Brevet FR2955770A1 — publié le 20110805

L'invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique, d'un miel de trèfle (Trifolium repens) ou d'un extrait de ce miel, en tant qu'agent actif pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou à en atténuer les effets, ainsi qu'une composition cosmétique contenant un agent actif et un procédé de soin cosmétique en comportant application. ETAT DE LA TECHNIQUE Comme il est bien connu, le vieillissement cutané résulte de facteurs génétiques mais aussi de facteurs environnementaux, tels que par exemple l'exposition au soleil, et se manifeste à la fois par des modifications moléculaires, cellulaires, histologiques et cliniques au niveau de l'épiderme et du derme. On constate, au cours du vieillissement, une altération des mécanismes assurant la vie de la cellule, jusqu'à I'apoptose ou « mort cellulaire programmée génétiquement ». Ces perturbations induisent une diminution de la prolifération cellulaire ainsi qu'un affaiblissement progressif de l'activité cellulaire, se traduisant par des modifications du cycle cellulaire telles que l'oxydation, l'altération des communications intercellulaires, ou encore la formation de radicaux libres. Ainsi, on observe notamment une diminution de l'épaisseur de l'épiderme et une diminution de la taille des crêtes épidermiques se traduisant par un aplatissement de la jonction dermo-épidermique, qui lui- même induit une moindre cohésion à l'interface de l'épiderme et du derme. Cette atrophie cutanée se traduit également progressivement par des altérations de la matrice extracellulaire liée à une diminution de la production de collagène et des fibres d'élastine de la peau, ainsi qu'une raréfaction des protéoglycanes, des glycosaminoglycanes et de la fibronectine. Tous ces phénomènes conduisent à une plus grande fragilité de la peau, liée à une altération de ses fonctions de protection et de barrière, en narircillIfDr Cinç CI-MÇÇ (tl\/Irnnriiry)(2nt? soumise, et de ses propriétés mécaniques (perte d'élasticité rendant plus visibles les rides d'expression). Les stress mécaniques répétés conduisent aussi à des modifications de l'expression de gènes, d'ou par exemple la suractivation des métalloprotéinases qui accentuent le vieillissement cutané par diminution locale de matière, d'ou creusement de la ride et perte de fermeté. A l'opposé, la cicatrisation est elle-même un processus de réparation tissulaire notamment du derme et de l'épiderme, aboutissant à une nouvelle épithélialisation de la plaie. Ce processus comprend plusieurs étapes : - une phase de réparation tissulaire, correspondant à la migration et la prolifération des fibroblastes, sous la dépendance de cytokines parmi lesquelles la TGF-béta (Transforming growth factor-béta), et à la synthèse d'une nouvelle matrice extracellulaire composée de collagène, de fibronectines et de protéoglycanes. - une phase d'épithélialisation de la plaie comprenant la migration de cellules épithéliales (kératinocytes), puis leur différentiation pour reformer l'épiderme. On connaît l'activité du miel dans le soin de brûlures, de blessures superficielles ou d'ulcères. Le miel permet une cicatrisation rapide et propre de plaies et le remplacement rapide des tissus lésés. Il stimule la formation de tissus de granulation, le développement d'une néovascularisation et la prolifération fibroblastique, et accélère ainsi l'épithélialisation des plaies (Mo/an, Primary Intentions, 1998, Dec, 148-158; Efem, Br. J Sing., 1988, 75, 679-681). On connaît notamment l'utilisation du miel de thym dans le soin des plaies chirurgicales (Descottes, Phytothérapie, 2009, 7, 112-116). BUTS DE L'INVENTION Comme on !t'a vu précédemment, écanismes de [ngt'r'(1tInn ('0111rinu-P Pt- ct\/n t-i-)p peau devenant progressivement déficients au cours du vieillissement, leur stimulation est donc une stratégie qui vise à reproduire le processus de cicatrisation d'une peau endommagée, pour obtenir les mêmes effets. L'invention a pour but principal l'identification d'agents actifs stimulant des cibles impliquées dans les processus de cicatrisation, pour obtenir une densification cellulaire au niveau du derme et de l'épiderme, et un remodelage de la matrice extracellulaire, contribuant ainsi à améliorer les propriétés mécaniques et fonctionnelles de la peau. L'invention