Brevet FR2958936A1 — publié le 20111021

Protéine de fusion Robot-Fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs. La présente invention concerne une protéine recombinante Robol-Fc et son utilisation pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine Slit est surexprimée. Elle concerne également une composition comprenant une telle protéine recombinante. Un autre aspect de l'invention consiste en l'utilisation d'une molécule Robol-Fc en tant qu'outil de diagnostic pour détecter la surexpression d'une molécule de la famille Slit chez un patient. Les ligands Slits ont tout d'abord été décrits pour leur rôle dans la répulsion de la pousse des axones dans le développement neuronal. Depuis, la voie de régulation Robo/Slit a également été décrite dans l'angiogenèse tumorale. En effet, la voie Robo4/Slit2 a été décrite pour inhiber la réponse des cellules endothéliales au VEGF (Jones C.A. et al. Nat. Med 14, 448û453 (2008). La régulation par la voie Robo/Slit permet de canaliser la prolifération excessive de néo vaisseaux non matures ou bourgeons endothéliaux (angiogenèse non productive) et de maturer ces vaisseaux. L'expression de Slit2 au niveau transcriptionnel a été démontré dans plusieurs lignées cancéreuses humaines notamment HCT116 issue de carcinome de colon, Skov-3 issue de carcinome ovarien, HeLa issue de cancer du col de l'utérus, MDA-MB-435 issue de mélanome, Hec-1A issue de cancer de l'utérus et enfin 769-P issue de carcinome rénal (Stella MC et al., Mol Biol Cell. 2009 Vol. 20, Issue 2, 642-657). Une surexpression de la protéine Slit2 a également été démontrée sur des tissus humains issus de carcinomes : carcinome buccal (Wang et al. 2008, Cancer Sci. 2008 Mar;99(3):510-7), carcinome de la prostate (Latil et al. 2003 Int J Cancer. 2003 Jan 20;103(3):306-15), du colon (Wang et al. 2003, Cancer Cell, Volume 4, Issue 1, July 2003, Pages 19-29), du foie (Avci et al, 2008, BMC cancer, 8:392). Plus récemment, la surexpression de la protéine Slit2 a été montrée sur des échantillons d'endométriose (Shen et al, 2009, AJP 175 (2): 479). La protéine Robol se présente sous deux isoformes a et b. Le domaine extracellulaire de la protéine Robol isoforme b (NP_598334) comprend 5 domaines immunoglobuline : Ig1, Ig2, Ig3, Ig4 et Ig5. La protéine Robo interagit avec les ligands Slit au niveau des domaines Ig1 et Ig2. Liu et al. (2004, Mol. Oeil Neurosci, 26 :232-240) ont démontré l'importance du domaine Ig2 dans l'interaction avec Slit et dans l'activité de Robo (chémorépulsion). L'utilisation d'anticorps spécifiques des protéines Robol et Slit2 a été décrite dans la demande WO2003/075860. Ces anticorps permettent d'inhiber l'angiogenèse tumorale. Cependant, il serait intéressant de proposer une approche alternative pour traiter le cancer, notamment une molécule capable d'inhiber la voie de signalisation de Slit-2. Les inventeurs ont développé une stratégie de récepteurs Robol chimères solubles capables de lier les ligands Slits et par conséquent d'inhiber la signalisation intracellulaire de la voie Robo/Slit. De manière surprenante, les molécules Robol-Fc selon l'invention ont un effet anti-angiogène en empêchant la formation de vaisseaux matures et non en inhibant la prolifération des cellules endothéliales. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet une protéine recombinante Robo-Fc comprenant le domaine extracellulaire de la protéine Robol isoforme b ou un partie de ce domaine, une région de jonction (linker) et un domaine Fc. Dans un mode particulier de réalisation, le domaine extracellulaire de la protéine Robol isoforme b est constitué des domaines Ig1 et Ig2. Ces domaines correspondent au peptide de SEQ ID NO.2 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.1. La protéine de fusion comprend également une région de jonction, aussi appelée « linker ». Dans le cadre de la présente invention, le linker permet d'apporter de la stabilité à la protéine recombinante, notamment en limitant le clivage in vivo. Des linkers pouvant être utilisés dans une molécule Robol-Fc sont par exemple GluArgProSerPheVal et GlyGlyGlyGlySer. L'homme du métier a les connaissances suffisantes pour choisir un linker adapté à cette utilisation. Le domaine Fc des molécules recombinantes Robol-Fc selon l'invention correspond à un fragment cristallisable d'une immunoglobuline. Ce fragment Fc peut provenir de différentes immunoglobulines IgG1, Ig2, IgG3 ou IgG4. Il est responsable de la fonction effectrice de la réponse immune (WO2008/065543). Dans un mode de réalisation selon l'invention, le domaine Fc provient d'une immunoglobuline IgG4, dans lequel trois mutations ponctuelles ont été introduites de sorte à augmenter la stabilité pont disulfure entre les 2 domaines Fc (Angla et al., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108) et à éliminer l'activité effectrice résiduelle du IgG4-Fc (WO 97/09351). Des molécules Robot-Fc selon l'invention comprenant les domaines Ig1 et Ig2 de Robot isoforme b, un linker et un domaine IgG4 muté comme décrit précédemment sont Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3. Robot-Fc L1 correspond à la protéine de séquence SEQ ID NO.4, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.3. Robot-Fc L2 correspond à la protéine de séquence SEQ ID NO.6, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.5. Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 diffèrent par la nature du linker. Robot-Fc L3 correspond à la protéine de séquence SEQ ID NO.24, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.23. Elle correspond à Robot-Fc L1 dans laquelle les deux acides aminés situés en position Nt ont été tronqués de sorte à augmenter l'homogénéité lors de la production. L'invention a également pour objet des protéines dont la séquence protéique correspond aux séquences SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 ou SEQ ID NO.24 ou présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité avec les séquences SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 ou SEQ ID NO.24. Ces variants protéiques présentent la même activité biologique que les protéines de ayant pour séquence SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 ou SEQ ID NO.24, en particulier leur capacité à interagir avec les protéines de la famille Slit. Les protéines Robot-Fc selon l'invention peuvent être produite par transfection des plasmides d'expression codant pour ces protéines dans tout type cellulaire adapté à l'expression de protéines recombinantes eucaryotes : HEK293, CHO, ... puis récupérées dans le surnageant de culture et purifiées selon les méthodes classiques. La caractérisation des protéines Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3 selon l'invention a permis de confirmer qu'elles présentent les qualités requises pour leur administration en tant qu'agent biothérapeutique. Une protéine Robot-Fc selon l'invention a la capacité d'interagir avec une protéine de la famille Slit. Les protéines Robot-Fc selon l'invention reconnaissent spécifiquement les protéines SIit1, Slit2 et Slit3 humaines et la protéine Slit2 murine, en particulier par interaction avec leur domaine D2. Leur affinité est similaire vis-à-vis des 3 membres de la famille Slit. Un autre objet selon l'invention correspond aux molécules d'acides nucléiques codant les protéines selon l'invention. Ainsi les molécules d'acides nucléiques correspondant aux séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 ou SEQ ID NO.23 ou présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité avec les molécules ayant pour séquence SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 ou SEQ ID NO.23 font partie de l'invention. Un autre objet selon l'invention consiste en l'utilisation d'une protéine Robot-Fc selon l'invention pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine de la famille Slit est surexprimée. Les protéines de la famille Slit qui peuvent être ciblées par les Robot-Fc selon l'invention sont Slit-1, Slit-2 ou Slit-3. Il a été montré que Robot pouvaient interagir avec les différents membres de la famille Slit. De ce fait, il est avantageux de noter que les protéines Robot-Fc sont capables d'inhiber simultanément les voies de signalisation médiées par SIit1, Slit2 et Slit3, ce qui permet d'élargir le spectre thérapeutique en comparaison aux anticorps qui ne sont spécifiques que d'une de ces voies. Dans un autre mode de réalisation, une protéine Robot-Fc est utilisée pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine de la famille Slit est surexprimée en inhibant l'angiogenèse sans inhiber la prolifération des cellules endothéliales. Cette activité antiangiogénique liée à un défaut de maturation des vaisseaux est appelée « angiogenèse non-productive ». En effet, les études expérimentales ont montré que les molécules Robot-Fc selon l'invention sont capables d'inhiber la formation de tubules, sans inhiber la prolifération des cellules endothéliales. Elles permettent de réduire de façon très significative le volume tumoral dans un modèle murin de cancer pulmonaire. Dans un mode préféré de réalisation, les protéines Robot-Fc pouvant être utilisées pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine Slit est surexprimée sont Robol-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3. De manière générale, les maladies susceptibles d'être traitées par une protéine Robot-Fc selon l'invention sont toutes les maladies dans lesquelles une inhibition de la voie Slit peut avoir un effet thérapeutique, en particulier les maladies dans lesquelles une protéine de la famille Slit est surexprimée, et notamment celles dans lesquelles Slit2 est surexprimée. Les molécules Robot-Fc selon l'invention liant spécifiquement la molécule Slit-2, il est intéressant de noter que celles-ci sont capables d'inhiber simultanément les deux voies dans lesquelles Slit-2 est impliquée, à savoir les voies Robot/Slit-2 et Robo4/Slit-2. Les protéines Robot-Fc selon l'invention peuvent donc être utilisées pour traiter le cancer, notamment le cancer du pancréas, le cancer du colon, le cancer colorectal avec ou sans métastase lymphatique, le cancer du sein, le cancer du poumon et les métastases pulmonaires, le cancer ovarien, le cancer du col de l'utérus, les mélanomes, le cancer rénal, le cancer buccal, le cancer de la prostate, le cancer du foie... Dans un mode de réalisation particulier, les protéines Robo-Fc sont utilisées pour traiter le cancer du poumon. Les molécules Robot-Fc selon l'invention peuvent également utilisées en tant que médicament anticancéreux en alternative ou en complément aux thérapeutiques actuelles. En particulier, ces molécules peuvent être administrées en association (simultanée ou non) avec des composés anti-cancéreux. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une protéine Robol-Fc telle que définie précédemment et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptable. Les protéines Robol-Fc selon l'invention peuvent être formulées dans des compositions pharmaceutiques en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, les compositions pharmaceutiques contiennent des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc., ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Un autre aspect de l'invention consiste en l'utilisation d'une molécule Robol-Fc en tant qu'outil de diagnostic pour détecter la surexpression d'une molécule de la famille Slit chez un patient. En effet, il a été montré que la voie Slit est impliquée dans de nombreux cancers. La mise à disposition d'un test pour évaluer une dérégulation de la voie de signalisation des Slit est très utile dans le but de sélectionner les patients susceptibles de répondre à un traitement reposant sur l'administration d'une molécule Robol-Fc. Cet outil de diagnostic peut se présenter sous forme d'un kit prêt à l'emploi, comprenant une molécule Robol-Fc sous une forme adaptée à sa mise en contact avec un échantillon biologique de patient (sang, urine, biopsie de tumeurs) susceptible de présenter une surexpression d'une molécule Slit. La molécule Robo-Fc peut être préalablement marquée ou non, et l'association Robo-Fc et Slit est détecter de sorte à évaluer une augmentation de l'expression d'une protéine Slit dans l'échantillon biologique en comparaison avec un échantillon témoin. Ce kit peut par exemple se présenter sous forme d'un kit ELISA. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Plasmides d'expression des protéines Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3. Figure 2 : Evaluation de l'interaction des variants de protéine de fusion Robot-Fc avec la protéine Slit2 par ELISA. Figure 3 : Affinité de Robot-Fc pour les cellules HEK293 n'exprimant pas Slit-2 mesurée par FACS. Figure 4 : Affinité de Robot-Fc pour les cellules HEK293 exprimant Slit2 mesurée par FACS. Figure 5 : Profil pharmacocinétique des protéines Robot-Fc après une injection iv chez la souris. A. Administration de Robot-Fc L1 B. Administration de Robot-Fc L2. Figure 6: Effet de la molécule Robot-Fc L1 dans un test co-culture avec des cellules endothéliales et des cellules mesenchymateuses A. Robot-Fc L1 inhibe la formation de tubule en culture. B. Robot-Fc L1 inhibe significativement la formation de pseudo-tubule induite par le VEGF. Figure 7 : Evaluation de l'effet de la molécule Robot-Fc L1sur un modèle ex vivo d'anneau aortique chez la souris. A : Description du protocole de préparation d'un anneau aortique et de la mesure des tubules. B : a. Contrôle ; b. Robot-Fc Slit-2- moins 500 pg/mL + VEGF 10 ng/mL ; c. Robot-Fc L1 500 pg/mL + VEGF 10 ng/mL. EXEMPLES Exemple 1 : Préparation des protéines Robot-Fo a. Constructions permettant l'expression des protéines recombinantes Robo1-Fc utilisées comme agents biothérapeutiques. Les protéines recombinantes Robot-Fc sont constituées d'une fusion entre les 2 7 premiers domaines immunoglobuline (Ig1-Ig2) de la protéine Robot humaine isoforme b (NP_598334) et le domaine Fc de l'immunoglobuline G4 humaine (hIgG4-Fc, SwissProt IGHG4_HUMAN). Pour obtenir la construction Robot-Fc L1, un fragment du cDNA (SEQ ID NO.1) correspondant aux domaines immunoglobuline (Ig) Ig1 et Ig2 de cette protéine (SEQ ID NO.2) suivi d'un linker GluArgProSerPheVal a été amplifié par PCR à partir de la banque de cDNA de coeur foetal humain (ref. HL5042T Clontech). Ce fragment amplifié a ensuite été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4904 (décrit à la Figure 1) afin que les deux domaines Ig de Robot soient exprimés en fusion avec le domaine Fc de l'IgG4 humaine en position C-terminale. Trois mutations ponctuelles ont été introduites dans le domaine IgG4-Fc pour obtenir les caractéristiques suivantes : S241 P (numérotation Kabat) afin de stabiliser la liaison par pont disulfure dans la région charnière de Fc ; L248E afin d'éliminer l'activité effectrice résiduelle du domaine IgG4-Fc ; Absence de la lysine C-terminale afin de réduire l'hétérogénéité de la protéine. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.3. La protéine recombinante obtenue est nommée Robot-Fc L1 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.4. Pour obtenir la construction Robot-Fc L2, le même cDNA correspondant aux domaines Ig1-Ig2 mais sans le linker mentionné a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4909 (décrit à la Figure 1) qui permet l'expression de ces domaines Ig en fusion avec le même domaine Fc de l'IgG4 contenant les 3 mutations ponctuelles décrites dans la construction de Robot-Fc L1, mais en introduisant cette fois un linker GlyGlyGlyGlySer en amont du domaine Fc . La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.5 La protéine recombinante obtenue est nommée Robo1-Fc L2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.6. b. Construction des protéines Robot-Fc utilisées comme contrôles Pour obtenir la construction Robot-Fc Slit-2-moins, le cDNA cloné précédemment dans le plasmide pXL4904 a été modifié par PCR pour introduire les mutations ponctuelles permettant les substitutions de la leucine position 38 en glutamine et la phénylalanine en position 89 en tyrosine. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.7. La protéine recombinante obtenue est nommée Robol-Fc Slit-2 moins et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.8. Pour obtenir la construction Robol-Fc Héparine-moins, le cDNA cloné dans le plasmide pXL4904 a été modifié par PCR pour introduire les mutations ponctuelles permettant les substitutions de l'arginine position 97 en alanine et la lysine position 98 en alanine. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.9. La protéine recombinante obtenue est nommée Robol-Fc Héparine-moins et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO. 10. c. Production des différentes protéines Robol-Fc Les deux protéines Robol-Fc L1 et Robol-Fc L2 ont été produites par transfection transitoire dans la lignée HEK293 (cellules FreeStyle 293-F réf 51-0029 Invitrogen selon les recommandations du fournisseur) à l'aide des plasmides pXL4904 et pXL4909 respectivement, et des plasmides accessoires pXL4544 et pXL4551 permettant l'expression de deux enzymes de glycosylation des N-glycans, i.e. la a-2,3-sialyltransférase et la 3-1,4-galactosyltransférase comme cela a été décrit dans la demande WO2008/065543. Ces protéines ont aussi été produites par transfection dans la lignée CHO (cellules CHO-S, réf 11619-012 Invitrogen selon les recommandations du fournisseur) à l'aide des plasmides pXL4904 et pXL4909 respectivement. Les protéines Robol-Fc L1 et Robol-Fc L2 exprimées dans le surnageant de culture des cellules HEK293 ont été purifiées par chromatographie sur colonne d'affinité protéine A (MabSelect ref. 17-5199-02 Amersham Biosciences) et élution en tampon 20 mM NaCl / 100 mM acide acétique puis formulée en tampon PBS (réf. 14190-094, Invitrogen). Les protéines recombinantes Robol-Fc Slit-2-moins et Robol-Fc Héparine-moins ont été produites et purifiées de la même manière. d. Caractérisation physico-chimique des protéines recombinantes Robol-Fc L'analyse en SDS-PAGE et en gel perméation ont permis de montrer que les protéines étaient dimériques et pures à plus de 96%. L'analyse par masse spectrométrie a permis de démontrer l'identité de ces protéines, la masse mesurée de la protéine déglycosylée étant en parfait accord avec la masse calculée in silico. L'analyse de la composition en monosaccharides et la quantification des acides sialiques des N-glycans comme décrit par Saddic et al. 2002. (Methods Mol. Biol. 194:23-36 and Anumula et a/.1998. Glycobiology 8:685-694) ont permis de démontrer que les protéines étaient très largement sialylées. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. On notera que l'analyse N-terminale des molécules Robol-Fc L1 et Robot-Fc L2 ont montré que ces protéines purifiées contenaient une proportion variable (0 à 40%) d'une forme tronquée des 2 premiers résidus (Ser20 et Arg21). Tableau 1 : Identité des protéines Robot-Fc Robot -Fc LI Robot -Fc L2 Masse (SDS-PAGE 56 kDa 55 kDa conditions réductrices) Masse (SEC, HPLC) 180 kDa 180 kDa Masse (LC/MS après 48812 Da 48410 Da déglycosylation) Profil des N-Glycans fortement sialylés fortement sialylés (HPLC) 21.4 % asialoglycans 20.1 % asialoglycans Composition en N-glycans complexes N-glycans complexes monosaccharides entièrement fucosylés entièrement fucosylés (HPLC) pas de 0-glycans pas de 0-glycans Exemple 2 : Préparation des protéines Slit utilisées comme ligand. Le cDNA codant pour la protéine Slit2 humaine, correspond à la protéine de référence NP_004778. Des fragments de ce cDNA ont été amplifiés par PCR à partir de la banque de cDNA de cerveau humain (réf. 639300, Clontech). Le cDNA correspondant au domaine D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4911 afin d'exprimer ce domaine contenant un Histag en position C- terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.11. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-2-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.12. Le cDNA correspondant aux domaines D1-D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4912 afin d'exprimer ces deux domaines contenant un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.13. La protéine recombinante obtenue est nommée SR-2-D1 D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.14. Le cDNA correspondant à la partie extracellulaire (Nt) de la protéine Slit2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL5033 afin d'exprimer cette protéine avec un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.15. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-2-N et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.16. Le cDNA codant pour le domaine D2 de la protéine Slit2 murine, et correspondant au domaine D2 de la protéine de référence décrite NP_848919 a été obtenu à partir du cDNA cloné dans le plasmide pXL4911. Quatre fragments permettant de générer les cinq mutations ponctuelles ont été générés par PCR avec le pXL4911 comme matrice puis ces fragments ont été utilisés comme matrice pour amplifier le cDNA codant pour le domaine D2 total par PCR séquentielle. La protéine porte les mutations Thr311 Ser, Lys313Arg, IIe329Leu, Ile411 Val et Pro418Ala lui permettant d'être identique au domaine D2 de la protéine Slit2 murine. Ce plasmide permet d'exprimer le domaine D2 de la protéine Slit2 murine avec un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.17. La protéine recombinante obtenue est nommée mSlit-2-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.18. Le cDNA codant pour la protéine SIit1 humaine, correspond à la protéine de référence décrite NP_003052. Un fragment de ce cDNA a été amplifié par PCR à partir de la banque de cDNA de cerveau humain (réf. 639300, Clontech). Le cDNA correspondant au domaine D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL5020 afin d'exprimer ce domaine contenant un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.19. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-1-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.20. Le cDNA codant pour la protéine Slit3 humaine, correspond à la protéine de référence décrite NP_003053. Un fragment de ce cDNA a été amplifié par PCR à partir de la banque de cDNA de cerveau humain (réf. 639300, Clontech). Le cDNA correspondant au domaine D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL5021 afin d'exprimer ce domaine contenant un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.21. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-3-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.22. Les trois protéines nommées Slit-2-D2 SR-2-D1 D2 et Slit-2-N ont été produites par transfection transitoire dans la lignée HEK293 (cellules FreeStyle 293-F selon les recommandations du fournisseur Invitrogen) à l'aide du plasmide pXL4911 (respectivement pXL4912 ou pXL5033). Les protéines Slit-2-D2 et SR-2-D1 D2 exprimées dans le surnageant de culture des cellules HEK293 ont été purifiées par chromatographie sur colonne de Sépharose Ni-chelating (réf. 17-0409-03, Amersham Biosciences) et élution en tampon imidazole puis formulée en tampon PBS (réf. 14190-094, Invitrogen) ajusté à 1 M NaCl. L'analyse par masse spectrométrie (LC/MS) a permis de démontrer l'identité de ces protéines. De façon comparable, les trois protéines nommées mSlit2-D2, Slitl-D2 et Slit3-D2 ont été produites purifiées et caractérisées. Exemple 3 : Etude de l'affinité des protéines recombinantes Robol-Fc pour les protéines Slit et pour l'héparine à l'aide de trois méthodes : ELISA, SPR et FACS a. Affinité des protéines Robol-Fc pour l'héparine Pour déterminer l'affinité des constructions Robol-Fc à l'héparine, 2 mg de protéine Robol-Fc, purifié et formulée dans 10 mM phosphate pH 7.0 a été chromatographié sur une colonne héparine (1 mL HiTrap Heparin-Sepharose HP, GE Heathcare) par élution avec un gradient linéaire de NaCl de 0 à 1,5 M. Sur le tableau 2 est indiquée la concentration en NaCl de 448 mM nécessaire pour éluer la protéine Robol-Fc L1 comme décrit dans la littérature (Fukuhara, N. et al. 2008 J. Biol. Chem. 283 p16226-16234). Tableau 2 : Affinité de Robol-Fc à l'héparine Construit Robot-Fc Décrochage de la colonne héparine [NaCI], mM Robol-Fc L1 448 Robol-Fc Héparine-moins Absence de fixation Ces résultats montrent que la protéine Robol-Fc Héparine-moins qui n'est pas retenue sur cette colonne donc qu'elle n'a plus d'affinité à l'héparine. Cette protéine est donc un mutant héparine négatif. 15 b. Evaluation de l'interaction des variants de protéine Robol-Fc avec le domaine D2 de la protéine Slit2 humaine Cet exemple décrit l'interaction des 2 variants nommés Robol-Fc L1 et Robol-Fc L2 avec leur ligand naturel (dans ces expériences le domaine D2 de Slit2 humain) par dosage ELISA. 20 La protéine humaine Slit2-D2 a été fixé sur des boîtes Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 20 pg/mL à 0.02 pg/mL) des variants Robol-Fc L1 et Robol-Fc L2 ont été ajoutés puis détectés grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB- H2O210 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. Les résultats obtenus sont reportés dans la figure 2. Ils montrent que Les deux variants Robot-Fc L1 et L2 interagissent spécifiquement avec la protéine Slit-2 humaine (en particulier avec le domaine D2). c. Evaluation de l'interaction de la protéine Robot-Fc avec les variants humains de la famille Slit, à savoir Slit-1 et Slit-3 Cet exemple décrit l'interaction de la protéine de fusion Robot-Fc L1 avec les variants Slit-1-D2, Slit-2-D2 et Slit-3-D2 par dosage ELISA. Le domaine D2 des variants Slit humains ont été fixé sur des boites Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 1 pg/mL à 0.001 pg/mL) de la protéine de fusion Robot-Fc L1 a été ajouté puis détecté grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB-H2O2 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. De même le variant Robot-Fc Slit-2-moins qui est muté au niveau du site de liaison à Slit2, a été évalué suivant une gamme de concentration (de 20 pg/mL à 0.02 pg/mL) par dosage ELISA dans les mêmes conditions décrites ci-dessus. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 : Affinité de Robot-Fc pour les variants humains de la protéine Slit Protéine Slit (ligand) Protéine Robot-Fc EC50 (pg/mL) CV (%) Slit-2-D2 Robot-Fc L1 1.32 E-01 3.3 Slit-1-D2 Robot-Fc L1 7.88 E-02 3.9 Slit-3-D2 Robot-Fc L1 2.60 E-01 12 Slit-2-D2 Robot-Fc Slit-2-moins 1.78 E+01 18 Ces résultats montrent que la protéine Robot-Fc interagit spécifiquement avec les trois protéines de la famille, SR-1, Slit-2 et Slit-3 (en particulier avec leur domaine D2). De plus, la protéine Robol-Fc Slit-2-moins n'a plus d'affinité à l'héparine et elle est donc un mutant héparine négatif. d. Evaluation de l'interaction de la protéine Robol-Fc avec la protéine Slit-2 murine Cet exemple décrit l'interaction de la protéine de fusion Robol-Fc L1 avec la protéine murine mSlit-2-D2 par dosage ELISA. La protéine murine mSlit-2-D2 a été fixée sur une boîte Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 2 pg/mL à 0.002 pg/mL) de la protéine de fusion Robol-Fc L1 a été ajouté puis détecté grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB-H2O2 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 : Affinité de Robol-Fc L1 à la protéine Slit-2 murine Protéine étudiée EC50 (pg/mL) CV (%) mSlit2-D2 2.21 E-01 18 Ces résultats montent que la protéine Robol-Fc interagit spécifiquement avec la 20 protéine Slit-2 murine e. Affinité de Robol-Fc à la protéine Slit mesurée par SPR Cet exemple décrit la détermination de la constante d'affinité de la protéine de fusion Robol-Fc L1 avec la protéine Slit-2 humaine (dans cette expérience Slit-2-D2) par SPR (Surface Plasmon Resonance ; BlAcore 2000). L'interaction entre la protéine 25 Robol-Fc et la protéine Slit2 humaine a été analysée après avoir fixé la protéine de fusion Robol-Fc sur une chips CM5. Les mesures de cinétiques sont réalisées selon le protocole de Canziani et al (2004. Anal. Biochem. 325 :301-307). Tableau 5 : Constante d'affinité de Robo-Fc L1 avec Slit2-D2 humain par SPR (analyse de type steady-state) Protéine KD (nM) Robol-Fc L1 32 Une seconde méthode qui consiste à déterminer la constante d'affinité entre la protéine de fusion Robol-Fc L1 et la protéine Slit2 humaine a été analysée après avoir fixé la protéine Slit-2-D2 sur la chips CM5. Les mesures de cinétiques sont 10 réalisées selon le protocole de Canziani et al (2004. Anal. Biochem. 325 :301-307) par la méthode de Sctachard suivant un modèle avec deux sites de liaison non équivalents. Tableau 6 : Constante d'affinité de Robol-Fc avec Slit2-D2 humain par SPR selon le modèle bi-phasique de Scatchard Robot -Fc LI KD (nM) Site de haute affinité KD1 : 1,5 Site de faible affinité KD2 :160 f. Affinité de Robol-Fc à Slit mesurée par FACS Cet exemple décrit l'affinité de la protéine Robol-Fc sur cellules mammifères HEK293 exprimant Slit2. 20 Les cellules HEK293 décrites et utilisées comme dans l'exemple 1, ont été 15 transfectées soit avec un plasmide ballast, n'ayant pas de cDNA codant dans la cellule mammifère, soit le plasmide pXL4911 codant pour la protéine Slit-2-D2; soit le plasmide pXL4912 codant pour la protéine SR-2-D1 D2 ; ou soit pXL5033 codant pour la protéine Slit-2-N décrit dans l'exemple 2. Les cellules ont été réparties en plaque 96-puits 48 heures post-transfection, et la protéine Robol-Fc a été ajoutée dans une gamme de concentrations de 0,01 à 3mg/L pendant 30 min à 4°C. La protéine Robol-Fc est soit l'agent bio-thérapeutique Robo-Fc L1, soit le mutant Robol-Fc Slit-2-moins, soit le mutant Robol-Fc Héparine-moins. Les cellules ont été lavées et l'anticorps anti-Fc humain marqué à l'Alexa 488 (réf : A-11013, Invitrogen) a été incubé pendant 30 min à 4°C. Puis les cellules HEK293 marquées sont quantifiées par FACS (Geomean). La figure 3 décrit la fixation des cellules HEK293 à la protéine Robol-Fc via la fluorescence mesurée en FACS en absence d'expression de Slit-2. La protéine Robol-Fc ainsi que le mutant Robol-Fc Slit-2-moins se fixent aux cellules HEK293 alors que le mutant Robol-Fc Héparine-moins ne se fixe pas. Robol-Fc se fixe donc en partie aux cellules HEK293 via le binding à l'héparine aux faibles concentrations en Robol-Fc de 0,3 à 0,03 mg/L. La figure 4 décrit le binding des cellules HEK293 à la protéine Robol-Fc via la fluorescence mesurée en FACS quand Slit-2-N est exprimée par transfection transitoire. Seule la protéine Robol-Fc se fixe aux cellules HEK293 exprimant Slit-2-N. Les mutants Robol-Fc Slit-2-moins et Robol-Fc Héparine-moins ne se fixent pas (ou quasiment pas) dans la gamme de concentrations de Robol-Fc de 3.0 à 0, 3 mg/L par rapport à la protéine Robol-Fc L1 biothérapeutique. Le tableau 7 décrit les constantes d'affinité mesurées par FACS de la protéine Robol-Fc lorsque les protéines Slit-2-N, SR-2-D1 D2 ou Slit-2-D2 sont exprimées dans la lignée HEK293. Tableau 7 : Affinité de Robot-Fc à la protéine Slit-2 sur cellule par FACS Robot -Fc ligand Protéine exprimée KD (nM) transitoirement dans HEK293 Robot-Fc L1 Slit-2-N 1,2 SR-2-D1 D2 0,98 Slit-2-D2 Fixation très faible Robot-Fc Héparine-moins Slit-2-N 43 SR-2-D1 D2 41 Robot-Fc Slit-2-moins Slit-2-N Pas de fixation Comme dans les exemples précédents, le mutant Robot-Fc Slit-2-moins s'est avéré Slit-2 négatif et le mutant Robot-Fc Héparine-moins présente une affinité plus faible à Slit2 que la protéine bio-thérapeutique. Robot-Fc se fixe sur Slit-2-N et SR-2-D1 D2 exprimées par les cellules HEK293 avec des affinités comparables qui sont meilleures que celle avec Slit-2-D2. Exemple 4: Propriétés pharmacocinétiques des protéines Robot-Fc LI et 10 Robot -Fc L2 Cet exemple décrit le profil pharmacocinétique et la concentration plasmatique de la protéine Robot-Fc injectée une fois chez la souris en intraveineuse (iv). Trois souris Balb/C (pour chaque temps) ont été injectées via la veine caudale avec chacune des protéines Robot-Fc à 2.5 mg/mL à raison de 100 pL/10 g (z' 25 15 mg/kg). Aux temps prédéterminés (0,5 ; 1 ; 6 ; 24 ; 48 ; et 72 h après administration), les souris ont été anesthésiées, le sang a été prélevé et collecté dans un tube contenant 10 pL de citrate (CPD-A, C-4431 Sigma) et 2 pL d'inhibiteurs de protéase (Complete Protease Inhibitor Mix, Roche Molecular Biochemical). Les tubes ont été centrifugés et les échantillons de plasma ont été collectés et congelés à -20°C. La protéine Slit2 (Slit-2-D2) a été coatée dans les puits des boites de 96-puits, les échantillons de plasma dilués au 1/5000 et 1/20000 ont été mis en contact pendant une heure à 37°C. L'anticorps anti-Fc humain conjugué à la péroxidase (réf. 31413, Pierce) a été ensuite incubé puis révélé avec le TMB-H2O2 (ref UP664780, Interchim) et l'absorbance a été lue à 450 nm. Une gamme étalon a été réalisée avec chaque protéine Robot-Fc purifiée. Les concentrations plasmatiques des protéines Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 sont représentées sur la figure 5. Les paramètres pharmacocinétiques sont décrits dans le tableau 8 suivant et montrent que la protéine est stable après injection chez la souris. Tableau 8 : Paramètres pharmacocinétiques des protéines Robot-Fc après injection iv chez la souris Protéine à Co T 12 AUC (O-Iast) AUC (0-24h) CI Vdss 25 mg/kg pg/mL h pg.h/mL pg.h/mL mL/H/kg mL/kg Robot-Fc 203 158 3655 1879 2,2 470 L1 Robot-Fc 198 142 3973 2042 2,2 417 L2 Exemple 5 : Description de la protéine bio-thérapeutique Robol-Fc améliorée pour son homogénéité en position N-terminale. Cet exemple décrit le plasmide d'expression, la production et la caractérisation physico-chimique d'une autre protéine Robot-Fc nommée Robot-Fc L3 qui est différente de la protéine Robot-Fc L1 par l'absence des deux premiers résidus Ser20 et Arg21. Le cDNA cloné dans le plasmide pXL4904 a été modifié par PCR pour éliminer les codons Ser20 et Arg21 et fusionné le codon suivant (Leu22) à la séquence codante du signal peptide de l'nterleukine 2. Le plasmide d'expression pXL5004 a alors été généré, voir figure 1. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.23. La protéine Robot-Fc L3 a été produite, purifiée et caractérisée comme décrit dans l'exemple 1. L'analyse N-terminale a montré que cette protéine purifiée était parfaitement homogène. La protéine recombinante obtenue est nommée Robot-Fc L3 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.24. Exemple 6: Evaluation de l'interaction de la protéine Robol-Fc L3 avec la protéine Slit2 humaine. Cet exemple décrit l'interaction de la protéine de fusion Robot-Fc L3 avec la protéine Slit2 humaine (Slit-2-D2) par dosage ELISA. La protéine Slit-2-D2 humaine a été fixée sur des boites Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 1 pg/mL à 0.001 pg/mL) de la protéine de fusion Robot-Fc L3 a été ajouté puis détecté grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB-H2O2 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau 9 ci-dessous. Tableau 9 : Affinité de la protéine Robot-Fc L3 pour la protéine Slit2 û Comparaison avec la protéine Robot-Fc L1 Protéines étudiées EC50 CV (%) (pg/ml) Robot-Fc L1 0,13 3,3 Robot-Fc L3 0,17 4,4 20 Ces résultats montrent que les affinités des deux variants Robol-Fc L1 et Robo1-Fc L3 pour la protéine Slit2-D2 sont comparables. Exemple 7: Evaluation de l'activité de la protéine Robo-Fc sur la neovascularisation a. Modèle in vitro de co-culture de cellules endothéliales et de fibroblastes : activité spécifique de la molécule Robot-Fc L1 Le modèle d'angiogenèse in vitro correspond à un réarrangement de cellules endothéliales veineuses humaines sur une monocouche de fibroblastes de derme humain. Brièvement, les fibroblastes (Lonza) sont ensemencés dans des plaques de 24 puits (Becton Dickinson) à 40 000 cellules/puits dans 1 ml de milieu. Après 3 jours de prolifération (J3), des cellules endothéliales veineuses humaines (HUVECLonza) sont ensemencées sur la monocouche de cellules fibroblastiques à 10 000 cellules/puits dans 500 pl de milieu EGM® (Endothelial Basal Medium, Lonza) + 2% SVF (sérum de veau foetal - Lonza) + hEGF (Epidermal Growth Factor Humaine Recombinante - Lonza) 10 pg/ml. Les cellules sont stimulées avec le VEGF (R&D Systems) 30 ng/ml, avec la molécule Robot-Fc L1 ou un contrôle négatif Robot-Fc Slit-2-moins à la concentration de 500pg/ml (J3 à J9). Après 3 jours, le milieu est remplacé et les puits sont stimulés en fonction des conditions de l'expérimentation. Après 2 jours, les cellules sont fixées par de l'éthanol et marquées avec un anticorps spécifique des HUVECs anti-CD31, suivi d'un anticorps anti-alkaline phosphaphatase puis révélés avec un substrat alkaline-phosphatase (J11). Une quantification des tubules marqués avec l'anticorps anti-CD31 est réalisée grâce à des acquisitions d'image faite au microscope (objectif X4) et l'analyse de la longueur des pseudo-tubules est effectuée à l'aide d'un logiciel d'image (BIOCOM-logiciel Visiolab 2000) (Figure 6). Dans ce test d'angiogenèse in vitro, Robot-Fc L1 (500pg/ml) montre une activité inhibitrice de la formation des tubules formés par les HUVECs. Cette inhibition s'élève à 82% et elle est statistiquement significative par rapport à l'effet obtenu avec la molécule Robot-Fc Slit-2-moins (contrôle négatif). b. Modèle ex vivo d'anneau aortique de souris: activité spécifique de la molécule Robot-Fc L1 La molécule Robot-Fc L1 a été évaluée dans un modèle d'anneau aortique de souris. Brièvement, des aortes de souris sont prélevées et nettoyées et découpées en tronçon de 1 mm (JO). Ces anneaux sont inclus dans du