Brevet FR2968171A1 — publié le 20120608

Procédé de préparation de jus de Noni La présente invention se rapporte au domaine de la préparation de jus de noni et de son utilisation pour la santé humaine et animale. Le nono ou pomme-chien (Morinda citrifolia) est un arbre tropical de la famille des Rubiaceae ; il donne des fruits (noni) moins d'un an après sa plantation (Figure 1) ; ils sont reconnaissables à leur odeur acre et leur goût amer. L'arbuste atteint sa pleine maturité à deux ans, et fournit jusqu'à 8 kg de fruits par mois, tout au long de l'année. Le murissement de ses fruits se caractérise par l'évolution de leur couleur (Figure 2) : ils sont verts (cliché 1 de la Figure 2), puis jaunes, et deviennent blanchâtres (cliché 2 de la Figure 2) lorsqu'ils sont mûrs ; s'ils conservés davantage, ils deviennent marron clair au bout d'une à trois semaines (cliché 3 de la Figure 2), marron foncé après 4 à 6 semaines de conservation (cliché 4 de la Figure 2) puis marron noir après 7 à 8 semaines (cliché 5 de la Figure 2). Compte tenu de l'intérêt que présente le noni pour la santé, il est préparé et vendu sous forme de jus ; c'est un remède traditionnel utilisé pour le traitement de multiples désordres incluant le diabète, les troubles cardiaques, l'hypertension ; ses vertus thérapeutiques sont attribuées à la présence d'un précurseur d'un alcaloïde, la xéronine, à ses propriétés antioxydantes et à sa teneur en polyphénols variés. Traditionnellement, le jus est obtenu par écoulement spontané lors de la conservation (sénescence) des fruits murs. Le jus ainsi préparé présente cependant l'inconvénient d'avoir une odeur très désagréable et une durée de conservation limitée à cause de sa fermentation. Plusieurs documents décrivent l'intérêt d'utiliser des extraits de noni tels que son jus pour des applications thérapeutiques variées : la Demande WO 02/45734 comme anti-douleur et anti-inflammatoire, la Demande WO 2009/006565 pour inhiber la croissance de bactéries anaérobies gram-, protozoaire et autres microbes et la Demande US 2008/0206376 pour traiter l'hypertension. Les extraits utilisables pour ses applications sont par exemple des décoctions ou des infusions de feuilles, ou encore de la pulpe ou du jus de noni. Lorsqu'il s'agit de jus, il est préparé par filtration (décanteur-centrifugeuse, filtre presse ou filtration par osmose inverse) avec un seuil de coupure compris entre 1 et 2000 µm (WO 02/45734 et WO 2009/006565) voire 0,01 à 2000 1.tm (US 2008/0206376). Les jus ainsi obtenus sont ensuite pasteurisés. Ces procédés ne permettent toutefois pas de supprimer l'odeur désagréable du jus. Afin de remédier à cet inconvénient, le brevet américain US 5,288,491 propose de préparer des extraits de noni sous forme de poudre ; mais ce mode de 5 préparation altère les composés actifs du noni. La Demande FR 2 783 137 décrit la préparation d'une composition à base de noni qui consiste à cueillir le fruit à un stade de mûrissement qui correspond au moment où la couleur du fruit vire du vert au jaune blanchâtre, puis les fruits sont lavés et broyés dans une broyeuse-centrifugeuse, la pulpe est ensuite pressée pour récupérer le jus, 10 le jus obtenu est filtré sur tamis fin puis traité par dépectinisation dans le but d'obtenir un jus clair ; le jus est ensuite pasteurisé. L'inconvénient de cette méthode est que le rendement en jus obtenu en pressant précocement les fruits est faible. Il demeure donc le besoin de préparer, avec un rendement satisfaisant, un jus de noni présentant des qualités nutritionnelles et thérapeutiques aussi bonnes que celles 15 du jus de noni préparé traditionnellement mais avec des qualités organoleptiques améliorées et ayant une meilleure durée de conservation. La Demanderesse a ainsi mis au point un nouveau procédé de préparation de jus de noni désodorisé présentant une bonne stabilité microbiologique et dont la composition biochimique en composés polyphénoliques est conservée par rapport au jus de 20 fruit préparé selon la méthode traditionnelle préservant ainsi les vertus thérapeutiques dudit jus. La présente invention se rapporte donc à un procédé de préparation de jus de noni comprenant les étapes de : a) broyage de fruits de noni lorsqu'ils sont au stade de maturité blanc 25 translucide pour produire une purée de fruits de noni ; b) traitement enzymatique de ladite purée de fruits de noni avec une préparation enzymatique présentant au moins une activité pectinase, correspondant à une activité polygalacturonase (EC 3.2.1.15) supérieure à 4 UI.ml-1 et/ou une activité pectinelyase (EC 4.2.2.10) supérieure à 3 UI.ml-1, et au moins une activité cellulase correspondant 30 à une activité endo-cellulase (EC 3.2.1.4) supérieure à 20 UI.ml-1 et/ou activité exo cellulases (EC 3.2.1.91) supérieure à 4 Ul.ml-1, à une teneur comprise entre 50 à 200 ml ou g/tonne de purée de fruits de noni à une température comprise entre 20 et 55°C pendant au moins 30 minutes ; c) élimination de la pulpe et des graines présentes dans les fruits de noni par pressage de ladite purée conduisant à un premier jus ; d) tamisage ou filtration grossière dudit premier jus obtenu à l'issue de l'étape c) conduisant à un second jus ; e) microfiltration ou ultrafiltration tangentielle sur membrane céramique tubulaire de seuil de coupure inférieur ou égal à 0,5 gm dudit second jus obtenu à l'issu de l'étape d). Les activités enzymatiques sont exprimées en UI, c'est-à-dire en micromoles de groupements réducteurs libérés à partir du substrat ; ledit substrat étant l'acide polygalacturonique pour l'activité polygalacturonase (EC 3.2.1.15) ; la pectine citrique estérifiée 80% pour l'activité pectine-lyase (EC 4.2.2.10) ; la carboxyméthylcellulose pour l'activité endo-cellulase (EC 3.2.1.4) et la cellulose cristalline pour l'activité exo-cellulase (EC 3.2.1.91) et les conditions expérimentales standards sont respectivement les suivantes : pH 4, à 30°C ; pH 6 à 40°C ; pH 4,6 à 38°C et pH 4,8 à 50°C. De façon préférée : - les fruits du noni sont lavés et désinfectés avant l'étape a) de broyage ; la désinfection peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple, avec une solution aqueuse de chlore ou une solution d'hypochlorite de sodium ; - l'étape b) de traitement enzymatique est réalisée sous agitation ; - l'étape c) de pressage peut être réalisée par tout moyen, par exemple, à l'aide d'une presse à paquet, d'une presse à vis, d'une presse à bande, etc. ; - l'étape d) de tamisage ou filtration grossière peut être par exemple réalisée avec un tamis de 1,5 mm. Cette étape permet avantageusement de diminuer la turbidité du jus obtenu après pressage. La turbidité est définie comme la réduction de la transparence d'un liquide due à la présence de matières non dissoutes ; dans le cas présent, elle est inférieure à 2000 NTU à l'issue de l'étape d) (Nephelometric Turbidity Unit, dont la mesure s'effectue sur la lumière diffusée avec un angle de 90° par rapport à l'échantillon à évaluer et à une longueur d'onde de 860 nm). L'étape de traitement enzymatique conduit à la liquéfaction de la purée de fruits de noni ; elle permet d'utiliser des