Brevet FR2952374A1 — publié le 20110513

La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en particulier la production de protéines recombinantes. Plus précisément, la présente invention a essentiellement pour objet une nouvelle lignée cellulaire hépatocytaire capable de produire du facteur IX recombinant biologiquement actif, ainsi que le facteur IX recombinant ainsi produit. Le facteur IX humain (FIX) est une protéine de 415 acides aminés (forme mature) naturellement présente dans le sang qui participe à la cascade de réactions conduisant à la coagulation du sang. Le FIX est principalement synthétisé par le foie, sous la forme d'un précurseur qui, après élimination du peptide signal, est soumis à différentes modifications posttraductionnelles telles que la gamma-carboxylation d'acides glutamiques, la glycosylation d'asparagines, de sérines, et de thréonines, la beta-hydroxylation d'un acide aspartique, la phosphorylation d'une sérine, la sulfatation d'une tyrosine. Après élimination du propeptide avant la tyrosine 1, le FIX actif est alors secrété dans la circulation sanguine. L'importance de ces modifications post-traductionnelles (et de l'élimination du propeptide) pour l'obtention d'un FIX biologiquement actif a été démontrée par plusieurs auteurs (Pipe, Thromb Haemost. 2008 May;99(5):840-50). L'hémophilie est la plus fréquente des maladies hémorragiques graves. C'est une maladie génétique récessive dont la transmission est liée au chromosome X. Une déficience en facteur de coagulation VIII (FVIII) caractérise l'hémophilie A (une naissance sur 5000) et une déficience en facteur de coagulation IX caractérise l'hémophilie B (une naissance sur 30 000). Les expressions cliniques de l'hémophilie peuvent être classées en fonction du taux du facteur concerné, à savoir les formes sévères (FVIII/FIX 5%). Le traitement de l'hémophilie (sévère ou modérée) consiste en un traitement substitutif par administration de concentrés de FVIII/FIX, à la demande, lors d'accidents hémorragiques ou d'actes chirurgicaux et/ou en prophylaxie pour prévenir les accidents hémorragiques en maintenant un taux de FVIII/FIX > 1 %. De nos jours, le FIX utilisé pour le traitement des patients atteints d'hémophilie B a deux origines, l'une plasmatique, l'autre recombinante (comme le Benefix®, Wyeth). Le FIX plasmatique est préparé à partir de pools d'échantillons de plasma humain. Les méthodes d'inactivation virale et de purifications ont significativement réduit les risques de transmission des virus de l'hépatite B et C, du VIH et d'autres agents pathogènes. Un FIX plasmatique toujours utilisé aujourd'hui est notamment commercialisé sous le nom de Mononine®, CSL Behring). Cependant, dans l'intérêt de la santé publique, l'obtention de FIX recombinant constitue une alternative plus sécurisée qui est largement préférée car elle permet d'éviter le problème de transmission de pathogènes qui seraient encore inconnus et qui pourraient être présents dans les échantillons de plasma humains utilisés pour préparer le FIX plasmatique. Le clonage et le séquençage du gène codant le FIX entre les années 1980 et 1985 ont donc rendu possible la production de FIX recombinant à l'aide de l'ADNc une fois caractérisé, et ont notamment permis d'identifier des mutations dans la plupart des patients atteints d'hémophilie B (Choo et coll., Nature. 1982 Sep 9;299(5879):178-80; Kurachi et coll., Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Nov;79(21):6461-4.; Yoshitake et coll., Biochemistry. 1985 Jul 2;24(14):3736-50), Ainsi, les patients ont aujourd'hui la possibilité d'être traités par l'utilisation de FIX recombinant, et notamment avec le produit commercialisé sous le nom de Benefix®. Le Benefix® est synthétisé par des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) transfectées stablement avec l'ADNc du FIX. Ces cellules possèdent un grand pouvoir sécréteur et sont à ce titre souvent utilisées pour produire des facteurs de coagulation recombinants. Cependant, ces cellules CHO ne disposent pas de l'ensemble de la machinerie cellulaire nécessaire pour réaliser toutes les modifications post-traductionnelles. Par conséquent, la protéine Benefix® est produite par co-expression de l'ADNc du FIX avec d'autres ADNc codant différentes enzymes nécessaires à l'obtention de ces modifications posttraductionnelles, telles que l'endopeptidase PACE/Furine (Paired basic Amino ace Converting Enzyme), afin d'obtenir une protéine recombinante fonctionnelle. Cependant, cette coexpression permet d'obtenir un FIX recombinant dont la gamma carboxylation est incomplète, et la phosphorylation et la sulfatation diminuées (Bond et coll., 1998. Semin. Hematol. 35, 11-17). Différents procédés ont été mis en oeuvre pour produire du FIX recombinant (par des animaux transgéniques par exemple) ou pour tenter d'améliorer la sécrétion, la demi-vie ou l'activité du FIX, et notamment par amélioration de différentes modifications post- traductionnelles, mais ces procédés ont conduit à des résultats plus ou moins satisfaisants en termes de production et/ou d'activité biologique du FIX ainsi produit (Jallat et coll. (EMBO J. 1990 Oct. 9(10):3295-301). Scheiflinger et coll. (US 7375084) ont fait part d'un facteur IX dont les degrés de sulfatation et de phosphorylation sont augmentés. White et coll. (Transfus. Sci. 19, 177-189, 1998) ont étudié les profils pharmacocinétiques du FIX plasmatique (Mononine®) et du FIX recombinant Benefix® chez des patients atteints d'hémophilie B. Ils ont démontré que l'activité spécifique du FIX recombinant est équivalente à celle du FIX d'origine plasmatique. Par contre, le taux de récupération in vivo) du FIX recombinant est inférieure de 20 à 30 % par rapport à celle du FIX plasmatique, alors que la demi-vie dans la circulation sanguine est similaire pour chacun de ces deux composés. Cette différence de taux de récupération implique d'injecter des doses supérieures de 20 à 30 °la de FIX recombinant pour obtenir un traitement efficace. En conséquence, il existe un besoin important de pouvoir disposer d'un FIX recombinant qui soit au moins aussi efficace que le FIX d'origine plasmatique, et qui présenterait idéalement un taux de récupération amélioré chez le patient hémophile B. La présente invention permet notamment de résoudre ces problèmes en fournissant une nouvelle lignée cellulaire hépatocytaire capable de produire un FIX recombinant biologiquement actif dont l'activité est supérieure ou égale à celle du FIX recombinant Benefix® notamment. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un facteur IX humain (FIX) recombinant caractérisé en ce quil est obtenu par un procédé de préparation comprenant, voire consistant en, les étapes consistant à : faire exprimer in vitro le matériel génétique codant le FIX dans une lignée cellulaire hépatocytaire humaine, récupérer le surnageant cellulaire dans lequel le FIX a été secrété, et - éventuellement purifier le FIX synthétisé. Le FIX recombinant de la présente invention présente notamment l'avantage de ne nécessiter aucun autre transgène que le matériel génétique codant le FIX. De plus, aucune modification supplémentaire du FIX recombinant ainsi obtenu n'est nécessaire pour obtenir un FIX recombinant biologiquement actif. Par FIX biologiquement actif, on entend un facteur IX dont l'activité spécifique de coagulation est au moins de 100 %. Le FIX recombinant sécrété dans le milieu de culture de la présente invention possède, de préférence, une activité spécifique de coagulation de 150 à 200 %, de préférence de 170 à 200%. L'activité spécifique de coagulation du facteur IX est déterminée à l'aide de la technique dite de temps de céphaline activée (TCA) (ou PU ou aPTT en anglais pour « activated partial thromboplastin time ») qui est un test semi-global de la coagulation sanguine qui met en oeuvre un coagulomètre. Le test utilisé est détaillé dans les exemples. Sur ce test, le Benefix® possède une activité spécifique de 100%. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le FIX recombinant de la présente invention est obtenu par l'utilisation du matériel génétique codant pour le FIX uniquement, sans autres matériel génétique codant pour d'autres protéines. De préférence, aucune modification structurelle n'est apportée à la protéine FIX recombinante obtenue. En effet, la protéine FIX recombinante obtenue a déjà subi des modifications post-traductionnelles grâce au système intrinsèque des cellules hépatocytaires, ce qui est suffisant dans de nombreux cas. En particulier, le matériel génétique codant le FIX utilisé est l'ADNc codant le FIX. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le matériel génétique utilisé est un ADNc qui code le facteur IX humain. De préférence, l'ADNc utilisé est l'ADNc complet (« full length ») du facteur IX humain sauvage, (Genbank N° NM_000133) comportant le polymophisme Thr148Ala, nucleotide A20422G (McGraw et coll., Proc Nati Acad Sci U S A. 1985 May;82(9):2847-51). Il est également possible d'utiliser l'ADNc du facteur FIX humain comprenant l'intron 1 tronqué, la construction étant obtenue selon Kurachi et coll. (3 Biol Chem. 1995 Mar 10;270(10):5276-81) et élaborée par Enjolras N. et coll. (Thromb Haemost. 1999 Oct; 82(4):1264-9). N'importe quel procédé de transfert et d'expression de gènes dans les cellules eucaryotes bien connus de l'homme du métier peut être utilisé pour préparer le FIX recombinant selon l'invention. Parmi ces procédés, on peut notamment citer la transfection par lipofection, ou la transfection à l'aide de précipité de phosphate de calcium. On utilisera de préférence la transfection, par lipofection et, en particulier, la transfection stable de manière à disposer d'une production constante et stable de protéine recombinante. De préférence, la lignée cellulaire hépatocytaire utilisée est la lignée cellulaire de carcinome hépatocytaire humaine Huh7 (ATCC N° CCL-185) ou Huh7-CD4 qui a été déposée le 20 octobre 2009 auprès de la Collection nationale de Cultures et Microorganismes de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux à Paris (France) et enregistrée sous le numéro I- 4234. Une fois le transfert de l'ADNc du FIXwt effectué, les cellules sont maintenues dans des conditions de culture adaptées au type de cellules utilisées et qui permettent l'expression et la sécrétion du FIX recombinant (présence de vitamine K1 dans le milieu de culture), ou tout du moins des conditions qui ne sont pas de nature à empêcher l'expression, la maturation et la sécrétion du FIX. De façon avantageuse, le facteur IX (FIX) humain recombinant selon l'invention possède un profil électrophorétique identique à la forme plasmatique du FIX humain, 5 notamment à la Mononine®. De plus, le FIX recombinant de l'invention possède les modifications posttraductionnelles nécessaires à l'obtention d'une activité de coagulation satisfaisante. En particulier, le FIX recombinant de l'invention est N-glycosylé et sialylé. Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de 10 préparation d'une lignée cellulaire hépatocytaire humaine productrice de FIX humain recombinant biologiquement actif caractérisé en ce qu'il comprend, voire consiste en, les étapes suivantes : faire exprimer in vitro le matériel génétique codant le FIX dans ladite lignée cellulaire hépatocytaire humaine, 15 - récupérer le surnageant cellulaire dans lequel le FIX a été secrété, et - éventuellement purifier le FIX synthétisé. De préférence, une purification du FIX produit par la lignée hépatocytaire est effectuée. La purification du FIXwt synthétisé peut être réalisée à partir du milieu de culture du clone producteur CD4. 