Brevet FR2955592A1 — publié le 20110729

La présente demande concerne un procédé et des moyens de contrôle de la stérilité des fluides aqueux ou gazeux entrant, notamment, dans la fabrication des produits et dispositifs pharmaceutiques. En particulier elle se rapporte à un milieu de culture alliant un substrat fluorogène et un fluorophore sensible au pH (en particulier l'association de 4-méthylumbelliférone (4-MU) et de dérivés de la fluorescéine) utile pour la détection par fluorescence des microorganismes, notamment par couplage des mesures de fluorescence relatives, d'une part, au fluorophore sensible au pH, et d'autres part à l'activation par les microorganismes du ou des substrat(s) fluorogène(s). L'industrie pharmaceutique fait partie de ces secteurs où les contraintes de stérilité sont fortes, imposant un suivi constant de la qualité des produits et de toutes les activités qui entourent ces produits. En matière de contamination par les microorganismes, les contrôles s'effectuent par des méthodes microbiologiques selon les règles et normes prescrites dans les Pharmacopées. La Pharmacopée européenne ou américaine définit plusieurs niveaux de qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques. Les produits obligatoirement stériles, tels que les préparations parentérales (produits injectables, préparations pour perfusions, ...) et les produits ophtalmiques, se caractérisent par l'absence totale de micro-organismes capables de se reproduire par eux-mêmes ou bien dans un organisme hôte. Les produits non obligatoirement stériles peuvent contenir un certain nombre de microorganismes à condition que la contamination microbienne soit contenue au dessous d'un certain seuil défini selon les critères de la Pharmacopée. La présence de ces microorganismes ne représente aucun danger pour le patient car il s'agit par exemple de médicaments par administration orale ou rectale. La flore microbienne et le pH acide de l'estomac empêche le développement des micro-organismes, à condition toutefois que leur nombre ne dépasse pas les critères préconisés par ladite Pharmacopée. Différentes catégories de produits non stériles sont définis dans la Pharmacopée ayant chacune leurs exigences propres en matière de contrôle microbiologique selon leur destination finale. Les produits à tester se retrouvent, par ailleurs, sous différentes formes, solides ou liquides, ainsi que dans des volumes et des conditionnements variés. On distingue à cet égard, les produits filtrables, dont le contrôle microbiologique peut être réalisé au moyen d'une filtration au travers d'une membrane, des produits non filtrables, pour lesquels la Pharmacopée préconise la technique d'inoculation directe de l'objet testé dans un milieu de culture. Les préparations que l'ont peut tester par ensemencement direct du milieu de culture sont généralement solides mais peuvent aussi avoir une consistance fluide comme, par exemple, les liquides huileux, auxquels on ajoute un milieu additionné de 10g/L de polysorbate 80, des pommades et des crèmes, dans lesquels on ajoute des agents diluants ou émulsionnants appropriés. Il est d'usage que le volume de l'objet ne dépasse pas 10% du volume du milieu de culture. Selon l'exigence en matière réglementaire, différents types de contrôle de la qualité microbiologique peuvent être mis en oeuvre, allant du test de stérilité stricte à un dénombrement spécifique des principaux germes aérobies et anaérobies, en passant par la détection ciblée de micro-organismes spécifiés. En général, lorsqu'on souhaite avoir une idée assez précise du type de microorganismes rencontré, les microbiologistes privilégient les cultures sur milieu gélosé qui permettent de rendre compte visuellement de la présence des germes, lesquels forment des micro-colonies à l'intérieur de, ou bien sur, la gélose. Cette approche permet, au besoin, de prélever les microorganismes formant ces colonies, et de procéder à des analyses complémentaires pour vérification. Ainsi, lorsque les germes sont de nature différente, il est possible de déterminer, dans une certaine mesure, la proportion relative des différents types de germes rencontrés. Ceci étant, les cultures sur milieu gélosé nécessitent du temps et de la main d'oeuvre. Ainsi, le temps de division de microorganismes à croissance lente, comme par exemple Methylobacter sp. sur un milieu de culture, tel que le milieu R2A, destiné à faire croître les microorganismes stressés par un traitement chloré, peut être de 48 à 72h [(Gallego V., Garcia M.T. and Ventosa A. (2006), Methylobacterium adhaesivum sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from drinking water. Int J Syst Evol Microbiol 56, 339-342)]. Des études montrent, par ailleurs, qu'une durée minimum d'incubation de 14 jours est nécessaire pour valider réellement l'absence de germes dans un échantillon [Bathgate, H. et al. (1993) Journal of Parental Science and Technology47(5) : 254-257]. Dans le cadre de tests de contrôle effectués dans une chaine de production industrielle, cette durée est trop longue