Brevet FR2951542A1 — publié le 20110422

Procédé de détection optique d'objets micrométriques en solution Le domaine de l'invention est celui des dispositifs et des procédés de détection en imagerie de contact pour le diagnostic et l'analyse biologique. Dans le domaine de l'imagerie optique pour le diagnostic biologique, si l'on se restreint à la détection spécifique, hors imagerie de contact, deux types de méthodes sont principalement utilisées. Ce sont la « cytométrie en flux » et l'imagerie moléculaire de fluorescence. La cytométrie en flux est une technique puissante qui permet de compter, de caractériser et de classer les différentes cellules qui coupent le faisceau lumineux d'un laser. En analysant les figures de diffraction, il est possible de déterminer les dimensions de la cellule. Des mesures de fluorescence permettent en outre de distinguer les différentes familles de bactéries. L'inconvénient de cette technique est qu'elle nécessite une instrumentation coûteuse et complexe. Un autre inconvénient est un angle solide de balayage relativement faible, limitant le champ d'investigation. L'imagerie moléculaire de fluorescence est une méthode largement utilisée en diagnostic biologique en raison de sa très grande efficacité. La sensibilité des mesures en fluorescence est celle des évènements discrets : à l'aide de marqueurs fluorescents, il est possible de détecter en microscopie des molécules individuelles. Pour obtenir de bons résultats, il est nécessaire de parfaitement séparer l'énergie qui excite les molécules fluorescentes appelée énergie d'« excitation » de celle émise par celles-ci, appelée énergie d'« émission ». Si d'excellents filtres existent aujourd'hui, ceux-ci imposent un conditionnement des faisceaux lumineux, en particulier une faible ouverture des faisceaux. Par conséquent, les systèmes optiques de mise en oeuvre de cette méthode sont complexes et volumineux. L'imagerie de fluorescence nécessite également l'ajout préalable d'un fluorophore dans le milieu à analyser, ce qui rend le procédé invasif. Aussi, on cherche à remplacer ces techniques complexes et coûteuses par des dispositifs d'imagerie de contact, ayant un champ d'observation étendu et non invasifs. Ces techniques se développent de plus en plus car elles permettent de détecter des cellules, des bactéries ou plus généralement des particules de taille micrométrique sans avoir recours aux systèmes optiques évolués précédents. Un dispositif d'imagerie de contact est représenté schématiquement en figure 1. Ce dispositif comporte une source d'éclairage 1, pouvant être une source de petite dimension, par exemple une diode électroluminescente, un diaphragme 2 permettant de limiter l'ouverture de la source et un imageur ou capteur 3 qui peut être une matrice de photosites, matrice de type « CCD », signifiant «Charge-Coupled Device » ou « CMOS », signifiant « Complementary Metal Oxide Semiconductor ». De tels imageurs comportent généralement des microlentilles associées à chaque photosite. Le diaphragme 2 n'est pas indispensable, mais son utilisation est avantageuse. On vient insérer entre cette matrice 3 et la source de lumière 1, une lame transparente 4 de type lame de microscope portant l'objet de l'étude 5. Cet objet est une solution comportant des particules micrométriques, ces particules pouvant être des particules biologiques telles des cellules ou des bactéries ou d'autres particules telles des micro-billes. La goutte analysée repose sur la lame transparente 4 et son ménisque est au contact du gaz ambiant, ce gaz pouvant être de l'air. La matrice 3 est reliée à un système d'affichage et/ou de traitement d'images, non représenté sur la figure 1. La distance séparant la diode 1 de la lame porte-objet 4 est de préférence supérieure à 1 centimètre, et peut être, par exemple, de quelques cm, typiquement comprise entre 2 et 5 centimètres. La distance séparant l'objet de la surface du capteur est comprise entre 0,1 et 2 millimètres. Bien qu'on parle d'imagerie de contact, l'objet de l'étude n'est pas situé au contact direct du capteur, mais à la distance précédemment indiquée. La