Brevet FR2949042A1 — publié le 20110218

Domaine technique de l'invention L'invention concerne un procédé de traitement d'un tissu de type cartilagineux, notamment en vue d'une greffe. Etat de la technique L'expression � tissu de type cartilagineux� désigne ici, comme dans la suite du texte, tout ou une partie d'un cartilage hyalin articulaire tel qu'il se trouve à la surface des articulations mobiles de type synoviale, d'un cartilage hyalin non-articulaire tels qu'une cloison nasale, des cartilages thyroïde ou cricoïde, des anneaux des grosses bronches et de la trachée, l'extrémité des côtes ou des côtes flottantes, d'un fibrocartilage tel que des disques intervertébraux, la symphyse pubienne, des ménisques, des sites d'insertions des ligaments, des tendons ou des capsules articulaires, d'un cartilage élastique tel que le cartilage de l'oreille externe, des trompes d'Eustache ou de l'épiglotte ou d'un cartilage aryténoïde du larynx ou tout autre tissu issu d'un quelconque cartilage. Les tissus de type cartilagineux est un tissu formé par des cellules, appelés � chondrocytes � o u � fibrochondrocyte �, de forme arrondie et par une matrice extracellulaire constituée de protéoglycannes et de différents collagènes. La structure tridimensionnelle est organisée et complexe. La reconstruction de novo est très longue voire non spontanée. Les lésions du cartilage entraînent des pathologies extrêmement courantes qui guérissent mal d'elles-mêmes car le cartilage ne possède qu'un très faible pouvoir de régénération. De plus, les traitements chirurgicaux donnent des résultats peu satisfaisants. Les tissus opérés retrouvent des propriétés biomécaniques inférieures à leurs propriétés normales et les taux de guérison sont variables. Les fibrocartilages sont tout aussi difficiles à traiter. Les pathologies méniscales, par exemple, se traitent aujourd'hui soit par suture, soit par ablation partielle ou totale. Les suivis cliniques ont montré qu'à terme les méniscectomies menaient à l'arthrose. 1 Les récents progrès de la chirurgie et des biotechnologies ouvrent des perspectives considérables dans le domaine de la réparation et des greffes de tissus cartilagineux. Il est aujourd'hui envisageable de développer un support de greffe de type cartilagineux au moyen de l'ingénierie tissulaire. Pour implanter un tel support, il est impératif de conserver la structure collagénique intacte dans toute sa complexité qui revêt un caractère de la plus haute importance dans la biologie et biomécanique du tissu et qui est le support essentiel de la reconstruction cellulaire cartilagineuse. Il est impératif de plus d'éliminer tout risque de transmission infectieuse. Il s'agit donc d'utiliser des transplants dont les pathogènes potentiels auront été éliminés ou inactivés préalablement à tout usage clinique. L'expression � pathogènes� désigne ici comme dans la suite du texte, tout agent infectieux ou étranger indésirable (c'est-à-dire les microorganismes, virus, bactéries, champignons, mycoplasmes, agents transmissibles non conventionnels, tels que les prions, etc.) et en particulier les contaminants qui empêchent l'utilisation d'un tissu comme greffon. L'élimination des pathogènes et des contaminants doit être réalisée dans l'ensemble du tissu de type cartilagineux jusque dans les zones les plus internes. Habituellement, l'élimination des pathogènes est réalisée grâce à des solutions désinfectantes. Par � solution désinfectante et/ou viroinactivante�, on entend une solution qui est capable d'éliminer, de détruire ou d'inactiver les pathogènes potentiellement présents dans un échantillon biologique. Cependant, ces solutions sont peu performantes dans le cas des tissus cartilagineux. En effet, ces solutions ne pénètrent que difficilement à l'intérieur des tissus cartilagineux et ne permettent pas d'éliminer une contamination interne. Pour faciliter la pénétration des solutions désinfectantes à l'intérieur du tissu de type cartilagineux, des techniques utilisant la centrifugation, la sonication ou l'utilisation d'une pression ont été développées. Toutefois, ces techniques sont relativement lourdes à mettre en oeuvre et demandent un matériel imposant et coûteux. Objet de l'invention