Brevet FR2948567A1 — publié le 20110204

Utilisation de l'acide rosmarinique et de ses dérivés pour traiter la ciguatéra La présente invention a pour objet l'utilisation de l'acide rosmarinique et de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des intoxications alimentaires par les poissons, en particulier la ciguatera. La ciguatera est une forme d'ichtyosarcotoxisme, c'est-à-dire une intoxication alimentaire par les chairs de poissons contaminés par les ciguatoxines (CTX) de la micro-algue benthique Gambierdiscus spp présente dans les récifs coralliens. Il s'agit d'une des formes d'intoxication par les poissons les plus communes dans les régions du Pacifique, de l'Océan Indien et des Caraïbes. Les ciguatoxines pénètrent la chaîne alimentaire par l'intermédiaire des poissons brouteurs de corail et des herbivores qui broutent les algues sur lesquelles sont fixées Gambierdiscus toxicus. Ces poissons sont ensuite les proies des poissons omnivores puis carnivores ; les toxines sont ainsi accumulées le long de la chaîne alimentaire. Parmi les 400 espèces potentiellement infectées, les grands poissons prédateurs comme le barracuda, la murène, le mérou ou encore les carangues sont les plus susceptibles de provoquer un empoisonnement. Les ciguatoxines sont des polyéthers liposolubles, thermostables, de faible poids moléculaire, elles font partie des plus puissantes biotoxines marines puisqu'il suffit d'à peine un microgramme pour tuer un homme. Les techniques de purification et de détection par chromatographie ont permis d'isoler 39 ciguatoxines différentes. Elles varient selon leur origine géographique (23 ciguatoxines du Pacifique ou P-CTX, 12 ciguatoxines des Caraïbes ou C-CTX et 4 ciguatoxines de l'Océan Indien ou I-CTX), selon les espèces pisciaires et selon leur position dans la chaîne alimentaire. Leurs structures moléculaires ne sont pas toutes encore élucidées. Les ciguatoxines sont des neurotoxines dont l'action sur les canaux sodiques dépendants du potentiel est responsable des manifestations cliniques observées au cours d'une intoxication. Les CTX agissent en maintenant ouverts les canaux sodiques à des valeurs de potentiel où normalement ils devraient être fermés, avec pour conséquence l'apparition spontanée et répétitive de potentiels d'action. L'ouverture des canaux sodiques est responsable d'un afflux massif d'ions sodium dans la cellule, entraînant un gonflement ; ce phénomène est particulièrement visible au niveau des noeuds de Ranvier et des terminaisons axonales. Les manifestations nerveuses découlent donc de cette action des toxines, aussi bien sur les nerfs moteurs que sensitifs et sur les jonctions neuro-motrices. Les 5 10 manifestations cardiaques et digestives de la maladie sont elles aussi dépendantes de l'action des ciguatoxines sur le système nerveux sympathique et parasympathique. Par ciguatoxines, on entend en particulier, les ciguatoxines du Pacifique ou P-CTX-1 à 23 de type 1 (Murata et al. 1989. J. Am. Chem. Soc. 111: 8929-31) : et de type 2 (Satake et al. 1993. Tetrahedron Letter. 34: 1975-78) : R4 les ciguatoxines des Caraïbes ou C-CTX-1 à 12 (Lewis et al. 1998. J Am. Chem. Soc. 120: 5914-20) : et les ciguatoxines de l'Océan Indien ou I-CTX-1 à 4 (Hamilton et al. 2002. Toxicon 40: 685-93). Il n'existe à ce jour aucun traitement de la ciguatera ; la médecine occidentale ne proposant que des médications soulageant les symptômes : antiémétiques et anti-diarrhéiques en cas de désordres gastro-intestinaux ; antihistaminiques contre les prurits et analgésiques en cas de troubles musculo-squelettiques. Le mannitol est un composé qui a été étudié pour le traitement de la ciguatera ; administré 48 à 72 heures après l'intoxication, le mannitol est décrit comme capable de soulager les désordres neurologiques et musculaires (Palafox et al., 1988, JAMA 259, 2740-2742 ; Blythe et al., 1994, Mem. Queensl. Mus. 34, 465-470). Des essais cliniques menés en aveugle avec du mannitol et une solution saline n'ont cependant pas pu montrer un effet bénéfique du mannitol sur les symptômes de la ciguatera au bout de 24 heures (Schnorf et al. 2002, Neurol. 