Brevet FR2951353A1 — publié le 20110422

Moyens pour induire l'apomixie chez les plantes cultivées à reproduction sexuée et utilisation pour la production de plantes totalement ou partiellement apomictiques. L'invention a pour objet des moyens pour réguler le développement reproducteur chez les plantes cultivées. Plus particulièrement, l'invention a pour objet le développement de plantes se reproduisant totalement ou partiellement par apomixie gamétophytique, c'est-à-dire de manière asexuée par l'intermédiaire de graines. L'apomixie gamétophytique est une forme de reproduction asexuée par graine. Elle existe chez de nombreuses angiospermes, et près de 400 espèces apomictiques ont été recensées. On ne trouve cependant pas de plantes apomictiques chez les principales céréales cultivées (maïs, blé, ou riz), mais uniquement chez des plantes sauvages, quelque espèces fourragères cultivées, et certaines espèces fruitières. L'apomixie est un mécanisme contrôlé génétiquement. Les plantes apomictiques développent les gamètes femelles sans méiose préalable. Les gamètes ainsi formés contiennent un génome identique à celui des tissus somatiques dont ils sont dérivés. Le développement de l'embryon à partir de ces gamètes se fait sans fécondation par un gamète mâle, c'est à dire par parthénogenèse. Le génome de l'embryon ainsi formé est donc strictement identique à celui de sa plante mère, sans contribution paternelle. L'apomixie est donc un mode de clonage par graine qui assure la perpétuation à l'identique des génotypes au travers des générations. L'utilisation de l'apomixie de manière contrôlée chez les espèces cultivées offre de nombreuses applications potentielles. Ces applications concernent la propagation de génotypes instables, le contrôle des contaminations polliniques, les méthodes d'amélioration des plantes, et les méthodes de production commerciale de graines. Aucune des ces applications n'est envisageable chez les principales espèces cultivées telles le blé, maïs, riz, et autres sur la base des technologies actuelles. On ne connaît en effet pas de formes apomictiques chez ces différentes espèces, et on ne connaît aucun système génétique qui permette d'induire de l'apomixie chez des plantes sexuées. De nombreux laboratoires se sont attachés, au cours des années passées, à développer des plantes apomictiques, soit en tentant de transférer les déterminants de l'apomixie depuis des plantes sauvages vers des plantes cultivées, soit en induisant par mutagenèse des phénotypes apomictiques chez des plantes sexuées. Aucune de ces deux approches n'a produit de génotype apomictique chez une espèce où ce mode de reproduction n'existait pas antérieurement. Des résultats publiés récemment dans la revue Nature (Ravi, M., Marimuthu, M.P., and Siddiqi, I. (2008). Gamete formation without meiosis in Arabidopsis. Nature 451: 1121-1124.), montrent chez Arabidopsis que l'inactivation d'un gène impliqué dans la méiose, appelé DYAD, dont la fonction est de réguler la cohésion des chromatides durant la méiose, permet de produire environ 0,1% de gamètes qui échappent à la méiose. Le reste des gamètes, et donc 99,9% des descendances, sont stériles. Il est même probable que la fréquence de gamètes non-méiotiques ne soit pas significativement différente chez ces plantes mutantes de celle chez des plantes sexuées, et que ces gamètes n'apparaissent en fait à l'observation que parce que la mutation tue par ailleurs tous les gamètes normalement issus de sexualité. Un autre travail récent (Erfurth, I., Jolivet, S., Froger, N., Catrice, O., Novatchkova, M., and Mercier, R. (2009). Turning meiosis into mitosis. PLoS Biol. 7: e1000124), montre qu'il est possible, chez Arabidopsis, de changer la division méiotique en division mitotique par l'inactivation simultanée de trois gènes impliqués dans la méiose (osdl/Atspoll-1/Atrec8). Le triple mutant produit des gamètes diploïdes fonctionnels. Ces gamètes sont cependant fécondés, les descendances ne sont donc pas apomictiques, et on ne sait pas si ce résultat est transposable chez d'autres espèces qu'Arabidopsis. Les travaux des inventeurs dans le domaine ont montré qu'il est possible d'induire un phénotype tout ou partiellement