Brevet FR2954779A1 — publié le 20110701

Gène GpaV de résistance aux nématodes chez les solanacées L'invention concerne le gène GpaV conférant une résistance aux nématodes chez les plantes solanacées. On conçoit aujourd'hui que l'activation des mécanismes de défense de plantes résulte d'une cascade d'événements au cours desquels les plantes supérieurs et les agents pathogènes échangent des signaux moléculaires. Les signaux déclenchant les mécanismes de défense sont appelés des éliciteurs. La reconnaissance par la cellule hôte d'un éliciteur produit par l'agent pathogène ou par la plante constitue l'étape préalable et nécessaire à l'activation de gènes spécifiques (reconnaissance gène par gène), d'autres sont généraux (reconnaissance non spécifique). Selon le comportement de l'hôte, on distingue les résistances totales des résistances partielles et, selon le spectre d'action du gène de résistance, on distingue les résistances spécifiques (ou verticales) des résistances générales (ou horizontales). La présence de gènes de résistance permet de limiter, retarder ou empêcher le déroulement du cycle d'infection de l'agent pathogène dans la plante. La plante réagit très tôt à la tentative d'invasion des agents pathogènes visant essentiellement à empêcher ou à stopper la colonisation du pathogène. La paroi cellulaire est une barrière physique naturelle très efficace face aux bioagresseurs qui synthétisent des enzymes et composés capables de la dégrader. Lors d'une infection par un agent pathogène cette paroi va être renforcée par des dépôts de composés phénoliques (lignines), d'esters tels que la subérine, de polysaccharides tel que la callose et par l'accumulation de glycoprotéines riches en hydroxyproline. Les réponses biochimiques sont: (1) une synthèse de phytoalexines (composés antibiotiques), (2) une synthèse et une accumulation de composés phénoliques de faible poids moléculaires et protéiques dans les parois cellulaires, (3) une synthèse de protéines PR (Pathogenesis-Related). Ces synthèses de composés se font en réponse à la reconnaissance de l'agent pathogène pour inhiber sa croissance et son développement (enzymes litiques, phytoalexines) mais aussi pour limiter sa propagation dans la plante. La mise en place des mécanismes de défense résulte d'une activation transcriptionelle d'un grand nombre de gènes. Ces gènes codent pour des enzymes de la voie de biosynthèse des phenylpropanoïdes ou pour des protéines de défense dont certaines possèdent des activités hydrolitiques connues (chitinase, glucanases, RNases, inhibiteurs de protéases). La dissection moléculaire des promoteurs des gènes de défense a permis de mettre en évidence des régions cis-régulatrices ainsi que des éléments trans-regulateurs. Le phénomène de résistance peut être dû à l'effet des allèles de résistance d'un seul gène (résistance monogénique), ou à l'effet combiné des allèles de plusieurs gènes (résistance polygénique). La résistance monogénique résulte d'une interaction spécifique entre un gène de résistance de la plante hôte et un gène d'avirulence du pathogène. Cette interaction peut être directe ou indirecte. Cependant, les résistances monogéniques présentent souvent l'inconvénient d'être rapidement contournées par le parasite et sont dans ce cas peu durable. Les résistances polygéniques sont considérées comme des résistances durables, mais difficiles à analyser et exploiter. Plusieurs loci gouvernent ce type de résistance : Il s'agit de QTL (Quantitative Trait Loci). A l'inverse des résistances monogénique, la résistance conférée par les QTL est souvent non spécifique d'un pathotype, et elle conduit à un ralentissement de développement de la maladie. Le marquage moléculaire des régions génomiques impliquées dans les résistances est aujourd'hui possible grâce aux marqueurs moléculaires qui permettent d'établir une trame de génome (carte génétique). Sur cette trame, sont localisées les régions associées à la variation phénotypique du caractère. Ces régions sont couramment appelées QTL dans le cas d'une résistance quantitative ou polygénique. Ce marquage devrait permettre à terme, de sélectionner spécifiquement chaque QTL séparément sur la base de marqueurs moléculaires en fonction de son effet, de son origine et de son mode d'action. La pomme de terre (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) appartient à la famille de solanacées. Cette famille comprend également d'autres espèces légumières largement cultivées comme la tomate (Solanum lycopersicum), le piment (Capsicum sp.) et l'aubergine (Solanum melongena). La culture de la pomme de terre est l'une des plus importantes à travers le monde. Ce tubercule est en effet produit dans plus de 130 pays. Avec une production de plus de 320 millions de tonnes en 2007, c'est la troisième culture alimentaire mondiale, après le blé et le riz (Données FAO, 2007). En France, on estime la quantité de pomme de terre produite à 4 440 000 tonnes en 2006, dont 1 million de tonnes destinés aux industries de transformation et près de 2 millions de tonnes au marché du frais français (Données FAO, 2007). Deux espèces de nématodes à kyste attaquent la pomme de terre: Globodera pallida et G. rostochiensis. Ces deux espèces sont inscrites sur la liste des parasites de quarantaine. Les pertes de production de pomme de terre dues aux nématodes sont estimées à 12,2 % de la production mondiale. Si les niveaux de populations de nématodes sont très élevés, 80 % de la récolte peut être perdue. Les nématodes à kystes sont des vers de très petite taille (moins de 1 mm). Leurs kystes résultant de la transformation des femelles après fécondation, sont visibles à l'oeil nu sur les racines. Les femelles sont blanches quand elles apparaissent à la surface racinaire; celles de G. pallida restent blanches alors que celles de G. rostochiensis vont passer par une phase jaune doré. Quand les femelles sont totalement développées elles meurent ; leur peau durcit, devient marron, et se transforme en une enveloppe protectrice : le kyste. Ce kyste peut renfermer plus de 1000 larves ; il est ainsi l'élément essentiel qui assure la conservation et la dispersion de l'espèce. Il s'agit donc de sa forme de résistance. Grâce à sa paroi riche en chitine, il est capable de supporter des conditions environnementales hostiles et peut, sous cette forme, se conserver plusieurs années dans le sol. Le kyste contient les larves juvéniles à leur deuxième stade de développement J2, qui est la forme infectante. Les J2 dans le kyste sont en diapause. La levée de cet état de latence est stimulée par les exsudats racinaires sécrétés par une plante hôte potentielle. Les nématodes au stade J2 se fixent sur les racines, puis pénètrent et se développent pour induire la formation de leur site nourricier: le syncytium. Il s'agit d'une cellule géante plurinucléée, à cytoplasme dense, résultant de la fusion de plusieurs dizaines de cellules adjacentes. Ce syncytium a une fonction importante lors de la croissance des juvéniles qui se développent préférentiellement en femelles (plus de 90 %) en conditions favorables. Dans le cas contraire (compétition entre les nématodes trop importante, mauvais état physiologique de la plante attaquée, présence de certains gènes de résistance), ils se développent préférentiellement en mâles ou restent bloqués à un stade larvaire. La résistance d'une plante aux nématodes a été définie comme l'aptitude de la plante hôte à réduire ou à prévenir la reproduction de celui-ci. Dans le cas présent, les gènes impliqués dans la résistance aux nématodes à kyste décrits jusqu'alors chez les Solanacée ne s'opposent ni à la pénétration, ni à la migration des juvéniles dans la racine (Caromel et al, 2004). L'expression de la résistance se manifeste après l'initiation du syncytium, en induisant une nécrose des cellules environnantes, empêchant ainsi son fonctionnement comme cellule de transfert. Les nématodes sont alors privés de nourriture, ce qui se traduit fréquemment par l'inversion du sex-ratio (pourcentages de mâles et de femelles) de la population, habituellement observées chez les plantes sensibles. Plus la nécrose est importante, moins le syncytium se développe. Et en cas de nécrose vraiment sérieuse, la majorité des nématodes restent bloqués à un stade juvénile (Mugniéry et al, 2001 ; Caromel et al, 2005). A l'exception du gène Gpa2 qui ne confère la résistance qu'à quelques populations de G. pallida (Rouppe Van der Voort et al, 1997), aucune résistance monogénique de haut niveau n'a été détecté chez la pomme de terre. En revanche, la cartographie de QTL de résistance à G. pallida, à partir de sources de résistance naturelle appartenant à trois espèces sauvages apparentées à la pomme de terre, S. sparsipilum (Caromel et al, 2005), S. spegazzinii (Caromel et al, 2003; Kreike et al, 1994) et S. vernei (Bryan et al, 2002 ; Rouppe van der Voort et al, 1998, 2000), a montré que l'expression d'un QTL à effet fort, localisé en position colinéaire sur le bras court du chromosome V (locus GpaV) de ces trois espèces, ainsi que l'expression de QTL à effet faible, était indispensable pour l'obtention d'une résistance de haut niveau. Cependant, les derniers résultats de cartographie localisaient le ou les gènes de résistance GpaV dans une région de plus 10 Megabases du chromosome 5. Chez S. sparsipilum, l'effet combiné du QTL GpaVspi, cartographié sur le bras court du chromosome V et du QTL GpaXI spi, cartographié sur le bras court du chromosome XI, permet une diminution considérable du développement du nématode à kyste. L'expression de ces QTL permet à la plante de développer une nécrose au niveau de la racine infectée par le parasite, et ainsi empêche le développement du syncytium: les nématodes ne peuvent alors plus se nourrir correctement et moins de 1 % entre eux peuvent se développer en femelle (Caromel et al, 2005). La présente invention a maintenant pour objet la séquence génomique complète d'un allèle de résistance du gène GpaV conférant une forte résistance aux nématodes dans des tests de complémentation. RESUME DE L'INVENTION L'invention se rapporte à des polynucléotides isolés choisis parmi les polynucléotides suivants : • le polynucléotide de la SEQ ID No.1, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID No. 