Brevet FR2957090A1 — publié le 20110909

La présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test et à une trousse pour la mise en oeuvre de ladite méthode. Les industries de la parfumerie, de la cosmétique et de la pharmacie se doivent de rester compétitives et performantes et continuer à proposer régulièrement des produits nouveaux, avec comme contrainte de répondre aux normes de sécurité pour l'homme et son environnement attachées à leur utilisation. L'irritation est une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact. Celle-ci se reconnaît par un oedème consécutif à un afflux de fluides dans les tissus, une rougeur, de la chaleur et/ou de la douleur. En réponse à une agression chimique, les kératinocytes de l'épiderme et les fibroblastes du derme sont stimulés et vont libérer dans la peau des cytokines IL1, TNF alpha, IL6, IL8, ainsi que des médiateurs comme les prostaglandines (PGE2) qui vont initier la réponse inflammatoire. Les effets délétères causés par un agent chimique comme l'irritation cutanée est d'une importance majeure en dermatologie et peut s'avérer être un frein à la mise sur le marché de produits nouveaux. Les nouvelles contraintes européennes imposent désormais l'utilisation de méthodes n'utilisant pas d'animaux et il est donc indispensable de mettre au point des méthodes alternatives permettant de déterminer si une composition nouvelle ou un produit nouveau est susceptible de représenter un risque pour l'homme par ses propriétés irritantes. D'un point de vue histologique les dermatites de contact sensibilisantes et irritantes sont très voisines. Pour autant, les conséquences cliniques ne sont pas similaires et il est important de posséder des méthodologies fiables permettant de les distinguer. Une approche prédictive originale est d'autant plus nécessaire qu'actuellement aucune corrélation claire n'a été mise en évidence entre une structure moléculaire donnée et son pouvoir irritant et/ou sensibilisant. Les méthodes actuelles permettant de prédire le potentiel irritant d'un composé sont d'une part, basées sur l'utilisation d'animaux ce qui est dorénavant interdit, d'autre part ne sont pas quantitatives et ne permettent par conséquent pas d'évaluer la force irritante d'une molécule. Les industriels des filières parfum et cosmétiques sont demandeurs de méthodologies permettant de distinguer les irritants faibles des irritants forts ce qui leur permettrait de mener avec beaucoup plus de précision des stratégies de mise sur le marché de leurs produits. De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que la réponse consécutive à l'action d'une substance irritante se fait directement sur la peau sans l'intervention de cellules immunocompétentes, et que le degré d'irritation d'une molécule peut être déterminé grâce à l'utilisation de biomarqueurs spécifiques de l'irritation. Les Inventeurs ont mis en évidence que l'épiderme constitue un modèle suffisant pour mettre en évidence des biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et/ou de l'irritation chez l'homme et chez la souris, et qu'il n'est pas nécessaire d'ajouter d'autres types cellulaires si l'analyse des gènes identifiés est réalisée à un temps donné. Le modèle EPISKIN peut ainsi être le tissu de référence pour évaluer le caractère sensibilisant d'un composant test. Ainsi, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique; b) détermination du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAST (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur). De préférence, la méthode selon la présente invention est une méthode in vitro. De préférence, la méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination du potentiel irritant d'un composé test. Préférentiellement, ladite étape c) peut consister en une étape de sélection dudit composé comme présentant un potentiel irritant si le niveau d'expression dudit gène est supérieur à une valeur seuil. Avantageusement, ladite étape c) permet d'évaluer la force irritante dudit composé test. Tel qu'utilisé ici, le terme « échantillon biologique » se réfère à tout échantillon solide ou liquide issu d'un sujet. De préférence, ledit échantillon biologique est un échantillon de peau. De façon particulièrement préférée, l'échantillon de peau est un échantillon de peau reconstruite in vitro, comme par exemple le modèle EpiSkin (EPISKIN, Lyon France), EpiDermTM (MATEK Corporation, Ashland, MA) ou SkinEthicTM RHE (SKINETHIC, Nice, France). De préférence, ledit échantillon de peau reconstruite in vitro comprend en outre une couche de kératine. De manière encore préférée, l'échantillon de peau ne comprend que l'épiderme et ne comprend pas l'addition d'autres types cellulaires supplémentaires, et encore préférentiellement pas de cellules de Langerhans supplémentaires. Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc. Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée. De telles compositions peuvent être, par exemple, des échantillons d'un produit cosmétique ou dermatologique. De préférence, ledit composé test est apte à être utilisé sur la peau et peut être utilisé dans une composition cosmétique ou dermatologique. On entend par «potentiel irritant », le risque pour le composé test de provoquer une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact. De préférence, ledit au moins un gène est choisi dans le groupe constitué par : 4-10 1BBL, COL7A1, HAST et RELT. La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement 15 automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. De préférence, dans la méthode selon la présente invention, le niveau d'expression dudit gène est déterminé par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par 20 ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit gène ou d'un fragment de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, le niveau d'expression dudit au moins un gène est effectuée par analyse de l'expression de transcrits d'ARNm ou de précurseurs 25 d'ARNm, tel qu'un ARN natif, dudit gène. Ladite analyse peut être réalisée en préparant l'ARNm/ADNc de cellules d'un échantillon biologique d'un patient, et hybridation de l'ARNm /ADNc avec un polynucléotide de référence. L'ARNm/ADNc préparé peut être utilisé dans une analyse par hybridation ou amplification qui inclut, sans s'y limiter, les analyses Southern et Northen, les 30 analyses par PCR (« polymerase chain reaction »), telle que la PCR quantitative (Taqman) et l'utilisation de sondes (« probes arrays ») telles que les matrices ADN GeneChip®(AFFYMETRIX).5 Avantageusement, l'analyse du niveau d'expression d'ARNm transcrit dudit au moins un gène implique un procédé d'amplification des acides nucléiques, comme par exemple la RT-PCR (mode de réalisation expérimental décrit dans le Brevet US 4,683,202), la réaction en chaîne par la ligase (BARANY, Proc. Nat/. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991), la réplication de séquences auto-entretenue (« self sustained sequence replication ») (GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990), le système d'amplification transcriptionnelle. (KWOH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989), la « Q-Beta Replicase » (LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988), la « rolling circle replication » (U. S. Patent No. 5,854,033) ou toute autre méthode d'amplification d'acides nucléiques, suivie d'une étape de détection des molécules amplifiées par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces modes de détection sont particulièrement utiles pour la détection de molécules d'acides nucléiques en très faibles quantités. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la méthode selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci. Telles qu'utilisées ici, les amorces d'amplifications sont définies comme étant une paire de molécules d'acides nucléiques qui peuvent s'apparier respectivement aux régions 3' et 5' d'un gène de façon spécifique (brins positif et négatif, ou inversement) et encadrent une courte région dudit gène. De manière générale, les amorces d'amplification ont une longueur de 10 à 30 nucléotides et permettent l'amplification d'une région d'une longueur comprise entre 50 et 200 nucléotides. Avantageusement, les amorces utilisées dans le cadre de la présente invention sont celles listées dans le tableau 1. Dans un autre mode de réalisation préféré, la détermination du niveau d'expression dudit au moins un gène est réalisée par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène, ou un fragment de celui-ci. Ladite analyse peut être réalisée