apomictique chez le maïs en manipulant l'expression de gènes particuliers. Les graines produites échappent à la réduction méiotique et sont fertiles. Ces résultats s'appliquent avantageusement aux autres plantes cultivées telles que le riz ou le blé. L'invention vise donc l'utilisation de séquences de nucléotides spécifiques dont la manipulation permet le développement de plantes cultivées telles que maïs, riz et blé et se 30 reproduisant totalement ou partiellement par apomixie gamétophytique. Elle a également pour but de fournir une méthode de production de plantes apomictiques. Selon encore un autre aspect, l'invention vise à utiliser de manière contrôlée l'apomixie chez des espèces cultivées à reproduction sexuée pour développer de nombreuses applications comme il sera exposé ci-après. L'invention vise ainsi, pour la production de plantes partiellement ou totalement apomictiques, l'utilisation d'un gène de la famille Argonaute, d'un transcript de ce gène ou de son ORF. Il s'agit plus spécialement d'un gène de la famille Argonaute codant pour une protéine 10 de séquence SEQ ID N°1. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un gène de la famille Argonaute répondant à la séquence SEQ ID N°2 ou du transcrit d'un tel gène répondant à la séquence SEQ ID N°3, ou de l'ORF de séquence SEQ ID N°4. Dans l'utilisation selon l'invention, le gène défini ci-dessus est inactivé par mutagénèse. Une telle inactivation permet la formation de gamètes d'origine apoméiotique. Les 20 plantes dont la protéine est inactive se reproduisent de manière apoméiotique. L'invention vise également une méthode de production d'une plante apoméiotique, comprenant l'insertion aléatoire dans le génome de la plante d'un élément transposable, par exemple de type Mutator, et l'identification du locus muté. L'utilisation de l'apomixie de manière contrôlée chez les espèces cultivées offre de nombreuses applications potentielles. Elles concernent la propagation de génotypes instables, le contrôle des contaminations polliniques, les méthodes d'amélioration des plantes, et les méthodes de production commerciale de graines. La première application concerne la propagation clonale, par graine, de génotypes génétiquement instables. C'est le cas en particulier de toutes les plantes hybrides; ces plantes hybrides produisent, par brassage génétique au cours de la méiose et de la fécondation des descendances qui sont différentes entre elles, et différentes de leur plante mère. C'est encore le 15 25 30 cas des espèces cultivées présentant des niveaux de ploïdie instables en méiose, comme les formes triploïdes. Chez certaines espèces cultivées, il faut, pour maintenir un haut niveau de pureté génétique, contrôler rigoureusement la pollinisation, pour éviter une contamination par du pollen issu de champs voisins, plus ou moins éloignés, le pollen pouvant se déplacer sur des distances assez variables, fonctions de l'espèce, des conditions climatiques, ou des vecteurs de dissémination comme les insectes. Dans le cas de plantes apomictiques, cependant, le génome issu des gamètes mâles ne participe pas à la génération suivante. L'utilisation de plantes apomictiques permettrait donc de s'affranchir des risques de contamination. L'apomixie est donc une méthode totalement unique de contrôle de pureté génétique. C'est aussi potentiellement une méthode efficace pour éviter les flux indésirables de transgènes dans le cas de culture d'organismes génétiquement modifiés. L'apomixie offre aussi de nouvelles perspectives en amélioration des plantes. Elle permettrait en effet d'utiliser comme variété nouvelle tout génotype sélectionné comme intéressant, dès lors qu'il s'agit d'un critère génétiquement déterminé, quelle qu'en soit la structure génétique, puisque celui-ci, dès lors qu'il est apomictique, devient génétiquement stable. On peut donc envisager de développer des variétés directement à partir de formes hybrides, éventuellement interspécifiques, en s'affranchissant des étapes de stabilisation actuellement nécessaires, comme les étapes d'autofécondation successives, ou la production d'haploïdes doublés. Cette méthode permet donc un gain de temps considérable, mais ouvre aussi la porte à