Brevet FR2948998A1 — publié le 20110211

PROCEDE DE TRAITEMENT D'UNE PREPARATION CYTOLOGIQUE OU HISTOLOGIQUE La présente invention se rapporte à un procédé de traitement d'une préparation cytologique ou histologique. Un examen cytologique permet notamment de rechercher des cellules anormales, cancéreuses ou précancéreuses, contenues dans des prélèvements d'origine variée: col utérin, corps utérin, expectoration, lavage bronchique et alvéolaire, aspiration bronchique, ponction d'organe à l'aiguille, urines, liquide pleural ou péritonéal. L'examen cytologique le plus fréquent est le frottis du col utérin. De façon connue, les analyses cytologiques consistent à prélever, sur le corps humain ou dans une cavité de celui-ci, un échantillon contenant des cellules, un tel prélèvement étant par exemple pratiqué au niveau du col de l'utérus, puis à effectuer une ou plusieurs étapes dans le but final d'obtenir une préparation ne contenant que les cellules devant être analysées. Cette préparation cytologique doit ensuite être déposée sur une lame de verre pour former une concentration des cellules obtenue par frottis, empreinte, cytospine ou couche mince, ladite lame étant ensuite traitée par des réactifs pour obtenir une préparation microscopique qui pourra être lue par un médecin cytologiste. L'histologie est la branche de la biologie qui étudie les tissus, à mi-chemin entre la cytologie et l'anatomie. Elle a pour but d'explorer la composition, la structure, le renouvellement des tissus, ainsi que les échanges cellulaires en leur sein. Les techniques d'analyse par coloration citées plus haut dans le cas des prélèvements cytologiques sont également utilisées pour l'analyse de prélèvements histologiques. Un premier procédé connu de coloration pour les techniques d'analyse de prélèvements cytologiques ou histologiques, consiste à réaliser manuellement un certain nombre d'opérations. La coloration est effectuée à l'aide un bac contenant un réactif. On place dans un panier les lames sur lesquelles sont déposées les matières biologiques à analyser. Le panier est ensuite trempé dans le réactif du bac. Le réactif recouvre la matière biologique présente sur les lames et certaines parties de ladite matière biologique se colorent par affinité de réaction chimique ou physique. Après la coloration engendrée par la mise en contact entre le réactif et le prélèvement, la lame est rincée au moins une fois afin d'éliminer l'excès de réactif, puis séchée avant d'être analysée avec un microscope. Dans le cas de l'hémalun, certaines parties de l'hémalun vont se fixer par affinité sur le noyau d'une cellule, le rinçage permet alors d'enlever les parties de l'hémalun présentes autour du noyau. Entre chaque étape de mise en contact du prélèvement avec un réactif coloré, des actions de rinçage, des temps de pose et parfois d'autres réactions chimiques ou physiques sont le plus souvent nécessaires. L'avantage de ce système est que le bac peut contenir plusieurs paniers plongés dans le même réactif, en même temps. Ce type de procédés manuels présente cependant de nombreux inconvénients. Un premier inconvénient réside dans le risque de contamination des réactifs. Par exemple, des cellules se décrochent d'une préparation mal fixée, tombent dans le bac de réactif et contaminent ainsi les lames suivantes. Cette contamination fausse alors toutes les analyses, engendrant alors une usure prématurée des réactifs et une importante perte de temps. En outre, ces procédés manuels d'analyse sont assez longs à mettre en oeuvre et des erreurs liées aux opérations de manipulation des paniers sont possibles. Une solution connue aux problèmes mentionnés ci-dessus consiste à utiliser des automates de coloration. Une telle solution permet de mettre automatiquement des paniers, contenant des lames avec de la matière biologique, dans des bacs de réactifs. Un bras robotisé déplace le panier de lames avec précision dans l'automate de coloration conformément à un protocole prédéfini. Le traitement simultané d'une pluralité de paniers et de différents programmes est alors possible. L'automate peut également comporter des moyens de séchage et de chauffage des lames. L'automate de coloration permet ainsi d'obtenir une coloration plus rapide et de réduire les risques d'erreurs. Une telle solution présente