Brevet FR2955663A1 — publié le 20110729

658/003FR1 ETAT DE L'ART Domaine technique de l'invention La présente invention concerne une méthode pour la détection d'un signal optique non linéaire résonant et un dispositif pour la mise en oeuvre de ladite méthode. Elle s'applique notamment à la détection de la diffusion CARS. Etat de l'art Toutes les liaisons chimiques possèdent des fréquences de vibration qui leur sont propres. On appelle techniques optiques vibrationnelles des méthodes qui visent à utiliser l'interaction lumière/matière pour obtenir des informations sur ces vibrations moléculaires. La plus connue de ces techniques est la spectroscopie infrarouge (IR) qui observe les raies d'absorption spécifiques des liaisons chimiques présentes dans un échantillon. Découverte en 1928, la diffusion Raman (du nom du physicien Chandrasekhara Venkata Raman qui découvrit l'effet) permet d'utiliser la lumière visible pour accéder au spectre vibrationnel des molécules qui interagissent avec un faisceau lumineux. Dans un processus de diffusion Raman, une onde pompe de pulsation coP incidente sur une molécule est diffusée inélastiquement en une onde dite Stokes de pulsation cos (Figure 1A) et une onde dite anti-Stokes de pulsation wAS (Figure 1B). L'écart en fréquence entre les ondes générées et l'onde pompe dépend de la transition Raman moléculaire (de pulsation SZR) de telle sorte que coPcos coAs-WP. R. Dans une vision photonique du processus, les ondes Stokes et anti-Stokes correspondent à une absorption à partir respectivement du niveau vibrationnel fondamental ou excité. Le processus générant l'onde anti-Stokes, partant du niveau vibrationnel excité, est beaucoup moins probable que le processus créant l'onde Stokes, qui est la seule observée dans la pratique en spectroscopie Raman spontanée. Une étude fine de la répartition spectrale des ondes Stokes renseigne sur les densités de liaisons chimiques présentes dans l'échantillon. Ce processus spontané de diffusion inélastique est très peu efficace comparé à la fluorescence (les sections efficaces Raman sont de -30 2 l'ordre de 10 cm /molécule, à comparer avec la section efficace d'absorption à 1 photon d'un -16 2 fluorophore qui atteint 10 cm /molécule). 1 658/003FR1 La spectroscopie Raman stimulée CARS (pour Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) est un processus de mélange à quatre ondes qui permet d'adresser les liaisons vibrationnelles présentes dans un échantillon. Ce processus est par exemple décrit dans R.W. Boyd, Nonlinear Optics (Academic Press, Boston, 1992). Il s'agit d'envoyer deux impulsions laser de pulsations co et w (ou de fréquences v et v) dont la différence de pulsations est rendue égale à la pulsation p s p s SZ du niveau vibrationnel que l'on veut adresser. Dans cette configuration de résonance wp-ws n, le niveau vibrationnel de pulsation n est peuplé de manière stimulée et va pouvoir diffuser inélastiquement le faisceau de pulsation co dans un faisceau de pulsation w = 2 w -co (Figure p as p s 2A). La présence de cette nouvelle radiation co. (appelée dans la suite de la description « signal diffusé CARS ») est la signature de la présence de la liaison vibrant à la pulsation SZ dans l'échantillon. Une première mise en oeuvre de CARS consiste à envoyer sur l'échantillon deux impulsions picoseconde fines spectralement dont la différence de pulsations n'adressera qu'une liaison vibrationnelle spécifique. Pour une identification optimale, on recherche l'ensemble des liaisons vibrationnelles présentes dans l'échantillon. Pour cela, on opère en mode dit « Multiplex CARS » (voir par exemple M. Muller et J. Schins, « Imaging the thermodynamic state of lipidic membranes with multiplex CARS spectroscopy », Physical Chimistry B 106, 3715-3723 (2002) ) où l'on envoie sur l'échantillon une impulsion wp fine spectralement et une impulsion ws large spectralement (Figure 2B). On peut ainsi adresser l'ensemble des niveaux vibrationnels ni présents dans l'échantillon et obtenir un spectre du signal was généré. Du point de vue technique, le spectre étroit est par exemple issu d'un laser picoseconde et le spectre large, par exemple d'un laser femtoseconde, ou d'une fibre à cristal photonique générant un supercontinuum (SC). Sur la figure 3A, nous décrivons le processus de diffusion CARS résonant, exploité pour avoir accès à la signature des espèces moléculaires que l'on cherche à identifier. Il existe cependant une contribution CARS non résonante, représentée sur la figure 3B, qui provient d'une contribution électronique de l'échantillon. Cette contribution non résonante peut être importante lorsqu'on fait de la spectroscopie CARS sur un échantillon comportant une grande diversité de liaisons chimiques. La demande de brevet US 6,809,814 au nom de Xie et al. décrit la détection d'un signal CARS dans un échantillon microscopique, basée sur une détection arrière (epi) du signal CARS, permettant de s'affranchir du bruit non résonant des objets de taille comparable aux longueurs 2 658/003FR1 d'onde