Brevet FR2957150A1 — publié le 20110909

Procédé et appareil de détection en continu et en temps sensiblement réel de traces de microbes (bactéries, virus) ou substances dangereuses ou illicites (explosifs, drogues) dans une atmosphère Secteur technique de l'invention : Le secteur technique est celui de la détection en continu, et donc en temps sensiblement réel, de traces de substances dangereuses, véhiculées volontairement ou non, dans une atmosphère donnée, par 10 exemple un aéroport, une gare ferroviaire, un immeuble ou toute autre atmosphère, y compris une atmosphère non confinée. Par « en temps sensiblement réel » on désigne le fait que la détection peut être très rapide pour certaines substances, comme le montreront certaines des figures annexées, par exemple en 2 heures pour les 15 bactéries. Problème technique posé : Les problèmes posés viennent du fait qu'il s'agit de déceler des TRACES de substances dangereuses dans une atmosphère qui peut être, soit confinée dans un volume très important, par exemple, une salle 20 d'enregistrement ou toute salle ou local sensible d'aéroport ou tout autre installation, y compris le volume d'un avion, ses soutes à bagages, sa cabine, un bateau de croisière, y compris des bureaux de tri postal, une salle d'attente, etc..., un hôpital (détection précoce d'agents responsables de maladies nosocomiales par exemple ou autres agents 25 pathogènes), et toutes atmosphère de ce type, soit non confinée, par exemple une place publique, la sortie d'une gare, d'un aéroport, etc... Le problème se complique énormément par le fait que la détection doit être effectuée en continu et en temps « sensiblement réel » de manière à permettre une défense / prévention rapide contre tes agents en cause. Un autre problème technique à résoudre, si possible, est que l'appareil doit être transportable (afin d'être placé ou déplacé à volonté) et aussi peu coûteux que possible (car, par exemple, la surveillance d'un aéroport ou d'un hôpital important requiert évidemment un certain 10 nombre d'appareils de détection, placés en des endroits stratégiques et/ou sensibles). Description détaillée de l'invention : L'invention concerne donc un procédé tel que défini ci-dessus et l'appareil de détection, ainsi que toutes leurs applications du type cité 15 ci-dessus, qui seront clairement visibles à tout homme de métier des services médicaux, de police, des services postaux ou sociétés de transports de plis ou colis, comme DHLTM',de renseignement, de prévention en général contre tout agent pathogène ou généralement dangereux ou illicite apparaissant sous forme de traces. 20 On ne connaît aujourd'hui pour résoudre ces problèmes que des mesures spectroscopiques (mesure d'absorbance, qui est non seulement « lourd » mais aussi n'est PAS sélectif), ou des mesures de numération (également lourd et non sélectif). 25 Procédé : L'invention concerne de manière générale un procédé de détection d'agents pathogènes, de substances dangereuses ou illicites (explosifs, drogues) sous forme de traces dans une atmosphère confinée ou non, y compris dans des atmosphères occupant un très grand volume (comme une salle d'aéroport ou un hôpital) caractérisé en ce qu'il comprend : une étape d'aspiration en continu de l'air ambiant, b) un transfert en continu ou discontinu de l'air aspiré sous a) vers un liquide circulant en continu ou discontinu au travers d'un récipient, et le passage dudit air aspiré en continu au travers de ce liquide, - c) éventuellement (très préférentiellement) une concentration en continu ou discontinu du liquide, 10 d) te transfert en continu ou discontinu d'au moins une fraction dudit liquide vers un appareil de dépistage adapté à l'agent ou aux agents que t'on souhaite détecter, ledit récipient étant d'autre part alimenté en continu ou discontinu par la même fraction de liquide. De manière totalement préférée, te procédé selon l'invention sera mis 15 en oeuvre dans ses quatre étapes en mode CONTINU. L'aspiration peut être effectuée par tout moyen approprié, adapté notamment à la taille du volume d'atmosphère à