Brevet FR2953528A1 — publié le 20110610

Introduction Les présents Inventeurs ont identifié une nouvelle molécule capable d'activer le récepteur aux oestrogènes ERa de façon très spécifique, la delphinidine. Cette molécule est capable de cibler sélectivement le domaine activateur d'ERa, ce qui explique qu'elle induit in vivo les effets protecteurs vasculaires liés à ER en évitant de provoquer les effets secondaires communément associés à l'activation de ce récepteur. La présente invention décrit l'utilisation de composés chimiques dérivés de la delphinidine dans des procédés de criblage pour identifier des composés capables d'activer sélectivement le récepteur aux oestrogènes ERa, et de stimuler la production de monoxyde d'azote (NO) par l'endothélium, de tels composés pouvant être par la suite incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées à traiter notamment les maladies cardiovasculaires. Art Antérieur Les maladies cardio-vasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde: il meurt chaque année plus de personnes en raison de maladies cardio-vasculaires que de toute autre cause. On estime à 17,1 millions le nombre de décès imputables aux maladies cardio-vasculaires, soit 29% de la mortalité mondiale totale. Parmi ces décès, on estime que 7,2 millions sont dus à une cardiopathie coronarienne et 5,7 millions à un AVC (dernières statistiques 2004). D'ici 2030, près de 23,6 millions de personnes mourront d'une maladie cardio-vasculaire (cardiopathie ou AVC principalement). D'après les projections, ces maladies devraient rester les premières causes de décès, le taux de progression le plus important devrait toucher la région de la méditerranée orientale. L'Asie du Sud-Est devrait compter le plus grand nombre de décès. Le monoxyde d'azote, oxyde azotique, oxyde nitrique ou NO est un composé chimique formé d'un atome d'oxygène et d'un atome d'azote. C'est un gaz dans les conditions normales de pression et de température. C'est un important neurotransmetteur chez les mammifères et le seul neurotransmetteur gazeux connu. Il est libéré par les cellules endothéliales, les macrophages, les cellules du foie, les neurones et bien d'autres cellules lors des pathologies cardiovasculaires et tumorales. Dans l'organisme le monoxyde d'azote est synthétisé naturellement par le corps à partir de la L-arginine et de l'oxygène par plusieurs enzymes dites NO synthases (NOS), qui sont des hémoprotéines proches du cytochrome P450. Le NO possède plusieurs propriétés bénéfiques et ainsi réduit le développement de nombreuses pathologies, telles que le cancer, l'ischémie cardiaque, l'athérosclérose et l'hypertension. Cela peut être expliqué par le fait que le NO a la capacité de modifier de nombreux facteurs impliqués dans la genèse de ces maladies. En effet, le NO est l'un des facteurs libérés par l'endothélium des vaisseaux sanguins doué d'une puissante propriété vasodilatatrice provoquant ainsi un accroissement du débit sanguin. Ainsi, le NO joue un rôle important dans la régulation de la pression artérielle. En outre, le NO est indispensable à la préservation de l'endothélium vasculaire grâce à sa capacité à protéger les cellules endothéliales lors de différentes agressions associées à l'apoptose. La production du NO permet entre autres : d'empêcher l'oxydation des lipoprotéines de faible densité, d'inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires, de limiter, d'empêcher l'agrégation et l'adhésion des plaquettes, et de stabiliser les cellules immunitaires. La voie de signalisation menant à la production du NO est donc essentielle à l'homéostasie des vaisseaux sanguins et est souvent impliquée dans les maladies cardiovasculaires. Le risque de présenter une maladie cardio-vasculaire est d'autant plus grand que la synthèse de NO se révèle insuffisante chez l'Homme. Les œstrogènes (ou estrogènes) constituent un groupe de stéroïdes, dont la fonction, à l'état naturel, est d'être une hormone sexuelle femelle primaire. Ils sont produits en premier lieu par le développement des follicules des ovaires, le corps jaune et le placenta. Certains oestrogènes sont également produits en petites quantités par d'autres tissus tels le foie, la surrénale, les seins et le tissu adipeux. Les trois oestrogènes naturels sont l'oestradiol, l'estriol et l'estrone. Dans le corps, ils sont tous produits au départ d'androgènes sous l'effet d'enzymes. L'oestradiol est produit à partir de la testostérone et l'estrone à partir de l'androstènedione. L'estrone est beaucoup moins puissante que l'oestradiol, et chez les femmes en post-ménopause, on trouve plus d'estrone que d'oestradiol. En plus de leurs rôles dans la reproduction, féminine mais aussi masculine, les oestrogènes sont impliqués dans le développement du système nerveux central, dans l'homéostasie du squelette et du système cardio-vasculaire. Ils ont également des effets sur le foie et le tissu adipeux. En particulier, les oestrogènes jouent un rôle important dans l'homéostasie des cellules endothéliales, puisqu'ils induisent la production de messagers endothéliaux comme le monoxyde d'azote. En effet, il a été montré que l'oestradiol peut rapidement induire la formation de NO par activation de l'enzyme NOS endothéliale (Mendelsohn ME, Circ Res 2000, Caulin-Glaser et al, Circ Res 1997), et participe par là même à la protection vasculaire. L'oestrogène secrété naturellement par la femme serait d'ailleurs l'une des raisons avancées sur la fréquence moindre de maladies cardio-vasculaires chez ces dernières. Cependant, les effets cardiovasculaires des oestrogènes sont beaucoup plus complexes que cela, et ne sont pas toujours positifs : par exemple, il a été montré que la prise d'oestrogènes augmente le risque de thrombose ou d'embolie veineuse chez les femmes ménopausées (Rossouw JE, Jama 2002). De plus, les oestrogènes sont impliqués dans des maladies à fort impact sur la société par leur fréquence et/ou leur gravité. Ce sont pour l'essentiel des cancers hormono- dépendants chez la femme, cancer du sein ou de l'utérus qui sont liés à la durée et à l'intensité de l'exposition aux oestrogènes. 4 Les données discordantes sur les effets des oestrogènes dans l'athérosclérose et les effets secondaires autres rendent ainsi difficile la décision de traiter les femmes après la ménopause dans un but de prévention cardio-vasculaire. Il serait pourtant très intéressant d'identifier des composés ayant l'effet bénéfique des oestrogènes sur la production du monoxyde d'azote, sans pour autant en partager les effets secondaires (en particulier sur le système de reproduction). Dans cette optique, il convient dans un premier temps de s'intéresser à la structure des récepteurs aux oestrogènes. Les principaux récepteurs des oestrogènes sont des protéines intracellulaires appartenant à la famille des récepteurs nucléaires et codés par deux gènes distincts chez l'animal possédant les deux types de récepteurs: il s'agit des récepteurs alpha (ERa) et bêta (ER/3) des oestrogènes. L'homme et la femme possèdent ces récepteurs qui sont répartis différemment selon les organes. Un troisième récepteur potentiel, appartenant à une autre famille (récepteur couplé aux protéines G), codé par un troisième gène et appelé GPR30 a récemment été décrit. Les effets des oestrogènes sur leurs cellules/tissus cibles par l'intermédiaire de ces