Brevet FR2958042A1 — publié le 20110930

L'invention se rapporte au domaine des produits de comblement, et à l'évaluation de leur activité. L'utilisation de produits de comblement (aussi appelés "fillers") s'est développé de façon importante au cours de ces dernières années. Ils représentent une solution alternative intéressante dans le traitement ou la diminution des signes du vieillissement. Les principaux signes cliniques du vieillissement cutané sont notamment l'apparition de ridules et/ou de rides, en augmentation avec l'âge. Ces rides peuvent être profondes, moyennes ou superficielles, et touchent en particulier les sillons nasogéniens, la zone périorbitaire, le contour des lèvres, le front (ride du lion); ces rides et ridules se traduisent par une dépression ou des sillons à la surface de la peau. De plus, on constate avec l'âge une perte de volume de la partie supérieure du visage, notamment au niveau des pommettes et des joues. Par ailleurs, il existe différentes situations où il est souhaitable de remédier à la perte de tissus et de combler des dépressions cutanées telles que des déplétions fibroblastiques, les blessures, l'ablation chirurgicale partielle de tissus (par exemple dans les cas de tumeur), y compris le comblement des « dépressions » cutanées secondaires à la prise d'un traitement entraînant une lipodystrophie qui se caractérise le plus souvent par une lipoatrophie faciale et pour favoriser la cicatrisation. Les produits de comblement sont injectés dans les tissus cutanés ou sous-cutanés, par voie sous-cutanée ou intradermique. Il s'agit ainsi d'implant dermique, c'est-à-dire des substances injectées directement dans la peau en vue de remédier aux désordres intervenant aux différents niveaux cutanés ou sous-cutanés (derme, hypoderme, etc.). Il peut s'agir d'une injection en un site unique, ou dans un nombre de points limité des tissus cutanés ou sous-cutanés. On réalise alors un nappage sous-cutané, sous- dermique et/ou intradermique de ladite composition, précisément au niveau de la zone corporelle à traiter. Ce comblement peut être réalisé par l'utilisation de produits non résorbables, tels que des gels de polyacrylamide ou des particules de polyméthylméthacrylate (PMMA) Néanmoins, ces composés peuvent entrainer des réactions d'intolérance du type inflammation ou hypersensibilité. On privilégie l'utilisation de composants résorbables, tels que les protéines, les graisses le collagène ou l'acide hyaluronique. Mais ces composés sont dégradés assez rapidement dans l'organisme, ce qui réduit leur efficacité. Pour y remédier il faut donc procéder à une réticulation plus ou moins poussée de ces composants.35 Il est donc souhaitable de pouvoir évaluer les propriétés physico-chimiques et/ou les modifications biologiques susceptibles d'être provoquées par l'injection des produits de comblement avant leur utilisation in vivo chez l'homme. Pour des raisons éthiques, il n'est pas souhaitable de tester ce type de produit chez l'animal. L'utilisation d'équivalent de peau à base de biomatériaux connus n'est pas satisfaisante car l'injection de produit de comblement à travers l'équivalent de peau provoque une rupture de l'épiderme et une désorganisation de la structure. En effet, la conception actuelle des équivalents de peau ne permet pas une épaisseur suffisante pour une évaluation d'une quantité moyenne de produit de comblement par la méthode d'injection. Le brevet US 4,481,001 décrit un modèle de peau pour tester l'injection intra-dermique d'un produit de comblement tel qu'un collagène réticulé, à base de matériaux synthétiques. Ce modèle comprend une couche élastomère mimant le tissu sous-cutané, un équivalent de derme constitué d'un gel de silicone élastomère et une couche d'élastomère à haut pouvoir tenseur mimant un épiderme. Ce modèle ne contient pas de cellules vivantes et ses constituants étant très différents de ceux de la peau, il ne peut permettre d'anticiper les réactions induites par l'injection de produit de comblement in vivo. Il existe donc un besoin de disposer d'un modèle tri-dimensionnel in vitro pouvant mimer la réalité cosmétique pour évaluer l'effet des matériaux de comblement aussi bien sur un plan biophysique, biomécanique ou biologique. De manière inattendue, il a été trouvé dans le cadre de la présente invention qu'il était possible d'obtenir un tel modèle en incorporant le produit de comblement au cours de la reconstruction de l'équivalent de peau. Plus particulièrement, il est désormais possible d'obtenir un modèle tridimensionnel contenant des cellules vivantes telles que des fibroblastes et permettant d'évaluer in vitro le comportement des produits de comblement lorsqu'ils seront injectés in vivo, en incorporant le produit de comblement dans la matrice extra-cellulaire avant la contraction des fibroblastes conduisant à la lattice. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé d'évaluation in vitro d'un produit de comblement, caractérisé en ce qu'il comprend au moins (i) une étape de mélange dudit produit de comblement avec des constituants d'un équivalent de matrice extracellulaire pour préparer un équivalent de derme in vitro, les constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire étant, au moins partiellement, différents du produit de comblement, (ii) une étape de mesure d'au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme ou d'un équivalent de peau in vitro le contenant. Le procédé pourra en particulier comprendre, avant l'étape (ii), une étape de préparation d'un équivalent de peau in vitro à partir de l'équivalent de derme, comprenant le produit de comblement. De préférence, l'équivalent de derme comprend au moins du collagène et des fibroblastes, en particulier des fibroblastes contractés. Avantageusement, les fibroblastes sont vivants. L'équivalent de derme est ainsi constitué d'un gel continu comprenant au moins du collagène, au sein duquel sont répartis les fibroblastes vivants. Avantageusement, l'équivalent de derme comprend une matrice dite "libre", c'est-à dire dans laquelle les fibroblastes sont orientés selon des axes qui peuvent être différents les uns des autres; en particulier, dans un tel équivalent de derme, le pourcentage des fibroblastes orientés longitudinalement par rapport à la surface de l'équivalent de derme est inférieur à 50%. L'invention concerne également un équivalent de peau in vitro susceptible d'être obtenu comme produit intermédiaire dans le procédé d'évaluation du produit de comblement, et son procédé de préparation. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un tel équivalent de peau pour l'évaluation de produits de comblement. Les constituants de la matrice extracellulaire seront proches de ceux trouvés dans la peau, et seront adaptés par l'homme du métier. L'équivalent de derme comporte au moins une matrice de collagène de type I dans laquelle sont répartis les fibroblastes. Elle peut contenir en outre d'autres constituants de la matrice extracellulaire. Par `constituant de matrices extracellulaires', on désigne notamment des molécules telles que les collagènes en particulier le collagène IV, les laminines, l'entactine, la fibronectine, les protéoglycanes, les glycosaminoglycans, l'acide hyaluronique, l'élastine, la fibrilline. Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, l'équivalent de derme contient au moins du collagène IV et de la laminine; de préférence, il contient aussi de l'entactine. Les concentrations de ces différents constituants pourront être adaptées par l'homme du métier et seront par exemple pour la laminine comprises entre 1 et 15% du volume final, pour le collagène IV entre 0,3 et 4,5% du volume final et pour l'entactine entre 0,05 et 1% du volume final. De préférence, les constituants de la matrice extracellulaire comprennent au moins du collagène I, du collagène III ou leurs mélanges. Le collagène utilisé peut être du collagène d'origine bovine, de queue de rat ou de 5 poisson ou toute autre source de collagène natif ou produit par génie génétique permettant une contraction en présence de fibroblastes. L'épaisseur de l'équivalent de derme pourra varier mais sera en général d'au moins 0,05 cm, notamment d'environ 0,05 à 2 cm mais pourra être augmenté sans inconvénient. De même, son diamètre sera adapté par l'homme du métier d'environ 3 mm à 20 cm ou plus. 10 L'équivalent de derme peut contenir un mélange de fibroblastes papillaires et réticulaires, en toutes proportions. Selon une des variantes de l'invention, l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes papillaires, selon une autre variante l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes réticulaires. Selon un mode de réalisation avantageux, on prépare un équivalent de peau in vitro contenant l'équivalent de derme et comportant en outre un équivalent d'épiderme contenant des kératinocytes. 20 De préférence, l'équivalent d'épiderme est différencié stratifié, et comprend au moins une couche superficielle et au moins une couche basale. Avantageusement, les kératinocytes reproduisent les caractéristiques d'un épiderme in vivo, à savoir un épithélium multicouche stratifié avec une couche basale au contact de l'équivalent de derme et dont les strates supérieures témoignent d'une différenciation, reproduisant de la profondeur 25 vers la périphérie une couche supra-basale (ou couche épineuse), une couche granuleuse (stratum granulosum) et une couche cornée (stratum corneum) d'un épiderme. Les kératinocytes utilisés dans l'équivalent d'épiderme peuvent être préparés selon toute méthode connue de l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple la culture à 30 partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique. Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale ou pathologique, en particulier selon la méthode décrite dans Asselineau et al. (Exp. Oeil 35 Res., 159(2): 536-9, 1985). 15 Par produit de comblement, on entend tout matériau naturel ou synthétique, solide ou liquide en mélange avec du solide (autre matériau), susceptible d'être injecté dans les tissus mous, en particulier cutané ou sous-cutané du visage ou du corps pour en modifier la forme ou les contours. Il peut s'agir de produits de comblement résorbables ou permanents. La durée totale de présence du produit en présence des cellules peut varier par exemple de 18 à 22 jours. De tels produits de comblement peuvent être choisis parmi les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques. A titre d'exemples de produits de comblement, on peut citer: - Biopolymères : • Acides hyaluroniques biotechnologiques ou aviaires, réticulés ou non (de 8 à 25 mg/ml, le plus souvent : 20mg/ml et le plus souvent à PM 3MDa ; commercialisés par exemple sous les marques Evenor®, Restylane® de QMed, Juvederm® de Cornéal) • Collagènes humains, bovins ou porcins ; réticulés ou non (ex: 35 ou 65 mg/ml ; ex2 : EvolenceTM, Cosmoplast®...) • Elastine (à partir de la tropoelastine humaine biotechnologique) - Polymères synthétiques et autres : • Polyacrylamide (ex: Aquamid®) • Acide polylactique (ex: Newfill®) • Acide polyvinylique • Hydroxyapatite de calcium ou triphosphate de Calcium (particules de 10 à 80pm, peut-être contenues dans de l'acide hyaluronique ou gel de polysaccharide ; ex : Atléan®, RadiesseTM) • Polyméthylmétacrylate (ex Artefill®, microsphères contenues dans du collagène bovin) • Alkylimides - Cellules ou transplants (autologues/allogenic) • Fibroblastes humains (ex: Isolagen TherapyTM, 10 millions de cellules autologues injectées) • Graisse ( injection de graisse autologue) Des produits de comblement pouvant être évalués selon l'invention seront notamment choisis parmi l'acide hyaluronique modifié ou non, le collagène, l'élastine, l'acide polylactique, les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques et leurs mélanges Les cellules seront notamment choisies parmi les fibroblastes et cellules souches de la peau. L'acide hyaluronique est formé par la répétition d'une unité disaccharidique hydrophile, dans laquelle le D-glucuronate de sodium est relié à la N-acétyl-glucosamine par des liaisons R1-4 glycosidique. Sa structure chimique est simple, linéaire et uniforme, sans spécificité d'espèce. En condition physiologique, le polysaccharide se trouve non sous forme acide mais sous la forme d'un sel sodique, l'hyaluronate de sodium, molécule polyanionique. Par convention, on parle d'hyaluronane. Dans les tissus sains, son poids moléculaire varie de 4 à 10 millions de daltons (400D par unité), ce qui donne un produit final pouvant atteindre 1011m. Seule la longueur et la concentration d'hyaluronane varie dans la nature. La masse moléculaire de l' hyaluronane dermique est en moyenne de 2,5 millions de daltons. Son contenu varie en fonction de l'âge . Par acide hyaluronique (AH) on entend dans la présente description l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, en particulier ses sels de sodium, potassium, manganèse, magnésium , et calcium. Son poids moléculaire peut varier, et est généralement supérieur à 106 daltons. Au sens de l'invention, on entend également désigner par acide hyaluronique un mélange de molécules de différentes masses moléculaires, correspondant à des répétitions plus ou moins nombreuses de l'unité disaccharidique de base. Au niveau industriel, l'acide hyaluronique peut être obtenu par extraction des tissus (par exemple de crêtes de coq) ou par fermentation bactérienne (tel que Streptococcus equi) L'acide hyaluronique est soluble dans l'eau, sa vitesse de dissolution étant masse moléculaire dépendante (plus la masse moléculaire est élevée, plus lentement il sera soluble), le processus peut être accéléré par agitation. Du fait de sa courte demi vie, pour son utilisation dans le cadre du traitement des rides par comblement, le produit doit généralement subir une réticulation. La réticulation se fait, essentiellement, en milieu alcalin, utilisant les sites carboxyliques et hydroxyles de la molécule. Mais cette réticulation peut être réalisée en milieu acide, bien que les liaisons créées dans ce milieu soient nettement moins résistantes qu'en milieu alcalin. Le procédé de réticulation ne change pas le caractère polyanionique du polysaccharide, mais diminue sensiblement la miscibilité à l'eau du gel obtenu. Dans les procédés de réticulation, l'acide