Brevet FR2952935A1 — publié le 20110527

PROCEDE DE PREPARATION DU N-BIOTINYL-6-AMINOCAPROATE DE N-SUCCINIMIDYLE La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de préparation du réactif de biotinylation N-biotinyl-6-aminocaproate de N-succinimidyle, ainsi qu'à un procédé de préparation de polysaccharides biotinylés mettant en oeuvre un tel réactif. Le N-biotinyl-6-aminocaproate de N-succinimidyle est un réactif de biotinylation 10 disponible commercialement, utilisé notamment pour le greffage du groupe biotine sur des molécules d'ADN ou des glycoprotéines. Compte tenu des coûts de main d'oeuvre et des matières premières, et pour une obtention du N-biotinyl-6-aminocaproate de N-succinimidyle à l'échelle industrielle, 15 il est nécessaire d'envisager une synthèse robuste, adaptée à la production du composé souhaité en grandes quantités et permettant d'obtenir ce dernier sous forme suffisamment pure, c'est-à-dire sans formation de sous-produits indésirables. Les Inventeurs ont maintenant trouvé une voie d'accès au N-biotinyl-6-aminocaproate de N-succinimidyle en deux étapes principales à partir de la biotine, qui satisfait aux 20 besoins sus-mentionnés. Le procédé selon l'invention comprend les étapes représentées ci-dessous dans le schéma 1, dans lequel R représente un groupe alkyle ou aryle et X et X', identiques ou différents l'un de l'autre, représentent des atomes d'halogène. 25 Dans le schéma 1, les composés de départ, intermédiaires et final sont les suivants : - composé (I) : N-biotinyl-6-aminocaproate de N-succinimidyle, composé (II) : acide N-biotinyl-6-aminocaproïque, 30 composé (II') : carboxylate de N-biotinyl-6-aminocaproate, composé (III) : biotine, composé (III') : biotinate de cyanométhyle. Schéma 1 : XCH2CN H2N-(CH2)5 COOH OCOOR O ONO OH Selon la présente invention, et sauf mention différente dans le texte, on entend par: - « alkyle » : un groupe aliphatique hydrocarboné saturé ou insaturé, linéaire ou 10 ramifié, comprenant par exemple de 1 à 6 atomes de carbone, avantageusement de 1 à 4 atomes de carbone, - « aryle » : un groupe aromatique cyclique, par exemple un groupe phényle, et - « halogène » : un atome de fluor, chlore, brome ou iode. 15 L'invention a ainsi pour objet un procédé de préparation du composé (I), caractérisé en ce qu'il comprend une étape de couplage du composé (II') avec le N-hydroxysuccinimide. Ce couplage est avantageusement réalisé à une température inférieure à 0°C, par exemple à environ -5°C. (I)5 Selon l'invention, le composé (II') est obtenu en traitant le composé (Il) par un halogénoformiate d'alkyle ou d'aryle (X'COOR, où R représente un groupe alkyle ou aryle et X un atome d'halogène) en présence d'une base faible de type amine tertiaire, dans un solvant polaire et aprotique, par exemple le DMF (diméthylformamide), le DMSO (diméthylsulfoxyde) ou la NMP (N-méthylpyrrolidone). Cette réaction permet d'activer, sous forme d'anhydride mixte, la fonction acide du composé (Il). Elle est avantageusement réalisée à une température inférieure à 0°C, par exemple à environ -5°C. Pour l'obtention du composé (II'), on utilise avantageusement le chloroformiate d'éthyle (CICOOEt). La réaction est avantageusement réalisée en présence de triéthylamine (NEt3) en tant que base faible de type amine tertiaire, et dans un solvant tel que le DMF. Selon l'invention, le composé (II) est obtenu par une étape de couplage entre le composé (III') et l'acide aminocaproïque (H2N-(CH2)5-COOH). Lors de cette étape, on utilise avantageusement un solvant polaire, par exemple le DMF, le DMSO ou la NMP. La réaction est avantageusement effectuée à chaud, à environ 100°C. 20 Quant au composé (III'), il est obtenu en traitant le composé (III) par un halogénoacétonitrile (X-CH2CN, où X représente un atome d'halogène), en présence d'une base faible de type amine tertiaire, dans un solvant polaire et aprotique, par exemple le DMF, le DMSO ou la NMP. Cette réaction permet d'activer, sous forme 25 d'ester, la fonction acide du composé (III). La réaction est avantageusement effectuée à chaud, à environ 60°C. Pour l'obtention du composé (III'), on utilise de préférence le chloroacétonitrile (CICH2CN). La réaction est avantageusement réalisée en présence de triéthylamine en 30 tant que base faible de type amine tertiaire, et dans un solvant tel que la NMP. Selon le procédé de la présente invention, les intermédiaires de synthèse (II') et (III') ne sont pas isolés ; aussi la réaction de préparation du composé (I) présentée selon le schéma 1 consiste en une réaction en deux étapes à partir de la biotine. 