fruits à un stade maturité précoce au cours duquel le fruit n'a pas encore développé d'odeur trop forte ; elle permet également d'augmenter la fraction de jus récupéré et ainsi le rendement de production de jus. Cette étape peut être réalisée avec un mélange enzymatique commercial conçu pour hydrolyser les parois des fruits et faciliter le pressage et sélectionné pour ses activités enzymatiques pectinase et cellulase ; de telles préparations peuvent notamment être sélectionnées comme décrit à l'exemple I.13. A titre d'exemple, les préparations enzymatiques pourront présenter toute ou partie des activités enzymatiques suivantes dans les gammes d'activité indiquées (exprimées en UI, gnioles de produits/min), étant entendu que lesdites préparations présentent au moins les activités pectinase et cellulases telles que définies précédemment : Activité Endo- Exo- Pectine- Pecti- Poly- Xylanase Mananase Galac- p- Exo- enzymatique cellulase cellulase lyase nesterase galacturonase tanase glucosidgse arabinase Gamme 20-100 5-200 5-300 50-800 5-4000 50-250 20-50 10-100 50-200 50-300 d'activité Ces préparations peuvent être utilisées à une concentration comprise entre 50 et 300 ml/tonne de fruits, de préférence 200 ml/tonne de fruits, et entre 120 et 200 minutes de macération, de préférence 150 minutes, avec une faible agitation. L'étape e) de micro- ou d'ultrafiltration permet de retenir totalement les composés insolubles et les formes végétatives des microorganismes et leurs spores ; elle permet également de retenir les acides gras volatils hydrophobes à chaîne longue responsables de l'odeur désagréable du jus de noni. L'étape de microfiltration peut être mise en oeuvre avec des membranes en céramique (par exemple, en alumine zircone) ou des membranes organiques avec un diamètre de pores compris entre 0,05 et 0,5 µ pour les membranes de microfiltration et un seuil de coupure compris entre 10 et 50 kD pour les membranes d'ultrafiltration ; cette étape est de préférence conduite en appliquant une pression transmembranaire comprise entre 0,5 et 3 bars, de préférence entre 1 et 1,5 bar. Enfin, le jus ainsi obtenu est préférentiellement conditionné aseptiquement ; il présente alors une durée de vie d'au moins 1 an. Un contrôle de la qualité nutritionnelle du jus ainsi obtenu montre que sa composition biochimique en composés non volatils n'est pas altérée et que le jus conserve toutes ses vertus thérapeutiques. En particulier, le procédé selon l'invention n'affecte pas la composition en composés phénoliques présents dans le jus initial ainsi que son pouvoir antioxydant. En outre, ce procédé permet avantageusement de réduire la teneur en 30 acides gras volatils responsables de la mauvaise odeur du jus de noni (en particulier de l'odeur de rance) de 50 â 70 % en poids par rapport à leur teneur initiale. Ainsi, la sénescence ou le vieillissement pratiqué traditionnellement en vue de l'obtention du jus de noni apparait inutile voire même préjudiciable pour les qualités organoleptiques des jus (développement d'une odeur très forte). L'utilisation de préparations enzymatiques, notamment de mélanges commerciaux, remplace de façon avantageuse l'action très lente des enzymes naturelles du fruit sur la liquéfaction des parois cellulosiques. La présente Invention se rapporte encore au jus de fruit de noni obtenu par le procédé selon l'invention. Plus spécifiquement, la présente invention se rapporte à un jus de noni qui se caractérise par une faible teneur en composés indésirables responsables d'une odeur désagréable ; en particulier, une teneur en acide octanoïque (ou caprylique) inférieure à 200 gg/g, de préférence, inférieure à 180 µg/g de jus de noni, et une teneur en acide hexanoïque inférieure à 200 gg/g, de préférence, inférieure à 190 gg/g de jus de noni. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ce jus se caractérise en outre par une teneur en acide 2-méthyle propanoïque inférieure à 6 gg/g de jus de noni et/ou une teneur en acide décanoïque inférieure à 1 µg/g de jus de noni. Figures La Figure 1 représente deux clichés de fruits de noni verts récoltés dans la plantation de l'Université EARTH, Costa Rica. La Figure 2 regroupe plusieurs clichés qui illustrent l'évolution de la 20 couleur de l'épicarpe du noni pendant sa maturation et sa sénescence. La Figure 3 représente le schéma méthodologique de détermination des polyphénols totaux et de la vitamine C (A, obtention des différents extraits; B, protocole de Folin-Ciocalteu optimisé). La Figure 4 représente le protocole suivi pour la détermination de la 25 filtrabilité des échantillons. La Figure 5 représente le schéma du flux de procédé suivi pour l'obtention de jus de noni traité enzymatiquement ; il s'agit du jus utilisé pour la microfiltration tangentielle. La Figure 6 est un schéma du pilote de microfiltration tangentielle ; 30 légende : 1. Pompe d'alimentation, 2. Pompe de circulation, 3. Module de microfiltration, 4. Echangeur thermique, 5. Manomètre, 6. Débitmètre. La Figure 7 est un histogramme montrant l'évolution de la concentration de scopolétine et de rutine dans les fruits de noni pendant le mûrissement et la sénescence. Les valeurs présentées sont les moyennes et les écarts types de trois échantillons analysés d'une façon indépendante. a'b'c Les valeurs dans les colonnes suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes à p La Figure 12 est un graphe représentant l'effet de trois valeurs de pression transmembranaire sur le flux pendant la microfiltration de jus de noni. Exemples 1. MATERIELS ET METHODES I.1. Matériel végétal Les fruits de noni utilisés proviennent de la plantation expérimentale de l'Université EARTH (Escuela de Agricultura de la Regiôn Tropical Hûmeda), Limôn, Costa Rica. Cette Université est localisée en zone tropicale humide entre 100 et 150 m d'altitude, la température varie entre 25 et 30°C et l'humidité entre 80 et 90%. Les fruits ont été récoltés au stade de maturité « vert » (épiderme vert clair jaune pâle, texture très dure, odeur légère) (Figure 1). I.2. Préparation des échantillons pour l'étude de vieillissement Les fruits verts (noni vert) ont été lavés et désinfectés avec une solution de chlore à 200 mg.l-' et stockés dans des containers fermés à température ambiante. Trois jours après, les fruits sont parvenus à maturité et un deuxième échantillon de noni mûr est alors prélevé. A partir de ce jour-là, un échantillon est prélevé chaque semaine et ce jusqu'à la huitième semaine (Figure 2, Tableau I). Tableau I. Caractéristiques des échantillons utilisés Nom Type échantillon Caractéristiques échantillon Noni vert Noni vert (fruit récolté) Vert clair - jaune pâle, très dur, odeur légère Noni mûr Noni mûr (3 jours après la récolte) Translucide - grisâtre, mou, odeur forte Noni 1 Noni à une semaine de stockage Marron clair, mou, odeur forte Noni 2 Noni à deux semaines de stockage Marron clair, très mou, odeur plus forte Noni 3 Noni à trois semaines de stockage Marron, très mou, odeur très forte Noni 4 Noni à quatre semaines de stockage Marron foncé, très mou, odeur très forte Noni 5 Noni à cinq semaines de stockage Marron