toutefois également certains inconvénients. Ainsi, l'utilisation de bacs entraîne la présence d'une grande quantité de réactif alors qu'une faible quantité de ce même réactif sera effectivement utilisé pour la coloration, cette surconsommation de réactif induisant de fait un surcoût non négligeable. Ces volumes importants de réactif sont par ailleurs susceptibles d'engendrer des rejets polluants non souhaitables. En outre, une coupe histologique sur cryostat possède typiquement une épaisseur de 3 à 6 �m. En préparation microscopique, vue de dessus, une telle coupe paraît sensiblement plane alors qu'elle est en réalité composée de vallées et de crevasses. Dès lors, l'utilisation de bacs à simple immersion ne permet pas nécessairement de toucher tous les endroits du relief lors du premier passage dans le bac. Même si les phénomènes de reliefs sont moins importants en cytologie, notamment pour les liquides simples (sang ou liquide céphalo-rachidien LCR par exemple), la présence de fibrine ou de mucosités peut également induire des reliefs pour d'autres types de liquide. Dans ce contexte, la présente invention vise à fournir un procédé rapide et efficace de traitement d'une préparation cytologique ou histologique permettant de réduire sensiblement la quantité de réactif utilisé et de rejet polluant, d'atteindre une meilleure qualité de pénétration au sein des prélèvements et d'assurer une diminution des risques d'erreurs et de contamination. A cette fin, l'invention propose un procédé de traitement d'une préparation cytologique ou histologique, ledit procédé comportant une étape de dépôt d'au moins une goutte d'un réactif apte à entraîner une réaction telle qu'une coloration lors de sa mise en contact avec ladite préparation, le dépôt de ladite goutte étant réalisé au moyen d'une tête de nébulisation comportant un élément piézoélectrique, la tête expulsant ladite goute sous l'effet de la déformation dudit élément piézoélectrique. Grâce à l'invention, on utilise la technologie dite de � la goutte à la demande � (DOD ou � Drop On Demand � en anglais) par piézoélectrique pour l'appliquer à l'analyse de lames de cytologie ou d'histologie. Cette technologie de nébulisation est particulièrement adaptée à ce type d'analyse cytologique ou histologique contrairement à d'autres technologies de nébulisation telles que la technique par injection thermique qui consiste à faire chauffer le produit à expulser sous pression et qui présente deux inconvénients majeurs : la nécessité de faire chauffer le produit à expulser est incompatible avec les réactifs utilisés en analyses histologiques ou cytologiques et le fait que la taille des gouttes expulsées est fixe. Au contraire, la technologie DOD par piézoélectrique ne nécessite aucun chauffage et permet, selon l'intensité du signal électrique envoyé au élément piézoélectrique, d'obtenir des tailles de gouttes différentes. L'intérêt de la nébulisation des réactifs est de toucher tous les endroits d'un relief au premier passage, ce qui permet un gain de temps en comparaison du contact coupe-réactif par simple immersion. La tension superficielle des réactifs, ainsi que les charges électrostatiques cellule/lame/réactif sont réduites au maximum, ce qui permet une qualité de pénétration particulièrement efficace. Le procédé selon l'invention pourrait même réduire le freinage de la pénétration des réactifs au sein des cellules du aux substances lipidiques. Ce procédé peut très facilement être automatisé au sein d'un automate intégrant des systèmes de rinçage, de chauffage et/ou de contrôle de paramètres physiques (chaleur, temps). Enfin, le fait d'utiliser des gouttes de réactifs permet une économie substantielle de réactifs et une diminution importante des éventuels rejets 30 polluants. Le procédé selon l'invention peut également présenter une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessous, considérées individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles Avantageusement, les réactifs sont aptes à réaliser une coloration sur certaines parties du prélèvement ; La présente invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention comportant - un carrousel comportant au moins un emplacement apte à recevoir une lame apte à recevoir une préparation cytologique ou histologique, ledit carrousel étant