Brevet FR2952368A1 — publié le 20110513

PARTICULE DE SILICE INCORPORANT UNE MOLÉCULE D'INTÉRÊT, SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET SES UTILISATIONS. DESCRIPTION 5 DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne le domaine des particules de silice et, plus particulièrement, des particules de silice capables d'incorporer ou d'encapsuler des molécules d'intérêt telles que des 10 biomolécules. La présente invention propose donc une particule de silice incorporant ou encapsulant une molécule d'intérêt. Dans le cadre de la présente invention, il est mis à profit la présence, au sein de 15 la particule de silice, de groupes aptes à établir une liaison non covalente, du type interaction électrostatique et/ou pont hydrogène, avec ladite molécule d'intérêt. La présente invention concerne également un 20 procédé pour préparer une telle particule de silice i.e. un procédé pour incorporer ou encapsuler une molécule d'intérêt dans une particule de silice et les utilisations d'une telle particule notamment dans la lutte anti-contrefaçon ou dans l'analyse biologique. 25 ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE La synthèse de nanoparticules de silice par voie sol-gel utilisant des alcoxydes de silicium est décrite dans la littérature depuis les travaux de 30 Stêber à la fin des années 60 qui a développé le 2 procédé portant son nom et qui permet d'obtenir des particules de silice micrométriques [1]. A partir de ce procédé, de nombreux développements ont permis de diminuer la taille des particules jusqu'à obtenir des nanoparticules ([2], [3]). Le procédé de synthèse par voie StOber utilise un alcoxyde de silicium tel que le tétraéthoxysilane (TEOS) ou le tétraméthoxysilane (TMOS) dans une solution d'alcool et d'eau. La solution est ensuite chauffée afin de réaliser l'hydrolyse de l'alcoxyde de silicium, puis l'ajout d'une certaine quantité de catalyseur, ici l'HCl, permet la condensation de la silice sous forme de particules. Un autre mode de synthèse basée sur une réaction sol-gel au sein d'une émulsion permet d'obtenir des particules de plus petite taille et plus monodisperses qu'avec le procédé StOber. Ce procédé est appelé synthèse sol-gel par microémulsion inverse ([4]- [61). Dans ce procédé, une émulsion d'eau dans une phase huileuse est formée à l'aide d'un tensioactif (ou surfactant) et dans certains cas un co-tensioactif (ou co-surfactant). La taille des micelles est généralement nanométrique, elles forment ainsi un nanoréacteur dans lequel se passe la réaction d'hydrolyse-condensation de l'alcoxyde de silicium. C'est la taille de la micelle qui détermine la taille de la particule formée. Dans le cas de la méthode StOber, l'encapsulation d'une molécule organique nécessite un 3 greffage covalent entre celle-ci et le réseau de silice. Ainsi par cette voie de synthèse, un certain nombre de fluorophores organiques ont été incorporés dans les particules de silice. Pour cela, il est nécessaire de créer un alcoxyde de silicium lié de façon covalente à la molécule organique par réaction entre une fonction isothiocyanate et une fonction amine. De nombreux exemples sont donnés dans la littérature avec la FITC (pour fluorescéine isothiocyanate) ou la RBITC (pour Rhodamine B isothiocyanate) encapsulée dans la silice par procédé StOber [7]. Dans ces procédés, le fluorophore ayant une fonction isothiocyanate est mélangé avec l'aminopropyltriéthoxysilane (APTES). La fonction isothiocyanate réagit avec la fonction amine de l'alcoxyde et forme un alcoxyde de silicium fluorescent qui est ensuite introduit dans la synthèse dans une certaine proportion par rapport à l'alcoxyde principal de silicium qu'est le TEOS. En général, cette concentration est de l'ordre de 1 à 5%. Lorsque l'alcoxyde fluorescent obtenu par réaction entre la fonction isothiocyanate et l'APTES est introduit en début de réaction, le fluorophore est réparti dans l'ensemble de la particule. Cette voie a également été utilisée pour former des structures du type coeur/coquille avec soit le coeur comportant la molécule organique et la surface de la silice soit inversement [8]. Dans ce cas, le procédé se fait en deux étapes successives identiques. 4 Ce procédé d'encapsulation par greffage covalent fonctionne également pour des molécules non fluorescentes en utilisant la même procédure : réaction entre un alcoxyde de silicium (APTES) et la molécule à relier de façon covalente avec la silice ([9], [10]). Il est également possible d'obtenir un coeur de silice et une coquille contenant les molécules organiques par greffage covalent ou par réaction sol-gel ([7], [11], [12]). Dans le cas des synthèses par voie micellaire, la méthode d'encapsulation de molécules organiques par greffage covalent comme pour la méthode StOber précédemment décrite fonctionne également mais n'est pas forcément nécessaire. En effet, le fait d'être en milieu micellaire permet de confiner au sein de la micelle des molécules ou des particules et ainsi de les encapsuler par de la silice. Les travaux de recherche effectués au laboratoire du Demandeur ont montré que ce procédé permet d'encapsuler des molécules organiques fluorescentes telles que la rhodamine et la fluorescéine [13]. Ce procédé d'encapsulation fonctionne pour des molécules solubles dans la phase aqueuse. Dans ce procédé, après la formation de l'émulsion inverse, la première étape consiste à introduire la molécule à encapsuler qui, si elle a une solubilité dans l'eau plus élevée que dans la phase huileuse, va se concentrer essentiellement à l'intérieur des micelles. Puis l'alcoxyde de silicium (TEOS) et du catalyseur pour la formation des particules de silice sont introduits. La formation de la particule de silice se fait de l'extérieur de la micelle vers l'intérieur encapsulant ainsi la molécule 5 présente dans la micelle. Les particules de silice ainsi obtenues sont ensuite fonctionnalisées par ajout d'agents de couplage tels que le N-2-(aminoéthyl)3-aminopropylthiéthoxysilane. Des travaux réalisés au laboratoire du Demandeur ont montré qu'en fonction de la solubilité de la molécule organique, celle-ci va, si elle est très soluble dans l'eau, se retrouver confinée au coeur de la particule de silice. Dans le cas où sa solubilité est plus faible, elle va soit être répartie dans la particule soit se retrouver plus en surface. Si elle n'est pas du tout soluble dans l'eau et si elle ne forme pas de liaison covalente avec la silice, elle n'est pas incorporée dans la particule. Dans le cas de l'acide désoxyribonucléotidique (ADN) et des macromolécules biologiques, des stratégies et procédés d'encapsulation ont été décrits dans la littérature. Des biomacromolécules ont déjà été encapsulées avec succès dans des objets de taille micrométrique et nanométrique dispersés dans l'eau (objets hydrophiles). Des biomacromolécules comme l'albumine de sérum bovin (BSA) et l'ADN ont été encapsulés avec succès dans des microcapsules de silice creuses [14]. Ces microcapsules sont synthétisées par double voie micellaire (eau-huile-eau). Les objets obtenus ont une 6 taille micrométrique. Le même format d'encapsulation a été développé par voie classique sol-gel, la méthode Stêber. La présence d'ADN dans les objets a été révélée par fluorescence grâce à des intercalants d'ADN de type bromure d'éthidium (BET). Une méthode similaire décrite dans la littérature relate la synthèse de nanoparticules de silice par voie sol-gel avec de plus petits diamètres - 200 nm [15]. Différentes nanoparticules de silice (- 40 nm) ont été synthétisées en employant une microémulsion inverse mettant en oeuvre du TEOS où l'on retrouve, dans la partie coeur de ces nanoparticules, des biomolécules conjuguées avec le fluorophore Cy5 (cyanine qui fluoresce dans le rouge 650-670 nm) [16]. Les molécules étudiées et conjuguées avec le Cy5 sont la polylysine (70000-15000 g.mol-1), des immunoglobines G (IgG ; 150000 g.mol-1), la BSA (68000 g.mol-1), l'insuline (5700 g.mol-1) et la pepsine (42500 g.mol-1). La présence du coeur biomoléculaire a été révélée par la fluorescence émise par le Cy5. De plus, il est important de souligner que ces biomolécules ont des caractéristiques de poids et de taille inférieures à celles de l'ADN plasmidique notamment utilisé dans la présente invention i.e. ADN composé de 3000 paires de bases (pb). L'utilisation d'un procédé de synthèse par voie micellaire pour l'encapsulation de l'ADN dans des particules de polymère a déjà été publiée [17]. L'article de Hammady et al. donne à titre d'exemple 7 l'encapsulation dans des billes de PVA (polyvinylacrylique) et de PLA (polylactide) d'ADN. Dans ce cas, l'ADN est a priori à l'intérieur des billes. Cependant, il n'est ni accessible pour analyse, ni utilisable tant que le polymère n'est pas détruit par dissolution. Par conséquent, la différence par rapport à la présente invention décrite ci-après concerne, d'une part, le matériau encapsulant l'ADN (polymère) et, d'autre part, la nécessité de dissoudre celui-ci pour avoir accès à l'ADN. On peut également citer d'autres types de particules ou de « containers » encapsulant de l'ADN. L'article de Cisse et al. décrit l'encapsulation de l'ADN dans des capsules dont la paroi est formée d'une membrane lipidique [18]. Celle-ci se compose d'une double couche de surfactant. Ce type de particule n'a pas grand chose à voir avec une particule de silice selon la présente invention puisque ce sont en quelque sorte des bulles, avec un liquide à l'intérieur, composées d'une paroi fine formée par une double couche moléculaire. Une troisième approche consiste à fonctionnaliser la surface des nano-objets afin d'y ancrer les biomolécules souhaitées ([19], [20]). Dans ces documents, les étapes de préparation et de fonctionnalisation des nanoparticules sont distinctes et effectuées préalablement à la mise en contact avec les biomolécules. Généralement, la surface des nano-objets est fonctionnalisée par des groupements aminés qui, par 8 interactions électrostatiques, se lient avec les biomolécules. Les nanoparticules possèdent une charge de surface positive grâce aux groupements aminés. Ainsi, un enrichissement d'ADN est réalisé sous forme de complexes « nanoparticules-ADN » qui impliquent des liaisons électrostatiques entre les groupements aminés des nanoparticules et la charge négative des groupements phosphates de l'ADN. Des modes opératoires analogues ont été développés consistant à améliorer la complexation avec l'ADN. Ainsi, une porosité régulière a été générée dans des nanoparticules de silice afin de mieux accommoder la proximité de la biomolécule et de favoriser la liaison électrostatique avec la surface fonctionnalisée des nanoparticules de silice [21]. Une dernière voie est utilisée pour encapsuler de l'ADN ou des biomolécules dans de la silice obtenue par sol-gel sous forme de film. Cette voie ne présente pas des particules mais des films. Des biomolécules ont été stockées dans des gels inorganiques ou hybrides organiques-inorganiques. L'encapsulation de l'ADN (50 pb) a été effectuée dans des gels hybrides d'alcool polyvinylique-silice. L'analyse des petits fragments d'ADN encapsulés dans des gels a montré que la complexation entre le réseau de silice et les groupements phosphatés se produit probablement. Ceci explique que la plupart des molécules d'ADN n'ont pu être extraites des gels [22]. Il existe donc un réel besoin des particules de silice telles que des nanoparticules de silice capables 9 d'incorporer ou d'encapsuler une molécule d'intérêt et notamment une molécule d'intérêt de grande taille telle que de l'ADN, permettant de protéger la molécule d'intérêt tout en la laissant accessible aux éléments et constituants du milieu extérieur. De plus, de telles particules doivent pouvoir être préparées par un procédé facile à mettre en oeuvre ne nécessitant pas la préparation de précurseurs réactionnels. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention permet de remédier aux inconvénients et problèmes techniques listés ci-dessus. En effet, cette dernière propose des matériaux particulaires, sphériques à base de silice et notamment nanoparticulaires, poreux, incorporant des molécules d'intérêt dans lesquels les molécules d'intérêt sont maintenues dans les particules tout en restant accessibles à des éléments présents à l'extérieur des particules tels que des enzymes. De plus, de tels matériaux peuvent être préparés par un procédé applicable au niveau industriel, ne nécessitant pas de procédures ou d'étapes lourdes et utilisant des produits facilement accessibles. Les travaux des inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation combinée d'un alcoxyde de silicium, également appelé « composé à base de silane », formant un réseau complet et d'un alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente avec une molécule d'intérêt permet de fabriquer des particules de silice telles que des nanoparticules de silice incorporant des molécules 10 d'intérêt. En effet, les particules de silice qui peuvent être de type coeur/coquille obtenues par un tel procédé sont fonctionnalisées, à l'intérieur du réseau de silice, par des groupements aptes à établir une liaison non covalente. Cette fonctionnalisation spécifique permet des liaisons non covalentes de type liaisons électrostatiques ou pont hydrogène avec la molécule d'intérêt. Ainsi, à titre d'exemple, lorsque la molécule d'intérêt est de l'ADN, ce dernier composé de phosphates liés aux sucres qui sont eux-mêmes liés aux bases azotés a un potentiel zéta négatif. L'utilisation d'un alcoxyde de silicium présentant un ou plusieurs groupement(s) aminé(s) et d'un alcoxyde de silicium formant un réseau complet permet d'obtenir des particules de silice fonctionnalisées par des groupements aminés à l'intérieur du réseau de silice. Le phosphate négativement chargé vient interagir électrostatiquement (ou par pont hydrogène) avec les groupements aminés du réseau de silice. Lors de l'hydrolyse des dérivés siliconés i.e. des alcoxydes de silicium, l'ADN se retrouve emprisonné dans la particule de silice et notamment dans le coeur de la particule de silice ce qui est principalement dû aux liaisons électrostatiques et aux propriétés hydrophiles de l'ADN. L'ADN est alors encapsulé dans le réseau poreux de silice des particules et notamment dans le coeur d'un tel réseau. Un schéma de principe de la structure finale de la particule est représenté Figure 1. 11 Les molécules d'intérêt encapsulées sont protégées par la silice. La silice sert donc de support stabilisateur de la molécule d'intérêt. Toutefois, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une coquille de silice entourant le coeur de la particule contenant la molécule d'intérêt. Cette coquille est suffisamment poreuse pour avoir une accessibilité à la molécule d'intérêt des constituants présents dans le milieu extérieur et ce, aussi bien pour de petites molécules comme des nucléotides fluorescents, que pour des molécules plus grosses comme des enzymes. De plus, comme l'encapsulation selon l'invention fait intervenir des liaisons non covalentes, les propriétés de la molécule d'intérêt telle qu'activité et/ou reconnaissance ne sont pas modifiées. La présente invention concerne donc une particule de silice poreuse, incorporant au moins une molécule d'intérêt et essentiellement obtenue à partir de l'hydrolyse : - d'au moins un premier alcoxyde de silicium de formules Si(OR)4, R2Si (0R3) 3 ou R4R5Si (0R6) 2 dans lesquelles RI, R3 et R6, identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone et R2, R4 et R5, identiques ou différents, représentent un hydrogène, un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou un radical alcényle de 1 à 6 atomes de carbone, et d'au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une 12 liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt. Par « particule de silice incorporant au moins une molécule d'intérêt », on entend, dans la présente invention, une particule de silice à l'intérieur de laquelle se trouve au moins une molécule d'intérêt. Dans le cadre de la présente invention, la molécule d'intérêt ou l'ensemble des molécules d'intérêt ne se trouvent pas à la surface de la particule de silice. Avantageusement, la particule de silice selon l'invention est une particule de type coeur/coquille dans le coeur de laquelle se trouve au moins une molécule d'intérêt. Lorsque la particule de silice incorpore plusieurs molécules d'intérêt, identiques ou différentes, ces dernières se trouvent de façon majoritaire à l'intérieur de la particule et notamment dans le coeur de la particule. La répartition des molécules d'intérêt dans la particule de silice peut se présenter sous forme d'un gradient avec une forte concentration en molécules d'intérêt au centre de la particule et notamment au centre du coeur de cette particule et une concentration plus faible au fur et à mesure que l'on s'éloigne de ce centre. Ainsi, au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98%, au moins 99% des molécules d'intérêt et/ou l'ensemble des molécules d'intérêt se trouvent à l'intérieur et notamment dans le coeur de la particule. Les expressions « particule de silice encapsulant au moins une molécule d'intérêt » et « particule de silice 13 incorporant au moins une molécule d'intérêt » sont équivalentes et utilisables de façon interchangeable. La particule de silice selon l'invention est de taille nanométrique ; on peut donc parler de « nanoparticule », « bille » ou « nanobille ». Comme présentée dans la partie expérimentale ci-après, il est possible de faire varier la taille moyenne des particules de silice selon l'invention en jouant sur les quantités de molécules d'intérêt et/ou le rapport liquide polaire (solvant polaire tel que l'eau) /tensioactif / liquide non polaire (phase huileuse principalement constituée par le solvant non polaire ou faiblement polaire). Avantageusement, les particules de silice selon l'invention présentent une taille moyenne inférieure ou égale à 150 nm, à 120 nm, à 100 nm, à 80 nm ou à 60 nm. Les particules de silice selon l'invention peuvent présenter une taille moyenne de l'ordre de 40 nm (i.e. 40 ± 10 nm). En variante, les particules de silice selon l'invention présentent une taille moyenne inférieure à 40 nm, à 20 nm et notamment de l'ordre de 10 nm (i.e. 10 ± 5 nm). Il est clair pour l'homme du métier que la taille moyenne de la particule de silice selon l'invention influencera la taille de la (ou des) molécule (s) d'intérêt incorporée(s). Les particules de silice selon l'invention sont poreuses et notamment mésoporeuses. Avantageusement, elles présentent une taille de pores inférieure à 100 angstrêms et une distribution de taille de pores allant de 1 à 100 angstrêms, notamment de 10 à 90 angstrêms, en particulier, de 15 à 80 angstrêms et, 14 tout particulièrement, de 20 à 70 angstrôms et une surface spécifique de 200 à 900 m2.g-1, notamment de 300 à 800 m2.g-1 et, en particulier, de 400 à 700 mz g-1 La particule de silice selon l'invention présente un certain nombre de caractéristiques listées ci-dessous . - la molécule d'intérêt est dans la particule de silice et notamment dans le coeur de cette particule, la silice joue un rôle protecteur vis-à-vis de la molécule d'intérêt, - la molécule d'intérêt est maintenue dans la particule de silice grâce aux liaisons non covalentes mises en oeuvre ; - la particule de silice étant poreuse, de petites molécules peuvent rentrer dans la particule de silice (lorsque la molécule d'intérêt est un acide nucléique, un intercalant peut venir s'intercaler dans l'acide nucléique et émettre un signal spécifique en présence de cet acide), - la molécule d'intérêt incorporée dans la particule de silice est également accessible à des réactions enzymatiques dont elle est le substrat, de telles réactions enzymatiques pouvant entraîner un signal détectable tel qu'une modification de marquage de la molécule d'intérêt. Ainsi, la (ou les) molécule(s) d'intérêt incorporée(s) dans la particule de silice selon l'invention est(sont) maintenue(s) et protégée(s) dans la particule de silice selon l'invention. La (ou les) molécule(s) d'intérêt incorporée(s) dans la particule de silice selon l'invention est(sont) accessible(s) à 15 des molécules présentes dans le milieu extérieur de la particule de silice selon l'invention. La (ou les) molécule (s) d'intérêt incorporée (s) dans la particule de silice selon l'invention est(sont) susceptible(s) d'interagir avec ces molécules. Par « molécule d'intérêt », on entend dans le cadre de la présente invention une quelconque molécule présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec le second alcoxyde de silicium tel que défini dans la présente. Cette molécule peut être naturelle ou synthétique, de petite ou grande taille (macromolécule). La molécule d'intérêt est avantageusement choisie dans le groupe constitué par une enzyme, une protéine, un oligopeptide, un peptide, un antigène, un anticorps, un acide nucléique, un polymère ou un glucide. La molécule d'intérêt peut être marquée notamment par un fluorochrome (fluorescéine, Cy5, Cy3, rhodamine), un isotope radioactif, une enzyme (phosphatase alcaline, péroxydase de raifort), l'or colloïdal, la biotine ou la digoxygénine. L'expression « acide nucléique » utilisée dans la présente est équivalente aux terme et expressions suivants : « séquence polynucléotidique », « molécule nucléotidique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique ». Par « acide nucléique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, 16 recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal ; un ARN de transfert ; une portion ou un fragment de ceux-ci. Un ADN dans le cadre de la présente invention peut présenter de 10 pb (ou 20 nucléotides) à 5 000 pb (ou 10 000 nucléotides), et notamment de 20 pb (ou 40 nucléotides) à 4 000 pb (ou 8 000 nucléotides). Par « liaison non covalente ionique », on entend dans le cadre de la présente invention une interaction intermoléculaire entre au moins deux groupements chargés positivement ou négativement. Les expressions « liaison non covalente ionique », « interaction ionique », « liaison électrostatique » ou « interaction électrostatique » sont équivalentes et utilisables de façon interchangeable. Dans le cadre de la présente invention, cette interaction intermoléculaire est attractive. Elle implique un groupement chargé négativement de la molécule d'intérêt et un groupement chargé positivement du second alcoxyde de silicium. En variante, elle implique un groupement chargé positivement de la molécule d'intérêt et un groupement chargé négativement du second alcoxyde de silicium. Par « liaison non covalente hydrogène », on entend une liaison dans laquelle un atome d'hydrogène lié de façon covalente à un atome A est attiré par un atome B contenant une paire d'électrons libres ( :B). Ceci entraîne une forte polarisation de la liaison A-H et des interactions électrostatiques entre H(8+) et :B. 17 L'expression « liaison non covalente hydrogène » est équivalente à l'expression « interaction dipoledipole ». Dans le cadre de la