Brevet FR2957934A1 — publié le 20110930

La présente invention se rapporte à une nouvelle bilirubine oxydase, à son procédé de préparation ainsi qu'à son utilisation notamment pour le dosage de la bilirubine et pour la mise en oeuvre de biopiles enzymatiques utilisant l'oxygène comme combustible. La bilirubine oxydase ou BOD (E.C. 1.3.3.5.) est une enzyme qui catalyse la réaction d'oxydation de la bilirubine en biliverdine : bilirubine + 1/2 02 - biliverdine + H2O La BOD présente quatre sites de liaison à des atomes de cuivre ; ces quatre atomes de cuivre sont nécessaires à la bonne activité de l'enzyme, il a en effet été montré que l'absence d'un cuivre de la protéine CotA de Bacillus subtilis (protéine à activité bilirubine oxydase commercialisée, en tant que BOD, par la Société Genzyme Diagnotics) suffisait à réduire l'activité de l'enzyme (tableau 3 de l'article de Durao et al. dans J Biol Inorg Chem. 2008 Feb;13(2):183-93). La bilirubine est une substance jaune formée dans le sang par la décomposition de l'hémoglobine, il s'agit d'un des principaux pigments produits dans le foie. La BOD présente un intérêt pour diverses applications telles que le dosage de la bilirubine permettant par exemple le diagnostic d'un excès de bilirubine dans le sang ; elle peut encore servir pour la préparation de biopiles enzymatiques où elle va capter les électrons de la cathode en réduisant l'oxygène en eau (voir la représentation schématique de biopile enzymatique où la BOD est fixée dans un polymère redox à la cathode à la Figure 1A) ou comme biocapteur à oxygène. Il existe de nombreuses sources de BOD ; cette enzyme peut être produite à partir de microorganismes tels que ceux du genre Bacillus [Bacillus subtilis dont la CotA présente une activité bilirubine oxydase, voir Sakasegawe et al. 2006 Applied and Environmental Microbiology 72, N°1, 972-975 ; Bacillus licheniformis (US 4,770,997)], ou de mycètes, parmi eux, ceux du genre Penicillium [Penicillium janthinellum (Demande de Brevet EP 0 295 101)], Trachyderma (US 4,600,689), Myrothecium (Tanaka et al. 1982 Agric. Biol. Chem. 46, 2499-2503) ou encore Schizophyllum, Coprinus, Trametes, Coriolus, Pholiota, Pleurotus, Lenzites ou Fomitopsis (US 4,677,062). Cette enzyme peut également être extraite de plantes telles que du genre Alfalfa (US 5,624,811), Solanacées, Musacées et Liliacées (EP 0 140 004) ou encore Composées telles que l'artichaut (EP 0 247 846). Parmi ces enzymes, les BOD présentant les propriétés enzymatiques, en particulier, l'activité et la stabilité, les plus avantageuses ont été retenues pour être commercialisées ; il s'agit de la CotA à activité bilirubine oxydase de Bacillus subtilis (elle est vendue en tant que BOD par la Société Genzyme Diagnotics et sera désignée BOD dans ce qui suit) et de la BOD Myrothecium verrucaria (vendue par les Sociétés Sigma-Aldrich et Amano). Les inventeurs ont maintenant identifié une nouvelle BOD produite par Bacillus pumilus qui est plus active et/ou plus stable que les BOD disponibles dans le commerce ; ils ont également mis au point un procédé de préparation de cette nouvelle BOD plus simple et plus rapide que ceux utilisés à ce jour pour les autres BOD connues. Selon un premier objet, l'invention se rapporte à la BOD sauvage de Bacillus pumilus ; en particulier, la BOD selon l'invention présente un pourcentage d'identité d'au moins 80%, et par ordre de préférence croissant au moins 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, par rapport à la BOD sauvage de Bacillus pumilus de SEQ. ID. N°2. La SEQ. ID. N°2 correspond à la BOD sauvage de la souche de Bacillus pumilus SAFRO32. A titre d'exemple, la présente invention se rapporte également aux BOD sauvages d'autres souches de Bacillus pumilus comme par exemple la BOD de la souche ATCC 7061 de SEQ. ID. N°6 qui présente un pourcentage d'identité de 98% avec la BOD de SEQ. ID. N°2 ; la BOD préférée selon l'invention est la BOD sauvage de la souche de Bacillus pumilus SAFRO32 de SEQ. ID. N°2. L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de la BOD sauvage de Bacillus pumilus (SEQ. ID. N°2) comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Le pourcentage d'identité peut être calculé par l'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402). Les programmes BLAST sont mis en oeuvre sur la fenêtre de comparaison constituée de la totalité de la SEQ. ID. N°2 indiquée comme séquence de référence. Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X% d'identité avec une séquence de référence est défini, dans la présente invention, comme un peptide dont la séquence peut inclure jusque 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles dudit peptide de référence, en l'occurrence son activité enzymatique d'oxydation de la bilirubine. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. La nouvelle BOD selon l'invention présente des propriétés améliorées par rapport aux BOD disponibles dans le commerce issues de Myrothecium verrucaria ou de Bacillus subtilis. En particulier, la BOD de Bacillus pumilus présente de meilleures propriétés enzymatiques (activité, efficacité catalytique kcat et affinité du substrat pour l'enzyme KM) de catalyse de l'oxydation de l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline- 6-sulphonique (ABTS) que les BOD de Myrothecium verrucaria ou de Bacillus subtilis. Les propriétés enzymatiques peuvent être déterminées comme décrit dans la partie 4 de l'exemple qui suit. Le tableau I ci-dessous présente l'efficacité catalytique kcat, c'est-à-dire, le nombre de molécules de substrat converties en produit par molécule d'enzyme et par unité de temps, et la constante de Michaelis KM qui représente l'affinité du substrat (ABTS) pour les BOD de B. subtilis et de B. pumilus. Les propriétés enzymatiques des BOD