en utilisant un anticorps (par exemple, un anticorps radiomarqué, marqué avec un chromophore, un fluorophore, ou une enzyme), un dérivé d'anticorps (par exemple un anticorps conjugué à un substrat ou à une protéine ou un ligand d'une protéine d'un couple ligand/protéine (par exemple biotine-streptavidine)) ou un fragment d'anticorps (par exemple un anticorps à une seule chaîne, un domaine hypervariable d'un anticorps isolé, etc.) qui se lie spécifiquement au polypeptide codé par ledit gène. Lesdites analyses peuvent être réalisées par de nombreuses techniques à la portée de l'homme du métier incluant, sans s'y limiter, les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'activité enzymatique (« enzyme immunoassay » EIA), les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'isotopes radioactifs (RIA), l'analyse par Western blot et les tests ELISA (« enzyme linked immunoabsorbant assay »). Au sens de la présente invention, on entend par «polypeptide » une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes «polypeptide », «peptide » et «protéine » peuvent être indifféremment utilisés. Par « fragment de l'ARNm ou de l'ADNc », on entend une séquence d'au moins 50 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides nucléiques, de préférence d'au moins 200 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides nucléiques, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides nucléiques. Par « fragment du polypeptide », on entend une séquence d'au moins 50 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés. De préférence, la méthode selon la présente invention comprend en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène, avec une valeur de référence. Cette valeur de référence peut servir de contrôle positif et/ou négatif. De préférence, l'étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène, avec une valeur de référence est réalisée après l'étape b). Un contrôle positif peut par exemple être effectué en comparant le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test avec le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé connu comme irritant. Un contrôle négatif peut être réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non sensibilisant et non irritant comme par exemple l'huile d'olive, le glycérol, le Cétyl trimethylammonium bromide (CTAB) ou le dipropylène glycol. Dans le cadre de la présente invention, on conclura qu'un composé test présente un potentiel irritant si une surexpression dudit gène est observée par rapport à son niveau d'expression en l'absence dudit composé test. On entend par « surexpression », un niveau d'expression significativement plus élevé dudit gène par rapport à son niveau d'expression normal. De préférence, on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon biologique qui est supérieur à au moins 20% du niveau normal d'expression dudit gène, de préférence supérieur à au moins 50% du niveau normal d'expression dudit gène, et de manière particulièrement préférée supérieur d'au moins 90% au niveau normal d'expression dudit gène. Le « niveau d'expression en l'absence dudit composé test » ou « niveau normal » est le niveau d'expression dudit gène dans un échantillon contrôle correspondant potentiellement à l'échantillon biologique d'un patient ne présentant pas d'irritation ou, de préférence, à la moyenne du niveau d'expression dudit gène dans différents échantillons contrôle. De plus, si l'on conclut qu'un composé test est irritant, la détermination du niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test permettra d'évaluer la force irritante du composé test. On entend par « force irritante » le degré d'inflammation des tissus au site de contact. Ainsi, plus la force irritante est importante, plus le degré d'inflammation des tissus au site de contact est important. Il est ainsi possible de réaliser une analyse quantitative du potentiel irritant d'un 5 composé. A titre d'exemple de composé connu comme irritant, on peut citer le LaurylSulfate de Sodium (SLS), l'acide octanoïque, le cholobenzene, l'acide lactique, le bromobutane, le méthyl salicylate et le butanol. 