypes is determined by the cellular localization of the viral glycoprotein, its capacity to interact with Gag, and the expression of the Nef protein. J Biol Chem. 281:528-42) a été utilisé. Brièvement, les glycoprotéines du virus influenza sont incorporées à la surface de rétrovirus déficients pour la réplication et originaires du virus de la leucémie murine (MLV). Ces Flu-PPV consistent en des protéines GagPol du MLV et un génome défectif doté du gène marqueur GFP (Hatziiannou et al., 1998, Szécsi et al., 2006). L'expression de la GFP dans les cellules infectées par ces PPV reflète précisément la capacité infectieuse des glycoprotéines à la surface des PPV. Ce système est donc un outil très adapté pour étudier l'entrée cellulaire et l'inhibition d'entrée de virus influenza. A la surface des PPV l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des différents virus influenza mentionnés ci-dessus ont été incorporé. Des Flu-PPVs ont été produits par l'expression transitoire dans des cellules productrices, des composants viraux internes (GagPol, GFP) et de surface (HA, NA). Les Flu-PPVs ont été récoltées à partir du surnageant des cellules productrices 48h après la transfection. Pour évaluer la concentration de la production Flu-PPV, leur titre infectieux a été déterminé, en ajoutant des dilutions en série de PPV porteur du gène marqueur GFP à des cellules TE671 (rhabdomyosarcoma humaine). Le titre infectieux a été déterminé 72 hr après infection en mesurant le pourcentage de cellules GFP-positives par cytomètrie en flux (FACS) comme décrit précédemment (Nègre et al., 2000). iv). Développement d'un test d'inhibition pour identifier des composés de sucre avec une activité anti-virale anti-influenza. Des particules rétrovirales, porteuses du gène marqueur GFP et incorporant à leur surface des glycoprotéines provenant de quatre virus influenza mentionnés ci-dessus, ont été utilisées pour cribler une banque de sucres, afin d'identifier ceux qui peuvent inhiber efficacement l'entrée de ces virus influenza. Différentes concentrations de sucres ont été incubées avec les Flu-PPV à 4°C pendant 40 min. Les concentrations en sucres qui ont été testées sont : 500pg/ml, 100pg/ml and 10pg/ml. Après 40 min, le mélange Flu-PPV- sucre a été mis en contact avec des cellules TE671, préalablement refroidies à 4°C. Les Flu-PPV ont été laissé pour se fixer sur les cellules pendant 2h à 4°C. Après cela, le mélange Flu-PPV- sucre a été retiré, les cellules ont été rincées avec du milieu de culture, puis incubées dans du milieu de culture pendant 72h à 37°C. Le niveau d'infectivité des cellules cibles par FACS a été mesuré en tirant profit de l'expression GFP dans les cellules infectées (Bartosch B, et al. (2003) In vitro assay for neutralizing antibody to hepatitis C virus: evidence for broadly conserved neutralization epitopes. Proc Natl Acad Sci U S A 100:14199-204). Le % d'inhibition qui reflète l'inhibition de l'entrée du virus, a été déterminé comme la diminution du titre infectieux en présence du sucre comparé au titre déterminé sans le sucre. Ce test d'inhibition est particulièrement sensible et robuste, et les résultats sont reproductibles. Ce test peut être facilement adapté au format de plaque 96 puits qui peut être facilement analysé avec notre cytomètre (HTS/CantoII, Becton-Dickinson), qui possède un adaptateur pour passer des échantillons à haut débit. Ce test d'inhibition a été miniaturisé pour augmenter la capacité de criblage : le test d'inhibition a été réalisé dans des plaques 96 puits qui nous a permis de tester 96 différents échantillons à la fois. v). Familles des composées qui inhibent l'entrée des virus influenza : modèle des pseudoparticules rétrovirales. Arabinoaalactanes La Figure 16 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2. La majorité des arabinogalactanes testés a inhibé l'entrée des PPV influenza A H3N2 (79, 237-240, 242), même à la concentration la plus faible (10pg/ml). L'efficacité de l'inhibition a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les Carraghénanes. La Figure 17 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes testés sur l'entrée des PPV influenza B. Tous les arabinogalactanes testés, à l'exception de 152, ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition pour la majorité des ces composés sucre a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les