Brevet FR2956409A1 — publié le 20110819

Procédés pour optimiser la production virale par l'inactivation ou l'inhibition du gène HIPK2 et cellules modifiées pour la production virale La présente invention concerne des procédés et des cellules pour améliorer la production de virus et de protéines virales en culture cellulaire. En particulier, l'invention concerne l'amélioration de la production industrielle de semences vaccinales ou d'antigènes de virus influenza en culture cellulaire. Pour la production de semences vaccinales, les virus influenza sont classiquement produits dans des oeufs de poule. Cette production des virus de la grippe dans les oeufs n'est pas sans poser de nombreux problèmes dont notamment le délai nécessaire pour le réassortiment des virus puis la production des semences vaccinales. En outre, les volailles elles-mêmes sont susceptibles d'être affectés par des virus influenza ce qui pourrait causer des difficultés d'approvisionnement si des élevages destinés à la production de virus étaient eux-mêmes concernés par une pandémie de virus influenza. Une première alternative serait la production de virus dans des cultures cellulaires, cette solution est d'ailleurs mise en oeuvre pour de nombreux virus dont les virus influenza. A partir des virus produits en culture cellulaire, des antigènes viraux peuvent être purifiés selon des techniques habituelles. Une autre solution serait la production directe d'antigènes viraux en culture cellulaire. Cependant, tant la production de virus que la production d'antigènes viraux en culture cellulaire se heurtent à des difficultés en termes de rendement et donc de quantité de virus ou d'antigènes produits. Dans le cas particulier des virus de la grippe, les lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires telles que les lignées MDCK, Vero, BHK21, CHO, HEK 293 et PERCE ne sont pas optimisées pour la production des semences vaccinales. Ces lignées ne permettent pas d'obtenir des rendements de production adéquats pour les industriels. Il en est de même pour d'autres virus tels que les adénovirus ou les Herpes Simplex Virus (HSV). La recherche porte donc sur le développement de nouvelles lignées cellulaires pour la production de virus en culture cellulaire ainsi que sur l'amélioration des rendements de la production de virus et d'antigènes viraux dans des lignées cellulaires disponibles pour la production industrielle. HIPK2 (Homeodomain-interacting protein kinase 2) est une protéine Sérine-Thréonine kinase originellement identifiée comme co-répresseur de facteurs de transcription à homéo-domaine. Depuis, HIPK2 a été le membre le mieux caractérisé de la famille des protéines HIPK (1 à 4) ; c'est un co-régulateur qui phosphoryle de nombreux facteurs et cofacteurs de transcription cellulaire. HIPK2 est activé en réponse à des agents de dommage de l'ADN et à des signaux morphogénétiques. Il est de ce fait impliqué dans la régulation des programmes d'expression génique de la différenciation, du développement et de l'apoptose cellulaire. HIPK2 a un effet pléiotropique et il est impliqué dans de nombreuses voies cellulaires, dont celle de p53. Le Knock-out stable de HIPK2 dans les cellules MCF7 (cancer sein) par exemple, induit un misfolding de p53 et l'inhibition de la trancription des gènes cibles de p53. HIPK2 a donc essentiellement fait l'objet de recherches dans le domaine de la cancérologie. En outre, le document WO 2004/108754 ainsi que Giraud et al. divulguent que la protéine US 11 du Herpes Simplex Virus (HSV) interagit avec HIPK2. Aucun effet sur la réplication du virus, sur la production virale ou sur la production d'antigènes viraux n'a cependant été évoqué. De façon inattendue, la présente invention montre que la suppression de l'expression de HIPK2 dans les cellules productrices permet d'obtenir une meilleure réplication et une meilleure production virale. Les procédés de la présente invention permettent ainsi d'améliorer la production de virus et d'antigènes viraux