Brevet FR2958298A1 — publié le 20111007

PROCEDE DE DETECTION D'AMAS DE PARTICULES BIOLOGIQUES L'invention porte sur un procédé de détection d'amas de particules biologiques, telles que des microorganismes (bactéries, levures, champignons...) ou des cellules végétales ou animales, sur une surface, par exemple la surface d'un milieu de culture ou d'un substrat fonctionnalisé. Ces particules présentent des dimensions microscopiques, typiquement de l'ordre de 10 pm ou moins. L'invention s'applique en particulier à la détection de colonies de microorganismes. Pour de nombreuses applications, on souhaite détecter le plus tôt possible la croissance de microorganismes tels que bactéries ou levures sur un milieu de culture, le plus souvent une surface de gel nutritif. En général, la surface d'un milieu de culture gélosé s'écarte notablement d'une planéité parfaite, car elle présente fréquemment des défauts locaux de quelques micromètres (pm) de profondeur sur des distances de quelques millimètres (mm). Des poussières ou débris apportés en même temps que l'échantillon peuvent également introduire des déformations locales de haute fréquence spatiale de la surface. Les bactéries et levures sont difficilement repérables au début de leur croissance, car leur absorption est très faible dans les domaines du visible, du proche ultraviolet et du proche infrarouge, et leur indice de réfraction très proche de celui de leur milieu environnant. Ainsi, typiquement seules les colonies ayant un diamètre d'environ 100 pm sont détectables à l'oeil nu ; le temps nécessaire à la croissance de colonies de ces dimensions est typiquement de l'ordre de 6 à 24 heures (h). L'examen microscopique poussé, de préférence en fond noir, est une voie possible mais difficile à mettre en oeuvre. D'autres techniques sont couramment appliquées. Par exemple, il est possible de rendre les microorganismes fluorescents par différents additifs non-fluorescents que le métabolisme des microorganismes transforme en une substance fluorescente, choisie pour rester longtemps à l'intérieur des microorganismes. Cette méthode réclame un temps assez long (>5 h) avant que les bactéries ne deviennent fluorescentes et la mise au point d'un métabolite fluorogène. De même, des milieux chromogènes permettent de visualiser les microorganismes de manière sélective, mais le même problème est rencontré: la coloration réclame un temps assez long (plusieurs heures)avant d'être visible à l'oeil nu. De plus, toutes ces méthodes risquent d'apporter des perturbations sérieuses au métabolisme des microorganismes, alors que la suite des tests (par exemple mesure de la sensibilité aux antibiotiques) exige un développement des microorganismes, dans les conditions les plus favorables. L'invention vise à pallier les inconvénients précités en procurant un procédé de détection d'amas de particules biologiques aussi peu intrusif que possible et permettant la détection précoce d'amas de petites dimensions tels que des colonies de microorganismes au début de leur croissance. Conformément à l'invention un tel but est atteint par un procédé de détection d'amas de particules biologiques sur une surface, comportant les étapes consistant à : a. déterminer une représentation topographique de ladite surface ; b. détecter sur ladite représentation topographique au moins un contour délimitant une région susceptible de correspondre à un amas de particules biologiques. Ces étapes sont mises en oeuvre à l'aide d'un ordinateur programmé de manière opportune ou d'un autre moyen électronique de traitement des données, associé (notamment pour l'exécution de l'étape a) à un dispositif de mesure approprié. Selon des modes de réalisation avantageux de l'invention : - Lesdites particules biologiques peuvent être choisies parmi des microorganismes, tels que des bactéries, levures ou champignons, et des cellules végétales ou animales. - Lesdites particules biologiques peuvent présenter un diamètre ou une dimension principale inférieure ou égale à 100 pm. - Ladite surface peut être choisie parmi : l'interface entre un milieu de culture et un milieu environnant, tel que l'air, la surface d'un substrat fonctionnalisé ou la surface d'une membrane microporeuse. - Ladite étape a. consistant à déterminer une représentation topographique de ladite surface peut être mise en oeuvre par un procédé optique qui s'effectue sans contact et sans préparation de l'échantillon afin d'assurer une intrusivité minimale. Il peut s'agir en particulier d'un procédé de microtopographie confocale chromatique ou bien de strioscopie. - Ladite étape b. consistant à détecter au moins un contour peut être mise en oeuvre par mesure de la pente locale de ladite représentation topographique de la surface, avec seuillage. - Le procédé peut comporter également une opération de prétraitement de ladite représentation