Brevet FR2952276A1 — publié le 20110513

Induction de l'apomixie chez les plantes cultivées à reproduction sexuée et utilisation pour la production de plantes totalement ou partiellement apomictiques. L'invention a pour objet des moyens pour réguler le développement reproducteur chez les plantes cultivées. Plus particulièrement, l'invention a pour objet le développement de plantes se reproduisant totalement ou partiellement par apomixie gamétophytique, c'est-à-dire de manière asexuée par l'intermédiaire de graines. L'apomixie gamétophytique est une forme de reproduction asexuée par graine. Elle existe chez de nombreuses angiospermes, et près de 400 espèces apomictiques ont été recensées. On ne trouve cependant pas de plantes apomictiques chez les principales céréales cultivées (maïs, blé, ou riz), mais uniquement chez des plantes sauvages, quelque espèces fourragères cultivées, et certaines espèces fruitières. L'apomixie est un mécanisme contrôlé génétiquement. Les plantes apomictiques développent les gamètes femelles sans méiose préalable. Les gamètes ainsi formés contiennent un génome identique à celui des tissus somatiques dont ils sont dérivés. Le développement de l'embryon à partir de ces gamètes se fait sans fécondation par un gamète mâle, c'est à dire par parthénogenèse. Le génome de l'embryon ainsi formé est donc strictement identique à celui de sa plante mère, sans contribution paternelle. L'apomixie est donc un mode de clonage par graine qui assure la perpétuation à l'identique des génotypes au travers des générations. L'utilisation de l'apomixie de manière contrôlée chez les espèces cultivées offre de nombreuses applications potentielles. Ces applications concernent la propagation de génotypes instables, le contrôle des contaminations polliniques, les méthodes d'amélioration des plantes, et les méthodes de production commerciale de graines. Aucune des ces applications n'est envisageable chez les principales espèces cultivées telles le blé, maïs, riz, et autres sur la base des technologies actuelles. On ne connaît en effet pas de formes apomictiques chez ces différentes espèces, et on ne connaît aucun système génétique qui permette d'induire de l'apomixie chez des plantes sexuées. De nombreux laboratoires se sont attachés, au cours des années passées, à développer des plantes apomictiques, soit en tentant de transférer les déterminants de l'apomixie depuis des plantes sauvages vers des plantes cultivées, soit en induisant par mutagenèse des phénotypes apomictiques chez des plantes sexuées. Aucune de ces deux approches n'a produit de génotype apomictique chez une espèce où ce mode de reproduction n'existait pas antérieurement. Des résultatsrécents, publiés récemment dans la revue Nature (Ravi, M., Marimuthu, M.P., and Siddiqi, I. (2008). Gamete formation without meiosis in Arabidopsis. Nature 451: 1121- 1124.), montrent chez Arabidopsis que l'inactivation d'un gène impliqué dans la méiose, appelé DYAD, dont la fonction est de réguler la cohésion des chromatides durant la méiose, permet de produire environ 0,1% de gamètes qui échappent à la méiose (Ravi et al., Nature 2008 -451 :1121-1124). Le reste des gamètes, et donc 99,9% des descendances, sont stériles. Il est même probable que la fréquence de gamètes non-méiotiques ne soit pas significativement différente chez ces plantes mutantes de celle chez des plantes sexuées, et que ces gamètes n'apparaissent en fait à l'observation que parce que la mutation tue par ailleurs tous les gamètes normalement issus de sexualité. Un autre travail récent (d'Erfurth, I., Jolivet, S., Froger, N., Catrice, O., Novatchkova, M., and Mercier, R. (2009). Turning meiosis into mitosis. PLoS Biol. 7: e1000124.), beaucoup plus prometteur, montre qu'il est possible, chez Arabidopsis, de changer la division méiotique en division mitotique par l'inactivation simultanée de trois gènes impliqués dans la méiose (osdl/Atspol 1-1/Atrec8). Le triple mutant produit des gamètes diploïdes fonctionnels. Ces gamètes sont cependant fécondés, les descendances ne sont donc pas apomictiques, et on ne sait pas si ce résultat est transposable chez d'autres espèces qu'Arabidopsis. Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont montré qu'il est possible d'induire un phénotype tout ou partiellement apomictique chez le maïs en manipulant l'expression de plusieurs gènes qui sont collectivement impliqués dans la régulation de l'expression des gènes dans les organes reproducteurs femelles (les ovules) de maïs. Les graines produites échappent à la réduction méiotique et sont fertiles. Ces résultats s'appliquent avantageusement aux autres plantes cultivées telles que le riz ou le blé. L'invention vise donc l'utilisation de séquences de nucléotides spécifiques dont la manipulation permet le développement de plantes se reproduisant totalement ou partiellement par apomixie gamétophytique. Elle a également pour but de fournir une méthode de production de plantes apomictiques. Selon encore un autre aspect, l'invention vise à utiliser de manière contrôlée l'apomixie chez des espèces cultivées à reproduction sexuée pour développer de nombreuses applications comme il sera exposé ci-après. L'invention vise ainsi, pour la production de plantes partiellement ou totalement apomictiques, l'utilisation d'un gène codant pour une protéine à motif DNA Méthyl Transférase. Il s'agit plus spécialement d'un gène de la famille des DNA Méthyl Transférases codant pour une protéine de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°5. Selon un mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation du gène DMT 103 de la famille des DNA Méthyl Transférases répondant à la séquence SEQ ID N°2 ou du transcrit d'un tel gène répondant à la séquence SEQ ID N°3, ou de l'ORF de séquence SEQ ID N°4. Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation du gène DMT102 de la 20 famille des ADN Methyl Transférases, répondant à la séquence SEQ ID N°6, ou du transcrit d'un tel gène répondant à la séquence SEQ ID N°7, ou de l'ORF de séquence SEQ ID N°8. Ces gènes sont exprimés de manière spécifique dans les ovules où se déterminent les cellules reproductives. L'inactivation de ces gènes par mutagenèse et donc des transcrits et des protéines chez des plantes sexuées conduit à la formation de gamètes non-réduits et de gamétophytes multiples dans l'ovule, caractéristiques du développement apomictique. 30 L'invention vise également une méthode de production d'une plante apoméiotique, comprenant l'invention aléatoire dans le génome de la plante d'un élément transposable par exemple de type Mutator et l'identification du locus muté. 25 L'utilisation de l'apomixie de manière contrôlée chez les espèces cultivées offre de nombreuses applications potentielles. Elles concernent la propagation de génotypes instables, le contrôle des contaminations polliniques, les méthodes d'amélioration des plantes, et les méthodes de production commerciale de graines. La première application concerne la propagation clonale, par graine, de génotypes génétiquement instables. C'est le cas en particulier de toutes les plantes hybrides; ces plantes hybrides produisent, par brassage génétique au cours de la méiose et de la fécondation des descendances qui sont différentes entre elles, et différentes de leur plante mère. C'est encore le cas des espèces cultivées présentant des niveaux de ploïdie instables en méiose, comme les formes triploïdes. Chez la plupart des espèces cultivées, il est nécessaire, pour maintenir un haut niveau de pureté génétique,de contrôler rigoureusement la pollinisation, pour éviter une contamination par du pollen issu de champs voisins, plus ou moins éloignés, le pollen pouvant se déplacer sur des distances assez variables, fonctions de l'espèce, des conditions climatiques, ou des vecteurs de dissémination comme les insectes. Dans le cas de plantes apomictiques, cependant, le génome issu des gamètes mâles ne participe pas à la génération suivante. L'utilisation de plantes apomictiques permettrait donc de s'affranchir des risques de contamination. L'apomixie constitue donc une méthode totalement unique de contrôle de pureté génétique. C'est aussi potentiellement une méthode efficace pour éviter les flux indésirables de transgènes dans le cas de culture d'organismes génétiquement modifiés. L'apomixie offre aussi de nouvelles perspectives en amélioration des plantes. Elle permettrait en effet d'utiliser comme variété nouvelle tout génotype sélectionné comme intéressant, dès