présente invention, l'atome A peut être un atome du second alcoxyde de silicium et l'atome B un atome de la molécule d'intérêt. En variante, l'atome A peut être un atome de la molécule d'intérêt et l'atome B un atome du second alcoxyde de silicium. Dans le cadre de la présente invention, le premier alcoxyde de silicium de formules Si(ORD4r R2Si (0R3) 3 ou R4R5Si (0R6) 2 dans lesquelles RI, R3 et R6, identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone et R2, R4 et R5, identiques ou différents, représentent un hydrogène, un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou un radical alcényle de 1 à 6 atomes de carbone participe principalement à la formation du réseau de silice et notamment à la formation de la coquille de la particule de silice selon l'invention. En effet, ce premier alcoxyde de silicium peut présenter avantageusement une vitesse d'hydrolyse inférieure ou égale à la vitesse d'hydrolyse du second alcoxyde de silicium. Par « radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone », on entend un radical alkyle, linéaire ou ramifié, présentant de 1 à 6 atomes de carbone et notamment de 1 à 4 atomes de carbone. Par « radical alcényle de 1 à 6 atomes de carbone », on entend un radical alcényle, linéaire ou 18 ramifié, présentant au moins une double liaison et de 1 à 6 atomes de carbone et notamment de 1 à 4 atomes de carbone. Avantageusement, R2, R4 et R5, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par un hydrogène, méthyle, éthyle, vinyle et propyle. Le premier alcoxyde de silicium utilisable dans le cadre de la présente invention est notamment choisi dans le groupe constitué par le tétraméthoxysilane (TMOS, Si(OCH3)4), le tétraéthoxysilane (TEOS, Si (0C2H5) 4) , le tétrapropoxysilane (TPOS, Si (OC3H-7) 4) , le tétrabutoxysilane (TBOS, Si(0C4H9)4), le triméthoxysilane (TMOS, HSi(OCH3)3), le méthyltriméthoxysilane [ (CH3) Si (OCH3) 3] , l'éthyltriméthoxysilane [ (C2H5) Si (OCH3) 3] , le propyltriméthoxysilane [ (C3H7) Si (OCH3) 3] , le vinyltriméthoxysilane [ (C2H3) Si (OCH3) 3] , le triéthoxysilane [HSi(0C2H5)3], le méthyltriéthoxysilane [ (CH3) Si (0C2H5) 3] , l' éthyltriéthoxysilane [ (C2H5) Si (0C2H5) 3] , le propyltriéthoxysilane [ (C3H7) Si (0C2H5) 3] , le vinyltriéthoxysilane [ (C2H3) Si (0C2H5) 3] , et leurs mélanges. Avantageusement, le premier alcoxyde de silicium mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est le TMOS ou le TEOS. Plus particulièrement, le premier alcoxyde de silicium mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est le TEOS. En effet, un tel précurseur permet d'obtenir, pour la coquille de silice, une couche dont la porosité est optimale pour permettre l'accessibilité à la (ou des) molécule(s) d'intérêt 19 telle (s) que l'ADN, encapsulée(s) dans le coeur de la particule par des constituants de taille importante présents dans le milieu extérieur. Le second alcoxyde de silicium mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention comprend au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt. Ce second alcoxyde peut présenter une vitesse d'hydrolyse égale ou supérieure à la vitesse d'hydrolyse du premier alcoxyde de silicium permettant ainsi de concentrer la (ou les) molécule(s) d'intérêt au coeur de la particule de silice. L'absence d'un tel alcoxyde empêche l'encapsulation de la molécule d'intérêt dans la particule de silice. Le second alcoxyde de silicium est avantageusement de formules R7Si (0R8) 3 ou R9R10Si (OR11) 2 dans lesquelles R8 et Rnr identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone et R7, R9 et R10r identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 8 atomes de carbone, un radical hétéroalkyle de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alkylaryle de 1 à 12 atomes de carbone ou un radical alcényle de 1 à 8 atomes de carbone, le radical R7 et l'un au moins des radicaux R9 et R10 étant substitués par au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt. 20 Les radicaux R8 et Rnr identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone tel que précédemment défini. Par « radical alkyle de 1 à 8 atomes de carbone », on entend un radical alkyle, linéaire ou ramifié, présentant de 1 à 8 atomes de carbone, notamment de 1 à 6 atomes de carbone et, en particulier, de 1 à 4 atomes de carbone. Par « radical hétéroalkyle de 1 à 10 atomes de carbone », on entend un radical alkyle, linéaire ou ramifié, présentant de 1 à 10 atomes de carbone, notamment de 1 à 8 atomes de carbone et, en particulier, de 1 à 6 atomes de carbone et présentant au moins un hétéroatome tel que N, S, 0 ou P. Par « radical alkylaryle de 1 à 12 atomes de carbone », on entend un radical alkyle, linéaire ou ramifié, présentant de 1 à 12 atomes de carbone, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, en particulier, de 1 à 8 atomes de carbone et, plus particulièrement, de 1 à 6 atomes de carbone, présentant un substituant aromatique ou hétéroaromatique de 3 à 8 atomes de carbone et éventuellement au moins un hétéroatome tel que N, S, 0 ou P. Par « radical alcényle de 1 à 8 atomes de carbone », on entend un radical alcényle, linéaire ou ramifié, présentant au moins une double liaison et de 1 à 8 atomes de carbone, notamment de 1 à 6 atomes de carbone et, en particulier, de 1 à 4 atomes de carbone. Par « groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène », on entend dans le cadre de la présente invention un groupement choisi 21 dans le groupe constitué par -NH2, -NHR12 avec R22 représentant un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone tel que précédemment défini, -NH3, -NH2R13+ avec R13 représentant un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone tel que précédemment défini, -COOH, -COO-, C(0)NH, -C(0), -SH et -OH. Le groupe de la molécule d'intérêt participant à la liaison non covalente avec la fonction dans le coeur de la particule issue du second alcoxyde de silicium peut comprendre également un tel groupement. Avantageusement, le second alcoxyde de silicium utilisable dans le cadre de la présente invention est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de N - triméthoxysilylpropyl-N, N, N-triméthylammonium (C9H24C1NO3Si, CAS : 35141-36-7) ; l'aminoéthylaminométhyl)phénéthyltriméthoxysilane (C14H26N2O3Si, CAS : 74113-77-2) ; le N- (6- aminohéxyl) aminopropyltriméthoxysilane (C12H3oN2O3Si, CAS : 51895-58-0) ; le 3-aminopropyl-méthyl- diéthoxysilane (C8H22NO2Si, CAS : 3179-76-8) ; le 3-aminopropyl-triméthoxysilane (APTMES, C6H17NO3Si, CAS : 13822-56-5) ; le 3-aminopropyl-triéthoxysilane (APTES, C9H23NO3Si, CAS : 919-30-2) ; le 3- (2- aminoéthylamino) propyl-triméthoxysilane ( (CH3O) 3Si (CH2) 3NHCH2CH2NH2) , CAS : 1760-24-3) ; le (3- mercaptopropyl) triméthoxysilane (HS (CH2) 3Si (OCH3) 3, CAS : 4420-74-0), le (3-mercaptopropyl) triéthoxysilane (HS (CH2) 3Si (0C2H5) 3, CAS : 14814-09-6) et leurs mélanges. Le second alcoxyde de silicium utilisable dans le cadre de la présente invention est, plus particulièrement, de l'APTMES. 22 La particule de silice selon l'invention est essentiellement obtenue à partir de l'hydrolyse d'au moins un premier alcoxyde de silicium et d'au moins un second alcoxyde de silicium tels que précédemment définis. La particule de silice selon l'invention est essentiellement constituée d'unités issues de l'hydrolyse d'au moins un premier alcoxyde de silicium et d'au moins un second alcoxyde de silicium tels que précédemment définis. En effet, la particule de silice peut comprendre d'autres éléments notamment au moins un élément apte à lui conférer des propriétés magnétiques. De tels éléments aptes à conférer des propriétés magnétiques sont notamment choisis dans le groupe constitué par du fer, gadolinium, nickel, cuivre, chrome, cobalt, or, argent, platine, palladium, un oxyde et un hydroxyde de ceux-ci. Ainsi, la particule de silice selon l'invention mais sans la (ou les) molécule(s) d'intérêt est constituée à au moins 80%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98%, au moins 99% d'unités issues de l'hydrolyse d'au moins un premier alcoxyde de silicium et d'au moins un second alcoxyde de silicium tels que précédemment définis. En variante, la particule de silice selon l'invention mais sans la (ou les) molécule(s) d'intérêt est uniquement constituée d'unités issues de l'hydrolyse d'un (ou de) premier(s) alcoxyde(s) de silicium et d'un (ou de) second(s) alcoxyde(s) de silicium tels que précédemment définis. 23 La présente invention concerne également un procédé pour préparer une particule de silice incorporant au moins une molécule d'intérêt selon la présente invention. Tout procédé pour préparer une telle particule à partir d'au moins un premier alcoxyde de silicium et d'au moins un second alcoxyde de silicium tels que précédemment définis est utilisable dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, la présente invention concerne un procédé de préparation, en présence d'une molécule d'intérêt, d'au moins une particule de silice par émulsion inverse à partir : d'au moins un premier alcoxyde de silicium (i . e . de formules Si(OR)4, R2Si (0R3) 3 ou R4R5Si (0R6) 2) tel 15 que précédemment défini, - d'au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt tels que précédemment définis. 20 Par « microémulsion inverse » également appelée microémulsion « eau dans huile », on entend une suspension limpide, thermodynamiquement stable, de fines gouttelettes d'un premier liquide polaire dans un 25 second liquide non-polaire et donc non miscible avec le premier liquide. Les expressions « par voie micellaire inverse » et « via une microémulsion inverse » sont équivalentes et utilisables de façon interchangeable. 30 Le procédé selon la présente invention peut mettre en oeuvre : 24 un premier alcoxyde de silicium tel que précédemment défini et un second alcoxyde de silicium tel que précédemment défini ; un premier alcoxyde de silicium tel que 5 précédemment défini et plusieurs seconds alcoxydes de silicium tels que précédemment définis ; plusieurs premiers alcoxydes de silicium tels que précédemment définis et un second alcoxyde de silicium tel que précédemment défini ; ou 10 plusieurs premiers alcoxydes de silicium tels que précédemment définis et plusieurs seconds alcoxydes de silicium tels que précédemment définis. Plus particulièrement, le procédé selon 15 l'invention comprend les étapes suivantes : a) préparer une microémulsion (Ma) du type eau dans huile contenant ladite (ou lesdites) molécule(s) d'intérêt, b) ajouter, à la microémulsion (Ma) préparée à 20 l'étape (a), un composé permettant l'hydrolyse d'un alcoxyde de silicium, c) ajouter, à la microémulsion (Mb) obtenue à l'étape (b), au moins un premier alcoxyde de silicium tel que précédemment défini et au moins un second 25 alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt tels que précédemment définis, d) ajouter à la microémulsion (Mc) obtenue à 30 l'étape (c) un solvant permettant de déstabiliser ladite microémulsion, et 25 e) récupérer les particules de silice incorporant au moins une molécule d'intérêt, précipitées lors de l'étape (d). L'étape (a) du procédé selon l'invention consiste donc à préparer une microémulsion (Ma) du type eau dans huile contenant au moins une molécule d'intérêt. Toute technique permettant de préparer une telle microémulsion est utilisable dans le cadre de la présente invention. Ainsi, il est possible de : soit préparer une première solution (M1) et d'y incorporer ultérieurement une (ou plusieurs) molécule(s) d'intérêt pour obtenir la microémulsion (Ma) ; soit préparer la