Brevet FR2952383A1 — publié le 20110513

La présente invention concerne un procédé de détection spécifique et directe de bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (STEC, Shiga toxinproducing Escherichia coli) dans un échantillon mettant en oeuvre un milieu d'isolement sélectif et différentiel pour souches STEC comprenant au moins un agent chromogène et du tellurite. Les E. coli producteurs de Shigatoxines (STEC) sont responsables de toxi-infections d'origine alimentaire qui se traduisent par des diarrhées mais aussi par des syndromes plus graves pour l'homme comme le syndrome hémolytique urémique pouvant provoquer la mort. Il s'agit d'agents zoonotiques dont le réservoir principal est le bovin et les autres ruminants. Les principaux modes de transmission des infections à STEC à l'homme sont la consommation d'aliments contaminés (viande de boeuf peu cuite, produits laitiers non pasteurisés), la transmission de personne à personne, l'ingestion d'eau contaminée et le contact avec des animaux (notamment les bovins) et leur environnement. Plus particulièrement, la souche de STEC du sérotype O157:H7 est responsable d'épidémies dans le monde entier. De nombreuses méthodes de diagnostic ont été développées pour identifier ce pathogène à partir des aliments. Elles regroupent des méthodes de bactériologie classique, des méthodes immunologiques et des méthodes moléculaires. Des mesures d'hygiène sont particulièrement importantes pour éviter la contamination des animaux à la ferme et celle de la viande à l'abattoir. Enfin, des modèles d'évaluation du risque ont été développés notamment afin de modéliser le comportement des STEC dans l'aliment. Bien que E. colt 0157 soit le STEC le plus courant, d'autres souches sont fréquemment impliquées dans les pathologies humaines. Parmi ces souches, on peut citer 026, 0103, 0111 et 0145. Peu de laboratoires réalisent des tests pour détecter ces STEC non-0157 en raison du manque de méthodes standardisées et du coût des équipements complexes nécessaires pour la réalisation de tels tests, tels que les méthodes modernes de PCR. Parmi les milieux d'isolement de l'art antérieur, on peut citer le milieu MacConkey au sorbitol (SMAC) qui a été développé pour isoler les souches 0157 négatives au sorbitol. Cependant, les souches non-0157 ou les souches 0157 positives au sorbitol ne peuvent pas être isolées en utilisant ce milieu. Des modifications du milieu SMAC ont été proposées et permettent essentiellement d'augmenter la sélectivité des E. col/ 0157 négatives au sorbitol en utilisant des inhibiteurs et/ou des antibiotiques comme CT-SMAC dans lequel du potassium de tellurite et du cefixime sont ajoutés au milieu SMAC, et le milieu CR-SMAC, dans lequel le cefixime et le rhamnose sont ajoutés au milieu SMAC pour améliorer efficacité d'isolement de souches 0157. Les méthodes de l'art antérieur utilisant un milieu pour l'isolement de souches STEC non-0157 comprennent un ou plusieurs sucres ou alcools. De tels milieux ne permettent cependant pas d'obtenir une sensibilité suffisante et donnent également lieu à de faux positifs ce qui limite la fiabilité des résultats. Il est donc important de disposer d'outils et de procédés de détection de ces bactéries qui combinent à la fois une bonne spécificité et sélectivité, et surtout une grande facilité d'usage de façon à pouvoir autant que possible simplifier les tests, les faire rapidement et en grand nombre, voire les automatiser, dans une perspective de contrôle de l'hygiène alimentaire et/ou hospitalière, tout en permettant de différencier rapidement différentes souches STEC. Il existe donc un réel besoin de disposer d'une technique de détection plus simple, plus spécifique, plus directe et moins coûteuse et permettant de différencier différentes souches de STEC tout en évitant de combiner plusieurs tests générant un délai supplémentaire pour l'obtention des résultats et augmentant le risque de contaminations parasites ou d'erreur ainsi que le risque de la diffusion de la bactérie. De manière surprenante et inattendue, l'Inventeur a montré que l'utilisation de tellurite et d'un chromogène, permet, d'isoler rapidement les STEC de façon sensible et spécifique. En particulier, lorsqu'il est mis en oeuvre sur un milieu solide gélosé, le procédé de détection développé par l'Inventeur est réalisable directement, par exemple à partir d'un échantillon alimentaire ou issu d'un patient, sans nécessiter d'étape d'isolement préalable des différentes souches présentes dans cet échantillon. En particulier, le procédé selon l'invention peut être appliqué à la détection de souches STEC choisie dans le groupe constitué des souches 026, 0103, 0111, 0145 et 0157, et encore préférentiellement dans le groupe constitué des souches 026, 0103, 0111 et 0145. Un objet de la présente invention consiste donc en un procédé de détection directe de bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines dans un échantillon comprenant les étapes successives : a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant du tellurite et au moins un agent chromogène, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines, et c) de détection des colonies de bactéries Escherichia col/ producteurs de Shigatoxines formées sur ledit milieu de culture. Avantageusement, le procédé