Brevet FR2955333A1 — publié le 20110722

La présente invention se rapporte au domaine de la régénération tissulaire et plus particulièrement de l'implantation de matrice de collagène. Elle a plus précisément pour objet l'utilisation d'une matrice composée de collagène de type II et de glycosaminoglycanes qui servent de support à la culture de cellules avant d'être implantée pour la régénération d'un tissu cartilagineux. L'association de collagène de type II et de glycosaminoglycanes pour la constitution de matrices a déjà été décrite notamment dans les brevets WO99/19005 et EP-1254670. Le brevet WO99/19005 décrit un procédé de préparation d'une membrane 1 o multicouche pouvant être utilisée « in vivo » pour la reconstruction d'un tissu osseux ou cartilagineux. L'une des couches de cette membrane est constituée d'un mélange de collagène de type II et de glycosaminoglycanes qui sera lyophilisé, réticulé et stérilisé pour former une matrice poreuse. Cette couche matriciéllée comprend de 1 à 10% en masse de glycosaminoglycanes et donc 90 à 99% de collagène de type II. La 15 réticulation des matrices est ici réalisée par la chaleur. Le brevet EP-1254670 concerne une méthode de préparation de matrices poreuses réticulées, constituées de collagène II modifié, et destinées à être utilisées dans l'ingénierie ou la régénération du cartilage. Ces matrices sont préparées à partir de collagène II modifié avec ou sans glycosaminoglycanes selon des proportions 20 connues et sont réticulées chimiquement par un bain de N-hydroxysuccinimide (NHS) et d'éthyl-3 (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Ces deux brevets décrivent donc des procédés de préparation de matrices à partir de collagène de type II et de glycosaminoglycanes. Toutefois, l'utilisation de proportions particulières de ces composés associées aux étapes du procédé de 25 préparation selon l'invention, notamment au niveau de la réticulation chimique, n'avait encore jamais été décrite. On sait que les matrices de collagène connues ne conservent pas leurs caractéristiques physiques lors de la culture et de l'implantation, ce qui diminue grandement l'efficacité des implants auxquels elles servent de base. 30 La présente invention a pour but de procurer une utilisation des matrices de collagène ayant la capacité de conserver leur stabilité mécanique et dimensionnelle en culture, en augmentant ainsi leur aptitude à la manipulation lors de l'utilisation. Leur efficacité dans le domaine de la régénération tissulaire s'en trouve sensiblement accrue. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une matrice de collagène réticulée poreuse, principalement composée de collagène de type II et de glycosaminoglycanes, destinée à servir de support à la culture cellulaire « in vitro » de chondrocytes avant d'être implantée pour réparer les défauts localisés du cartilage. Elle est douée d'une stabilité mécanique et dimensionnelle en culture. Elle est caractérisée en ce qu'elle est composée avantageusement de 80 à 90% de collagène de 1 o type II et de 10 à 20% de glycosaminoglycanes puis réticulée chimiquement. Selon un mode d'exécution particulier, les glycosaminoglycanes sont choisis parmi l'acide chondroitine sulfurique, l'acide hyaluronique, le dermatan sulfate et le Keratan sulfate. Selon une caractéristique de l'invention, le matériau de collagène de type II est 15 dérivé de cartilage naturel provenant de tissus bovins, porcins ou aviaires. Selon une autre caractéristique, le cartilage naturel est dérivé du cartilage articulaire porcin. Selon une caractéristique la matrice présente une porosité comprise entre 50 et 150 µm. 20 Selon une autre caractéristique la matrice présente, après découpe dans son épaisseur et conservation de la tranche centrale, une porosité ouverte sur les deux faces. Selon une caractéristique le procédé de préparation de la matrice comprend une étape de mélange du collagène de type II et des glycosaminoglycanes, une étape de 25 