Brevet FR2960550A1 — publié le 20111202

Moyens pour la production transitoire dans les plantes de protéines recombinantes utilisables notamment en prophylaxie et en thérapeutique L'invention a pour objet des moyens pour la production transitoire dans les plantes de 5 protéines recombinantes d'intérêt et les applications des protéines recombinantes obtenues, en particulier dans le domaine de la santé humaine et animale. Par «protéines recombinantes d'intérêt », on entend, dans la description et les revendications, des protéines biologiquement actives, en particulier utiles à titre préventif ou curatif, obtenues par les techniques de recombinaison génétique. 10 Les systèmes classiques de production de protéines recombinantes d'intérêt biologique comprennent les bactéries, les levures, les cellules de mammifères ou d'insectes. Des rendements de 1 à 3 g/L sont obtenus par exemple à partir de suspensions cellulaires de mammifères. Les rendements sont généralement plus faibles chez les plantes, à savoir de l'ordre de 15 100 à 200 mg/L, mais les coûts de production apparaissent nettement inférieurs. La production de protéines recombinantes à grande échelle implique de prendre en compte différentes contraintes, dont le mécanisme de régulation post-transcriptionnelle, communément désigné par le terme PTGS en abrégé, pour « Post Transcriptional Gene Silencing ». 20 Ce mécanisme, qui entre généralement en jeu lors d'une infection virale, limite l'expression de protéines recombinantes en dégradant spécifiquement les ARNm codant pour ces protéines. Afin de s'affranchir de ce problème, il a été proposé de co-exprimer des protéines suppresseurs de silencing en même temps que la protéine à produire. 25 Les travaux des inventeurs ont plus particulièrement porté, dans ce contexte, sur l'obtention de moyens permettant d'atteindre un niveau élevé d'expression en une protéine antigénique de promastigotes ou d'amastigotes de leishmanies. Les recherches effectuées ont alors montré que, de manière inattendue, l'utilisation de suppresseurs de silencing en mélange permettait d'augmenter fortement l'expression de la 30 protéine antigénique. Avantageusement, de tels effets sont également obtenus de manière générale avec d'autres protéines d'intérêt. L'invention a donc pour objet de fournir une composition pour la transfection d'une agrobactérie destinée à être inoculée dans une plante afin de co-exprimer une protéine d'intérêt avec un mélange de suppresseurs de silencing. L'invention a plus spécialement pour objet de fournir des moyens pour co-exprimer une protéine antigénique de promastigotes ou d'amastigotes de leishmanies. Elle vise également à fournir un procédé de production, en système transitoire, d'une protéine antigénique de promastigotes ou d'amastigotes de leishmanies dans une plante, exploitable à l'échelle industrielle, plus particulièrement d'une PSA (abréviation pour Promastigote Surface Antigen) ou d'un dérivé de PSA. Selon un premier aspect, l'invention vise ainsi une composition pour l'inoculation dans une plante d' agrobactéries transfectées par des vecteurs d'expression, aux fins de production dans la plante d'une protéine d'intérêt ou d'un dérivé de cette protéine, par délétion ou par mutation, caractérisée en ce qu'elle comprend - des agrobactéries transfectées par au moins un vecteur d'expression, comprenant un insert de séquence nucléotidique codant pour ladite protéine ou un dérivé de cette protéine, et - des agrobactéries transfectées par une pluralité de vecteurs d'expression comprenant chacun au moins un insert de séquence nucléotidique codant pour des protéines à effet suppresseur de silencing. De manière inattendue, le mélange des suppresseurs de silencing conduit à un effet synergique au niveau du silencing, ce qui permet d' atteindre des taux élevés en protéines ou en dérivés de protéines. Conformément à ce premier aspect, l'invention vise, plus spécialement, une composition pour l'inoculation dans une plante d'agrobactéries transfectées par des vecteurs d'expression, aux fins de production dans la plante d'une PSA ou d'un dérivé de PSA, par délétion ou par mutation, caractérisée en ce qu'elle comprend a) des agrobactéries transfectées par au moins un