selon la présente invention comprend en outre une étape d) permettant de conclure à la présence ou non d'une souche particulière de bactéries en fonction de la couleur des colonies formées. Il s'agit par conséquent d'une étape d) d'identification de souche STEC dans ledit échantillon. Par rapport aux procédés antérieurs, le procédé développé par l'Inventeur permet une détection directe et rapide des bactéries Escherichia col/ producteurs de Shigatoxines (STEC). Par « échantillon biologique », on entend tout type de prélèvement microbiologique, tel que par exemple un prélèvement de matières alimentaires (produits laitiers, viande, etc.), un prélèvement de sol, un prélèvement sur un mammifère (peau, muqueuses, etc.), de préférence l'homme, ou l'un de ses dérivés comme une préculture issue d'un tel prélèvement. Avantageusement, ledit échantillon biologique est un échantillon biologique liquide, comme de la salive, du sang ou de l'urine, un échantillon biologique solide, comme des fèces ou un produit alimentaire, ou encore un dérivé d'un échantillon biologique liquide ou solide tel qu'une pré-culture d'un tel échantillon biologique liquide ou solide. Avantageusement encore, ledit échantillon biologique comprend différents microorganismes, lesquels peuvent appartenir à des espèces voire à des genres distincts. À titre d'exemple, ledit échantillon biologique comprend au moins deux microorganismes différents, de préférence d'au moins cinq microorganismes différents et, de manière particulièrement préférée, d'au moins dix microorganismes différents. Par « milieu de culture », on entend un milieu permettant la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter. Ledit milieu de culture comprend en effet les nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter. Par « nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter », on entend la composition d'un milieu de base nécessaire à ladite croissance. L'homme du métier connaît parfaitement la composition de tels milieux et est à même de l'adapter si nécessaire en fonction de la spécificité de certains microorganismes ou de contraintes qui pourraient être liées à certains cas de la présente invention (transparence du milieu par exemple). Ces nutriments sont notamment choisis dans le groupe comprenant du carbone, de l'azote, du soufre, du phosphore, des vitamines, des inducteurs de croissance, des hydrates de carbone, des sels (par exemple calcium, magnésium, manganèse, sodium, potassium), des complexes nutritifs (par exemple des acides aminés, du sang, du sérum, de l'albumine) ainsi que des peptones et des extraits de tissus animaux et végétaux. Le milieu de culture utilisé dans le cadre de la présente invention pour la détection des souches STEC, et qui constitue un autre objet selon la présente invention, peut être sous forme solide, semi-solide, liquide ou lyophilisée. De préférence, ledit milieu de culture est un milieu gélosé, lequel milieu de culture est, à titre d'exemple, à base d'agar. Parmi les présentations des milieux de culture utilisables, on peut ainsi citer les boîtes de Pétri sur lesquelles se développent des microorganismes. Les milieux de culture selon la présente invention peuvent éventuellement contenir un ou plusieurs agents antimicrobiens, en particulier un ou plusieurs antibiotiques et/ou un ou plusieurs antifongiques. Le ou lesdits agents antimicrobiens permettent de limiter la croissance de microorganismes autres que ledit au moins un microorganisme spécifique à détecter. La quantité efficace d'agent antimicrobien à utiliser peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. Par «mise en culture », on entend l'inoculation dudit milieu de culture par tout ou partie de l'échantillon biologique et incubation dudit milieu de culture inoculé. L'homme du métier adaptera les conditions d'incubation en fonction du milieu de culture, de l'échantillon biologique et du microorganisme spécifique à détecter en fonction de ses connaissances générales. L'étape d'incubation peut être réalisée à une température d'environ 30°C à 43°C, de préférence 37°C, et ce pendant une durée d'environ 18 à 24 h. Cependant, en fonction des moyens dont il disposera, l'homme du métier pourra adapter la température et la durée de cette étape d'incubation au regard de ses connaissances générales. Par « procédé de détection directe », on entend un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon, de préférence un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement de chacune des souches bactériennes présentes dans l'échantillon. En effet, le procédé selon l'invention permet d'éviter l'étape d'isolement de colonies de bactéries candidates pouvant ensuite être soumises à un test plus précis de confirmation de la propriété STEC. Il s'applique donc à un échantillon brut comprenant un mélange de bactéries. De préférence, le tellurite compris dans ledit milieu est sous forme de tellurite de potassium. Par « agent chromogène », on entend un composé portant un chromophore précipitant libéré après une hydrolyse par une enzyme spécifique. Le chromophore ainsi libéré donne sa couleur aux colonies comprenant ladite enzyme. Par exemple, parmi les enzymes dont l'activité est utilisable dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment : l'alpha-galactosidase, la