lyophilisation, une étape de réticulation chimique et une étape de stérilisation. Selon une caractéristique de l'invention, la réticulation chimique de la composition formée de 80 à 90% de collagène II et de 5 à 45% glycosaminoglycanes est effectuée à l'aide de N-hydroxysuccinimide (NHS) et d'un carbodiimide soluble dans l'eau tel que l'éthyl-3 (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC). • 2955333 3 Selon une autre caractéristique, la lyophilisation est conduite après congélation du gel de collagène dans le lyophilisateur entre -20°C et -40°C et plus précisément à ù 35°C. Selon une caractéristique, la réticulation est réalisée grâce à un bain de 5 NHS/EDC 34mM en solution dans un tampon MES (acide 2-(Morpholino-éthane) sulfonique) à pH 5,5 à 60% et éthanol à 40% suivi d'un lavage par un bain de solution saline (NaCl) et par l'eau purifiée. Selon un mode particulier d'exécution de l'invention, la stérilisation est conduite par irradiation à une dose minimale de 25 kGy. 1 o La matrice selon l'invention s'applique à la culture de chondrocytes autologues. La matrice selon l'invention s'applique tout particulièrement à la conservation des chondrocytes dans ses pores par la taille et la stabilité de son maillage. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description donnée ci-après de modes de réalisation 15 particuliers. L'invention concerne spécifiquement l'utilisation de cette matrice destinée à être implantée chez un patient, atteint d'arthrose ou présentant des lésions d'origine traumatique ou une ostéochondrite dissécante après avoir servi de support à la culture de ses chondrocytes, pour réparer ses tissus cartilagineux lésés. 20 Afin de réaliser cette implantation, une biopsie de cartilage du patient doit être prélevée et les chondrocytes autologues doivent être extraits puis amplifiés. La matrice de collagène II doit ensuite être ensemencée et doit subir une phase de culture cellulaire. Le prélèvement provient d'une biopsie pratiquée au niveau du cartilage du 25 patient à traiter. L'amplification des chondrocytes extraits est alors réalisée ex-vivo pendant 25 à 30 jours. Cette étape vise à augmenter le nombre de chondrocytes autologues présents dans le prélèvement afin d'obtenir un plus grand nombre de cellules bien différenciées nécessaires lors de l'ensemencement. La matrice tridimensionnelle de collagène de type II est ensuite ensemencée par 30 une suspension de chondrocytes autologues amplifiés selon une technique dite du serpentin permettant un ensemencement homogène. 4 Enfin, la matrice de collagène II cellulaire subit une phase de culture pendant 7 à 14 jours avant d'être réimplantée au niveau de la lésion du cartilage du patient. La durée totale du processus est de 32 à 40 jours. Le procédé base de l'invention comporte cinq étapes permettant d'obtenir des matrices poreuses réticulées. Tout d'abord, le gel est préparé en mélangeant le collagène de type II et les glycosaminoglycanes. Ce mélange est ensuite lyophilisé pour obtenir des matrices poreuses dont la porosité est comprise entre 50 et 150 µm. Après cela, les matrices sont découpées dans leur épaisseur afin de présenter une porosité ouverte sur les deux faces. Elles sont ensuite réticulées chimiquement par bain z o de NHS/EDC dans un tampon MES et éthanol. Enfin, elles sont lyophilisées, découpées, conditionnées et stérilisées afin d'obtenir des matrices stériles de tailles et de formes spécifiées. Selon un mode de réalisation particulier, le gel est préparé avec 77% de 15 collagène II et 23% de glycosaminoglycanes. De préférence, le glycosaminoglycane est l'acide chondroitine sulfurique. Le collagène est repris en solution à 1,5% et l'acide chondroitine sulfurique est repris à 3,0 %. L'ajout de l'acide chondroitine sulfurique au collagène se fait sous agitation et le mélange est ensuite réparti dans un moule. Le gel obtenu est lyophilisé afin d'obtenir des matrices ayant une porosité de 50 20 à 150 µm. Cette lyophilisation