Brevet FR2960877A1 — publié le 20111209

FRACTION DE PROTEINES ET PEPTIDES ISSUS DU BLANC D'OEUF ET PROTEINE ISSUE DU BLANC D'OEUF ET LEUR UTILISATION COMME AGENT ANTI-LISTERIA DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne une fraction de protéines et/ou peptides issus du blanc d'oeuf et présentant une activité anti Listeria monocytogenes. L'invention concerne également une molécule spécifique, issue du blanc d'oeuf, à savoir la protéine OVAX, pour son action anti-microbienne et de manière plus particulière pour son action ciblée contre Listeria monocytogenes. L'invention trouve des applications notamment dans le domaine de l'agro-alimentaire, par exemple lors de l'élaboration de produits alimentaires de consommation courante, tels que les charcuteries et les fromages, afin d'éliminer toute trace de Listeria monocytogenes dans ces produits. L'invention trouve également des applications dans le domaine pharmaceutique, par exemple pour la préparation de médicaments destinés à traiter et/ou prévenir les affections liées à Listeria monocytogenes, telles que la Listériose. ETAT DE LA TECHNIQUE ET PROBLEMES RENCONTRES Listeria monocytogenes est une bactérie présente dans le sol, la végétation, l'eau, les eaux usées, les produits d'ensilage et les matières fécales humaines et animales. Certains animaux peuvent être porteurs de la bactérie à leur insu, sans être malades. Ces porteurs sains peuvent être à l'origine de la contamination d'aliments, tels que le lait et la viande, et les produits dérivés. Notamment, on retrouve de manière récurrente cette bactérie dans les charcuteries et les fromages au lait cru. Listeria monocytogenes peut alors être à l'origine d'une affection appelée Listériose, apparentée à une intoxication alimentaire. La Listériose peut avoir des conséquences graves, notamment chez les femmes enceintes et les personnes âgées ou dont le système immunitaire est affaibli. Jusqu'à présent, hormis par des règles d'hygiène strictes, et une cuisson à coeur des aliments et denrées susceptibles d'être porteuses du germe, il n'est pas possible de garantir l'absence de Listeria monocytogenes dans un aliment. On sait que Listeria monocytogenes est sensible à certains antibiotiques, et notamment à l'ampicilline et l'amoxicilline. Dans la mesure où les personnes devant recevoir un traitement contre Listériose en cas d'affection sont des personnes fragiles, il est connu de les traiter via un pool d'antibiotiques, et en particulier la pénicilline, la streptomycine et les sulfamides. Ce traitement peut être prolongé avec des lactamines. Malgré ce traitement lourd, et souvent long, les résultats restent aléatoires et dépendent surtout de l'état du système immunitaire du patient. Par ailleurs, dans la mesure où la résistance, voir la multi résistance, des bactéries aux antibiotiques est de plus en plus fréquente, il est important de trouver une alternative à ce traitement, afin de palier à une telle éventualité et/ou éviter qu'elle ne s'installe pour Listeria monocytogenes. EXPOSE DE L'INVENTION Dans l'invention, on cherche à résoudre au moins partiellement au moins un des problèmes exposés ci-dessus, en fournissant un nouveau composé susceptible d'agir contre Listeria monocytogenes. Pour cela, l'invention propose d'utiliser une molécule ayant une activité antimicrobienne spécifiquement dirigée contre Listeria monocytogenes. La molécule selon l'invention est issue d'une protéine présente dans l'oeuf, notamment de poule, et plus particulièrement dans le blanc d'oeuf, connu pour comporter de nombreuses protéines et des peptides ayant des effets contre les bactéries, et notamment des enzymes, tel que le lysozyme. La protéine d'intérêt, appelée par la suite OVAX, pour « l'ovalbumin-related protein X » a également été identifiée, dans des quantités moindres, dans le jaune d'oeuf, la coquille d'oeuf, la membrane vitelline etc. La séquence d'acides aminés correspondante de l'OVAX a été identifiée, de sorte qu'il est possible d'utiliser la protéine native, c'est-à-dire isolée à partir de l'oeuf de poule, mais également la protéine de recombinante. L'invention a également permis de démontrer qu'une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf de poule et aptes à lier l'héparine-sépharose, présente une activité anti Listeria monocytogenes. L'invention a permis d'identifier les peptides et protéines de cette fraction, au nombre de douze, et qui comporte notamment de dOVAX qui représente avantageusement au moins 50% en proportion de cette fraction. De manière surprenante, il a été observé que l'activité anti Listeria monocytogenes de la protéine OVAX et de la fraction selon l'invention, est conservée après digestion par certaines enzymes digestives et notamment par la trypsine ou la chymotrypsine. Or, la trypsine est une enzyme digestive présente dans le suc gastrique chez l'homme, tandis que la chymotrypsine est une enzyme digestive présente dans le pancréas des bovins. Toutes deux participent à la digestion des protéines contenues dans l'alimentation ingérée par l'animal, humain ou non humain. De tels résultats permettent donc d'envisager chez l'animal, humain ou non humain