monté rotatif autour d'un axe de rotation ; - une tête de nébulisation passant au-dessus dudit carrousel, comportant ledit élément piézoélectrique et un volume dudit réactif de sorte que ladite tête de nébulisation expulse au moins une goutte de réactif sous l'effet de la déformation dudit élément piézoélectrique. Le dispositif selon l'invention peut également présenter une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessous, considérées individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles - ledit volume dudit réactif est intégré dans une cartouche ; - le dispositif selon l'invention comporte une pluralité de cartouches aptes à contenir différents réactifs ; - le dispositif selon l'invention comporte : - des moyens de rinçage aptes à rincer la lame passant à proximité desdits moyens de rinçage ; - des moyens de séchage aptes à sécher la lame passant à proximité desdits moyens de rinçage ; - les moyens de rinçage comportent des moyens pour sélectionner des produits de rinçage et/ou des réactifs non nébulisables ; - le dispositif selon l'invention comporte un positionneur pour le repérage des lames placées sur le carrousel ; - le carrousel comporte des moyens de chauffage positionnés sous ledit au moins un emplacement de la lame ; - Le dispositif selon l'invention comporte : o des moyens d'identification aptes à identifier chaque lame, chaque lame étant équipée d'un identifiant ; o des moyens d'obtention d'une traçabilité du ou des réactifs auxquels chacune des lames a été soumise. L'invention et ses différentes applications seront mieux comprises à la lecture de la description qui suit et à l'examen des figures qui l'accompagnent. Celles-ci ne sont présentées qu'à titre indicatif et nullement limitatif de l'invention. Les figures montrent : - à la figure 1, une représentation d'un schéma de principe d'une tête de nébulisation avec un élément piézoélectrique intervenant dans le procédé selon l'invention ; - à la figure 2, une représentation schématique d'un exemple de dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention ; - à la figure 3, une illustration des différentes étapes du procédé selon l'invention. Dans toutes les figures, les éléments communs portent les mêmes numéros de référence. Dans la suite de la description, on entendra par préparation, soit des préparations cytologiques, soit des préparations histologiques, qui sont par exemple : - soit des coupes de tissus (fixées ou fraiches) ; - soit des étalements (frottis ou spot de cellules issu d'un liquide de ponction, cytoponction ou d'écoulement naturel). La figure 1 représente un schéma de principe d'une tête de nébulisation 100 avec un élément piézoélectrique 120 intervenant dans le procédé selon l'invention. La tête de nébulisation 100 comporte les éléments suivants : - une cartouche 110, contenant un réactif ; - une cuve 121, permettant l'arrivée du réactif provenant de la cartouche 110 ; - un élément piézoélectrique 120 tel qu'un cristal piézoélectrique ; - une pluralité de buses (dits également injecteurs) 122 (ici trois buses sont représentées mais il suffit d'avoir au moins une buse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention). Une lame 400, sur laquelle est déposée une préparation 401, se situe en-dessous des buses 122. La cartouche 110 contient un réactif apte à entraîner une réaction telle qu'une coloration lors de sa mise en contact avec la préparation 401. Chaque tête de nébulisation 100 comporte une unique cartouche 110. La cuve 121 permet de guider le réactif provenant de la cartouche 110, jusqu'aux buses 122. Le cristal piézoélectrique 120 est électrisé via un champ électrique appliqué par des moyens de commande électrique non représentés et est ensuite défléchi. Cette déflexion crée une pression qui provoque l'éjection du réactif au travers des buses 122. Les buses 122 forment des gouttes de réactif parfaitement rondes qui sont ensuite expulsées sous l'effet de la déformation du cristal piézoélectrique 120 lorsque ce dernier est soumis à un champ électrique. On notera que la taille des gouttes est fixée en fonction de l'intensité du champ électrique appliqué. Chaque cartouche 110 contient un type de réactif, ladite cartouche 110 étant à usage unique. Selon un autre mode de réalisation, les réactifs peuvent être contenus dans des