Brevet FR2957087A1 — publié le 20110909

DOMAINE TECHNIQUE GENERAL La présente invention concerne la culture in vitro de cellules Plus précisément, elle concerne une boîte multi-bioréacteurs pour culture cellulaire dynamique en milieu nutritif. ETAT DE L'ART Les cultures de cellules sont aujourd'hui utilisées comme outil d'évaluation toxicologique de substances. On dispose également de bioréacteurs reproduisant un environnement favorable au développement et à l'organisation de cellules, proche de celui d'un tissu ou d'un organe animal ou humain. Grâce à eux, on peut prévoir la réaction d'un organe vis-à-vis d'une substance comme un xénobiotique, un cosmétique, un médicament ou plus généralement tout principe actif, et développer des modèles in vitro pertinents. Ces modèles sont de plus en plus souvent utilisés dans la recherche pharmaceutique car ils représentent une alternative sérieuse aux modèles in vivo, c'est à dire l'expérimentation animale, contre laquelle des pressions à la fois économiques et éthiques apparaissent au niveau international. La culture de cellules représente également la base de la création d'organes artificiels capables de se substituer aux organes défaillants ou absents, un des enjeux de l'ingénierie tissulaire. Les bioréacteurs comprennent aux deux extrémités d'une chambre microstructurée (une chambre de culture comportant une paroi supérieure et une paroi inférieure présentant des microstructures) un point d'entrée de fluide et un point de sortie de fluide pour permettre le passage d'un fluide nutritif nécessaire au développement des cellules. Le fluide est donc en circulation, mu par exemple par une pompe, c'est ce que l'on appelle une culture cellulaire dynamique. Un tel dispositif a été décrit dans la demande de brevet FR0954288. 1 Ce bioréacteur précurseur offre d'excellents résultats et permet un développement optimal des cellules, mais ne peut tout seul suffire à un usage industriel. Il serait souhaitable de pouvoir augmenter autant que possible la surface de culture des cellules. Une solution pour cela est d'utiliser des multi-bioréacteurs, c'est-à-dire des bioréacteurs parallélisés. Ces dispositifs devraient en outre présenter un encombrement réduit. Divers systèmes de culture cellulaire intégrée ont été proposés à cet effet. Le système Hprel®, décrit par les brevets US5612188 et US7288405, est constitué de quatre doubles bioréacteurs disposés en parallèle et reliés à une pompe péristaltique. Un réservoir est également inséré dans le circuit. Celui-ci sert de réserve de milieu nutritif, mais aussi d'espace de prélèvement d'échantillons. En effet des prélèvements s'effectuent tout au long de la culture cellulaire pour surveiller son bon déroulement, et lors de l'utilisation des cellules à des fins d'étude toxicologique : après exposition à une substance à tester, une série de prélèvements réguliers permet par exemple de déterminer la réponse métabolique des cellules à cette substance, de mesurer la clairance (c'est-à-dire la capacité de l'organe à éliminer la substance dans un volume donné), ou encore d'observer les cinématiques de réaction des cellules. Or la procédure de prélèvement du système Hprel® (dans un réservoir) est longue et complexe, puisqu'il est nécessaire d'arrêter la perfusion de fluide pour pouvoir débrancher le circuit et ouvrir le réservoir. De plus ce prélèvement s'effectue loin des bioréacteurs, ce qui fait qu'il y a un risque que des marqueurs métaboliques recherchés via les prélèvements voient leur concentration chuter entre le bioréacteur et le réservoir, à cause de phénomènes d'adsorption sur la surface des tuyaux. Les systèmes BiofluxTM 200 et BiofluxTM 1000, décrits par la demande de brevet US2007/0243523, proposent une boîte étanche utilisant une plaque multi-puits du commerce adaptée. Une plaque multi-puits est une plaque standardisée comportant de nombreux puits ayant le rôle de petites éprouvettes. Il s'agit d'un outil couramment utilisé dans les laboratoires, disponible en de très nombreux modèles. Dans cette plaque adaptée, des microcanaux reliant deux puits servent de support à la croissance des cellules. Le prélèvement se fait ainsi dans le second puits, il s'agit donc d'un prélèvement in situ au plus près de la zone de culture. Cependant les problèmes de complexité de prélèvement sont encore pires que dans le système Hprel®, car il faut décapoter entièrement la plaque multi-puits, et donc arrêter le fonctionnement de la totalité des réacteurs parallélisés. Par ailleurs, ces deux systèmes sont bien moins favorables à la culture des cellules : ils ne permettent pas la culture cellulaire dynamique recirculante, car la perfusion du milieu de culture se fait par l'application d'une surpression. Il n'y a pas de microstructures, mais un simple canal entre deux puits. L'adhérence et la surface efficace sont très faibles et le rendement chute. Des moyens de prélèvement issus d'autres domaines technologiques ont également été proposés, mais aucun ne