Brevet FR2966930A1 — publié le 20120504

UTILISATION DE PARTICULES DE SiC POUR LA REVELATION DE PROTEINES ET D'ACIDES NUCLEIQUES La présente invention a trait au domaine de la révélation de molécules de type protéines et acides nucléiques, notamment dans le cadre d'expériences d'électrophorèse. Dans les expériences d'électrophorèse sur gel d'agarose, le bromure d'éthydium (BEt) est utilisé en laboratoire depuis des décennies pour la révélation d'ADN et d'ARN. Le BEt se fixe à ces acides nucléiques, ce qui permet de visualiser les différentes bandes d'acides nucléiques de l'échantillon par fluorescence sous lumière ultra-violet. La technique de visualisation des acides nucléiques par le BEt est reconnue comme efficace et relativement peu chère. Cependant, le bromure d'éthydium présente un certain nombre d'inconvénients: - il traverse les gants en latex en moins de 5 minutes et peut être absorbé par la peau, irriter les yeux, la bouche et les voies respiratoires, - de part sa nature d'agent intercalant de l'ADN, c'est un mutagène et un tératogène puissant, - il nécessite des précautions importantes d'utilisation, de traitement des déchets et de décontamination, qui peuvent se révéler très coûteuses. Pour de plus amples détails, on pourra notamment se reporter à : Journal of Molecular Biology, 13, 269-282 (1965). L'emploi du BEt implique de ce fait la récupération des déchets contaminés, pour en assurer la destruction (typiquement pas incinération), ce qui engendre des coûts importants. Dans le but de fournir des alternatives moins toxiques, d'autres molécules ont été proposées. On peut notamment citer le colorant SYBR Green, proposé par Molecular Probes. Ce composé possède une structure relativement similaire à celle du BEt et bien qu'il démontre des performances de révélations accrues, il présente néanmoins des risques mutagènes potentiels, comme toute molécule capable de se fixer à l'ADN et d'en modifier la forme. De plus ce composé s'avère être plus cytotoxique que le BEt et est décrit comme relativement instable. On peut également citer le colorant SYBR SafeTM qui, selon des tests indépendants (test biologique d'Ames), semble présenter moins d'effets mutagènes que le BEt. Il n'est pas suspecté d'être cancérogène, n'est pas classifié comme déchet dangereux et de fait peut être jeté à l'évier sans traitement spécifique. Cependant, ce produit présente également quelques inconvénients : - sa distribution en solution dans le DMSO augmente les risques d'absorption par la peau, ce qui accentuerait ses effets néfastes, - il ne semble pas permettre la visualisation de brins d'ARN, - il est reporté comme relativement photosensible, - bien qu'il ne nécessite pas de traitement spécifique des déchets, ce colorant reste relativement cher (typiquement plus de 60 fois plus cher que le BEt). On peut enfin évoquer les colorants GelRed et GelGreen, proposés par Biotium. Non cytotoxiques et non-mutagènes, ils sont incapables de pénétrer les gants en latex et la membrane cellulaire, ils sont décrits comme beaucoup plus stables que SYBR SafeTM et ne sont pas classifiés comme déchet dangereux. Cependant cette technique est relativement chère (de l'ordre de 120 fois plus chère que le BEt). Finalement, malgré les avantages et les performances supérieures de ces différentes alternatives, de nombreux laboratoires continuent de préférer le BEt en raison de son faible coût. Il apparaît donc qu'en matière de révélation de brins d'ADN, d'ARN ou de macromolécules similaires par électrophorèse, une alternative propre, non toxique et peu coûteuse fasse toujours défaut. Un but de la présente invention est de fournir un procédé de révélation d'ADN et d'ARN, notamment adapté pour des expériences d'électrophorèse, permettant d'obtenir des résultats au moins aussi bons qu'avec les techniques existantes susmentionnées, tout en s'affranchissant de leurs inconvénients notamment en termes de toxicité et/ou de coût. A cet effet, l'invention propose de mettre en ceuvre, pour la révélation, des particules de carbure de silicium (SiC), qui permettent de s'affranchir de la nécessité d'employer les molécules préconisées dans l'état de la technique, notamment les colorants de type BEt. Plus précisément, selon ce premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de révélation d'acides nucléiques ou de protéines qui comprend les étapes suivantes : (a) lesdits acides nucléiques ou protéines sont mis en contact avec des particules de SiC au sein d'un milieu dispersant, ce par quoi lesdites particules de SiC se lient auxdits acides nucléiques ou protéines, puis (b) lesdits acides nucléiques ou protéines ainsi liés aux particules de SiC sont soumis à un rayonnement UV provoquant une photoluminescence spécifique des particules. Ce procédé s'avère tout particulièrement adapté à la révélation d'acides nucléique, à savoir d'ADN et d'ARN, particulièrement d'ADN. Il peut également être utilisé pour la révélation d'autres types de macromolécules, par exemple des protéines. 15 Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet l'utilisation de particules de SiC à titre de marqueurs d'acides nucléiques (ou d'autres macromolécules, notamment des protéines), révélables par la méthode de photoluminescence. Le plus souvent, le procédé de l'invention est mis en ceuvre en l'absence totale de BEt ou de colorants similaires. Toutefois, il n'est pas exclu, selon des modes de 20 réalisation particuliers, de mettre en ceuvre conjointement des particules de SiC et des colorants de type BEt. Par « colorant de type BEt » on entend toute molécule usuellement utilisée dans l'état de la technique pour la révélation d'acides nucléiques ou de protéines. Dans le cadre de la présente description, on entend par « particules de SiC » des 25 objets dispersibles en milieu liquide comprenant du SiC, de préférence à titre majoritaire, et généralement au moins en surface. Typiquement, il s'agit d'assemblages de quelques centaines à plusieurs milliers d'atomes. De préférence les particules de SiC employées selon l'invention sont des objets dont au moins l'une des dimensions linéaires (par exemple, le diamètre) a une taille comprise entre 1 et 1000 nm. Les particules de SiC 30 comprennent généralement de 90 à 100% de SiC en masse. Les particules peuvent éventuellement contenir des impuretés chimiques (par exemple : hydrogène, oxygène, azote, aluminium, phosphore, bore, béryllium, gallium, titane, chrome) dont la quantité (pour chaque impureté) ne dépasse de préférence pas 1 °/O en masse (c'est-à-dire inférieure à 1°/O), par rapport à la masse totale de la particule. 10 Selon un mode de réalisation intéressant, les particules sont essentiellement constituées de SiC, typiquement avec une teneur supérieure à 95%, voire supérieure à 980/0 en masse par rapport à la masse totale de la particule. Les particules de SiC utilisées selon l'invention sont des particules présentant, de façon connue, des propriétés de luminescence. Les longueurs d'ondes de luminescence généralement utilisées dans le procédé de l'invention sont comprises entre 300 et 800 nm, de préférence entre 350 et 600 nm. En fonction de la nature exacte des particules employées, on choisit dans l'étape (b) une longueur d'onde adaptée, propre à induire la luminescence. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont observé, de façon inattendue, que les particules de SiC s'auto-associent avec les molécules de type ADN, ARN ou protéines, en particulier avec les ADN et ARN, à savoir que les particules de SiC se fixent spontanément sur les ADN, ARN ou protéines par simple mise en contact. Cette auto-association intervient vraisemblablement par l'intermédiaire d'interactions électrostatiques entre ces molécules et les particules de SiC. L'utilisation de particules de SiC proposée selon la présente invention présente de nombreux avantages par rapport aux techniques employées dans l'état de la technique. En particulier, les particules de SiC sont non toxiques, elles sont stables chimiquement, thermiquement, mécaniquement et aux radiations (UVA, UVB et rayons X notamment). Par ailleurs, elles sont faciles d'incorporation dans divers matériaux et possèdent une propriété de photoluminescence quand elles sont soumises à une excitation lumineuse de longueur d'ondes comprise entre 240 et 520 nm. En outre, les particules de SiC employées dans le cadre de l'invention ne modifient pas, en général, la charge globale des acides nucléiques ou de protéines et ne perturbent donc pas leur