Brevet FR2957354A1 — publié le 20110916

Traitement des végétaux contre l'infection par des oomycètes L'invention concerne un micro-organisme utile pour le traitement des végétaux contre l'infection causée par des oomycètes phytopathogènes. L'invention a pour but d'utiliser d'autres sources de traitements que ceux habituellement utilisés tels que des traitements chimique ou génétique. Les oomycètes représentent un phylum de protistes filamenteux comprenant environ 500 espèces. Ce sont des organismes aquatiques non photosynthétiques qui, bien que ressemblant aux champignons, en sont éloignés. Des études moléculaires récentes ont permis de mieux les classer dans le taxon des Straménopiles. Ils sont caractérisés par l'existence, au cours de leur cycle, d'une cellule biflagellée. Les oomycètes vivent dans l'eau, sur des déchets organiques et des cadavres des petits animaux. Certaines espèces vivent dans le sol en saprophytes sur les débris organiques. Plusieurs espèces sont des pathogènes majeurs de plantes. Parmi les oomycètes phytopathogènes, on connait le genre Pythium qui comprend de nombreuses espèces parasites de plantes et quelques autres parasites d'animaux. Le genre Phytophthora est également responsable de maladies chez les végétaux sauvages et cultivés. Plasmopara vit/cola est l'agent du mildiou de la vigne. Par exemple, l'espèce Phytophthora parasitica (P. parasitica) engendre une maladie qui touche les végétaux, en particulier les plantes cultivées telles que la tomate, le piment, l'aubergine, les agrumes, le cacao, le tabac. Plus précisément, l'espèce P. parasitica est responsable chez le tabac de l'apparition du syndrome du « black shank ». Les maladies végétales provoquées par l'infection par des oomycètes se manifestent par des symptômes variés, foliaires ou racinaires (pourriture pied noir, nanisme, taches brunes, puis flétrissement général de la feuille, d'un rameau ou de toute la plante). Les oomycètes se trouvent fréquemment associés à la rhizosphere et peuvent être transmis par le sol. Ainsi, parmi les oomycètes, beaucoup d'entre eux sont donc des micro-organismes phytopathogènes, constituant une contrainte majeure pour l'agriculture mondiale et l'environnement causant des pertes mondiales considérables (de 10 à 60% selon les cultures) en particulier dues à Phytophthora parasitica, sojae et ramorum, Plasmopara haistedii et vit/cola. Pour limiter l'impact des maladies provoquées par les oomycètes des fongicides sont en général utilisés, en particulier le metalaxyl, mais aussi des traitements à base de cuivre, des fongicides de contact (manèbe, mancozèbe, fluazinam, ...), des fongicides pénétrants (cymoxanil), des fongicides diffusants (dimétomorph, propamocarbe) ou des fongicides systémiques (oxadyxil). Le nombre de substances actives disponibles est toutefois réduit ; de plus, non seulement des risques de résistances d'oomycètes apparaissent mais ces produits peuvent potentiellement être nuisibles pour l'environnement. Une autre alternative consiste en la création de variétés végétales résistantes aux maladies, sur la base d'un criblage des ressources génétiques disponibles selon des méthodes classiques ou par voie biotechnologique, comme exposé par exemple dans le brevet US2008 022423. Mais, de la même manière que pour les produits chimiques, les oomycètes ont la capacité de contourner les résistances variétales ; de plus, le temps de développement d'une variété résistante issue de ces programmes d'amélioration génétique s'avère assez long. Des traitements faisant intervenir des micro-organismes comme agents de lutte biologique contre divers champignons phytopathogènes sont également connus ; par exemple, les brevets WO95/20879, WO95/31106, WO03/065811, KR2003/0075092, WO2010/009241 enseignent respectivement l'utilisation de métabolites produits par Trichoderma, d'une souche de Fusarium, de souches de Bac/il/us cereus et subtilis, d'une souche de Paenibacillus, d'une combinaison de Trichoderma et Bacillus amyloliquefasciens, afin de lutter notamment contre Phytophthora. Toutefois les professionnels disposent d'encore peu de méthodes de contrôle biologique des oomycetes malgré le regain d'intérêt pour ces méthodes alternatives. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont cherché une solution alternative aux traitements chimiques sans les inconvénients des autres méthodes citées ci-dessus. Par un procédé tout à fait original d'identification des micro- organismes capables de cohabiter au sein d'un biofilm avec au moins une espèce donnée d'oomycète phytopathogène, les inventeurs ont isolé une souche de micro-organisme particulière qui a pour effet d'empêcher le développement d'une infection par ladite espèce d'oomycète phytopathogène. Plus précisément, les inventeurs ont découvert que cette souche de micro-organisme permettait de contrôler la croissance dudit oomycète phytopathogène. Le contrôle de la croissance s'effectue en inhibant au moins partiellement la croissance de l'oomycète phytopathogène. Les inventeurs se sont en effet intéressés à la flore microbienne présente dans la rhizosphère d'une plante. A la surface d'une plante hôte, l'oomycète forme un biofilm auquel s'associent d'autres micro-organismes provenant notamment de la rhizosphère. Par biofilm on entend une pellicule formée par un regroupement d'oomycètes, lesdits oomycètes générant une matrice protectrice adhésive composée de substances polymères et de substances dites chémo-attractives qui vont attirer les divers micro-organismes provenant de la rhizosphère. Les micro-organismes que l'on retrouve associés dans les biofilms ont été sélectionnés au cours du temps pour leur capacité à cohabiter avec l'oomycète phytopathogène. Ainsi ont probablement été sélectionnés des micro-organismes capables de se développer en utilisant comme seule ressource nutritive celle apportée par l'oomycète phytopathogène ; parmi ces mêmes micro-organismes certains sont éventuellement capables d'inhiber au moins partiellement la croissance de l'oomycète auquel ils sont associés. En mélangeant les micro-organismes de la rhizosphère avec l'oomycète phytopathogène, les inventeurs ont isolé et caractérisé une nouvelle souche de micro-organisme qui inhibe le développement de l'oomycète. Dans un exemple de réalisation de l'invention, l'oomycète phytopathogène est Phytophthora parasitica (P. parasitica). Mais il pourrait s'agir d'une toute autre espèce d'oomycète phytopathogène. L'invention a donc pour objet une souche de champignon filamenteux du genre Phoma déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 25 février 2010 sous le n°CNCM I-4278. Une analyse moléculaire a permis d'établir que cette souche comporte 35 un ARN ribosomal 18S ou ARNr 18S codé par un gène de séquence nucléotidique SEQ I D N°1. Cette séquence nucléotidique SEQ I D N °1 présente 98% d'identité de séquence avec la séquence nucléotidique codant pour l'ARNr 18S de Phoma herbarum. La souche de Phoma précédemment identifiée présente en outre les caractéristiques suivantes : - elle inhibe au moins partiellement la croissance des oomycètes phytopathogènes, - elle inhibe la croissance des oomycètes du genre Phytophthora, - elle inhibe la croissance de Phytophthora parasitica. Dans le même exemple de réalisation de l'invention, les inventeurs ont découvert qu'un surnageant de culture de la souche de Phoma objet de l'invention inhibe la croissance de P. parasitica. Mais il est entendu que ce surnageant pourrait également inhiber au moins partiellement la croissance d'autres espèces d'oomycètes. L'invention a donc également pour objet un surnageant de culture de la souche précédemment décrite, ledit surnageant de culture inhibant au moins partiellement la croissance des oomycètes phytopathogènes. L'invention présente en outre les caractéristiques suivantes : - le surnageant comporte au moins un métabolite de taille inférieure ou égale à une valeur comprise entre 0,18µm et 0,22µm, de préférence inférieure ou égale à 0,2µm. - le surnageant de culture inhibe la croissance de Phytophthora parasitica. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention du 25 surnageant précédemment mentionné, ledit procédé comprenant les étapes suivantes - mise en culture de la souche précédemment décrite, - mise en suspension de la culture obtenue, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape suivante 30 - filtration de la suspension au travers d'un tamis de 0,18µm à 0,22µm, de préférence 0,2µm, - récupérer la solution filtrée. En variante, préalablement à la filtration de la suspension, le procédé d'obtention prévoit de centrifuger la suspension entre 1500g et 6000g 35 pendant 1 à 10 minutes, de préférence à 2000g pendant 2 minutes. L'invention a pour objet également un autre procédé d'obtention du surnageant précédemment mentionné, comprenant les étapes suivantes - mise en culture de la souche précédemment décrite, - mise en suspension de la culture obtenue, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape suivante - centrifuger la suspension entre 1500g et 6000g pendant 1 à 10 minutes, de préférence à 2000g pendant 2 minutes, puis - récupérer le surnageant. La souche précédemment décrite peut être utilisée pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes. Par composition phytosanitaire, on entend une composition comprenant outre la souche de Phoma et/ou un surnageant de culture, comme substance active, des additifs acceptables en agriculture. Dans le même exemple de l'invention non limitatif, l'une des espèces d'oomycètes contre laquelle est active la souche est l'espèce P. parasitica. Mais il pourrait s'agir d'une autre espèce de Phytophthora ou d'une autre espèce d`oomycète. L'invention a donc aussi pour objet une composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend la souche de Phoma précédemment décrite. Le surnageant de culture de la souche de Phoma déposée et identifiée ci-dessus peut également être utilisé pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes phytopathogènes. L'invention a donc aussi pour objet une composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend un surnageant de culture comme précédemment décrit. Notamment, les végétaux susceptibles d'être traités peuvent être une plante de tabac, tomate, pomme de terre, poivron, vigne, tournesol, des arbres fruitiers, ou tout autre type de végétal susceptible d'être infecté par des espèces oomycètes phytopathogènes. L'invention a aussi pour objet une composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend la souche de Phoma précédemment décrite. L'invention a aussi pour objet une composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend un surnageant de culture comme précédemment décrit. L'invention a aussi pour objet une composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend la souche de Phoma précédemment décrite et le surnageant de culture comme précédemment décrit. L'invention a aussi pour objet l'utilisation de la souche de Phoma précédemment décrite pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes phytopathogènes. L'invention a aussi pour objet l'utilisation du surnageant de culture précédemment décrit pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes phytopathogènes. L'invention a enfin pour objet l'utilisation de la souche de Phoma précédemment décrite et du surnageant de culture précédemment décrit pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes phytopathogènes. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit et à l'examen des figures qui l'accompagnent. Celles-ci ne sont présentées qu'à titre indicatif et nullement limitatif de l'invention. Les figures montrent : Figure 1 : Une représentation schématique d'une formation d'une communauté de micro-organismes prélevés à partir d'une rhizosphère d'une plante et d'une micro-colonie de P. parasitica ; Figure 2 : Une représentation schématique d'une formation d'un biofilm à partir d'une colonie de P. parasitica ; Figure 3 : Une représentation schématique d'un procédé de sélection de micro-organismes capables de vivre en présence de P. parasitica ; Figure 4 : Des représentations schématiques d'une co-infection in vitro et in planta de P. parasitica et de micro-organismes capables de