dans les lignées cellulaires existantes en inactivant ou inhibant l'expression du gène HIPK2 dans ces cellules. Ainsi, la présente invention concerne également de nouvelles cellules et lignées cellulaires particulièrement adaptées pour la production virale dans lesquelles le gène HIPK2 a été inactivé ou inhibé. Une des applications des procédés et des cellules modifiées de la présente invention est la production de virus influenza pour utilisation comme semences vaccinales. L'objectif étant d'atteindre des rendements similaires ou supérieurs aux rendements obtenus par les procédés de production actuels sur oeufs de poule ou par les procédés de production actuels sur lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires. RESUME DE L'INVENTION L'invention se rapporte donc à des procédés de production in vitro de virus par culture cellulaire comprenant l'infection de cellules avec un virus et la réplication du virus dans ces cellules dans lequel les cellules sont des cellules modifiées dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est inhibée. De préférence, les procédés selon l'invention comprennent en outre l'isolement des virus à partir de la culture cellulaire. Dans un premier mode de réalisation, les cellules modifiées ont une délétion du gène HIPK2. Dans un deuxième mode de réalisation, les cellules modifiées expriment un ARN interférant spécifique de HIPK2. De préférence, l'invention se rapporte à des procédés de production de virus choisis parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des orthomyxoviridae. Plus préférentiellement, l'invention se rapporte à des procédés de production de virus choisi parmi les virus influenza de type A, B et C. Avantageusement, les cellules sont choisies parmi les cellules de mammifères, les cellules aviaires ou les cellules d'insectes. De préférence, les cellules sont choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGEI.CR, AGEI.CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2. L'invention a aussi pour objet la production de produits viraux comprenant la production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes. L'invention a aussi pour objet des cellules modifiées pour la production de virus 20 par culture cellulaire dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 est inhibée; ces cellules étant infectées par un virus. L'invention a aussi pour objet des cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERC6, HEK, HeLa, AGEI.CR, AGEI.CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2 ; dans lesquelles le 25 gène HIPK2 est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 est inhibée. De préférence, les cellules modifiées selon l'invention sont infectées par un virus, préférentiellement par un virus choisi parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des ortyhomyoxoviridae, plus préférentiellement par un virus choisi parmi les virus influenza de type A, B ou C. 30 Dans un premier mode de réalisation, le gène HIPK2 est inhibé par l'expression d'un ARN interférant spécifique de HIPK2. Dans un deuxième mode de réalisation, le gène HIPK2 a été supprimé. DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention concerne donc un procédé de production de virus par culture cellulaire comprenant l'infection de cellules avec un virus et la réplication du virus dans ces cellules dans lequel les cellules sont des cellules modifiées de telle façon que le gène HIPK2 est inactivé ou de telle façon que l'expression du gène HIPK2 est inhibée. L'invention concerne également un procédé de production d'antigènes viraux par culture cellulaire comprenant l'expression des antigènes viraux dans les cellules dans lequel les cellules sont des cellules modifiées de telle façon que le gène HIPK2 est inactivé ou de telle façon que l'expression du gène HIPK2 est inhibée. Les procédés de la présente invention sont de préférence des procédés in vitro. L'invention concerne donc notamment un procédé de production de virus par culture cellulaire comprenant