Brevet FR2953719A1 — publié le 20110617

NOUVELLES APPLICATIONS THERAPEUTIQUES D'UN COMPLEXE D'ALPHACETOGLUTARATE ET D'ORNITHINE La présente invention a pour objet de nouvelles applications thérapeutiques d'un complexe d'alpha-cétoglutarate et d'ornithine. De nombreuses situations de stress telles que les traumatismes chirurgicaux ou les chocs septiques induisent un hypercatabolisme protéique c'est-à-dire une dégradation anormalement exagérée des protéines de l'organisme dont le réservoir essentiel est représenté par les muscles. Par ailleurs, dans ces situations, des modifications du métabolisme de certains acides aminés, tels que la glutamine, sont également observés. En situation catabolique, la glutamine est considérée comme conditionnellement essentielle car sa synthèse endogène n'est pas suffisante pour couvrir les besoins accrus de l'organisme. Or la glutamine a de nombreuses actions sur le métabolisme protéique et l'hypercatabolisme observé pourrait être, en partie, la conséquence d'altération du métabolisme de la glutamine (Boelens et al. (2001), J. Nutr.131 :2569S-2577S, brevet FR 3.533 M). Enfin, l'administration intraveineuse de glutamine sous forme de di-peptide permet de restaurer la concentration intramusculaire de cet acide aminé (Fürst P. et al. (1987) Contr. Infusion Thér. Clin. Nutri. 17, 117-136). Toutefois la glutamine sous forme libre est difficilement utilisable pour un usage clinique : la glutamine est faiblement soluble en solution et lors d'une filtration stérilisante, elle peut former du pyroglutamate et de l'ammoniac qui sont potentiellement neurotoxiques. Cependant, il est essentiel de préserver la glutaminémie en situation d'agression L'ornithine est connue pour ses propriétés sécrétagogues (hormone de croissance et insuline), pour stimuler la croissance cellulaire et la synthèse protéique et limiter le catabolisme protéique. Elle est en particulier utilisée sous forme d'alpha-cétoglutarate d'ornithine (ACO), notamment pour améliorer le métabolisme protéique et le bilan azoté de sujets dénutris ou en situation traumatique (brevet FR 1 424 480). La demande internationale WO 99/47134 décrit l'utilisation des complexes comprenant un céto-acide et un ou deux acides aminés naturels, en particulier le complexe d'alpha-cétoglutarate d'ornithine et de glutamine (GLACO) et leur utilisation dans le traitement des douleurs associées aux pathologies du tube digestif, de la vessie et des voies biliaires dans lesquelles sont impliqués les neurones silencieux. GLACO diminuerait ces douleurs à partir d'une dose de 1 mg/kg p.o. La demande internationale WO 02/078676 décrit des compositions gastro-résistantes contenant des complexes comprenant un céto-acide et un ou deux acides aminés naturels et leur utilisation dans différentes pathologies. Ces compositions présentent un goût amélioré du fait de l'enrobage. Bien que GLACO soit cité parmi les nombreux complexes possibles, aucun résultat n'est donné pour ce complexe particulier, les seuls résultats présentés concernant ACO. Or les inventeurs ont découvert de manière surprenante que le complexe d'alpha-cétoglutarate d'ornithine et de glutamine présente un effet très supérieur à celui du complexe d'alpha-cétoglutarate d'ornithine sur le bilan azoté dans un modèle pathologique d'état hypercatabolique. Aussi la présente invention a-t-elle pour objet, un complexe de glutamine et d'alpha- cétoglutarate d'ornithine (GLACO) pour son utilisation dans le traitement de patients souffrant de troubles liés à une diminution des concentrations plasmatique et/ou musculaire de glutamine, lesdits patients étant choisis dans le groupe comprenant : - les traumatisés crâniens, - les personnes ayant eu un accident vasculaire cérébral, - les personnes ayant subi une greffe de moelle ou conditionnées en vue de cette thérapeutique, - les personnes en réanimation, - les personnes souffrant de fractures, - les personnes souffrant des effets de la radiothérapie, - les personnes en situation pré-opératoire de chirurgie, - les personnes en continuation post-opératoire d'une nutrition préopératoire et - les personnes âgées dénutries. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le complexe est un complexe équimolaire de glutamine et d'alpha-cétoglutarate d'ornithine. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le complexe peut se présenter sous toute forme administrable par voie orale ou parentérale, notamment sous forme de sachets, de cachets, de gélules, de comprimés, de dragées, d'ampoules buvables, de solutés aqueux ou alcooliques, de sirops, de suspensions ou d'hydrosols. L'administration par voie entérale correspond notamment à une administration par sonde naso-gastrique ou nasointestinale, par gastrotomie ou jéjunostomie, par instillation directe dans un segment d'anastomose ou toute autre voie d'abord permettant une nutrition entérale, l'administration par voie parentérale correspond notamment à une administration par perfusion intraveineuse centrale, périphérique ou sous-cutanée. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le complexe est présenté pour une posologie journalière comprise entre 10 et 500 mg/kg de poids, avantageusement entre 14 et 300 mg/kg de poids. Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant un complexe de glutamine et d'alpha-cétoglutarate d'ornithine tel que défini précédemment en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable pour son utilisation dans le traitement de patients souffrant de troubles liés à une diminution des concentrations plasmatique et/ou musculaire de glutamine, lesdits patients étant choisis dans le groupe comprenant : - les traumatisés crâniens, - les personnes ayant eu un accident vasculaire cérébral, - les personnes ayant subi une greffe de moelle ou conditionnées en vue de cette thérapeutique, - les personnes en réanimation, - les personnes souffrant de fractures, - les personnes souffrant des effets de la radiothérapie, - les personnes en situation pré-opératoire de chirurgie, - les personnes en continuation post-opératoire d'une nutrition préopératoire et - les personnes âgées dénutries. Conformément à l'invention, les compositions pharmaceutiques peuvent également comprendre d'autres principes actifs choisis en fonction des maladies à traiter. Ainsi on peut citer à titre d'exemple d'autres acides aminés (tels que l'arginine, la leucine), des acides gras polyinsaturés, des vitamines hydrosolubles ou liposolubles, des minéraux (tels que le calcium, 25 le zinc et le sélénium) ou tout autre nutriment (tel que révérastrol, curcumine, lutérine, lycopène ou autres polyphénols) ou agent pharmacologique connu pour moduler le métabolisme protéique. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention, notamment lorsqu'elles sont sous forme de solutions aqueuses présentent des propriétés organoleptiques nettement améliorées 30 comparativement à celles contenant ACO. Les exemples 1 à 5 et les figures 1 et 2 qui suivent illustrent l'invention. La figure 1 représente l'excrétion urinaire d'azote cumulée mesurée selon l'exemple 1 chez des rats brûlés traités par GLACO ou ACO aux doses de 0,5 g/kg/j et de 5 g/kg/j ; * * p EXEMPLE 1: COMPARAISON DE L'EFFET SUR L'AZOTE DE LA 5 GLUTAMINE ET DE GLACO DANS UN MODELE DE RAT BRULE 1.1. Mode opératoire 1.1.1. Préparation du complexe 58,4 g (0,4 moles) de glutamine et 58,4 g (0,4 mole) d'acide alpha-cétoglutarique sont dissous dans 300 ml d'eau. On ajoute une solution d'ornithine à 40 % (117 ml ; 0,4 mole) puis 10 500 ml d'éthanol. On refroidit cette solution et on la laisse à -18 °C pour compléter la cristallisation. On collecte l'insoluble par filtration, lavage à l'acétone et séchage sous vide. On obtient 155 g d'un solide blanc (Rendement = 95 %). Les dosages des différents constituants effectués par chromatographie liquide haute 15 performance (CLHP) donnent la composition suivante : alpha-cétoglutarate : 1 ; ornithine : 0,91 et glutamine 1,13. 1.1.2. Test pharmacologique : Des rats mâles de souche Wistar de poids moyen 80-90 g ont été acclimatés à l'animalerie (température : 22+2 °C) pendant 3 jours en cage à métabolisme (croquette UAR 20 A03 ; 23,5 % d'azote), en cycle inversé 12 heures nuit/12 heures jour. A JO, les rats, exceptés les témoins, sont anesthésiés et brûlés par immersion du dos pendant 11 secondes dans de l'eau portée à 95 °C. Ils reçoivent immédiatement par voie intrapéritonéale 10 ml pour 100 g de poids d'une solution de chlorure de sodium à 0,9 % et sont ensuite replacés dans les cages à métabolisme. Ils sont privés de nourriture pendant 24 heures (JO à J1) avec un accès à l'eau 25 ad libitum. Ils reçoivent ensuite 3 gavages quotidiens de 210 Kcal/kg/j et 1,18 g d'azote/kg/j sous forme d'Osmolité de J1 à J3. En parallèle à cette nutrition, on administre aux animaux soit 0,5 g/kg/j de GLACO ou d'ACO, soit 5 g/kg/j de GLACO ou d'ACO correspondant respectivement à 0,066 g d'azote/kg/j et à 0,66 g d'azote/kg/j et représentant respectivement 5 et 36 % de l'apport azoté total. Les doses choisies sont celles pertinentes pour des rats 30 agressés. L'extrapolation à l'homme conduit à une dose 10 fois moins élevée. Les rats sont euthanasiés après 48 heures de nutrition. On mesure quotidiennement l'excrétion urinaire d'azote par chimioluminescence avec un détecteur Antek® et l'excrétion d'urée par dosage enzymatique à l'uréase. 