vivre en présence de P. parasitica ; Figure 5A : Une photographie au microscope optique d'un milieu de culture comprenant seulement un filtrat comprenant de l'eau et l'espèce P. parasitica ; Figure 5B : Une photographie au microscope optique d'un milieu de culture comprenant P. parasitica et un surnageant de culture de micro-organismes provenant de l'isolat 13 sélectionné pour la capacité des mêmes micro-organismes provenant de l'isolat 13 à survivre en présence de P. parasitica ; Figure 6 : Une photographie d'une feuille de tabac qui été mise au contact de zoospores de P. parasitica seuls (Pp) ou au contact de zoospores de P. parasitica mélangés avec des spores provenant de différents micro-organismes (11 : Penicillium, 12 : Aspergillus et 13 : souche de Phoma), et Figure 7 : Une représentation graphique en pourcentage de l'effet d'un surnageant de culture de micro-organismes sur la germination de zoospores de P. parasitica (13) et de l'effet d'un autre filtrat contenant de l'eau sur la croissance de Phytophthora parasitica (C), lesdits micro-organismes provenant d'un isolat 13 sélectionné pour la capacité des micro-organismes contenus dans cet isolat à survivre en présence de P. parasitica. 1 û Matériels et méthodes 1.1. Constitution de la communauté (Figure 1) Une plante de tabac âgée de 5 semaines a été mise en culture dans un terreau vendu dans le commerce et cultivée à 24°C dans un phytotron, avec une photopériode de 16 heures et une intensité lumineuse de 100pEm-2sec-1. Après 5 semaines de croissance, des échantillons de sols ont été prélevés à partir de la rhizosphère de cette même plante. Ces échantillons ont été mixés avec de l'eau stérile (1/5, W/V). La flore microbienne rhizosphérique (taille des microorganismes 1.4. Identification des micro-organismes ayant un impact sur la croissance de P. parasitica et sur la maladie de la plante. (figures 4, 5A, 5B, 10 6, 7) Cette identification a été réalisée d'une part, in vitro (figures 4, 5A, 5B, 7) en confrontant les micro-organismes représentatifs de chacun des isolats obtenus précédemment et deux souches de P. parasitica, et d'autre part aussi in planta (figure 4, 6) au moyen de co-infections. 15 Pour les confrontations in vitro, les souches de P. parasitica et les micro-organismes représentatifs de chaque isolat précédemment obtenu ont été mis en culture sur de l'agar V8. Puis les disques mycéliens obtenus (5mm de diamètre) ont été transférés dans une nouvelle boîte de Petri contentant de l'agar V8 et ont été placés sur la partie droite pour P. parasitica 20 et sur la partie de gauche pour l'isolat. La zone d'inhibition que l'on voit autour du disque de l'isolat a été utilisée pour mesurer l'activité anti-P. parasitica. L'effet des micro-organismes provenant de chacun des isolats 11, 12 et 13 sur la germination de P. parasitica a aussi été testé, sur lames de 25 microscopie. Une suspension de zoospores (10 µL) de P. parasitica (4.105 cellules/mL) a été mélangée avec un volume égal de milieu V8 et d'eau préalablement incubée avec chaque isolat testé, puis filtrée. L'eau ainsi conditionnée est préparée en incubant des disques mycéliens dans de l'eau stérile (1 mL) pendant une heure à 25°C. Après une centrifugation à 2000g 30 pendant 2 minutes, le surnageant a été filtré au travers d'un filtre de porosité 0,2 lm pour éliminer les débris et le matériel cellulaire résiduels. La centrifugation peut également être réalisée à une valeur s'étendant dans une fourchette de valeurs allant de 1500g à 6000g et de 1 minute à 10 minutes. De préférence, la centrifugation s'effectue à 2000g pendant 2 minutes. Le surnageant peut être filtré ou non filtré. Il est généralement filtré après la centrifugation pour se débarrasser des débris cellulaires qui auraient pu se mêler au surnageant au moment de son prélèvement. La suspension obtenue après incubation des disques mycéliens dans de l'eau stérile pendant 1 heure peut également ne pas subir de centrifugation et être directement filtrée avec le filtre de porosité de 0,2µm. Le filtre peut présenter une porosité d'une valeur qui