des sources d'excitation. En particulier, ce mode de détection permet de visualiser des objets de taille sub-longueur d'onde (organelles par exemple) et de supprimer le bruit de fond non résonant du solvant qui entoure généralement les échantillons biologiques. Cette détection présente cependant l'inconvénient de ne pas supprimer le bruit de fond non résonant intrinsèque de ces objets sub-longueur d'onde. Une autre technique de détection du signal CARS permettant de s'affranchir de la contribution non résonante est décrite dans la demande de brevet WO 2005/124322 au nom de Potma et al. Le bruit de fond non résonant CARS est supprimé en utilisant un oscillateur local et en réalisant une détection hétérodyne. Pratiquement il s'agit de générer le signal CARS dans un échantillon annexe (dans un solvant ou une fibre optique par exemple) et de le recombiner au signal CARS généré par l'échantillon d'intérêt dans le microscope tout en contrôlant sa phase. Ce contrôle de la phase demande un montage interférométrique difficile à stabiliser. Dans la pratique, cette méthode en est restée au stade de la démonstration de Laboratoire. Dans la demande de brevet WO2008135257 au nom de Rimke et al., le schéma de détection hétérodyne reporté dans la demande WO 2005/124322 cité ci-dessus est appliqué et la source laser utilisée est composé d'un laser picoseconde émettant à 1064 nm et doublé à 532 nm. Le faisceau à 532 nm vient par la suite pomper un oscillateur paramétrique optique (OPO). L'OPO génère deux longueurs d'onde « signal » 2signal et « idler » Xidier accordables selon 1/ Xsignal(nm)+ Xidler(nm)=1/532(nm). Les faisceaux à 1064 nm et idler jouent alors respectivement les rôles de faisceaux pompe et Stokes. Le faisceau signal est lui à la même longueur d'onde que le faisceau anti-Stokes généré dans l'échantillon. Il est recombiné avec le faisceau anti-Stokes et le signal résultant de cette interférence est détecté selon le procédé d'interférométrie hétérodyne décrit dans la demande WO 2005/124322. Cette technique très efficace nécessite l'utilisation d'un OPO pouvant générer les deux longueurs d'onde signal et idler. Une autre technique de détection du signal CARS permettant de s'affranchir de la contribution non résonante est décrite dans la demande de brevet US 7,352,458 au nom de Xie et al. Le bruit de fond non résonant CARS est supprimé en modulant rapidement (à la fréquence v) la longueur d'onde anti-Stokes d'observation. En pratique, l'un des deux faisceaux (pompe ou Stokes) est délivré par une source laser délivrant deux longueurs d'onde et l'autre faisceau est généré par une source laser à une seule longueur d'onde. La modulation rapide entre les deux 3 658/003FR1 longueurs d'onde délivrées par la première source permet de moduler à la même fréquence l'excitation résonante et non-résonante du signal CARS. Le bruit non-résonant du signal CARS est alors supprimé en démodulant le signal CARS à la fréquence v. En pratique, cette méthode nécessite une source émettant deux longueurs d'onde et un bon contraste entre les signaux résonant et non-résonants entre lesquels la modulation opère. Une autre technique de détection du signal CARS permettant de s'affranchir de la contribution non résonante est décrite dans la demande de brevet US 6,789,507 au nom de Xie et Cheng. Elle joue sur les propriétés de polarisation différentes des signaux résonant et non-résonant. Il est connu en spectroscopie Raman spontanée qu'une résonance vibrationnelle dépolarise le faisceau d'excitation. En pratique, le faisceau diffusé est dépolarisé par rapport au faisceau d'excitation. Cet effet de dépolarisation est quantifié par un « coefficient de dépolarisation » propre à chaque résonance vibrationnelle. Appliqué à la diffusion CARS, l'effet est utilisé comme suit: un angle est introduit entre les polarisations linéaires des faisceaux d'excitation pompe et Stokes. Les signaux CARS résonant et non-résonant sont alors générés selon des polarisations différentes. Un polariseur est alors introduit après l'échantillon pour éteindre le signal non-résonant et laisser passer la fraction de signal résonant non éteinte. Cette méthode est simple à mettre en oeuvre mais diminue de manière drastique le niveau de signal résonant détecté. Cette réduction est d'autant plus forte que le « coefficient de dépolarisation » de la résonance Raman sondée est proche de 1/3. La présente invention propose une méthode originale de détection d'un signal optique non linéaire résonant, simple à mettre en oeuvre, compatible avec une imagerie rapide, et permettant notamment de s'affranchir du bruit CARS non résonant dans des applications d'imagerie microscopique ou de spectroscopie. Cette méthode est basée sur l'analyse de la direction de diffusion du signal CARS à l'interface axiale d'un milieu résonant et non résonant, et plus précisément sur l'analyse de la déviation angulaire du signal. RESUME DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif pour détecter un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon, l'échantillon