Brevet FR2960781A1 — publié le 20111209

La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un vaccin oral sec, composé d'un virus vivant atténué dont la stabilité du titre infectieux au cours du temps est améliorée. Selon un mode particulier on obtient un vaccin oral sec utilisable sans réhydratation préalable. Les vaccins composés de virus vivants atténués sont pour la plupart fragiles et se présentent généralement sous forme lyophilisée ceci malgré la chute du titre infectieux entraînée par la lyophilisation qui est particulièrement importante en ce qui concerne le virus polio. Diverses tentatives pour freiner cette chute sont reportées dans l'art antérieur. La demande WO 89/06542, par exemple, enseigne que la perte en titre infectieux d'un virus polio type 3, séché à 37°C et conservé 7 jours à cette température, peut être ramené de 6 à 3,7 logs par simple séchage de la solution en stock de virus à 37°C en présence d'une solution stabilisante constituée par du tréhalose à 10 0/0 en tant qu'unique agent protecteur. Toutefois la chute en titre infectieux reste importante et supérieure à celle observée pour le vaccin non séché. Ceci montre la difficulté de sécher ce virus. En outre, le vaccin sec ainsi préparé n'est pas prêt à l'emploi ; il doit nécessairement être réhydraté avant de pouvoir être utilisé. Une initiative a été lancée par l'OMS dans les années 1990 - 1995 (Children's vaccine initiative product development group on thermostable Oral Poliovaccine), pour encourager le développement d'un vaccin polio oral (OPV) thermostable, liquide ou lyophilisé. Cette action a été menée dans le cadre du programme d'éradication de la poliomyélite, l'instabilité du vaccin OPV limitant le succès de la vaccination avec ce vaccin. Les seuls résultats intéressants de stabilisation obtenus durant cette période, ont été obtenus par R. Crainic en utilisant de l'eau deutériée (D2O) à une concentration minimum de 90 %, sous forme liquide (Crainic R., Wu R., Otelea D. et al. The replacement of water with deuterium oxide significantly improves the thermal stability of the oral polio virus. In Brown F, editor, New Approaches to Stabilization -2- of Vaccines Potency Developments in Biologicals Standardization, 1996; vol. 87:161-6 ; e t la demande de brevet WO 94 / 21298: Compositions Pharmaceutiques stabilisées et leur procédés de préparation). Néanmoins, le procédé de préparation utilisant l'eau deutériée est difficile à mettre en oeuvre pour des raisons administratives et de sécurité reliées à l'utilisation de l'eau deutériée (eau lourde). Par ailleurs, le brevet DD-A-299 213 A7 concerne un procédé de stabilisation d'un vaccin sec composé du virus vivant de la rougeole. Ce procédé comprend une étape de congélation à -20° de ce virus dans une composition comprenant obligatoirement de l'arginine, du dextran, du tréhalose ou sorbitol et un tampon phosphate, suivie d'une étape de dessiccation de 48 heures à 22°C. Selon ce document, la perte en titre infectieux du virus est de 0,81 log mais le procédé décrit dans ce document ne conduit pas à un vaccin sec sous une forme administrable par voie orale et comporte une étape de dessiccation dont la durée relativement longue s'est avérée gênante pour une exploitation industrielle. En outre, il n'est pas fait mention de stabilité au cours d'une longue période de stockage. La stabilisation des vaccins vivants atténués reste un problème et des laboratoires continuent de travailler sur ce sujet. H. Shiomi et coll. (Jpn. J. Infect. Dis., 56, 70 - 72, 2003) ont obtenus des résultats intéressants en ce qui concerne un vaccin OPV : juste après un séchage par lyophilisation, la perte en titre infectieux pour les sérotypes 1 à 3 étaient respectivement de 0.52 log ; 0.68 log ; et 1.29 log. Après séchage pendant 7 jours à 37°C, la perte en titre infectieux pour les sérotypes 1 à 3 était respectivement de 0.48 log ; 0.57 log ; et 0.38 log. Ces