Brevet FR2955495A1 — publié le 20110729

MEDICAMENT POUR LA REDUCTION DE LA CHOLESTEROLEMIE Domaine de l'invention La présente invention concerne un médicament destiné à réduire la cholestérolémie. Arrière-plan technique L'hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires, comme l'athérosclérose, l'infarctus du myocarde, et les maladies 1 o cérébrovasculaires. Le traitement de première intention pour l'hypercholestérolémie est un régime alimentaire adapté pauvre en cholestérol. Si la modification du régime alimentaire s'avère insuffisante pour traiter l'hypercholestérolémie, des traitements pharmacologiques sont alors envisagés, notamment à bases d'inhibiteurs de HMG- 15 CoA réductase (statines) et de fibrates. Divers autres moyens de prise en charge de l'hypercholestérolémie sont également disponibles, en particulier en complément du régime alimentaire adapté, comme les phytostérols, que l'on trouve incorporés dans de nombreuses préparations alimentaires, ou les probiotiques, notamment bactériens. 20 Du fait de leurs autres propriétés intéressantes en santé humaine et de leur quasi absence d'effets secondaires, il a ainsi été proposé d'utiliser de nombreux probiotiques différents dans le cadre du traitement de l'hypercholestérolémie. Cependant, cela repose le plus souvent sur des études in vitro d'extraction du cholestérol par les probiotiques à partir d'un milieu de culture. Or ces études ne sont 25 pas directement indicatives d'un effet anti-hypercholestérolémique in vivo. Ainsi, sur la base d'étude in vitro, il pu être proposé que Lactobacillus rhamnosus puisse exercer un effet anti-hypercholestérolémique (Xanthopoulos et al. (1998) Microbiologie, Aliments, Nutrition 16:199-203), alors qu'aucun effet n'est observé in vivo (Hattaka et al. (2008) J. Am. Coll. Nutr. 27:441-447). 30 De fait, à l'heure actuelle, un véritable effet anti-hypercholestérolémique n'a pu être démontré de manière adéquate par des expériences in vivo que pour un faible nombre de probiotiques. On peut citer à ce titre, une association des probiotiques Lactobacillus acidophilus et Streptococcus faecalis (Fukushima & Nakano (1996) Br. J. Nutr. 76:857-867) ou une association de probiotiques composée de Bacillus, de Lactobacillus, de Streptococcus, de Saccharomyces, et de Candida (Fukushima & Nakano (1995) Br. J. Nutr. 73:701-710). Saccharomyces boulardii (Ultra-Levure®) est une souche particulière de la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce probiotique est principalement indiqué en complément de la réhydratation pour le traitement des diarrhées. Son utilité a été notamment établie chez l'enfant (Villarruel et al. (2007) Acta Paediatr 96:538-541 ; Szajewska et al. (2007) Aliment Pharmacol Ther 25:257-264) et pour les diarrhées liées à la prise d'antibiotiques (Surawicz et al. (1989) Gastroenterology 96:981-988; Kotowska et al. (2005) Aliment Pharmacol Ther 21:583-590) ou aux infections à 1 o Clostridium difficile (Surawicz et al. (2000) Clin Infect Dis 31:1012-1017). Résumé de l'invention La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que Saccharomyces boulardii permettait de réduire 15 l'hypercholestérolémie et l'hépatomégalie induites chez le rat par un régime enrichi en cholestérol. Ainsi, la présente invention concerne des cellules de levure Saccharomyces boulardii pour leur utilisation dans la réduction de la cholestérolémie chez un individu, notamment pour traiter l'hypercholestérolémie. 20 La présente invention concerne également l'utilisation de cellules de levure Saccharomyces boulardii pour la préparation d'un médicament destiné à la réduction de la cholestérolémie chez un individu, notamment pour traiter l'hypercholestérolémie. La présente invention concerne également une méthode de réduction de la 25 cholestérolémie, notamment une méthode de traitement de l'hypercholestérolémie, chez un individu, dans laquelle on administre à l'individu des cellules de levure Saccharomyces boulardii, notamment en une quantité thérapeutiquement efficace. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, à titre de substances actives : 30 - des cellules de levure Saccharomyces boulardii, et - au moins un composé additionnel destiné au traitement de l'hypercholestérolémie, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, en particulier pour son utilisation dans la réduction de la cholestérolémie chez un individu, plus particulièrement pour traiter l'hypercholestérolémie. La présente invention concerne également des produits contenant : - des cellules de levure Saccharomyces boulardii, et - au moins un composé additionnel destiné au traitement de l'hypercholestérolémie, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour la réduction de la cholestérolémie chez un individu, notamment pour traiter l'hypercholestérolémie. Description de la figure La figure représente l'effet de Saccharomyces boulardii administré à 3 g/kg/j 1 o sur l'augmentation de la cholestérolémie de rats (axe des ordonnées, en mg/dl) induite par un régime alimentaire enrichi en cholestérol à 2%, en fonction du temps (axe des abscisses, en jours). Le régime enrichi en cholestérol et S. boulardii sont donnés à partir de JO et J4 respectivement. * : p Description détaillée de l'invention La notion de « cholestérolémie » est bien connue de l'homme du métier. Elle représente un taux de cholestérol sanguin, et notamment le taux de cholestérol total 25 sérique. La cholestérolémie est notamment exprimée en g/I ou en mmol/l. Comme on l'entend ici, l'expression « réduire la cholestérolémie » signifie notamment, diminuer le taux sérique de cholestérol total. Le terme « hypercholestérolémie » désigne une cholestérolémie pathologique. L'hypercholestérolémie désigne en particulier une cholestérolémie supérieure à 2 g/I, 3o plus particulièrement supérieure à 2,4 g/I chez l'homme. Les expressions « dans le traitement de l'hypercholestérolémie » et « pour traiter l'hypercholestérolémie » sont synonymes et signifient diminuer, en particulier pour la rendre normale, la cholestérolémie chez un individu présentant une hypercholestérolémie. L'individu chez lequel on souhaite réduire la cholestérolémie peut présenter une hypercholestérolémie. L'individu peut également présenter une cholestérolémie qui n'est pas en elle-même pathologique, c'est-à-dire qui est de préférence inférieure ou égale à 2 g/I, mais qui est suffisamment élevée, pour rendre souhaitable une diminution de la cholestérolémie, par exemple si l'individu présente d'autres facteurs de risque cardiovasculaire. Ainsi, l'individu selon l'invention peut présenter une cholestérolémie supérieure à 1,8 g/I et inférieure ou égale à 2 g/I. En particulier, l'individu selon l'invention présente une hypercholestérolémie, notamment modérée, c'est-à-dire qu'il présente une cholestérolémie de préférence supérieure à 2 g/I et de préférence inférieure ou égale à 2,4 g/I, et est soumis à un régime alimentaire appauvri en cholestérol. On désigne par « régime alimentaire appauvri en cholestérol » un régime dans lequel la quantité de cholestérol est diminuée par rapport à un régime alimentaire normal. L'homme du métier sait bien définir un régime appauvri en cholestérol. En particulier, dans un régime appauvri en cholestérol, la quantité de cholestérol est inférieure à la quantité de cholestérol qui se trouve habituellement dans le régime alimentaire de l'individu avant qu'il ne débute le régime appauvri en cholestérol. L'individu selon l'invention est un animal, de préférence un mammifère, et plus préférablement un humain. Comme on l'entend ici, l'expression « cellules de levure » regroupe des cellules de levure viables ou mortes, entières ou sous forme de débris. De préférence, au moins une partie des cellules de levure Saccharomyces boulardii selon l'invention sont viables. La viabilité d'une cellule de levure est définie comme la capacité d'une cellule de levure à se multiplier. Le nombre de cellules viables dans un échantillon peut être estimé en déterminant le nombre d'Unités Formant Colonie (UFC) comprises dans l'échantillon. A titre d'exemple, le nombre d'UFC de cellules de levure