l'infection des cellules avec un virus et la culture des cellules pour obtenir la replication virale. Après la réplication du virus, le procédé peut comprendre l'isolement ou la purification des virus produits à partir des cellules ou de la culture cellulaire. Par "isolement ou purification des virus" on entend également l'obtention et la purification de produits viraux dont notamment les antigènes viraux. La culture des cellules, l'infection des cellules par un virus et la replication virale dans les cellules sont effectués selon les techniques habituelles dans ce domaine. La présente invention repose sur l'observation inattendue que l'inactivation ou l'inhibition du gène HIPK2 dans les cellules accroît la réplication ou la production de virus dans les cellules. Ainsi, la culture de cellules modifiées dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est inhibée, permet d'accroître significativement le rendement de la production de virus par culture cellulaire. Ces cellules modifiées sont également utiles pour une production accrue d'antigènes viraux par expression directe des gènes codant pour ces antigènes dans les cellules. Les cellules modifiées mise en oeuvre dans les procédés selon l'invention ont par exemple une délétion du gène HIPK2 ou elles expriment un ARN interférant spécifique de 30 HIPK2 inhibant l'expression de ce gène dans les cellules. Ces cellules sont mise en oeuvre pour la production de virus ou pour la production directe d'antigènes viraux. Les cellules modifiées selon la présente invention sont utiles pour la production industrielle de virus, de produits viraux, de semences vaccinales et/ou d'antigènes viraux. 4 Dans des modes de réalisation préférées, les cellules modifiées sont donc infectées par un virus et permettent la multiplication ou la réplication du virus dans la cellule. De préférence, le virus est un virus choisis parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des orthomyxoviridae, plus préférentiellement, le virus est choisi parmi les virus influenza de type A, B et C. Les cellules modifiées mises en oeuvre dans les procédés de la présente invention ainsi que les cellules modifiées de la présente invention peuvent être tout type de cellule appropriée pour la culture cellulaire, la réplication, la production de virus et la production d'antigènes viraux. Ainsi, les cellules sont par exemple choisies parmi les cellules de mammifères, les cellules aviaires et les cellules d'insectes. Parmi les cellules de mammifères on citera en particulier les cellules de culture dérivées de cellules humaines, de cellules de porc ou de chien. Ces cellules peuvent notamment être dérivées de cellules d'épithélium pulmonaire (ex : carcinome humain poumon A549 humaine CCL-185) ou d'épithélium intestinal (Caco-2 ATCC HTB-37). Parmi les cellules de mammifères, on citera également les cellules suivantes : o les cellules d'épithélium pulmonaire de porc SJPL dont notamment la lignée PTA- 3256 déposée à 1'ATCC (US2004/0142450 et WO2009/059411), o les cellules MDCK de chien, o BHK21 CCL-10 Mesocricetus auratus (hamster), o les cellules humaines HOS dont notamment la lignée CRL-1543. Parmi les cellules d'insectes, on citera en particulier les cellules de drosophiles et les cellules choisies parmi les cellules SF9 CRL-1711, Schneider's Drosophila Line 2 CRL-1963 et bombyx BM-N CRL-8910. Dans un mode de réalisation préféré, les cellules sont des cellules aviaires adaptées à la culture cellulaire telles que par exemple : o CCL-141 Anas platyrhynchus domesticus, o CRL-12135 Gallus gallus Con A - Cl ù VICK, o CRL-12203 Gallus gallus UMNSAH/DF-1, o CRL-12357 Gallus gallus ConA-B1-VICK, o CRL-1590 Gallus gallus SL-29, o CRL-1708 Coturnix coturnix japonica QT6, o CRL-1962 Coturnix coturnix japonica QM7 (Quail muscle clone 7), o CRL-2111 Gallus gallus (chicken) DT40, o CRL-2112 Gallus gallus (chicken) DT95, o CRL-8135 Meleagris gallopavo (turkey) MDTC-RP19, et o et la lignée QM7 de myoblastes déposée à 1'ATCC (CRL-1632) décrite