Brevet FR2959568A1 — publié le 20111104

PROCÉDÉ ET DISPOSITIF POUR DÉTECTER ET QUANTIFIER UN ANALYTE AVEC RECYCLAGE DES RÉACTIFS DESCRIPTION 5 DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se réfère au domaine des dispositifs et procédés analytiques, notamment utilisés pour détecter et/ou quantifier un analyte dans un liquide d'intérêt. De tels dispositifs sont également 10 connus sous le nom de « biocapteurs » ou « biopuces ». Plus particulièrement, dans le cadre d'analyses biologiques réalisées par des procédés de bioreconnaissance sur support, la présente invention propose un procédé et un dispositif qui permettent le 15 recyclage des réactifs secondaires mis en oeuvre et n'ayant pas été adsorbés sur la surface du capteur de façon à les réutiliser après leur passage sur ce dernier. 20 ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Les supports fonctionnalisés sont connus et utilisés depuis plusieurs décennies pour identifier des analytes d'intérêt tels que des séquences nucléotidiques, des anticorps ou des molécules de 25 nature chimique variée et notamment des protéines. De façon générale, un support biofonctionnalisé présente, greffées sur sa surface, des sondes spécifiques possédant des affinités pour des analytes en solution telles que des anticorps ou des antigènes, 30 dirigées contre un analyte ou molécule cible bien 2 défini(e). Ce support est adapté à un système de détection permettant de mettre en évidence l'adsorption de l'analyte ou de la molécule cible sur la surface du capteur. Cette détection peut mettre en oeuvre des réactifs secondaires détectables comme, par exemple, des anticorps marqués reconnaissant un antigène de l'analyte ou de la molécule cible. La surface du support est maintenue sous flux d'une solution telle qu'un milieu expérimental ou un échantillon notamment aqueux à analyser. Pour ce faire, un dispositif fluidique est placé au-dessus d'une zone active du support : il est constitué d'une (ou plusieurs) voie(s) d'entrée, d'une chambre d'interaction, et d'une (ou plusieurs) voie(s) de sortie. En amont de la voie d'entrée, se trouve éventuellement un système à injection permettant d'injecter un volume bien défini de l'échantillon à analyser (Figure 1A). Certaines analyses peuvent nécessiter l'injection d'un (ou plusieurs) réactif(s) secondaire(s) permettant de traduire l'adsorption de l'analyte à la surface du support en signal exploitable expérimentalement. De tels réactifs secondaires peuvent être des marqueurs fluorescents [1]. Pour ce faire, un réactif secondaire présentant une bonne affinité pour l'analyte à détecter est injecté sur le support. Ces réactifs secondaires se lient ainsi aux molécules d'analytes présentes à la surface du support. Ce réactif secondaire chimique doit, par ailleurs, aussi posséder des propriétés le rendant facilement détectable par le système de lecture 3 choisi. Il est ainsi tout à fait possible de faire appel à plusieurs réactifs secondaires, en utilisant des entités chimiques ayant des affinités chimiques successives les unes avec les autres. Ces techniques sont souvent dénommées « sandwich ». L'analyse d'un échantillon peut se dérouler en plusieurs étapes [2]. Le support est d'abord maintenu sous flux d'un milieu expérimental avant qu'un échantillon de volume donné contenant potentiellement l'analyte à détecter ne soit injecté sur le support via un système d'injection donné. Lorsque la totalité de l'échantillon à analyser a circulé sur le support, le retour en milieu expérimental se fait automatiquement. En variante, l'échantillon peut également être mis en circulation continue sur le support. Puis, par un procédé (similaire), l'utilisateur injecte une solution contenant le réactif secondaire. Dans le cas d'une révélation « multiple » nécessitant plusieurs réactifs secondaires, l'utilisateur injecte successivement les réactifs secondaires. Ce dispositif microfluidique est un système « ouvert » c'est-à-dire que les entités chimiques n'ayant pas adhéré au support sont évacuées, via la voie de sortie, vers une poubelle biologique. Plus précisément, la technique telle qu'elle est décrite précédemment nécessite la consommation systématique de réactifs secondaires pour chaque échantillon étudié et ce, que l'échantillon analysé soit négatif (i.e. il ne contient pas de molécule cible) ou positif. Dès lors que la probabilité d'analyser un échantillon contaminé 4 est faible, ce système presente l'inconvénient d'engendrer une dépense inutile en termes de réactifs secondaires. Par ailleurs, avec un tel dispositif, l'analyse de l'échantillon nécessite deux injections successives : celle de l'échantillon contenant éventuellement l'analyte, puis l'injection du réactif secondaire. Ainsi, pour chaque échantillon à analyser, il faut injecter un nouveau lot de réactifs secondaires. Le recyclage des réactifs est un procédé classiquement utilisé en chimie, comme lors d'une distillation à reflux. Pour des synthèses complexes, certains réactifs peuvent être recyclés, comme, par exemple, dans le cas de la synthèse des hydrazines décrite dans le brevet US 6,605,265 [3]. La demande internationale WO 98/49187 décrit l'utilisation du recyclage dans le cadre de la synthèse de molécules bio-organiques complexes que sont des oligomères peptoïdes [4]. En revanche, dans le domaine de l'analyse biologique, il est commun d'utiliser des réactifs à usage unique. Seule la zone réactive peut être recyclée dans le cas des biocapteurs (cf. Figure 1). Il existe donc un réel besoin d'un dispositif et d'un procédé dans le domaine des analyses biologiques qui permettent de limiter la consommation de réactifs secondaires sans affecter le signal détecté voire même en l'améliorant.30 EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention propose un dispositif et un procédé utilisant un tel dispositif permettant de parer aux inconvénients des méthodes de l'état de la technique précédemment exposés. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour détecter et éventuellement quantifier un analyte éventuellement présent dans un liquide d'intérêt. Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : i) mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; ii) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un réactif secondaire, détectable directement ou indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; iii) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active ; le procédé selon la présente invention comprenant en outre une étape consistant à recycler ladite solution afin de la remettre en contact avec la surface au moins une fois. Dans le cadre du procédé selon la présente invention et de ses différentes formes de mise en oeuvre ou variantes, les étapes de mise en contact avec le réactif secondaire et de détection et éventuelle quantification peuvent être successives ou simultanées. 