foncé, très mou, odeur très forte Noni 6 Noni à six semaines de stockage Marron foncé, très mou, odeur très forte Noni 7 Noni à sept semaines de stockage Marron-noir, très mou, odeur très forte Noni 8 Noni à huit semaines de stockage Marron-noir, très mou, odeur très forte I.2.1. Préparation de la purée de noni La purée a été obtenue à partir de la pulpe des fruits séparée manuellement des graines et broyée avec un Warring Blendor pendant 3 minutes. Pour les analyses où l'échantillon frais était requis, la pulpe a été conservé à 5°C. Pour les autres mesures, la pulpe a été congelée à l'azote liquide et lyophilisée. Les échantillons ont été conservés à -20°C. I.3. Analyses chimiques I.3.1 pH Le pH a été mesuré avec une électrode de verre et un pH-mètre (Model 530) par la méthode officielle (AOAC, 1990) sur une fraction aliquote de jus obtenue par filtration de la purée sur papier N° 4. I.3.2 Extrait sec soluble (°Brix) La concentration en extrait sec soluble a été mesurée par réfractométrie. La déviation de l'angle lumineux est rapportée à la teneur en éléments solubles présents dans le milieu. Les sucres sont les constituants majoritaires de l'extrait sec de la plupart des fruits et l'indice réfractométrique est généralement directement converti en la teneur en sucre du milieu (1 degré Brix = 1 g de sucres pour 100 ml). L'extrait sec soluble a été mesuré à l'aide d'un réfractomètre Abbe 5 (Milton Roy Company LR45227) sur une fraction aliquote de jus obtenue par filtration de la purée. La lecture a été effectuée à température ambiante. I.3.3 Détermination de la matière sèche La matière sèche des échantillons a été déterminée par gravimétrie. Les échantillons frais ont été pesés avant et après séchage dans une étuve à 50°C pendant 3 h 10 puis une nuit à 60°C dans une étuve sous vide. Les résultats sont exprimés en g.100 g-1 pulpe. I.3.4 Dosage des protéines Les teneurs en protéines ont été déterminées par dosage de l'azote par la technique de micro-Kjeldhal (Bietz, 1974). L'azote organique est oxydé en sulfate 15 d'ammonium par l'acide sulfurique concentré à chaud en présence d'un catalyseur approprié. L'azote ammoniacal formé par addition de phénol en milieu alcalin est dosé par colorimétrie suite à l'addition d'hypochlorite de sodium. La coloration bleue due à la formation d'indophénol est mesurée à 630 nm. La teneur en protéines est obtenue en multipliant la teneur en azote par 6,25. 20 1.4. Analyses microbiologiques Les analyses microbiologiques ont été réalisées sur de la pulpe des fruits le jour même de sa préparation. Toutes les analyses ont été réalisées en triple. 1.4.1 Flore totale (bactéries mésophiliques) Le contenu total en bactéries mésophiliques dans le noni a été évalué par 25 la méthode AMCITA-M001 Galerie API «Aerobic Plate Count» décrite par l'AOAC (1998). I.4.2 Moisissures et levures Le contenu en moisissures et en levures dans le noni a été évalué par la méthode officielle AMCITA-M007 décrite par l'AOAC (1998). 30 I.4.3 Bactéries acides lactiques Le contenu total en bactéries lactiques dans le noni a été évalué par la méthode AMCITA-MO22 décrite par Downes et Ito (2001). L5. Détermination de l'activité antioxydante I.5.1. Méthode O.R.A.C. (Oxygen Radical Absorbance Capacity) Le pouvoir antioxydant des échantillons a été évalué à partir de la mesure de la capacité d'absorption du radical oxygène (ORAC), en présence de fluorescéine utilisée comme indicateur d'attaque du radical péroxyle selon la méthode décrite par Ou et al. (2001) et modifiée par Vaillant et al. (2005). 0,5 g d'échantillon lyophilisé ont été mélangés à 20 ml d'une solution d'acétone/eau (50:50, v/v) et maintenus sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. Après filtration sur papier filtre, l'extrait a été dilué 100 fois avec du tampon phosphate 75 mM, pH 7,4. 750 µl de cet extrait ont été ensuite incubés pendant 15 min à 37°C avec 1,5 ml de fluorescéine 8,16 X 10-5 M (Sigma, USA) directement dans la cuve du spectrophotomètre (spectrophotomètre Shimadzu RF-1501 équipé d'une lampe de xénon). Puis 750 µl d'une solution à 153 mM d'AAPH (2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, Wako International, USA) ont été ajoutés. Une mesure de la fluorescence a été réalisée 30 secondes après cet ajout puis, toutes les minutes jusqu'à ce que la valeur de fluorescence soit inférieure ou égale à 10% de la valeur initiale. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 493 nm et la longueur d'onde d'émission à 515 nm. Pendant toute la mesure, la température de la cuve a été maintenue à 37°C. Les résultats sont donnés en équivalents du Trolox® (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique) par gramme grâce à une gamme étalon dont les concentrations sont comprises entre 10 à 50 µM. I.5.2. Méthode FTC (Ferric thiocyanate) La capacité antioxydante a été déterminée par la mesure de l'absorbance d'un complexe coloré généré par la réaction entre le péroxyde et le chlorure ferreux qui forment les ions ferriques. Les ions ferriques réagissent avec le thiocyanate d'ammonium et produisent le thiocyanate ferrique qui donne une couleur rouge. La méthode FTC a été adaptée de la méthode d' Osawa et Namiki (1981) et de Mohd et al. (2002). Préparation des extraits : 5 g de purée de noni mûr lyophilisée ont été traités avec 30 ml de méthanol à température ambiante pendant 24 heures. Puis, ce mélange a été filtré (filtre n°4) et rincé deux fois avec 20 ml de méthanol. La fraction méthanolique a été évaporée sous vide jusqu'à l'obtention de l'extrait méthanolique d'une texture pâteuse au fond du ballon. Le filtrat a été traité avec 20 ml d'acétate d'éthyle, filtré (filtre n°4) et rincé deux fois avec 10 ml d'eau distillée. La fraction d'acétate d'éthyle a été évaporée sous vide jusqu'à l'obtention d'une texture pâteuse au fond du ballon (extrait d'acétate d'éthyle). Ces extraits sont les échantillons à utiliser pour la méthode FTC et TBA. 4 mg d'échantillon (extrait méthanolique et extrait d'acétate d'éthyle) ont été ajoutés à 4 ml d'éthanol 99,5% (p/v) et mélangés avec 4,1 ml d'acide linoléique à 2,51% dans l'éthanol, 8 ml de tampon phosphate (0,05 M, pH 7,0) et 3,9 ml d'eau distillée. Cette solution a été conservée dans un flacon opaque à l'obscurité à 40°C. 0,1 ml de cette solution a été alors ajouté à 9,7 ml d'éthanol à 75% (v/v) et 0,1 ml de thiocyanate d'ammonium 30% (p/v). Puis 3 minutes après avoir ajouté 0,1 ml de chlorure ferreux 20 mM en acide chlorhydrique à 3,5% (v/v) à ce mélange réactionnel, l'absorbante a été mesurée à 500 nm toutes les 24 h jusqu'à ce que l'absorbante du contrôle atteigne sa valeur maximum. Le contrôle négatif a été fait avec de l'éthanol pur et le contrôle positif avec 4 mg de BHT (SIGMA). Les résultats sont exprimés en différence d'absorbante laquelle est inversement proportionnelle à la capacité antioxydante. I.5.3. Méthode TBA (Thiobarbituric Acid Test) La capacité antioxydante des échantillons a été évaluée à partir de la mesure de l'absorbante d'un complexe rouge généré par la réaction entre l'acide thiobarbiturique et le produit obtenu de la péroxydation lipidique (malonaldéhyde) de l'extrait en conditions acides. La méthode TBA a été accomplie selon la méthode adaptée de Kikuzaki et Nakatani (1993), Ottolenghi (1959) et Mohd et al. (2002). Cette méthode s'applique aux extraits méthanoliques et d'acétate d'éthyle. 