récepteurs peuvent être classés en deux catégories: les effets génomiques, i.e. sur l'expression des gènes; et les effets non génomiques qui concernent directement d'autres acteurs moléculaires dans les cellules, principalement des protéines. Il est connu que l'activation sélective du récepteur ERa implique une activation de la voie NO dans les cellules endothéliales, alors que l'activation du récepteur ER(3 ne le permet pas (Darblade B, Circ Res 2002, Bolego C, J. Pharmacol. Exp. Ther 2005). Ainsi, un composé activateur d'ERa suffirait a priori pour induire la production de la voie NO dans les cellules endothéliales, et donc l'effet protecteur des vaisseaux 25 sanguins. Par ailleurs, Billon-Gallès A. et al (PNAS 2009) a récemment montré qu'un des domaines du récepteur (AF-1) n'est pas nécessaire pour les effets protecteurs des estrogènes au niveau vasculaire mais qu'il est nécessaire pour les effets au niveau du b système reproducteur (responsable notamment des effets indésirables des activateurs de ERa). Ainsi, une molécule qui serait capable de ne cibler sélectivement que le domaine activateur AF2 de ERa, et pas le domaine AF1 de ERa 1, serait un bon candidat de 5 modulateur sélectif permettant d'induire les effets protecteurs vasculaires liés à ER en évitant de provoquer des effets secondaires communément associés à l'activation de ce récepteur (en particulier induction de cancers du sein, de thromboses veineuses, d'embolies, et probablement aussi d'effets pro-inflammatoires). Il existe un réel besoin dans l'industrie pharmaceutique pour ce type de composés. La présente Invention s'inscrit dans ce cadre et répond justement à ce besoin. Les présents Inventeurs ont en effet identifié pour la première fois une molécule capable de cibler de façon très sélective le site activateur de ERa, et d'induire une très forte production de NO dans les cellules endothéliales exprimant le récepteur aux oestrogènes. Les études de modélisation de cette molécule sur le site de liaison de l'oestradiol dans le domaine AF2 montre que celle-ci interagit directement avec le site activateur d'ERa dans le domaine de liaison au ligand. Cette molécule est la delphinidine, un pigment végétal de couleur bleue appartenant à la famille des anthocyanes, qui donne la couleur bleu rougeoyante du cépage Cabernet sauvignon. La delphinidine (n° CAS 528-53-0) a la formule chimique suivante : HO OH La présente invention s'appuie sur des résultats solides démontrant sans ambiguïté que la delphinidine interagit directement avec le site activateur du récepteur aux oestrogènes ERa, et induit la production de monoxyde d'azote dans les cellules endothéliales via le récepteur aux oestrogènes ERa. Ce mécanisme d'action permet d'expliquer pour la première fois le rôle bien établi de la delphinidine sur la production de monoxyde d'azote via la mobilisation du Cal+ (Martin S. et al, British Journal of Pharmacology 2002), le relâchement de l'endothélium vasculaire (Andriambeloson E et al, American Society for Nutritional Sciences, 1998), et l'inhibition de l'apoptose des cellules endothéliales (Martin S, et al, British Journal of Pharmacology 2003). Ce mécanisme est d'autant plus surprenant qu'une récente étude a démontré que des polyphénols du vin rouge induisent la production de monoxyde d'azote par un mécanisme indépendant du récepteur aux oestrogènes (Kane M.O. et al, Vascular Pharmacology 2009). La découverte et la compréhension de l'interaction entre la Depphinidine et le récepteur ERa peut à présent servir, notamment grâce aux procédés de criblages de composés décrits dans la présente invention, à identifier d'autres composés d'intérêt, capables d'interagir directement avec ERa et susceptibles d'avoir des propriétés bénéfiques sur la protection cardiovasculaire. Légendes des figures La figure 1 décrit le relâchement vasculaire dépendant de l'endothélium induit des concentrations croissantes d'un extrait de polyphénols de vin rouge (A) ou de delphinidine (B) dans des anneaux d'aortes de rat, ayant (cercles ouverts) ou non (cercles pleins) un endothélium fonctionnel en présence ou non de l'inhibiteur pharmacologique de NOS, le L-NAME (triangles) (**P Description détaillée de l'invention Les résultats présentés ci-dessous indiquent clairement û et pour la première fois - que la delphinidine interagit directement avec le site activateur du récepteur aux oestrogènes ERa, et induit la production de monoxyde d'azote dans les cellules endothéliales via le récepteur aux oestrogènes ERa. Il existe ou il est possible d'obtenir des dérivés de la delphinidine, qui ont les mêmes (voire des meilleures) propriétés de production de NO ou d'activation d'ERa que la delphinidine elle-même, et qui pourraient servir dans des protocoles cliniques notamment dans le domaine de la protection cardiovasculaire. La présente invention porte donc sur l'identification de composés ayant une structure chimique proche de celle de la delphinidine, et qui pourraient être capables i) d'activer le site activateur du domaine de liaison au ligand du récepteur ERa spécifiquement, et/ou ii) de stimuler la production de NO dans les cellules endothéliales avec lesquelles elles sont mises en contact. Plus précisément, dans un premier aspect, la présente invention porte sur un procédé de criblage et de sélection de composés chimiques dérivés de la delphinidine activant le récepteur aux oestrogènes ERa, comprenant au moins les étapes : a) obtenir au moins un composé de formule générale (I) suivante: Rio R11 R9 (I) dans laquelle : RI, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R19, R11 sont choisis indépendamment les uns des autres dans le groupe constitué par : l'hydrogène, les atomes d'halogène, en particulier le fluor, le brome, ou l'iode, les groupements hydroxy, amino, nitroso, nitro, cyano, ou azonium, les groupements (C1-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2-C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (C1-C6)thioalcoxy, (C1-C6)halogénoalcoxy, di((C1-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, et X est un hétéroatome choisi dans le groupe constitué par : l'oxygène, l'azote ou le soufre, éventuellement chargé et éventuellement substitué par un groupement (C1-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2-C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (CI-C6)thioalcoxy, (C1-C6)halogénoalcoxy, di((C1-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, b) tester si ledit composé active le récepteur aux oestrogènes ERa, c) sélectionner ledit composé s'il active le récepteur aux oestrogènes ERa. Par « atome d'halogène », on entend, au sens de la présente invention, les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode. Dans le cadre de la présente invention, on entend par groupement « hydroxy » le groupement O-H, par groupement « amino », le groupement NH2, par groupement « nitroso » le groupement NO, par groupement « nitro » le groupement NO2, par groupement « cyan » le groupement CN, et par groupement « azonium » le groupement N=N éventuellement chargé. Par groupement «(C1-C6)alkyle» ou «alkyle en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 6, de préférence 1 à 4, atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle ou encore hexyle. Par groupement « (C2-C6)alcényle » ou « alcényle en C2-C6 »,, on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, comportant au moins une double liaison et comportant 2 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes éthényle ou allyle. Par groupement « (C2-C6)alcynyle » ou « alcynyle en C2-C6 », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, comportant au moins une triple liaison et comportant 2 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes éthynyle ou propynyle. Par « (C1-C6)halogénoalkyle » ou « halogénoalkyle en CI-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (C1-C6)alkyle, tel que défini ci-dessus, pour lequel un ou plusieurs atomes d'hydrogène ont été remplacés par un atome d'halogène tel que défini ci-dessus. Il peut s'agir en particulier d'un groupe CF3. Par groupement « (C1-C6)alcoxy » ou « alcoxy en C 1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (C1-C6)alkyle, tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un atome d'oxygène. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy ou encore tertbutoxy. Par groupement «(C1-C6)thioalcoxy» ou «thiolalcoxy en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (C1-C6)alkyle, tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un atome de soufre. A titre d'exemple, on peut citer les groupes thiométhoxy, thioéthoxy, thiopropoxy, ou encore thiobutoxy. Par « (C1-C6)halogénoalcoxy » ou « halogénoalcoxy en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (C1-C6)halogénoalkyle, tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un atome d'oxygène. Par groupement « (C1-C6)alkylamino » ou « alkylamino en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe ûNHA avec A représentant un groupe (C1-C6)alkyle tel que défini ci-dessus. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthylamino, éthylamino, propylamino, isopropylamino, butylamino ou encore tertbutylamino. Par groupement «di((C1-C6)alkyl)amino» ou «di((alkyl en C1-C6)amino », on entend, au sens de la présente invention, un groupe ûNAB avec A et B représentant, indépendamment l'un de l'autre, un groupe (C1-C6)alkyle tel que défini ci-dessus. A titre d'exemple, on peut citer les groupes diméthylamino, diéthylamino ou encore méthyléthylamino. Par « alkylcarbonyle», on entend, au sens de la présente invention, tout groupe alkyle, tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un groupe carbonyle (CO). Un exemple de groupe alkylcarbonyle est le groupe acétyle, propionyle, n-butyryle, sec-butyryle, t-butyryle ou encore iso-propionyle. De tels composés peuvent être obtenus soit en modifiant la molécule de delphinidine qui est commercialisée sous forme de chlorure de delphinidine (par exemple par Extrasynthèse, Genay, France) par des techniques classiques de chimie combinatoire, soit par synthèse chimique ab initio par des techniques connues de l'homme du métier. 11 Par « récepteur aux oestrogènes ERa », on entend, dans la présente invention, le récepteur aux oestrogènes humain tel que décrit dans Jensen EV and Jordan VC, Clin Cancer Res, 2003, et qui a 4 isoformes : l'isoforme 1 (numéro d'accession NCBI: NP000116.2) (SEQ ID NO :1), l'isoforme 2 (numéro d'accession NCBI: NP001116212.1) (SEQ ID NO :2), l'isoforme 3 (numéro d'accession NCBI: NP001116213.1) (SEQ ID NO: 3), l'isoforme 4 (numéro d'accession NCBI: NP_001116214) (SEQ ID NO4). On entend également désigner sous le terme « récepteur aux oestrogènes ERa » toute séquence polypeptidique identique à 80%, de préférence 90% avec SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 ou SEQID NO :4, et qui conserve sa capacité à se lier avec ses ligands habituels, par exemple le 17-f3-estradiol ou le 1,3,5-tris(4-hydroxyphenyl)-4-propyl-lH-pyrazole (PPT). On pourra aussi, dans les procédés de criblage de l'invention, utiliser des cellules endothéliales de souris, de boeuf, de chien, de cheval, de chat, ou de rat, qui exprimeront les récepteurs ERa de souris (NP_031982.1, SEQ ID NO :7), de boeuf (NP001001443, SEQ ID NO :8), de cheval (NP_001075241, SEQ ID NO : 9), de chien (NP_001002936, SEQ ID NO :10), de chat (NP_001019402, SEQ ID NO : 11), ou de rat (BAI48013.1, SEQ ID NO :12). Par pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques, on entend le pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d'acides aminés. Par meilleur alignement possible ou alignement optimal, on entend l'alignement permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à identifier et comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant des programmes d'ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, 12 BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), ou en utilisant les algorithmes d'alignement multiples MUSCLE que l'homme du métier connaît bien. Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d'obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. De façon générale, un composé « active un récepteur » lorsqu'il agit positivement sur ce récepteur. Ainsi, il n'est pas nécessaire que le composé se fixe directement dans le site actif du récepteur, il peut également se fixer ailleurs sur le récepteur ou encore agir de façon indirecte. Le terme « activer » est donc ici synonyme de « stimuler » ou « agir positivement ». Dans le cadre de la présente invention, et compte-tenu des résultats obtenus avec la delphinidine, les procédés de criblage de l'invention visent à identifier des composés qui se fixent directement sur le récepteur ERa, et qui induisent au moins une voie moléculaire de signalisation dépendante d'ERa. Ainsi, au sens de la présente invention, le terme « activer le récepteur ERa» signifie que le composé se fixe sur le récepteur ERa et induit au moins une voie moléculaire choisie parmi les voies Src-ERK1/2-eNOS ou PI3K-Akt-eNOS, la protéine G, ou la phospholipase C (Martin S. et al., British Journal of Pharmacology 2002 ; Klinge et al., FASEB J 2008). De préférence, cette voie moléculaire est la production du NO. En fonction des différents modes de réalisation de l'invention, les composés visés dans la présente invention peuvent ou doivent se lier au récepteur ERa et doivent donc avoir une certaine affinité pour le récepteur ERa. Cette affinité peut être mesurée par exemple par un test de liaison compétitif avec le 17-(3-estradiol sur ERa. Dans ce cas, le déplacement de plus de 50% de la liaison spécifique du 17-f3-estradiol sur ERa peut être pris comme valeur seuil pour sélectionner les composés qui sont capables d'activer le récepteur ERa (cf. exemple 2). De manière préférée, les composés sélectionnés dans les procédés de criblage doivent être capables de déplacer au moins 60%, de préférence 70% la liaison spécifique du 17-13-estradiol (E2) sur ERa dans le test de liaison décrit dans l'exemple 2 ci-dessous (voir aussi Parker GJ, et al, JBiomol Screen. 