5 6 Le procédé selon la présente invention se distingue des procédés de l'état de la technique par la mise en oeuvre de l'étape de recyclage et donc d'une mise en contact répétée de la solution contenant le réactif secondaire avec la surface du support. Dans le procédé selon l'invention, le nombre de fois où la solution contenant le réactif secondaire est mise en contact avec la surface du support et notamment avec la (ou les) zone(s) active(s) (étape (ii) + étape(s) de recyclage) est un nombre entier compris entre 2 et 1000, notamment entre 2 et 200 et, en particulier, entre 2 et 20. L'homme du métier saura déterminer, sans effort inventif, le nombre de mise en contact le mieux adapté en fonction de différents paramètres tels que la stabilité du réactif secondaire. Dans une 1ere variante du procédé selon l'invention, l'étape de recyclage est mise en oeuvre juste après la lere mise en contact de la surface du support avec le réactif secondaire. Dans cette variante, le procédé selon l'invention comprend donc les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; b) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un réactif secondaire, détectable directement ou indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; 7 c) recycler ladite solution de façon à répéter au moins une fois une étape (b) et éventuellement l'étape (c) ; d) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active. De par cette étape, le réactif secondaire n'ayant pas été lié avec l'analyte immobilisé sur la zone active est recyclé afin d'être remis en contact avec la surface du support et notamment avec la (ou les) zone(s) active(s) qu'elle présente. Si la mise en contact du réactif secondaire avec la surface du support se fait plus de deux fois, la répétition de l'étape (c) n'est pas optionnelle. Dans une 2eme variante du procédé selon l'invention, l'étape de recyclage est mise en oeuvre préalablement à la mise en contact de la surface du support avec un liquide d'intérêt (i.e. préalablement à l'étape (i)). Dans ce cas, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : a1) mettre en contact un ter liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; b1) mettre en contact ladite surface avec au moins un réactif secondaire, détectable directement ou indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; 8 c1) recycler ledit réactif secondaire ne s'étant pas immobilisé sur ladite zone active par liaison directe ou indirecte avec l'analyte ; d1) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active ; a2) mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec ladite surface ; b2) mettre en contact ladite surface avec au moins le réactif secondaire recyclé lors de ladite étape (c1) d2) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active. Dans le cadre de cette 2ème variante, le ter liquide mis en oeuvre peut être un liquide « contrôle » qui est reconnu ne pas contenir l'analyte à détecter. De ce fait, la détection et l'éventuelle quantification lors de l'étape (d1) permettent de détecter et éventuellement de quantifier le bruit de fond de l'expérience. Le ter liquide dit « contrôle » peut être un liquide de même nature que le liquide d'intérêt testé. A titre d'exemple, on peut citer le cas où lorsque l'analyte à détecter est un anticorps anti- rougeole, le liquide « contrôle » est un sérum provenant d'un sujet n'ayant jamais contracté la rougeole et dont les anticorps anti-rougeole d'origine maternelle ont complètement disparu. Dans le cadre de cette 2ème variante, le ter liquide mis en oeuvre peut également être un liquide 9 d'intérêt conformément à la présente invention qui, une fois l'étape (d1) réalisée, a été reconnu ne pas contenir l'analyte recherché. Dans le cadre de cette 2ème variante, le ter liquide mis en oeuvre peut aussi être un liquide contrôle contenant des quantités connues du (ou des) analyte(s) servant ainsi à calibrer le système. Une 3ème variante du procédé selon l'invention combine les deux précédentes variantes. Les différentes formes de mise en oeuvre envisagées pour ces précédentes variantes s'appliquent également à cette 3ème variante. Cette dernière comprend les étapes suivantes : a1') mettre en contact un ter liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; b1') mettre en contact ladite surface avec au moins un réactif secondaire, détectable directement ou indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; c1') recycler ledit réactif secondaire ne s'étant pas immobilisé sur la zone active par liaison directe ou indirecte avec l'analyte ; d1') détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur la zone active ; a2') mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec ladite surface ; 10 b2') mettre en contact ladite surface avec au moins le réactif secondaire recyclé lors de ladite étape (c1') ; c2') recycler ledit réactif secondaire ne s'étant pas immobilisé sur la zone active par liaison directe ou indirecte avec l'analyte de façon à répéter au moins une fois une étape (b2') et éventuellement l'étape (c2') ; d2') détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur la zone active. Le liquide d'intérêt mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est un liquide susceptible de contenir l'analyte à détecter et éventuellement à quantifier. Il peut être de nature et d'origine très variées. Ce liquide d'intérêt est avantageusement choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudat racinaire ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique comme une culture cellulaire d'eucaryotes supérieurs, de levures, de champignons ou d'algues ; un liquide obtenu à partir d'une (ou plusieurs) cellule (s) animale (s) ou végétale(s) ; un liquide obtenu à partir d'un tissu animal ou végétal ; un prélèvement dans une matrice alimentaire ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; de l'eau de ville, de rivière, de mer, de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide 11 ou gazeux ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges. Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito-urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. De même, si un des prélèvements envisagés ne permet pas de mettre en oeuvre le procédé de l'invention, par exemple du fait de sa nature gazeuse ou solide, de sa concentration ou des éléments qu'il contient tels que résidus solides, déchets, suspension ou molécules interférentes, le procédé de l'invention comprend en outre une étape préalable de préparation du liquide d'intérêt avec éventuellement une mise en solution du prélèvement par les techniques connues de l'homme du métier telles que filtration, précipitation, 12 dilution, distillation, mélange, concentration, lyse, etc. L'analyte à détecter et éventuellement à quantifier dans le liquide d'intérêt peut être choisi dans le groupe constitué par une molécule d'intérêt biologique ; une molécule d'intérêt pharmacologique ; une toxine ; un glucide ; un peptide ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur nucléaire ou membranaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur nucléaire ou membranaire ; une hormone ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable ou CDR pour « Complementarity Determining Region » ; une molécule nucléotidique ; une cellule eucaryote ; une cellule procaryote et un virus. L'expression « molécule nucléotidique » utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : « acide nucléique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique », « séquence polynucléotidique ». Par « molécule nucléotidique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal (ou ribozyme) ; un ARN de transfert ; une 13 séquence faisant office d'aptamère ; une portion ou un fragment de ceux-ci. La sonde utilisée pour fonctionnaliser la zone active du support solide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est toute molécule capable de former avec l'analyte à détecter une paire de liaison, la sonde et l'analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en oeuvre dans la liaison analyte-sonde sont avantageusement des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals. La sonde utilisée est donc dépendante de l'analyte à détecter. En fonction de cet analyte, l'homme du métier saura, sans effort inventif, choisir la sonde la plus adaptée. Elle peut être choisie dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Region ») ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; un acide nucléique peptidique et un aptamère tel qu'un aptamère ADN ou un aptamère ARN.30 14 Le support solide du dispositif selon l'invention peut être un quelconque support permettant de mettre en oeuvre cette invention. Il peut s'agir, par