lame est constituée d'un matériau transparent tel la Silice, le quartz, et son épaisseur varie entre quelques dizaines de micromètres et 1 millimètre. Ce dispositif très simple, sans optique de grossissement peut constituer, dans certains cas, une alternative aux méthodes conventionnelles de comptage optique telles que la cytométrie en flux, la microscopie optique haute résolution ou les techniques d'imagerie moléculaire de fluorescence. Depuis quelques années, plusieurs équipes ont obtenu des résultats impressionnants en imagerie de contact. Ainsi, une équipe de l'université américaine UCLA (University of California, Los Angeles) utilise l'imagerie de contact pour détecter et identifier des bactéries. Cette méthode est décrite dans la publication suivante « Lensfree holographic imaging for on-chip cytometry and diagnostics » de Sungkyu Seo and al. parue dans «The Royal Society of chemistry» - Dec. 5, 2008 û 2009, 9, 777-787. Dans les dispositifs décrits dans cette publication, les bactéries sont placées dans un liquide entre deux plaques, l'ensemble étant posé sur une matrice de photosites. Un éclairage monochromatique est filtré par un diaphragme de 100 microns de diamètre pour obtenir une bonne cohérence spatiale. On obtient ainsi au niveau de la matrice de photosites une figure de diffraction pour chaque cellule immergée. Selon les auteurs, les figures de diffraction obtenues sont suffisamment résolues et distinctes d'une espèce à l'autre pour permettre un comptage spécifique des différentes bactéries. La méthode proposée par l'équipe de l'université UCLA est élégante. Elle présente cependant un inconvénient. Elle nécessite l'utilisation de capteurs CCD haute sensibilité nécessairement coûteux. Ainsi, les capteurs utilisés sont des capteurs CCD haute sensibilité de marque « Kodak » et de référence « Kodak Kai-10002 ». Si l'on utilise des capteurs standards, tels des capteurs CMOS ou des CCD à bas coût, il est encore possible d'observer des figures de diffraction pour différents particules micrométriques de 1 micromètre de diamètre telles que des billes de Silanol, des billes de Latex ou des bactéries de type Escherichia Coli. Par contre, l'efficacité de détection est très faible, au mieux de l'ordre du %.. La figure 2 représente ainsi le signal S obtenu sur un axe x du capteur passant par le centre d'une particule P. Le signal S représente ici le niveau de gris mesuré par différents pixels selon l'axe des ordonnées, les pixels constituant l'axe des abscisses: il s'agit d'un profil. On voit que le rapport signal sur bruit est très faible, à peine suffisant pour permettre la détection de la particule. Le procédé selon l'invention ne présente pas ces inconvénients. Il permet, en effet, dans un dispositif à imagerie de contact, de détecter des particules de taille micrométrique sans avoir recours à des capteurs haute sensibilité. La caractéristique principale du procédé selon l'invention est de réaliser la mesure ou les mesures pendant la phase d'évaporation de la goutte de liquide dans laquelle se trouvent les particules micrométriques (bactéries, cellules, billes ...) à détecter. Ainsi, contrairement aux mesures de l'art antérieur, la goutte n'est pas disposée entre deux plaques. De plus, la goutte doit être au contact d'un gaz, par exemple de l'air, afin que l'évaporation puisse avoir lieu. On a en effet constaté que la détection était beaucoup efficace au cours ou à la suite de l'évaporation. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de détection optique de particules ou d'organismes de taille micrométrique ou sub- micrométrique au moyen d'un dispositif à imagerie de contact, lesdites particules ou organismes étant immergés dans une goutte de liquide, la détection étant réalisée au moyen d'une matrice de cellules photo-sensibles ou photosites, caractérisé en ce que ledit procédé comporte au moins une première étape de détection réalisée pendant l'évaporation de la goutte de liquide. Avantageusement, ledit procédé comporte au moins une seconde étape de détection réalisée après l'évaporation de la goutte de liquide. Avantageusement, la