Brevet FR2954830A1 — publié le 20110701

METHODE D'ANALYSE COMPARATIVE PAR RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE La présente invention concerne une méthode d'analyse comparative par spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) permettant la comparaison de conformations tridimensionnelles de protéines dans différentes préparations protéiques. Cette méthode permet notamment de déterminer si une protéine sélectionnée est dans la même conformation tridimensionnelle dans différentes préparations protéiques. Cette méthode permet en particulier l'analyse de composés thérapeutiques, particulièrement de biomédicaments ou encore de biosimilaires, dans différents échantillons, et ce sans altérer lesdits échantillons. Les protéines sont formées de chaînes polypeptidiques, ou successions d'aminoacides, plus ou moins longues dont on peut déterminer la séquence. Une telle succession d'aminoacides liés par des liaisons peptidiques constitue la structure primaire d'une protéine. Cependant, chaque protéine a également une structure tridimensionnelle, ou conformation, qui est établie et maintenue par d'autres types de liaisons que les liaisons peptidiques. Lesdites liaisons sont assurées en général par des ponts disulfures, des liaisons ioniques, des liaisons hydrogène ou des interactions hydrophobes. Ceci relève du domaine de la biochimie structurale, domaine où l'on parle alors de structure secondaire, tertiaire, voire quaternaire, qui confère à chaque protéine ses propriétés particulières. Chaque protéine a donc une conformation protéique ou structure tridimensionnelle qui lui est propre. Cette conformation est susceptible d'être bouleversée ou désorganisée sans qu'aucune liaison peptidique ne soit rompue. Ce sont les autres liaisons qui sont affectées et ceci aboutit à une modification de la conformation protéique qu'on appelle également dénaturation. La dénaturation peut être réversible ou irréversible, complète ou partielle, suivant la nature et le nombre de liaisons destabilisées ; ceci affecte inévitablement les propriétés physiques et biologiques de la protéine. Une telle dénaturation protéique peut être provoquée par toute une variété d'agents physiques et/ou chimiques comme la chaleur, le froid, la congélation, les radiations ultraviolettes et ionisantes, les variations de pH, les détergents, les solvants organiques, une solution d'urée ou de guanidine, mais également par une dilution ou l'agitation d'une préparation protéique. L'analyse des structures protéiques peut donc être très délicate dans la mesure où les conformations protéiques sont très sensibles, y compris à l'agitation. De plus, une préparation protéique peut contenir plusieurs protéines, il est donc souvent nécessaire de procéder en premier lieu à un isolement et à une purification de la protéine d'intérêt. Les techniques permettant de déterminer ces structures primaires, secondaires, etc...sont 35 maintenant bien connues de l'homme de l'art. L'analyse de la structure primaire des protéines se fait généralement par l'analyse de la composition en aminoacides par chromatographie (par échange d'ions, en phase gazeuse ou d'adsorption) ou par séquençage des aminoacides en faisant appel à des méthodes récurrentes chimiques ou enzymatiques libérant les acides aminés un à un à partir de l'extrémité C ou N terminale ou plus récemment en utilisant des méthodes mettant en oeuvre la spectrométrie de masse. Les structures secondaires, tertiaires et quaternaires sont déterminées par analyse des diagrammes de diffraction des rayons X ou par résonance magnétique nucléaire (RMN). Ces techniques nécessitent cependant souvent au moins la purification et la concentration des protéines sinon leur dénaturation et par conséquent la perte de l'échantillon, ou préparation protéique, à analyser. L'analyse d'échantillons par résonance magnétique nucléaire (RMN) présente l'avantage de permettre l'étude d'une protéine d'intérêt sans pour autant la dénaturer. Le principe de l'utilisation de la RMN dans l'analyse protéique consiste à placer une protéine d'intérêt en solution dans un champ magnétique intense. Les spins des noyaux atomiques composant la protéine d'intérêt vont alors s'orienter le long de l'axe principal du champ magnétique. Il est alors possible de perturber l'état d'équilibre de ces spins grâce à une série d'impulsions électromagnétiques et de mesurer le courant induit lors du retour à l'équilibre. Le signal RMN enregistré contient la combinaison de l'ensemble des contributions des différents atomes en solution ; ensemble également appelé spectre (Cavanagh et al., Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice, Academic Press, Dec. 1995). Suivant la méthode de RMN sélectionnée, on obtiendra un spectre à une dimension (RMN 1 D), à deux dimensions (RMN 2D) ou à trois dimensions (RMN 3D). Le niveau d'informations divulgué par chaque spectre dépendra de la méthode de RMN choisie. Plusieurs méthodes d'analyse applicables à l'étude de conformations protéiques et mettant en oeuvre la spectrométrie de RMN ont été décrites à ce jour. On citera notamment la méthode DOSY, les méthodes NOESY, SOFAST, COSY, TOCSY, HSQC, HNCA, HNCO, HNCOCA, HCCH TOCSY, HCCH COSY améliorées ou non par la variante TROSY, ainsi que toute séquence d'enregistrement RMN permettant d'établir des corrélations entre deux ou plusieurs noyaux de la protéine d'intérêt (Sattler et al., Prog Nuc Mag Reson Spectro, 1999, vol. 34(2) p. 93-158). Les plus communément employées dans ce cadre particulier sont les méthodes DOSY 1H (C.S. Johnson Jr., Diffusion ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy: principles and applications, Prog. NMR Spectrosc. 34 (1999) 203û256 ; Balayssac S. et al., J. Magn. Reson. 