d'un échantillon liquide comprenant des levures peut être déterminé en étalant un volume déterminé de l'échantillon sur un milieu solide, par exemple gélosé, permettant la croissance des levures et en incubant le milieu solide pendant une durée, par exemple 48 h, et à une température, par exemple 30°C, permettant la croissance de colonies de levures. Le nombre de colonies rapporté au volume étalé sur le milieu solide permet de déterminer le nombre d'UFC compris dans l'échantillon. Un protocole détaillé de la détermination d'UFC conforme à l'invention est notamment décrit dans Toothaker & Elmer (1984) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 26:552-556 au paragraphe « Assay for S. boulardii ». Par ailleurs, lorsque l'échantillon de levure se présente sous forme d'un solide, par exemple une poudre lyophilisée, on préfère déterminer le nombre d'UFC compris dans l'échantillon après avoir repris une masse déterminée de l'échantillon dans une solution aqueuse, notamment de l'eau distillée ou une solution à 0,9% de NaCl à pH 7. Une « levure » selon l'invention est un champignon de préférence unicellulaire. Les cellules de levure selon l'invention sont de l'espèce Saccharomyces 1 o boulardii. Saccharomyces boulardii est bien connu de l'homme du métier. De manière particulièrement préférée, les cellules de levure Saccharomyces boulardii selon l'invention sont obtenues à partir de médicaments de marque Ultra-Levure® ou à partir des dépôts effectués à l'American Type Culture Collection (ATCC, USA) sous la référence 74012 ou à la Collection Nationale de Culture et de 15 Microorganismes (CNCM, France) sous la référence l-745. De préférence, également les cellules de levure Saccharomyces boulardii selon l'invention sont lyophilisées. De manière avantageuse, la viabilité et la vitalité de cellules de levure obtenues à partir de lyophilisats sont supérieures à ce qui peut être obtenu à partir 20 d'autre mode de conservation des cellules de levure. Comme on l'entend ici, la « lyophilisation » est une méthode de conservation dans laquelle les cellules de levure sont congelées puis soumises à une sublimation de l'eau congelée qu'elles contiennent pour donner un lyophilisat sous forme d'une poudre de levure sèche contenant de préférence moins de 2% d'eau et plus 25 préférablement moins de 1°/o d'eau. De préférence, les cellules de levure lyophilisées sont obtenues à partir de concentrés de cellules de levure. N'importe quel type de méthode de lyophilisation de cellules de levure connu de l'homme du métier peut être utilisé. Toutefois, les cellules de levure sont de préférence lyophilisées selon l'invention à l'aide de la méthode de lyophilisation suivante : 30 - cultiver les cellules de levure dans un milieu nutritif liquide jusqu'à ce que les cellules atteignent une phase stationnaire; - concentrer les cellules de levure cultivées et congeler le concentré; - lyophiliser le concentré. De préférence les cellules de levure Saccharomyces boulardii selon l'invention sont administrées sous forme de gélules ou de sachets. De préférence également, les cellules de levure Saccharomyces boulardii selon l'invention sont administrées à une dose de 0,5.108 à 100.1010 UFC/kg/j ou à une dose de 0,00125 g/kg/j à 25 g/kg/j. Par ailleurs, la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, ou les produits tels que définis ci-dessus, comprennent de préférence une dose de 50 à 250 mg de cellules de levure Saccharomyces boulardii. En outre les cellules de levure Saccharomyces boulardii pour leur utilisation telle que définie ci-dessus sont 1 o de préférence administrée à une dose unitaire de 50 à 250 mg. Comme l'homme du métier le comprendra, la quantité de cellules de levure à administrer par unité de masse (kg) se réfère à la masse de l'individu auquel sont destinées les cellules de levure. Par ailleurs, lorsque la quantité de cellules de levure à administrer est exprimée en unité de masse (g), les cellules de levure sont de 15 préférence sous forme lyophilisée. Comme on l'entend ici l'expression « un composé additionnel