l'utilisation de cette molécule d'OVAX et/ou de la fraction dans une composition alimentaire, thérapeutique et/ou prophylactique devant être ingérée, dans la mesure où l'activité anti- Listeria monocytogenes est conservée après action de la trypsine et/ou de la chymotrypsine. L'invention a donc pour objet une molécule de séquence d'acides aminés SEQ ID N°1, pour son activité anti-microbienne, et plus particulièrement anti Listeria monocytogenes. La séquence SEQ ID N°1 correspond à la séquence d'acides aminés de la protéine OVAX. En effet, Les inventeurs ont découvert que le regroupement séquentiel et/ou conformationnel d'acides aminés de charge positive de la molécule selon SEQ ID N°1 entraîne une affinité particulière de ladite molécule pour des surfaces chargées négativement, et notamment pour le lipopolysaccharide de certaines bactéries Gram négatif, et le peptidoglycane de certaines bactéries Gram positif (dû à la présence de l'acide téichoïque). La liaison entre au moins une de ces séquences chargées positivement et la surface d'un microorganisme chargée négativement entraîne une déstabilisation de la paroi dudit microorganisme, conduisant à sa lyse. La molécule selon l'invention est donc apte à inhiber la croissance de tels microorganismes. Ainsi, l'invention vise tout particulièrement la molécule de séquence SEQ ID N°1 pour son action anti- Listéria monocytogenes, comme cela est plus spécifiquement exposé ci-dessous. L'invention concerne également une composition comportant une molécule de séquence SEQ ID N°1, en tant que principe actif anti-microbien et notamment comme principe actif anti- Listéria monocytogenes. La composition selon l'invention peut notamment être destinée à la fabrication d'un médicament anti- Listéria monocytogenes. Une telle composition peut notamment être une solution destinée à être ingérée, et comportant les excipients requis. Autrement, la composition peut être une poudre destinée à être mise en suspension ultérieurement, ou à être conditionnée telle que, sous forme de gélules. La composition selon l'invention peut également être utilisée pour la fabrication d'aliments, destinés à l'alimentation animale, humaine ou non humaine, en tant qu'additif alimentaire anti- Listéria monocytogenes. Avantageusement, la composition est alors utilisée lors du procédé de fabrication du produit alimentaire, ladite composition étant ajoutée dans la préparation destinée à former le produit alimentaire, au court de son élaboration. Notamment, la composition peut être utilisée comme additif alimentaire lors de la préparation de charcuteries telles que les pâtés, rillettes, saucisses etc. La composition peut également être ajoutée à du lait destiné à être utilisé pour fabriquer du fromage. Préférentiellement, la composition est ajoutée à la préparation après toute étape de cuisson et/ou toute étape lors de laquelle ladite préparation est soumise à des températures supérieures à 60°C. Selon l'invention, la concentration en la molécule de séquence SEQ ID N°1 dans la composition peut être comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement comprise entre 20 pg/mL et 100 pg/mL. De manière encore plus préférée, la concentration en la molécule de séquence SEQ ID N°1 dans la composition est comprise entre 25 pg/mL et 60 pg/mL. L'invention concerne également une fraction de peptides et/ou protéines, issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, pour son action anti- Listéria monocytogenes. Par issus du blanc d'oeuf, on entend que les peptides et protéines présents dans la fraction selon l'invention se trouvent tous dans le blanc d'oeuf, et peuvent être obtenus à partir du blanc d'oeuf. Bien entendu, ces peptides et protéines pourront avoir été obtenus autrement que par purification à partir du blanc d'oeuf, et notamment par synthèse chimique. Par action anti Listeria monocytogenes, ou action dirigée contre Listeria monocytogenes, on entend que cette fraction est apte à inhiber la croissance de cette bactérie. Toutes les molécules de ladite fraction sont aptes à lier l'héparine. Ainsi, la fraction selon l'invention est susceptible de comporter tout ou partie des peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf pouvant se lier à l'héparine. Cette fraction peut comporter quelques molécules contaminantes d'ovalbumine, protéine majeure du blanc d'oeuf, qui représente plus de 50% en proportion des protéines totales présentes dans le blanc d'oeuf, et qui elle ne présente pas d'affinité pour l'héparine. Ces molécules peptidiques et protéiques ont été isolées directement à partir de blanc d'oeuf de poule, par chromatographie d'affinité utilisant des billes d'héparine-sépharose, puis identifiées par spectométrie de masse. La fraction selon l'invention comporte ainsi au moins une des molécules parmi les peptides et protéines ci-dessous : - l'OVAX, de poids moléculaire d'environ 45 kDa, et qui présente 1 site consensus HBS liant l'héparine ; - une protéine similaire à la protéine MGC82112, de poids moléculaire d'environ 170 kDa et présentant 2 sites consensus HBS liant l'héparine ; - l'Avidine, de poids moléculaire d'environ 17 