2000). De manière encore plus préférée, ce composé est capable de se lier au site activateur AF2 de ERa, et non au site AF1 de ERa. Le récepteur ERa comprend 6 domaines A à F et possède deux fonctions de transactivation AF 1 et AF2 situées dans les régions B et E respectivement. AF 1 est situé dans le domaine N-terminal d'ERa, tandis qu'AF2 fait partie du domaine de liaison au ligand (Tora L et al, Cell 1989). L'équipe de Jean-François Arnal a pu démontrer que le domaine AF1 n'était pas impliqué dans les voies de signalisation menant à la production de NO, à l'inverse de AF2 (Billon-Gallès A. et al, Proc Nad AcadSci USA. 2009). Les composés sélectionnés dans les procédés de criblage de l'invention activent de préférence le site activateur AF2 de ERa, et n'ont aucun effet sur le site AF1 de ERa. De telles propriétés peuvent être mises en évidence en utilisant des cellules endothéliales dans lesquelles le site activateur AF2 est inactivé, est bloqué par un antagoniste ou n'est pas synthétisé (cellules AF2KO), et en vérifiant que la mise en contact avec les composés sélectionnés dans les procédés de criblage n'induit pas la production de NO ou la libération de calcium intracellulaire dans de ces cellules. De façon alternative, l'activation du récepteur ERa par les composés testés dans le procédé de criblage de l'invention peut être mesurée en contrôlant la production de NO, ou encore en contrôlant la quantité de calcium intracellulaire libérée, dans des cellules endothéliales mises en contact avec lesdits composés, comme présenté dans l'exemple 1 ci-dessous. De préférence, les composés sélectionnés dans le procédé de criblage de l'invention induisent la production de NO dans les cellules endothéliales avec lesquelles ils sont mis en contact. Dans le cadre de la présente invention, un composé est capable d« 1,5, de manière préférée >1,7, de manière encore plus préférée >2. L'homme du métier connaît différentes méthodes classiques de mesure du NO: la méthode de référence, à ce jour, de mesure de l'espèce NO dans les systèmes vivants 20 est la résonance paramagnétique éléctronique (Andriambeloson E. et al., BJP, 1997). La mesure de la production de NO par résonance paramagnétique électronique est,en effet la méthode la plus spécifique permettant de mesurer l'espèce NO dans des systèmes vivants (Vanin AF, Stud. Biophys, 1984). Dans le cadre de la présente invention, les cellules endothéliales peuvent êtres des 25 lignées cellulaires (EaHy 926) ou des cultures primaires de cellules (BAECs, HUVECs) telles que décrites dans Martin S et aL, Bri. J. Pharmacol, 2002. Dans un second aspect, la présente invention porte sur un procédé de criblage et de sélection de composés chimiques dérivés de la delphinidine induisant la production de monoxyde d'azote dans les cellules endothéliales, comprenant au moins les étapes : a) obtenir au moins un composé de formule générale I suivante: (I) dans laquelle : RI, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rio, R11 sont choisis indépendamment les uns des autres dans le groupe constitué par : l'hydrogène, les atomes d'halogène, en particulier le fluor, le brome, ou l'iode, les groupements hydroxy, amino, nitroso, nitro, cyano, ou azonium, les groupements (CI-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2- C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (CI-C6)alcoxy, (CI-C6)thioalcoxy, (CI- C6)halogénoalcoxy, di((CI-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, et X est un hétéroatome choisi dans le groupe constitué par : l'oxygène, l'azote ou le soufre, éventuellement chargé et éventuellement substitué par un groupement (CIC6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2-C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (CI-C6)thioalcoxy, (CI-C6)halogénoalcoxy, di((CI-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, b) tester si ledit composé induit la production de NO dans les cellules endothéliales avec lesquelles il est mis en contact, r c) sélectionner ledit composé s'il induit la production de NO dans les cellules endothéliales avec lesquelles il est mis en contact. De préférence, le composé sélectionné dans ce procédé de criblage comme induisant la production de NO dans les cellules endothéliales active le récepteur aux 5 oestrogènes ERa. De préférence, le composé sélectionné dans ce procédé se lie et active le site activateur AF2 de ERa et non le site AF 1 de ERa. Dans un troisième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un composé de formule générale I suivante : dans laquelle : R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rio, R11 sont choisis indépendamment les uns des autres dans le groupe constitué par : l'hydrogène, les atomes d'halogène, en particulier le fluor, le brome, ou l'iode, les groupements hydroxy, amino, nitroso, 15 nitro, cyano, ou azonium, les groupements (C1-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2- C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (Cl-C6)thioalcoxy, (C1- C6)halogénoalcoxy, di((C1-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, et X est un hétéroatome choisi dans le groupe constitué par : l'oxygène, l'azote ou le soufre, éventuellement chargé et éventuellement substitué par un groupement (C1- 20 C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2-C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (C1-C6)thioalcoxy, (C1-C6)halogénoalcoxy, di((C1-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, 10 (I) 17 dans un procédé de criblage pour identifier au moins un composé induisant la production de NO dans les cellules endothéliales. Dans un quatrième aspect, la présente invention est relative à l'utilisation d'un composé de formule générale (I) suivante : (I) dans laquelle : R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R19, R11 sont choisis indépendamment les uns des autres dans le groupe constitué par: l'hydrogène, les atomes d'halogène, en 10 particulier le fluor, le brome, ou l'iode, les groupements hydroxy, amino, nitroso, nitro, cyano, ou azonium, les groupements (C1-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2- C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (C1-C6)thioalcoxy, (CI- C6)halogénoalcoxy, di((C1-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, et X est un hétéroatome choisi dans le groupe constitué par: l'oxygène, l'azote ou le 15 soufre, éventuellement chargé et éventuellement substitué par un groupement (C1-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2-C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (C1-C6)thioalcoxy, (C1-C6)halogénoalcoxy, di((C1-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, dans un procédé de criblage pour identifier au moins un composé activant le 20 récepteur aux oestrogènes ERa.5 Dans une variante de l'invention, le ou les composé(s) testé(s) dans les procédés de criblage de l'invention est (sont) choisi(s) dans le groupe constitué par: l'aurantidine (composé de formule I avec Ri, R3, R8, R9, Rio, R11= H, et R2, R4, R5, R6, R7= OH et X=O), la cyanidine (composé de formule I avec R3, R6, R8, R9, Rio, R1 1= H, et Ri, R2, R4, R5, R7= OH et X=O), l'europinidine (composé de formule I avec Ri, R5 = OCH3, et R6, R8, R9, Rlo, R11= H, et R3, R2, R4, R7= OH et X=O), la lutéolinidine (composé de formule I avec Ri, R6, R3, R8, R9, Rio, R11= H, et R2, R4, R5, R7= OH et X=O), la pélargonidine (composé de formule I avec Ri, R3, R6, R8, R9, Rlo, Rit= H, et R2, R4, R5, R7= OH et X=O), la malvidine (composé de formule I avec Ri, R3= OCH3, et R6, R8, R9, Rlo, R11= H, et R2, R4, R5, R7= OH et X=O), la péonidine (composé de formule I avec Ri= OCH3, et R3, R6, R8, R9, Rlo, R11= H, et R2, R4, R5, R7= OH et X=O), la pétunidine (composé de formule I avec Ri= OCH3, et R6, R8, R9, Rlo, R11= H, et R2, R3, R4, R5, R7= OH et X=O) et la rosinidine (composé de formule I avec Ri, R7= OCH3, et R3, R6, R8, R9, Rio, R11= H, et R2, R4, R5= OH et X=O). Dans une autre variante de l'invention, le ou les composé(s) testé(s) dans les procédés de