Brevet FR2955334A1 — publié le 20110722

La présente invention se rapporte au domaine de la réparation tissulaire et plus particulièrement de l'implantation de matrice de collagène. Elle a plus précisément pour objet l'utilisation d'une matrice composée de collagène de type II et de glycosaminoglycanes comme support à la culture de cellules, avant 5 implantation pour la réparation d'un tissu cartilagineux. L'association de collagène de type II et de glycosaminoglycanes pour la constitution de matrices a déjà été décrite, ainsi que leur réticulation chimique, notamment dans la demande de brevet EP1254670, ainsi que dans les articles de Cao et Xu (2008), Pieper et al (2002), Vickers et al, (2006) (Cao and Xu, 2008; Pieper et al., 2002; Vickers et al., 10 2006). Dans les trois premiers documents, les auteurs ont observé une colonisation inhomogène des matrices, les cellules restant essentiellement à la surface des matrices. Vickers et al. ont étudié l'influence de la réticulation de la matrice sur la chondrogénèse in vitro. Pour cela, différentes matrices ont été obtenues, par réticulation thermique ou chimique par trois mélanges EDC:NHS:acide carboxylique, variant par les proportions de chaque 15 élément. Seules la matrice réticulée thermiquement et une matrice réticulée en présence d'une forte proportion d'acide carboxylique (notée EDAC1), ont permis d'observer une colonisation dans l'épaisseur de la matrice. L'article de Vickers et al. ne présente aucune information sur la stabilité thermique et mécanique des différentes matrices. Toutefois, l'expérience des inventeurs de la présente invention montre que les matrices réticulées thermiquement ne 20 présentent pas les propriétés de stabilité thermique et mécanique nécessaires à une utilisation réparatrice. On sait que les matrices de collagène connues ne conservent pas leurs caractéristiques physiques lors de la culture et de l'implantation, ce qui diminue grandement l'efficacité des implants auxquels elles servent de base. 25 La présente invention concerne l'utilisation de matrices de collagène particulières, capables d'être colonisées de façon homogène (sur l'ensemble de leur volume) par des chondrocytes en culture, et ayant la capacité de conserver leur stabilité mécanique et dimensionnelle en culture, en augmentant ainsi leur aptitude à la manipulation lors de l'utilisation. Les matrices utilisées dans le cadre de la présente invention présentent également 30 une stabilité mécanique suffisante pour leur implantation dans des articulations. En effet, ces régions sont par définition des régions mobiles soumises à d'intenses contraintes mécaniques, et une stabilité mécanique suffisante est indispensable pour que la matrice ne soit pas détériorée avant d'avoir permis la réparation des lésions cartilagineuses. L'efficacité des matrices décrites ci-dessous dans le domaine de la réparation de lésions cartilagineuses est 35 nettement supérieure à ce qui a été décrit dans l'art antérieur. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une matrice de collagène réticulée poreuse, principalement composée de collagène de type II et de glycosaminoglycanes, destinée à servir de support à la culture cellulaire in vitro de chondrocytes avant d'être implantée pour réparer les défauts localisés ou lésions du cartilage. Cette matrice est douée d'une stabilité mécanique et dimensionnelle en culture. Elle est caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'avoir été obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes (a) mélange du collagène de type II et des glycosaminoglycanes, (b) lyophilisation, (c) découpe de la matrice obtenue à l'étape (b) en au moins trois tranches, et élimination de la première tranche et de la dernière tranche, (d) réticulation chimique, et (e) lavage. Le procédé ci-dessus permet en effet d'obtenir des matrices présentant une réticulation suffisamment dense et stable pour conférer à la matrice les propriétés de stabilité souhaitée, tout en lui conférant, par l'étape de découpe, une porosité