destiné au traitement de l'hypercholestérolémie » regroupe l'ensemble des composés utilisé pour réduire la cholestérolémie, notamment chez un individu souffrant d'hypercholestérolémie. Ces composés peuvent être de tout type et couvrent 20 notamment les composés pharmacologiques, les probiotiques et les prébiotiques. On préfère, toutefois, que le composé additionnel destiné au traitement de l'hypercholestérolémie selon l'invention soit sélectionné dans le groupe constitué d'une statine, d'un fibrate, de niacine, et d'un phytostérol. Par ailleurs, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les cellules 25 de levure Saccharomyces boulardii ne sont pas administrées avec un autre probiotique, et la composition pharmaceutique ne comprend pas de probiotique autre que Saccharomyces boulardii. Comme on l'entend ici, le terme « probiotique » désigne tout microorganisme, de préférence viable, administré à un individu, notamment en vue d'améliorer son 30 état de santé. EXEMPLE 1. Matériels et méthodes 1.1. Animaux Des rats Sprague Dawley (Janvier), de poids compris entre 200 et 220 grammes au début de l'étude sont utilisés après acclimatation d'au moins 7 jours dans l'animalerie (t°= 22 ± 2°C ; hygrométrie : 50 ± 20 % ; nourriture SAFE « A04 » ; cycle nycthéméral 12h/12h). 1.2. Protocole 1.2.1. Régime alimentaire 4 groupes de 8 à 10 rats ont été respectivement soumis à : - un régime alimentaire normal « A04 » (SAFE), - un régime alimentaire normal avec Saccharomyces boulardii à 3 g/kg/j, - un régime alimentaire incorporant 2% de cholestérol (MP Biomedicals, réf. 904691), et - un régime alimentaire incorporant 2% de cholestérol (MP Biomedicals, réf. 20 904691) supplémenté avec Saccharomyces boulardii à 3 g/kg/j. 1.2.2. Prélèvements sanguins Du sang est prélevé de la veine caudale à l'aide d'une aiguille Terumo 21G (réf. NN2125R) et d'une seringue Terumo 2 ml (réf. 55-025) 3 jours avant le début de 25 l'expérimentation pour déterminer la cholestérolémie basale. Un antihémorragique (Dycinone®) est utilisé pour arrêter l'éventuel écoulement de sang. Le sang est versé dans un tube Sarstedt Multivette de 600µI contenant un activateur de coagulation (réf. 15.1670). Le tube est centrifugé à 10 000 g (14 000 rpm) pendant 5 min. à température ambiante dans une centrifugeuse Centrifuge 30 5415C Eppendorff. On récupère le sérum dans plusieurs micro-tubes Sarstedt de 0,5 ml (réf. 72.699), qui sont placés à -80°C avant analyse. Différents prélèvement sont ensuite effectués le jour du début du régime enrichi en cholestérol (JO) puis 4, 7, 11, 14, 18, 21 et 25 jours après le début du régime enrichi en cholestérol. 7 1.2.3. Dosage du cholestérol total par colorimétrie Une solution mère de cholestérol (Sigma, réf. C3045) à 3 g/I est réalisée en solubilisant 30 mg de cholestérol dans 10 ml d'une solution de déoxycholate de sodium à 150 g/I, à 40°C pendant 60 min. minimum. La solution de déoxycholate de sodium est obtenue par solubilisation de 15 g de déoxycholate de sodium dans 100 ml de NaCl à 0,9% puis en agitant à 40°C pendant 60 min. minimum. Une gamme étalon est préparée par dilutions successives dans la solution de déoxycholate de sodium à partir de la solution mère pour obtenir des concentrations de 0,375 ; 0,75 ; 1,5 et 3 g/I de cholestérol. 10 pl de l'échantillon ou de l'étalon est mélangé à 1000 pl de réactif CHOL destiné à mesure le cholestérol total (Ménarini, ref. 30990). 30 min. après, la mesure de l'absorbance est effectuée par rapport à un blanc réactif, à une température de 37°C, à une longueur d'onde de 510 nm, sur un spectrophotomètre SPEDCOR 2005 avec des cuves ayant un trajet optique de 1 cm (Spectrovettes Evergreen, Dutscher, réf. 064005). 