criblage de l'invention ont des groupements Ri, R2, R3, R4, R5 qui sont OH, ou un groupement alcoxy en C1-C6, et les groupements R6, R7, R8, R9, Rio, Riisont l'hydrogène, ou un atome d'halogène, ou un alkyle en Ci-C6, et X=0+, et ce à l'exception de la delphinidine, i.e. à l'exception du composé de formule I ayant Ri, R2, R3, R4, R5=OH et R6, R7, R8, R9, Rio, R11= H, et X=O+. De manière préférée, les composés sélectionnés dans les procédés de criblage de l'invention, i.e. ceux induisant la production de NO, et/ou ceux activant le récepteur aux oestrogènes ERa, ont une interaction spécifique avec ERa, de préférence avec le site activateur AF2 de ERa, et sont donc dépourvus d'effet sur les autres récepteurs présents dans les cellules endothéliales, en particulier sur le récepteur aux oestrogènes ER(3. Ainsi, ces composés sont dépourvus d'effet lorsqu'ils sont mis en contact avec des cellules n'exprimant pas le récepteur aux oestrogènes ERa, c'est-à-dire, par exemple, qu'ils n'y induisent ni élévation de Cal+ intracellulaire, ni production de NO. 19 Par « récepteur aux oestrogènes ER[3 », on entend, dans la présente invention, le récepteur aux oestrogènes humain tel que décrit dans (Kuiper GG et al., PNAS 1996), et qui a 2 isoformes : l'isoforme 1 (numéro d'accession NCBI : NP_001428.1) (SEQ ID NO : 5), et l'isoforme 2 (numéro d'accession NCBI : NP_001035365.1) (SEQ ID NO : 6). On entend également désigner sous le terme « récepteur aux oestrogènes ER(3 » toute séquence polypeptidique identique à 80%, de préférence 90% avec SEQ ID NO :5 ou SEQ ID NO :6 par alignement avec un programme tel que BLAST, et qui conserve sa capacité à se lier avec ses ligands habituels, par exemple le 1743-estradiol, le tamoxifène, ou le raloxifène (Hall et coll. J Biol Chem 2001; 276: 36869-36872). On pourra aussi utiliser dans les procédés de criblage de l'invention des cellules endothéliales de souris qui expriment le récepteur ER(3 de séquence NP_997590 (SEQ ID NO :13, isoforme 1), ou NP034287 (SEQ ID NO : 14, isoforme 2). Selon un mode de réalisation de l'invention, lorsque des cellules endothéliales dans lesquelles le récepteur aux oestrogènes ERa est inactivé, sont mises en contact avec le(s) composé(s) sélectionné(s) dans les procédés de criblage de l'invention, il y a absence de production de NO dans ces cellules. Le récepteur aux oestrogènes ERa peut être inactivé dans les cellules endothéliales de différentes manières, et notamment de manière pharmacologique ou génétique. Par exemple, des antagonistes bloquants spécifiques de ERa peuvent être utilisés, comme le fulvestrant, ou le 1,3,5-tris(4-hydroxyphenyl)-4-propyl-lH-pyrazole (PPT), qui, en se liant au récepteur ERa, empêchent d'autres molécules de se fixer sur ce récepteur. Alternativement, des inhibiteurs de synthèse d'ERa agissant au niveau génomique sont connus de l'homme du métier. En particulier, dans le contexte de l'invention, il est possible d'utiliser un siRNA qui va cibler spécifiquement le gène codant pour ERa. Une fois transfectée dans la cellule, ce siRNA va se lier à l'ARN codant pour ERa et bloquer la traduction de cet ARN en récepteur fonctionnel. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les composés sélectionnés dans les procédés de criblage de l'invention sont utilisés en tant que médicament, 5 notamment pour protéger les vaisseaux sanguins. Les maladies cardio-vasculaires constituent un ensemble de troubles affectant le coeur et les vaisseaux sanguins, qui comprend les cardiopathies coronariennes (touchant les vaisseaux sanguins qui alimentent le muscle cardiaque), les maladies cérébro-vasculaires (touchant les vaisseaux sanguins qui alimentent le cerveau), les 10 artériopathies périphériques (touchant les vaisseaux sanguins qui alimentent les bras et les jambes), les cardiopathies rhumatismales, affectant le muscle et les valves cardiaques et résultant d'un rhumatisme articulaire aigu, causé par une bactérie streptocoque, les malformations cardiaques congénitales (malformations de la structure du coeur déjà présentes à la naissance), les thromboses veineuses profondes 15 et les embolies pulmonaires (obstruction des veines des jambes par un caillot sanguin, susceptible de se libérer et de migrer vers le coeur ou les poumons). Les infarctus et les accidents vasculaires cérébraux sont généralement des événements aigus et sont principalement dus au blocage d'une artère empêchant le sang de parvenir au coeur ou au cerveau. Leur cause la plus courante est la 20 constitution d'un dépôt gras sur les parois internes des vaisseaux sanguins alimentant ces organes. Les accidents vasculaires cérébraux peuvent aussi résulter du saignement d'un vaisseau sanguin cérébral ou de caillots. 25 De préférence, les composés sélectionnés par les procédés de l'invention induisent le relâchement endothélial, produisent le NO, protègent l'intégrité de l'endothélium, inhibent l'aggrégation des plaquettes ainsi que la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses. L'ensemble de ces effets contribue à la protection vasculaire notamment les phénomènes cellulaires menant à l'athérosclérose. Ils peuvent donc avoir des effets prophylactiques et/ou thérapeutiques, notamment sur l'une des maladies vasculaires et cardiovasculaires ci-dessus citées, et peuvent donc être avantageusement incorporés dans des compositions pharmaceutiques qui seront utilisées en particulier pour traiter l'une de ces maladies cardiovasculaires. Les compositions pharmaceutiques incluant les composés sélectionnés dans l'invention peuvent être formulées pour une administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale, destinée aux mammifères, y compris l'homme. Les compositions pharmaceutiques incluant les composés sélectionnés par les procédés de criblage de l'invention peuvent être administrées sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux ou aux êtres humains. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire et les formes d'administration rectale. L'homme du métier est à même d'identifier les excipients et ingrédients pharmaceutiquement acceptables à introduire, en plus des composés identifiés par les procédés de criblage de l'invention, dans les compositions pharmaceutiques en question. Par ailleurs, les composés sélectionnés dans les procédés de criblage de l'invention 25 comme activant le récepteur ERa pourraient être utilisés dans des compositions pharmaceutiques destinées à traiter les maladies impliquant ce récepteur. De plus, les composés sélectionnés dans les procédés de criblage de l'invention comme induisant la production de NO dans les cellules endothéliales peuvent être 22 utilisés dans des compositions pharmaceutiques destinées à traiter les maladies pour lesquelles la stimulation de la production de NO a un effet bénéfique, telles que : le cancer, l'ischémie cardiaque, l'athérosclérose et l'hypertension (Lagrue-Lak-Hal A., Arch. Mal. Coeur Vaiss. 2006 ; Curin et al., Curr. Med. Chem. Cardiovas. Hematol. Agents 2006; Perez Vizcaino et al., Free Radical Res. 2006 ; Martinez M.C., Antioxid. Redox Signal. 2009). Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne un composé de formule générale I telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il induit la production de NO dans les cellules endothéliales avec lesquelles il est mis en contact. De préférence, un tel composé active spécifiquement le récepteur ERa, et pas le récepteur ER(3, et peut être utilisé dans une composition pharmaceutique destinée à protéger les vaisseaux sanguins, notamment chez des patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Dans un dernier aspect, la présente invention concerne un composé de formule 15 générale I telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il active spécifiquement le récepteur ERa dans les cellules endothéliales avec lesquelles il est mis en contact. De préférence, un tel composé n'active pas le récepteur ER(3, et peut être utilisé dans une composition pharmaceutique destinée à protéger les vaisseaux sanguins, notamment chez des patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Exemples 25 Exemple 1 : ERa est la cible de la Delphinidine sur les cellules endothéliales, responsable de son effet sur la production de NO 20 23 1) Le relâchement vasculaire dé p endant de l'endothélium induit s ar l'extrait de polyphénols de vin rouge et par la delphinidine est associé à un mécanisme sensible à l'inhibiteur de la synthèse de NO. Des rats mâles Wistar de 12 semaines ont été sacrifiés. L'aorte thoracique des animaux a ensuite été prélevée et délicatement nettoyée de la graisse et du tissu conjonctif. L'aorte a ensuite été coupée en anneaux de 2 mm de longueur. Les anneaux ont été montés sur un myographe, dans des cuves contenant une solution saline physiologique PSS (composition en mM : NaCl, 119 ; KC1, 4,7 ; CaCl2, 1,25 ; MgSO4, 1,17 ; KH2PO4, 1,18 ; NaHCO3, 25 ; glucose, 11) maintenue à 37°C et continuellement oxygénée avec un mélange gazeux (composition : 95% 02 et 5% CO2). Une tension basale de repos a été appliquée à 2g. La tension a été mesurée par un transducteur de force isométrique. Après une période d'équilibre de 90 min, les vaisseaux ont été stimulés avec de la noradrénaline (1 µmoUL) afin de tester leur capacité contractile. Dans certaines expériences, l'endothélium a été enlevé en frottant doucement la surface de l'intima sur une aiguille. La présence d'un endothélium fonctionnel a été évaluée dans toutes les expériences en appréciant la capacité de l'acétylcholine (1µM) à induire un relâchement des anneaux supérieur à 50% des vaisseaux contractés comme décrit précédemment. Les vaisseaux étaient considérés comme dépourvus d'endothélium lorsqu'aucun relâchement n'était observé en présence d'acétylcholine. Les anneaux ont ensuite été rincés et, une fois retournés à leur tension basale, les anneaux dépourvus d'endothélium ont été précontractés avec de la noradrénaline (1 µmoUL). Une fois que la réponse contractile a atteint un plateau stable, le relâchement dépendant de l'endothélium en réponse aux différents composés a été évalué par ajout de concentrations cumulatives de delphinidine et d'un extrait de polyphénols de vin rouge contenant des acides phénoliques, des anthocyanes et des flavanols, dont environ 10mg/L de delphinidine) (10-5 à 10-1 g/L). L'implication du NO a été observée par l'utilisation de la L-arginine méthyl ester (un inhibiteur de la synthèse de NO, 300µM), ainsi que par enlèvement de l'endothélium. En présence d'un endothélium fonctionnel, l'extrait de polyphenols de vin rouge et la delphinidine sont tous deux capables d'induire un relâchement endothélium- dépendant dans les anneaux d'aortes de rats (cf. figure 1). Lorsque l'endothélium n'est plus présent, les deux composés ne sont plus capables d'induire de relâchement des anneaux d'aorte. Le relâchement dépendant de l'endothélium est complètement aboli après inhibition de la synthèse de NO en présence de la L-arginine méthyl ester (L-NAME). Ainsi, ces résultats démontrent que le relâchement induit par la delphinidine et l'extrait de polyphénols de vin rouge dépend de l'endothélium et est dû à un mécanisme sensible aux inhibiteurs de la production de NO. 2) La production de NO dépend de l'activation de ERa La détection du NO dans des systèmes vivants est réalisée par résonance 15 paramagnétique électronique. Cette technique a été précédemment décrite (Vanin AF, Stud. Biophys, 1984). Des cellules issues d'une lignée cellulaire endothéliale (EaHy 926) ont été mises en culture dans une plaque de 6 puits en absence ou en présence des molécules d'intérêt pendant 10 min (delphinidine, 10-2 g/L ; ProvinolsTM, 10-2 g/L ; PPT, 10-5 M ; 17-13- 20 estradiol, 10-5 M), puis elles ont été récoltées et mises en présence d'un capteur de spin pour le NO ; d'abord du diéthyl-dithio-carbamate (DETC, 5 mM), puis du sulfate de fer (FeSO4, 50 µM), cela en présence ou non d'un inhibiteur pharmacologique de ERa, le fulvestrant (30nM, 30 minutes avant la stimulation), ou d'un siRNA spécifiquement dirigé contre ERa (100nM). 25 L'implication d'ERa dans la production de NO est étudiée en utilisant soit l'antagoniste pharmacologique d'ERa, le fulvestrant ou un siRNA dirigé contre ERa. Dans le but d'inhiber la synthèse d'ERa, des duplexes siRNA spécifiques pour ERa et non spécifiques (contrôle) ont été obtenus chez Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, respectivement sc-29305 et sc-8005)). La transfection transitoire des cellules endothéliales EaHy 926 a été réalisée selon le protocole fourni par le revendeur de siRNA et précédemment décrit (Agouni A, et al., FASEB J, 2007). Les cellules ont été mises en culture dans une plaque de 6 puits pendant 24 heures. Une fois les cellules à 60% de confluence, elles ont été transfectées transitoirement soit avec le siRNA spécifique d'ERa (100 nM), soit avec le siRNA contrôle (100nM), en présence du réactif de transfection fourni par le revendeur, qui sert aussi de contrôle sans siRNA. Le milieu de culture a été remplacé 24 heures plus tard avec du milieu de culture frais et les cellules ont été cultivées pendant encore 24 heures avant d'être stimulées par les molécules d'intérêt. L'extinction d'ERa par le siRNA a été quantifiée par Western Blot et RT-PCR à environ 80%. Par ailleurs, lorsqu'il est utilisé pour bloquer ERa, le fulvestrant (30 nM) est incubé avec les cellules 30 min avant la stimulation par les molécules d'intérêt. Les résultats de la figure 2 indiquent clairement que la delphinidine et le ProvinolsTM sont tous deux capables d'induire de façon significative une production de NO dans les cellules endothéliales EaHy 926. Par ailleurs, cette production est complètement bloquée lorsque l'on utilise soit le 20 fulvestrant, soit un siRNA dirigé spécifiquement contre ERa (cf. figure 2). La production endothéliale de NO induite par la delphinidine ainsi que par le ProvinolsTM implique donc ERa. 25 3) La production de NO est consécutive à l'élévation de la teneur en Cal+ dans le cytosol 26 L'augmentation de la concentration calcique intracellulaire est nécessaire pour induire une production de NO (l'enzyme responsable de la production de NO, eNOS, nécessite en effet une augmentation du calcium intracellulaire). C'est pourquoi la mesure de l'élévation du taux de calcium intracellulaire est un premier indice de la production ultérieure de NO. Les cellules endothéliales d'aortes de boeuf ont été mises en contact avec une sonde (Fura-2 AM) pendant 45 minutes à 37°C dans du milieu de culture, puis lavées et placées dans du PSS avec 20 mM d'HEPES. Pour les mesures sans Calcium, celui-ci n'était pas présent dans le PSS et 0.5 µmM d'EGTA était ajouté au milieu 10 min avant la mesure. Afin d'évaluer le relargage de Calcium à partir des stocks intracellulaires, les cellules ont été prétraitées avec de la ryanodine (Ry, 301.tM) qui agit sur les canaux RAC (release activated channels), et de la bradykinine (BK, 0.1 µM) ou de la thapsigargine (TG, 1 µM) qui affecte les stocks de calcium du réticulum endoplasmique par un mécanisme faisant intervenir les pompes Calcium-ATPases générées et inhibées par l'IP3 respectivement. Le U73122 (3 µM) et la néomycine (3 mM), qui sont des inhibiteurs de la phospholipase C et du turnover des phospholipides (Yule DI & Williams JA, J. Biol. Chem 1992; Lee H.Z. et Wu C.H., Eur. J. Pharmacol. 