réservoirs auxiliaires permettant la recharge automatique des cartouches sans avoir à les manipuler. La figure 2 représente schématiquement un exemple d'un dispositif 500 pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Le dispositif 500 est un automate comportant les éléments suivants : - un carrousel 300 comportant un axe de rotation 304 ; - une pluralité d'emplacements 302 aptes à recevoir une lame 400 (au moins un emplacement est nécessaire) ; - un positionneur 301 ; - un pousse-lame 310, - des capteurs d'entrée 311E et de sortie 311S ; - un convoyeur 312 ; - des moyens de rinçage 320 utilisant des produits 321 de rinçage et/ou des réactifs non nébulisables ; - des moyens de séchage 330 ; - une tête de nébulisation 100 telle que celle décrite en référence à la figure 1 pour chaque réactif. La lame 400 sur laquelle a été déposée la préparation 401 est insérée dans un panier, non représenté. Le panier contenant au moins une lame 400 est ensuite placé en entrée E du dispositif 500. Le pousse-lame 310 pousse la lame 400 sélectionnée dans le panier, vers les capteurs d'entrée 311E. Les capteurs d'entrée 311E servent de guide pour accompagner la lame 400 sur l'emplacement 302 du carrousel 300. L'emplacement 302 est alors identifié par un numéro (de 1 à 20) par rapport au positionneur 301 permettant de repérer les lames 400 sur le carrousel 300 (la lame est ici placée sur l'emplacement 302 en position 6). De plus, chaque lame 400 est identifiée par un numéro ou un code barre unique. L'identifiant permet par exemple de connaître le type de prélèvement 401 collé sur la lame 400, le nom du patient et le type d'examen auquel est soumis le prélèvement 401. L'automate 500 comporte dans ce cas des moyens d'identification permettant d'obtenir une traçabilité des réactifs auxquels la lame 400 a été soumise pendant l'analyse ainsi que des informations relatives au patient. Ces moyens sont typiquement des moyens logiciels mis en oeuvre par ordinateur. Lorsque la lame 400 est positionnée sur son emplacement 302, la tête de nébulisation 100 comportant la cartouche 110 et le réactif choisi, passe au-dessus de la lame 400, et par excitation électrique entraînant le déplacement du cristal piézoélectrique 120, dépose au moins une goutte de réactif sur la préparation 401. Pour ce faire, la tête 100 se déplace en translation au-dessus du carrousel 300. Le carrousel 300 tourne dans un sens horaire ou antihoraire, autour de l'axe de rotation 304. La rotation du carrousel 300 permet de laisser un temps d'attente avant une étape de rinçage (un exemple de procédé comportant une telle étape 207 sera décrit en référence à la figure 3). Les moyens de rinçage 320 comportent des moyens pour sélectionner des produits 321. Les produits 321 sont soit des produits de rinçage comme par exemple, de l'alcool à 70, 95 ou 100°C, de l'eau acétifiée, ou de l'eau ; soit des réactifs comme par exemple du carbonate de lithium, de l'alcool ammoniacal ou une solution acide. Les réactifs présents dans les moyens de rinçages 320 sont des réactifs non nébulisables (i.e. ils comportent des éléments solides susceptibles d'obstruer les buses de la tête de nébulisation). Les produits 321 sont aspirés par une pompe volumétrique (Quatre pompes P1 à P4 sont ici représentées) avant d'être déposés sur la préparation 401. Afin d'éviter que les produits 321 se mélangent et créent une réaction chimique pouvant entrainer l'obstruction des ouvertures de la pompe volumétrique, les moyens de rinçage 320 comportent une pompe unique pour chaque produits 321. La pompe volumétrique contient entre 5 et 10 millilitres de produit de rinçage et environ 2 millilitres pour un réactif. Le rinçage de la lame 400 est effectué sans pression afin de ne pas décoller la préparation 401. Une nouvelle rotation du carrousel 300 permet de placer la lame 400 à proximité des moyens de séchage 330. Les moyens de séchage 330 sont par exemple un séchage à l'air. Le carrousel 300 tourne à nouveau afin que la lame 400 soit placée face à la sortie S dudit carrousel 300. La lame 400 est poussée par le pousse-lame 310, insérant ladite lame 400 dans le panier et faisant passer ledit panier devant les capteurs de sortie 311S. Le panier sort ainsi de l'automate 500 par le convoyeur 312 de sortie permettant à l'utilisateur de récupérer la