Brevet FR2948769A1 — publié le 20110204

La présente invention concerne le domaine médical, notamment le diagnostic de la toxoplasmose, et en particulier de la toxoplasmose congénitale chez les nouveau-nés. Toxoplasma gondii, un parasite protozoaire intracellulaire ubiquiste, est une cause importante de morbidité et de mortalité chez les individus infectés de manière congénitale. L'infection maternelle peut avoir de sérieuses conséquences pour le foetus. Dans d'autres cas, les nouveau-nés infectés sont totalement asymptomatiques à la naissance mais risquent de développer des atteintes rétiniennes au cours de l'enfance ou de l'adolescence. Le � gold standard � qui est actuellement utilisé pour le diagnostic de la toxoplasmose congénitale repose sur la présence d'au moins un des caractères suivants : - diagnostic ante natal positif (amniocentèse et /ou échographie) - présence d'IgA et/ou d'IgM spécifiques à la naissance - présence d'IgG spécifiques à 1 an. En effet, le diagnostic de la maladie chez les nouveau-nés dont les mères ont présenté une séroconversion pendant la grossesse repose principalement sur la détection d'anticorps spécifiques. Les immunoglobulines (Ig) spécifiques M et/ou A, qui ne traversent pas le placenta, sont considérées comme étant de bons marqueurs d'infection congénitale. Cependant, le stade de la grossesse au moment de l'infection maternelle affecte les performances des tests sérologiques, et à la naissance ils ne peuvent pas détecter plus de 75 % des bébés infectés. La présence d'IgG spécifiques de la toxoplasmose dans le sang des nouveau-nés ne peut pas être considérée comme un marqueur d'infection congénitale puisque les IgG traversent le placenta. Les IgG transférées par la mère disparaissent habituellement dans un délai de 6 à 12 mois. Ainsi, la mise en place d'un traitement n'est pas engagée sur la seule base de la présence d'IgG toxoplasmiques chez le nouveau-né. La sérologie du nouveau-né est suivie à 1 mois puis tous les 3 mois jusqu'à l'âge d'un an. Seule la constatation d'une sérologie négative avant l'âge d'un an permet d'écarter une toxoplasmose congénitale. Si la sérologie de l'enfant est positive à 1 an, cela signe une toxoplasmose congénitale et l'enfant doit être traité. Par conséquent, même s'il s'avère par la suite qu'ils sont non infectés, tous les nourrissons nés de mères qui ont présentées une séroconversion au cours de leur grossesse doivent à l'heure actuelle subir un suivi d'un an de prélèvements sanguins réguliers pour effectuer des tests sérologiques avant que la présence d'une toxoplasmose congénitale ne puisse être confirmée ou infirmée et qu'un traitement adéquat puisse éventuellement lui être administré. L'infection T. gondii conduit à une immunité cellulaire de longue durée fortement dépendante de l'activité effectrice de l'IFN-y produit par les lymphocytes T. Bien que l'immunité cellulaire joue un rôle majeur dans la résistance à l'infection, l'étude de cette immunité n'est pas effectuée en routine pour le diagnostic de la toxoplasmose, car les données de la littérature sont contradictoires à ce sujet. En effet, l'absence de stimulation des lymphocytes par des antigènes T. gondii a été rapportée chez des enfants infectés de manière congénitale. Récemment, des auteurs ont décrit une incapacité liée à l'âge de la réponse T spécifique à l'antigène parasitaire dans des infections congénitales en utilisant des peptides synthétiques. Au contraire, de récentes publications mentionnent que l'évaluation de l'immunité cellules T est importante pour le diagnostic précoce et fiable de la toxoplasmose congénitale. Les inventeurs ont d'ailleurs précédemment décrit une immunité cellulaire détectable dans la plupart des patients infectés par la toxoplasmose, y compris des nouveau-nés, par détection de l'expression du CD25 en cytométrie de flux. Les cliniciens sont par conséquent à la recherche d'indicateurs valables de l'infection congénitale par la toxoplasmose afin de pouvoir poser une décision clinique fiable et éventuellement entreprendre les mesures thérapeutiques nécessaires. Les inventeurs se sont donc donnés pour but de trouver un procédé de diagnostic de la toxoplasmose congénitale, et notamment adapté aux contraintes liés à l'établissement de ce diagnostic chez les nouveau-nés dont les mères ont présenté une séroconversion au cours de leur grossesse. Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic in vitro de la toxoplasmose à partir d'un échantillon de sang total, comprenant les étapes consistant à a) séparer les cellules sanguines du plasma à partir de l'échantillon à tester pour le diagnostic de la toxoplasmose, de manière à récupérer le plasma d'une côté et les cellules sanguines de l'autre, b) reprendre les cellules sanguines dans du milieu de culture, 10 c) ajouter des antigènes toxoplasmiques pour stimuler la réponse cellulaire immune, d) détecter la présence ou mesurer la quantité d'au moins une molécule effectrice immune produite par les cellules sanguines après stimulation à l'aide des antigènes toxoplasmiques. 15 La présente invention trouve donc une application toute particulière dans le domaine du diagnostic précoce de la toxoplasmose chez les nouveau-nés puisque le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre avec de faibles quantités d'échantillon biologique. En particulier, le procédé permet de déterminer de manière fiable l'existence d'une infection toxoplasmique à 20 partir de seulement 1 ml de sang total par exemple. De plus, le procédé selon la présente invention permet, sur un même échantillon de sang total et malgré le faible volume d'échantillon à disposition dans le cas de nouveau-nés, d'obtenir à la fois la mesure de l'immunité humorale (tests sérologiques habituels) réalisée sur le plasma de l'échantillon 25 de sang total (surnageant) et la mesure de l'immunité cellulaire réalisée sur les cellules sanguines, qui sont les réponses immunitaires consécutives à l'infection par un toxoplasme (et ce en plus des contrôles négatif et positif nécessaires). De manière surprenante et non évidente, les inventeurs ont en effet 30 constaté que les cellules sanguines, bien que séparées dans le cadre de l'invention de leur environnement naturel biochimique (environnement plasmatique), restent capables de synthétiser des molécules effectrices immunes (telles que l'IFN-y) suite à une stimulation antigénique. Le taux de tests invalidés dans le cadre du procédé selon l'invention n'est que de 5 % environ, du fait d'une sécrétion spontanée d'IFN-y ou du manque de réponse positive à la PHA (contrôle positif) principalement observé chez les adultes. Le procédé selon l'invention est de préférence réalisé à partir d'un échantillon de sang total de nouveau-né pour diagnostiquer une toxoplasmose congénitale. Lors de la collecte ou rapidement suite à la collecte, l'échantillon de sang total est de manière classique mis en présence d'un agent anticoagulant, tel que l'héparine, et de préférence l'héparinate de lithium ou de sodium. Dans tous les cas, l'agent anti-coagulant utilisé devra en particulier être compatible avec le milieu utilisé pour la culture et la stimulation cellulaire ultérieure. Le procédé selon l'invention peut être mise en oeuvre à partir d'une quantité de sang total qui est habituellement collectée lors d'une prise de sang, à savoir de 2 à 5 ml. La présente invention trouvant une application toute particulière pour le diagnostic de la toxoplasmose chez le nouveau-né, le procédé peut également être réalisé avec un échantillon de sang total de faible volume, notamment inférieur à 2 ml. Ainsi, le procédé sera de préférence mis en oeuvre à l'aide d'un volume de sang total d'environ 1 ml, tout à fait adapté à la quantité de sang total disponible dans le domaine pédiatrique. Les cellules sanguines peuvent être séparées du plasma par toute technique de séparation ou de fractionnement bien connue dans le domaine et qui conduit à la séparation du plasma d'une part et des cellules sanguines d'autre part. Les conditions de séparation qui peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention doivent néanmoins permettre de récupérer des cellules sanguines qui restent capables de produire les molécules effectrices de l'immunité cellulaire suite à une stimulation antigénique, et notamment les molécules effectrices qui seront dosées lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. De préférence, les cellules sanguines peuvent être séparées du plasma par centrifugation. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le plasma de l'échantillon de sang total à tester qui est séparé des cellules sanguines est récupéré pour effectuer en parallèle les tests sérologiques de la toxoplasmose, consistant notamment en la mise en évidence d'anticorps spécifiques de la toxoplasmose. Les tests sérologiques de la toxoplasmose consistent par exemple en la mise en évidence et/ou la mesure de la quantité d'IgG et/ou d'IgM et/ou digA spécifiques par des techniques classiques telles que la méthode ELISA, Western Blot comparatifs mère/enfant, etc, ou toute technique conduisant à l'obtention du bilan sérologique immun à partir du plasma de l'échantillon à tester. Les cellules sanguines sont resuspendues dans du milieu de culture approprié pour ce type de cellules, c'est-à-dire un milieu généralement liquide qui contient les composants indispensables pour maintenir en culture les cellules humaines, et en particulier les cellules sanguines, dans un état biologique aussi proche possible des conditions in vivo. A titre d'exemple, le milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) est particulièrement préféré pour cette étape. La présence de sérum dans le milieu de culture utilisé n'est pas nécessaire, même si la présence de sérum (par exemple à hauteur de 10 °fo comme habituellement utilisé) n'est pas exclue. Selon un mode de réalisation préféré, les cellules sanguines sont reprises dans un volume de milieu égal à celui du plasma prélevé. Dans le cadre de la présente invention, on entend par antigène toute fraction, soluble ou fragmentaire, molécule ou agent parasitaire qui stimule une réponse immunitaire, et en particulier une réponse d'immunité cellulaire. Ainsi des antigènes toxoplasmiques sont des molécules qui stimulent la réponse immune spécifique de la toxoplasmose. La stimulation des cellules sanguines à l'aide des antigènes toxoplasmiques est réalisée à l'aide d'antigènes solubles ou particulaires. De manière particulièrement avantageuse, on utilisera des antigènes solubles, par exemple obtenus par fractionnement des parasites, par sonication ou des cycles de congélation/décongélation. Les antigènes utilisés peuvent être � bruts �, c'est-à-dire obtenu et utilisés directement après simple disruption/fractionnement de toxoplasmes, ou bien être purifiés, par exemple par colonne d'affinité, colonne de filtration en fonction du poids moléculaire. Des antigènes de synthèse, notamment recombinants, peuvent également être utilisés comme par exemple ceux disponibles dans le commerce tels que les antigènes P30, P35 et les protéines de granules denses (Gra) par exemple. La présence et la quantité de la ou des molécules effectrices immunes produites après stimulation antigénique peuvent être de différents types, à savoir toute molécule produite en réponse à une activation ou une stimulation cellulaire par un antigène. Ainsi, parmi les molécules effectrices immunes d'intérêt dans le cadre du procédé selon l'invention, on peut notamment citer, les cytokines comme les interleukines et en particulier l'IL-2, l'IL-12, le TNF (TNF-a, TNF-p), les interférons et en particulier l'IFN-y. La détection ou le dosage d'IFN-y est particulièrement préféré dans le cadre du procédé selon l'invention. La mesure de la ou des molécules effectrices immunes produite(s) par les cellules sanguines est réalisée après stimulation des cellules à l'aide des antigènes toxoplasmiques pendant un temps nécessaire pour obtenir une réponse des cellules effectrices. Le temps nécessaire de stimulation est généralement compris entre 16 et 24 heures de culture. La mesure est ensuite réalisée sur le surnageant obtenu après séparation du milieu de culture dans lequel les cellules sanguines ont été resuspendues. Cette séparation peut être réalisée à l'aide de n'importe quelle technique de séparation comme par exemple par centrifugation. Parmi les techniques qui peuvent être utilisées pour la