comprenant un milieu résonant et un milieu non résonant formant une interface, le dispositif comprenant : une source d'émission 4 658/003FR1 d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation wp donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant ladite interface entre le milieu résonant et non résonant, et des moyens d'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, permettant d'obtenir à une interface axiale des milieux résonant et non résonant un signal caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une variante, la source d'émission permet l'émission d'un faisceau pompe de pulsation wp et d'un faisceau Stokes de pulsation cos, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et Stokes est un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation was = 2wp - cos et le signal résultant de l'analyse de la direction d'émission du signal diffusé CARS, un signal caractéristique d'une émission Raman du milieu résonant. Selon une variante, les moyens d'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprennent un module de détection optique dudit signal optique non linéaire dans au moins deux directions symétriques (k, k') par rapport à l'axe optique, et une unité de traitement des signaux ainsi détectés permettant d'obtenir la différence desdits signaux, le signal de différence résultant étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une autre variante, les moyens d'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprennent un module de détection optique dudit signal optique non linéaire comprenant un masque en rotation autour de l'axe optique à une fréquence (v) donnée, le masque occultant partiellement ledit signal, et un détecteur du signal optique ainsi modulé, et une unité de traitement du signal détecté modulé résultant permettant d'obtenir l'amplitude de la composante fréquentielle du signal à ladite fréquence de rotation du masque, l'amplitude étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une variante, le dispositif comprend en outre un dispositif de balayage angulaire du ou des faisceaux d'excitation, permettant au ou à les faisceaux d'excitation d'intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. Selon une variante, la source d'émission émet au moins un faisceau d'excitation à longueur 30 d'onde variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques 5 658/003FR1 du milieu résonant. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une méthode pour détecter un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon, l'échantillon comprenant un milieu résonant et un milieu non résonant formant une interface, la méthode comprenant : l'émission d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation wp donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant ladite interface entre le milieu résonant et non résonant, et l'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, permettant d'obtenir à une interface axiale des milieux résonant et non résonant un signal caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une variante, la méthode comprend l'émission d'un faisceau pompe de pulsation wp et d'un faisceau Stokes de pulsation ws, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et Stokes étant un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation was = 2wp - cos et le signal résultant de l'analyse de la direction d'émission du signal diffusé CARS, un signal caractéristique d'une émission Raman du milieu résonant. Selon une variante, l'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprend la détection dudit signal optique non linéaire dans au moins deux directions symétriques par rapport à l'axe optique, et le calcul de la différence des signaux détectés, le signal de différence résultant étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une autre variante, l'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprend la détection d'un signal optique modulé résultant de l'occultation partielle dudit signal optique non. linéaire au moyen d'un masque (130) en rotation autour de l'axe optique à une fréquence (v) donnée et la détermination de l'amplitude de la composante fréquentielle du signal détecté modulé à ladite fréquence de rotation du masque, l'amplitude étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. Selon une variante, le ou les faisceaux d'excitation subissent un balayage angulaire pour intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non 6 658/003FR1 résonant. Selon une variante, l'un au moins des faisceaux d'excitation présente une longueur d'onde d'émission variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description, illustrée par les figures suivantes : Figures lA et 1B (déjà décrites), principe de l'émission Stokes et anti-Stokes dans un 10 processus de diffusion Raman; Figure 2A et 2B (déjà décrites), principe de la diffusion CARS dans deux modes différents ; Figures 3A et 3B (déjà décrites), illustrations des processus CARS résonant et non résonant ; 15 Figure 4, schéma des