topographique comportant la détection et la soustraction d'une surface de référence. - Le procédé peut comporter la répétition des étapes a. et b. à des temps successifs, et la sélection des seules régions identifiées aux étapes b dont la forme ou la taille évolue dans le temps. Selon une variante avantageuse de l'invention, le procédé peut comporter une étape supplémentaire c. consistant à quantifier un indicateur relatif à la taille d'un amas détecté, par exemple son volume. Cela présente notamment de l'intérêt lorsque la taille moyenne des particules biologiques d'intérêt est connue. En effet, dans ce cas, cette étape c permet d'évaluer la quantité de particules biologiques présentes dans l'amas. En effet, en connaissant la taille moyenne des particules biologiques d'intérêt, prises individuellement, il peut être aisé une fois que la taille de l'amas est déterminée, de quantifier les particules biologiques présentes dans ledit amas. Une telle variante de l'invention est particulièrement avantageuse, quand les particules biologiques sont des microorganismes et qu'un traitement subséquent sur lesdits microorganismes est envisagé, auquel cas, un prélèvement de la colonie est nécessaire. Cette variante permet alors de s'assurer que la quantité de microorganismes présents est suffisante. Selon une autre variante avantageuse de l'invention, le procédé peut comporter une étape supplémentaire d'identification, in situ ou 10 ex situ, des microorganismes disposés en amas.. D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement : - La figure 1, la surface d'un milieu de culture sur laquelle 15 sont présentes des colonies bactériennes ; - La figure 2, une illustration schématique des différentes étapes d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention; - La figure 3, une illustration du principe de la microtopographie confocale chromatique, utilisée dans une première variante 20 du procédé selon l'invention ; - Les figures 4A, 4B et 5A, 5B, 5C, 5D et 5E des résultats expérimentaux obtenus en appliquant la technique de microtopographie confocale chromatique à un milieu de culture ensemencé par des bactéries ; et 25 - La figure 6, une illustration du principe de la strioscopie, utilisée dans une deuxième variante du procédé selon l'invention. La figure 1 montre une boîte de Pétri 10 vue en plan ; cette boîte est remplie d'un milieu nutritif (une gélose), sur la surface 11 de laquelle se sont développées de colonies bactériennes 12. Le procédé de l'invention 30 vise à détecter ces colonies à un stade précoce de leur croissance, lorsque leur diamètre est trop faible pour qu'elles soient visibles à l'oeil nu (diamètre de quelques dizaines de micromètres, par exemple 30 dam ou moins). La surface 11 du milieu de culture (c'est-à-dire l'interface gélose-air) présente des irrégularités 13, liées à l'état de surface de la gélose. Dans l'exemple de la figure 1, la gélose est directement exposée à l'air ; par conséquent, elle a tendance à se dessécher, ce qui induit des modifications de sa surface, et notamment une variation de son niveau moyen. Avantageusement, un procédé de détection d'amas de particules biologiques sur une surface de gélose prend en considération ces irrégularités de la surface, ainsi que les modifications auxquelles elle est soumise. Le procédé de l'invention exploite le fait, connu, que la multiplication des bactéries à la surface d'un milieu nutritif forme une protubérance. La hauteur de cette protubérance se mesure, dans les phases initiales de la croissance de la colonie, en centaines de nanomètres ou en micromètres. L'idée à la base de l'invention consiste à détecter les protubérances associées aux amas de particules biologiques au moyen de techniques û connues par elles-mêmes û de topographie de surface, associées à un traitement d'image adapté. Comme le montre la figure 2, la première étape El du procédé de l'invention consiste à déterminer une représentation topographique 20 de la surface 11 sur laquelle se développent les amas 12 à détecter. Dans le cas représenté sur cette figure, il s'agit d'une représentation topographique tridimensionnelle, prenant en particulier la forme d'une « nappe tridimensionnelle ». Une représentation topographique tridimensionnelle associe, à chaque point de la surface, des coordonnées (x,y) dans un plan Oxy et une coordonnée z selon un axe Oz de préférence perpendiculaire au plan Oxy. Cette représentation peut prendre la forme d'une surface en trois dimensions dans un repère Ox,Oy,Oz, ou d'une matrice dont les éléments a;i correspondent à la hauteur selon z des points de coordonnées (i,j) dans un plan Oxy. La deuxième étape E2 est une opération de prétraitement de la représentation topographique 20 comportant la détection et la soustraction d'une surface de base. En effet, comme expliqué plus haut, la surface 11 