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 et le polynucléotide de la SEQ ID No. 11; • un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12. L'invention a aussi pour objet un polynucléotide isolé conférant aux plantes Solanacées une résistance aux nématodes Globodera, ledit polynucléotide isolé étant choisi parmi : • un polynucléotide présentant au moins 80% d'homologie avec le polynucléotide de la SEQ ID No.1, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11; • un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 1, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 3, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 5, d'un polynucléotide de la SEQ ID 7, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 11. De préférence, les plantes sont choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. De préférence, les nématodes sont choisis parmi Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, ssp. virginiae et ssp. solanacearum, et Globodera mexicana. L'invention a aussi pour objet des cassettes d'expression comprenant dans le sens de la transcription : • un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, • un polynucléotide isolé selon l'invention; • une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte. Avantageusement, le promoteur fonctionnel dans un organisme hôte est choisi parmi CaMV 35S, les promoteurs T-DNA, les promoteurs de gènes codant pour des 20 ubiquitines, des promoteurs exprimés spécifiquement dans les racines et le promoteur de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1. Un autre objet de la présente invention est un vecteur comprenant un polynucléotide selon l'invention ou une cassette d'expression selon l'invention. La présente invention se rapporte aussi à une cellule hôte transformée avec un 25 polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Préférentiellement, la cellule hôte transformée est choisie parmi les cellules végétales et les protoplastes de cellules végétales. L'invention a aussi pour objet un organisme hôte comprenant au moins une cellule transformée selon l'invention. 30 L'invention se rapporte aussi à un organisme hôte transformé avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. L'organisme hôte est un organisme hôte non humain. Avantageusement, l'organisme hôte transformé est choisi parmi les plantes, les graines et les tissus végétaux. L'invention se rapporte aussi à une plante transformée exprimant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. L'invention a aussi pour objet une plante exprimant un polypeptide selon l'une des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 ou 12. De préférence, les plantes transformées appartiennent à la famille des Solanacées. Plus préférentiellement, les plantes transformées sont choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. L'invention se rapporte aussi aux plantes choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum comprenant ou exprimant un polynucléotide ou un polypeptide selon l'invention. De préférence, la plante est choisie parmi les pommes de terre de culture et elle comprend ou exprime polynucléotide selon l'invention ou un polypeptide selon l'invention. L'invention a aussi pour objet un procédé pour conférer une résistance aux nématodes Globodera à une plante Solanacée comprenant les étapes suivantes : - transformation de la plante avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention; - sélection d'une plante résistante aux nématodes Globodera. L'invention se rapporte également à un procédé pour rendre résistante une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja aux nématodes Globodera comprenant les étapes suivantes : - introgression d'un segment d'ADN génomique de Solanum sparsipilum comprenant un polynucleotide selon l'invention dans une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja ; sélection d'une plante de Solanum tuberosum L. subsp. Tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja résistante aux nématodes Globodera, avec des marqueurs moléculaires dérivés de la SEQ ID No 1. L'invention se rapporte enfin à l'utilisation d'amorces ou de sondes polynucléotidiques dérivées de la SEQ ID No. 1 pour la détection de plantes Solanacées résistantes aux nématodes. 30 35 7 LISTAGE DES SEQUENCES SEQ ID No. 1 : SEQ ID No. 2 : SEQ ID No. 3 : SEQ ID No. 4 : SEQ ID No. 5 : SEQ ID No. 6 : SEQ ID No. 7 : SEQ ID No. 8 : SEQ ID No. 9 : SEQ ID No. 10 : SEQ ID No. 11 : SEQ ID No. 12: SEQ ID No. 13 : SEQ ID No. 14 : SEQ ID No. 15 : SEQ ID No. 16 : SEQ ID No. 17 : SEQ ID No. 18 : SEQ ID No. 19 : SEQ ID No. 20 : SEQ ID No. 21 : SEQ ID No. 22 : SEQ ID No. 23 : SEQ ID No. 24 : SEQ ID No. 25: SEQ ID No. 26 : SEQ ID No. 27 : SEQ ID No. 28 : SEQ ID No. 29 : SEQ ID No. 30 : Séquence génomique du gène GpaV Protéine GpaV ADNc 1 Protéine codée par 1'ADNc 1 ADNc B6 Protéine codée par 1'ADNc B6 ADNc 8 Protéine codée par l'ADNc 8 ADNc 9 Protéine codée par 1'ADNc 9 ADNc Hl Protéine code par l'ADNc H1 Amorce MS063_2F Amorce MS0632R Amorce MS092F Amorce MS092R Amorce ASC 102_F Amorce ASC102_R Amorce ASC23 1 F Amorce ASC231_R Amorce ASC240F Amorce ASC240R Amorce Z751 2F Amorce Z751 2R Amorce Z1505 6F Amorce Z1505 R Amorce Z1505 8F Amorce Z1505 4R Amorce Q63F Amorce Q63R DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention concerne le gène GpaV de résistance aux nématodes, isolé de Solanum sparsipilum une espèce sauvage de Solanacée apparentée à la pomme de terre. L'invention concerne la séquence polynucléotidique de ce gène comprenant la partie codante du gène ainsi que des séquences régulatrices situées en amont et en aval de ces séquences codantes. L'invention a aussi pour objet des cassettes d'expression comportant la partie codante de ce gène, des vecteurs ainsi que les polypeptides codés par le gène Gpa V. Le gène GpaV confère aux plantes Solanacées une résistance monogénique de haut niveau aux nématodes. Avec le gène de résistance GpaV, il est donc maintenant possible de conférer une résistance aux nématodes à d'autres plantes appartenant à la famille des Solanacées et notamment à des plantes d'espèces légumières largement cultivées. Par « résistance aux nématodes Globodera », on entend la résistance de plantes, en particulier de plantes Solanacées, aux nématodes du genre Globodera. Les tests qui sont pratiqués couramment sont des tests sur plantes en pots, inoculées soit avec des kystes, soit avec des J2 déjà éclos. En fin de culture, on compte le nombre de kystes néoformés sur les racines et on le compare avec le nombre de kystes néoformés sur un témoin sensible (par exemple, la variété Désirée sensible à G. pallida et G. rostochiensis). La procédure pour réaliser le test de résistance est décrite dans la directive 2007/33/CE de l'union européenne. Le test de résistance à G. pallida permet de mesurer le nombre de kystes néoformés sur une plante de pomme de terre après un cycle complet du nématode. Il est réalisé sur 4 plantes (4 répétitions) de chaque génotype avec des kystes de la population Chavornay, qui correspond à un pathotype Pa3 dans la classification de Kort et al. (1977). Les tubercules sont plantés individuellement dans un pot contenant 400 grammes d'un mélange de terreau et de terre franche, auxquels sont ajoutés 10 kystes de G. pallida. Ce nombre de kystes est suffisant pour obtenir, après éclosion, 5 à 10 larves de nématode par gramme de sol. Les plantes sont mises en culture en serre. Un cycle complet de culture est effectué afin de laisser le temps aux nématodes de se développer et de s'enkyster. Au bout de quatre mois de culture, le contenu de chaque pot est lavé et tamisé afin de permettre le comptage des kystes néoformés. La moyenne des nombres de nématodes retrouvés sur chaque génotype de pomme de terre est comparée à la moyenne des nombres de nématodes retrouvés sur la variété témoin Désirée, sensible à G. pallida, en suivant le protocole de la directive 2007/33/CE du conseil du 11 juin 2007, publiée au journal officiel de l'Union européenne du 16/06/2007. 8 Par « résistance aux nématodes Globodera », on entend donc la résistance de plantes Solanacées, pour lesquelles on obtient moins de 200 ou moins de 100 kystes néoformés, de préférence entre 0 et 100 kystes néoformés, plus préférentiellement entre 0 et 80 kystes néoformés après réalisation du test selon le protocole ci-dessus. Typiquement, dans les mêmes conditions il est observé plus de 400 kystes sur la variété sensible Désirée. La présente invention concerne la résistance aux nématodes du genre Globodera qui sont des ravageurs bien connus des plantes de la famille des Solanacées. On citera en particulier Globodera pallida et Globodera rostochiensis qui infestent la pomme de terre, la tomate et l'aubergine, ainsi que Globodera mexicana qui infecte la tomate et des Solanum apparentées à la pomme de terre et Globodera tabacum (incluant les sous-espèces Globodera tabacum tabacum, Globodera tabacum virginiae et Globodera .tabacum solanacearum) qui infecte principalement le tabac mais aussi le piment et certaines espèces apparentées à la pomme de terre. Le gène GpaV de Solanum sparsipilum confère une résistance aux nématodes Globodera aux plantes Solanacées et en particulier aux plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L. et Nicotiana tabacum ainsi qu'aux plantes appartenant au genre Capsicum. Avantageusement, le gène GpaV confère une résistance aux nématodes à la pomme de terre (Solanum tuberosum L. et Solanum phureja) dont notamment les nombreux cultivars exploités commercialement. Les pommes de terre cultivées comprennent les deux sous-espèces : Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum et Solanum tuberosum L. subsp. Andegenum ainsi que Solanum phureja. Dans