conditions géométriques pour la mise en oeuvre de la diffusion CARS à l'interface de milieux résonant et non résonant ; Figures 5A à 5E, illustration de la déviation du signal diffusé CARS en fonction de la position relative du lieu de focalisation des faisceaux d'excitation avec l'interface entre des milieux résonant et non résonant ; 20 Figure 6, schéma illustrant le montage expérimental des fentes d'Young ; Figure 7, courbe obtenue par simulation numérique, illustrant la déviation du signal diffusé CARS en fonction du paramètre. t=(wp-ws-S-2R)/F (décalage normalisé à la résonance Raman); Figures 8A et 8B, courbes obtenues par simulation numérique, montrant les intensités 25 lumineuses calculées respectivement dans l'espace des (kx>0) et (kx 0) dans l'espace des vecteurs d'onde k . Sur la vignette 3 (figure 5C), le volume CARS est centré dans l'objet CARS, le signal CARS est alors intense et est dirigé dans la direction normale (parallèle à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes). On retrouve ensuite une situation similaire sur 9 658/003FR1 les vignettes suivantes (vignette 4, figure 5D et vignette 1, figure 5E); il est cependant important de noter que sur la vignette 4, a est négatif et correspond à une déviation dans une direction définie par (k. 0) et (kX I(x) = E1 2 +1E212 + 21E111E21 cos( D + ço) Il en résulte que la différence d'intensité DI(x) = I(x) ù I(-x) obtenue par la différence 25 d'intensités mesurée en deux points M(x) et M'(-x) symétriques par rapport à l'axe de symétrie des fentes s'écrit : Al(x) = 4E1 11E2 sin D 1 sn(rp) 10 658/003FR1 La déposante a démontré que par analogie, on pouvait dériver de la théorie des fentes d'Young une expression de la différence AI(k) des intensités IFW'(k) et IFwd( k') mesurée selon deux directions k et k ' symétriques par rapport à l'axe d'incidence des faisceaux pompe et Stokes (figure 4) : AI(k)= IFWd (k')- IFWd (k) oc 4 x(3) xz3~ sin(ç) Ici, le déphasage cp a pour origine la signature d'une vibration moléculaire du milieu résonant. Il résulte de cette expression que la différence AI( k) est proportionnelle à la partie imaginaire de la susceptibilité non linéaire d'ordre 3 du milieu résonant, c'est-à-dire du spectre Raman pur du milieu 1. La figure 7 présente les résultats d'un calcul numérique rigoureux prenant en compte la nature vectorielle des faisceaux pompe et Stokes focalisés sur une interface axiale entre un milieu 1 résonant et un milieu 2 non résonant (figure 4). L'analyse consiste à étudier dans l'espace des vecteurs d'onde k le décalage angulaire du signal diffusé CARS émis en fonction du paramètre de décalage normalisé à la résonance Raman, =(wp-ws-S2RHors résonance (t=-10), le faisceau est centré tandis qu'à la résonance (Ç=0), il apparaît clairement un décalage. Sur la figure 8A sont représentés les spectres CARS intégrés sur les demi-espaces (k.>0) et (k 0) et (kX 0) (problème a, Figure 9A) et dans l'espace (kx 0) (problème a, Figure 9B) et dans l'espace (ky Le système laser 101 comprend par exemple, dans une application dite deux couleurs, deux sources laser 108 fines spectralement, accordables, par exemple de type Titane û Saphir, émettant entre 690 et 1000 nm, pompés par un laser de pompe 109, type Nd :YVO4 émettant à 532 nm. Les lasers accordables émettent par exemple des impulsions picoseconde (ps), typiquement de l'ordre de 3 ps, pour former les faisceaux d'excitation pompe de pulsation c op (de longueur d'onde typique 730 nm) et Stokes de pulsation cas. Un sélecteur d'impulsion 110 (ou « pulse picker ») peut être utilisé pour réduire la cadence des lasers d'excitation pompe et sonde sans réduire la puissance crête des impulsions. L'utilisation d'un faisceau Stokes ou d'un faisceau pompe accordable permet notamment de balayer le spectre d'émission anti-Stokes pour des applications en spectroscopie visant à déterminer le spectre Raman du milieu résonant. D'autres sources laser accordables peuvent être utilisées, par exemple de type oscillateur paramétrique optique (OPO), amplificateur paramétrique optique (OPA), oscillateurs picoseconde de type Nd :verre, lasers fibrés dopés Ytterbium ou Erbium, etc. Les sources peuvent également être des sources lasers nanoseconde (ns) ou femtoseconde (fs), en fonction de la largeur spectrale des raies Raman que l'on veut observer. Cependant, les impulsions nanosecondes, si elles sont très bonnes d'un point de vue spectral, ont une puissance crête moins élevée que les impulsions ps et une fréquence de répétition plus basse. Par ailleurs, les effets thermiques associés aux impulsions ns sont plus à même d'endommager les échantillons biologiques. Les impulsions femtoseconde brutes sont généralement trop larges spectralement. En phase condensée (solide ou liquide), les largeurs de raie sont autour de 10-20 cm 1, ce qui correspond à l'emploi d'impulsions picosecondes. Dans l'exemple de la figure 10, les moyens 104 comprennent par exemple un objectif de focalisation 107 des faisceaux d'excitation visant à focaliser les faisceaux pompe et Stokes en un volume de focalisation commun pour l'analyse de l'échantillon. L'utilisation d'un objectif de focalisation est particulièrement appropriée dans les applications type microscopie. Cependant, il n'est pas indispensable pour l'émission du signal CARS de travailler en faisceaux focalisés, et notamment dans le cas de l'étude d'échantillons minces. 13 658/003FR1 Dans l'exemple de la figure 10, le module de détection optique 106 comprend un objectif de collection 111 permettant de collecter le signal optique non linéaire émis, dans cet exemple le signal CARS, un filtre 112 pour couper les signaux d'excitation, un élément optique de séparation des faisceaux selon deux voies, et sur chaque voie, une lame 114, 115, type lame de rasoir, permettant de délimiter deux demi-espaces complémentaires. Dans le cas de la figure 10, les lames sont agencées pour délimiter les deux demi-espaces (kX>0) et (kX 0) et (k billes sont plongées dans un liquide aqueux d'indice de réfraction n=1.56 et sont excitées par un objectif d'ouverture numérique 1.2 dans l'eau. La longueur d'onde du faisceau pompe est fixée à 730 nm et on fait varier la longueur d'onde du faisceau Stokes de telle sorte à parcourir la résonance Raman susmentionnée. La courbe Cl représente l'intensité CARS, c'est-à-dire l'intensité lumineuse intégrée sur tout l'espace. La courbe C2 (en trait plein) représente la différence des intensités AI mesurées respectivement dans les demi-espaces (kX>0) et (kX -1 -1 Hors résonance à 995 cm , la différence AI ne donne aucun signal. Par contre, à 1010 cm en utilisant les lames d'occultation telles que décrites dans la figure 10, les interfaces suivant la direction x s'illuminent, révélant le résultat attendu (voir la figure 8B). Si on retire les lames, aucun signal n'apparaît car les détecteurs 116, 117 (figure 10) voient le même signal. Du point de vue spectral, les courbes C2 et C3 représentent l'évolution de AI en fonction de wP ws à deux interfaces opposées entre la bille et le liquide. La déposante a démontré que ces courbes suivent le spectre Raman, aux erreurs d'incertitude expérimentale près. La figure 10 montre ainsi un mode de réalisation particulièrement simple pour la mise en 15 oeuvre de la détection Dk-CARS. De nombreuses variantes sont possibles. Selon une variante, les lames de rasoir 115, 116 peuvent être remplacées par tout type de masque d'occultation permettant de délimiter deux demi-espaces complémentaires. Par exemple, ces masques peuvent être agencés directement sur l'élément optique de séparation 113. Selon une autre variante, le module de détection optique 106 ne comprend qu'une seule 20 voie, avec un détecteur unique, du type photodiode à avalanche ou photomultiplicateur, en utilisant par exemple un filtre adaptatif, par exemple un filtre à cristaux liquides commandé électriquement. Dans ce cas, on mesure dans un premier temps l'intensité intégrée sur un demi-espace, puis l'intensité mesurée sur l'autre demi-espace et on procède au calcul de la différence des intensités. 25 La figure 12 représente une variante de la figure 10, dans laquelle les moyens d'analyse de la direction de diffusion du signal CARS comprennent un module de détection optique 106 avec une seule voie , adaptée à la détection en mode XY (figure 9C). Selon cette variante, le système des masques d'occultation est remplacé par un détecteur unique formée d'un système d'enregistrement d'images, par exemple une caméra matricielle de type CCD, ou CMOS, ou 30 d'une photodiode à 4 quadrants. L'utilisation de la caméra permet de détecter point à point le15 658/003FR1 signal optique non linéaire émis dans des directions symétriques par rapport à la direction d'incidence des faisceaux d'excitation sur la caméra (quand on a retiré le filtre 112), la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés. En pratique, dans une application de microscopie par exemple dans laquelle on procède au balayage des faisceaux d'excitation sur l'échantillon, la direction d'incidence des faisceaux d'excitation varie et on pourra procéder à un calibrage, par exemple en repérant la position des faisceaux d'excitation sur le détecteur, pour les différentes positions de balayage. On peut aussi réaliser le calibrage de la caméra « en solution ». Pour cela, on pourra par exemple repérer la position du signal, pour différents angles d'incidence des faisceaux d'excitation, lorsque les faisceaux d'excitation sont focalisés dans un milieu CARS homogène et qu'il n'y a donc pas de déviation du signal diffusé CARS. Le décalage sera alors mesuré par rapport à cette position de référence. Dans le cas de l'application à la microscopie, lorsqu'on utilise un système de balayage des faisceaux d'excitation pompe et Stokes, il est préférable de positionner la caméra dans la pupille de sortie de l'objectif de collection, ou une image de la pupille de sortie. Cela permet de garder les faisceaux d'excitation centrés quelle que soit leur angle d'incidence sur l'échantillon. Sinon, on pourra procéder à un calibrage de