donne pleinement satisfaction. Un premier système possible est d'utiliser une voie de dérivation, au bout de laquelle on va pouvoir prélever. Toutefois le fluide présent dans cette voie de dérivation stagne, et va la polluer par des dépôts. Il est nécessaire de la nettoyer avant chaque prélèvement si l'on veut une mesure fiable, et pour ce on retrouve les problèmes de l'art antérieur (arrêt et démontage du circuit), à moins de mettre en place un deuxième circuit complet pour effectuer le nettoyage, avec toutes les difficultés et le coût que cela représente. Un autre système envisagé utilise un septum, c'est-à-dire un petit bouchon en caoutchouc, comprimé, fermant un orifice dans le circuit à prélever. Les septums sont notamment utilisés en médecine (sur la tête des cathéters par exemple). On prélève en traversant le bouchon avec l'aiguille d'une seringue, le trou créé se refermant naturellement par déformation du matériau lorsque l'on retire l'aiguille. Néanmoins, un septum est à changer après une dizaine de prélèvements (arrêt et démontage du circuit à nouveau requis). De plus l'utilisation d'une seringue est adaptée pour prélever des volumes d'au moins plusieurs millilitres, ce qui s'avère incompatible avec les circuits classiques de culture cellulaire, dont le volume total est généralement de 2-3mL. Les systèmes cités précédemment utilisent des micropipettes autorisant des prélèvements de seulement quelques dizaines de microlitres. PRESENTATION DE L'INVENTION La présente invention vise à résoudre les difficultés précédemment énoncées en proposant un dispositif qui, par une structure simple, permet de paralléliser des bioréacteurs performants de culture cellulaire dynamique tout en permettant un prélèvement de milieu cellulaire in situ en fonctionnement. Un but annexe de l'invention est de parvenir à cet objectif tout en obtenant un produit plus facile à utiliser, dans lequel des très petits volumes peuvent être prélevés avec grande précision en un minimum de manipulations. La présente invention se rapporte donc à une boîte comprenant au moins un puits et au moins une chambre microstructurée de culture cellulaire dynamique, caractérisée en ce que chaque chambre microstructurée est connectée à un puits en sortie, la boîte comprenant en outre au moins un port de prélèvement donnant dans le puits et situé à une altitude supérieure à tout point de ce puits. Grâce à cette structure, le prélèvement s'effectue tout simplement en ouvrant le port, et en insérant par exemple une micropipette directement dans le puits de sortie de la chambre microstructurée à prélever, c'est-à-dire à proximité immédiate des cellules. Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives : - le port de prélèvement est pourvu d'un bouchon amovible ; - la boîte est constituée d'un boitier inférieur recouvert d'un capot étanche maintenu par des moyens de serrage ; - le port de prélèvement est constitué en entrée d'un connecteur femelle que comprend le capot ; - le capot comprend en outre au moins un connecteur mâle perfusant le puits et étant aligné avec le connecteur femelle ; - chaque chambre microstructurée est connectée à un puits d'entrée et un puits de sortie, chaque puits étant perfusé par un connecteur mâle ; - le capot comprend un connecteur femelle par puits d'entrée et un deuxième connecteur femelle par puits de sortie. - les connecteurs femelle et d'un puits sont connectés au même connecteur mâle perfusant ledit puits, le connecteur étant incliné par rapport à l'alignement formé par ledit connecteur mâle et le connecteur femelle ; - le boitier inférieur comprend une plaque multi-puits, les puits étant des puits de ladite plaque multi-puits ; - le boitier inférieur comprend en outre un microsystème, les puits auxquels est connectée une chambre microstructurée étant pourvus sur leur fond de trous dans lesquels viennent s'insérer au moins une connectique d'interface dudit microsystème ; - le microsystème est constitué d'une plaque inférieure comprenant l'empreinte de ladite au moins une chambre microstructurée, et d'une plaque supérieure comprenant la ou les connectiques ; - le microsystème est constitué d'une plaque inférieure comprenant l'empreinte de ladite au moins une chambre microstructurée, et d'une plaque supérieure, la ou les connectiques étant des connecteurs fixés aux trous perfusant la ou les chambres à travers des trous de la plaque supérieure ; - le microsystème est constitué de polydimethylsiloxane ; - la plaque multi-puits est une plaque jetable en polystyrène ; - la plaque multi-puits est une plaque autoclavable en polycarbonate ; - une sonde est disposée dans au moins l'un des ports de prélèvement ; - ladite sonde est intégrée au bouchon du port ; - un insert à membrane est disposé dans au moins l'un des puits. L'invention propose également, selon un deuxième aspect de l'invention, un système de culture cellulaire dynamique caractérisé en ce qu'il comprend : - une boîte selon l'une des revendications précédentes, et - au moins un circuit de fluide comprenant une tuyauterie de circulation 10 munie d'un moyen de circulation et connectée à au moins une chambre microstructurée. Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives : - le moyen de circulation est une pompe péristaltique multicanaux. 15 PRESENTATION DES FIGURES D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre d'un mode de réalisation préférentiel. Cette description sera donnée en référence aux 20 dessins annexés dans lesquels : - La figure 1 est une vue éclatée en perspective d'une boîte selon l'invention ; - les figures 2a et 2b sont deux coupes transversales de la boîte selon l'invention. La figure 2a montre un prélèvement de fluide, et la figure 25 2b met en évidence le chemin fluidique dans la boite ; - la figure 3a est une vue en perspective du capot de la boîte selon l'invention dans lequel est montré un possible système de fermeture de des ports de prélèvement ; - la figure 3b est une vue éclatée en perspective du capot de la boîte 30 selon l'invention ; - la figure 4 est une vue éclatée en perspective du boitier inférieur de la boîte selon l'invention ; - la figure 5 est une vue éclatée en perspective du microsystème de la boîte selon l'invention ; - la figure 6 est une vue en perspective d'une autre réalisation possible du boitier inférieur de la boîte selon l'invention, dans lequel le microsystème est détachable ; - les figures 7a-7c représentent trois types possibles d'une plaque multi-puits utilisables dans divers modes de réalisation de la boîte selon l'invention ; - les figures 8a-8b sont des exemples d'observations au microscope de cellules en culture dans divers modes de réalisation de la boîte selon l'invention ; - la figure 9 est un schéma d'un système de culture cellulaire dynamique selon l'autre aspect de l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE Architecture générale La boîte 1 conforme à l'invention vise préférentiellement la parallélisation des bioréacteurs. Elle sera ainsi désignée dans certains modes de réalisation en tant que boîte multi-réacteurs. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut ne comprendre qu'un puits 10, et qu'une chambre microstructurée 15. Dans le mode de réalisation préféré illustré par les figures, la boîte 1 est constituée d'un boitier inférieur 100 que vient recouvrir un capot étanche 200 maintenu par un système de serrage 20, par exemple quatre vis le traversant, comme représenté sur la figure 1. Ce boitier 100, que l'on voit mieux en détail sur la figure 4, comprend une plaque multi-puits 110, parmi lesquels on va trouver le ou les puits 10, et un microsystème 150. Des entretoises filetées 21 peuvent être disposées entre les puits 10 de façon complémentaire avec les moyens de serrage 20. Ces entretoises 21 peuvent être partie intégrante de certaines plaques multi-puits 110, ou être des tubes insérés dans des orifices percés dans le boitier, et collés. La plaque multi-puits 110 est un objet bien connu de l'homme du métier qui peut ainsi se décliner sous de nombreuses formes, et qui est parfois appelé plaque microtitre, en référence aux petits volumes calibrés des puits. Par convention, ceux-ci sont disposés selon une matrice de rapport 2 :3, et on trouve généralement des plaques de 6, 12, 24, 96 ou 384 puits dans le commerce. Avantageusement, pour des considérations liées au volume des puits, la plaque multi-puits 110 conforme à l'invention est une plaque 24 puits. Une telle boîte contient six rangées de quatre puits 10 agencés comme le montrent la figure 2a ou 2b. Dans cette architecture, les puits centraux sont des puits d'entrée 10a, et les deux puits latéraux sont des puits de sortie 10b. Au fond des puits 10, sont percés des trous 11 par lesquels s'effectuent les communications de fluide entre les puits 10 et les chambres microstructurées 15. Chaque trou 11 sert en outre à l'ensemencement initial en cellules à la mise en culture. Prélèvement de fluide La figure 2a représente la boîte en situation de prélèvement de fluide. La pointe d'une pipette 3 de prélèvement est insérée dans le port 22. Ce port 22 est situé à une altitude supérieure à tout point du puits 10 en dessous de lui. Par altitude supérieure, on sous-entend des conditions telles que toute goutte de fluide du puits 10 possède moins d'énergie potentielle de pesanteur qu'une goutte qui passerait le port 22. Cela est le cas en plaçant la boîte 1 selon l'invention dans une position de fonctionnement normale, c'est-à-dire avec le fond du boitier inférieur 100 posé sur une surface proche de l'horizontale. Cette structure permet de faire des prélèvements de fluide du puits 10 sans arrêter la perfusion, contrairement à ce qui se faisait jusque là. En effet le port 22 est fermé en conditions normales de fonctionnement. Pour cela il comprend un bouchon 205, ou tout autre dispositif équivalent rendant le port 22 facilement ouvrable et refermable. On peut en voir un exemple sur la figure 3a. De par la différence d'altitude entre le port 22 et le puits 10, on ne trouve pas de fluide immédiatement sous le bouchon 205, mais un peu d'air piégé. Ce qui fait que lorsqu'on ouvrira le port 22 pour faire un prélèvement, il n'y a pas de risque immédiat de débordement de fluide, ni de problème de fluide qui pourrait stagner et polluer le port 22. Le prélèvement s'effectue ainsi en ouvrant le bouchon 205 du port 22, introduisant rapidement la pointe de la pipette 3 de prélèvement jusque dans le puits 10, aspirant un volume requis, avant de retirer la pipette 3 et refermer. Le puits 10 équipé du port 22 est un puits de sortie 10b, c'est-à-dire qu'il reçoit le fluide juste après qu'il soit passé dans la chambre microstructurée 15 à laquelle ce puits 10b est relié. Avantageusement, le port 22 traverse le capot étanche 200 de façon à permettre le prélèvement sans nécessiter de décapoter la boîte 1, comme c'est souvent le cas pour les systèmes connus. Structure du capot On rappelle que le capot étanche 200 est un élément facultatif de l'invention qui peut faire l'objet de nombreux modes de réalisation. Un capot 200 avantageux, détaillé figure 3b, est préférentiellement constitué d'une plaque de Polycarbonate de 10 mm d'épaisseur dans laquelle 24 connecteurs de Polypropylène mâle 204 et 36 connecteurs de Polypropylène femelle 201 sont vissés (04 mm 10-32 UNF). 24 de ces connecteurs femelle 201 a et 201 c sont situés sur le dessus du capot 200, et sont alignés avec les connecteurs male 201. Les douze autres 201b sont sur le flanc du capot 200. Ainsi, lorsque la boîte est refermée, l'étanchéité étant assurée par un joint plat de PDMS 203 de 2 mm d'épaisseur, il y a un connecteur mâle 204 et un ou deux connecteurs femelle 201 par puits 10 : - pour les puits d'entrée 10a, il y a un seul connecteur de chaque type (201 a et 204). L'entrée de fluide est sur le dessus du capot 200. - Pour les puits de sortie 10b, on retrouve les deux connecteurs femelle 201 b-c. Seul le connecteur latéral 201b sert au passage du fluide. Le connecteur femelle 201c constitue l'entrée du port 22. Comme on le voit sur les figures 2a et 2b le connecteur femelle 201 c et son connecteur mâle 204 sont alignés. C'est cela qui permet l'insertion de la pointe d'une pipette 3 de prélèvement à travers ces deux connecteurs à la fois, et donc à travers tout le capot 200. Circulation de fluide dans le boîtier inférieur La figure 2b permet de visualiser le chemin fluidique. Le fluide pénètre par le connecteur femelle 201a. Il est transmis dans le puits d'entrée 10a par un connecteur mâle 204. Le fluide contenu dans ce puits d'entrée 10a est ensuite perfusé par une connectique 16 d'entrée de la chambre microstructurée 15, pour être recueilli dans le puits de sortie 10b via une connectique 16 de sortie de la chambre 15. L'excédent de fluide contenu dans le puits de sortie 10b est alors aspiré par un connecteur mâle 204 et acheminé vers le connecteur femelle 201b du capot. En prenant garde au volume utilisé, il est ainsi possible de perfuser en continu la chambre de culture. On remarque que le chemin fluidique fait un coude avant le connecteur femelle 201 b. Cette architecture non limitative permet d'avoir les deux sorties indépendantes 201b et 201c pour un seul connecteur mâle 204. C'est une astuce de construction grâce à laquelle on peut avoir un port 22 de prélèvement spécifique, toujours disponible et apte à recevoir une micropipette 3, sans complexifier le circuit de fluide. Dans ce cas, une bifurcation apparaît à l'intérieur du capot 200. Si l'on suit l'axe vertical du connecteur mâle 204 en sortant du puits 10b, on traverse le connecteur femelle 201c et donc on sort par le port de prélèvement 22, et si on prend la bifurcation, on sort sur le flanc du capot par le connecteur femelle 201 b. Prélèvements élaborés En plus des mécanismes de prélèvement décrits précédemment, on peut également envisager d'effectuer en parallèle des prélèvements en amont des chambres 15, notamment dans les puits d'entrée 10a, par exemple en y installant un autre port 22 similaire à celui des puits de sortie 10b. En comparant ces nouveaux prélèvements avec les prélèvements de sortie, notamment en soustrayant les grandeurs d'entrée aux grandeurs de sortie, on peut réaliser une mesure différentielle de la réaction cellulaire. Aucun système connu ne le permet, ceux-ci ne permettant que le prélèvement en un unique endroit qu'est le réservoir. Dans un autre mode de réalisation encore plus avancé, on peut envisager de remplacer le prélèvement manuel à la pipette par une surveillance automatique via des sondes. En effet on dispose de sondes physico-chimiques miniaturisées, qui peuvent être introduites dans les ports de prélèvement 22 pendant tout ou partie de la culture cellulaire. La surveillance est alors continue. Ces sondes sont généralement constituées d'un capteur, souvent piezorésistif, relié par un fil à un instrument de mesure, qui déduit une grandeur physique des données transmises par le capteur. On peut citer de façon non exhaustive les pH-mètres, les thermomètres, les conductimètres, les débitmètres, les manomètres, les néphélomètres ou encore les turbimètres, dont le capteur est placé dans au moins un puits 10b, le fil sortant par le port 22 colmaté par un matériau assurant l'étanchéité. La sonde peut en outre être l'extrémité d'une ou plusieurs fibres optiques, enregistrant le spectre d'émission et/ou d'absorbance du fluide à destination d'un spectrophotomètre, grâce auquel est calculée en permanence la concentration d'une ou plusieurs substances présentes en solution. Avantageusement, on intègre la sonde dans le bouchon 205. Grâce à cela, l'étanchéité est directement assurée pendant toute la durée de fonctionnement de la sonde, et il reste possible d'ôter la sonde pour effectuer un prélèvement. La possibilité d'une ou plusieurs sondes incorporées à la boîte selon l'invention n'est de plus pas incompatible avec la possibilité de mesures différentielles : on peut comparer une mesure automatique en entrée avec une mesure automatique en sortie. On notera toutefois que l'invention n'est limitée à aucun de ces modes de réalisation. Structure du microsystème Le microsystème 150 évoqué précédemment est une structure abritant éventuellement la ou les chambres microstructurées 15 et placée sous la plaque multi-puits 110. Ce microsystème 150 peut faire l'objet de nombreux modes de réalisation, mais s'adapte avantageusement à une plaque 24 puits telle que représentée sur les figures en étant constitué de douze chambres 15. Ces chambres 15, dont la surface est microstructurée, sont de dimensions identiques et disposées de façon à ce qu'il y en ait deux par rangée, chacune reprenant de façon particulièrement préférée mais sans y être limitée un bioréacteur suivant la demande de brevet FR0954288. L'invention n'est cependant par limitée à cette architecture, et il est seulement nécessaire d'avoir au moins un puits par chambre, ce puits étant disposé en sortie. Par exemple, dans un autre mode de réalisation, une boîte selon l'invention peut comprendre six chambres microstructurées et une plaque six puits. Deux pièces visibles sur la figure 5 peuvent composer le microsystème 150: une plaque inférieure 152 portant l'empreinte du fond des chambres 15, et une plaque supérieure 151. Une fois ces deux plaques assemblées hermétiquement, les cavités qui apparaissent sont les chambres 15. Celles-ci sont des petits volumes dans lesquels les cellules vont se développer dans des conditions très favorables. En effet les microstructures forment des canaux complexes offrant une grande surface de contact avec le fluide. La présence d'un microsystème 150 est toutefois optionnelle, d'autres structures pouvant abriter une chambre 15 de culture cellulaire étant connues de l'homme de l'art. Modes de réalisation de la plaque supérieure du microsystème La plaque supérieure 151 peut faire l'objet de deux modes de réalisation avantageux. On remarquera que l'invention n'est limitée ni à l'un ni à l'autre de ces modes de réalisation, la plaque supérieure 151 étant un élément facultatif. Toutefois chacun de ces deux modes de réalisation se combine parfaitement avec l'ensemble des caractéristiques décrites précédemment. Un matériau, le PolyDiMéthylSiloxane (PDMS), se prête tout particulièrement à l'un comme l'autre de ces modes de réalisation, ainsi qu'au reste du microsystème 150. En effet, il est transparent, poreux à l'oxygène et aux gaz en général, et très adapté à la microstructuration, d'où son intérêt pour la culture cellulaire. En outre il est légèrement déformable. Dans le premier mode de réalisation, la plaque supérieure 151 comprend des connectiques 16 d'entrée et de sortie du microsystème 150, visibles sur la plupart des figures et particulièrement sur la figure 5. Ces petits tubes s'insèrent dans les trous 11 des puits 10, et assurent la communication fluidique en fonctionnement normal. Si les puits 10 sont des puits d'une plaque multi-puits 110, l'étanchéité peut être éventuellement renforcée par exemple par un joint en matériau siliconé coulé au fond de chaque puits 10. Ces connectiques permettent en outre l'ensemencement en cellules des chambres 15. Dans l'architecture représentée sur les dessins, on trouve une telle connectique 16 à l'entrée et à la sortie de chaque chambre 15, les connectiques centrales étant des entrées de fluide, et les latérales des sorties de fluide par analogie avec l'agencement des puits 10. On notera que ces connectiques permettent aux puits 10 et notamment ceux de sortie d'être au plus près des chambres. Les métabolites éventuellement libérés par les cellules lors de leur exposition à un xénobiotique pourront être immédiatement prélevés à leur sortie de la chambre, d'où des résultats bien plus fiables car non biaisés par les phénomènes d'adsorption dus à la longueur des tuyaux. Dans le second mode de réalisation, représenté figure 6, la plaque supérieure 151 est pourvue de trous en lieu et place des connectiques 16 du premier mode de réalisation. Celles-ci ne sont plus intégrantes au microsystème 150, mais sont des connecteurs en dur, fixés dans les trous 11 des puits 10, par exemple par vissage, mais encore par collage, moulage, ou toute autre technique connue. Ces connecteurs 16 s'insèrent de façon amovible dans les trous pour désolidariser facilement le microsystème 150 du reste de la boîte 1. Leur matériau est préférentiellement le polycarbonate ou le polypropylène. La souplesse du PDMS est très appréciable pour la plaque 152. En jouant sur le diamètre des trous, une jonction hermétique entre le microsystème et les connecteurs 16 est possible. Cela permet un fonctionnement sans risque de fuite, même après des désolidarisations et resolidarisations successives du microsystème 150. Observation au microscope des cellules pendant la culture Grâce à leurs matériaux, le capot 200 et le microsystème 150 sont autoclavables : selon les besoins des utilisateurs, il est possible dans certains cas de les réutiliser pour une nouvelle culture après les avoir nettoyés et stérilisés. Pour la plaque multi-puits 110, de nombreux matériaux existent. Il est tout d'abord possible de choisir une plaque en Polystyrène, comme celle de la figure 7a. Une plaque 110 en ce matériau est à usage unique et doit être jetée en fin de culture. Elle est par contre peu chère et parfaitement transparente, rendant facile l'observation des cellules pendant la culture : l'encombrement de la boîte multi-réacteurs totale selon l'invention n'étant pas plus grand que celui d'une boîte de Pétri, on peut la placer en entier sous un microscope. Il est en effet souhaitable de pouvoir surveiller à tout moment les cellules sans les perturber, aussi bien pour s'assurer de la bonne croissance que pour observer l'impact toxicologique direct d'une substance. Alternativement on peut choisir une plaque 110 en Polycarbonate, c'est-à-dire le même matériau que le capot 200. L'ensemble est alors autoclavable, mais le Polycarbonate possède l'inconvénient de devenir opaque lorsqu'il est usiné, ce qui est problématique pour l'observation des parties de chambre sous les puits. Une première solution, si l'on choisit une plaque multi-puits 110 en Polycarbonate comme celle représentée figure 7b, consiste à découper le fond des puits 10, et à interposer entre la boîte 110 et le microsystème 150 une fine plaque supplémentaire 111 de polycarbonate et un joint de PDMS assurant une étanchéité identique à celle entre le boitier 100 et le capot 200. Un moyen de serrage similaire au moyen 20 maintient alors le boitier inférieur uni. Grâce à cette plaque supplémentaire 111 parfaitement transparente car non usinée, l'observation au microscope est parfaite et en même temps l'ensemble est autoclavable. Une seconde solution, plus astucieuse, consiste à choisir une plaque 110 avec des puits demi-lune, représentée figure 7c. En effet on remarque par exemple sur la figure 5 que la zone la plus intéressante d'observation est la partie centrale des chambres 15. En effet c'est là qu'est le coeur de la culture cellulaire, les parties latérales d'une chambre 15 étant plutôt des canaux de répartition de fluide. Et cette zone centrale ne se situe pas sous les puits 10, mais entre un puits 10a et un puits 10b, comme on le voit particulièrement sur la figure 2a ou 2b. Dans le cas d'une boîte demi-lunes, c'est une zone rectangulaire dégagée qui correspond au « plat » des puits demi-lune. Une plaque avec des puits demi-lune est donc parfaitement adaptée à l'observation, sans qu'il y ait besoin de modifier le fond des puits. Les images obtenues en observant les cellules à travers la totalité de la boîte multi-bioréacteurs sont ainsi d'une précision remarquable, malgré l'épaisseur de plastique traversée. La figure 8a en est un exemple, une précision d'une dizaine de microns est atteinte, largement suffisante pour compter les cellules. Il est toutefois possible d'atteindre une précision optique encore supérieure dans le cas d'une boîte à microsystème 150 détachable (figure 6) décrite précédemment. Pendant la culture cellulaire, il suffit ainsi d'arrêter la circulation de fluide, et de désolidariser les bioréacteurs du boîtier 100 en tirant doucement sur le microsystème 150 en PDMS. Ce dernier peut être introduit dans une enceinte stérile transparente et observé avec un niveau de détail et de contraste inégalé, puisque la vision est directe, à travers seulement quelques millimètres de plastique. On peut alors observer jusqu'à l'intérieur des cellules, comme le montre la figure 8b, pour par exemple analyser de façon très poussée certains effets d'une substance testée. Pendant la phase de désolidarisation, le boitier supérieur 100 reste rempli de liquide : la circulation étant arrêtée, le fluide est maintenu dans les fins canaux des connecteurs vissés 16 par simple capillarité à condition que le capot 200 ne soit pas ouvert. Le microsystème 150 est ensuite reconnecté au reste de la boîte 1 via les connecteurs 16, pour continuer et reprendre la perfusion. Il a été testé expérimentalement qu'il suffit de placer une goutte de milieu de culture dans chaque trou d'entrée et de sortie des chambres 15 avant de reconnecter l'ensemble pour éviter le risque d'introduction d'une bulle d'air dans une chambre 15. Système de culture cellulaire dynamique Selon un autre aspect, l'invention concerne un système de culture cellulaire dynamique comprenant une boîte 1 selon le premier aspect de30 l'invention, au moins un circuit 300 de fluide et une pompe 320, préférentiellement une pompe péristaltique, ou toute autre moyen de circulation de fluide connu de l'homme de l'art. Les différents organes sont liés sur le circuit 300 par une tuyauterie 310 constituée de tubes, préférentiellement des tubes les plus courts possibles, et à la surface interne la moins adsorbante possible afin de limiter toute variation de concentration d'une substance injectée dans le circuit 300. Le fait que la culture soit dynamique signifie qu'il y a recirculation en circuit fermé du fluide. Dans une telle configuration les conditions de développement des cellules sont plus proches de celles de l'organisme que dans les systèmes d'art antérieur dans lesquels le fluide soit est statique, soit n'effectue jamais une rotation complète de circuit (mouvement de va-et-vient de fluide dans une chambre, qui en particulier n'autorise pas de comparaison entre le fluide en entrée de chambre et celui sortant de la chambre, ou traversée unique de la chambre par un fluide qui n'est pas réutilisé). Une pompe péristaltique est une pompe dans laquelle le fluide est entraîné par compression et déformation d'un tube, à la manière des contractions musculaires autour de l'oesophage par exemple. Ce système est particulièrement adapté pour l'application à la culture cellulaire pour de nombreuses raisons. Tout d'abord, il s'applique principalement aux petits débits, pour lesquels il est d'une grande précision et d'une grande souplesse. L'arrêt de la pompe coïncide exactement avec l'immobilisation du fluide dans le circuit. Ensuite, il n'y a pas d'éléments autres que le tube flexible en contact avec le fluide. Il n'y a donc pas de risque de contamination ou de fuite. Enfin une seule pompe peut gérer plusieurs circuits de fluide à la fois, notamment 24 pour une pompe Ismatec® IPC-N particulièrement préférée. Cela correspond à la totalité des chambres de deux boîtes multi-réacteurs précédemment décrites. En jouant sur le diamètre interne des tuyaux 310, il est également possible de travailler en même temps avec des débits différents selon les circuits, ce qui peut par exemple être utile pour comparer différentes cinétiques d'exposition à une substance. Un exemple de circuit avec une pompe 320 douze canaux et une boîte 1 selon l'invention est représentée figure 9. Il y a un circuit 300 de fluide par chambre 15. On remarque qu'aucun élément supplémentaire tel un réservoir ou un piège à bulle n'est requis. La longueur de chaque circuit 300 et donc les variations de concentrations des substances injectées, sont minimales. De plus, chaque circuit possède donc son port 22 de prélèvement, et est donc testable indépendamment. Dans cet exemple, toutes les cultures sont parallélisées. Grâce aux connectiques 201, il est toutefois possible de réaliser des architectures très variées, avec différents réacteurs en série ou en parallèle. Cet aspect modulaire possible grâce à l'aspect dynamique de la culture cellulaire du système selon l'invention permet de simuler des métabolismes complexes, par exemple un enchaînement de plusieurs organes bioartificiels et/ou de différents types de cellules caractéristiques d'un même organe. C'est ce que l'on appelle la co-culture. En effet la réponse métabolique à une substance pourrait être à plusieurs niveaux : ne pas affecter un premier organe mais affecter un second, entraîner la sécrétion d'une substance par un premier organe qui aurait des répercussions sur un second, etc. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, chaque chambre 15 de la boîte multi-réacteurs simule un organe différent (foie, rein, pancréas...), ces organes bioartificiels étant câblés selon de multiples circuits représentant l'architecture humaine au plus près (rein en aval du foie par exemple). Inserts à membranes De façon encore plus avantageuse, la boîte selon l'invention permet de simuler certains « filtres » présents dans l'organisme. Ainsi, la barrière hémato-encéphalique est une barrière anatomique qui filtre et contrôle le passage des substances sanguines et les empêche de passer librement du sang au liquide extra-cellulaire du système nerveux central. Elle isole la substance grise du reste de l'organisme et lui permet d'avoir un milieu spécifique. Seules 2% des molécules la traversent librement. Des substances qui s'avéreraient ainsi neurotoxiques si injectées directement sans le cerveau pourrait s'avérer d'une totale innocuité si injectées normalement. Pour