20 Tous les modes de réalisation préférés qui sont énoncés ci-dessus s'agissant du FIX recombinant de l'invention sont également applicables sans restriction au procédé. Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet le FIX recombinant qui est produit par la lignée cellulaire Huh7-CD4 qui a été déposée le 20 octobre 2009 auprès de la Collection nationale de Cultures et Microorganismes de l'Institut Pasteur, 25 rue du 25 Docteur Roux à Paris (France) et enregistrée sous le numéro I- 4234. Selon un quatrième aspect, la présente invention a également pour objet la lignée cellulaire I-4234 en tant que telle. La présente invention est décrite plus en détails dans les exemples non limitatifs qui suivent et qui se réfèrent aux figures annexées dans lesquelles : 30 La figure 1 représente les concentrations en FIX () (en pg FIX/ml /5.105 cellules à l'aide du kit ELISA Asserachrom FIX:Ag mesurées dans les lysats cellulaires (L ù NT) et les milieux après 36 heures de transfection, et l'activité spécifique du FIX (^) mesurée dans les surnageants de cellules Huh7 transfectées (S - FIXwt) ou non transfectées (S-NT) par pcDNAFIXwt, 36h après transfection transitoire. La figure 2 représente le Western Blot obtenu pour les surnageants (A) et les lysats totaux (B) de cellules Huh7 transfectées avec pcDNAFIXwt (FIXwt) ou non transfectées (NT). Le Benefix® (BFIX) et le Mononine® (MIX) sont utilisés comme témoins. Un marqueur standard de poids moléculaires (PM) Biorad a été utilisé en tant que référence. La figure 3 représente un Northern Blot à partir des ARN totaux de cellules Huh7 transfectées avec pcDNAFIXwt (FIXwt) ou non transfectées (NT) après hybridation pendant une nuit avec une sonde correspondant à l'ADNc entier du FIX humain - ou une sonde correspondant à l'ADNc de la GAPDH du rat comme contrôle et 30 minutes d'exposition. La figure 4 représente un western blot obtenu à partir de lysats de cellules Huh7 transfectées de manière transitoire avec pcDNAFIXwt, et traitées avec des inhibiteurs de la dégradation des protéines NH4CI (b), c/asto-lactacystin (6-lactone) (c) et de la bréfeldine A (d), ou sans traitement (contrôle (a)). La figure 5(A) représente le Western Blot obtenu à partir de surnageants de cellules Huh7 transfectées (FIXwt) . Ces surnageantsont été traités (+) ou non (-) avec la Neuraminidase (N) ou la N-glycosidase (G). La figure 5 (B) représente le Western Blot obtenu à partir de Mononine® (MIX) traité (+) ou non (-) avec la Neuraminidase (N) ou la N-glycosidase (N) (+) ou non (-) La figure 6 représente : (A) les concentrations en FIX ( ) (et l'activité spécifique FIX correspondante (^) mesurées pour chaque clone obtenus à partir de cellules Huh7 transfectées de manière stable avec pcDNAFIXwtI1. (B) le Western Blot obtenu à partir des surnageants des 6 clones sélectionnés après transfection stable de cellules Huh7 avec pcDNAFIXwtI1. La figure 7 représente : (A) les concentrations en FIX (U) () et l'activité spécifique FIX (n) mesurées pour chaque échantillon collecté chaque jour pendant 4 jours (Dl à D4 respectivement) à partir de la culture du clone Huh7-CD4 en flacons roulants (« roller bottles »). (B) le Western Blot permettant de visualiser le FIX obtenu à partir des surnageants des échantillons collectés chaque jour (Dl à D4) pendant 4 jours. La figure 8 représente : (A) Une élèctrophorèse en SDS-PAGE de la purification de facteur IX (FIXwt) (100 ng) à partir des surnageants de culture du clone Huh7-CD4. Le Mononine® (MIX) et le Benefix® (BIX) ont été déposés comme témoins. Les protéines sont visualisés après coloration au nitrate d'argent. (B) L'electrophorèse du facteur IX (FIXwt) (100ng) purifié à partir des surnageants de culture du clone Huh7-CD4. Le Mononine® (MIX) et le Benefix® (BIX) ont été déposés comme témoins. Les protéines ont été visualisées après immunodétection à l'aide d'un anticorps polyclonal. EXEMPLES Obtention du vecteur d'expression L'ADNc complet de 1,4 Kb du FIX humain a été cloné dans pcDNA3.1 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) pour obtenir le plasmide pcDNAFIXwt, un vecteur d'expression avec le promoteur du cytomégalovirus (CMV) et l'ADNc du FIXwt humain (Enjolras et coll., 1999, supra, selon Kurachi et coll., 1995, supra). Culture cellulaire et transfection transitoire La lignée cellulaire de carcinome hépatocytaire humaine Huh7 (ATCC N°CCL-185) a été maintenue en milieu HYQ (Thermo Scientific, Logan, Utah), complémenté avec 10 % de sérum de veau foetal (FBS) (Perboscience, Brebières, France), 1% de PS (pénicilline, streptomycine), 1% of L-Glutamine, et 5 pg/mL de vitamine K1 (Roche, Neuilly-sur-Seine, France) à 37°C en atmosphère humide à 5% de CO2. Vingt heures avant transfection, les cellules Huh7 ont été platées dans des plaques 6-puits à une densité de 5x105 cellules/puits. Les cellules Huh7 ont été transfectées avec 1 pg par puits de vecteur recombinant pcDNAFIXwt à l'aide de FuGENE-6°(Roche, Neuilly-sur-Seine, France) selon les instructions du fournisseur Vingt quatre heures après la transfection, les cellules sont incubées en ajoutant du milieu frais avec sérum. Milieux de culture media, lysats cellulaires et Western Blotting Les cellules Huh7 (5x105/puits) ont été transfectées ou non avec pcDNAFIXwt dans des plaques 6-puits. Trente six heures après la transfection, les surnageants ont été collectés. Les cellules ont ensuite