ouverte au moins sur deux faces (représentant la plus grande partie de la surface des matrices). Cette porosité ouverte permet aux cellules, lors de la culture, de pénétrer et diffuser aisément dans la totalité de la matrice, et d'éviter les phénomènes d'agrégation à la surface tels que décrits dans l'art antérieur (Cao and Xu, 2008; Pieper et al., 2002). La présente invention porte également sur un biomatériau pour la réparation de lésions d'un tissu cartilagineux, constitué d'une matrice susceptible d'être obtenue par un procédé tel que décrit plus haut, colonisée par des chondrocytes sur l'ensemble de son épaisseur. Un mode de réticulation particulièrement adapté pour obtenir des matrices présentant les propriétés de stabilité requises dans le cadre de la présente invention est la réticulation par une solution de N-hydroxysuccinimide (NHS) et d'éthyl-3 (3- diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Par exemple, une solution équimolaire d'EDC et NHS, dans un tampon MES (acide 2-(Morpholino-éthane) sulfonique), peut être utilisée. De façon préférée, la solution de réticulation ne comprend pas d'acide carboxylique, en tout cas pas en concentration supérieure à celle du NHS et de l'EDC. Selon un mode de réalisation particulier, la matrice est préparée en utilisant 30 77 à 90% de collagène de type II et 10 à 23% de glycosaminoglycanes à l'étape (a) du procédé. De façon préférée, la matrice comporte 80 à 90% de collagène de type II et 10 à 20% de glycosaminoglycanes. Selon un mode d'exécution particulier, les glycosaminoglycanes sont 35 choisis parmi l'acide chondroitine sulfurique, l'acide hyaluronique, le dermatan sulfate et le Keratan sulfate. Selon une caractéristique de l'invention, le matériau de collagène de type II est dérivé de cartilage naturel, provenant par exemple de tissus bovins, porcins, équins ou aviaires. Le cartilage naturel dérivé du cartilage articulaire porcin est 5 particulièrement adapté à la mise en oeuvre de l'invention. Selon une caractéristique, la lyophilisation est conduite après congélation du gel de collagène dans le lyophilisateur entre -20°C et -40°C et plus précisément à û 35°C. La porosité des matrices utilisées selon la présente invention est de préférence comprise entre 50 et 150 µm. L'étape de découpe permet que cette porosité soit 10 ouverte sur au moins deux faces de la matrice. Cette étape consiste en général à découper la matrice en tranches d'épaisseur contrôlée et adaptée à l'application envisagée (par exemple 2 à 5 mm), les tranches correspondant aux extrémités n'étant pas conservées. Suivant la géométrie du moule utilisé pour couler le mélange de l'étape (a) du procédé, ces tranches peuvent être horizontales (moule plus plat que haut), ou verticales (par exemple dans le cas 15 d'un moule de forme « moule à cake »). Des découpes supplémentaires, notamment pour adapter la taille et la forme des « tranches » obtenues à l'étape (c) à l'application envisagée (par exemple pour obtenir des disques d'un diamètre donné), peuvent être pratiquées et augmentent la proportion de la surface de porosité ouverte. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la matrice présente une porosité ouverte sur toutes ses faces. 20 Bien entendu, lors de la mise en oeuvre de l'invention, les matrices peuvent être lyophilisées, découpées, conditionnées et stérilisées afin d'obtenir des matrices stériles de tailles et de formes spécifiées. Selon un mode particulier d'exécution de l'invention, la stérilisation est conduite par irradiation f3 à une dose minimale de 25 kGy. La présente invention est particulièrement adaptée à la culture de 25 chondrocytes autologues, avant réimplantation. Du fait de la taille et la stabilité de son maillage, la matrice utilisée lors de la mise en oeuvre de l'invention s'applique tout particulièrement à la conservation des chondrocytes dans ses pores. Ainsi, un biomatériau selon l'invention peut être conservé quelques jours et transporté si nécessaire, avant d'être implanté chez le patient, humain