résultats qui représentent une réelle amélioration par rapport à l'art antérieur, ont été obtenus dans des conditions qui nécessitent cependant une réhydratation avant utilisation. US 2006 / 0127414 propose un procédé de stabilisation du virus polio (vaccin IPV - Inactivated Polio Vaccine) par séchage, qui permet d'obtenir un vaccin hautement visqueux nécessitant une réhydratation. Ce procédé n'a toutefois pas été appliqué au vaccin oral (OPV). -3- La réémergence de cas de poliomyélite dans certains pays africains en 2009, ou la maladie avait été éradiquée, montre le besoin d'un vaccin stable et d'utilisation aisée (OPV ou IPV). On a maintenant trouvé qu'un procédé de préparation faisant appel à une opération de séchage conduite à partir d'une composition liquide particulière, permettait de réduire de manière significative la perte en titre infectieux non seulement après séchage mais aussi après excursion vers des températures élevées. D'autre part, l'usage de cette composition, associé à des conditions de séchage particulières, permet d'obtenir un vaccin qui est administrable en prise directe, c'est-à-dire utilisable sans réhydratation préalable. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un vaccin oral sec, composé d'un virus vivant atténué, par séchage (dessiccation) d'une composition aqueuse comprenant : (i) ledit virus ; (ii) un agent de ballaste (charge), sélectionné dans le groupe constitué par les monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides et les sucres alcool qui en sont dérivés ainsi que leur mélanges ; (iii) un agent épaississant ; et (iv) un agent stabilisant comprenant un tensioactif, des acides aminés, et de l'urée, en milieu liquide tamponné. L'opération de séchage peut être mise en oeuvre selon des techniques conventionnelles. On cite notamment la lyophilisation et le séchage sous vide. Selon un mode particulièrement avantageux, le séchage n'est pas poursuivi au-delà du temps nécessaire à l'obtention d'un produit possédant un taux d'humidité résiduelle compris entre 5 et 10 % (poids : poids) bornes incluses. On indique que ce taux d'humidité résiduelle peut être commodément déterminé selon la méthode Karl Fisher. Pour atteindre l'objectif explicité ci-dessus en opérant selon une technique conventionnelle, on procède à l'opération de séchage par exemple la lyophilisation, en quelques heures, avantageusement en moins de 24 heures, de -4- manière préférée en moins de 12 heures, de manière particulièrement préférée en moins de 8 heures ; ce qui sur le plan industriel présente un grand intérêt. Toujours selon un mode particulièrement avantageux, le poids sec de la composition aqueuse en usage dans le procédé selon l'invention et qui est soumise à l'opération de séchage, est compris entre 70 à 85 % (poids : poids) bornes incluses, du poids total de la composition aqueuse. Les quatre composants (i) à (iv) y contribuent en des proportions diverses, l'agent de ballaste y contribuant pour la plus grande part et le virus pour une part infime. Ainsi, l'agent de ballaste (charge) est présent dans la composition aqueuse destinée à être séchée, à une concentration comprise entre 80 et 100 % (bornes incluses) de la solubilité maximale de l'agent de ballaste en milieu aqueux entre 25 et 35°C. L'agent épaississant est présent dans la composition aqueuse destinée à être séchée, à une concentration comprise entre 0,08 et 0,12 g / 100 mL, bornes incluses. L'agent stabilisant est présent dans la composition aqueuse destinée à être séchée, à une concentration comprise entre 40 et 80 %, avantageusement 50 à 70 %, de manière préférée 55 et 60 % (vol. / vol.) bornes incluses. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre pour obtenir n'importe quel vaccin sec oral contenant pour antigène un virus vivant atténué. Il est parfaitement adapté à la préparation de vaccins composés de virus thermosensibles. Par « vaccin sec » on entend un vaccin de consistance solide, non-liquide. Par « vaccin oral » on signifie un vaccin destiné à être administré par voie orale. Le virus peut être n'importe quel virus à l'encontre duquel, il est désirable d'obtenir un vaccin vivant atténué destiné à être administré par voie orale. Le virus de la polio et le rotavirus sont des virus à l'encontre desquels un vaccin sec oral est tout à fait approprié. Ces virus présentent chacun des variations de souche telles qu'une sous-classification s'applique. Ainsi le virus de la polio se répartit à ce jour en trois -5- sérotypes : 1, 2 et 3 ; et le rotavirus se répartit en un nombre de sérotypes plus élevé encore. Pour le rotavirus, on cite par exemple, les sérotypes G1, G2, G3, G4, G8 et G9. Le procédé selon l'invention s'applique à tous les sérotypes de ces virus. Au fin de la présente invention, l'agent de ballaste peut être par exemple le dextran, le maltodextran, le glucose, le xylose, le galactose, l'arabinose, le fructose, le D-mannose, le sorbose, le maltose, le sucrose, le saccharose, le lactose ou le tréhalose ; ce dernier étant préféré. De manière typique, le tréhalose peut être utilisé à une concentration comprise entre 60 et 85 g / 100 mL (bornes incluses), avantageusement de 0.7 g/mL (70 % poids / vol). L'agent de ballaste peut être aussi un sucre-alcool tel que le sorbitol, le mannitol, le xylitol, le glycerol, erythritol ou l'arabitol. L'agent de ballaste peut être aussi un mélange des composés cités, par exemple un mélange mannitol + sorbitol. Pour usage dans le procédé selon l'invention, l'agent épaississant peut être par exemple du xanthane, du caroube, du guargel, de l'alginate et du mucigel ; le xanthane étant préféré dans la mesure où cet épaississant a aussi des effets stabilisants sur les virus. De manière typique, le xanthane peut être utilisé à une concentration de 0.1 % (poids / vol.). L'agent stabilisant est un mélange, notamment un mélange liquide, réunissant les composés suivants : au moins un tensioactif, des acides aminés, de l'urée et un tampon. Le tensioactif actif peut être n'importe quel tensioactif. On cite en particulier le dodecyl sulfate de sodium (tensioactif anionique) ainsi que les tensioactifs non ioniques tels que ceux de type ester de sorbitane polyoxyéthyléné. Un exemple de ces derniers est constitué par le produit connu sous la dénomination commerciale de Tween'M Un mélange d'acides aminés peut être un mélange d'acides aminés essentiels ou un mélange d'acides aminés non-essentiels. On utilise avantageusement les -6- 2 types de mélange dans la composition stabilisante utile aux fins de la présente invention. Le tampon peut être n'importe quel tampon, salin ou non. On cite notamment les tampons phosphate et le tampon HEPES. De manière avantageuse, l'agent stabilisant peut être aussi comprendre (i) un ou des polysaccharides tels que le Dextran ; et/ou (ii) un ou des alcools de sucre (sucres alcool) ; en particulier le sorbitol et le mannitol. Ainsi, un mélange utile en tant qu'agent stabilisant peut être constitué : d'un tensioactif (par exemple, entre 0,005 et 0,02 % vol. /vol.) ; d'un mélange d'acides aminés (par exemple, en mélange concentré entre 30 et 45 % vol. / vol.) ; d'urée (par exemple, entre 0,5 et 1,5 % poids / vol.) ; d'un tampon (par exemple, entre 15 et 40 mM) ; d'un sucre-alcool (par exemple, entre 5 et 10 % poids / vol.) ; et d'un polysaccharide (par exemple, entre 1 et 2 % poids / vol.). A titre illustratif, on indique qu'un mélange liquide ayant fonction d'agent stabilisant, peut être par exemple, composé des produits et mélanges suivants (composition SI) : Tween® 80 (Polysorbate 80, 0,01 % poids / vol.), HEPES (20 mM), sorbitol (5 % poids / vol.), mannitol (2 ,5 % poids / vol.), chlorhydrate d'arginine (Arg-HCI) (2,14 % poids / vol.), Cystéine-HCI (Cys-HCI, 0,00001 % poids / vol.), Mélange d'acides aminés essentiels BME 100xc (20 0/0 vol. /vol.), Mélange