l'introduction de matériels génétiques totalement nouveaux dans les programmes de sélection, et en particulier de matériels génétiques qui, chez des plantes sexuées, induisent une forte stérilité. C'est le cas par exemple de la plupart des croisements interspécifiques. Une application très importante concerne la production de graines hybrides. Telle qu'elle se pratique aujourd'hui, celle-ci implique l'hybridation contrôlée à large échelle d'écotypes parentaux génétiquement stables. Il s'agit généralement de lignées homozygotes, obtenues par différentes méthodes (production d'haploïdes doublés, autofécondations...). L'un des deux parents est utilisé comme mâle, l'autre comme femelle. Seules les femelles produisent les graines commerciales. Le rendement des parcelles de production de semences est généralement faible comparativement aux hybrides, pour trois raisons: (1) les lignées mâles sont nécessaires mais utilisent une part importante de l'espace sans produire de graines; (2) les lignées parentales ont généralement un rendement très inférieur aux hybrides du fait de la dépression de consanguinité ; (3) le contrôle des pollinisations implique la castration physique ou génétique des lignées utilisées comme femelle, un processus qui entraîne une perte de rendement importante. Dans le cas de plantes apomictiques, cependant, on pourrait envisager de produire les graines directement à partir d'hybrides, donc avec des rendements très supérieurs, en utilisant 100% de la surface disponible, sans nécessité de contrôler la pollinisation, et sans étape de castration. L'intérêt d'utiliser l'apomixie pour la production de graine est très significatif chez les espèces comme le maïs, ou l'on produit déjà des formes hybrides, pour des raisons de diminution de coûts, mais aussi chez les espèces autogames, comme par exemple le blé ou le riz, où les hybridations contrôlées à large échelle sont difficiles. La production de quelques plantes hybrides apomictiques serait suffisante pour initier la production à large échelle de graines hybrides, génétiquement stables. Les plantes partiellement ou totalement apomictiques d'espèces cultivées telles que le maïs, riz et blé, caractérisées en ce qu'elles comportent dans leur génome, un gène ou un ORF de séquence SEQ ID N°2 ou 4, respectivement, inactivé, ou le transcript de gène inactivé, entrent également dans le champ de l'invention. Les graines obtenues à partir de plantes hybrides apomictiques telles que définies ci- dessus sont également couvertes par l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés à titre illustratif dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 5, qui représentent, 25 respectivement, - les figures lA à 1C, les résultats relatifs à l'identification de plantes apoméiotiques chez le maïs par une crible génétique ; - la figure 2, les résultats de l'analyse cytologique du mutant FNR4 ; - la figure 3, l'arbre phylogénétique de la famille multigénique comprenant le mutant 3 0 FNR4 ; - la figure 4, la structure du gène FNR4 et les sites d'insertions des éléments transposables dans les différents allèles disponibles ; et - la figure 5, le profil d'expression de FNR4 . DEFINITIONS «Apomixie gamétophytique» se réfère à une forme de reproduction asexuée par graines dans laquelle les gamètes produits dans les gamétophytes femelles n'ont pas subi de réduction méiotique, et présentent donc la même ploïdie et la même constitution génétique que la plante mère. L'apomixie gamétophytique implique deux étapes successives: apoméiose et parthénogenèse. «L'apoméiose» correspond aux mécanismes par lesquels les plantes apomictiques échappent à la méiose. la «parthénogenèse» correspond au développement des embryons sans fécondation et sans contribution génétique paternelle. EXEMPLE 1 : Identification de plantes apoméiotiques par un crible génétique ciblé 15 Les résultats obtenus sont illustrés dans les figures IA à IC : Pour identifier des plantes apoméiotiques, une population de mutagénèse basée sur des éléments transposables de type Mutator, dans un fond génétique diploïde a été construite (Figure 1A). Le crible se base sur la réponse de l'albumen à une divergence dans les niveaux 20 de ploïdie respectifs des gamètes mâles et femelles. Lorsque chez une plante de maïs sauvage, une femelle diploïde est croisée par un mâle tétraploïde, il en résulte un avortement précoce du développement de l'albumen, et donc de la graine. 