détection ou la mesure de cette(ces) molécule(s), on peut notamment citer la technique ELISA sandwich classique, ou toute technique similaire bien connue par l'homme du métier qui permette de détecter la présence et/ou de quantifier le taux de production de ces molécules. La détection d'une quantité significative de molécule(s) effectrice(s) immune(s), c'est-à-dire la présence à des taux significatifs (par rapport au contrôle négatif) est en faveur d'une toxoplasmose congénitale. De plus, même si cela n'est pas exclu, la mise en oeuvre du procédé selon l'invention ne nécessite aucune mise au point particulière concernant par exemple le récipient collecteur de l'échantillon biologique (forme, volume, largeur, hauteur, diamètre etc). Le procédé selon l'invention permet de poser un diagnostic précoce et fiable de la toxoplasmose, mais il peut également être utilisé pour obtenir le panel immunitaire lié à la toxoplasmose, et en particulier chez les nouveau-nés, car il permet de pratiquer à partir du même échantillon biologique de faible volume (seulement 1 ml sang total par exemple), à la fois les tests sérologiques et la mesure de la réponse cellulaire immune. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un kit de diagnostic de la toxoplasmose comprenant : - des antigènes toxoplasmiques pour la stimulation des cellules 20 sanguines obtenues après séparation du plasma à partir d'un échantillon de sang total à tester, - des instructions pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, - éventuellement un milieu de culture pour resuspendre les cellules sanguines, 25 - et éventuellement les outils de mesure de la production d'au moins une molécule effectrice immune, et de préférence de l'IFN-y. Les outils de mesure utilisés peuvent être de différents types et l'homme du métier saura les choisir notamment en fonction de la molécule effectrice immune choisie. Par exemple des outils de mesure utilisables sont 30 des composés qui permettent de détecter et/ou de quantifier spécifiquement la molécule effectrice choisie, tels que des anticorps par exemple, qui peuvent éventuellement être directement marqués à l'aide d'un marqueur détectable (enzymatique notamment) ou bien, lorsqu'ils sont non marqués, nécessiter l'utilisation d'un ou plusieurs composés secondaires (spécifique du premier composé utilisé) qui seront marqués et détectables. De préférence, le kit selon l'invention contiendra des antigènes toxoplasmiques solubles pour la stimulation des cellules sanguines. La présente invention sera décrite plus en détails dans les exemples qui suivent et qui se réfèrent aux figures annexées dans lesquelles : La Figure 1 représente la production d'IFN-y exprimée en pg/ml mesurée après stimulation par des antigènes bruts T. gondii (3 �g/ml) des cellules sanguines obtenu à partir des échantillons de sang total d'adultes � non infectés� et � infectés �. La différence entre les deux groupes est significative (p Tests sérologiques La détection des anticorps IgG et IgM spécifiques de T. gondii a été réalisée par dosage ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Enzygnost toxoplasmosis, Siemens Healthcare Diagnostics Marburg, Allemagne). Un � dye test � (test de lyse, test de Sabin et Feldman) a été réalisé (Institut de Puériculture et Périnatalogie de Paris, France ù Dr Thulliez) sur les échantillons pour lesquels les résultats obtenus entre le dosage de l'IFN-'y selon l'invention et les tests sérologiques effectués étaient discordants, d'après la technique de référence décrite par Sabin et al., 1948, Science, 108: 660-663. Préparation d'antigènes solubles Toxoplasma gondii Des parasites T. gondii de souche RH ont été récupérés de la cavité péritonéale de souris OF1 (Charles River, L'Arbresle, France). Les ascites ont été collectées par ponction péritonéale 2 jours après infection selon un protocole classique (tachyzees de souche RH injectés en intrapéritonéal). Les parasites ont été lavées dans du PBS et dissociés par quatre cycles de congélation-décongélation et 3 sonications pendant 20 secondes chacune. La suspension a été filtrée à travers une membrane pore 0,2�m puis stockée à - 20°C jusqu'à utilisation. Culture des cellules sanguines et stimulation Les échantillons de sang ont été traités dans les 24h suivant leur collecte. 