vecteur d'expression, comprenant un insert de séquence nucléotidique codant pour ladite PSA ou un dérivé de 25 PSA, et b) des agrobactéries transfectées par une pluralité de vecteurs d'expression comprenant chacun au moins un insert de séquence nucléotidique codant pour des protéines à effet suppresseur de silencing. La séquence nucléotidique insérée dans le vecteur a) correspond avantageusement à 30 l'une des séquences SEQ ID N°1-5 et 11 décrite notamment dans la demande WO 2005/051989 au nom de l'IRD. Ces séquences sont capables de coder pour des PSA, respectivement, de séquences SEQ ID N°6-10 et 12. Plus particulièrement, la séquence nucléotidique insérée dans le vecteur a) correspond à celle du gène IJ11 de L. infantum de séquence SEQ ID N°11, qui code pour la protéine LiPSA 50s de séquence SEQ ID N°12, ou du clone d'ADNc A3B de L.amazonensis de séquence SEQ ID N°13. Dans d'autres séquences nucléotidiques, un ou plusieurs codons ont été délétés ou mutés dans les séquences ci-dessus. Les protéines codées par de telles séquences correspondent à des dérivés de PSA pouvant également être produits dans une plante, conformément à l'invention. Selon une disposition avantageuse, qui permet de stimuler la production de PSA ou du dérivé de PSA, le vecteur sous a) comprend en amont de la séquence nucléotidique et en aval du promoteur, une séquence nucléotidique codant pour un peptide signal de sécrétion-excrétion de leishmanie (SP en abrégé pour Signal Peptide). Il s'agit par exemple des séquences SEQ ID N°14-16, codant, respectivement, pour le peptide signal de la PSA de L. mexicana, de L. infantum (codée par le gène IJ11) ou de 15 L.amazonensis (codée par le clone d'ADNc A3B) : Les séquences SEQ ID N°14-16 sont les suivantes : SEQ ID N°14 : 20 ATGGCCTCGAGGCTCGTCCGTGTGCTGGCCGCCGCCATGCTGGTTGCAGCGGCCG TGTCGGTCGACGCTGGCGCCTCTCTAGAC SEQ ID N°15 : ATGGCGCTGTGCGTGCGTCGGCTGGTGCTGGCGGCGACCCTCGCCGCTGTGGTGG 25 CGCTGCTGCTGTGCACGAGCAGTGCGCCGGTGGCGCGTGCT SEQ ID N°16 : ATGGCGCAGTGCGTGCGTCGGCTGGTGCTGGCGGCGCCCCTCGCCGCTGTGGTGG CGCTGCTGCTGTGCACGAGCAGTGCACCGGTGGCGCGTGCT 30 Les séquences insérées dans les vecteurs d'expression sous b) correspondent avantageusement à des séquences codant pour des protéines exprimées par des virus responsables de maladies chez les plantes, tels que les sobemovirus, les polerovirus ou les nepovirus ou pour des mutants de ces protéines. Des protéines présentant un fort effet 35 suppresseur de silencing correspondent à celles exprimées par RYMV (Rice Yellow Mottle Virus), IYMV (Imperata Yellow Mottle Virus), BWYV (Beet western yellows virus) virus ou TRSV (Tomato Ring Spot Virus). En variante, il s'agit d'un mutant des séquences codant pour ces protéines, dans lequel un codon du type sauvage a été modifié. Des séquences nucléotidiques préférées correspondent à celles codant pour une protéine suppresseur P1 de RYMV ou de IYMV, responsable aussi du mouvement de cellule à cellule dans la plante, ou un mutant d'une telle protéine. L'ORFI de RYMV code ainsi pour une protéine suppresseur de silencing présentant un PM de 18-19 kDa (Voinnet et al, 1999 ; Siré et al, 2008). De préférence, la protéine P1 exprimée selon l'invention correspond à celle d'un isolat de Tanzanie désigné par P1-Tz3, tel que décrit dans Siré et al, 2008 cité ci-dessus. Des séquences d'acides nucléiques préférées, modifiées par mutation, comprennent les séquences de type sauvage dans lesquelles le codon GCC en position 58 a été remplacé par le codon ACC, et/ou le codon AAG en position 160 par le codon GGG, le codon CAG en position 196 par le codon GAC. Les acides nucléiques mutants correspondants sont désignés dans la description et les revendications par P1-A20T, P1-K54G, P1-Q66R, P1-Q110D. Ces séquences nucléotidiques sont capables de coder pour des protéines comprenant les séquences de type sauvage, dans lesquelles Ala en position 20 a été remplacé par Thr, Lys en position 54 par Gly, Gln en position 66 par Arg et Gln en position 110 par Asp. Les acides nucléiques ci-dessus peuvent comporter plusieurs mutations. Un acide nucléique de ce type préféré comprend par exemple les 3 premières mutations ci-dessus et correspond ainsi à pi A20T-K54G-Q66 Une séquence d'acide nucléique préférée de