surveiller, et notamment l'aspiration se fera par un système à soufflante, turbine, système à vide, par exemple de type Venturi ou tout autre dispositif qui 20 apparaîtra clairement à tout homme de métier. Il n'est pas nécessaire que le volume et/ou le débit d'atmosphère ainsi prélevé en continu par aspiration soit important : l'appareil peut être de petite taille, par exemple de la taille d'un fermenteur de laboratoire, et le débit d'atmosphère peut être compris notamment 25 entre 30 et 240 L/h, et tout particulièrement, selon l'exemple non limite du prototype réalisé, entre 80 et 160 L/h, notamment 120 L/h. La base de l'invention réside donc dans l'emploi d'un liquide pour réaliser la détection, au lieu de l'atmosphère elle-même comme dans les systèmes actuels. Le passage de la détection par une phase liquide permet l'emploi de systèmes de détection, analyse (quantitative et/ou qualitative), mesures etc... qui ne peuvent pas, en l'état actuel de la technologie, être employés sur l'atmosphère elle-même. Ledit liquide sera sélectionné en fonction des agents pathogènes, substances dangereuses ou illicites, recherchée, notamment eau, solution saline tamponnée, milieu de culture etc. Il pourra s'agir notamment, pour les virus et les bactéries (ensemble plus généralement « microbes ») d'un milieu de culture de type connu, comme notamment le bouillon trypticase soja, te bouillon mueller hinton ou des milieux spécifiques de différentes espèces bactériennes comme un milieu hypersalé pour la recherche des Staphylocoque. Pour les virus, un milieu pour culture cellulaire conviendra (milieu de Eagle complémenté par exemple). Le principe est que les bactéries, qu'elles soient issues de spores ou non, vont se multiplier dans un tel liquide nutritif ou milieu de culture contenu dans ledit récipient. Les virus ne vont pas y croître, mais ils passeront en partie (comme les bactéries, ou comme toute trace de substance dangereuse ou illicite) dans la fraction de liquide prélevée en continu, pour être dirigée éventuellement (mais de manière tout à fait préférée après au moins une étape de concentration) vers un appareil de dépistage ou détection adapté aux substances recherchées, dont le seuil de détection sera tel qu'il permette une action rapide (de une heure à un jour par exemple, notamment de l'ordre de 1 à 2 h) de prévention. Grâce au passage par une phase liquide, il devient possible de faire en sorte que tes « traces » soit s'accumulent dans te circuit de détection jusqu'à atteindre le seuil de détection (virus, explosifs, drogues ou autres substances illicites) soit vont même germer et/ou croître ( spores ou respectivement bactéries), cette croissance déclenchant le seuil de détection encore plus rapidement. Si l'on recherche uniquement, des substances dangereuses (explosifs) ou des substances illicites, ledit liquide peut être une solution saline tamponnée. Si l'on recherche des bactéries, on pourra aussi employer une solution saline tamponnée comme liquide, avec le seul inconvénient d'un déclenchement plus tardif (faute de milieu de culture et donc faute de croissance des bactéries dans ledit récipient) de l'appareil de détection/dépistage. Pour rechercher des spores ou des bactéries, on emploiera un milieu de culture adapté, où les spores pourront germer et libérer des bactéries qui vont croître, ou bien où tes bactéries (si elles sont directement présentes dans l'atmosphère à surveiller) vont croître, l'ensemble permettant d'atteindre plus rapidement le seuil de détection. Si l'on recherche à la fois certaines bactéries, certains spores, certaines 15 substances dangereuses et certaines substances illicite, on emploiera avantageusement un milieu de culture comme « liquide ». On pourrait dans ce cas aussi employer de l'eau ou une solution saline tamponnée etc... avec, comme indiqué plus haut, le seul inconvénient de relever pour tes spores et les bactéries, le délai d'atteinte du seuil 20 de déclenchement. L'homme de métier non seulement connaît parfaitement les spores, bactéries, virus, substances dangereuses, substances