peut aussi varier dans une fourchette de valeurs s'étendant de 0,18µm à 0,22µm. de préférence, le filtre présente une porosité de 0,2µm. Les figures 5A et 5B illustrent une expérience réalisée avec le micro- organisme représentatif de l'isolat 13. Le pourcentage de germination a été déterminé après une incubation de deux heures des zoospores en présence du surnageant filtré provenant de l'isolat 13 à 25°C, figure 7. Pour l'analyse et le screening in planta (figure 6), la co-infection a été réalisée dans le tissu parenchymateux, une suspension de 100 µL contenant 500 zoospores de P. parasitica et 500 spores du micro-organisme représentatif de chaque isolat est infiltrée dans la partie droite des feuilles de tabac âgées de 4 à 6 semaines. Notamment, sur la figure 6 est illustré l'effet du micro-organisme représentatif de chacun des trois isolats 11, 12, 13 sur la feuille. Les aires montrant les symptômes typiques d'invasion par Phytophthora ont été mesurées 2 jours après la co-inoculation. Pour évaluer l'impact des micro-organismes représentatifs de chacun des isolats sur la progression de l'infection, ces aires ont été comparées à celles mesurées à la partie gauche de la feuille qui a été inoculée avec 500 zoospores de P. parasitica seul. Il faut noter qu'aucun micro -organisme présents dans chacun des isolats ne provoque le développement de symptômes sur la plante lorsqu'ils sont inoculés seuls sans zoospores de P. parasitica (pendant 7 jours), ni de manifestation de phytotoxicité. 1.5. Identification de lARNr 18S des micro-organismes de chacun des isolats Il, 12 et 13. 1.5.1. Amplification par PCR des ARNr 18S L'ARNr 18S des micro-organismes correspondant à chacun des isolats 11, 12 et 13 a été amplifié par la technique de PCR. Pour ce faire, il a été utilisé, comme précédemment décrit, une amorce sens de séquence nucléotidique SEQ ID N°2 et une amorce anti-sens de séquence nucléotidique SEQ I D N°3. 1.5.2. Identification des micro-organismes Les amplifiats correspondant aux ARNr 18S ont été clonés dans le vecteur pGEMT-easy (Promega), séquencés et comparées aux séquences déjà répertoriées dans les banques de données à l'aide du programme blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.gate1.inist.fr/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLA 10 ST PROGRAMS=megaBlast&PAGE TYPE=BlastSearch&SHOW DEFAUL TS=on&LINK LOC=blasthome) 2 û Résultats Après analyse des séquences nucléotidiques d'ARNr 18S amplifiées, 15 le micro-organisme présent dans l'isolat 11 a été identifié comme un Penicillium. Le micro-organisme présent dans l'isolat 12 est un Aspergillus. Le micro-organisme présent dans l'isolat 13 est un Phoma. La figure 5B montre l'absence de filaments mycéliens produits par P. parasitica en présence du surnageant de culture filtré de micro-organismes 20 représentatifs de l'isolat 13. Ainsi, les inventeurs ont constaté que le surnageant de culture filtré issu de l'isolat 13 inhibe la croissance de P. parasitica. D'après l'aspect de la feuille de tabac obtenue après co-infection (figure 6), les inventeurs ont constaté également que, à l'endroit où ont été 25 inoculés les spores des isolats 11 et 12 mélangés à P. parasitica et P. parasitica seul, les symptômes de la maladie causée par P. parasitica apparaissent. Seul l'endroit où ont été inoculées les spores de l'isolat 13 avec P. parasitica ne présente pas ces mêmes symptômes. Par cette expérience, les inventeurs ont confirmé que le micro-organisme présent dans l'isolat 13 30 présente une activité inhibitrice sur la croissance de P. parasitica dans la plante. Du fait de cette activité inhibitrice potentiellement intéressante pour la lutte biologique contre l'infection des végétaux par P. parasitica, le micro-organisme présent dans l'isolat 13 a été identifié. Une étude morphologique 35 au microscope montre qu'il s'agit d'un champignon filamenteux dont les spores sont de couleur brune- marron. La séquence nucléotidique codant pour l'ARNr 18S de ce micro-organisme ou SEQ ID N°1 présente 98% d identité de séquence avec une séquence nucléotidique codant l'ARNr 18S de la souche Phoma herbarum. Des résultats exposés il découle que cette nouvelle souche de Phoma présente dans cet isolat 13 et/ou le surnageant de culture de cette même souche peuvent donc servir de base pour l'élaboration d'une composition phytosanitaire en vue de traiter des végétaux infectés ou susceptibles de l'être par au moins un oomycète phytopathogène.10 Références J.W. Costerton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg, Science 21, 1318-1322 (1999). T. Danhorn, C. Fuqua, Annu Rev. Microbiol. (2007). A. D. Kent, E. W. Triplett, Annu. Rev. Microbiol. 