58, 1155-1163) ; son efficacité est donc controversée. Deux produits sont actuellement étudiés pour le traitement de la ciguatera : - deux anticorps monoclonaux anticiguatoxine dont l'administration simultanée neutralise in vitro et in vivo l'action de la ciguatoxine C-TX3C (Inoue et al., 2009, Toxicon doi : 10.1016/j.toxicon.2009.02.17) ; - le brevenal, isolé du dinoflagellé producteur des brevetoxines Karenia brevis (Bourdelais et al., 2005, J. Nat Prod. 68(1), 2-6) : Brevenal C'est un puissant inhibiteur des effets neurotoxiques induits par les ciguatoxines et un traitement potentiel pour la ciguatera (Bourdelais et al., 2004 Molecular Neurobiology, 24(4), 553-563 ; Mattei et al., 2008, cells. PLoS ONE 3(10) 1-9). Ce composé est cependant difficile à synthétiser et ne peut être obtenu qu'en faible quantité à partir de cultures de Karenia brevis. La pharmacopée traditionnelle est plus riche de remèdes que la médecine 30 occidentale : dans le Pacifique, de nombreux remèdes traditionnels à base de plantes sont employés pour traiter la ciguatera. Des enquêtes ethno-pharmacologiques menées principalement en Nouvelle-Calédonie et au Vanuatu ont permis de dresser une liste de près d'une centaine de plantes utilisées dans la médecine traditionnelle (Bourdy et al., 1992, J. Ethnopharmacology 36, 163-174 ; Laurent et al., 1993, ORSTOM Editions, Paris, pp. 51-116). En Nouvelle-Calédonie, l'usage de ces remèdes est extrêmement populaire et la majorité de la population préfère s'adresser à des guérisseurs plutôt que de consulter des médecins. Parmi ces remèdes, la décoction de feuilles d'Heliotropium foertherianum Diane & Hilger est répandue dans de nombreuses îles du Pacifique sud (Nouvelle-Calédonie, Polynésie française, Vanuatu, Tonga, Micronésie) et même dans les îles Ryukyu du Japon. Selon une enquête menée auprès de la population de Nouméa, plus de 40% des 500 personnes interrogées utilisent cette plante pour se soigner (Amade & Laurent, 1992, eds Gopalakrishnakone P. and Tan C.K., 2, 503-508). Largement répandue en Polynésie, Micronésie et Mélanésie et aussi présente dans l'Océan Indien, Heliotropium foertherianum est une plante côtière de la famille des Boraginaceae. Originellement appelée Tournefortia argentea L.f., elle fut nommée ensuite Argusia argentea (L.�) Heine et resta sous ce nom jusqu'à récemment où elle fut renommée Tournefortia avant d'être appelée Heliotropium en 2003 après des études moléculaires. Elle a aussi été répertoriée sous les noms scientifiques de Messerschmidia argentea (L.f.) Johnston, T. arborea Blanco, T. sarmentosa sensu Christian non Lam. et T sericea Cham. Des études in vivo et in vitro sur les extraits de feuilles d'Heliotropium foertherianum ont démontré l'efficacité de cette plante pour lutter contre les symptômes de la ciguatera. Evalué sur un test de perte pondérale de la souris intoxiquée par du foie de murène contenant des ciguatoxines, l'extrait de feuilles d'H. foertherianum a provoqué une diminution de la réduction corporelle induite (Amade & Laurent, 1992). Cet extrait a aussi montré des effets identiques au mannitol sur des axones isolés de grenouille traités avec de la ciguatoxine du Pacifique. En effet, cet extrait inhibe les décharges de potentiels d'action spontanées et répétitives provoquées par le blocage des canaux sodium en position ouverte par les ciguatoxines et la rentrée de sodium qui en résulte. Il inhibe également le gonflement des noeuds de Ranvier des axones myélinés engendré par la rentrée d'eau répondant au changement osmotique (Benoit et al., 2000, Cybium 24, 33-40). H foertherianum inhibe également le gonflement des érythrocytes humains ou de grenouille provoqué par la ciguatoxine (Boydron et al., 2001, Rencontres en toxinologie : Explorer, exploiter les toxines et maîtriser les organismes producteurs, Editions scientifiques et médicales Elsevier, Paris, pp. 63-6 et Boydron et al., 2002, Rencontres en toxinologie : Toxines et recherches biomédicales, Editions scientifiques et médicales Elsevier, Paris, pp. 101-104). Par la suite, en utilisant des neuroblastomes murins (neuro-2a), il a été montré que les extraits de feuilles de cette plante exerçaient un effet protecteur contre l'action cytotoxique des ciguatoxines et des brévétoxines (Boydron-Le Garrec et al., 2005, Toxicon 46, 625-634). Les brévétoxines appartiennent à une autre classe de biotoxines marines qui ressemblent aux ciguatoxines par leur structure polyéthérée et qui se lient sur le même site des canaux sodium voltage dépendants. Les Inventeurs ont poursuivi les travaux de recherche sur H foertherianum dans le but d'identifier la substance capable de lutter contre les symptômes des ciguatoxines. A partir d'une préparation du remède selon la méthode habituellement utilisée (Laurent et al., 1993) : 200 grammes de feuilles jaunies sont mises à bouillir dans 1 litre d'eau durant 30 minutes, les Inventeurs ont isolé par fractionnement chimique bioguidé le principe actif d'H foertherianum. L'analyse structurale du produit est effectuée par RMN du proton et du carbone et spectrographie de masse ; elle a permis d'identifier l'acide rosmarinique. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation de composés de formule générale (I) : dans laquelle : RI à R10 représentent, indépendamment les uns des autres : o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ; o un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6 ou un radical aryle en C3-C10 ; o un radical ùO-Z1 avec Z1 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6, un radical aryle en C3-25 C10 et un radical glycosyle ; o un radical ùS-Z2 avec Z2 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en C1-C6 ; R3X4~X5 X6.R5 R4 R6 (I) Z3 ùN o un radical \Z4 avec Z3 et Z4 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6, un radical aryle en C3-CIO et un radical glycosyle ; Z5 N Z6 o un radical ûCOOZ5 ou un radical 0 avec Z5 et Z6 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, parmi un atome d'hydrogène et un radical alkyle en C1-C6 ; o une fonction -CN ; étant entendu que deux radicaux adjacents choisis parmi RI à R5 ou pallni R6 à Rlo peuvent fonner ensemble un cycle sélectionné dans le groupe constitué par le phényle, le naphthyle, 10 le furanyle, le thiophényle, le pyrrolyle et le triazolyle ; - X1 à X12 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome de carbone ou un atome d'azote ; YI et Y2, représentent, indépendamment l'un de l'autre : o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ; 15 o un radical alkyle en C1-C6 ou un radical aryle en C3-CIO, o un radical -0-Z' i avec Z' l sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-Cio ; Z'2 o un radical \Z 3 avec Z'2 et Z'3 sélectionnés, indépendamment l'un de 20 l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-Clo ; Z4 Z'S o un radical ûCOOZ'4 ou un radical O avec Z'4 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical acyle en C2-C6 et Z'5 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical acyle 25 en C2-C6 et un radical aryle en C3-Clo ; o une fonction ûCN ; 6 ùN - Z représente un atome d'oxygène ou une chaine ûNZ7-, avec Z7 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C 1-C6 et un radical aryle en C3-C10 - W1 et W2 représentent, indépendamment l'un de l'autre : o un atome d'hydrogène ; o une fonction -NO2, -N3 ou ûCN ; fi N~Zz o un radical -000Z" 1 ou un radical O avec Z" l sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en C1-C6 et Z"2 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en CI-C6 et un radical aryle en C3-C10 ; leur énantiomères (R,S) et leur sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention et/ou au traitement des désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines. Par atome d'halogène, on entend les éléments chimiques du groupe VII du 15 tableau périodique des éléments, notamment, le fluor, le chlore, le brome et l'iode. Par radical alkyl en C1-C6, on entend un radical hydrogénocarboné, linéaire ou ramifié, de 1 à 6 atomes de carbone. O Par radical acyle en C2-C6, on entend un radical ùR R' comprenant 2 à 6 atomes de carbone, R étant une chaîne alkyle avec m atomes de carbone, m compris 20 entre 0 et 4, et R' un radical alkyle avec n atomes de carbone, n compris entre 1 et 5, et tels que m+n est compris entre 1 et 5. Par chaîne ou radical alkyl, on entend respectivement une chaîne ou un radical hydrogénocarboné, linéaire ou ramifié. Par radical aryle en C3-C10, on entend un radical aromatique mono- ou bicyclique de 3 à 10 atomes de carbone. De préférence les radicaux aryles en C3-C10 sont 25 sélectionnés dans le groupe constitué par les radicaux pyrrole, thiophène, furane, oxazole, isoxazole, thiazole, imidazole, pyrazole pyridinyle, pyrimidinyle, guanyle, naphthyle, quinoleinyle, indolyle, benzofuranyle, benzothiophényle. Par radical glycosyle, on entend un monomère ou dimère de résidus glycosyle, mannosyle, glucuronyle, glucosamine et mannosamine. 