1999) ont été préincubés pendant 1h et 10 minutes, respectivement, avant la stimulation avec le ProvinolsTM(10-2 g/L) et la delphinidine (10-2 g/L). De l'herbimycine A (1 µM), un inhibiteur des tyrosine kinases et de la phosphorylation des protéines sur la tyrosine en réponse a de nombreux stimuli dans les cellules endothéliales (Kruse H.J. et al., Biochem Biophys Res. Commun. 1994; CohenAW et al., Am J. Physiol, 1999) a été préincubée pendant 1 heure avant la stimulation avec les polyphénols. L'implication des protéines G a été étudiée après 3 heures d'incubation avec de la toxine de B. pertussis (PTX, 1 µg/ml) ou de la toxine de V. choiera (CTX, 1 µg/ml). Les cellules ont été stimulées par injection de polyphénols dans le bain en utilisant, directement sur les cellules, une pipette standard. Le système de perfusion n'a pas été utilisé pour éviter les oscillations spontanées de calcium associées aux forces de cisaillement. Cette méthode est similaire à celles utilisées en spectrofluorométrie pour des cellules non adhérentes. Aucune modification de la concentration calcique intracellulaire n'a été observée quand le solvant a été utilisé seul. L'imagerie calcique digitale a été réalisée à 37°C dans des puits simples et visualisée à l'aide d'un objectif (x20) UV-fluor (n.a. 0.75) sur un microscope inversé (Nikon Diaphot, Tokyo, Japan). La fluorescence a été mesurée à la longueur d'onde 510120 nm en utilisant un appareil photo prise par un Darkstar-800 CCD amplifié (Photonics, Milham, U.K.). Les images ratiométriques de calcium ont été générées à de courts intervalles en utilisant 4 images représentatives à chaque longueur d'onde (340110 and 380110 nm) et analysées avec le logiciel IMSTAR. Pour chaque cellule, la concentration calcique intracellulaire a été moyennée à partir des pixels présents à l'intérieur des aires cellulaires. Selon la méthode de Grynkiewicz et al, (J. Biol. Chem 1985) la concentration calcique a été calibrée in vitro: [Ca2+]; (Kd)((3)[RûRmin]/[Rmax R]. Kd représente la constante de dissociation du complexe Ca2+-fura-2 (244 nM). R est le ratio de la fluorescence due à l'excitation à 340 et à 380 nm. Rm;n et Rmax sont les ratios mesurés comme décrit précédemment (Lynch et al., J. Biol. Chem 1994), après ajout de 10 µM d'un ionophore calcique, la ionomycine,dans une solution sans calcium (IOmM EGTA) ou dans une solution contenant du calcium (10 mM) respectivement. B est le ratio des signaux à 380 nm dans une solution dépourvue, ou non de calcium. Les valeurs de Rmi,,, Rmax and f3 ont été calculées et les résultats sont exprimés en terme de concentration calcique intracellulaire, en nM. La concentration basale de calcium intracellulaire mesurée dans les cellules non stimulées aux ProvinolsTM ou à la delphinidine, est de 219±10nM. En moyenne, sur 882-967 cellules de 21-24 expériences analysées, 75-97% des cellules ont répondu à la stimulation par le ProvinolsTM ou la delphinidine (comme sur la figure 3), que ce soit sous la forme d'une réponse transitoire (colonne de gauche, 34 ± 6% pour les cellules stimulées au ProvinolsTM , et 25 ± 5% pour les cellules stimulées avec la Delphinidine), d'oscillations (colonne centrale, 31 ± 5% pour les cellules stimulées au ProvinolsTM , et 37 ± 5% pour les cellules stimulées 28 avec la Delphinidine) ou des réponses biphasiques (colonne de droite, 35 ± 6% pour les cellules stimulées au ProvinolsTM , et 38 ± 7% pour les cellules stimulées avec la Delphinidine). Ces résultats indiquent donc que la delphinidine et le ProvinolsTM sont capables d'induire une augmentation de la concentration calcique intracellulaire, précédant la production de NO. Exemple 2 : Interaction directe entre la Delphinidine et ERa Le test de liaison a été réalisé de la façon suivante : le récepteur purifié (13nM) a été mélangé avec 1nM d'estrogène marqué avec de la fluorescéine (FluormoneTM ES2). Le mélange a été incubé pendant 2 heures à température ambiante en présence ou non de delphinidine, et ce dans un tampon (composition : 100 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,4), 10 µg/ml gamma globuline bovine et 0,02% NaN3). Les liaisons non spécifiques ont été déterminées en présence de 17-13-estradiol (10 µM). Après l'incubation, la fluorescence polarisée a été mesurée (?excitation = 485 nm, a ,émission = 535 nm) à l'aide d'un lecteur de plaque (Ultra, Tecan). Les résultats ont été exprimés en pourcentage d'inhibition de la liaison spécifique du Fluormone contrôle. Le bruit de fond dû à l'autofluorescence du composé a été mesuré dans le tampon, aux mêmes longueurs d'ondes, avant l'ajout du complexe Fluormone/récepteur. Le composé de référence est le 17-(3-estradiol, qui est testé dans chaque condition à différentes concentrations afin de déterminer une courbe de compétition, qui permet de déterminer l'IC50. Les résultats montrent que la delphinidine est capable de déplacer 73% des liaisons spécifiques entre ERa et le 17-13-estradiol. Ainsi, la delphinidine se lie bien de façon spécifique à ERa. Plus concrètement, cela montre qu'il existe une interaction directe entre la delphinidine et ERa. Exemple 3 : Exemple d'un procédé selon l'invention Un exemple de criblage selon l'invention est présenté ci-dessous. Le but de ce test est de savoir si deux dérivés de la delphinidine, la cyanidine (nombre CAS 6294-83-3) et la malvidine (nombre CAS 7228-78-6), sont capables d'induire la production de monoxyde d'azote dans les cellules endothéliales avec lesquelles ils sont mis en contact. Un premier exemple de test pour mesurer les propriétés de la malvidine et de la cyanidine consiste à mesurer le relâchement dépendant de l'endothélium des anneaux d'aorte (cf. exemple 1) à différentes concentrations du composé, allant de 10-5 à 3.10-2 g/L. Ceci peut permettre dans un premier temps d'estimer la concentration qui entraine le relâchement maximal des anneaux d'aorte. Cette concentration du composé peut ensuite être utilisée dans les autres tests (production de NO et de calcium intracellulaire). Test de production de NO : Les conditions expérimentales sont celles évoquées précédemment pour la détection du NO dans des systèmes vivants par résonance paramagnétique électronique (qui est, à l'heure actuelle, la méthode la plus spécifique permettant de mesurer l'espèce NO dans des systèmes vivants). D'autres techniques classiques de détection de NO peuvent évidemment être utilisées si l'homme du métier considère que la technique de résonance paramagnétique électronique est trop complexe ou trop couteuse. Brièvement, les cellules endothéliales issues d'une lignées cellulaires endothéliales, par exemple EaHy 926, sont mises en culture dans une plaque de 6 puits en absence ou en présence