exemple, d'un support de biopuce tel que ceux classiquement utilisés en silicium, en verre, en métal, en polymère ou en plastique. Il peut être de taille et de forme variées. La surface du support solide présente une (ou plusieurs) zone(s) active(s), ces zones actives peuvent être organisées de façon aléatoire ou non. Une zone active correspond à un plot, un spot ou une partie de surface définie chimiquement. La surface de ce support et notamment la zone active peut être avantageusement constituée d'un matériau conducteur si une fonctionnalisation électrique ou électrochimique est nécessaire. Elle peut être constituée de tout autre matériau utilisable pour greffer la sonde si d'autres techniques de fonctionnalisation sont choisies, par exemple des techniques de fonctionnalisation chimiques. Elle peut être en un matériau modifié chimiquement ou biologiquement pour que la sonde puisse être fixée dessus. Il peut s'agir de la surface même du support ou d'un revêtement déposé sur ce support par les techniques habituelles de dépôt connues de l'homme du métier, permettant la fonctionnalisation par la sonde. Ce revêtement peut être par exemple du silicium ; du verre ; du dioxyde de silicium permettant une silanisation ; un (co)polymère conducteur approprié tel que ceux utilisés pour la fabrication de biopuces, en particulier pour la fixation de sondes moléculaires de 15 biopuces comme du polypyrrole ; un métal tel que de l'or, de l'argent, du platine, par exemple pour réaliser un électrogreffage, pour la formation de monocouches auto-assemblées, etc. La zone d'accrochage peut être délimitée par exemple par la localisation des sondes qui la fonctionnalisent. De manière générale, la fonctionnalisation de la zone active par la sonde qui consiste en une immobilisation de la sonde sur la zone active peut être réalisée au moyen des techniques habituelles de greffages chimiques ou électrochimiques (« électrogreffage »), par exemple telles que celles décrites dans les documents [5] et [6]. Le réactif secondaire mis en oeuvre et recyclé dans le cadre du procédé selon la présente invention est toute molécule capable de se lier à l'analyte. Cette liaison peut être directe. Dans ce cas, le réactif secondaire et l'analyte sont capables de former une paire de liaison, le réactif secondaire et l'analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en oeuvre dans la liaison analyte-réactif secondaire sont avantageusement des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que précédemment définies pour la liaison analytesonde. Lorsque la liaison analyte-réactif secondaire est directe, ce dernier peut être choisi dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur 16 membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une hormone ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable ou CDR pour « Complementarity Determining Region » ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; un acide nucléique peptidique ; un phare moléculaire et un aptamère tel qu'un aptamère ADN ou un aptamère ARN. Par « phare moléculaire » ou « molecular beacon », on entend une molécule nucléotidique se présentant sous une forme en épingle à cheveux avec un fluorophore désactivé, la fluorescence du fluorophore étant restaurée lorsque le phare se lie à l'analyte se présentant sous forme d'une séquence nucléotidique complémentaire. L'homme du métier saura déterminer, sans effort inventif, la composition de la solution dans laquelle le (ou les) réactif(s) secondaire(s) est(sont) contenu(s). Cette composition dépendra principalement de la nature du (ou des) réactif(s) secondaire(s) et de la nature des liaisons analyte-sonde et analyte-réactif secondaire. La liaison entre le réactif secondaire mis en oeuvre et recyclé dans le cadre du procédé selon la présente invention et l'analyte peut être indirecte. Dans ce cas, la liaison analyte-réactif secondaire fait intervenir au moins un 31eme partenaire également désigné « 2nd réactif secondaire », ce dernier étant capable de se lier directement, d'une part, à l'analyte 17 et, d'autre part, au ter réactif secondaire. En variante, on peut envisager l'utilisation de plusieurs 2nde réactifs secondaires parmi lesquels au moins un lie directement l'analyte, au moins un autre lie directement le ter réactif secondaire et au moins un autre lie deux 2nds réactifs secondaires. Une telle liaison indirecte peut mettre en oeuvre, lorsque l'analyte à détecter est une protéine, un 2nd réactif secondaire qui est un anticorps spécifique de ladite protéine, marqué par la biotine et un ter réactif secondaire recyclé qui est une streptavidine détectable. Une telle liaison indirecte peut également mettre en oeuvre, lorsque l'analyte à détecter est une protéine, un 2nd réactif secondaire qui est un anticorps primaire spécifique de ladite protéine et un ter réactif secondaire recyclé qui est un anticorps secondaire marqué dirigé contre une portion espèce-spécifique de l'anticorps primaire. Dans le cadre d'une liaison indirecte, le procédé selon la présente invention peut comprendre non seulement une étape de recyclage du ter réactif secondaire mais aussi une étape de recyclage du (ou des) 2nd(s) réactif (s) secondaire(s). Dans les procédés de la présente invention, le réactif secondaire mis en oeuvre et recyclé dans le cadre du procédé selon la présente invention est détectable directement ou indirectement. Cette détection directe ou indirecte et cette éventuelle quantification du réactif secondaire peuvent 18 mettre en oeuvre des techniques sans marqueur telles que les techniques utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR pour « Surface Plasmon Resonance ») ou les balances à quartz. En variante, la détection directe ou indirecte et l'éventuelle quantification peuvent mettre en oeuvre un marqueur. Le réactif secondaire mis en oeuvre et recyclé est détectable directement lorsqu'il porte un tel marqueur. Il est détectable indirectement lorsqu'un 3eme réactif secondaire capable de se lier, directement ou indirectement, à ce ter réactif secondaire porte un tel marqueur. Que la détection soit directe ou indirecte, le marqueur utilisable dans le cadre de la présente invention est notamment choisi dans le groupe constitué par : - une particule colorée telle qu'une particule de latex colorée qui peut produire, lorsque agrégée sur la zone active, un signal visible à l'oeil nu ; un fluorophore ou marqueur fluorescent tels que la fluorescéine, la rhodamine, la phycobiliprotéine, un point quantique (ou « quantum dot ») et les fluorophores Alexa ; un marqueur phosphorescent tel qu'un complexe métallique d'un ou plusieurs métaux comme ruthénium, osmium, platine, cuivre, molybdène et chrome ; un marqueur chimioluminescent tel que le luminol ou le dioxétane ; 19 une molécule chimique telle que la digoxygénine ; une molécule active électrochimiquement telle que le ferrocène ; une molécule active biologiquement capable de produire un signal détectable lorsqu'incubée avec l'enzyme ou le substrat chromogène adéquat(e). Cette molécule active biologiquement est, par exemple, une enzyme telle que la phosphatase alcaline, la peroxydase de raifort, la luciférase ou une protéase ou un substrat tel que le para-nitrophényl phosphate, la diaminobenzidine, la luciférine ; et - un marqueur radioactif tel qu'un isotope notamment du phosphore [32P], du soufre [35S], de l'hydrogène [3H] ou de l'iode [1251] Dans les procédés selon la présente invention, l'expression « mettre en contact avec » est équivalente à l'expression « faire circuler sur ». La surface du support solide est mise en contact avec le ter liquide, un liquide d'intérêt ou le réactif secondaire tels que précédemment définis. Dans la présente invention, la surface entière du support solide peut être mise en contact ou seulement une partie de cette dernière, à condition que la partie impliquée comprenne au moins une zone active telle que précédemment définie. On peut parler de « surface active » du support, cette dernière correspondant à ou englobant l'ensemble des zones actives présentes au niveau de la surface du support solide. 