ou 30 animal, pour lequel il a été produit. L'invention concerne spécifiquement l'utilisation d'une matrice telle que décrites plus haut, destinée à être implantée chez un patient (humain ou animal) atteint d'arthrose ou présentant des lésions d'origine traumatique ou une ostéochondrite dissécante, après amplification des chondrocytes dudit patient et culture dans la matrice, pour réparer ses 35 tissus cartilagineux lésés. Afin de réaliser cette implantation, une biopsie de cartilage du patient doit être prélevée et les chondrocytes autologues doivent être extraits puis amplifiés. La matrice doit ensuite être ensemencée et doit subir une phase de culture cellulaire. Le prélèvement provient d'une biopsie pratiquée au niveau du cartilage du patient à traiter. L'amplification des chondrocytes extraits est alors réalisée ex vivo pendant 25 à 30 jours. Cette étape vise à multiplier le nombre de chondrocytes autologues, afin d'obtenir un plus grand nombre de cellules nécessaires lors de l'ensemencement. La matrice tridimensionnelle est ensuite ensemencée par une suspension de chondrocytes autologues amplifiés, par exemple selon une technique dite du serpentin, permettant un ensemencement homogène. Selon cette technique, l'ensemencement de la matrice se déroule en deux temps : la moitié du volume de la suspension cellulaire est ensemencée en réalisant un mouvement manuel sinusoïdal sur la matrice. Quelques instants après, l'autre moitié est ensemencée de la même manière mais en sens inverse. La matrice est ensemencée à une densité d'environ 1 million de cellules/cm'. Enfin, la matrice subit une phase de culture pendant 7 à 14 jours, aboutissant au biomatériau selon l'invention. Celui-ci est destiné à être implanté au niveau de la lésion du cartilage du patient. La durée totale du processus est de 32 à 40 jours. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois limiter son étendue. Exemples Exemple 1 : matrice réalisée à partir de collagène II porcin, pour une utilisation médicale humaine Dans cet exemple, le gel est préparé à partir d'un mélange de 77% de collagène II et 23% de glycosaminoglycanes. De préférence, le glycosaminoglycane est l'acide chondroitine sulfurique. Le collagène est repris en solution à 1,5% et l'acide chondroitine sulfurique est repris à 3,0 %. L'ajout de l'acide chondroitine sulfurique au collagène se fait sous agitation et le mélange est ensuite réparti dans un moule. Le gel obtenu est lyophilisé afin d'obtenir des matrices ayant une porosité de 50 à 150µm. Cette lyophilisation est réalisée après congélation du gel à -30°C environ dans le lyophilisateur. Les matrices obtenues sont refendues dans leur épaisseur avec une lame afin d'obtenir trois tranches à savoir une tranche inférieure, une tranche centrale et une tranche supérieure. Seule la tranche centrale est conservée ce qui permet d'obtenir une porosité ouverte de 50 à 150 µm sur les deux faces des matrices. Ces matrices sont ensuite réticulées chimiquement par un bain de NHS/EDC 34 mM en solution dans un tampon MES pH 5,5 à 60% et éthanol à 40% puis lavées par bain de solution saline (NaCl) et eau purifiée. Enfin, les matrices réticulées sont réparties dans des plateaux et lyophilisées. Elles sont ensuite découpées à l'emporte pièces et conditionnées en double sachet puis stérilisées par irradiation f3 à 25kGy. Le collagène de type II utilisé dans le procédé de préparation de la matrice est obtenu à partir de collagène articulaire porcin. Ce collagène II peut par exemple être extrait des rotules de porcs par digestion enzymatique du cartilage par la pepsine. Pour permettre l'utilisation de la matrice dans le domaine médical, il faut garantir la sécurité microbiologique du collagène II qui la compose. Ce collagène II doit donc être prélevé dans des abattoirs ne travaillant qu'avec des porcs pour éliminer tout risque de contamination croisée inter espèce et sur des animaux ayant fait l'objet d'un contrôle vétérinaire assurant qu'ils sont propres à la consommation humaine. Le collagène II extrait doit ensuite subir des traitements efficaces pour inactiver les virus potentiellement présents dans les tissus et les agents transmissibles non conventionnels tels que les prions, en particulier l'agent responsable de l'ESB (Encéphalopathie Spongiforme Bovine). La co-précipitation, c'est-à-dire la réalisation du gel de collagène II et de glycosaminoglycanes avant la lyophilisation, permet d'obtenir des taux de glycosaminoglycanes non extractibles dans la matrice de 9 à 20%, ce qui est nettement supérieur aux taux obtenus lorsque le greffage est réalisé sur une matrice de collagène II déjà lyophilisée. La réticulation de la matrice est indispensable pour maintenir les caractéristiques mécaniques de ladite matrice lors des étapes de culture cellulaire lui permettant ainsi de conserver sa bonne tenue et de ne pas se déliter une fois réhydratée. La réticulation chimique avec le NHS/EDC permet également d'obtenir une meilleure stabilité thermique de la matrice soit par exemple une stabilité thermique de 87,4°C avant stérilisation et de 71,5°C après stérilisation, ce qui est supérieur aux valeurs connues. Exemple 2 : Etude de tolérance et d'efficacité On a effectué en premier lieu un essai d'efficacité et de bonne tolérance en utilisant une matrice poreuse préalablement lyophilisée, produite selon le procédé décrit précédemment, sur un modèle animal utilisant la brebis présentant des lésions induites par l'expérimentateur. Les résultats obtenus ont montré que l'implantation d'une telle matrice, cellularisée par des chondrocytes articulaires autologues, amène une amélioration significative de la réparation du cartilage. Le tissu cartilagineux néoformé montre un caractère typique hyalin attesté par une coloration intense à la Safranine O. En outre, les cellules chondrocytaires présentent une organisation en colonnes. Exemple 3 : L'objectif d'une seconde étude a été d'évaluer la tolérance et l'efficacité d'une matrice telle que décrite, ensemencée avec des chondrocytes autologues et associée à une membrane suturable au cours de la réparation de lésions du cartilage induites. Le but d'une telle association utilisant une membrane suturable était d'éviter le détachement de l'implant. On a créé deux lésions dans le cartilage à l'intérieur d'une même articulation dans le genou de la brebis (un site trochléaire et un site condylaire). Le groupe témoin n'a pas reçu d'implantation de matrice cellularisée et un autre groupe d'animaux a constitué le groupe d'essai, dans lequel les animaux ont été implantés par la matrice cellularisée et par la membrane suturable. Les animaux ont été euthanasiés au bout de six mois et une évaluation locale 5 macroscopique de la zone lésionnelle de l'articulation n'a pas mis en évidence de particularités anormales. On n'a pas constaté de situation anormale locale macroscopique qui pourrait résulter du biomatériau cellularisé implanté. En ce qui concerne la réparation du cartilage, le résultat des évaluations macroscopiques (réalisées selon le score de Brittberg) et 10 microscopiques (selon le score de O'driscoll modifié) a suivi la même évolution et a montré une meilleure tendance à la réparation du cartilage à la fois quantitative et qualitative chez les animaux ayant reçu la matrice cellularisée que chez les animaux témoins. On a pu observer dans le groupe d'essai qu'une meilleure réparation du cartilage pouvait être constatée (par rapport au groupe témoin), avec un score macroscopique maximum et le meilleur score 15 microscopique. La réparation était parfaitement intégrée dans le cartilage et présentait les caractéristiques typiques d'un cartilage hyalin (c'est-à-dire une mini coloration par la Safranine O), et surtout un aspect cellulaire chondrocytaire ainsi qu'une organisation en colonnes. Conclusion sur les exemples 2 et 3 : 20 L'interprétation globale de ces résultats a montré que la sécurité générale de l'élément expérimental et la tolérance locale sont bonnes. Les résultats d'efficacité sont positifs. Ces résultats montrent que quand