pour pouvoir remédier rapidement à une contamination. En effet, si la contamination est établie plusieurs jours après la fabrication d'un produit, le rappel de ce produit pour vérification, peut entrainer des pertes économiques importantes. Le problème peut se poser également en termes de santé publique en ce qui concerne le contrôle de la qualité de l'eau potable, laquelle est distribuée rapidement après traitement. Les cultures en milieu liquide permettent, quant à elles, dans une certaine mesure, de réduire la main d'oeuvre et le temps de culture des microorganismes. Cependant, les risques de faux positifs liés à la manipulation des membranes de filtrations et/ou des boites gélosées sont plus élevés. Il existe depuis plusieurs années des unités de filtration stériles transparentes, comme par exemple, celles mises au point par le demandeur (Steritest EZ, Millipore Corporation, Billerica, MA 01821, USA) permettant de réaliser un test de stérilité après filtration d'un échantillon liquide ou gazeux. Le principe est de retenir à la surface de la membrane les éventuels contaminants contenus dans l'échantillon filtré. Puis, une fois la filtration de l'échantillon réalisée, à incuber la membrane de filtration à l'intérieur de l'unité de filtration remplie de milieu de culture stérile. En cas de présence d'un ou plusieurs contaminants, le milieu qui est transparent, devient trouble du fait du développement des cellules. C'est alors visuellement qu'on établit la présence de microorganismes dans l'unité de filtration. La détection en milieu liquide nécessite généralement un peu plus de temps que sur milieu gélosé, car il faut atteindre une concentration de cellules suffisante dans le milieu de culture, pour que celui-ci devienne trouble. Les cultures en milieu liquide sont cependant généralement plus favorables à la croissance des germes aérobies ou anaérobies. Les tests en milieux liquides présentent, par contre, certaines limitations, au nombre desquelles figurent, en particulier, l'impossibilité d'estimer le nombre, la nature et la proportion des contaminants présents initialement dans l'échantillon testé. A cet égard, les tests effectués dans un milieu de culture liquide ne permettent que de délivrer un message d'alerte, mais sans fournir d'information sur la nature des germes impliqués. Pour ces différentes raisons, il serait souhaitable de pouvoir disposer de tests en milieu liquide plus rapides et susceptibles de donner une première indication sur la nature des germes identifiés. A tout le moins, une information sur les types de microorganismes rencontrés (une ou plusieurs espèces, aérobies ou anaérobies, à croissance lente ou rapide, gram + ou gram -, ...), obtenue à un stade précoce, serait avantageuse pour qu'un technicien puisse se rendre compte de l'étendue de la contamination et déterminer son origine. Pour déceler plus vite les contaminations, certains procédés font appel à des substrats fluorogènes qui sont incorporés dans les milieux de culture. Les substrats fluorogènes sont des molécules complexes, qui, au contact d'enzymes synthétisées par les microorganismes, sont clivées et deviennent fluorescentes. La fluorescence émise est facilement détectable à l'aide d'un spectrophotomètre par illumination du milieu de culture à l'aide d'un rayonnement dans l'UV ou dans le visible, et ce avant que la densité de cellules soit suffisante pour troubler le milieu de culture. Ils permettent donc une détection plus rapide des contaminations. Il existe plusieurs familles de substrats fluorogènes. Néanmoins, ces familles de substrats présentent des inconvénients qui leur sont propres et qui limitent leur utilisation dans le cadre de tests de stérilité. Les dérivés de la fluorescéine (CFA, CFDA) sont, par exemple, des substrats fluorogènes activés par un large spectre de microorganismes ; la CFDA est ainsi communément reconnu pour être un marqueur de viabilité des cellules procaryotes ou eucaryotes. Ces substrats sont sensibles à l'activité estérasique d'enzymes présentes chez la plupart des microorganismes. Cependant, cette activité estérasique se manifeste de manière résiduelle dans de nombreux milieux de culture prescrits par la Pharmacopée, notamment ceux comprenant des extraits de levure ou des extraits protéiques. De ce fait, ces substrats subissent souvent une hydrolyse abiotique non négligeable [Clarke, J.M. et al., 2001, Journal of microbiological methods, 46 :261-267] et sont, par conséquent, peu adaptés à une utilisation dans des tests de détection en milieu liquide. Par ailleurs, l'intensité de la fluorescence émise par ces substrats est sensible à certains paramètres physiques du milieu de culture, notamment le pH, ce qui peut avoir une influence sur la fiabilité de la détection. Les dérivés de la méthylumbelliférone (méthylumbelliféryl), à l'exception de certains de leurs dérivés acétate ou butyrate, sont des substrats beaucoup moins sensibles à une hydrolyse abiotique que les dérivés fluorescéine, mais de spectre beaucoup plus étroit. Il existe un choix