IYMV code pour une protéine Pl 25 présentant un PM de 24,1 kDa (Sérémé et al. 2008). D' autres séquences nucléotidiques codent pour des protéines suppresseurs agissant à différents niveaux de la voie du silencing telles que la protéine PO de BWYV et la protéine P19 de TRSV Selon un deuxième aspect, l'invention vise un procédé de production d'une protéine 30 d'intérêt ou d'un dérivé de protéine d'intérêt dans une plante, caractérisé par la co-expression, dans la plante, de la protéine d'intérêt ou du dérivé de cette protéine et d'un mélange de protéines à effet suppresseur de silencing, par les vecteurs d'expression tels que défmis ci-dessus. L'invention vise en particulier un procédé de production de PSA ou d'un dérivé de PSA dans une plante, caractérisé par la co-expression, dans la plante, de la PSA ou du dérivé de PSA et d'un mélange de protéines à effet suppresseur de silencing, par les vecteurs d'expression définis sous a) et sous b) ci-dessus. Plus particulièrement, ledit procédé comprend - la transfection d'agrobactéries par la composition d'inoculation avec lesdits vecteurs d'expression, - l'agro-infiltration de la plante hôte par le mélange d'agrobactéries obtenues à l'étape 10 précédente, et l'extraction de la protéine biologiquement active. L'étape d'agro-infiltration est avantageusement réalisée en utilisant un rapport entre les souches d'agrobactéries exprimant la PSA et le mélange de souches exprimant les 15 suppresseurs notamment de 45/55 à 55/ 45 et plus spécialement de 50/50. Selon une autre disposition avantageuse, les souches exprimant les suppresseurs correspondent plus spécialement à un mélange de souches transfectées par des séquences nucléotidiques codant pour Pl-TZ3 du RYMV, ou Pl de IYMV, ou des mutants de P 1-TZ 3 tels que Pl-Q66R ou P 1-A20T ou P 1-Q66R et des souches transfectées par des séquences 20 nucléotidiques codant pour PO du BWYV ou P19 du TRSV. Les souches transfectées par des séquences nucléotidiques codant pour des mutants de protéines à effet suppresseur comprennent un ou plusieurs mutants d'une même protéine ou une protéine comportant plusieurs mutations. Par exemple, une combinaison préférée, pour l'expression transitoire dans 25 N.benthamania, comprend PO de BWYMV+ Plx +P19, x correspondant à un mutant de P1 et étant un entier de 1 à 3. De manière avantageuse, dans la combinaison ci-dessus, les souches sont présentes selon un rapport de 1/3 chacune. L'étape d'extraction comprend un broyage des feuilles de la plante plusieurs jours 30 après la transfection, plus particulièrement 6 jours après la transfection, l'utilisation d'un tampon d'extraction et une étape de centrifugation, suivie de la récupération de l'extrait protéique, soumis ensuite à une ou plusieurs étapes de purification. Selon un mode de réalisation, la purification de la PSA est effectuée sur une colonne de nickel. Les résidus histidine ayant une très forte affinité pour le nickel, une queue de plusieurs résidus His, par exemple 10 est rajoutée en N-terminal de la PSA. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'agrobactérie est Agrobacterium 5 tumefaciens. La plante hôte est avantageusement le tabac, en particulier N. benthamania. Les dispositions ci-dessus permettent de produire la protéine d'intérêt avec une séquence His pour sa purification et à un niveau d'expression de l'ordre de 100 mg/kg de feuilles fraîches. 10 On mesurera en particulier l'intérêt de disposer ainsi, en quantités importantes, de PSA ou d'un dérivé de PSA utilisable en prophylaxie et en médecine humaine ou animale. De manière générale, l'invention donne les moyens de développer de nouvelles stratégies pour lutter contre les processus infectieux. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples 15 qui suivent qui font référence aux figures 1 à 9, représentant, respectivement - Figure 1: la structure du plasmide pCambia5300 utilisé pour les transformations selon l'invention d'Agrobacterium tumefaciens ; - Figure 2: Western blot montrant les effets sur la production de PSA de l'augmentation du % de souches PSA par rapport au % de souches suppresseurs ; 20 - Figure 3 : Western blot montrant les résultats de production de PSA en utilisant 1 ou plusieurs suppresseurs; Figure 4 :l'effet de mutants de supresseurs; Figure 5 : l'estimation du rendement en PSA; Figure 6 : l'effet d'un mélange de différentes P1 sur l'expression de la PSA; 25 Figure 7 : l'effet de P1 de IYMV dans un mélange de suppresseurs ; Figure 8 : les résultats de production de PSA ; Figure 9 : la construction pCambia 1300 modifié avec l'insert de K7 cloné avec BamHl et SacI ; le gène codant pour la PSA IJ11 (insert de IJ11) est représenté avec la séquence de secrétion-excrétion (sp+) et sans la séquence hydrophobe (h-) localisée 30 en C-terminal cloné Bamhl et Sacl dans pCambia 1300. Séquences soulignées : A4; séquence italique avant insert : Promoteur 35S, séquence après insert : nos-terminator. MATERIELS ET METHODES 1. Matériel Matériel végétal Le tabac utilisé est le cultivar Nicotiana benthamiana RDR6 (Sainsbury Laboratory) : il s'agit d'une plante transgénique mutée dans la voie d'amplification du silencing. Le tabac est en stabulation dans des chambres bioclimatiques à atmosphère contrôlée (22°C, 10h à l'obscurité et à 70% d'humidité relative). Les plantules sont repiquées 2 semaines après semis, puis agro-infiltrées après 2 semaines. 50 plantes sont utilisées pour chaque expérimentation. Plasmide pCAMBIA 5300 est utilisé pour l'insertion des gènes codant pour les protéines 15 d'intérêt. Sa structure est représentée sur la Figure 1. Vecteur de transformation : Agrobacterium tumefaciens (souche GV3101) Géne codant pour la PSA : gène de Leishmania IJII codant pour une protéine excrétée /secrétée de L. infantum, 8M 56kDa. 20 II. Production a- Constructions plasmidiques Le gène codant pour la protéine d'intérêt est inséré entre le promoteur P35S et le 25 terminateur T35S pCambia 5300. b - Transformation d'Agrobacterium tumefaciens à l'aide de ces constructions L'intégration de l'ADN plasmidique dans Agrobacterium tumefaciens est effectuée 30 par électroporation (Biorad Gene Pulser system). On applique un courant électrique qui désorganise la paroi des bactéries, laissant ainsi pénétrer l'ADN à l'intérieur. Le produit de transformation est étalé sur milieu sélectif (LB additionné de 50 µg/mL rifampicine et de 50 µg/mL kanamycine) et les cultures sont incubées 2 à 3 jours à 28°C. 7 Les colonies positives sont mises en culture liquide et aliquotées en présence de glycérol avant d'être conservées à -80°C. c - Préparation de suspensions des agrobactéries Les agrobactéries sont mises en culture à 28°C dans un milieu nutritif LB additionné de Rifampicine et Kanamycine, pendant environ 14 h, afin d'activer la croissance de la population bactérienne. Cette pré-culture sert ensuite à ensemencer un plus grand volume de milieu. Un volume de 50m1 pour 3 plantes est utilisé pour l'agro-infiltration de 3 feuilles entières. A D0600 = 0,5, l'état physiologique des bactéries apparaît optimal pour l'agroinfiltration et les cultures sont arrêtées. Après une centrifugation (5 min à 4000g), les bactéries sont remises en suspension 15 dans un même volume de MgC12 10mM additionné de 200µM d'acétosyringone. Ce mélange est utilisé pour la transformation des plants de tabac. d- Préparation des inocula : Les suspensions d'Agrobacterium tumefaciens transformées par les constructions 20 plasmidiques sont mélangées. 2 types de mélanges : Les mélanges obtenus sont désignés ci-après par référence aux types de protéines codées par les souches d'Agrobacterium tumefaciens - souche de PSA/mélange de souches de suppresseurs. 25 - Mock : A4K7 vide/mélange de souches de suppresseurs. Le mélange est laissé 14h environ au repos à température ambiante. e- Agro-infiltration d'Agrobacterium sur des plants de N. benthamiana RDR6 Les agro-infiltrations sont réalisées avec une seringue contenant l'inoculum. L'injection est faite sur la face abaxiale de la feuille où le tissu est plus apte à absorber le liquide. Les plantes sont ensuite replacées dans les chambres bioclimatiques. Les feuilles transformées sont récoltées 6 jours après l'agro-infiltration. 