lame 400. L'enceinte de l'automate 500 comporte un filtre non représenté afin de filtrer l'air contenu dans l'automate 500 et de ne pas perturber les analyses des préparations 401. Le filtre est notamment en charbon actif. Le charbon actif piège les solvants actifs, l'alcool, les produits chimiques, et permet ainsi de protéger les utilisateurs des odeurs dégagées pas les réactifs. Selon un autre mode de réalisation, le dispositif 500 comporte des moyens chauffant 303 placés sous les emplacements 302 pour l'analyse de certaines préparations 401, par exemple lors de l'utilisation de nitrate d'argent. La figure 3 illustre les différentes étapes du procédé selon l'invention. Les différentes étapes du procédé ont un ordre spécifique en fonction des techniques utilisées. A titre purement illustratif, un ordre d'étapes est décrit dans ce qui suit afin de mieux comprendre le procédé. Le procédé de traitement d'une préparation 401 comporte les étapes suivantes : - Dans une étape 200, dite de mise en place d'une préparation sur une lame 400, la préparation 401 est déposée sur la lame 400, puis ladite lame 400 est placée dans un panier situé à l'entrée E d'un automate tel que le dispositif 500 décrit en référence à la figure 2 ; - Dans une étape 201, dite de mise en marche de l'automate, l'opérateur lance l'automate 500 ; - Dans une étape 202, dite de pousse-lame, la lame 400, placée dans le panier situé à l'entrée E de l'automate 500, est poussée par le pousse-lame 310 afin d'entrer dans ledit automate 500 ; - Dans une étape 203, dite de détection de la lame, les capteurs 311E placés à l'entrée E de l'automate 500, après le pousse-lame 310, détectent l'arrivée de la lame 400 ; de plus, les capteurs 311E servent de guide pour la lame 400 ; - Dans une étape 204, dite de positionnement de la lame, après la détection de la lame 400, ladite lame 400 est alors positionnée sur un emplacement 302 du carrousel 300 ; - Dans une étape 205, dite de dépôt de réactif, une fois la lame 400 à son emplacement 302, un passage de la tête de nébulisation 100 au-dessus de la lame 400 dépose au moins une goutte de réactif sur la préparation 401 par excitation électrique de l'élément piézoélectrique 120 ; - Dans une étape 206, dite de temps d'attente, après le dépôt de réactif, on laisse un temps d'attente préalablement déterminé et nécessaire pour l'établissement de la réaction de coloration ; - Dans une étape 207, dite de rinçage, la préparation 401 ainsi colorée est alors placée devant le moyen de rinçage 320 comportant des moyens de sélection des produits 321 ; - Dans une étape 208, dite de temps d'attente, un temps d'attente préalablement déterminé est à respecter entre les deux étapes 207 et 209 du procédé ; - Dans une étape 209, dite de séchage, la préparation 401 ainsi rincée est alors placée devant le moyen de séchage 330, notamment à l'air ; - Dans une étape 210, dite de temps d'attente, un temps d'attente préalablement déterminé est à respecter entre les deux étapes 209 et 211 du procédé ; - Dans une étape 211, dite de rinçage final, la préparation 401 est placée une dernière fois devant le moyen de rinçage 320 avant d'être analysée ; - Dans une étape 212, dite de pousse-lame, la lame 400 placée sur l'emplacement 302 du carrousel 300 est poussée par le pousse-lame 310 afin de sortir de dudit emplacement 302 ; - Dans une étape 213, dite de détection de la lame, les capteurs 311S placés à la sortie S de l'automate 500, après le pousse-lame 310, détectent la sortie de la lame 400 et guident la lame 400 dans le panier ; - Dans une étape 214, dite de convoyeur de sortie, la lame 400 sortant de l'automate 500 est alors placée sur le convoyeur 312 permettant de sortir entièrement ladite lame 400 dudit automate 500 ; - Dans une étape 215, dite d'émission de signal sonore, la lame 400 sortant de l'automate 500 est alors signalée à l'opérateur par un signal tel qu'un signal sonore ou visuel. Des étapes supplémentaires peuvent venir compléter le procédé selon l'invention, par exemple : - une étape de nettoyage de la tête de nébulisation 100 permet, à la fin de l'utilisation de l'automate 500, d'éviter que les résidus de réactifs obstruent les buses 122 ; - une étape d'évacuation des excès de réactifs et/ou de produits 321 de rinçage. L'automate est capable d'analyser des lames