est réalisée après congélation du gel à -30°C environ dans le lyophilisateur. Les matrices obtenues sont refendues dans leur épaisseur avec une lame afin d'obtenir trois tranches à savoir une tranche inférieure, une tranche centrale et une tranche supérieure. Seule la tranche centrale est conservée ce qui permet d'obtenir une 25 porosité ouverte de 50 à 150 µm sur les deux faces des matrices. Ces matrices sont ensuite réticulées chimiquement par un bain de NHS/EDC 34 mM en solution dans un tampon MES pH 5,5 à 60% et éthanol à 40% puis lavées par bain de solution saline (NaCl) et eau purifiée. Enfin, les matrices réticulées sont réparties dans des plateaux et lyophilisées. 30 Elles sont ensuite découpées à l'emporte pièces et conditionnées en double sachet puis stérilisées par irradiation (3 à 25kGy. Le collagène de type II utilisé dans le procédé de préparation de la matrice est obtenu à partir de collagène articulaire porcin. Ce collagène II peut par exemple être extrait des rotules de porcs par digestion enzymatique du cartilage par la pepsine. Pour permettre l'utilisation de la matrice dans le domaine médical, il faut garantir la sécurité 5 microbiologique du collagène II qui la compose. Ce collagène II doit donc être prélevé dans des abattoirs ne travaillant qu'avec des porcs pour éliminer tout risque de contamination croisée inter espèce et sur des animaux ayant fait l'objet d'un contrôle vétérinaire assurant qu'ils sont propres à la consommation humaine. Le collagène II extrait doit ensuite subir des traitements efficaces pour inactiver les virus 1 o potentiellement présents dans les tissus et les agents transmissibles non conventionnels tels que les prions, en particulier l'agent responsable de l'ESB (Encéphalopathie Spongiforme Bovine) La co-précipitation, c'est-à-dire la réalisation du gel de collagène II et de glycosaminoglycanes avant la lyophilisation, permet d'obtenir des taux de 15 glycosaminoglycanes non extractibles dans la matrice de 9 à 20% ce qui est nettement supérieur aux taux obtenus lorsque le greffage est réalisé sur une matrice de collagène II déjà lyophilisée. La réticulation de la matrice est indispensable pour maintenir les caractéristiques mécaniques de ladite matrice lors des étapes de culture cellulaire lui 20 permettant ainsi de conserver sa bonne tenue et de ne pas se déliter une fois réhydratée. La réticulation chimique avec le NHS/EDC permet également d'obtenir une meilleure stabilité thermique de la matrice soit par exemple une stabilité thermique de 87,4°C avant stérilisation et de 71,5°C après stérilisation ce qui est supérieur aux valeurs connues. 25 Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois limiter sa portée. Exemple I : Etude de tolérance et d'efficacité. On a effectué en premier lieu un essai d'efficacité et de bonne tolérance en 30 utilisant une matrice poreuse préalablement lyophilisée, produite selon le procédé décrit précédemment sur un modèle animal utilisant la brebis présentant des lésions 6 induites par l'expérimentateur. Les résultats obtenus ont montré que l'implantation d'une telle matrice cellularisée dans laquelle des chondrocytes autologues sont ensemencés, amène une amélioration significative de la réparation du cartilage. Le tissu cartilagineux néoformé montre un caractère typique hyalin attesté par une coloration intense à la Safranine O. En outre, les cellules chondrocytaires présentent une organisation en colonnes. Exemple II : L'objectif d'une seconde étude a été d'évaluer la tolérance et l'efficacité d'une 1 o matrice telle que décrite, ensemencée avec des chondrocytes autologues associée à une membrane suturable au cours de la réparation du défaut du cartilage. Le but d'une telle association utilisant une membrane suturable était d'éviter le détachement de l'implant. On a créé deux lésions dans le cartilage à l'intérieur d'une même articulation dans le genou de la brebis (un site trochléaire et un site condylaire). 