été lavées à l'aide de PBS et incubées 16h dans du milieu sans sérum. Les surnageants sans sérum ont été récoltés et les extraits cellulaires ont été préparés dans 300 1.11 (pour 2x106 cellules) de tampon de lyse 100X froid 0.5% Triton (100 mM/l KCI, 2 mM/l MgCl2, 10 mM/l Hépès pH 7.5, 0.5% TritonûX100) contenant un mélange complet d'antiprotéases (antiprotease mix Complete® (Roche, Mannheim, Germany). Un aliquot de la solution résultante (10 pl) (surnageants sans sérum ou lysats cellulaires) a été soumis à une électrophorèse sur un gel dénaturant de polyacrylamide 10 % (SDS-10%PAGE). Les gels ont été transférés sur membrane Hybond C® Pure membranes (GeHealthcare Orsay, France). Les membranes ont été bloquées avec du TBS-T-lait (0.15 mM/l NaCl, 10 mM/l Tris-HCI, pH 7.5, Tween-20 0,1%, lait en poudre) toute la nuit à température ambiante, puis incubées pendant 1h avec un anticorps polyclonal de lapin anti-FIX humain dilué au 1:200 dans du TBS-T-lait (Régilait). La membrane a ensuite été lavée 3 fois dans du TBS-T puis incubée pendant 30 min avec un anticorps anti-lapin marqué à la peroxidase dilué au 1:3 000 (Biorad, Ivry sur Seine, France) dans du TBS-T-lait. Après 3 lavages, la chimioluminescence a été mesurée par autoradiographie à l'aide du system System (GeHealthcare). Test ELISA et activité spécifique de coagulation Les concentrations en FIX dans le milieu de culture et les extraits cellulaires ont été mesurées 36 heures après la transfection transitoire à l'aide du kit ELISA Asserachrom IX:Ag (Diagnostica Stago). L'activité spécifique du FIX a été déterminée dans un test de coagulation en une-étape (aPTT) avec un coagulomètre MDA II (Trinity Biotech, Dublin, Irlande). L'activité spécifique de coagulation du facteur IX est déterminée à l'aide de la technique dite de temps de céphaline activée (TCA) (ou PU ou aPTT en anglais pour « activated partial thromboplastin time ») qui est un test semi-global de la coagulation sanguine. Cinquante microlitres d'échantillon sont dilués au 1/10ème dans du tampon Imidazole (Trinity Biotech,Bray, Ireland). Cinquante microlitres d'échantillon dilué sont ajoutés à 50pl de plasma déficient en facteur IX (Precision Biologic, Darmouth, Canada) et 50p1 de MDA Platelin LS® (Trinity Biotech, Darmouth, Canada). Après 3 minutes d'incubation, la coagulation est initiée en ajoutant 50 pl de MDA Platelin LS® 25 mM CaCl2(25mM). Le temps de coagulation est mesuré à l'aide d'un coagulomètre utilisant un automate MDA II® (Trinity Biotech, Bray, Ireland). L'activité du facteur IX est déterminée à partir de valeurs de plasma standard par une courbe en log-log. Le Benefix® possède une activité spécifique de 100%. Northern blot Les ARN totaux ont été préparés 36 heures après transfection à partir de 5x105 cellules Huh7 transfectées de manière transitoire avec pcDNAFIXwt ou non transfectées à l'aide du kit Rneasy Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Après électrophorèse sur gel agarose 0,8 % dans un tampon phosphate (10 mM/l NaH2PO4, 10 mM/l Na2HPO4, pH 7) à partir de 500 ng d'ARN totaux, les ARNm ont été transférés sur une membrane nylon Hybond N® (GeHealthcare). Les plasmides contenant l'ADNc complet du FIX humain et celui de la GAPDH de rat sont ceux décrits par Enjolras et coll., 1999, supra. Les sondes ARN contenant la séquence anti-sens du FIX humain et de la GAPDH de rat ont été générées et marquées avec des NTP contenant des UTP-digoxigénine(DIG) en utilisant le système de transcription in vitro du kit T7 RNA polymerase (Roche) et selon le protocole décrit par Enjolras et coll., 1999, supra. Les étapes de pré-hybridation, hybridation et lavages ont été réalisées selon les recommandations de Roche. Les membranes ont été incubées toute la nuit avec les deux types de sondes ARN. Les signaux ont été détectés après 4 heures avec le kit de détection de DIG Luminescent Detection Kit (Roche). Effets des inhibiteurs de dégradation des protéines sur le taux intracellulaire de FIXwt Des cellules Huh7 (1.106 cellules/boite) ont été transfectées de manière transitoire à 80% de confluence dans des boites de culture de 60 mm. Trente six heures après la transfection, les cellules ont été incubées dans du milieu exempt de FBS et contenant 10 pM/l de clasto-lactacystine 6-lactone (Calbiochem, France Biochem, Meudon, France), 50 mM/l de chlorure d'ammonium, ou 10 pg/ml de bréfeldine A (Sigma Aldrich). Le milieu a été renouvelé toutes les 2 heures. Les lysats cellulaires ont été récoltés 6 h plus tard et préparés dans 120 pl de tampon de lyse froid. La concentration en antigène FIX a été quantifiée sur les lysats par test ELISA. Les résultats sont exprimés en pourcentage de valeurs obtenues par rapport aux lysats contrôles non traités. Les comparaisons ont été faites par application du test de Fisher à l'aide du logiciel Stat View®. Analyse de sialylation et N-glycosylation Les surnageants de cellules Huh7 transfectées de manière transitoire ont été collectés 36 heures après transfection. Les cellules ont été lavées à l'aide de PBS et incubées pendant 16 h en milieu sans sérum. Ces milieux ont été récoltés et ils ont été incubés avec 100 mU/ml de neuraminidase (Roche) pendant 1 h à 37°C, et avec 9,4 U/ml de peptide-N4 (N-acétyl-f3-glucosaminyl) asparagine amidase (N-glycosidase F recombinante) (Roche) pendant 16 h à 37°C dans 20 mM/I de Tris-maléate pH 6.0, 150 mM/I NaCl, 5 mM/I chlorure de calcium, et 1,75 % (vol/vol) de NP-40. Les digestions ont été stoppées en ajoutant du tampon Laemmli 2X contenant SDS et 6-mercaptoéthanol, et les produits de digestion ont été soumis à une électrophorèse SDS-PAGE 10% dans des conditions dénaturantes. Le FIX a ensuite été visualisé par immunoblotting comme décrit ci-dessus. Le même protocole a été appliqué pour 100 ng de Mononine® (MIX). Transfection stable et sélection des clones Huh7 produisant du FIX Les cellules Huh7 ont été ensemencées dans des boites de pétri (1.106 cellules/boite). Les cellules Huh7 ont été transfectées avec 2 pg de vecteur recombinant pcDNAFIXwtI1 à l'aide de FuGENE-6® (Roche, Neuilly-sur-Seine, France) selon les instructions du fournisseur. Ce plasmide contient l'intron 1 tronqué du gène humain FIX, et a été précédemment montré pour avoir une activité qui augmente l'expression dans les cellules HepG2 (Kurachi et coll., 1995, supra), et dans les cellules CHO (Enjolras et coll., 1999, supra). Ce plasmide pcDNAFIXwtI1 contient le gène de résistance à la généticine (G418). Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été mises en présence de milieu comportant de la généticine (G418) (350pg/ml).Les clones résistants au G418 ont été obtenus 3 semaines après transfection. Les clones ont été repiqués individuellement (sans trypsine) et ré-ensemencés dans des plaques 96-puits contenant 200 pl de milieu de culture. La quantité de FIX a été évaluée dans chaque surnageant à partir de cellules à confluence et les clones produisant le plus de FIX ont été amplifiés dans des plaques 24-puits. Lors des passages des clones exprimant le FIX de plaques 96-puits aux plaques 24-puits et des plaques 24-puits aux plaques 12- puits et des plaques 12-puits aux plaques 6-puits, les cellules ont été décollées mécaniquement à l'aide d'un grattoir ou d'un cône et donc jamais trypsinées. Ce mode de passage lors de l'amplification des cellules a permis le succès de l'obtention des clones décrits dans ce manuscrit. Lorsque les cellules ont présenté une confluence de 80% dans un flasque de 75 cm2, elles ont été congelées dans l'azote liquide pour conservation dans du milieu complet contenant 90% de FBS et 10 %o de DMSO. Le choix du clone producteur a été effectué lors du passage des cellules en plaque 24 puits. Les surnageants de six clones les plus producteurs de FIX ont été ensemencés à raison de 2.105 cellules par puits. Le lendemain, le milieu de culture a été renouvelé par du milieu complet contenant 10%FBS en présence de généticine. Après 24 heures d'incubation, le milieu de culture de chaque clone a été récolté et la concentration en FIX, ainsi que l'activité spécifique ont été mesurées. Les cellules ont été rincées et incubées pendant les 18 heures suivantes en milieu sans sérum. Après cette incubation, les milieux ont été récoltés. Des aliquots de 10p1 ont été déposés sur un gel d'électrophorèse. Les FIX sécrétés par les différents clones ont été visualisés par western blot. Cette étape a permis de choisir le clone Huh7 destiné à la production de FIX. Production du FIX recombinant issu de surnageant de la lignée Huh7-CD4 Les cellules du clone Huh7-CD4 ont été amplifiées à raison de deux passages au 1/3 par semaine. Durant les deux semaines d'amplification, la concentration en généticine a été progressivement augmentée jusqu'à une valeur de 0,4 mg/ml. Les cellules ont été ensemencées dans des flacons-roulants, à raison de 30.106 cellules par flacon-roulant. Ces flacons-roulants ont une contenance de 1700 cm2 (Cellmaster rollerbottles, Ref 682065, Greiner Bioone, Dutscher) et sont utilisés avec un système de rotation IBS CelIRoll (Integra Biosciences). Soixante douze heures après, les cellules ont été lavées et mises en présence de milieu sans sérum, puis incubées pendant 18 heures. Le milieu a été ensuite prélevé et débarrassé des cellules en suspension et autres débris cellulaires par centrifugation (3000 rpm, 20 min). Les cellules ont été mises en présence de milieu complet pendant 12 heures. Ce protocole de production a été renouvelé trois fois pour un même flacon-roulant, les cellules ayant servi à la production n'ont pas été conservées. Les milieux contenant le FIXwt ont été conservés par congélation à -30°C. Un aliquot de chaque surnageant de culture sans sérum ; prélevé tous les jours de production, a été soumis à une quantification de FIX à l'aide d'un kit ELISA FIX, puis à une mesure de coagulation par la méthode en un temps chronométrique sur un automate de type MDA II. Les mesures ont été effectuées après une première décongélation des milieux. Des aliquots de ces surnageants de culture ainsi récoltés (10p1) ont été soumis directement à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE/10%). Le FIX a été visualisé dans chaque surnageant par western blot. Purification du FIX recombinant issu des surnageants du clone Huh7-CD4 Une colonne échangeuse d'ions (High Trap Q FF, 5m1, GE Healthcare Ref : 17-5156-01) a été utilisée lors de la première étape de purification. La colonne a été préalablement équilibrée à l'aide de tampon Tris 50 mM, pH 8. Elle a été chargée par un volume de 250 à 300m1 de surnageant de cellules Huh7-CD4 contenant en moyenne 0,2pg/ml de FIX et filtré sur une unité de filtration de 0,2pm. La colonne a été ensuite lavée par un tampon Tris 50 mM, pH 8. L'élution du FIX s'est effectuée à l'aide de tampon Tris 50 mM, pH 8, NaCl 1M. La fraction contenant le FIX (environ 30 ml) est recueillie. Une deuxième étape de purification a consisté en une chromatographie utilisant une colonne d'immuno-affinité. La colonne d'immuno-affinité a été élaborée en couplant de façon covalente un anticorps monoclonal dirigé contre le FIX (Centeon, Kankakee, IL, USA) à des billes magnétiques de type Dynabeads MyOne Tosylactivated (Invitrogen Ref 655.01). Le protocole de couplage billes/anticorps a été suivi selon les instructions du fournisseur. La colonne d'immuno-affinité a été