Brevet FR2960553A1 — publié le 20111202

La présente invention concerne un procédé de typage automatisé et discriminant de Staphylococcus aureus. Un autre but de la présente invention se rapporte à un kit pour la mise en oeuvre du procédé susmentionné. Le genre Staphylococcus comprend plus de 50 espèces et sous-espèces mais la plus fréquente en pathologie humaine est représentée par Staphylococcus aureus. Cette bactérie commensale se retrouve dans diverses niches écologiques comme la peau ou la plupart des muqueuses chez les mammifères à sang chaud. Chez l'homme, S. aureus se loge principalement au niveau des fosses nasales et près de 30% de la population comprendrait des porteurs sains. La contamination se produit le plus souvent au contact de la peau car les infections surviennent généralement lors d'une rupture de la barrière cutanéo-muqueuse. Cependant, un affaiblissement du système immunitaire peut également conduire à des infections très diverses en brisant le fragile équilibre qui existe entre la bactérie et son hôte. En effet, une fois dans le sang, la bactérie peut facilement coloniser l'ensemble des organes vitaux et induire des pathologies mortelles comme des endocardites, des chocs toxiques, des septicémies ou encore des pneumonies nécrotiques. L'augmentation drastique de souches résistantes aux antibiotiques constitue un trait majeur de la virulence de S. aureus. En effet, S. aureus a montré une incroyable capacité d'adaptation en modulant son spectre de résistance aux antibiotiques selon leurs utilisations. L'utilisation non raisonnée d'antibiotiques dans les hôpitaux a induit une sélection de souches multirésistantes à la plupart des dérivés méticilline ainsi qu'à certains glycopeptides. Les cliniciens se retrouvent alors dans une situation d'impasse thérapeutique engendrée par l'acquisition de cette multirésistance. La virulence de cette bactérie couplée à sa multirésistance aux antibiotiques assure à Staphylococcus aureus le deuxième rang des pathogènes nosocomiaux avec plus de 30% des infections nosocomiales recensées. Staphylococcus aureus est également pathogène pour de nombreux mammifères, notamment des animaux d'élevage, bovins, ovins et caprins. En France, S. aureus est l'une des principales causes de ce type d'infection avec près de 30% des mammites diagnostiquées. Cette pathologie, dont l'enjeu est majeur en élevage laitier, touche près d'un quart des ruminants allaitants et se manifeste par une réduction de la quantité et de qualité du lait et dans les cas les plus graves par une nécrose de la glande mammaire. Staphylococcus aureus représente un enjeu majeur pour de nombreux secteurs : clinique, vétérinaire et agro-alimentaire. Les professionnels des secteurs concernés doivent mettre en place les mesures adéquates afin d'identifier les sources de contamination ainsi que les modes et vecteurs de contamination. L'engagement vers l'emploi de ce type de procédures préventives est d'autant plus important que les outils utilisés pour éradiquer ce pathogène sont parfois défaillants. Pour répondre à ce besoin, il est nécessaire de savoir distinguer les différentes souches au sein de l'espèce considérée. Le génotypage permet de caractériser la variabilité génétique de ces populations et d'identifier alors les relations de parenté entre les souches qui les composent. ETAT DE LA TECHNIQUE L'utilisation récente de techniques de typage moléculaire faisant appel aux méthodes d'empreintes génétiques (« DNA fingerprinting ») a augmenté considérablement la puissance des méthodes de typage bactérien qui, traditionnellement, se fondaient sur l'utilisation de marqueurs phénotypiques peu discriminants et à la reproductibilité médiocre. Avant l'ère du séquençage en masse des génomes bactériens, les techniques moléculaires de génotypage reposaient sur la détection par hybridation de séquences d'insertion (IS-RFLP : polymorphisme de longueur des fragments de restriction de séquence d'insertion), d'amplification PCR (amplification en chaîne par polymérase), d'amplification au hasard RAPD (Amplification au hasard d'ADN polymorphe), AFLP (polymorphisme de longueur de fragments amplifiés) ou de différences à des sites de restriction. La PFGE (Electrophorèse sur gel en champ pulsé) repose sur l'analyse des profils de macrorestriction de l'ADN total par électrophorèse en champ pulsé. Le résultat est un profil de restriction définissant un pulsotype caractérisant l'isolat bactérien étudié. La PFGE demeure la technique de typage standard pour de nombreuses espèces bactériennes dont S. aureus. Une collection de référence, composée de 98 isolats MRSA, a été établie par un groupe de travail de l'IUMS (Union internationale des sociétés de microbiologie - « International Union of Microbiology Societies ») dans le cadre d'un projet de lutte contre les infections nosocomiales. Ce projet appelé Harmonisation des mesures de résistance aux antibiotiques, Procédé de typage des organismes et moyens de les utiliser et autres outils afin d'accroître l'efficacité du contrôle des infections nocosomiales (« Harmonisation of Antibiotic Resistance measurement, Methods of typing Organisms and ways of using these and other tools to increase the effectiveness of Nosocomial Infection control ») a donné son nom à la collection HARMONY et a conduit au développement d'un protocole de PFGE harmonisé et standardisé. En 2007, les auteurs de ce projet ont montré que la PFGE est la technique la plus discriminante et préconise son utilisation dans un contexte épidémique. De nombreuses études comparatives corroborent ces conclusions. Dès lors, cette méthode a été utilisée avec succès dans le cadre de nombreuses enquêtes épidémiologiques. La PFGE a également été utilisée pour des études macro-épidémiologiques de grande ampleur. L'étude épidémiologique la plus conséquente menée jusqu'à présent concerne une étude sur plus de 3000 isolats, récoltés en Europe, en Amérique du sud et aux Etats-Unis, qui ont été génotypes par PFGE et regroupés en cinq lignées majeures. Plus récemment, afin d'envisager l'établissement d'une base de données standardisée de profils PFGE aux Etats-Unis, près de 1000 isolats, dont 68% sont agrégés en huit groupes phylogénétiques majeurs, ont été typés. Cependant, certain s scientifiques déconseillent d'entreprendre ce type d'études par analyse PFGE en raison de l'instabilité des marqueurs étudiés qui indexe rapidement l'accumulation des variations génétiques. De plus, la PFGE est en cours d'abandon dans les laboratoires de biologie moléculaire eu égard à ses nombreux inconvénients techniques et pratiques : la technique est longue, couteuse et difficile à mettre en oeuvre. L'inconvénient majeur reste le manque de reproductibilité inter-laboratoire et le défaut évident de standardisation des résultats obtenus. Au cours de la dernière décennie, la disponibilité croissante des séquences génomiques complètes de nombreuses bactéries pathogènes a permis de développer de nouvelles techniques. L'une d'entres elles, le typage par séquençage multi-locus MLST (« Multi Locus Sequence Typing ») est désormais utilisée comme technique de premier choix pour des études globales et pour l'établissement de relations phylogénétiques solides entre isolats de Staphylococcus aureus. Cette méthode est basée sur le polymorphisme de séquences de sept fragments internes de gènes de ménage qui présentent des variations intraspécifiques. Chaque locus d'intérêt est séquencé puis l'allèle identifié est associé à un caractère numérique. Ainsi, pour chaque souche, le profil allèlique représentant le génotype («sequence type» (ST)) est défini par un code numérique. Le typage par MLST permet donc facilement l'échange des données produites dans différents laboratoires. Ces échanges sont facilités par l'existence d'une base publique pour les données de typage de S. aureus par MLST (http://saureus.mlst.net). Cette base de données, créée en 1999, compte en 2010 près de 1500 ST. Ce nombre reflète l'importance des études épidémiologiques, reposant sur l'analyse MLST, qui ont été menées aussi bien en clinique humaine qu'en clinique vétérinaire. Ces différentes études ont permis de mieux comprendre la structure phylogénétique de la population de Staphylococcus aureus. Le MLST montre que l'évolution de Staphylococcus aureus se fait par mutation ponctuelle et non par recombinaison : la population de Staphylococcus aureus est donc clonale. L'importance du génome dit accessoire est mise en exergue par le MLST. En effet, cette méthode reposant sur l'analyse des gènes de ménage, constituant le génome dit central, ne corrèle pas les ST avec l'acquisition de la résistance, la virulence, ou la propension à coloniser un hôte spécifique, caractéristiques alors associées au génome accessoire. Cependant, compte tenu du faible taux de mutation des gènes de ménage, le MLST demeure une technique de typage peu discriminante et donc inusitée dans des contextes épidémiques. De plus, l'application en routine du typage par MLST dans les