10 De préférence, l'étape b) de la méthode selon la présente invention comprend la détermination du niveau d'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille 15 du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS 1 (hyaluronane synthase 1), RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), IL-lA (interleukine 1, alpha), IL-7R (Récepteur de l'interleukine 7), IL-8 (Interleukine 8), JUN (oncogene jun), PLAUR (plasminogène activateur, urokinase récepteur) et 20 TNF-A (Facteur de nécrose tumorale), de préférence dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur). 25 Ainsi, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel irritant si une surexpression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, 30 type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1), RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), IL-1A(interleukine 1, alpha), IL-7R (Récepteur de l'interleukine 7), IL-8 (Interleukine 8), JUN (oncogene jun), PLAUR (plasminogène activateur, urokinase récepteur) et TNF-A (Facteur de nécrose tumorale) est observée par rapport à leur niveau d'expression en l'absence dudit composé test. De préférence, l'étape b) est réalisée entre 1 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière préférée entre toute 6 heures après l'étape a). 10 Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS 1 (hyaluronane 15 synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur) pour l'évaluation in vitro du potentiel irritant et/ou la force irritante d'un composé test. La présente invention se rapporte également à une trousse pour la mise en oeuvre de la méthode selon la présente invention. 20 De préférence, ladite trousse comprendra au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du 25 TNF récepteur). De manière particulièrement préférée, ladite au moins une paire d'amorce est choisie dans le tableau 1. Exemples 1) Mise en évidence de biomarqueurs selon le protocole Skinethic 30 2957090 lo Les peaux, 1,07 cm2, ont été achetées chez EPISKIN. Les différentes substances ont été appliquées soit sous forme liquide (34l à différentes concentrations) soit sous forme solide (341 PBS ou huile d'olive + 30µg ou moins pour évaluer différentes concentrations de poudre) sur les peaux. Après une incubation de l5mn à 5 température ambiante les peaux ont été lavées avec du PBS (25 ml) et incubées 3h, 6h ou 18h à 37°C dans une étuve à CO2. Après incubation les peaux ont été prélevées avec un punch et séparées du support en collagène. Elles ont ensuite été directement placées dans une solution de « Tri Reagent » (Ambion) (1 ml) et immédiatement dissociées mécaniquement. Préparation de l'ADNc Les tissus ont été placés dans une solution de «Tri Reagent» (Ambion) et broyés mécaniquement. L'ARN a été préparé suivant le protocole décrit par le fabriquant avec une précipitation à l'isopropanol. Pour la préparation de l'ADNc, les ARN totaux sont traités avec une DNAse pour retirer les ADN génomiques contaminants. On utilise pour le traitement 1 à 5 µg d'ARN total avec de la DNAse RNAse free, de la RNAsin (1µl) et des random primers (3 µg). On ajoute ensuite de la superscipt III RT (1,5 µl à 200U/µl). Les cDNA sont ensuite testés par RT-PCR. PCR quantitative La PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant la technologie SYBR Green des appareils LC480 de chez Roche. Les amorces ont été conçues pour couvrir les jonctions intron-exon pour prévenir d'éventuelles traces d'amplification de l'ADN génomique. L'amplification donne des amplicons entre 100 et 150 pb. Toutes les paires d'amorces ont été qualifiées par digestion avec des enzymes de restriction et analysées par électrophorèse. La PCR a été réalisée dans 10 µl en utilisant le mix PCR Sybr green 2X mix PCR de Roche dans des plaques PCR de chez Roche. L'expression des gènes cibles a été mesurée après normalisation de l'ARN grâce à quatre gènes de ménage, et les valeurs sont exprimées en utilisant la méthode des CT, et exprimés en taux d'expression supplémentaire par rapport à un zéro théorique (user bulletin no. 2, Applied Biosystems, December 1997). Résultats Pour cette analyse, une application de l5mn suivi d'un lavage et d'une post incubation de 6h avant collecte des biopsies et d'une analyse de la transcription des 5 gènes ont été réalisés. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. 