Brevet FR2966162A1 — publié le 20120420

OBTENTION DE PLANTES AYANT UNE TOLÉRANCE AMÉLIORES À UN DÉFICIT HYDRIQUE La présente invention concerne un procédé d'obtention de plantes tolérantes à un déficit hydrique. Le « déficit hydrique » correspond à une situation où la quantité d'eau transpirée par une plante est supérieure à la quantité d'eau absorbée par ladite plante. Le déficit hydrique est l'un des stress abiotiques les plus importants pour les plantes. Il peut affecter leur croissance et leur reproduction des plantes, conduisant ainsi à une perte de rendement. Par conséquent, il est important d'identifier des gènes qui possèdent la capacité d'améliorer la tolérance des 15 plantes au déficit hydrique. Les protéines ENR (« enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase ») et TE (acyl-ACP thioestérase, E.C. 3.1.2.14) sont impliquées dans la biosynthèse des acides gras chez les plantes. Les protéines ENR convertissent le 2,3- 20 trans-enoyl-ACP en acyl-ACP saturé et les protéines TE hydrolysent la moitié acyl de l'ACP libérant un ACP-SH et un acide gras qui va subir d'autres transformations via la voie de biosynthèse des acides gras à longues chaînes catalysée par l'acyl-CoA synthétase. Il a été montré que les protéines ENR 25 et TE interagissent physiquement ensemble (HELLYER et al., Plant Mol. Biol., 20:763-780, 1992). Elles constitueraient un métabolon facilitant le transfert de substrats et de produits, et la régulation simultanée (« channeling ») des enzymes impliquées dans la voie métabolique des acides gras (BROWN et 30 al., J. Exp. Bot., 57:1563-1571, 2006). I1 existe deux classes majeurs de protéines TE : la classe de type FatA, qui a comme substrat préférentiel l'acide oléique-ACP (18:1-ACP), et la classe de type FatB qui a comme substrat préférentiel l'acide palmitique-ACP (16:0-ACP) 35 (BEISSON et al., Plant Physiol., 132:681-697, 2003). Chez le maïs, une protéine TE de type FatA (dénommée ZmFatA), dont le gène codant pour cette protéine est localisé sur le chromosome 2, possède la séquence peptidique représentée par la séquence SEQ ID NO : 1. MAYER et SHANKLIN (BMC Plant Biology, 7:1, 2007) ont identifié 4 résidus d'acides aminés dans la séquence peptidique des protéines TE d'Arabidospsis thaliana (acides aminés en position 74, 86, 141 et 174) qui influencent, chez les plantes, la spécificité de substrat entre les protéines TE de type FatA et celles de type FatB. Ces 4 résidus sont respectivement situés aux positions 108, 120, 175 et 208 dans la séquence d'acides aminés de ZmFatA (SEQ ID NO : 1). Au cours de leurs travaux, les inventeurs ont mis en évidence que des plantes de maïs (Zea mays) transgéniques surexprimant la protéine TE de type FatA (ZmFatA) présentaient une tolérance augmentée à un déficit hydrique par rapport aux plantes de maïs sauvages (non transgéniques). Les inventeurs ont également mis en évidence les orthologues de la protéine ZmFatA chez le riz (Oryza satina), le sorgho (Sorghum bicolor), le blé (Triticum aestivum), Brachypodium distachyon et Arabidopsis thaliana. La séquence peptidique des orthologues chez les plantes monocotylédones (e.g., sorgho, blé et Brachypodium) possède au moins 78% d'identité ou au moins 84% de similarité avec la séquence peptidique ZmFatA et comprend les acides aminés conservés situés aux positions 1-4, 8-10, 15, 19, 46, 51, 69-74, 76-87, 89-92, 94-116, 118-121, 123-133, 135-136, 138-168, 170-171, 174-180, 182-184, 187-189, 191-197, 200-202, 204-212, 214-219, 221-224, 226-239, 241-242, 244, 246, 249, 251-303, 305-312, 315, 317-318, 323-325, 330-331, 337-345, 348, 350, 352-359, 360-361 et 363 de ZmFatA (SEQ ID NO : 1) lorsqu'elle est alignée avec la protéine ZmFatA (voir les Figures 1A et 1B). La séquence peptidique des orthologues chez A. thaliana (plante dicotylédone) (BEISSON et al., 2003, cité ci- dessus) possède au moins 