2009, 196, 78-83) et SOFAST (Schanda et al. J Am Chem Soc (2005) vol. 127 (22) p. 8014-15). L'application des méthodes de RMN à l'analyse de conformations protéiques permet en particulier l'analyse de biomédicaments. Les biomédicaments sont développés depuis plus de vingt ans et peuvent être classés en différentes catégories par exemple : les produits hormonaux (hormones de croissance, érythropoïétine, et insuline), les immunomodulateurs (beta-interferon), les anticorps monoclonaux, les modulateurs de coagulation sanguine (facteurs VIII et IX), les enzymes et les vaccins. Les biomédicaments peuvent être obtenus par des méthodes variées et sensibles à plusieurs facteurs externes et il y a donc un intérêt tout particulier à pouvoir les analyser rapidement notamment pour déterminer si leur conformation est fonctionnelle (Knâblein J., Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, Wiley VC, Feb. 2008). Parmi les médicaments disponibles sur le marché européen, plus d'une centaine répondent à la définition de biomédicament ci-dessus. Il existe par exemple plusieurs biomédicaments commercialisés ou ayant été commercialisés en Europe, qui sont dérivés de l'insuline : Actrapid® (Boehringer Ingelheim), Apidra ® Insuman® et Lantus® (Sanofi-Aventis), Humalog® et Umuline rapide® (EH Lilly), Insulatard® Levemir ® Mixtard® Monotard® Novomix® Novorapid® Ultratardo et Velosuline® (Novo Nordisk). Il existe également plusieurs biomédicament dérivés de l'erythropoïetine : Eprex® (Janssen Cilag), Neorecormon® (Roche), et Aranesp® (Amgen). Il existe aussi plusieurs médicaments dérivés de l'hormone de croissance : Humatrope® (Eli Lilly), Norditropine® (Novo Nordisk) et Genotonorm® (Pfizer). Cette liste n'est pas exhaustive et n'est donnée qu'à titre d'exemple. Suite au développement des biomédicaments est apparue la notion de médicament biosimilaire ou de traitement par biosimilaire. Ces biosimilaires sont des composés à usage thérapeutique qui succèdent à un biomédicament dont le monopole légal d'exploitation s'est éteint. La notion de « traitement par biosimilaires » a été intégrée dans la législation européenne en 2003 (voir également Directive européenne CHMP/42832/05). Dans ce cas particulier, il y a un intérêt certain à disposer de moyens d'analyse pour déterminer si un biosimilaire est identique au biomédicament auquel il succède tant sur le plan de sa structure primaire que de sa structure tridimensionnelle. À ce jour, il existe plusieurs médicaments biosimilaires disponibles sur le marché européen dans quatre groupes : erythropoïetine, hormone de croissance, insuline et G- CSF (granulocyte-colony stimulating factor). On citera par exemple dans le domaine des somatotropines Omnitrope* (SandozD) et Valtropin® (Biopartners®) qui sont des biosimilaires de Genotropin ® ou Genotonorm® (Pfizer®), dans le domaine des erythropoïétines alpha Binocrit® (Sandoz®), Epoetin alfa Hexal (Hexal®) et Abseamed ® (Medice Arzneimittel Putter GmbH&Co) qui sont des biosimilaires d'Eprex® (Janssen Cilag) ou encore dans le domaine de filgrastim Biograstim® (CT Arzneimittel GmbH), Filgrastim Ratiopharm (Ratiopharm GmbH), Ratiograstim® (Ratiopharm GmbH), Tevagrastim (Teva Generics GmbH) qui sont des o biosimilaires de Neupogen® (Amgen De nombreuses études de conformations protéiques mettant en oeuvre la RMN ont été décrites dans l'art antérieur (Cavanagh et al., Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice, Academic Press, Dec. 1995). Ces expériences décrivent en général l'élucidation ou la confirmation de la conformation protéique d'une protéine d'intérêt par utilisation de spectres de ) o RMN, une fois la séquence de la protéine connue, d'une protéine d'intérêt dans ses différentes conformations (active par opposition à inactive, stable par opposition à instable, etc...). La RMN permet également de déterminer quelle est la structure quaternaire d'une protéine : dimère, tetramère etc... En effet, l'activité biologique d'une protéine réside souvent dans sa structure oligomérique, à savoir la situation dans laquelle plusieurs chaînes polypeptidiques s'associent de manière spécifique. La mise en oeuvre de la RMN permet d'étudier cette oligomérisation suivant les contraintes physico-chimiques imposées à une protéine puisqu'elle n'impose pas la dénaturation de la protéine d'intérêt. Le brevet européen EP0975954 décrit un procédé de criblage pour identifier la présence de composés qui se lient à une biomolécule cible déterminée. Ce procédé comprend les étapes suivantes: a) générer un premier spectre RMN monodimensionnel filtré T2 ou par diffusion d'un composé d'un mélange de composés chimiques; b) exposer le composé ou le mélange de composés chimiques à une molécule cible; c) générer un second spectre RMN monodimensionnel filtré T2 ou par diffusion dudit composé ou dudit mélange de composés chimiques lorsqu'il est exposé à la molécule cible dans l'étape b) ; et d) comparer lesdits premier et deuxième spectres RMN monodimensionnels filtré T2 ou par diffusion pour déterminer les différences entre ledit premier et ledit deuxième spectres RMN, les différences identifiant la présence d'un ou plusieurs composés parmi ledit premier composé ou ledit mélange de composés chimiques respectivement, qui sont des ligands qui se sont liés à la molécule cible. Ce procédé de criblage mettant en oeuvre la RMN permet d'identifier une liaison entre une biomolécule, potentiellement une protéine, et un ligand de cette biomolécule. La RMN est utilisée ici pour la réalisation de campagnes de criblage permettant d'identifier des ligands; il n'est aucunement question d'appliquer la RMN à l'analyse des structures primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires de biomolécules. La demande internationale W02008/128219 décrit une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre des spectres RMN 'H-'H NOESY. Dans cette demande seule la méthode 'H-'H NOESY est décrite pour la caractérisation de protéines dans différentes formulations thérapeutiques. Seuls les déplacements de fréquence des atomes d'hydrogène sont détectés. Aucune autre expérience n'est réalisée pour atteindre un niveau d'information supplémentaire. Or il est bien connu de l'homme de l'art que dans une formulation thérapeutique, la protéine d'intérêt constituant généralement le principe actif de la formulation, est mélangée à des excipients de type tampons, liants, diluants, délitants, édulcorants, etc... qu'on retrouve en général en plus grande concentration que ladite protéine d'intérêt. Il y a donc plusieurs inconvénients à cette méthode d'analyse. En effet, dans les conditions