30 III. Extraction et dosage protéique par spectrophotomètrie Le tampon d'extraction suivant est préparé : Tris 20mM NaCl 30OMm Glucose 25Mm Triton 1% Glycérol 5% DTT 5mM Anti-protéase (EDTA-free) Les échantillons provenant des plantes transformées sont congelés dans l'azote liquide, puis broyés. Pour chaque traitement, les 9 feuilles sont broyées. Le tampon d'extraction est ajouté à la poudre obtenue par broyage. Le mélange est incubé une demi-heure dans la glace, en le vortexant de temps en temps. Les tubes sont centrifugés pendant 20 min, à 10 000g à 4°C. Le surnageant contenant les protéines est récupéré et chaque échantillon est dosé selon la méthode de Bradford qui consiste à mélanger le Bleu de Coomassie à l'extrait protéique et à mesurer 1'absorbance du mélange à une longueur d'onde de 595 nm. IV. Immunodétection de la PSA par Western blot 1 Préparation des gels d'acrylamide (19 :1) à 12% Pour 1 gel de 1,5 mm Tampon Gel de d'électrophorèse à 12% concentration à 5% Acrylamide Bis-acrylamide 40% 3 ml 500 µl Tris HC1 1,5 M, pH 8,8 2,6 ml 500 µl SDS 20% 50 µl 20 µl Persulfate d'ammonium 10% 100 pl 40 p l Temed (N,N,N',N'- 10 µl 4 µl tetraméthylène diamine) H20 4,4 ml 3 ml25 Migration dans un gel SDS-PAGE Les échantillons sont déposés dans un gel d'acrylamide (19 :1) à 12% en utilisant un 5 tampon de glycérol+ bleu de bromophénol+ SDS. La même quantité de protéine est déposée dans chaque puits. La migration se fait dans un tampon TG-SDS 1X. Les protéines sont transférées sur une membrane PVDF déposée sur le gel et un courant électrique traversant le gel en direction de la membrane est appliqué. Cette étape est réalisée dans un tampon de transfert (Tris base 4.84 g ; Glycine 22.52 g ; Méthanol 100 ml, 10 H20 Qsp 2L). Les protéines chargées négativement par le SDS et préalablement séparées en fonction de leur poids moléculaire sont entraînées par le courant pour être déposées sur la membrane qui sera révélée par un anticorps polyclonal anti-PSA. La membrane est saturée avec 5% de lait écrémé (Biorad) dans TBS 1X (Tris base (20mM) 2.423g, NaCl (75 mM) : 4.39g, H20 :Qsp 1L) pendant une heure à température 15 ambiante. 10 ml de cette solution de blocage sont récupérés, puis l'anticorps primaire anti-PSA (1/2000ème) est ajouté. La membrane est laissée dans cette solution contenant l'anticorps pendant environ 14h à 4°C, sous agitation lente. La membrane est ensuite récupérée et lavée comme suit: 6 rinçages de 2 min chacun 20 avec du TBS - Tween (TBS-T= TBS 1X + 5001.11 de Tween 20). Un anticorps secondaire anti - lapin (1/10000) est ajouté dans une nouvelle solution de blocage (lµl dans 10 ml) et la solution obtenue est laissée 1 heure sous agitation à température ambiante. La membrane est ensuite lavée comme suit: 4 x 2 min avec TBS-T puis 2 x 2 min avec 25 du TBS 1X. Pour la révélation, une solution ECL+ (Enhanced Chemiluminescence) (Amersham), déposée sur la membrane, permet la formation enzymatique d'un ester d'acridinium. La membrane est laissée 5 min à température ambiante. Le résultat est obtenu en scannant la membrane (Typhoon, Amersham) avec les paramètres suivants : scan à 100 PMT = 600, 30 Filter = 520 BP 40. Longueur d'onde d'émission= 45nm. 10 V. Construction pour la purification de la protéine produite On utilise, comme vecteur de base, le vecteur pCambia 1300 modifié avec un insert de K7. L'insert de PSA (Ij11)sp+h-taggué en N-ter, avec 6 histidines de 1326pb soit 442aa (protéine de 48.6Kda) est cloné dans A4K7 (pCambia 1300 modifié avec insert de K7) cloné avec BamHI et Sacl ( Figure 9 avec le schéma de l'insert) avec lettres italiques = insert PSA IJ11, lettres normales = vecteur pCambia, gras = Histag ( après ATG) et souligné : début = séquence 35S et fm : Nos terminator). SEQ ID N°19 correspond à la séquence de l'insert et SEQ ID N°20 à pCambia1300 10 modifié avec l'insert de K7, cloné avec BamHl et SacI. RESULTATS Expérience 1 : Etude de différents ratios souches PSA/souches suspenseurs 15 Les conditions utilisées sont les suivantes: 3 plantes par traitement, une inoculation de 3 feuilles par plante et un prélèvement à J+6, 20µg d'extrait total sont placés dans chaque puits. 