63% d'identité ou au moins 69% de similarité avec la séquence peptidique ZmFatA et comprend les acides aminés conservés situés aux positions 24, 55, 61, 70, 73-74, 76, 78, 80-82, 84-87, 89, 91-92, 94-97, 99-103, 105- 114, 116-118, 120, 122-132, 134-138, 140-144, 146-157, 159- 168, 171, 173-183, 186-189, 191-202, 204-208, 210, 212, 214-217, 222-223, 226-235, 237-242, 244, 246-251, 254-255, 257-283, 285, 287-291, 294-303, 305-306, 308-312, 323-325, 328, 338-340, 342-343, 348, 350-354, 356 et 358-360 de ZmFatA (SEQ ID NO : 1) lorsqu'elle est alignée avec la protéine ZmFatA (voir Figure 2). Sauf précision contraire, l'alignement entre deux séquences peptidiques et le calcul des pourcentages d'identité et de similarité sont effectués sur toute la longueur des séquences peptidiques à l'aide du programme d'ordinateur « needle » (NEEDLEMAN et WUNSCH, J. Mol. Biol., 48, 443-453, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » 0,5.. La présente invention propose en conséquence d'utiliser la protéine ZmFatA ou un orthologue de celle-ci pour augmenter la résistance des plantes au déficit hydrique. La présente invention a pour objet un procédé pour augmenter la tolérance d'une plante au déficit hydrique, caractérisé en ce que l'on surexprime dans ladite plante une protéine TE de type FatA possédant au moins 60% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, ou au moins 70% de similarité, et par ordre de préférence croissant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1. Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, ladite protéine TE de type FatA comprend les acides aminés conservés situés aux positions 70, 73-74, 76, 78, 80-82, 84-87, 89, 91-92, 94-97, 99-103, 105-114, 116, 118, 120, 123-132, 135-136, 138, 140-144, 146-157, 159-168, 171, 174-180, 182-183, 187-189, 191-197, 200-202, 204-208, 210, 212, 214-217, 222-223, 226-235, 237-239, 241-242, 244, 246, 249, 251, 254-255, 257-283, 285, 287-291, 294-303, 305- 306, 308-312, 323-325, 338-340, 342-343, 348, 350, 352-354, 356, 358-359 et 360 de ladite séquence SEQ ID NO : 1 lorsqu'elle est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO : 1. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, ladite protéine TE de type FatA est issue d'une plante monocotylédone, et possède au moins 78% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, ou au moins 84% de similarité, et par ordre de préférence croissant au moins 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% de similarité avec la séquence SEQ ID N0: 1 et comprend les acides aminés conservés situés aux positions 1-4, 8-10, 15, 19, 46, 51, 69-74, 76-87, 89-92, 94-116, 118-121, 123-133, 135-136, 138-168, 170-171, 174-180, 182-184, 187-189, 191-197, 200-202, 204-212, 214-219, 221-224, 226-239, 241-242, 244, 246, 249, 251-303, 305-312, 315, 317-318, 323-325, 330-331, 337-345, 348, 350, 352-359, 360-361 et 363 de ladite séquence SEQ ID NO : 1 lorsqu'elle est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO : 1. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, ladite protéine TE de type FatA est issue d'une plante dicotylédone, et comprend les acides aminés conservés situés aux positions 24, 55, 61, 70, 73-74, 76, 78, 80-82, 84-87, 89, 91-92, 94-97, 99-103, 105-114, 116-118, 120, 122-132, 134-138, 140-144, 146-157, 159-168, 171, 173-183, 186-189, 191-202, 204-208, 210, 212, 214-217, 222-223, 226-235, 237-242, 244, 246-251, 254-255, 257-283, 285, 287-291, 294-303, 305-306, 308-312, 323-325, 328, 338-340, 342-343, 348, 350-354, 356 et 358-360 de ladite séquence SEQ ID NO : 1 lorsqu'elle est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO : 1. On entend par une protéine TE de type FatA issue d'une plante monocotylédone ou dicotylédone, une protéine TE de type FatA exprimée par une plante monocotylédone ou dicotylédone ou une protéine TE de type FatA synthétique obtenue par mutation d'une protéine TE de type FatA exprimée par une plante monocotylédone ou dicotylédone. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite protéine TE de type FatA est fonctionnelle. La détermination d'une protéine TE de type FatA fonctionnelle peur être effectuée selon la méthode décrite par MAYER et SHANKLIN (BMC Plant Biology, 7:1, 2007). Brièvement, un plasmide contenant un gène codant pour une protéine TE de type FatA telle que définie ci-dessus est introduit dans la souche d'E. coli K27 (CGSC 5478). Les souches d'E. coli transformées sont ensuite cultivées dans un milieu approprié. La teneur et la quantité des esters méthyliques d'acides gras excrétés dans le milieu de culture par lesdites souches sont alors déterminées. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite protéine TE de type FatA est choisie dans le groupe constitué par les séquences d'acides aminés suivantes - SEQ ID NO : 1 (ZmFatA), - SEQ ID NO : 2 (protéine TE de type FatA de B. distachyon), - SEQ ID NO : 3 (protéine TE de type FatA de T. aestivum), - SEQ ID NO : 4 (protéine TE de type FatA d'O. sativa), - SEQ ID NO : 5 et 6 (protéines TE de type FatA de S. bicolor), et - SEQ ID NO : 7 et 8 (protéines TE de type FatA d'A. thaliana). - SEQ ID NO : 8 (protéine TE de type FatA d'A. thaliana), 20 de préférence encore, SEQ ID NO : 1. La présente invention s'applique à toutes les plantes monocotylédones ou dicotylédones, et notamment aux plantes sensibles au déficit hydrique. De manière non limitative, elle peut s'appliquer aux plantes potagères, aux 25 plantes ornementales, aux arbres fruitiers, aux plantes de grandes cultures telles que le blé, le maïs ou le riz, ou aux plantes de cultures industrielles comme le cotonnier, le colza ou le tournesol, de préférence le maïs. La surexpression (augmentation de l'expression) 30 dans une plante d'une protéine TE de type FatA telle que définie ci-dessus, peut être effectuée par la modification du génome de ladite plante. Cette modification du génome peut notamment s'effectuer par transformation génétique de ladite plante par une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant 35 pour ladite protéine, associé à des séquences de régulation en cis de son expression. La surexpression de ladite protéine TE de type FatA peut également être obtenue par modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite protéine TE FatA, par exemple en remplaçant son promoteur endogène par un promoteur plus fort, permettant un niveau de transcription plus élevé, ou bien en adjoignant au promoteur endogène des séquences activatrices de la transcription, de type « amplificateur », ou de la traduction. Pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on utilise une cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour une protéine TE de type FatA telle que définie ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ledit promoteur peut être un promoteur hétérologue. Dans ce cas, on peut utiliser par exemple : - des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur de la gluténine de haut poids moléculaire spécifique de l'endosperme (VERDAGUER et al., Plant Mol Biol., 31:1129-1139, 1996), le promoteur de l'ARN 35S (ODELL et al., Nature, 313:810-812, 1985) ou 19S (KAY et al., Science, 236:1299-1302, 1987) du CaMV, le promoteur de l'actine 1 du riz (McELROY et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), le promoteur de l'ubiquitine 3 du riz ou du maïs (SIVAMANI et QU, Plant Mol Biol., 60:225-239, 2006), - des promoteurs spécifiques du phloème, tels que le promoteur du Wheat Dwarf Virus (DINANT et al., Physiologia plantarum 121 : 108-116, 2004 ; Demande PCT WO 03/060135) ou le promoteur de AtPP2-A1 (DINANT et al., Plant Physiol., 131 : 114-128, 2003), - des promoteurs spécifiques des feuilles, tels que le promoteur de la petite sous-unité de la