35 De façon particulièrement avantageuse, le procédé selon l'invention permet d'accéder facilement au composé (II) en une étape à partir de la biotine et de l'acide aminocaproïque, avec un rendement élevé (supérieur à 80%) et aboutissant à un produit d'une excellente pureté. De façon surprenante, d'autres voies d'accès au composé (Il) qui auraient pu être envisagées, inspirées des techniques de couplage issues de la synthèse peptidique, se sont révélées inefficaces ou inadaptées à la production industrielle. En particulier, les Inventeurs ont montré que la voie au chlorure d'acide, qui consiste à transformer la biotine (III) en chlorure d'acide (par exemple D.E. Wolf et al. dans J. Am. Chem. Soc., année 1951, 73, p. 4142-4144 et année 1952, 74, p. 2002-2003), puis à la faire réagir avec l'acide aminocaproïque en milieu basique, ne permet pas un rendement satisfaisant, du fait de l'insolubilité de la biotine. Par ailleurs, cette voie implique l'utilisation de chlorure de thionyle en très large excès : la toxicité de ce solvant cause des problèmes d'hygiène industrielle. Quant à la voie au dicyclohexylcarbodiimide (DCC), qui consiste à activer in situ la biotine avant son couplage avec l'acide aminocaproïque (voir par exemple C. Somlai et al. dans Zeit. Naturforsch., 1993, 48, p. 511-516), elle s'est révélée inefficace de par la réactivité insuffisante entre la biotine activée et l'acide aminocaproïque. En outre, l'utilisation du DCC avec l'acide aminocaproïque génère du DCU (dicyclohexylurée), sous-produit très difficilement éliminable en fin de réaction (DCU inséparable du composé (Il')). Enfin, la voie aux anhydrides mixtes (activation de la fonction acide de la biotine par la formation d'un anhydride très réactif, qui réagit ensuite avec l'acide aminocaproïque) permet d'obtenir le composé désiré (II), mais présente plusieurs inconvénients qui la rende inadaptée pour l'échelle industrielle : en effet, quelles que soient les conditions utilisées, il reste toujours de la biotine en fin de réaction (au moins 2%), il se forme un produit secondaire correspondant à l'addition de 2 acides aminocaproïques sur la biotine, et le milieu se transforme rapidement en gel extrêmement épais. La voie aux esters activés selon la présente invention surmonte donc les inconvénients des autres voies précitées pour l'obtention du composé (Il).35 De façon particulièrement avantageuse, le procédé selon l'invention permet d'accéder au composé (I) en une étape à partir de l'intermédiaire de formule (II) et du N-hydroxysuccinimide, selon la voie de synthèse aux anhydrides mixtes. Cette voie de synthèse permet d'obtenir le composé (I) avec une pureté et un rendement élevés. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de polysaccharides biotinylés, par exemple d'idrabiotaparinux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - préparation du composé (I) selon le procédé défini ci-avant, puis - couplage du composé (I) avec un polysaccharide présentant une fonction réactive envers la fonction ester activé du composé (I). Ladite fonction réactive du polysaccharide est par exemple une fonction amine, auquel cas le couplage avec le composé (I), qui comprend une fonction ester activé, 15 est effectué par une réaction classique de couplage amino/acide. La réaction de couplage entre le composé (I) et le polysaccharide est avantageusement réalisée dans une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium. 20 Les polysaccharides biotinylés dont la préparation est décrite ci-dessus sont par exemple tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 02/24754 et WO 2006/030104. II peut s'agir notamment du pentasaccharide biotinylé connu sous la Dénomination Commune Internationale « idrabiotaparinux » et décrit dans la demande 25 de brevet WO 02/24754, ou des hexadécasaccharides biotinylés