de B. pumilus et de B. subtilis peuvent facilement être comparées car ces deux enzymes présentent des conditions optimales d'utilisation très proches : pH compris entre 3 et 4 et température comprise entre 75 et 80°C. BOD kcat (pour ABTS) KM B. pumilus 391,3 s-t 31,7.tM B. subtilis 322 s"t 124 µM Tableau I : propriétés enzymatiques des BOD de B. pumilus et B. subtilis Les propriétés enzymatiques décrites pour la BOD de M. verrucaria par Kataoka et al. (2005, Protein Expression and Purification, 41, 77-83) à pH 6,5 sont un kcat de 115 s -1 et un KM de 250 µM. Par ailleurs, Sakurai et al. (2008, Biochemical and Biophysical Research communication, 371, 416-419) ont déterminé l'activité spécifique de la BOD de M verrucaria pour l'ABTS qui vaut 106 U/mg, l'activité spécifique de la BOD selon l'invention vaut elle 375 U/mg. En outre, la BOD de B. pumilus présente une très bonne stabilité thermique et de bonnes propriétés enzymatiques d'oxydation de la bilirubine. La présente invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique codant pour la BOD selon l'invention ; de préférence, il s'agit d'une molécule d'acide nucléique de séquence choisie parmi la SEQ. ID. N°1 codant pour la BOD sauvage de Bacillus pumilus SARF032 ou la SEQ. ID. N°5 codant pour la BOD sauvage de Bacillus pumilus ATCC 7061. La molécule d'acide nucléique codant pour la BOD selon l'invention peut être clonée dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide, puis transformée dans un hôte approprié tel qu'une bactérie, une levure ou encore une culture cellulaire. Par vecteur d'expression, on entend un vecteur possédant une région permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique codante entre les signaux indispensables à son expression, notamment, un promoteur (constitutif ou inductible), un site de fixation des ribosomes, un signal de terminaison de transcription et, éventuellement, un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique. La présente invention se rapporte encore à un vecteur d'expression comprenant ladite molécule d'acide nucléique et à une cellule hôte transformée avec ledit vecteur d'expression et exprimant une BOD selon l'invention. L'introduction du vecteur d'expression dans la cellule hôte peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier, par modification de la perméabilité membranaire de la cellule hôte, par exemple en présence d'ions calcium, ou par électroporation. Après culture des cellules hôtes transformées pour exprimer la BOD selon l'invention, lesdites cellules peuvent être récupérées par centrifugation, lysées afin de libérer les enzymes dont ladite BOD selon l'invention. Si Escherichia coli est le micro-organisme hôte, les plasmides qui peuvent être utilisés sont notamment les plasmides pBluescript, pUC 18, pET, pGEX, pGS, pMAL-c2 ou similaires. Selon un procédé préféré de préparation de la BOD selon l'invention, la BOD est exprimée par une bactérie E. col/ transformée avec un vecteur d'expression pET21a codant pour une enzyme accolée à une étiquette 6HIS en position C-terminale. Ce procédé, illustré dans la partie expérimentale qui suit (partie 3), est avantageux par sa rapidité et sa simplicité ; en effet, l'induction de l'expression de la BOD de Bacillus pumilus dans la bactérie E. col/ s'effectue en 4 à 24 heures, alors que la production de la BOD issue de Myrothecium verrucaria nécessite des durées d'induction pouvant atteindre 5 jours (Kataoka et al. Biochemistry. 2005 May 10;44(18):7004-12; Kataoka et al., Biochem Biophys Res Commun. 2008 Jul 4;371(3):416-9; Kataoka et al. K, Protein Expr Purif. 2005 May;41(1):77-83). En outre, l'étiquette 6HIS permet la purification de la BOD de Bacillus pumilus par chromatographie d'affinité sur une résine nickel en une seule étape pour l'obtention d'une enzyme pure ; la petite taille de l'étiquette (6 acides aminés) permet de s'affranchir de son élimination car elle ne perturbe pas significativement l'activité de l'enzyme. A titre de comparaison, la purification des BOD de Myrothecium verrucaria et B. subtilis décrite, respectivement, dans les articles de Kataoka et al. (voir ci-avant) et Durao et al. (J Biol Inorg Chem. 2008 Feb;13(2):183-93), demandent plusieurs étapes de chromatographie. La rapidité et la simplicité de ce procédé représentent donc des avantages 10 considérables par rapport aux procédés de préparation des enzymes commerciales disponibles actuellement. L'homme du métier choisira la cellule hôte en fonction du vecteur d'expression utilisé. De préférence, lorsque le vecteur d'expression pET21a est utilisé, on 15 choisira une cellule hôte exprimant la T7 RNA polymérase telles que les souches d'E. coli BL21 DE3, BL21-SI, BL21 pLys, Novablue(DE3) ou BL21 Star. De préférence, la BOD de Bacillus pumilus selon l'invention est produite dans une souche d'Escherichia coli BL21 Star ; la molécule d'acide nucléique qui la code est obtenue par PCR avec les amorces de SEQ. ID. N°3 et 4 et clonée dans le vecteur 20 pET21 a pour conduire au vecteur transformé pFD1. La BOD ainsi produite est ensuite purifiée, après lyse des bactéries, par chromatographie d'affinité. La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation d'une BOD selon l'invention comprenant les étapes de : a) préparation de cellules hôtes, exprimant la BOD selon l'invention ; 25 b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ; c) lyse des cellules hôtes ; d) traitement du lysat obtenu à l'étape c) par chromatographie d'affinité ; e) récupération de ladite BOD purifiée. 