hyaluronique utilisé est de qualité pharmaceutique. La technique de réticulation classique comporte 3 étapes. Une étape de préparation d'une acide hyaluronique de qualité pharmaceutique, suivi d'un séchage , laissant l'hyaluronane sous forme de fibres. L'écheveau de fibre d'hyaluronane obtenu est remis en solution dans une solution tampon . Par exemple, l'acide hyaluronique de faible masse moléculaire est mélangé à un acide de forte masse moléculaire. A ce stade le réticulant est ajouté, en milieu alcalin pour donner une masse gélifiée. Les différents réticulants utilisés pour réaliser les gels disponibles en chirurgie esthétique sont : - divinyl sulfone, - 1,2,7,8 diépoxyoctane - 1,4 butanediol diglycidyl éther (BDDE) , pour un grand nombre de produits actuellement sur le marché Dans certains cas une 4ème étape soit par addition d'acide hyaluronique soit par une seconde étape de réticulation en milieu acide. Au sens de l'invention, on entend par dérivés de l'acide hyaluronique notamment les dérivés modifiés chimiquement et/ou réticulés (présentant des ponts intra ou inter chaînes). De préférence, le dérivé réticulé est choisi parmi les dérivés réticulés de poids moléculaire supérieur ou égal à 106 daltons et notamment supérieur ou égal à 2 millions de daltons. Toutefois, ce poids moléculaire est généralement inférieur ou égal à 15. 106 daltons. Le collagène peut être de diverses origines, par exemple : humain, bovin ou porcin. Le collagène peut-être libre ou réticulé et est utilisé de préférence à une concentration élevée à 35mg/ml. La réticulation conduisant éventuellement à des pontages entre les chaines de collagène, après réaction avec une fonction aldéhyde, peut-être réalisée de façon aléatoire (ex avec le réticulant Glutaraldéhyde ou sucre réducteur) ou de façon précise et spécifique. La réaction de réticulation est appelée réaction de glycation. Cette réaction si elle se fait de façon aléatoire peut conduire à des produits néfastes pour la biologie de la peau. Le collagène peut-être réticulé et/ou modifié de façon spécifique conduisant à la formation de produits de glycation bénéfiques pour la peau. Le procédé d'évaluation selon l'invention comprendra notamment les étapes suivantes: a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme. Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, le procédé d'évaluation d'au moins un produit de comblement peut ainsi comprendre les étapes suivantes: a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme au dessus de l'équivalent de derme; d) on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de peau comprenant l'équivalent de derme et d'épiderme obtenu à l'issue de l'étape c). Le temps de contact de l'étape b peut varier de 3 à 6 jours, par exemple être d'environ 4 jours. Avantageusement, à l'étape c, on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme. De telles conditions sont connues de l'homme du métier. En particulier, après ensemencement des kératinocytes sur le support, la culture peut être maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Rheinwald et Green, 1975, (Cell, 6, (3), 317-330) milieu qui permet la prolifération des kératinocytes (nommé par ailleurs dans le texte milieu 3F) . Après un temps d'incubation de 3 à 15 jours, préférentiellement de 7 à 9 jours, l'équivalent de peau est maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt sur une grille métallique. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que le précédent. L'incubation se poursuit ensuite jusqu'à obtention d'un équivalent de peau présentant les caractéristiques d'une peau, à savoir le support sur lequel se trouve un équivalent d'épiderme présentant les quatre types de couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours préférentiellement entre 7 et 10 jours. L'équivalent de derme ou de peau obtenu par ce mode de réalisation se rapproche d'une injection finale de type nappage, à savoir dans la pratique réelle en médecine esthétique sur un patient répartition homogène et globale par injections multiples du produit dans la peau du visage. En effet, la répartition du produit de comblement dans l'équivalent de derme est homogène et la concentration du produit de comblemnt est sensiblement constante dans tout le volume de l'équivalent de derme. Avec un produit réticulé, on se situera dans le comblement des rides profondes ou la redéfinition des contours du visage avec des injections linéaires multiples et/ou croisées. Avec de l'acide hyaluronique non réticulé, on se situera plutôt dans un axe mésothérapie avec des injections multiples mais de petites tailles. Selon l'une des variantes du procédé, à l'étape d, on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme. Selon une autre variante, à l'étape