20 A titre de contrôle, on utilise une agrobactérie avec un vecteur vide A4 (Mock) + mélange de souches de suppresseurs. Le mélange de suppresseurs est le suivant : (1/3 P1+ 1/3 PO+1/3 P19) J = jours après agro-infiltration PSA : construction sp+h- dans GV3101 25 Conditions : non dénaturante pour échantillons (sans chauffage, sans DTT) Anti-corps : anti- ESP Ldi IJ11 sens au 1/2000e (ESP = excreted/secreted protein) Contrôle positif PSA : IJ11, surnageant de leishmanies. Des inocula avec quantités croissantes en souche PSA ont été utilisés. Les résultats obtenus en Western blot sont rapportés sur la Figure 2. Les bandes observées dans le Mock (témoin négatif de l'expérience) sont dites aspécifiques et constituent le bruit de fond. 30 Les bandes qui ne sont que dans les traitements et pas dans le Mock sont supposées correspondre à la PSA. On constate que l'intensité des bandes de PSA est la plus forte dans le traitement 50/50. Cette combinaison donc conduit dans les conditions d'expérience à la plus forte accumulation de PSA dans les tissus du tabac. Expérience 2 : Etude des effets sur la production de PSA des suppresseurs utilisés seuls ou en combinaison Les résultats rapportés ci-après sont obtenus dans les conditions suivantes : 10 Utilisation de 3 plantes par traitement, prélèvement à J+6 inoculation de 3 feuilles par plante L'inoculum utilisé est composé de 50% de suppresseurs et 50% de PSA Suppresseurs: P0, Pl, P19, HcPro 30 µg d'extrait total sont déposés dans chaque puits 15 Mock : agrobactérie avec vecteur vide A4, J = jours après agro-infiltration Conditions : non dénaturante pour les échantillons (sans chauffage, sans DTT) Anti-corps : anti - ESP Ldi IJ11 sens au 1/2000e Contrôle positif PSA : IJ11 surnageant de leishmanies. 20 Lad = ladder La Figure 3 illustre les résultats obtenus. L'expression transitoire du gène codant pour la protéine d'intérêt varie en fonction du 25 suppresseur de silencing, ce qui traduit des modes d'actions différents sur la voie du PTGS. On remarque que seul, PO permet une expression de la PSA assez forte alors que P1, et P19 seuls, semblent induire un signal très faible. En revanche avec l'utilisation d'un mélange composé des 3 suppresseurs, on observe une bande très forte correspondant à une accumulation de PSA importante. 30 Ainsi le mélange des suppresseurs P0, Pl, P19 apparaît comme particulièrement performant dans N. benthamiana. Ce résultat démontre un effet synergique des protéines à effet suppresseur qui correspondent à des étapes clés différentes du PTGS.5 Expérience 3 : Etude de l'effet de mutants de P1 dans le mélange de suppresseurs sur la production de PSA On rapporte ci-après les résultats d'expériences réalisées avec l'inoculum composé de 5 50% de suppresseurs et 50% de PSA, en utilisant 3 mutants de Pl-Tz3, à savoir P1-A20T, P1-K54G, P1-Q66R. Les conditions utilisées correspondent à celles des expériences 1 et 2 et les symboles utilisés dans la Figure 4 ont les mêmes significations. Le mélange de suppresseurs : correspond à 1/3 PO + 1/3 Plx+ 1/3 P19, différents 10 isolats ou mutants du suppresseur P1 étant utilisés (x). Le mélange constitué de PO Pl P19 sert de référence et le mélange P1 est remplacé dans chaque inoculum par l'un des mutants. Après révélation du Western blot, on constate que le mélange contenant le mutant Pl- Q66R donne un signal nettement plus accentué que celui obtenu avec P1-A20T et P1-K54G. Ainsi, dans le tabac, la combinaison P0, Pl-Q66R, P19 apparaît particulièrement 15 efficace dans l'expression transitoire de PSA. Expérience 4 : Estimation du rendement en PSA Les conditions utilisées dans l'expérience rapportées sont les suivantes : 20 - 3 plantes par traitement, inoculation de 3 feuilles par plante, prélèvement à J+6, - anti-corps : anti-ESP Ldi IJ11 sens au 1/2000e - 30 µg d'extrait total dans chaque puits. - les inocula sont composés de : 50% PSA / 50% mélange de suppresseurs - mélange de suppresseurs : 1/3 PO + 1/3 Pl+ 1/3 P19 25 J = jours après agro-infiltration Conditions : non dénaturantes pour les échantillons (sans chauffage, sans DTT) Anti-corps : anti -ESP Ldi IJ11 sens au 1/2000e Lad = ladder Les résultats sont rapportés sur la Figure 5. 30 Le rendement en PSA pour 100g de feuilles est estimé à : 0,70 mg Expérience 5 : mélange avec différentes P1, prélèvement à J+6 Les conditions utilisées sont telles que définies dans l'Expérience 4 (T+ = 250 de surnageant de Leishmanie). Les résultats sont donnés sur la Figure 6. Les pistes correspondent respectivement à : 1 :Mock ; 2 : Pl-A20T ; 3 :PIK54G ; 4 : P1-Q66R ; 5 : P1 Tz3 ; 6 : P1 IYMV ; 7 : Ladder ; 8 : Ladder (Mock=1/2 A4K7 vide + 1/2 mélange avec P 1 Tz3. 