30 Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé selon l'invention est tel que : - la souche Escherichia coli BL21 Star transformée avec le vecteur pFD1 est préparée à l'étape a) ; - la culture réalisée à l'étape b) est une culture en phase liquide, sous agitation, en conditions anaérobies d'une durée de 4 à 30h, de préférence 24h, à une température comprise entre 18 et 37°C, de préférence 20°C, au cours de laquelle, l'expression de la BOD est induite par l'ajout d'isopropyl (3-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Lorsque le procédé est mis en oeuvre selon ces conditions préférées, il permet la production de la BOD avec un temps d'induction court, de l'ordre de 24 heures ; la purification de la BOD est réalisée en une seule étape de chromatographie d'affinité et la BOD ainsi produite comporte bien les quatre atomes de cuivre nécessaires à son activité (voir la partie 5 de l'exemple). 10 Il est également possible de produire une BOD en présence d'agents dénaturants comme l'urée, le chlorure de guanidium, le SDS, le triton... ; la BOD ainsi produite sera alors dépourvue de cuivre et pourra être activée par l'ajout d'atomes de cuivre. L'invention se rapporte également à l'utilisation de la BOD de Bacillus 15 pumilus selon l'invention pour doser la bilirubine en solution, c'est-à-dire mesurer la concentration en bilirubine dans un échantillon, notamment un échantillon biologique. Par échantillon biologique, on entend un fluide biologique tel que du sang, du sérum, de la lymphe, de la bile, de l'urine, du liquide céphalo-rachidien, de la sueur... La présence dans l'organisme de bilirubine est normale, elle provient de la dégradation de l'hémoglobine et il se forme environ 200 à 230 mg de bilirubine par jour chez un adulte sain. Chez un individu en bonne santé, la bilirubine est captée par le foie puis dégradée, sa concentration ne doit donc pas dépasser certains seuils et le dosage de la bilirubine est utile pour détecter des pathologies telles que : - les cas d'hémolyse importante : anémies hémolytiques congénitales ou acquises, hémolyses médicamenteuses, toxiques ou infectieuses, accident transfusionnel... ; - les captations ou conjugaisons hépatiques insuffisantes : Maladie de Gilbert, Maladie de Criggler Najajr, prise de Rifampicine (antibiotique antituberculeux) ; - les affections hépatiques et biliaires : les différents types d'hépatite 30 (virale, toxique, médicamenteuse), les différents types de cirrhose, les anomalies métaboliques rares (maladie de Rotor, de Dubin Johnson) ; - les affections biliaires ; - la lithiase biliaire ; - les pancréatites ; 20 25 - le cancer du pancréas ou des voies biliaires. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation de la BOD selon la présente invention pour mesurer la concentration en bilirubine dans un échantillon liquide, en particulier, un échantillon biologique. Selon une première variante, le principe du dosage de la bilirubine avec la BOD repose sur la mesure du changement de couleur de l'échantillon provoqué par la dégradation de la bilirubine. La bilirubine présente un pic d'absorption (%,max) de la lumière à 440 nm ; lorsqu'elle est dégradée enzymatiquement par une BOD, l'absorbance à de l'échantillon dans lequel elle est présente diminue ; cette diminution permet de quantifier la bilirubine initialement présente dans l'échantillon par comparaison avec la diminution d'absorbance à 440 nm de solutions étalons contenant des teneurs connues en bilirubine mesurées dans les mêmes conditions expérimentales. La présente invention se rapporte également à un kit de dosage de bilirubine en solution caractérisé en ce qu'il comprend une BOD selon l'invention. Typiquement, le kit de dosage contient également les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre du test de dosage de la bilirubine, en particulier : - les tampons ; - les solutions standards de bilirubine permettant la réalisation de courbes d'étalonnage, et - les instructions d'utilisation nécessaires pour effectuer le dosage. La présente invention se rapporte encore à un procédé de dosage de la bilirubine en solution dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mesure de l'absorbance à = 440 nm dudit échantillon liquide avant réaction enzymatique ; b) introduction dans ledit échantillon liquide d'une BOD selon l'invention ; c) mesure l'absorbance à 2,,,,ax = 440 nm dudit échantillon liquide après réaction enzymatique ; d) calcul de la différence d'absorbances mesurées aux étapes a) et c) et comparaison de cette différence avec des différences d'absorbances mesurées pour des solutions standards ayant une teneur en bilirubine connue ; e) détermination de la concentration initiale en bilirubine dudit échantillon liquide. Selon une autre variante, le dosage de la bilirubine dans un échantillon liquide est réalisé par une méthode électrochimique qui met en oeuvre une électrode incluant la BOD selon l'invention. Ainsi, la présente invention se rapporte également à des électrodes à BOD comprenant un matériau conducteur tel qu'un métal conducteur, notamment, du platine, du cuivre, de l'argent, de l'aluminium, de l'or ou de l'acier ou du carbone, comme du carbone vitreux, des fibres de carbone, des fibres de nanotubes de carbone ou encore en diamant... ledit matériau conducteur est recouvert d'un dépôt comprenant au moins une BOD selon l'invention ; ledit dépôt pouvant en outre comprendre un polymère redox pour améliorer la conduction électrique entre l'enzyme et l'électrode ainsi que la stabilité du système. Le polymère redox peut être par exemple choisi parmi les polymères à base de ferrocène, d'osmium et de ruthénium et les polymères conducteurs tels que par exemple le polypyrrole et la polyananilline. Les méthodes d'immobilisation de la BOD sur ledit matériau conducteur peuvent être choisies parmi les méthodes classiques à la disposition de l'homme du métier qui comprennent notamment l'inclusion de la BOD dans une matrice polymérique, l'adsorption de la BOD à la surface de la membrane polymérique, la fixation par liaison