des molécules d'intérêt pendant 10 min (delphinidine, 10-2 g/L ; cyanidine, 10-2 g/L ; malvidine, 10-2 g/L ; PPT, 10-5 M ; 17-(3-estradiol, 10-5 M), puis elles sont récoltées et mises en présence d'un capteur de spin pour le NO (d'abord du diéthyl-dithio-carbamate (DETC, 5 mM), puis du sulfate de fer (FeSO4, 50 µM) cela en présence ou non d'un inhibiteur pharmacologique de ERa, le fulvestrant (30nM, 30 minutes avant la stimulation), ou d'un siRNA spécifiquement dirigé contre ERa (100nM). Si la malvidine et/ou la cyanidine sont capables d'induire la production de NO dans les cellules endothéliales, alors il est préférable de vérifier l'implication d'ERa dans la production de NO. Ceci est réalisé en utilisant soit un antagoniste pharmacologique d'ERa, comme le fulvestrant, soit un siRNA dirigé contre ERa. Les composés qui ne seront pas capables d'induire la production de NO dans les cellules endothéliales dans lesquelles les récepteurs ERa sont bloqués ou ne sont pas traduits, seront très intéressants à considérer dans le cadre des études pharmacologiques visant à sélectionner des composés actifs dans le traitement des maladies vasculaires sans effets secondaires. Mesure de la concentration du calcium intracellulaire De manière alternative, l'activité des récepteurs ERa peut être estimée par la mesure de la concentration calcique intracellulaire (comme décrit ci-dessus dans l'exemple 1). Si la malvidine et/ou la cyanidine sont capables d'induire l'augmentation de la quantité de calcium intracellulaire dans les cellules endothéliales, alors il est préférable de vérifier si le récepteur ERa est impliqué. Ceci est réalisé en utilisant soit un antagoniste pharmacologique d'ERa, comme le fulvestrant, soit un siRNA dirigé contre ERa. Si la malvidine et/ou la cyanidine sont effectivement capables d'induire l'augmentation de la quantité de calcium intracellulaire dans les cellules endothéliales dans lesquelles les récepteurs ERa sont bloqués ou ne sont pas traduits, ils sont intéressants à considérer dans le cadre des études pharmacologiques visant à sélectionner des composés actifs dans le traitement des maladies vasculaires sans effets secondaires. Avantageusement, des tests de mesure de la spécificité de la liaison avec ERa, comme celui décrit dans l'exemple 2, peuvent être réalisés afin de confirmer la 5 spécificité de la malvidine et/ou de la cyanidine sur ce récepteur. 32 Références bibliographiques Andriambeloson E et al, JNutr. 1998 Dec;128(12):2324-33 Andriambeloson E. et al., Br J Pharmacol. 1997 Mar;120(6): 1053-8. Billon-Gallès A. et al, Froc Natl Acad Sci USA. 2009 Feb 10;106(6):2053-8. Bolego C, JPharmacol Exp Ther. 2005 Jun;313(3):1203-8.. Caulin-Glaser et al, Circ Res. 1997 Nov;81(5):885-92. Cohen AW et al. Am. J. Physiol., 1999, 277,112038-H2049 Curin et al., Curr. Med. Chem. Cardiovas. Hematol. Agents 2006, 4:277-288; 10 Darblade B, Circ Res. 2002 Mar 8;90(4):413-9. Grynkiewicz et al. (1985) J Biol Chem. 1985 Mar 25;260(6):3440-50 Hall et al. 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Biophys, 1984 Yule DI et Williams JA, J. Biol. Chem 1992. 267, 13830-13835 Revendications1. Procédé in vitro de criblage et de sélection de composés chimiques dérivés de la delphinidine activant le récepteur aux oestrogènes ERa, comprenant au moins les étapes : a) obtenir au moins un composé de formule générale I suivante: (I) dans laquelle : R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rlo, R11 sont choisis indépendamment les uns des autres dans le groupe constitué par : l'hydrogène, les atomes d'halogène, en particulier le fluor, le brome, ou l'iode, les groupements hydroxy, amino, nitroso, nitro, cyano, ou azonium, les groupements (CI-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2-C6)alcynyle, (C1-C6)halogénoalkyle, (C1-C6)alcoxy, (C1-C6)thioalcoxy, (C1-C6)halogénoalcoxy, di((C1-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle, et X est un hétéroatome choisi dans le groupe constitué par : l'oxygène, l'azote ou le soufre, éventuellement chargé et éventuellement substitué par un groupement (CI-C6)alkyle, (C2-C6)alcényle, (C2-C6)alcynyle, (CI-C6)halogénoalkyle, (CI-C6)alcoxy, (CI-C6)thioalcoxy, (CIC6)halogénoalcoxy, di((CI-C6)alkyl)amino, ou alkylcarbonyle. b) tester si ledit composé active le récepteur aux oestrogènes ERa, c) sélectionner ledit composé s'il active le récepteur aux oestrogènes ERa. 2953528 Nos ref : 245109 ù D28209 GFA CABINET REGIMBEAU 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit composé sélectionné induit la production de monoxyde d'azote (NO) dans les cellules endothéliales avec lesquelles il est mis en contact. 3. Procédé in vitro de criblage et de sélection de composés chimiques dérivés de la delphinidine induisant la production de monoxyde d'azote (NO) dans les cellules endothéliales, comprenant au moins les étapes : a) obtenir au moins un composé de formule générale (I) telle que définie dans la revendication 1, b) tester si ledit composé induit la production de monoxyde d'azote dans les cellules endothéliales avec lesquelles il est mis en contact, c) sélectionner ledit composé s'il induit la production de monoxyde d'azote dans les cellules endothéliales avec lesquelles il est mis en contact. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit composé sélectionné active le récepteur aux oestrogènes ERa, de préférence le site activateur AF2 de ERa. 5. Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit composé sélectionné est dépourvu d'effet sur le récepteur aux oestrogènes ERJ3. 6. Procédé selon les revendications 1 à 5, caractérisé par l'absence de production de monoxyde d'azote dans des cellules endothéliales dans lesquelles le récepteur aux oestrogènes ERa est inactivé, lorsqu' elles sont mises en contact avec ledit composé sélectionné. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le récepteur aux oestrogènes ERa est inactivé dans les cellules endothéliales de manière pharmacologique ou génétique. 8. Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit composé sélectionné induit le relâchement endothélial. 9. Procédé selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit composé sélectionné a des effets prophylactiques et/ou thérapeutiques, notamment sur les maladies vasculaires. 2953528 Nos ref : 245109 ù D28209 GFA CABINET REGIMBEAU 10. Utilisation d'un composé de formule générale (I) telle que définie dans la revendication 1, dans un procédé de criblage in vitro pour identifier au moins un composé induisant la production de monoxyde d'azote (NO) dans les cellules endothéliales. 11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit composé identifié dans le procédé de criblage active le récepteur aux oestrogènes ERa, de préférence le site activateur AF2 de ERa. 12. Utilisation d'un composé de formule générale (I) telle que définie dans la revendication 1, dans un procédé de criblage in vitro pour identifier au moins un composé activant le récepteur aux oestrogènes ERa. 13. Utilisation selon les revendications 10 à 12, caractérisée en ce que ledit composé identifié dans le procédé de criblage est dépourvu d'effet sur le récepteur aux oestrogènes ER(3. 14. Utilisation selon les revendications 10 à 13, caractérisée en ce que ledit composé identifié dans le procédé de criblage est un médicament, destiné notamment à protéger les vaisseaux sanguins.