migration lors d'électrophorèses. Dans le cadre de la présente invention, il s'avère intéressant de mettre en ceuvre les modes de réalisation préférés décrits ci-après. De préférence, avant la mise en contact des particules de SiC avec lesdits acides nucléiques ou protéines, les particules susmentionnées de SiC du milieu de l'étape (a) sont sous la forme d'objets dispersés (particules individualisées, agrégats de particules) de dimension inférieure à 1 µm. Selon un mode de réalisation préféré, les particules susmentionnées ont une taille moyenne comprise entre 0,5 nm à 1 µm. Plus préférentiellement encore, la taille moyenne desdites particules est inférieure à 10 nm, avantageusement inférieure à 7 nm, et préférentiellement inférieure à 5 nm. Dans le cadre de la présente description, lorsqu'il est fait référence à la taille moyenne des particules, celle-ci se réfère à la taille moyenne mesurée par la méthode employée dans Botsoa et al. Applied Physics Letters, 92, 173902 (2008). La distribution en taille des particules est typiquement déterminée par microscopie électronique en transmission (MET), après dépôt sur une grille de graphite d'une suspension des particules dont la taille moyenne est à mesurer, puis évaporation de la suspension. On peut également valider la distribution en taille des particules, sans évaporer la suspension, en utilisant un granulomètre optique. En général, la taille des particules reste inchangée après la mise en contact avec les acides nucléiques ou les protéines. Notamment dans les gammes précitées, il n'y a pas de phénomène d'agrégation des particules en amas de taille supérieure à 1 µm. Des particules dans cette gamme de tailles présentent des effets de confinement quantique des porteurs de charge photogénérées qui se manifestent en particulier par l'augmentation de l'intensité de leur luminescence. En outre, cette gamme de tailles peut permettre aux particules de s'inclure au sein de la structure tridimensionnelle de l'ADN, ce qui peut notamment permettre une meilleure association des particules avec l'ADN. Notamment pour améliorer le contraste de la révélation des acides nucléiques ou des protéines, on peut, après l'étape (a) et préalablement à l'étape (b), séparer les acides nucléiques ou protéines liés aux particules et les particules non liées « célibataires », par exemple par centrifugation ; les particules non liées étant ainsi récupérées dans le surnageant. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé susmentionné est mis en ceuvre dans le cadre d'une séparation électrophorétique. Dans ce cas, il comporte, entre l'étape (a) et l'étape (b), une étape de migration par électrophorèse des acides nucléiques ou protéines liés aux particules. Dans ce cadre, le procédé peut être réalisé en l'absence totale de colorants de type BEt, ce qui permet d'éviter les problèmes afférents. Le procédé de l'invention s'avère tout particulièrement adapté pour la révélation d'acides nucléiques, à savoir de brins d'ADN et/ou d'ARN, en particulier d'ADN, notamment dans le cadre de séparation électrophorétique, où les particules de SiC sont un bon substitut du BEt. Le procédé de l'invention peut également être utile pour la révélation d'autres macromolécules, notamment de protéines.35 Notamment dans le cas où le procédé est mis en ceuvre dans le cadre d'une séparation électrophorétique, il s'avère généralement avantageux que, dans le milieu de l'étape (a), les particules de SiC soient employées en excès par rapport à la quantité d'acides nucléiques ou de protéines capables de se lier à ces particules. Selon ce mode de réalisation, la quantité d'ADN (respectivement d'ARN ou de protéines) dans l'étape (a) est inférieure à la quantité d'ADN (respectivement d'ARN ou de protéines) nécessaire pour fixer la totalité des particules en présence. Cette quantité peut être aisément déterminée pour un type de particules donné et un type d'ADN (respectivement d'ARN ou de protéines) donné. Typiquement, la quantité utilisée est de l'ordre de 10 pg de particules pour environ 1 à 5 pg d'ADN (d'ARN ou de protéines). L'emploi de particules de SiC en excès induit qu'il reste, dans le milieu de l'étape (a) après la mise en contact, des particules « célibataires » non liées aux acides nucléiques ou aux protéines. Dans le cadre d'une séparation électrophorétique, la présence de ces particules célibataires, qui ne migrent pas dans les conditions de l'électrophorèse sont sans conséquence sur l'efficacité et la sensibilité de la détection. Les particules célibataires ne nécessitent donc pas d'être éliminées du milieu préalablement à la mise en ceuvre de l'étape (b). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé est mis en ceuvre dans le cadre de séparation électrophorétique et comprend les étapes suivantes : - mise en contact des acides nucléiques ou des protéines avec un excès de particules de SiC au sein d'un milieu dispersant ; puis - électrophorèse des acide nucléiques ou des protéines liés aux particules de SiC, sans élimination préalable des particules célibataires ; puis - révélation des acides nucléiques ou protéines liés aux particules de SiC par un rayonnement UV provoquant une photoluminescence des particules. Selon un mode de réalisation particulier, dans le milieu de l'étape (a), le rapport entre la quantité de particules de SiC et la quantité d'acides nucléiques ou de protéines est supérieur à 1 pg/µg, de préférence inférieur à 10 pg/µg, préférentiellement inférieur à 7 µg/µg- Typiquement, le rapport entre la quantité de particules de SiC et la quantité d'acides nucléiques ou de protéines est de 5 pg/µg. De préférence, au sein du milieu de l'étape (a), les particules de SiC selon la présente invention sont sous forme d'une suspension à une concentration comprise 0,5 µg/µL et 5 µg/µL en particules de SiC, de préférence comprise entre 1 µg/µL et 3 Typiquement, au sein du milieu de l'étape (a), les particules de SiC selon la présente invention sont sous forme d'une suspension à une concentration de l'ordre de 2 µg/µL en particules de SiC. A titre de particules de SiC particulièrement adaptées à la mise en ceuvre de la présente invention, on peut notamment citer les particules de SiC obtenues selon un procédé de gravure d'un substrat de SiC, la gravure étant obtenue par attaque électrochimique du substrat de SiC, par exemple selon une méthode du type de celle décrite dans Botsoa et al. Applied Physics Letters, 92, 173902 (2008). Plus généralement, on peut avantageusement employer toute particule de SiC de type susceptible d'être obtenu selon un tel procédé. L'expression "substrat de SiC" désigne, dans le cadre de la présente description, tout composé chimique constitué des atomes de silicium (Si) et de carbone (C) liés chimiquement entre eux. La structure atomique du substrat de SiC (et donc des particules) peut être monocristalline, polycristalline ou amorphe. Le polytype du substrat de SiC peut être par exemple : 6H-SiC, 4H-SiC, 3C-SiC, 15R-SiC, 21 R-SiC, 24R-SiC, 27R-SiC, etc. La composition chimique du substrat de SiC peut être par exemple : SiC ou tout autre composé exprimé par la formule SixC(1-x) avec 0 Avantageusement, les particules employées selon la présente invention sont obtenues par gravure d'un substrat de SiC massif, à savoir un objet macroscopique à base d'atomes de silicium et de carbone liés chimiquement entre eux par des liaisons Si-C et dont au moins une dimension (hauteur, largeur, longueur, diamètre, etc.) est supérieure à 1 mm. De préférence, la gravure du substrat de SiC est obtenue par une attaque électrochimique du substrat de SiC. Par exemple, la gravure peut être obtenue par une attaque électrochimique durant laquelle le substrat de SiC se trouve en contact avec un électrolyte formé au moins à base d'acide (acide fluorhydrique, par exemple). Ce substrat est traversé par un courant électrique. Les paramètres de gravure tels que la densité du courant, la composition chimique, la concentration de l'électrolyte, la pression et la température ambiante sont choisis en fonction des besoins (vitesse de gravure, etc). On obtient ainsi des particules de SiC, les paramètres de gravure étant préférentiellement choisis pour permettre l'obtention de particules de taille moyenne inférieure ou égale à 50 nm, préférentiellement inférieure ou égale à 7 nm, et avantageusement inférieure ou égale à 5 nm. Selon un autre mode de réalisation, les particules employées selon la présente invention sont obtenues par ablation laser d'un substrat de