30 De préférence, les composés de formule générale (I) sont tels que : X, à X12 représentent un atome de carbone ; et/ou - Y, et Y2 représentent un atome d'hydrogène. Un composé de formule générale (I) préféré selon l'invention est l'acide rosmarinique. L'acide rosmarinique (acide (R)-a-[[3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-oxo-2E-propenyl]oxy]-3, 4-dihydroxy-benzenepropanoique, masse moléculaire 360 et formule chimique brute C18H1608) est un composé polyphénolique de structure : OH Acide rosmarinique La synthèse chimique de l'acide rosmarinique a été décrite par Zinsmeister (Zinsmeister H.D. et al., 1991, Angew. Chem.103, 134-151). L'acide rosmarinique peut également être produit par procédé biotechnologique de culture de cellules végétales (Hippolyte et al., 1992, 1. Plant Cell Rep.11, 109-112) ou encore être isolé à partir de plantes (Lu et al., 1999. Phytochemistry 51, 91-94; Zgorka et al. 2001. J. Pharmaceut. Biomed. 26, 79-87.). Ce composé est connu pour présenter des activités biologiques d'intérêt : antivirales, antibactériennes, anti-inflammatoire et antioxydante (Petersen et al., 2003, Phytochemistry 62, 121-125) ; il est couramment utilisé dans les industries alimentaire et cosmétique. Il n'a cependant jamais été décrit comme susceptible d'avoir un effet bénéfique sur les intoxications alimentaires telles que la ciguatera. Les composés de formule générale (I) peuvent être synthétisés par couplage de type peptidique (obtention d'analogues esters et amides) entre des unités acide carboxylique et des unités alcool/amine tel que décrit par See-Hyoung Park et al. (Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2003, 12 (20), 3455-3459). Les désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines sont de plusieurs ordres : - Les désordres digestifs : Ils sont les premiers à apparaître ; ils peuvent être isolés ou d'emblée associés à des signes nerveux. Les symptômes les plus souvent rencontrés sont des douleurs OH OH HO abdominales diffuses, des nausées et vomissements et des diarrhées, le plus souvent aqueuses. D'autres symptômes peuvent survenir tels que ténesme et hoquet. - Les désordres du système nerveux central et/ou périphérique : Ils apparaissent en quelques jours, voire en quelques heures, ce sont les signes qui peuvent persister le plus longtemps (quelques semaines, parfois des mois). Ils peuvent toucher l'ensemble du système nerveux. Les signes neurologiques qui visent plus particulièrement le système nerveux central comprennent les syndromes cérébelleux (une ataxie cérébelleuse peut être observée avec des troubles de la coordination et de l'équilibre), des atteintes du système nerveux central, une fatigue chronique (asthénie, léthargie, troubles du sommeil avec cauchemars, réveils précoces, intolérance à l'exercice, manque de motivation, douleurs variées...), céphalées, vertiges, étourdissements, hallucinations visuelles ou auditives Ceux visant le système nerveux périphérique comprennent le plus fréquemment des paresthésies (picotements, engourdissements, fourmillements) qui sont observées surtout au niveau des extrémités, du visage (péri-orales, labiales, linguales, pharyngées) ; les dysesthésies qui sont également fréquentes et considérées comme un des signes les plus évocateurs de la ciguatera : le patient se plaint de sensations de brûlure ou de décharges électriques au contact d'objets froids ; on peut également citer l'ataxie. D'autres signes liés à des désordres neurologiques peuvent être observés : troubles de la déglutition, convulsions, troubles de la conscience, coma, paralysie de la fonction respiratoire. Les désordres cardiovasculaires : Ils sont habituellement considérés comme faisant toute la gravité de l'intoxication. Lorsqu'ils sont présents, ils surviennent de façon précoce mais ils durent rarement plus d'une semaine. On observe le plus souvent : une bradycardie sinusale inférieure à 60/mn, une hypotension artérielle, une hypotension orthostatique pouvant persister jusqu'à quatre semaines. - Les désordres musculo-squelettiques : Parmi eux, peuvent être cités : les myalgies, les arthralgies (surtout des 30 grosses articulations, particulièrement les genoux, les chevilles, les épaules et les coudes). - Les désordres cutanés : Le prurit constitue l'un des principaux symptômes de la ciguatera, à tel point qu'il a donné son nom à la maladie en Nouvelle-Calédonie : � la gratte �. Ce sont les paumes des mains et les plantes des pieds qui sont les plus souvent atteintes. Le prurit peut parfois être généralisé, notamment après l'ingestion d'alcool ou suite à un exercice physique important, c'est à dire lorsque le flux sanguin cutané est augmenté. Les démangeaisons peuvent être très sévères et occasionner des lésions de grattage avec leur lot de complications : excoriations, abcès, cellulites, cicatrices, lichenification. D'autres désordres cutanés peuvent être observés tels que des éruptions cutanées : lésions éruptives non spécifiques érythémato-papuleuses, avec parfois une desquamation lors de la phase de guérison. Ainsi les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont plus particulièrement destinées à traiter des douleurs abdominales diffuses et/ou des nausées et vomissements et/ou des diarrhées et/ou un syndrome cérébelleux et/ou une fatigue chronique et/ou des céphalées et/ou des vertiges et/ou des étourdissements et/ou des hallucinations visuelles ou auditives et/ou des paresthésies et/ou dysesthésies et/ou des troubles de la déglutition et/ou des convulsions et/ou des troubles de la conscience et/ou le coma et/ou une paralysie de la fonction respiratoire et/ ou une bradycardie sinusale inférieure à 60/mn et/ou une hypotension artérielle et/ou une hypotension orthostatique et/ou des myalgies et/ou des arthralgies et/ou du prurit et/ou des éruptions cutanées. La quantité de composé de formulé générale (I) et notamment d'acide rosmarinique à administrer au mammifère dépend notamment de la gravité de la pathologie et des symptômes à traiter, résultant notamment de la quantité de ciguatoxine absorbée et de la voie par laquelle elle l'a été, elle dépend enfin de l'âge et du poids de l'individu à traiter. L'acide rosmarinique étant peu toxique, il peut être administré à forte concentration. A titre d'exemple et sans caractère limitatif, la dose journalière d'acide rosmarinique ou de son dérivé est comprise entre 0,1 mg et 1 g, de préférence entre 5 et 500 mg, par prise en 1 à 3 prises. La composition pharmaceutique comprenant un composé de formule générale (I) pourra être adaptée à une administration par voie orale, parentérale, pulmonaire, oculaire, nasale.... La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'isolement et de caractérisation de l'acide rosmarinique comme principe actif de d'H. foertherianum et à l'évaluation de son activité contre les effets des ciguatoxines ; ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : FIGURES La Figure 1 est un graphe représentant la viabilité cellulaire de neuroblastomes en présence de ciguatoxines contenues dans des échantillons de bénitier toxique (GPS59) à 100 �g/ml avec ou sans acide rosmarinique (dans une gamme de 10 à 1000 .tg/ml). La Figure 2 est la courbe de compétition entre le radioligand ([3H]-PbTx-3) et l'acide rosmarinique sur les canaux sodiques d'une préparation de membranes de cerveau de rats. Cette courbe montre le déplacement de la brévétoxine marquée [3H]PbTx-3 de son site d'action par l'acide rosmarinique. Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE I- Isolement du produit Le principe actif d'H foertherianum a été isolé par fractionnement chimique bioguidé. Des feuilles jaunies d'H. foertherianum ont été récoltées au pied d'un arbre dans la region cotière de Nouvelle-Calédonie (Anse Vata, Nouméa). Le remède est préparé selon la méthode habituellement utilisée (Laurent et al., 1993). Brièvement, 200 g de feuilles jaunies sont mises à bouillir dans 1 litre d'eau durant 30 minutes. La solution (environ 750 ml) est ensuite filtrée et lyophilisée pour donner 7,934 g d'extrait brut. 7,8 g sont ensuite redissous dans l'eau et partitionnés avec du n-butanol. 