10 La mutation P1-Q66R (ligne 4) a l'effet le plus fort sur l'accumulation de la PSA. Expérience 6 : Mélange avec Pl de IYMV Les conditions utilisées correspondent à celle de l'Expérience 7 ci-dessus. 15 Les résultats sont rapportés sur la figure 7. Les pistes correspondent respectivement à : 1 :T+; 2 : Ladder ; 3 :J+8 ; 4 : J+7 ; 5 : J+6 ; 6 : J+5 ; 7 : J+3 ; 8 : Mock (Mock= 1/2 A4K7 vide + 1/2 mélange avec P 1 Tz3. Comme pour P1-Tz3, l'effet de IYMV sur l'accumulation de la PSA est maximum 5 et 6 jours (lignes 5 et 6) après la co-infiltration avec le gène d'intérêt. 20 Expérience 7 : rendements pour 100g de poudre La Figure 8 illustre les rendements obtenus avec P120, P154, P166, P 1 IYMV et P1Tz3. Les quantités déposées en ng/Western sur PSA A3B avec un anticorps anti-C-ter de 25 lapin. Le tableau exprime à partir d'une gamme croissante de PSA purifiée, les différents rendements obtenus selon le suppresseur ou le mutant de P1-Tz3.5 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 - Voinnet et al., 1999, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Arnerica I999:96(24):14147-52. 2 - Siré et al., Virology Journal, 2008, 5 :55, p 1-12. 3 - Sérémé et al., Arch. Virol., 2008, 153 : p 1813-1820. REVENDICATIONS1- Composition pour l'inoculation dans une plante d'agrobactéries transfectées par des vecteurs d'expression, aux fins de production dans la plante d'une protéine d'intérêt ou d'un dérivé de cette protéine, par délétion ou par mutation, caractérisée en ce qu'elle comprend des agrobactéries transfectées par au moins un vecteur d'expression, comprenant un insert de séquence nucléotidique codant pour ladite protéine ou un dérivé de cette protéine, et - des agrobactéries transfectées par une pluralité de vecteurs d'expression comprenant chacun au moins un insert de séquence nucléotidique codant pour des protéines à effet suppresseur de silencing. 2 - Composition selon la revendication 1, pour l'inoculation dans une plante d' agrobactéries transfectées par des vecteurs d'expression, aux fins de production dans la plante d'une PSA Leishmania, ou d'un dérivé de PSA, par délétion ou par mutation, caractérisée en ce qu'elle comprend a) des agrobactéries transfectées par au moins un vecteur d'expression , comprenant un insert de séquence nucléotidique codant pour ladite PSA ou un dérivé de PSA, et b) des agrobactéries transfectées par une pluralité de vecteurs d'expression comprenant chacun au moins un insert de séquence nucléotidique codant pour des protéines à effet suppresseur de silencing. 3 - Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique insérée dans le vecteur a) correspond à l'une des séquences SEQ ID N°1-5 et 11. 4 - Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdites séquences 30 nucléotidiques sont capables de coder pour des PSA de séquences SEQ ID N°6-10 et 12. 5 -- Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique insérée dans le vecteur a) correspond à celle du gène IJ I i de L. infantum deséquence SEQ ID N°11, qui code pour la protéine LiPSA 50s de séquence SEQ ID N°12, ou à celle du clone d'ADNc A3B de L.amazonensis de séquence SEQ ID N°13. 6 - Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en que la séquence nucléotidique insérée dans le vecteur a) comporte au moins une mutation. 7 - Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisée en ce 10 que le vecteur sous a) comprend en amont de ladite séquence nucléotidique et en aval du promoteur, une séquence nucléotidique codant pour un peptide signal de sécrétion-excrétion de leishmanie (SP en abrégé pour Signal Peptide). 8- Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que la séquence 15 nucléotidique codant pour le peptide signal correspond à SEQ ID N°14, 15 ou 16, ces séquences codant, respectivement, pour le peptide signal de la PSA de L.mexicana, de L. infantum (codée par le gène IJ11) ou de L.amazonensis (codée par le clone d'ADNc A3B). 