d'acides aminés non-essentiels MEM 100xc (20 % vol. /vol.), Dextran 70 (1,5 % poids / vol.), Urée (0,9 % poids / vol.). Pour obtenir ce mélange stabilisant, les mélanges BME et MEM utilisés sont comme suit : BME (acides aminés essentiels) : 2.1 g. / I. - Chlorhydrate de Arginine...: -Cystine : 1.2 g./I. - Histidine : 0.8 g / I - Isoleucine : 2.6 g / 1 2960781 -7- - Leucine : 2.6 g/ I - Chlorhydrate de Lysine : 3.65 g / 1 - Methionine : 0.75 g / 1 - Phenylalanine : 1.65 g / 1 5 - Threonine : 2.4 g / 1 - Tryptophane : 0.4 g / 1 - Tyrosine : 1.8g/1 - Valine : 2.35 g / 1 10 MEM (acides aminés non essentiels) : - Alanine : 0.89 g / 1 - Asparagine : 1.5 g / 1 - Ac. Aspartique : 1.33 g/ I - Ac. Glutamique : 1.47 g / 1 15 - Glycine : 0.75 g / 1 - Praline : 1.15g/1 - Serine : 1.05 g / 1 Une composition aqueuse utile aux fins de la présente invention peut être obtenue en dissolvant un agent de ballaste, e.g. du tréhalose et un agent épaississant, e.g. 20 du xanthane, dans un agent stabilisant liquide comprenant e.g. au moins un tensio-actif, un tampon, des acides aminés et de l'urée ; puis en rajoutant une quantité appropriée de virus. Selon un mode opératoire avantageux, le séchage s'effectue à partir d'une composition aqueuse répartie en échantillons de telle sorte que, après séchage, 25 les échantillons séchés possèdent une taille appropriée à une administration par voie orale, sans réhydratation préalable. La répartition en échantillons peut être mise en oeuvre de plusieurs manières : On peut par exemple répartir la composition aqueuse en alvéoles (e.g., cupules thermoformées à partir d'une feuille en PVC) ou en grosses gouttes sur une plaque. Dans ces conditions la taille 30 des alvéoles et des gouttes peut être adaptée pour correspondre in fine à une dose vaccinale. Il suffit à l'individu de prendre cette dose telle quelle de la poser sur la langue où elle se délitera d'elle-même. Selon un mode de répartition alternatif, on congèle la composition en azote liquide ou gazeux sous forme de microbilles notamment selon la technique décrite dans WO 2010/003670. Le séchage des microbilles est ensuite parachevé. Les -8- microbilles sèches sont ensuite réparties en dose de poids identique pour prise directe par le destinataire. Les méthodes de séchage conventionnelles s'appliquent quelque soit le mode de répartition choisi ; Ainsi, une fois la répartition effectuée on peut notamment procéder à une opération de séchage par lyophilisation. La lyophilisation est une méthode de séchage qui s'effectue conventionnellement en deux étapes : congélation et sublimation. A titre d'illustration, on indique que la composition aqueuse une fois répartie en alvéoles ou sur plaque, peut être congelée à environ - 70°C. Puis la température est ramenée entre -40 et -30°C bornes incluses, par exemple -35°C, température à laquelle on met par la suite en oeuvre la sublimation sous une pression de 300 à 400 pBars. L'étape de sublimation se termine en ramenant la température entre +5 et +15°C, bornes incluses, par exemple +10°C. Les alvéoles sont alors obturées à l'aide d'une feuille d'aluminium. Il suffit par la suite de percer une alvéole, de prendre la dose vaccinale qu'elle contient et de l'appliquer sur la langue. Les doses sèches produites sur plaques sont simplement collectées en flacons. Lorsqu'on utilise une composition aqueuse répartie en microbilles (e.g. de 800 pm à 1 mm de diamètre) par congélation, on peut procéder directement à l'étape de sublimation comme décrit ci-avant. Après sublimation, les microbilles sont réparties en dose vaccinale, par exemple en flacon hermétique unidose. Ainsi, le produit obtenu selon un mode particulier du procédé selon l'invention, ne nécessite pas au moment de l'administration, de reprise extemporanée par un quelconque solvant. Le procédé selon l'invention permet de préserver le titre infectieux du virus vivant atténué et donc du pouvoir