Carraghénanes. La Figure 18 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1. Tous les arabinogalactanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml, et la majorité a même été efficace à la concentration de 10pg/ml. L'efficacité de l'inhibition pour la majorité des ces composés sucre a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les Carraghénanes. La Figure 19 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H7N1. Tous les arabinogalactanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H7N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition pour la majorité de ces composés sucre a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les Carraghénanes. En résumé, une grande efficacité d'inhibition d'entrée a été détectée en utilisant les arabinogalactanes, sur les quatre types de PPV influenza. L'inhibition de l'entrée virale a été légèrement plus efficace quand les glycoproteines virales provenaient des virus influenza aviaires hautement pathogènes. Les arabinogalactanes ont été très efficace pour empêcher l'entrée virale, même à une concentration faible (i.e. 10pg/ml). L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les Carraghénanes. Aoiocalacturonanes La Figure 20 présente l'activité inhibitrice des apiogalacturonanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2. Les deux échantillons d'apiogalacturonane 160 et 161 ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H3N2 à des concentrations de 500 et 100pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces sucres a été entre 50 et 60%. La Figure 21 présente l'activité inhibitrice des apiogalacturonanes testés sur l'entrée des PPV influenza B. Tous les échantillons d'apiogalacturonane testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 40 et 65%. La Figure 22 présente l'activité inhibitrice des apiogalacturonanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1. Tous les échantillons d'apiogalacturonane testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 40 et 55%. En résumé, l'efficacité de l'inhibition de l'entrée virale par les apiogalacturonanes testés a été modérée ou haute, selon les PPV utilisées. Trois types de PPV influenza (H3N2, influenza B et H5N1) ont été inhibées par ces sucres. Hétéroglycanes sulDhatés La Figure 23 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes suiphatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2. Tous les hétéroglycanes sulphatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H3N2 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 50 et 800/0. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycanes suiphatés a été similaire à celle obtenue avec les sucres contrôles, les Carraghénanes. La Figure 24 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes suiphatés testés sur l'entrée des PPV influenza B. Tous les hétéroglycanes suiphatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 90 et 65%. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycane sulphatés a été similaire à celle obtenue avec les sucres contrôles, les Carraghénanes. La Figure 25 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes sulphatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1. Tous les hétéroglycanes sulphatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 55 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycanes sulphatés a été similaire à celle obtenue avec les sucres contrôles, les Carraghénanes. La Figure 26 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes sulphatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H7N1. Tous les hétéroglycanes suiphatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H7N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 60 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycanes sulphatés a été similaire à celle obtenue par les sucres contrôles, les Carraghénanes. En résumé, une très haute efficacité d'inhibition d'entrée des PPV influenza a été obtenue en utilisant les hétéroglycanes sulphatés, sur les quatre types de PPV. Carraghénane (sucres contrôles Dositifs) La Figure 27 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2. Tous les Carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H3N2 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 60 et 70%. L'inhibition obtenue avec ces Carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes. La