décrits dans les exemples 1 et 2 de la demande de brevet WO 2006/030104. Pour préparer ces polysaccharides biotinylés, le composé (I) est couplé, respectivement, avec le pentasaccharide 44 décrit dans la demande de brevet WO 02/24754 ou avec les hexadécasaccharides 42 et 43 décrits dans la demande de 30 brevet WO 2006/030104 : - pentasaccharide 44 : méthyl (2-amino-2-désoxy-3,4-di-O-méthyl-6-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1-÷4) -(acide 2,3-di-O-méthyl-(3-D- glucopyranosyluronique)-(1 -*4)-(2,3,6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1 ù>4)-(acide 2,3-di-O-méthyl-a-L-idopyranosyl-uronique)-(1 -4)-2,3,6-tri-O-sulfonato-a-o-35 glucopyranoside ; - hexadécasaccharide 42 : méthyl (2,3,4,6-tétra-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(13, 6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)-(2,3,6-tri-O-sulfonato- [3-D-glucopyranosyl)-(1ù4)-(2, 3-di-O-méthyl-6-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)-(2,3, 6-tri-O-méthyl-[3-D-glucopyranosyl)-(1 ù*4)-[(2,3,6-tri-O- méthyl-a-D-glucopyranosyl)-(1-34)-O-(2,3,6-tri-O-méthyl- (3-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)]3- (2-amino-2-désoxy-3-O-méthyl-6-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1 ù*4)-(acide 2,3-di-O-méthyl-(3-D-glucopyranosyluronique)-(1-4)-(2,3, 6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1 ù*4)-(acide 2,3-di-O-méthyl-a-L-idopyranosyluronique)- (1->4)-3-0-méthyl-2,6-di-O-sulfonato-a-D-glucopyranoside ; - hexadécasaccharides 43 : méthyl (2,3,4,6-tétra-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù4)-(2,3, 6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)-(2,3, 6-tri-O-sulfonato-R-D-glucopyranosyl)-(1->4)-(2, 3-di-O-méthyl-6-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)-(2,3, 6-tri-O-méthyl-(3-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)-[(2,3, 6-tri-O-méthyl-a-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)-O-(2,3,6-tri-O-méthyl- [3-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)]3- (2-amino-2-désoxy-3-O-méthyl-6-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù*4)- (acide 2,3-di-O-méthyl-j3-D-glucopyranosyluronique)-(1 ù*4)-(2,3,6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù*4)-(acide 2,3-di-O-méthyl-a-L-idopyranosyluronique)- (1ù 4)-2,3,6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranoside. L'invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent, qui détaillent un procédé de préparation du composé (I) conformément à l'invention. Dans ces exemples, on utilise les abréviations suivantes : Ac : acétyle ; CPL : Chromatographie en Phase Liquide ; DMF: diméthylformamide ; min: minutes ; MTBE : méthyl-tertbutyl-éther; NMP: N-méthylpyrrolidone ; éq : équivalents molaires ; Et : éthyle ; T : température ; THF : tétrahydrofurane ; tr : temps de rétention ; UO : unités opératoires, V : volume. Exemple 1 : Préparation du composé (I) Le suivi des réactions se fait par CPL avec les conditions suivantes : colonne Symmetry C18 150 x 4.6 mm 5p (Waters) ; éluant A : tampon KH2PO4 0.01 M ajusté pH = 3 ; éluant B : acétonitrile ; débit 1 mL/min ; gradient : t = 0 min A/B 85/15, t = 9 min NB 65/35, t = 10 min NB 85/15, t = 15 min A/B 85/15. Cette méthode permet de visualiser la biotine (composé (III), tr = 4.5 min), l'ester activé intermédiaire (III') (tr = 8.4 min), l'acide N-biotinyl-6-aminocaproïque (composé (Il), tr = 5.5 à 5.6 min), l'anhydride mixte intermédiaire (Il') (tr = 11.2 min) et le N-biotinyl-6-aminocaproate de N-succinimidyle (composé (I), tr = 7.9 à 8.2 min). 1.1 : Préparation du composé (II) Dans un réacteur, on charge 7.5 kg de biotine (III), de la triéthylamine (15 L, 2 V, 3.5 éq) , de la NMP (15 L, 2 V), et enfin le chloroacétonitrile (3.5 kg, 0.47 UO, 1.5 éq). Le milieu est chauffé à 60°C. Après 2h de maintien à cette température, une analyse CPL montre que toute la biotine a été transformée en composé (III') ( On coule ensuite lentement cette suspension sur un mélange d'éthanol (120 L) et MTBE (60 L) préalablement refroidi à environ 4°C, ce qui permet de faire précipiter le pentasaccharide biotinylé. On filtre ensuite la suspension ainsi obtenue et on la rince successivement avec de l'éthanol absolu et de l'acétone. On sèche le précipité à l'étuve sous vide jusqu'à poids constant. On obtient ainsi 1.60 kg d'idrabiotaparinux brut (contenant des sels) sous la forme d'une poudre crème, avec une pureté organique de 99%, avec un rendement de 109% par rapport au pentasaccharide 44 et un rendement chimique de 70% sur les 3 dernières étapes. 