SiC massif. Par exemple, l'ablation laser est obtenue par des impacts d'un faisceau laser pulsé laser sur une cible constituée d'un substrat massif de SiC, plongée dans une solution aqueuse. Au contact de ce faisceau, de la matière s'arrache, et les particules de SiC se trouvent en suspension dans la solution aqueuse. Les paramètres du laser (fréquence et durée de l'impact, puissance et longueur du rayonnement laser), la vitesse de déplacement du laser sur le substrat, ainsi que la durée de l'opération totale d'ablation laser influent sur les propriétés des particules obtenues. Le procédé d'ablation laser peut typiquement être réalisé avec un laser Ti/saphir (Hurricane, Spectra Physics Lasers), selon le protocole illustratif suivant. Le laser mentionné fournit des impacts lasers FWHM d'une durée de 110 fs et de longueur d'onde 800 nm, avec un maximum d'énergie de 1 mJ/impact et une fréquence de répétition de 1 kHz. Le faisceau est focalisé par un objectif de longueur focale de 7,5 cm sur une cible d'environ 1 mm : un substrat massif de 3C-SiC, placé au fond d'un bécher de 20 mL rempli d'eau distillée. La hauteur de la colonne d'eau sur le substrat est d'environ 10 mm. Le faisceau laser est dirigé sur la cible selon un parcours rectangulaire, à une vitesse constante de 0,1 mm/s. Pour des échantillons traités par un laser de puissance comprise entre 100 et 500 mW, le procédé d'ablation laser est conduit pendant une durée de 2 à 3 heures. Les particules de SiC employées dans le cadre d'une séparation éléctrophorétique peuvent, préalablement à leur association avec des acides nucléiques ou des protéines, faire l'objet d'une fonctionnalisation chimique, ce par quoi on obtient des particules fonctionnalisées. Par « particules fonctionnalisées », on entend des particules modifiées chimiquement, c'est-à-dire dont la surface a été modifiée par exemple par greffage de groupes chimiques appropriés, notamment des groupes conférant des charges positives aux particules, comme par exemple des groupes du type -(C=O)-NH-CH2CH2-NH3+, en équilibre avec la base conjuguée d'un acide. Ainsi, les particules de SiC de l'invention peuvent être soumises à une fonctionnalisation chimique afin de modifier leur chimie de surface qui est notamment décrite en détail dans Alekseev et al. (Chemistry of Materials, 2007, vol. 19, 2189-2194). Cette fonctionnalisation permettra de moduler le phénomène d'association des particules avec les acides nucléiques ou protéines à marquer. Quelle que soit la nature de leur procédé d'obtention, les particules employées selon l'invention peuvent être employées dans le cadre de toute expérience, in vitro et in vivo, à titre de marqueurs d'acides nucléiques et/ou de protéines, révélables par photoluminescence. L'invention sera encore davantage illustrée au vu de l'exemple décrit ci-après. 10 EXEMPLE Les particules de SiC utilisées dans cet exemple ont été obtenues selon un procédé de gravure d'un substrat de SiC du type décrit dans l'article de Botsoa et al. dans Applied 15 Physics Letters, 92, 173902 (2008), la gravure étant réalisée par attaque électrochimique d'un substrat massif de SiC. L'article décrit également la méthode de mesure de la distribution en taille des particules ainsi préparées. Les particules de SiC utilisées dans le cadre du présent exemple ont une taille moyenne de 1,6 nm, leur taille maximale ne dépassant pas 4 nm. 20 Les particules ainsi préparées présentent une absence de toxicité. Pour illustrer cette non-toxicité, les particules de SiC (0.1 mg) ont été injectées par voie intraveineuse à cinq souris mâles en suspension dans du sérum physiologique. Les souris ont été strictement suivies par monitoring et aucune modification d'un paramètre vital n'a été 25 observée dans les toutes premières heures suivant l'injection. Les souris n'ont pas perdu de poids et n'ont jamais montré aucun signe de souffrance imputable aux particules de SiC. La durée de vie moyenne observée de ces souris est comparable à celle des souris de contrôle de la même souche. 