laboratoires de biologie moléculaire n'est pas encore envisageable. En effet, le typage d'un isolat comprend l'amplification et le séquençage de sept fragments PCR (sens et anti-sens pour chaque locus étudié aboutissant à l'obtention de 14 séquences), cette méthode reste donc encore très coûteuse, fastidieuse et longue (le résultat de typage MLST d'un isolat est assuré en 12 heures avec un séquenceur 4-capillaires). Avec la possibilité d'analyser les génomes bactériens in silico, la MLVA ou l'Analyse de plusieurs locus VNTR (Répétition en tandem polymorphe (« Multiple Locus VNTR Analysis ») a également pu émerger. Les VNTRs sont des répétitions en tandem présentant un polymorphisme intra- espèce du nombre de répétitions justifiant ainsi leur utilisation comme marqueurs moléculaires. Les répétitions en tandem sont des séquences génomiques, présentes dans les régions codantes ou intergéniques, caractérisées par la répétition d'un motif nucléotidique élémentaire. Ces séquences sont également souvent appelées microsatellites lorsque le motif répété comprend moins de 9 paires de bases et minisatellites lorsque le motif répété comprend 9 paires de base et plus. Le génotypage par MLVA repose sur l'amplification par PCR de ces régions ciblées, dispersées sur le génome bactérien, à l'aide d'amorces spécifiques des régions flanquantes, et sur la détermination des tailles des amplicons par électrophorèse permettant d'évaluer le nombre de répétitions à un locus donné. Les motifs répétés peuvent compter de une à plus de cent paires de bases et la taille des amplicons varie de quelques dizaines à plus de mille nucléotides. La longueur des unités répétées étant connue, ces tailles reflètent le nombre de séquences répétées dans les régions amplifiées. Cette méthode d'empreintes génétiques augmente considérablement, pour certaines espèces, la puissance des méthodes de génotypage bactérien. Le résultat du typage est un code numérique incluant le nombre de motifs à chaque locus. Ce type de génotypes numériques, dont l'interprétation est facilitée, est parfaitement adapté aux études comparatives intra et inter laboratoire menées dans le cadre d'un suivi ou d'une enquête épidémiologique. Plusieurs publications traitent de la thématique MLVA Staphylococcus aureus au sens le plus général du terme. Parmi ces articles, quatre semblent devoir faire référence en la matière : 1) Pourcel et al., J. Clin. Microbiol. 2009,47(10):3121-8 ; 2) Schouls et al., Plos One. 2009,4(4):e5082 ; 3) Hardy et al., Microbiology. 2004 Dec, 150 (Pt12):4045-52 et 4) Sabat et al., J. Clin. Microbiol. 2003 Apr,41(4):1051-66. Le protocole développé par Sabat et collaborateurs ne constitue pas un MLVA mais une MLVF : empreinte de plusieurs locus VNTRs (« Multiple Locus VNTR Fingerprinting »). Cette technique repose sur l'analyse et la comparaison de profils obtenus par l'analyse concomitante de six à sept VNTRs. Cette méthode, bien que discriminante car reposant sur l'analyse du polymorphisme de plusieurs VNTRs, ne présente pas les mêmes commodités que le MLVA (incapacité de coder le génotype, difficulté d'échange de résultats, ...). Les travaux de Hardy et collaborateurs ont décrit les premiers véritables protocoles de typage par MLVA pour Staphylococcus aureus. Le protocole MLVA défini par Hardy repose sur l'analyse en simplex sur agarose de sept VNTRs (nommés SIRU pour Staphylococcal Interspersed Repeat Unit par analogie avec l'acronyme MIRU utilisé pour certaines répétitions en tandem de Mycobacterium tuberculosis. Quatre études ont validé ce protocole sur une collection de souches cliniques et une étude a montré ses limites sur une collection de souches animales. Un protocole MLVA à 14 marqueurs, dont 10 primordiaux, a été publié par l'équipe GPMS de l'IGM (Pourcel et al., 2009). Ce protocole a été validé sur plus de 500 souches dont la collection HARMONY. Les travaux de Hardy et collaborateurs ainsi que Pourcel et collaborateurs montrent que le MLVA satisfait tous les critères de performance relatifs à une excellente technique de typage : stabilité des marqueurs utilisés, typabilité excellente (supérieure à 98%), reproductibilité parfaite et pouvoir de discrimination élevé (similaire à celui du SBT à six loci). Cependant, dans ces travaux, l'analyse des tailles des loci a été réalisée par électrophorèse sur gel d'agarose. Il paraît difficile d'envisager d'entreprendre le typage systématique par MLVA des nouveaux isolats identifiés dans un contexte de suivi épidémiologique en utilisant le même support. Les recherches de Schouls et collaborateurs constituent un progrès significatif dans le typage de S. aureus par MLVA (Schouls et al., 2009). En effet, l'article est le premier et le seul à ce jour à publier un protocole MLVA validé sur électrophorèse capillaire ABI3730 en deux multiplexes de quatre VNTRs. La technique s'est avérée performante sur la collection de souches testées (2525 dont 100 souches animales issues de porcs) mais la comparaison avec le MLST n'a pas été effectuée. Cependant, les amorces utilisées ne s'apparient pas toutes correctement avec les 14 génomes séquencés de Staphylococcus aureus et le nombre de marqueurs analysés est encore insuffisant pour permettre un typage à la résolution convenable. La nécessité du développement d'une nouvelle méthode de typage moléculaire s'impose donc pour permettre la réalisation d'un typage bactérien de Staphylococcus aureus discriminant à haut-débit, de routine et à moindre coût. RESUME DE L'INVENTION La présente invention a pour but un nouveau procédé de typage automatisé et discriminant de Staphylococcus aureus. Un autre but de la présente invention est de fournir des kits (ou trousses) pour la mise en oeuvre du procédé susmentionné. A cet effet, l'invention concerne un procédé de génotypage de l'espèce Staphylococcus aureus par MLVA comprenant les étapes consistant à : (i) réaliser une co-amplification d'au moins huit loci VNTRs par PCR multiplexe dans un milieu réactionnel comprenant un échantillon d'ADN issu d'un isolat de Staphylococcus aureus afin de former plusieurs amplicons pour chacun des huit loci VNTRs, (ii) analyser lesdits amplicons par électrophorèse capillaire afin d'obtenir un profil électrophorétique dudit échantillon, et (iii) attribuer un code numérique MLVA audit profil électrophorétique. La présente invention repose sur la technique de typage MLVA combinée à une PCR multiplexe apte à co-amplifier au moins huit, de préférence au moins dix loci VNTRs en une seule fois, en une seule étape. En effet, la présente invention représente le premier procédé de typage du pathogène Staphylococcus aureus par une seule réaction de PCR, et est le seul procédé ayant dépassé le multiplexage de plus de huit VNTRs pour un typage par MLVA. Jusqu'à présent, il était possible de co-amplifier maximum quatre loci VNTRs mais pas au moins huit. Le précédé selon l'invention représente donc une réelle avancée technologique. Par définition, le terme de "PCR multiplexe" désigne une mise au point de la technique PCR autorisant l'amplification, en une seule réaction, de plusieurs segments d'ADN distincts. Le premier avantage de cette adaptation technique est la réduction du coût et la diminution du temps de réalisation et d'analyse des résultats. La réalisation d'une PCR multiplexe doit répondre à de nombreuses contraintes techniques. Ainsi, un des intérêts du procédé de l'invention réside dans l'identification d'un produit PCR multiplexe, comme l'allèle de VNTRs connus. Il n'est pas judicieux d'analyser le résultat de la PCR multiplexe sous forme d'un profil de bandes, souvent peu reproductibles et dont la standardisation est hasardeuse. Le procédé selon l'invention a donc été conçu pour une application du typage avec analyse des fragments amplifiés par électrophorèse capillaire et validés sur les appareils de type Applied Biosystems Genetic Analyser 3100-Avant, 3130, 3130x1 et 3500. En outre, la technique MVLA employée avec la PCR multiplexe permet un typage précis de la souche identifiée et convient également parfaitement à des études comparatives fines entre souches bactériennes dans un délai très court (moins de quatre heures). Par conséquent, le présent demandeur a ainsi mis au point une méthode permettant 10 un génotypage du pathogène Staphylococcus aureus à un coût suffisamment réduit pour envisager sa large utilisation dans les laboratoires de microbiologie en test de premier rang. En particulier, le code numérique MLVA de l'étape (iii) est obtenu automatiquement par informatique, à partir de logiciel d'analyse de fragments ou de génotypage. Le profil électrophorétique obtenu peut être analysé avec plusieurs logiciels 15 différents disponibles en libre accès (Peak Scanner ®, CLC Sequence Viewer®,...). Cependant, le traitement des données électrophorétiques ainsi que l'automatisation des résultats de typage sont possible par l'utilisation du logiciel Genemapper® (Applied Biosystems). En particulier, ce logiciel peut être associé à trois fichiers mis au point