L'invention vise à fournir un procédé de traitement d'un tissu de type cartilagineux ne présentant pas les inconvénients des procédés précédemment évoqués. L'invention vise en particulier à fournir un tissu de type cartilagineux prêt à être transplanté sans pathogène, ni contaminant et qui soit compatible avec les contraintes d'une utilisation clinique. L'invention vise particulièrement à proposer un procédé de traitement d'un tissu de type cartilagineux permettant la conservation dans sa complexité de la structure collagénique du tissu et des propriétés compatibles avec une utilisation clinique. L'invention vise particulièrement à proposer un substitut cartilagineux et notamment un substitut méniscal, qui soit propre à être utilisé tel quel en greffe ou être le support d'ingénierie cellulaire et tissulaire. L'invention vise particulièrement à proposer un tissu traité propre à accueillir des cellules ou toutes molécules biologiquement actives à toutes fins de reconstruction ou de régénération tissulaire. L'invention vise également un procédé de traitement d'un tissu de type cartilagineux facile à mettre en oeuvre et relativement rapide qui permet de stocker le tissu de type cartilagineux traité à température ambiante. Pour ce faire, l'invention concerne un procédé de traitement d'un tissu de type cartilagineux, notamment en vue d'une greffe comprenant : - au moins une étape de lavage, - au moins une étape de désinfection, - au moins une étape de rinçage. Selon l'invention, le procédé comprend une étape d'extraction des glycosaminoglycannes préalable à l'étape de désinfection. En effet, les inventeurs ont constaté que, de manière surprenante, une extraction des glycosaminoglycannes (GAG) était suffisante pour � perméabiliser � le tissu de type cartilagineux et ainsi permettre une bonne pénétration des solutions de traitement. Les GAG du fait du nombre élevé de leurs charges négatives fixent de nombreux cations attirant par conséquent une grande quantité d'eau Cette présence d'eau retenue dans la structure du tissu par les GAG empêche les solvants et autres produits de traitement de pénétrer et de circuler dans les tissus. En extrayant les GAG, l'eau n'est plus retenue et les solutions de traitement peuvent pénétrer à l'intérieur des tissus. Le procédé selon l'invention est très simple à mettre en oeuvre et facilement automatisable. Avantageusement et selon l'invention, qu'au moins une étape d'extraction des glycosaminoglycannes est réalisée par un bain dans une solution d'extraction. Contrairement aux procédés de l'état de l'art chimiquement agressifs ou faisant intervenir des technologies lourdes à mettre en oeuvre, une simple incubation dans une solution d'extraction adaptée suffit à perméabiliser le tissu de type cartilagineux et à permettre la désinfection de la totalité de ce tissu. Avantageusement et selon l'invention, la solution d'extraction est choisie dans le groupe comprenant de la soude, du chlorure de guanidine, du chlorure de calcium, de l'acétate de sodium, du chlorure de cétylpryridinium ou des solutions enzymatiques de type chondroïtinase, d'héparinase, de hyaluronidase, de trypsine, de pronase, de papaïne, ou de pepsine tout autre produit permettant l'extraction des GAG ou tout mélange de ces produits. De préférence, avantageusement et selon l'invention, la solution d'extraction est de la soude. Avantageusement et selon l'invention, la solution d'extraction est de la soude 30 0,05M à 3M. De préférence, avantageusement et selon l'invention, la solution d'extraction est de la soude 1M. Avantageusement et selon l'invention, le bain dans la solution d'extraction dure de 15 minutes à 48 heures. De préférence, avantageusement et selon l'invention, le bain dans la solution d'extraction dure environ 2 heures. L'étape d'extraction des GAG est relativement courte ce qui rend le procédé selon l'invention particulièrement rapide. De préférence, avantageusement et selon l'invention, l'étape d'extraction est un bain dans une solution de soude 1M pendant 2h. Egalement, avantageusement et selon l'invention, au moins étape de lavage est réalisée par un bain du tissu de type cartilagineux dans une solution choisie dans le groupe comprenant de l'eau