détection est réalisée en périphérie de la goutte, à l'interface séparant la goutte de sa partie évaporée. Avantageusement, ledit procédé comporte une succession d'étapes de détection réalisées à intervalles de temps réguliers pendant l'évaporation de la goutte, chaque étape de détection permettant de mesurer la répartition de particules ou d'organismes se trouvant dans un plan donné, ledit plan étant à une distance de la matrice de photosites dépendant du temps d'évaporation, l'ensemble desdites répartitions de particules ou d'organismes obtenues permettant de reconstituer une répartition tridimensionnelle des particules ou des organismes dans la goutte initiale avant évaporation. Avantageusement, le liquide est de l'eau ou du « TRIS », 35 abréviation de trishydroxyméthylaminométhane. Enfin, la lame de verre portant la goutte de liquide peut être fonctionnalisée. L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages 5 apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre donnée à titre non limitatif et grâce aux figures annexées parmi lesquelles : La figure 1 représente un dispositif en imagerie de contact ; La figure 2 représente le signal de détection obtenu avec une matrice à photosites à faible sensibilité ; 10 La figure 3 représente le principe du procédé de détection selon l'invention ; La figure 4 représente un signal de détection obtenu avec une matrice à photosites à faible sensibilité en utilisant le procédé selon l'invention ; 15 La figure 5 représente des étapes de détection successives mettant en oeuvre le procédé selon l'invention. Comme on l'a vu, l'utilisation d'un capteur de faible sensibilité ne permet pas d'obtenir des rapports signal sur bruit élevés. Le procédé selon 20 l'invention permet d'augmenter considérablement le rapport signal sur bruit et par conséquence l'efficacité de détection. Les systèmes de détection selon l'art antérieur détectent les micro-particules ou les micro-organismes au sein même d'une goutte de liquide. Or, tant que les particules sont immergées, elles sont difficilement discernables, sauf à utiliser un capteur à haute 25 sensibilité. Ainsi, la vue de gauche de la figure 3 représente, au temps T, l'image issue d'une vue partielle d'une goutte G comportant des particules P. Cette image est issue d'un capteur d'un dispositif à imagerie de contact. Les particules ne sont pas discernables si le capteur a une sensibilité trop faible. Or, lorsque la goutte de liquide s'évapore, les particules, bactéries 30 ou billes micrométriques apparaissent très clairement au niveau de l'interface air/liquide, et plus particulièrement lorsque la particule se trouve dans le ménisque de la goutte. Ainsi, la vue de droite de la figure 3 représente, au temps T+OT, l'image d'une vue partielle de la goutte G précédente partiellement évaporée. Les particules P apparaissent clairement dans la 35 zone Z de la goutte qui s'est évaporée. La partie située dans le coin supérieur droit, désignée par la lettre L, correspond à la lame non initialement recouverte de la solution. La figure 4 représente ainsi le profil du signal S obtenu sur un axe x du capteur passant par le centre d'une particule P. On voit que le rapport signal sur bruit est maintenant suffisant pour permettre la détection de la particule. Le rapport signal sur bruit représenté est suffisant pour envisager une détection d'une grande partie des cellules immergées. II est de l'ordre de quelques dizaines de %. Cette méthode est reproductible. Le procédé selon l'invention est donc très simple à mettre en oeuvre. Il consiste essentiellement à réaliser des mesures pendant l'évaporation de la goutte de liquide. Une mesure ou une étape de détection consiste essentiellement à enregistrer les signaux détectés par les photosites de l'imageur du dispositif en imagerie de contact et à analyser leur amplitude. L'explication physique de cette augmentation de contraste des particules éclairées pendant l'évaporation est complexe. On sait que l'on observe des taches de diffraction, avec un saut d'intensité lors de l'évaporation ou peu après cette évaporation, le signal s'atténuant peu à