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ; - le Lysozyme C, de poids moléculaire d'environ 14 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente également un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ; - la beta-defensine 11, de poids moléculaire d'environ 12 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse également penser qu'elle présente un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ; - la protéine TENP de poids moléculaire d'environ 47 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente elle aussi, un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ; - la cyclophiline B (peptidylprolyl isomerase B) de poids moléculaire d'environ 22 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine ; - la protéine Vmo-I (pour « Chain A, crystal Structure Of vitelline membrane Outer Layer Protein I ») de poids moléculaire d'environ 18 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine ; - le précurseur de l'ovotransferrine (Conalbumine) (Allergen Gal d 3) (Gal d III) (serum transferrin) de poids moléculaire d'environ 78 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine ; - la Mucine 5, sous type B trachéobronchiale, de poids moléculaire d'environ 233 kDa et présentant 4 sites consensus HBS liant l'héparine ; - la Clusterine, de poids moléculaire d'environ 51 kDa et présentant 2 sites consensus HBS liant l'héparine ; et - la Pléiotrophine (facteur de croissance 8 liant l'héparine) de poids moléculaire d'environ 15 kDa et présentant 3 sites consensus HBS liant l'héparine. Par site de liaison conformationnel à l'héparine, on entend une exposition spécifique d'acides aminés chargés positivement, lorsque la molécule est conformée, et formant un site capable de se lier à l'héparine. La fraction selon l'invention comporte au moins une molécule de séquence SEQ ID N°1 qui correspond à la séquence de IOVAX telle qu'isolée à partir du blanc d'oeuf. La fraction peut autrement, ou également comporter la molécule d'OVAX de séquence SEQ ID N°2, qui correspond à la séquence connue qui a été prédite à partir de l'analyse bioinformatique du génome de la poule. La fraction selon l'invention peut avantageusement comporter l'ensemble des peptides et protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, tels que listés ci-dessus. Dans ce cas, il est intéressant de prévoir que la molécule de séquence SEQ ID N°1 et/ou de séquence SEQ ID N°2 représente au moins 50% en proportion des molécules de la fraction. Une telle fraction peut alors être obtenue directement par passage du blanc d'oeuf sur chromatographie d'affinité de type héparine-sépharose, et utilisée telle que. En effet, la fraction issue de cette chromatographie comporte, de fait, plus de 50% d'OVAX (Fig. 1, piste 5 -HB-EW, tâche autour de 45-50 kDa). C'est la quantification des pixels de la bande de 50 kDa du gel rapportée au nombre de pixel total du puits qui a permis d'estimer la quantité de la molécule d'OVAX dans cette fraction à au moins 50% en proportion. On retrouve également de l'OVAX dans les autres bandes, mais dOVAX étant alors avec d'autres molécules, on ne peut pas quantifier la part due à dOVAX Ainsi, l'utilisation de cette fraction en agro-alimentaire ou dans le domaine médicale, peut être directe, puisque l'oeuf est une denrée alimentaire communément utilisée par l'homme, et dont l'innocuité, hormis pour les personnes allergiques, est reconnue. Bien entendu, tout ou partie des molécules de la fraction selon l'invention peut également être obtenue par synthèse chimique, notamment à partir de la séquence peptidique correspondante, puisque le génome de la poule a déjà été entièrement séquencé. L'invention a également pour objet une composition comportant la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention en tant que principe actif anti- Listéria monocytogenes. Autrement dit, la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention peut être utilisée en tant que principe actif anti-Listéria monocytogenes, pour la réalisation d'une composition médicinale, alimentaire ou autre. Selon l'invention, la concentration totale en peptides et/ou protéines dans la composition peut être comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement comprise entre 20 pg/mL et 100 pg/mL. De manière encore plus préférée, la concentration en ces molécules dans la composition est comprise entre 25 pg/mL et 60 pg/mL. Par concentration totale, on entend la concentration cumulée de chacun des peptides et/ou protéines selon l'invention présents dans la fraction utilisée pour réaliser la composition. La composition selon l'invention peut notamment être destinée à la fabrication d'un médicament anti- Listéria monocytogenes. Une telle composition peut être une solution destinée à être ingérée, et comportant les excipients requis. Autrement, la composition peut être une poudre, et notamment une poudre de blanc d'oeuf éventuellement enrichie en la fraction selon l'invention, pour être mis en suspension ultérieurement, ou être conditionnée sous forme de gélules. La composition selon l'invention peut également être utilisée pour la fabrication d'aliments, destinés à l'alimentation animale, humaine ou non humaine, en tant qu'additif alimentaire anti- Listéria monocytogenes. Avantageusement, la composition est alors utilisée lors du procédé de fabrication du produit alimentaire, ladite composition étant ajoutée dans la préparation destinée à former le produit alimentaire, au court de son élaboration. Notamment, la composition peut être utilisée comme additif alimentaire lors de la préparation de charcuteries telles que les pâtés, rillettes, saucisses etc. La composition peut également être ajoutée à du lait destiné à être utilisé pour fabriquer du fromage. Préférentiellement, la composition est ajoutée à la préparation après toute étape de cuisson et/ou toute étape lors de laquelle ladite préparation est soumise à des températures supérieures à 60°C. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 est une photo d'un gel SDS-PAGE montrant la migration des protéines du blanc d'oeuf de poule ; ainsi, on peut voir les protéines du blanc d'oeuf après digestion à la trypsine (colonne T), les protéines du blanc d'oeuf après digestion à la chymotrypsine (colonne CT), les protéines du blanc d'oeuf dans leur ensemble (colonne EW), les protéines de la fraction du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine (colonne HUB-EW), les protéines de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine (colonne HB-EW), les protéines de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine après digestion à la trypsine (colonne HB-EW-T), et les protéines de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine après digestion à la chymotrypsine (colonne HB-EW-CT). La figure 2 est une photo d'un gel SDS-PAGE des différentes étapes de purification de l'OVAX ; la première colonne (1) représente le blanc d'oeuf ; la deuxième colonne (2) la fraction éluée de l'héparine-sépharose ; la troisième colonne (3), la fraction non-fixée de la biotine-sépharose ; et la quatrième colonne (4) le pic correspondant à l'OVAX après tamisage moléculaire. La figure 3 est un alignement de séquences d'acides aminés entre la séquence de l'OVAX issue de la base de données NCBI (OVAXdb, XP 418984.2 GI :118086485) et la séquence prédite par le logiciel Genemark de l'Institut de technologie de Georgie (OVAXgm) à partir de la protéine OVAX purifiée selon l'invention. La figure 4 comporte deux graphiques (Figures 4A et 4B) montrant respectivement l'activité antimicrobienne de l'Ovalbumine et de l'OVAX vis-à-vis de Listeria monocytogenes. La croissance de Listéria monocytogenes a été suivie à 600 nm pendant 20 heures sans Ovalbumine/OVAX ou avec des concentrations croissantes d'Ovalbumine/OVAX. La figure 5 comporte quatre graphiques (Figures 5A à 5E) montrant l'activité anti Listeria monocytogenes de différents échantillons de blanc d'oeuf, à différentes concentrations. Ainsi, la figure 5A montre l'activité anti Listeria monocytogenes du blanc d'oeuf pur ; la figure 5B montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine ; la figure 5C montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine ; la figure 5D montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine, après digestion par la trypsine ; la figure 5E montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine, après digestion par la chymotrypsine. EXPERIMENTATIONS 1- MATERIEL Collecte et préparation du blanc d'oeuf. Les blancs d'oeufs ont été collectés à partir de plusieurs oeufs provenant de poules pondeuses (Isa-Hendrix, St Brieuc, France) et dilués au '/2 dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. L'échantillon a été homogénéisé délicatement et centrifugé à 14 000 g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant obtenu a été congelé jusqu'à utilisation ultérieure. Bien entendu, il est autrement possible de procéder directement aux étapes de purification, sans congélation préalable. 2- METHODES 2.1- Purification de I'OVAX. Une chromatographie de type héparine-sépharose a été effectuée en utilisant la technique en « batch » suivant les instructions du fournisseur (Marque GE-Healthcare, distribué par Fischer Scientific, W7346E). On équilibre quatre fois 0,6 g de billes d'héparine-sépharose dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4 dans des tubes Falcon de 50 mL On ajoute dans chaque tube 15 mL de blanc d'oeuf préparé comme décrit ci-dessus et 15 mL de Tris-HCI 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. On incube, sous agitation douce, toute une nuit à 4°C. A l'issue de l'incubation, les protéines sans affinité pour l'héparinesépharose sont éliminées par lavages successifs en tampon Tris-HCI 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 et centrifugation pendant 5 minutes à 2500 g à 4°C. L'efficacité des lavages est vérifiée en mesurant l'absorbance à 280 nm, une absorbance de 0 attestant de l'élimination totale de ces protéines. Les billes sont alors chargées sur deux colonnes de polypropylène de 5 mL (Qiagen, courtaboeuf, France, 34964). L'élution des protéines affines est réalisée en tampon Tris-HCI 50 mM, NaCl 1M, pH 7,4 par pas de 1 mL sur les deux colonnes en parallèle (l'expérience a montré que le rendement était meilleur en chargeant sur deux colonnes plutôt qu'une) et