par le demandeur afin d'obtenir le code numérique MLVA automatiquement. Ces fichiers sont 20 ainsi à importer sous GeneMapper®, qui décrivent les différents paramètres à ajuster et les données à interpréter afin qu'un utilisateur non initié puisse obtenir simplement le code MLVA de la souche typée avec pour chaque locus un indice indiquant le degré de confiance attribué à la valeur associée (nombre de motifs répétés pour le VNTR considéré). Ainsi, le fichier nommé «Méthode d'analyse.xml » permet le traitement des données analysées selon 25 des critères définis et les fichiers nommés « MLVA management A.txt » et « MLVA management B.txt » compilent l'ensemble des données recueillies sur les différents allèles associés à chaque marqueur défini par une gamme de taille et de couleur. Ces fichiers sont décrits plus explicitement par la suite. Par conséquent, le présent procédé présente l'avantage de permettre un typage 30 automatique, rapide, au pouvoir de discrimination élevé, reproductible et à haut-débit de S. aureus dans le cadre d'une application en typage de routine. Or, au vu de l'état de la technique actuel, il n'était pas évident pour un homme du métier de mettre au point une technique permettant l'obtention de l'ensemble de ces avantages. Avantageusement, le milieu réactionnel de l'étape (i) comprend : au moins huit amorces sens marquées et au moins huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces sens/anti-sens pour chacun desquels correspond un locus VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en amont de son locus respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son locus respectif. Par définition les amorces sens et anti-sens sont des séquences oligonucléotidiques capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, respectivement sur le brin d'ADN anti-sens i.e. le brin non codant transcrit et sur le brin d'ADN sens i.e. le brin codant non transcrit. Selon une caractéristique de l'invention, les au moins huit amorces sens sont marquées par un fluorophore en 5'. Préférentiellement, le fluorophore est choisi parmi : 6-FAMTM, NEDTM, PETTM ou VICTM (Applied Biosystems) Chacune des amorces sens est donc marquée avec un fluorophore défini par un spectre d'excitation unique et permet alors d'associer un VNTR donné à une gamme de couleur ou de motifs lors de la visualisation des profils électrophorétiques. De plus, les amorces sens et anti-sens ont été élaborées de telle sorte que chaque VNTR soit associé à une gamme de taille connue. Ainsi, un plan de multiplexage calibré par les deux dimensions spectrale, assurée par le marquage des amplicons, et spatiale, garanti par le choix pertinent des amorces, permet d'identifier d'une manière unique chaque VNTR (voir le plan de multiplexage Figure la). De manière préférée, le milieu réactionnel comprend en outre au moins huit amorces sens supplémentaires non marquées. En particulier, le ratio : amorces sens non marquées sur amorces anti-sens est de l'ordre de 2/3 et le ratio : amorces sens marquées sur amorces anti-sens est de l'ordre de 1/3. De manière avantageuse, les au moins huit couples d'amorces respectivement anti- sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis parmi : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24; SEQ ID NO : 25/ SEQ ID NO : 26; SEQ ID NO : 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO : 29/ SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 32. Selon un mode de réalisation préféré, est réalisée à l'étape (i), une première coamplification de dix loci VNTRs par PCR multiplexe dans un premier milieu réactionnel. De préférence, le premier milieu réactionnel comprend les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20. Selon une variante de ce mode, est également réalisée à l'étape (i) une seconde coamplification d'au moins six loci VNTRs supplémentaires par PCR multiplexe dans un second milieu réactionnel, chacun des premier et second milieux réactionnels comprenant un échantillon d'ADN issu du même isolat de Staphylococcus aureus. De préférence, le second milieu réactionnel comprend les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants : SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24; SEQ ID NO : 25/ SEQ ID NO : 26; SEQ ID NO : 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO : 29/ SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 32. La présente invention permet ainsi dans cette variante, l'analyse de seize VNTRs en deux étapes successives comprenant dans un premier temps l'analyse d'un panel de dix VNTRs (nommé Panel 1) et dans un second temps l'analyse d'un panel de six VNTRs (nommé Panel 2). Par conséquent, la présente invention peut décrire un schéma MLVA à seize VNTRs composé de ces deux panels complémentaires. Le panel 1 permet d'assigner les isolats typés aux groupes phylogénétiques majeurs. Ce panel est intéressant dans le cadre d'études macro-épidémiologiques. En effet il permet d'avoir, en une PCR, une idée générale sur la diversité génétique d'une population bactérienne assurant un index de diversité supérieur à celui du MLST et identique à celui du champ pulsé. Tandis que le panel 2 permet d'assurer un caractère résolutif très supérieur au typage. La combinaison des deux panels garantit une résolution extrêmement fine permettant d'effectuer une étude micro- épidémiologique dans un cadre spatio-temporel restreint. Pour cette variante, le second milieu réactionnel de l'étape (i) comprend en outre six autres amorces sens marquées et six autres amorces anti-sens correspondant aux six loci VNTRs supplémentaires. Ces amorces sens et anti-sens ont été élaborées de telle sorte que chaque VNTR soit associé à une gamme de taille connue. Ainsi, un plan de multiplexage calibré par les deux dimensions spectrale, assurée par le marquage des amplicons, et spatiale, garanti par le choix pertinent des amorces, permet d'identifier d'une manière unique chaque VNTR (voir le plan de multiplexage Figure lb). La présente invention se rapporte également à un kit de génotypage de Staphylococcus aureus pour la mise en oeuvre du procédé de génotypage tel que décrit ci-dessus, comprenant : - un milieu réactionnel comportant au moins huit amorces sens marquées et au moins huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces sens/anti-sens pour chacun desquels correspond un locus VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en amont de son locus respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son locus respectif, - un mix d'amplification, - éventuellement un témoin positif et un faux témoin négatif, de manière à valider le résultat et s'affranchir de faux-positifs ou de faux-négatifs. De préférence, les au moins huit couples d'amorces respectivement anti-sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis parmi : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24; SEQ ID NO : 25/ SEQ ID NO : 26; SEQ ID NO : 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO : 29/ SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 32. Selon un mode de réalisation du kit, celui-ci comprend un premier milieu réactionnel comprenant les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20. Dans une variante de ce mode, le kit comprend un second milieu réactionnel comprenant les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants : SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24; SEQ ID NO : 25/ SEQ ID NO : 26; SEQ ID NO : 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO : 29/ SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 32. Par conséquent, les amorces utilisées présentent, pour chaque panel, la triple particularité i) de garantir l'unicité d'un VNTR sur un profil électrophorétique par la caractérisation du vecteur taille/couleur, ii) de permettre leur association dans une seule réaction de PCR (la formation de structures en dimères ou hairpin entre les amorces a été recherchée) et iii) de s'hybrider au niveau de zones conservées chez l'espèce Staphylococcus aureus. DESCRIPTION DETAILLEE L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de tests expérimentaux, en référence aux figures annexées dans lesquelles : - la Figure la représente le plan de multiplexage selon la présente invention pour 10 loci VNTRs (Panel 1) et la Figure lb pour les 6 VNTRs supplémentaires (Panel 2); - la Figure 2 représente (sur deux pages 2.1 et 2.2) un dendrogramme réalisé selon 1'UPGMA [Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean] (méthode de groupe de paires hiérarchiques non pondérées avec l'agrégation (cluster) de l'analyse de la moyenne arithmétique) présentant l'agrégation des isolats de la collection HARMONY (89 isolats) par le protocole de typage selon l'invention (16 loci VNTRs) ; - la Figure 3 représente (sur deux pages 3.1 et 3.2) un dendrogramme réalisé selon 1'UPGMA présentant l'agrégation des isolats de la collection HARMONY (89 isolats) par le protocole de typage selon l'invention (Panel 1) - la Figure 4 représente (sur deux pages 4.1 et 4.2) un