1 ml de sang périphérique de chacun des 172 adultes a été récupéré dans des tubes vacutainers (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA) contenant un anticoagulant lithium héparine. Les tubes ont été centrifugés à 1600 g pendant 15 minutes à 'température ambiante. Le plasma a été collecté pour les tests sérologiques et remplacé par un volume égal de milieu RPMI (Sigma Aldrich, St Louis, MO) pour resuspendre les cellules sanguines. 300 �l de cellules sanguines diluées dans du milieu a été cultivé dans des tubes stériles en propylène (Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne) en présence de différentes concentrations d'antigènes T. gondii préparés comme indiqué ci-dessus. Les antigènes T. gondii ont été testés à des concentrations finales de 1,5 �g/ml, 3 �g/ml, et 6 �g/ml. Parmi ces concentrations, 3 �g/ml est la condition qui donne les meilleurs résultats par rapport à la sensibilité et la spécificité (données non présentées). Ainsi, c'est cette dilution qui a été utilisée. Des contrôles positifs et négatifs consistant respectivement en du PHA (phytohémagglutinine) à une concentration finale de 20 �g/ml et du PBS ont également été réalisés en parallèle. Toutes les cultures ont été incubées pendant 24 heures à 37°C à 5 % de CO2 en atmosphère humide. Le surnageant de culture a été collecté pour chaque tube, après centrifugation à 1600 g pendant 15 minutes à température ambiante, puis a été stocké à - 40°C jusqu'au dosage IFN-y. Dosage IFN- y L'IFN- y est dosé en duplicate à l'aide du kit commercial ELISA (AbCys, Paris, France). La densité optique moyenne (DO) des contrôles négatifs (PBS) a été soustraite de la DO moyenne des échantillons stimulés par l'antigène. La production d'IFN- y exprimée en pg/ml a été obtenue par conversion de la DO à l'aide d'une courbe standard du kit (élaborée à l'aide d'échantillons dont la quantité d'IFN-y est connue). Les résultats ont été validés lorsque les puits stimulés par la PHA ont atteint une valeur positive (confirmation de la présence de lymphocytes � viables �) et lorsque la DO dans les puits PBS était inférieure à 0,75 (moyennes des DO obtenues sur l'ensemble des puits PBS + 2 déviations standard après transformation de Cox box pour normaliser la distribution des variables. Les inventeurs ont également pu démontrer que la production d'IFN-y est équivalente sur 300 pl de sang total ou sur 300 �l de cellules sanguines reprises dans du milieu de culture RPMI et stimulées à l'aide de 3 tg/ml d'antigènes toxoplasmiques solubles bruts pendant 24h (données non présentées). Analyse statistique Les différences de réponse IFN- y entre les différents groupes de patients ont été analysées par un test Mann Whitney à l'aide du logiciel SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). p Dans ces conditions, 16 des 17 cas � infectés� ont été détectés par le test de l'invention, c'est-à-dire ont présenté un test positif de production d'IFN- y. Parmi ces 16 cas � infectés� positifs pour la réponse IFN-y, 5 présentaient une infection congénitale infra-clinique (sans manifestation clinique) qui avait été diagnostiquée entre 3 semaines et 3 mois de vie. De plus, parmi ces 5 cas, la sécrétion d'IFN- y était le seul signe d'infection dans 2 cas testés positifs âgés de moins de 3 mois et aurait conduit à une décision de traitement plus précoce en utilisant le procédé selon l'invention. Le seul test faux-négatif correspondait à un bébé de 8 mois qui était sous traitement lorsqu'il a été inclus dans cette étude et qui a affiché par la suite des tests sérologiques et de dosage d'IFN-y positifs après l'arrêt du traitement. De plus, le test a exclu la maladie dans 44 cas sur 45 � non infectés �, ce qui aurait permis d'éviter le suivi clinique et sérologique tout au long de la première année de vie s'il avait pu être pratiqué juste après la naissance. Le seul faux positif a été observé avec l'échantillon d'un bébé âgé de 6 mois qui a présenté un test positif pour le dosage de l'IFN-y