covalente, l'électrodéposition (Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, N°5, 810-813) ou encore la technique décrite dans la Demande de Brevet américain US 2009/0053582. Selon une variante de réalisation, l'électrode à BOD sur laquelle est immobilisée la BOD est également recouverte d'une membrane qui évite le détachement de ladite enzyme de l'électrode. Selon les applications envisagées, ladite membrane peut être constituée de nafion, de cellulose ou de tout matériau biocompatible, c'est-à-dire compatible avec un environnement physiologique. La présente invention se rapporte ainsi également à un biocapteur de bilirubine constitué d'une électrode à BOD selon l'invention. De façon générale, un biocapteur consiste en une électrode sur laquelle est immobilisé un biorécepteur capable de reconnaître une cible biologique ; la fixation de la cible biologique sur le biorécepteur conduit à des modifications physico-chimiques de la membrane et la production d'un signal électrique par un transducteur électrochimique (ampérométrique, potentiométrique, conductimétrique,...) accolé à l'électrode. Dans le cas présent, le biorécepteur est une BOD selon l'invention et la cible biologique est la bilirubine. La présente invention se rapporte encore à un procédé de dosage de la bilirubine en solution dans un échantillon liquide avec un biocapteur de bilirubine selon l'invention. Selon une variante d'utilisation du biocapteur de bilirubine, ce dernier est implanté sous la peau d'un individu et permet d'enregistrer la concentration en bilirubine du sang dudit individu. La présente invention se rapporte aussi à un capteur à oxygène constitué d'une électrode selon l'invention. L'électrode à BOD selon l'invention peut encore être avantageusement utilisée à titre de cathode dans une biopile enzymatique ; la Figure lA représente schématiquement le principe de fonctionnement d'une biopile enzymatique. Les biopiles enzymatiques selon l'invention sont des dispositifs comprenant une électrode à BOD à titre de cathode et une anode où une réaction d'oxydation d'un substrat se produit (catalysée par l'« enzyme X ») ; à titre d'illustration, le substrat peut être du glucose et l'« enzyme X » la glucose oxydase, une telle pile présente un intérêt particulier lorsque la biopile est implantée chez un individu pour une application médicale ; le substrat peut aussi être choisi, par exemple, parmi des nitrites, nitrates, sulfures, urates, ascorbates, glutamates, pyruvates, lactates, de la cellulose... si une application en dépollution est envisagée, le choix de l'enzyme se fera alors en fonction du substrat à dégrader, à titre d'exemple, les enzyme suivantes peuvent être utilisées, le type de substrat qu'elles peuvent dégrader est mentionné entre parenthèse : la glucose oxydase (glucose ou tous sucres étant oxydés par cette enzyme), la lactate oxydase (lactate), la pyruvate oxydase (pyruvate), l'alcool oxydase (alcool), la cholestérol oxydase (cholestérol), la glutamate oxydase (glutamate), la pyranose oxydase (pyranose), la choline oxydase (choline), la cellobiose déshydrogénase (cellobiose), la glucose déshydrogénase (glucose), la pyranose déshydrogénase (pyranose), la fructose déshydrogénase (fructose), l'aldéhyde oxydase (aldéhyde), la gluconolactone oxydase (glucunolactone), l'alcool déshydrogénase (alcool), l'ascorbate oxydase (oxygène ou ascorbate) ou encore la sulfure dioxygénase (sulfure). Le procédé d'oxydation et de réduction concomitant aux électrodes de la biopile produit un courant électrique. La Figure 1B illustre plus spécifiquement une biopile enzymatique à glucose ; une telle biopile enzymatique consiste en deux électrodes modifiées par l'immobilisation d'enzymes. Une glucose oxydase (GOx) est fixée sur l'anode (1) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur «I» et une bilirubine oxydase (BOD) est fixée sur la cathode (2) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur « II ». En fonctionnement, à l'anode, les électrons sont transférés du glucose présent dans le fluide physiologique vers la GOx, puis de la GOx au polymère conducteur « 1» et du polymère conducteur « 1» vers l'anode. A la cathode, les électrons sont transférés de la cathode vers le au polymère conducteur « II », puis vers la BOD et enfin de la BOD à l'oxygène présent dans le fluide physiologique. Il est à noter qu'une biopile peut aussi éventuellement fonctionner en modifiant les électrodes avec leurs enzymes respectives et en rajoutant des médiateurs solubles, tels que le ferrocèneméthanol pour l'anode et le ferricyanure de potassium pour la cathode, et en rajoutant le cas échéant une membrane séparant l'anode et la cathode. Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une BOD selon l'invention pour dégrader la bilirubine présente dans un échantillon, notamment un échantillon biologique. En effet, la présence de bilirubine dans un échantillon est susceptible de fausser la détection d'autres substances (comme le glucose ou le cholestérol sanguin) en particulier lorsque ces autres substances sont détectées par une méthode colorimétrique. De façon générale, les BOD selon l'invention trouvent de nombreuses applications industrielles, notamment dans les industries textile et papetière et dans le domaine alimentaire, afin, par exemple, d'améliorer la stabilité et/ou de la qualité d'aliments, telles que des boissons, ou encore d'aliments contenant des huiles végétales par désoxygénatation. Plus spécifiquement, les BOD peuvent être utilisées pour des applications liées à la dépollution, à titre d'exemple, on peut citer la décoloration et la détoxification des eaux usées et la dégradation de xénobiotiques ; comme réactifs de synthèse organiques ; pour la préparation de compositions antimicrobiennes ; pour la fabrication d'articles en bois et de cartons détoxifiés ou encore pour la production de détergent (Morozova et al. Biochemistry (Mosc.) 2007 Oct;72(10):1136-50) et pour la décoloration de colorants utilisés en milieux industriels. La BOD selon l'invention peut également être utilisée pour dimériser l'acide phénolique (Koschorreck, K., et al. 2008. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 79 : 217-224) et présente ainsi un intérêt pour la synthèse de pigments et de colorants utilisés dans des applications textiles et alimentaires (R. Mustafa et al. Food Research International. Volume 38, Issues 8-9, October-November 2005, Pages 995-1000) ; cette réaction de dimérisation peut également être utilisée pour la préparation de composés anti- oxydants, comme par exemple, les dimères d'acide férulique (Garcia-Conesa MT, et al Redox Rep. 1997 Oct-Dec;3(5-6):319-23). La BOD selon l'invention peut encore être utilisée comme réactif dans une composition de teinture d'oxydation des fibres kératiniques, telle qu'une composition de coloration capillaire, comprenant, dans un milieu approprié pour la teinture, au moins une base d'oxydation, une BOD selon l'invention et, optionnellement, un donneur pour ladite BOD (tel qu'un substrat comme la bilirubine). Les différents ingrédients, autres que la BOD, utilisables dans ladite composition sont décrits dans la Demande Internationale WO 99/15138 ; à titre d'exemple, la ou les bases d'oxydation peuvent être choisies parmi les paraphénylènediamines, les bases doubles, les paraaminophénols, les orthoaminophénols et les bases d'oxydation hétérocycliques. La BOD selon l'invention peut avantageusement être utilisée pour le traitement de pâte à papier pour son action sur la dégradation de la lignine et/ou pour produire un papier qui présente une meilleure résistance à l'humidité (voir la Demande Internationale WO 00/68500). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : Figures La Figure lA représente schématiquement le principe de fonctionnement d'une biopile enzymatique ; la Figure 1B représente une biopile enzymatique à glucose. La Figure 2 représente la carte plasmidique du vecteur pFD 1. La Figure 3 est un graphe illustrant l'activité spécifique en U/mg de la BOD de Bacillus pumilus en fonction de la concentration d'ABTS à 37°C. La Figure 4 est la représentation graphique de l'équation de Michaelis-Menten (kss en s-1 en fonction de la concentration en bilirubine non-conjuguée) de la BOD de Bacillus pumilus à 37°C. Les résultats en activité relative de la BOD de Bacillus pumilus sur 30 l'oxydation de dABTS à 37°C en fonction du pH sont représentés sur le graphe de la Figure 5. La Figure 6 présente graphiquement le résultat du test d'activité de la BOD de Bacillus pumilus en fonction du pH sur l'oxydation de la bilirubine à 37°C. Les Figures 7A et 7B sont des graphes représentant la stabilité en fonction du pH de la BOD de Bacillus pumilus sur l'oxydation de l'ATBS à 4°C. La Figure 8 est un histogramme représentant l'oxydation de l'ABTS en activité relative par la BOD de Bacillus pumilus en fonction de la température. Les Figures 9A et 9B représentent graphiquement la stabilité (exprimée en activité spécifique et en activité relative sur l'oxydation de l'ABTS) de la BOD de Bacillus pumilus en fonction du temps d'incubation de l'enzyme à 80°C. Les Figures 10A et 10B représentent graphiquement l'activité (exprimée en activité spécifique et en activité relative sur l'oxydation de l'ABTS) de la BOD de Bacillus pumilus en fonction de la concentration d'urée à 25°C ou 37°C dans un tampon phosphate/citrate 100 mM, pH 3. EXEMPLE 1. Matériels 1.1 Souches bactériennes d'Escherichia coli DH5a : supE44, AIacU169, (b80 IacZDM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1 (Hanahan, 1983). Cette souche est utilisée pour l'amplification de plasmides lors des étapes de construction des vecteurs d'expression protéique. BL21 Star : Fù ompT hsdSB(rBù, mBù) gal dcm rnel3l (DE3) (Invitrogen). Cette souche est utilisée pour la production en erlenmeyers de la BOD de Bacillus pumilus. Cette souche est alors transformée par le plasmide pFD1 qui contient la séquence d'ADN codant pour la BOD de Bacillus pumilus sous la dépendance du promoteur T7 dans le vecteur pET21 a. 1.2 Vecteur pFD1 : Plasmide pET21a contenant la séquence d'acide nucléique SEQ. ID N°1 codant pour la BOD de Bacillus pumilus clonée en phase avec l'étiquette 6xHis en C-terminal. La carte plasmidique du vecteur pFD1 est représentée à la Figure 2. 1.3 Milieu de culture Milieu riche LB : Tryptone 10 g/L Extrait de levure 5 g/L NaCl 5 g/L H2O distillée qsp IL pH non ajusté, autoclavé pendant 50 min à 1 bar. 2. Techniques de génie génétique 2.1 Transformation des bactéries supercompétentes Les bactéries DH5a supercompétentes sont préparées à l'aide de la méthode SEM (Simple and Efficient Method) selon le protocole décrit par Inoue et al. (Inoue et al. 1990. Gene 96:23-28). 2.2 Préparation de l'ADN Un kit de purification d'ADN plasmidique (Quiagen) est utilisé pour les préparations d'ADN en petite et grande quantité. 2.3 Séquençaie de l'ADN double brin L'ADN double brin est séquencé. Les réactions de séquences sont effectuées avec le kit de séquençage BigDye Terminator vl.l ou v3.1. Le réactif contient les 4 ddNTPs avec différents marqueurs fluorescents (BigDyeTerminators), l'AmpliTaq DNA Polymerase, et tous les autres composants nécessaires à la réaction. Les produits d'extension doivent être purifiés avant le passage sur séquenceur ABI 3130x1, pour éliminer les marqueurs non incorporés, sels et autres contaminants. 