dendrogramme réalisé selon 1'UPGMA présentant l'agrégation des isolats de la collection HARMONY (89 isolats) par le protocole de typage selon l'invention (Panel 2) - la Figure 5 représente (sur deux pages 5.1 et 5.2) un dendrogramme réalisé selon 1'UPGMA présentant l'agrégation des isolats de la collection HARMONY (89 isolats) par le protocole de typage de Pourcel et col. (10 loci VNTRs par MVLA et sans PCR multiplexe) ; - la Figure 6 représente (sur deux pages 6.1 et 6.2) un dendrogramme réalisé selon 1'UPGMA présentant l'agrégation des isolats de la collection HARMONY (89 isolats) par le protocole de typage de Schouls et col. (8 loci VNTRs par MLVA en deux PCR) ; - la Figure 7 représente (sur deux pages 7.1 et 7.2) un dendrogramme réalisé selon 1'UPGMA présentant l'agrégation des isolats de la collection HARMONY (89 isolats) par le protocole de typage MLST7 (technique de l'art antérieure) ; - la Figure 8 représente trois tableaux 10a, 10b et 10c correspondant aux résultats pour une analyse de reproductibilité ; - et les Figures 9, 10 et 11 représentent les fichiers mis au point par le présent demandeur pour obtenir le code MVLA automatiquement, c'est-à-dire : Figure 9 (sur cinq pages 9.1 à 9.5) pour la méthode d'analyse.xml, Figure 10 pour MLVA Management A.txt, Figure 11 (sur deux pages 11.1 et 11.2) pour MLVA Management B.txt. A) Détails expérimentaux La section suivante décrit les matériels et méthodes utilisés pour le génotypage de Staphylococcus aureus par le procédé de la présente invention. Elle sera décomposée en cinq parties : 1) Choix et sélection des VNTRs, 2) Définition des panels, 3) Elaboration des amorces et construction du plan de multiplexage, 4) PCR multiplexe et analyse des fragments et 5) Obtention du code MLVA. 1) Choix et sélection des VNTRs La présence des 16 VNTRs choisis, dans les génomes des 14 souches de S. aureus séquencés, a été recherchée à l'aide de la base de données : http://minisatellites.u-psud.fr. Dans la section « Bacteria » de la partie « Access the microbial tandem repeats database main page », chaque souche séquencée est choisie successivement et chacun des VNTR est recherché par la taille du motif nucléotidique élémentaire répété. Les 14 souches présentent les 16 VNTRs. Finalement, le présent demandeur a choisi une combinaison unique de seize marqueurs, décrit dans le Tableau 1 ci dessous, pour le typage par MLVA de Staphylococcus aureus. 2) Définition des panels Le protocole de typage par MLVA décrit se décline sous deux formes représentées par deux panels garants de deux niveaux de discrimination différents. Le premier panel est constitué de dix VNTRs alors que le second en comprend six. Le panel 1 a été constitué de telle sorte qu'il soit assez discriminant pour être utilisé seul et le plus congruent possible avec le protocole à seize VNTRs. Nombre Taille Position Nom Taille du théorique Type de séquences de sur le simplifié Panel motif de présentant le répétition génome VNTR répété (pb) l' amplicon VNTR s (kb) (pb) Sa0122 1 24 10 331 122 protein A Sa0311 1 55 3 316 311 Intergénique Sa0387 1 55 2 255 387 Intergénique Sa0550 1 21 5 847 550 Intergénique Sa0684 1 66 2 1000 684 Intergénique Sa0964 1 43 6 597 964 Intergénique Sa1097 1 9 18 196 1097 cystéine protease Sa1194 1 67 7 874 1194 Intergénique Sa1729 1 56 5 797 1729 Intergénique Sa1866 1 159 3 933 1866 hypothetical protein Sa0266 2 81 6 630 266 staphylocoagulase Sa0704 2 67 4 303 704 Intergénique Sa1132 2 63 6 884 1132 Intergénique Sa1291 2 64 4 870 1291 Intergénique Sa2039 2 56 3 275 2039 Intergénique Sa2511 2 61 3 370 2511 Intergénique Tableau 1 : Caractéristiques des VNTRs utilisés dans la présente invention (Les caractéristiques associées à chaque VNTR sont propres à la souche Staphylococcus aureus Mu50) 3) Elaboration des amorces et construction du plan de multiplexage Une fois les loci d'intérêt choisis, l'originalité développée par la présente invention réside, selon un mode de réalisation préféré, dans la capacité à co-amplifier par PCR multiplexe respectivement 10 VNTRs dans le cas du panel 1 et 6 VNTRs dans le cas du panel 2. Pour cela, la pertinence dans le choix des amorces est primordiale. Comme évoqué précédemment dans la description de l'invention, le choix de la séquence des amorces utilisées a été réalisé pour remplir trois objectifs : i) les amorces doivent assurer l'unicité d'identification d'un amplicon, issu de chaque multiplexe, par la visualisation d'un plan de multiplexage. ii) les amorces doivent permettre la co-amplification efficace des marqueurs respectifs des panels 1 et 2 iii les amorces doivent être choisies au niveau de séquences conservées de diverses souches de l'espèce Staphylococcus aureus afin que le protocole de typage présente une typabilité proche de 100%. Aucune hiérarchie ou chronologie n'est établie entre ces objectifs pour effectuer le choix des amorces. L'ensemble de ces paramètres est à prendre en compte et les trois critères de décision s'imbriquent. Cependant, par souci de clarté, chacun d'entre eux sera détaillé indépendamment. i) Le typage de la collection HARMONY, représentative de la diversité des souches cliniques MRSA, et de plus de 1000 autres isolats cliniques donne une estimation de la gamme d'allèle pour chaque VNTR. Il est ainsi raisonnable de disposer et d'arranger les gammes d'allèles afin d'établir deux plans de multiplexage pour chaque panels. Ces plans, illustrés par un schéma en 2D (spatiale et spectrale), représentent l'agencement des différents amplicons issus des deux multiplexes. La première dimension est imposée par l'attribution d'un des 4 fluorophores suivants : 6-FAMTM, NEDTM, PETTM, VICTM. La présente invention étant développée sur les plateformes d'analyse Applied Biosystems Genetic Analyser 3100-Avant, 3130, 3130x1 et 3500, les fluorophores sont choisis chez Applied Biosystems. La seconde dimension est définie par une gamme de taille propre à chaque VNTR. Le croisement de ces deux dimensions permet d'attribuer une position spectrale et spatiale unique pour chaque VNTR. Pour une couleur donnée, chaque gamme de taille est séparée par au moins la taille d'une unité répétée. De plus, les amorces des VNTRs de type microsatellite sont systématiquement choisies de telle sorte que les amplicons soient de petite taille. Après avoir considéré l'ensemble de ces paramètres, les plans de multiplexage ont été construits comme illustré par les Figures la et lb. ii) Une fois la configuration spatiale des VNTRs connue, des zones génomiques au sein desquelles les amorces peuvent être élaborées sont définies. Classiquement, les séquences des amorces doivent répondre à plusieurs critères : séquence comprise entre 18pb et 25pb, %GC compris entre 40 et 60, ne comprenant pas plus de 4 répétitions mononucléotidiques. Ensuite, d'autres exigences sont spécifiques à la réalisation de la PCR multiplexe. Ainsi, afin que les 10 et 6 produits puissent respectivement être co-amplifiés au sein des panels 1 et 2, de manière efficace et homogène, en utilisant un même protocole PCR et a fortiori une même température d'hybridation, les amorces présentent une température de désappariement (Tm) semblable. Les inventeurs ont empiriquement imposé une différence maximale de 8°C entre les différents Tm. De plus, la co-amplification exigeant le rassemblement de tous les réactifs dans une seule réaction, il est primordial que les amorces restent neutres entre elles, c'est-à-dire qu'elles ne donnent pas d'hybridation croisée. La probabilité de formation de structures en dimères par les amorces a été testée par le logiciel Autodimer. Après importation d'un fichier fasta comprenant l'ensemble des séquences à valider, ce logiciel indique si des couples sont susceptibles de se former. Enfin, une queue nucléotidique de 7pb est ajoutée en position 5' de chaque amorce anti-sens afin de faciliter l'adénylation des produits PCR. En effet, l'ajout partiel d'une adénine en 3' des amplicons par la Taq polymérase entraine une difficulté d'analyse des profils électrophorétiques ; on appelle cet artefact le «pic +A ». L'étape finale du choix des amorces est la démonstration de leur spécificité. Chaque séquence est donc soumise à l'algorithme BLAST et recherchée dans tous les génomes séquencés. iii) Une des caractéristiques principales d'une bonne technique de typage est la typabilité, c'est-à-dire la capacité à attribuer un génotype à tous les isolats typés. Autrement dit, l'amplification des 16 VNTRs doit être possible pour l'ensemble de l'espèce Staphylococcus aureus et un code MLVA complet (composé de 16 valeurs) doit être attribué. Classiquement une technique de typage dont la typabilité est supérieure à 97% est considérée comme excellente. Deux raisons peuvent provoquer l'absence d'amplification : l'absence du VNTR et la non hybridation des amorces. Concernant la présence des VNTRs pour l'ensemble des souches séquencées, celle-ci a été préalablement vérifiée sur les 14 génomes séquencés. Cependant, ces 14 souches ne sont surement pas représentatives