peut être mal définie et même variable dans le temps. Pour assurer une bonne détection des amas de particules, il faut déterminer une surface de base extraite par un traitement approprié des données, par exemple un filtrage spatial passe-bas., la fréquence de coupure étant typiquement de l'ordre de 0.001 pm-1, et par exemple comprise entre 1/2000 pm-1 et 1/500 pm"1. Les rayures dues à la préparation du milieu de culture, les variations même hétérogènes de l'épaisseur et la non-planéité disparaissent. Selon une variante plus simple, une pente moyenne est calculée au niveau d'une région de la surface, pour déterminer une surface de base plane et inclinée. La référence 21 indique la nappe tridimensionnelle (plus généralement : la représentation topographique) filtrée, dans laquelle les irrégularités 201 de faible fréquence spatiale (dues, par exemple, aux irrégularités du milieu de culture 13) ont été éliminées par l'opération de traitement que l'on vient de décrire. Seules persistent, sur la nappe 21, les irrégularités et aspérités 202 de taille suffisamment petite et/ou contenant des fréquences spatiales suffisamment élevées. On entend par fréquence spatiales élevées des fréquences supérieures à 1/500 pm"' . On pourra éliminer des composantes très hautes fréquences, c'est-à-dire les composantes correspondant à des fréquences spatiales supérieures à quelques pm-1, de telles composantes correspondant à la rugosité du gel composant le milieu de culture. La troisième étape E3 consiste à extraire des contours 22 à partir de la nappe tridimensionnelle 21. D'une manière connue en soi, les contours peuvent être détectés par des filtres de détection de contour connus de l'homme du métier, par mesure de la pente locale de la nappe suivie d'un seuillage, ou par filtrage spatial passe-bande, par exemple un filtre ayant une bande passante comprise entre quelques 1/500 pm-1 et quelques 1/10 pm-l. Au moins certains des contours 22 définissent des régions fermées 23 qui sont identifiées, lors de la quatrième étape E4, comme pouvant correspondre à des amas de particules biologiques. L'étape E4 peut comprendre une opération de sélection des régions fermées à prendre en considération. Par exemple, il est possible d'appliquer un critère de sélection selon lequel seulement les régions de dimensions suffisamment petites (diagonale ou diamètre de l'ordre quelques dizaines de micromètres) sont retenues comme susceptibles de représenter des amas de particules biologiques. En variante ou en combinaison, il est possible de répéter les étapes El ù E4 à des temps successifs, et de sélectionner les seules régions 22 dont la forme ou la taille varie dans le temps. En effet, les amas de particules biologiques sont des structures « vivantes », qui évoluent, tandis que les structures non biologiques ne changent pas, ou très peu, entre deux mesures successives. Cela permet aussi de mesurer la cinétique de croissance des amas. La première étape El du procédé, consistant à déterminer une représentation topographique de la surface sur laquelle se développent les amas à détecter, peut être mise en oeuvre par application de plusieurs techniques différentes de microtopographie, connues par elles-mêmes. Afin de ne pas perturber la croissance des amas à détecter, les techniques sans contact, et en particulier les techniques optiques sans préparation de l'échantillon (c'est à dire ne reposant pas sur l'utilisation de colorants, fluorophores ou leurs précurseurs) sont particulièrement préférées. D'une manière générale, une technique de microtopographie optique comporte : - l'éclairement par une source lumineuse de la surface dont une représentation tridimensionnelle doit être réalisée ; - la détection, par un capteur de lumière, d'un signal, correspondant à la lumière réfléchie ou transmise par cette surface ; et - la détermination d'une représentation topographique tridimensionnelle de la surface à partir du signal détecté. L'éclairement de la surface peut être dirigé du milieu ambiant 30 vers la surface. Lorsque l'éclairement n'est pas collimaté, on peut le focaliser sur la zone à mesurer. La source de lumière peut-être spatialement et/ou temporellement cohérente, ou bien être incohérente. Elle peut être polychromatique ou monochromatique. La détection peut être réalisée par un capteur d'image monodimensionnel (barrette) ou bidimensionnel (matrice), de type CMOS, CCD, photomultiplicateur, photodiode, etc. Ce capteur peut avoir une fonction spectrométrique, permettant d'analyser le spectre de la lumière détectée. Il peut aussi être couplé à un diaphragme, ou trou sténopéïque, afin de constituer un dispositif de détection confocal. Deux techniques seront décrites en détail par la suite comme constituant des modes de réalisation préférés de l'invention. Cependant, d'autres méthodes optiques peuvent également être