lors qu'il s'agit d'un critère génétiquement déterminé, quelle qu'en soit la structure génétique, puisque celui-ci, dès lors qu'il est apomictique, devient génétiquement stable. On peut donc envisager de développer des variétés directement à partir de formes hybrides, éventuellement interspécifiques, en s'affranchissant des étapes de stabilisation actuellement nécessaires, comme les étapes d'autofécondation successives, ou la production d'haploïdes doublés. Cette méthode permet donc un gain de temps considérable, mais ouvre aussi certainement la porte à l'introduction de matériels génétiques totalement nouveaux dans les programmes de sélection, et en particulier de matériels génétiques qui, chez des plantes sexuées, induisent une forte stérilité. C'est le cas par exemple de la plupart des croisements interspécifiques. Une application très importante concerne la production de graines hybrides. Telle qu'elle se pratique aujourd'hui, celle-ci implique l'hybridation contrôlée à large échelle d'écotypes parentaux génétiquement stables. Il s'agit généralement de lignées homozygotes, obtenues par différentes méthodes (production d'haploïdes doublés, autofécondations...). L'un des deux parents est utilisé comme mâle, l'autre comme femelle. Seules les femelles produisent les graines commerciales. Le rendement des parcelles de production de semences est généralement faible comparativement aux hybrides, pour trois raisons: (1) les lignées mâles sont nécessaires mais utilisent une part importante de l'espace sans produire de graines; (2) les lignées parentales ont généralement un rendement très inférieur aux hybrides du fait de la dépression de consanguinité ; (3) le contrôle des pollinisations implique la castration physique ou génétique des lignées utilisées comme femelle, un processus qui entraîne une perte de rendement importante. Dans le cas de plantes apomictiques, cependant, on pourrait envisager de produire les graines directement à partir d'hybrides, donc avec des rendements très supérieurs, en utilisant 100% de la surface disponible, sans nécessité de contrôler la pollinisation, et sans étape de castration. L'intérêt d'utiliser l'apomixie pour la production de graine est très significatif chez les espèces comme le maïs, ou l'on produit déjà des formes hybrides, pour des raisons de diminution de coûts, mais aussi chez les espèces autogames, comme par exemple le blé ou le riz, où les hybridations contrôlées à large échelle sont difficiles. La production de quelques plantes hybrides apomictiques serait suffisante pour initier la production à large échelle de graines hybrides, génétiquement stables. Les plantes partiellement ou totalement apomictiques d'espèces cultivées telles que le maïs, riz et blé, caractérisées en ce qu'elles comportent dans leur génome, un gène, un transcript ou un ORF de séquences 2, 3 ou 4, ou de séquences 6, 7 ou 8, respectivement, inactivé, entrent également dans le champ de l'invention. Les graines obtenues à partir de plantes hybrides apomictiques telles que définies ci-dessus sont également couvertes par l'invention. Ces plantes et ces graines, dont la protéine à motif DNA Méthyl Transférase est inactivée, produisent des gamètes non réduits et des sacs embryonnaires multiples.30 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent à titre illustratif. Ces exemples font référence aux figures 1 à 6, qui représentent, respectivement, - la figure 1 : les profils comparés d'expression des régulateurs chromatidiens; - la figure 2 : la comparaison de séquences protéiques avec l'alignement des séquences protéiques de DMT 102 et CMT3, et DMT 103 et DRM2; - la figure 3 : le profil d'expression des deux gènes par mRNA in situ ; - la figure 4 : la structure des deux gènes DMT 102 et DMT 103 ; - la figure 5 : les phénotypes des plantes mutantes avec production de sacs embryonnaires multiples ; et - la figure 6 : les phénotypes des plantes mutantes avec production de gamètes non-réduits. DEFINITIONS « Le gamétophyte » est la structure haploïde qui se développe à partir des produits de la méiose, et contient à maturité les gamètes. Il s'agit du sac embryonnaire côté femelle, et du grain de pollen côté mâle. Chez le maïs, l'ovule ne contient qu'un sac embryonnaire. « L'apomixie