décrites, le signal détecté par la méthode 'H-'H NOESY risque d'être masqué par le signal des excipients. De plus, en fonction du nombre d'aminoacides constituant la protéine d'intérêt, le spectre 'H-'H NOESY peut devenir si complexe qu'il ne pourra être aisément interprété. Enfin, le pH de la formulation thérapeutique à étudier aura également son importance dans la mesure où à certains pH, notamment ceux supérieurs à 7,5 , la protéine d'intérêt ne donnera aucun signal détectable. Une analyse directe sur un échantillon prélevé à partir d'une formulation thérapeutique ne sera donc pas possible. En effet, pour remédier à tous ces inconvénients, il faudra dans un premier temps purifier la protéine d'intérêt puis la concentrer, ou alors trouver un moyen de filtrer les signaux afin de pouvoir extraire le signal spécifique de la protéine d'intérêt. Par ailleurs, il est préférable que la protéine d'intérêt ne soit pas trop grande de façon à pouvoir discriminer les contributions individuelles dans le spectre utilisé. Enfin, il convient également de trouver un moyen de contrôler les paramètres externes de type pH de l'échantillon. La présente invention se propose de fournir une alternative fiable et rapide à cette situation. La méthode d'analyse objet de la présente invention est très sensible et permet une analyse directe à partir de la formulation thérapeutique sélectionnée. En effet, cette nouvelle méthode d'analyse comparative de conformations protéiques permet l'analyse de protéines non-marquées, de protéines de toutes tailles, le filtrage spécifique du signal correspondant à la protéine d'intérêt, ainsi que l'affranchissement du contrôle des paramètres extérieurs tels le pH. La présente invention consiste en une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine 20 d'intérêt ; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; 25 d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. 30 Cette méthode innovante permet d'étudier, à partir de la détection et de l'analyse de déplacements de fréquence, la structure primaire de la protéine d'intérêt dans les échantillons étudiés, sa conformation protéique, ainsi que de détecter la présence ou l'absence d'excipients ou tout autre élément de nature protéique ou non-protéique. Le fait de cumuler les informations fournies par au moins deux spectres réalisés à partir d'un même échantillon protéique, mais selon des méthodes d'acquisition différentes, permet de déduire de façon certaine des informations quant à la conformation de la protéine d'intérêt. Cette nouvelle méthode ne nécessite aucune étape de conditionnement de l'échantillon à analyser. En effet, dans la mise en oeuvre de cette méthode, les préparations protéiques sont utilisées directement, sans étape de purification ou de concentration de la protéine d'intérêt, et sans marquage de la protéine d'intérêt. La préparation protéique est mise en solution puis placée sur le support de lecture et d'analyse propre à l'appareil de RMN utilisé. Cette méthode permet en particulier de travailler directement sur la formule galénique des compositions thérapeutiques contenant une protéine d'intérêt. Dans le cadre d'une analyse directe à partir d'une formulation commerciale de médicament par exemple, si ladite formule commerciale présentait une concentration de la protéine d'intérêt en quantité insuffisante par rapport au seuil de détection du signal RMN, alors il conviendrait d'augmenter le champ (passer de 600MHz à 800, 900 ou 1000MHz) et/ou d'utiliser la méthode de polarisation nucléaire dynamique (comme celle commercialisée par Oxford Instrument®) ou toute autre méthode d'augmentation de polarisation. Les mots définis ci-dessous sont employés aussi bien au singulier qu'au pluriel. Par « aminoacide » on entend dans la présente invention un composé comportant une fonction acide carboxylique et une fonction amine sur un même atome de carbone. Ceci inclut les vingt aminoacides constitutifs de toutes les protéines ainsi que tous les autres aminoacides se trouvant à l'état libre et ayant un rôle métabolique important, et ceux constituant les petits peptides de moins de vingt aminoacides fabriqués par des micro-organismes ou des plantes uniquement. Par « biomédicament » on entend dans la présente invention un composé à usage thérapeutique dont la substance active est issue des biotechnologies comme les anticorps monoclonaux, les protéines recombinantes (par exemple les enzymes et les cytokines), les composés de thérapie génique et les cellules souches, mais aussi composés et traitements plus anciens comme les vaccins, les produits sanguins, les toxines et les antisera. Sont également inclus dans cette définition les peptides et les polynucléosides. La notion de biomédicament s'entend par opposition aux médicaments constitués de petites entités chimiques (ou « small chemical entities » en anglais). Par « biosimilaire » on entend dans la présente invention un composé à usage thérapeutique qui succède à un biomédicament dont l'exploitation, et en particulier le procédé de fabrication, ne fait plus l'objet d'un monopole légal. Les biosimilaires sont également issus des biotechnologies et présentent des similarités en termes de qualité, de sécurité et d'efficacité par rapport au biomédicament auquel on les compare. Par « conformation protéique » ou « conformation tridimensionnelle d'une protéine » on entend la structure tridimensionnelle de la protéine d'intérêt, c'est-à-dire non seulement la structure primaire, secondaire et tertiaire de ladite protéine, mais également le cas échéant, sa structure quaternaire. Par « nucléoside » on entend dans la présente invention la molécule composée par la liaison d'une base purique (comme l'adénine et la guanine) ou pyrimidique (comme l'uracile, la cytosine, la thymidine) avec le ribose ou le désoxyribose. Parmi les principaux nucléosides on citera l'adénosine et la désoxyadénosine, la guanosine et la désoxyguanosine, l'uridine et la désoxyuridine, la cytidine et la désoxycytidine, ainsi que la thymine ribonucléoside et la désoxythymidine (également appelée thymidine). Par « peptide » on entend dans la présente invention un enchaînement d'au moins deux aminoacides