1 ml d'échantillon a été ajouté à 2 ml d'acide trichloracétique et 2 ml d'une solution d'acide thioarbiturique 20%. Ce mélange est alors placé dans un bain à 100°C pendant 10 minutes. Après refroidissement, le mélange est centrifugé à 3000 g pendant 20 minutes et l'absorbante du surnageant est mesurée à 532 nm. Les résultats sont exprimés en différence d'absorbante laquelle est inversement proportionnelle à la capacité antioxydante. I.6. Détermination de la teneur en polyphénols I.6.1. Détermination de la teneur en polyphénols totaux La teneur en polyphénols totaux a été mesurée par une adaptation de la méthode Folin-Ciocalteu (Georgé et al., 2005) (Figure 3). Pour la préparation de l'échantillon, 0,3 g de noni lyophilisé a été ajouté à 10 ml d'une solution d'acétone/eau (70/30, v/v) et le mélange est maintenu sous agitation pendant 10 minutes avec un agitateur magnétique. La suspension a été ensuite broyée à l'aide d'un ultra-turax pendant 2 minutes puis agitée pendant 5 minutes avant d'être filtrée sur papier filtre N° 1. Ce filtrat est alors appelé extrait brut. Une fraction aliquote de 50 µl d'extrait brut a été ajoutée à 450 µl de méthanol contenu dans un tube à essai flacon. 2,5 ml de réactif de Folin (dilué 10 fois avec de l'eau distillée) ont été ajoutés et l'ensemble a été laisser à incuber 2 min à température ambiante. Ensuite, 2 ml d'une solution de carbonate de sodium (75 g.1-1) ont été ajoutés et l'ensemble a été placé 15 min dans un bain marie à 50°C. L'absorbance a été mesurée à 760 nm après refroidissement complet dans un bain d'eau glacé. Les résultats sont donnés en équivalents d'acide gallique (EAG) par 100 grammes grâce à une gamme étalon dont les concentrations d'acide gallique sont comprises entre 0 et 100 mg.l"1 (équation de la droite d'étalonnage = 0.021, R2 = 0,98). Pour éliminer les interférences liées à la présence d'acide ascorbique et certains sucres dans l'extrait brut, 500 µl d'extrait brut sont mélangés avec 3500 µl d'eau et 500 µl de cette solution ont été déposés sur une cartouche OASIS© et rincés deux fois avec 2 ml d'eau distillée. La cartouche retient les composés phénoliques alors que les autres composés réducteurs sont élués par le lavage à l'eau. 500 µl de cette solution aqueuse sont alors traités comme l'extrait brut avec le réactif de Folin. Par conséquent, pour trouver la concentration réelle en polyphénols, il faut soustraire l'interférence au contenu total de polyphénols. I.6.2. Dosage de l'acide ascorbique Le dosage de l'acide ascorbique et de l'acide déhydroascorbique a été réalisé par CLHP d'après un protocole adapté de celui décrit par Kacem et al. (1986). L'analyse a été réalisée sur de la purée fraîche le jour même de sa préparation. Les échantillons ont été mis à l'abri de la lumière. L'extraction des acides ascorbique et déhydroascorbique a été réalisée avec une solution d'acide métaphosphorique et d'EDTA pour éviter l'oxydation liée à l'air et à la lumière. 5 g de purée de noni ont été mélangés avec 40 ml d'une solution de dilution préparée par mélange en part égale d'une solution à 3% d'acide métaphosphorique et 8% d'acide acétique préparée dans l'eau et d'une solution renfermant 3,6 g.l-1 d'EDTA dans l'eau. Après 30 minutes d'agitation suivies d'une heure de repos, le mélange a été centrifugé à 2500 g pendant 5 min. Le surnageant et les lavages du culot réalisés avec la solution de dilution ont été transférés dans une fiole jaugée dont le volume a été ajusté à 100 ml. Cette solution a été microfiltrée sur une membrane de 0,45 µm et 10 µl ont été injectés en CLHP (colonne C18 Alltech Econosphera, granulométrie 5 µm, 4,6 x250 mm, débit d'élution 0,7 ml.miri-1 avec KH2PO4 0,1 mon-1 (13,60 g.1-1) ajusté à pH 2,50 avec de l'acide phosphorique, température 40°C). L'acide ascorbique est détecté en sortie de colonne par spectrophotométrie UV (254 nm) et l'acide déhydroascorbique est détecté par fluorescence (430 nm de longueur d'onde d'émission, 350 nm de longueur d'onde d'excitation). Les résultats ont été exprimés en mg.l-1 d'acide ascorbique et en mg.l"1 d'acide déhydroascorbique grâce à l'utilisation de gammes d'étalonnage de 10 à 200 mg.l-1 d'acide. La Figure 3 représente le schéma méthodologique de détermination des polyphénols totaux et de la vitamine C (A, obtention des différents extraits; B, protocole de Folin-Ciocalteu optimisé). I.7. Identification de composants phénoliques dans le noni par chromatographie sur plaque ou chromatographie sur couche mince En chromatographie sur couche mince, la phase stationnaire est déposée sous la forme d'un film très adhérent sur une surface plane solide rigide comme le verre ou flexible comme l'aluminium ou le plastique. Les phases stationnaires les plus utilisées sont le gel de silice et la poudre de cellulose. Selon sa nature, cette phase agit comme une phase d'adsorption ou comme un support de liquide, ce qui permet la mise en oeuvre de phénomènes de séparation variables. Les échantillons sont déposés en faible quantité sur la plaque puis celle-ci est déposée dans une cuve en présence de la phase mobile. Cette phase va alors migrer au travers de la phase stationnaire essentiellement par capillarité entraînant plus ou moins rapidement les différents composés du mélange. La vitesse de migration dépend en effet de l'affinité du composant pour la phase stationnaire d'une part, et d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. 100 mg d'échantillon lyophilisé ont été mélangés avec 2 ml d' éthanol 80% et homogénéisés dans un bain à ultra-sons pendant 15 minutes. Ce mélange a été ensuite filtré sur papier filtre ou sur du coton puis stocké à 4°C avant d'être déposé (2 à 5 µl) sur une plaque de cellulose (Merck 1.05552.0001). La plaque a été ensuite placée dans la cuve à solvant en présence du solvant de travail (acide acétique 2%, solvant D : (CH2C12/CH3COOH/H2O, 60:40:4, v/v/v), acide acétique 15% ou n-butanol/acide acétique/eau (40:10:22, v/v/v)). La migration a été arrêtée à 1,5 cm du bord supérieur, puis la plaque a été séchée et éventuellement traitée avec le révélateur approprié (NEU: 2- aminoéthyle diphényborinate et PEG polyéthylenglycol) avant d'être observée à la lumière ou sous UV. L'identification des composés phénoliques a été rendue possible grâce à l'utilisation de différents étalons (alizarine, aucubine, isoquercitrine, 1-kaempferol, kaempferol-3-glucoside, rutine, morine et quercetine). I.8. Détermination des composants phénoliques dans le noni par HPLC 500 mg de poudre de noni lyophilisée et 25 ml de méthanol ont été homogénéisés dans un bain à ultra-sons pendant 1 heure et puis sous agitation pendant 30 minutes. La suspension a été ensuite filtrée et séchée au rotavapor à 40°C. Les composants phénoliques ont alors été récupérés avec 2 ml d'un mélange méthanol:eau (50:50, v/v) et microfiltrés sur une membrane de 0,45µm. L'extrait récupéré a été stocké à -20°C jusqu'à