25 Les résultats obtenus sont illustrés dans la Figure I B. Lorsque les gamètes sont au même niveau de ploïdie (haploïdes tous les deux, ou diploïdes tous les deux), la graine se développe normalement. Dans ce crible, une plante tétraploïde a été utilisée comme mâle, et 15000 plantes mutagénisées comme femelles. La recherche à porté sur les plantes qui, du fait 30 de l'absence de réduction méiotique induite par mutation, produisent des gamètes eux-mêmes diploïdes, et donc en équilibre avec la contribution génomique des gamètes miles diploïdes produits par le pollinisateur. Dans ce crible, la très grande majorité des plantes présentaient la réponse attendue, c'est à dire d'avortement du développement de la graine. Dans le cas du mutant fnr4 (Female Non Reduction 4), cependant, le croisement avec un testeur tétraploïde10 conduit à la formation de graines normalement développées. En analysant ces graines normalement développées, par une analyse classique de cytométrie de flux (Figure 1 C), on vérifie que l'embryon de ces graines présente un génome tétraploïde, donc issu de la fusion de deux gamètes diploïdes. Les plantes mutantes produisent donc bien des gamètes apoméiotiques. L'analyse cytologique du mutant fnr4, rapportée sur la Figure 2, indique que l'échec de la méiose résulte d'un défaut de condensation des chromosomes au cours de la méiose et la désorganisation qui en résulte du réseau de microtubules constituant le fuseau meiotique. L'image est obtenue par immunolocalisation d'une part d'un anticorps spécifique contre la tubuline beta, révélée par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (visible en vert), et par un marquage de l'ADN au iodure de propidium (visible en rouge). W23 est une lignée sauvage. EXEMPLE 2 : Identification de la fonction altérée chez les plantes mutantes Le phénotype apoméiotique du mutant FNR4 découlant de l'insertion aléatoire d'un élément transposable de type Mutator dans le génome, la séquence, connue, des éléments Mutator a été utilisée pour identifier le locus muté par une classique analyse de co-ségrégation entre le phénotype et les sites d'insertion des différents éléments Mutator. Une séquence candidate a ainsi pu être identifiée et clonée. L'analyse de trois mutations indépendantes dans le même gène, toutes issues d'insertions d'éléments transposables, montre un phénotype identique. Le locus identifié correspond donc bien à celui responsable du phénotype apoméiotique. La comparaison de la séquence du locus aux bases de données publiques permet d'associer une fonction biologique à ce gène. Il apparaît sans ambiguïté comme appartenant à une famille multigénique, comprenant une vingtaine de loci, tous identifiés comme codant pour des protéines de type Argonaute. Les séquences du gène (génomique, transcript et cadre de lecture) correspondent respectivement aux séquences SEQ ID N° 2, 3 et 4 et celle de la protéine correspondante à SEQ ID N°1. Un arbre phylogénétique comparant la séquence protéique de FNR4 et celle des autres Argonautes connus chez le maïs et chez Arabidopsis est présentée Figure 3. Elle inclue les membres connus chez Arabidopsis (AGO00X) et le maïs (AGO10X). La position dans cet arbre du gène MEL 1, un autre gène Argonaute, décrit chez le riz comme impliqué dans la régulation de la méiose est également indiquée. Le phénotype d'un mutant mell est très différent de fnr4, mais il est important de noter que c'est par ailleurs un Argonaute clairement distinct. La Figure 4 donne la structure du gène FNR4 et les sites d'insertions des éléments transpostables dans les différents allèles disponibles. EXEMPLE 3 : Profil d'expression du gène et de la protéine chez les formes sauvages, les mutants apoméiotiques, et les plantes apomictiques. La méthode de RT-PCR a été utilisée pour analyser le profil d'expression du gène. Les résultats montrent que le gène est exprimé de manière constitutive dans tous les tissus analysés (feuilles, pollen mature, ovules pré-méiotiques, ovules