56, 211-236 (2002). B. Stecher, W. D. Hardt, Trends Microbiol. 16, 107-14 (2008). J. Wolinska, K.C. King, Trends Parasitol. 25, 236-244 (2009). E. Galiana, S. Fourré, G. Engler, Environ. Microbiol. 10, 2164-2171 (2008). S. Kamoun, Annu. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006). 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Watanabe, BMC Microbiol. 8, 6 (2008). 1320 REVENDICATIONS1 - Souche de Phoma déposée à la Collection Nationale de Cultures de micro-organismes de l'Institut Pasteur le 25 février 2010 sous le n°CNCM I-4278. 2 ù Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle inhibe au moins partiellement la croissance des oomycètes phytopathogènes. 3 ù Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle inhibe la croissance des oomycètes du genre Phytophthora. 4 ù Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle inhibe la croissance de Phytophthora parasitica. 5 ù Surnageant de culture de la souche selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit surnageant inhibe au moins partiellement la croissance des oomycètes phytopathogènes. 6 ù Surnageant selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un métabolite de taille inférieure ou égale à une valeur comprise entre 0,18µm et 0,22µm, de préférence inférieure ou égale à 0,2µm. 7 - Surnageant selon l'une des revendications 5 à 6, caractérisé en ce que le surnageant de culture inhibe la croissance de Phytophthora parasitica. 8 - Procédé d'obtention du surnageant selon l'une des revendications 5 à 7, ledit procédé comprenant les étapes suivantes - mise en culture de la souche selon la revendication 1, - mise en suspension de la culture obtenue dans l'eau, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape suivante - filtration de la suspension au travers d'un tamis de 0,18µm à 0,22µm, de préférence 0,2µm, - récupérer la solution filtrée. 9 ù Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes - préalablement à la filtration de la suspension, centrifuger la suspension entre 1500g et 6000g pendant 1 à 10 minutes, de préférence à 2000g pendant 2 minutes. 10 ù Procédé d'obtention du surnageant selon l'une des revendications 5 à 7, comprenant les étapes suivantes- mise en culture de la souche selon la revendication 1, - mise en suspension dans l'eau de la culture obtenue, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape suivante - centrifuger la suspension entre 1500g et 6000g pendant 1 à 10 minutes, de préférence à 2000g pendant 2 minutes, puis - récupérer le surnageant. 11 ù Composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend la souche de Phoma selon la revendication 1. 12 ù Composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend un surnageant de culture selon l'une des revendications 5 à 7. 13 ù Composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend la composition selon la revendication 11 et la composition selon la revendication 12. 14 ù Utilisation de la souche de Phoma selon la revendication 1 pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes phytopathogènes. 15 - Utilisation d'un surnageant de culture selon l'une des revendications 5 à 7 pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes phytopathogènes. 16 - Utilisation de la souche de Phoma selon la revendication 1 et du surnageant de culture selon l'une des revendications 5 à 7 pour la fabrication d'une composition phytosanitaire destinée à traiter des végétaux contre l'infection par des oomycètes phytopathogènes.25