un mode de réalisation préféré, le gène GpaV confère une résistance aux nématodes aux pommes de terre cultivées de la sous-espèce Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum. Polynucléotides L'invention concerne donc la séquence polynucléotidique du gène GpaV représenté à la SEQ ID No. 1. La SEQ ID No.1 comporte également des séquences en amont en en aval de la séquence du codante du gène GpaV. En particulier, la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1 contiennent notamment le promoteur du gène GpaV de résistance aux nématodes. L'invention se rapporte donc également au promoteur du gène GpaV de résistance aux nématodes et en particulier au polynucléotide ayant la séquence de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No.l. La séquence codante du gène GpaV correspond aux positions suivantes sur la SEQ ID No. 1 : 1822-2330, 2526-3615, 4227-4532 et 6844-8322. Cette séquence codante est représentée à la SEQ ID No. 3. De préférence, la résistance aux nématodes est obtenu par transformation de plantes Solanacées avec le polynucléotide de la SEQ ID No.1 ou par introgression d'un fragment génomique comprenant le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 dans les plantes Solanacées. Au final, le fragment génomique de Solanum sparsipilum comprenant le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 introgressé dans une plante d'intérêt a de préférence une taille inférieure à 20, 50, 200, 250, 500 kb ou 1Mbp. Dans un autre mode de réalisation, la résistance aux nématodes est obtenue par transformation de plantes Solanacées et expression du polynucléotide de la SEQ ID No.3 ou par expression du polypeptide de la SEQ ID No. 2 dans les Solanacées. Le transcrit du gène GpaV est susceptible d'épissage alternatif et différents ARN messagers correspondant au gène GpaV ont été identifiés. Les SEQ ID No. 5, 7, 9 et 1l représentent des ADNc préférés (ADNc B6, ADNc 8, ADNc 9 et ADNc Hl) correspondant à différents ARN messagers. Dans un autre mode de réalisation, la résistance aux nématodes est obtenue par transformation de plantes Solanacées et expression du polynucléotide de la SEQ ID No.5, 7, 9 ou 11 ou par expression du polypeptide de la SEQ ID No. 6, 8, 10 ou 12 dans les Solanacées. Le gène GpaV comporte des exons aux positions suivantes sur la SEQ ID No.1 : 1658-2330 (exon 1), 2526-3615 (exon 2), 4227-4532 (exon 3), 6844-8331 (exon 4) et 8465-8811 (exon 5). Différentes possibilités de séquences codantes résultant de différents types d'épissage alternatif ont été identifiées. Ces séquences ont été construites à partir des séquences obtenues par RACE et RT-PCR. Les régions 5' et 3' UTR n'ont pas été représentées : les séquences débutent à l'ATG (exon 1) et se terminent au premier codon stop rencontré (en fonction du décalage de cadre de lecture dû à l'épissage alternatif, le codon stop peut être dans un exon ou un intron). Ces ADNc additionnels correspondent aux positions suivantes sur les exons/introns de la SEQ ID No. 1 : cDNA_2 (El : 1-509, E2 : 510-1599, E4 : 1600-3081), cDNA_3 (El : 1-509, E3 : 510-519), cDNA_4 (El : 1-509, E4: 510-549), cDNA_5 (El : 1-509, 8E2 : 510-633, E3 : 634-939, E4: 940-2421), cDNA 6 (E1 : 1-509, 8E2 : 510-633, E4 : 634-2115), cDNA 7 (El : 1-509, Il : 510-528), cDNA 8 (E1 :1-509, E2 : 510-1599, I2 : 1600-1638), cDNA 9 (E1 : 1-509, E2 : 510-1599, E3 1600-1905, I3 : 1906-1992), cDNA_10 (El : 1-509, 8E2 : 510-633, I2 : 634-672) et cDNA 1l (El : 1-509, 8E2 : 510-633, E3 : 634-939, I3 : 940-1026). L'invention se rapporte aussi aux polynucléotides correspondants à ces différents ADNc et aux polypeptides codés par ces ADNc. Dans un autre mode de réalisation, la résistance aux nématodes est obtenue par transformation de plantes Solanacées et expression d'un polynucléotide correspondant à l'un des différents ADNc ci-dessus ou par expression d'un polypeptide codé par l'un des ADNc ci-dessus. L'invention a pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi les polynucléotides suivants : - le polynucléotide de la SEQ ID No.1, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID No. 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 et le polynucléotide de la SEQ ID No. 11 ; - un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No.12. L'invention a également pour objet un polynucléotide isolé conférant aux plantes Solanacées une résistance aux nématodes Globodera, ledit polynucléotide isolé étant choisi parmi : - un polynucléotide présentant au moins 80% d'homologie avec le polynucléotide de la SEQ ID No.1, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11 ; - un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 1, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 3, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 5, d'un polynucléotide de la SEQ ID 7, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 11. De préférence, les polynucléotides de la présente invention sont isolés d'une plante résistante aux nématodes de l'espèce Solanum sparsipilum. De préférence, les polynucléotides de la présente invention confèrent une résistance aux nématodes Globodera aux plantes des espèces Solanum tuberosum L. (ssp. tuberosum et andigena), Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. Préférentiellement, les polypeptides de la présente invention confèrent une 35 résistance aux nématodes Globodera pallida et Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, Globodera tabacum ssp. virginiae et Globodera tabacum ssp. solanacearum, et Globodera mexicana. Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN complémentaire ou génomique. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés. Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique. Dans un premier mode de réalisation, l'invention se rapporte aux polynucléotides 15 des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 et 11. L'invention concerne aussi des polynucléotides présentant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11. De préférence, l'invention concerne des polynucléotides présentant au moins 75%, 20 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité sur toute leur longueur avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11. L'invention concerne aussi des polynucléotides présentant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'homologie avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11. 25 L'invention concerne aussi des polynucléotides présentant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'homologie sur toute leur longueur avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11. L'invention se rapporte aussi à des fragments d'au moins 500bp, lkb, 1.5kb, 2kb ou 2.5kb des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11. 30 Le terme "fragment" d'un polynucléotide désigne un polynucléotide comprenant une partie mais pas la totalité du polynucléotide dont il est dérivé. De préférence, ces polynucléotides confèrent une résistance aux nématodes aux plantes Solanacées lorsque ces polynucléotides sont introduits et exprimés dans ces plantes. Par nucléotides identiques, on entend des nucléotides invariants ou inchangés entre deux séquences. Ces polynucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence. Par homologie, on entend la mesure de la ressemblance entre séquences nucléiques. Ces polynucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au polynucléotide de référence. Le pourcentage d'homologie entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitutions conservatrices des séquences. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré d'homologie entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le programme Lalign (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN form.html) en utilisant la méthode d'alignement "global" et les paramètres par défaut, à l'exception de la matrice de score "DNA" qui sera choisie pour les séquences nucléotidiques. Ce programme permet de calculer le degré d'identité sur la totalité de la séquence. La suite de programmes BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) permet d'identifier rapidement les gènes présentant une forte homologie avec tout ou partie de la séquence testée (QUERY). Le programme donne le pourcentage d'identité pour les portions de séquences homologues (alignement local). Préférentiellement, les polynucléotides présentant un degré d'homologie avec un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. Dans le cas présent, les polynucléotides confèrent une résistance aux nématodes aux plantes de la famille des Solanacées. Les tests de résistance applicables sont notamment décrit ci-dessus et dans les exemples. L'invention concerne aussi des polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective avec l'un des polynucléotides des SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11. De préférence, l'hybridation sélective est effectuée dans des conditions de moyenne stringence et préférentiellement dans des conditions de forte stringence. Par " séquence capable de s'hybrider de manière sélective ", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ug/ml sperme de saumon dénaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1% SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01% SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. L'invention se rapporte de manière générale aux polynucléotides codant pour les polypeptides selon l'invention. En raison de la dégénérescence du code génétique, différents polynucléotides peuvent coder pour un même polypeptide. Le gène GpaV peut être exprimé dans les plantes Solanacées à partir de ses séquences régulatrices homologues notamment pour une surexpression dans Solanum tuberosum L. Ainsi, le gène GpaV peut être exprimé dans une plante Solanacée sous le contrôle du promoteur de la SEQ ID No. 1 de la présente invention ou sous le contrôle d'un promoteur hétérologue. La transformation et l'expression des polynucléotides selon l'invention dans des plantes de la famille des Solanacées confèrent