vaccinant du vaccin sec oral qui le contient. En effet, juste après l'opération de séchage, le virus contenu dans le produit obtenu par le procédé présente une perte en titre infectieux par rapport à celui déterminé avant séchage à partir de le composition aqueuse, perte qui, de manière -9- surprenante, est très réduite : moins de un ou deux log. De plus, après vieillissement accéléré par chauffage et lyophilisation 7 jours à 45°C, on constate une chute en titre infectieux du même ordre de grandeur, ce qui préjuge d'une remarquable stabilité dans le temps du vaccin vivant sec obtenu par le procédé selon l'invention. C'est pourquoi, l'invention a aussi pour objet un vaccin oral sec comprenant un virus vivant atténué, pouvant être obtenu par un procédé selon l'invention. Il a notamment pour caractéristique de contenir un virus vivant atténué dont le titre infectieux est inférieur d'au plus 1 ou 2 log (log de base 10) par rapport à celui déterminé à partir de la composition aqueuse qui est utilisée dans le procédé d'obtention avant qu'elle ne soit soumise au séchage. Il peut aussi avoir pour caractéristique de contenir, avoir été maintenu pendant 7 jours à 45°C juste après son obtention, un virus vivant atténué dont le titre est inférieur d'au plus 2 log (log de base 10), de manière préférée d'au plus 1 log, par rapport à celui déterminé juste après son obtention. Il a aussi pour caractéristique de contenir de 5 à 10 % (poids : poids) d'humidité résiduelle. Selon un mode particulier, le vaccin selon l'invention est adapté à une administration sous sa forme sèche (sans réhydratation préalable) par voie orale. Le virus contenu dans le vaccin selon l'invention peut être n'importe lequel de ceux décrits comme pouvant entrer dans la composition aqueuse pour usage dans le procédé selon l'invention. A titre d'exemple on indique qu'un vaccin selon l'invention peut comprendre (i) les sérotypes 1, 2 et/ou 3 du virus de la polio ; ou (ii) un ou plusieurs sérotypes du rotavirus. Enfin l'invention a aussi pour objet une composition aqueuse pour usage dans le procédé selon l'invention, comprenant : (i) un virus vivant atténué ; (ii) un agent de ballaste (charge), sélectionné dans le groupe comprenant les monosaccharides, les oligosaccharides, les -10- polysaccharides, les sucres alcool qui en sont dérivés ainsi que leur mélanges ; (iii) un agent épaississant ; et (iv) un agent stabilisant comprenant un tensioactif, des acides aminés, de l'urée et un tampon ; et de manière optionnelle, (v) un sucre-alcool et/ou un polysaccharide. Données expérimentales A - Préparation d'un vaccin sec polio oral. On prépare une composition aqueuse en dissolvant dans une préparation liquide stabilisante SI, S2 ou S3, du xanthane 0,7 g/mL (70%) final et une charge dont la concentration finale est donnée dans le tableau I ci-après. Puis incorpore environ 7 DICC 50/d du virus de la polio constitué des sérotypes 1, 2 et 3 (DICC 50/d : dose virale infectant 50% des cultures de cellules) et préparé par propagation sur culture de cellules selon les consignes fournies par la Pharmacopée Européenne Ed. : 6.1 Les préparations stabilisantes SI à S3 sont comme suit : SI : Tween® 80 (Polysorbate 80, 0,01 % poids / vol.), HEPES (20 mM), sorbitol (5 0/0 poids / vol.), mannitol (2 ,5 % poids / vol.), Arg-HCI (2,14 % poids / vol.), Cystéine-HCI (Cys-HCI, 0,00001 % poids / vol.), Mélange d'acides aminés essentiels BME 100xc (20 % vol. / vol.), Mélange d'acides aminés non-essentiels MEM 100xc (20 % vol. / vol.), Dextran 70 (1,5 % poids / vol.) et Urée (0,9 % poids / vol.). S2 : Sorbitol (5 % poids / vol.), mannitol (2 ,5 % poids / vol.), Arg-Cl (2,14 % poids / vol.), Cystéine-HCI (Cys-Cys-HCI, 0,00001 % poids / vol.), Mélange d'acides aminés essentiels BME 100xc (40 % vol. / vol.), Mélange d'acides aminés non-essentiels MEM 100xc (40 % vol. / vol.), Dextran 70 (1,5 % poids / vol.) et Urée (0,9 % poids / vol.). -11 - S3 : Mélange d'acides aminés essentiels BME 100xc (10 % vol. / vol.) et Mélange d'acides aminés non-essentiels MEM 100xc (10 % vol. / vol.). La composition aqueuse est ensuite répartie dans les alvéoles de 0,3 ml d'une plaque thermoformée en PVC. La plaque alvéolée est congelée à -70°C. La sublimation est mise en oeuvre à - 35°C pendant 2 heures, puis à + 10°C pendant 6 heures, sous une pression de 350 pbars pendant toute la durée. Les alvéoles sont ensuite obturées avec une feuille d'aluminium. Le produit sec obtenu se présente sous forme d'une pastille formée par les alvéoles. Il est blanc homogène à l'oeil. Son pourcentage d'humidité résiduelle est compris entre 7 et 8 %. Sa résistance/ cohérence est suffisante pour perforer la feuille d'aluminium qui obture les alvéoles. Il se délite rapidement au contact de l'eau ou de la salive. B - Mesure du titre infectieux Le titre infectieux du virus avant et après lyophilisation ainsi qu'après lyophilisation suivie d'un stockage à 37°C ou 45°C pendant 7 jours, est déterminé par la technique DICC 50 (détermination du titre infectant 50 % des cultures de cellules) décrite dans la Pharmacopée Européenne Ed. : 6.1, page 3588, et précisée ci-après. La préparation virale à titrer est diluée de -1 à - 6 ou -7 (en log) dans des plaques de 96 puits à raison de 50 pL par puits avec un milieu de culture MEM 1xc complémenté avec 2 % (vol. / vol.) de sérum de veau foetal (ne contenant pas d'anticorps contre la polio), 4 % (vol. / vol.) d'une solution de bicarbonate de sodium à 5.6 % et 0.2 % (vol. / vol.) d'une solution d'antibiotiques pénicillinedidromycine 400xc. Puis on ajoute soit 50 pL du milieu de dilution (titrage global) ; soit 50 pL de l'un 25 des mélanges suivants : - antisérum anti-polio type 2 plus antisérum type 3 dilués dans du milieu MEM, pour neutraliser les virus polio type 2 et 3, contenus dans la préparation virale (titrage du type 1) ; -12- - antisérum anti-polio type 1 plus antisérum type 3 dilués dans du milieu MEM, pour neutraliser les virus polio type 1 et 3, contenus dans la préparation virale (titrage du type 2) ; - antisérum anti-polio type 1 plus antisérum type 2 dilués dans du milieu MEM, pour neutraliser les virus polio type 1 et 2, contenus dans la préparation virale (titrage du type 3). Une colonne témoin négatif est constituée avec 100 pL de milieu MEM par puits. Les plaques sont recouvertes et mises sous agitation 1 hr à 36°C. Après ce temps de contact, on ajoute dans chaque puits, 100 pL de suspension cellulaire Hep-2 (Cincinnati), à 50.000 cellules / mL. Puis on place les plaques 9 jours à l'étuve à 36°C sans agitation. On lit les effets cytopathogènes dans chaque puits après avoir vérifier l'intégrité des témoins cellules. Pour chacune des dilutions, on détermine le nombre de puits positifs. Le calcul du titre est réalisé en utilisant une régression linéaire du nombre des puits positifs (transformées par la fonction « arc sinus racine carrée ») en fonction des dilutions (transformées en logarithme). La perte en titre infectieux avant / après lyophilisation ainsi que celle directement liée aux conditions de stockage (après lyophilisation / après lyophilisation + stockage) est exprimée en log (log de base 10) dans le tableau 1 ci-dessous. -13-Tableau I Charge Agent Perte en titre Perte en titre Perte en titre stabilisant global (log) global (log) global (log) après après après lyophilisation lyophilisation lyophilisation et stockage à et stockage à 37°C pendant 45°C pendant 7 jours 7 jours Lactose 70 % S3 1.5 2,8 - Lactose 70 % S2 0.8 0,9 - Trehalose 70 % S3 1.3 1,9 3,15 Trehalose 70 % S2 0,75 0,25 2,1 Trehalose 70 % SI 1,15 0,1 1,0 Saccharose 137 % S1 0,55 - - Mannitol 70 % S3 1,55 - - Mannitol 60 % S1 1,5 1,4 2,4 Lactose 70 % + S1 0,75 0,4 2,8 Sorbitol 20 0/0 S1 0,4 1,8 2,8 Glucose 95 % La stabilité du vaccin sec polio oral contenant du tréhalose, du xanthane et la préparation SI tel