Figure 28 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza B. Tous les Carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 90 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces Carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes. La Figure 29 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1. Tous les Carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 90 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés Carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes. La Figure 30 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H7N1. Tous les Carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H7N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 60 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés Carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes. En résumé, un très haut niveau d'inhibition d'entrée a été obtenu avec les Carraghénanes, sur les quatre types de PPV influenza. Néanmoins, les Carraghénanes ont été efficaces qu'à des concentrations élevées (500 et 100pg/ml), et l'efficacité de l'inhibition d'entrée a été plus faible que celle obtenue avec les arabinogalactanes. 3. Mécanisme d'action Les résultats obtenus dans la modélisation de l'entrée virale par les PPV exposés au paragraphe 2 mettent en évidence que les sucres arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates peuvent avoir un effet préventif, en plus d'un effet curatif contre les virus influenza. D'autres essais ont été réalisés a) pour mettre en évidence des interactions sucres-hémagglutine et b) sur un exemple de MOA pendant le cycle viral. a. Mise évidence des interactions sucres-hémaggiutinine L'étude des mécanismes d'action des polysaccharides d'intérêt est effectuée au moyen d'une plateforme de criblage utilisant la technologie des puces à sucres. Cette technologie - nécessitant une fonctionnalisation chimique préalable des sucres avant leur immobilisation - couplée à un procédé de détection par imagerie de Résonance Plasmonique de Surface (SPRi), est une méthode pertinente permettant d'étudier en temps réel et sans marquage des biomolécules, les interactions entre les polysaccharides immobilisés et des protéines en solution. Pour le criblage des familles de sucres décrites dans la présente invention, le ligand choisi est la glycoprotéine d'enveloppe Hémagglutinine HA, plus précisément la sous-unité soluble HA1, nécessaire à l'attachement du virus Influenza à la cellule hôte. Les études par SPR ont permis de mettre en évidence une interaction 25 spécifique et dose-dépendante entre ces sucres et la protéine purifiée HA1, et soulignent que l'action antivirale de ces polysaccharides est réalisée par inhibition de la liaison de l'enveloppe virale à son récepteur. L'illustration de ce travail est réalisée pour différents sucres appartenant aux familles suivantes : 30 *Polysaccharides d'Apiogalacturonane : 158, 160, 161, 138 - Polysaccharides d'Arabinogalactane : 79, 98, 109, 141, 237, 239, 240, 242 - Polysaccharides d'Hétéroglycane sulfaté : 162, 233, 234 -Témoin d'efficacité : Polysaccharides de Carraghénane: 164, 165, 166 i. Fonctionnalisation chimique des sucres L'immobilisation covalente des sucres sur une surface d'or nécessite au préalable leur fonctionnalisation chimique. Si de nombreuses fonctions sont disponibles sur la chaîne osidique, la fonction aldéhyde de l'extrémité réductrice possède l'avantage d'être unique, et le couplage sur cette position permet d'orienter les sucres de la même façon sur la surface. Le couplage chimique se déroule en deux étapes. Premièrement, les sucres sont modifiés par un réactif bi-fonctionnel, l'adipate dihydrazide, dont la fonction amine primaire libre peut ensuite réagir avec une molécule de pyrrole ramifiée par une chaîne d'ester activée (Pyrrole-NHS). Le principe général du couplage est résumé à la Figure 31. 