2.4 Construction du vecteur d'expression de la BOD La PCR est réalisée avec l'ADN polymérase Phusion HF sur l'ADN génomique de la bactérie Bacillus pumilus. Les deux oligodésoxyribonucléotides, complémentaires des extrémités 3' et 5' de la séquence ADN du gène codant la BOD de Bacillus pumilus (SEQ ID N°3 et 4), vont servir d'amorces pour la synthèse de l'ADN. Le produit amplifié ainsi que le plasmide pET21a sont ensuite traités avec les deux enzymes de restrictions BamHl et Xhol dont les séquences de reconnaissance ont été introduites dans les oligonucléotides sens pour BamHl et antisens pour Xhol, respectivement notés SEQ ID N°3 et 4. Les produits de digestion sont purifiés sur gel avec le kit « Nucleospin®» (NucleoSpin® Extract II, Clontech Laboratories, Inc.) et le gène de la BOD est alors ligué dans le plasmide par coincubation avec la T4 DNA Ligase à 37°C sur la nuit. Les plasmides néoformés sont alors sélectionnés et amplifiés par transformation de bactéries DH5a sur boîte contenant de l'ampicilline. Nom de l'amorce Séquence SEQ ID N° B.pumilus_S_BamH1 CATGGATCCATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAG 3 B.pumilus_AS_Xho1 TACCTCGAGAATAATATCCATCGGCCTCATCATGTC 4 Tableau II : Liste des amorces utilisées. 3. Production, purification et caractérisation de l'enzyme bilirubine oxydase de Bacillus pumilus 3.1 Production des enzymes BOD de type sauvage L'enzyme BOD est produite dans la souche E. coli BL21 star par le plasmide recombinant pET21 a portant la séquence codant la BOD sauvage. Une préculture de 50 mL de milieu LB supplémenté en ampicilline (150 mg/L) (LBA) et 0,25 mM CuSO4 est ensemencée par un clone isolé sur boîte LB agar supplémenté en ampicilline (100 mg/L) et laissée sous agitation, à 220 rpm, pendant la nuit à 37°C. Deux litres de milieu LBA contenant 0,25 mM CuSO4 dans un Erlenmeyer de 5L sont alors ensemencés au 1/100eme Celui-ci est incubé à 37°C sous agitation (220 rpm) jusqu'à une D0600nm comprise entre 0,8 et 1 D0600nm /mL. La culture est ensuite induite par 200 µM d'IPTG puis laissée sous agitation (180-220 rpm) à 25°C pendant 4 heures. Les cellules sont alors transférées dans une bouteille Schot stérile de 2L contenant un barreau aimanté de façon à poursuivre pendant 20 heures la culture et l'induction protéique sous agitation en anaérobie pour augmenter l'incorporation de cuivre dans les bactéries. Les cellules récoltées par centrifugation (4000g, 4°C) sont lavées dans l'eau et stockées à -20°C. Il est important de souligner que l'induction de l'expression de cette BOD dans la bactérie E. coli s'effectue en seulement 24 heures ; ceci représente un avantage considérable par rapport aux protocoles d'induction des enzymes commerciales disponibles actuellement. En effet, la production de BOD issues de chez Myrothecium verrucaria peut nécessiter des durées d'induction pouvant atteindre 5 jours. 3.2 Purification des enzymes BOD de type sauvage 3.2.1 Eclatement des cellules et traitement à la DNase I Le culot cellulaire, issu de deux litres de culture, est repris dans 40 mL de tampon Sodium phosphate 50 mM, NaCl 500 mM, Imidazole 20 mM, pH 7,6 et soniqué 10 fois à une puissance de sonication de 40 W pendant 3 minutes par cycle d'une seconde d'ultrasons et d'une seconde d'arrêt. L'échantillon obtenu appelé extrait brut est complémenté par 2 mM final MgCl2 et traité 30 minutes à température ambiante à la DNase I (1 U/mL d'extrait brut). L'extrait brut est ensuite débarrassé des débris cellulaires insolubles par 60 minutes de centrifugation à 20000 g. 3.2.2 Chromatographie d'affinité sur colonne nickel Le surnageant de sonication filtré sur filtre de 0,22 µm et dilué à une D0280nm de 10 est injecté sur une colonne d'affinité HisPrep FF 16/10 (GE Healthcare ), couplée au système AKTA purifier (GE Healthcare®), équilibrée dans un tampon Sodium phosphate 50mM, NaCl 500mM, Imidazole 20mM, pH 7.6. L'élution est réalisée par un gradient de 5% à 30% d'un tampon Sodium phosphate 50mM, NaCl 500mM, Imidazole 1M, pH 7,6 sous un débit de 1 mL/min. Les fractions contenant la protéine BOD sont identifiées par un test d'activité à l'ABTS et sont rassemblées, concentrées et dessalées avec un tampon sodium phosphate 50mM pH 7.6 par centrifugation sur membrane Amicon YM10. A ce stade, la protéine BOD est pure et peut être conservée à -20°C sous forme soluble. Là encore, il peut être souligné, en comparant avec les procédés de purification des BOD disponibles dans le commerce, le net avantage découlant de l'utilisation de cette protéine. En effet, une seule étape de purification est nécessaire pour l'obtention d'une enzyme pure en opposition avec les successions de chromatographie (size exclusion, échangeuse anionique ou cationique, hydrophobe...) indispensables pour les BOD commerciales. 3.2.3 Caractérisation des enzymes BOD de type sauvage 3.2.3.1 Détermination de la masse moléculaire L'analyse de la masse de la protéine entière a été réalisée sur le spectromètre de masse LCQ Deca XP couplé en amont d'une nano-chromatographie liquide équipée d'une colonne de dessalage et de pré-concentration C4 (µ-PrecolumnTM Cartridge ; Acclaim PepMap 300 ; Ointerne 300 µm x 5m ; LC Packings Dionex) et d'une colonne analytique C4 (C4 PepMap 300 ; Ointerne 75 µm x 5 cm ; LC Packings Dionex). Une masse de 61005.91 Da a été obtenue pour la BOD, soit une différence de 130,4 Da par rapport à la masse théorique de la protéine ; la masse théorique est calculée pour la protéine tronquée au niveau de la méthionine en N-terminal, une différence de seulement 0,80 Da est retrouvée ce qui démontre le clivage de cet acide aminé au sein de la bactérie lors du processus de maturation protéique. 3.2.3.2 Mesure de la concentration La concentration en enzyme d'une solution est calculée selon la technique Bradford en utilisant la BSA comme étalon (Bradford, anal. Biochimie. 72:248, 1976). 