dans le document US2005/0084503. D'autres lignées cellulaires aviaires sont connues de l'homme du métier et peuvent être utilisées. Il peut notamment s'agir de cellules embryonnaires aviaires. Les lignées cellulaires EB66 et EBx ont été décrites dans le WO03/076601 et le WO2008129058. Lohr et al. décrivent l'établissement de lignées cellulaires aviaires AGEI.CR et AGEI.CR.pIX pour la propagation ou la réplication virale. WO2009/004016 décrit également des cellules aviaires immortalisées pour la production virale et leurs procédés de préparation. De préférence, ces cellules sont choisies parmi les cellules MDCK, Vero, A549 et de manière générale parmi les lignées de cellules aviaires utilisées pour la production de virus influenza. Les cellules MDCK sont par exemple décrites dans US2006/0188977 et EP1862537. On citera en particulier les lignées suivantes : MDCK-SF101 (ATCC PTA- 6501), MDCK-SF102 (ATCC PTA-6502) et MDCK-SF103 (ATCC PTA-6503). Les cellules sont de préférence choisies parmi les cellules : o les cellules Vero notamment la lignée CCL-81 Cercopithecus aethiops Vero ; o les cellules CHO notamment les lignées CRL-12444 Cricetulus griseus (Chinese hamster) et CHO DP-12 clone#1933 aIL8.92 NB 28605/12 ; o les cellules MDCK notamment la lignée CCL-34 Canis familiaris MDCK (NBL-2), o les cellules COS notamment les lignées CRL-1650 Cercopithecus aethiops, COS-1 CRL-1651 Cercopithecus aethiops et COS-7 ; o les cellules CV1 notamment les lignées CCL-70 Cercopithecus aethiops CV-1, o les cellules HeLa, et o les cellules HEp-2. Avantageusement, les cellules sont choisies parmi les lignées cellulaires bénéficiant d'autorisations réglementaires pour la production virale en culture cellulaire à des fins 30 médicales. De préférence, les cellules sont choisies parmi les cellules BHK21, Vero, PERCE, HEK et EB66. Dans des modes de réalisation avantageux, les cellules sont choisies parmi CHO, MDCK, COS, CV-1, Vero, BHK21, PERCE, HEK, HeLa, AGEI.CR, AGEI.CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2. L'utilisation de lignées cellulaires CV-1, CV-C, Vero et BSC-1 pour la production virale est par exemple décrite dans US 6,303,371. Les cellules de la présente invention sont des cellules modifiées. Par « cellule modifiée », on entend une cellule dont le génome a été modifié ou dans laquelle a été introduit un matériel génétique extra-chromosomique. Typiquement, cette modification est une modification stable ou constitutive. Par "cellule modifiée", on entend également une cellule dans laquelle la protéine HIPK2 est inactivée ou inhibée. De préférence, dans les cellules modifiées selon la présente invention, le gène HIPK2 est inactivé ou l'expression du gène HIPK2 est inhibée. L'inactivation ou le « Knock-out » du gène HIPK2 peut être obtenue par toute méthode de mutagénèse dirigée ou de recombinaison connue de l'homme du métier. Dans des modes de réalisation préférés, les cellules ont été modifiées par la délétion du gène HIPK2. Le gène peut également être inactivé par l'insertion d'une séquence dans le gène HIPK2 qui interrompt le cadre ouvert de lecture du gène HIPK2. Lorsque le gène HIPK2 est inactivé il n'y a plus aucune expression du gène HIPK2 dans la cellule modifiée. L'inactivation du gène HIPK2 n'affecte pas la viabilité des cellules. Par « cellule modifiée dans laquelle l'expression du gène HIPK2 est inhibée », on entend des cellules modifiées dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est réduite d'au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% par rapport à la même cellule non modifiée. L'inhibition de l'expression du gène peut affecter la transcription ou la traduction du gène HIPK2. Alternativement, cette inhibition est une inhibition de l'activité de la protéine HIPK2. Dans un mode de réalisation préféré, le gène HIPK2 est inhibé par l'expression d'un ARN interférant spécifique de HIPK2. L'inhibition de l'expression ou de l'activité du gene HIPK2 peut s'effectuer par tous les moyens usuels à