a pour but principal de fournir un nouvel agent actif cosmétique ayant un bon pouvoir cicatrisant, d'origine naturelle, respectant l'environnement. L'invention a aussi pour but principal de trouver un nouvel agent actif cosmétique peu coûteux, disponible en quantité suffisante pour l'industrie cosmétique. RESUME DE L'INVENTION La Demanderesse a découvert que le miel de trèfle ( Tnfolium repens) stimule significativement l'expression de gènes codant pour la synthèse de cytokines impliquées dans les processus de cicatrisation, et qu'il permet en outre d'accélérer la prolifération des fibroblastes au niveau du derme artificiellement lésé. Ces résultats permettent d'envisager l'utilisation de cet agent actif particulier comme agent actif cosmétique pour stimuler les processus de réparation des tissus superficiels de la peau saine et non lésée, en particulier du derme et de l'épiderme, de façon à rétablir ses propriétés mécaniques et fonctionnelles. L'amélioration des propriétés mécaniques de la peau se traduit notamment par une atténuation visible des rides et ridules de la peau, en particulier au niveau du visage et du cou. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La Demanderesse a découvert, de manière surprenante, que le miel de trèfle agit de façon plus efficace que le miel de thym ou d'autres actifs connus pour leur pouvoir cicatrisant, en ce qui concerne l'expression de gènes impliqués dans la synthèse de facteurs cellulaires produits au cours des processus de cicatrisation. Il est également plus efficace pour stimuler la prolifération de fibroblastes au niveau du derme d'une peau artificiellement lésée. Le miel de trèfle est ainsi un agent actif particulièrement efficace pour assurer le redémarrage de l'activité cellulaire dont l'affaiblissement progressif induit la perte d'élasticité de la peau conduisant à la formation de rides ou de ridules. Le miel de trèfle est largement disponible dans le commerce. Le miel de trèfle comprend majoritairement, emprisonnés dans sa masse, des grains de pollen dont la forme et la taille sont caractéristiques de l'espèce végétale Trifolium repens. Un premier objet de la présente demande vise ainsi l'utilisation dans une composition cosmétique, d'un miel de trèfle ( Tnfo/ium repens), ou d'un extrait de ce miel, en tant qu'agent actif pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou à en ralentir les effets, en particulier pour restructurer l'épiderme, raffermir la peau et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides ou ridules, notamment au niveau du visage et du cou. De préférence, le miel de trèfle, ou un extrait de ce miel est utilisé en tant qu'agent actif cosmétique anti-rides. Un miel de trèfle particulièrement préféré est celui produit en Nouvelle-Zélande. Un deuxième objet de l'invention porte sur une composition 30 cosmétique comprenant à titre d'agent actif cosmétique, un miel de trèfle Trffo/iunl repens) ou un extrait de ce miel. Plus particulièrement l'invention porte sur une composition cosmétique anti-âge ou anti-rides comprenant un miel de trèfle (Trifo//wn repens) ou un extrait de ce miel, à titre d'agent actif anti-rides ou anti-âge. La composition peut aussi comprendre un ou plusieurs miels unifloraux d'autres plantes, de préférence un miel unifloral de thym (Thymus vulgarfs) ou un miel de Manuka (Leptospernum scoparium), et/ou un ou plusieurs miels polyfloraux, et/ou un ou plusieurs extraits de ces miels et/ou un ou plusieurs produits issus de l'apiculture, tels que la gelée royale. La préparation d'un extrait de miel est bien connue de l'homme 10 de l'art. Un extrait préféré est obtenu à l'aide de solvants polaires. A titre de solvant polaire ou de mélange de solvants polaires, on choisit avantageusement un solvant ou un mélange de solvants choisi(s) parmi l'eau, un alcool en C1-C4, par exemple l'éthanol, un glycol 15 en C2-C6 choisi préférentiellement parmi le glycérol, le butylèneglycol et le propylèneglycol et leurs mélanges. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, l'extraction est menée en utilisant un mélange hydroalcoolique ou hydroglycolique. 20 Les propriétés du miel de trèfle peuvent être obtenues ou améliorées dans des compositions cosmétiques, dans lesquelles il est associé avec d'autres agents actifs sous forme de molécules purifiées et/ou d'extraits de plantes dont les effets cosmétiques sont similaires et/ou complémentaires de celles dudit miel. 25 Outre le miel de trèfle précité, la composition cosmétique peut ainsi comprendre un ou plusieurs autres agents actifs cosmétiques choisis parmi des substances ayant une activité asti-vieillissement ; des substances ayant une activité dépigmentante ou une activité éclaircissante de la peau; des substances ayant une activité amincissante ; des 30 substances ayant une activité hydratante ; des substances ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; des substances stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; des substances ayant une activité sébo-régulatrice pour le soin des peaux grasses ; des substances destinées à nettoyer ou purifier la peau ; des substances ayant une activité anti-radicalaire. Ainsi, a composition cosmétique de l'invention comprend avantageusement une ou plusieurs autres substances choisies parmi : - des molécules favorisant le renouvellement cellulaire telles que la vitamine A, le rétinol et/ou ses esters; des alpha ou béta-hydroxy acides tels que les acides de fruits, notamment l'acide malique, glycolique ou citrique, l'acide salicylique ou ses esters, l'acide gentisique ou ses esters, en particulier le gentisate de tocophérol. - des molécules ou extraits stimulant la fermeté de la peau telles que des peptides stimulant la synthèse de collagène, en particulier du collagène de type I, II, IV ou VII, un extrait de Centella asiatica, l'acide madécassique, l'acide asiatique, un extrait d'avoine, un extrait de Berthollétia exscelsa, un hydrolyzat de protéines ou des peptides de soja, un extrait de Potentilla erecta, un extrait de Siegesbeckia orientalis, des ginsenosides ou notoginsenosides, en particulier Rbl, RO, un extrait de graines de Vigna aconitifolia, - des molécules ou extraits favorisant la synthèse d'acide hyaluronique ou de glycosaminoglycanes au niveau de l'épiderme et du derme, tels qu'un extrait Essence vitale de Mamaku, un extrait de feuilles de Cyathea medullaris, un extrait d'Eriobotrya japonica ou des fragments d'acide hyaluronique de bas poids moléculaires ou bien encore un extrait d'Adenum obesum, - des molécules ou extraits régulant la différentiation de l'épiderme tels que l'ecdysterone, la turkestérone, des dérivés de calcium, des précurseurs de vitamine D - l'adénosine, la carnitine ou ses dérivés en particulier l'acetylcarnitine, la vitamine A ou un de ces esters cosmétiquement acceptable, en particulier le propionate ou le palmitate de vitamine A. - des inhibiteurs de métalloprotéinases (MMP), en particulier des inhibiteurs des MMP 1, 2, 9, tels qu'un extrait de Ruscus asculeatus, des peptides de soja ou des flavonoïdes tels que la quercetine, le kaempferol, l'apigenrne, la wogonine ou des extraits végétaux en n n,i nt - des inhibiteurs d'élastase tels que des extraits végétaux d'Aspergillus fumigatus, de Momordica charantia, de Cucurbita maxima - des substances stimulant la synthèse de dermatopontine, telles qu'un extrait d'ambre, - des molécules ou extraits de plantes astringents resserrant les pores tels qu'un extrait d'Hamamélis - des filtres protégeant des radiations UVA et UVB, tels que la benzophénone, le 4-butyl methoxydibenzoylmethane, l'éthylhexyl méthoxycinnamate, l'octocrylène, l'éthylhexyl salicylate, l'acide sulfonique phenylbenzymidazole, l'homosalate, seuls ou en association avec des oxydes de titane - des molécules ou extraits végétaux agissant sur la pigmentation telles que l'acide kojique, les extraits de racine de réglisse ou de mûrier, l'arbutine, le pantothenosulfonate de calcium, la boldine, la diacétylboldine, la vitamine C ou un de ses dérivés, tels que les glycosides, des extraits de lys, en particulier de bulbe. - des molécules ou extraits antiradicalaires ou anti-inflammatoires tels qu'un extrait d'Artemisia capillaris, un extrait de Sanguisorba officinalis, le resvératrol et ses dérivés, le cucurma, la cucurmine ou la tetrahydrocurcumine, des polyphénols extraits de pépins de raisin, la vitamine E et ses dérivés, en particulier ses dérivés phosphate, l'ergothionéine ou ses dérivés, l'idébenone, du picéid, des stilbènes ou hydroxyphénanthrènes. - un extrait d'orchidée telle qu'une orchidée appartenant au genre Brassocattleya, par exemple un