5 REVENDICATIONS, 1. Procédé de préparation du N-biotinyl-6-aminocaproate de N-succinimidyle, répondant à la formule (I) et comprenant une fonction ester activé : o (1) caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'activation, sous forme d'anhydride mixte, de la fonction acide du composé (Il) : 10 o o OH de façon à obtenir le composé (II'), dans lequel R représente un groupe alkyle ou aryle : o suivie du couplage du composé (Il') avec le N-hydroxysuccinimide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation de la 20 fonction acide du composé (Il) est réalisée en traitant ledit composé par un halogénoformiate d'alkyle ou d'aryle de formule X'COOR, où R représente un groupe alkyle ou aryle et X' représente un atome d'halogène, en présence d'une base faible de type amine tertiaire, dans un solvant polaire et aprotique. OCOOR 15 25 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledithalogénoformiate de formule X'COOR est le chloroformiate d'éthyle. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite base faible de type amine tertiaire est la triéthylamine. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que ledit solvant polaire et aprotique est choisi parmi le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde ou la N-méthylpyrrolidone. 10 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape d'activation de la fonction acide du composé (II) est réalisée à une température inférieure à 0°C. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce 15 que le composé (II) est obtenu par une étape d'activation, sous forme d'ester, la fonction acide du composé (III) : O 20 de façon à obtenir le composé (III') : suivie du couplage du composé (III') avec l'acide aminocaproïque. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'activation de la fonction acide du composé (III) est réalisée à l'aide d'un halogénoacétonitrile, en présence d'une base faible de type amine tertiaire, dans un solvant polaire et 25aprotique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit halogénoacétonitrile est le chloroacétonitrile. 10. Procédé selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce que ladite base faible de type amine tertiaire est la triéthylamine. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en 10 ce que ledit solvant polaire et aprotique est choisi parmi le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde ou la N-méthylpyrrolidone. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que la réaction d'activation de la fonction acide du composé (III) est réalisée à 15 environ 60°C. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que la réaction de couplage entre le composé (III') et l'acide aminocaproïque est réalisée à environ 100°C. 20 14. Procédé de préparation de polysaccharides biotinylés, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - préparation du composé (I) selon le procédé défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 13, puis 25 - couplage du composé (I) avec un polysaccharide présentant une fonction réactive envers la fonction ester activé du composé (I). 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite fonction réactive du polysaccharide est une fonction amine. 30 16. Procédé selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisé en ce qu'il consiste en la préparation d'idrabiotaparinux et qu'il comprend les étapes suivantes : - préparation du composé (I) selon le procédé défini dans l'une quelconque des 35 revendications 1 à 13, puis 11- couplage du composé (I) avec le sel de sodium du pentasaccharide méthyl (2-amino-2-désoxy-3,4-di-O-méthyl-6-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù>4) -(acide 2,3-di-O-méthyl-R-D-glucopyranosyluronique)-(1 -*4)-(2,3,6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1ù>4)-(acide 2,3-di-O-méthyl-a-L-idopyranosyl-uronique)-(1-*4)- 2,3,6-tri-O-sulfonato-a-D-glucopyranoside.