de la diversité de l'espèce ; il est donc impossible de prédire la conservation d'une séquence génétique pour l'ensemble de l'espèce. Cependant, la comparaison de ces génomes permet d'identifier des zones conservées et de désigner les amorces au niveau de celles-ci. Les amorces utilisées pour la présente invention répondant aux trois critères i), ii) et iii) ont été élaborées ; leurs caractéristiques sont détaillées dans les Tableau 2a et 2b ci-après.35 Nom du SEQ ID NO Type d'amorce Séquence VNTR (Le fluorophore amplifié utilisé pour le marquage est indique entre parenthèses) SaO122 SEQ ID NO: 1 Anti-sens non marquée GCACCAAAAGAGGAAGAC SEQ ID NO: 2 Sens non marquée CAGCAGTAGTGCCGTTTG SEQ ID NO: 2 Sens marquée (NED) NED-CAGCAGTAGTGCCGTTTG Sa0311 SEQ ID NO: 3 Anti-sens non marquée AAATGATATTTTCGCAAAATTTATT SEQ ID NO: 4 Sens non marquée GTATCAACAAGTGATAGCATCA SEQ ID NO: 4 Sens marquée (VIC) VIC-GTATCAACAAGTGATAGCATCA Sa0387 SEQ ID NO: 5 Anti-sens non marquée CATTCCAAACATACCATCAC SEQ ID NO: 6 Sens non marquée CAAAGTAATAGGCACTACAA SEQ ID NO: 6 Sens marquée (FAM) 6FAM-CAAAGTAATAGGCACTACAA Sa0550 SEQ ID NO: 7 Anti-sens non marquée AACTTGATCGACACCAGAGC SEQ ID NO: 8 Sens non marquée GTGACAGATGTAAGACTTAGA SEQ ID NO: 8 Sens marquée (PET) PET-GTGACAGATGTAAGACTTAGA Sa0684 SEQ ID NO: 9 Anti-sens non marquée CAACAAGTTGTTCAGCCTGC SEQ ID NO: 10 Sens non marquée AGGTATTGGAAGTGAAACAGC SEQ ID NO: 10 Sens marquée (FAM) 6FAM-AGGTATTGGAAGTGAAACAGC Sa0964 SEQ ID NO: 11 Anti-sens non marquée CCAACCTGTTAATCCGATGT SEQ ID NO: 12 Sens non marquée ATCCCAGATTATCCAATACAA SEQ ID NO: 12 Sens marquée (PET) PET-ATCCCAGATTATCCAATACAA Sa1097 SEQ ID NO: 13 Anti-sens non marquée GCAACTTCTTAAAACAAAATATTG SEQ ID NO: 14 Sens non marquée GAATTATTGTTATCGCCATTGTC SEQ ID NO: 14 Sens marquée (PET) PET-GAATTATTGTTATCGCCATTGTC Sa1194 SEQ ID NO: 15 Anti-sens non marquée GGTGCTAAAGTCGATGTAAT SEQ ID NO: 16 Sens non marquée CTGTGTCGGTAGGTTACATT SEQ ID NO: 16 Sens marquée (NED) NED-CTGTGTCGGTAGGTTACATT Sa1729 SEQ ID NO: 17 Anti-sens non marquée GACCATGCACTACGTGTTAC SEQ ID NO: 18 Sens non marquée GTCTCGAATCACTTAACAACG SEQ ID NO: 18 Sens marquée (FAM) 6FAM-GTCTCGAATCACTTAACAACG Sa1866 SEQ ID NO: 19 Anti-sens non marquée GCTTGTTGGTTCAGCTTTAGG SEQ ID NO: 20 Sens non marquée GCTTTACGTGTAATAACACC SEQ ID NO: 20 Sens marquée (VIC) VIC-GCTTTACGTGTAATAACACC Tableau 2a : Caractéristiques des amorces utilisées dans la présente invention (Les amorces décrites utilisées pour la co-amplification des 10 VNTRs du panel 1) Nom du SEQ ID NO Type d'amorce Séquence VNTR (Le fluorophore amplifié utilisé pour le marquage est indique entre parenthèses) Sa0266 SEQ ID NO: 21 Anti-sens non marquée CTTCCGATTGTTCGATGCTT SEQ ID NO: 22 Sens non marquée TTGGATATGAAGCGAGACCA SEQ ID NO: 22 Sens marquée (PET) PET-TTGGATATGAAGCGAGACCA Sa0704 SEQ ID NO: 23 Anti-sens non marquée CGATCGCACGATATGGTGG SEQ ID NO: 24 Sens non marquée AAGAGTGTGTAGGGAATGGC SEQ ID NO: 24 Sens marquée (VIC) VIC-AAGAGTGTGTAGGGAATGGC Sa1132 SEQ ID NO: 25 Anti-sens non marquée TGGGAGGAATTAATCATGTC SEQ ID NO: 26 Sens non marquée CTAGTTCAAGCTAGATCAGG SEQ ID NO: 26 Sens marquée (FAM) 6FAM-CTAGTTCAAGCTAGATCAGG Sa1291 SEQ ID NO: 27 Anti-sens non marquée GTGTTGCTCTTGAATCATC SEQ ID NO: 28 Sens non marquée GTCAAGACACAGATATTGCT SEQ ID NO: 28 Sens marquée (NED) NED-GTCAAGACACAGATATTGCT Sa2039 SEQ ID NO: 29 Anti-sens non marquée CATAAATTCAATGTCCTAGGC SEQ ID NO: 30 Sens non marquée TATTTCGTTCTACCCCAACT SEQ ID NO: 30 Sens marquée (FAM) 6FAM-TATTTCGTTCTACCCCAACT Sa2511 SEQ ID NO: 31 Anti-sens non marquée AAGGTCAAGAATATTTAAAATCAATT SEQ ID NO: 32 Sens non marquée GGCAAAATGCACATGAAACACT SEQ ID NO: 32 Sens marquée (NED) NED-GGCAAAATGCACATGAAACACT Tableau 2b : Caractéristiques des amorces utilisées dans la présente invention (Les amorces décrites utilisées pour la co-amplification des 6 VNTRs du panel 2) PCR multiplexe et analyse des fragments Deux réactions de PCR permettent le typage d'un isolat de Staphylococcus aureus. Deux constituants participent à chacune de ces réactions : un mix d'amplification et un mix d'amorces. Le mix d'amplification utilisé est le QIAGEN Multiplex PCR 2X Kit fourni par Qiagen. Le mix d'amorces est constitué d' oligonucléotides marqués et non marqués obtenus chez Applied Biosystems et d'eau PPi. L'amplification d'un VNTR nécessite la combinaison de 3 amorces : une amorce anti-sens, une amorce sens et une amorce sens marquée par un fluorophore (les séquences des amorces sens marquées et non-marquées sont identiques). L'équimolarité entre les amorces sens et anti-sens est assurée par l'établissement d'un ratio 1015 entre la concentration des amorces sens et de celle de l'amorce anti-sens. Dans la présente invention, les ratio imposés sont : [amorce anti-sens non marquée] / [amorce sens] = 2/3 et [amorce anti-sens marquée] / [amorce sens] = 2/3 d'où [amorce sens] = [amorce anti-sens non marquée] + [amorce anti-sens marquée]. Chacun des triplets d'amorces utilisés pour l'amplification du VNTR associé est élaboré selon les ratios précédents. Les concentrations finales nécessaires de chaque triplet ont été ajustées afin de permettre l'homogénéité d'intensité des pics lors de l'analyse des profils électrophorétiques. La concentration finale de l'amorce anti-sens, suffisante pour connaître les concentrations finales, est indiquée dans les Tableau 3a et 3b ci dessous. Concentration finale en amorce anti-sens (en Nom simplifié du VNTR amplifié EN) Sa0311, Sa0964 0.6 Sa0387, Sa0550, Sa1097, Sa1866 0.3 Sa0122, Sa0684, Sa1194 0.15 Sa1729 0.05 Tableau 3a : Concentration finale utilisée en amorce anti-sens pour la co-amplification des VNTRs du panel 1 Concentration finale en amorce anti-sens (en Nom simplifié du VNTR amplifié EN) Sa2511 0.3 Sa1132, Sa1291, Sa2039 0.15 Sa0266, Sa0704 0.05 Tableau 3b : Concentration finale utilisée en amorce anti-sens pour la co-amplification des 6 VNTRs du panel 2 A titre d'exemple, deux mix d'amorces (un pour la réalisation de chaque panel) pour 100 réactions, i.e. 100 typages, respectant les conditions ci dessus est décrit dans les Tableau 4a et 4b. Nom du Nom de l'amorce Volume VNTR d'amorce (à 20 ^M) à prélever SaO311R, Sa0964R 45 5a0311, Sa0964 5aO311F,5a0964F 30 SaO311F-VIC,Sa0964F-PET 15 5a0387, Sa0387R, SaO550R, Sa1097R, Sa1866R 22,5 5a0550, Sa0387F, SaO550F, Sa1097F, Sa1866F 15 5a1097, Sa0387F-6FAM Sa0550E-PET Sa1097F-PET Sa1866F- Sa1866 VIC 7,5 5a0122, Sa0122R, Sa0684R, Sa1194R 11,25 5a0684, Sa0122F, Sa0684F, Sa1194F 7,5 Sa1194 Sa0122F-NED, Sa0684F-6FAM, Sal194F-NED 3,75 Sa1729R 3,75 Sa1729 Sa1729F 2,5 Sa1729F-6FAM 1,25 Tableau 4a : Constitution d'un mix d'amorces pour 100 tvpages (Panel 1) Un volume d'eau de 865 I~, doit être ajouté Nom du VNTR Nom de l'amorce Volume d'amorce (à 20 CM) à prélever Sa2511R 22,5 Sa2511 Sa2511F 15 Sa2511F-NED 7,5 Sa1132R, Sa1291R, Sa2039R 11,25 Sa1132, Sa1291, Sa2039 Sa1132F, Sa1291F, Sa2039F 7,5 Sal 132F-6FAM, Sa1291F-NED, Sa2039F-6FAM 3,75 Sa0266R, SaO704R 3,75 Sa0266, Sa0704 Sa0266F, SaO704F 2,5 Sa0266F-PET, SaO704F-VIC 1,25 Tableau 4b : Constitution d'un mix d'amorces pour 100 tvpages (Panel 2) Un volume d'eau de 1172.5 IPfl, doit être ajouté Pour chaque réaction, le volume réactionnel est de 15µL dont 5.5µL de mix d'amorces, 7.5µL du mix QIAGEN Multiplex PCR 2X et 2 µL d'ADN bactérien (concentré à 2ng/µL). Le procédé d'extraction d'ADN ne fait pas l'objet de la présente invention mais les inventeurs recommandent l'utilisation du kit d'extraction DNeasy Blood & Tissue de Qiagen. Chaque mélange réactionnel est ensuite soumis à une réaction de PCR dont le protocole original est indiqué sur le Tableau 5 ci dessous. Puis, 7.51L du produit PCR est purifié sur colonnes selon la technologie DyeEx de Qiagen. Enfin, la préparation d'un mélange constitué de 2µL de produit PCR purifié, de 7.75µL d'HiDi formamide (Applied Biosystems) et de 0.251L de GS1200LIZ (Applied Biosystems) permet l'analyse des fragments par électrophorèse capillaire sur les plateformes Applied Biosystems Genetic Analyser 3100-Avant, 3130, 3130x1 et 3500. Le protocole d'électrophorèse capillaire est décrit sur le Tableau 6 ci-dessous. Etape Etape 2 Etape 3 Etape 1 15 cycles 15 fois 4 1 fois 1 fois Temp 15 min 30 sec 60 sec 70 sec 30 sec 60 70 sec 10 s sec (+5 min sec/cycle) Temp 95 °C 95°C ° 72°C 95°C 60°C 72°C 72 °C ératur (_1 1°C/cycle) e Tableau 5 : Caractéristiques du protocole PCR utilisé Caractéristiques Valeurs utilisées Run température 60°C Polymer fill volume 5020 Current stability 5µA Pre mn voltage 15kV Pre run time 180sec Injection voltage 1.6kV Injection time 10sec Number of steps 40 Voltage step interval 15sec Data delay time 80sec Run voltage 12kV Run time 6200sec Tableau 6 : Caractéristiques du protocole d'électrophorèse capillaire utilisé (°C : degré Celsius, µA : micro ampère, kV : kilo volt, sec : seconde) 5) Obtention du code MLVA L'analyse du profil électrophorétique s'effectue par le logiciel GeneMapper qui interprète les données brutes et attribue une taille à chaque amplicon marqué par un fluorophore. Le présent