microémulsion (Ma) directement en mélangeant ensemble les différents composants et donc une (ou plusieurs) molécule(s) d'intérêt. Avantageusement, l'étape (a) du procédé selon l'invention consiste à préparer une première solution (M1) dans laquelle est ultérieurement incorporée au moins une molécule d'intérêt. Cette solution (M1) est obtenue en mélangeant ensemble au moins un tensioactif, éventuellement au moins un co-tensioactif et au moins un solvant non-polaire ou faiblement polaire. Le tensioactif, le co-tensioactif et le solvant non-polaire ou faiblement polaire peuvent être mélangés en une fois ou être ajoutés les uns après les autres ou par groupe. Avantageusement, ils sont ajoutés les uns après les autres et, dans l'ordre suivant, tensioactif 26 puis éventuellement co-tensioactif puis solvant non-polaire ou faiblement polaire. Le mélange est effectué sous agitation en utilisant un agitateur, un barreau magnétique, un bain à ultrasons ou un homogénéisateur, et peut être mis en oeuvre à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) pendant une durée comprise entre 1 min et 1 h, notamment entre 10 et 45 min et, en particulier, entre 15 et 30 min. Le (ou les) tensioactif(s) utilisable(s) dans le cadre de la présente invention vise(nt) à introduire des espèces hydrophiles dans un environnement hydrophobe et peu(ven)t être choisi (s) parmi les tensioactifs ioniques, les tensioactifs non-ioniques et leurs mélanges. Par « mélanges », on entend, dans le cadre de la présente invention, un mélange d'au moins deux tensioactifs ioniques différents, un mélange d'au moins deux tensioactifs non-ioniques différents ou un mélange d'au moins un tensioactif non-ionique et d'au moins un tensioactif ionique. Un tensioactif ionique peut notamment se présenter sous forme d'une chaîne hydrocarbonée, chargée dont la charge est contre-balancée par un contre-ion. A titre d'exemples non limitatifs de tensioactifs ioniques, on peut citer le bis(2- éthylhexyl sulfosuccinate) de sodium (AOT), le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), le bromure de cétylpyridinium (CPB) et leurs mélanges. 27 Un tensioactif non-ionique utilisable dans le cadre de la présente invention peut être choisi dans le groupe constitué par les alcools polyéthoxylés, les phénols polyéthoxylés, les oléates, les laurates et leurs mélanges. A titre d'exemples non limitatifs de tensioactifs non-ioniques commerciaux, on peut citer les Triton X tels que le Triton X-100 ; les Brij tels que Brij-30 ; les Igepal CO tels que le Igepal CO-520 ou le Igepal CO-720 ; les Tween tels que le Tween 20 ; les Span tels que le Span 85. Par « co-tensioactif », on entend dans le cadre de la présente invention un agent capable de faciliter la formation des microémulsions et les stabiliser. Avantageusement, ledit co-tensioactif est un composé amphiphile choisi dans le groupe constitué par un sulfate d'alkyle sodique à 8 à 20 atomes de carbone tel que le SDS (pour « Sodium Dodecyl Sulfate ») ; un alcool tel qu'un isomère de propanol, de butanol, de pentanol et d'hexanol ; un glycol et leurs mélanges. Avantageusement, le co-tensioactif, lorsqu'il est présent dans la solution (M1), est du n-hexanol. Tout solvant non-polaire ou faiblement polaire est utilisable dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, ledit solvant non polaire ou faiblement polaire est un solvant organique non polaire ou faiblement polaire et, notamment, choisi dans le groupe constitué par le n-butanol, l'hexanol, le cyclopentane, le pentane, le cyclohexane, le n-hexane, le cycloheptane, l'heptane, le n-octane, l'iso-octane, l'hexadécane, l'éther de pétrole, le benzène, l'isobutyl-benzène, le toluène, le xylène, les cumènes, 28 le diéthyl éther, le n-butyl acétate, l'isopropyl myristate et leurs mélanges. Avantageusement, le solvant non polaire ou faiblement polaire utilisé dans le cadre de la présente invention est le cyclohexane. Dans la solution (M1), le tensioactif est présent dans une proportion comprise entre 1 et 40 %, notamment entre 5 et 30 % et, en particulier, entre 10 et 25 % en volume par rapport au volume total de ladite solution. Le co-tensioactif se trouve, lorsqu'il est présent dans la solution (M1), dans une proportion comprise entre 1 et 30 %, notamment entre 5 et 25 % et, en particulier, entre 10 et 20 % en volume par rapport au volume total de ladite solution. Ainsi, le solvant non-polaire ou faiblement polaire est présent, dans la solution (M1), dans une proportion comprise entre 40 et 98 %, notamment entre 50 et 90 % et, en particulier, entre 60 et 80 % en volume par rapport au volume total de ladite solution. Une fois la solution (M1) préparée, au moins une molécule d'intérêt telle que précédemment définie est incorporée pour former la microémulsion (Ma) du type eau dans huile. La (ou les) molécule(s) d'intérêt peu(ven)t être ajoutée(s) sous forme solide, sous forme liquide ou en solution dans un solvant polaire. Quelle que soit la variante mise en oeuvre, un solvant polaire est rajouté à la microémulsion après l'incorporation de la (ou des) molécule(s) d'intérêt dans la solution (M1). Avantageusement, la (ou les) molécule(s) d'intérêt est (sont) ajoutée(s) à la solution (M1) en solution dans un solvant polaire puis du solvant polaire, identique 29 ou différent du premier, est encore ajouté. Plus particulièrement, les deux solvants polaires utilisés sont identiques. L'ajout de la (ou des) molécule(s) d'intérêt et éventuellement du solvant polaire peut être effectué sous agitation en utilisant un agitateur, un barreau magnétique, un bain à ultrasons ou un homogénéisateur. Par « solvant polaire », on entend dans la cadre de la présente invention un solvant choisi dans le groupe constitué par l'eau, l'eau désionisée, l'eau distillée, acidifiées ou basiques, l'acide acétique, les solvants hydroxylés comme le méthanol et l'éthanol, les glycols liquides de faible poids moléculaire tels que l'éthylèneglycol, le diméthylsulfoxyde (DMSO), l'acétonitrile, l'acétone, le tétrahydrofurane (THF) et leurs mélanges. Le solvant polaire (solvant polaire dans lequel la (ou les) molécule(s) d'intérêt est(sont) en solution et/ou autre solvant polaire ultérieurement ajouté) est présent, dans la microémulsion (Ma), dans une proportion comprise entre 0,25 et 20 %, notamment entre 0,5 et 10 % et, en particulier, entre 1 et 5 % en volume par rapport au volume total de ladite microémulsion. La (ou les) molécule(s) d'intérêt est(sont) présent (es) dans ce solvant polaire en une quantité comprise entre 0,05 et 10 %, notamment entre 0,1 et 5 % et, en particulier, entre 0,2 et 1,5 % en volume par rapport au volume total de solvant polaire. L'étape (b) du procédé selon l'invention vise à prévoir l'hydrolyse des alcoxydes de silicium en 30 ajoutant à la microémulsion (Ma) un composé permettant cette hydrolyse, la microémulsion (Mb) ainsi obtenue étant une microémulsion eau dans huile. Par « composé permettant l'hydrolyse d'un alcoxyde de silicium », on entend dans le cadre de la présente invention un composé choisi dans le groupe constitué par l'ammoniaque, l'hydroxyde de sodium (KOH), l'hydroxyde de lithium (LiOH) et l'hydroxyde de sodium (NaOH) et, avantageusement, une solution d'un tel composé dans un solvant polaire, identique ou différent, au solvant polaire mis en oeuvre lors de l'étape (a). Le composé permettant l'hydrolyse d'un alcoxyde de silicium est, plus particulièrement, de l'ammoniaque ou une solution d'ammoniaque dans un solvant polaire. En effet, l'ammoniaque agit comme réactif (H2O) et comme catalyseur (NH3) de l'hydrolyse d'un alcoxyde de silicium. Le composé choisi dans le groupe constitué par l'ammoniaque, l'hydroxyde de sodium (KOH), l'hydroxyde de lithium (LiOH) et l'hydroxyde de sodium (NaOH), en solution dans le solvant polaire, est présent dans une proportion comprise entre 5 et 50 %, notamment entre 10 et 40 % et, en particulier, entre 20 et 30 % en volume par rapport au volume total de ladite solution. De plus, ladite solution est présente dans une proportion comprise entre 0,05 et 20 %, notamment entre 0,1 et 10 % et, en particulier, entre 0,2 et 5 % en volume par rapport au volume total de la microémulsion (Mb). L'étape (b) peut être mise en oeuvre sous agitation en utilisant un agitateur, un barreau magnétique, un bain à ultrasons ou un homogénéisateur, 31 et à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) pendant une durée comprise entre 5 et 45 min, notamment entre 10 et 30 min et, en particulier, pendant 15 min. L'étape (c) consiste à incorporer, dans la microémulsion (Mb) ainsi obtenue, les alcoxydes de silicium tels que précédemment définis qui donneront par réaction sol-gel la silice des particules de silice selon l'invention. L'incorporation dans la microémulsion (Mb) des alcoxydes de silicium pour obtenir la microémulsion (Mc) du type eau dans huile est effectuée sous agitation en utilisant un agitateur, un barreau magnétique, un bain à ultrasons ou un homogénéisateur, et peut être mise en oeuvre à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) pendant une durée comprise entre 6 et 48 h, notamment entre 12 et 36 h et, en particulier, pendant 24 h. Le (ou les) premier(s) alcoxyde(s) de silicium et le (ou les) second(s) alcoxyde(s) de silicium peuvent être incorporés simultanément dans la microémulsion (Mb). En variante, ils peuvent être incorporés successivement. Dans ce cas, le (ou les) second(s) alcoxyde(s) de silicium sont avantageusement incorporés avant le (ou les) premier(s) alcoxyde(s) de silicium. 32 Dans la microémulsion (Mc), les alcoxydes de silicium i.e. les premier(s) + second(s) alcoxydes de silicium sont présents dans une proportion comprise entre 0,05 et 20 %, notamment entre 0,1 et 10 % et, en particulier, entre 0,5 et 5 % en volume par rapport au volume total de ladite microémulsion. Avantageusement, le rapport molaire premier(s) alcoxyde(s) de silicium/ second(s) alcoxyde(s) de silicium est compris entre 1/0,005 et 1/0,5 ; notamment entre 1/0,01 et 1/0,1 ; et, en particulier, entre 1/0,02 et 1/0,05. L'étape (d) du procédé selon l'invention vise à précipiter les particules de silice par addition d'un solvant qui ne dénature pas la structure des nanoparticules mais qui déstabilise ou dénature la microémulsion (Mc) obtenue à l'étape (c). Avantageusement, le solvant mis en oeuvre est un solvant polaire tel que précédemment défini. Un solvant polaire particulier à mettre en oeuvre lors de l'étape (d) est choisi dans le groupe constitué par l'éthanol, l'acétone et le THF. Ainsi, est ajouté, à la microémulsion (Mc), un volume de solvant identique ou supérieur au volume de ladite microémulsion, notamment supérieur d'un facteur 1,2 ; en particulier, supérieur d'un facteur 1,5 ; et voire supérieur d'un facteur 2 ou 3. Toute technique permettant de récupérer les particules de silice incorporant au moins une molécule d'intérêt, précipitées lors de l'étape (d) peut être mise en oeuvre lors de l'étape (e) du procédé selon 33 l'invention. Avantageusement, cette étape (e) met en oeuvre une ou plusieurs étapes, identiques ou différentes, choisies parmi les étapes de centrifugation, de sédimentation et de lavages. La (ou les) étape(s) de lavage est(sont) effectuée(s) dans un solvant polaire tel que précédemment défini. Lorsque l'étape de récupération met en oeuvre plusieurs lavages, un même solvant polaire est utilisé pour plusieurs voire pour tous les lavages ou plusieurs solvants polaires différents sont utilisés à chaque lavage. Concernant une (ou plusieurs) étape(s) de