cependant relativement large de substrats différents [Manafi, M., Kneifel, W. and Bascomb, S. (1991) Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol Mol Biol Rev. 55(3): 335-348] adaptés à la détection spécifique d'un certain nombre de souches courantes de bactéries. Néanmoins, les spectres d'émission en fluorescence de ces différents substrats méthylumbelliféryl tendent à se superposer, ce qui limite leur utilisation concomitante en vue de différencier différents types de microorganismes présents simultanément dans un même milieu de culture. Une autre famille de substrats fluorogènes, mise au point plus récemment par la société Biosynth, sont les AldolsTM Ces substrats présentent des caractéristiques similaires de celles des dérivés de la méthylumbelliférone. En particulier, les aldols présentent un spectre d'émission en fluorescence très proche de celui de composés méthylumbelliféryl. En conséquence, ils ne permettent pas, non plus, de faire une distinction entre les microorganismes présents dans un même milieu de culture, ni de déterminer leur proportion relative. Dans le but d'améliorer la spécificité et la rapidité des tests de stérilité effectués en milieu liquide, les présents inventeurs ont eu l'idée de tirer parti des spécificités des différentes familles de substrats susvisés, et de les combiner, pour parvenir à des tests de stérilité, qui soient à la fois plus rapides et qui permettent d'obtenir une information sur le type de microorganisme détecté. A cet effet, les inventeurs ont sélectionné et employé simultanément des substrats fluorogènes Aldols ou méthylumbelliféryl, stables dans les milieux de culture usuels, et les ont associés avec des substrats dont la fluorescence est, au contraire, sensible aux variations du pH du milieu de culture, tels que les dérivés de la fluorescéine ou l'HPTS. De manière surprenante, les inventeurs ont constaté que les mesures de fluorescence émise, d'une part, par les substrats fluorogènes (dérivés d'Aldols ou méthylumbelliféryl), et d'autre part, par les fluorophores sensibles au pH (fluorescéine ou HPTS), permettaient de détecter précocement une contamination et d'évaluer, dans une certaine mesure, le type de microorganismes impliqués dans la contamination. L'invention consiste donc, dans son principe général, en la mise en oeuvre simultanée de fluorophores, sensibles et non sensibles au pH, dans le but d'obtenir une détection universelle précoce des microorganismes, le couplage des mesures de fluorescence obtenues respectivement pour le fluorophore sensible au pH et le fluorophore activé par les cellules vivantes permettant d'obtenir une signature caractéristique des microorganismes rencontrés. Figure 1 : Résultats expérimentaux préliminaires à l'invention. Les différents graphiques représentent les résultats de mesures de la fluorescence relatifs aux différents fluorophores sensibles au pH, effectuées au cours de cultures réalisées pendant 24 heures d'E.coli, S.aureus et C.albicans en utilisant différentes concentrations pour chaque molécule. 1A : HPTS. 1B: Naphtofluorescéine. 1C: Fluorescéine. ID: Carboxynaphtofluorescéine. Figure 2 : Résultats expérimentaux préliminaires à l'invention. Le graphique rapporte la fluorescence émise par le HPTS en présence de différents microorganismes au cours de cultures de 24 heures. Figure 3 : Tableau récapitulant les différents essais de cultures mis en oeuvre selon l'invention pour obtenir les données expérimentales représentées dans les graphiques des figures 4 à 7. Figures 4 à 7 : Les graphiques des figures 4 à 7 représentent les résultats des mesures de fluorescence au cours du temps, relatives aux différentes associations de composés fluorescents utilisés, à savoir, respectivement : 4 - Association 4MU û HPTS ; 5 - Association 4MU û CF ; 6 - Association Aldol û HPTS ; 7 - Association Aldol û CF. Les mesures reportées sur ces graphiques sont telles que : Lml correspond à la fluorescence émise par les Aldols Lm2 correspond à la fluorescence émise par l'HPTS Lm3 correspond à la fluorescence émise par les 4-MU Lm4 correspond à la fluorescence émise par la Carboxyfluorescéine (CF) Chaque graphique A à F correspond à la culture d'un microorganisme comme indiqué ci-dessous: A - E. coli B - P. aeruginosa C - B. subtilis D - S. aureus E - A. brasiliensis F - C. albicans Le graphique G correspond aux mesures témoin (milieu de culture comprenant les associations susvisées, non contaminé). Figure 4 : Comparatif de la croissance des différents germes en présence du mélange de dérivés méthylumbelliféryl (4-MU phosphate, 4-MU beta-glucopyranoside, 4-MU alpha-glucopyranoside, 4-MU betagalactopyranoside) et d'acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique. (Association 4MU - HPTS). Figure 5 : Comparatif de la croissance des différents germes en présence du mélange de dérivés méthylumbelliféryl (4-MU phosphate, 4-MU beta-glucopyranoside, 4-MU alpha-glucopyranoside, 4-MU betagalactopyranoside) et de 5,6-carboxyfluorescéine. (Association 4MU - CF) Figure 6 : Comparatif