30 Par ailleurs, l'application d'une formulation de particules de SiC sur de la peau humaine a montré que celle-ci se comporte comme une barrière efficace et ne laisse pas pénétrer les particules à travers ses couches superficielles. Les particules de SiC préparées ont été utilisées selon le protocole ci-après pour la 35 révélation d'ADN dans le cadre d'une expérience de séparation électrophorétique. La dispersion de particules de SiC telle que préparée selon le procédé de gravure cité ci-dessus (concentration en particules de SiC de 2 µg/µ L) a été employée pour marquer des fragments d'ADN plasmidique de différentes tailles (entre 500 et 1500 pb). Des fragments d'ADN (5 µg) ont été additionnés à une suspension aqueuse de particules de SiC préparée selon le protocole (5 µL) pour donner l'échantillon n °1. Un gel d'agarose 2% dans un tampon TAE de pH = 8.3 (Tris 40 mM, sodium acétate mM, EDTA 1 mM) a été préparé sans bromure d'éthydium. Une solution de dépôt (300/0 de glycérol, 0.750/0 SDS) a également été préparée. 10 µL de la solution de dépôt ont été ajoutés à l'échantillon n°1 ainsi qu'à un échantillon témoin comprenant 5 µg de fragments d'ADN et 10 µg de BEt. Chacun de ces mélanges a ensuite été déposé dans un puits du gel d'électrophorèse. La migration a été réalisée sous tension constante à raison d'environ 5 V/cm de gel et en présence d'un marqueur de taille. Après migration des échantillons, le gel a été illuminé par une source de lumière UV (310 nm), ce qui a permis de visualiser la position des brins d'ADN liés aux particules, puis le gel a été photographié à l'aide d'une caméra CCD (ImageMaster VDS-CL, Amersham Biotech). La lumière produite et enregistrée est comparable à celle obtenue en utilisant un gel préparé avec du bromure d'éthydium. L'utilisation des particules selon la présente méthode présente donc les mêmes avantages que la technique employant le BEt, sans en avoir les contraintes évoquées plus haut. REVENDICATIONS1. Procédé de révélation d'acides nucléiques ou de protéines qui comprend les étapes suivantes : (a) lesdits acides nucléiques ou protéines sont mis en contact avec des particules de SiC au sein d'un milieu dispersant, ce par quoi lesdites particules de SiC se lient auxdits acides nucléiques ou protéines, puis (b) lesdits acides nucléiques ou protéines ainsi liés aux particules de SiC sont soumis à un rayonnement UV induisant une photoluminescence spécifique des particules. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, avant la mise en contact des particules de SiC avec les acides nucléiques ou protéines, les particules de SiC du milieu de l'étape (a) sont sous la forme d'objets dispersés de dimension inférieure à 1 µm. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel les particules de SiC ont une taille moyenne comprise entre 0,5 nm et 1 µm, de préférence inférieure à 10 nm, avantageusement inférieure à 7 nm, et préférentiellement inférieure à 5 nm. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, qui est mis en ceuvre dans la cadre d'une séparation électrophorétique, le procédé comportant, entre l'étape (a) et l'étape (b), une étape de migration par électrophorèse des acides nucléiques et/ou protéines liés aux particules. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, mis en ceuvre pour la révélation d'acides nucléiques, de préférence d'ADN. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les particules de SiC sont mises en ceuvre, au sein du milieu de l'étape (a), sous forme d'une suspension à une concentration comprise entre 0,5 pg/µL et 5 pg/µL en particules de SiC, de préférence comprise entre 1 pg/µL et 3 pg/µ L. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel, dans le milieu de l'étape (a), on utilise un excès de particules de SiC par rapport à la quantité totale d'acides nucléiques ou de protéines. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel, dans le milieu de l'étape (a), le rapport entre la quantité de particules de SiC et la quantité d'acides nucléiques ou de protéines est compris entre 1 pg/µg et 10 pg/µg, de préférence inférieur à 7 pg/µg. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les particules de SiC sont susceptibles d'être obtenues selon un procédé de gravure d'un substrat de SiC, la gravure étant obtenue par attaque électrochimique du substrat de SiC. 15 10. Utilisation de particules de SiC à titre de marqueurs d'acides nucléiques et/ou de protéines, révélables par photoluminescence. 10