11 12 Abréviation Nom du gène Nom en anglais Numéro d'accès Amorce sens Amorce antisens 4.1 BBL Membre 9 de la superfamille tumor necrosis NM 003811.3 CAGGGCATGTTTGCGCAGCTG AGCTCCTTCGTGTCCTCTTTGT du TNF factor (ligand) û GT (SEQ ID NO : 13) (SEQ ID NO : 14) superfamily, member 9 COL7A1 collagène, type VII, alpha 1 collagen, type NM 000094.3 ACTGACCGAGTACCAAGTGAC GCTGTGGTATTCTGGATGGTCAG VII, alpha 1 û TGT (SEQ ID NO : 1 ) T (SEQ ID NO : 2 ) CTSD cathepsine D cathepsin D NM 001168903.1 TCCCGAGGTGCTCAAGAACTA AAGCGATGTCCAGCAGTTTGCAG CAT (SEQ ID NO : 3) T (SEQ ID NO : 4) FDXR ferredoxine reductase ferredoxin XM_001492615.2 TTTGTGCCAGAGAACGGACAT ACTGAATCATCTCCCGAAGCTCCT reductase CAC (SEQ ID NO : 5) (SEQ ID NO : 6) GAA glucosidase, alpha; acide glucosidase, NM_001079804.1 AGAACCTGAGCTCCTCTGAAA TCTCAGTCTCCATCATCACGTCCA alpha; acid TGG (SEQ ID NO : 7) (SEQ ID NO : 8 ) HAS1 hyaluronane synthase 1 hyaluronan NM 001523.2 GCGATACTGGGTAGCCTTCAA TGTACCAG G C CTCAAGAAACTG C synthase 1 TGT (SEQ ID NO : 9) T (SEQ ID NO : 10 ) RELT Membre 19 de la tumor necrosis NM 152222.1 AGATCACCATCTTGTCTGTGG ACCTCAGACACCATTGAACTTGTC superfamille du TNF factor receptor GCA (SEQ ID NO : 11) (SEQ ID NO : 12 ) recepteur superfamily, member 19-like IL-1A interleukine 1, alpha interleukin 1, NM_000575.3 TAGTAGCAACCAACGGGAAG TGCTCAGGAAGCTAAAAGGTGC alpha GT (SEQ ID NO : 15) (SEQ ID NO : 16 ) 13 IL-7R Recepteur de l'interleukine interleukin 7 NM 002185.2 GAATGGATCGCAGCACTCACT TTCAGGCACTTTACCTCCACGAGG 7 receptor û GA (SEQ ID NO : 17) (SEQ ID NO : 18) IL-8 Interleukine 8 Interleukin 8 NM 000584.2 CTCTCTTGGCAGCCTTCCTGAT GGGTGGAAAGGTTTGGAGTATG TT (SEQ ID NO : 19) (SEQ ID NO : 20) JUN oncogene jun jun oncogene NM_002228.3 TGGAAACGACCTTCTATGACG AGGGTCATGCTCTGTTTCAGGAT AT (SEQ ID NO : 21) (SEQ ID NO : 22) PLAUR plasminogène activateur, plasminogen NM 001005376.1 CTGCAACACCACCAAATGCAA CGGCAGTCAATGAGGAAAGTCTCT urokinase recepteur activator, û CGA (SEQ ID NO : 23) (SEQ ID NO : 24) urokinase receptor TNF-A Facteur de nécrose tumorale tumor necrosis NM 000594.2 GATCATCTTCTCGAACCCCGA ACTGGAGCTGCCCCTCAGCTTGA factor(TNF GTG (SEQ ID NO : 25) (SEQ ID NO : 26) superfamily, member 2) Tableau 1 2) Analyse quantitative Les substances du tableau 2 ont été utilisées comme contrôles irritants (SLS, acide octanoique, Cholobenzene, acide lactique, bromo-butane, methyl salicylate, butanol) et non irritants (glycérol, Cetyl trimethylammonium bromide et Dipropylène Glycol). Classe Nom CAS# Abréviation Non ù Cetyl trimethylammonium bromide 57-09-0 CTAB Irritant Non ù Dipropylène Glycol 25265-71-8 LG Irritant Non ù Glycérol 56-81-5 Glyc Irritant Irritant Acide Octanoïque / Acide caprilique 124-07-2 OA Irritant Acide Lactique 598-82-3 LA Irritant nButanol- 1Butanol 71-36-3 But Irritant LaurylSulfate de Sodium 151-21-3 SLS Irritant Chlorobenzène 108-90-7 CBZ Irritant BromoButane 109-65-9 BrBut Irritant Méthylsalicylate 119-36-8 M Tableau 2 Le tableau 3 montre le taux d'expression des biomarqueurs de l'irritation pour ces différentes substances. On voit clairement que les irritants induisent de façon forte la plupart des biomarqueurs. 15 On remarque également que dans le cas des biomarqueurs déjà connus (TNF-A, IL-1, IL7-R, PLAUR, IL-8, JUN), au moins une des substances non irritantes (CTAB, DPG ou Glycérol) induit l'expression de ces gènes ce qui peut conduire à définir des substances faussement positives si on utilise uniquement ces marqueurs. Ainsi on peut en déduire que, de manière préférée, si au moins 6 gènes testés sont 20 surexprimés par rapport au contrôle non traité et/ou que la moyenne de10 l'augmentation de l'expression de ces gènes dépasse 2, alors la substance est considérée comme irritante de manière certaine. Tableau 3 : taux d'expression des gènes spécifiques de l'irritation dans le modèle 5 EPISKIN 16 Substance Propriété Q D J ? Q H Q = Û m J il H c Û SLS 5% Irritant 49,1 3,6 24,4 6,3 10,2 11,2 6,6 4,4 48,2 1,4 1,6 1,8 7 Chlorobenzene Irritant 38,3 8,5 3,2 18,4 3,7 1,6 3,2 2 23,4 1,4 1,3 1,3 4,5 Acide Irritant 40,7 1,5 14,7 8,1 30,4 5,5 21,4 9,3 55 4,1 2,9 3,8 41,2 octanoïque Butanol Irritant 17,5 1,4 13,3 0,5 19,1 0,6 13,4 9,4 1,8 1,6 3,3 2,5 15,7 Methyl Irritant 32,3 2,7 5,2 2,7 1,2 1,3 3,3 55,2 4,1 1,6 1,4 2,2 18,1 salicylate Bromo-butane Irritant 34,3 9,2 12,2 14,3 30,5 18 20,6 46,2 1,5 2,9 3,4 6,7 69,6 Acide lactique Irritant 1,2 0,4 0,7 2,2 2,7 2,6 3,3 1,5 2,4 