de la croissance des différents germes en présence du mélange des dérivés d'Aldols (Aldol 470 phosphate, Aldol 470 acétate, aldol 455 beta-glucopyranoside, aldol 455 beta-galactopyranoside) et d'acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique (HPTS). (Association Aldol - HPTS) Figure 7 : Comparatif de la croissance des différents germes en présence du mélange des dérivés d'Aldols (Aldol 470 phosphate, Aldol 470 acétate, aldol 455 beta-glucopyranoside, aldol 455 beta-galactopyranoside) et de 5,6-carboxyfluorescéine. (Association Aldol - CF) 20 25 30 La présente invention consiste donc en un procédé de détection de microorganismes, utile, notamment, pour réaliser un test de stérilité en milieu de culture liquide, caractérisé en ce qu'il comprend la culture, dans un milieu approprié, d'un échantillon dont on cherche à déterminer s'il est contaminé par un microorganisme vivant. Ce procédé s'applique à toute forme d'échantillons filtrable ou non filtrable, notamment via une inoculation directe dudit échantillon dans un milieu de culture préalablement stérile. A cet égard, il est possible de filtrer un échantillon liquide, tel que de l'eau, ou un gaz, tel que l'air, à l'aide d'une membrane. Cette membrane est alors inoculée dans un milieu de culture liquide, comme si elle formait un échantillon solide. Selon l'invention, le procédé de détection comprend une ou plusieurs des étapes suivantes : (i) on place un échantillon tel que défini précédemment dans un milieu de culture comprenant : - au moins un substrat fluorogène ou une combinaison de substrats fluorogènes pouvant être activés par au moins une enzyme d'un microorganisme, et - au moins un fluorophore, dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture, dans des conditions permettant la croissance des microorganismes recherchés ; (ii) ledit milieu de culture est analysé en fluorescence pour déterminer, d'une part, la fluorescence liée à l'activation du substrat fluorogène contenu dans la milieu de culture par ledit microorganisme, et d'autre part, la fluorescence émise par ledit fluorophore indicative du pH du milieu de culture, (iii) les mesures de fluorescence déterminées pour le fluorophore dont la fluorescence est indicative du pH, ainsi que pour le substrat fluorogène sont analysées de sorte à déterminer la présence ou l'absence de(s) type(s) de microorganisme(s) recherché(s) dans le milieu de culture. Par substrat fluorogène, on désigne une molécule comprenant, d'une part, un groupement fluorophore capable d'absorber de l'énergie lumineuse et de restituer tout ou partie de cette énergie sous forme d'un spectre d'émission en fluorescence, et, d'autre part un groupement dit « quencher » masquant la fluorescence dudit groupement fluorophore. Au contact d'enzymes spécifiques des microorganismes, le substrat fluorogène adopte une forme différente permettant au fluorophore d'émettre en fluorescence. Cette activation se traduit soit par un changement de conformation de la molécule formant le substrat, soit par un clivage de celle-ci formant des résidus fluorescents. Différents substrats fluorogènes peuvent être envisagés selon l'invention. Des substrats fluorogènes préférés selon l'invention résultent après activation enzymatique en des composés 4-méthylumbelliférone, dont l'émission en fluorescence se situe autour de 460 ± 10 nm pour une longueur d'onde d'excitation d'environ 360 ± 10 nm. De tels substrats fluorogènes préférés selon l'invention sont, par exemple, les dérivés du méthylumbelliféryl (4-MU), notamment un ou plusieurs substrats choisis parmi les suivants : - 4-Méthylumbelliféryl acétate (CAS: 2747-05-9) - 4-Méthylumbelliféryl caprylate (CAS: 20671-66-3) - 4-Méthylumbelliféryl a-D-glucopyranoside (CAS: 17833-43-1) H- ,) •:'"j``- Ho Oé - 4-Méthylumbelliféryl R-D-glucopyranoside (CAS: 18997-57-4) , HO HO Off-, 4-Méthylumbelliféryl a-D-galactopyranoside (CAS: 38597-12-5) 4-Méthylumbelliféryl R-D-galactopyranoside (CAS: 6160-78-7) - 4-Méthylumbelliféryl phosphate (CAS: 3368-04-5) 0 O OH r \-i15 Ces substrats étant relativement spécifiques d'une catégorie de microorganismes, c'est-à-dire activés seulement par certaines enzymes qui ne sont pas présentes chez tous les microorganismes, il est avantageux, selon l'invention, d'en sélectionner plusieurs, de sorte à élargir le spectre de la détection. Les inventeurs ont déterminé, plus particulièrement, que l'association de 4 dérivés méthylumbelliféryl sélectionnés parmi les composés susvisés, était avantageuse, notamment celle incluant le 4-MU phosphate, 4-MU alpha-D-glucopyranoside (ou alpha-D-glucoside), 4-MU beta-D- glucopyranoside (ou beta-D-glucoside) et le 4-MU beta-D-galapyranoctoside (ou beta-D-galactoside). Cette association permet d'obtenir la détection de la plupart des microorganismes couramment recherchés, en particulier les suivants : les bactéries à gram négatif tels que E. coli et P. aeruginosa, les bactéries à gram positif, B. subtilis et S.aureus, et les champignons C.albicans et A. brasiliensis. L'invention ne se limite toutefois