extrait de l'orchidée Brassocattleya marcella, ou au genre Vanda, par exemple un extrait d'une orchidée parmi Vanda coerulea, Vanda teres ou encore Vanda denisoniana. - des molécules hydratantes comme le glycérol ou des polyols naturels, des céramides naturels ou de synthèse, des eaux de sources ou minérales, Avantageusement, la composition comprend en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable qui peut être choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH des agents anti-oxydants, des conservateurs, et leurs mélanges. La composition cosmétique se présente avantageusement sous forme d'un sérum, d'une lotion, d'une crème ou d'un hydrogel, de préférence un masque, ou sous la forme d'un stick ou d'un patch. Les compositions de l'invention présentent un effet particulièrement recherché pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou en ralentir les effets, en particulier pour restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides. La présente invention concerne, comme exposé précédemment, une utilisation du miel de trèfle tel que défini ci-dessus en tant qu'agent actif cosmétique destiné à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou à en ralentir les effets, en particulier destiné à restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides. L'invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur les zones de peau concernées, d'un miel de trèfle ou d'une composition cosmétique telle que définie précédemment, en une quantité efficace pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou en ralentir les effets, en particulier pour restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides. Avantageusement, l'application a lieu sur une zone de peau du 25 visage, du cou ou du corps, notamment des mains, présentant des signes de vieillissement tels que la présence de rides ou de ridules. Pour chacun des objets l'invention précitée, la concentration en miel de trèfle utilisée en tant qu'agent actif cosmétique sera comprise entre 0,001 et 10% en poids, plus particulièrement entre 0,01 et 5 % en 30 poids, encore mieux entre 0,1 et 3 % en poids, par rapport au poids de la composition cosmétique. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à lumière de description explicative qui va I k f:1 i- PYl fi n o rn L-^ e c L L._I 1 L L tests mettant en évidence les propriétés des extraits et à un exemple de composition cosmétique utilisant de tels extraits, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, la température est en degrés Celsius, la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. DESCRIPTION DE FIGURES Les figures la, lb, 2a à 2f et 3 se rapportent à l'exemple 1 ci-après. Les figures 4 à 6 se rapportent à l'exemple 2. Les figures la et lb sont deux exemples d'observations faites au microscope à contraste de phase, d'une même zone artificiellement « lésée » du puit dans lequel sont cultivés les fibroblastes humains normaux (FHN). L'image de la fig. la visualise une zone dépourvue de cellule, correspondant à l'endroit où se trouvait l'insert de culture IBIDI, immédiatement après retrait dudit insert. La figure lb visualise la même zone après recolonisation partielle par les FHN. - Les figures 2a à 2d représentent les quatre étapes de l'analyse d'images capturées en fluorescence bleu et en fluorescence rouge, permettant de caractériser la colonisation par les fibroblastes de la zone du support, lésée artificiellement à l'aide des inserts IBIDI. Les figures 2c et 2d représentent respectivement la zone lésée non traitée (témoin négatif) après marquage des noyaux cellulaires (étape 3 de l'analyse d'image), puis après détection automatique des noyaux cellulaires (étape 4 de l'analyse d'image). Les figures 2e et 2f représentent la zone lésée après traitement par un miel de trèfle selon l'invention, respectivement après l'étape 3 (fig. 2e) et l'étape 4 (fig. 2f) de l'analyse d'image. - La figure 3 représente en ordonnées, sous forme de résultat en bâtera, le nombre de cellules ayant recolonisé la cicatrice par centimètre carré obtenu avec chacun des produits testé respectivement in t-.