1,6 1,4 2,2 6,9 Glycerol Non 0,6 1,1 1,1 0,8 0,5 0,5 0,4 0,4 0,7 0,6 1,6 0,3 0,6 Irritant Diprobpylène Non 2,6 1,7 1,1 0,7 0,8 1,8 1,0 0,4 0,1 0,6 0,3 1,1 1,2 Irritant CTAB Non 2,2 1,0 1,4 1,6 0,7 1,1 0,6 0,6 0,7 0,5 1 0,6 0,8 Irritant Tableau 3 Par ailleurs, pour des substances trop corrosives, comme le SLS à des doses supérieures à 10% ou l'acide lactique supérieur à 1%, la dégradation tissulaire est alors trop importante, même avec un temps de contact limité à 15 mn, la quantité d'ARN recueillie étant alors trop faible pour pouvoir l'analyser par RT-PCR. Typiquement cette quantité est de 20µg/cm2, l'analyse n'est pas réalisée si ce taux est inférieur à 15µg/cm2 de peau. Par ailleurs, des analyses de réponses dose-dépendantes avec du SLS ont permis de montrer que l'on pouvait utiliser les biomarqueurs IL-8, 4-1BBL ou col7Al 10 pour quantifier la force de l'irritation, comme le montre la Figure 1. En effet, la figure 1 montre une linéarité dans le taux d'expression de ces 3 gènes par rapport à la quantité, démontrant ainsi une réaction dose-dépendante. Il est donc possible, d'utiliser le SLS à différentes doses pour établir une courbe 15 standard pour chaque expérience. Ceci présente un intérêt dans la mesure où l'épaisseur, notamment de la couche cornée, introduit des variations entre les expériences, notamment en ralentissant la vitesse de pénétration, ce qui a une influence sur le taux d'expression observé à 6 h. Cependant, quelque soit les conditions utilisées, une linéarité dans l'expression en fonction de la dose est 20 observée et il est possible de retrouver les mêmes valeurs de force d'irritation, comme le montre le tableau 4 suivant. La valeur du SLS 5% a été fixée arbitrairement à 1. Le methyl salicylate à 10% n'est pas irritant dans le test. 18 gène SLS 5% SLS 1% Chlorob Bromobutane pur Bromob Methyl Methyl enzene utane salicylate salicylate 50% 10% 50% 10% Expl IL-8 1 0,2 0,31 4,2 0,3 0,72 0 4-1BBL 1 0,21 0,42 4,1 0,32 0,81 0 Co17A1 1 0,28 0,27 3,2 0,27 0,68 0 Exp2 IL-8 1 0,14 0,2 3,9 0,41 0,81 0 4-1BBL 1 0,17 0,36 3,7 0,37 1,1 0 Co17A1 1 0,25 0,28 2,8 0,22 0,72 0 Exp3 IL-8 1 0,19 0,38 4,1 0,32 0,83 0 4-1BBL 1 0,21 0,46 3,9 0,31 0,89 0 Co17A1 1 0,19 0,32 3,5 0,24 0,74 0 Tableau 4 : analyse quantitative d'irritant REVENDICATIONS1. Méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique; b) détermination du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAST (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur). 2. Méthode d'évaluation selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit au moins un gène avec une valeur de référence. 3. Méthode d'évaluation selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle le niveau d'expression dudit au moins un gène est déterminé par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit au moins un gène ou d'un fragment de celui-ci. 4. Méthode d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit au moins un gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de peau, de préférence un échantillon de peau reconstruite in vitro. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'étape b) comprend la détermination du niveau d'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1), RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), IL-1A(interleukine 1, alpha), IL-7R (Récepteur de l'interleukine 7), IL-8 (Interleukine 8), JUN (oncogene jun), PLAUR (plasminogène activateur, urokinase recepteur) et TNF-A (Facteur de nécrose tumorale). 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'étape b) est réalisée entre 2 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière préférée entre toute 6 heures après l'étape a). 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle 20 l'étape c) permet d'évaluer la force irritante dudit composé test. 9. Utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; 25 acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), pour l'évaluation in vitro du potentiel irritant et/ou la force irritante d'un composé test. 10. Trousse pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une quelconque des 30 revendications précédentes. 11. Trousse selon la revendication 10, comprenant au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAST (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur).