Brevet FR2952942A1 — publié le 20110527

Méthode pour amplifier la voie des pentoses phosphate dans des souches de levures, levures obtenues et leurs applications L'invention a pour objet une méthode pour augmenter le flux à travers la voie des pentoses phosphate (VPP) et les levures ainsi obtenues. Elle vise également les applications de ces levures, notamment dans les industries de fermentation. La VPP étant au centre du métabolisme carboné et redox de la levure, une amplification de cette voie présente un intérêt pour conduire à un remodelage métabolique important et ainsi conférer de nouvelles propriétés à la levure. L'obtention d'une souche de levure ayant une VPP amplifiée peut être envisagée par différentes stratégies. De nombreuses approches ont été développées ces dernières années dans le but d'obtenir des souches de S. cerevisiae capables de fermenter les pentoses. Ainsi, des souches de S. cerevisiae capables de fermenter le xylose en éthanol ont été obtenues par expression de gènes hétérologues permettant son assimilation (Eliasson et a1.,2000). Cependant, la formation d'éthanol par ces souches reste limitée du fait de la sécrétion d'une partie du xylose consommé sous forme de xylitol L'accumulation du xylitol pourrait provenir de la limitation du flux à travers la partie non oxydative de la VPP dans S. cerevisiae. En effet, des études sur des mutants possédant une meilleure capacité à métaboliser le xylose ont montré une augmentation de l'activité de leur transaldolase ou leur transcétolase ou bien les deux (Becker et al., 2003; Sonderegger et al., 2005 ; Pitkânen et al., 2005). De plus, la délétion d'un des deux gènes (ZWF1, GND1) codant pour les enzymes NADPH dépendantes du segment oxydatif permet de diminuer également le rendement de production de xylitol et d'augmenter le rendement en éthanol (Eliasson et al., 2000 ; Jeppsson et al., 2002). La sélection de mutants par évolution dirigée constitue une alternative aux approches d'ingénierie métabolique. Cette approche est basée sur la sélection de variants, obtenus par maintien d'une souche pendant de nombreuses générations en conditions sélectives pour forcer l'adaptation. Ce principe de sélection a été choisi par les inventeurs qui, de manière surprenante, sont parvenus à sélectionner des variants ayant accumulé des mutations permettant une amplification significative de la VPP. Ces mutations permettent de dégrader davantage de gluconate et confèrent aux souches des propriétés nouvelles, totalement inattendues (réduction de la production d'acétate, augmentation de celle d'esters, besoins en azote réduits). L'invention a donc pour but de fournir une méthode d'obtention de mutants de levures dans lesquels la VPP est amplifiée par rapport à une souche parentale. Elle vise également à fournir des mutants de levure dont le métabolisme, de manière inattendue, a été remodelé par rapport aux souches parentales, suite à l'amplification de la voie VPP. L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés de ces levures notamment dans les industries de fermentation. La méthode d'obtention de souches mutantes de levures selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend la culture des souches sur un substrat à base de dérivé d'acide gluconique, plus particulièrement d'un sel d'acide gluconique (un tel sel étant désigné ci-après en abrégé par le terme « gluconate). De manière avantageuse, le gluconate est incorporé dans la VPP au niveau de la 3ème étape. La culture des souches est effectuée afin de permettre leur adaptation dans des conditions de culture défavorables, sur au moins 10 générations, à une température d'incubation de 16°C à 32°C, de préférence de 28°C, sous agitation. Les mutants ayant accumulé des mutations permettant une amplification de la VPP sont avantageusement sélectionnés par test de croissance et ceux ayant une densité optique (DO) supérieure à au moins 1,3 fois celle de la souche parentale sont récupérés. L'invention vise également les mutants de souches de levures ayant une VPP améliorée par rapport à une souche parentale. Ces mutants sont caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par un procédé de culture comprenant les étapes . d'adaptation d'une souche de levure, sur au moins 10 générations, en utilisant comme seule source de carbone un substrat à base de gluconate, . de sélection des mutants ayant accumulé des mutations permettant une amplification de la VPP, ayant une DO finale d'au moins 1,3 fois supérieure à celle de la souche parentale non soumise aux conditions d'adaptation ci-dessus. Plus spécialement, l'invention vise les mutants de souches de levures ayant, par rapport à une souche parentale, une VPP améliorée, une vitesse de fermentation supérieure,et par conséquent une consommation plus rapide de glucose, ainsi qu' une réduction de la production d'acétate De manière avantageuse, les mutants de l'invention sont caractérisés par une forte production de composés aromatiques, tel l'alcool isoamylique, l'acétate d'isoamyle, le 2-phényléthanol. Les souches de levures appartiennent de préférence au genre Saccharomyces, notamment aux espèces cerevisiae, bayanus ou à des genres non Saccharomyces. Des souches préférées appartiennent au genre Saccharomyces et comprennent, notamment, les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces 10 bayanus, Saccharomyces uvarum et Saccharomyces kudriavzevii. D'autres souches préférées appartiennent au genre non Saccharomyces. L'invention vise également les hybrides des souches définies ci-dessus. L'invention vise en particulier la souche adaptée de Saccharomyces cerevisiae déposée à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), 25 rue 15 du Dr Roux , Paris, aux fins d'un dépôt selon le traité de Budapest, sous le n° CNCM 1-4216, le 29 juillet 2009. L'amplification de la VPP dans les souches mutantes de l'invention permet, notamment : une diminution de la production d'éthanol 20 une diminution de la production d'acétate une modification de la production de certains composés d'arômes. une augmentation de la vitesse de fermentation Ces propriétés présentent un intérêt majeur pour différentes utilisations de la levure, notamment dans les industries de fermentation. 25 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux Figures 1 à 5, qui représentent, respectivement, - les Figures 1A et 1B : les résultats de tests de croissance d'une souche issue d'une adaptation sur gluconate (1-4216) et de la souche parentale (I- 30 4215), sur milieu YNB glucose (2%)(Figure 1A) et sur milieu YNB gluconate (2%)(Figure 1B); - la Figure 2, la vitesse de fermentation de ces souches ; - la Figure 3, les résultats relatifs à la production d'acétate avec une souche de l'invention et la souche parentale ; - la Figure 4, la répartition des flux métaboliques dans une souche de l'invention et dans une souche parentale, et - la Figure 5, les histogrammes représentant le gluconate résiduel dans le milieu. Adaptation dirigée et mode de culture La souche industrielle 1-4215 a été cultivée dans des tubes de 13 ml contenant 5 ml de milieu YNB gluconate [Yeast nitrogen base 0.67% DIFCO, et gluconate 2% (Sigma)]. Deux cultures ont été réalisées en parallèle. Les cultures sont ensemencées à une densité optique (DO) de 0,1, à partir d'une préculture d'une nuit sur YEPD (Bacto Yeast Extract 1% (Difco), Bacto Peptone 2% (Difco), glucose 2%). Dans le but d'éliminer toute trace de glucose, les cellules sont centrifugées et lavées avec de l'eau stérile. La culture est réalisée pendant de nombreuses générations, en diluant les cellules par transfert dans un nouveau milieu toutes les 3 générations (DO=0,8). Les cultures sont incubées à 28°C sous agitation (250 rpm). La croissance sur ce substrat étant très lente, 8 jours sont nécessaires pour atteindre une DO de 0,8. Analyse des souches adaptées A intervalles réguliers, 200pL de cultures sont étalés sur une boîte contenant du milieu YEPD, afin de réaliser des tests de croissance permettant de mettre en évidence une évolution des souches. A cet effet, la croissance des souches issues de l'adaptation est comparée à celle de la souche parentale 1-4215, sur YNB gluconate (2%) et sur YNB glucose (2%). Les cultures sont ensemencées à DO 0,1, à partir d'une pré-culture d'environ 14h sur YEPD. Les cultures sont réalisées dans des erlenmeyers de 250 ml contenant 50 ml de milieu et incubées à 28°C sous agitation (250 rpm). Après 23, 37 et 79 transferts correspondant à environ 70, 180 et 240 générations, des souches issues des deux adaptations ménées en parallèles ont été isolées sur l'évolution des capacités de croissance YNB gluconate (2%). Ces souches sont nommées ECA2 et 1-4216 pour la sélection effectuée à 70 générations, ECB2 et ECB5 pour la sélection réalisée à 180 générations et ECC2 et ECC5 pour celle réalisée à 240 générations (Figurel ). Leur capacité à consommer le gluconate est réprésentée sur la Figure 5 (carrés noirs : biomasse finale sur YNB gluconate ; triangles noirs : biomasse finale sur YNB glucose). Plus l'adaptation est prolongée, plus la capacité à consommer le gluconate augmente. En revanche, la capacité de ces souches à se multiplier sur glucose diminue plus l'adaptation est prolongée. L'ensemble de ces souches a été testé dans des conditions de fermentation oenologique sur MS 70 contenant 240 g/l de glucose à 18°C. La souche 1-4216 présente les meilleures capacités fermentaires (temps de fermentation réduit de 30%), alors que les souches ECB2 et ECC2 ne terminent pas leur fermentation. Les souches ECA2, ECB5 et ECC5 présentent un phénotype fermentaire intermédiaire entre 1-4216 et I-4215. Une analyse comparative détaillée des propriétés souches 1-4216 et l-4215 a alors été réalisée. Aucune différence de croissance n'a été observée sur YNB glucose entre cette souche et l-4215 (Figure 2). En revanche, sur YNB gluconate, la DO finale atteinte par I- 4216 est de 1,3 fois supérieure à celle atteinte par I-4215 (Figure 2). Propriétés fermentaires de la souche adaptée I- 4216 Conditions de cultures Les fermentations ont été réalisées dans des réacteurs de 1,2 litres (SGI, France) avec un volume réactionnel de 1 litre. Le milieu MS a été utilisé pour la pré-culture et la culture. Il s'agit d'un milieu synthétique qui simule un moût standard de raisin. Le milieu MS contient 20% glucose, 6 g/I d'acide malique, 6 g/l d'acide citrique, 100 mg/1 d'azote, sous forme de NH4CI (79 mg/I) et d'acides aminés (28 mg/1). Le pH du milieu MS est ajusté à 3,3 avec une solution de NaOH à 32%. Des facteurs d'anaérobiose, ergostérol (7,5 mg/I), acide oléique (2,5 mg/l) et Tween 80 (0,21 g/I) sont ajoutés. Les pré-cultures ont été réalisées dans des erlenmeyers de 250 ml contenant 50 ml de milieu YEPD à 28°C sous agitation (150 rpm) pendant 8h. Ces pré-cultures ont été ensemencées à 0,1 UDO/ml à partir d'une pré-préculture sur YEPD réalisée pendant environ 14h. Les réacteurs ont été inoculés à partir des pré-cultures, à 0,5 million de cellules par ml et maintenus à température constante de 18°C avec une agitation permanente (300 rpm). Méthodes analytiques La croissance a été suivie par le comptage du nombre de cellules sur un appareil de type Coulter Counter (ZBI) à partir d'une fraction aliquote du milieu de culture. Les métabolites ont été dosés dans le surnageant de culture, après centrifugation à 13000 rpm pendant 5 minutes. Les concentrations en glucose, glycérol, éthanol, pyruvate, succinate, acétate, a-cétoglutarate ont été déterminées par chromatographie liquide sous haute pression (HPLC) en utilisant une colonne de type HPX-87H (Bio-Rad). Les concentrations en composés volatils (alcools supérieurs et esters) ont été 10 déterminées par chromatographie en phase gazeuse. Résultats La souche 1-4216 présente une vitesse maximale (Vmax) de fermentation supérieure à celle de l-4215, et consomme le glucose plus rapidement (Figure 3). 15 Le tableau 1 ci-dessous donne la balance carbone et redox des souches 1-4215 et 1-4216. Comme il ressort de l'examen de la figure 3, le résultat le plus marquant concerne la souche I- 4216 qui termine sa fermentation 200 heures plus tôt que la souche témoin. La souche adaptée présentant une biomasse finale inférieure à celle de la souche témoin (Tableau 1), la vitesse spécifique de fermentation est donc 20 fortement augmentée par rapport à celle de l-4215. Tableau 1 Composé (g/I) 1-4215 1-4216 Glucose 239 ± 2 239 ± 2 Biomasse 2,1 ± 0,2 1,3 ± 0,2 Ethanol 119 ± 2,5 118 ± 4,0 Glycérol 7,4 ± 0,3 7,3 ± 0,7 Pyruvate 0,1 ± 0,0 0,1 ± 0,0 Acétate 0,70 ± 0,06 0,35 ± 0,01 2,3 butanediol 0,4 0,6 Succinate 1,0 ± 0,1 0,9 ± 0,1 Balance Carbone 101 100 (%) Balance redox (%) 103 101 D'autre part, la souche adaptée produit moins d'acétate que l-4215. Cette réduction 15 atteint un facteur 2 (Figure 3 ; tableau I) L'acétate étant la seconde source de NADPH après la VPP, la diminution de la production d'acétate suggère que le flux à travers la VPP est augmenté dans ces souches. L'obtention d'une souche à faible production d'acétate présente un intérêt en 20 oenologie, notamment dans les vinifications de moûts blancs très clarifiés. Aucun effet marqué n'est observé sur la production des autres sous produits. Les balances carbones et redox sont équilibrées dans les deux souches (Tableau 1). La production des composés aromatiques a été analysée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus sur la production d'arômes sont résumés dans 25 le tableau 2 ci-après. 10 Tableau 2 1-4215 1-4216 Isobutanol 24,5 ± 1,4 29,5 ± 1,2 Alcool 280,6 ± 13 415,4 ± 6,4 isoamylique 90,2 ± 3,9 195,8 ± 0,6 2-phényl éthanol 0 ,0 ± 0,0 12,4± 0,2 acétate d'isoamyle Des effets marqués ont été observés sur la production d'arômes de la souche 15 adaptée par rapport à la souche témoin (1-4215). La souche adaptée 1-4216 présente une production accrue d'alcool isoamylique et d'acétate d'isoamyle (1,5 fois supérieur à EC1118) (Tableau 2). De plus, la production de 2-phényléthanol est plus élevée dans cette souche (2 fois) (Tableau 2). Le phényléthanol est produit à partir de la dégradation de la phénylalanine. Cet 20 acide aminé est synthétisé à partir d'un intermédiaire de la VPP, l'érythrose-4-phosphate. Une augmentation de ce composé est cohérente avec une augmentation du flux à travers la VPP. Une modification importante des propriétés aromatiques est ainsi observée, en partie expliquée par une augmentation du flux à travers la VPP. 25 Ces modifications présentent un grand intérêt en oenologie car l'acétate d'isoamyle et le 2-phényléthanol sont considérés comme des arômes positifs des vins et sont associés aux saveurs de banane et de poire pour le premier et de rose et de fleurs pour le second. 30 Quantification du flux à travers la Voie des Pentoses phosphate chez la souche adaptée 1-4216 L'ensemble des modifications observées montre que le flux à travers la voie des pentoses phosphate a été amplifié chez la souche adaptée 1-4216. Aux fins de 10 confirmation et de quantification de cet effet, une analyse comparative 13C flux chez I-4216 et I-4215 a été réalisée. Conditions de cultures Les cultures sont réalisées dans des fioles à pénicilline contenant 10 ml de milieu synthétique dont la composition est modifiée pour qu'il contienne 100g/L de glucose dont 40% est marqué en 13C sur le Cl (Eurisotope) et 1.4 g/L de NH4CI comme seule source de carbone. Les fioles sont ensemencées à 0,01 UDO. Traitement des cellules A DO 3 (milieu de la phase exponentielle de croissance), les cellules sont centrifugées. L'incorporation du 13C dans les acides aminés est déterminée après hydrolyse acide de la biomasse et dérivatisation comme décrit par Gombert et al. (2001). Le surnageant de culture est conservé dans le but de déterminer la production de sous produits extracellulaires par HPLC. Méthode Analytique La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GCMS) a été utilisée pour déterminer la distribution isotopique du carbone dans les acides aminés protéinogéniques obtenus au cours des cultures réalisées sur glucose 13C. La méthode utilisée est celle décrite par Christensen et Nielsen (1999). L'analyse est réalisée a l'aide d'une GC-MS de type GC-17A/GCMS-QP5050A (Shimadzu) fonctionnant en mode ionisation El (Electron Impact) et à 70 eV. La colonne utilisée lors des analyses est de type DB-1701 (Lenght = 30 mm, ID = 250pm, film = 0,10pm) fournie par Agilent. Le spectromètre de masse fonctionne en mode SIM. Analyse et traitement des données A partir des données brutes obtenues des mesures par GC-MS, le taux d'incorporation du 13C de chaque fragment est calculé de la manière suivante : SFL = 100 x [(1.m1 + 2.m2 + .... + n.mn) x (mo + m1 + m2 + ...+ mn)-1], m;>o représente l'abondance des molécules contenant i carbones marqués. De plus, la concentration des métabolites extracellulaires produits est dosée par HPLC. L'ensemble de ces données (SFLs et métabolites extracellulaires) a été utilisé comme contrainte du modèle mathématique (Gombert et al. 2001) pour quantifier les flux dans le métabolisme carboné. 50 itérations sont réalisées et les répartitions de flux figurant sur la figure 4 sont la moyenne de 25 distributions choisies. Résultats La distribution des flux, estimée en phase exponentielle de croissance, montre une augmentation considérable du flux à travers la VPP pour la souche I-4216. A ce stade, une légère diminution de la production d'éthanol est observée (168 and 165 mmol /100 mmol glucose pour I-4215 et 1-4216 respectivement), tandis que le flux dirigé vers la biomasse est globalement diminué dans la souche 1-4216 (figure 4). La perte de carbones résultant de l'amplification du flux à travers la VPP dans la souche ECA5 semble donc être compensée par une diminution la fois de la biomasse et de l'éthanol. Bilan de la fermentation de la souche 1-4216 sur un moût de Chardonnay Conditions de cultures : Les fermenteurs de 100 litres ont été ensemencés à 1 million de cellules par ml, à partir d'une pré culture en levain liquide des souches I-4215 et 1-4216. Les milieux utilisés pour la fermentation et pour la préculture sont les mêmes (moût de chardonnay récolté en 2007). Une oxygénation de 15 mg/L ainsi qu'un ajout de di-ammonium hydrogéno-phosphate (30g/hl) ont été réalisés après la vitesse maximale. Méthodes analytiques : Dosage de l'éthanol : dosage par densimètre de Paar. Cette méthode consiste à la distillation du vin alcalinisé par une suspension d'hydroxyde de calcium (98%) et à la mesure de la masse volumique du distillat. Pour cette mesure, le distillat est directement injecté dans un système oscillant dont la fréquence de vibration est modifiée par la masse de la substance injectée. Mesure de l'acidité volatile : après distillation par entraînement à l'azote à 98°C, les acides du vin sont mis en présence d'un réactif coloré (le bleu de bromophénol) dont les variations d'intensité colorante sont proportionnelles à la teneur en acidité volatile du vin. Mesure des composés d'arômes : les concentrations en composés volatils (alcools supérieurs et esters) ont été déterminées par chromatographie en phase gaz Headspace Agilent 6890 équipé d'un passeur HP 7694 et d'un détecteur FID. 10 Comme observé précédemment, 1-4216 produit moins d'acidité volatile (dont l'acétate) que 1-4215 (4 fois moins)(Tableau 3), produit beaucoup plus de composés aromatiques tels que l'acétate d'isoamyle (4 fois plus) (Tableau4). Une diminution de la production d'éthanol dans la souche 1-4215 est également 5 observée. Elle se traduit par une diminution de son rendement éthanol de 0,47 à 0,46 g d'éthanol/g de sucre consommé (Tableau 3). Tableau 3 Echantillon pH Acidité Acidité volatile Alcool Glucose + Rendement g/L H2SO4 g/L H2SO4 % vol éthanol g Fructose g/I d'éthanol/g dE sucre consommé 1-4215 3,3 ± 0,0 3,9 ± 0,1 0,4 ± 0,0 14,1 ± 0,0 0,8 ± 0,0 0,47± 0,00 1-4216 3,3 ± 0,0 3,7 ± 0,1 0,1 ± 0,0 14,0 ± 0,0 1,6 ± 0,0 0,46± 0,00 Tableau 4 Isobutanol alcool isoamylique acétate d'isobutyle acétate d'isoamyle butyrate d'éthyle hexanoate d'éthyle 1-4215 1-4216 22.,5 ± 0,7 32,23 ± 1,5 207,3 ± 6,9 250,4 ± 8,8 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 7,2 ± 0,1 33,6 ± 1,9 0,3 ± 0,0 0,4 ± 0,0 0,3 ± 0,0 1,5 ± 0,1 Références Becker, J. and E. Boles (2003). "A modified Saccharomyces cerevisiae strain that consumes L-Arabinose and produces ethanol." Appl Environ Microbiol 69(7): 4144- 50. Blank, L. M., F. Lehmbeck, et al. (2005). "Metabolic-flux and network analysis in fourteen hemiascomycetous yeasts." FEMS Yeast Res 5(6-7): 545-58. Christensen, B. and J. Nielsen (1999). "Isotopomer analysis using GC-MS." Metab Eng 1(4): 282-90. Eliasson, A., C. Christensson, et aI. (2000). "Anaerobic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1, XYL2, and XKS1 in minerai medium chemostat cultures." Appl Environ Microbiol 66(8): 3381-6. Gombert, A. K., M. Moreira dos Santos, et aI. (2001). "Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression." J Bacteriol 183(4): 1441-51. Jeppsson, M., B. Johansson, et aI. (2002). "Reduced oxidative pentose phosphate pathway flux in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose." Appl Environ Microbiol 68(4): 1604-9. Pitkanen, J. P., E. Rintala, et al. (2005). "Xylose chemostat isolates of Saccharomyces cerevisiae show altered metabolite and enzyme levels compared with xylose, glucose, and ethanol metabolism of the original strain." Appl Microbiol Biotechnol 67(6): 827-37. Saint-Prix, F., L. Bonquist, et al. (2004). "Functional analysis of the ALD gene family of Saccharomyces cerevisiae during anaerobic growth on glucose: the NADP+- dependent AId6p and Ald5p isoforms play a major role in acetate formation." Microbiology 150(Pt 7): 2209-20. Sonderegger, M., M. Jeppsson, et aI. (2004). "Fermentation performance of engineered and evolved xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae strains." Biotechnol Bioeng 87(1): 90-8. Revendications1 - Méthode d'obtention de souches mutantes de levures ayant une VPP amplifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend la culture des souches sur un substrat 5 à base d'un sel d'acide gluconique. 2 û Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la culture des souches est effectuée sur au moins 10 générations, à une température d'incubation de 16°C à 32°C , de préférence de 28°C, sous agitation. 3- Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend 10 en outre une étape de sélection des souches adaptées ayant accumulé des mutations permettant une amplification de la VPP, par test de croissance, ayant une DO supérieure à au moins 1,3 fois celle de la souche parentale. 4 - Mutants de souches de levures ayant une VPP amplifiée par rapport à une souche parentale, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par un 15 procédé de culture comprenant les étapes . d'adaptation d'une souche de levure, sur au moins 10 générations, en utilisant comme seule source de carbone un substrat à base de gluconate, . de sélection des mutants ayant accumulé des mutations permettant une amplification de la VPP, ayant une DO finale d'au moins 1,3 fois supérieure à celle 20 de la souche parentale non soumise aux conditions d'adaptation ci-dessus. - Mutants selon la revendication 4, caractérisés, par rapport à une souche parentale, par une VPP amplifiée, une vitesse de fermentation supérieure, une production d'acétate réduite. 6 û Mutants selon la revendication 4 ou 5, caractérisés par une production 25 accrue, par rapport à une souche parentale, de composés aromatiques, tel l'alcool isoamylique et l'acétate d'isoamyle, de phényléthanol. 7 û Mutants selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisés en ce qu'ils appartiennent au genre Saccharomyces, notamment aux espèces cerevisiae, bayanus, uvarum ou kudriavzevii, des genres non Saccharomyces, ou 30 d'hybrides. 8 - Souche mutante de Saccharomyces cerevisiae déposée à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Dr Roux , Paris, aux fins d'un dépôt selon le traité de Budapest, sous le n° CNCM 1-4216, le 29 juillet 2009. 9 ù Application des souches selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, en fermentation.5