500 mg de la phase butanolique sont chromatographiés sur colonne de silice et élués avec 6 mélanges de dichlorométhane et de méthanol de polarité croissante. Le principe actif (environ 360 mg) est élué principalement (90%) au CH2C12/MeOH. II- Analyse du produit L'analyse structurale du produit est effectuée par RMN du proton et du carbone en utilisant un spectromètre Brucker ARX400. Le spectre de masse est obtenu sur un spectrophotomètre Perkin Elmer API Sciex triple quadripole équipé en électrospray. Le composé a été identifié comme étant l'acide rosmarinique par comparaison des données de spectre de masse et de RMN avec celles d'un composé témoin et celles de la littérature. III- Toxicité de l'acide rosmarinique La DL50 de l'acide rosmarinique a été déterminée après injection d'une solution à 531 mg/kg en intraveineuse (iv) chez la souris (Fiche Sigma-Aldrich, valeur tirée de Petersen, 2003. Référence : Parnham, M.J., Kesselring, K., 1985. Rosmarinic acid. Drugs of the Future 10, 756-757. Il ressort de ces résultats qu'à cette concentration, l'acide rosmarinique ne manifeste pas de toxicité. IV- Activité de l'acide rosmarinique IV.1. Inhibition de la c totoxicité srovosuée •ar des extraits de loche toxi ue ou de bénitiers 5 toxiques sur des cultures cellulaires de neuroblastomes L'échantillon de loche saumonée (Ref15), fourni par l'Institut Louis Malardé, a été récolté à Mururoa (Archipel des Tuamotu, Polynésie française). L'échantillon de bénitier (GPS59) a été récolté à Raivavae (Archipel des Australes, Polynésie française). La toxicité de ces deux échantillons a été préalablement confirmée sur souris, par un test de 10 cytotoxicité sur neuroblastomes et des tests radioligand avec P-CTX-3. Les échantillons sont conservés à 4°C. L'acide rosmarinique provient de chez Sigma. Des plaques 96 puits sont préparées avec un nombre de 50 000 cellules dans 100 �L de milieu par puits. Les puits extérieurs ne sont pas utilisés, pour éviter les 15 variations de réponse dues aux effets de bord. Les cellules sont incubées pendant 24h à 37°C avec 5% de CO2 pour leur laisser le temps d'adhérer. Un mélange Ouabaine (glycoside cardiotonique qui intervient dans la perméabilité cellulaire en inhibant la pompe Na/K) et vératridine (alcaloïde polycyclique qui entraine une activation persistante des canaux sodiques), ci-après désigné O/V, dans lequel 20 les deux actifs sont présents respectivement à une concentration finale de 0,33 et 0,033 mM dans 20 �l, est ajouté dans les puits. La ouabaïne est un inhibiteur de l'ATPase Na+/K+, et la vératridine, un activateur des canaux sodium. L'action conjointe de ces deux produits induit un niveau intracellulaire élevé de sodium et provoque une altération de la morphologie des cellules qui 25 diminue nettement leur viabilité. L'induction, par ces deux composés, d'une sensibilisation aux toxines agissant sur les canaux sodium, permet de visualiser la cytotoxicité des toxines. Sont ensuite ajoutés les extraits de loche (LST) ou de bénitier (GSP), dissous au préalable dans du milieu de culture à la concentration voulue (concentration finale par puits de 250, 125 et 100 �g/ml), enfin, l'acide rosmarinique est ajouté à 30 différentes concentrations (concentration finale par puits comprise entre 10 à 1000 �g/ml). Chaque puits est complété par le milieu de culture afin d'obtenir un volume final de 200 �l. Toutes les plaques possèdent un contrôle de milieu standard (cellules seules) et un contrôle avec des cellules en présence du mélange O/V. L'acide rosmarinique est testé seul avec le mélange O/V pour enregistrer des effets de cytotoxicité ou de prolifération cellulaire ainsi que d'éventuelles interférences de coloration due à de fortes concentrations de produits, qui pourra entraîner de faux positifs à la lecture au spectrophotomètre. Chaque échantillon est testé en 3 réplicats avec et sans acide rosmarinique 5 mais toujours en présence du mélange O/V. Les cellules sont ainsi incubées à 37°C et 5% de CO2 pendant 18h. Après l'incubation, les puits sont vidés de leur milieu et la plaque est laissée à sécher sur papier absorbant en vue de réalisée le test au bromure de MethylThiazolyldiphenyl-Tetrazolium (MTT). 10 Le test au MTT est basé sur la capacité des enzymes (succinatedéshydrogénases mitochondriales) des cellules viables de convertir le sel jaune de tétrazolium en cristaux de formazan insolubles dans le PBS. Une solution de MTT à 0,8 mg/ml est préparée dans du PBS (tampon phosphate salin) ; 50 �l de cette solution est ajouté dans chacun des puits. 15 Après incubation pendant une heure trente, les cristaux de formazan formés sont dissous grâce à 150 �L de DMSO (diméthylsulfoxyde) pour chaque puits. Après homogénéisation, les plaques sont lues avec un lecteur de plaque UV à 490 nm. Puis les données sont transférées et traitées sous Excel� et analysées avec le logiciel GraphPad Prism� (version 4). 