1. Couplage des polysaccharides avec l'adipate dihydrazide La forme pyranose du sucre situé à l'extrémité réductrice est en équilibre avec une forme tautomérique ouverte minoritaire, présentant une fonction aldéhyde. C'est cette fonction qui réagit dans un premier temps avec l'hydrazide de l'adipate dihydrazide, en milieu acide. Cette étape, limitée par le taux d'ouverture de cycle des oses (1% de forme ouverte), est déterminante. Lors de la réaction, un équilibre vers la forme cyclique du sucre est favorisé, ce qui permet de recouvrer la forme native de l'ose. Pour réaliser le couplage : 4 mg de polysaccharides, pesés précisément, sont dissouts dans 1,8 mL de tampon de réaction Acétate de Sodium 0,1 M pH 5, auxquels sont ajoutés 200 pL d'une solution stock d'adipate dihydrazide à 500 mM. La réaction se déroule à 56°C, pendant 72 heures. Pour chaque polysaccharide couplé, une condition témoin, sans adipate dihydrazide est réalisée en parallèle. A l'issue de ce couplage, une purification par dialyse contre H20 permet de s'affranchir des sels et du réactif n'ayant pas réagi. Les sucres sont ensuite concentrés, lyophilisés et pesés afin de déterminer la quantité de sucre total recouvré. 2. Couplage des « polysaccharides-hydracide » avec le NHydroxysuccinimidyl-6-(pyrrole yl)-caproate (Pyrrole-NHS) Dans un deuxième temps, les sucres réagissent avec le NHydroxysuccinimidyl-6-(pyrrole-yl)-caproate (synthétisé comme en 1), par une réaction d'addition élimination entre l'ester activé et la fonction hydrazine libre du bras adipate dihydrazide du sucre. Cette réaction doit avoir lieu dans un tampon 50 % PBS / 500/o DMSO v/v, afin de favoriser la solubilité du Pyrrole-NHS, sans précipiter le polysaccharide. Les sucres fonctionnalisés par l'adipate dihydrazide sont repris dans du PBS à 20 mg/mL. 100 pL de sucre, 60 pL de DMSO, et 40 pL d'une solution stock de Pyrrole-NHS à 50 mM (dans du DMSO) sont mélangés. La réaction se déroule pendant 2 heures, à température ambiante. Des conditions témoins, avec les sucres non modifiés sont aussi effectuées. Au terme de la réaction, le volume réactionnel est complété à 500 pL par du tampon 50 % PBS / 50% DMSO v/v, et une étape de dialyse contre ce tampon permet d'éliminer le Pyrrole-NHS restant. Les sels sont ensuite éliminés par dialyse contre H20. Les sucres sont enfin lyophilisés, et pesés précisément. Ils sont repris à 20 mg/mL dans l'eau. 3. Estimation du rendement de couplage Un dosage calorimétrique permet d'obtenir une estimation du rendement de couplage des deux réactions, et ainsi de pouvoir greffer sur la surface les différents polysaccharides d'intérêt à une même concentration de sucre-pyrrolylé. Cette méthode, utilisant le réactif TNBSA (P2297-10 mL, Sigma-Aldrich), est basée sur la détection des amines primaires et hydrazines. Elle permet après la première réaction de couplage, de déterminer la proportion de sucres couplés avec l'adipate dihydrazide, et après la deuxième réaction, d'estimer la quantité de sucre-pyrrolylé, en mesurant une diminution des hydrazines dans la solution. La détection se fait à 450 nm (Victor 1420 Multilabel Counter), et la quantification est estimée au moyen d'une gamme étalon réalisée avec différentes solutions d'adipate dihydrazide. Dans une plaque 96 puits, 10 pL d'échantillon (sucre modifié ou non) ou de gamme étalon sont additionnés à 40 pL de tampon 0,1M Na2CO3/ NaHCO3 pH 9,6. 10 pl de réactif TNBSA dilué au 1/10ème dans ce tampon sont ajoutés dans chaque puits. Après 4 minutes d incubation, la réaction colorimétrique est stoppée par l'addition de 100 pL de tampon d'arrêt 98,5 % NaH2PO4 0,1M / 1,5 % Na2SO4 0,1M v/v, et la lecture de l'absorbance est effectuée. ii. Immobilisation des sucres : Electrospotting L'immobilisation covalente des molécules de « Polysaccharide-pyrrole» s'effectue par électro copolymérisation avec des monomères de pyrrole. Ce processus, appelé electrospotting, permet le greffage très rapide d'une biomolécule sur une surface d'or via un film de polypyrrole (Livache T, et al. Synth. Met, 2001, 121 (2-3):1443-1444). Les puces sont constituées par des prismes de verre (n = 1,717 à À= 633 nm) recouverts d'une fine couche d'or (50 nm) (Genoptics, Orsay). Le protocole, décrit par Mercey et al (Methods Mol Biol. 2007 385:159-75), consiste à préparer des mélanges réactionnels contenant du pyrrole à 20 mM et les sucres pyrrolylés à différentes concentrations (5 et 50 pM), dans du tampon d'électrocopolymérisation (50 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl, 10 % (p/v) glycérol pH 6,8). La construction de la puce est ensuite effectuée grâce à un robot (Genomic solutions) et une carte d'acquisition U12 (Lab]ack), pilotés par un logiciel Labview. Le système électrochimique est constitué d'une aiguille en céramique (X-Tend Pin, Genoptics) contenant un fil de platine de 200 dam, capable de