Rubisco, le promoteur de la phosphoénolpyruvate carboxylase, - des promoteurs spécifiques des racines, tels que le promoteur RCc3 du riz (Demande Internationale WO 2009/016104), le promoteur antiquitine du riz (Demande Internationale WO 2007/076115), ou - des promoteurs localement inductibles par le stress (sécheresse, salinité), tels que le promoteur rd29 d'Arabidopsis (YAMAGUCHI-SHINOZAKI et SHINOZAKI, Mol. Gen. Genet., 236: 331-340, 1993), de préférence le promoteur de la gluténine de haut poids moléculaire spécifique de l'endosperme. On peut également utiliser le promoteur d'une autre protéine TE (par exemple une protéine TE de type FatB). Pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on peut aussi utiliser des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus dans un vecteur hôte. Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants tels que décrits ci-dessus peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc. On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription, les séquences de tête (séquences « leader ») et les sites de polyadénylation. Ces séquences peuvent être celles qui sont naturellement associées au gène codant la protéine TE de type FatA telle que définie ci-dessus, ou bien peuvent être des séquences hétérologues. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. A titre d'exemples de séquences de ce type fréquemment utilisées chez les plantes, on citera parmi les plus répandues, le terminateur de l'ARN 35S du CaMV et le terminateur du gène de la nopaline synthase. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences « enhancer » de transcription et de traduction). Parmi les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules ou organismes transformés. Il s'agit notamment de gènes rapporteurs, conférant aux cellules ou organismes transformés un phénotype aisément reconnaissable, ou bien de gènes marqueurs de sélection : seules les cellules ou organismes exprimant un gène marqueur de sélection déterminé, sont viables dans des conditions données (conditions sélectives). Des gènes rapporteurs fréquemment employés sont par exemple celui de la beta-glucuronidase (GUS), celui de la luciférase, ou celui de la « green fluorescent protein » (GFP). Des gènes marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistance à un antibiotique, ou également, dans le cas des plantes ou des cellules végétales, à un herbicide. Il existe une très grande variété de gènes marqueurs de sélection parmi lesquels l'homme du métier peut effectuer son choix en fonction des critères qu'il aura lui-même déterminés. Pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on peut également utiliser des cellules-hôtes transformées par un polynucléotide codant pour une protéine TE de type FatA telle que définie ci-dessus, ce qui inclut en particulier les cellules hôtes transformées par une cassette d'expression ou un vecteur recombinant tels que décrits ci-dessus. On entend par cellule ou organisme transformé par un polynucléotide, toute cellule ou organisme dont le contenu génétique a été modifié par transfert dudit polynucléotide dans ladite cellule ou ledit organisme, quelle que soit la méthode de transfert qui a été utilisée, et que l'information génétique apportée par ledit polynucléotide soit intégrée dans l'ADN chromosomique ou demeure extra-chromosomique. Les cellules hôtes peuvent être des cellules procaryotes ou eucaryotes. Dans le cas de cellules procaryotes, il peut notamment s'agir d'Agrobactéries telles qu'Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizobium. Dans le cas de cellules eucaryotes, il peut s'agir notamment de cellules végétales, issues de plantes monocotylédones ou dicotylédones. Les plantes transgéniques peuvent être obtenues par transformation génétique par au moins un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus. Ces plantes