la caméa pour tenir compte de la position des faisceaux d'excitation incidents pour les différents angles de balayage, cette position servant de repère à la mesure du décalage du signal optique non linéaire. Les figures 13 à 16 illustrent une autre variante des moyens d'analyse de la direction d'émission du signal CARS. Comme dans les exemples précédents, un échantillon 105 (figure 13B) comprenant un milieu résonant et un milieu non résonant formant une interface, est excité par un faisceau de pompe et un faisceau Stokes, colinéaires, incidents sur l'échantillon selon un volume de focalisation commun 45. Dans l'exemple tel qu'illustré sur la figure 13A, le module de détection optique 106 comprend un masque en rotation 130 autour de la direction principale Z à une fréquence (v) donnée. Ce masque, par exemple formé d'un demi-disque 134 comme cela est représenté sur la figure 13C, occulte partiellement le signal diffusé CARS dans un plan XY perpendiculaire à la direction principale Z. Le signal ainsi occulté est détecté par un détecteur 132, par exemple de type photomultiplicateur, photodiode PIN ou photodiode à avalanche, précédé par une optique de focalisation 131. 16 658/003FR1 Hors résonance, le signal diffusé CARS est centré et le signal détecté par le détecteur 132 est constant en fonction de la position angulaire 0 du masque (0 étant par exemple défini par rapport à l'axe x, comme cela est illustré sur la figure 13C). Comme cela apparaît sur la figure 14A, le signal détecté S(0) est constant. Dans l'espace de Fourier, les harmoniques du signal à la fréquence v sont nulles (Figure 14B). A la résonance, le signal diffusé CARS est dévié, il n'est plus centré sur le masque tournant et le signal détecté par le détecteur 132 (courbe 141, figure 15A) est donc modulé selon l'équation : S(0) = a cos (0 + 4)) + constante Ou S(t) = a cos (vt + 4)) + constante L'unité de traitement 125 permet de démoduler le signal à la fréquence v, par calcul de la transformée de Fourier, ou, avantageusement, au moyen d'une détection synchrone, afin de déterminer l'amplitude (non nulle) de la transformée de Fourier à la fréquence v. Cette amplitude (3) est proportionnelle à la partie imaginaire Im[x 1R] du milieu 1 ; elle est donc caractéristique d'une résonance vibrationnelle du milieu résonant et permet donc de déterminer le spectre Raman dans une application de spectroscopie, ou en microscopie, d'obtenir des images contrastées aux interfaces axiales. Par ailleurs, comme cela est illustré sur la figure 16, la détermination de la phase 4) du signal modulé à la première harmonique v, obtenue par transformée de Fourier, permet de renseigner sur l'orientation et la position relative des milieux résonant et non résonant. On pourra utiliser pour le masque tournant d'autres formes qu'un demi-disque, comme par exemple un quart de disque ou trois quart de disque. Par ailleurs, le masque tournant peut être réalisé mécaniquement, comme cela a été décrit, ou au moyen d'un filtre commandable électriquement, par exemple un filtre à cristaux liquides. La figure 13A montre l'application de la méthode à la microscopie, lorsqu'on utilise un système de balayage des faisceaux d'excitation pompe et Stokes. Dans cet exemple il est préférable de positionner le disque tournant dans la pupille de sortie de l'objectif de collection, ou une image de la pupille de sortie. , afin de garder les faisceaux d'excitation centrés quelle que 17 658/003FR1 soit leur angle d'incidence sur l'échantillon. Pour la mise en oeuvre de Dk-CARS, l'analyse de la direction de diffusion du signal CARS est faite en champ lointain. L'utilisation de l'objectif de collection 111 (figure 10, 12, 13A) facilite la mise en oeuvre expérimentale. Cependant cet objectif de collection n'est pas strictement nécessaire et la détection pourrait se faire directement après l'échantillon La détection Dk-CARS a été décrite dans une application deux couleurs, utilisant deux sources laser fines spectralement. Dans une application dite multiplexe, on pourra choisir une source d'émission du faisceau Stokes large spectralement, générée par exemple par une impulsion femtoseconde ou par un supercontinuum généré par une fibre optique ou un autre milieu dispersif. Le signal pompe reste lui fin spectralement. Dans cette application, il sera possible d'acquérir un spectre Raman en une seule impulsion, par exemple en utilisant deux spectromètres à fente ou un spectromètre unique équipé d'une caméra CCD dans lequel on injecte les deux signaux détectés dans les deux demi-espaces. Dans cette application, il s'agit d'acquérir les spectres dans les demi-espaces (kX>0) et (kX Dans une application dite trois couleurs, on utilise trois longueurs d'ondes de pulsations associées w1, w2 et w3 pour générer un signal CARS à la pulsation w1-w2+w3. Le signal CARS peut être rendu sans bruit non résonant en détectant les signaux à la pulsation w1-w2+w3 dans les demi-espaces (kX>0) et (kX Selon un autre exemple, on peut utiliser un processus de mélange à quatre ondes