gamétophytique » se réfère à une forme de reproduction asexuée par graines dans laquelle les gamètes produits dans les gamétophytes femelles n'ont pas subis de réduction méiotique, et présente donc la même ploïdie et la même constitution génétique que la plante mère. L'apomixie gamétophytique implique deux étapes successives : apoméiose et parthénogenèse. « L'apoméiose » correspond aux mécanismes par lesquels les plantes apomictiques échappent à la méiose. La « non-réduction » correspond à la formation de gamète en absence de réduction méiotique. Des gamètes « non-réduits » sont donc des gamètes qui se développent en absence de méiose, ou au travers d'une méiose non réductionnelle. L'apoméiose est donc la forme spécifique de non réduction que l'on observe chez les plants apomictiques. « La displosporie » est une forme spécifique d'apomixie gamétophytique, dans laquelle les gamètes apoméiotiques se développent à partir des mêmes cellules que celles qui participent au développement reproducteur sexué, c'est-à-dire l'archéspore. « L'aposporie » est une forme spécifique d'apomixie gamétophytique, dans laquelle les gamétophytes femelles et les gamètes apoméiotiques se développent à partir des cellules somatiques de l'ovule. Chez les plantes aposporiques, la sexualité et l'apomixie coexiste fonctionnellement, et on retrouve donc typiquement plusieurs sacs embryonnaires dans un même ovule, issus soit de sexualité soit d'aposporie. La « parthénogenèse » correspond au développement des embryons sans fécondation et sans contribution génétique paternelle. EXEMPLE 1 : Identification de régulateur de la structure de la chromatine dérégulée chez les 15 plantes apomictiques L'expérience décrite ci-après porte sur la comparaison du profil d'expression de gènes impliqués dans le déterminisme de la structure de la chromatine entre des plantes sexuées et des plantes apomictiques. Les ARNs d'échantillons correspondant à des ovules de plantes apomictiques et sexuées aux stades de développement suivants ont été isolés ; ovules contenant une cellule mère de la mégaspore, ovules contenant une mégaspore fonctionnelle, et ovules au moment de la fécondation. 25 Les plantes sexuées utilisées sont deux lignées de maïs de référence, B73 et W23. Les plantes apomictiques sont des formes hybrides obtenues par croisement d'une plante apomictique de l'espèce Tripsacum dactyloides, un apparenté sauvage du maïs chez qui on trouve des formes apomictiques, avec un maïs sexué ; ces plantes ont été ensuite rétro- 30 croisées plusieurs fois sur du maïs, en sélectionnant les descendances apomictiques, jusqu'à l'obtention de plantes contenant un génome de maïs diploïde, et un génome de Tripsacum dactyloides haploïde. 20 Ces plantes ont été décrites dans la littérature précédemment, (Grimanelli et al, Genetics, 2003, Nov, 163(3) ; 1521-31) et se reproduisent par apomixie avec très forte pénétrance du caractère, proche de 95%. La taille relativement importante des organes reproducteurs chez le maïs permet une dissection fine des tissus utilisés, en utilisant un stéréomiscroscope. Un échantillon aléatoire des tissus échantillonnés est utilisé après chaque prélèvement pour vérifier les stages de développement. Dans cette expérience, le profil d'expression de 386 gènes de maïs appartenant aux différentes familles de gènes connus pour affecter la structure de la chromatine a été précisé. Ces gènes ont été identifiés en utilisant la base de donnés CHROMDB, qui répertorie l'ensemble de gènes appartenant à ces familles chez les différentes espèces dont le génome est tout ou partiellement séquencé. L'analyse s'est faite en deux étapes, avec tout d'abord la sélection des gènes s'exprimant spécifiquement dans les tissus reproducteurs ; puis, pour ces gènes sélectionnés, l'analyse de leur profil d'expression aux différents stades mentionnés précédemment pour les formes apomictiques et sexuées. Sur 386 gènes analysés, 8 présentent un profil clairement altéré. Ces résultats sont illustrés sur la Figure 1 : Légende :mei : ovule en méiose (sexualité) ou apoméiose (apomixie), gam : ovules en gamétogenèse ; emb : démarrage de l'embryogenèse, correspondant au moment de la fécondation ; soma ; tissus somatiques de la plante. 