15 Le groupe témoin n'a pas reçu d'implantation de matrice cellularisée et un autre groupe d'animaux a constitué le groupe d'essai dans lequel les animaux ont été implantés par la matrice cellularisée et par la membrane suturable. Les animaux ont été euthanasiés au bout de six mois et une évaluation locale macroscopique de l'articulation n'a pas mis en évidence de particularités anormales 20 sauf chez un seul animal. On n'a pas constaté de situation anormale locale macroscopique qui pourrait résulter du biomatériau cellularisé implanté. En ce qui concerne la réparation du cartilage le résultat des évaluations macroscopiques et microscopiques a suivi la même évolution et a montré une réparation du cartilage à la fois quantitative et qualitative. 25 On a pu observer dans le groupe d'essai qu'une meilleure réparation du cartilage pouvait être constatée avec un score macroscopique maximum et le meilleur score microscopique, avec un cartilage ayant subi une réparation qui était ainsi parfaitement intégrée et qui présentait les caractéristiques typiques d'un cartilage hyalin (c'est-à-dire une coloration par la Safranine O) et surtout un aspect cellulaire chondrocytaire ainsi 30 qu'une organisation en colonnes, pratiquement complet de la zone radiale. 7 Résultats : L'interprétation globale de ces résultats a montré que la sécurité générale de l'élément expérimental et la tolérance locale sont bonnes. Les résultats d'efficacité ont indiqué qu'il y a un effet positif dans le groupe d'essai. Ces résultats montrent que quand la matrice est implantée, les scores globaux macroscopiques et microscopiques sont meilleurs que chez les animaux témoins. A l'issue de cette étude la membrane précédemment implantée et les points de suture n'étaient plus visibles chez aucun des animaux ayant subi une telle implantation. Il est encore possible d'envisager une évolution de la matrice dans les lésions 10 ostéochondrales en prévoyant une couche intermédiaire à base de sels minéraux contribuant à l'ossification de la partie sous chondrale. REVENDICATIONS1. Utilisation d'une matrice de collagène réticulée poreuse, principalement composée de collagène de type II et de glycosaminoglycanes comme support à la culture cellulaire in vitro de chondrocytes destinée à être implantée pour réparer les défauts localisés du cartilage, composée de 80 à 90% de collagène de type II et de 10 à 20% de glycosaminoglycanes et réticulée chimiquement. 2. Utilisation selon la revendication 1 d'une matrice de collagène réticulée 10 poreuse caractérisée en ce que le glycosaminoglycane est l'acide chondroitine sulfurique, l'acide hyaluronique, le dermatan sulfate ou le keratane sulfate. 3. Utilisation d'une matrice de collagène réticulée poreuse selon la revendication 1, caractérisée en ce que le collagène de type II est dérivé d'un cartilage naturel. 15 4. Utilisation d'une matrice de collagène réticulée poreuse selon la revendication 3, caractérisée en ce que le cartilage naturel est dérivé du cartilage articulaire porcin, bovin ou aviaire. 20 5. Utilisation d'une matrice de collagène réticulée poreuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la matrice présente une porosité comprise entre 50 et 150µm. 6. Utilisation d'une matrice de collagène réticulée poreuse selon l'une 25 quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la matrice présente, après découpe dans son épaisseur et conservation de la tranche centrale, une porosité ouverte sur les deux faces. 7. Utilisation de la matrice selon l'une quelconque des revendications 30 précédentes destinée à la culture de chondrocytes autologues. 8. Utilisation de la matrice de collagène réticulée poreuse selon l'une quelconque des revendications précédentes comme agent de conservation des chondrocytes dans ses pores par la taille et la stabilité de son maillage. 9. Utilisation de la matrice de collagène réticulée poreuse selon l'une des revendications précédentes comme agent assurant la réparation du cartilage.