d, on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent d'épiderme. La mesure peut être qualitative, quantitative ou semi-quantitative. Par mesure d'un paramètre biologique, on entend notamment la mesure (ou le dosage) du taux de protéines exprimées par l'équivalent de derme ou d'épiderme comprenant le produit de comblement, notamment des protéines exprimées par les différents types cellulaires présents en particulier par les fibroblastes et/ou les kératinocytes. Cette mesure peut s'effectuer au sein de l'équivalent de derme ou d'épiderme, notamment en mesurant la concentration de protéines de la matrice extracellulaire; elle peut aussi concerner le dosage des protéines libérées par l'équivalent de derme ou de peau dans le surnageant de culture obtenu à l'issue de l'étape b. Le paramètre biologique mesuré peut aussi comprendre l'évaluation du taux de prolifération des cellules constitutives de l'équivalent de derme ou de peau contenant le produit de comblement, en particulier des fibroblastes ou des kératinocytes. L'évaluation peut comprendre la visualisation de l'expression de protéines par immunofluorescence (solubles ou non, membranaires ou non comme par exemple le récepteur CD44), la morphologie des fibroblastes dans le collagène observée par un marquage immunofluorescent des filaments du cytosquelette tels que la vimentine. L'équivalent de peau utile dans le procédé selon l'invention peut aussi contenir des cellules endothéliales, des mélanocytes, des cellules de papilles dermiques, des cellules du système immunitaire, telles que des lymphocytes, des cellules dendritiques, des macrophages des monocytes ou des cellules de Langerhans, des adipocytes, des cellules nerveuses, et leurs mélanges; en particulier, l'équivalent de peau tel que défini précédemment comprend en outre des cellules choisies parmi les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les adipocytes. Le modèle permet ainsi d'étudier l'effet biologique d'un produit de comblement sur la signalisation inflammatoire et de donner des informations sur l'éventuelle composante inflammatoire d'un produit. La présence d'une structure et d'une composition de derme reproduisant la structure de la peau humaine est nécessaire pour évaluer l'ensemble des effets pouvant être induits par l'injection de produits de comblement. En particulier, il a été montré chez l'animal que l'injection d'acide hyaluronique réticulé stimule la production de collagène (Wang et al. arch. Dermatol. 2007; 143:155-163). Il est donc important de pouvoir évaluer ce type d'activité biologique, ce qui est possible avec le modèle selon l'invention. Les produits de comblement sont destinés, selon les indications du fabricant et leur composition, à être injectés soit dans la partie superficielle de la peau (derme papillaire) soit dans la partie moyenne à profonde de la peau (derme réticulaire). Les propriétés biologiques étant différentes entre les fibroblastes de la partie papillaire et ceux de la partie réticulaire, les effets d'un actif ou d'un produit peuvent donc être différents selon les cellules qui sont mises en contact. La mise en oeuvre d'équivalent de derme à teneur contrôlée en fibroblastes papillaires et/ou réticulaires selon la présente invention permet donc de tester spécifiquement l'effet du produit selon la profondeur à laquelle il est destiné ou inversement, permet de déterminer à quelle profondeur le produit aura l'effet le plus bénéfique.35 Le procédé et l'équivalent de peau selon l'invention permettent d'évaluer les effets biologiques, biophysiques, biomécaniques, physiques, modifications d'apparence visuelle, morphologie, relief, couleur induits par l'injection d'un produit de comblement. La mesure des paramètres physiques, chimiques ou biologiques représentatifs de ces effets, peut être qualitative, quantitative ou semi-quantitative, et sera effectuée par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier, l'évaluation pourra comprendre une étape au cours de laquelle on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique tel que défini précédemment d'un équivalent de derme ou de peau contenant le produit de comblement, et on le compare à celle mesurée dans un équivalent de peau préparé dans les mêmes conditions mais ne contenant pas de produit de comblement. Selon un mode de réalisation de l'invention, on mesure la quantité de protéines de la matrice extracellulaire et/ou la quantité d'ARNm de la matrice extracellulaire produite par l'équivalent de derme contenant le produit de comblement, et on la compare à celle mesurée d'un équivalent de derme préparé dans les mêmes conditions mais ne contenant pas de produit de comblement. Comme indiqué précédemment, cette mesure pourra être effectuée dans l'équivalent de derme ou dans le surnageant de culture