20 Le graphe de la Figure 1 montre la cytotoxicité mesurée par la viabilité cellulaire d'un extrait de bénitier toxique (GPS59) à 100 �g/ml en présence ou non d'acide rosmarinique à différentes concentrations (10 à 1000 11g/m1). Ce graphe montre bien l'effet protecteur de l'acide rosmarinique, l'effet de ce composé augmente significativement la viabilité cellulaire dès 50 �g/ml. Des résultats similaires ont été observés l'extrait de loche 25 saumonnée toxique. Sur la base de ces résultats, on peut estimer que l'IC50 de l'acide rosmarinique (concentration d'acide rosmarinique pour diminuer de 50% la mortalité cellulaire provoquée par les ciguatoxines et toxines associées) se situe entre 0,5 et 1 mg/ml. IV.2. Déplacement de la brévétoxine marquée [3H]PbTx-3 de son site d'action (canaux 30 sodiques voltage-dépendants) Des synaptosomes de cerveau de rats sont préparés comme préalablement décrit par Dechraoui et al. (1999, Toxicon. 37(1):125-43). La concentration en protéine des préparations synaptosomales est déterminée en duplicat par la méthode de Bradford avec la sérumalbumine bovine comme standard (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem. 72:248-254). La concentration finale en protéine est de l'ordre de 120 �g/ml. Après incubation de ces préparations avec de la brévétoxine tritiée 5 [3H]PbTx-3, on observe un maximum de 10 % de la radioactivité totale. Le test de détection de l'interaction ligand-récepteur est mené dans un tube avec une concentration finale en brévétoxine tritiée [3H]PbTx-3 de 1,1 nM, suivant le protocole de Darius et al. (Darius et al., 2007 Toxicon 50(5), 612-626). La radioactivité est déterminée en utilisant un compteur à scintillation Perkin Elmer Microbeta Trilux 1450 dans 10 des fioles de comptage de 2 ml d'un liquide à scintillation Betaplate (Perkin Elmer). L'interaction non-spécifique est évaluée par mesure de la radioactivité en présence d'une concentration saturante de [3H]PbTx-3 (0,67 mM) et soustraite à l'interaction totale pour conduire à l'interaction spécifique. La ciguatoxine P-CTX-3C (obtenue d'une culture clonale de 15 Gambierdiscus polynesiensis) est connue pour présenter une meilleure affinité au site d'action que les brévétoxines ; elle a été utilisée comme standard interne pour la calibration de l'échantillon (Chinain et al., 1999 ; Darius et al., 2007). Deux tubes de contrôles de qualité des expérimentations de radioligand sont utilisés à chaque expérimentation ; ils sont composés d'un extrait toxique de 20 Gambierdiscus polynesiensis avec une concentration connue en ciguatoxine P-CTX-3C équivalente à 3,1 pg. Huit dilutions en duplicate ont été testées à partir de 2 concentrations d'acide rosmarinique à 5 et 20 mg/ml. Les courbes sigmoïdales et les valeurs d'IC50 sont obtenues en utilisant le 25 logiciel Graphpad Prism v4.0. L'IC50 est définie comme la concentration d'extrait capable d'induire 50% d'inhibition de l'interaction avec [3H]PbTx-3 et elle est exprimée en mg equivalent/ml d'extrait. La Figure 2 représente la courbe de compétition entre le radioligand ([3H]-PbTx-3) et l'acide rosmarinique sur les canaux sodiques d'une préparation de membranes de 30 cerveau de rats. On constate en présence d'acide rosmarinique à 5 et 20 mg/ml une diminution de la radioactivité mesurée indiquant un remplacement de la brévétoxine tritiée sur les canaux sodiques par l'acide rosmarinique. On peut ainsi calculer la valeur de l'IC50 : 0,88 mg/ml et la valeur du Ki à 1,43 x 10"3 M V- Estimation de la quantité de principe actif ingéré par l'homme lors d'un traitement par le remède traditionnel Le taux d'acide rosmarinique est estimé à 1,2 mg/g de feuilles fraiches d'Heliotropium foertherianum ; soit pour des feuilles d'environ 10 grammes, une douzaine de mg d'acide rosmarinique et pour un remède basé sur une décoction de 4 à 5 feuilles, une cinquantaine de mg de ce produit. Il s'agit là d'une valeur indicative, la posologie d'un remède traditionnel étant très variable ; de plus, le contenu en substance active du remède peut également varier selon que l'on utilise les plantes de bord de mer ou de l'intérieur des terres.10 REVENDICATIONS1 Utilisation de composés de formule générale (I) : R9 R10 /X11. ~Rs 12 .X10 X7\X X9 R7 R3X4X5 X6 'R5 R4 R6 R6 (I) dans laquelle : R1 à R10 représentent, indépendamment les uns des autres : o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ; o un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6 ou un radical