liés entre eux par des liaisons peptidiques, ce qui comprend les oligopeptides ou dipeptides formés par l'union de deux aminoacides et les tripeptides, ainsi que les polypeptides (à partir des tétrapeptides). Les peptides naturels sont formés de différents aminoacides mais on peut synthétiser des homopeptides (tels la triglycine ou la polyphénylalanine, etc...). Les peptides peuvent avoir des structures diverses : peptides linéaires, peptides ramifiés ; peptides cycliques et peptides semi-cycliques. Suivant leur structure, les peptides pourront comporter d'autres liaisons en plus des liaisons peptidiques. Par « préparation protéique » on entend dans la présente invention un mélange de protéines, identiques ou différentes, obtenu selon une méthode de production donnée. Ceci inclut les formulations thérapeutiques telles que commercialisées par les laboratoires pharmaceutiques (susceptible de contenir également des excipients de type tampons, liants, diluants, délitants, édulcorants, etc...). Ceci englobe également toute préparation d'un mélange protéique obtenu par isolement, prélèvement ou tout procédé biotechonologique connu de l'homme de l'art, à savoir notamment la solubilisation, la concentration, la purification, etc... Par « protéine » on entend dans la présente demande un polypeptide impliquant une ou des liaisons peptidiques unissant deux ou plusieurs aminoacides. Il est communément admis que les protéines sont des polypeptides de masse moléculaire supérieure à 10 000 et qui ne dialysent pas à travers une membrane de cellophane (Biochimie Générale, J.-H. WEIL, Dunod, 11eme édition, Chapitre 1, page 17). Une protéine peut inclure une portion qui n'est pas constituée par un ou des aminoacides (ex.: glycoprotéines) et peut par ailleurs être tronquée ou modifiée. Il est évident pour l'homme de l'art qu'une protéine peut être une séquence polypeptidique sy thétique ou naturelle telle que sécrétée par une cellule, ou simplement une portion fonctionnelle d'une telle protéine. Par «RMN 1D » on entend la résonance magnétique nucléaire à une seule dimension ou monodimensionnelle. Par « RMN 2D » on entend la résonance magnétique nucléaire à deux dimensions ou bidimensionnelle (expérience de type COSY, DOSY, NOESY, HSQC, HMBC, etc...). Par « RMN 3D » on entend la résonance magnétique nucléaire à trois dimensions ou tridimensionnelle (expérience de type HNCO, etc...). Par « signature spectrale » on entend l'ensemble des résonances des noyaux observés d'une protéine d'intérêt dans des conditions données (par exemple champ, solvant, température...). Suivant la nature de la protéine d'intérêt et afin d'obtenir un niveau d'information suffisant pour réaliser une analyse comparative de conformations protéiques fiable, il est parfois préférable de disposer des informations fournies par au moins un spectre RMN bidimensionnel (RMN 2D). En effet, la présente invention est susceptible d'utiliser une grande variété de spectres pour obtenir la signature spectrale d'une protéine. Les deux critères essentiels pour le choix du type d'expérience de RMN à réaliser sont la sensibilité, qui doit être adaptée à la quantité de protéine présente dans la formulation, et le degré d'ambiguïté de la signature spectrale obtenue. Pour atteindre la sensibilité maximale, l'acquisition des informations se fera en enregistrant les spectres à la fréquence du proton, noyau le plus sensible en RMN. Il est ensuite possible de gagner en sensibilité en utilisant, d'une part, un spectromètre équipé d'une sonde cryogénique, et d'autre part, des méthodes d'acquisition permettant de tirer avantage des propriétés de relaxation particulières des macromolécules. De manière générale, afin de réduire le degré d'ambiguïté de la signature spectrale, on enregistrera des spectres bidimensionnels ou de dimensionnalité plus élevée. Par conséquent, dans un mode de réalisation préféré, la présente invention décrit une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt ; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. dans laquelle au moins un spectre RMN réalisé durant l'étape b) à partir de l'une des préparations 5 protéiques sélectionnées met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D. Dans un mode de réalisation différent, la présente invention décrit une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine 10 d'intérêt ; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; 15 d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. 20 dans laquelle au moins un spectre RMN réalisé durant l'étape c) à partir de l'une des préparations protéiques sélectionnées met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D. L'interprétation des informations fournies par les spectres obtenus suite à la mise en oeuvre de la méthode ci-dessus permet alors de détecter la présence ou l'absence d'excipients, l'état de la protéine d'intérêt et en particulier sa conformation, ainsi que d'éventuels déplacements de 25 fréquence, même légers, si la protéine d'intérêt est différente dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. Si la protéine d'intérêt est identique et dans le même état conformationnel dans les deux préparations protéiques, aucun déplacement de fréquence n'est observé. Selon un mode de réalisation préféré, la méthode de comparaison met en oeuvre la méthode 30 DOSY, les méthodes NOESY, SOFAST, COSY, TOCSY, HSQC, HNCA, HNCO, HNCOCA, HCCH TOCSY, HCCH COSY améliorées ou non par la variante TROSY, ainsi que toute séquence d'enregistrement RMN permettant d'établir des corrélations entre deux ou plusieurs noyaux de la protéine d'intérêt. Selon un autre mode de réalisation, la méthode d'analyse selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite méthode de RMN 2D est sélectionnée parmi les méthodes DOSY, et SOFAST, éventuellement en combinaison avec la variante TROSY. L'expérience de RMN mise en oeuvre durant l'étape b) et/ou durant l'étape c) est préférentiellement sélectionnée parmi les expériences suivantes : DOSY et SOFAST. Selon un autre mode de réalisation, la méthode selon l'invention est caractérisée en ce que la méthode de RMN 2D utilisée est la méthode DOSY. Enfin, selon un mode de réalisation préféré, la méthode d'analyse est caractérisée en ce que la méthode de RMN 2D utilisée est la méthode SOFAST, éventuellement en combinaison avec la variante TROSY. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN, lesdits spectres étant réalisés selon les mêmes méthodes de RMN que durant l'étape b) ; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique par superposition des spectres réalisés durant les étapes b) etc); e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde 25 préparation protéique. En effet, la possibilité de superposer des spectres réalisés suite à la mise en oeuvre des mêmes méthodes de RMN permet une interprétation plus rapide des résultats. On réalise par exemple une expérience DOSY et une expérience SOFAST, soit deux spectres, durant l'étape b) à partir d'un échantillon contenant la protéine d'intérêt. On réalise alors les mêmes expériences DOSY et 30 SOFAST, soit deux spectres, sur le second échantillon protéique durant l'étape c). Un logiciel d'exploitation des spectres RMN (par exemple NMRnotebook®) permet alors la superposition desdits spectres, qui sont au nombre de quatre et qui seront comparés deux à deux. L'interprétation des informations ainsi fournies permet alors de détecter la présence ou l'absence d'excipients, l'état de la protéine d'intérêt et en particulier sa conformation, ainsi que d'éventuels 35 déplacements de fréquence, même légers, si la protéine d'intérêt est différente dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. Si la protéine d'intérêt est identique et dans le même état conformationnel dans les deux préparations protéiques, les spectres se superposent totalement et aucun déplacement de fréquence n'est observé. Dans un mode réalisation préféré, la méthode d'analyse de conformations protéiques mettant en 5 oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation 10 protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN, lesdits spectres étant réalisés selon les mêmes méthodes de RMN que durant l'étape b) ; comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la 15 seconde préparation protéique par superposition des spectres réalisés durant les étapes b) etc); e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. 20 dans laquelle au moins un spectre RMN réalisé à partir de l'une des préparations protéiques sélectionnées met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D. Comme évoqué ci-dessus, la présente invention est susceptible d'utiliser une grande variété de spectres pour obtenir la signature spectrale d'une protéine. En particulier, on utilisera dans certains cas la possibilité d'affiner des largeurs des raies en utilisant le phénomène de corrélation 25 croisée entre deux mécanismes de relaxation (expérience de type TROSY), ou la possibilité d'optimiser le taux de répétition des expériences en utilisant les propriétés de relaxation longitudinale spécifique de certains groupes de protons au sein de la protéine (comme les protons amides ou ceux des groupes méthyles). On pourra également utiliser des spectres de corrélation entre les protons de la protéine et des hétéronoyaux comme l'azote 15 ou le carbone 13. 30 L'abondance naturelle faible de ces isotopes de l'azote et du carbone réduit la sensibilité des expériences mais augmente la spécificité des signatures spectrales obtenues. La balance entre spécificité et sensibilité doit être adaptée à chaque famille de médicaments. La structure quaternaire (degré d'oligomérisation de la protéine d'intérêt) ainsi que la composition du solvant seront obtenues en enregistrant des spectres permettant de mettre en évidence les vitesses de diffusion translationnelle des molécules. Ces données peuvent, par exemple, être obtenues à l'aide de spectres DOSY. Selon un mode de réalisation particulier, la méthode d'analyse ci-dessus est caractérisée en ce que ladite méthode de RMN 2D est sélectionnée parmi la méthode DOSY, les méthodes NOESY, SOFAST, COSY, TOCSY, HSQC, HNCA, HNCO, HNCOCA, HCCH TOCSY, HCCH COSY améliorées ou non par la variante TROSY, ainsi que toute séquence d'enregistrement RMN permettant d'établir des corrélations entre deux ou plusieurs noyaux de la protéine d'intérêt. L'expérience de RMN mise en oeuvre est préférentiellement sélectionnée parmi les expériences suivantes : DOSY et SOFAST. Selon un autre mode de réalisation particulier, la méthode selon l'invention est caractérisée en ce que la méthode de RMN 2D utilisée est la méthode DOSY. Enfin, selon un mode de réalisation préféré, la méthode d'analyse est caractérisée en ce que la méthode de RMN 2D utilisée est la méthode SOFAST, éventuellement améliorée par la variante TROSY. Afin d'obtenir un niveau d'information supplémentaire, la présente invention prévoit une méthode d'analyse selon la revendication 1, caractérisée en ce que les étapes a) d) et e) sont inchangées par rapport à la méthode générale et qui comprend les étapes suivantes : a) réaliser au moins deux spectres RMN 2D de la première préparation protéique ; b) réaliser au moins deux spectres RMN 2D de la seconde préparation protéique ; Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention consiste en une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation protéique à partir d'un spectre RMN DOSY et d'un spectre RMN SOFAST; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'un spectre RMN DOSY et d'un spectre RMN SOFAST; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la 30 protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. Comme ceci est évoqué ci-dessus, la méthode innovante objet de la présente invention revêt un intérêt tout particulier dans le cas de l'étude de biomédicaments ou encore de biosimlaires. En conséquence, dans un mode de réalisation particulier la méthode d'analyse comparative de 35 conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est un biomédicament. Selon un mode de réalisation préféré, la méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est un biosimilaire. Il peut également être envisagé d'étudier une préparation protéique contenant un biomédicament dérivé d'un composé donné par comparaison avec une préparation protéique contenant un biosimilaire dérivé de ce même composé. On