préalablement équilibrée à l'aide de tampon PBS - Tween 0,05% pH7,4. Les billes (500pl) ont été mises en présence de 10 ml d'éluat contenant le FIX issu de la colonne échangeuse d'ions (2pg/ml de FIX). L'incubation s'est effectuée pendant une nuit à 4°C sous agitation rotative. La colonne a ensuite été lavée deux fois à l'aide de PBS -Tween 0,05%. L'élution du FIX a été effectuée par 500pl de tampon d'élution 0,5M Glycine pH 2,1. L'éluat a été déposé sur une colonne de dessalage PD10 (GE Healthcare). Le FIX est élué à l'aide de 1 ml de tampon Tris-Hcl 50mM, pH8, NaCl 0,1M et concentré sur un système de concentration dont le pouvoir de coupure est à 30 kDa. La qualité de l'éluat a été vérifiée en déposant 100 ng sur un gel d'électrophorèse. La révélation a été réalisée par coloration à l'aide de nitrate d'argent et par western blot. RÉSULTATS Exemple 1 : expression, biosynthèse et activité du FIXwt produit par les cellules Huh7 transfectées de manière transitoire Des cellules Huh7 ont été transfectées de manière transitoire avec le plasmide pcDNA FIXwt contenant l'ADNc FIX wi/d-type (FIXwt) sous contrôle du promoteur CMV. Après 36 h de transfection, les concentrations en FIX dans les surnageants de culture et les lysats cellulaires totaux ont été mesurées à l'aide du kit ELISA et l'activité spécifique dans les surnageants de culture a été mesurée à l'aide d'un test de coagulation en une-étape. Les résultats des valeurs représentatives de trois transfections sont regroupés dans la figure 1 annexée. Ces résultats montrent que les cellules Huh7 ainsi transfectées possèdent la capacité de secréter entre 0,5 et 0,6 pg/ml/36h/5.105 cellules de FIX (S- FIXwt). Les taux de FIX intracellulaire (L-FIXwt) atteignent 0,05 pg/ml de lysat cellulaire. Aucun FIX n'a été détecté dans les lysats (L-NT) et surnageants issus des cellules Huh7 non transfectées (S-NT). L'activité spécifique mesurée sur les surnageants des cellules transfectées est comprise entre 150 et 200 % par rapport à celle du Benefix® qui de 100%. Les lysats et les surnageants ont été soumis à une électrophorèse, puis analysés par Western Blot afin de mettre en évidence le FIX produit. Les résultats sont regroupés sur la figure 2 annexée. Les résultats concernant les surnageants (figure 2(A)) montrent que le facteur IX (S-FIXwt) secrété est visualisé sous la forme d'une seule bande (bande E) avec un poids moléculaire apparent de 65 kDa et présente la même mobilité que le Mononine® alors que le Benefix® (BIX) migre légèrement plus lentement. Aucun signal FIX n'a été détecté dans le milieu (S-NT) issu des cellules Huh7 non transfectées. Les résultats concernant les lysats (figure 2(B)) montrent trois bandes majoritaires pour les cellules Huh7 transfectées (L-FIXwt). La bande le plus haute (bande E) a le même poids moléculaire que celui de la forme secrétée ou que celle du Mononine® (MIX), le Benefix® (BIX) migrant toujours plus lentement. .Les deux autres bandes (bandes I) migrent légèrement plus vite (57 kDa) que la bande E. Ces résultats montrent que les cellules Huh7 exprimant le FIX contiennent deux formes de FIX intracellulaire, l'une correspondant à une forme qui peut être secrétée (bande E) et l'autre correspondant à un doublet (bandes I) qui correspond à différents degrés de modifications post-traductionnelles. Afin d'étudier l'efficacité de transcription du plasmide pcDNAFIXwt, les ARN totaux ont été extraits à partir des cellules Huh7 transfectées ou non transfectées 36 h après transfection. Les ARN ont été analysés par Northern Blot avec une sonde ARN FIX « full- length ». Les résultats sont regroupés sur la figure 3 annexée. Un seul transcrit FIX a été détecté dans les cellules transfectées (FIXwt) alors que les cellules Huh7 non transfectées (NT) ne contiennent aucun transcrit endogène détectable. Les ARNm sont présents dans des quantités similaires dans les deux types d'échantillons, comme indiqué par le signal obtenu pour la référence GAPDH. Exemple 2 : effets d'inhibiteurs de la dégradation des protéines sur la biosynthèse de FIX intracellulaire Les résultats ci-dessus (figure 1) montrent que le FIXwt est présent à de faible taux intracellulaire dans les cellules Huh7 transfectées, ce qui signifie que ces cellules n'accumulent pas le FIX. L'effet de différents inhibiteurs de la dégradation des protéines et du trafic cellulaire a été testé sur les cellules Huh7 transfectées avec pcDNAFIXwt. Trente six heures après transfection, les inhibiteurs ont été ajoutés dans le milieu de culture et laissés pendant 6 h. Les concentrations en FIX intracellulaire ont été mesurées après traitement part test ELISA (les valeurs sont exprimées en % de FIX par rapport aux valeurs obtenues dans les lysats de cellules non traitées. Les résultats sont regroupés dans le Tableau 1 ci-dessous et correspondent à trois transfections indépendantes. Tableau 1 Traitements Taux de FIX intracellulaire (moyenne ± SE) Contrôle (sans traitement) 100 NH4CI (50 mM/I) 84,7 % +/- 28,1 Beta-lactone (10 pM/I) 50,1 % +/- 25,8 Bréfeldine A (10 dag/ml) 254,4 % +/- 21,4 L'inhibiteur spécifique du protéasome c/asto-lactacystine B-lactone n'a pas d'effet significatif sur le taux de FIXwt intracellulaire. De la même manière, le NH4CI, qui inactive les enzymes lysosomales par modification du pH n'augmente pas de manière significative le taux de FIXwt (50,1% avec NH4CI versus 100% sans NH4CI). La bréfeldine A bloque le transport des protéines du réticulum endoplasmique (RE) vers le complexe de Golgi et provoque la translocation retour des composants du Golgi vers le RE. Après incubation avec la bréfeldine A, le taux de FIXwt intracellulaire augmente de 370 % par