la matrice est implantée, les scores globaux macroscopiques et microscopiques sont meilleurs que chez les animaux témoins. A l'issue de cette étude la membrane précédemment implantée et les points de suture n'étaient plus 25 visibles chez aucun des animaux ayant subi une telle implantation. Il est possible d'envisager une évolution de la matrice dans les lésions ostéochondrales en prévoyant une couche intermédiaire à base de sels minéraux contribuant à l'ossification de la partie sous chondrale. Exemple 4 : Coupe à congélation et études histologiques d'une matrice 30 cellularisée La matrice cellularisée étudiée dans les exemples 4 à 6 a été réalisée avec 80-90% de collagène de type II d'origine porcine, et 10-20% d'acide chondroitine sulfurique, réticulée et conditionnée comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, et ensemencée avec des chondrocytes humains. 35 Les coupes histologiques colorées par l'Hoechst (qui se lie à l'ADN du noyau et ne devient fluorescent que lorsqu'il est fixé) ont permis de mettre en évidence la présence effective de nombreuses cellules réparties de manière homogène dans toute l'épaisseur de la matrice (Figure 1). A la fin de la culture cellulaire, les matrices ensemencées par les chondrocytes ont été fixées et colorées au trichrome de Masson. Les résultats montrent que les cellules sont nombreuses et régulièrement réparties dans la matrice. En outre, les chondrocytes synthétisent de la matrice extracellulaire (figure 2). Exemple 5 : Test de viabilité au MTT Le MTT est un test colorimétrique permettant la détection de la viabilité cellulaire. Les déshydrogénases présentes dans les cellules transforment un substrat de couleur jaune (MTT) en cristaux de formazan solubles dans le DMSO donnant une couleur violette. Les résultats des tests de viabilité au MTT ont mis en évidence la présence de cellules viables à la fin de la période de culture en matrice. Exemple 6: Analyse, par microscopie électronique à balayage, d'une matrice cellularisée A la fin de la culture cellulaire, la matrice ensemencée a été transférée dans le fixateur constitué de glutaraldéhyde et de tampon phosphate. La figure 3 montre l'analyse de la matrice cellularisée, par microscopie électronique à balayage. Exemple 7 : Adaptation des matrices cellularisées au modèle équin Les matrices décrites plus haut ont ensuite été utilisées comme support de culture pour des cellules équines, afin d'obtenir des matrices cellularisées utilisables pour réparer des lésions cartilagineuses chez le cheval. Pour cela, des biopsies ont été réalisées sur 3 chevaux différents, à différents sites de prélèvement : - boulet, condyle fémoral médial, condyle latéral, condyle fémoral métacarpien, lèvre latérale trochlée fémorale. Une excellente viabilité cellulaire (100%) a été observée au cours de la réalisation du process. Du fait de problèmes d'adhésion des chondrocytes équins, il est préférable d'ensemencer les cellules isolées à une densité supérieure ou égale à 12000 cellules/cm2 lors de la mise en culture et après trypsination. Pour obtenir des matrices adaptées, par leurs dimensions, aux lésions kystiques équines, deux « modèles » de matrice de collagène II-chondroïtine sulfate ont été mis au point. Le premier modèle est un disque de 1,2 cm de diamètre et 5 mm d'épaisseur, et le second un disque de 1 cm de diamètre et de 2 mm d'épaisseur. Il est apparu que le nombre de cellules nécessaires pour cellulariser ces matrices devait être calculé en fonction de la surface du disque, sans tenir compte de son épaisseur. Ainsi, 1.106 cellules suffisent à cellulariser les matrices de plus grande taille. L'étude de viabilité cellulaire a mis en évidence la présence et la prolifération de cellules au sein de la matrice tridimensionnelle. Tous les marqueurs d'expression chondrocytaire ont été testés sur des coupes à congélation, et les résultats confirment la fonctionnalité et la conservation du phénotype chondrocytaire. Une expression de collagène de type I a été constatée, qui correspond à