(=,r-nnin -^n f- t-,i") Repair » en tant que témoin de référence positif; le miel de thym en tant qu'autre produit de référence, et le miel de trèfle selon l'invention ; - la figure 4 représente en ordonnées, sous forme de résultat en bâton, le ratio de transcrits du gène HMGB1 entre les cellules de KHN (Kératinocytes Humains Normaux) normaux traités et les cellules de KHN normaux non traités, normalisés par bêta-2-microglobuline, obtenu avec chacun des produits testés, respectivement le contrôle, noté NT ; le produit du commerce « Gatuline Skin Repair » en tant que témoin de référence positif et le miel de trèfle selon l'invention ; - la figure 5 représente en ordonnées, sous forme de résultat en bâton, le ratio de transcrits du gène TGF-béta entre les cellules de FHN (Fibroblastes Humains Normaux) traités et les cellules de FHN non traités, normalisés par bêta-2-microglobuline; obtenu avec chacun des produits testés, respectivement le contrôle, noté NT ; le produit du commerce « Gatuline Skin Repair » en tant que témoin de référence positif et le miel de trèfle selon l'invention ; - la figure 6 représente en ordonnées, sous forme de résultat en bâton, le ratio de transcrits sur l'expression des gènes de béta-1,4-galactosyltransférase, entre les FHN traités et les FHN non traités, normalisés par bêta-2-microglobuline, obtenu avec chacun des produits testés, respectivement le contrôle, noté NT ; le produit du commerce « Gatuline Skin Repair » en tant que témoin de référence positif et le miel de trèfle selon l'invention. EXEMPLES DE L'INVENTION Exemple 1 - Etude du miel de trèfle dans un modèle de cicatrisation in vitro Cette expérience s'appuie sur l'utilisation d'inserts de culture cellulaire biocompatibles permettant de mesurer de façon quantitative et parfaitement reproductible des phénomènes de cicatrisation in vitro. MATERIEL ET METHODES 1. Culture cellulaire Les cellules utilisées dans cette étude sont des fibroblastes Humains Normaux (FHN). Les cellules sont ensemencées dans des flasques de 175 cm2 à une densité de 1 million par flasque en milieu de culture DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplémenté de 10% de sérum de veau foetal et de L-glutamine 1,3mM. Parvenues à confluence, les cellules sont trypsinées et réensemencées pour le test de cicatrisation 2. Test de cicatrisation Ensemencement des cellules Avant ensemencement des cellules, on place au fond de six puits d'une plaque, des inserts commercialisés sous forme de kits et sous la dénomination Culture-Insert (réf. 80209) par la société IBIDI (Allemagne). Les FHN sont ensemencés à raison de 20000 cellules /cm2 dans du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal et cultivés pendant 48h. Lorsque les cellules sont parvenues à confluence, le milieu de culture est changé et remplacé par du DMEM seul. La culture est poursuivie pendant 24h. Traitements Dans cette étude, deux expériences identiques ont été réalisées à une semaine d'intervalle dans les mêmes conditions. On utilise deux puits pour chaque substance testée. 100 pg/ml fr-,rirlir-),, Ni,-,i 11 Les substances testées sont les suivantes : GATULINE SKIN REPAIR (témoin positif) 0,10% Nller de thym (origine : Fralc Une culture de cellules est également réalisée dans du milieu DMEM seul, sans adjonction de substance à tester, dans deux puits, afin de réaliser un témoin non traité (NT). GATULINE SKIN REPAIR est un extrait hydroalcoolique 5 d'acanthe sauvage, commercialisé par la société GATTEFOSSE (France), pour lequel il est décrit un effet de protection de peaux abîmées, par une stimulation de l'expression des marqueurs de la différenciation kératinocytaire (test ex-vivo sur expiants de peau stripés). Les actifs testés (miel de thym et miel de trèfle) sont préparés 10 de la façon suivante : on prépare une solution mère à 100 mg/ml du miel dans du PBS, qui est ensuite stérilisée sur filtre 0,22pm. La dilution finale (1/1000ème) est réalisée dans du DMEM seul. Cicatrisation 15 L'insert de culture est tout d'abord enlevé avec une pince stérile. Au microscope à contraste de phase, on observe une zone « lésée », dépourvue de toute cellule, à l'endroit où se trouvait l'insert (FIG la). Le milieu de culture initial est ensuite remplacé dans chaque 20 puit par le milieu de culture contenant les actifs testés selon les conditions décrites ci-dessus. Les cellules sont maintenues en culture pendant 16h (temps de mesure optimal déterminé préalablement), à l'étuve à 37°C et dans une atmosphère contenant 5% de CO2. On observe