rapport à celui détecté sans bréfeldine A (p = 0.005). Les lysats des cellules traitées ont également été soumis à une électrophorèse et le FIXwt a été détecté par Western Blot comme indiqué ci-dessus. Les résultats sont regroupés sur la figure 4 annexée et correspondent à six transfections indépendantes. Le FIX des cellules non traitées présente le même profil que celui précédemment observé (figure 2), la forme secrétée (bande E) et le doublet (bandes I), piste a. Lorsque les cellules sont traitées en présence de NH4CI (piste b) ou de 3-lactone (piste c), l'intensité des bandes diminue selon les valeurs ELISA FIX, la forme E ne varie pas en intensité. Au contraire, en présence de bréfeldine A (piste d), toutes les formes intracellulaires du FIX se sont accumulées dans les cellules et en particulier la forme E secrétée. Ces résultats montrent que les formes intracellulaires FIXwt ne sont pas ou peu dégradées dans les cellules Huh7 transfectées et qu'elles traversent la barrière du RE de manière efficace pour être rapidement sécrétées. Le FIX recombinant synthétisé par les cellules Huh7 selon l'invention empreinte donc une voie classique de maturation intracellulaire. Exemple 3 : analyse de modifications post-traductionnelles du FIXwt secrété Afin d'étudier la N-glycosylation et la sialation du FIXwt secrété par les cellules Huh7 transfectées de manière transitoire, les surnageants de culture ont été incubés avec de la neuraminidase et une N-glycosidase. Les produits de digestion ont été soumis à une électrophorèse réductrice et analysés par Western Blot comme décrit ci-dessus. Les résultats sont regroupés sur la figure 5 annexée. Ces résultats montrent que la forme secrétée du FIXwt (figure 5(A)) panneau de gauche est retrouvée avec un poids moléculaire de 65 kDa comme décrit ci-dessus. Une légère diminution du poids moléculaire du FIXwt est observée suite à la digestion par la neuraminidase (N+, G-) et une réduction additionnelle est également observée après N-déglycosylation (N+, G+). Les mêmes profils de migration ont été constatés suite au traitement du Mononine® (FIX plasmatique de l'art antérieur) dans les mêmes conditions de digestion (panneau de droite (figure 5(B)). Ces résultats montrent que le FIXwt secrété par les cellules Huh7 tranfectées de manière transitoire avec pcDNAFIXwt est N-glycosylé et sialilé de la même manière que l'est le Mononine®, ce qui correspond à un FIX sécrété mature. L'ensemble des résultats décrits dans les exemples 1 à 3 ci-dessus démontrent que les cellules Huh7 transfectées de manière transitoire avec pcDNAFIXwt sont capables de produire un FIX recombinant actif biologiquement qui présente une activité spécifique améliorée d'un facteur 1,7. La protéine produite est correctement synthétisée, suit les voies de trafic intracellulaires classiques avant d'être secrétée. Les N-glycoslylation et sialylation sont correctement réalisées, et le FIXwt n'est pas retenu dans les cellules. Ces données démontrent que ces cellules Huh7 représentent un système cellulaire efficace pour la production d'un FIX recombinant biologiquement actif. Exemple 4 : Obtention d'une lignée cellulaire Huh7 qui secrète de manière stable du FIX recombinant. Des cellules Huh7 ont été transfectées de manière stable avec le plasmide pcDNAFIXwtI1. Chaque clone résistant au G418 a été repiqué individuellement pour être amplifié comme indiqué ci-dessus. Six clones qui produisent du FIX à des concentrations supérieures à 0.1 pg/ml ont été sélectionnés. Ils ont été ensemencés dans des plaques 24-puits à raison de 2.105 cellules par puits et maintenus sous 5 % de CO2 dans du milieu de culture HyQ complémenté en sérum de veau foetal (10 %) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois au PBS et 500 pl de milieu sans sérum ont été ajoutés et les surnageants collectés après 24 h d'incubation. La production et l'activité spécifique du FIX présent dans le milieu de chacun de ces 6 clones ont été mesurées. Puis des aliquots issus du surnageant sans sérum de ces 6 clones ont été soumis à une électrophorèse et les signaux ont été détectées par autoradiographie. Les résultats sont regroupés sur la figure 6 annexée. Ces résultats (figure 6(A)) montrent que trois des six clones (CD4, CC6 et CA8) présentent une production de FIX jusqu'à 0,75 pg/ml avec une activité FIX totale et deux clones (CD4 et CA8) présentent des concentrations en FIX entre 0,75 et 1 pg/ml avec une activité FIX totale. Des activités spécifiques améliorées similaires ont été retrouvées ici comme précédemment montré pour les cellules Huh7 transfectées de manière transitoire. De plus, les résultats en Western Blot (figure 7(B)) montrent que chaque clone producteur présente une bande unique de FIX au poids moléculaire attendu. Le clone CD4 présente la meilleure association concentration/activité spécifique, ce qui en fait un clone de choix pour la production de FIX recombinant. La lignée cellulaire Huh7-CD4 issu du clone CD4 et qui représente un des aspects de l'invention a pu être sous-cultivée par deux passages par semaine avec un rapport 1:3 de repiquage. Exemple 5 : production de FIX en flacons roulants (ou "flacons-roulants") par la, 5 lignée cellulaire Huh7-CD4 en milieu sans sérum. Des flacons roulants de 1700 cm' (Cellmaster rollerbottles, Ref 682065, Greiner Bioone, Dutscher) ont été utilisés avec un système de rotation IBS CellRoll (Integra Biosciences). Trois millions de cellules du clone Huh7-CD4 ont été maintenues dans du milieu HyQ complémenté avec 10% de FBS pendant 72 h dans des flacons roulants à 37 °C sous 10 5% CO2. Au jour 1, les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon PBS et du milieu