son analyse par HPLC (Dubber et Kanfer, 2004). L'appareillage utilisé est une chaîne Waters (Millipore Corp. Milford, USA), comprenant un injecteur à boucle, deux pompes haute pression modèle 510, un contrôleur automatique de gradient, un four à colonnes, un détecteur à barrette de diodes Waters modèle 990 avec un logiciel de traitement de données. La séparation a été réalisée à 40°C sur une colonne 100 RP-18 (phase inverse) (Merk, Lichspher), granulométrie 5 µm, dimensions 4x250 mm. 20 µl d'extrait ont été injectés et l'élution a été réalisée par un gradient des solvants A (100 % acétonitrile) et B solution aqueuse à 3% d'acide formique dont les caractéristiques sont rapportées dans le Tableau II. Tableau II. Gradient d'élution de la phase mobile. Pourcentage du Pourcentage du solvant A solvant B 0 15 85 0,7 15 25 75 0,7 33 25 75 0,7 La détection a été réalisée à 350 nm et les concentrations en scopolétine, rutine et quercétine ont été déterminées grâce à des gammes étalon réalisées pour chaque constituant entre 20 et 50 µg/ml dans un mélange méthanol:eau (50:50, v/v). I.9. Détermination des composants aromatiques Extraction des composants aromatiques 1 g de jus ou purée de noni et 45 µg de n-octanol ont été homogénéisés à l'aide d'un Potter Elvejhem en présence de 50 ml du mélange azéotropique (pentane/éther, Temps (minutes) Débit (ml.min"1) 1:1 v/v) pendant 5 minutes à température ambiante. La phase azéotropique est ensuite récupérée et déshydratée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à 1 ml sur colonne Vigreux à 37°C. Les extraits ont été stockés à -20°C jusqu'à analyse. Dosage des composants aromatiques L'identification et la quantification des composants aromatiques ont été réalisées à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard 6890 couplé à un spectromètre de masse Hewlett-Packard 5973 fonctionnant en mode impact électronique. La colonne utilisée est une colonne capillaire DB-Wax (60 m x 0,32 mm ; épaisseur de phase 0,25 µm ; J/W Scientific, Folsom, CA, USA). Les conditions d'injections sont les suivantes : Température de la source : 230°C, Température du quadripole : 150°C, Energie 70 eV Température du four : 40°C pendant 3 minutes, puis 3°C.miri-1 jusqu'à 250°C, enfin 20 min à 250°C, Gaz vecteur : He à 1,1 ml.miri-1. 2 µl d'extrait ont été injectés et les composants volatiles ont été identifiés sur leurs spectres de masse (homologie avec le spectre de référence > 90% des bibliothèques de Wiley 275 et MME NIST) et sur leurs indices de rétention linéaires (IRL) calculés à partir d'un mélange de n-alcanes (C5-C30). Le log P (coefficient de partition de l'octanol-eau) a été obtenu à partir de la littérature. Les résultats ont été exprimes en µg.g-1 pulpe et développés par l'analyse de composés principales (ACP) en utilisant le logiciel XLSTAT Version 2007.1. I.10. Préparation des matériels insolubles dans l'alcool (MIA) La méthode est basée sur l'insolubilité des composants polysaccharides pariétaux dans l'éthanol à 80% (v/v) et permet de les séparer des constituants cytoplasmiques et vacuolaires (Selvendran, 1975). Les échantillons (100 g de purée de noni) ont été mélangés avec 400 ml d'éthanol 95% bouillant pour inhiber les activités enzymatiques endogènes (pectineméthylestérases, polygalacturonases) et d'éliminer les constituants de faibles masses moléculaires comme les sucres solubles (glucose, fructose, saccharose), les acides organiques (acide tartrique, acide citrique) et les pigments. Le mélange a été maintenu 30 minutes à ébullition afin d'inhiber les activités enzymatiques endogènes puis il a été filtré sur fritté n°3. Le précipité récupéré a été ensuite lavé par deux volumes d'éthanol à 80%, puis deux volumes d'éthanol absolu, deux volumes d'acétone et enfin un volume d'éther. Le précipité final a été séché à 60°C pendant 3 heures puis entièrement déshydraté à l'étuve sous vide à 55°C pendant une nuit. Le produit a alors été pulvérisé et stocké à 20°C. I.11. Préparation de la matière insoluble dans l'alcool et dans l'eau (MIA-E) Le MIA a été lavée avec de l'eau à 5°C jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de sucres (test d'anthrone négatif). Le précipité insoluble dans l'eau a été séché par lyophilisation (MIA-E). L'eau de lavage qui contient les pectines solubles a également été séchée par lyophilisation. Les lyophilisats obtenus ont ensuite été pulvérisés et stockés à - 20°C. I.12. Détermination des sucres (test d'anthrone) Par chauffage en milieu acide, les polyosides sont hydrolysés en sucres neutres que forment des dérivés f u-furiques avec l'anthrone (9,10-hydro-9-oxoanthracéne). Ces derniers se condensent avec l'anthranol pour former un composé bleu-vert dont le maximum d'absorption se situe à 625 nm (Dubois et al., 1956). 10 mg des échantillons (MIA, MIA-E, MIA-E traité enzymatiquement et cocktails enzymatiques) ont été préparés par l'adition de 10 ml d'une solution tampon à pH 4,6. Pour les échantillons traités enzymatiquement 100, 150 et 200 1.11.1-' d'un cocktail enzymatique ont été additionnés. Les produits obtenus ont ensuite été incubés sous agitation à 30°C pendant 60 minutes. Puis les enzymes ont été inactivées par immersion dans un bain-marie à 80°C pendant 2 minutes. Les produits sont filtrés et stockés à -20°C jusqu'à leur analyse qui a été réalisée selon le protocole suivant. 100 µl de la solution à tester et 1,15 ml d'eau distillée ont été placés dans un bain d'eau glacée. Puis 2,5 ml de la solution d'anthrone (0,1 g d'anthrone dans 50 ml d'acide sulfurique) ont été ajoutés. Le mélange obtenu a ensuite été placé dans un bain marie porté à ébullition pendant 10 minutes exactement afin de permettre le développement de la couleur. La réaction a été arrêtée en plaçant le mélange dans un bain d'eau glacée pendant 5 minutes. Puis la mesure de l'absorbance à 625 nm a été réalisée. Les résultats sont exprimés en pourcentage grâce à l'utilisation d'une solution étalon de 10 et 50 µg.ml-1 de glucose. I.13. Sélection du mélange enzymatique pour la liquéfaction du jus de noni I.13.1 Test de filtrabilité Le test de filtrabilité permet d'identifier de manière rapide l'activité du 5 mélange enzymatique sur la purée de noni. 7 mélanges enzymatiques commerciaux (Tableau III) ont été testés. Tableau III. Mélanges enzymatiques testés pour la liquéfaction de la pulpe de noni Mélanges enzymatique Activités enzymatiques dominantes Rapidase° -citrus UF Rapidase°-pineapple Rapidase°-UF Rapidase°-vegetable juice Clarex®-citrus 12XL Rapidase®-TF Kerzyme®-150 Pectinase et hémicellulase Hémicellulase Pectinase Pectine cellulase Pectinase et cellulase Pectinase et cellulase Pectinase et cellulase Compositions détaillées des préparations à activités pectinase et 10 cellulase : CX Cl PL PE PG xylanase Mananase Galactanase (3- Exo- glucosidgse arabinase Clarex citrus 53 157 92 256 1056 119 26 45 64 166 12XL Klerzyme 150 65 134 116 52 46 65 21 30 61 58 Rapidase TF 19 12 258 716 3658 222 31 89 159 262 La purée de noni mûr a été obtenue à l'aide d'une raffineuse avec un tamis de 1 mm. 1 kg de purée de noni a été mélangé avec 200 gkg-1 du cocktail enzymatique et