25 L'altération des profils d'expression peut impliquer l'absence totale d'expression chez une forme de reproduction par rapport à l'autre, c'est le cas par exemple de DMT 102 et CHR 106, dont l'expression est totalement abolie chez les plantes apomictiques. La majorité des exemples, cependant, illustrent des dérégulations plus spécifiques dans le 30 temps. C'est le cas de CHR120, DMT 103, DMT 107 HXA 102, MBD 109 ou SGD 110, dont l'expression n'est abolie qu'à cette étape spécifique du développement. EXEMPLE 2 : Fonction biologique des gènes, identifiée par homologie de séquence20 La recherche d'homologies pour ces différents gènes, et en particulier l'utilisation de BLAST pour les comparer aux bases de données publiques, permet de leur attribuer une fonction biologique. Il apparaît clairement sur la base de ces homologies que l'ensemble des gènes identifiés sont impliqués directement ou indirectement dans les voies de silencing, et en particulier l'établissement ou de la maintenance de la méthylation de l'ADN : CHR 106 est un homologue chez le maïs de DDM1 chez Arabidopsis, une enzyme impliquée dans la maintenance de la méthylation de l'ADN. DMT102, DMT103 and DMT107 sont les homologues chez le maïs de respectivement CMT3, et DRM2 ou DRM1 chez Arabidopsis. DRM1 et 2 et CMT3 agissent de manière partiellement redondante dans le contrôle de la méthylation asymétrique (au site CHH ou CHG). MBD109 est une protéine à motif d'attachement au groupe méthyle (Methyl Bindind Domain), de fonction inconnue, mais agit donc probablement sur des sites méthylés. CHR120 est un homologue chez le maïs de MOM1 chez Arabidopsis, un gène impliqué dans les mécanismes de silencing. HXA102 est un homologue chez le maïs de AtADA2 chez Arabidopsis, un composant du complexe histone acetyltransférase ADA. SDG110 est une histone méthyl transférase, de fonction inconnue. EXEMPLE 3 : Profil d'expression des gènes DMT102 et DMT103 chez le maïs sexué. On rapporte ci-après les résultats relatifs à DMT102 et DMT103. Ils correspondent à une voie extrêmement bien caractérisée chez Arabidopsis, appelée voie RdDM (pour RNA dependent 30 DNA methylation). DMT102 et DMT103 sont respectivement les homologues de CMT3 (CHROMOMETHYLASE 3) et DRM1 et 2 (DOMAIN REARRANGED METHYL 25 TRANSFERASE 1 et 2) chez Arabidopsis. Les profils d'expression tissulaires de ces deux gènes (DMT102 et DMT103) ont été analysés par hybridation in situ de sondes ARN chez un maïs sexué. Les résultats sont illustrés Figure 3. Les profils d'hybridation obtenus confirment la grande spécificité d'expression détectée par RT-PCR: les deux gènes s'expriment de manière très spécifique au cours d'étapes ciblées du développement reproducteur. Ainsi, un signal est détectable pour DMT102 immédiatement avant, puis pendant la méiose. DMT103 n'est détecté qu'au cours de la gamétogenèse. Les données in situ montrent par ailleurs qu'au niveau tissulaire, ces deux gènes ne s'expriment que dans un nombre très limité de cellules, correspondant pour chaque ovule d'une part à la cellule reproductrice (l'archéspore, la cellule mère de la mégaspore et les méiocytes durant la sporogenèse; le gamétophyte au cours de la gamétogenèse), et d'autre part à un petit nombre de cellules entourant la cellule reproductrice. L'action de ces gènes est donc limitée par un profil d'expression extrêmement ciblé d'un point de vue spatial et temporel. Ce profil indique une différence importante entre les membres de la voie RdDM identifiés ici et la voie RdDM telle qu'elle a été décrite chez Arabidopsis: chez cette espèce, la voie RdDM est essentielle dans les tissus somatiques de la plantes, où ils jouent un rôle dans le maintien des profils de méthylation des séquences répétées. Leur rôle reproducteur chez Arabidopsis est inconnu, et des mutations dans les gènes correspondant n'ont pas de phénotype reproducteur particulier, ou d'effets notables sur la fertilité des plantes. Les gènes identifiés ici, par opposition, possèdent un profil d'expression essentiellement reproducteur. EXEMPLE 4 : Phénotype de plantes mutantes pour lesquelles la fonction de DMT102 et DMT103 est abolie Pour démontrer le rôle potentiel de DMT102 et DMT103 dans l'expression de l'apomixie des expérimentations ont été