à ces dernières une résistance aux nématodes et en particulier à Globodera tel que décrit ci-dessus. Le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 code pour un polypeptide comprenant des domaines TIR, NBS et LRR. De préférence, les polynucléotides de la présente invention codent pour un polypeptide comprenant au moins un domaine TIR. Polypeptides L'invention se rapporte aussi à des polypeptides dont l'expression dans des plantes Solanacées confère une résistance aux nématodes Globodera. L'invention a ainsi pour objet les polypeptides des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 et 12. L'invention a aussi pour objet des polypeptides présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec l'un des polypeptides des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 et 12. Par acides aminés identiques, on entend des acides aminés invariants ou inchangés entre deux séquences. Ces polypeptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de référence L'invention a également pour objet des polypeptides présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% de similarité avec l'un des polypeptides des SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 et 12. Par similarité, on entend la mesure de la ressemblance entre séquences protéiques. Ces polypeptides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de référence. Le degré de similarité entre deux séquences, quantifié par un score, est basé sur le pourcentage d'identités et/ou de substitutions conservatrices des séquences. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre polypeptides sont connues de l'homme du métier. Pour calculer le degré d'identité sur l'ensemble de la séquence (alignement global), on peut employer par exemple le programme Lalign (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html) en utilisant la méthode d'alignement "global" et les paramètres par défaut. Le programme BlastP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) permet d'identifier rapidement les gènes présentant une forte homologie avec tout ou partie de la séquence testée (QUERY). Le programme donne les pourcentages d'identité et de similarité pour les portions de séquences homologues (alignement local). Les polypeptides selon l'invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. Les polypeptides de la présente invention lorsqu'ils sont exprimés dans une plante de la famille des Solanacées confèrent une résistance aux nématodes et en particulier à Globodera tel que décrit ci-dessus. Le polypeptide de la SEQ ID No. 2 comprend des domaines TIR, NBS et LRR. De préférence les polypeptides de la présente invention comprennent au moins le domaine TIR. Cassettes d'expression Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour les polypeptides selon l'invention. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide par une cellule hôte ou un organisme hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Typiquement, ces cassettes d'expression comprennent dans le sens de la transcription: - un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; - un polynucléotide selon l'invention; - une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte. Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène GpaV. De préférence, les cassettes d'expression de la présente invention sont pour l'expression des polynucléotides ou des polypeptides de la présente invention dans les plantes, les graines, les tissus végétaux et les cellules végétales et plus particulièrement pour l'expression dans les plantes Solanacées. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les plantes on citera les promoteurs CaMV 35S, les promoteurs T-DNA, les promoteurs de gènes codant pour des ubiquitines (Garbarinov et al.1994, 1995), des promoteurs exprimés spécifiquement dans les racines tels que Tob, RB7 et SIREO (Opperman et al. 1994, Jones et al. 2008). Ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation, les polynucléotides de la présente invention sont exprimés dans les plantes Solanacées et en particulier dans les plantes de l'espèce Solanum tuberosum L. sous le contrôle d'un promoteur fort constitutif tel que le promoteur 35S. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les polynucléotides de la présente invention sont exprimés dans les plantes Solanacées et en particulier dans les plantes de l'espèce Solanum tuberosum L. sous le contrôle d'un promoteur spécifique des racines. Dans un mode de réalisation préféré, les polynucléotides de la présente invention sont exprimés sous le contrôle du promoteur de la SEQ ID No. 1 et en particulier sous le contrôle du polynucléotide ou d'un fragment du polynucléotide de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1. Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression des polypeptides ou des polynucléotides. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans la cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. Pour l'expression dans les plantes Solanacées, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant un terminateur choisi parmi la séquence terminatrice de la SEQ ID No. 1 (8811-10046) ou des séquences terminatrices de gènes d'ubiquitine. Avantageusement, les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur. Vecteurs L'invention se rapporte aussi à des vecteurs comprenant un polynucléotide selon l'invention ou une cassette d'expression selon l'invention. La présente invention concerne donc également des vecteurs de réplication ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte comprenant au moins un polynucléotide ou une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment correspondre à un plasmide, un cosmide, un bactériophage, un virus ou un chromosome artificiel dans lequel est inséré un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont bien connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer, de se propager ou de s'insérer dans le génome d'une cellule hôte ou d'un organisme hôte afin d'induire notamment l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés en fonction de l'organisme hôte à transformer, et en fonction de la technique de transformation mise en oeuvre. De préférence, les vecteurs de la présente invention permettent l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide selon l'invention dans une plante de la famille des Solanacées ou dans une cellule végétale, une graine ou un tissu végétal issu d'une plante Solanacée. Parmi les vecteurs habituellement utilisés pour la transformation de la pomme de terre on citera notamment pBIN19 et dérivés (Bevan et al. 1984), la série des pCAMBIA et dérivés, la série des pPZP (Hajdukiewicz et al. 1994) et dérivés, en particulier les vecteurs GATEWAY compatibles, par exemple p*GW (Karimi et al. 2002), la série des pGWB (Nakagawa et al. 2009) ou encore les vecteurs décrits dans les reviews Hellens et al. 2000 et Karimi et al. 2007. Cellules et organismes hôtes La présente invention a également pour objet, un procédé de transformation d'une cellule ou d'un organisme hôte par intégration dans ladite cellule ou dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide ou d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention. Le polynucléotide peut être intégré dans le génome de la cellule/de l'organisme hôte ou se répliquer de manière stable dans la cellule/l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des cellules/organismes hôtes sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature. L'invention a donc également pour objet une cellule hôte transformée avec un polynucléotide selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention ou avec un vecteur selon l'invention. De préférence, ces cellules transformées sont des cellules végétales ou des protoplastes de cellules végétales. La présente invention concerne en outre un organisme hôte transformé avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur. Par organisme hôte on entend un organisme non humain. De préférence, l'organisme hôte transformé est une plante, une graine ou un tissu végétal. Ainsi l'invention se rapporte aussi à une plante transformée avec un polynucléotide selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. De préférence, la plante transformée est une plante Solanacée dans laquelle on exprime ou l'on sur-exprime le gène GpaV afin de conférer à cette plante une résistance 25 aux nématodes Globodera. Avantageusement, la plante transformée est choisie parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. Plus préférentiellement, la plante transformée est une pomme de terre et plus 30 particulièrement un cultivar de pomme de terre exploité commercialement. Les plantes Solanacées peuvent être rendues résistantes aux nématodes par transformation avec un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Les plantes transformées sont donc typiquement des plantes transgéniques ayant intégré dans leur génome un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur 35 selon l'invention. Ces cellules, organismes hôtes et plantes transformées expriment polynucléotide ou un polypeptide selon l'invention. Cependant, l'invention concerne aussi des plantes, et particulièrement des plantes Solanacées cultivées commercialement dans lesquelles les polynucléotides de la présente 5 invention notamment le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 a été introduit par introgression. Ainsi, l'invention se rapporte à des plantes choisies parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum comprenant un polynucléotide selon 10 l'invention. Préférentiellement, l'invention a pour objet une pomme de terre (Solanum tuberosum ou Solanum phureja) comprenant un polynucléotide selon l'invention et en particulier un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1. Plus préférentiellement, l'invention a pour objet une pomme de terre (Solanum 15 tuberosum L subsp. tuberosum) comprenant un polynucléotide selon l'invention et en particulier un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1. Procédés