pas à ces seules espèces et le terme microorganisme doit être compris comme désignant toute cellule vivante capable de se multiplier de manière autonome. Par cellule, on entend un cytoplasme délimité par une membrane, comprenant un patrimoine génétique. Les composés commercialisés sous le nom d'AIdolTM (Biosynth AG, Rietlisstrasse 4, 9422 Staad, Suisse) sont des substrats préférés selon l'invention, au même titre que les précédents, en particulier les composés Aldol 470 (1-[2-(2,4-Diméthoxybenzoyl)phényl]-1 H-indol-3-yl) et Aldol 455 (1- (2-benzoylphényl)-6-chloro-1 H-indol-3-yl), ainsi que leurs dérivés, en particulier, les dérivés acétate, phosphate, beta-galactoside et beta-glucoside desdits composés. Ces composés sont décrits dans la demande de brevet européen déposée sous le n°09159639. Ces composés présentent l'avantage d'être activables en condition aérobie, aussi bien qu'en condition anaérobie, sans produire de toxicité sur les microorganismes. Au sens de la présente invention, « un fluorophore dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture » désigne une molécule dont l'intensité de l'émission en fluorescence varie en fonction de l'évolution du pH dans le milieu de culture ou dont la longueur d'onde d'émission varie en fonction de cette même évolution du pH pour une longueur d'onde d'excitation constante, la concentration de cette molécule dans le milieu restant sensiblement constante. De préférence, lesdites variations de fluorescence s'observent dans une gamme de pH comprise entre 3 et 10, de préférence entre 5 et 9, plus préférentiellement entre 6 et 8. Les mécanismes moléculaires expliquant ces variations de fluorescence en fonction du pH ont été décrits, par exemple, pour certains dérivés cyanines [Briggs M.S. et al. (2000) Chem. Commun. 2323-2324]. Par variation de la fluorescence, on entend une variation d'au moins 10 % de la RFU (unité de fluorescence relative), de préférence d'au moins 20% et plus préférentiellement d'au moins 30% pour une variation d'une unité de pH. Les fluorophores dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture, préférés selon l'invention, sont sélectionnés parmi l'acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique ou un de ses sels, les composés cyanines ou l'un de leurs dérivés, en particulier la pentaméthine cyanine ou bien un composé comprenant de la fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters. Parmi les composés comprenant de la fluorescéine, la carboxyfluorescéine est préférée, notamment la 5(6)-carboxyfluorescéine (CAS 72088-94-9). Un fluorophore préféré de l'invention est aussi l'acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique trisodique (HPTS) (CAS 27928-00-3). L'association de CF et de 4-MU est préférée selon l'invention. En effet, le couplage des mesures de fluorescence effectuées par rapport à l'un et l'autre des spectres d'émission en fluorescence de ces composés a permis une détection précoce et spécifique des microorganismes. Ainsi que cela ressort des exemples expérimentaux présentés plus loin dans la présente demande, les variations respectives au cours du temps de la fluorescence liée à l'un et l'autre des composés fluorescents sont différentes pour chaque type de microorganismes, ce qui forme une signature unique pour chacun d'entre-eux, détectable à un stade précoce du procédé de détection des microorganismes. Les associations selon l'invention d'un ou plusieurs composés Aldols et de carboxyfluorescéine, ou d'HPTS et d'un ou plusieurs dérivés de la méthylumbelliféryl se sont également montrées pertinentes pour détecter et obtenir une signature spécifique des microorganismes. Les profils obtenus s'expliquent, du moins en partie, par des différences de métabolisme entre les différentes espèces de microorganismes (influence sur le pH du milieu, vitesse de croissance, intensité de l'activation des substrats fluorescents etc....). L'invention, dans l'un de ses aspects fondamentaux, a pour objet le couplage des mesures de fluorescence provenant respectivement de l'activation du substrat fluorogène et du fluorophore sensible au pH, dans un même milieu de culture, dans le but d'identifier le type de microorganisme présent dans ce milieu de culture. Par couplage, on entend la mise en relation de la mesure de fluorescence rendant compte de l'activation du substrat fluorogène avec l'autre mesure de fluorescence rendant compte de la variation du pH du milieu de culture. De préférence, cette relation est établie en fonction d'une variable de temps (t), par calcul ou sous forme d'une représentation graphique. Selon un aspect préféré de l'invention, le couplage de ces données permet d'obtenir une description de l'évolution du milieu de culture propre aux différents types de microorganismes, intégrant les variables pH, temps et activité enzymatique microbienne. Ainsi, le procédé de détection des microorganismes selon l'invention peut comprendre, à l'étape ii) décrite plus haut que la fluorescence soit mesurée à intervalles réguliers pour obtenir une variation