transgéniques comprennent dans leur génome au moins une copie d'un transgène contenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus. On définit ici comme plante transgénique une plante transformée chez laquelle l'information génétique exogène apportée par un polynucléotide transformant est intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique, sous forme de transgène, et peut ainsi être transmise aux descendants de ladite plante. Cette définition englobe donc également les descendants des plantes résultant de la transgénèse initiale, dès lors qu'ils contiennent dans leur génome une copie du transgène. Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc.) obtenu à partir des cellules transformées ou des plantes transgéniques fait également partie de l'objet de la présente invention. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes transgéniques, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs et les fruits. Différentes méthodes d'obtention de plantes transgéniques sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier. Généralement, ces méthodes impliquent la transformation de cellules végétales, la régénération de plantes à partir des cellules transformées, et la sélection des plantes ayant intégré le transgène. De nombreuses techniques de transformation de cellules végétales germinales ou somatiques (isolées, sous forme de cultures de tissus ou d'organe, ou sur la plante entière), et de régénération des plantes sont disponibles. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante concernée. A titre d'exemples non limitatifs de méthodes utilisables dans le cas des plantes mentionnées ci-dessus, il est possible de citer les protocoles décrits par GUIS et al. (Scientia Horticulturae 84 : 91-99, 2000) pour le melon, par HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot. 44 : 1837-1845, 1993) pour la tomate, par SHOEMAKER et a1. (Plant Oeil Rep. 3 : 178-181, 1986), ou TROLINDER et GOODIN (Plant Oeil Rep. 6 : 231-234, 1987) pour le cotonnier, par VAN DER MARK et a1. (J. Genet Breeding 44 : 263-268, 1990) ou par MARCHANT et al. (Ann. Bot. 81 : 109-114, 1998) pour les rosiers. Dans le cas des plantes monocotylédones, on peut citer par exemple les protocoles décrits par HIEI et al. (The Plant Journal, 6, 271-282, 1994) ou ISHIDA et a1. (Nature biotechnology, 14, 745-750, 1996) pour le maïs, ou par RASCO-GAUNT et al. (J. Exp. Bot. 52 : 865-874, 2001) pour le blé. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'obtention de plantes transgéniques surexprimant la protéine TE de type FatA telle que définie ci-dessus et la mise en évidence de son rôle dans l'augmentation de la résistance au déficit hydrique, ainsi que des figures annexées : Figure 1A et 1B : alignement et pourcentage d'identité et de similarité des séquences peptidiques des protéines TE de type FatA de B. distachyon (SEQ ID NO : 2), T. aestivum (SEQ ID NO : 3), d'O. sativa (SEQ ID NO : 4), de S. bicolor (SEQ ID NO : 5, FatAl et SEQ ID NO : 6, FatA2) avec la protéine TE de type FatA de Z. mays (ZmFatA, SEQ ID NO : 1), en utilisant le programme d'ordinateur « needle » (« Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » 0,5). Les acides aminés conservés (a. a. conservés) entre toutes les séquences peptidiques sont aussi représentés. Figure 2 : alignement et pourcentage d'identité et de similarité des séquences peptidiques des protéines TE de type FatA d'A. thaliana (SEQ ID NO : 7 [AtFatAl] et SEQ ID NO : 8 [AtFatA2]) avec la protéine TE de type FatA de Z. mays (ZmFatA, SEQ ID NO : 1), en utilisant le programme d'ordinateur « needle » (« Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5). Les acides aminés conservés (a. a. conservés) entre toutes les séquences peptidiques sont représentés par un astérisque (*). Figure 3 : carte des vecteurs binaires pBIOS1996 (A) et pBIOS1995 (B). EXEMPLE 1 : OBTENTION DE MAÏS TRANSGÉNIQUES SUREXPRIMANT LA PROTEINE ZmFatA 1) Clonage et transformation génétique du maïs Deux vecteurs de transformation différents (pBIOS 1562 et pBIOS 1958) ont été utilisés pour la transformation génétique du maïs. Ces vecteurs contiennent le gène bar de Streptomyces hygroscopicus conférant la résistance à l'herbicide bialaphos (WHITE et al., Nucleic Acids Res., 18:1062, 1990), utile pour la sélection des transformants de maïs, et un gène codant une GFP (Green Fluorescente Protein) en tant que marqueur visuel pour suivre la présence du transgène dans les plantes et les graines. La différence entre ces deux vecteurs réside dans la stratégie de clonage utilisée pour introduire la cassette d'expression contenant le gène d'intérêt (clonage via le système Gatewa e ou clonage par restriction) et le promoteur pour l'expression de la GFP (le promoteur du virus de la mosaïque des nervures du manioc (CsVMV) suivi par l'intron FAD2 d'Arabidopsis ou le promoteur de la gluténine de haut poids moléculaire spécifique de l'endosperme). Selon une première stratégie de clonage, le gène synthétique codant ZmFatA (SEQ ID NO : 9 ; séquence synthétique optimisée pour l'expression dans le maïs) contenant les sites de restriction attLl et attL2 a été introduit par une réaction de recombinaison LR dans le vecteur binaire de destination GATEWAY pBIOS 1562, générant ainsi le vecteur pBIOS1995 (voir Figure 3A). Le vecteur pBIOS 1562 est dérivé du vecteur pSB12 (KOMARI et al., Plant J., 10:165-174, 1996) contenant le gène bar sous le contrôle du promoteur pActin, le gène codant une GFP sous le contrôle du promoteur du CsVMV suivi par l'intron FAD2, le promoteur et le ter intron de l'ubiquitine 3 du riz (SIVAMANI et QU, Plant Mol Biol., 60:225-239, 2006) suivie d'une cassette GATEWAY et d'une séquence de polyadénylation provenant du gène Sac66 d'Arabidopsis (JENKINS et al., Plant Cell Environ., 22:159-167, 1999). Selon une seconde stratégie de clonage, le gène synthétique codant ZmFatA (SEQ ID NO : 9) a été introduit par clonage par restriction (présence de sites de restriction Sapl entre la région codante et les sites attL) dans le vecteur binaire de destination pBIOS 1958 digéré par Sapl, générant ainsi le vecteur pBIOS1996 (voir Figure 3B). pBIOS 1958 est également dérivé du vecteur pSB12, mais possède le gène codant une GFP sous le contrôle du promoteur de la gluténine de haut poids moléculaire spécifique de l'endosperme (promoteur HMWG). les vecteurs pBIOS1995 ou pBIOS1996 ont ensuite été transférés dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB1) selon la méthode décrite par KOMARI et a1., 1996 (cité ci-dessus). Le cultivar de maïs A188 a ensuite été transformé par cette souche d'agrobactérie contenant le vecteur pBIOS1995 ou le vecteur pBIOS1996, selon la méthode décrite par ISHIDA et al., 1996 (cité ci-dessus).Les transformants primaires (TO) ont été sélectionnés selon des méthodes de routine en fonction des quatre critères suivants : (i) nombre de copies insérées : Cette détermination a été réalisée par PCR quantitative. Tous les évènements de 20 transformation possédant plus de 2 copies du transgène ont été éliminés. (ii) intégrité de l'ADN-T inséré : Elle a été vérifiée par une réaction de PCR au cours des premières étapes de développement de la plante transformée. 25 (iii) absence de terminaison prématurée de la transcription du transgène : Chacun des gènes ciblés étant sous le contrôle d'un promoteur constitutif, il est possible de mesurer leur expression à partir de tissus foliaires. Les ARN de feuilles de plantes TO ont donc été extraits et 30 l'intégrité des transcrits vérifiée par RT-PCR à l'aide d'une amorce sens située sur l'intron ubiquitine3 de riz et d'une amorce antisens située sur le terminateur AtSac66. (iv) nombre de grains Tl récoltés. Après sélection des transformants, il a été obtenu 35 41 lignées trangéniques dont 18 ont un transgène unique et intègre. 