demandeur a développé trois fichiers, issus de GeneMapper , nécessaires à l'attribution du code MLVA. Le fichier nommé «Méthode d'analyse» permet le traitement des données analysées selon des critères définis. Les fichiers nommés «MLVA management A» et « MLVA management B» rassemblent l'ensemble des données recueillies sur les différents allèles associés à chaque marqueur défini par une gamme de taille et de couleur. Ces fichiers sont illustrés en figures 10 et 11. L'export du «Report manager» sous forme d'un fichier .txt donne l'attribution d'une valeur numérique, reflet du nombre de répétitions, pour chaque marqueur VNTR. Cette valeur est associée à un indice de qualité indiquant le degré de confiance que l'utilisateur peut attribuer à ce résultat. Arbitrairement, un indice supérieur à 0.5 est considéré comme valide. EXEMPLES Exemple 1 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa01223 avec les amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 20 (SEQ ID NO: 33) 5' CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTTTTGCAATGTCATTTACTGTATCACCAGGTTTAAC GACATGTACTCCGTTGCCGTCTTCTTTACCAGGTTTGTTGCCGTCTTCTTTACCAG GCTTGTTGCCGTCTTCTTTACCAGGCTTGTTGTTGTCTTCTTTACCAGGCTTGTTG 25 CCGTCTTCTTTGCCAGGTTTGTTGTTGTCTTCTTTACCAGGCTTGTTGCCGTCTTCT TTACCAGGTTTTTTGTTGTCTTCTTTACCAGGCTTGTTGCCGTCTTCTTTGCCAGG TTTGTTGCCGTCTTCTTTACCAGGTTTTTTGTTGTCTTCCTCTTTTGGTGC 3' Exemple 2 : 30 Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa0311 avec les amorces SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 34) 5' GTATCAACAAGTGATAGCATCAAATGGAGATAAATTATAAAGGTATATTATAAG 35 TATTTTAGGGTTAGAGCCCGAGACATAAATTAATATAGTAGGACCTACAGTGTT ATAATGGCGGGCCCCCAACACAAAGAATTTCGAAAAGAAATTCTACAGGTAATG CAAGTTGGCGGGGCCCCAACACAGAGAAATTCGAAAAGAAATTCTACAGGCAA TGCAAGTTGGCGGGGCCCCAACACAGAGAATTTCGAAAAGAAATTCTACAGGTA ATGCAAGTTGGGGAAGGACAGGAATAAATTTTGCGAAAATATCATTT 3' Exemple 3 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa0387 avec les amorces SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 35) 5' CAAAGTAATAGGCACTACAACGCTTATTGGCGGGGCCCCAACAAAGAAGCTGAC GAAAAGTCAGCTTACAATAATGTGCAAGTTGGGGATGGGCCCCAACATAGAGA AATTGGGTCCGTAATTTCTACAGACAATGCAAGTTGGCGGGGCCCCAACAAATT TAAGATACAATGCGTAATATTAATATGTTATTATTATGATAATTTACAGAATTAT ATGAAAAATGAATGAGGATGTGATGGTATGTTTGGAATG 3' Exemple 4 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa0550 avec les amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 20 (SEQ ID NO: 36) 5' GTGACAGATGTAAGACTTAGAAAAATACAAACAGATGGACGAATGAAAGCACT CGTTTCCATTACATTAGATGAAGCTTTCGTAATTCATGATTTACGTGTAATTGAA GGAAACTCTGGCTTGTTCGTTGCAATGCCAAGTAAACGTACACCAGATGGTGAA 25 TTCCGCGACATCGCGCATCCTATTAATTCAGATATGAGACAAGAAATTCAAGAT GCAGTGATGAAAGTATATGATGAAACAGATGAAGTAGTACCAGATAAAAACGC TACATCAGAAGATTCAGAAGAAGCTTAATCAATTTTATATTTAGCGATGTAATAC ATTTGCAATAAGTTGATTTGATACTGTCGATAAAGCATAAAGCTTTGTCGGCAGT TTTTTTAGTTTGTATTAATGTTTTTTTAGTTTGTATTAATGTTTTTTTAGTTTGTAT 30 TAATGTTTTTTTAGTTTGTATTAATGTTTTTTTATTTTTAATGAAAGGCTAATAAA TATATACGTTAACAGATTATGATGATATGAAAATTATTGATTCATTGCTGATAAA AATTGCGTTTGAATGATGCTCGTATTTTTGAAGTAAGAAAAAAGTTGTTTTTAAA ATTACAACGAATTAAAAACAATGCCTTTTATATGTTGAAAGAGTATTGCAGATT AAATTATAATAATGACGAAGTGTAAAATTTAATGGGGGTTAATGTTCATGCGAA 35 GACACGCGATAATTTTGGCAGCAGGTAAAGGCACAAGAATGAAATCTAAAAAG TATAAAGTGCTACACGAGGTTGCTGGGAAACCTATGGTCGAACATGTATTGGAA AGTGTGAAAGGCTCTGGTGTCGATCAAGTT 3' Exemple 5 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa0684 avec les amorces SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 37) 5' AGGTATTGGAAGTGAAACAGCAGATGTCTTACTTGTTTATATATTCGGACGTATT GAATTTATTCCAGATAGCTATACAAGAAAAATATATGATAAATTAGGATATGAA AACACTAAAAATTATGATCAATTAAAAAAAGTAGTCACATTACCAAATCATTTT ACAAATCAAGATGCTAATGAATTTCATGCTCTGTTAGATGTATTTGGTAAACATT ACTTTAGAGACAAAGATATAAAGAATTATGATTTTTTAGAACCTTACTTTAAAAA GTAAACGCTGTGAAGTTAGATAGATGAGTTTATATGAAATATAAAAAATAATTT ACTATTTTCTTTTAGTATGTGGACTTATATAATAAATAGAAGCATATAAAGAAAA AAACAGTTGTTTGTTTGTGCAGCAACTGCATAAAAGCCTCTAATCACTAAAGGT GAAGAGGAACGCAGTTGGATGCTAAGGCACAACTGCATAAATCCCTCTAATCGC TAAAGCGAAAAGTGGGATTAAAAAGGAGATGTGATAATGTGAAGAAATCGTTA ATTGCTTTTATTTTGATTTTTATGCTTGTCCTGAGTGGCTGTGGTATGAAAGATA ATGATAAACAAGGTAGCGATGATAATGGCTCGTCTAAATCGCCGTACCATAGAA TTGTTTCGTTAATGCCTAGTAATACTGAAATTTTATATGAATTAGGATTAGGTAA ATACATAGTTGGTGTTTCAACGGTTGATGATTATCCAAAAGATGTGAAAGAGGG TAAGAAACAATTTGATGCTTTGAATCTAAATAAAGAGGAACTTTTAAAGGCAAA GCCAGATCTAATTCTTGCGCATGAGTCGCAAAAGGCAACTGCTAATAAAGTATT GTCATCATTAGAGAAACAAGGCATCAAAGTAGTGTATGTTAAAGATGCACAATC AATTGATGAAACATACAACACATTTAAGCAAATTGGGAAATTAACGCATCATGA TAAGCAGGCTGAACAACTTGTTG 3' Exemple 6 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa0964 avec les amorces SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 38) 5' ATCCCAGATTATCCAATACAAAATGAGCTAACAAGTAGCATAAGAAAAGCCGCA 35 GCAAACATCGGCGACAAAGAGTTAACACATATGTGGAGTGGACAAAGCCCGCG ACTAGCAACAACGCATCCCGCCAACACCATCATGTCCAATATAATCAATCAAAT TAATCAAATCATGCAATATAAATAATCGACCGCAATCCACAAAAGCACAAGCAC TCCCAAACATTATTTTAGTGCTTGCCATTTTTGTGGATTGCGTTTCTATTTTACCA ATCTAGTCAAACGAAATTATCAAACTAAAGTTCGCTGAAATGATTATAGTCAAA CGAAAACATCAAACTAAAGTTCGCTGAAATGATTATGATCAAACGAAATTATCG AGCTGAAGGTCACCGAAATGATTATAATTAAACGAAATTATCGAGCTAAAGTTC ACTGAAATGATTATAATCAAACGAAAACATCAAGCTGAAGATCGCCGAAAGATT TTAATCAAGCGAAAACATCAAATTAAAGTTCGCTGAAATGATTATGATAAAAGT TATATGGTATGATGACATTGGTGATATATATGATAAACATCGGATTAACAGGTT GG 3' Exemple 7 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa1097 avec les amorces SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 39) 5' GAATTATTGTTATCGCCATTGTCTGGATTATCAGGGTTGTTAGGGTTGTCAGGG TTATTTGGTTCATCTGGGTTGTTAGGGTTATCAGGATTGTTAGGGTTATCAGGAT TGTTAGGGTTATCAGGATTATCTGGGTTATTAGGTTGGTCATCGTTGGCAAAATG GATATCTTCAATATTTTGTTTTAAGAAGTTGC 3' Exemple 8 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa1194 avec les amorces SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 40) 5' CTGTGTCGGTAGGTTACATTAATTACCAGCCAATTCCGAGATTCCCAGGCATGTC TCGTGACATTGCATTAGAAGTAGATCAAAATATTCCAGCAGCTGATTTATTATCA ACGATTCATGCACACGGTGGCAATATATTAAAAGATACACTTGTCTTTGATGTAT ATCAGGGCGAACATTTAGAAAAAGGTAAAAAATCAATTGCAATACGTTTAAATT ATTTAGACACAGAAGAAACATTGACAGATGAGCGCGTTTCAAAAGTGCAAGCG GAAATTGAAGCAGCATTAATTGAACAAGGTGCTGTTATTAGATAATGATTTAAA CCCCATGTATAAGGATATCTGAAGTAGATTGATATCCTTAACATGGGGTTTTATT TTTGGATTCACCAATTAGGTTTCGATTCATTTAAAAATCAAAGAGGCACAGCGG AATACAGATGATGCTTCTCACAACTGCATATAAAGTCATACTTATGAGCAAAGC AAATTAGTATGACTTACCTAATAGGATTTCCTATTAGGATCCAATTTATCTTGAT TTTATAAATCATAGAGGCACAGTGGATTACAGATGATGCTTCGCATCACTGCAT ATAAAGTCATACTTATGAGCAAAGCAAATTAGTATGACTTACCTAATAGGATCA CCTATTAGGATCCAATTCATTTTATAAATCAAAGAGGAACAGCGGAATACAGAT GATGCTTCGCACAACTGCATAAAAGCCTCTAATGATTAAAAATCAAAGAGGCTT TAAAATTTTTTGGGCTTTTTCACGATTTTTAAAATGCTTTTTTGAAATGGTATCTA AACGTGAAAGACCGTATTTTTTTATAATTTTTGCGGCAATTACATCGACTTTAGC ACC 3' Exemple 9 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa1729 avec les amorces SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 10 (SEQ ID NO: 41) 5' GTCTCGAATCACTTAACAACGAATAAAATATAATCTAATATCATTTTCATTCATG AAAAAGCGGGAATGGAATAGAAATGCTAAAGAACCATTAACGGTTTATTATGTA ATGGTTCTTCCACATTAGCCACCACTATTATGTACTTAAAAATAGGAATACATAA 15 TTAGATTCATGCATAGGGAGTGGGACAGAAATGATATTTTAACAAAATTAAATT CGTTATCCCCAACTGGCATTGCCTGTAGAATTTCTTTACGAAATTCTCTGTGTTG GGGCCCCATCCCCAACTTGCACATTATTGAAAGCTGACTTTTGGTCAGCTTCTAT GTTGGGGGCCCCGTCCCCAACTTCCATTGCCTGTTGAAATTAGGGTTCCAATTTC TCTGTGTTGGGGCCCCGCCAACTTCCATTGCCTGTTGAAATTGGGGTTCCAATTT 20 CTCTATGTTGGGGCCCCGTCCCCAACTTCCATTGCCTGTAGAATTTCTTTACGAA ATTCTCTATGTTGGGGCCCCGCCAATATAACATTGTAGAGCCTAGGACATTGTGA TGTCCCAGACTCTATCATCATGAATTATTCTCATCAAAAACTGTCTTTCGTCATTT TCGACGTTGAAACTTCAAATAAGTAATTTATTGTTGCCATTGTTTATACAACAAA ATTTAATTGACCTTCATTTTTGAACACATCGTCAATTGTTGCACCACCAAGACAC 25 ACATCACCTTGATAAAAAACAACTGCTTGTCCAGGTGTGATTGCTCTTACTGGCT CAGCAAAAGTAACACGTAGTGCATGGTC 3' Exemple 10 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa1866 avec les amorces 30 SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 42) 5' GCTTTACGTGTAATAACACCATTTTCAAATTTAGCTTCTTTTTGTTTAACAGTGTC TTTATTATCTATATTAACCGTCTCTGTCTCTGATACATCATTCTTTTTAGTAACTA 35 ATTGAGGAATTTCTTTCAAGTCATTTTTAGCAACTGGTTTTTCTGCAAATAACGC TTCAGTTAATTGACTCTCTTTTGAACCTGGTGTTAATTTAGCTTGCTTCTGTTTTG CAGCGTTTGCTAATCTTTCAGCTTGTGACTCTGGTTTTGATACTTCTACCTTTGCT GCACTTGCATCTTTAGTTGATGTGTCACTGTCTTTCTCTGCTTGTGCTTCTTTTTTA GCTTCTTGAACCTCTTGTGCCTCTTGTGATGTATCACTTAAATTATTTGCACTTGC TTCTTCTTTTATCGCTGCTTGTTGTGCTTTCAATGCCACTGCTTTTGGTTCTTCATT TGATACAGCTGCACTTTTATCTGTTTCTGCTTGTGCTTCTTTTTTAGCTTCTTGAAT CTCTTGTGCCTCTTGTGACGTGTCACTTAAATTATTTGCACTTGCTTCTTCTTTTAT TGCTGCTTGTTGTACTTTTAATGCCGATGCTTTTGACTCTTCATTTGATACAGCCA CACTTTTATCCGCTTCTGCTTGTGCTTCTCTTTTAGCTTCTTGAATCTCTTGTGCTT CTTGTGATGTATCACTTAAATTATTTGCACTTGCTTCTTCTTTTATCGCTGCTTGTT GTGCCTTTAATGCCGCTTGCTCATTTTTAGATTTGTTTAAAAATCCTTCAACACGT TCTTTTGTATAGGCAACCGTTTCTTCAAGTTGCGTTTTTCTTTCTTCAAACTTTTG CGACAGTTCTTGTTCTTTGACTTTTAAATCATCTGCTTTTTGATAAACTTTATTTTT AAAATACAAACCTAAAGCTGAACCAACAAGC 3' Exemple 11 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa0266 avec les amorces SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 22 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 43) 5' TTGGATATGAAGCGAGACCAAGATTCAACAAGCCAAGTGAAACAAATGCATAC AACGTAACGACAAATCAAGATGGCACAGTATCATACGGAGCTCGCCCAACACA