au cours de la méiose, ovules au cours de la gamétogenèse, ovules matures avant fécondation). En utilisant des peptides de synthèse dessinés sur la base de la séquence de la protéine, des anticorps spécifiques de séquences SEQ IDN°5 et SEQ ID N°6 permettant de visualiser par Western Blot la présence de la protéine sur des extraits échantillonnés à différentes étapes de développement ont été générés. La détection de l'anticorps par immuno-detection, est illustrée Figure 5, A : Expression chez le maïs des transcrits de la protéine. La spécificité de l'anticorps utilisé est validée par l'utilisation de lignées mutantes. B : localisation tissulaire de la protéine, limitée à la partie basale du sac embryonnaire mature ; détection par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (en vert). ADN révélé en bleu. L'examen de la Figure 5A montre une bande de taille attendue sur la base de la séquence protéique, environ 100kD. La protéine détectée, contrairement à l'ARN, ne se retrouve que dans les ovules, avant et pendant la méiose. Une présence résiduelle est visible dans les ovules post-méiose, mais aucune protéine n'est détectée dans les autres tissus de la plante. La spécificité de l'anticorps pour la protéine du locus FNR4 a été vérifiée en testant en parallèle la présence de la protéine sur des ovules de plantes mutantes. Le signal de l'anticorps disparaît totalement chez les mutants, ce qui indique une excellente spécificité. Cela montre par ailleurs que les plantes mutantes correspondent bien à une perte de fonction. Des techniques d'immunolocalisation ont ensuite été utilisées pour étudier la localisation de la protéine au niveau tissulaire. Les résultats, illustrés Figure 5B, indiquent que la protéine est localisée exclusivement dans les cellules reproductrices de l'ovule. Le gène est donc exprimé de manière constitutive dans la plante, mais régulé post transcriptionellement, la protéine correspondante présentant un profil d'expression exclusif des cellules reproductrices. Le profil d'expression du gène dans des écotypes apomictiques hybrides entre maïs et Tripsacum a également été étudié. Ces plantes hybrides apomictiques, obtenues en croisant des plantes de maïs sexuées et des Tripsacum apomictiques, présentent le génome des deux espèces dans un même cytoplasme. En utilisant des amorces capables de détecter à la fois les allèles de maïs et de Tripsacum; on vérifie le profil d'expression du gène dans les tissus somatiques et reproducteurs de ces plantes. On constate que les transcripts détectés par RTPCR sont absents des formes apomictiques. REVENDICATIONS1 - Utilisation pour produire des plantes partiellement ou totalement apomictiques d'un gène de la famille Argonaute, d'un transcript de ce gène ou de son ORF. 2 û Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le gène de la famille Argonaute code pour une protéine de séquence SEQ ID N°1. 3- Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le gène de la famille Argonaute répond à la séquence SEQ ID N°2. 4 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit transcript répond à la séquence SEQ ID N°3. 5 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit ORF répond à la 15 séquence SEQ ID N°4. 6 û Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le gène est inactivé par mutagénèse. 20 7 û Méthode pour induire dans les espèces cultivées telles que maïs, riz ou blé un phénotype tout ou partiellement apomictique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'insertion aléatoire dans le génome de la plante d'un élément transposable, par exemple de type de Mutator, et l'identification du locus muté. 25 8 û Application de la méthode selon la revendication 5, pour la propagation de génotypes instables, le contrôle de contaminations polliniques, l'amélioration des plantes et la production commerciale de graines. 9 û Plantes totalement ou partiellement apomictiques d'espèces cultivées telles que 30 maïs, riz ou blé, caractérisé en ce qu'elles comportent dans leur génome, un gène inactivé de séquence SEQ ID N° 2, un transcript de ce gène de séquence SEQ ID N° 3 ou un ORF de ce gène de séquence SEQ ID N°4. û Graines obtenues à partir de plantes hybrides apomictiques. 10