pour conférer une résistance aux nématodes aux plantes Solanacées Le gène GpaV de Solanum sparsipilum conférant une résistance aux nématodes a été identifié. Ce gène peut maintenant être introduit dans des espèces de Solanacées 20 d'intérêt. Pour l'introduction du gène GpaV dans les plantes Solanacées, il est essentiel de disposer de marqueurs moléculaires spécifiques du gène GpaV de la présente invention. Ces marqueurs moléculaires sont notamment des amorces ou des sondes dérivées de la SEQ ID No.l. 25 L'invention se rapporte donc aussi à des marqueurs de sélection dérivés des polynucléotides de la présente invention et à leur utilisation pour la sélection assistée par marqueurs de plantes résistantes aux nématodes et notamment de plantes de la famille des Solanacées telles que les pommes de terre. Un autre aspect de l'invention est donc l'utilisation d'amorces ou de sondes 30 polynucléotidiques dérivées de la SEQ ID No. 1 pour la détection de plantes Solanacées résistantes aux nématodes, pour la détection de plantes exprimant un polynucléotide selon la SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9 ou 11 ou pour la détection de plantes comprenant le gène de résistance aux nématodes GpaV de la SEQ ID No. 1. Cette détection peut s'effectuer selon des méthodes bien connues de l'homme du 35 métier telles que la PCR ou l'hybridation. De préférence, le gène GpaV est inséré dans le génome de la plante d'intérêt par transformation ou transgénèse. Les espèces d'intérêt sont notamment les plantes choisies parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. L'invention a donc pour objet un procédé pour conférer une résistance aux nématodes Globodera à une plante Solanacée comprenant les étapes suivantes : - transformation de la plante avec un polynucléotide selon l'invention, une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur selon l'invention ; - sélection d'une plante résistante aux nématodes Globodera. De préférence, la sélection d'une plante résistante aux nématodes s'effectue à l'aide de marqueurs ou d'amorces dérivés des polynucléotides de la présente invention. La transgenèse consiste à introduire dans le génome de la plante hôte un fragment d'ADN codant pour un gène impliqué dans l'expression d'un caractère d'interêt. La méthode la plus couramment utilisée est la transformation via Agrobacterium tumefasciens. Le fragment d'ADN est recombiné dans un vecteur binaire (voir la description des vecteurs) qui sera introduit dans une souche d'Agrobacterium tumefasciens par électroporation ou par choc thermique. Cette souche bactérienne sera utilisée pour infecter des tissus végétaux ou des protoplastes, et le fragment d'ADN d'intérêt sera intégré dans le génome de certaines cellules. Ces cellules seront cultivées sur un milieu favorisant la régénération, afin de régénérer une plante entière. Les plantes transformées seront sélectionnées soit par culture sur un milieu additionné d'antibiotique ou d'herbicide si un gène de résistance à l'antibiotique ou à l'herbicide a été transféré conjointement au gène d'intérêt, soit par des techniques moléculaires (PCR avec des amorces spécifiques du gène d'intérêt) directement (de Vetten et al. 2003). Une technique alternative à la transformation via Agrobacterium tumefasciens, est la transformation par biolistique. L'ADN contenant le gène d'intérêt est déposé sur des billes de métal (en général de l'or), et ces billes de métal sont projetées sur des tissus végétaux grâce à un canon à particule. L'ADN pénètre dans les cellules et dans certains cas s'intégre dans le génome. La sélection des plantes transformée s'effectue de la même façon que pour la transformation via Agrobacterium tumefasciens. Dans un autre mode de réalisation préféré, le gène GpaV de résistance aux nématodes est inséré dans la plante d'intérêt par introgression. Dans ce cas, la plante d'intérêt est de préférence une pomme de terre et l'introgression comporte un croisement d'une plante des espèces Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. andigena, ou Solanum phureja avec une plante sauvage apparentée à la pomme de terre, Solanum sparsipilum, résistante aux nématodes. Ces techniques d'introgression suivies de rétrocroisements pour obtenir le retour au fond génétique du receveur (plante d'intérêt) sont bien connues de l'homme du métier. Ces procédés d'introgression sont rendus possibles par l'identification du gène GpaV et de sa séquence polynucléotidique. Les polynucléotides de la présente invention, des marqueurs ou des amorces dérivables de ces polynucléotides sont notamment utilisables dans la sélection assistée par marqueurs. L'invention se rapporte ainsi à un procédé pour rendre résistante une plante des espèces Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. andigena, ou Solanum phureja aux nématodes Globodera comprenant les étapes suivantes : - introgression d'un segment d'ADN génomique de Solanum sparsipilum comprenant un polynucleotide selon l'invention dans une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum ; sélection, avec des marqueurs moléculaires dérivés de la SEQ ID No. 1, d'une plante des espèces Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, Solanum tuberosum L. ssp. 15 andigena, ou Solanum phureja résistante aux nématodes Globodera. Au final, le fragment génomique de Solanum sparsipilum comprenant le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 introgressé dans une plante d'intérêt a de préférence une taille inférieure à 20, 50, 200, 250, 500 kb, lMbp ou 2Mbp. Solanum sparsipilum est une espèce diploïde alors que Solanum tuberosum est une 20 espèce tétraploïde. L'introgression d'un gène de S. sparsipilum dans le génome de S. tuberosum nécessite donc un changement de niveau de ploïdie. On peut, par parthénogenèse in situ, ou par culture d'anthères ou d'ovules, obtenir des clones de S. tuberosum diploïdes. Ces clones diploïdes sont sexuellement compatibles avec S. sparsipilum. Inversement, on peut passer du niveau diploïde au niveau tétraploïde soit en 25 utilisant l'aptitude de certains clones de pomme de terre sauvages ou cultivés à produire des diplogamètes, soit en provocant la polyploïdisation par culture in vitro ou par traitement avec des agents chimiques comme la colchicine. L'introgression d'un gène d'une espèce sauvage diploïde dans le génome d'une espèce cultivée tétraploïde peut donc se faire par une succession de pseudo-backcross (on change de clone de S. tuberosum à 30 chaque croisement car la pomme de terre supporte mal la consanguinité) soit au niveau diploïde soit au niveau tétraploïde. A chaque nouvelle génération on sélectionne sur la base des marqueurs (dans le cas qui nous intéresse, mais on peut aussi faire de la sélection phénotypique) les individus qui possèdent le gène d'intérêt (ou plus exactement l'allèle de résistance au gène en question). Si la sélection a été faite au niveau diploïde, il faut 35 repasser au niveau tétraploïde au bout de 4 à 5 générations afin d'obtenir une plante d'un bon niveau agronomique. Si un clone diploïde de S. sparsipilum a été doublé dès le départ, il n'y a pas de changement de ploïdie ultérieur, mais il est plus difficile de se débarrasser d'allèles défavorables (ayant une influence sur la teneur en glycoalcaloïdes, la qualité agronomique et gustative) apportés par le génome du parent sauvage. FIGURES Figure 1 : Génotype et phénotype des individus présentant un événement de recombinaison entre les marqueurs MS063_2 et Z751 2R. EXEMPLES 1. Matériel végétal : Le QTL GpaVspi a été cartographié grâce à une descendance interspécifique 15 (nommée 96D31/00D53) de 239 clones diploïdes issue du croisement entre les deux accessions parentales sp1329.18 et Caspar H3 (Caromel et al. 2005). Le parent résistant à G. pallida, sp1329.18, est un clone diploïde de l'accession de S. sparsipilum PI310984, provenant de la collection de Sturgeon Bay (USA). Le parent sensible, Caspar 113, est un clone dihaploïde obtenu par parthénogenèse in situ à l'INRA de Ploudaniel (France) à 20 partir de la variété tétraploïde Caspar. 1393 plantes supplémentaires, issues du même croisement, ont été analysées pour la cartographie à haute résolution du QTL GpaVspr. Le génotype 96D31.75 fait partie de la descendance 96D31. Il possède l'allèle de sensibilité au QTL GpaVspi et l'allèle de résistance au QTL GpaXIspi (Caromel et al. 2005). Deux génotypes de la descendance 96D31, hétérozygotes pour la résistance au 25 locus GpaVspr, ont été croisés pour donner naissance à la descendance 05D2. Quarante individus de cette descendance ont été analysés avec des marqueurs flanquant le QTL GpaVspi afin d'identifier le génotype 05D2.12, homozygote au locus GpaVspr. II. Tests de résistance à G. pallida pour la cartographie génétique : 30 La résistance des clones de pomme de terre à G. pallida, pour la cartographie du QTL GpaVspi et pour la cartographie à haute résolution du gène sous-jacent au QTL GpaVspi, a été évaluée par dénombrement des kystes néoformés comme décrit dans la publication Caromel et al. 2005. Brièvement, quatre tubercules par génotype ont été plantés séparément dans des pots en plastiques, remplis avec 400 cm3 d'un mélange de 35 sable et de terre franche. Dix kystes de G. pallida, pathotype Pa2/3 (population 10 Chavornay), ont été ajoutés dans chaque pot de façon à obtenir une densité d'infestation de 5 à 10 juvéniles de G. pallida par gramme de sol. Les plantes ont été cultivées en serre pendant quatre mois. Le témoin sensible était la variété Désirée. Les kystes néoformés ont été séparés du substrat par élutriation. Ils ont été dénombrés séparément pour chaque pot. Les données brutes ont été transformées par une fonction logarithmique : log10 (nombre de kystes + 1). III. Développement de nouveaux marqueurs et cartographie génétique du gène sous-jacent au QTL GpaVspi Le QTL GpaVspi a été cartographié sur le chromosome V de sp1329.18, dans un intervalle de 5 cM compris entre les marqueurs GP21-SCAR et TG432P-CAPS (Caromel et al. 2005). Afin de développer de nouveaux marqueurs moléculaires dans cet intervalle, une recherche d'homologie a été réalisée entre les séquences de GP21-SCAR et TG432PCAPS et les séquences de clones BAC de Solanum demissum disponibles dans les bases de données publiques. La séquence du marqueur TG432P-CAPS a permis d'identifier le clone BAC AC150162. Le clone BAC AC150162 est chevauchant, avec les clones BAC AC 151803 et AC154033 (Kuang et al. 2005). Les marqueurs ASC231, ASC240, Z751F2R, ASC102 et MS092 ont été développés à partir des séquences des BAC AC151803 et AC154033. Le marqueur MS063_2 à été développé à partir de la séquence de l'EST de pomme de terre CK864217. Les séquences des amorces permettant d'amplifier ces marqueurs sont indiquées dans le listage de séquences. Afin de cartographier le gène sous-jacent au QTL GpaVspi comme un locus marqueur, nous avons converti les données quantitatives de résistance (nombre de kystes de G. pallida néoformés) en données qualitatives (résistant vs. sensible). Un clone a été considéré comme possédant l'allèle de résistance au QTL GpaVspi quand un nombre moyen inférieur à 13 kystes néoformés par pot a été retrouvés, et un clone a été considéré comme possédant l'allèle de sensibilité au QTL GpaVspi quand un nombre moyen supérieur à 70 kystes néoformés par pot a été retrouvé. Les clones sur lesquels ont été retrouvés un nombre moyen de kystes néoformés compris entre 13 et 70 n'ont pas été pris en considération. De cette façon, nous avons cartographié le gène sous-jacent au QTL GpaVspi, dans la descendance de cartographie de 239 clones utilisée pour la détection du QTL (Caromel et al. 2005), entre les marqueurs MS063_2 et Z751F_2R, à 0,4 cM de chacun de ces deux marqueurs. Afin de trouver des événements de recombinaison plus proches du gène sous-jacent 35 au QTL GpaVspi, les 1393 clones, issus du croisement des mêmes parents sp1329.18 et Caspar H3, ont été triés à l'aide de marqueurs moléculaires en plusieurs étapes. Un premier tri a été effectué sur l'ensemble de ces plantes avec les marqueurs GP21-SCAR (Caromel et al. 2005) et GP179 (Meksem et al. 1995), flanquant largement l'intervalle de confiance du QTL GpaVspi, mais faciles à utiliser sur de grands effectifs. Les 107 clones présentant un événement de recombinaison entre ces deux marqueurs ont ensuite été génotypés avec les marqueurs MS063_2 et Z751F_2R, ce qui nous a permis d'identifier 12 clones présentant un événement de recombinaison entre ces deux marqueurs. Les 12 clones présentant un événement de recombinaison entre MS063_2 et Z751F_2R ont été phénotypées selon le protocole décrit ci-dessus pour la cartographie de QTL, avec quatre répétitions par clone. Sur les 12 clones testés, 5 ont été considérés comme résistants, cinq comme sensibles, et deux n'ont pas été pris en compte (figure 1). Les 12 clones présentant un événement de recombinaison entre MS063_2 et Z751F_2R ont également été génotypés avec cinq marqueurs définis d'après la séquence des clones BAC de S. demissum (AC151803 et AC154033): les marqueurs ASC231, ASC240, Z751, ASC 102 et MS092. La cartographie du caractère de résistance et de ces 5 nouveaux marqueurs a permis de localiser le gène sous-jacent au QTL GpaVspl entre les marqueurs ASC231 et ASC240 (figure 1). Un événement de recombinaison sépare le locus Gpa1/spi du marqueur ASC231 et deux événements de recombinaisons le séparent du marqueur ASC240. Aucun événement de recombinaison n'a permis de séparer les marqueurs ASC102 et MS092 de la résistance à G. pallida. IV. Atterrissage chromosomique au locus GpaVspl et identification de gènes candidats Sur la séquence du clone BAC de S. demissum AC151803, les marqueurs ASC231 et ASC240 sont distants de 30 kb. Trois gènes putatifs ont été annotés dans ces 30 kb : - SDM1_55t00002 ="Leucine Rich Repeat family protein", position 18476 à 20167, - SDM155t00003 ="Disease resistance protein, putative", position 22149 à 26161, SDM1_55t00004 ="Putative mTERF domain containing protein, identical", position 28630 à 29641. Plusieurs gènes de résistance, décrits dans la bibliographie (van Ooijen et al. 2007), comprennent un domaine TIR (Toll-interleukin 1 receptor homology region), un domaine NB-ARC (nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1 resistance proteins, and CED-4) et un domaine LRR (leucine-rich repeat). Les domaines TIR et NB-ARC sont détectés dans le gène putatif SDMI_55t00003 et le domaine LRR est détecté dans le gène putatif SDMI_55t00002. Ces deux gènes putatifs, annotés sur la séquence du clone BAC de S. demissum, espèce sensible à G. pallida, pourraient donc former un seul gène fonctionnel chez l'accession de S. sparsipilum résistante à G. pallida. Un autre argument allant dans ce sens provient de la séquence du gène Bs4 conférant la résistance à Xanthomonas campestris pv. tomato chez la tomate (Schornack et al. 2004). Ce gène, cartographié en position colinéaire au locus GpaVspl, possède les trois domaines TIR, NBS et LRR. Il était donc probable que les deux gènes putatifs SDM1_55t00002 et SDM1_55t00003 n'en forment en réalité qu'un seul chez S. sparsipilum. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons amplifié des ADNc correspondant à ce locus chez S. sparsipilum et les avons séquencés. Les séquences correspondant aux domaines TIR, NB-ARC et LRR se retrouvent sur un même ADNc (séquence ADNc_Hl), confirmant ainsi que les deux gènes putatifs détectés sur la séquence de S. demissum n'en forment en réalité qu'un seul chez S. sparsipilum. Les gènes de la famille des TIR-NBARC-LRR étant des gènes de résistance classique, nous avons décidé de cloner l'allèle de résistance de ce gène chez sp1329.18 pour valider fonctionnellement son implication dans la résistance à G. pallida. V. Obtention de la séquence de l'allèle de résistance du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL GpaVspl Le couple d'amorce Z1505_6F/Z1505_R a été défini à partir des séquences des clones BAC chevauchant de S. demissum (AC 151803 et AC 154033) et de S. lycopersicum (AC232763), pour amplifier par PCR la totalité de la séquence codante du gène TIR-NBARC-LRR et environ 2000 paires de bases de séquences flanquantes 5' et 3'. L'amplification a été réalisée dans 50 pl à partir de 50 ng d'ADN du génotype 05D2.12, issus d'un croisement frère-soeur entre deux génotypes de la descendance de cartographie et homozygote au locus GpaVspl, en utilisant une unité d'ExTaq HS de Takara (Lonza, Verviers, Belgique) selon les condition décrites dans le protocole fourni par le fournisseur, avec le programme d'amplification suivant : une étape de dénaturation initiale à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 98°C pendant 10 secondes et une étape d'hybridation des amorces et synthèse du brin complémentaire à 68°C pendant 10 minutes, et suivis d'une étape finale d'élongation à 72°C pendant 15 minutes. La taille et la quantité du produit de PCR obtenu a été estimée par migration de 2 gl de produit de PCR sur gel d'agarose à 0,8 %. Huit amplifications indépendantes ont été réalisées. Les produits de PCR ont été purifiés par précipitation avec deux volumes d'éthanol absolu et de l'acétate de sodium à 0,3 M de concentration finale, lavé deux fois avec 600 µl d'éthanol à 70 % et re-suspendu dans de l'eau ultra-pure. Le produit de PCR purifié a été envoyé à séquencer chez la société Cogenics (Meylan, France). La séquence obtenue a servi de séquence de référence pour l'étape ultérieure d'amplification et de clonage. VI. Validation fonctionnelle du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL GpaVspr Le couple d'amorce Z1505_8F/Z15054R a été défini à partir de la séquence du fragment obtenu par PCR avec le couple d'amorce Z1505_6F/Z1505_R sur l'ADN du génotype 05D2.12. Ces amorces ont été utilisées pour amplifier par PCR la totalité du gène TIR-NB-ARC-LRR avec 1821 paires de bases de séquences amont en 5' (avant l'ATG) et 1720 paires de bases de séquences aval après le codon STOP, à partir de l'ADN du génotype sp1329.18 résistant à G. pallida. L'amplification a été réalisée dans 8 fois 20 µl en utilisant l'Herculase II Fusion Enzyme (Agilent Technologies, Massy, France) suivant les instructions du fournisseur. Le programme d'amplification suivant a été utilisé : une étape de dénaturation initiale à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 20 cycles comprenant une étape de dénaturation à 98°C pendant 10 secondes et une étape d'hybridation des amorces et synthèse du brin complémentaire à 68°C pendant 5 minutes, et suivis d'une étape finale d'élongation à 72°C pendant 15 minutes. Après vérification sur gel d'agarose 0,8 %, chaque produit d'amplification a été cloné séparément dans le vecteur binaire pBIN19 (Bevan et al. 1984) digéré par l'enzyme Sali, en utilisant le kit de clonage In-Fusion 2.0 Dry-Down PCR Cloning Kit de Clontech (revendu par Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France) suivant les instructions du fournisseur. Le produit de chaque réaction a été utilisé pour transformer 50 µl de la souche NEB 10-beta Competent E. coli, puis mis en culture selon les instructions du fournisseur (New England BioLabs, revendu par Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France). Pour chacun des huit clonages indépendants, 12 colonies blanches isolées (la couleur indiquant la présence d'un insert dans le plasmide (Bevan et al. 1984)) ont été mises en culture dans 2 ml de milieu LB contenant 50 µg de kanamycine par ml. Un aliquote de la culture a été utilisé pour vérifier par PCR la présence d'un insert de la taille attendue en utilisant le couple d'amorces Z1505_8F/Z1505_4R. Un clone positif par clonage indépendant a été envoyé à séquencer chez la société Cogenics après purification du plasmide avec le kit NucleoSpin Plasmid de Macherey-Nagel (Düren, Allemagne). Deux des huit clones séquencés présentaient une séquence 100 % identique à la séquence de référence obtenue à partir du produit de PCR. Un de ces deux clones, le clone