prendre en considération cela, il est possible de placer dans les puits des inserts à membranes. Ces supports vendus dans le commerce se présentent sous la forme d'un petit disque présentant les propriétés physico-chimiques de la membrane anatomique à simuler, et s'installent dans les puits 10 d'entrée et de sortie de l'organe à isoler. La culture dynamique offerte par le système selon l'invention est encore une fois nécessaire pour utiliser cette possibilité. On peut ainsi par exemple compléter la structure décrite précédemment en simulant le passage dans le sang d'une molécule ingérée grâce à une muqueuse intestinale de synthèse. REVENDICATIONS1. Boîte (1) comprenant au moins un puits (10) et au moins une chambre microstructurée de culture cellulaire dynamique (15), caractérisée en ce que chaque chambre microstructurée (15) est connectée à un puits (10) en sortie, la boîte (1) comprenant en outre au moins un port de prélèvement (22) donnant dans le puits (10) et situé à une altitude supérieure à tout point de ce puits (10). 2. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le port de prélèvement (22) est pourvu d'un bouchon amovible (205). 3. Boîte selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un boitier inférieur (100) recouvert d'un capot étanche (200) maintenu par des moyens de serrage (20). 4. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce le port de prélèvement (22) est constitué en entrée d'un connecteur femelle (201c) que comprend le capot (200). 5. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée 25 en ce que le capot (200) comprend en outre au moins un connecteur mâle (204) perfusant le puits (10) et étant aligné avec le connecteur femelle (201c). 6. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée 30 en ce que chaque chambre microstructurée (15) est connectée à un puits d'entrée (10a) et un puits de sortie (10b), chaque puits étant perfusé par un connecteur mâle (204). 20 7. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le capot (200) comprend un connecteur femelle (201a) par puits d'entrée (10a) et un deuxième connecteur femelle (201 b) par puits de sortie (10b). 8. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que les connecteurs femelle (201b) et (201c) d'un puits (10b) sont connectés au même connecteur mâle (204) perfusant ledit puits (10b), le connecteur (201b) étant incliné par rapport à l'alignement formé par ledit connecteur mâle (204) et le connecteur femelle (201 c). 9. Boîte selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le boitier inférieur (100) comprend une plaque mufti- puits (110), les puits (10) étant des puits de ladite plaque multi-puits (110). 10. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le boitier inférieur (100) comprend en outre un microsystème (150), les puits (10) auxquels est connectée une chambre microstructurée (15) étant pourvus sur leur fond de trous (11) dans lesquels viennent s'insérer au moins une connectique (16) d'interface dudit microsystème (150). 11. Boîte selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le microsystème (150) est constitué d'une plaque inférieure (152) comprenant l'empreinte de ladite au moins une chambre microstructurée (15), et d'une plaque supérieure (151) comprenant la ou les connectiques (16). 12. Boîte selon la revendication 10, caractérisée en ce que le microsystème (150) est constitué d'une plaque inférieure (152) comprenant l'empreinte de ladite au moins une chambre microstructurée(15), et d'une plaque supérieure (151), la ou les connectiques (16) étant des connecteurs fixés aux trous (11) perfusant la ou les chambres (15) à travers des trous de la plaque supérieure (151). 13. Boîte selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que le microsystème (150) est constitué de polydimethylsiloxane. 14. Boîte selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que la plaque multi-puits (110) est une plaque jetable en polystyrène. 15. Boîte selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que la plaque multi-puits (110) est une plaque autoclavable en polycarbonate. 16. Boîte selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'une sonde est disposée dans au moins l'un des ports de prélèvement (22). 17. Boîte selon la revendication précédente et selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite sonde est intégrée au bouchon (205) du port (22). 18. Boîte selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'un insert à membrane est disposé dans au moins l'un des puits (10). 19. Système de culture cellulaire dynamique caractérisé en 30 ce qu'il comprend : - une boîte (1) selon l'une des revendications précédentes, et 25 5- au moins un circuit (300) de fluide comprenant une tuyauterie (310) de circulation munie d'un moyen (320) de circulation et connectée à au moins une chambre microstructurée (15). 20. Système selon la revendication précédente caractérisé en ce que le moyen (320) de circulation est une pompe péristaltique multicanaux.