appliquées au procédé de l'invention, par exemple : une mise au point automatique sur la surface, par auto-collimation ou par traitement d'image ; des méthodes interférométriques et/ou holographiques ; une analyse du front d'onde en réflexion ; etc. La première technique optique de microtopographie qui a été appliquée avec succès à la détection précoce d'amas de particules biologiques sur une surface est la microtopographie confocale chromatique. Cette technique a été mise à point par la société STIL S.A. et est décrite en détail par le document FR 2 738 343. La technique de microtopographie confocale chromatique ù ou imagerie confocale chromatique ù est illustrée sur la figure 3 Une source ponctuelle 300 de lumière blanche (ou, en tous cas, polychromatique), par exemple réalisée à partir d'une source étendue associée à un trou sténopéïque (« pinhole » en anglais), émet un faisceau lumineux 301 qui est focalisé par un objectif 310. Cet objectif 310 présente un chromatisme axial étendu : par conséquent, les différentes composantes spectrales du faisceau 301 sont focalisées en des points focaux respectifs 321, 322, 323 ... espacés le long de l'axe optique de l'objectif. Le faisceau ainsi focalisé en incidence normale est dirigé sur la surface 330 d'un échantillon. La lumière réfléchie par la surface 330 traverse une deuxième fois l'objectif 310, cette fois en se propageant vers la source 300 ; une partie de la lumière réfléchie est extraite par un séparateur de faisceau (« beamsplitter » en anglais) 340 et dirigée vers un trou sténopéïque 350 mobile axialement, disposé -devant un spectrophotomètre 360. On réalise ainsi un filtrage spatial : seuls les rayons lumineux issus d'un point conjugué du le trou sténopéïque 350 peuvent atteindre le spectrophotomètre 360. En raison de la chromaticité axiale de l'objectif 310, ces rayons présentent une longueur d'onde (2) bien définie Xi, qui dépend de la distance H entre l'objectif 310 et la surface réfléchissante 330. De la mesure, réalisée par le spectrophotomètre 360, de la longueur d'onde X il est donc possible de déterminer H. Une représentation topographique de la surface 330 peut donc être obtenue par balayage. Une démonstration expérimentale de l'utilisation de cette technique pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention a été réalisée, en utilisant un milieu de culture gélosé ensemencée et un système optique caractérisé par : - une fréquence d'échantillonnage de 1 kHz ; - une dynamique de distance d'environ 300 pm ; - un spectrophotomètre utilisant comme détecteur une barrette CCD de 1000 pixel, chaque pixel codant une hauteur de 300 nm ; Des méthodes de traitement du signal, par exemple procédés de surpixelisation, permettent d'obtenir une résolution verticale inférieure à 300 nm. De tels procédés, connus, permettent une amélioration de la résolution en combinant le contenu de pixels adjacents. A titre d'exemple on peut utiliser l'appareil Altisurf 500 de la société Altimet. Les résultats expérimentaux sont illustrés sur les figures 4A et 4B, ainsi que 5A ù 5E. Dans ces figures, la nappe tridimensionnelle a été remplacée par une représentation tout à fait équivalente exploitant une échelle de gris (gris foncé pour les faibles altitudes, gris clair ou blanc pour les altitudes plus élevées). io La figure 4A montre une représentation topographique de la surface d'un milieu de culture gélosé ensemencé avec Staphilococcus. epidermidis. On peut noter une distorsion de la surface de plusieurs dizaines de micromètres, sous la forme de stries. La figure 4B montre la même représentation après un prétraitement de soustraction d'une surface de base . La distorsion de surface a disparu, mais on peut distinguer sans difficulté des colonies de bactéries d'environ 2 pm de hauteur, et de diamètre compris entre 10 pm et quelques centaines de pm. Ensuite, ces colonies ont été identifiées automatiquement par calcul de la pente locale et seuillage. La taille de la surface de gélose étudiée dans cet exemple est de 1,2 x 5 mm. La figure 5A montre une représentation topographique de la surface d'un autre milieu de culture gélosé ensemencée avec Escherichia Coli, avant soustraction du fond. La figure 5B montre la surface de fond, mettant en évidence des irrégularités de surface en forme de stries, et la figure 5C la surface après soustraction du fond, sur laquelle sont clairement visibles des colonies bactériennes. Les figures 5D et 5E montrent l'évolution dans le temps (à 0 heure ; 1,3 h ; 2,2 h ; 3 h ; 3,9 h) des profils (unidimensionnels) de deux de ces colonies. On peut voir que les colonies deviennent détectables au bout de 2h environ, et qu'il est possible de suivre leur dynamique de croissance. Dans cette méthode, la représentation de la topographie de la surface du milieu est une représentation tridimensionnelle. Les contours