1.2. Résultats L'excrétion d'azote cumulée au cours des jours J2 et J3 est représentée dans la figure 1. Le bilan azoté journalier est donné dans la figure 2. A la dose de 0,5 g/kg/j, GLACO diminue l'excrétion d'azote cumulée de manière 5 significative comparativement à ACO administrée à la même dose (figure 2). Le bilan azoté redevient positif dès J2 avec seulement 0,5 g/kg/j de GLACO alors qu'avec ACO, il faut 5 g/kg/j (figure 1). EXEMPLE 2: MESURE DES CONCENTRATIONS MUSCULAIRES DE 10 GLUTAMINE CHEZ LE RAT BRULE ù COMPARAISON ENTRE GLUTAMINE ET GLACO 1.1. Mode opératoire Le complexe est préparé comme indiqué dans l'exemple 1 et le modèle de rat brûlé est 15 celui décrit dans ce même exemple. Des animaux reçoivent 0,066 g d'azote/kg/j (5 % de l'apport azoté total) sous forme de GLACO, soit 0,5 g/kg/j du complexe GLACO ou sous forme d'un mélange glutamine et glycine (Gln + Gly) afin d'apporter la même quantité de glutamine (soit 0,17 g/kg/j) que dans le groupe recevant GLACO tout en restant isoazoté. 20 Parallèlement, des rats ont été soumis à la même nutrition entérale (Osmolyte®) supplémentée en un apport isoazoté de glycine. Ces rats sont soit soumis à une brûlure (lot Gly), soit ne le sont pas et constituent le groupe témoin. Les rats sont euthanasiés après 48 heures de nutrition. Les muscles extensor digitalorum longus (EDL) sont prélevés et congelés immédiatement dans l'azote liquide puis conservés à 25 ù 80 °C. Les échantillons sont broyés à 4 °C dans une solution d'acide trichloracétique 0,6 M contenant 0,5 mM d'EDTA à l'aide d'un UltraturraX . Après centrifugation les acides aminés sont dosés dans le surnageant par chromatographie liquide sur colonne échangeuse de cations sur un analyseur Biotronik LC 500. 30 .2. Résultats Ils sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 Lots (nombre de rats) Concentration musculaire en glutamine libre (µmole/g de muscle EDL) Témoin (n=4) 5,00 ± 0,37 Gly (n=6) 4,18 + 0,18 GLACO (n=4) 5,98 ± 0,18* Gln + Gly (n=5) 4,77 +0,53 10 * p EXEMPLE 3: MESURE DES CONCENTRATIONS MUSCULAIRES DE GLUTAMINE CHEZ LE RAT BRULE COMPARAISON ENTRE ACO ET 20 GLACO 3.1. Mode opératoire Un protocole identique à celui décrit dans l'exemple 2 est appliqué. Dans cette expérience un lot d'animaux reçoit de l'ACO à la dose de 0,5g/kg/j, c'est-à-dire à la même dose que GLACO. 25 3.2. Résultats Les résultats sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous. 6 30 Tableau 2 Lots (nombre de rats) Concentration musculaire en glutamine libre (µmole/g de muscle EDL) Témoins (n=9) 5,30+0,24 Gly (n=15) 4,44+0,23 ACO (n=15) 5,36+0,29** GLACO (n=9) 5,69+0,18*** ** p 10 EXEMPLE 4: MESURE DES CONCENTRATIONS MUSCULAIRES DE GLUTAMINE CHEZ LE RAT ENDOTOXEMIQUE û COMPARAISON ENTRE GLUTAMINE ET GLACO 4.1. Mode opératoire Des rats mâles de souche Wistar adultes de poids 163 ± 7 g ont été utilisés après 15 acclimatation pendant 3 jours en cage à métabolisme (croquettes UAR A03 ; 23,5 % d'azote), en cycle inversé 12 h nuit/12 h jour. A JO, les rats exceptés les rats témoins reçoivent une injection intra-péritonéale d'une endotoxine (lipopolysaccharide d'E. Coli sérotype 127 B:8) solubilisée dans du NaCl à 0,9 % à la dose de 3 mg/kg. Les témoins reçoivent seulement une injection intrapéritonéale de NaCl 20 sous le même volume. Les animaux sont euthanasiés et les muscles prélevés comme indiqué dans l'exemple 2. Le dosage de la glutamine musculaire est également réalisé selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 2. 