3.2.3.3 Test enzymatique Les tests enzymatiques sont effectués à l'aide d'un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0,1M citrate/phosphate à 37°C dans un volume de 3 mL en suivant l'oxydation de l'ABTS à 420 nm en fonction du temps (E420nm = 36 mM"1 cm'l). L'activité spécifique de l'enzyme est exprimée en µmoles d'ABTS oxydées par minute et par mg de protéine. La concentration d'ABTS standard utilisée est 1 mM. L'enzyme est diluée de façon à mesurer une pente comprise entre 0,05 et 0,3 D0420nm/min. 4. Techniques d'étude des propriétés enzymatiques de l'enzyme BOD de Bacillus pumilus de type sauvage 4.1 Détermination des constantes cinéti ues k°Q et de Michaelis à l'état stationnaire 4.1.1 le substrat est l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulphonique (ABTS) Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0,1 M citrate/phosphate pH 3. La concentration en ABTS varie dans le test de 0 à 5 mM. Le test est déclenché par l'ajout d'enzyme. Les points expérimentaux sont analysés par régression non linéaire selon le modèle de Michaelis-Menten à l'aide du logiciel Sigma-plot 6.0 selon l'équation ci-dessous: Modèle de Michaelis-Menten : kss = kcat * [S] / (KM + [S]) Résultats : kcat = 391,3 s-1 et KM = 31,7 µM La Figure 3 illustre graphiquement l'activité spécifique en U/mg de la BOD de Bacillus pumilus en fonction de la concentration d'ABTS. A titre de comparaison, la protéine homologue CotA de Bacillus subtilis présente vis-à-vis de l'ABTS dans les mêmes conditions optimales d'activité un kcat de 322 s"1 pour un KM de 124 µM (Martins et al., 2008. J biol Inorg Chem, 13 :183-193). 4.1.2 le substrat est la bilirubine Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon sodium phosphate 50 mM pH 7. La concentration en bilirubine varie dans le test de 0 à 60 .iM. Le test, déclenché par l'ajout d'enzyme, consiste à suivre l'oxydation de la bilirubine à 450 nm par changement colorimétrique (E450nm = 32 mM"lcm 1). Les points expérimentaux sont analysés par régression non linéaire selon le modèle de Michaelis-Menten à l'aide du logiciel Sigma-plot 6.0 selon l'équation ci-dessous: Modèle de Michaelis-Menten : kss = kcat * [S] / (KM + [Si) Résultats keat = 70 s"1 et KM = 22 tM La Figure 4 est la représentation graphique de l'équation de Michaelis-Menten (kss en si en fonction de la concentration en bilirubine non-conjuguée) de la BOD de Bacillus pumilus. .2 Etude en fonction du pH 4.2.1 Activité en fonction du pH 4.2.1.1 ABTS L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 3 à 7 dans un tampon 0,1 M citrate/phosphate en utilisant l'ABTS à 1 mM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotomètre Varian. L'activité est suivie par l'oxydation de l'ABTS aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 420 nm. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats de l'oxydation de l'ABTS en fonction du pH par la BOD de Bacillus pumilus sont représentés en activité relative sur le graphe de la Figure 5. 4.2.1.2 Bilirubine L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 7 à 8,5 dans un tampon Tris- HC1 0,2 M en utilisant la bilirubine non-conjuguée à 30 µM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotomètre Varian. L'activité est suivie par l'oxydation de la bilirubine aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 450 nm (E450nm = 32 mM-1 cm-1). Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. La Figure 6 est un histogramme représentant l'activité de la BOD de Bacillus pumilus sur l'oxydation de la bilirubine en fonction du pH. 4.2.2 Stabilité en fonction du pH La stabilité en fonction du pH de la BOD sauvage est déterminée par dilution de l'enzyme purifiée à homogénéité dans un tampon mixte allant de pH 3 à 9 à température ambiante. Ce tampon mixte est composé de Tris 120 mM, imidazole 30 mM, acide acétique 30 mM, dont la force ionique est ajustée à 190 mM avec du NaCl. Différents prélèvements sont effectués en fonction du temps. L'activité résiduelle est mesurée à 4°C à l'aide d'un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0,1 M citrate/phosphate pH 3 contenant 1 mM ABTS. Les résultats d'activité spécifique et d'activité relative de l'oxydation de 30 l'ATBS en fonction du pH à 4°C sont représentés dans les graphes des Figures 7A et 7B. 17 4.3 Etude en fonction de la température 4.3.1 Activité en fonction de la température L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction de la température est réalisée dans un tampon 0,1 M citrate/phosphate pH 3 en 5 présence de 1 mM d'ABTS. La température varie de 10 à 85°C. Le suivi de l'activité s'effectue sur un spectrophotomètre Varian CARY UV Biomelt régulé en température. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. La Figure 8 est un histogramme représentant l'activité relative de la 10 BOD de Bacillus pumilus en fonction de la température sur l'oxydation de l'ABTS. 4.3.2 Stabilité de l'enzyme en fonction de la température L'enzyme est préincubée à une concentration de 10 mg/ml dans un bain à sec à 80°C. Des prélèvements de 2 µL sont effectués et l'enzyme est diluée dans un tampon Tris-H2SO4 50 mM pH 7,5 de façon à ajuster la concentration en enzyme pour le 15 test d'activité. L'activité résiduelle de l'enzyme incubée à 80°C est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0,1 M citrate/phosphate pH 3 à 37°C, en présence d'l mM d'ABTS. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les Figures 9A et 9B représentent graphiquement la stabilité (exprimée en activité spécifique et en activité relative sur l'oxydation de l'ABTS) de la BOD de 20 Bacillus pumilus en fonction du temps d'incubation de l'enzyme à 80°C. 4.4 Etude de l'activité en fonction de la présence d'urée Le protocole décrit ci-dessus au point 4.1.1 a été reproduit en présence d'une concentration d'urée variant entre 0 et 6 M. Les Figures 10A et 10B représentent graphiquement l'activité (exprimée 25 en activité spécifique et en activité relative sur l'oxydation de l'ABTS) de la BOD de Bacillus pumilus en fonction de la concentration d'urée à 25°C et à 37°C. A 25°C, il est clairement observé un effet activateur de l'urée sur la BOD. Cet effet pourrait être dû à une légère modification conformationelle du site actif de l'enzyme qui serait responsable d'une meilleure efficacité enzymatique ; ce phénomène, 30 connu, a déjà été décrit pour d'autres protéines (voir Hong-Jie Zhang et al. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 238, 382ù386 (1997) et FAN et al. Biochem. J. (1996) 315, 97-102). A 37°C, cet effet n'est pas retrouvé. On peut émettre l'hypothèse selon laquelle l'effet combiné de la température et de l'urée conduit à une trop grande 10 15 modification du site actif, entraînant de ce fait une diminution des performances de l'enzyme. 5. Vérification de la présence des quatre cuivres de la bilirubine oxydase de Bacillus pumilus La détermination de la présence des 4 cuivres s'effectue par un test biquinoline en utilisant une gamme étalon de la concentration en cuivre pour mesurer la concentration molaire en cuivre (Felsenfeld, G. 1960. Arch. Biochem. Biophys., 87, 247-251 ; Griffiths et al. 1961. J. Biol. Chem., 236, 1850-1856) ; les résultats sont présentés dans le Tableau III. Chaque mesure, basée sur un dosage colorimétrique à 546 nm, est réalisée en duplicata. Cette technique permet de montrer la présence de 15,3 µM de cuivre pour un échantillon protéique de BOD à 3,75 µM soit un ratio de 4,08 et confirme bien la présence des quatre ions cuivre associés à l'enzyme. Enfin, pour confirmer la présence des 4 cuivres au sein de la protéine BOD, une analyse élémentaire sur les cuivres de la protéine a été réalisée par absorption atomique. Les résultats ont clairement confirmé la présence de 4 cuivres par protéine. échantillon Solution de Tampon Biquinoline Volume total Concentration de cuivre (solution imidazole (solution 3) (pL) cuivre dans 2) (pL) (solution 1) (pL) (pL) l'échantillon (pM) 1 0 1200 1800 3000 0 2 0 1200 1800 3000 0 3 120 1080 1800 3000 12.59 4 120 1080 1800 3000 12.59 240 960 1800 3000 25.18 6 240 960 1800 3000 25.18 7 360 840 1800 3000 37.77 8 360 840 1800 3000 37.77 9 480 720 1800 3000 50.36 480 720 1800 3000 50.36 11 600 600 1800 3000 62.95 12 600 600 1800 3000 62.95 BOD_1 450 750 1800 3000 15.7 (3.75pM) BOD_2 450 750 1800 3000 15.3 (3.75pM) Tableau III: Protocole expérimental pour le test biquinoline nécessaire au dosage du cuivre de la BOD. REVENDICATIONS1. Bilirubine oxydase (BOD) caractérisée en ce qu'elle presente un pourcentage d'identité d'au moins 80% par rapport à la BOD de Bacillus pumilus de SEQ. ID. N°2. 2. Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une BOD selon la revendication 1. 3. Molécule d'acide nucléique selon la revendication 2, de séquence choisie parmi la SEQ. ID. N°1 ou la SEQ. ID. N°5. 4. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 2 ou 3. 5. Cellule hôte exprimant une BOD selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec un vecteur d'expression selon la revendication 4. 6. Procédé de préparation d'une BOD selon la revendication 1 comprenant les étapes de : a) préparation de cellules hôtes selon la revendication 5 ; b) mise en culture de cellules hôtes préparées à l'étape a) ; c) lyse desdites cellules hôtes ; d) traitement du lysat obtenu à l'étape c) par chromatographie d'affinité ; e) récupération de ladite BOD purifiée, caractérisé en ce que ladite cellule hote préparée à l'étape a) est une souche d'Escherichia coli BL21 Star transformée avec le vecteur pFD1 et en ce que ladite culture réalisée à l'étape b) est une culture en phase liquide, sous agitation, en conditions anaérobies d'une durée de 20 à 30 h, à une température comprise entre 20 et 30°C, au cours de laquelle, l'expression de la BOD est induite par l'ajout d'isopropyl [3-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). 7. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 pour mesurer la concentration en bilirubine dans un échantillon liquide. 8. Kit de dosage de bilirubine, caractérisé en ce qu'il comprend une BOD selon la revendication 1. 9. Procédé de dosage de la bilirubine en solution d'un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mesure de l'absorbance à a,,,,ax = 440 nm dudit échantillon liquide avant réaction enzymatique ;b) introduction dans ledit échantillon liquide d'une BOD selon la revendication 1 ; c) mesure l'absorbance à X.. = 440 nm dudit échantillon liquide après réaction enzymatique ; d) calcul de la différence d'absorbances mesurées aux étapes a) et c) et comparaison avec des différences d'absorbances mesurées pour des solutions standards ayant une teneur en bilirubine connue ; e) détermination de la concentration en bilirubine dudit échantillon liquide. 10. Utilisation d'une BOD selon la revendication 1 pour dégrader la bilirubine présente dans un échantillon. 11. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 comme réactif dans une composition de teinture d'oxydation des fibres kératiniques. 12. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 pour le traitement de pâte à papier. 13. Utilisation de la BOD selon la revendication 1 pour la décoloration de colorants utilisés en milieux industriels. 14. Electrode à BOD comprenant un matériau conducteur recouvert d'un dépôt comprenant au moins une BOD selon la revendication 1. 15. Biocapteur de bilirubine, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode selon la revendication 14. 16. Capteur à oxygène, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode selon la revendication 14. 17. Biopile enzymatique comprenant une anode sur laquelle est immobilisée une enzyme catalysant une réaction d'oxydation et une électrode selon la revendication 14 à titre de cathode.