détectés correspondent à des lignes fermées délimitant un volume. En fonction du procédé de détection de contour retenu, ces lignes fermées relient des pixels correspondant soit à une même pente, soit à une même altitude. Chaque volume délimité par un contour peut-être quantifié par un indicateur, ce dernier pouvant comprendre l'intégrale du poids (c'est à dire de la hauteur) des pixels compris dans ledit volume. Lors du calcul de cette intégrale, le poids des pixels peut faire l'objet d'un seuillage. Autrement dit, on ne prend en compte que la valeur des poids dépassant un certain seuil. Ce seuil peut être établi à partir du poids d'un ou d'une pluralité de pixels Il constituant le contour, ou du poids d'un ou d'une pluralité de pixels répartis sur une surface délimitée par le contour. Lorsque le type de microorganisme constituant le volume est connu, cet indicateur permet une estimation de la biomasse. La strioscopie est une méthode optique, connue par elle-même, basée sur les principes de l'optique de Fourier. La figure 6 montre un montage strioscopique permettant la mise en oeuvre d'un deuxième mode de réalisation de l'invention. Une source ponctuelle 600 émet un faisceau divergent 601 de lumière sensiblement monochromatique qui est ensuite focalisé par un objectif 620. Une boîte de Pétri transparente 610 contenant un milieu de culture ensemencé sur la surface 611 duquel se développent des colonies 612 de microorganismes à détecter est disposée immédiatement en aval de l'objectif 620, de manière à être traversée par le faisceau focalisé. Un cache 630 est disposé dans le plan focal de l'objectif 620. Ce cache occulte tous les rayons lumineux qui proviennent de la source, à travers l'objectif et la boîte de Pétri, sans avoir été déviés. Si la surface 611 était parfaitement plane et homogène (et en approximation d'optique géométrique), toute la lumière du faisceau 601 serait interceptée par le cache. En réalité, les irrégularités de la surface 611 û y comprises celles dues aux colonies 612, dévient certains rayons lumineux, qui passent ainsi à côté du cache. Du point de vue de l'optique de Fourier on sait que dans le plan focal de l'objectif se forme une distribution lumineuse correspondant approximativement au spectre de fréquences spatiales de la surface 611 ; le cache réalise ainsi un filtrage spatial passe-haut. En aval du cache est positionné un système imageur (appareil photographique 640) mis au point sur la surface du milieu de culture. L'image acquise par le système imageur contient une information sur la pente locale de la surface 611, et permet donc de reconstituer une nappe tridimensionnelle de ladite surface (qui, de plus, est déjà partiellement filtrée passe-haut, sans besoin de prétraitement). Etant donné que le cache a une dimension finie, seuls les rayons lumineux qui sont déviés d'un angle supérieur ou égal à une valeur seuil sont détectés. Cette valeur seuil est minimisée-lorsque le cache a la taille de la tache de diffraction de la lentille. Si on suppose que la source 600 est réellement ponctuelle (ce qui est toujours une approximation), seules pourront être détectées les pentes locales supérieures à 2J(n-1)d où 2^, est la longueur d'onde de la lumière utilisée, d est le diamètre de la lentille et n l'indice optique du milieu. En effet, une pente locale d'angle a dévie les rayons de l'angle (n-1) a et seules les déviations supérieures à la diffraction peuvent être observées. En pratique, les milieux de culture ont des défauts de surface de quelques milliradians, ce qui impose un cache bien plus grand que cette limite théorique si on veut pouvoir se passer de tout prétraitement. Le diamètre du cache devra être de l'ordre de (n-1) I * Pmax, Pmax étant la pente locale maximale des défauts de surface, et I est la distance entre la lentille et le cache. Une micro-colonie d'épaisseur l pm et de diamètre 30 pm impose à la surface d'onde une pente locale moyenne de (1,35-1)/15= 23 milliradians, très supérieure aux défauts de surface du gel, et est donc facilement visible. Un avantage de la strioscopie sur les techniques de cartographie géométrique, telles que l'imagerie confocale chromatique, est qu'il n'est pas nécessaire d'avoir une résolution latérale meilleure que la dimension des micro-colonies : puisqu'on est en fond noir, on détecte et on localise sans aucune difficulté des objets plus petits que la limite de résolution (mais on ne sépare évidemment pas deux objets plus proches que ladite limite de résolution). Un autre avantage est qu'avec une seule acquisition, le champ observé peut couvrir une région plus étendue qu'avec la technique de microtopographie confocale précédemment décrite. Ainsi, une acquisition d'une image par un procédé de strioscopie permet d'observer partie étendue d'une boite de Pétri, voire la totalité de cette boite. Selon