4.2. Résultats Ils sont donnés dans le tableau 3 ci-dessous 25 Tableau 3 Lots (nombre de rats) Concentration en glutamine libre (µmol/g de muscle EDL) Témoin (n=4) 5,03+0,25 Gly (n=6) 4,68+0,10 GLACO (n=6) 5,45+0,25 * Gln +Gly (n=6) 4,90+0,56 * p EXEMPLE 5 : APPRECIATION DU CARACTERE ORGANOLEPTIQUE 6.1. Mode opératoire Deux solutions aqueuses à 10 % d'ACO et de GLACO sont préparées extemporanément. Elles sont présentées respectivement comme solution Y et X à 34 personnes (19 femmes et 15 hommes) recrutées pour tester les deux solutions. La répartition en fonction de l'âge et du sexe est donnée dans le tableau suivant : Age (ans) Femmes Hommes 20-30 n= 5 n= 5 30-40 n=8 n=7 40-50 n=1 n=1 50-60 n=5 n=2 TOTAL n=19 n=15 Les personnes ont été interrogées sur l'aspect et la couleur des solutions, sur leur odeur et sur leur saveur. Pour cette dernière caractéristique, chacune des quatre saveurs classiques 15 (sucré, salé, acide et amer) a été codée de 1 à 5 par ordre d'intensité croissante. 6.2. Résultats 6.2.1. Aspect et couleur 21 personnes ont préféré l'aspect plus limpide et la couleur jaune très pâle de la solution X( GLACO). 3 personnes ont préféré l'aspect plus liquoreux et la couleur jaune foncée de la 20 solution Y (ACO). 10 personnes n'ont montré aucune préférence. 6.2.2. Odeur L'odeur de la solution Y (ACO) est trouvée désagréable à l'unanimité mais avec des variations importantes en intensité (de « pas très agréable » à « immonde »). En revanche l'odeur de la solution Y (GLACO) a été préférée par l'ensemble des personnes avec toutefois 25 12 personnes qui ont trouvé la solution X (GLACO) sans odeur. 6.2.3. Saveur 30 personnes, rebutées par l'odeur de la solution Y (ACO) ont choisi de goûter la solution X (GLACO) en premier. 4 personnes ont choisi de goûter la solution Y (ACO) en premier. La saveur acide dominante a été reconnue pour la solution X (GLACO) par 32 5 personnes, cette saveur pouvant aller d'agréable (code 1, 2 ou 3) à pas très agréable (code 4) voire insupportable (code 5). Les résultats sont donnés dans le tableau suivant : Intensité de l'acidité de la n % du total solution X (GLACO) 1 0 0 2 7 20 3 8 24 4 10 29 7 21 Les 7 personnes qui ont trouvé cette saveur acide insupportable ont dit être incapable de mordre dans un citron. La solution Y(ACO) a donné globalement un comportement gustatif aversif de l'ensemble des personnes dû avant tout à l'odeur. Les autres saveurs (amer, salé et sucré) ne sont mentionnées que par très peu de personnes pour les deux solutions. Ainsi, 25 personnes ont préféré la solution X (GLACO) pour son absence d'odeur et son 15 goût acidulé. REVENDICATIONS1. Complexe de glutamine et d'alpha-cétoglutarate d'ornithine pour son utilisation dans le traitement de patients souffrant de troubles liés à une diminution des concentrations plasmatique et/ou musculaire de glutamine, lesdits patients étant choisis dans le groupe comprenant : - les traumatisés crâniens, - les personnes ayant eu un accident vasculaire cérébral, - les personnes ayant subi une greffe de moelle ou conditionnées en vue de cette thérapie, - les personnes en réanimation, - les personnes souffrant de fractures, - les personnes souffrant des effets de la radiothérapie, - les personnes en situation pré-opératoire de chirurgie, - les personnes en continuation post-opératoire d'une nutrition préopératoire et - les personnes âgées dénutries. 20 2. Complexe selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est sous une forme administrable par voie orale, entérale ou parentérale. 3. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il est sous une forme administrable par voie orale. 4. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il est présenté pour une posologie journalière comprise entre 10 et 500 mg/kg de poids, avantageusement comprise entre 14 et 300 mg/kg de poids. 30 5. Composition pharmaceutique comprenant un complexe glutamine et d'alpha-cétoglutarate d'ornithine selon l'une quelconque des revendications précédentes en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable pour son utilisation dans le traitement de patients souffrant de troubles liés à une diminution des 15 25 5 10concentrations plasmatique et/ou musculaires de glutamine, lesdits patients étant choisis dans le groupe comprenant : - les traumatisés crâniens, - les personnes ayant eu un accident vasculaire cérébral, - les personnes ayant subi une greffe de moelle conditionnées en vue de cette thérapie, - les personnes en réanimation, - les personnes souffrant de fractures, - les personnes souffrant des effets de la radiothérapie, - les personnes en situation pré-opératoire de chirurgie, - les personnes en continuation post-opératoire d'une nutrition préopératoire et - les personnes âgées dénutries.