20 Dans les procédés selon la présente invention, une (ou plusieurs) étape(s) de rinçage de la surface du support, notamment après les étapes (a), (a1), (a2), (a1') et/ou (a2') et/ou préalablement aux étapes (d), (d1) , (d2) , (d1') et/ou (d2' ) peut (peuvent) également être réalisée(s). La solution de rinçage est, de préférence, une solution qui préserve les liaisons sonde-analyte et les liaisons directes ou indirectes analyte-réactif secondaire telle qu'un tampon phosphate ou une solution aqueuse. De même, préalablement aux étapes de détection (d), (d1) , (d2) , (d1') et/ou (d2'), la surface du support et notamment la (ou les) zone (s) active (s) peu(ven)t être séchée (s) et recouverte (s) d'un milieu adapté pour faciliter cette détection. La détection lors des étapes (d), (d1), (d1'), (d2) et (d2' ) met en oeuvre une technique adaptée au marqueur utilisé dans les procédés de l'invention. Cette technique peut être une technique permettant de mesurer la radioactivité, l'absorbance, la fluorescence, l'angle de réfraction de la lumière, la modulation de la longueur d'onde, une différence de potentiel, un changement de la fréquence de résonance ou un changement de réflectivité. Lors des étapes (d), (d2) et (d2'), la présence d'un signal au niveau de la zone active sur laquelle une (ou plusieurs) sonde(s) a(ont) été préalablement immobilisée(s) est une indication de la présence, dans le liquide d'intérêt mis en oeuvre, d'un analyte donné capable de se lier à cette sonde. 21 De plus, une fois que le procédé a été calibré, par exemple, en mesurant le signal obtenu pour des quantités variables d'analyte (courbes étalons), le signal obtenu pour un liquide d'intérêt particulier peut être une indication de la quantité ou de la concentration de l'analyte dans ce liquide. Dans ce cas, le procédé et le dispositif selon l'invention peuvent être utilisés non seulement pour détecter mais aussi pour quantifier un analyte donné dans un liquide d'intérêt. La présente invention concerne également un dispositif susceptible d'être mis en oeuvre dans le cadre d'un procédé tel que précédemment défini. Le dispositif selon l'invention comprend : une chambre (1) comprenant un support solide dont la surface comprend au moins une zone active susceptible d'être fonctionnalisée par au moins une sonde capable de lier un analyte ; un ter système fluidique adapté pour faire circuler un liquide d'intérêt susceptible de contenir ledit analyte sur ladite surface ; un 2nd système fluidique adapté pour faire circuler une solution comprenant au moins un réactif 25 secondaire au moins deux fois sur ladite surface. La chambre (1) comprenant un support solide dont la surface comprend au moins une zone active susceptible d'être fonctionnalisée par au moins une 30 sonde capable de lier un analyte est une structure 22 classiquement présente dans les biocapteurs ou biopuces de l'état de la technique. Le dispositif de la présente invention peut comprendre, par exemple, à des fins de commercialisation, un support solide comportant une surface non fonctionnalisée. L'utilisateur de ce dispositif peut alors aisément, au moyen des techniques classiques de fonctionnalisation de surface de biopuces, fonctionnaliser cette surface afin d'y créer au moins une zone active avec une (ou plusieurs) sonde(s) qu'il a choisie en fonction de l'analyte qu'il désire retenir pour obtenir un dispositif permettant de mettre en oeuvre un des procédés de l'invention. Le dispositif de la présente invention peut aussi se présenter, à des fins de commercialisation, comme comportant déjà une (ou des) zone(s) active(s) fonctionnalisée(s) par une (ou des) sonde(s) capable(s) de se lier à un analyte particulier pour l'accrocher. Il permet alors de mettre en oeuvre un des procédés de l'invention immédiatement, sans fonctionnalisation préalable de la surface du support solide, pour l'analyte correspondant à ladite sonde. Le dispositif selon la présente invention comprend une poubelle biologique, des réservoirs (ou chambres d'introduction ou de circulation de fluide) pour contenir le liquide d'intérêt et la (ou les) solution(s) comprenant les réactifs secondaires et des éléments adaptés pour faire circuler le liquide d'intérêt et la (ou les) solution(s) à partir de ces 23 réservoirs et les amener sur la surface du support solide et notamment sur la surface active du support. De tels éléments sont notamment choisis dans le groupe constitué par des conduits (ou canaux), des connecteurs, une (ou des) boucle(s) fluidique(s), des pompes, des pompes péristaltiques, des pousse- seringues, des vannes notamment d'injection, des soupapes et des valves et tout autre système permettant de déplacer des fluides, en particulier des systèmes de microfluidique intégrés [7]. Pour les réactifs secondaires, le dispositif selon la présente invention peut présenter des réservoirs différents contenant chacun un ou plusieurs réactifs secondaires différents. Dans une forme de mise en oeuvre particulière, le 2nd système fluidique du dispositif selon la présente invention est adapté pour faire circuler au moins une solution comprenant au moins un réactif secondaire au moins deux fois dans le même sens sur ladite surface. Dans cette forme de mise en oeuvre, le 2nd système fluidique comprend au moins un réservoir (7) contenant une solution comprenant au moins un réactif secondaire. Ainsi, le 2nd système fluidique peut comprendre un seul réservoir (7) contenant une solution comprenant au moins un réactif secondaire. En variante, le 2nd système fluidique peut comprendre plusieurs réservoirs (7) contenant, chacun, une solution avantageusement différente comprenant au moins un réactif secondaire. 24 Dans une autre forme de mise en oeuvre particulière, le 2nd système fluidique du dispositif selon la présente invention est adapté pour faire circuler au moins une solution comprenant au moins un réactif secondaire au moins une fois dans un sens et au moins une autre fois en sens inverse sur ladite surface du support et notamment sur la surface active. Dans cette forme de mise en oeuvre, le 2nd système fluidique comprend un (ou plusieurs) réservoir(s) (7 ou 7a) amont contenant la (ou les) solution(s) comprenant au moins un réactif secondaire, et éventuellement un (ou plusieurs) réservoir(s) (7b) disposé(s) en aval contenant ou susceptible(s) de contenir la (ou les) solution(s) comprenant au moins un réactif secondaire. Dans cette forme de mise en oeuvre, le 2nd système fluidique peut comprendre un (ou plusieurs) réservoir(s) (7) amont contenant la (ou les) solution(s) comprenant au moins un réactif secondaire, et aucun réservoir (7b) disposé en aval. En variante, le 2nd système fluidique peut comprendre un réservoir (7a) amont contenant la solution comprenant au moins un réactif secondaire et un réservoir (7b) disposé en aval. En autre variante, le 2nd système fluidique peut comprendre plusieurs réservoirs (7a) amont contenant les solutions comprenant au moins un réactif secondaire et plusieurs réservoirs (7b) disposés en aval. Avantageusement, le nombre de réservoirs amont et aval est identique. 25 Le dispositif selon la présente invention peut également comprendre des moyens adaptés pour permettre la détection et l'éventuelle quantification d'un réactif secondaire immobilisé sur la zone active. Ces moyens sont adaptés à une détection et à une éventuelle quantification sans marquage ou marqueur. En variante, ces moyens sont adaptés au marqueur qui rend le réactif secondaire détectable directement ou indirectement. Les marqueurs envisagés dans le cadre de la présente invention sont communément utilisés, l'homme du métier saura déterminer, sans effort inventif, les éléments à utiliser pour détecter et éventuellement quantifier le signal émis par le marqueur. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, et faisant référence aux figures annexées. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La Figure 1 présente un dispositif utilisant un procédé de bioreconnaissance sur support et de détection du signal conforme à l'état de la technique. La Figure 1A présente ce système maintenu sous flux. La Figure 1B présente ce système soumis à l'injection de l'entité chimique amplifiante, suite à l'injection de l'échantillon contenant l'analyte à détecter, les réactifs en excès (échantillon et entité chimique amplifiante) étant évacués vers la poubelle biologique. 26 Les références numériques de la Figure 1 correspondent aux éléments portant les mêmes références de la Figure 2 explicités ci-après et ont les mêmes fonctions que ces éléments. La Figure 2 propose différents variants des dispositifs selon la présente invention et permettant de recycler au moins un réactif secondaire. Les Figures 2A et 2B présentent un dispositif de type « inversion du flux ». La Figure 2C présente un dispositif de recyclage en boucle. La Figure 3 propose une représentation schématique d'un dispositif selon l'invention à deux vannes d'injection permettant le recyclage. La Figure 3A propose un ter état du dispositif avec la lere vanne d'injection permettant d'injecter le liquide d'intérêt dans le circuit fluidique principal et la 2nde isolant le circuit secondaire contenant les réactifs secondaires de la zone active. La Figure 3B propose un 2nd état du dispositif dans lequel les réactifs secondaires sont injectés sur la zone active qui est isolée du circuit fluidique principal par action respective de la 2nde et de la lere vannes. La Figure 4 est une représentation schématique du montage permettant la réalisation de l'imagerie SPR. La Figure 5 est une représentation schématique du procédé d'amplification par nanoparticules d'or fonctionnalisées. La Figure 6 présente les variations temporelles de réflectivité. Les expériences présentées Figure 6A et Figure 6B comportent 3 étapes : (1) injection de l'échantillon à analyser, suivie de (2) l'injection 27 d'anticorps secondaires, puis (3) mise en circulation des nanoparticules d'or sur la zone active. Les deux lignes verticales délimitent la durée durant laquelle le circuit fermé contenant les nanoparticules d'or est au contact de la zone active. Figure 6A : L'échantillon analysé ne contient pas de molécules cibles. Figure 6B : L'échantillon analysé contient des molécules cibles. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS I. Dispositifs selon la présente invention. I.1. Dispositifs selon la présente invention utilisant une inversion de flux. i. Dispositif représenté Figure 2A. La Figure 2A présente un dispositif de type « inversion du flux ». Ce dispositif permet d'injecter la solution contenant le réactif secondaire sur le support dans un sens puis dans le sens contraire pour recharger le réservoir. Dans cette configuration, le recyclage consiste à réinjecter directement les réactifs sur la zone active. Ce dispositif comprend une chambre (1) dans laquelle le support avec la (ou les) zone(s) active(s) adaptée(s) pour immobiliser l'analyte recherché se trouve et un système fluidique principal connecté fluidiquement à cette chambre. Ce système fluidique principal comprend un conduit fluidique (3a) connecté à, d'une part, la chambre (1) et, d'autre part, une pompe (2) et un conduit fluidique (3b) connecté, d'une part, à la chambre (1) et à une poubelle biologique (4). Les conduits fluidiques (3a) et (3b) sont 28 avantageusement en matière plastique notamment thermostable telle que du polyétheréthercétone (PEEK), du polychlorure de vinyle (PVC), du polypropylène (PP), du polyéthylène (PE), du polysiloxane (PDMS) ou une matière à base de matériaux teflonés. Le système fluidique principal permet, au moyen de la pompe (2), de maintenir un courant fluidique portant maintenant sous flux la chambre (1) et donc la surface active et la (ou les) zone(s) active(s) du support. Le courant fluidique portant également désigné « milieu expérimental » est un fluide qui ne réagit ni avec le fluide d'intérêt ou « contrôle », ni avec le(s) réactif(s) secondaire(s). Il peut s'agir d'un tampon phosphaté. Le dispositif comprend également un module d'introduction du liquide d'intérêt i.e. un système adapté pour introduire (ou injecter) le liquide d'intérêt (5) dans la chambre (1). Ce système présente un réservoir comprenant le liquide d'intérêt du type seringue, connecté au conduit fluidique (3a) au niveau d'un point d'introduction (6). Il peut s'agir, par exemple, d'une vanne d'injection à 6 voies (type HPLC) munie d'une boucle d'injection contenant le liquide d'intérêt. Une fois introduit dans le courant fluidique portant, le liquide d'intérêt circule du conduit fluidique (3a) vers la chambre (1) puis vers la poubelle biologique (4) via le conduit fluidique (3b). Le courant fluidique portant additionné du liquide d'intérêt est éliminé via la poubelle biologique (4). Le dispositif comprend, en outre, un module adapté pour introduire la solution contenant au moins 29 un réactif secondaire et recycler cette solution. Ce système comprend un réservoir (7) comprenant la solution contenant au moins un réactif secondaire, connecté au conduit fluidique (3a) au niveau d'un point d'introduction (8). Il peut, par exemple, s'agir d'une vanne d'injection, d'un connecteur ou d'une électrovanne à 3 voies, l'une reliée au conduit fluidique ((3a), l'autre au conduit (3b) et la dernière au conduit menant au réservoir (7) . Le point d'introduction (8) se situe entre le point d'introduction du liquide d'intérêt (6) et la chambre (1). En variante, le point d'introduction du liquide d'intérêt (6) pourrait se situer entre le point d'introduction (8) et la chambre (1). Une fois introduite dans le courant fluidique portant, la solution contenant le réactif secondaire circule du conduit fluidique (3a) vers la chambre (1) puis vers la poubelle biologique (4) via le conduit fluidique (3b) et ce, au moyen d'une pompe placée entre le réservoir (7) et le point d'introduction (8) ou en aval de la chambre (1) ; ou d'un pousse-seringue, la seringue faisant, dans ce cas, office de réservoir (7) ; ou de pompes multicanaux programmables ; ou d'un système pneumatique fonctionnant par pression-dépression ; ces systèmes pouvant être intégrés dans un système microfluidique. Toutefois, avant que le courant fluidique portant additionné de la solution contenant le réactif secondaire n'atteigne la poubelle biologique (4), le courant est inversé par inversion de flux opérée par la pompe. Le courant inversé passe du conduit fluidique 30 (3b) à la chambre (1) puis au conduit fluidique (3a) et au réservoir (7). Une variante du dispositif présenté à la Figure 2A est un dispositif présentant plusieurs réservoirs (7) comprenant chacun une solution contenant un (ou plusieurs) réactif (s) secondaire (s) distinct(s). ii. Dispositif représenté Figure 2B. Le dispositif de la Figure 2B se distingue de celui de la Figure 2A par le module adapté pour introduire la solution contenant au moins un réactif secondaire et recycler cette solution. Les autres éléments du dispositif de la Figure 2B sont identiques aux éléments de la Figure 2A portant les mêmes références numériques et ont la même fonction que ces derniers. Le module adapté pour introduire la solution contenant au moins un réactif secondaire et recycler cette solution du dispositif de la