centrifugation, elle(s) peu(ven)t être mise(s) en oeuvre en centrifugeant les particules de silice notamment dans un solvant de lavage à température ambiante, à une vitesse comprise entre 4000 et 8000 rpm et, en particulier, de l'ordre de 5000 rpm (i.e. 5000 ± 500 rpm) et ce, pendant une durée comprise entre 5 min et 2 h, notamment entre 10 min et 1 h et, en particulier, pendant 15 min. Le procédé selon la présente invention peut comprendre une étape additionnelle, suite à l'étape (e), visant à éliminer la (ou les) molécule(s) d'intérêt libre(s) et toute trace de tensioactif. Avantageusement, cette étape consiste à mettre les particules de silice récupérées suite à l'étape (e) au contact d'un très large volume d'eau. Par « très large volume », on entend un volume supérieur d'un facteur 50, notamment d'un facteur 500 et, en particulier, d'un facteur 1000 au volume de particules de silice récupérées après l'étape (e) du procédé selon 34 l'invention. Cette étape peut être une étape de dialyse, les nanoparticules de silice encapsulant une (ou plusieurs) molécule(s) d'intérêt étant séparées du volume par une membrane de cellulose, du type Zellu trans® (société Roth). Alternativement, on peut prévoir une étape d'ultrafiltration à la place de l'étape de dialyse, via une membrane en polyéthersulfone. Cette étape additionnelle peut, de plus, être mise en oeuvre sous agitation en utilisant un agitateur, un barreau magnétique, un bain à ultrasons ou un homogénéisateur, à une température comprise entre 0 et 30°C, avantageusement entre 2 et 20°C et, plus particulièrement, à froid (i.e. 6°C ± 2°C) et ce, pendant une durée comprise entre 3 h et 36 h, notamment entre 6 h et 24 h et, en particulier, pendant 12 h. Pour certaines applications des particules selon l'invention incorporant au moins une molécule d'intérêt, il peut être nécessaire de les concentrer avant de les remettre en suspension dans un liquide ou un gel approprié. Une telle concentration peut être obtenue, dans le cas des liquides, par centrifugation. Une autre méthode connue des biotechnologies consiste à préparer des particules de silice présentant des propriétés magnétiques. Ce but peut être atteint grâce à l'utilisation d'au moins un élement apte à conférer des propriétés électromagnétiques à la particule. Cet élément peut être par exemple de l'oxyde de fer. Dans ce cas, la concentration et la récupération des particules de silice selon l'invention se fait par champ magnétique. 35 Par conséquent, le procédé de la présente invention peut présenter une forme de mise en oeuvre particulière dans laquelle la particule de silice incorporant au moins une molécule d'intérêt qui est préparée est une particule de silice comprenant au moins un élément apte à lui conférer des propriétés magnétiques tel qu'un constituant métallique. Cette forme de mise en oeuvre comprend l'ajout dans la micro-émulsion (Ma), dans la micro-émulsion (Mb) et/ou dans la micro-émulsion (Mc) telles que précédemment décrites d'au moins un élément apte à conférer des propriétés magnétiques à la particule de silice (en fer, gadolinium, nickel, cuivre, chrome, cobalt, or, argent, platine, palladium, ou un oxyde ou hydroxyde de ceux-ci) se présentant en une taille suffisamment petite par rapport à la taille finale de la particule souhaitée. Dans cette variante, la condensation de la silice avec la (ou les) molécule(s) d'intérêt par le second alcoxyde de silicium tel que précédemment défini se fait en incorporant cet élément puis, de la même façon, une couche de silice par le premier alcoxyde de silicium tel que précédemment défini se crée en surface. Avantageusement, cet élément se trouve sous la forme d'une particule magnétique. La présente invention concerne également la microémulsion (Mc) susceptible d'être mise en oeuvre dans le cadre du procédé selon l'invention. Cette microémulsion de type eau dans huile comprend : 36 au moins un tensioactif, notamment tel que précédemment défini, éventuellement au moins un co-tensioactif, notamment tel que précédemment défini, au moins un solvant non-polaire ou faiblement polaire, notamment tel que précédemment défini, au moins un solvant polaire, notamment tel que précédemment défini, au moins une molécule d'intérêt, notamment telle que précédemment définie, - au moins un premier alcoxyde de silicium, notamment tel que précédemment défini, au moins un second alcoxyde de silicium 15 présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt, notamment tel que précédemment défini, au moins un composé capable d'hydrolyser 20 lesdits alcoxydes de silicium, notamment tel que précédemment défini, et éventuellement un élément apte à conférer des propriétés magnétiques tel que précédemment défini. Avantageusement, la microémulsion de type eau 25 dans huile objet de la présente invention comprend : au moins un tensioactif en une quantité comprise entre 1 et 40 %, notamment entre 5 et 30 % et, en particulier, entre 10 et 25 % ; éventuellement au moins un co-tensioactif en 30 une quantité comprise entre 1 et 30 %, notamment entre et 25 % et, en particulier, entre 10 et 20 % 5 10 37 au moins un solvant non-polaire ou faiblement polaire en une quantité comprise entre 40 et 95 %, notamment entre 50 et 90 % et, en particulier, entre 60 et 80 % ; au moins un solvant polaire en une quantité comprise entre 0,25 et 20 %, notamment entre 0,5 et 10 % et, en particulier, entre 1 et 5 % ; au moins une molécule d'intérêt en une quantité comprise entre 0,0001 et 2 %, notamment entre 10 0,005 et 0,5 % et, en particulier, entre 0,001 et 0,1 0 o ; au moins un premier alcoxyde de silicium en une quantité comprise entre 0,05 et 20 %, notamment entre 0,1 et 10 % et, en particulier, entre 0,5 et 15 5 % ; au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt en une quantité comprise entre 20 0,0005 et 0,2 %, notamment entre 0,001 et 0,1 % et, en particulier, entre 0,005 et 0,05 % au moins un composé capable d'hydrolyser ledit composé à base de silane en une quantité comprise entre 0,01 et 5 %, notamment entre 0,05 et 1 % et, en 25 particulier, entre 0,1 et 0,5 % ; et éventuellement un élément apte à conférer des propriétés magnétiques en une quantité comprise entre 0,001 et 5 %, notamment entre 0,005 et 1 % et, en particulier, entre 0,01 et 0,5 % ; 30 les différentes quantités sont exprimées en volume par rapport au volume total de la microémulsion.5 38 La présente invention concerne enfin l'utilisation d'une particule de silice selon l'invention dans différents domaines tels que les capteurs, le diagnostic in vivo ou in vitro, la traçabilité, la lutte contre la contrefaçon, la préservation et/ou le transport de molécules d'intérêt. En effet, comme précédemment expliqué, les particules de silice selon l'invention présente un certain nombre de caractéristiques listées ci-dessous : protection de la molécule d'intérêt incorporée dans la particule de silice et notamment dans le coeur de cette particule par la silice, maintient dans la particule de silice de la molécule d'intérêt grâce aux liaisons non covalentes entre la molécule d'intérêt et les unités issues du 2nd alcoxyde de silicium ; - porosité de la particule de silice qui permet le passage de molécules de petite ou grande taille. Dans l'application dans les capteurs, la molécule d'intérêt incorporée dans la particule de silice selon l'invention sera choisie de façon à être capable de capter un élément donné. Dans l'application dans le diagnostic, la particule de silice selon l'invention via la molécule d'intérêt qu'elle a incorporée peut servir de substrat à des réactions biologiques. Ainsi, la présente invention concerne la particule de silice pour utilisation comme agent de diagnostic. 39 La partie expérimentale ci-après présente l'utilisation des particules de silice incorporant un acide nucléique et notamment un ADN lésé pour étudier l'activité d'enzymes de réparation ou l'activité réparatrice d'un extrait donné tel qu'un extrait cellulaire. Les particules de silice selon l'invention peuvent être placées dans de petits volumes d'extraits biologiques contenant les enzymes à doser. Les particules de silice peuvent également être utilisées in cellulo. En variante, l'intérieur de la particule de silice selon l'invention peut servir de réacteur où la réaction est déclenchée par l'entrée d'un petit substrat qui passe par les pores de la silice (hybridation par exemple dans la circulation sanguine). Dans le cadre des applications de marquage anti-contrefaçon et de traçabilité, la molécule d'intérêt est avantageusement de l'ADN car il permet de coder un grand nombre d'informations dans un petit volume et ces informations sont amplifiables et décodables de façon spécifique par des protocoles maîtrisés et connus de la biotechnologie. Le marquage ADN est d'ailleurs déjà proposé sur le marché par des entreprises. Ces solutions utilisent l'ADN introduit sous forme moléculaire dans les liquides notamment. Dans la présente invention, les expériences décrites montrent que l'ADN encapsulé dans les particules de silice reste accessible pour, d'une part, l'amplification spécifique (PCR) et, d'autre part, la réparation in-situ. Par ce dernier procédé, on peut avoir un décodage de l'information par l'introduction 40 d'un ADN lésé et connu dans la particule puis par une réparation spécifique permettant de le rendre fluorescent et donc détectable. Le fait d'avoir l'ADN dans une particule de silice permet de l'isoler suffisamment du milieu ambiant dans lequel on souhaite l'incorporer pour faire du marquage (pour une application de traçabilité ou anti-contrefaçon). Le fait de l'encapsuler dans une particule de silice permet également d'avoir accès à la fonctionnalisation de la silice afin de rendre ces nanotraceurs compatibles avec des solvants ou des matériaux variés. Par exemple, il est possible de greffer, à la surface des nanoparticules, des fonctions hydrophobes telles que des fonctions thiol, ou de longues chaînes carbonées ou fluorées, et ainsi pouvoir disperser ces particules dans des solvants organiques. Ceci peut par exemple servir à marquer des polymères ou des liquides organiques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-après donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La Figure 1 présente un schéma de principe décrivant la structure d'une nanoparticule de silice avec l'ADN plasmidique encapsulé en son coeur ainsi que les interactions hydrogène entre le réseau de silice di-aminée et les groupements phosphates de l'ADN. 41 La Figure 2 présente des images par microscopie électronique à transmission de nanoparticules de silice selon l'invention encapsulant de l'ADN. La Figure 3 présente les graphiques représentant la distribution des nanoparticules de silice en nombre en fonction de la taille, les nanoparticules de silice ayant été synthétisées selon protocole II ci-après : taille environ 40 nm (Figure 3A) ou selon protocole I : taille environ 100 nm (Figure 3B). La Figure 4 présente une image par microscopie électronique en transmission de nanoparticules de silice selon l'invention encapsulant de l'acide polyacrylique (protocole IV). La Figure 5 présente l'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose 1% des nanoparticules de silice non fonctionnalisées synthétisées avec de l'ADN (Figure 5A) et des nanoparticules de silice selon l'invention i.e. fonctionnalisées synthétisées avec de l'ADN (Figure 5B). Figure 5A : pistes 1 à 4 (contrôle) : marqueurs de masse moléculaire, plasmide linéarisé (200 ng), plasmide superenroulé (200 ng) et nanoparticules de