pourra par exemple utiliser dans le cadre d'une étude portant sur le filgrastim : durant l'étape b) une préparation protéique contenant le composé thérapeutique Neupogen® (Amgen) et durant l'étape c) une préparation protéique contenant le composé thérapeutique Tevagrastim® (Teva Generics GmbH) ; dans le cadre d'une étude portant sur les somatotropines : durant l'étape b) une préparation protéique contenant le composé thérapeutique Genotropino (Pfizer) et durant l'étape c) une préparation protéique contenant le composé thérapeutique Omnitrope® (Sandoz). La présente invention décrit également une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt ; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation 20 protéique contenant un biomédicament de la protéine d'intérêt à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique contenant un biosimilaire de la protéine d'intérêt à partir d'au moins deux spectres RMN; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la 25 seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. Dans un mode de réalisation particulier selon la méthode décrite ci-dessus la protéine d'intérêt est 30 sélectionnée parmi : les produits hormonaux (hormones de croissance, érythropoïétine, et insuline), les immunomodulateurs (beta-interferon), les anticorps monoclonaux, les modulateurs de coagulation sanguine (facteurs VIII et IX), les enzymes et les vaccins. De façon préférée, la protéine d'intérêt est sélectionnée parmi les produits hormonaux : insuline, hormone de croissance et erythropoïetine. Dans un mode de réalisation préféré la protéine d'intérêt est 35 l'insuline. La pertinence et l'efficacité de la méthode selon l'invention a été établie lors d'études comparatives sur l'insuline est ses biomédicaments. En conséquence, la présente invention décrit une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques de l'insuline mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant de l'insuline ; b) établir la signature spectrale de l'insuline dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de l'insuline dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; d) comparer les signatures spectrales de l'insuline dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si l'insuline est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. Si les spectres obtenus à partir de la première préparation protéique durant l'étape b) et à partir de la seconde préparation protéique durant l'étape c) montrent des déplacements de fréquence jugés significatifs au niveau de l'insuline, alors les insulines en présence sont considérées différentes. Si les spectres sont superposables, alors les insulines en présence sont considérées comme identiques. Par ailleurs, les spectres renseigneront également sur la structure primaire de l'insuline dans les échantillons étudiés, sa conformation protéique (structure oligomérique), ainsi que de la présence ou l'absence d'excipients. Dans un premier mode de réalisation, dans la méthode décrite ci-dessus dans son application à l'insuline au moins un spectre RMN réalisé durant l'étape b), ou durant l'étape c) à partir de l'une des préparations protéiques sélectionnées, met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D. Dans un second mode de réalisation, dans la méthode décrite ci-dessus dans son application à l'insuline au moins un spectre RMN réalisé durant les étapes b) et c) à partir des deux préparations protéiques sélectionnées, met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode décrite ci-dessus dans son application à l'insuline, les expériences de RMN réalisées durant l'étape c) sont identiques à celles réalisées durant l'étape b). Par exemple, si des expériences de RMN DOSY et SOFAST sont réalisées durant l'étape b), alors des expériences de RMN DOSY et SOFAST seront réalisées durant l'étape c). Dans un mode de réalisation particulier, la méthode décrite ci-dessus dans son application à l'insuline est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant de l'insuline; b) établir la signature spectrale de l'insuline dans la première préparation protéique à partir de deux spectres RMN 2D; c) établir la signature spectrale de l'insuline dans la seconde préparation protéique à partir de deux spectres RMN 2D; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. Dans une mode de réalisation préféré selon la méthode ci-dessus, ladite méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant de l'insuline; b) établir la signature spectrale de l'insuline dans la première préparation protéique à partir d'un spectre RMN DOSY et d'un spectre RMN SOFAST; c) établir la signature spectrale de l'insuline dans la seconde préparation protéique à partir d'un spectre RMN DOSY et d'un spectre RMN SOFAST; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. La présente invention décrit également une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques de l'hormone de croissance mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant de l'hormone de croissance ; b) établir la signature spectrale de l'hormone de croissance dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de l'hormone de croissance dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; d) comparer les signatures spectrales de l'hormone de croissance dans la première et dans la seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si l'hormone de croissance est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. Si les spectres obtenus à partir de la première préparation protéique durant l'étape b) et à partir de la seconde préparation protéique durant l'étape c) montrent des déplacements de fréquence jugés significatifs au niveau de l'hormone de croissance, alors les hormones de croissance en présence seront jugées différentes. Si les spectres sont superposables, alors les hormones de croissance en présence sont identiques. Par ailleurs, les spectres renseigneront également sur la structure primaire de l'hormone de croissance dans les échantillons étudiés, sa conformation protéique (structure oligomérique), ainsi que de la présence ou l'absence d'excipients. La présente invention porte également sur une méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon dans laquelle la protéine d'intérêt est l'hormone de croissance. La présente invention est illustrée par les exemples et figures ci-dessous : La Fig. 1 présente la séquence en aminoacides de l'insuline humaine et de l'insuline lispro. Les 20 traits gras représentent les trois ponts disulfures. Les différences entre les deux séquences sont soulignées et les aminoacides concernées (lysine et proline) présentés en gras. La Fig. 2 présente la superposition de spectres SOFAST-HMQC 'H-13C de l'insuline humaine Actrapid® (en trait clair) et de l'insuline lispro Humalog® (en trait foncé). La Fig. 3 présente la superposition de spectres SOFAST-HMQC 1H-13C de l'insuline humaine 25 Actrapid® (en trait clair) et de l'insuline humaine Umuline rapide® (en trait foncé). Dans l'encart est mis en évidence un léger déplacement de fréquence. La Fig. 4 présente la superposition des cartes DOSY 1H de l'insuline humaine Actrapid® à pH 7 (en trait clair) et à pH 2 (en trait foncé). Les excipients détectables dans ces conditions par RMN sont le glycérol (C3H8O) et le métacrésol (C7H8O). EXEMPLES La présente méthode est utilisable pour toute formulation commerciale de médicament, en particulier pour les biomédicaments et les biosimilaires, dans les limites de détection du signal 30 RMN. Ces limites sont notamment fixées par la concentration en composé thérapeutique de nature protéique. Comme vu précédemment cette méthode est notamment applicable aux produits hormonaux (hormones de croissance, érythropoïétine, et insuline), aux immunomodulateurs (beta-interferon), aux anticorps monoclonaux, aux modulateurs de coagulation sanguine (facteurs VIII et IX), aux enzymes et aux vaccins ; cette liste est donnée à titre d'exemple et n'est en aucun cas limitative. Si toutefois la formule commerciale présentait une concentration de la protéine d'intérêt en quantité insuffisante par rapport au seuil de détection du signal RMN, alors il conviendrait d'augmenter le champ (cet exemple est réalisé à 600MHz mais on pourra passer à 800, 900 ou 1000MHz) et/ou d'utiliser la méthode de polarisation nucléaire dynamique (comme celle commercialisée par Oxford Instrument®) ou toute autre méthode d'augmentation de polarisation. A. Insuline Généralités La structure en aminoacides de l'insuline a été la première structure polypeptidique identifiée par F. Sanger en 1955. L'insuline est une hormone peptidique qui comporte deux chaînes peptidiques : une chaîne A composée de 21 aminoacides et dépourvue d'aminoacides basiques et une chaîne B de 30 aminoacides comportant des aminoacides basiques. Ces deux chaînes sont liées entre elles par 3 ponts disulfure dont deux ponts interchaîne et un pont intrachaîne au sein de la chaîne A. Par ailleurs, la nature des aminoacides en position 8, 9 et 10 (dans la région du pont intrachaîne) est variable selon les espèces animales. L'insuline est une hormone hypoglycémiante secrétée par le pancréas. Sa masse moléculaire (MM) est d'environ 6000 et des dimères de MM 12000 se forment aisément. Ces dimères sont encore susceptibles de s'associer pour former des polymères de MM 24000 ou 48000. Ceci est la forme oligomérique de l'insuline. C'est cette forme oligomérique de l'insuline qui est active. Formulations d'insulines commerciales Les formulations commerciales d'insuline disponibles actuellement contiennent en général du métacrésol et des ions zinc qui permettent l'oligomérisation de la protéine sous la forme d'un héxamère stable dans le temps (Chang X. et al., Biochemistry, 1997, 36, 9409-9422). Historiquement isolée à partir de pancréas de mammifères (boeuf et porc), l'insuline en tant que composé thérapeutique est maintenant produite par des techniques dites de génie génétique utilisant la séquence d'ADN de la forme humaine de la protéine. Cette avancée a permis le développement d'analogues dits « rapides » ou « retardés » de l'insuline humaine permettant d'améliorer le confort des malades. Ces analogues ont une séquence en aminoacides qui diffère de la séquence humaine. Par exemple, l'insuline lispro commercialisée par Eli Lilly sous le nom commercial Humalog® présente une séquence en aminoacides où les positions de deux acides aminés à l'extrémité de la chaîne B sont inversées (Figure 1). Identification du type d'insuline Les formulations commerciales d'insuline contiennent des concentrations importantes de protéines ce qui permet l'acquisition rapide de spectres de corrélation. Une signature spectrale non-ambigüe peut être obtenue rapidement en mesurant un spectre de corrélation entre les protons méthyles et le carbone correspondant. La Figure 2 montre une superposition des spectres de corrélation 'H-13C dans la région des méthyles mesurés pour l'insuline humaine (Actrapid®, Novo Nordisk) et l'insuline lispro (Humalog®, Eli Lilly). La comparaison des spectres montre clairement la conséquence de l'inversion des deux acides aminés sur la fréquence de résonance des groupes méthyles. Dans le cas de l'insuline, l'attribution des fréquences est disponible ce qui permet d'identifier les fréquences associées à l'isoleucine 2 de la chaîne A comme étant les plus perturbées par la mutation, ce qui est cohérent avec la structure tridimensionnelle de l'insuline (Chang X. et al., Biochemistry, 1997, 36, 9409-9422). Cet effet de déplacement de fréquences permet une identification non-ambigüe de ce variant d'insuline. On démontre ainsi que l'utilisation de ce type de spectre permet de distinguer deux molécules qui ont la même composition en aminoacides mais dont la séquence en aminoacides diffère. Effet de la formulation galénique Les fréquences de résonance des groupes méthyles sont également sensibles à plusieurs paramètres physicochimiques de leur environnement (température, pH, composition du solvant). Dans cet exemple, deux compositions thérapeutiques contenant de l'insuline humaine provenant de deux laboratoires pharmaceutiques différents sont comparées (Fig. 3). La protéine est identique, mais la formulation est légèrement différente : Actrapid® contient outre l'insuline humaine, du chlorure de zinc, du glycérol, du métacrésol, de l'hydroxyde de sodium, de l'acide chlorhydrique et de