Figure 2B comprend un ter réservoir (7a) comprenant la solution contenant au moins un réactif secondaire, connecté au conduit fluidique (3a) au niveau d'un point d'introduction de type vanne d'injection, connecteur ou électrovanne à 3 voies (8). Le point d'introduction (8) se situe entre le point d'introduction du liquide d'intérêt (6) et la chambre (1). En variante, le point d'introduction du liquide d'intérêt (6) pourrait se situer entre le point d'introduction (8) et la chambre (1). Une fois introduite dans le courant fluidique portant, la solution contenant le réactif secondaire circule du conduit fluidique (3a) vers la chambre (1) puis vers la 31 poubelle biologique (4) via le conduit fluidique (3b) et ce, au moyen d'une pompe placée entre le réservoir (7a) et le point d'introduction (8) ou entre le réservoir (7b) et le point d'introduction (10) ; ou d'un pousse-seringue, la seringue faisant, dans ce cas, office de réservoir (7a) ou (7b) ; ou de pompes multicanaux programmables ; ou d'un système pneumatique fonctionnant par pression-dépression ; ces systèmes pouvant être intégrés dans un système microfluidique. Une variante du dispositif présenté à la Figure 2B est un dispositif présentant plusieurs réservoirs (7a) comprenant chacun une solution contenant un (ou plusieurs) réactif(s) secondaire(s) distinct(s) et plusieurs réservoirs (7b) destinés à récupérer et à recycler une solution particulière chacun. Toutefois, avant que le courant fluidique portant additionné de la solution contenant le réactif secondaire n'atteigne la poubelle biologique (4), il est dévié vers une voie annexe distincte du conduit fluidique (3b) menant à la poubelle (4). La déviation (10) peut se faire au moyen de la même vanne d'injection que celle éventuellement utilisée au point d'injection (8). On peut aussi utiliser une vanne à 3 voies d'entrées. Cette voie annexe est un conduit fluidique (9) fluidiquement connecté à un 2nd réservoir (7b) susceptible de contenir la solution contenant au moins un réactif secondaire. Dans ce cas, la circulation de la solution contenant au moins un réactif secondaire sur la zone active dans la chambre (1) peut se faire alternativement dans un sens (ter 32 réservoir (7a) , chambre (1) , 2nd réservoir (7b)) puis dans l'autre (2nd réservoir (7b) , chambre (1) , ter réservoir (7a». Par ailleurs, les inversions successives du sens du flux, aussi bien dans le dispositif de la Figure 2A que dans celui de la Figure 2B, peuvent être réitérées un grand nombre de fois permettant ainsi d'augmenter le temps d'interaction réactif secondaire/zone active. I.2. Dispositifs selon la présente invention sans inversion de flux. i. Dispositif représenté Figure 2C. Le dispositif de la Figure 2C se distingue de celui de la Figure 2B par une partie du module adaptée pour introduire la solution contenant au moins un réactif secondaire et recycler cette solution. Les autres éléments du dispositif de la Figure 2C sont identiques aux éléments des Figures 2A et 2B portant les mêmes références numériques et ont la même fonction que ces derniers. Après avoir circulé sur la zone active, la solution contenant le réactif secondaire circule dans une voie annexe à celle menant à la poubelle biologique. La voie annexe aboutit alors au réservoir à échantillon initial. Dans ce cas, l'échantillon peut circuler de façon continue sur la zone active. Ainsi, le dispositif de la Figure 2C comprend un unique réservoir (7) comprenant la solution contenant au moins un réactif secondaire, connecté au 33 conduit fluidique (3a) au niveau d'un point d'introduction de type vanne d'injection, connecteur ou électrovanne à 3 voies (8). Le point d'introduction (8) se situe entre le point d'introduction du liquide d'intérêt (6) et la chambre (1). En variante, le point d'introduction du liquide d'intérêt (6) pourrait se situer entre le point d'introduction (8) et la chambre (1). Une fois introduite dans le courant fluidique portant, la solution contenant le réactif secondaire circule du conduit fluidique (3a) vers la chambre (1) puis vers la poubelle biologique (4) via le conduit fluidique (3b) et ce, au moyen d'une pompe de recyclage type péristaltique ou autre, éventuellement intégrée au système fluidique, connectée au réservoir (7) soit en amont, soit en aval de la chambre (1). Toutefois, avant que le courant fluidique portant additionné de la solution contenant le réactif secondaire n'atteigne la poubelle biologique (4), il est dévié vers une voie annexe distincte du conduit fluidique (3b) menant à la poubelle (4). La déviation (10) peut se faire au moyen de la même vanne d'injection que celle éventuellement utilisée au point d'injection (8). On peut aussi utiliser une vanne à 3 voies d'entrées. Cette voie annexe est un conduit fluidique (11) fluidiquement connecté au réservoir (7) comprenant la solution contenant au moins un réactif secondaire. Dans ce cas, la circulation de la solution contenant au moins un réactif secondaire sur la zone active dans la chambre (1) peut se faire de façon continue dans le même sens (réservoir (7) ù conduit 34 (3a) ù chambre (1) ù conduit (3b) ù conduit (11) réservoir (7». Dans ce cas, le circuit (réservoir de solution contenant un réactif secondaire (7) et chambre (1)) forme une boucle et la circulation du réactif sur la zone active est assurée tant que le flux est maintenu (par exemple via une pompe péristaltique). Il est évident que des vannes judicieusement placées permettent la recirculation du réactif excédant. Ainsi, ce dispositif présente l'avantage de ne pas imposer de limite temporelle de l'interaction réactif secondaire/zone active. L'éventuel réactif en excès peut être mis en circulation sur la zone active pour une durée illimitée en théorie. Une variante du dispositif présenté à la Figure 2C est un dispositif présentant plusieurs réservoirs (7) comprenant chacun une solution contenant un (ou plusieurs) réactif (s) secondaire (s) distinct(s). ii. Dispositif de la Figure 3. La Figure 3 propose une représentation schématique d'un dispositif illustrant le procédé et le dispositif décrits dans la Figure 2C. La Figure 3A propose le dispositif dans lequel l'échantillon à analyser est injecté à partir d'un réservoir (17) grâce à une première vanne d'injection (12) dans la chambre (1) puis vers la poubelle biologique (4) et ce, via le circuit fluidique principal (14). Une seconde vanne d'injection (13) permet d'isoler le circuit fluidique principal (14) qui peut présenter un dégazeur (18) apte à dégazer le 35 liquide d'intérêt, d'un circuit secondaire (15) contenant la solution avec les réactifs secondaires. Ce circuit secondaire (15) est maintenu sous flux via une pompe péristaltique (16). La Figure 3B propose le même dispositif dans lequel le réactif a déjà été injecté dans la chambre (1) et donc au niveau de la zone active. La première vanne d'injection (12) a été basculée de façon à isoler la chambre (1) du circuit fluidique principal (14). La seconde vanne (13) est actionnée manuellement. Elle permet de mettre en contact la zone active dans la chambre (1) avec le circuit secondaire (15) contenant les réactifs, tout en l'isolant du circuit fluidique principal (14). La solution contenant les réactifs secondaires circule dans la chambre (1) et donc sur la zone active du support tant que la vanne d'injection (13) n'est pas basculée dans sa position initiale. Dans le dispositif conforme à la Figure 3, un système actionné manuellement (vanne d'injection par exemple, pompe, etc.) permet de séparer la solution contenant les réactifs secondaires du système permettant de maintenir la zone active sous flux (14). Ainsi, le dispositif de l'invention permet de conserver un réservoir à réactifs réutilisable aussi souvent que nécessaire, dans la limite de la stabilité