prélever les solutions de sucres pyrrolylés contenues dans une plaque 96 puits et les déposant à un endroit précis sur le prisme. Une impulsion de tension de 2,4 V durant 100 ms entre l'aiguille (contre électrode) et la surface d'or (électrode de travail) provoque la synthèse du film de polypyrrole et son dépôt sur la surface. Quand tous les plots sont synthétisés, le prisme est rincé à l'eau, séché et conservé à 4°C. Une illustration du schéma de la disposition des plots sur la surface dorée d'un prisme, est donnée Figure 32. A gauche de la Figure 32 est présentée l'image différentielle obtenue en SPR, lors de l'injection de HA1 (H1N1) à 600 nM. Famille A : Apiogalacturonanes ; Famille B : Arabinogalactanes ; Famille C : Hétéroglycanes Sulfatés ; Famille D : Carraghénanes ; Famille E : Glucomannanes ; Hp : Héparine 15 kDa ; PPy : polypyrrole. 120 plots sont greffés sur la surface, représentant 29 polysaccharides de 5 familles à deux concentrations (5 et 50 pM en sucre pyrrolylé), et en doublet. De l'héparine (HP) de 15 kDa (Sigma) fonctionnalisée est également déposée et tient lieu de témoin positif pour le dépôt, l'injection d'un des ligands connu de ce sucre, l'interféron-y (IFNy) Sarrazin S, et al. (2005) J Biol. Chem 280:37558-64) permettant de vérifier la présence du sucre greffé. Quatre plots de polypyrrole sont aussi déposés, et servent de témoins négatifs. iii. Etude des interactions entre HA1 et les polysaccharides par 20 SPRi 1. Purification de l'Hémagglutinine L'hémagglutinine HA est un homotrimère de 220 kDa, présente à la surface des virus Influenza, et responsable de leur attachement aux cellules cibles via sa liaison aux acides sialiques attachés aux glycoprotéines et 25 glycolipides de l'hôte (Skehel JJ, Wiley DC. (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemaggiutinin. Annu Rev Biochem 69: 531-69). Chaque monomère est composé de deux sous unités, reliées entre elles par un pont disulfure : HA1 et HA2. HA1, qui est la partie soluble de la protéine, contient le site de liaison au récepteur. Les 30 hémagglutinines inclues dans ces études proviennent de deux virus de grippe aviaire extrêmement pathogènes : H5N1 et H7N1. De plus, l'hémagglutinine HA1 de la souche de virus pandémique H1N1, qui a circulée en 2009 au sein de la population humaine mondiale, a été inclus dans cette étude. Toutes les hémagglutinines ont été exprimées en tant que protéines solubles en fusion avec un Tag 6xHis, permettant leur purification. Les protéines ont été produites par transfection transitoire dans ces cellules de rein humaines 293T. Les protéines solubles ont été purifiées du surnageant des cellules productrices 48 heures après transfection. La purification des différentes HA1 par leur tag 6xHis est réalisée au moyen d'une colonne de Nickel-NTA (Quiagen), puis par une colonne de gel filtration (Superdex 75, GE Healthcare), afin d'éliminer d'éventuels contaminants. La pureté de la protéine a été vérifiée par migration sur un gel SDS PAGE suivi d'une coloration des protéines au bleu de Coomassie, ainsi que par Western Blot, par révélation avec un anticorps monoclonal anti His-Tag (Sigma) ou un anticorps anti- HA1. L'évaluation de la quantité de protéine recueillie est effectuée au moyen d'un dosage colorimétrique (QuantiPro BCA assay kit, Sigma-Aldrich), et les protéines sont conservées à 4°C. 2. Interactions HAI polysaccharides Les interactions entre la protéine purifiée, et les sucres d'intérêt immobilisés sur la puce, sont étudiées par SPRi, en temps réel et sans marquage préliminaire des molécules. Le système optique (Genoptics), décrit par Mercey E, et al. (2008) Anal Chem 80:3476-82 et Guedon P, et al. (2000) Anal Chem 72:6003-9, permet de visualiser directement les interactions sur chaque plot, et d'obtenir les courbes d'association et de dissociation des complexes polysaccharides-protéines, au moyen d'un logiciel Genovision (Genoptics). Les interactions ont lieu à l'intérieur d'une cellule d'interaction en PEEK de 7,2 pL, connectée à une pompe pousse-seringue, dans le tampon de rinçage (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0,005 % Tween 20, pH 7,4) délivré à un débit de 70 pL/min. Tous les tampons utilisés pour ces expériences sont au préalable filtrés et dégazés. Avant chaque étude d'interaction, le prisme est saturé par une injection de tampon de rinçage contenant 1 % de BSA (p/v). Après l'injection de la protéine durant 7 minutes, la surface est rincée avec du tampon de rinçage afin d'éliminer les molécules non liées, et de dissocier les complexes. La régénération est effectuée avec du tampon de rinçage contenant du NaCI 1M, ou bien de la Guanidine-HCI 2M, pendant 5 minutes. Les protéines sont injectées à des concentrations croissantes, allant de 50 nM à 800 nM. Sur la Figure 32, l'image de gauche représente le prisme vu en imagerie SPR, lors de l'injection de la protéine HA1 (H1N1) à 600 nM. Les valeurs du pourcentage de réflectivité de chaque espèce - sucre ou pyrrole, qui est le témoin négatif de nos expériences - sont relevées en fin d'injection de la protéine. Les résultats sont symbolisés sous la forme d'histogrammes, représentant le pourcentage de réflectivité du sucre (déposé à 50 pM) par rapport au pourcentage de réflectivité du pyrrole (relevés en fin d'injection), pour la concentration de 800 nM de protéine. Ces réponses ainsi normalisées, permettent de comparer les interactions obtenues pour chacun des polysaccharides étudiés. Plus la valeur est supérieure à 1, plus l'interaction observée est importante. Pour un polysaccharide de chaque famille, les courbes d'interaction 20 (association et dissociation) avec les trois protéines, injectées à différentes concentrations sont représentées sur les Figures 33 à 39. i. Etudes d'interaction avec les Arabinogalactanes La Figure 33 présente les courbes d'interaction des arabinogalactanes 25 testés avec la protéine HA1. Tous les arabinogalactanes testés ont démontré une interaction notable avec les hémagglutinines purifiées issues des trois souches de virus étudiées. On peut remarquer que, lorsque les trois protéines ont pu être testées, HA1 (H5N1) est celle qui présente l'interaction la plus forte. Les interactions observées sont largement plus fortes que celles 30 obtenues entre les protéines HA1 et les Carraghénanes, polysaccharides brevetés pour leur activité antivirale. La Figure 34 présente les courbes d'association et de dissociation entre l'arabinogalactane 79 et l'HA1 des trois virus Influenza, à différentes concentrations, alors que la Figure 35 présente les courbes d'association et de dissociation entre le pyrrole (témoin négatif) et HA1 issue des trois virus Influenza, à différentes concentrations. Les interactions observées entre les hémagglutinines et le sucre 79, qui tient lieu d'exemple, sont doses-dépendantes : plus on augmente la concentration en HA1 injectée, plus l'interaction est élevée. Nous avons vérifié que cette observation ne se fait pas pour les plots de pyrrole (cf ci-dessus). La phase d'association est relativement rapide, alors que la dissociation du complexe se déroule plus lentement. Une dissociation complète est obtenue suite à une injection de NaCl 1M dans le tampon de rinçage, ou de Guanidine-HCI 2 M suivant l'injection de la protéine à la plus forte concentration. ii. Etudes d'interaction avec les Hétéroglycanes sulfatés La Figure 36 présente les courbes d'interaction des hétéroglycanes sulfatés testés avec la protéine HA1. Les hétéroglycanes sulfatés actifs dans les tests biologiques, interagissent également de façon spécifique avec les protéines HA1 purifiées des trois souches de virus étudiés, et ces interactions sont supérieures aux Carraghénanes. La Figure 37 présente les courbes d'association et de dissociation entre l'hétéroglycane sulfaté 233 et l'HA1 des trois virus Influenza, à différentes concentrations. Comme il est illustré avec le polysaccharide 233, les interactions observées sont spécifiques et dépendantes de la concentration en protéine injectée (témoin : cf pyrrole). iii. Etudes d'interaction avec les Carraghénanes La Figure 38 présente les courbes d'interaction des Carraghénanes testés avec la protéine HA1. Les polysaccharides de Carraghénanes, déjà décrits pour leur activité antivirale, tiennent lieu de témoins d'efficacité pour les tests biologiques mis au point. Cependant, il a été constaté par cette technologie des puces à sucre, que les polysaccharides 164, 165 et 166 issus de cette famille, n'interagissaient pas ou très peu avec les hémagglutinines purifiées. Les interactions obtenues sont en effet faibles, alors que les activités antivirales sont similaires à celles des autres polysaccharides. Il peut donc être supposé que l'effet antiviral de