peu après l'évaporation, lorsque la bactérie se trouve au contact de l'air. L'intensité du signal est maximum lorsque la particule se trouve à l'interface liquide / gaz, au niveau du ménisque de la goutte. Dans certaines conditions, il est possible que lorsqu'une goutte s'évapore, elle diminue essentiellement de hauteur, l'évaporation se produisant du haut de la goutte vers le bas et non pas du bord de la goutte vers le centre. Cela se produit, par exemple, lorsque la lame est inclinée de quelques degrés. On peut mettre à profit cet effet pour reconstituer une répartition tridimensionnelle des particules ou des organismes dans la goutte initiale avant évaporation. Il suffit pour cela de réaliser une succession d'étapes de détection réalisées à intervalles de temps réguliers pendant l'évaporation de la goutte. Chaque étape de détection permet de mesurer la répartition de particules ou d'organismes se trouvant dans un plan donné, ledit plan étant à une distance de la matrice de photosites dépendant du temps d'évaporation, l'ensemble desdites répartitions de particules ou d'organismes obtenues permettant de reconstituer une répartition tridimensionnelle des particules ou des organismes dans la goutte initiale avant évaporation. La figure 5 illustre ce principe. Sur cette figure, on a représenté à trois temps différents de l'évaporation d'une goutte comportant des particules, d'une part une vue tridimensionnelle d'une portion de la goutte et d'autre part l'image correspondante issue du détecteur matriciel du dispositif à imagerie de contact. Il est à noter que les vues tridimensionnelles ne sont pas représentatives des dimensions réelles des gouttes et de leur répartition. Au temps To, seules deux particules émergent de la goutte et sont identifiables sur l'image issue du détecteur. Elles sont représentées par des cercles blancs. Au temps T1, après 30 secondes d'évaporation, un plus grand nombre de particules émergent et sont identifiables sur l'image issue du détecteur. Enfin, Au temps T2, après 45 secondes d'évaporation, l'évaporation est pratiquement achevée, toutes les particules émergent et sont identifiables sur l'image issue du détecteur. Ainsi, à partir des différentes images successives prises aux instants To, T1, T2, ..., il devient possible de connaître la répartition tridimensionnelle des particules au sein de la goutte. II est possible, si l'on souhaite maîtriser parfaitement le procédé, de contrôler l'évaporation au moyen de diodes infrarouges, ou de résistances chauffantes ou d'un souffle de gaz atteignant le ménisque de la goutte. Des moyens de chauffage peuvent également être intégrés dans le substrat. II s'agit par exemple de lames de quartz sur lesquelles on dépose une couche mince d'ITO (Indium Tin Oxyde oxyde d'indium et de tungstène), ce dépôt pouvant alors former une résistance électrique. Pour donner des ordres de grandeur, selon la taille de la goutte, le liquide utilisé et les conditions expérimentales, le temps d'évaporation d'une goutte dure de quelques secondes à quelques dizaines de secondes, le volume de la goutte étant compris entre 1 microlitre et 20 microlitre, voire au-delà. Différents liquides comme le TRIS, abréviation de trishydroxyméthylaminométhane ou l'eau purifiée peuvent être utilisés. Le TRIS présente l'avantage d'être une solution saline permettant de préserver les bactéries quelques jours. Il est préférable que la lame qui porte la goutte ne soit pas trop hydrophobe. Le procédé fonctionne avec différents types de particules. On citera, à titre d'exemples, les billes de Silanol de 1 micromètre de diamètre, les billes de Latex de 1 micromètre de diamètre et des bactéries. Des essais concluants ont été réalisés sur des bactéries de type Escherichia Coli ou Bacillus Subtilus. Il fonctionne dans une grande gamme de concentrations, d'une particule par goutte jusqu'à cent mille particules par goutte. Il est bien entendu préférable que l'éclairage venant de la source soit le plus homogène possible. Autrement dit, la surface du ménisque est éclairée selon une intensité sensiblement égale en chaque point. Il est également