disposition de l'homme du métier permettant de contrôler l'expression des gènes sont utilisables, notamment l'utilisation d'inhibiteurs de transcription ou de traduction. En particulier l'usage d'ARN interférents permet d'inhiber spécifiquement l'expression de gènes d'intérêt. Les molécules d'ARN interférent sont utilisées pour cibler spécifiquement des ARN messager (ARNm) : l'ARN interférent vient s'hybrider à l'ARNm et par conséquent inhibe la traduction de la protéine correspondante, soit par simple encombrement stérique, soit en favorisant le clivage de l'ARNm. L'ARN interférent peut être choisi parmi plusieurs formes telles que : ARN antisens, ARN double-brin, « small interfering » ARN (siRNA), « Small Hairpin» ARN (shRNA) ou ARN ribosomal. Les siRNA, pour « Small Interfering RNA » ou ARN interférant de petite taille, sont des séquences courtes d'environ 15 à 30 paires de bases (bp), de préférence de 19 à 25 bp. Elles comprennent un premier brin et un brin complémentaire identiques à la région ciblée de l'ARN du gène cible. Par siRNA, on entend les formes d'ARN double brin synthétiques. Les shRNA pour « Small Hairpin RNA » sont des ARN double brin produits par une séquence clonée dans un vecteur d'expression, codant pour une molécule d'ARN qui adoptera une forme en épingle à cheveux après clivage. Le design et la préparation d'ARN interférents et leur utilisation pour la transfection de cellules in vivo et in vitro sont bien connues et largement décrites dans de nombreuses publications. Les siRNA peuvent être conçus et préparés en employant des logiciels appropriés disponibles en ligne. Les outils pour la préparation de siRNA et la transfection de cellules sont à la disposition du public, comme par exemple les vecteurs de siRNA commercialisés par la société Invitrogen®. Par « ARN interférent spécifique de HIPK2», on entend un acide ribonucléique simple ou double brin, qui interfère avec l'ARN messager spécifique du gène HIPK2 conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine. Dans un mode de réalisation préféré, l'expression du gène HIPK2 est inhibée par la modification de la cellule pour obtenir l'expression d'un siRNA spécifique de HIPK2 ayant la séquence « sense » 5'-GACACCAGAUGACCAUGAA-3' et antisense 5 '-UUCAUGGUCAUCUGGUGUC- 3 '. Dans un autre mode de réalisation, les cellules modifiées expriment une protéine «neutralisant» l'activité de HIPK2. Il peut par exemple s'agir d'une protéine se liant à 30 HIPK2. Dans un autre mode de réalisation, les cellules modifiées expriment un mutant dominant négatif de HIPK2. Toute autre méthode appropriée peut être utilisée pour inactiver ou inhiber le gène HIPK2 dans les cellules modifiées. Le gène HIPK2 est un gène conservé au sein de différentes espèces et l'homme du métier saura donc inactiver ou inhiber le gène HIPK2 dans les différentes cellules utilisées pour la production virale. Le tableau ci-dessus indique les références GENBANK du gène HIPK2 dans différentes espèces. espèce symbol gene/unigene Refseq Accession Homo sapiens HIPK2 28996 NM_001113239 AAL37371 NM_022740 AAG41236 Mus musculus Hipk2 15258 NM_010433 AAK07649 NM_001136065 AAK07650 Rattus norvegicus Hipk2 362342 XM_001066812 XM_342662 Danio rerio Hipk2 557551 NM_001080160 BC171706 NM_001099985 Pan troglodytes Hipk2 463772 XM_519419 XM_001151817 Gallus gallus Hipk2 374138 XM_416335 AF461697 BX950640 Canis lupus familiaris L0C482772 482772 NM_001014769 AY800385 Drosophila melanogaster CG17090 38070 NM_167834 NM_138194 25 L'homme du métier dispose donc des informations nécessaires à l'inactivation ou à l'inhibition du gène HIPK2 dans des cellules dérivées de différentes espèces. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules modifiées de la présente invention sont infectées par un virus pour la production de ce virus par culture 30 cellulaire. Tout type de virus pouvant se répliquer dans des cultures cellulaires in vitro peut être produit par les procédés de la présente invention. Avantageusement, les virus sont choisis parmi les virus à ADN dont par exemple les Adénovirus et les virus HSV. Dans un autre mode de réalisation, les virus sont choisis 35 parmi les virus à ARN comme les virus de la famille des orthomyxoviridae et en particulier les virus influenza de type A, B et C humains et animaux. De préférence, il s'agit de virus ayant un intérêt dans une application vaccinale et plus particulièrement de virus influenza. 15 20 Ainsi l'invention concerne aussi un procédé de production d'une semence vaccinale comprenant la production in vitro de virus par culture cellulaire selon les procédés de la présente invention ou mettant en oeuvre des cellules modifiées selon la présente invention. FIGURES Figure 1 : Quantification de la production de virus A/H3N2 en condition d'extinction de l'expression endogène d'HIPK2 par transfection de siRNA (SiHIPK2). Après transfection par des SiRNA, les cellules HeLa ont été infectées par le virus A/H3N2 (à MOI (,1). La progéniture virale produite à 8, 24 et 32 hpi a été titrée par RT-qPCR. L'extinction d'HIPK2 induit une augmentation de la quantité de virus A/H3N2 produite par rapport aux conditions de production en cellules non transfectées (T) ou transfectées par un siRNA témoin (SiC). Figure 2 : Quantification de la production d'Ad5 en conditions d'extinction de l'expression endogène d'HIPK2 par transfection de siRNA (SiHIPK2). Après transfection par des SiRNA, les cellules HeLa ont été infectées par l'Ad5 (à MOI 0,1 et 1). La progéniture virale produite à 36 et à 90 hpi a été titrée sur cellules 293. L'extinction d'HIPK2 induit une augmentation de la quantité d'Ad5 produite par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un siRNA témoin (SiC). Figure 3 : Quantification de la production d'HSV-1 en conditions d'extinction de l'expression endogène d'HIPK2 par transfection de siRNA (SiHIPK2). Après transfection par des SiRNA, les cellules HeLa ont été infectées par l'HSV-1 (à MOI (,1). La progéniture virale produite à 3, 6, 9 et 12 hpi a été titrée sur plaque elisa. L'extinction d'HIPK2 induit une augmentation de la quantité d'HSV-1 produite par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un siRNA témoin (SiC). Figure 4 : Quantification de la production de virus A/H3N2 en condition de sur-expression d'eGFP-HIPK2 par transfection de plasmide codant pour la fusion eGFPHIPK2. Après transfection, les cellules HeLa ont été infectées par le virus A/H3N2 (à MOI 0,1). La progéniture virale produite à 16, 20 et 36 hpi a été titrée par RT-qPCR. La sur-expression d'eGFP-HIPK2 induit une diminution de la quantité de virus A/H3N2 produite jusqu'à 20 hpi par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un plasmide codant pour l'eGFP. Figure 5 : Quantification de la production d'Ad5 en condition de sur-expression d'eGFP-HIPK2 par transfection de plasmide codant pour la fusion eGFP-HIPK2. Après transfection, les cellules HeLa ont été infectées par l'Ad5 (à MOI 0,1 et 1). La progéniture virale produite à 48 et 56 hpi a été titrée sur cellules 293. La sur-expression d'eGFPHIPK2 induit une diminution de la quantité d'Ad5 à 48 et 56 hpi par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un plasmide codant pour l'eGFP. Figure 6 : Quantification de la production d'HSV-1 en condition de sur-expression d'eGFP-HIPK2 par transfection de plasmide codant pour la fusion eGFP-HIPK2. Après transfection, les cellules HeLa ont été infectées par l'HSV-1 (à MOI 0,1 ; 0,5 et 1). La progéniture virale produite à 6, 9 et 12 hpi a été titrée sur plaque Elisa. La sur-expression d'eGFP-HIPK2 induit une diminution de la quantité d'HSV-1 à 6, 9 et 12 hpi par rapport aux conditions de production en cellules transfectées par un plasmide codant pour l'eGFP. EXEMPLES 1. Modification du patron de localisation subcellulaire d'HIPK2 endogène au cours de l'infection Par le virus influenza A/Moscow/10/99 H3N2 Des cellules A549 ont été infectées par le virus H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 24 heures (hpi). Après fixation au PFA 4%, HIPK2 endogène et la nucléoprotéine virale (NP) ont été immunodétectées par les anticorps anti-HIPK2 (polyclonal de lapin, Santa Cruz H55) et anti-NP (monoclonal de souris 17C2, FRE3011) et les noyaux cellulaires marqués par le DAPI. Les cellules ont été observées en microscopie confocale. Le patron de localisation subcellulaire de HIPK2 endogène est complètement remodelé par l'infection à 30 hpi : les domaines d'accumulation d'HIPH2 (visible dans le noyau des cellules non infectées, m) ont disparu ; le marquage d'HIPK2 est diffus dans l'espace nucléaire. Des résultats identiques ont été obtenus en cellules HeLa. Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules infectées par HSV-1 ou par l'Adénovirus de type 5. Dans des cellules A549 infectées par l'Adénovirus de type 5 (Ad5). Le patron de localisation d'HIPK2 endogène est modifié par rapport aux cellules non infectées. HIPK2 s'accumule fortement dans des domaines nucléaires périphériques à la zone centrale nucléaire d'accumulation de matériel viral (sous forme de chapelet). Dans des cellules infectés par un virus HSV-1. Le patron de localisation subcellulaire d'HIPK2 endogène est modifié par rapport aux cellules non infectées. HIPK2 constitue une cible privilégiée des virus, qui en modifient systématiquement le patron de localisation subcellulaire. II. L'infection par le virus influenza A/H3N2 induit une forte augmentation d'expression d'HIPK2 endogène Des cellules HeLa ont été infectées par le virtus A/H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 8, 24 et 30 hpi. Des extraits cellulaires totaux ont été réalisés et déposés sur gel de polyacrilamide SDS PAGE pour caractérisation. Des Western blot ont été réalisés avec des anticorps permettant de révéler les protéines HIPK2, NP (marqueur d'infection) et actine cellulaire (témoin étalon pour la quantité de matériel). Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules infectées par HSV-1 ou par l'Adénovirus de type 5 : l'expression endogène d'HIPK2 est induite par les infections à 10 virus HSV-1 et Ad5. L'expression endogène cellulaire d'HIPK2 est induite lors de stress tels que les infections virales. A l'image de PML, HIPK2 pourrait constituer un acteur majeur dans une nouvelle voie de réponse cellulaire (innée) anti-virale. 15 III. La sous-expression d'HIPK2 endogène aboutit à une augmentation significative de la production de virus A/H3N2 Des cellules HeLa ont été transfectées par des siRNA témoin (SiC) ou spécifique de l'ARNm codant HIPK2 (SiHIPK2). A 48 heures post-transfection, les cellules ont été infectées par le virus H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 8, 24 et 32 hpi. 20 Une analyse par immunofluorescence à 32 hpi a été effectuée et révèle une diminution significative de l'expression d'HIPK2 endogène dans les cellules transfectées par le siRNA HIPK2 en comparaison des cellules transfectées par le siRNA témoin (SiC). Le marquage de la nucléoprotéine virale dans les noyaux de cellules infectées, indique une augmentation significative du nombre de cellules infectées dans le contexte d'extinction de 25 l'expression de HIPK2 endogène. Une quantification des virus produits a été réalisée dans les deux populations de cellules transduites par les siRNA témoin (SiC) et d'extinction d'expression d'HIPK2 endogène (SiHIPK2), ainsi que dans une population de cellules non transduites (T) (Figure 1). La titration virale a été réalisée par RTqPCR afin de quantifier l'ARN viral 30 contenu dans les virions produits dans le surnageant de culture (Figure 1). En condition d'extinction d'expression d'HIPK2 (siHIPK2), la production de virus influenza est optimisée. Des résultats similaires ont été obtenus pour les virus HSV-1 et Ad5, dont la production est augmentée en condition d'extinction d'expression d'HIPK2 endogène (Figure 2 et Figure 3). IV. La sur-expression d'HIPK2 est défavorable au cycle réplicatif du virus A/H3N2 Des cellules HeLa ont été transfectées par un