GpaVspl_clone8 a été utilisé 15 pour les étapes ultérieures de validation fonctionnelle. La séquence du fragment cloné correspond à la « séquence génomique GpaVspi » de la SEQ ID No. l . Deux µl de plasmide purifié du clone GpaVspl clone8 ont été introduit par électroporation dans la souche d'Agrobacterium tumefasciens C58 porteuse du plasmide assistant pGV2660 (Deblaere et al. 1985), en utilisant une procédure classique. La souche a été cultivée à 28 °C pendant environ 24 heure dans un milieu LB + kanamycine (50µg/ml) jusqu'à l'obtention d'une densité optique de 0,3 à 600 nm. Des fragments d'entre-noeuds (0,5 û 0,8 cm de long), issus de boutures de pomme de terre cultivées in vitro, ont été mis à incuber pendant 20 minutes dans 15 ml de la solution bactérienne. Les fragments d'entre- noeuds ont ensuite été essorés sur papier filtre et co-cultivés sur un milieu de co-culture « pomme de terre » (tableau 1) supplémenté avec 0,9 mg/L de Thiamine et 39 mg/L d'Acétosyringone puis placés à l'obscurité pendant deux jours à 24°C. Tableau 1 : composition du milieu « pomme de terre » Quantité pour 1 litre de milieu K NO3 2,69 g NH4 NO3 536 mg Ca (NO3)2, 4 H2O 472 mg Mg SO4, 7H2O 418,6 mg KH2 PO4 274 mg KC1 350 mg H3 BO3 6,2 mg Mn SO4, H2O 16,9 mg Zn SO4, 7H2O 10,6 mg M 0,83 mg Cu SO4, 5H2O 0,025 mg Co C12, 6H2O 0,025 mg Nat Mo 04, 2H2O 0,25 mg Myo-inositol 100 mg Glycine 2 mg Thiamine HCL 0,5 mg Pyridoxine HCL 0,5 mg Acide Nicotinique 0,5 mg SO4Fe û 7H2O 37,3 mg Na2EDTA 27,8 mg Saccharose 25 g Vitro Agar 6 g pH ajusté à 5,8 avec KOH Après cette période de coculture, les explants ont été transférés dans des boites de pétri sur un nouveau milieu « pomme de terre » riche en antibiotique de sélection (Kanamycine 300 mg/L), antibiotique pour éliminer la bactérie (Timentin 225 mg/L) et hormones favorisant la régénération (ANA 0,1 mg/L, GA3 0,1 mg/L, BAP 1 mg/L), puis placés en chambre de culture à 20°C. Le milieu de culture a été renouvelé tous les 15 jours. Après 2 à 3 mois de culture, les plantes régénérées ont été isolées des explants puis transférées pour enracinement dans des tubes de culture contenant du milieu « pomme de terre » additionné de 225 mg/L de Timentin et de 300 mg/L de Kanamycine. Les plantes issue d'un événement de transformation et produisant un système racinaire sur le milieu additionné de kanamycine, ont été indexées et multipliées afin de disposer d'un nombre de boutures suffisant pour réaliser les tests de résistance à G. pallida. La résistance à G. pallida des plantes transgéniques a été évaluée par un test in vitro. Six événements de transformation indépendants, régénérés à partir du génotype 96D31.75 possédant l'allèle de sensibilité au QTL GpaVspl, ont été testés. Ces événements de transformation indépendants ont été nommés 96D31.75 A, 96D31.75 B, 96D31.75 C, 96D31.75 E, 96D31.75_F, et 96D31.75 G. Le génotype 96D31.75, transformé avec le gène rapporteur GUS a été utilisé comme témoin (nommé 96D31.75_GUS). Des boutures enracinées ont été transférées dans des boites de Pétri contenant du milieu « pomme de terre » sans saccharose et dans lequel le Vitro Agar a été remplacé par de la Gelrite (Kalys, Saint Ismier, France) à 5g/l. Les boites ont été placées verticalement dans un phytotron réglé à une température de 17°C, hygrométrie 70 %, durée du jour 16 heures et de la nuit 8 heures, intensité d'éclairage de 250 µmol.photon.m2.s-I. Au bout de deux jours, trente racines ont été inoculées par événement de transformation et pour le témoin (2 racines par bouture et 15 boutures par événement de transformation ou pour le témoin). Chaque racine a été inoculée avec 5 juvéniles de G. pallida (population Chavornay) au stade J2 et les boites contenant les boutures inoculées ont été placées horizontalement dans le phytotron. Les racines inoculées ont été excisées 4 semaines après inoculation, immergée 5 min dans une solution d'hypochlorite de calcium à 1 % et colorées 15 secondes dans une solution de Fuchsine Acide (0,1% dans 30 % d'Acide Acétique) à 100°C. Les nématodes sont ainsi colorés en rouge. Les racines ont été ensuite écrasées entre lame et lamelle, et les nématodes aux différents stades de développement ont été dénombrés sous un microscope 28 (grossissement 400). Ils ont été répartis en deux classes : stade femelle d'une part, et autres stades d'autre part (stades mâles, J2 et J3). Les données obtenues sur les six événements de transformation ont été comparées à celle obtenues sur le génotype témoin 96D31.75_GUS, par un test de khi2 à 1 degré de liberté. Selon le test Khi2 les événements de transformation 96D31.75.A, B, C, E et G sont significativement différents du témoin utilisé : ils ont permis le développement d'un nombre significativement plus faible de femelles que dans le témoin (tableau 2). Tableau 2 : Pourcentage de nématodes développés en femelles, 21 jours après inoculation, 10 dans les racines des plantes transformées avec le gène TIR-NBS-LRR. La significativité des différences entre les transformants 96D31.75.A à G et le témoin 96D31.75 transformé avec le gène GUS a été évaluée par une statistique du khi2 à 1 degré de liberté. Événement Effectif % de femelles Khi2 Probabilité Significativité 96D31.75.A 116 21,6 3,94 0,04709 La différence est significative 96D31.75.B 101 15,8 8,41 0,00374 La différence est significative 96D31.75.0 72 11,1 11,45 0,00071 La différence est significative 96D31.75.E 73 15,1 7,54 0,00604 La différence est significative 96D31.75.F 90 26,7 1,15 0,28366 La différence n'est pas significative 96D31.75.G 87 8,0 17,66 0,00003 La différence est significative Témoin 85 34,1 - - - 15 L'expérience a été répétée une seconde fois pour les événements 96D31.75.C, E et G et a une nouvelle fois montré des différences très significatives entre ces trois transformants et le témoin (96D31.75.0 : khi2 = 18,58, p = 4,66.10-5 ; 96D31.75.E : khi2 = 20 36,70, p = 1,36.10-9 ; 96D31.75.G : khi2 = 34,77, p = 3,70.10-9). Ces expériences démontrent que le gène TIR-NB-ARC-LRR est impliqué dans la résistance à G. pallida. VII. Détermination de la séquence codante du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL GpaVspi La séquence codante du gène a été identifiée à partir d'ARN issus de fragments tissulaires prélevé sur le génotype 05D2.12. Des fragments tissulaires ont été prélevés sur des racines inoculées et non inoculées par G. pallida à 6 heures, 2 jours et 4 jours post-inoculation, ainsi que sur des feuilles, des germes et des tiges. Les ARN de chaque échantillon ont été extraits avec le kit RNeasy Plant Mini Kit de Qiagen (Courtaboeuf, France), selon les indications du fournisseur et dosé au spectrophotomètre. Les ARN des différents échantillons ont été mélangés en proportions équivalentes. Un microgramme d'ARN total a été rétro-transcrit avec 200 unités de SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), suivant les instructions du fournisseur. Les extrémités des ARN transcrits à partir du gène TIR-NB-ARC-LRR ont été déterminées par 5' et 3' RACE en utilisant le kit SMART RACE cDNA Amplification Kit (ClonTech, revendu par OZYME). Une série d'expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les amorces définies pour les expériences de RACE et des amorces définies sur les extrémités 5' et 3' des ADNc. Les fragments d'ADNc ont été amplifié par PCR avec une unité d'ExTaq HS de Takara (Lonza, Verviers, Belgique) selon les condition décrites dans le protocole fourni par le fournisseur, avec le programme d'amplification suivant : une étape de dénaturation initiale à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 98°C pendant 10 secondes, une étape d'hybridation des amorces à 60°C pendant 20 secondes et une étape de synthèse du brin complémentaire à 72°C pendant 3 minutes, et suivis d'une étape finale d'élongation à 72°C pendant 10 minutes. Les produits amplifiés ont été clonés et/ou purifiés et envoyé à séquencer chez la société Cogenics. Les séquences obtenues suite aux expériences de RACE et de RT-PCR ont été alignées avec la séquence de l'ADN génomique grâce aux logiciel SIM4 (http://pbil.univlyonl.fr/sim4.php) et Multalin (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html). Les alignements ont permis de déterminer la position des introns et des exons et ont mis en évidence une importante utilisation des mécanismes d'épissage alternatif lors de la maturation des ARNm. Après la région promotrice, le gène GpaVspl comprend 5 exons et 4 introns. L'exon 1 comporte la région 5' non traduite (5'UTR) et le domaine TIR, l'exon 2 comporte le domaine NB-ARC, l'exon 3 comporte le début du domaine LRR, l'exon 4 comporte la fin du domaine LRR jusqu'au codon stop et le début de la région 3' non traduite (3'UTR), et l'exon 5 comporte la fin de la région 3'UTR. Des ARNm correspondant à différents mécanismes d'épissage alternatif ont été observé : rétention des intron 1, intron 2 et/ou intron 3, saut de l'exon 3, utilisation d'un site accepteur cryptique dans l'exon 2 conduisant à une délétion des 966 premières paires de bases de l'exon 2. Des sites de polyadenylation alternatifs ont été identifiés dans les exons 2, 3 et 5 ainsi que dans l'intron 3. Quatre sites d'initiation de la transcription ont été identifiés dans l'exon 1. La rétention d'un intron entraine systématiquement l'apparition d'un codon STOP prématuré avant l'exon suivant. Les séquences nucléotidiques, allant de l'ATG jusqu'au codon STOP, et résultant des différents types d'épissage possibles correspondent aux séquences cDNA_1 à cDNA 11. VIII. Evaluation du niveau d'expression du gène TIR-NB-ARC-LRR sous jacent au QTL GpaVspl Le niveau d'expression du gène TIR-NB-ARC-LRR a été déterminé sous deux conditions (I : Inoculé avec le nématode et NI : Non Inoculé) et en trois points de cinétique (6h, 2 jours et 4 jours après l'infection avec le parasite) dans différent génotypes de la population issue du croisement entre Caspar H3 et sp13219.18. Les génotypes ont été choisis en fonction de leurs combinaisons alléliques au deux QTL GpaVspl