silice, respectivement ; piste 5 : nanoparticules de silice préparées en présence d'ADN puis dialysées ; pistes 6 à 8 : différentes dilutions de nanoparticules de silice préparées en présence d'ADN. Figure 5B : pistes 1 à 3 (contrôle) : marqueurs de masse moléculaire, plasmide seul (14 ng, concentration insuffisante), nanoparticules de silice préparées sans ADN ; piste 4 : vide ; piste 5 : 42 nanoparticules de silice encapsulant de l'ADN et piste 6 : nanoparticules de silice encapsulant de l'ADN-IP. La Figure 6 présente les analyses de spectroscopie fluorescente de l'ADN marqué à l'IP dans de l'eau (Figure 6A), de nanoparticules de silice encapsulant de l'ADN marqué à l'IP dans de l'eau (Figure 6B), de l'ADN marqué au Cy3 dans de l'eau (Figure 6C) et de nanoparticules de silice encapsulant de l'ADN marqué au Cy3 (Figure 6D). La Figure 7 présente les spectres d'émission des nanoparticules analysées en microscopie confocale obtenues après excitation à 488 nm. Les nanoparticules étudiées sont des nanoparticules de silice préparées sans ADN (Billes de silice pure), des nanoparticules de silice encapsulant de l'ADN (Billes de silice/ADN), encapsulant de l'ADN-IP (Billes de silice/ADN-IP) ou encapsulant de l'ADN-Cy3 (Billes de silice/ADN-Cy3) soumises à une excitation à 488 nm. La Figure 8 présente la quantification de la réparation/ nick-translation par fluorescence sur le gel d'agarose 2%, à l'aide du Typhonn 9400 sur de l'ADN encapsulé dans des nanoparticules de silice selon l'invention encapsulant de l'ADN avec le dCTP-Cy3 comme marqueur fluorescent, sans enzyme « Blanc » et avec enzyme « Nick translation » (Figure 8A) ou avec du biotine-ddCTP révélée ensuite par streptavidine-Fluoprobes 647, sans enzyme « Blanc » et avec enzyme « Nick translation 4 » (Figure 8B). La Figure 9 présente la quantification des tests de réparation après gel d'électrophorèse sur des nanoparticules de silice (Si) et sur des nanoparticules 43 de silice selon l'invention encapsulant de l'ADN (Si/ADN), de l'ADN lésé (Si/ADN lésé), du PAA et de l'ADN (Si/PAA/ADN) ou du PAA et de l'ADN lésé (Si/PAA/ADN lésé). EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS 1. Protocole de synthèse de nanoparticules encapsulant de l'ADN. 1.1. Nanoparticules encapsulant de l'ADN d'une 10 taille de l'ordre de 100 nm (Protocole I) Les nanoparticules ont été préparées en utilisant la méthode de microémulsion inverse (eau dans huile) [6]. La solution de microémulsion a été préparée en 15 mélangeant les quantités adéquates de tensioactif, de co-tensioactif, de solvant organique, d'eau et de solution aqueuse d'ammoniaque, d'APTMES (3-aminopropyltriméthoxysilane; d = 1,027; M = 179,29 gmol-1) et de TEOS (tétraéthoxysilane; d = 0,934; M = 208,33 gmol-1). 20 L'ammoniaque (NH4OH) en se décomposant agit comme réactif (H20) et comme catalyseur (NH3) de l'hydrolyse du TEOS et de l'APTMES. La préparation classique d'une microémulsion inverse pour fabriquer des nanoparticules de silice 25 contenant un plasmide est décrite ci-après. Ce protocole permet d'obtenir des particules de l'ordre de 100 nm (voir les photos TEM de la Figure 2). La procédure consiste à ajouter dans un ballon de 50 mL, en respectant l'ordre décrit, les produits 30 chimiques suivants : le tensioactif triton X100 (2,1 mL), le co-tensioactif n-hexanol (2,05 mL), le5 44 solvant organique cyclohexane (9,38 mL). La solution est alors agitée à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, le plasmide (100 pL à 5 pg/pL dans l'eau, 3000 pb), l'eau (200 pL) ainsi que de l'ammoniaque à 33% (125 pL, catalyseur de l'hydrolyse des alcoxydes de silicium) sont additionnés à la solution. L'émulsion formée est agitée 15 min. Les alcoxydes de silicium APTMES (1,5 pL) et TEOS (123,75 pL) sont injectés dans cette émulsion. L'injection peut se faire successivement en commençant par l'APTMES ou bien simultanément. Dans les deux cas, les résultats obtenus sont identiques. La réaction est alors agitée pendant 24 h à température ambiante. L'émulsion est enfin déstabilisée par l'ajout d'éthanol (45 mL) et les nanoparticules sont rincées trois fois à l'éthanol et une fois à l'eau. Chaque lavage est suivi d'une centrifugation à 5000 rpm pendant 15 min pour sédimenter les nanoparticules. Les nanoparticules de silice sont dispersées par vortex dans l'eau (5 mL). Elles sont ensuite dialysées 1 nuit dans 600 ml d'H20 (MWCO : 4000-6000), ce qui permet l'élimination de l'ADN libre, et d'éventuelles traces de surfactant. Elles sont alors prêtes à être caractérisées et utilisées. 1.2. Nanoparticules encapsulant de l'ADN d'une taille de l'ordre de 50 nm (Protocole II) Pour obtenir des particules de 50 nm, le protocole est modifié en changeant le rapport eau/surfactant/phase huileuse. 45 La procédure consiste à ajouter dans un ballon de 50 mL, dans l'ordre, les produits chimiques suivants : le tensioactif triton X100 (6,7 mL), le cotensioactif n-hexanol (6,6 mL), le solvant organique cyclohexane (15 mL). La solution est alors agitée à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, le plasmide (100 pL à 5 pg/pL dans l'eau, 3000 pb), l'eau (300 pL) ainsi que de l'ammoniaque à 33% (100 pL, catalyseur de l'hydrolyse des alcoxydes de silicium) sont additionnés à la solution. L'émulsion formée est agitée 15 min. Les alcoxydes de silicium APTMES (1,5 pL) et TEOS (98,5 pL) sont injectés dans cette émulsion. La réaction est agitée pendant 24 h à température ambiante. L'émulsion est enfin déstabilisée par l'ajout d'éthanol (45 mL) et les nanoparticules sont rincées trois fois à l'éthanol et une fois à l'eau. Chaque lavage est suivi d'une centrifugation à 5000 rpm pendant 15 min pour sédimenter les nanoparticules. Les nanoparticules de silice dispersées par vortex dans l'eau (5 mL). Elles sont ensuite dialysées 1 nuit dans 600 ml d'H2O (MWCO : 4000-6000), ce qui permet l'élimination des petites molécules résiduelles. Elles sont alors prêtes à être caractérisées et utilisées. 1.3. Nanoparticules encapsulant de l'ADN d'une taille de l'ordre de 15 nm (Protocole III) Pour obtenir des particules encore plus petites (de l'ordre de 15 nm) il est possible d'utiliser un autre surfactant, selon le protocole ci-après. 46 Dans un ballon, sont mélangés sous agitation magnétique 1,3 mL de tensioactif IGEPAL CO-520 avec 10 mL de cyclohexane. Le mélange se fait à température ambiante et pendant 30 min. Puis est introduite une solution de plasmide (100 pL à 5 pg/pL dans l'eau) suivie d'un volume de 380 pL d'eau. Ensuite un volume de 100 pL d'ammoniaque à 33% est ajouté à l'émulsion toujours sous agitation. La solution est agitée pendant 30 min afin de stabiliser le système avant l'ajout successif ou simultané des précurseurs de silice de la même façon que pour les autres protocoles, à savoir : 1,5 pL d'APTMES et 98,5 pi de TEOS. Dans le cas d'un ajout successif, on commence par ajouter l'APTMES puis le TEOS. La solution est laissée sous agitation pendant 24 h. L'émulsion est enfin déstabilisée par l'ajout d'éthanol (45 mL) et les nanoparticules sont rincées trois fois à l'éthanol et une fois à l'eau. Chaque lavage est suivi d'une centrifugation à 5000 rpm pendant 15 min pour sédimenter les nanoparticules. Les nanoparticules de silice sont dispersées par vortex dans l'eau (5 mL). Elles sont ensuite dialysées 1 nuit dans 600 ml d'H2O (MWCO : 4000-6000), ce qui permet l'élimination de l'ADN libre et des petites molécules résiduelles. Elles sont alors prêtes à être caractérisées et utilisées. Cependant, dans ce cas, si l'on souhaite encapsuler de l'ADN, il est nécessaire d'utiliser un plasmide plus petit ( II. Protocole de synthèse de nanoparticules encapsulant de l'acide polyacrylique (Protocole IV) Les nanoparticules ont été préparées en utilisant le protocole I. La seule différence réside dans l'étape où le polymère acide polyacrylique (100 pL à 5 pg/pL dans l'eau, soit une concentration de 0,4 pM, MW = 1 250 000 gmol-1) est introduit dans la synthèse à la place de l'ADN. III. Protocole de synthèse de nanoparticules encapsulant à la fois de l'ADN et de l'acide 15 polyacrylique (Protocole V) Dans un ballon, sont mélangés, sous agitation magnétique, 2,1 mL de tensioactif Triton X100 avec 2,05 mL de n-hexanol et 9 mL de cyclohexane. Le mélange se fait à température ambiante et pendant 15 min. 20 Puis sont introduits 50 pL de solution d'acide polyacrylique (MW = 1 250 000 gmol-1, C = 0,4 pM) et une solution de plasmide (100 pL à 5 pg/pL dans l'eau, 3000 pb) suivie d'un volume de 150 pL d'eau. Ensuite un volume de 125 pL d'ammoniaque à 33% 25 est ajouté à l'émulsion toujours sous agitation. La solution est agitée pendant 30 min afin de stabiliser le système avant l'ajout successif ou simultané des précurseurs de silice de la même façon que pour les autres protocoles à savoir : 1,5 pL d'APTMES et 30 123,6 pL de TEOS. Dans le cas d'un ajout successif on 48 commence par ajouter l'APTMES puis le TEOS. La solution est laissée sous agitation pendant 24 h. L'émulsion est enfin déstabilisée par l'ajout d'éthanol (45 mL) et les nanoparticules sont rincées trois fois à l'éthanol et une fois à l'eau. Chaque lavage est suivi d'une centrifugation à 5000 rpm pendant 15 min pour sédimenter les nanoparticules. Les nanoparticules de silice dispersées par vortex dans l'eau (5 mL) sont dialysées 24 h. Les particules dialysées sont alors prêtes à être caractérisées et utilisées (MWCO : 4000-6000). Le ratio acide polyacrylique/ADN peut être modifié afin d'obtenir des objets plus volumineux et ayant une couche de silice plus fine. IV. Caractérisation des nanoparticules encapsulant de l'ADN et/ou de l'acide polyacrylique L résultats et les caractérisations présentés ci-dessous ont été obtenus sur des nanoparticules de silice dans lesquelles des plasmides ont été incorporés par synthèse micellaire inverse. Cette caractérisation a permis de démontrer : - d'une part, l'efficacité du procédé d'encapsulation de l'ADN et - d'autre part, la fonctionnalité de ces objets : c'est-à-dire l'accessibilité de l'ADN encapsulé pour plusieurs types de réactions biologiques spécifiques de l'ADN, malgré le fait qu'il soit encapsulé dans les nanoparticules. Ceci provient du fait que la coquille de la particule est constituée de silice poreuse. 49 IV.1. Caractérisation morphologique i. Encapsulation d'ADN Les clichés MET des particules de silice avec l'ADN encapsulé selon le protocole I sont présentés sur la Figure 2. Ces images montrent que la taille des particules est comprise entre 50 et 80 nm. Par ailleurs, un contraste très net est visible entre le coeur de la particule et la couche de surface. Ce contraste est dû à une différence de densité électronique qui montre clairement que la couche externe des particules est essentiellement composée de silice et que le coeur lui est constitué majoritairement de l'ADN. Une mesure des particules par diffusion dynamique de la lumière (DLS pour « Dynamic Light Scattering », Nanosizer de chez Malvern) confirme les observations MET (Figure 3). ii. Encapsulation d'acide polyacrylique Afin de conforter ce point, une expérience similaire a été menée en encapsulant cette fois un polymère de structure similaire à l'ADN et dont le comportement vis-à-vis des alcoxydes de silicium et de la synthèse sol-gel est similaire à l'ADN (protocole IV). Ce polymère est l'acide polyacrylique. Le protocole de synthèse utilisé est identique à celui utilisé dans le cas de l'ADN mis à part que l'on remplace l'ADN par l'acide polyacrylique (cf. point II). 