au moyen d'une technique 25 d'analyse d'image l'intensité de la recolonisation de la zone cicatricielle selon les traitements (FIG. lb). Marquages cellulaires Après rinçage au PBS, les cellules sont fixées pendant 10 30 minutes avec une solution de formaline 1O% puis rincées au PBS. Les cellules sont ensuite perméabilisées avec une solution de Triton X100 0,1% pendant 10 minutes. Une solution contenant r!u DAPI K,6'-diarnidino-2- nh,n,/Iinrinl,,1 rf^ ct,,-, cellulaires, et de la Phalloidine 546, utilisée pour le marquage du cytosquelette d'actine, est déposée sur les cellules et incubée à température ambiante, à l'abri de la lumière pendant 1h. Les cellules sont ensuite rincées au PBS et recouvertes d'une goutte de milieu de montage aqueux. Des images sont immédiatement réalisées sur un vidéomicroscope Nikon TE2000 en fluorescence bleue (noyaux cellulaires) et rouge (filaments d'actine) à raison de 2 photos par puit au niveau de la zone lésée. Analyse d'images L'analyse d'image est utilisée pour visualiser et quantifier la colonisation par les fibroblastes de la zone artificiellement « lésée » après retrait de l'insert. On utilise pour l'analyse, le logiciel Leica QWIN L'analyse comprend quatre étapes ci-dessous : 1 - capture d'une image avant traitement (temps 0), à l'aide du vidéomicroscope NIKON TE2000 équipé par le logiciel NIS (FIG. 2a) : l'image montre la zone stripée, dépourvue de cellule, après retrait de l'insert 2 - détermination de la zone de mesure à l'aide d'un outil informatique - zone en jaune (FIG. 2b). 3 - capture d'une nouvelle image après les étapes de traitement et de marquage des noyaux cellulaires (FIG. 2c et 2d pour le témoin NI et FIG. 2e et 2f pour le traitement avec le miel de l'invention) : la zone lésée comprend des fibroblastes qui recolonisent la zone initialement vierge de cellules. 4 - sélection automatique des noyaux cellulaires marqués dans la zone définie à l'étape 2, et comptage desdits noyaux cellulaires marqués (FIG. 2d et 2f). 0 On calcule nombre de cellules ayant recolonisé la zone lésée, par unité de surface On reproduit la mesure sur 4 images par actifs testés. . RESULTATS L'effet de chacun des actifs testés, sur la recolonisation de la cicatrice est présenté en fig. 3. Sur cette figure il apparaît clairement que le miel de trèfle présente une activité significative sur la recolonisation de la zone lésée par les fibroblastes, de même ordre que la Gatuline Skin Repair (témoin positif). Par contre, le miel de trèfle produit lui-même un effet bien supérieur à celui du miel de thym, dont l'activité cicatrisante est bien connue, ce qui constitue un résultat inattendu. Cela justifie la sélection du miel de trèfle comme agent actif cosmétique particulièrement efficace pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou en ralentir les effets. Exemple 2 - Effet du miel sur l'expression de gènes codant pour des marqueurs de la cicatrisation. Cette étude a pour but d'évaluer la modulation de l'expression de trois gènes codant pour des protéines impliquées dans le processus de cicatrisation, par un traitement comprenant le miel de trèfle. Les gènes sélectionnés sont les suivants : HMGB1 (High Mobility Group Box 1) : ce gène code pour une cytokine multifonctionnelle impliquée dans la réponse inflammatoire et la cicatrisation. Un niveau d'expression élevé de cette protéine reflète une cicatrisation de bonne qualité (Stralno et al., J. Invest, Dermatol. 2008 Jun;128(6):1545-53). Beta 1,4 Galactosyl transférase ce gène code pour une 30 galactosyl transférase qui participe au dépôt de collagène, élément fondamental dans la cicatrisation (Shen et al., Am J Dermatopathol. 2008 Feb;30(1):1 0-5). 14 2955770 1s TGF beta : ce gène tient un rôle central dans l'ensemble du processus de cicatrisation (Wang X.7et al., Investig. Dermatol. Symp. Prix'. 2006 Sep,»11(1):112- ; 5 On étudie, l'influence de chaque actif sur l'expression des gènes précités à l'aide de la technologie de PCR quantitative, après une phase de traitement de kératinocytes humains normaux (KHN) ou de fibroblastes dermiques humains normaux (FHN) par l'agent actif de l'invention. 