plasmide pcDNA3 codant la protéine HIPK2 en fusion avec l'eGFP ou uniquement l'eGFP. A 48 heures post-transfection, les cellules ont été infectées par le virus H3N2 à une MOI de 0,1 pendant 16, 20 et 36 hpi. Une quantification des virus produits a été réalisée dans les deux populations de cellules transduites par les plasmides codant eGFP-HIPK2 et eGFP (Figure 4). La titration virale a été réalisée par RTqPCR afin de quantifier l'ARN viral contenu dans les virions produits dans le surnageant de culture. En condition de surexpression d'HIPK2 (eGFP-HIPK2), la production de virus influenza est diminuée de manière significative à 16 et 20 hpi, en comparaison à celle obtenue à partir de cellules surexprimant l'eGFP seule ou non transfectées (Figure 4). REFERENCES REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Giraud S et al., J Virol. 2004, 78(6):2984-93 Lohr et al., Vaccine, 2009, 27:4975-4982 REFERENCES BREVET WO 2003/076601 WO 2004/108754 WO 2008/129058 WO 2009/059411 WO 2009/004016 US 6,303,371 EP 1862537 US 2006/0188977 US 2004/0142450 US 2005/0084503 REVENDICATIONS1. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire comprenant l'infection de cellules avec un virus et la réplication du virus dans ces cellules caractérisé en ce que les cellules sont des cellules modifiées dans lesquelles le gène HIPK2 est inactivé ou dans lesquelles l'expression du gène HIPK2 est inhibée. 2. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon la revendication précédente dans lequel les cellules modifiées ont une délétion du gène HIPK2. 3. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes dans lequel les cellules modifiées expriment un ARN interférant spécifique de HIPK2. 15 4. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes dans lequel le virus est choisi parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des orthomyxoviridae. 5. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des 20 revendications précédentes dans lequel le virus est choisi parmi les virus influenza de type A, B et C. 6. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les cellules sont choisies parmi les 25 cellules de mammifères, les cellules aviaires ou les cellules d'insectes. 7. Procédé de production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que les cellules sont choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERCE, HEK, HeLa, AGE1.CR, 30 AGE1.CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2. 8. Procédé de production de produits viraux comprenant la production in vitro de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes.10 9. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire caractérisées en ce que le gène HIPK2 est inactivé ou en ce que l'expression du gène HIPK2 est inhibée; et en ce que les cellules sont infectées par un virus. 10. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire caractérisées en ce que les cellules sont choisies parmi les cellules CHO, MDCK, COS, CV1, Vero, BHK21, PERCE, HEK, HeLa, AGE1.CR, AGE1.CR.pIX, EB66, EBx et HEp-2 ; et en ce que le gène HIPK2 est inactivé ou en ce que l'expression du gène HIPK2 est inhibée. 11. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon la revendication 10 caractérisées en ce que les cellules sont infectées par un virus. 12. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications 9 ou 11 caractérisées en ce que les virus sont choisis parmi les adénovirus, les virus HSV et les virus de la famille des orthomyxoviridae. 13. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon la revendication 12 caractérisées en ce que les virus sont choisis parmi les virus influenza de type A, B et C. 14. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications 9-13 caractérisées en ce que le gène HIPK2 est inhibé par l'expression d'un ARN interférant spécifique de HIPK2. 15. Cellules modifiées pour la production de virus par culture cellulaire selon l'une des revendications 9-13 caractérisées en ce que le gène HIPK2 est inactivé par sa délétion.25