illicites, mais il saura de plus choisir le liquide le mieux adapté. Pour les virus et les bactéries, ledit dispositif de dépistage / détection 25 sera notamment un appareil de PCR (« Polymérase Chain Reaction » - réaction de polymérisation en chaîne) permettant l'amplification de gènes caractéristiques des bactéries ou virus recherchés et tes exemples ci-après montrent que le délai de réaction (c'est-à-dire le temps nécessaire au dépassement du seuil de détection du dispositif) peut être 30 aussi faible que 2h. Une concentration plus importante permettrait de descendre jusqu'à 1 h ou moins, le seuil de détection étant atteint plus rapidement. Un des grands avantages de l'invention est que la détection se fait en continu et donc en temps « sensiblement réel ». Cependant il sera évident pour l'homme de métier, et cela fait donc partie de l'invention, que le système peut également fonctionner en discontinu (« batch ») avec par exempte un prélèvement d'un certain volume d'atmosphère toutes les heures ou toutes les 12 h etc mais on perd naturellement la « réactivité » et donc la grande efficacité du système en mode « continu ». Appareil L'invention couvre également l'appareil comprenant un moyen de passage de la détection par une phase liquide. Tout appareil capable de « contaminer » un liquide par tes microbes ou substances d'une atmosphère sont utilisables. Selon l'invention, ledit appareil comprend : 1 un récipient contenant ledit liquide, 2 au moins une entrée d'atmosphère (qui sera généralement l'air ambiant), 3 pour le mode en continu, au moins une sortie d'atmosphère APRÈS son passage au travers dudit liquide, - 4 un moyen permettant de transférer ou envoyer ladite atmosphère au travers dudit liquide, 5 pour le mode continu, au moins une entrée de liquide « neuf » (circuit amont) et au moins une sortie de liquide « chargé » des substances recherchées (circuit aval) et un moyen de circulation dudit liquide du circuit amont vers le circuit aval, comme une pompe. L'appareil comprend de plus un moyen ou appareil de concentration du liquide (sur le circuit de sortie - aval - dudit liquide) tel que un appareil de centrifugation ou de filtration. L'appareil est encore connecté à un ou plusieurs appareils de détection/ dépistage (plusieurs appareils et/ou un seul appareil capable de dépister/détecter simultanément plusieurs agents) placé sur le circuit de sortie d'atmosphère (et en AVAL du moyen ou appareil de concentration lorsqu'il est présent). En ce qui concerne la détection de matériel vivant (bactéries, virus) de manière tout à fait préférée, le ou lesdits appareils ou moyens de détection / dépistage sont des appareils connus du type PCR. Pour les substances illicites (drogues), on pourra utiliser des tests immunochromatographiques et pour les explosifs des biosenseurs. De manière absolument préférée, l'appareil selon l'invention est configuré pour un fonctionnement en mode continu. On a représenté un exemple de réalisation d'un prototype et les essais réalisés sur la figure 1 annexée (appareil capable de fonctionner en continu et en mode « industriel ») et sur la figure 2 (prototype avec mode en discontinu par injection d'un aérosol chargé en bactéries) annexée. Sur ta figure 2, on note la présence du récipient (4) muni d'un couvercle (6), et éventuellement d'un agitateur (5). Ce récipient contient un liquide tel que défini ci-dessus, notamment un milieu de culture, L , dans lequel on fait passer l'atmosphère (en général, l'air ambiant du volume à surveiller) par l'entrée (1), un ou plusieurs tubes plongeurs (2) et un diffuseur (3) comme un tube ou un anneau perforé permettant la génération de nombreuses bulles dudit air à surveiller, ou tout système assurant un contact optimal air/liquide, y compris des systèmes à plaques successives perforées, des anneaux de Rachig ou analogues ; un liquide neuf arrive par l'entrée (8) sous l'effet d'une pompe ou un effet de pression quelconque, et le liquide « chargé » en substances/microbes est soutiré également en continu par une ou plusieurs sorties (9, 10) placées en des points