pure, une solution salée hypertonique, une solution salée isotonique, une solution salée hypotonique, de l'éthanol, du PBS, de l'HBSS, des détergents, du sodium dodécyl sulfate, du triton X, du limonène, du tributylphosphate, du chloroforme, du dichlorométhane, de l'éther ou un mélange de ces produits. De préférence, avantageusement et selon l'invention, qu'une étape de lavage est réalisée par un bain dans de l'eau suivie par une étape de lavage réalisée par un ou plusieurs bains dans de l'éthanol. Egalement, avantageusement et selon l'invention, au moins une étape de désinfection est réalisée par un bain du tissu de type cartilagineux dans une solution désinfectante et/ou viroinactivante choisie dans le groupe comprenant une solution antibactérienne, une solution antivirale, un alcool, des antibiotiques, une solution antifongique, de la soude, de l'hypochlorite de sodium, du chlore, du CIO2, de l'urée ou du peroxyde d'hydrogène. De préférence, avantageusement et selon l'invention, la solution désinfectante et/ou viroinactivante est du peroxyde d'hydrogène. De préférence, avantageusement et selon l'invention, la solution désinfectante et/ou viroinactivante est du peroxyde d'hydrogène à 5% à 30%. Avantageusement, le procédé selon l'invention est suivi d'une étape de lyophilisation. La lyophilisation permet notamment la conservation à température ambiante des tissus traités. Avantageusement, le procédé selon l'invention est suivi d'une étape de conditionnement dans un emballage hermétique. Le tissu une fois traité selon l'invention peut alors être conditionné en emballage hermétique. Ce conditionnement permet de conserver la qualité du tissu acquise lors du procédé. Avantageusement, le procédé selon l'invention est suivi d'une étape de stérilisation par irradiation gamma. Elle permet une élimination des microorganismes. L'élimination de l'eau par lyophilisation selon l'invention permet lors de l'irradiation de limiter la formation de radicaux libres s'avérant toxiques. Elle permet également une conservation prolongée du tissu de plusieurs mois à plusieurs années. L'invention concerne également un tissu de type cartilagineux traité selon le procédé. Le tissu ainsi traité pourra être greffé sans risque de contamination Description détaillée d'une forme de réalisation de l'invention D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante qui se réfère aux figures annexées représentant des modes de réalisation préférentiels de l'invention, donnés uniquement à titre d'exemples non limitatifs, et dans lesquelles : - la figure 1 est le schéma du procédé selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, - la figure 2 représente un test de pénétration de colorant en fonction du temps du bain d'extraction, - la figure 3 est une photo du tissu sur une échelle graduée après avoir subi différentes étapes du procédé selon l'invention. Prélèvement du tissu de type cartilagineux Le tissu de type cartilagineux à traiter selon l'invention est prélevé sur un humain ou non humain selon une technique connue. Selon le mode de réalisation donné à titre d'exemple, le tissu de type cartilagineux provient d'un ménisque. Les différentes expériences citées à titre d'exemple ont été menées sur des ménisques d'humains ou de moutons. Ces ménisques ont été traités dans leur intégralité ou seulement en partie. Les tissus prélevés peuvent soit être traités directement soit congelés dans l'attente du traitement. Lavage Dans un premier temps, le tissu de type cartilagineux prélevé est lavé. Ce lavage a pour but d'éliminer certains éléments tels que le sang ou d'autres liquides, par exemple du liquide synovial dans le cas d'un ménisque. Pour ce faire le tissu est placé dans un ou plusieurs bains contenant une solution de lavage. La solution de lavage est choisie dans le groupe comprenant de l'eau pure, d'une solution salée (hypertonique, isotonique ou hypotonique), d'éthanol, du PBS, de l'HBSS, des détergents, du sodium dodécyl sulfate, du triton X, du limonène, du tributylphosphate, du chloroforme, du dichlorométhane, de l'éther ou un mélange de ces produits. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, l'étape de lavage comprend un premier bain de 10min à 48h dans de l'eau pure, stérile qui en plus d'éliminer certains contaminants crée un choc hypo-osmotique entrainant l'éclatement des cellules. Ce premier bain est suivi d'un ou plusieurs bains dans de l'éthanol à 70% à 100% pendant 15min à plusieurs jours. L'éthanol outre son rôle de lavage permet une désinfection partielle. De plus, il crée un choc hyper-osmotique important qui entraîne l'eau hors du tissu. Enfin, l'éthanol présente l'avantage d'être un dégraissant.30 Extraction des GAG Une fois le tissu de type cartilagineux lavé, on extrait les glycosaminoglycannes (GAG). L'étape d'extraction des GAG est réalisée par un bain du tissu de type cartilagineux dans une solution d'extraction. La solution d'extraction est choisie dans le groupe comprenant de la soude, du chlorure de guanidine, du chlorure de calcium, de l'acétate de sodium, du chlorure de cétylpryridinium ou des solutions enzymatiques de type chondroïtinase, d'héparinase, de hyaluronidase, de trypsine, de pronase, de papaïne, ou de pepsine ou tout autre produit permettant l'extraction des GAG ou un mélange de ces produits. De préférence, la solution est de la soude de 0,05M à 3M. La durée du bain varie de 15min à 48h en fonction de la molarité de la solution d'extraction, en l'occurrence de la soude. Le compromis molarité/durée du bain est particulièrement important car un bain prolongé dans une solution à molarité élevé entraine une altération de la matrice extracellulaire. Sur la figure 2, est représenté un test de pénétration de colorant. Des ménisques lavés et ayant subi une extraction des GAG à la soude ont 20 été trempés dans une solution colorante de bleu de méthylène. Sur la figure 2, on constate que la pénétration de colorant est déjà très bonne après un bain d'une heure dans de la soude 1M signe que le tissu a bien été rendu perméable grâce à l'extraction des GAG. Le tissu ainsi traité permettra une bonne pénétration de solution désinfectante et/ou viroinactivante. 25 Par contre, un bain d'une durée trop importante altère la matrice extracellulaire. On observe en effet sur la figure 2 qu'après 24h dans de la soude 1M les ménisques sont déstructurés. Pour un ménisque, on privilégiera donc une extraction dans de la soude 1M pendant 1h. 30 Suite à l'étape d'extraction des GAG, on rince le tissu de type cartilagineux. 8 Si l'étape d'extraction a été réalisée avec de la soude, on utilise un à plusieurs bains pendant 30 min à plusieurs heures dans un tampon afin de neutraliser la soude, par exemple du tampon phosphate pH 7,4. Désinfection Afin de s'assurer d'avoir un greffon exempt de pathogènes, on recommande lors du traitement d'un tissu de procéder à deux étapes de désinfection faisant intervenir chacune des solutions désinfectantes différentes, ce qui permet une cumulation des facteurs logarithmiques de réduction virale Si l'on utilise une solution d'extraction qui est par ailleurs une solution désinfectante et/ou viroinactivante, une première étape de désinfection est alors réalisée pendant l'étape d'extraction des GAG. Quant à l'autre étape de désinfection, elle consiste en un bain dans une solution désinfectante et/ou viroinactivante choisie dans le groupe comprenant une solution antibactérienne, une solution antivirale, un alcool, des antibiotiques, une solution antifongique, de la soude, de l'hypochlorite de sodium, du chlore, du CIO2, de l'urée ou du peroxyde d'hydrogène. De préférence, l'étape de désinfection consiste en un ou plusieurs bains de peroxyde d'hydrogène de 5% à 30% pendant 30 min à 8 heures. Rinçage Le tissu ainsi traité est alors rincé afin d'éliminer toute trace du traitement et notamment de solution désinfectante et/ou viroinactivante. De préférence, il est d'abord placé dans un ou plusieurs bains de tampon, par 25 exemple un bain dans du tampon soude à pH 8,5 pendant 15min à plusieurs heures. Ceci afin de rincer la solution désinfectante et/ou viroinactivante et de neutraliser l'acide dans le cas d'une utilisation de peroxyde d'hydrogène. Enfin, le tissu est rincé dans une solution salée isotonique telle que le PBS, 30 HBSS ou sérum physiologique ou un tampon salé pendant 30 min à plusieurs heures.20 Afin de déterminer l'évolution du taux de GAG extraits au cours du procédé selon l'invention, la concentration des GAG accumulés dans les différents bains a été dosée après chaque étape par un dosage colorimétrique au bleu diméthylméthylène (DMMB) comme décrit précédemment par Farndale et al.. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant. Concentrations GAG calculées en pg/ml Eau pure contrôle 0,0 Eau pure après bain 0,0 Soude 1 M contrôle 0,0 Soude 1 M après bain 10,5 Tp Phosphate contrôle 0,0 Tp Phosphate après bain 17,7 soude pH 8,5 contrôle 0,0 soude pH 8,5 après bain 2,3 PBS contrôle 0,0 PBS après 1 er bain 3,2 PBS après 2ème bain 9,1 Témoin PBS contrôle 0,0 Témoin PBS après bain 2,4 Éthanol Peroxyde d'hydrogène interférence avec le dosage On constate que les GAG ont bien été extraits aux étapes attendues en 10 particulier suite à l'étape d'extraction. De même afin d'évaluer la dégradation de la matrice extracellulaire au cours du procédé selon l'invention, la concentration en hydroxyproline a été dosée. Le ménisque est constitué à 22% de collagène en poids humide. Le collagène est donc un élément primordial de la matrice extracellulaire. L'hydroxyproline représentant un pourcentage sensiblement constant des acides aminés totaux du collagène, un dosage d'hydroxyproline et une extrapolation permette de quantifier le collagène et par voie de conséquence d'évaluer la dégradation de la matrice extracellulaire. Ce dosage s'est fait selon une technique connue dite à la chloramine T. Ce dosage n'a pas permis de mettre en évidence une lyse du collagène ce qui laisse supposer que la dégradation du collagène est faible lors du procédé selon l'invention. Ces résultats sont confirmés par la calorimétrie différentielle. La stabilité thermique des collagènes peut être déterminée par calorimétrie différentielle. Cette technique permet de suivre le changement d'état tridimensionnel des collagènes lorsqu'ils sont soumis à une dénaturation thermique, c'est-à-dire la transition de la forme stable organisée en triple hélice à la forme entropique de pelote statistique. Ce changement se traduit par un pic de dénaturation et une absorption de chaleur. L'échantillon et la référence sont placés dans deux fours différents mais dans la même enceinte calorifique. La variation de température entre les deux fours se fait simultanément par la même quantité de calories. La température est maintenue toujours égale dans les deux fours, et varie de manière linéaire. Les différences des énergies absorbées ou dégagées par l'échantillon et la référence sont mesurées. Lorsqu'une transition se passe, selon qu'elle soit endothermique ou exothermique, l'échantillon va absorber ou dégager de l'énergie. Un générateur de puissance fournit plus ou moins d'énergie par rapport à la référence. C'est cette variation d'énergie qui est enregistrée en fonction du temps ou de la température. Le pic maximum d'un ménisque traité selon l'invention est à 64,3°C alors que le pic témoin est à 67,0°C ce qui montre une altération minime de la matrice extracellulaire. La qualité de la désinfection a quant à elle était évaluée par un marquage des acides nucléiques au Hoescht. Contrairement au contrôle non traité, aucun acide nucléique n'apparaît sur le tissu traité selon l'invention. Le procédé selon l'invention permet donc d'obtenir un greffon exempt de pathogènes et possédant une structure de matrice extracellulaire conservée. Lyophilisation Le tissu une fois traité selon l'invention peut alors être lyophilisé. De préférence, la lyophilisation dure 27h c'est à dire moins longtemps que pour les autres procédés de lyophilisation de ménisque connus. Le tissu peut alors être stocké à température ambiante. Conditionnement en emballage hermétique Le tissu une fois traité selon l'invention peut alors être conditionné en emballage hermétique. Ce conditionnement permet de conserver la qualité du tissu acquise lors du procédé. Stérilisation par irradiation gamma Le tissu une fois traité et lyophilisé selon l'invention peut alors stérilisé par irradiation gamma. Réhydratation Après une réhydratation de moins de 23 heures dans une solution saline isotonique telle que du PBS, un tampon salé, du HBSS ou du sérum physiologique, on constate que le tissu traité selon