laissé à température ambiante pendant 60 minutes. Ensuite, la purée a été placée dans un sac en toile filtrante et le volume de filtrat récupéré en 25 minutes a été 15 déterminé. Ce volume est proportionnel à l'activité du cocktail enzymatique testé. La Figure 4 représente le protocole suivi pour la détermination de la filtrabilité des échantillons. I.13.2. Détermination de la concentration et du temps optimal d'action du mélange enzymatique Pour la détermination de la concentration et du temps optimal d'action des mélanges enzymatiques, deux plans d'expérience central rotatif avec répétition du point central ont été utilisés (Tableaux IV et V). Une quantité déterminée du mélange enzymatique à étudier a été ajoutée à 1 kg de purée ; le tout est laissé à température ambiante pendant le temps déterminé par le plan d'expérience. Ensuite, la pulpe a été filtrée grâce à l'aide d'un petit sac de tissu pendant 25 minutes. Le rendement d'extraction a été déterminé à partir de la mesure du volume récupéré. Les résultats ont été exprimés par la méthode de la surface de réponse (MSR) qui est la plus couramment utilisée à la suite de tels plans d'expériences (Gacula, 1984). Le logiciel de traitement statistique JMP version 4.0.4 a été utilisé pour analyser les résultats. Tableau IV. Premier plan d'expérience pour la détermination de la concentration et du temps optimal d'action des mélanges enzymatiques sélectionnés. Test (codifié) Essai Facteur 1 Facteur 2 Temps (min) Concentration (ppm) 1 1 1 2 -1 -1 3 0 0 4 1 -1 5 0 0 6 0 0 7 -1,4142 0 8 -1 1 9 0 1,4142 10 1,4142 0 11 0 0 12 0 0 13 0 -1,4142 -1,4142 = 18 minutes et 29,3 ppm -1 = 30 minutes et 50 ppm 0 = 60 minutes et 100 ppm 1 90 minutes et 150 ppm 1,4142 = 102,4 minutes et 170,7 ppm Tableaux V. Deuxième plan d'expérience pour la détermination de la concentration et du temps optimal d'action des mélanges enzymatiques sélectionnés Test (codifié) Essai Facteur 1 Facteur 2 Temps (min) Concentration (ppm) 1 -1,4142 0 2 1 1 3 0 1,4142 4 1,4142 0 1 -1 6 0 -1,4142 7 0 0 8 -1 1 9 -1 -1 5 -1,4142 = 23 minutes et 8,6 ppm -1 = 50 minutes et 50 ppm 0 = 115 minutes et 150 ppm 1 = 180 minutes et 250 ppm 1,4142 = 207 minutes et 291 ppm I.14. Microfiltration tangentielle du jus de noni I.14.1. Préparation du jus de noni Le jus de noni frais a été produit à partir de fruits de noni mûrs récupérés trois jours après leur récolte. Les fruits ont été lavés et désinfectés avec une solution de chlore à 200 mg.l-1 puis dépulpés à l'aide d'une raffineuse avec un tamis de 2,5 mm. La purée a été traitée avec 200111.1-1 du produit commercial Klerzyme®-DSM pendant 150 minutes à température ambiante. La purée traitée a ensuite été filtrée sur tissu et le jus obtenu a été stocké à -20 °C (Figure 5). I.14.2. Protocole de microfiltration tangentielle Les essais de microfiltration ont été réalisés avec un équipement pilote de 20 microfiltration tangentielle installé au CITA-UCR au Costa Rica (Figure 6). Le pilote comprend une cuve d'alimentation de 200 litres de capacité reliée à la pompe d'alimentation. Il est équipé d'une membrane céramique de microfiltration (Tube multicanaux membralox P19 40 commercialisé par la société Pall Exekia). Cette membrane en a-alumine présente un diamètre moyen de pore de 0,2 µm, une surface totale filtrante de 0,22 m2. Les essais ont été réalisés à une vitesse tangentielle (U) de 7 m.s-1, une température de 35°C et un volume de travail de 501 de jus de noni prétraité enzymatiquement. Le volume mort de l'installation est de 3,9 1. Trois pressions transmembranaires (Ptm) de travail ont été choisies pour déterminer l'effet de ce paramètre sur les caractéristiques du rétentat et du perméat obtenus (Tableau VI). Tableau VI. Pressions transmembranaires testées dans la microfiltration tangentielle du jus de noni. Pression d'entrée Pression de sortie Ptm (tr/min) (bar) (bar) (bar) Ptm faible 1,8 0 0,9 144 Ptm moyenne 2,2 0,45 1,3 444 Ptm élevée 3,0 1,25 2,1 804 La cuve d'alimentation a été remplie avec 501 de jus de noni, puis l'installation a été alimentée en continu. La filtration a été réalisée avec extraction continue du perméat et s'est poursuivit jusqu'à ce que le volume de rétentat soit égal au volume mort de l'installation. Pendant les essais, le flux (Jp) et le facteur de réduction volumétrique (FRV) du procédé ont été déterminés. Les formules mathématiques permettant le calcul de ces deux paramètres sont données par les équations 1 et 2 : Jp = flux de pérmeat/ surface totale filtrante (1/h.m2) Equation 1 Equation 2 FRV = Va = Vr + Vp Où Va est le volume d'alimentation, Vr le volume du rétentat et Vp le volume du pérmeat. I.14.3. Détermination de la turbidité La turbidité de chaque échantillon (jus de noni traité enzymatiquement, perméat et rétentat) a été déterminée en utilisant un turbidimètre Hach 2100AN (Rach Co., Loveland, CO). Les résultats sont reportés en unités NTU. II. Caractérisation de la composition biochimique du noni au cours de son mûrissement et de sa sénescence II.1. Potentiel antioxydant Le Tableau VII ci-dessous montre l'évaluation de la concentration en phénols totaux et en vitamine C et la détermination de l'activité antioxydante (ORAC) 10 dans les fruits de noni pendant le mûrissement et la sénescence. Echantillons Phénols" (mg GAE.100 g 1 pulpe) Vitamine CB (mg.100 g-1 pulpe) ORAC` (µmol Trolox.g 1) Noni vert (Vert clair - jaune pâle) Noni mûr (Translucide - grisâtre) S Semaine 1 e Semaine 2 n e Semaine 3 s Semaine 4 Semaine 5 Semaine 6 c Semaine 7 e Semaine 8 A Exprimés en milligrammes 41,4 (6,9)a'b 391 (22)a 7,4 (0,4)a'b 51,1 (1,8)a'b 316 (64) a'b 8,0 (0,8) a 43,9 (17,5) a'b 293 (79) b 7,8 (1,4) a'b 27,5 (10,4) a 278 (44) b'd 6,8 (0,9) a'b 29,4 (19,3) a 223 (37) b'c'd 7,2 (2,1) a'b 45,3 (12,4) a'b 318 (51) a'b 8,4 (0,8) a,b 50,8 (12,4) a'b 294 (41) b 7,1 (0,5) a'b 60,0 (12,5)1) 148 (46) ` 9,1 (1,0) b 29,9 (10,6) a 284 (18) b'd 9,4 (1,4) a,b 29,2 (13,0) a 193 (28) d'c 8,7 (0,9) a d'équivalent acide gallique (GAE) par 100 g de pulpe sans c e n graines B Somme d'acide ascorbique et d'acide déhydroascorbique par gramme de pulpe fraîche sans graines 15 c ORAC est la capacité d'absorbance du radical oxygène et elle est exprimé en µmol de Trolox ® par gramme de pulpe fraîche sans graines a,b,c Les valeurs dans les colonnes suivies par la même lettre ne sont pas significativement différentes à P III. Choix de la préparation enzymatique pour la liquéfaction enzymatique des parois cellulaires Le but de ces essais est d'optimiser la liquéfaction enzymatique des parois cellulaires du noni mur au stade blanc translucide. Au cours des traitements de clarification, des enzymes pectinolytiques ont été ajoutées pour améliorer la production du jus et faciliter sa clarification. Le prétraitement enzymatique des jus permet de réduire à la fois la viscosité pour faciliter les post-traitements de filtration ; la dépectinisation est donc nécessaire pour augmenter le flux lors de l'application de la technique de clarification par membranes. En général des préparations commerciales de pectinases sont ajoutées à des concentrations variant de 0,005% à 0,015% et la durée du traitement varie de 6 à 8h à une température comprise entre 15 et 20°C ou de 1 à 2h à une température comprise entre 45 et 55°C. Le détail du plan d'expérience et du protocole mis en oeuvre figure au paragraphe I.16, ci-avant. Dans le cas de noni et au regard des caractéristiques chimiques de la MIA (en particulier sa richesse en pectine, cellulose et acides galacturoniques), le cocktail enzymatique à privilégier devra contenir des quantités importantes de pectinase (polygalacturonase et/ou pectine-lyase) et de cellulase (endo-cellulase et/ou exocellulases). 