AAACAAGCCAAGTGAAACAAACGCATATAACGTAACAACACATGCAAATGGTC AAGTATCATACGGTGCTCGCCCAACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCA TACAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACA CAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCATATAACGTAACAACACATGCAAATGG TCAAGTATCATACGGAGCTCGCCCGACATACAAGAAGCCAAGCGAAACAAATG CATACAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGA CACAAAAAAAGCCAAGCGAAACAAACGCATATAACGTAACAACACATGCAGAT GGTACTGCGACATATGGGCCTAGAGTAACAAAATAAATTTATAACTCTATCCAA AGACATACAGTCAATACAAAGAATTATGTATCTATACAACAGTAATCATGCATT CTATGATGCTTCTAACTGAATTAAAGCATCGAACAATCGGAAG 3' Exemple 12 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa0704 avec les amorces SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 24 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 44) 5' AAGAGTGTGTAGGGAATGGCGTTGTATAAATTGTATTAGAAGAACTTCTAACGC ATCTCTGTGGTTAAAAGAGATGAAGGGAACGACAGTTTAATTAAAACTGCATAA GAACTTCTAGCTTTTCTCTTTCGTTCAAAGAGAAGCAGCTGTTCGCAGTTTAATC AAAACCACATAAAGCTTTTAACTTTACTCTTTGATTTAAAGAGTGACAAATGTTT ACAGTTTAATTAAAACTGCATAAGAACTTCTAGCTTTTCTCTTTCGTTCAAAGAG AAGTTCTAATACCACCATATCGTGCGATCG 3' Exemple 13 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa1132 avec les amorces SEQ ID NO: 25 et SEQ ID NO: 26 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 45) 5' CTAGTTCAAGCTAGATCAGGTTCAAAGGGTTTGAGGGCAAGCCTCATCTCAGTA TAAAACACCCCTAGTGTGTGCGATTTATTTAATTAATTATACTGTAAGACGTTTG TAAACTTATGTCAATAGGTTGTCTTCATGAAATTTCGTTTAATTCGATTTAAAATT TATAATATTAGCATTGGATTTAAATTGAAGATGTAGTAGGAATGTTAGTAATTAA AGATATAAAAATATGTGACATGTAATAAGATTGAGCTGATAAATGAAGAGGGAT ACTTATCAATCATACCTCTTTAACAACAGTGAAGAACCCGTGCATAATGGCTTAC GAATTATAGTTTGTAGGGTAAAAGAGGGATACATGCGCCGAGCACATGCAAAA AAGCCCCTAACAACTAAAAGTTGTAAGGTAAAAGAGGGATACATGCGCCGAGC ACATGCAAAAAAGCCCCTAACAACTAAAAGTTGTAAGGTAAAAGAGGGATACA TGCACCGAGCGCAAGCAAAAAAGCCCCTAACAACTAAAGGTTGTAAGGAAGAA GAGGGATACATGCACCGAGCACATGCATAAAATCCCCTAACAACTAAAAGTTGT AAGGTAAAAGAGGGATACATGCGCCGAGCACATGCATAAAATCCCCTAACAAC TAAAAGTTGTAAGGAAGAAGAGGAACACATGCGCCGAGCACATGCATAAAAGC CCCTAACAACTAAAAGTTGTAAGGGGATTTAAATTAATTTAGTGTATCTTGGATA TCTTGTTTTGTTTGATTAATATCTTCTGTTTTTTCTTCTTTTTTATCTTTTAATTTTT CTTCAACTTCTTTAGCTTTTTCTGCTGCTTTTTTATTTTGATTTTCATTAGACATGA TTAATTCCTCCCA 3' Exemple 14 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa1291 avec les amorces SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 28 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 46) 5' GTCAAGACACAGATATTGCTAATACAGTAGCGTTCTTAGCATCAGACAAAGCAA AATATATTACAGGTCAAACAATCCATGTAAATGGTGGAATGTACATGTAATATA TTTGAGCTAAAGCTCATTGACGCAGTGGTTGACTGGTCATCCAATGGAGAATTGT CTGACCTAGTCAACTTTGCGGGGGAAATTCTAAGCAACCTAGATAAGGTTCCAG AATTTCTCCCTAAGAAACACTAATCAATAAATTGATAAGAAGATTAGAGGAACG CTTGAGCTAAAGCTCAAGATAAAGACGCAGAAATCAATAAATTGATAACTGGGA TAGAGGTACGCCTGAGCTAAAGCTCAAGATAAAGACGCAGTAATCAATAAATTG ATAACTGGGATAGAGGTACACCTGAGCTAAAGCTCATGCATAAGAAACACTAAT CAATAAATTGATAAGTGTTTCTAAAATTTCTACTTGTTTTTTAGAATTTAAAATG GGAAAATATAATAGTCTATGTATAGGCATTTTTAAAGGAGGTGAATCGACGTGG AAAATTTCGATAAAGTAAAAGATATCATCGTTGACCGTTTAGGTGTAGACGCTG ATAAAGTAACTGAAGATGCATCTTTCAAAGATGATTTAGGCGCTGACTCACTTG ATATCGCTGAATTAGTAATGGAATTAGAAGACGAGTTTGGTACTGAAATTCCTG ATGAAGAAGCTGAAAAAATCAACACTGTTGGTGATGCTGTTAAATTTATTAACA GTCTTGAAAAATAATAAATCTTACATCTGGGTCGTCAGTATTGTCGACTCAGTTT TTTTCTTTAATTATCAATAGTTTTAACGTAAAATTAAAGATGATTCAAGAGCAAC AC 3' Exemple 15 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa2039 avec les amorces SEQ ID NO: 29 et SEQ ID NO: 30 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 25 (SEQ ID NO: 47) 5' TATTTCGTTCTACCCCAACTTGCATTGTCTGTAGAATTTCCTTTCGAAATTCTCTT TGTTTGGGGCCCCACCCCAACTTGCACATTATTGTAAGCTGACAGAAAGTCAGCT TCTATGTTGGGGCCCCGCCAACTTGCACATTATTGTAAGCTGACAGAAAGTCAG 30 CTTCTATGTTGGGGCCCCACTAGAATTGAAAAAAGCTTGTTACAAGCGTATTTTC TTTCAGTCAACTACTGCCAATATAACATTGTAGTGCCTAGGACATTGAATTTATG 3' Exemple 16 : 35 Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Sa2511 avec les amorces SEQ ID NO: 31 et SEQ ID NO: 32 pour la souche Staphylococcus aureus Mu50 (SEQ ID NO: 48) 5' GGCAAAATGCACATGAAACACTAATTAAGCTTTAATTTTGAGTAATATAGAAGA TATTAAAAGCAGCAGTAAGATGTTTTCTAATTGAAAATTATCTTACTGCTGCTTT TTAAGAATTACTGTGTCAGTCTATTTTCGGTTCGCCTGCGCTTTTGCGCATGCATA AAAGCCCCTAACAACCTGAGGTCACTGCGCTTCGGTTCGCCTGCGCTTTTGCGCA TGCATAAAAGCCCCTAACAACCTGAGGTCACTGCGCTTCGGTTCGCCTGCGCTTT TGCGCATGCATAAAAGCCCCTAACAACCAAAGGTTGTAAGGGGCTTTAAATGTC AGATAGTATTTTTTAAATTGATTTTAAATATTCTTGACCTT 3' B) Test de génotypage Le groupe d'étude sur les marqueurs épidémiologiques (l'ESGEM) a défini plusieurs critères permettant de définir la performance d'une méthode de typage. Une méthode fiable doit reposer sur des marqueurs stables et identifiables sur les isolats typés. L'analyse des résultats de typage doit permettre une bonne discrimination entre les isolats tout en conservant une signification épidémiologique dans un contexte donné. Enfin, et de manière inhérente aux aspects expérimentaux, la technique considérée doit être reproductible afin d'envisager une future standardisation et automatisation. Cette méthode de typage doit être validée sur un panel de souches dont les 20 caractéristiques doivent être connues. Ces souches doivent avoir été typées par d'autres méthodes afin de démontrer l'amélioration technologique. Les critères de performance établis ont été validés pour la technique de typage selon la présente invention. Cette validation a été réalisée sur une collection de référence établie par groupe de travail de l'IUMS [International Union of Microbiology Societies]. La 25 collection HARMONY est composée de 89 isolats cliniques non reliés épidémiologiquement typés par plusieurs techniques dont la PFGE et le MLST. 1) Diversité des souches et indice de discrimination 30 Le traitement des résultats antérieurs de typage par MLVA (selon Pourcel et al. et Schouls et al.) et MLST (autre technique de l'art antérieur) a été réalisé par import des données numériques issues respectivement de Pourcel et al. et Schouls et al. dans le logiciel bionumerics v.6.0 (Applied Maths). Les ST ont été identifiés par Cookson et collaborateurs, chaque ST a été décomposé en un code numérique de 7 chiffres selon la description de 35 chacun d'entre eux dans la base http://saureus.mlst.net. Les résultats de typage développé dans la présente invention sont traités par le logiciel bionumerics v.6.0 (Applied Maths) à partir des données exportées de GeneMapper v.4.1 (Applied Biosystems). L'agrégation ou clustering a été obtenu par la méthode 1'UPGMA selon le coefficient « categorical » (figures 2, 3, 4, 5, 6 et 7). Les motifs ont été imposés par un seuil « cut-off » de 60% sur l'agrégation ou « clustering » des données issues du typage décrit par la présente invention (appelée dans la suite de la description MLVA16_DS). Ces mêmes motifs ont été conservés pour les agrégations des données issues du présent procédé (Panell et Pane12), du protocole MLST (MLST), pour le MLVA décrit par Pourcel et col. (appelé ci- après MLVA10_CP) et pour le MLVA décrit par Schouls et col. (appelé ci-après MLVA8 LS). Ces symboles permettent de visualiser la corrélation entre les différents protocoles. Cette concordance entre les différents résultats de comparaison peut mathématiquement être évaluée par un indice dit de congruence calculé selon le coefficient de corrélation de Pearson. Les protocoles MLVA (MLVA16_DS, MLVA10_CP et MLVA8_LS) sont très congruents (conservation des motifs) et montrent des indices de congruence très élevés. Ces indices sont indiqués sur le Tableau 7 ci après. MLVA16_DS Panell_DS MLST7 MLVA8_LS MLVA10_CP Pane12_DS MLVA16_DS 100.00 97.01 92.61 92.80 92.51 89.10 Panell_DS 97.01 100.00 91.76 86.29 85.70 75.95 MLST7 92.61 91.76 100.00 79.04 81.17 77.85 MLVA8_LS 92.80 86.29 79.04 100.00 85.26 86.09 MLVA10_CP 92.51 85.70 81.17 85.26 100.00 86.55 Pane12_DS 89.10 75.95 77.85 86.09 86.55 100.00 Tableau 7 : Indice de congruence entre les différents protocoles Cette observation permet de conclure à la pertinence de chacun des VNTRs utilisés dans le procédé décrit par la présente invention. En effet, l'agencement des VNTRs entre eux et la combinaison des 16 VNTRs n'a pas eu d'effet sur la structure de l'arbre construit et sur la conservation des complexes clonaux. D'ailleurs, il est intéressant de remarquer que les protocoles MLVA, et notamment MLVA16_DS, sont congruent avec le MLST comme le prouve la conservation des motifs et les indices de congruence élevés. Ces valeurs de congruence montrent que l'agencement des différents VNTRs au sein de chaque panel a été réalisé de manière pertinente. En effet, MLVA16 DS et Panell DS sont les protocoles les plus congruents avec le MLST. Le gain de congruence réalisé par l'ajout du panel 2 est minime (0.85%), l'analyse du panel 1 est donc nécessaire et suffisante pour classer correctement les groupes phylogénétiques. Le calcul des indices de discrimination (D) a été déterminé, selon l'indice de Simpson, sur les 89 isolats appartenant à la collection HARMONY. Les indices de discrimination de MLVA16 DS, Panell DS, Panel2 DS, MLVA10 CP, MLVA8_LS et MLST7 sont respectivement de 0.965, 