l'invention conserve sa structure collagénique et ses mensurations, comme cela est représenté sur la figure 3. De plus, après réhydratation, le tissu de type cartilagineux conserve une texture similaire.30 Le tissu traité et réhydraté peut alors servir de support en bioingénierie ou servir de greffon. L'invention a été décrite ci-dessus en référence à une forme de réalisation donnée à titre de pur exemple. Il va de soi qu'elle n'est pas limitée à cette forme de réalisation mais qu'elle s'étend à toutes les formes de réalisations couvertes par les revendications ci-annexées. REVENDICATIONS1/ Procédé de traitement d'un tissu de type cartilagineux, notamment en vue d'une greffe comprenant : au moins une étape de lavage, au moins une étape de désinfection, au moins une étape de rinçage, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction des glycosaminoglycannes préalable à l'étape de désinfection. 2/ Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'au moins une étape d'extraction des glycosaminoglycannes est réalisée par un bain dans une solution d'extraction. 3/ Procédé selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que la solution d'extraction est choisie dans le groupe comprenant de la soude, du chlorure de guanidine, du chlorure de calcium, de l'acétate de sodium, du chlorure de cétylpryridinium ou des solutions enzymatiques de type chondroïtinase, d'héparinase, de hyaluronidase, de trypsine, de pronase, de papaïne, ou de pepsine tout autre produit permettant l'extraction des GAG ou tout mélange de ces produits. 4/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 3 caractérisé en ce que la solution d'extraction est de la soude. 5/ Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la solution d'extraction est de la soude 0,05M à 3M. 6/ Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce que la solution d'extraction est de la soude 1M. 7/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 6 caractérisé en ce que le bain dans la solution d'extraction dure de 15 minutes à 48 heures. 8/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 7 caractérisé en ce que le bain dans la solution d'extraction dure environ 2 heures. 9/ Procédé selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce que l'étape d'extraction est un bain dans une solution de soude 1M pendant 2h.10/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'au moins une étape de lavage est réalisée par un bain du tissu de type cartilagineux dans une solution choisie dans le groupe comprenant de l'eau pure, une solution salée hypertonique, une solution salée isotonique, une solution salée hypotonique, de l'éthanol, du PBS, de l'HBSS, des détergents, du sodium dodécyl sulfate, du triton X, du limonène, du tributylphosphate, du chloroforme, du dichlorométhane, de l'éther ou un mélange de ces produits. 11/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'une étape de lavage est réalisée par un bain dans de l'eau suivie par une étape de lavage réalisée par un ou plusieurs bain(s) dans de l'éthanol. 12/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'au moins une étape de désinfection est réalisée par un bain du tissu de type cartilagineux dans une solution désinfectante et/ou viroinactivante choisie dans le groupe comprenant une solution antibactérienne, une solution antivirale, un alcool, des antibiotiques, un solution antifongique, de la soude, de l'hypochlorite de sodium, du chlore, du CIO2, de l'urée ou du peroxyde d'hydrogène. 13/ Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que la solution désinfectante et/ou viroinactivante est du peroxyde d'hydrogène. 14/ Procédé selon l'une des revendications 13 caractérisé en ce que la solution désinfectante et/ou viroinactivante est du peroxyde d'hydrogène de 5% à 30%. 15/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'il est suivi d'une étape de lyophilisation. 16/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce qu'il est suivi d'une étape de conditionnement dans un emballage hermétique. 17/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce qu'il est suivi d'une étape de stérilisation par irradiation gamma. 18/ Tissu de type cartilagineux traité selon l'une des revendications 1 à 17.30