50 La caractérisation MET des particules obtenues montre des structures similaires avec un coeur moins dense que la coquille. Cette caractérisation montre donc que les molécules telles que l'ADN ou l'acide polyacrylique se retrouvent préférentiellement au coeur des particules et qu'une coquille externe de silice se forme (Figure 4). Dans le cas de l'acide polyacrylique, la taille des particules est beaucoup plus polydisperse qu'avec l'ADN, avec des particules allant de 40 nm à 150 nm. Ceci vient du fait probablement de la perturbation de l'émulsion par l'acide polyacrylique mal dissous dans la phase aqueuse. Cette dispersion est beaucoup moins importante dans le cas de l'encapsulation de l'ADN. IV.2. Caractérisation du potentiel de surface Afin de vérifier que la surface des nanoparticules est bien composée de silice et non d'ADN, une mesure de potentiel zeta a été faite sur des billes sans ADN et avec ADN. A pH 7, le potentiel des particules de silice est de -30 mV et celui des nanoparticules encapsulant de l'ADN de -25 mV. Le potentiel de surface des particules des deux synthèses étant quasiment identique, cette mesure montre que la surface se compose majoritairement de silice et que l'ADN est confiné majoritairement au coeur de la particule de silice. IV.3. Démonstration de la présence de l'ADN dans les nanoparticules par méthode électrophorétique 51 Afin de démonter que le procédé précédemment décrit utilisant un précurseur de silice avec des fonctions amine (nanoparticules de silice fonctionnalisées) permet l'encapsulation stable de l'ADN dans les nanoparticules, on effectue une analyse comparative du profil de migration sur gel d'agarose des différentes préparations en présence des témoins adaptés. On compare ainsi par cette méthode, les capacités de piégeage d'ADN de nanoparticules préparées avec une silice sans fonction amine (noté Si) ou avec fonctions amines (dites « fonctionnalisées »; noté SiNH2) (Protocole 1). On peut ainsi différencier les préparations pour lesquelles l'ADN est piégé dans les nanoparticules de celles pour lesquelles l'ADN est simplement adsorbé sur les billes. Les propriétés suivantes de l'électrophorèse sur gel d'agarose 1% sont utilisées : les nanoparticules restent confinées dans le puits de dépôt, l'ADN non piégé migre dans le gel sous la force du courant électrique appliqué. Les fragments d'ADN sont séparés en fonction de leur poids moléculaire et de leur encombrement (1 kb a un poids moléculaire de 330 000 g.mol-1). L'ADN négativement chargé migre vers l'anode tandis que les ions positifs du tampon migrent vers la cathode ralentissant ainsi la migration de l'ADN en séparant ces fragments. La Figure 5 présente le profil de migration électrophorétique des deux préparations de 52 nanoparticules /ADN en présence de témoins adéquats. L'ADN est révélé par BEI. Les nanoparticules de silice déposées sur le gel ont été synthétisées à partir d'une émulsion contenant l'ADN et uniquement du TEOS comme précurseur de silice (noté Si) (Figure 5A). Les billes de silice déposées sur le gel ont été synthétisées avec l'ADN, le TEOS et une proportion d'APTES suivant le protocole décrit précédemment (noté Si/NH2) (Protocole I) (Figure 5B). Pour l'échantillon Figure 5A, les plasmides ont été encapsulés en les ajoutant à la phase aqueuse de la synthèse micellaire. Le profil électrophorétique sur gel d'agarose de ces nanoparticules a été comparé aux plasmides libres non encapsulés (piste 3) et aux nanoparticules sans ADN (piste 4). La Figure 5A montre les nanoparticules de silice synthétisées avec des plasmides avant dialyse (pistes 6, 7 et 8) et après dialyse (piste 5) ainsi que des nanoparticules de silice seule (piste 4) et les plasmides non encapsulés (piste 3). Cette expérience montre que, dans les pistes 6, 7 et 8, les plasmides, qui ont migré comme le plasmide témoin non encapsulé (piste 3), sont libres. De plus, après dialyse (piste 5), les plasmides ne sont plus visibles dans le gel, ils ont donc été éliminés pendant la dialyse. On en conclut que les plasmides sont repoussés à la surface pendant la synthèse des nanoparticules et qu'ils se désorbent en dialyse. Les résultats obtenus avec les nanoparticules synthétisées suivant le protocole I à partir des 53 fonctions amines de l'APTES, sont exposés Figure 5B. Le gel d'agarose montre que les nanoparticules colocalisent avec les plasmides révélés par BET (pistes 5 et 6). Ces plasmides restent dans les puits, il n'y a pas de désorption pendant la migration sur gel. Cette expérience nous indique que grâce a la fonctionnalisation, les plasmides restent accrochés aux nanoparticules. De plus, il n'y a pas de séparation par électrophorèse, l'ADN se trouve donc à l'intérieur des nanoparticules, piégé par la silice et le BET pénètre dans la matrice de silice poreuse pour s'intercaler entre les paires de bases de l'ADN. IV.4. Démonstration de la présence de l'ADN 15 dans les nanoparticules par microscopie confocale et spectrométrie Des analyses en fluorescence et microscopie confocale ont été réalisées pour confirmer la présence de l'ADN dans les nanoparticules fonctionnalisées. Pour 20 détecter l'ADN, ce dernier a tout d'abord été marqué par différents fluorophores tels que l'iodure de propidium (IP ; par incubation simple entre l'ADN et l'IP) et le Cy3 (par marquage enzymatique par nick- translation). Nous avons ensuite encapsulé ces 25 plasmides marqués par la méthode des nanoparticules fonctionnalisées (Protocole I). Les résultats obtenus sont décrits ci-après. i. Analyse en fluorescence 30 Les graphiques Figures 6A et 6B permettent de comparer la fluorescence de l'IP dans de l'eau (Figure 54 6A) et des nanoparticules de silice ayant encapsulé l'ADN marqué à l'intercalant IP (Figure 6B). Les mêmes courbes d'excitation et d'émission sont observées dans les deux cas. L'ADN est donc bien présent dans les particules de silice. Le graphique Figure 6C correspond aux analyses la fluorescence de l'ADN marqué au translation dans de l'eau comparé nanoparticules encapsulant ce même ADN Cy3 par nickà celui des marqué au Cy3 de (Figure du pic 6D). Le graphique Figure 6D d'émission de fluorescence montre la présence du Cy3 dans les 10 nanoparticules de silice. L'ADN est donc bien présent dans les nanoparticules de silice. 15 ii. Analyse par microscopie confocale D'après les images de microscopie confocale, les nanoparticules ne contenant pas d'ADN marqué ne sont pas visibles (billes + IP seul, billes + ADN non marqué, billes seules), contrairement à celles ayant 20 été préparées avec de l'ADN marqué fluorescent. Des films à base d'acide polyvinylique (APV) ont été préparés, et les nanoparticules étudiées ont été incorporées dans ces films afin d'en étudier la fluorescence par microscopie confocale. Les spectres 25 d'émissions de ces nanoparticules sont regroupés Figure 7. Ces courbes concordent avec celles de la Figure 6, ce qui confirme la présence des fluorophores dans les nanoparticules de silices. 55 V. Démonstration de l'accessibilité aux enzymes de l'ADN encapsulé dans les nanoparticules selon l'invention La présence d'ADN et son accessibilité sont mises en évidence par des réactions biologiques se déroulant spécifiquement sur l'ADN. Ceci permet le marquage spécifique de l'ADN et donc sa détection. V.1. Marquage et réparation de l'ADN encapsulé 10 par nick-translation Les résultats précédents démontrent que les nanoparticules de silice synthétisées et fonctionnalisées par voie micellaire inverse sont capables de retenir dans leur coeur les plasmides. Ces 15 plasmides restent accessibles aux petites molécules type BET qui diffusent à travers les pores du réseau de silice. Les expériences suivantes ont pour objectif de démontrer que l'ADN encapsulé est également accessible 20 à des molécules volumineuses de type enzymes qui utilisent l'ADN comme substrat, au sens enzymatique du terme. Il a été procédé à un marquage enzymatique en incubant les nanoparticules/ADN (Protocole I) avec des 25 enzymes commerciales et différents nucléotides marqués. Une réaction contrôle (nanoparticules dans le même mélange réactionnel exempt d'enzyme appelé « blanc ») est conduite en parallèle. La méthode bien connue des biologistes de 30 marquage par nick-translation a été utilisée via un kit commercial (N5500, Amersham, GE Healthcare) en présence 56 de dCTP-Cy3 ou de ddCTP-biotine. Dans ce dernier cas, une incubation supplémentaire en présence de streptavidine-FluoProbes 647 (Interchim) est nécessaire pour révéler l'incorporation de ddCTP-biotine au niveau de l'ADN. Protocole expérimental : Les billes (40 pl) sont incubées avec 21 pl de chacun des dATP, dGTP, dTTP du kit (solutions à 300 pM). On ajoute 6 pl de dCTP (300 pM), 3 pl de dCTPCy3 ou bien 3 pl de ddCTP-biotine (Perkin Elmer) à 1 mM et 30 pl du mélange enzymatique du kit (contenant un mélange de DNA polymérase I et de DNAse I). La réaction procède pendant 4 h à 15°C et est arrêtée par addition de 6 pl d'EDTA 0,5 M. Les billes sont lavées 2 fois avec 150 pl de PBS contenant NaCl 0,2 M et Tween 20 0,1% puis 2 fois avec de l'eau distillée. Dans le cas où le marqueur utilisé est le ddCTP-biotine, 100 pl de cette réaction sont ensuite incubés avec 40 pl de streptavidine-FluoProbes 647 (Interchim) pendant 15 min à température ambiante. Le mélange est lavé comme décrit précédemment. Les nanoparticules sont reprises par 100 pl d'eau distillée. Une quantité identique (10 pl) des différentes réactions de nick-translation est déposée dans les puits de charge d'un gel d'agarose 2% Afin de déterminer si un marquage par nick- translation a bien eu lieu au niveau de l'ADN, la fluorescence des nanoparticules encapsulant de l'ADN 57 est mesurée, après élimination des nucléotides non incorporés dans l'ADN, grâce à une électrophorèse des mélanges réactionnels sur gel d'agarose. Les solutions de marquage sont déposées dans les puits de charge d'un gel d'agarose à 2%. Pendant l'électrophorèse, les nanoparticules restent dans le puits de dépôt, tandis que l'ADN libre et les nucléotides non incorporés, chargés négativement, migrent dans l'agarose vers l'anode. Ceci est particulièrement visible au niveau des pistes dans lesquelles ont été déposés du dCTP-Cy3 et du dCTP-Cy5 purs, le Cy5 étant équivalent au FluoProbes 657 en terme de spectre de fluorescence. La quantification de la fluorescence est réalisée avec un lecteur Typhoon 9400 (GE Healthcare). Cet appareil permet la quantification simultanée de plusieurs fluorophores. Sur le graphique Figure 8A, est rapportée la quantification de la fluorescence présente dans les puits correspondant au test de nick-translation réalisé avec le dCTP-Cy3 comme marqueur fluorescent, sans enzyme « Blanc » et avec enzyme « Nick translation ». Sur le graphique Figure 8B, est rapportée la quantification de la fluorescence présente dans les puits correspondant au test de nick-translation réalisé avec du biotine-ddCTP révélée ensuite par streptavidine-Fluoprobes 647, sans enzyme « Blanc » et avec enzyme « Nick translation 4 ». On voit sur les histogrammes que la fluorescence est plus importante dans les puits correspondant aux réactions effectuées en présence d'enzymes. Ceci signifie qu'un marquage enzymatique a 58 bien eu lieu au niveau de l'ADN piégé dans les nanoparticules. L'ADN est donc bien accessible à des molécules du milieu extérieur des nanoparticules. V.2. Test de réparation de l'ADN encapsulé par excision resynthèse Au cours du test de réparation de l'ADN, les nanoparticules préparées avec de l'ADN plasmidique ou pas sont incubées avec des extraits cellulaires actifs (extraits nucléaires HeLa), de