de manière transitoire, sans syndrome inflammatoire clinique, et qui a par la suite lors du suivi conduit à un test IFN-y négatif. Au total lors de l'inclusion, la sensibilité du test était de 94 % (16/17) et la spécificité de 98 % (44/45). Pendant la première année de leur vie, ces patients ont été suivis selon un protocole de surveillance classique de la toxoplasmose congénitale (présence d'IgG, d'éventuelles manifestations cliniques notamment ophtalmiques, suivi hématologique pour les patients sous traitement (numération/formule) tous les trois mois pendant un an). Durant le suivi de ces patients, 96 (autres) tests IFN-y ont été réalisés (résultats non présentés) afin de confirmer l'efficacité des résultats obtenus selon l'invention. Dans ce cas, et contrairement à la situation décrite ci-dessus des tests réalisés lors de l'inclusion dans l'étude, les valeurs analysées ici ne sont pas indépendantes car chaque malade est testé plusieurs fois dans le cadre du suivi. Les résultats obtenus lors du suivi montrent que les 96 tests IFN- y pratiqués selon l'invention sauf 2 correspondent au statut clinique des nourrissons. Ces 2 faux négatifs ont été observés pour des patients traités qui ont présenté un pic du titre d'IFN- y après arrêt du traitement. De manière intéressante, ces 2 patients ont ensuite affiché des sérologies négatives de façon simultanée pendant le suivi et après l'arrêt du traitement (FANSIDAR), ils ont présenté une augmentation dramatique du titre d'IFN- y et du titre d'IgG (Fig. 4). Les résultats de la Fig. 4 montrent que le titre d'IgG est parallèle à celui de l'IFN- y chez l'un de ces 2 patients. Ce profil anticorps passant d'une négativation transitoire suivi d'une augmentation du titre d'anticorps (rebond par passage de 0 à 1300 unités environ) est couramment observé chez les patients traités. L'impact du traitement dans la réduction de la réponse spécifique IFN- y a également été décrit pour la tuberculose. Ceci suggère que ces tests (suivi IgG + IFN- y) peuvent être utilisés pour suivre la réponse d'un patient au traitement dans le cadre de la toxoplasmose. L'ensemble de ces résultats démontrent que chez les nourrissons, le test de mesure de la production d'IFN- y selon le procédé de l'invention est un bon marqueur de la toxoplasmose congénitale. Ni l'âge de la grossesse au moment de la contamination, ni le traitement anténatal (lors de la grossesse) ne semblent gêner le test. EXEMPLE 3 ù Etude de la production d'IFN- y chez des patients infectés de manière congénitale, âgés d'un an ou plus, et qui subissent un suivi annuel régulier de vérification clinique et ophtalmologique 124 patients infectés par la toxoplasmose de manière congénitale ayant des âges allant de 1 à 30 ans, et qui ont été soumis à la prise d'un traitement pendant leur première année de vie, ont été recensés. Parmi eux, 39 sont des cas d'infection patente avec des manifestations cliniques (présence de calcifications cérébrales et/ou des lésions oculaires), et 85 sont des cas d'infection infraclinique (sans signes cliniques ou lésions). L'ensemble des 124 échantillons issus de ces patients ont été traités à l'aide du procédé selon l'invention comme indiqué à l'exemple 1. Tous présentent une réponse positive au test d'IFN- y allant de 9 pg/ml à 2285 pg/ml (moyenne de 168,5 pg/ml). Dans ces conditions, la sensibilité du test est donc de 100 %. Ces résultats montrent qu'il existe une réponse IFN-y soutenue 30 ans après l'infection que chez des patients infracliniques, et qu'elle représente un marqueur de la production continue d'antigènes parasitaires par les kystes avec maintient des cellules T effectrices spécifiques dans la circulation sanguine. Aucune corrélation significative n'a été mise en évidence entre le niveau d'IFN- y et le nombre de lymphocytes (r=0,06 ; p=0,5) ou le titre IgG (r=0,08 ; p=0,6). Par conséquent, ces résultats démontrent qu'aucune différence n'a été observée dans le dosage IFN-y de l'invention entre une infection infraclinique et une infection patente. Ils permettent ainsi de conclure que les cellules T chez les patients porteurs de kystes peuvent répondre aux