20 Sept préparations enzymatiques commerciales utilisées dans l'industrie ont été testées en mesurant leur effet de solubilisation sur la filtrabilité des jus, la Figure 10 montre le volume de jus de noni obtenu au cours de 25 minutes de filtration après le traitement enzymatique (200 µl de mélange enzymatique.kg-1 pulpe de noni pendant 60 minutes à température ambiante) (les valeurs numériques représentent l'augmentation de 25 volume par rapport au volume du témoin non traité). Les meilleurs rendements d'extraction de la pulpe de noni mûr, sont obtenus avec les mélanges Clarex-citrus 12 XLe, Rapidase-TF® et Klerzym-150®. Par rapport au volume de filtrat récupéré à partir de pulpe de noni non traitée, ces trois mélanges enzymatiques ont produit plus de 18 fois le volume drainé pendant la filtration. 30 Afin d'optimiser le traitement de liquéfaction du jus, un plan d'expériences centrale composé a été mis en oeuvre pour départager les trois préparations présélectionnées et en faisant varier la concentration en enzyme et le temps de réaction. Après hydrolyse, les échantillons ont été filtrés à 28±1°C pour la température pendant 25 10 15 minutes. L'efficacité du traitement enzymatique a été évaluée à la fois en terme de rendement d'extraction en jus (Tableau IX), en fonction de la turbidité du jus (Tableau X) qui est un indicateur pertinent de la filtrabilité en microfiltration tangentielle, puis finalement en fonction de la viscosité (Tableau XI). Les résultats montrent que le traitement réalisé avec la préparation Klerzym-150® permet un rendement extraction supérieur et l'obtention de jus moins troubles. Tableau IX. Rendements en jus de noni obtenus en 25 minutes de filtration après traitement enzymatique avec les cocktails testés (résultats du deuxième plan d'expérience). Temps Concentration Rendement (%) (min) (µg/ml) Klerzym-150® Rapidase-TF® Clarex-citrus 12 XL® 23,08 150 7,9 6,2 10,5 50 50 5,8 4,8 8,7 50 250 18,3 11,5 16,4 115 8,58 3,3 2,1 3,2 115 150 26,3 17,15 22 115 291,42 24,2 20,6 22,7 180 50 13,6 8,5 14,6 180 250 25,5 21,1 23,5 206,92 150 27,4 24,2 25,7 Tableau X. Turbidité des jus de noni récupérés au cours des 25 minutes de filtration en fonction du traitement enzymatique testé (résultats du plan d'expérience utilisant comme point central 60 minutes et 100 gl.kg-1 de pulpe). Temps Concentration Turbidité (NTU) (min) (µl/Kg pulpe) Klerzym-150® Rapidase-Tr Clarex-citrus 12 XL® 17,57 100 213 369 331 30 50 446 531 545 30 250 253 360 163 60 29,29 205 571 268 60* 100* 158* 498* 219* 60 170,71 267 453 164 90 50 253 282 288 90 150 143 271 170 102,43 100 153 125 178 * Moyenne de 5 répétitions Tableau XI. Viscosité du jus de noni traité avec les trois mélanges enzymatiques testés (résultats du deuxième plan d'expérience). Clarex-citrus 12 XL® Concentration Temps (min) (µl/Kg pulpe) Klerzym-150® Rapidase-TF® (cpoise) 23,08 150 40,26 41,61 40,95 50 50 41,49 43,80 41,45 50 250 41,25 43,70 39,73 115 8,59 52,44 59,81 42,63 115 150 39,62 44,54 40,41 115 291,42 38,96 42,87 39,51 180 50 43,39 49,12 41,76 180 250 39,67 40,18 41,45 206,92 150 39,37 42,97 39,79 Pour la préparation commerciale K1 erzyme-1508, l'analyse du rendement en fonction de la concentration en enzymes utilisée et le temps d'incubation a permis d'établir le graphe de la Figure 11 qui représente la surface de réponse du rendement du cocktail enzymatique Klerzyme-150° en relation à la concentration et temps d'activité dans la pulpe de noni mûr. Ainsi, il apparait que les conditions optimales de traitement ont été 10 déterminées en utilisant les résultats du plan d'expérience précédent. Dans ces conditions, l'optimum correspond à l'utilisation de 200 ml.kg-1 de fruit et 150 minutes de macération avec une faible agitation. IV. Mierofiltration tangentielle du jus de noni IV.1. Essais à l'échelle pilote Après récolte, les fruits de noni verts ont été conservés pendant trois jours à température ambiante, puis ils ont été dépulpés à l'aide d'une raffineuse. Le rendement en jus de cette première étape a été élevé (82%), les rejets correspondant essentiellement aux graines et au résidu de pulpe adhérant à ces dernières. La pulpe récupérée a été additionnée d'enzymes (200 gkg-1 du produit Klerzyme-150®) et laissée 150 minutes à température ambiante (28°C±1 °C) puis pressée pour obtenir le jus à microfiltrer. Le rendement en jus de cette seconde étape a été de 73%. Le rendement total de production de jus de noni mûr traité enzymatiquement a été de 60% (Tableau XII ci-dessous). Tableau XII. Rendements de production du jus de noni mûr pour les essais de microfiltration (traitement enzymatique : Klerzyme-150® à 200 µl.kg-1 pulpe et 150 minutes d'action). Etapes Rendement (%) Etape 1 : récupération de la pulpe 82 (2) Etape 2 : traitement enzymatique de la pulpe 73 (5) Procédé global 60 (6) Pour les conditions opératoires de la microfiltration tangentielle (MFT), la température moyenne d'alimentation est fixée à 35°C. La vitesse tangentielle a été fixée ici à 5 m.s-1. La pression transmembranaire, facteur également important pour les performances du procédé de microfiltration a variée en fonction des expériences réalisées. Le Tableau XIII récapitule les conditions opératoires des essais de microfiltration réalisées. Tableau XIII. Conditions opératoires des essais de MFT du jus de noni mûr. Paramètres Valeurs Suspension filtrée : 501 de pulpe de noni prétraitée par voie enzymatique (200 p.l.kg 1 pulpe de Klerzyme-150®-DMS 150 minutes à 28 ± 1°C) Vitesse tangentielle (U) 7 m.s-1 Température de filtration (T) 35 °C Pression transmembranaire (Ptm) Variable 0,9 bar-1,325 bar-2,125 bar Effet de la pression transmembranaire (Ptm) Les flux de pérmeat en fonction du temps obtenus lors des essais de microfiltration sont présentés dans la Figure 12. Les valeurs des flux obtenus pour les trois essais réalisés à différentes Ptm sont comprises entre 100 à 160 1.h-1.m2. Ces valeurs sont importantes et très supérieures à celles obtenues lors d'essais de MFT avec d'autres fruits. On constate qu'au-delà d'une valeur optimale (Ptmoptimale) correspondant environ à 1,3 bar, le flux n'augmente plus avec la Ptm. Par conséquent, la mise en oeuvre de la MFT à des pressions supérieures à cette valeur optimale, n'entraînera que des augmentations de coût de fonctionnement et des risques accrus de colmatage suite à la compaction des dépôts. Par ailleurs, on constate que pour toutes les conditions opératoires testées il a été possible d'atteindre des Facteurs de Réduction Volumique (FRV) supérieurs à 10 correspondants à des rendements en jus