10 1. Culture des cellules Les cellules cutanées (kératinocytes ou fibroblastes) sont conservées dans des cryotubes plongés dans l'azote liquide (-180°C), jusqu'à utilisation. Après décongélation à 37°, le contenu de chaque 15 cryotube est repris puis centrifugé (5 minutes à 150 g à température ambiante). Le culot cellulaire est repris dans 10 mL d'un milieu de culture adapté à chaque type de cellules, puis ensemencé dans un flacon de 75 cm2. 20 La composition de ces milieux est la suivante : Milieu A, adapté à la culture de kératinocytes KSFM (Invitrogen) 25 + extraits pituitaires (Invitrogen) 50 pg/ml Milieu B, adapté à la culture de fibroblastes DMEM (Invitrogen) + sérum de veau foetal (Biowest) 10% v/v A confluence, les cellules (kératinocytes ou fibroblastes) sont décollées du support de culture par un milieu trypsine-EDTA (1 mL de trypsine et 0,2 g/L d'EDTA) pendant nuelques minutes °C. Anrific: ni ."Hr -7Hr:in r-f30 chaque culot cellulaire est repris dans 1 mL du milieu A (KHN) ou du milieu B (FHN). 2. Traitements Les cellules (KHN ou FHN) sont ensemencées en boîte de Pétri de 35mm de diamètre à raison de 2,5.105 cellules/boîte dans leur milieu respectif. Le milieu de culture des FHN (milieu B) est remplacé 24 heures avant la phase de traitement par du milieu DMEM seul. On ensemence deux boîtes par condition de culture, soit 2 boîtes pour chaque substance testée et 2 boîtes ensemencées avec le milieu de culture (témoin non traité), si cela est nécessaire. 15 Substances testées (dilution dans le milieu de culture) - Miel de trèfle 100 pg/mL - GATULINE SKIN REPAIR (témoin positif) 0,01% Après 24 heures de traitement, les cellules sont récupérées 20 pour en extraire les ARN totaux. 3. Obtention des ARN totaux à l'aide de l'extracteur EZ1 naen-t 25 Le milieu de culture des cellules est éliminé, puis on ajoute 500 pL de Qiazol (fourni dans le kit). Le lysat cellulaire est récupéré dans un tube de 1,5 mL. Les ARN totaux sont extraits selon le protocole du fournisseur. Les solutions d'ARN totaux obtenues sont dosées, et leur 30 qualité vérifiée, à l'aide du Bioanalyseur 2100 (Agitent Technologies) relié à un ordinateur possédant le logiciel spécifique d'analyse des résultats (logiciel 2100 expert). La technique nécessite une micro-plaque de 12 puits (RNA 6000 NanoChips) et un kit de réactifs (RNA 6000 Nano 10 4. Synthèse des ADN complémentaire Le kit de reverse transcription (RT) utilisé est le High capacity cDNA archive kit. Il a été utilisé selon le protocole fourni. 100 ng d'ARN totaux, après DNAse, sont dilués dans de l'eau pour un volume final de 25 pL. Ils sont ensuite incubés pendant 10 minutes à 25°C puis 2 heures à 37°C avec 25 pL de mélange réactionnel de High capacity cDNA archive kit 2X préalablement préparé comme indiqué ci dessous. Mélange réactionnel High capacity cDNA archive kit 2X pour 1 réaction : RT buffer 5 pL dNTP buffer 2 pL Random primer 5 pL RNAse out 0,5 pL RT 2,5 pL H20 10 pL 5. RT-PCR quantitative en temps réel L'effet des différents traitements est évalué par PCR quantitative en temps réel avec le bloc 96 puits fast du 7900HT (Applied biosystems). 25 Préparation du mélange réactionnel High pour 1 réaction : TaqMan Fast universal PCR master mix (2x) 10 pL TaqMan gene expression assay 1 pL H20 4 pL 30 Les 15 pL du mélange sont placés dans les puits d'une plaque 96 puits spécialement conçue pour l'appareil 7900HT, 5 pL d'eau sont ajoutés (pour le blanc) ou 5 pL de dilutions successives d'ADNc (pour la gamme) ou 5 pL d'échantillons dilués au 1/50 e dans les puits20 RESULTATS - Expression du gène HMGB1, dans des KHN après 24 heures 5 de traitement Le taux de transcrits codant pour le gène HMGB1 mesuré pour un échantillon est rapporté aux taux de transcrits codant pour le gène invariant béta-2-microglubuline (Béta-2-m). Les résultats obtenus sont 10 traités sous forme d'histogrammes (FIG. 4). Le traitement par le miel de trèfle augmente l'expression du gène, de 1,17 fois par rapport au témoin non traité, contrairement au témoin positif qui n'augmente pas l'expression dudit gène. 15 - Expression du gène TGF-béta dans des FHN après 24 heures de traitement Le taux de transcrits codant pour le gène TGF-béta est rapporté au taux de transcrits codant pour le gène invariant Béta-2-microglobuline 20 (béta-2-m). Les résultats obtenus sont traités sous forme d'histogrammes (FIG. 5). Le traitement des cellules par le miel de trèfle augmente l'expression du gène étudié, de 1,76 fois par rapport au témoin non traité. Le