collagène de rat en présence de VEGF à 10 ng/ml, de la molécule Robot-Fc L1 ou d'un contrôle négatif Robot-Fc Slit-2-moins à la concentration de 500pg/ml. Des tubules vont se former à partir de l'anneau mimant ainsi in vitro la formation de néovaisseaux. Après 6 jours, une quantification des tubules marqués est réalisée grâce à des acquisitions d'image faite au microscope (objectif X3) (Figure 7A) et l'analyse de la longueur des pseudo-tubules est effectuée à l'aide d'un logiciel d'image (BIOCOM-logiciel Visiolab 2000) (Figure 7). Dans ces conditions expérimentales, Robot-Fc L1 (500pg/ml) montre une forte activité inhibitrice de la formation des tubules formés en comparaison avec la molécule Robot-Fc Slit-2-moins utilisée comme contrôle négatif. Ces résultats suggèrent que Robot-Fc L1 est capable d'inhiber la formation de néovaisseaux sans inhiber la prolifération des cellules endothéliales. Cette activité antiangiogénique liée à un défaut de maturation des vaisseaux est appelée « angiogenèse non-productive ». Exemple 8 : Evaluation de la protéine Robol-Fc LI dans un modèle de tumeur pulmonaire chez la souris. La molécule Robot-Fc L1 a été évaluée dans un modèle de tumeur cancéreuse pulmonaire chez la souris C57/B16. a. Modèle murin de tumeur pulmonaire Pour établir le modèle murin de tumeur pulmonaire, des souris C57/B16 femelles âgées de 8 sem ont été anesthésiées. La zone au niveau de l'omoplate gauche de la souris a été rasée et désinfectée. Une incision de 1 cm a été pratiquée au dessus de l'omoplate. Les cellules à injecter sont issues d'une lignée tumorale Lewis lung carcinoma (ATCC, CRL-1642). Les cellules ont été mélangées à du Matrigel® dans un rapport 22 de 1 vol de Matrigel pour 4 vol de cellules .La concentration cellulaire était de 62500 cellules/ml. Les cellules ont été injectées dans le poumon à raison de 20p1 par souris puis la plaie a été suturée. Au bout de 23 jours, les souris ont été euthanasiées. La cage thoracique a été ouverte, le poumon gauche et la chaine médiastinale ont été prélevés. La tumeur présente sur le poumon gauche a été mesurée à l'aide d'un pied à coulisse électronique pour déterminer le volume tumoral selon la formule : 12xLxO.52. La chaine médiastinale est pesée. Les résultats sont exprimés en valeur moyenne ± ecart-type à la moyenne. L'analyse statistique a été faite par un test paramétrique de Student. b. Traitement des souris porteuses d'une tumeur pulmonaire avec la protéine recombinante Robol-Fc Le traitement à l'aide de la protéine Robol-Fc a été réalisé comme suit : Une préparation contenant la protéine Robol-Fc a été injectée à la dose de 25 mg/kg/jour par voie intrapéritonéale à J10, J14, J17, et J21 post injection des cellules tumorales. Le groupe contrôle a été injecté avec du tampon PBS (10ml/kg). c. Résultats A J23, le volume moyen des tumeurs obtenues dans le groupe traité avec la protéine recombinanate Robol-Fc etait de 21,45± 2,16 mm3 ; le volume moyen des tumeurs obtenues dans le groupe contrôle était de 39,93±8,41 mm3. La réduction du volume tumoral chez les animaux traités avec la protéine Robol-Fc est de 46%. Cette différence est statistiquement significative (p Revendications1. Protéine recombinante Robol-Fc comprenant le domaine extracellulaire d'une protéine Robol ou une partie de ce domaine, un linker et un domaine Fc dans laquelle ledit domaine extracellulaire provient de l'isorforme b de la protéine Robol 2. Protéine selon la revendication 1, dans laquelle le domaine extracellulaire de Robol comprend les domaines immunoglobuline Ig1 et Ig2. 3. Protéine selon la revendication 2, dans laquelle le domaine extracellulaire de Robol présente au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO.2. 4. Protéine selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le domaine Fc provient de l'immunoglobuline G4 humaine. 5. Protéine selon la revendication 4 dans laquelle le domaine Fc comporte les mutations S241 P et L248E et dans lequel de la lysine située en position C-terminale est absente. 6. Protéine selon l'une des revendications 1 à 4 dont la séquence présente au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.6 ou SEQ ID NO. 24. 7. Molécule d'acides nucléiques correspondant à la séquence SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 ou SEQ ID NO.23 ou présentant au moins 80% d'identité avec les molécules ayant pour séquence SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 ou SEQ ID NO.23. 8. Protéine recombinante Robol-Fc pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine de la famille Slit est surexprimée. 9. Protéine recombinante Robol-Fc selon la revendication 8 pour traiter un cancer. 10. Protéine recombinante Robol-Fc selon l'une des revendications 8 ou 9 qui n'inhibe pas la prolifération des cellules endothéliales. 11. Protéine recombinante Robol-Fc selon l'une des revendications 8 à 10, cette protéine dérivant de l'isoforme b de la protéine Robot . 12. Protéine recombinante Robol-Fc selon la revendication 11, cette protéine étant telle que définie aux revendications 2 à 6 13. Composition pharmaceutique comprenant une protéine recombinante Robol-Fc telle que définie aux revendications 1 à 6 et au moins un excipient. 14. Utilisation d'une protéine recombinante Robol-Fc en tant qu'outil de diagnostic pour détecter la surexpression d'une molécule de la famille Slit chez un patient.