cette méthode, la représentation de la topographie de la surface du milieu est une représentation bidimensionnelle, c'est-à-dire une image, sur laquelle la variation d'intensité entre deux pixels traduit une variation d'altitude de la surface objet éclairée. Les contours détectés correspondent à des lignes fermées délimitant une surface. Ces lignes relient des pixels correspondant à une même variation du niveau de gris. Aussi bien dans le cas de la strioscopie qu'en cartographie de surface, on peut avantageusement mettre en oeuvre toutes les méthodes de traitement d'image et de soustraction d'images consécutives capables de mettre en évidence des modifications dues à la croissance. Une fois la localisation de l'amas réalisé, une identification des bactéries peut-être réalisée par une mesure connue, par exemple par analyse in-situ (diffraction, spectrométrie Raman) ou par d'autres moyens d'analyse, tels que la spectrométrie de masse. Dans ce dernier cas, l'analyse est faite ex-situ et nécessite donc de prélever la colonie de bactéries. La localisation par topographie peut par exemple permettre de sélectionner des amas dont le volume dépasse un certain seuil, les amas sélectionnés faisant ensuite l'objet d'une analyse qualitative L'invention n'est pas limitée à la détection de colonies de microorganismes sur la surface d'un milieu de culture. La surface sur laquelle se trouvent les amas biologiques, et plus généralement les particules biologiques, à détecter peut aussi être un solide, par exemple, un substrat en verre ou silicium fonctionnalisé, ou un filtre microporeux utilisé pour récupérer des bactéries contenues dans un liquide filtré et pouvant par exemple, mais non nécessairement, être placé sur un milieu de culture. Les opérations de prétraitement mises en oeuvre lors de la deuxième étape E2 du procédé seront de préférence adaptées au type de surface considéré. Le milieu ambiant, situé au-dessus de la surface, peut être du vide ou un fluide tel qu'un gaz ou un liquide, le gaz et en particulier l'air étant le mode préféré. Le milieu ambiant peut être confiné, ce qui évite les risques de contamination et, le cas échéant, d'évaporation de la gélose.30 REVENDICATIONS1. Procédé de détection d'amas de particules biologiques (12) sur une surface (11), comportant les étapes consistant à : - a. déterminer (El) une représentation topographique (20) de ladite surface ; b. détecter (E3, E4) sur ladite représentation topographique au moins un contour délimitant une région susceptible de correspondre à un amas de particules biologiques. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel lesdites particules biologiques sont choisies parmi des microorganismes, tels que des bactéries, levures ou champignons, et des cellules végétales ou animales. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel lesdites particules biologiques présentent un diamètre ou une dimension principale inférieure ou égale à 100 pm. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite surface (11) est choisie parmi : l'interface entre un milieu de culture et un milieu environnant, tel que l'air ; la surface d'un substrat fonctionnalisé ou la surface d'une membrane microporeuse. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite étape a. consistant à déterminer une représentation topographique de ladite surface est mise en oeuvre par un procédé optique effectué sans contact et sans préparation de l'échantillon. 6. Procédé selon la revendication 5 dans lequel ladite étape a. consistant à déterminer une représentation topographique de ladite surface est mise en oeuvre par microtopographie confocale chromatique. 7. Procédé selon la revendication 5 dans lequel ladite étape a. consistant à déterminer une représentation topographique de ladite surface est mise en oeuvre par strioscopie. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ladite étape b. consistant à détecter au moins un contour est mise en oeuvre par mesure de la pente locale de ladite représentation topographique de la surface, avec seuillage. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes comportant également une opération de prétraitement (E2) de ladite représentation topographique comportant la détection et la soustraction d'une surface de référence. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes comportant la répétition des étapes a. et b. à des temps successifs, et la sélection des seules régions identifiées aux étapes b. dont la forme ou la taille évolue dans le temps. 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, 10 comportant une étape supplémentaire c. consistant à évaluer la quantité de particules biologiques présentes dans l'amas. 12. Procédé selon l'une des revendications 2 à 11, qui comprend une étape supplémentaire d'identification, in situ ou ex situ, des microorganismes disposés en amas. 15 20