clarifié supérieurs à 90% par rapport au jus initial. En conclusion, on constate que globalement, les performances obtenues lors de la microfiltration du jus de noni sont très intéressantes si on les compare à celles obtenues lors de la microfiltration de jus de divers fruits (Tableau XIV). Les valeurs des flux (de l'ordre de 100 à 160 L.h-l.m 2) de même que les rendements (93%) sont dans les plus élevées. L'importance de la mise en oeuvre d'un prétraitement de la pulpe n'est pas à mettre en doute si on rappelle le résultat d'essais préliminaires réalisés sur de la pulpe non traitée. Les performances obtenues alors étaient respectivement égales à 301.h-1.m2 pour le flux de pérmeat, 3 pour le FRV et enfin de 67% pour le rendement. Tableau XIV. Comparaison de différents jus de fruits microfiltrés Jus de fruit clarifié Turbidité Flux FRV Rendement (NTU) (I.h"l.m-2) (%) Noni 1,2 ± 0,2 100-160 10-12 92 Ananas (Gold) 0,9 ± 0,1 70 8 88 Orange (Valencia)b 1,0 ± 0,1 62 3,5 71 Citron (Messino) 0,7 ± 0,1 105 5,5 80 Pastèque 0,9 ± 0,1 120 6 85 Banana (Great Dwart) 0,7 ± 0,1 100 15 93 Melon (Cantaloupe)f 80 3 67 Mure (Vina) 0,6 ± 0,1 70 4 75 0,4 ± 0,1 bCisse et al., 2005., (Vaillant et al., 2005. IV.2. Essais à l'échelle semi-industrielle Afin de valider le procédé dans sa globalité, des essais ont été réalisés à l'échelle semi-industrielle en intégrant toutes les étapes décrites précédemment. Des fruits verts et sains ont été collectés manuellement, puis lavés avec de l'eau potable et désinfectés par immersion dans une solution d'hypochlorite de sodium (200 ppm / 5 min). Les fruits ont ensuite été stockés à température ambiante (25°C) pendant 3 jours, période pendant laquelle le fruit développe une couleur blanchâtre translucide. Les fruits sont alors dépulpés à l'aide d'une passoire rotative (2 mm) pour éliminer les graines et les fibres grossières. La purée obtenue de noni est alors macérée avec des enzymes commerciales (dose comprise 50 et 200 ml/tonne de purée) pour un temps compris entre 30 et 150 minutes et à une température entre 30 et 50°C. La purée macérée est ensuite pressée dans un filtre presse à une pression entre 2 et 10 bars. Le jus pulpeux obtenu est alors microfiltré en utilisant un équipement semi-industriel constitué par des membranes céramiques tubulaire de 0,2 m2 (Membralox®, Pall) et de diamètre de pore de 0,2 µm. Les pressions transmembranaires utilisées s'échelonnent entre 1 et 3 MPa, la vitesse tangentielle avoisine les 5 m.s-r et la température est contrôlée entre 30 et 40°C. Pendant la filtration, le flux de perméat se maintient autour de 150 1/h.m2 pour 2 MPa de pression transmembranaire jusqu'à un facteur de réduction volumique de 10 correspondant à un rendement en jus microfiltré de 90% par rapport au volume de jus initial. Ce rendement est obtenu au bout d'une heure et demie de filtration. Ensuite, en continu est extrait du rétentat (purée riche en fibre) à raison d'environ 151.h-l.m 2 de surface filtrante et dans le même temps, on extrait 1501.h-1.m2 de jus clarifié microfiltré. Ce régime d'extraction et d'alimentation continu peut durer plusieurs heures. Au total l'équipement de microfiltration est alimenté en continu avec 1651.h-I.m2 de jus pulpeux provenant du filtre presse. Le jus prélevé de façon aseptique en sortie du module de filtration est ensuite conditionné en bouteille de verre. Optionnellement il peut être pasteurisé. Dans les deux cas, une période de quarantaine est observée pour vérifier la qualité du jus embouteillé avant la commercialisation. Qualité des jus obtenus par le procédé Les paramètres physico-chimiques du jus de noni initial, des permeat et rétentat obtenus en fin de MFT (FRV compris entre 10 et 12) sont rapportés dans le Tableau XV. Aucun effet de la pression transmembranaire sur les SST, le pH et l'humidité n'a été mis en évidence. Les valeurs des caractéristiques physico-chimiques étudiées sont similaires quelle que soit la valeur de la pression transmembranaire appliquée. Tableau XV. Caractéristiques physico-chimiques de jus de noni microfiltré a trois pressions transmembranaires Analyses Pression transmembranaire (bar) 0,9 1,3 2,1 7,5 (0,5) a 6,9 (0,9) a 6,9 (0,1) b 6,8 (1) 7,8 (0,3) a 7,0 (1) a 3,56 (0,03) a 3,53 (0,08) a 3,56 (0,02) a 3,52 (0,09) a 3,55 (0,01) a 3,57 (0,1) a 93,2 (0,5) a 93,5 (0,9) a 93,9 (0,4) a 93,6 (0,8) a 91,5 (0,2) b 91,4 (1) b 6,8 (0,6) a 6,5 (1)a 6,8 (0,7) a 6,3 (0,9) a 7,8 (0,8) b 8,6 (1) b SST (9Brix) jus brut 7,2 (0,3)a pérmeat 7,3 (0,5) a rétentat 8,4 (0,7) b pH jus brut 3,62 (0,02) a pérmeat 3,62 (0,01) a rétentat 3,61 (0,02) a Humidité (%) jus brut 93,7 (0,4) a pérmeat 94,0 (0,6) a rétentat 92,5 (0,3) b Matière sèche (g.100g-') jus brut 6,3 (0,4) a pérmeat 6,0 (0,7) a rétentat 7,5 (0,4)1' V. Effet de la microfltration tangentielle sur les propriétés du ius de noni V.1. Com osés hénoli ues et ro riétés antiox dantes du jus de Noni Les résultats de la détermination du pouvoir antioxydant (Tableau XVI) montrent qu'il n'y a pas de différences statistiquement significatives (P REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de jus de noni comprenant les étapes de : a) broyage de fruits de noni lorsqu'ils sont au stade de maturité blanc translucide pour produire une purée de fruits de noni ; b) traitement enzymatique de ladite purée de fruits de noni avec une préparation enzymatique présentant au moins une activité pectinase, correspondant à une activité polygalacturonase (EC 3.2.1.15) supérieure à 4 UI.ml-1 et/ou une activité pectinelyase (EC 4.2.2.10) supérieure à 3 UI.ml-1, et au moins une activité cellulase correspondant à une activité endo-cellulase (EC 3.2.1.4) supérieure à 20 UI.ml-1 et/ou activité exo cellulases (EC 3.2.1.91) supérieure à 4 UI.ml-1, à une teneur comprise entre 50 à 300 ml/tonne de purée de fruits de noni à une température comprise entre 20 et 55°C pendant au moins 30 minutes ; c) élimination de la pulpe et des graines présentes dans les fruits de noni par pressage de ladite purée conduisant à un premier jus ; d) tamisage ou filtration grossière dudit premier jus obtenu à l'issue de l'étape c) conduisant à un second jus ; e) microfiltration ou ultrafiltration tangentielle sur membrane céramique tubulaire de seuil de coupure inférieur ou égal à 0,5 µm dudit second jus obtenu à l'issu de l'étape d). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fruits du noni sont lavés et désinfectés avant l'étape a) de broyage. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape b) de traitement enzymatique est réalisée sous agitation. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 25 caractérisé en ce que ladite préparation enzymatique est utilisée à une concentration comprise entre 150 et 300 ml/tonne de fruits. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape e) de microfiltration est mise en oeuvre en appliquant une pression transmembranaire comprise entre 0,5 et 3 bars. 30 6. Jus de fruit de noni susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par une teneur en acide octanoïque inférieure à 200 gg/g de jus de noni et une teneur en acide hexanoïque inférieure à 200 µg/g de jus de noni.