du réactif et de son éventuelle dilution au fur et à mesure des recyclages : le réactif en excès n'est plus gaspillé. Par ailleurs, l'intérêt de ce dispositif réside dans le fait que l'analyse des échantillons est simplifiée : le réactif secondaire est injecté à partir 36 du réservoir à échantillon préalablement à toute analyse. Ainsi, après avoir injecté le liquide d'intérêt, il suffit de relier le circuit contenant les réactifs secondaires (15) à la chambre (1) pour éventuellement amplifier le signal, et de faire l'opération inverse pour mettre un terme à l'interaction réactifs secondaires/zone active. En variante, le dispositif peut présenter plusieurs circuits secondaires (15) distincts contenant chacun une solution avec un (ou plusieurs) réactif(s) secondaire(s). Ainsi, dans ces deux configurations de recyclage, ce dispositif permet de favoriser l'interaction réactifs secondaires/zone active. En effet, il est tout à fait possible de faire circuler les réactifs secondaires en excès en continu sur la zone active, afin d'optimiser le contact entre les réactifs secondaires et la zone active. Par conséquent, ce dispositif permet de faire de réelles économies en terme de consommation de réactifs, puisque, d'une part, un même lot de réactifs secondaires peut être utilisé plusieurs fois pour analyser différents échantillons ; et d'autre part, les interactions sont favorisées sans consommation supplémentaire d'un nouveau lot de réactifs. Il faut cependant noter que ce recyclage ne peut pas être illimité, car chaque cycle entraîne une perte de réactifs soit vers la poubelle biologique, soit par dilution, du fait de l'existence d'une interface tampon/réactifs. D'autre part, un réactif 37 biologique fragile peut avoir une stabilité limitée. Par conséquent, le nombre de recyclage d'un réactif donné doit être adapté aux besoins analytiques en termes de sensibilité et de reproductibilité. Ce procédé peut être adapté à toute analyse biologique mettant en oeuvre au moins un réactif secondaire, que cela soit relatif à l'analyse d'ADN, l'immuno-analyse... III. Mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention. III.1. Principe et Matériel. Le mode de réalisation présenté ici se réfère au cas où l'excès de réactifs est récupéré dans une voie de recyclage isolable du circuit fluidique principal. Une des réalisations possibles du dispositif permettant le recyclage est décrit à la Figure 3. Pour cette réalisation, des vannes d'injection Rheodyne® sont utilisées. Le dispositif selon la présente invention est utilisé dans le cadre de la détection de toxines reposant sur l'utilisation d'une biopuce à anticorps couplée à un système de lecture optique, permettant de faire de la résonance plasmonique de surface. Ce sont des nanoparticules d'or qui sont recyclées dans cet exemple. Ces nanoparticules permettent d'amplifier le signal dans le cas d'un échantillon dans lequel la concentration en analyte est trop faible. Le biocapteur utilisé est constitué d'un prisme sur lequel est déposée une couche d'or de 50 nm d'épaisseur. La couche d'or est fonctionnalisée grâce 38 au greffage d'anticorps anti-toxine d'intérêt par l'intermédiaire d'un film de polypyrrole. Afin de s'assurer de la fiabilité de cette technique de détection de la toxine, des zones de « contrôles négatifs » sont réalisées sur la surface du capteur. Ces zones sont constituées d'espèces ne présentant pas d'affinité spécifique pour la toxine à détecter. D'un point de vue pratique, l'appareil utilisé est tel que représenté à la Figure 4. Une diode électroluminescente (LED) (19) illumine par-dessous le prisme en verre doré qui constitue le support (20) de la zone active. Cette illumination est réalisée sous un angle fixe pour lequel se produit la résonance de plasmons de surface (SPR). Le rayon réfléchi est alors capté par une caméra CCD (pour l'anglais « Charge Coupled Device ») (21) elle-même reliée à un ordinateur. L'acquisition de la réflectivité en temps réel est réalisée grâce à un logiciel commercialisé par la société Genoptics®, Genovision. L'ensemble de la fluidique est constitué de tubes en PEEK de diamètre intérieur 0,8 mm. Le milieu expérimental utilisé est un tampon phosphaté salin. Sur la Figure 4, les termes « Entrée » et « Sortie » matérialisent le sens d'écoulement du milieu expérimental et le sens d'injection des échantillons contenant éventuellement la toxine. La référence (1) correspond à la chambre dont la base est constituée par tout ou partie de la surface du surface du support présentant des zones actives et des zones de « contrôles négatifs ». 39 A angle d'incidence et longueur d'onde fixes, les interactions biologiques à l'interface milieu expérimental/métal sont détectées en étudiant la variation de l'intensité du faisceau réfléchi. Plus particulièrement, l'adsorption de molécules cibles à la surface du biocapteur entraîne une variation locale de réflectivité. Cet ensemble est placé dans une chambre noire régulée à 25°C. III.2. Méthode. L'échantillon contenant une toxine donnée est d'abord injecté sous flux constant sur le biocapteur. Dans des conditions de débit et de concentrations adéquates, l'interaction spécifique anticorps antitoxine/toxine entraîne l'accrochage spécifique de la toxine sur les plots d'anticorps correspondant présents sur le biocapteur. Puis le signal de réflectivité est amplifié une première fois grâce à l'injection d'anticorps antitoxine fonctionnalisés avec de la biotine (augmentation fictive de la masse de l'analyte). Enfin, la dernière étape d'amplification est réalisée grâce à l'accrochage de nanoparticules d'or fonctionnalisées par de la streptavidine (Figure 5). Dans le cadre du procédé selon l'invention, ce sont les nanoparticules d'or qui sont recyclées dans le cas de la détection de toxine présentée ci-après. Ces nanoparticules d'or constituent, selon les définitions de la présente invention, un réactif secondaire lié indirectement à l'analyte et directement détectable. 40 Pour ce faire, après avoir rempli le circuit fermé d'un échantillon de nanoparticules d'or, un flux constant est maintenu dans le réservoir à nanoparticules d'or ainsi formé. Le biocapteur est maintenu sous flux permanent de tampon expérimental égal à 50 pL/min. L'expérience se déroule sur le même biocapteur, en deux temps : d'abord l'analyse d'un échantillon blanc, c'est-à-dire ne contenant pas la toxine cible, puis l'analyse d'un échantillon contenant une faible quantité de toxines cibles. Pour chaque échantillon analysé, le protocole est identique. Après avoir injecté l'échantillon via la 1ere vanne d'injection, un nouvel échantillon contenant des anticorps anti-toxine cible biotinylés est injecté via cette même vanne d'injection. Enfin, la 2nde vanne d'injection est actionnée manuellement permettant ainsi aux nanoparticules d'or d'être présentes dans le circuit zone active. III.3. Résultats. Les résultats de ces deux analyses sont présentés Figure 6. Le graphique supérieur (Figure 6A) montre la cinétique de réflectivité au fur et à mesure des injections successives. Le niveau de réflectivité postérieur à l'injection de nanoparticules d'or est similaire au niveau de réflectivité initiale et diffère peu d'une espèce à l'autre. Aucune adsorption de toxine n'est détectée. 41 Le graphique de la Figure 6B montre l'évolution temporelle de la réflectivité correspondant à l'analyse de l'échantillon contenant la toxine à détecter. Après l'interaction entre la zone active et les nanoparticules d'or et le retour en tampon expérimental, un changement de réflectivité est observé uniquement sur la zone sensible à la toxine. La variation de réflectivité observée est donc bien spécifique à la présence de toxine dans l'échantillon analysé. Ainsi, les nanoparticules d'or ayant circulé une première fois sur la zone active, ont pu être réutilisées avec succès pour détecter la présence de toxine dans le second échantillon analysé.15 42 RÉFÉRENCES [1] Livache T, Maillart E, Lassalle N, et al. "Polypyrrole based DNA hybridation assays : study of lebel free detection processes versus fluorescence on microchips". Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003 ; 32(4-5): 687-696. [2] Delehanty JB, Ligler FS. "A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria." Anal Chem. 2002 ; 74(21): 5681-7. [3] Brevet US 6,605,265 au nom de Atochem publié le 12 août 2003. [4] Demande internationale WO 98/49187 au nom de Chiron Corporation publiée le 5 novembre 1998. [5] Demande internationale WO 02/051856 au nom du CEA publiée le 4 juillet 2002. [6] Demande internationale WO 00/36145 au nom du CEA publiée le 22 juin 2000. [7] Tabeling P. "Introduction to Microfluidics" Oxford University Press. 2006. REVENDICATIONS1) Procédé pour détecter et éventuellement quantifier un analyte éventuellement présent dans un liquide d'intérêt, comprenant les étapes suivantes : i) mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; ii) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un réactif secondaire, détectable directement ou indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; iii) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active ; caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre une étape consistant à recycler ladite solution afin de la remettre en contact avec la surface au moins une fois. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; b) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un réactif secondaire, détectable directement ou indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; 44 c) recycler ladite solution de façon à répéter au moins une fois une étape (b) et éventuellement l'étape (c) ; d) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active. 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a1) mettre en contact un ter liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; b1) mettre en contact ladite surface avec au moins un réactif secondaire, détectable directement ou indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; c1) recycler ledit réactif secondaire ne s'étant pas immobilisé sur ladite zone active par liaison directe ou indirecte avec l'analyte ; d1) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active ; a2) mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec ladite surface ; b2) mettre en contact ladite surface avec au moins le réactif secondaire recyclé lors de ladite étape (c1) d2) détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur ladite zone active. 45 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a1') mettre en contact un ter liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit analyte est immobilisée ; b1') mettre en contact ladite surface avec au moins un réactif secondaire, détectable directement ou 10 indirectement, capable de se lier, directement ou indirectement, à l'analyte ; c1') recycler ledit réactif secondaire ne s'étant pas immobilisé sur la zone active par liaison directe ou indirecte avec l'analyte ; d1') détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire immobilisé sur la zone active ; a2') mettre en contact ledit liquide d'intérêt avec ladite surface ; b2') mettre en contact ladite surface avec au moins le réactif secondaire recyclé lors de ladite étape (c1') ; c2') recycler ledit réactif secondaire ne s'étant pas immobilisé sur la zone active par liaison 25 directe ou indirecte avec l'analyte de façon à répéter au moins une fois une étape (b2') et éventuellement l'étape (c2') ; d2') détecter et éventuellement quantifier, directement ou indirectement, ledit réactif secondaire 30 immobilisé sur la zone active. 15 20 46 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le liquide d'intérêt est choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un fluide végétal ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique ; un liquide obtenu à partir d'une (ou plusieurs) cellule (s) animale (s) ou végétale (s) ; un liquide obtenu à partir d'un tissu animal ou végétal ; un prélèvement dans une matrice alimentaire ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; de l'eau de ville, de rivière, de mer, de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ou gazeux ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit analyte à détecter et éventuellement à quantifier est choisi dans le groupe constitué par une molécule d'intérêt biologique ; une molécule d'intérêt pharmacologique ; une toxine ; un glucide ; un peptide ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur nucléaire ou membranaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur nucléaire ou membranaire ; une hormone ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps ; une molécule nucléotidique ; une cellule eucaryote ; une cellule procaryote.30 47 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite sonde est choisie dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps ; une molécule nucléotidique ; un acide nucléique peptidique et un aptamère. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la détection directe ou indirecte et l'éventuelle quantification du réactif secondaire mettent en oeuvre des techniques sans marqueur telles que les techniques utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR pour « Surface Plasmon Resonance ») ou les balances à quartz. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la détection directe ou indirecte et l'éventuelle quantification du réactif secondaire mettent en oeuvre un marqueur, notamment choisi dans le groupe constitué par une particule colorée, un fluorophore ou marqueur fluorescent, un marqueur phosphorescent, un marqueur chimioluminescent, une molécule chimique, une molécule active électrochimiquement, une molécule active biologiquement capable de produire un signal détectable 48 lorsqu'incubée avec l'enzyme ou le substrat chromogène adéquat(e) et un marqueur radioactif. 10) Dispositif susceptible d'être mis en oeuvre dans le cadre d'un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes comprenant : une chambre (1) comprenant un support solide dont la surface comprend au moins une zone active susceptible d'être fonctionnalisée par au moins une sonde capable de lier un analyte ; un ter système fluidique adapté pour faire circuler un liquide d'intérêt susceptible de contenir ledit analyte sur ladite surface ; - un 2nd système fluidique adapté pour faire circuler une solution comprenant au moins un réactif secondaire au moins deux fois sur ladite surface. 11) Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit 2nd système fluidique est adapté pour faire circuler au moins une solution comprenant au moins un réactif secondaire au moins deux fois dans le même sens sur ladite surface. 12) Dispositif selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que ledit 2nd système fluidique comprend au moins un réservoir (7) contenant une solution comprenant au moins un réactif secondaire. 13) Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit 2nd système fluidique est adapté pour faire circuler au moins une solution 49 comprenant au moins un réactif secondaire au moins une fois dans un sens et au moins une autre fois en sens inverse sur ladite surface. 14) Dispositif selon la revendication 10 ou 13, caractérisé en ce que ledit 2nd système fluidique comprend un (ou plusieurs) réservoir(s) (7 ou 7a) amont contenant la (ou les) solution(s) comprenant au moins un réactif secondaire, et éventuellement un (ou plusieurs) réservoir(s) (7b) disposé(s) en aval contenant ou susceptible(s) de contenir la (ou les) solution(s) comprenant au moins un réactif secondaire.