1.2.3. Détermination du poids du foie Au terme de l'étude (J25), les rats sont sacrifiés et leur foie est prélevé et pesé. 1.3. Produits Saccharomyces boulardii lyophilisé (Ultralevure® lot 4325, Biocodex) est conservé entre 4 et 6°C, il est solubilisé dans de l'eau distillée. Le cholestérol (Sigma, réf. C3045) est stocké à -20°C. Le déoxycholate de sodium est obtenu chez Fluka (réf. 30970). Le réactif de dosage CHOL (Ménarini) est stocké entre 4 et 6°C. 1.4. Administration Saccharomyces boulardii est administré par voie orale 4 jours après le début du régime alimentaire enrichi en cholestérol quand l'hypercholestérolémie est installée. . Résultats Aucune différence significative n'est observée dans le poids des animaux en fonction du régime alimentaire auquel ils ont été soumis. Les résultats sont résumés dans le Tableau 1 suivant et dans la Ficiure. Tableau 1 : Effet de S. boulardii administré à 3 g/kg/j sur l'augmentation de la 10 cholestérolémie (mg/dl) induite par un régime alimentaire enrichi en cholestérol à 2°/0 : S. Cholestérol n J-3 JO J4 J7 J11 J14 J18 J21 J25 boulardii 2% 10 107,3 97,6 95,9 90,0 83,1 86,0 76,3 72,3 70,4 ±2,9 ±3,4 ±3,0 ±3,4 ±2,5 ±2,7 ±2,7 ±2,7 ±2,9 + - 9 105,6 98,0 96,7 92,1 81,9 81,5 71,6 73,7 72,8 ±2,5 ±1,7 ±2,6 ±3,1 ±3,4 ±2,8 ±4,2 ±3,3 ±3,0 + 8 109,9 97,3 142,3 127,6 123,5 120,6 115,2 110,3 113,5 ±2,2 ±2,8 ±6,4 ±5,1 ±5,1 ±5,3 ±4,3 ±7,1 ±6,8 + + 9 106,6 97,6 131,1 120,1 109,6 103,4 97,2 97,5 94,7 ±3,1 ±3,5 ±3,0 ±2,5 ±4,5 ±3,0 ±3,1 ±3,1 ±3,5 * * * # * # * # * # * # Le régime enrichi en cholestérol et S. boulardii sont donnés à partir de JO et J4 respectivement. * : p En conclusion, S. boulardii limite de manière significative l'hypercholestérolémie et l'hépatomégalie induites par un régime alimentaire enrichi en cholestérol chez le rat. Revendications1. Cellules de levure Saccharomyces boulardii pour leur utilisation dans la réduction de la cholestérolémie chez un individu. 2. Cellules de levure Saccharomyces boulardii pour leur utilisation selon la revendication 1, dans le traitement de l'hypercholestérolémie. 3. Cellules de levure Saccharomyces boulardii pour leur utilisation selon la 1 o revendication 1 ou 2, les cellules de levure étant lyophilisées. 4. Cellules de levure Saccharomyces boulardii pour leur utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, les cellules de levure Saccharomyces boulardii étant administrées sous forme de gélules ou de sachets. 5. Cellules de levure Saccharomyces boulardii pour leur utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, les cellules de levure Saccharomyces boulardii étant administrées à une dose de 0,00125 à 25 g/kg/j. 20 6. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substances actives : - des cellules de levure Saccharomyces boulardii, et - au moins un composé additionnel destiné au traitement de l'hypercholestérolémie, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 25 7. Composition pharmaceutique selon la revendication 6, dans laquelle le composé destiné au traitement de l'hypercholestérolémie est sélectionné dans le groupe constitué d'une statine, d'un fibrate, de niacine, et d'un phytostérol. 8. Composition pharmaceutique selon la revendication 6 ou 7, comprenant une dose 30 de 50 à 250 mg de cellule de levure de l'espèce Saccharomyces boulardii sous forme lyophilisée. 9. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 à 8, pour réduire la cholestérolémie chez un individu. 15 10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 à 9, pour son utilisation dans le traitement de l'hypercholestérolémie. 11. Produits contenant : - des cellules de levure Saccharomyces boulardii, et - au moins un composé additionnel destiné au traitement de l'hypercholestérolémie, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour la réduction de la cholestérolémie chez un individu. 12. Produits selon la revendication 11, dans lesquels le composé destiné au traitement de l'hypercholestérolémie est sélectionné dans le groupe constitué d'une statine, d'un fibrate, de niacine, et d'un phytostérol. 13. Produits selon la revendication 11 ou 12, pour le traitement de l'hypercholestérolémie. 14. Produits selon l'une des revendications 11 à 13, les cellules de levure Saccharomyces boulardii étant lyophilisées. 15. Produits selon l'une des revendications 11 à 14, les cellules de levure Saccharomyces boulardii étant administrées à une dose de 0,00125 à 25 g/kg/j.20