une dédifférenciation chondrocytaire plus marquée que pour les chondrocytes humains, lors d'une culture à long terme, cohérente avec les observations relatées dans l'étude de Schulze-tanzil et al (Schulze-Tanzil et al., 2009). L'ensemble de ces résultats montre que l'utilisation de matrices, selon l'invention, est adaptée à la réparation de lésions cartilagineuses chez le cheval.15 REFERENCES Cao, H. and Xu, S.Y. (2008) EDC/NHS-crosslinked type II collagen-chondroitin sulfate scaffold: characterization and in vitro evaluation. J Mater Sei Mater Med, 19, 567- 575 Pieper, J.S., van der Kraan, P.M., Hafmans, T., Kamp, J., Buma, P., van Susante, J.L., van den Berg, W.B., Veerkamp, J.H. and van Kuppevelt, T.H. (2002) Crosslinked type II collagen matrices: preparation, characterization, and potential for cartilage engineering. Biomaterials, 23, 3183-3192. Schulze-Tanzil, G., Muller, R.D., Kohl, B., Schneider, N., Ertel, W., Ipaktchi, K., Hunigen, H., Gemeinhardt, O., Stark, R. and John, T. (2009) Differing in vitro biology of equine, ovine, porcine and human articular chondrocytes derived from the knee joint: an immunomorphological study. Histochem Cell Biol, 131, 219-229. Vickers, S.M., Squitieri, L.S. and Spector, M. (2006) Effects of cross-linking type II collagen- GAG scaffolds on chondrogenesis in vitro: dynamic pore reduction promotes cartilage formation. Tissue Eng, 12, 1345-1355. REVENDICATIONS1. Utilisation d'une matrice comportant du collagène de type Il et des glycosaminoglycanes, comme support de culture ex vivo de chondrocytes humains ou animaux, caractérisée en ce que ladite matrice a été obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : (a) mélange du collagène de type II et des glycosaminoglycanes, (b) lyophilisation, (c) découpe de la matrice obtenue à l'étape (b) en au moins trois tranches, et élimination de la première tranche et de la dernière tranche, (d) réticulation chimique, et (e) lavage. 2. Biomatériau pour la réparation de lésions d'un tissu cartilagineux, constitué d'une matrice réticulée comportant du collagène de type II et des glycosaminoglycanes, caractérisé en ce que (i) la matrice est telle qu'obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : (a) mélange du collagène de type II et des glycosaminoglycanes, (b) lyophilisation, (c) découpe de la matrice obtenue à l'étape (b) en au moins trois tranches, et élimination de la première tranche et de la dernière tranche, (d) réticulation chimique, et (e) lavage, et (ii) la matrice est colonisée par des chondrocytes sur l'ensemble de son épaisseur. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou biomatériau selon la revendication 2, caractérisé(e) en ce que la matrice a été réticulée par une solution de N-hydroxysuccinimide (NHS) et d'éthyl-3 (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC). 4. Utilisation ou biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé(e) en ce qu'à l'étape (a), le mélange comporte 77 à 90% de collagène de type II et 10 à 23% de glycosaminoglycanes. 5. Utilisation ou biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé(e) en ce que la matrice comporte 80 à 90% de collagène de type II et 10 à 20% de glycosaminoglycanes. 6. Utilisation ou biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé(e) en ce que le glycosaminoglycane est l'acide chondroitine sulfurique, l'acide hyaluronique, le dermatan sulfate ou le keratan sulfate. 7. Utilisation ou biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé(e) en ce que le collagène de type II est dérivé d'un cartilage naturel. 8. Utilisation ou biomatériau selon la revendication 7, caractérisé(e) en ce que le cartilage naturel est dérivé du cartilage articulaire porcin, bovin, équin ou aviaire. 9. Utilisation ou biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé(e) en ce que la matrice présente une porosité comprise entre 50 et 150 tm. 10. Utilisation ou biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé(e) en ce que la matrice présente une porosité ouverte sur toutes ses faces.