est suivie en mesurant l'absorbance à 280 nm. Les fractions d'élution les plus concentrées sont regroupées et dialysées pendant 24 heures contre du tampon Phosphate de Na 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7.4 (PBS) dans des membranes de dialyse (exclusion de 3500 Da) (Marque Spectrum, distribuées par Fischer Scientific, 132720). A l'issue de la dialyse, l'échantillon est centrifugé à 10000 g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est alors chargé sur une colonne de polypropylène de 1 mL, dans laquelle 1,5 mL de billes d'agarose couplées à la biotine (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France, B0519) ont été au préalable équilibrées dans du tampon PBS. Le non-fixé de la colonne est récupéré et concentré sur cellule de concentration d'exclusion 3500 Da (Millipore, UFC900324). Cette étape permet d'éliminer l'avidine de l'échantillon, cette dernière présentant une forte affinité pour la biotine. L'échantillon concentré est alors injecté sur une chromatographie d'exclusion TSK-gel filtration G3000SW (Tosoh Bioscience, Hampton, UK) préquilibréé en tampon PBS. Le pic majeur correspondant à l'OVAX est collecté et concentré sur cellule de concentration d'exclusion 3500 Da (Millipore, UFC900324). Les différentes étapes de purification ont été analysées par gel SDSPAGE 4-20% en conditions non-réductrices après coloration au bleu de Coomassie afin de vérifier la pureté de la protéine. 2.2- Identification de I'OVAX par spectrométrie de masse. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE en conditions réductrices et colorées au bleu de Coomassie. La bande majeure de 45 kDa a été extraite du gel et rincée avec de l'eau et de l'acétonitrile. Les protéines ont été réduites avec du dithiothreithiol, alkylées avec de l'iodoacétamide et digérées par la trypsine (12.5 ng/pL) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) une nuit à 37°C dans du tampon NH4HCO3 25 mM, selon le protocole décrit par Shevchenko et al. Les extraits peptidiques ont ensuite été séchés. Plusieurs techniques de spectrométrie de masse ont été utilisées pour identifier l'OVAX et obtenir une couverture de séquence maximale : - la cartographie MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight) et - la nanochromatographie liquide capillaire monodimensionnelle couplée à de la spectrométrie de masse en tandem (NanoLC-MS/MS). L'identification par l'approche protéomique dite « bottom up » a été réalisée sur un extrait peptidique en solution dans 8 pL d'un mélange d'acide formique 0.1 %/ acétonitrile 2%. L'analyse NanoLC-MS/MS a été conduite en utilisant un système CapLC couplé à un spectromètre de masse hybride de type « Quadrupole time-of-flight » (Q-TOF Ultima Global, Waters, Manchester Grande-Bretagne) équipé d'une source d'ion en Z-spray. L'appareil est calibré à l'aide d'une solution de GIuF à 500 fmol/pL (50% d'une solution d'acide formique 1% / 50 acétonitrile, v/v). Les échantillons sont dessalés et concentrés en ligne par une précolonne (Monolithic trap colonne, 200 pm i.d X 5mm (PS-DVB), Dionex, ref 163972). La séparation des peptides est réalisée sur une colonne capillaire phase réverse (Acclaim PepMap 100 C18, 5pm, 75 pm I.D., 25 cm de longueur, Dionex) avec un débit de 200 nL/min. Le profil du gradient est le suivant : Equilibration des colonnes avec 95% de solvant A (0.1% acide formique / 2% acétonitrile / 98% H2O, v/v) et 5% de solvant B (0.1% acide formique / 20% H2O/ 80% acétonitrile, v/v), Gradient de 5 à 55% de B en 80 min ; Palier à 95% de B pendant 10 min. L'acquisition des données se fait de façon automatique entre les modes MS et MS/MS (fragmentation) : un MS survey scan est suivi par trois MS/MS scans sur les trois pics détectés les plus intenses. Seuls les ions bi et trichargés sont sélectionnés comme précurseurs dans une gamme de masse m/z entre 400 et 1300. L'énergie de collision est sélectionnée en fonction de la masse et la charge de l'ion. Les données brutes sont traitées par le logiciel ProteinLynx Global Server V 2.2.5 (PLGS) pour créer des fichiers .pkl comportant l'ensemble des précurseurs sélectionnés à la fragmentation ainsi que la liste des ions fragments associés. L'échantillon est soniqué quelques minutes avant le dépôt sur la cible. 1 pL d'échantillon a été déposé sur la cible avec 1 pL de matrice selon la méthode de dépôt dite de la goutte séchée. La matrice utilisée est une solution de CHCA (a-cyano-4-hydroxycinnamic acid) à 5 mg/mL dans 50% éthanol / 50% acétonitrile/TFA 0.1%110 mM de 18-C-6 crown éther. L'appareil MALDI-TOF a été calibré en externe à l'aide de peptides issus de la digestion tryptique de la BSA (Bovine Serum Albumin) à 300fmol/pL. Les spectres MALDI-TOF sont obtenus à l'aide d'un spectromètre de masse MALDI L/R P/N (Waters, Manchester, UK). Les analyses ont été réalisées : en mode positif, en mode réflectron, avec une tension d'accélération de 15 KV, pulse Voltage : 2226, avec une gamme de masse (m/z) de 500 Da à 5000 Da. Le traitement informatique des spectres (substract, smooth, centroid) se fait à l'aide du logiciel MassLynx V4.0 (Waters). Toutes les masses ont été relevées manuellement pour