0.952, 0.925, 0.955, 0.955 et 0.878. Contrairement au MLST, les protocoles MLVA (excepté le panel 2) dont les pouvoirs discriminants sont sensiblement les mêmes, satisfont aux recommandations de 1'ESGEM [ESCMID Study Group for Epidemiological Markers - ESCMID : European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases] (D>0.95). L'indice de discrimination élevé du panel 1 justifie qu'il puisse être utiliser seul lors d'investigations épidémiologiques. Cependant l'utilisation conjointe des deux panels assure une discrimination inégalée par les protocoles de typage précédemment développés. Le procédé de typage selon le protocole MLVA16_DS (Panel 1 et Panel 2) permet ainsi un suivi précis d'une souche de S. aureus dans un contexte spatio-temporel restreint. Il est intéressant de remarquer que les 16 VNTRs utilisés présentent des indices de discrimination très différents (Tableau 8). Certains marqueurs comme Sa0550, Sa1729 ou Sa1866 sont faiblement discriminants, permettant ainsi d'enraciner l'arbre et de consolider certains groupes phylogénétiques. Ces marqueurs sont d'ailleurs avantageusement compris dans le panel 1. D'autres VNTRs comme Sa0704, Sa1132 ou Sa2511 sont davantage discriminants et assurent la distinction génotypique d'isolats appartenant à de grandes familles. Ces marqueurs sont d'ailleurs avantageusement compris dans le panel 2. Nom du VNTR Nombre Indice de Intervalle de confiance de d'allèles discrimination (D) D à 95% Sa0122 9 0.8062 [0.7631,0.8493] Sa0266 5 0.6696 [0.6333,0.7058] Sa0311 5 0.6397 [0.5865,0.6929] Sa0387 5 0.7204 [0.6802,0.7605] Sa0550 5 0.3767 [0.2597,0.4936] Sa0684 5 0.5365 [0.4389,0.6341] Sa0704 6 0.7546 [0.7073,0.8019] Sa0964 4 0.6044 [0.5334,0.6755] Sa1097 9 0.6476 [0.5495,0.7457] Sa1132 4 0.6425 [0.5852,0.6998] Sa1194 5 0.5822 [0.4976,0.6669] Sa1291 5 0.5102 [0.4003,0.6202] Sa1729 5 0.5983 [0.5256,0.6711] Sa1866 3 0.4969 [0.4036,0.5903] Sa2039 6 0.6453 [0.5612,0.7294] Sa2511 10 0.8189 [0.7775,0.8604] Protocole de typage Nombre de Indice de Intervalle de confiance de génotypes discrimination (D) D à 95% MLVA16 DS 49 0.9650 [0.9455,0.9846] Panell 41 0.9515 [0.9294,0.9736] Pane12 36 0.9252 [0.8883,0.9621] Tableau 8 : Diversité de la collection HARMONY et indices de discrimination des protocoles MLVA16_DS, Panell, Pane12 ainsi que des VNTRs utilisés 2) Typabilité Le typage a été réalisé sur 89 isolats avec 16 VNTRs, 1424 données devraient donc avoir été produites. Or, 7 données n'ont pas pu être obtenues et sont indiquées par un 0 dans l'arbre (Figure 2). Le MLVA16_DS présente donc une typabilité de 99.6%, valeur très satisfaisante pour une méthode de typage (Tableau 9 ci-dessous). De même, les protocoles Panell et Pane12 montrent une typabilité respective de 99.8% et 99.1%. Cependant, un VNTR (Sa2511) concentre la majorité de ces données manquantes.15 Nom du VNTR Données manquantes Typabilité (en%) Sa0122 0 100 Sa0266 0 100 Sa0311 1 98.9 Sa0387 0 100 Sa0550 0 100 Sa0684 0 100 Sa0704 0 100 Sa0964 0 100 Sa1097 1 98.9 Sa1132 0 100 Sa1194 0 100 Sa1291 0 100 Sa1729 0 100 Sa1866 0 100 Sa2039 0 100 Sa2511 5 94.4 Protocole de typage Données manquantes Typabilité (en%) MLVA16 DS 7 99.6 Panell 2 99.8 Pane12 5 99.1 Tableau 9 : Typabilité des protocoles MLVA16_DS, Panell, Pane12 ainsi que des VNTRs utilisés sur la collection HARMONY (89 isolats) 3) Reproductibilité Les 89 isolats ont été typés deux fois et ont montré un même profil génotypique. Afin de valider cette reproductibilité, un plan expérimental précis a été mis en place. Ainsi, trois souches de la collection Harmony et appartenant à trois complexes clonaux différents ont été typées huit fois de manière indépendante. Les tailles observées de chaque locus pour les huit essais sont recensées sur les Tableaux 10a, 10b et 10c représentés en Figure 8. Un intervalle de confiance à 95% a été calculé selon un test de Student avec le coefficient de Student t(0.95 ; 8). Toutes les valeurs sont comprises dans leur intervalle de confiance respectif ; le typage décrit dans la présente invention est donc reproductible. Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention. REVENDICATIONS1. Procédé de génotypage de l'espèce Staphylococcus aureus par MLVA comprenant les étapes consistant à : (i) réaliser une co-amplification d'au moins huit loci. VNTRs par PCR multiplexe dans un milieu réactionnel comprenant un échantillon d'ADN issu d'un isolat de Staphylococcus aureus afin de former plusieurs amplicons pour chacun des huit loci VNTRs, (ii) analyser lesdits amplicons par électrophorèse capillaire afin d'obtenir un profil élcetrophorétique dudit échantillon, et (iii) attribuer un code numérique MLVA audit profil éleetrophorétique. 2. Procédé de génotypage selon la revendication 1, dans lequel le code numérique MLVA de l'étape (iii) est obtenu automatiquement par informatique, à partir de logiciel d'analyse de fragments ou de génotypage. 3. Procédé de génotypage selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le milieu réactionnel de l'étape (i) comprend : au moins huit amorces sens marquées et au moins huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces sens/anti-sens pour chacun desquels correspond un locus VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en amont de son locus respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son locus respectif 4. Procédé de génotypage selon la revendication 3, dans lequel les au moins huit amorces sens sont marquées par un fluorophore en 5'. 5. Procédé de génotypage selon l'une des revendications 3 ou 4, dans lequel les au moins huit couples d'amorces respectivement anti-sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis parmi : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24; SEQ ID NO 25/ SEQ ID NO : 26; SEQ ID NO : 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO: 29/ SEQ ID NO 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 32. 6. Procédé de génotypage selon l'une des revendications précédentes, dans lequel est réalisée à l'étape (i), une première co-amplification de dix loci VNTRs par PCR multiplexe dans un premier milieu réactionnel. 7. Procédé de génotypage selon la revendication 6, dans lequel le premier milieu réactionnel comprend les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9l SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16: SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20. 8. Procédé de génotypage selon l'une des revendications 6 et 7, dans lequel est également réalisée à l'étape (i) une seconde co-amplification d'au moins six loci VNTRs supplémentaires par PCR multiplexe dans un second milieu réactionnel, chacun des premier et second milieux réactionnels comprenant un échantillon d'ADN issu du même isolat de Staphylococcus aureus. 9. Procédé de génotypage selon la revendication 8, dans lequel le second milieu réactionnel comprend les couples d'amorces respectivement anti- sens/sens suivants : SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO 15 24; SEQ ID NO : 25/ SEQ ID NO : 26; SEQ ID NO : 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO ; 29/ SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO : 32. 10. Kit de génotypage de Staphylococcus aureus pour la mise en oeuvre du procédé de génotypage selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant : - un milieu réactionnel comportant au moins huit amorces sens marquées et au moins 20 huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces sens/anti-sens pour chacun desquels correspond un loci VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en amont de son loci respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son loci respectif, - un mix d'amplification, 25 éventuellement un témoin positif et un faux témoin négatif, de manière à valider le résultat et s'affranchir de faux-positifs ou de faux-négatifs. 11. Kit de génotypage selon la revendication 10, dans lequel les au moins huit couples d'amorces respectivement anti-sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis pa SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ II? NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :Il/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO 24; SEQ ID NO: 25/ SEQ ID NO : 26; SEQ IDNO 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO : 29/ SEQ ID NO 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO:32. 12. Kit de génotypage selon l'une des revendications 10 à 11, comprenant un premier milieu réactionnel qui comprend les couples d'amorces respectivement antisens/sens suivants : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO 8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20. 10 13. Kit de génotypage selon la revendication 12, comprenant un second milieu réactionnel qui comprend les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants: SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24; SEQ ID NO : 25/ SEQ ID NO 26; SEQ ID NO : 27/ SEQ ID NO : 28; SEQ ID NO : 29/ SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31/ SEQ ID NO: 32.