sans sérum (25 ml par flacons roulant) a été ajouté pendant 15-18 heures. Les surnageants ont été collectés et représentent le premier échantillon de production de FIX (jour 1 ou Dl). Les cellules ont ensuite été maintenues pendant 10h dans du milieu complet et la production 15 de FIX dans du milieu sans sérum a été répétée durant 3 autres jours en alternant avec les étapes d'incubation en milieu complet. La production de FIX dans les 4 échantillons collectés du jour 1 au jour 4 (Dl à D4 respectivement) a été mesurée par test ELISA et l'activité spécifique de coagulation de chaque échantillon a été mesurée comme indiqué ci-dessus. La présence de FIX a également 20 été vérifiée par Western Blot. Les résultats sont regroupés sur la figure 7 annexée. Les résultats de la figure 7(A), exprimés en valeur moyenne +/- SD à partir de 4 productions pendant 4 jours, montrent que les concentrations en FIX sont de 0,2 pg/ml au jour 1 (Dl) au jour 4 (D4), jour de la fin de la période de production. De plus, une activité spécifique totale est conservée au cours des quatre jours de culture. 25 Les résultats de la figure 7(B) montrent également que le FIX est détecté dans chaque échantillon Dl à D4, ce qui permet de conclure que le FIX continue bien à être secrété avec la même qualité au cours de la période de production en flacons roulants. Exemple 6 : Caractérisation du FIX purifié par western blot et mesure de l'activité 30 spécifique Le FIX recombinant produit par la lignée Huh7 a été purifié par une étape de chromatographie d'échangeuse d'ions et une étape d'immuno-affinité comme décrit dans les résultats. Un aliquot de 100 ng de FIX recombinant, Benefix®100 ng de Mononine® et de Benefix® ont subi une electrophorèse. La qualité des FIX a été visualisée par coloration des protéines à l'aide de nitrate d'argent (figure 8(A)) et par western blot (figure 8(B)). Comme le montre la figure 8(A), le FIX recombinant purifié (FIXwt) présente une bande à 65 kDa, de même mobilité que le signal correspondant au Mononine® et de mobilité légèrement plus rapide que celle du Benefix®. Une bande à 50 kDa est visible dans l'échantillon. Elle correspond à une contamination très faible en anticorps anti-FIX de la colonne d'immuno-affinité. En effet, une fraction de l'anticorps est co-éluée avec le FIX. Ces observations sont confirmées par les expériences de western blot. (figure 8(B)). Le FIXwt purifié présente une mobilité identique à celle du Mononine® et légèrement plus rapide que celle du Benefix®. REVENDICATIONS1. Facteur IX (FIX) humain recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé de préparation comprenant, voire consistant en, les étapes consistant à : faire exprimer in vitro le matériel génétique codant le FIX dans une lignée cellulaire hépatocytaire humaine, - récupérer le surnageant cellulaire dans lequel le FIX a été secrété, et éventuellement purifier le FIX synthétisé. 2. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériel génétique codant le FIX est l'ADNc codant le FIX. 3. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'ADNc codant le FIX est l'ADNc du facteur IX humain. 4. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le matériel génétique codant le FIX est transféré et exprimé dans la lignée cellulaire hépatocytaire par transfection. 5. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite lignée cellulaire hépatocytaire est la lignée cellulaire de carcinome hépatocytaire humaine Huh7. 6. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite lignée cellulaire hépatocytaire est la lignée cellulaire de carcinome hépatocytaire humaine Huh7-CD4 déposée et enregistrée sous le numéro I-4234, auprès de la CNCM. 7. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il possède une activité spécifique de coagulation, déterminée à l'aide de la technique dite de temps de céphaline activée de 150 à 200 %, de préférence, de 170 à 200%. 8. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il possède un profil électrophorétique identique à la forme plasmatique du FIX humain. 9. Facteur IX (FIX) humain recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est glycosylé et/ou sialylé. 10. Procédé de préparation d'une lignée cellulaire hépatocytaire humaine productrice de FIX humain recombinant biologiquement actif caractérisé en ce qu'il comprend, voire consiste en, les étapes suivantes : faire exprimer in vitro le matériel génétique codant le FIX dans ladite lignée cellulaire hépatocytaire humaine, récupérer le surnageant cellulaire dans lequel le FIX a été secrété, et - éventuellement purifier le FIX synthétisé. 11. Procédé de préparation selon la revendication 10, caractérisé en ce que le matériel génétique codant le FIX est l'ADNc codant pour le FIX. 12. Procédé de préparation selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que l'ADNc codant le FIX est l'ADNc du facteur IX humain. 13. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le matériel génétique codant le FIX est transféré et exprimé dans la lignée cellulaire hépatocytaire par transfection. 14. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ladite lignée cellulaire hépatocytaire est la lignée cellulaire de carcinome hépatocytaire humaine Huh7. 15. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ladite lignée cellulaire hépatocytaire est la lignée cellulaire de carcinome hépatocytaire humaine Huh7-CD4 déposée et enregistrée sous le numéro I- 4234, auprès de la CNCM. 16. Facteur IX recombinant produit par la lignée cellulaire Huh7-CD4 déposée et enregistrée sous le numéro I- 4234, auprès de la CNCM 17. Lignée cellulaire Huh7-CD4 déposée et enregistrée sous le numéro I-4234, auprès de la CNCM.