2) Evaluation de la tolérance des plantes transgéniques au déficit hydrique Des plantes de première génération (croisement du transformant primaire avec la lignée récurrente A188) sont évaluées sur une plate-forme de phénotypage. Ces plantes transgéniques sont donc hémizygotes pour le transgène (caractère dominant de la transformation génétique). Les témoins (« RRS » et « RCP) utilisés dans l'expérimentation correspondent aux ségrégants sauvages issus de ce même croisement. 2.1 Compartiment de culture Les plantes étudiées sont cultivées en phytotron. Ce dernier, d'une surface de 30 m2 dispose de deux chambres de culture indépendantes. Dans ces chambres l'éclairage, la température et l'hygrométrie sont régulés (voir paragraphe 2.2. ci-dessous) Les semis sont réalisés dans des terrines de dimensions 44 x 28,5 x 7 cm (H x 1 x L). Cinq génotypes sont semés par terrine à raison de dix graines par génotype. Cinq plantes seulement par génotype sont utilisées pour la cinétique de dessèchement. 2.2 Conditions de culture Au sein du compartiment de culture la température, l'humidité et l'éclairage sont régulés. Les conditions appliquées sont les suivantes : Photopériode : - Jour durant 16h (6h à 22h) avec complément photosynthétique (lampe à sodium 400W) lorsque le rayonnement extérieur est inférieur à 100W/m2. - Nuit durant 8h (22h à 6h). Thermopériode : 24°C / 20°C. Le respect de ces conditions est assuré par un chauffage lorsque la température est inférieure à 20°C la nuit ou 24°C le jour, lorsque la température dépasse 25°C. Humidité 75% d'humidité relative régulée par brumisation nocturne. Ces différentes conditions assurent une croissance optimale du maïs. 2.3 Mesure de la cinétique de dessèchement Pertinence du caractère mesuré : Le comportement des plantes vis-à-vis de la transpiration est étudié grâce au suivi en continu de la baisse de la teneur en eau relative (RWC : Relative Water Content) de plantules à un stade jeune (4 feuilles visibles). L'objectif est d'étudier la réponse en terme de contrôle stomatique des plantes lors d'un arrêt brutal de l'alimentation en eau. Un contrôle stomatique très rapide à l'apparition d'un déficit hydrique permet d'économiser l'eau disponible mais limite la capacité d'assimilation du COZ donc le potentiel de production de la plante. En revanche, une fermeture assez tardive des stomates permet le maintien de l'activité photosynthétique de la plante assurant le maintien du potentiel de production au risque de se dessécher plus rapidement (Khalfaoui, 1991). Méthode . Les mesures sont réalisées sur des plantules T1 entières au stade 3-4 feuilles visibles. Les plantes utilisées au cours de cette mesure sont des plantes issues d'un semis en excès par rapport aux besoins de la plate-forme (3 graines semées par pot). Les effectifs pour la mesure de dessèchement sont de 5 plantes par évènement de transformation et témoins sauvages. Les plantes sont coupées au niveau du collet, immergées pendant 24 heures à 4°C à l'obscurité (pour saturer les cellules en eau) puis placées dans une enceinte climatique lumineuse régulée à 30°C. Un suivi du poids des plantules est alors réalisé selon le calendrier détaillé dans le Tableau I ci-dessous : Tableau I : Calendrier des pesées des plantules conditionnées à 30°C en pleine lumière. Le poids à HO correspond au poids à pleine turgescence. En fin de jour 3, les plantules sont placées dans une étuve à 80°C pendant 24h00 afin d'obtenir par une dernière pesée la valeur de poids sec. 4-- Poids pleine turgescence (PTurg) ~- Poids à l'instant t (Pt) ^-- Poids sec ( Ps ) A l'instant t, la teneur en eau relative des plantes est ensuite calculée selon la formule mathématique 5 suivante : (Pt-P,) / (PTurg- Ps ) x 100. Jour Durée 1 HO 1 H0+2 1 H0+6 1 H0+8 4 H0+96