témoin positif augmente également significativement l'expression du gène étudié 25 - Expression du gène béta-1,4-galactosylransferase dans des FHN après 24 heures de traitement Le taux de transcrits codant pour le gène béta-1,4- 30 galactosyltransférase est rapporté aux taux de transcrits codant pour le gène invariant Béta-2-m. Les résultats obtenus sont traités sous forme d'histogrammes (FIG. 6). Après traitement par le miel de trèfle, on observe une augmentation de 1,59 fois du taux de transcrits du gène 18 béta-1,4- galactosyltransférase 1 par rapport au témoin non traité. Le témoin positif est également significativement actif CONCLUSIONS Le miel de trèfle stimule significativement l'expression des gènes codant pour les marqueurs HMGB1, TGF-beta et la Beta-1,4 Galactosyltransférase. Il favorise l'ensemble des processus impliqués dans la 10 réparation tissulaire et la cicatrisation. Cela justifie la sélection du miel de trèfle comme agent actif cosmétique particulièrement efficace pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou en ralentir les effets. 15 Exemple 3 : sérum anti-âge améliorant la fermeté de la peau On prépare un sérum dont la composition est la suivante (% exprimés en poids par rapport à la composition finale) : 20 Miel de trèfle 4 Gelée royale 0,5 Hétérosides de Centella asiatica 0,1 Extrait de Malva sylvestris 0,1 25 Extrait de vigna aconitifolia 0,1 Excipients, dont conservateurs qsp 100 Le sérum est appliqué le matin sur le visage pour améliorer la fermeté de la peau. 30 Exemple 4 : crème de nuit anti-âge apaisante: On prépare une émulsion dont la composition est la suivante (% exprimés en poids par rapport à la composition finale) : Glycolysat de miel de trèfle 1 (par exemple hydroglycolique (mélange eau - butylèneglycol)) Glycerol 3 Beurre de mangue 2 Acide hyaluronique 1 Ergothioneine 0,4 Ascorbyl glycoside 0,4 Alphatocopherol 0,2 Glyccyrhizinate de potassium 0,05 Conservateurs qs Excipients émulsion parfumée qsp 100 La crème est appliquée au coucher, sur le visage, en particulier sur les zones présentant des signes de vieillissement cutané.20 REVENDICATIONS1. Utilisation dans une composition cosmétique, d'un miel de trèfle (Trifolium repens), ou un extrait de ce miel, en tant qu'agent actif pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou en ralentir les effets, en particulier pour restructurer l'épiderme, raffermir la peau et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides ou ridules, notamment au niveau du visage et du cou. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il est utilisé en tant qu'agent cosmétique anti-rides. 3. Composition cosmétique comprenant à titre d'agent actif 15 cosmétique, un miel de trèfle (Trifollum repens) ou un extrait de ce miel. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est une composition anti-âge ou anti-rides comprenant le miel de trèfle ou ledit extrait, à titre d'agent actif anti-rides ou anti-âge. 5. Composition selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,01 % à 10 % en poids de miel de trèfle, de préférence de 0,01 % à 5 % en poids de miel de trèfle. 25 6. Composition selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs miels unifloraux d'autres plantes, de préférence un miel unifloral de thym (Thymus vu/garis) ou un miel de Manuka (Le,otospernum scoparium), et/ou un ou plusieurs miels polyfloraux, et/ou un ou plusieurs extraits de ces miels 30 et/ou un ou plusieurs produits issus de 'apiculture, tels que la gelée royale. . Composition selon. ('(abri(-t-r.-ric,e-r» en np rii 20d'une crème ou d'un hydrogel, de préférence un masque, ou sous la forme d'un stick ou d'un patch. 8. Méthode de soin cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur les zones de peau concernées, d'un miel de trèfle ou d'une composition cosmétique telle que définie dans l'une des revendications 3 à 7, en une quantité efficace pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement de la peau ou en ralentir les effets, en particulier pour restructurer l'épiderme, raffermir la peau, et/ou favoriser l'atténuation ou la résorption des rides. 9. Méthode cosmétique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur une zone de peau du visage, du cou ou des mains présentant des signes de vieillissement tels que la présence de rides ou de ridules.