de l'équivalent de derme. Des protéines utiles à mesurer dans les différents modes de réalisation du procédé selon l'invention sont notamment les métalloprotéinases, telles que la MMP-1, les inhibiteurs de MMPs tels que TIMP-1, et les facteurs de croissance tels que KGF. Le procédé d'évaluation pourra également être utile pour comparer plusieurs produits de comblement et par exemple les classer selon leur structure et établir une corrélation avec leurs effets biologiques. L'invention a encore pour objet un équivalent de peau susceptible d'être obtenu comme produit intermédiaire dans le procédé d'évaluation défini dans ce qui précède, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un équivalent de derme comprenant au moins (i) des constituants de matrice extracellulaire et des fibroblastes et (ii) un produit de comblement. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un tel équivalent de peau pour l'évaluation d'un produit de comblement. L'invention concerne enfin un procédé de préparation d'un tel équivalent de peau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme au dessus de l'équivalent de derme; d) on récupère l'équivalent de peau comprenant l'équivalent de derme et l'équivalent d'épiderme obtenus à l'issue de l'étape c. L'invention sera illustrée plus en détail par les exemples qui suivent Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes: Figure 1: coupe schématique d'un modèle de type nappage Figure 2: expression des protéines MMP-1 dans le surnageant dans des modèles préparés avec des acide hyaluronique (HA) de différents degrés de réticulation. Figure 3: évaluation de la prolifération épidermique dans des modèles préparés avec des acide hyaluronique (HA) de différents degrés de réticulation. Exemple 1: préparation d'un équivalent de peau: Les milieux et tampons utilisés sont décrits dans Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7). Stérilement, on prépare la `solution intermédiaire lattis' dans un tube Falcon. Pour la réalisation d'une lattis, on mélange 4,6m1 de MEM 1,76X, 0,9m1 de sérum de veau foetal (SVF), 0,5m1 de NaOH à 0,1 N, 0,28m1 de MEM Hépès à 10%SVF. Mélanger 100pl de solution de produit de comblement avec la solution intermédiaire lattis (10m1 -100pl du produit) de façon homogène. A cette solution, ajouter 1,42 millions de fibroblastes à partir de la solution initiale de fibroblastes concentrés à 2 millions par ml dans du MEM Hépès à 10% SVF, soit 0,71 ml. Les fibroblastes issus de plastie mammaires ont été préalablement isolés et amplifiés selon la méthode décrite par Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7). A cette solution, ajouter 3ml de solution de collagène bovin (Ci=Smg/ml soluble dans 0.017N d'acide acétique), on dénommera le mélange ainsi crée solution finale lattis. La solution finale lattis avec produit ainsi obtenue est déposée dans une boîte de pétri 60mm de diamètre. NB : L'incorporation du produit de comblement ainsi est répartie dans la matrice dermique. Après contraction de 4 jours, le derme équivalent est ensemencé en kératinocytes pour 7 jours de culture et l'épiderme est différencié avec l'interface air pendant 7/11 jours. La figure 1 représente une coupe schématique du modèle ainsi obtenu : Exemple2 : Caractérisation des HA réticulés en fonction de leur réticulation et du volume incorporé dans le derme Les milieux de cultures des dermes équivalents ont été prélevés et un dosage ELISA a été effectuée (MMP-1 ELISA, Amersham Biosciences, Réf RPN2610) pour détecter la protéine MMP-1 (métalloprotéinase extracellulaire de type 1) exprimée par les fibroblastes contenus dans ce derme suite à la contraction de la matrice. La figure 2 représente les différences liées à la réticulation et en fonction du volume: Légende : HA du moins réticulé au plus réticulé : HA+, HA++, HA+++. On observe une augmentation de l'expression de la protéine MMP-1, dans le surnageant 30 de culture des dermes équivalents après contraction, avec les HA réticulés, cette augmentation est fonction de la réticulation et la quantité injectée. Exemple 3 : Stimulation de la prolifération épidermique en présence de HA réticulés 35 Des coupes de tissus paraffines d'une peau reconstruite témoin (aucun produit/pas d'inclusion) et d'une peau reconstruite `inclusion' préparée comme décrit à l'exemple 1 25 (produit acide hyaluronique réticulé avec BDDE, 20mg/ml) sont réalisées pour une épaisseur de 5pm. Ces coupes sont déparaffinées suivant le protocole ci-après : xylène 2 fois 5 min, alcool absolu 3 min, alcool 70% 3 min, alcool 50% 3 min, eau distillée 10 minutes, PBS 5 min. Les coupes sont plongées dans une solution de citrate pH9 chaude à 95°C pendant 25 min et laissée à refroidir dans cette solution hors du bain-marie pendant 25 min. Ces coupes, rincées au PBS, subissent les étapes de blocage, suivantes : H2O2 (10 min), avidine (20min), biotine (20min), sérum de cheval (30 min). Ces coupes, rincées au PBS, sont incubées à 4°C pendant la nuit avec un anticorps primaire souris anti-Ki67 humain qui reconnait les cellules en prolifération (Novocastra, réf 25120). Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps secondaire cheval anti-souris (couplé à une biotine) qui reconnait l'anticorps primaire (Vector, réf BA-1400) à TA pendant 30 min. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec une solution d'amplification ABCHRP reagent (complexe biotine-avidine couplé à une enzyme peroxydase, Dako, réf S2001) pendant 30min à TA. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées 10 min avec le chromogène AEC puis rincées à nouveau en PBS. Une coloration des noyaux est effectuée avec l'hématoxyline pendant 5 sec. Les coupes rincées à nouveau sont montées dans du milieu de montage sous lamelle. L'observation est réalisée au microscope conventionnel (modèle DMDR, Leica Microsystems). La figure 3 représente la stimulation de la prolifération épidermique en présence de HA réticulés : Légende : HA du moins réticulé au plus réticulé : +, ++, +++. On observe une stimulation de la prolifération épidermique en présence des HA réticulés indépendamment de la réticulation de l'HA. 30 Revendications1- Procédé d'évaluation in vitro d'un produit de comblement, caractérisé en ce qu'il comprend au moins (i) une étape de mélange dudit produit de comblement avec des constituants d'un équivalent de matrice extracellulaire pour préparer un équivalent de derme in vitro, les constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire étant différents du produit de comblement, (ii) une étape de mesure d'au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme ou d'un équivalent de peau in vitro le contenant. 2- Procédé d'évaluation selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'équivalent de derme comprend au moins du collagène et des fibroblastes vivants. 3- Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le produit de comblement est choisi parmi l'acide hyaluronique modifié ou non, le collagène, l'élastine, l'acide polylactique, les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques et leurs mélanges. 4- Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on prépare un équivalent de peau in vitro contenant l'équivalent de derme et comportant en outre un équivalent d'épiderme contenant des kératinocytes. 5- Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes dans lesquelles a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme au dessus de l'équivalent de derme; d) on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de peau comprenant l'équivalent de derme et d'épiderme obtenu à l'issue de l'étape c). 6- Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes dans lesquelles a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme. 7- Procédé d'évaluation selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'à l'étape d, on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme. 8- Procédé d'évaluation selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'à l'étape d, on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent d'épiderme. 9- Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les constituants de la matrice extracellulaire comprennent au moins du collagène I, du collagène III ou leurs mélanges. 10-Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'équivalent de peau comprend en outre des cellules choisies parmi les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les adipocytes. 11-Procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on mesure la quantité de protéines de la matrice extracellulaire produite par l'équivalent de derme contenant le produit de comblement, et on la compare à celle mesurée avec un équivalent de derme préparé dans les mêmes conditions mais ne contenant pas de produit de comblement. 12- Equivalent de peau susceptible d'être obtenu comme produit intermédiaire dans le procédé d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un équivalent de derme comprenant au moins (i) des constituants de matrice extracellulaire et des fibroblastes et (ii) un produit de comblement. 13-Procédé de préparation d'un équivalent de peau selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra- cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme au dessus de l'équivalent de derme; d) on récupère l'équivalent de peau comprenant l'équivalent de derme et l'équivalent d'épiderme obtenus à l'issue de l'étape c. 14-Utilisation d'un équivalent de peau selon la revendication 12, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 13, pour l'évaluation d'un produit de comblement.15