dans le domaine de la coloration standard, comme les HES (Hémalun, Eosine, Safran), ou pour des réalisations plus spécifiques. Le procédé est aussi utilisable pour des applications avec des coupes au cryostat. Le panier comporte plusieurs lames, par exemple vingt lames pour un automate comportant vingt emplacements. L'automate comporte alors des moyens de détection et de sélection permettant de détecter une lame donnée et de l'insérer dans l'automate. Lorsqu'une lame doit être analysée d'urgence, l'opérateur peut modifier le parcours des lames afin que la lame à traiter d'urgence soit analysée plus rapidement. Les cartouches des têtes de nébulisation sont suivies pour connaitre leur niveau ainsi que la dernière date à laquelle elles ont été changées. Le suivi des réactifs peut être obtenu à partir des moyens d'identification permettant d'obtenir une traçabilité des réactifs auxquels les lames ont été soumises. Selon un autre mode de réalisation, l'automate peut être un automate linéaire de sorte que la lame se déplace le long de l'automate pour suivre les différentes étapes du procédé ; mis à part le carrousel, cet automate linéaire comporte les mêmes moyens que l'automate 500 décrit en référence à la figure 2. Il peut toutefois être réalisé de manière plus compacte que l'automate 500 de la figure 2. REVENDICATIONS1) Procédé de traitement d'une préparation (401) cytologique ou histologique, ledit procédé comportant une étape de dépôt (205) d'au moins une goutte d'un réactif apte à entraîner une réaction telle qu'une coloration lors de la mise en contact avec de ladite préparation (401), le dépôt de ladite goutte étant réalisée au moyen d'une tête de nébulisation (100) comportant un élément piézoélectrique (120), ladite tête de nébulisation (100) expulsant ladite goutte sous l'effet de la déformation dudit élément piézoélectrique (120). 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite étape de dépôt (205) est une étape de dépôt d'une goutte d'un réactif apte à réaliser une coloration sur certaines parties de la préparation (401). 3) Dispositif (500) de traitement d'une préparation (401) cytologique ou histologique pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que ledit dispositif (401) comporte : - un carrousel (300), comportant au moins un emplacement (302) apte à recevoir une lame (400) apte à recevoir une préparation (401) cytologique ou histologique, ledit carrousel (300) étant monté rotatif autour d'un axe de rotation (304) ; - une tête de nébulisation (100) passant au-dessus dudit carrousel (300), comportant ledit élément piézoélectrique (120) et un volume dudit réactif de sorte que ladite tête de nébulisation (100) expulse au moins une goutte de réactif sous l'effet de la déformation dudit élément piézoélectrique (120). 4) Dispositif (500) selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit volume dudit réactif est intégré dans une cartouche (110). 5) Dispositif (500) selon la revendication précédente caractérisé en qu'il comporte une pluralité de cartouches (110) aptes à contenir différents réactifs. 6) Dispositif (500) selon l'une des revendications 3 à 5 caractérisé en ce qu'il comporte : - des moyens de rinçage (320) aptes à rincer la lame (400) passant à proximité desdits moyens de rinçage (320) ; - des moyens de séchage (330) aptes à sécher la lame (400) passant à proximité desdits moyens de rinçage (330) ; 7) Dispositif (500) selon la revendication 6 caractérisé en ce que les moyens de rinçage (320) comportent des moyens pour sélectionner des produits (321) de rinçage et/ou des réactifs non nébulisables. 8) Dispositif (500) selon l'une des revendications 3 à 7 caractérisé en ce qu'il comporte un positionneur (301) pour le repérage des lames (400) placées sur le carrousel (300). 20 9) Dispositif (500) selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que le carrousel (300) comporte des moyens de chauffage (303) positionnés sous ledit au moins un emplacement (302) de la lame (400). 10) Dispositif (500) selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce 25 qu'il comporte : - des moyens d'identification aptes à identifier chaque lame (400), chaque lame (400) étant équipée d'un identifiant ; - des moyens d'obtention d'une traçabilité du ou des réactifs auxquels chacune des lames a été soumise. 30