toutes les cartographies. Les données expérimentales issues de l'analyse MALDI et NanoLC- MS/MS ont été confrontées à une banque de données non redondantes (NCBInr 20071102) et à l'aide du logiciel MASCOT (Matrix Science UK, htt atrixscience.com). La spécificité enzymatique a été établie comme étant la trypsine, en incluant deux clivages manquants. Les modifications variables suivantes ont été sélectionnées : la carbamidomethylcysteine et l'oxidation de la méthionine. La recherche a été effectuée dans toutes les taxonomies. La précision de masse a été fixée à ± 0.3 Da. Les protéines candidates ont été validées quand les scores individuels des ions présentaient un niveau de significativité supérieur à p 2.3- Séquençage d'Edman 18 pg d'OVAX a été digéré par la trypsine (1,2 pM, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier) ou la chymotrypsine (1,2 pM, Sigma-Aldrich, Saint- Quentin Fallavier) en présence d'héparine (10 pg/mL, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) pendant 1 heure à 37°C. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE en conditions réductrices et transférées sur membrane de polyvinylidène. La bande majeure (40 kDa) a été excisée du gel et analysée par 30 séquençage d'Edman. La séquence amino-terminale de la protéine a été déterminée par dégradation automatique d'Edman en utilisant le séquenceur LF 3000 (Beckman/Porton) équipé d'un système HPLC « on-line Gold HPLC system, Beckman Coulter) pour la détection des dérivés acides-aminés- 35 Phénylthiohydantoine. 2.4- Prédiction de la séquence protéique de l'OVAX. La prédiction de la séquence de l'OVAX a été réalisée à partir de la séquence du gène disponible sur le site « Ensembl » (http://www.ensembl.orq/Gallus gallus/Info/Index, ENSGALG00000019551) en utilisant le logiciel Genemark (Georgia Institute of Technology (http://exon.biology.gatech.edu/).. 2.5- Analyse de l'activité antimicrobienne de l'OVAX Les échantillon de blanc d'oeuf (EW), de fractions ne liant pas l'héparine (HUB-EW), et de fractions liant l'héparine (HB-EW) ont été dilués dans du tampon Tris 50 mM, NaCl 150 mM à pH 7,4, afin d'obtenir des échantillons contenant 1,8 mg/mL de protéines. La concentration en protéines a été déterminée en utilisant le test Protein DC (Biorad, Saint- Quentin, France) avec du sérum albumine bovin (Interchim, Montluçon, France) comme contrôle. Les échantillons HB-EW (0,9 mg/mL) ont été digérés soit par de la trypsine à 5,5 pM (HB-EW-T) soit par de la chymotrypsine à 1,2 pM (HB-EW-CT) dans du tampon Tris-HCL 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 pendant 1 heure à 37°C. La réaction a été stoppée par refroidissement et les produits de la digestion (5 pL pour les échantillons de trypsine, chymotrypsine, EW, HUB-EW, HB-EW, ou 10 pL pour les échantillons de HB-EW-T et HB-EW-CT) ont été analysés par SDS-PAGE 4-20% (figure 1). L'activité anti-microbienne de ces différents échantillons a été ensuite analysée. Les souches bactériennes Listeria monocytogenes EGD ont été conservées après congélation dans l'azote liquide dans le milieu de culture Brain Heart Infusion (Oxoid, Hampshire, England) contenant 15% (v/v) de glycérol. Les souches bactériennes ont été mises en culture une nuit à 37°C dans le milieu de culture Tryptone Soya (TSB, Oxoid), sans agitation. On a ensuite dilué cette préculture et on l'a utilisée pour inoculer les milieux de culture (TSB) de manière à obtenir une densité bactérienne initiale d'environ 1.107 CFU.mL-1. La culture a alors été incubée à 37°C sous agitation afin d'obtenir des bactéries en phase mi-exponentielle (environ 1. 10$ CFU.mL-1) correspondant à une densité optique à 600 nm (OD60onm) d'approximativement 0.15 après 5 heures d'incubation. Dans une première expérimentation, on a suivi la croissance bactérienne en présence de différentes concentrations d'Ovalbumine ou d'OVAX (0-400pg/mL) à l'aide du lecteur de plaque Bioscreen C couplé au logiciel Biolink (Oy Growth Curves Ab Ltd.) dans le milieu de culture TSB. La croissance bactérienne, la stérilité des milieux de culture et de l'échantillon d'OVAX ou d'Ovalbumine ont été vérifiées sur chaque plaque. La croissance bactérienne a été enregistrée pendant 24 heures en continu à 37°C, une lecture étant effectuée toutes les 45 minutes (figure 4). Dans une seconde expérimentation, on a suivi la croissance bactérienne en présence de différentes fractions de blanc d'oeuf à l'aide du lecteur de plaque Bioscreen C couplé au logiciel Biolink (Oy Growth Curves Ab Ltd.) dans le milieu de culture TSB. La croissance bactérienne, la stérilité des milieux de culture des fractions de blanc d'oeuf, de la trypsine et de la chymotrypsine ont été vérifiées sur chaque plaque. Chaque fraction de blanc d'oeuf (EW, HUB-EW, HB-EW, HB-EW digérée par trypsines ou chymotrypsine) a été ajoutée à différentes concentrations. Pour les tests portant sur la fraction liant l'héparine après digestion par la trypsine, des concentrations croissantes de trypsine ont été ajoutées, après deux dilutions successives de la fraction de blanc d'oeuf liant l'héparine (HB-EW) pour obtenir une concentration de 0,9 pg/mL de HB-EW et 5,5 pM de trypsine. La croissance bactérienne a été enregistrée pendant 24 heures en continu à 37°C, une lecture étant effectuée toutes les 45 minutes (figure 5). 