ces polysaccharides n'est pas causé par la liaison avec la glycoprotéine HA de l'enveloppe du virus, mais se manifeste vis-à-vis d'une autre cible. La Figure 39 présente les courbes d'association et de dissociation entre le Carraghénane 164 et l'HA1 des trois virus Influenza, à différentes concentrations. b. Exemple de MOA pendant le cycle viral Le mécanisme d'action a été étudié avec l'arabinogalactane 152. Ce polysaccharide a été sélectionné en raison de sa forte activité, aussi bien vis-à-vis des virus de type A que de type B. Afin de déterminer les phases du cycle infectieux neutralisées par l'arabinogalactane 152, cinq modalités d'infection ont été réalisées de manière à discriminer les phases précoces des phases tardives de l'infection. Les différents essais ont été réalisés en présence de 30 CCID50/50p1 de virus pour une concentration finale en arabinogalactane 152 de 62,5 pg/ml. Les différentes modalités utilisées sont résumés dans la Figure 40. Les modalités 1 à 4, permettent de mettre en évidence une activité durant les phases précoces de l'infection. La modalité 5 permet l'étude d'une activité antivirale sur la phase tardive de l'infection. Les Figures 41 et 42 représentent les résultats d'inhibition de la réplication virale selon les cinq modes d'infections. L'inhibition de la réplication est principalement observable dans la modalité n°5, aussi bien en présence du virus A/Brisbane/10/07 que du virus B/Florida/04/06 montrant que la molécule 152 inhibe principalement la fin du cycle réplicatif du virus. REVENDICATIONS1 - Polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour leur utilisation en tant que médicament dans le traitement, préventif ou curatif, d'une maladie causée par un virus influenza. 2 - Polysaccharides selon la revendication 1 pour leur utilisation en tant qu'agent anti-viral contre le virus influenza dans un médicament destiné au traitement, préventif ou curatif, d'une maladie causée par un virus influenza. 3 - Polysaccharides selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce que l'activité anti-virale contre le ou les virus influenza est assurée au moins à 70%, de préférence au moins à 90%, et préférentiellement au moins à 95% par les arabinogalactanes, apiogalacturonanes ou hétéroglycanes sulfates présents. 4 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisés en ce que ledit médicament ne contient pas d'autre composé, que le ou les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, présentant une activité anti-virale significative. 5 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisés en ce qu'ils correspondent à un extrait de Codium fragile, Codium vermilara, Echinea purpurea, Echnea angustifolia, Echinea pallidae, Echinea vegetalis, Echinea atribactilus, pimpnella anisum, myroxylon, arctostaphylos, carum, capsicum, eugenia mytacea, coriandrum, inula, allium, gentiana, junipeerus, calendula, origanum, mentha labiate, commiphora, plantago, rosmarinus, ruta, lapsita, artemisa, sage, mentha, parthenium, integrifolium, eucalyptum, ou asteriacea comprenant des arabinogalactanes. 6 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisés en ce qu'ils correspondent à des arabinogalactanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 1 000 à 2. 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 3 000 à 1,1 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 50%, de préférence de 5 à 40 % des groupements sulfates. 7 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisés en ce qu'ils correspondent à un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes. 8 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 ou 7 caractérisés en ce qu'ils correspondent à des apiogalacturonanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 10 000 à 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 50 000 à 700 000 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 20%, de préférence de 4 à 12 °k des groupements sulfates. 9 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisés en ce qu'ils correspondent à un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates. 10 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 ou 9 caractérisés en ce qu'ils correspondent à des hétéroglycanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 500 000 à 5.106 g/mol et, par exemple d'environ, 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 5 à 30%, de préférence de 13 à 22 % des groupements sulfates. 