l'eau pour préparations injectables ; Umuline rapide ® contient, outre l'insuline humaine, du glycérol, du métacrésol, de l'hydroxyde de sodium, de l'acide chlorhydrique, du phosphate disodique heptahydraté et de l'eau pour préparations injectables. On constate que les spectres de corrélation 1H-13C dans la région des méthyles mesurés pour l'insuline en provenance de Novo Nordisk et de Eli Lilly sont quasi superposables, ce qui permet d'attester l'identité des deux protéines. De faibles déplacements de fréquences ( Etat oligomérique et nature des excipients Les spectres DOSY 1H permettent également de distinguer les signaux provenant des excipients des signaux provenant du composé thérapeutique de nature protéique. Les excipients étant généralement des petites molécules et possèdent un coefficient de diffusion bien supérieur à celui d'une protéine. La présente méthode permet donc de détecter la présence des excipients listés dans la composition du produit commercial. De plus, elle permet d'identifier d'éventuels contaminants de faible poids moléculaire et d'en déterminer éventuellement la nature chimique. De la même façon, il est possible d'estimer l'état d'oligomérisation de l'insuline puisque le coefficient de diffusion mesuré sur les signaux provenant de la protéine est lié au nombre de monomères qui s'associent (Figure 4). Ainsi, un hexamère aura un coefficient de diffusion inférieur à celui d'un dimère, la forme hexamèrique représentant la forme stable de l'insuline. La présente méthode est donc capable de déterminer si la formulation commerciale étudiée présente bien une forme stable d'insuline. Méthode expérimentale : Les échantillons utilisés contiennent de l'insuline humaine ou l'un de ses analogues dans une formulation commerciale. Les insulines disponibles sur le marché français sont dosées à 100 UI/mL, ce qui correspond à une concentration en protéine de 3,5 mg/mL. À 500 µL de solution directement prélevée dans l'échantillon 50 µL de D2O sont ajoutés. Ces 550 µL sont placés dans un tube RMN de diamètre égal à 5 millimètres. La première étape est la réalisation d'un spectre SOFAST-HMQC 1H-13C (Schanda P. et al. J. Biomol. NMR, 2005, 33, 199-211) centré sur la zone spectrale des groupements méthyles d'une protéine. La seconde étape est la réalisation d'un spectre DOSY 1H (Balayssac S. et al., J. Magn. Reson. 2009, 196, 78-83). Ces deux spectres sont enregistrés sur un spectromètre BRUKER opérant à 600 MHz (1H) équipé d'une sonde cryogénique. Le traitement des spectres est effectué avec le logiciel NMRnotebook (NMRTEC). B. Hormone de croissance (somatropine) Cette protéine de 191 acides aminés se présente sous forme de poudre à reconstituer ou directement en solution. Les concentrations disponibles sont de l'ordre de 5-10 mg/mL permettant d'envisager des expériences RMN basées sur l'abondance naturelle du 15N et du 13C. De plus, son conditionnement sous forme de poudre est idéal pour les expériences d'échange 1H/2H. Enfin il existe des versions biosimilaires de cette hormone, ce qui permet d'envisager une étude comparative avec le médicament originel ou biomédicament. 1935 REVENDICATIONS1. Méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la 15 seconde préparation protéique ; e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. 20 2. Méthode d'analyse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un spectre RMN réalisé durant l'étape b) à partir de l'une des préparations protéiques sélectionnées met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D. 3. Méthode d'analyse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un spectre 25 RMN réalisé durant l'étape c) à partir de l'une des préparations protéiques sélectionnées met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D. 4. Méthode d'analyse selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que la méthode de RMN 2D utilisée est sélectionnée parmi la méthode DOSY, les méthodes 30 NOESY, SOFAST, COSY, TOCSY, HSQC, HNCA, HNCO, HNCOCA, HCCH TOCSY HCCH COSY améliorées ou non par la variante TROSY, ainsi que toute séquence d'enregistrement RMN permettant d'établir des corrélations entre deux ou plusieurs noyaux de la protéine d'intérêt. 35 5. Méthode d'analyse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt ; b) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la première préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN ; c) établir la signature spectrale de la protéine d'intérêt dans la seconde préparation protéique à partir d'au moins deux spectres RMN, lesdits spectres étant réalisés selon les mêmes méthodes de RMN que durant l'étape b) ; d) comparer les signatures spectrales de la protéine d'intérêt dans la première et dans la seconde préparation protéique par superposition des spectres réalisés durant les étapes b) 10 etc); e) déterminer à partir des signatures spectrales obtenues durant les étapes b) et c) si la protéine d'intérêt est identique dans la première préparation protéique et dans la seconde préparation protéique. 15 6. Méthode d'analyse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins l'un des spectres RMN réalisés durant les étapes b) et c) à partir des préparations protéiques sélectionnées met en oeuvre une méthode de RMN bidimensionnelle dite RMN 2D.. 7. Méthode d'analyse comparative selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle 20 comprend les étapes suivantes : a) sélectionner au moins deux préparations protéiques différentes contenant une protéine d'intérêt; b) réaliser au moins deux spectres RMN 2D de la première préparation protéique ; c) réaliser au moins deux spectres RMN 2D de la seconde préparation protéique ; 25 d) comparer les signatures spectrales obtenues à partir de la première et de la seconde préparation protéique ; e) déterminer si la protéine est identique dans la première et dans la seconde préparation protéique. 30 8. Méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est un biomédicament. 9. Méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est un biosimilaire. 10. Méthode d'analyse comparative de conformations protéiques mettant en oeuvre la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est l'insuline.