l'ATP et des nucléotides marqués par un fluorophore. L'extrait cellulaire contient entre autres les enzymes responsables de la réparation de l'ADN par excision resynthèse (réparation par excision de base et réparation par excision de nucléotides), l'ATP est indispensable à la catalyse de certaines réactions enzymatiques et les nucléotides fluorescents seront incorporés dans l'ADN par les polymérases contenues dans les extraits si la réparation a lieu. Cette expérience a été réalisée avec les nanoparticules/ADN préparées avec le Protocole I, en utilisant de l'ADN non lésé ainsi que de l'ADN lésé. Cette expérience a également été réalisée en utilisant des nanoparticules/ADN préparées selon le protocole V (mélange acide polyacrylique/ADN). L'ADN lésé, c'est-à-dire comportant des lésions de bases a été obtenu par irradiation UVC à une dose de 4.5 J/cm2 des plasmides non lésés. La réaction de réparation a également été effectuée avec les différentes billes préparées sans ADN. 59 Pour effectuer un test de réparation de l'ADN, les différents composants sont ajoutés, dans les proportions adéquates. Dans un tube de volume final 50 pl, le tampon ATG 5x (200 mM Hepes KOH pH 7,8; 35 mM MgCl2; 2,5 mM DTT; 1,25 pM dATP; 1,25 pM dTTP; 1,25 pM dGTP; 10 mM EDTA; 17% glycérol; 50 mM phosphocréatine; 250 pg/ml créatine phosphokinase; 0,5 mg/ml BSA), l'ATP (0,5 pl, solution à 100 mM), le dCTP-Cy5 (0,25 pl d'une solution 10-5 M), l'extrait nucléaire HeLa (1 pl à 10 mg/ml ; CilBiotech, Belgique), l'eau et les nanoparticules dispersées dans de l'eau. On incube 4 h à 37°C. Après réaction, les nanoparticules sont centrifugées et lavées deux fois avec 150 pl de PBS contenant NaCl 0,2 M et Tween 20 0,1%, une fois avec de l'éthanol puis 2 fois avec de l'eau distillée. Les nanoparticules sont ensuite dispersées dans 100 pL d' eau. Une quantité identique (10 pl) des différentes réactions de réparation est déposée dans les puits de charge d'un gel d'agarose 2%. La mesure de fluorescence est réalisée après élimination par électrophorèse sur gel d'agarose des nucléotides non incorporés dans l'ADN. Pendant l'électrophorèse, les billes restent dans le puits de dépôt, tandis que l'ADN libre et les nucléotides non incorporés migrent dans l'agarose vers l'anode. La quantification de la fluorescence dans chaque puits est réalisée avec un lecteur Typhoon 9400 (GE Healthcare). Les valeurs sont rapportées dans l'histogramme Figure 9. 60 Sur cet histogramme, la quantité de fluorescence est clairement plus élevée lorsque l'ADN encapsulé a été préalablement lésé, qu'avec un ADN sans lésion, ou pas d'ADN du tout. Les réactions de réparation ont donc bien eu lieu au niveau des nanoparticules encapsulant l'ADN. L'ADN encapsulé est donc bien accessible à des enzymes contenues dans le milieu extérieur et la réaction qui a lieu est bien spécifique. L'ADN encapsulé peut donc servir de substrat pour le dosage d'activités d'enzymes présentes dans le milieu extérieur. RÉFÉRENCES [1] StOber et al. (1968) « Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range » Journal of Colloid and Interface Science 26(1): 62-69. [2] Bogush et al. (1988) « Preparation of monodisperse silica particles: Control of size and mass fraction » Journal of Non-Crystalline Solids 104(1): 95-106. [3] Lindberg et al. 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REVENDICATIONS1) Particule de silice poreuse, incorporant au moins une molécule d'intérêt et essentiellement obtenue à partir de l'hydrolyse : - d'au moins un premier alcoxyde de silicium de formules Si(OR)4, R2Si (0R3) 3 ou R4R5Si (0R6) 2 dans lesquelles RI, R3 et R6, identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone et R2, R4 et R5, identiques ou différents, représentent un hydrogène, un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou un radical alcényle de 1 à 6 atomes de carbone, et d'au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt. 2) Particule de silice selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite particule de silice est une particule de type cœur/coquille. 3) Particule de silice selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite (ou lesdites) molécule(s) d'intérêt est(sont) maintenue (s) et protégée(s) dans ladite particule de silice. 4) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite (ou lesdites) molécule(s) d'intérêt est(sont) 65 accessible(s) à des molécules présentes dans le milieu extérieur de ladite particule. 5) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par une enzyme, une protéine, un oligopeptide, un peptide, un antigène, un anticorps, un acide nucléique, un polymère et un glucide. 6) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les radicaux R2, R4 et R5 dudit premier alcoxyde de silicium, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par un hydrogène, méthyle, éthyle, vinyle et propyle. 7) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit premier alcoxyde de silicium est choisi dans le groupe constitué par le tétraméthoxysilane, le tétraéthoxysilane, le tétrapropoxysilane, le tétrabutoxysilane, le triméthoxysilane, le méthyltriméthoxysilane, l' éthyltriméthoxysilane, le propyltriméthoxysilane, le vinyltriméthoxysilane, le triéthoxysilane, le méthyltriéthoxysilane, l' éthyltriéthoxysilane, le propyltriéthoxysilane, le vinyltriéthoxysilane, et leurs mélanges. 8) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que 66 ledit second alcoxyde de silicium est de formules R7Si (0R8) 3 ou R9R10Si (OR11) 2 dans lesquelles R8 et R11, identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone et R7, R9 et R10r identiques ou différents, représentent un radical alkyle de 1 à 8 atomes de carbone, un radical hétéroalkyle de 1 à 10 atomes de carbone, un radical alkylaryle de 1 à 12 atomes de carbone ou un radical alcényle de 1 à 8 atomes de carbone, le radical R7 et l'un au moins des radicaux R9 et R10 étant substitués par au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt. 9) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène est choisi dans le groupe constitué par -NH2, -NHR12 avec R12 représentant un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -NH3, -NH2R13+ avec R13 représentant un radical alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -COOH, -COO-, C(0)NH, -C (0) , -SH et -OH. 10) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit second alcoxyde de silicium utilisable dans le cadre de la présente invention est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de N-triméthoxysilylpropyl- N,N,N-triméthylammonium, l'aminoéthylaminométhyl)- phénéthyltriméthoxysilane, le N-(6- 67 aminohéxyl)aminopropyltriméthoxysilane, le 3- aminopropyl-méthyl-diéthoxysilane, le 3-aminopropyl- triméthoxysilane, le 3-aminopropyl-triéthoxysilane, le 3-(2-aminoéthylamino)propyl-triméthoxysilane, le (3- mercaptopropyl) triméthoxysilane, le (3-mercaptopropyl) triéthoxysilane et leurs mélanges. 11) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un élément apte à lui conférer des propriétés magnétiques. 12) Procédé pour préparer une particule de silice incorporant au moins une molécule d'intérêt selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation, en présence de ladite molécule d'intérêt, d'au moins une particule de silice par émulsion inverse à partir : - d'au moins un premier alcoxyde de silicium tel que défini à l'une quelconque des revendications 1, 6 et 7, d'au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 et 8 à 10. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes . 68 a) préparer une microémulsion (Ma) du type eau dans huile contenant ladite (ou lesdites) molécule(s) d'intérêt, b) ajouter, à la microémulsion (Ma) préparée à l'étape (a), un composé permettant l'hydrolyse d'un alcoxyde de silicium, c) ajouter, à la microémulsion (Mb) obtenue à l'étape (b), au moins un premier alcoxyde de silicium tel que défini à l'une quelconque des revendications 1, 6 et 7 et au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 et 8 à 10, d) ajouter à la microémulsion (Mc) obtenue à l'étape (c) un solvant permettant de déstabiliser ladite microémulsion, et e) recupérer les particules de silice incorporant au moins une molécule d'intérêt, précipitées lors de l'étape (d). 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite étape (a) du procédé consiste à préparer une première solution (M1) dans laquelle est ultérieurement incorporée au moins une molécule d'intérêt, ladite solution (M1) étant obtenue en mélangeant ensemble au moins un tensioactif, éventuellement au moins un co-tensioactif et au moins un solvant non-polaire ou faiblement polaire.30 69 15) Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'au moins un élément apte à conférer des propriétés magnétiques à ladite particule de silice est ajouté dans ladite micro-émulsion (Ma), ladite micro-émulsion (Mb) et/ou dans ladite micro- émulsion (Mc). 16) Microémulsion de type eau dans huile (Mc) susceptible d'être mise en oeuvre dans le cadre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend : au moins un tensioactif, éventuellement au moins un co-tensioactif, au moins un solvant non-polaire ou faiblement polaire, - au moins un solvant polaire, au moins une molécule d'intérêt au moins un premier alcoxyde de silicium, au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt, au moins un composé capable d'hydrolyser lesdits alcoxydes de silicium, et éventuellement un élément apte à conférer des propriétés magnétiques. 17) Microémulsion selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend : 70 au moins un tensioactif en une quantité comprise entre 1 et 40 %, notamment entre 5 et 30 % et, en particulier, entre 10 et 25 éventuellement au moins un co-tensioactif en une quantité comprise entre 1 et 30 %, notamment entre 5 et 25 % et, en particulier, entre 10 et 20 au moins un solvant non-polaire ou faiblement polaire en une quantité comprise entre 40 et 95 %, notamment entre 50 et 90 % et, en particulier, entre 60 et 80 % ; au moins un solvant polaire en une quantité comprise entre 0,25 et 20 %, notamment entre 0,5 et 10 % et, en particulier, entre 1 et 5 % ; au moins une molécule d'intérêt en une quantité comprise entre 0,0001 et 2 %, notamment entre 0,005 et 0,5 % et, en particulier, entre 0,001 et 0,1 0 o ; au moins un premier alcoxyde de silicium en une quantité comprise entre 0,05 et 20 %, notamment entre 0,1 et 10 % et, en particulier, entre 0,5 et 5 ° o , au moins un second alcoxyde de silicium présentant au moins un groupement apte à établir une liaison non covalente ionique et/ou hydrogène avec la molécule d'intérêt en une quantité comprise entre 0,0005 et 0,2 %, notamment entre 0,001 et 0,1 % et, en particulier, entre 0,005 et 0,05 % au moins un composé capable d'hydrolyser ledit composé à base de silane en une quantité comprise entre 0,01 et 5 %, notamment entre 0,05 et 1 % et, en particulier, entre 0,1 et 0,5 % ; et 71 éventuellement un élément apte à conférer des propriétés magnétiques en une quantité comprise entre 0,001 et 5 %, notamment entre 0,005 et 1 % et, en particulier, entre 0,01 et 0,5 % les différentes quantités sont exprimées en volume par rapport au volume total de la microémulsion. 18) Utilisation d'une particule de silice selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans les capteurs, le diagnostic in vitro, la traçabilité, la lutte contre la contrefaçon, la préservation et/ou le transport de molécules d'intérêt. 19) Particule de silice selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour utilisation comme agent de diagnostic.