11 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisés en 20 ce que le médicament ne contient pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau. 12 - Polysaccharides selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le virus influenza est choisi parmi les virus influenza humains, aviaires, équins, porcins et félins. 25 13 - Polysaccharides selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le virus influenza correspond à un virus de type B, AH5N1, A-H7N1 ou A-H3N2. 14 - Polysaccharides selon l'une des revendications précédentes pour son utilisation dans un médicament à usage vétérinaire, par exemple destiné à la 30 population aviaire. 15 - Compositions pharmaceutiques comprenant en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable :- soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara, Echinea purpurea, Echnea angustifolia, Echinea pallidae, Echinea vegetalis, Echinea atribactilus, pimpnella anisum, myroxylon, arctostaphylos, carum, capsicum, eugenia mytacea, coriandrum, inula, allium, gentiana, junipeerus, calendula, origanum, mentha labiate, commiphora, plantago, rosmarinus, ruta, lapsita, artemisa, sage, mentha, parthenium, integrifolium, eucalyptum, ou asteriacea comprenant des arabinogalactanes, - soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes, - soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates. 16 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15 caractérisées en ce qu'elles ne contiennent pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau. 17 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15 ou 16 pour leur utilisation en tant . que médicament dans le traitement, préventif ou curatif, d'une maladie causée par un virus influenza. 18 - Utilisation d'un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates dans une composition alimentaire dans laquelle ledit polysaccharide est utilisé pour lutter, à titre préventif ou curatif, contre une maladie causée par un virus influenza. 19 - Utilisation selon la revendication 18 caractérisé en ce que la composition alimentaire comprend - soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara, Echinea purpurea, Echnea angustifolia, Echinea pallidae, Echinea vegetalis, Echinea atribactilus, pimpnella anisum, myroxylon, arctostaphylos, carum, capsicum, eugenia mytacea, coriandrum, inula, allium, gentiana, junipeerus, calendula, origanum, mentha labiate, commiphora, plantago, rosmarinus, ruta, lapsita, artemisa, sage, mentha, parthenium, integrifolium, eucalyptum, ou asteriacea comprenant des arabinogalactanes, - soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes,- soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates. 20 - Utilisation selon l'une des revendications 18 ou 19 caractérisée en ce que la composition alimentaire ne contient pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau. 21 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisée en ce que le polysaccharide est choisi parmi les arabinogalactanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 1 000 à 2. 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 3 000 à 1,1 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 50%, de préférence de 5 à 40 % des groupements sulfates. 22 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisée en ce que le polysaccharide est choisi parmi les apiogalacturonanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 10 000 à 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 50 000 à 700 000 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 20%, de préférence de 4 à 12 % des groupements sulfates. 23 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisés en ce que le polysaccharide est choisi parmi les hétéroglycanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 500 000 à 5.106 g/mol et, par exemple d'environ, 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 5 à 30%, de préférence de 13 à 22 % des groupements sulfates. 24 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 23 caractérisée en ce que le virus influenza est choisi parmi les virus influenza humains, aviaires, équins, porcins et félins. 25 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 24 caractérisée en ce que le virus influenza correspond à un virus de type B, A-H5N1, A-H7N1 ou A-H3N2.