réalisées pour vérifier si l'inactivation de leur fonction chez une plante sexuée conduit au même phénotype que celui de plantes apomictiques. Il s'agit de vérifier qu'en manipulant l'expression de ces gènes de telle façon que leur expression soit similaire à ce qu'elle est chez une plante apomictique, on récupère bien un réponse phénotypique équivalente. Les plantes de maïs mutées spécifiquement dans ces deux gènes ont donc été analysées, les mutations correspondantes abolissant leur fonction. Pour DMT102, la lignée mutante correspond à l'insertion d'un transposon de la famille Mutator dans le domaine methyltransférase de la protéine. Pour DMT103, la mutation découle de la substitution de plusieurs acides aminés dans des sites essentiels: R-49-I, R-272-Q, C-182-Y (résidu dans la forme sauvage - position - résidu dans le mutant). L'analyse de ces plantes a porté sur l'expression de deux caractéristiques propres aux plantes apomictiques: l'apoméiose, et donc la capacité à produire des gamètes non réduits, et 1'aposporie, et donc la capacité à produire plusieurs sacs embryonnaires dans les ovules, mais avec une seule archéspore. Comme montré sur la figure 5, les formes mutantes de DMT103 produisent des sacs embryonnaires multiples dans un unique ovule. Ce phénotype n'a jamais été décrit dans la littérature en dehors des plantes apomictiques. La figure 6 donne les phénotypes des plantes mutantes avec production de gamètes non-réduits : A) la taille des gamétophytes mâles est chez les plantes très corrélée au niveau de 20 ploïdie des gamètes qu'ils contiennent. On peut rapidement évaluer la capacité d'une plante à produire des gamètes non-réduits par l'observation sous microscope des gamètophytes matures, ici les grains de pollen. WT correspond à une plante sauvage, la lignée W23. 25 dmtl02-mu et dmt103 sont deux formes mutantes de DMT102 et DMT103, respectivement, et produisent clairement des gamétophytes de tailles variables, telles qu'illustrées par le graphe de fréquence B). La fréquence de ces gamètes dans les plantes sauvage W23, et les deux formes mutantes est quantifiée en C). La relation entre taille des graines et le niveau de ploïdie est démontrée par une analyse en cytométrie de flux (D). 30 Cette figure montre que les deux gènes, sous leurs formes mutantes respectives, produisent une proportion élevée de gamètes non-réduits, de 30% chez DMT103 à 50% chez DMT102. Ces formes sont donc fortement apoméiotiques. 1115 REVENDICATIONS1 - Utilisation pour produire des plantes partiellement ou totalement apomictiques d'un gène, 5 d'un transcrit de ce gène, ou de son ORF, codant pour une protéine à motif DNA Méthyl Tranférase. 2 û Utilisation selon la revendication 1, d'un gène codant pour une protéine de séquence SEQ IDN°1 ou SEQIDN°5. 3 û Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit du gène DMT 103 répondant à la séquence SEQ ID N°2, ou d'un transcrit d'un tel gène répondant à la séquence SEQ ID N°3, ou de son ORF de séquence SEQ ID N°4. 15 4 û Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit du gène DMT 102 répondant à la séquence SEQ ID N°6, ou du transcrit d'un tel gène répondant à la séquence SEQ ID N°7, ou de son ORF de séquence SEQ ID N°8. û Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le gène 20 est inactivé par mutagénèse. 6 û Méthode pour induire dans les espèces cultivées telles que le maïs, riz ou blé, un phénotype tout ou partiellement apomictique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'insertion aléatoire dans le génome de la plante d'un élément transposable, par exemple de type de 25 Mutator, et l'identification du locus muté. 7 û Application de la méthode selon la revendication 6, pour la propagation de génotypes instables, le contrôle de contaminations polliniques, l'amélioration des plantes et la production commerciale de graines. 8 û Plantes totalement ou partiellement apomictiques d'espèces cultivées telles que maïs, riz ou blé, caractérisées en ce qu'elles comportent dans leur génome, un gène inactivé, un transcrit de ce gène ou son ORF, de séquences, respectivement SEQ ID N°2, 3 ou 4, ou de séquences, respectivement, SEQ ID N°6, 7 ou 8. 30 13ù Graines obtenues à partir de plantes hybrides apomictiques selon la revendication 7.