3- RESULTATS 3.1- Purification de dOVAX à partir du blanc d'oeuf Les deux chromatographies d'affinité successives héparine-sepharose et biotine-agarose, suivies par une chromatographie d'exclusion ont permis d'éliminer les protéines majeures du blanc d'oeuf, et d'isoler dOVAX. La figure 1 est une photo d'un gel des protéines du blanc d'oeuf, aux différents niveaux de purification. Ainsi, la troisième colonne (EW) représente la migration des protéines du blanc d'oeuf dans leur ensemble. La cinquième colonne (HB-EW) représente une fraction selon l'invention, à savoir la fraction de protéines et peptides du blanc d'oeuf liant l'héparine-sépharose. Cette première purification permet notamment d'éliminer l'ovalbumine, protéine majeure dans le blanc d'oeuf (la quatrième colonne, HUB-EW, montre les protéines du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine). Il ressort que cette fraction contient majoritairement une protéine de poids moléculaire d'environ 45 kDa. La digestion de la fraction d'intérêt par la trypsine (Sixième colonne - HB-EW-T) et par la chymotrypsine (septième colonne - HB-EW-CT) montre que la protéine d'intérêt, de poids moléculaire d'environ 45 kDa, correspondant à IOVAX, est bien clivée en une pluralité de peptides par ces enzymes. La même bande à environ 45 kDa est obtenue lors des étapes successives de purification de la fraction de protéines et peptides issue du blanc d'oeuf et liant l'héparine, comme cela est visible sur la figure 2. La purification sur héparine sépharose (colonne 2), suivie d'une purification sur biotine-sépharose (colonne 3) et d'une filtration sur gel (colonne 4) permet d'isoler la protéine de poids moléculaire 45 kDa. La colonne 4 représente une protéine pure à 92%, identifiée comme étant IOVAX. La majorité des contaminants de cette fraction représente des multimères de IOVAX (hautes masses apparaissant sur le gel). En effet, une analyse par western-blot a montré qu'ils réagissent avec des anti-corps antiovalbumine et disparaissent après réduction en présence de betamercaptoéthanol. Ainsi, environ 7,5 mg de protéines pures d'OVAX ont pu être obtenus 30 à partir de 50 mL de blanc d'oeuf. La concentration en OVAX est estimée à environ 0,5 mg/mL de blanc d'oeuf au minimum, ce qui permet d'envisager de nombreuses applications notamment dans le domaine de l'agro-alimentaire, directement par purification de la protéine à partir du blanc d'oeuf. 35 3.2- Identification de I'OVAX L'identification par spectrométrie de masse et séquençage a permis d'isoler et identifier une protéine de séquence SEQ ID N°1, correspondant à l'OVAX précédemment isolée, qui présente une séquence quasi-identique à la séquence prédite déjà connue (SEQ ID N°2) à partir de l'analyse bioinformatique du génome du poulet, et disponible dans les banques de données NCBI. En effet, comme cela est visible sur la figure 3, qui compare les deux séquences d'acides aminés, la séquence SEQ ID N°1 présente une différence sur cinq résidus aminoacides par rapport à la séquence SEQ ID N°2. Ces résultats ont été confirmés par séquençage amino terminal de l'OVAX digéré à la trypsine. Plus précisément, après protéolyse limitée à la trypsine, on a procédé au séquençage d'Edman (donc par l'extrémité N-terminale). A deux reprises la séquence VQKPKXGKSVNIHLLFXELLVQKPXXGKSV a été obtenue, dans laquelle X est un résidu qui n'a pas pu être déterminé avec certitude, ce qui est souvent observé avec les cystéines. Parmi les cinq résidus (KVQKP) qui ont été mis en évidence par genemark, 4 (VQKP) ont pu être confirmé. Cependant, la trypsine est connue pour couper spécifiquement les séquences peptidiques après les lysines (K) ou les arginines (R). Cette spécificité tend à valider le résidu K qui précède ces quatre résidus. Aucun séquençage d'Edman n'a pu être effectué sur l'OVAX native, ce qui laisse penser qu'elle contient une amino-acétylation, bloquant l'extrémité N-terminale de la molécule. 3.3- Activité anti-microbienne Les graphiques de la figure 4 permettent de faire le parallèle entre l'action dans le temps de l'Ovalbumine (Figure 4A) et de l'OVAX (figure 4B) contre Listéria monocytogenes, à des concentrations croissantes en ces molécules. Ainsi, on constate qu'aucune action spécifique contre Listéria monocytogenes n'est observée avec l'Ovalbumine pour des concentrations inférieures à 400 pg/mL. Et l'effet observé à 400 pg/mL est très faible. A l'inverse, on observe que lOVAX présente une activité anti Listéria monocytogenes dès 25 pg/mL, au moins pendant les 10 premières heures du test. Et dès 50 pg/mL d'OVAX, l'activité anti Listéria monocytogenes perdure, puisque même après 15 heures, plus aucune croissance bactérienne n'est observée. Les graphiques de la figure 5 permettent, eux, de faire le parallèle entre l'activité anti Listeria monocytogenes du blanc d'oeuf pur (figure 5A - EW), de la fraction du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine (figure 5B - HUBEW), de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine (figure 5C - HB-EW) et de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine, après digestion par la trypsine (figure 5D - HB-EW-T). Le blanc d'oeuf pur, tout comme la fraction issue du blanc d'oeuf et ne liant pas l'héparine présentent des profils d'activité similaires. Aucune activité significative anti Listéria monocytogenes n'est observée, même à des concentrations supérieures à 400 pg/mL. A l'inverse, on observe un profil d'activité anti Listéria monocytogenes similaire entre la fraction liant l'héparine et la fraction liant l'héparine digérée par trypsine. Une action transitoire contre Listéria monocytogenes est obtenue dès 28 pg/mL, cette action étant quasi-définitive à 56 pg/mL. 28 pg/mL de l'une ou l'autre de ces fractions suffisent à réduire de plus de 50% la croissance de la bactérie. A cette concentration, pendant les 16 premières heures, les fractions HB-EW et HB-EW-T semblent interférer avec la croissance des bactéries, et semblent agir contre celle-ci, la croissance bactérienne étant réduite de plus de 50%. Après 16 heures, on observe une nouvelle dégradation de la croissance du pathogène. L'action de la trypsine pure contre Listéria monocytogenes a également été étudiée (figure 5D). On observe un léger effet sur la croissance de Listéria monocytogenes. Il faut soustraire cet effet à celui observé pour IOVAX à la plus forte concentration. En effet, dans l'échantillon le plus concentré d'OVAX, il y a de la trypsine concentrée. Cet échantillon est ensuite dilué de 2 en 2, la concentration en trypsine diminuant donc d'autant et son activité antimicrobienne propre aussi. Ici, la trypsine sert de contrôle. Des résultats comparables ont été obtenus avec la fraction liant l'héparine et digérée par chymotrypsine (Figure 5E). Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus avec l'OVAX seule (Figure 4B), qui sont comparables. Dans ces trois cas, on observe un effet dose dépendant de la fraction ou molécule sur Listéria monocytogenes. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Benarafa, C., and E. Remold-O'Donnell. 2005. The ovalbumin serpins revisited: perspective from the chicken genome of clade B serpin evolution in vertebrates. Proc Natl Acad Sci U S A 102:11367-72. 2. Heilig, R., R. Muraskowsky, C. Kloepfer, and J. L. Mandel. 1982. The ovalbumin gene family: complete sequence and structure of the Y gene. Nucleic Acids Res 10:4363-82. 3. Heilig, R., F. Perrin, F. Gannon, J. L. Mandel, and P. Chambon. 1980. 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REVENDICATIONS1- Molécule antimicrobienne présentant une séquence amino acide SEQ ID N°1 pour son action anti-Listéria monocytogenes. 2- Fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, pour son action anti- Listéria monocytogenes comportant au moins une molécule selon la revendication 1. 3- Fraction selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une molécule parmi dOVAX, une protéine similaire à la protéine MGC82112, l'Avidine, le Lysozyme C, la beta-defensine 11, la protéine TENP, la cyclophiline B, la protéine Vmo-I, le précurseur de l'ovotransferine, la Mucine 5, la Clusterine, et la Pleiotrophine. 4- Fraction selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisée en ce que la molécule d'OVAX représente au moins 50% en proportion de la fraction. 5- Fraction selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine est comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement entre 20 pg/mL et 100 pg/mL et de manière encore plus préférée entre 25 pg/mL et 60 pg/mL. 6- Fraction selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce qu'elle est digérée par au moins une enzyme digestive. 7- Fraction selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une trypsine. 8- Fraction selon l'une des revendications 6 à 7, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une chymotrypsine. 9- Composition comportant la molécule antimicrobienne selon la revendication 1, en tant que principe actif anti- Listéria monocytogenes. 10- Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la concentration en la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N°1 est comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement entre 20 pg/mL et 100 pg/mL et de manière encore plus préférée entre 25 pg/mL et 60 pg/mL. 11- Composition selon l'une des revendications 9 à 10, pour son utilisation comme médicament anti- Listéria monocytogenes. 12- Composition selon l'une des revendications 9 à 10, pour son utilisation comme additif alimentaire anti- Listéria monocytogenes. 13- Composition comportant la fraction de peptides et/ou protéines selon l'une des revendications 2 à 8, en tant que principe actif anti- Listéria monocytogenes. 14- Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine est comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement entre 20 pg/mL et 100 pg/mL et de manière encore plus préférée entre 25 pg/mL et 60 pg/mL. 15- Composition selon l'une des revendications 13 à 14, pour son utilisation comme médicament anti- Listéria monocytogenes. 16- Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 13 à 14, comme additif alimentaire anti- Listéria monocytogenes.15