beta-D-glucuronidase, la beta-D-galactosidase, la C8-esterase, la beta-Glucosidase et la beta-Glucosaminidase, de préférence ladite enzyme est la beta-Glucosidase. Avantageusement, le milieu selon la présente invention comprendra au moins agent chromogène sensible à l'activité de la beta-Glucosidase et au moins une autre enzyme choisie parmi l'alpha-galactosidase, la beta-D-glucuronidase, la beta-D-galactosidase, la C8-esterase, et la beta-Glucosaminidase, de préférence l'alphagalactosidase. De façon préférée, le milieu selon la présente invention comprendra au moins agent chromogène sensible à l'activité de la beta-Glucosidase et au moins agent chromogène sensible à l'activité de l'alpha-galactosidase. De préférence, le milieu selon la présente invention comprendra du désoxycholate, de manière davantage préférée du désoxycholate de sodium. Avantageusement, la concentration de tellurite dans le milieu selon la présente invention est comprise entre 0,5 et 10 mg/L, préférablement entre 1 et 5 mg/L et encore préférentiellement d'environ 2,5mg /L. Avantageusement, la concentration de chromogène(s) dans le milieu selon la présente invention est comprise entre 10 et 300 mg/L, préférablement entre 20 et 200 mg/L et encore préférentiellement d'environ à 100 mg/L. La quantité efficace de tellurite et de chromogène(s) dans le milieu selon la présente invention pourra être simplement ajustée par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales et des résultats décrits dans les exemples ci-après. Les conditions d'incubation permettant la croissance de souches STEC sont bien connues de l'homme du métier et ne sont pas différentes de celles des méthodes traditionnelles. On peut par exemple choisir comme milieu de culture utilisé dans le procédé selon la 10 présente invention un milieu CHROMagarTM Orientation (Société CHROMagar, Paris - France) additionné de tellurite et de désoxycholate. Un autre objet de l'invention porte sur l'utilisation d'un milieu de culture tel que décrit précédemment pour la détection et la différenciation directes de souches STEC. 15 L'exemple qui suit est fourni à titre d'illustration et ne saurait limiter la portée de la présente invention. EXEMPLE Détection directe de bactéries Escherichia col/ producteurs de Shigatoxines à l'aide 20 d'un milieu selon la présente invention : Différents échantillons contenant des suspensions de bactéries sont étalés directement sur boîte de Pétri comprenant un milieu gélosé comprenant: Peptone et Extrait de levure 8 g/L ; NaC15 g/L ; 25 Agar 15 g/L ; X-glucoside 0,01 g/L ; Mag-alpha-galactoside 0,01 g/L ; Désoxycholate de sodium 1 g/L ;et Tellurite 0,0025 g/L . Après incubation pendant 18 à 24 heures, l'analyse visuelle des boîtes de Pétri permet d'identifier directement celles comprenant des souches STEC. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 suivant : Souche isolée Coloration Taille des colonies en mm E.coli 0157 H7 Mauve 1,5 E.coli 026 Mauve 1,5 E.coli 0103 Mauve Irrégulière E.coli 0111 Mauve 1 Klebsiella pneumoniae ND20 Bleu 2 Proteus AR3919 Vert 0,5 Enterobacter cloacae ND36* - - E.coli AR3740* - Proteus AR5075 Marron 0,8 * Souches dont la croissance est inhibée Tableau 1 Ainsi, le procédé selon l'invention permet, en une seule étape de culture, de détecter spécifiquement et de différencier les bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines, sans nécessité d'une étape préalable d'isolement ni étape ultérieure de différenciation. REVENDICATIONS1. Procédé de détection directe de bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines dans un échantillon comprenant les étapes successives: a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant du tellurite et au moins un agent chromogène, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines, et c) de détection des colonies formées sur ledit milieu de culture correspondant aux bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines sont choisies dans le groupe constitué des souches 026, 0103, 0111, 0145 et 0157. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit procédé ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon. 4. Milieu de culture, susceptible d'être mis en oeuvre dans un procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Milieu de culture selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est un milieu de culture gélosé. 6. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que ledit agent chromogène est sensible à l'activité d'au moins une enzyme choisie parmi l'alpha-galactosidase, la beta-D-glucuronidase, la beta- D-galactosidase, la C8-esterase, la beta-Glucosidase et la beta-Glucosaminidase. 7. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il est gélosé. 8. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend du tellurite à une concentration comprise entre 0,5 et 10 mg/L, préférablement entre 1 et 5 mg/L et encore préférentiellement d'environ 2,5mg /L. 9. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend ledit chromogène à une concentration comprise entre 10 et 300 mg/L, préférablement entre 20 et 200 mg/L. 10. Utilisation d'un milieu de culture tel que défini selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, pour la détection et la différenciation directes de bactéries Escherichia coli producteurs de Shigatoxines.