aryle en C3-C10 ; o un radical ùO-Z1 avec Z1 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6, un radical aryle en C3-C10 et un radical glycosyle ; o un radical ùS-Z2 avec Z2 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en C1-C6 ; /Z3 o un radical \Z4 avec Z3 et Z4 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6, un radical aryle en C3-C10 et un radical glycosyle ; Z5 N Z6 o un radical ùCOOZ5 ou un radical O avec Z5 et Z6 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, parmi un atome d'hydrogène et un radical alkyle en C1-C6 ; o une fonction -CN ; étant entendu que deux radicaux adjacents choisis parmi R1 à R5 ou parmi R6 à R10 peuvent former ensemble un cycle sélectionné dans le groupe constitué par le phényle, le naphthyle, le furanyle, le thiophényle, le pyrrolyle et le triazolyle ; ùN X1 à X12 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome de carbone ou un atome d'azote ; Y1 et Y2, représentent, indépendamment l'un de l'autre : o un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ; o un radical alkyle en C1-C6 ou un radical aryle en C3-C10, o un radical -0-Z' i avec Z' I sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-Cio ; I I Z'5 o un radical ùCOOZ'4 ou un radical O avec Z'4 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical acyle en C2-C6 et Z'5 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical acyle 15 en C2-C6 et un radical aryle en C3-Clo ; o une fonction ùCN ; - Z représente un atome d'oxygène ou une chaine ùNZ7-, avec Z7 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6 et un radical aryle en C3-C10 ; 20 W1 et W2 représentent, indépendamment l'un de l'autre : o un atome d'hydrogène ; o une fonction -NO2, -N3 ou ùCN ; Z" i' Z"2 o un radical -000Z" 1 ou un radical 0 avec Z" l sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène et un radical alkyle en C1-C6 et Z"2 25 sélectionné dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6 et un radical aryle en C3-C10 ; leur énantiomères (R,S) et leur sels pharmaceutiquement acceptables, N, o un radical Z 3 avec Z'2 et Z'3 sélectionnés, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué par un atome d'hydrogène, un atome d'oxygène, un atome d'azote, un radical alkyle en C1-C6, un radical acyle en C2-C6 et un radical aryle en C3-C10 ; Z'4 Npour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention et/ou au traitement des désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les composés de formule générale (I) sont tels que : X1 à X12 représentent un atome de carbone et/ou Y1 et 5 Y2 représentent un atome d'hydrogène. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit composé est l'acide rosmarinique. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les ciguatoxines sont choisies parmi les ciguatoxines du Pacifique ou P-CTX-1 à 23, 10 les ciguatoxines des Caraïbes ou C-CTX-1 à 12 et les ciguatoxines de l'Océan Indien ou ICTX-1 à 4. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle lesdits désordres provoqués par les intoxications aux ciguatoxines sont des désordres digestifs et/ou des désordres des systèmes nerveux central et/ou périphérique et/ou 15 des désordres cardiovasculaires et/ou des désordres musculo-squelettiques et/ou des désordres cutanés. 6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle lesdits désordres sont des douleurs abdominales diffuses et/ou des nausées et vomissements et/ou des diarrhées et/ou un syndrome cérébelleux et/ou une fatigue chronique et/ou des céphalées 20 et/ou des vertiges et/ou des étourdissements et/ou des hallucinations visuelles ou auditives et/ou des paresthésies et/ou dysesthésies et/ou des troubles de la déglutition et/ou des convulsions et/ou des troubles de la conscience et/ou le coma et/ou une paralysie de la fonction respiratoire et/ ou une bradycardie sinusale inférieure à 60/mn et/ou une hypotension artérielle et/ou une hypotension orthostatique et/ou des myalgies et/ou des 25 arthralgies et/ou du prurit et/ou des éruptions cutanées. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la dose journalière d'acide rosmarinique ou de son dérivé est comprise entre 0,1 mg et 1 g par prise en 1 à 3 prises. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, 30 dans laquelle ladite composition pharmaceutique est adaptée à une administration par voie orale, parentérale, pulmonaire, oculaire, nasale.