préférable que l'éclairage ait une certaine cohérence spatiale, c'est-à-dire que le diaphragme disposé devant la source soit de petites dimensions. On peut, par exemple, utiliser un diaphragme de 100 micromètres de diamètre. Le dispositif d'acquisition est simple et peu coûteux puisqu'il ne comprend qu'une carte électronique d'acquisition des images numériques venant des photosites d'un capteur de type « CCD » bas coût ou « CMOS » pour caméra de type « webcam », une diode électroluminescente, un diaphragme et une lamelle de verre. Les pixels ou photosites du capteur peuvent avoir des dimensions moyennes, de l'ordre de deux à dix microns. Ces capteurs ont un prix bien plus faible que celui des capteurs haute sensibilité où la taille des pixels n'excède pas deux microns. Il s'agit de capteurs CMOS ou de CCD à faible coût. Il est possible, pour améliorer la détection, d'utiliser des lames de verres dites « fonctionnalisées » au moyen d'anticorps pour isoler les bactéries spécifiquement du milieu bactérien. On peut alors détecter et identifier les bactéries détectées, l'identification étant réalisée selon la fonctionnalisation de la lame. Concernant les applications industrielles du procédé selon l'invention, on citera, à titre d'exemples non limitatifs: - Le contrôle de la qualité de l'air, en terme de charge bactérienne et fongique, des milieux hospitaliers, pharmaceutiques ou agro-alimentaires ; - La mesure ou l'aide au diagnostic pour les études précliniques qui portent sur les micro-organismes, la biologie cellulaire et les pathologies - Des mesures de concentrations de particules biologiques réalisées sur des fluides corporels. On citera également, à titre d'exemple, le diagnostic bactériologique des infections urinaires. L'examen bactériologique des urines permet d'affirmer l'infection urinaire quand il montre la présence d'une bactériurie monomicrobienne (une seule espèce de bactérie) avec un nombre de colonies supérieur à 100 bactéries/pl, associée à une leucocyturie (présence de globules blancs dans les urines) supérieur à 10 leucocytes/pl ou une pyurie. De telles mesures peuvent être effectuées facilement avec le 10 procédé selon l'invention. REVENDICATIONS1. Procédé de détection optique de particules ou d'organismes de taille micrométrique ou sub-micrométrique au moyen d'un dispositif à imagerie de contact, lesdites particules (P) ou organismes étant immergés dans une goutte (G) de liquide, la détection étant réalisée au moyen d'une matrice (3) de cellules photo-sensibles ou photosites, caractérisé en ce que ledit procédé comporte au moins une première étape de détection réalisée pendant l'évaporation de la goutte de liquide. 2. Procédé de détection optique selon la revendication 1, 10 caractérisé en ce que ledit procédé comporte au moins une seconde étape de détection réalisée après l'évaporation de la goutte de liquide. 3. Procédé de détection optique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection est réalisée en périphérie de la goutte, à 15 l'interface (Z) séparant la goutte de sa partie évaporée. 4. Procédé de détection optique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit procédé comporte une succession d'étapes de détection réalisées à intervalles de temps réguliers pendant 20 l'évaporation de la goutte. 5. Procédé de détection optique selon la revendication 4, caractérisé en ce que chaque étape de détection permet de mesurer la répartition de particules ou d'organismes se trouvant dans un plan donné, 25 ledit plan étant à une distance de la matrice de photosites dépendant du temps d'évaporation, l'ensemble desdites répartitions de particules ou d'organismes obtenues permettant de reconstituer une répartition tridimensionnelle des particules ou des organismes dans la goutte initiale avant évaporation. 30 6. Procédé de détection optique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le liquide est de l'eau ou du « Tris », abréviation de trishydroxyméthylaminométhane. 7. Procédé de détection optique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lame de verre portant la goutte de liquide est fonctionnalisée.