extraits bruts de tackyzoites de la souche RH non-kystogène et suggèrent une présence sur le long terme d'antigènes circulants communs aux deux stades de l'infection parasitaire chez les personnes infectées. En conclusion, il ressort de ce qui précède que la mise en oeuvre du procédé selon l'invention permet d'avoir un test diagnostic de la toxoplasmose qui repose sur une méthode simple, facile à réaliser. Seul 5 0/0 de l'ensemble des tests réalisées (25/479) sur les différents groupes de patients exposés ci-dessus à l'aide du procédé selon l'invention ont été invalidés du fait du manque de réponse positive à la stimulation par la PHA ou de la sécrétion spontanée d'IFN- y (production d'IFN- y dans le tube PBS). Ce test est particulièrement adapté au diagnostic de la toxoplasmose congénitale chez le nouveau-né puisqu'il utilise des quantités d'échantillon biologique de l'ordre de 1 ml compatibles avec les contraintes du domaine pédiatrique. De plus, ce procédé permet l'établissement d'un diagnostic précoce qui dans l'affirmative permet d'entreprendre au plus tôt les traitements nécessaires afin de réduire les séquelles dus à l'infection, et dans la négative permet d'écarter de manière fiable une infection congénitale dès la naissance et ainsi d'éviter le suivi sérologique et l'anxiété qui s'en suivent ainsi que la mise en place d'un traitement inutilement. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car 25 diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS1 - Procédé de diagnostic in vitro de la toxoplasmose, comprenant les étapes consistant à : a) séparer les cellules sanguines du plasma à partir d'un échantillon 5 de sang total à tester pour le diagnostic de la toxoplasmose b) reprendre les cellules sanguines dans du milieu de culture c) ajouter des antigènes toxoplasmiques pour stimuler la réponse cellulaire d) détecter la présence ou mesurer la quantité d'au moins une 10 molécule effectrice immune produite par les cellules sanguines après stimulation à l'aide des antigènes toxoplasmiques. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit procédé est un procédé de diagnostic de la toxoplasmose congénitale chez les nouveau-nés effectué à partir d'un échantillon de sang total du nouveau-né à 15 tester. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les antigènes toxoplasmiques utilisés pour stimuler la réponse cellulaire à l'étape c) sont des antigènes solubles. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 20 caractérisé en ce que le volume d'échantillon de sang total utilisé est inférieur à 2 ml. - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules sanguines sont séparées du plasma par centrifugation. 25 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le plasma qui est séparé des cellules sanguines dans l'échantillon de sang total à tester à l'étape a) dudit procédé est récupéré pour effectuer en parallèle des tests sérologiques de mise en évidence d'anticorps spécifiques de la toxoplasmose. 30 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les antigènes toxoplasmiques utilisés pour lastimulation des cellules sanguines à l'étape c) dudit procédé sont des antigènes bruts, purifiés ou de synthèse. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ou les molécules effectrices immunes produites après stimulation antigénique dont la présence ou la quantité sont mesurées à l'étape d) dudit procédé est l'IFN-y. 9 - Kit de diagnostic de la toxoplasmose comprenant : - des instructions pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, - des antigènes toxoplasmiques pour la stimulation des cellules sanguines obtenues après séparation du plasma à partir d'un échantillon de sang total, - éventuellement du milieu de culture pour resuspendre les cellules sanguines, - et éventuellement les outils de mesure de la production d'au moins une molécule effectrice immune. 10 - Kit de diagnostic selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il contient des antigènes toxoplasmiques solubles. 11 - Kit de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, 20 caractérisé en ce qu'il contient les outils de mesure de la production d'IFN-y.