de fluorescence en fonction du temps. De même, à l'étape iii), les mesures de fluorescence peuvent être comparées à des mesures type référencées dans une base de données, permettant de mieux discriminer les différents types de microorganismes. L'invention, dans l'un de ces aspects, a pour objet un milieu de culture permettant plus particulièrement la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, lequel est formé d'un support liquide ou solide nutritif, dans lequel sont solubilisés de manière homogène au moins un substrat fluorogène ou combinaison de ces substrats fluorogènes, et au moins un fluorophore dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture, tels que définis ci-dessus respectivement. Le support nutritif est le plus souvent un milieu classique déjà décrit ne comprenant pas d'agents fluorescents. La fluorescence propre du support nutritif est, en outre, de préférence, insensible aux variations du pH du milieu de culture, ainsi qu'à l'introduction desdits microorganismes dans le milieu de culture. En d'autres termes, il convient de veiller préférentiellement à ce que le milieu de culture lui-même, ne connaisse pas de variations de fluorescence susceptibles d'interférer avec la fluorescence émise par les fluorophores. Les conditions de culture des microorganismes sont sensiblement les mêmes que celles décrites dans la littérature, notamment, dans la Pharmacopée, pour un milieu classique. Bien qu'initialement conçue pour des cultures en milieu liquide, rien ne s'oppose à ce que l'invention soit mise en oeuvre avec des milieux de cultures gélosés en utilisant des dispositifs de mesure de la fluorescence adaptés (par exemple un cytomètre à balayage), lesquels sont connus de l'homme du métier. Un milieu de culture selon l'invention comprend de préférence, comme substrat(s) fluorogène(s) et fluorophore(s), les composés ou associations de composés détaillées plus haut. Selon un aspect préféré de l'invention, le procédé de détection des microorganismes peut comprendre une l'étape i) dans laquelle le ou les microorganisme(s) sont préalablement filtré(s) sur une membrane avant d'être mis en culture. L'invention vise également un kit de détection de microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend un milieu de culture selon l'invention, ou bien sous forme de conditionnements séparés en vue d'être mélangés : - un milieu de culture classique pour microorganismes ; - au moins un substrat fluorogène ou une combinaison de substrats fluorogènes soluble dans ledit milieu de culture ; et - au moins un fluorophore, soluble dans ledit milieu de culture, dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture. Le milieu de culture peut être conditionné sous forme déshydratée pour des besoins de conservation ou de commodité. Un tel kit de détection peut comprendre, en outre, une membrane pour la mise en oeuvre d'un test de stérilité précédé d'une étape de filtration. Une telle membrane de filtration peut être mono ou multicouche. Elle est en général constituée d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi le polytétrafluoroéthylène, le fluorure de poly(vinylidène) (PVDF), le polycarbonate, le polyamide, le polyester, le polyéthersulfone, l'acétylcellulose et la nitrocellulose. Un exemple de ce type de membrane est commercialisé par le demandeur sous la référence (HAWG Milliflex, Millipore). Un kit selon l'invention peut comprendre, en outre, une unité de filtration, bouteille ou poche, de préférence stériles, destinées à recevoir le milieu de culture pour la mise en oeuvre d'un test de stérilité. Les exemples qui suivent ont pour but de compléter la description de l'invention sans y apporter de limitation. EXEMPLE 1/ Préparation des milieux de culture 100 mL de milieu TSB (Biomerieux) liquide a été préparé et stérilisé selon les recommandations du fabriquant. Puis, selon les différentes associations définies ci-après, les solutions de fluorophores sensibles au pH et substrats fluorogènes suivants ont été ajoutées stérilement au milieu TSB: Fluorophores sensibles au pH: HTPS : 30 - 30 pL d'une solution stock stérile à 10 mm de l'acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique ; ou CF: - 20 pL d'une solution stock stérile à 100 pM de 5,6-5 carboxyfluorescéine Substrats fluorogènes : Aldols : - 200 pL du mix stérile de dérivés d'Aldols (Aldol 470 phosphate, Aldol 470 acétate, aldol 455 beta-D-glucopyranoside, aldol 455 beta-D- 10 galactopyranoside) où chaque dérivé a une concentration stock de 25 mg/mL ; ou 4-MU : - 200 pL du mix stérile de dérivés 4-méthylumbelliféryl (4-MU phosphate, 4-MU beta-D-glucopyranoside, 4-MU alpha-D-glucopyranoside, 4- 15 MU beta-D-galactopyranoside) (4-MU) où chaque dérivé a une concentration stock de 50 mg/mL. Les solutions de fluorophores et de substrats fluorogènes, ont été préalablement stérilisées à l'aide d'une unité de filtration Stéricup 20 possédant une membrane filtrante ayant des pores de 0.22 pm avant d'être incorporées pour former les milieux de culture testés. Référence des produits