9 - Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisée en ce 20 que les séquences insérées dans les vecteurs d'expression sous b) correspondent à des séquences codant pour des protéines exprimées par des virus responsables de maladies chez les plantes tels que les sobemovirus, Ies polerovirus ou les nepovirus ou pour des mutants de ces protéines, plus particulièrement à des protéines présentant un fort effet suppresseur de silencing correspondant à celles exprimées par RYMV (Rice Yellow Mottle Virus), IYMV 25 (Imperata Yellow Mottle Virus), BWYV (Beet western yellows virus) virus ou TRSV (Tomato Ring Spot Virus), ou à leurs mutants. 10 - Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques correspondent à celles codant pour une protéine suppresseur PI de RYMV ou 30 de IYMV, responsable aussi du mouvement de cellule à cellule dans la plante, plus particulièrement à celle d'un isolat de Tanzanie Tz3, ou à un mutant de la protéine PI exprimé par une séquence d'acide nucléique dans lequel un codon du type sauvage a été modifié. 11 - Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que les séquences d'acides nucléiques modifiées par mutation, comprennent les séquences de type sauvage dans lesquelles le codon GCC en position 58 a été remplacé par le codon ACC, et/ou le codon AAG en position 160 par le codon GGG, le codon CAG en position 196 par le codon GAC, les acides nucléiques mutants correspondants étant désignés par P1-A20T, Pi-K54G, Pl-Q66R, PI -Qi IOD et ceux comportant Ies 3 premières mutations par P1 A20T-K54G-Q66R. 12 - Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques modifiées par mutation codent pour des protéines de type sauvage dans lesquelles Ala en position 20 a été remplacé par Thr, Lys en position 54 par Gly, Gln en position 66 par Arg et Gln en position 110 par Asp. 13 - Procédé de production d'une protéine d'intérêt ou d'un dérivé de protéine d'intérêt ans une plante, caractérisé par la co-expression, dans la plante, de la protéine d'intérêt ou du dérivé de cette protéine et d'un mélange de protéines à effet suppresseur de silencing, par les vecteurs d'expression définis dans la revendication 1. 14 - Procédé selon la revendication 13 pour la production de PSA de Leishmania ou d'un dérivé de PSA dans une plante, caractérisé par la co-expression, dans la plante, de la PSA de Leishmania ou du dérivé de PSA et d'un mélange de protéines à effet suppresseur de silencing, par les vecteurs d'expression définis sous a; et sous b) dans l'une quelconque des revendications 2 à 12. 15 --- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend - la transfection d'agrobactéries par la composition d'inoculation avec lesdits vecteurs d'expression, - l'agro-infiltration de la plante hôte par le mélange d'agrobactéries obtenues à 30 l'étape précédente, et - l'extraction de la protéine biologiquement active. 16 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape d'agro-infiltration est réalisée en utilisant un rapport entre les souches d'agrobactéries exprimant la PSA et le 19 mélange de souches exprimant les suppresseurs notamment de 45/55 à 55/ 45 et plus spécialement de 50/50. 5 17 Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que les souches exprimant les suppresseurs correspondent à un mélange de souches transfectées par des séquences nucléotidiques codant pour P1-TZ3 du RYMV, ou P1 de IYMV, ou des mutants de P 1-TZ 3 tels que P 1-Q66R ou P 1-A20T ou P 1-Q66R et des souches transfectées 10 par des séquences nucléotidiques codant pour PO du BWYV ou P19 du TRSV. 18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que les souches transfectées par des séquences nucléotidiques codant pour des mutants de protéines à effet suppresseur comprennent un ou plusieurs mutants d'une même protéine ou une protéine comportant 15 plusieurs mutations. 19 - Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que, pour l'expression transitoire dans Nbenthamania, la combinaison de suppresseurs comprend PO de BWYMV+ P1 de RYMV x +P19 de TRSV, x correspondant à un mutant de P1 et étant un entier de 1 à 3. 20 20 - Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les souches sont présentes selon un rapport de 1/3 chacune. 21 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisé en ce que 25 l'agrobactérie est Agrobacterium tumefaciens. 22 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que la plante hôte est le tabac.