A, B, ... . Ledit liquide soutiré passe en continu dans un circuit aval (11) comportant éventuellement une pompe (11), passe dans un concentrateur (12) et est ensuite dirigé vers un appareil de détection/dépistage (13) qui déclenche une alarme, ou trace une courbe, ou enregistre des données etc (14). Sur la figure 2, qui représente également très schématiquement le prototype réalisé, on retrouve le récipient (4) muni de son couvercle (7) (en fait, une fermenteur de laboratoire adapté), le liquide nutritif L ainsi qu'une arrivée (8) de liquide L « neuf » et une sortie de soutirage du liquide « chargé » (9), disposée en un point C. Ce liquide chargé est dirigé vers un système de mesure capable de fournir les données qui ont été retranscrites sur les courbes également annexées. Le prototype fonctionne en discontinu, ou « batch », avec une atmosphère stérile (20) et l'injection ponctuelle par un tube (21), un tube plongeur (2) et un diffuseur à bulles (3), d'un aérosol (23), issu d'un barbotage dans un milieu de culture chargé en « microbes » (24). La figure 3 annexée représente , à partir de t° (atmosphère stérile), l'injection de l'aérosol « Bacillus » à t° + 30 min et durant 10 minutes, donc jusqu'à t° + 40 min. La suspension de Bacillus à partir de laquelle est créé l'aérosol contient 100 000 spores / mL et ensuite injection d'air stérile puis l'observation de la détection. L'atmosphère (20) de départ, ainsi que le liquide L de départ étant stériles, on observe un plateau horizontal qui représente en fait te temps nécessaire pour atteindre le seuil de détection par l'appareil de mesure (22). On voit que le temps de « réaction » du prototype est de seulement 2h, moment où l'on observe une forte croissance en UFC/ mL. Ce temps de réaction est parfaitement compatible avec la réactivité nécessaire en pratique. La figure 4 annexée représente l'évolution de la croissance bactérienne mesurée par la DO en fonction du temps de séjour dans le récipient. La densité optique (DO) est une mesure du trouble du liquide. Lorsque les bactéries se multiplient, te trouble s'accentue. Cette mesure est moins sensible que te dénombrement des bactéries ci-dessus détaillé mais lors de la réalisation des essais, il a l'avatage de donner un résultat immédiat de la croissance bactérienne. Le dénombrement des UFC (Unités Formant Colonies) demande 24 heures d'incubation à 37°C mais le résultat obtenu est plus précis. Dans la figure 4, nous suivons l'évolution de la DO en fonction du temps 15 (plus les bactéries se multiplient, plus le milieu se trouble et donc plus la DO augmente). La figure 5 annexée représente l'évolution de la DO en fonction du temps de séjour dans le récipient. Dans la figure 5, nous suivons le nombre de bactéries en fonction du 20 temps. Plus les bactéries se multiplient, plus leur nombre augmente. On remarquera que les ordonnées sont en échelle logarithmique. L'invention couvre également tous les modes de réalisation et toutes les applications qui seront directement accessibles à l'homme de métier à ta lecture de la présente demande, de ses connaissances propres, et 25 éventuellement d'essais simples de routine. REVENDICATIONS1. Procédé de détection d'agents pathogènes, dangereux, d'explosifs ou substances illicites (comme certaines drogues) sous forme de traces dans une atmosphère, y compris dans des atmosphères occupant un très grand volume (comme une salle d'aéroport ou un hôpital) caractérisé en ce qu'il comprend : a) une étape d'aspiration en continu de l'air ambiant, b) un transfert en continu ou discontinu de l'air aspiré sous a) vers un liquide circulant en continu ou discontinu au travers d'un récipient, et le passage dudit air aspiré en continu au travers de ce liquide, c) éventuellement (très préférentiellement) une concentration en continu ou discontinu du liquide, d) le transfert en continu ou discontinu d'au moins une fraction dudit liquide vers un appareil de dépistage adapté à l'agent ou aux agents que l'on souhaite détecter, ledit récipient étant d'autre part alimenté en continu ou discontinu par la même fraction de liquide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le 20 procédé sera mis en oeuvre dans ses quatre étapes en mode CONTINU. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'aspiration peut être effectuée , selon la taille du volume d'atmosphère à surveiller, notamment par un système à soufflante, turbine, système à vide par exemple de type Venturi. 25 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le débit d'atmosphère peut être comprisnotamment entre 30 et 240 L/h, et tout particulièrement, selon l'exemple non limite du prototype réalisé, entre 80 et 160 L/h, notamment 120 L/h. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit liquide sera sélectionné en fonction des agents pathogènes, substances dangereuses ou illicites, recherchée et est choisi parmi : - eau - solution saline tamponnée - milieu de culture choisi parmi : -Bouillon trypticase soja (toutes bactéries) -Bouillon mueller hinton (toutes bactéries) -Bouillon chapman (bactéries halophiles comme tes staphylocoques) - Milieu de Eagle (pour les virus) 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les bactéries vont se multiplier dans un tel liquide nutritif ou milieu de culture contenu dans ledit récipient, les virus ne vont pas y croître, mais ils passeront en partie (comme les bactéries ou comme toute trace de substance dangereuse ou illicite) dans la fraction de liquide prélevée en continu, pour être dirigée éventuellement (mais de manière tout à fait préférée après au moins une étape de concentration) vers un appareil de dépistage ou détection adapté aux substances recherchées, dont le seuil de détection sera tel qu'il permette une action rapide de prévention. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le seuil de détection sera de une heure à un jour par exemple, notamment de l'ordre de 1 à 2 h. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que pour les virus et les bactéries on utilisera notamment comme dispositif de dépistage / détection, un appareil de PCR (« Polymérase Chain Reaction » - réaction de polymérisation en chaîne). 9. Appareil pour la détection d'agents pathogènes, de substances dangereuses ou illicites (explosifs, drogues) sous forme de traces , y compris dans des atmosphères occupant un très grand volume, comme une salle d'aéroport ou un hôpital utilisant te procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen de passage du circuit de la détection au travers d'une phase liquide. 10. Appareil selon ta revendication 9 caractérisé en ce que ledit appareil comprend : 1 un récipient contenant ledit liquide, 2 au moins une entrée d'atmosphère (qui sera généralement l'air ambiant), 3 pour le mode en continu, au moins une sortie d'atmosphère APRÈS son passage au travers dudit liquide, 4 un moyen permettant de transférer ou envoyer ladite atmosphère au travers dudit liquide, - 5 pour le mode continu, au moins une entrée de liquide « neuf » (circuit amont) et au moins une sortie de liquide « chargé » des substances recherchées (circuit aval ) et un moyen de circulation dudit liquide du circuit amont vers le circuit aval, comme une pompe.11 Appareil selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un moyen ou appareil de concentration du liquide (sur le circuit de sortie - aval - dudit liquide) tel que un appareil de centrifugation ou de filtration. 12 Appareil selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que il est encore connecté à un ou plusieurs appareils de détection/dépistage (plusieurs appareils et/ou un seul appareil capable de dépister/détecter simultanément plusieurs agents) placé sur te circuit de sortie d'atmosphère (et en AVAL du moyen ou appareil de concentration lorsqu'il est présent). 13 Appareil selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que, de manière tout à fait préférée, le ou lesdits appareils ou moyens de détection / dépistage sont des appareils connus du type PCR. 14. Appareil selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que, de manière absolument préférée, l'appareil est configuré pour un fonctionnement en mode continu.15