et GpaXlspl (Caromel et al. 2005). Le génotype 96D31.139 possède les allèles de résistance aux deux QTL (R5R11), le génotype 96D31.03 possède l'allèle de résistance au QTL GpaVspl et l'allèle de sensibilité au QTL GpaXIspl (R5S11), et le génotype 96D31.152 possède les allèles de sensibilité aux deux QTL (S5S11). Les ARN ont été extraits à partir de 5 fragments racinaires de 5 mm autour du point d'inoculation ou de la zone correspondante pour les plantes non inoculées, avec le kit RNeasy Plant Mini Kit de Qiagen (Courtaboeuf, France). Pour chaque échantillon, 1µg d'ARN a été rétro-transcrit avec 200 unités de SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), suivant les instructions du fournisseur. La réaction a ensuite été diluée 20 fois avec de l'eau ultra-pure. Le niveau d'expression du gène TIR-NB-ARC-LRR a été mesuré par Q-RT-PCR avec le kit SYBR Premix Ex Taq (Takara) sur un appareil MX3005 (Stratagene) suivant les instructions du fournisseur, en utilisant les amorces Q63 et le programme suivant : une étape de dénaturation initiale à 95°C pendant 2 minutes, suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 95°C pendant 20 secondes, une étape d'hybridation des amorces à 55°C pendant 20 secondes et une étape de synthèse du brin complémentaire à 72°C pendant 30 seconde. La courbe de dénaturation du produit amplifié a été calculée après les trois étapes suivantes : 95°C pendant 1 minute, 55°C pendant 30 seconde et 95°C pendant 1 minute. Nous avons utilisé comme référence les données d'expression du gène de la Phosphoglycerate kinase Cytosolique F (PGK) pour la normalisation des résultats obtenus entre les différents échantillons (Coker and Davies 2003). Il a été amplifié selon le même protocole, à l'exception de la température d'hybridation des amorces qui était de 50°C. Les analyses statistiques pour interpréter les résultats bruts donnés par le Mx3005P® QPCR System ont été réalisées à l'aide du logiciel REST® (Pfaffl et al. 2002). Celui-ci fonctionne en se basant sur les valeurs de Ct et l'Efficacité de la Q-RT-PCR. On calcule un ratio d'expression relative entre un gène cible et un gène de référence (ou gène de ménage), dont l'expression reste inchangée dans la cellule au cours du temps. Cela permet de s'affranchir d'éventuelles différences de quantité d'ADNc au départ. Si d'un échantillon à l'autre, la quantité d'ADNc est fortement différente, le gène de ménage, permet de normaliser les résultats. Ce ratio est déterminé suivant la formule : AC Ptarget ( MEAN control - MEAN sample ) Etarget R= ( E ref ) ACPref ( MEAN control- MEAN sample ) Dans notre cas : - E target = Efficacité de la PCR avec le gène cible (TIR-NB-ARC-LRR). - MEAN control target = Ct du gène cible dans l'échantillon contrôle (par exemple SS NI 20 6h). - MEAN sample target = Ct du gène cible dans l'échantillon inconnu (par exemple SS I 6h). - E ref = Efficacité de la PCR avec le gène de ménage PGK. - MEAN control ref = Ct du gène PGK dans l'échantillon contrôle (par exemple SS NI 6h). - MEAN sample ref= Ct du gène PGK dans l'échantillon inconnu (par exemple SS I 6h). 25 Le gène TIR-NB-ARC-LRR est beaucoup plus exprimé dans un génotype R5R11 que dans un génotype S5S11, à 6h (31 fois plus) et à 4 jours (14 fois plus). De même, ce gène est 6 fois plus exprimé dans un génotype R5R11 que dans un génotype R5S11, 6h après l'inoculation avec le nématode. Dans le cas de plantes non inoculées, le gène TIR-NSB-LRR est également plus 30 exprimé, quelque soit la cinétique, dans un génotype R5R11 que dans un génotype S5S11 : 6h après l'infection il est 16 fois plus exprimé, 2 jours après il l'est 13 fois plus et après 4 jours il l'est 234 fois plus. Les différences de niveaux d'expression observés entre génotypes possédant l'allèle de sensibilité au gène TIR-NSB-LRR (S5S11) et génotypes possédant l'allèle de résistance 35 (R5S11 et R5R11), suggèrent une influence du promoteur du gène sur l'expression de la résistance. Pour les génotypes possédant l'allèle de résistance au gène TIR-NSB-LRR, les différences de niveaux d'expression, observées pour ce gène, entre génotypes possédant les allèles de sensibilité (R5S11) et de résistance (R5R11) au QTL à effet faible GpaX1 i suggèrent également que l'interaction entre les deux QTL est liée à une augmentation du niveau de transcription du gène TIR-NB-ARC-LRR par l'allèle de résistance au QTL GpaXIspj. Il est probable que cette augmentation du niveau d'expression du gène TIR-NBARC-LRR passe par la reconnaissance (directe ou indirecte) d'un motif spécifique de son promoteur par l'allèle de résistance au QTL GpaXIspi.10 Références Bevan, M. 1984. A New Agrobacterium Vector for Plant Transformation. Heredity 53:577-578. Bryan, G. J., McLean, K., Bradshaw, J. E., Jong, W. S. d., Phillips, M., Castelli, L. and Waugh, R. 2002. Mapping QTLs for resistance to the cyst nematode Globodera pallida derived from the wild potato species Solanum vernei. Theor. Appl. 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Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides suivants : - le polynucléotide de la SEQ ID No.l, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID No. 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11; - un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12. 2. Polynucléotide isolé conférant aux plantes Solanacées une résistance aux 15 nématodes Globodera, ledit polynucléotide isolé étant choisi parmi : - un polynucléotide présentant au moins 80% d'homologie avec le polynucléotide de la SEQ ID No.1, le polynucléotide de la SEQ ID No. 3, le polynucléotide de la SEQ ID No. 5, le polynucléotide de la SEQ ID 7, le polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou le polynucléotide de la SEQ ID No. 11; 20 un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 1, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 3, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 5, d'un polynucléotide de la SEQ ID 7, d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 9 ou d'un polynucléotide de la SEQ ID No. 11. 25 3. Polynucléotide isolé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les plantes sont choisies parmi les plantes des espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. 30 4. Polynucléotide isolé selon l'une des revendications 2-3 caractérisé en ce que les nématodes sont choisis parmi Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum ssp. tabacum, ssp. virginiae et ssp. solanacearum, et Globodera mexicana. 10 5. Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription : un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, - un polynucléotide isolé selon l'une des revendications 1-4; - une séquence terminatrice fonctionnelle dans le même organisme hôte. 6. Cassette d'expression selon la revendication 5 caractérisée en ce que le promoteur fonctionnel dans un organisme hôte est choisi parmi CaMV 35S, des promoteurs exprimés spécifiquement dans les racines et le promoteur de la position 1 à la position 1657 de la SEQ ID No. 1. 7. Vecteur comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4 ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6. 8. Cellule hôte transformée avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6 ou un vecteur selon la revendication 7. 9. Cellule hôte transformée selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules végétales et les protoplastes de cellules végétales. 10. Organisme hôte, à l'exclusion de l'homme, transformé avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6 ou un vecteur selon la revendication 7. 11. Organisme hôte transformé, à l'exclusion de l'homme, selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les plantes, les graines et les tissus végétaux. 12. Organisme hôte transformé, à l'exclusion de l'homme, selon l'une des 30 revendications 10-11 caractérisé en ce que l'organisme hôte est une plante de la famille des Solanacées. 13. Organisme hôte transformé, à l'exclusion de l'homme, selon la revendication 12 caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les plantes des espèces25Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum. 14. Plante choisie parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4. 15. Plante choisie parmi les espèces Solanum tuberosum L., Solanum phureja, Solanum lycopersicum L., Solanum melongena L., Nicotiana tabacum et les plantes du genre Capsicum caractérisée en ce qu'elle exprime un polypeptide choisi parmi le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12. 16. Plante choisie parmi les pommes de terre de culture caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4. 17. Plante choisie parmi les pommes de terre de culture caractérisée en ce qu'elle exprime un polypeptide choisi parmi le polypeptide de la SEQ ID No. 2, le polypeptide de la SEQ ID No. 4, le polypeptide de la SEQ ID No. 6, le polypeptide de la SEQ ID No. 8, le polypeptide de la SEQ ID No. 10 ou le polypeptide de la SEQ ID No. 12. 18. Procédé pour conférer une résistance aux nématodes Globodera à une plante Solanacée caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - transformation de la plante avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5-6 ou un vecteur selon la revendication 7 ; sélection d'une plante résistante aux nématodes Globodera. 19. Procédé pour rendre résistante une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja aux nématodes Globodera caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :- introgression d'un segment d'ADN génomique de Solanum sparsipilum comprenant le polynucleotide de la SEQ ID No.1 dans une plante de Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja ; - sélection d'une plante de Solanum tuberosum L. subsp. Tuberosum, Solanum tuberosum L. subsp. andigena, ou Solanum phureja résistante aux nématodes Globodera, avec des marqueurs moléculaires dérivés de la SEQ ID No 1. 20. Utilisation d'amorces ou de sondes polynucléotidiques dérivées de la SEQ ID No. 1 pour la détection de plantes Solanacées résistantes aux nématodes.