utilisés (# références catalogues) : 25 30 TSB HPTS 5,6-carboxyfluorescéine Aldol 470 phosphate Aldol 470 acétate Aldol 455 beta-D-glucopyranoside Aldol 455 beta-D-galactopyranoside 4-MU phosphate 4-MU beta-D-glucopyranoside 4-MU alpha-D-glucopyranoside Biomerieux # 41146 Fl u ka # 56360 Sigma # 21877 Biosynth # A-4678 Biosynth # A-4680 Biosynth # A-4689 Biosynth # A-4684 Glycosynth # 44093 Glycosynth # 44059 Glycosynth # 44051 4-MU beta-D-galactopyranoside: Glycosynth # 44045 2/ Préparation des suspensions de microorqanismes Les tests ont été conduits avec les microorganismes suivants: 10 A E. coli B P. aeruginosa C B. subtilis D S. aureus E A. brasiliensis F C. albicans ATCC 8739 ATCC 9027 ATCC 6633 ATCC 6538 ATCC 16404 DSMZ 1386 Chaque souche de microorganismes a été diluée jusqu'à une concentration initiale variant entre 103 et 104 cellules/mL (102 cellules/mL pour A. brasiliensis). 15 3/ Préparation des cultures sur une plaque de 96 puits Pour les essais une plaque de 96 puits Greiner Bio-One pClear Plate de référence 655090 a été utilisée. Les inocula pour chaque souche ont été introduits dans la première colonne de chaque série de milieu de culture, puis dilués au 1/10° en 20 série. La figure 3 récapitule les différents essais de cultures réalisés, lesquelles sont effectués à l'aide des milieux de culture indiqués ci-dessous. Pour l'association 4MU ù HPTS : - TSB - Mélange de dérivés méthylumbelliféryl (4-MU phosphate, 4-MU beta-glucopyranoside, 4-MU alpha-glucopyranoside, 4-MU betagalactopyranoside) et - Acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique. Pour l'association 4MU ù CF: - TSB 25 30 - Mélange de dérivés méthylumbelliféryl (4-MU phosphate, 4-MU beta-glucopyranoside, 4-MU alpha-glucopyranoside, 4-MU betagalactopyranoside) et - 5,6-carboxyfluorescéine. Pour l'association Aldol ù HPTS : - TSB - Mélange des dérivés d'Aldols (Aldol 470 phosphate, Aldol 470 acétate, aldol 455 beta-glucopyranoside, aldol 455 betagalactopyranoside) et - Acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique (HPTS). Pour l'association Aldol - CF: - TSB - Mélange des dérivés Aldol (Aldol 470 phosphate, Aldol 470 acétate, aldol 455 beta-glucopyranoside, aldol 455 beta- 15 galactopyranoside), et - 5,6-carboxyfluorescéine. Chaque milieu ci-dessus est testé pour chacun des microorganismes suivant trois dilutions différentes. Le lecteur de plaque de 96 puits de marque Gemini a été 20 programmé afin de réaliser une acquisition sur 72h toutes les 30 minutes, soit 145 points de mesure. L'acquisition des valeurs de fluorescence est réalisée par une lecture optique du bas des puits. Chaque puits fait l'objet de 10 mesures et la valeur moyenne est 25 enregistrée. Pour chaque puits, il est réalisé 4 types de mesure : 1 ù Lml : Exc : 355 nm Em : 555 nm cutoff : 530 nm 2 ù Lm2 : Exc : 403 nm Em : 451 nm cutoff : 435 nm 3 ù Lm3 : Exc : 360 nm Em : 455 nm cutoff : 435 nm 30 4 ù Lm4 : Exc : 485 nm Em : 525 nm cutoff : 595 nm L'acquisition sur le canal Lml permet de mesurer la fluorescence des aldols. 10 L'acquisition sur le canal Lm2 permet de mesurer la fluorescence de l'HPTS. L'acquisition sur le canal Lm3 permet de mesurer la fluorescence des 4-MU. L'acquisition sur le canal Lm4 permet de mesurer la fluorescence de la CF. Les cinétiques d'acquisition ont été réalisées à l'aide du software softmax Pro. 4/ Analyse des résultats obtenus Les résultats des mesures de fluorescences sont représentés sous la forme de graphiques dans les figures 4 à 7. Les figures 4A à 4G concernent l'association 4-MU + HPTS. Les figures 5A à 5G concernent l'association 4MU + CF. Les figures 6A à 6G concernent l'association Aldol + HPTS. Les figures 7A à 7G concernent l'association Aldol + CF. Les graphiques notés G correspondent au témoin négatif non contaminé. Dans tous les cas un profil caractéristique des germes est obtenu sur le canal permettant de mesurer une baisse de pH (HPTS ou CF), ainsi que sur celui permettant de mesurer l'activité métabolique (4-MU ou Aldol). En particulier, des profils très atypiques sont obtenus dans le cas de P. aeruginosa, le signal lié à l'utilisation d'HPTS augmente alors que le pH diminue (Fig. 4B et 6B). D'une manière similaire pour S. aureus, le signal lié à l'utilisation de 4-MU forme un pic, puis augmente de façon quasi linéaire (Fig. 4D et 5D). En ce qui concerne l'utilisation de carboxyfluorescéine (CF) on peut noter des profils de chute de pH variant en fonction des souches (Fig. 5 et 7). REVENDICATIONS1. Milieu de culture pour détecter la présence de microorganismes, caractérisé en ce qu'il est formé d'un support liquide ou solide nutritif, dans lequel sont solubilisés de manière homogène : - au moins un substrat fluorogène ou une combinaison de substrats fluorogènes, pouvant être activés par au moins une enzyme d'un microorganisme, et - au moins un fluorophore, dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture, la fluorescence propre dudit support nutritif étant, de préférence, insensible aux variations du pH du milieu de culture et à l'introduction desdits microorganismes dans le milieu de culture. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit support nutritif est liquide. 3. Milieu de culture selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit support nutritif est gélosé. 4. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat fluorogène sélectionné parmi le 4-méthylumbelliférone ou un dérivé de celui-ci. 5. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat fluorogène consiste en un mélange de dérivés du 4-méthylumbelliférone (4-MU). 6. Milieu de culture selon la revendication 5, caractérisé en ce que le (les) dérivé(s) de 4-méthylumbelliférone est (sont) sélectionné(s) parmi les composés suivants : 4-MU phosphate, 4-MU butyrate, 4-MU acétate, 4-MU alpha-glucoside, 4-MU beta-glucoside, 4-MU beta-galactoside, 4-MU N,N diacétylchitobioside, 4-MU N,N,N triacétylchitotrioside, 4-MU caprylate, introduits dans le milieu de culture séparément ou en mélange. 7. Milieu de culture selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat fluorogène consiste en un mélange des composés dérivés du 4-méthylumbelliférone suivants : 4-MU phosphate, 4-MU alpha-glucoside, 4-MU beta-glucoside et 4-MU beta-galactoside. 8. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat fluorogène sélectionné parmi les composés suivants : - 1 -(2-benzoylphényl)-6-chloro-1 H-indol-3-yl-beta-glucopyranoside ; - 1 -(2-benzoylphényl)-6-chloro-1 H-indol-3-yl- beta-galactopyranoside ; - 1 -(2-benzoylphényl)-6-chloro-1 H-indol-3-yl-acétate; ou - 1 -(2-benzoylphényl)-6-chloro-1 H-indol-3-yl-phosphate. 13. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit fluorophore, dont la fluorescence est indicative du pH du milieu de culture, est sélectionné parmi l'acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique (HPTS), un composé cyanine ou l'un de ses dérivés, ou bien un composé fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters. 14. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit fluorophore, dont la fluorescence varie en fonction du pH du milieu de culture, est la 5,6 carboxyfluorescéine ou un de ses sels ou esters. 15. Procédé de détection de microorganismes (test de stérilité), caractérisé en ce qu'il comprend la culture dans un milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, d'un échantillon dont on cherche à déterminer s'il est contaminé par un microorganisme vivant. 16. Procédé de détection de microorganismes selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'échantillon testé est un filtre ou une membrane ayant préalablement servi à filtrer un volume d'eau ou de gaz. 17. Procédé de détection d'un ou plusieurs microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :(i) on place un échantillon dans un milieu de culture comprenant : - au moins un substrat fluorogène ou une combinaison de substrats fluorogènes pouvant être activés par au moins une enzyme d'un microorganisme, et - au moins un fluorophore, dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture, dans des conditions permettant la croissance des microorganismes recherchés ; (ii) ledit milieu de culture est analysé en fluorescence pour déterminer, d'une part, la fluorescence liée à l'activation du substrat fluorogène contenu dans la milieu de culture par ledit microorganisme, et d'autre part, la fluorescence émise par le fluorophore dont la fluorescence est indicative du pH du milieu de culture, (iii) les mesures de fluorescence déterminées pour le fluorophore dont la fluorescence est indicative du pH, ainsi que pour le substrat fluorogène, sont analysées de sorte à déterminer la présence ou l'absence de(s) type(s) de microorganisme(s) recherché(s) dans le milieu de culture. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 10. 15. Procédé de détection de microorganismes selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'à l'étape i), ledit microorganisme est préalablement filtré sur une membrane avant d'être mis en culture. 16. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce qu'à l'étape ii) la fluorescence est mesurée à intervalles réguliers pour obtenir une variation de fluorescence en fonction du temps. 17. Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape iii) les mesures de fluorescence sontcomparées à des mesures type référencées dans une base de données. 18. Kit de détection des microorganismes caractérisé en ce qu'il comprend: - un milieu de culture pour microorganismes ; - au moins un substrat fluorogène ou une combinaison de substrats fluorogènes solubles dans ledit milieu de culture ; - au moins un fluorophore, soluble dans ledit milieu de culture, dont la fluorescence est indicative du pH dudit milieu de culture. 19. Kit de détection selon la revendication 18, caractérisé en ce que le milieu de culture est conditionné sous forme déshydratée. 20. Kit de détection selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que le milieu de culture, le substrat fluorogène et ledit fluorophore dont la fluorescence est indicative du pH, sont contenus dans une cassette gélosée.