que décrit ci-avant (vaccin Lyoc) est comparée à celle observée avec (i) un vaccin liquide polio oral obtenu selon le procédé D2O (le procédé de R. Crainic) et (ii) un vaccin liquide polio oral à base de MgCl2,1 M, couramment utilisée (vaccin T). Le titre infectieux de chacun des trois sérotypes est déterminé -14- au cours d'une période de stockage de 3 mois à 25°C, de 3 semaines 37°C ou de 7 jours à 45°C. La perte en titre directement aux conditions de stockage à 25°C (après lyophilisation / après lyophilisation + stockage) est exprimée en log (log de base 10) dans le tableau II ci-dessous. Les titres infectieux au cours du stockage à 37°C et 45°C sont directement lisibles à partir des graphes I et II ci-après. Tableau II : Stabilité après 3 mois à 25°C Perte en titre infectieux Titre Sérotype 1 Sérotype 2 Sérotype 3 après 3 mois à 25°C Total (exprimée en log) Vaccin T > 2,2 2,7 2,3 2,2 Vaccin D20 > 1,5 1,9 1,6 1,7 Vaccin Lyoc 0,8 0,9 0,6 1,2 5 -15-Graphe I : Stabilité après 3 semaines à 37°C Graphe II : Stabilité après 7 iours à 45°C On constate d'après le tableau II et les courbes de stabilité, que la stabilisation obtenue pour le vaccin OPV est surprenante. En effet, la perte en titre infectieux, de l'ordre de 1 log en 7 jours à 45°C, est très réduite lorsqu'on met en oeuvre le -16- procédé selon l'invention en comparaison avec un procédé de l'état de la technique en présence de MgCl2, stabilisant considéré comme puissant, qui conduit à une perte de l'ordre de l'ordre de 3,4 logs dans les mêmes conditions de stockage. Il s'ensuit que le procédé selon l'invention augmente de façon inattendue la stabilité du titre global infectieux du mélange des trois sérotypes connue du virus de la polio. Cette stabilisation se montre étonnante et supérieure à celle obtenue avec le procédé de R Crainic (D2O), et supérieure à celle obtenue par H. Shiomi et coll., tout en procurant une facilité d'administration pour le vaccin OPV. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un vaccin oral sec, composé d'un virus vivant atténué, par séchage d'une composition aqueuse comprenant : (i) ledit virus ; (ii) un agent de ballaste (charge), sélectionné dans le groupe constitué par les monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides et les sucres alcool qui en sont dérivés ainsi que leur mélanges ; (iii) un agent épaississant ; et (iv) un agent stabilisant comprenant un tensioactif, des acides aminés, et de l'urée, en milieu liquide tamponné. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le séchage n'est pas poursuivi au-delà du temps nécessaire à l'obtention d'un produit possédant un taux d'humidité résiduelle compris entre 5 et 10 % (poids : poids) bornes incluses. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le poids sec de la composition aqueuse est compris entre 70 et 85 % (poids : poids) bornes incluses, du poids total de la composition aqueuse. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent de ballaste (charge) est présent dans la composition aqueuse destinée à être séchée, à une concentration comprise entre 80 et 100 % (bornes incluses) de la solubilité maximale de l'agent de ballaste en milieu aqueux entre 25 et 35°C. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent de ballaste (charge) est choisi dans le groupe constitué par le mannitol, le sorbitol, le tréhalose, le saccharose, le xylose, le maltose et le lactose ou un mélange de ces derniers.-18- 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent de ballaste (charge) est le tréhalose. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent épaississant est présent dans la composition aqueuse destinée à être séchée, à une concentration comprise entre 0,08 et 0,12 g / 100 mL, bornes incluses. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent épaississant est le xanthane. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent stabilisant est présent dans la composition aqueuse destinée à être séchée, à une concentration comprise entre 40 et 80 %, avantageusement 50 à 70 %, de manière préférée 55 et 60 % (vol. / vol.) bornes incluses. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'agent stabilisant est une composition comprenant un tensioactif non-ionique, un tampon, des sucres alcool, un mélange d'acides aminés, un polyoside et de l'urée. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le séchage s'effectue à partir d'une composition aqueuse répartie en échantillons de telle sorte que, après séchage, les échantillons séchés possèdent une taille appropriée à une administration par voie orale, sans réhydratation préalable. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le séchage s'effectue par lyophilisation qui est une méthode comprenant une étape de congélation et une étape de sublimation. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape de sublimation de la lyophilisation s'effectue d'abord à une température comprise entre -40 et -30°C, bornes incluses, puis à une température-19- comprise entre + 5°C et +15°C, bornes incluses, sous une pression de 300 à 400 pBars et durant une période de temps appropriée. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le séchage s'effectue à partir d'une composition aqueuse répartie en échantillons dans des alvéoles ou sur des plaques. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le séchage s'effectue à partir d'une composition aqueuse congelée en azote liquide ou gazeux sous forme de microbilles. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le séchage s'effectue par sublimation. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le virus est le virus de la polio, composé d'au moins un sérotype. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le virus de la polio est composé de deux sérotypes. 19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le virus de la polio est composé de trois sérotypes. 20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le virus est le rotavirus composé d'au moins un sérotype. 21. Vaccin oral sec comprenant un virus vivant atténué, pouvant être obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20. 22. Vaccin oral sec selon la revendication 21, caractérisé en ce que le titre infectieux du virus vivant atténué est inférieur d'au plus 2 log (log de base 10), de manière préférée d'au plus 1 log, par rapport à celui déterminé à partir de la composition aqueuse à partir de laquelle le procédé est mis en oeuvre.- 20 - 23. Vaccin oral sec selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que après avoir maintenu une dose de vaccin pendant 7 jours à 45°C juste après son obtention, le titre infectieux du virus vivant atténué est inférieur d'au plus 2 log (log de base 10), de manière préférée d'au plus 1 log, par rapport à celui déterminé à partir d'une dose de vaccin juste après son obtention. 24. Vaccin oral sec selon l'une des revendications 21 à 23, contenant de 5 à 10 0/0 (poids : poids) d'humidité résiduelle. 25. Vaccin selon l'une des revendications 21 à 24, pour administration sous sa forme sèche (sans réhydratation préalable) par voie orale. 26. Vaccin selon l'une des revendications 21 à 25, comprenant un ou plusieurs des sérotypes 1, 2 et 3 du virus de la polio. 27. Vaccin selon l'une des revendications 21 à 25, comprenant un ou plusieurs sérotype(s) du rotavirus. 28. Composition aqueuse pour usage dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 20, comprenant : (i) un virus vivant atténué ; (ii) un agent de ballaste (charge), sélectionné dans le groupe comprenant un monosaccharide, un oligosaccharide, un polysaccharide les sucres alcool qui en sont dérivés ainsi que leur mélanges ; (iii) un agent épaississant ; et (iv) un agent stabilisant comprenant un tensioactif, des acides aminés, de l'urée et un tampon ; et de manière optionnelle (v) un sucre-alcool et/ou un polysaccharide.