résonant dans lequel la résonance est une résonance électronique, en excitant avec un faisceau d'excitation pompe unique, de pulsation %, un échantillon comprenant une interface entre un milieu résonant et un milieu non-résonant. Par exemple on utilise une source laser picoseconde ou femtoseconde de type oscillateurs Ti : Saphir, Nd :verre, lasers fibrés dopés Ytterbium ou Erbium. Les deux exemples décrits précédemment traitent de résonances électroniques. On les trouve dans des atomes, de molécules, des cristaux semi-conducteurs, etc. Selon un autre exemple, on pourra exciter la seconde harmonique résonante avec un faisceau pompe unique, ou on pourra faire de la somme de fréquence avec un faisceau pompe et un faisceau sonde (effet non linéaire du 28me ordre). Bien que décrite à travers un certain nombre d'exemples de réalisation détaillés, le dispositif de détection et la méthode selon l'invention comprend différentes variantes, modifications et perfectionnements qui apparaîtront de façon évidente à l'homme de l'art, étant entendu que ces différentes variantes, modifications et perfectionnements font partie de la portée de l'invention, telle que définie par les revendications qui suivent. 19 REVENDICATIONS1. Dispositif (100 ) pour détecter un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon (105), l'échantillon comprenant un milieu résonant (41) et un milieu non résonant (42) formant une interface (43), le dispositif comprenant : une source d'émission (101) d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation wp donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant ladite interface entre le milieu résonant et non résonant, des moyens d'analyse (106, 125) de la déviation angulaire du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, permettant d'obtenir à une interface axiale des milieux résonant et non résonant un signal caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la source d'émission (101) permet l'émission d'au moins un deuxième faisceau d'excitation du milieu résonant à au moins une deuxième pulsation ws différente de la première pulsation wp, les faisceaux d'excitation étant colinéaires, les moyens d'analyse de la direction d'émission du signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux avec l'échantillon permettant d'obtenir à une interface axiale des milieux résonant et non résonant un signal caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant à une pulsation égale à combinaison linéaire des pulsations des faisceaux d'excitation. 3. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la source d'émission permet l'émission d'un faisceau pompe de pulsation wp et d'un faisceau Stokes de pulsation ws, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et Stokes est un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation was = 2wp - cos et le signal résultant de l'analyse de la direction d'émission du signal diffusé CARS, un signal caractéristique d'une émission Raman du milieu résonant. 4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comprenant un objectif de focalisation (107) du ou desdits faisceaux d'excitation en un volume de focalisation commun (45), permettant d'intercepter ladite interface entre le milieu résonant et le milieu non résonant. 20658/003FR1 5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprennent : un module de détection optique (106) dudit signal optique non linéaire dans au moins deux directions symétriques (k, k') par rapport à l'axe optique, et - une unité de traitement (125) des signaux ainsi détectés permettant d'obtenir la différence desdits signaux, le signal de différence résultant étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 6. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le module de détection optique (106) comprend au moins un masque d'occultation et au moins un détecteur, permettant de détecter le signal optique non linéaire intégré dans deux demi-espaces complémentaires, symétriques par rapport à l'axe optique, la différence étant effectuée sur les signaux intégrés dans les deux demi-espaces. 7. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel le module de détection optique (106) comprend un élément optique de séparation (113) du signal optique non linéaire collecté selon une première et une deuxième voie, et sur chaque voie, un masque d'occultation (114, 115) du signal optique non linéaire et un détecteur (116, 117), les signaux sur chacune des voies étant occultés respectivement selon les deux demi-espaces. 8. Dispositif selon l'une des revendications 6 ou 7, dans lequel le module de détection optique comprend un objectif de collection (111) dudit signal optique non linéaire. 9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel le ou les masques d'occultation sont centrés sur la pupille de sortie ou sur une image de la pupille de sortie de l'objectif de collection. 10. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le module de détection optique (106) comprend un système d'enregistrement d'images (120) permettant de détecter point à point le signal optique non linéaire collecté dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés. 11. Dispositif selon la revendication 10, dans lequel le module de détection optique 21658/003FR1 comprend un objectif de collection dudit signal optique non linéaire. 12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel le système d'enregistrement d'images est placé sur la pupille de sortie ou sur une image de la pupille de sortie de l'objectif de collection. 13. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel les moyens d'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprennent : un module de détection optique (106) dudit signal optique non linéaire comprenant un masque (130) en rotation autour de l'axe optique à une fréquence (v) donnée, le masque occultant partiellement ledit signal, et un détecteur du signal optique ainsi modulé, et une unité de traitement (125) du signal détecté modulé résultant permettant d'obtenir l'amplitude de la composante fréquentielle du signal à ladite fréquence de rotation du masque, l'amplitude étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 14. Dispositif selon la revendication 13, dans lequel l'unité de traitement permet d'obtenir en outre la phase de la composante fréquentielle du signal détecté modulé, la phase étant caractéristique de la position relative des milieux résonant et non résonant. 15. Dispositif selon l'une des revendications 12 ou 13, dans lequel le masque comprend un demi-disque (134) en rotation autour de l'axe optique. 16. Dispositif selon l'une des revendications 12 à 15, dans lequel le module de détection optique comprend un dispositif de collection dudit signal optique non linéaire. 17. Dispositif selon la revendication 16, dans lequel le masque est centré sur la pupille de sortie du dispositif de collection, ou sur une pupille image de ladite pupille de sortie. 18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un dispositif de balayage angulaire du ou des faisceaux d'excitation, permettant au ou à les faisceaux d'excitation d'intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. 19. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la source d'émission 22658/003FR1 émet au moins un faisceau d'excitation à longueur d'onde variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant. 20. Méthode pour détecter un signal optique non linéaire résonant induit dans un échantillon (105), l'échantillon comprenant un milieu résonant (41) et un milieu non résonant (42) formant une interface (43), la méthode comprenant : - l'émission d'au moins un premier faisceau lumineux d'excitation du milieu résonant, dit faisceau pompe, à une première pulsation wp donnée, ledit faisceau pompe étant incident sur l'échantillon selon un axe optique, et interceptant ladite interface entre le milieu résonant et non résonant, l'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire résultant de l'interaction du ou desdits faisceaux avec l'échantillon, permettant d'obtenir à une interface axiale des milieux résonant et non résonant un signal caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 21. Méthode selon la revendication 20, comprenant l'émission d'au moins un deuxième faisceau d'excitation du milieu résonant à au moins une deuxième pulsation cos différente de la première pulsation wp, les faisceaux d'excitation étant colinéaires, l'analyse de la direction d'émission du signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux avec l'échantillon permettant d'obtenir à une interface axiale des milieux résonant et non résonant un signal caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant à une pulsation égale à combinaison linéaire des pulsations des faisceaux d'excitation. 22. Méthode selon la revendication 21, comprenant l'émission d'un faisceau pompe de pulsation wp et d'un faisceau Stokes de pulsation cm, le signal optique non linéaire résultant de l'interaction desdits faisceaux pompe et Stokes étant un signal dit signal diffusé CARS, de pulsation ms = 2wp - cos et le signal résultant de l'analyse de la direction d'émission du signal diffusé CARS, un signal caractéristique d'une émission Raman du milieu résonant. 23. Méthode selon l'une des revendications 20 à 22, dans laquelle le ou lesdits faisceaux d'excitation sont focalisés en un volume de focalisation commun (45), permettant d'intercepter ladite interface entre le milieu résonant et le milieu non résonant. 23658/003FR1 24. Méthode selon l'une des revendications 20 à 23, dans laquelle l'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprend : la détection dudit signal optique non linéaire dans au moins deux directions symétriques (k, k') par rapport à l'axe optique, et le calcul de la différence des signaux détectés, le signal de différence résultant étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 25. Méthode selon la revendication 24, dans laquelle la détection du signal optique non linéaire est faite par intégration du signal dans deux demi-espaces complémentaires, symétriques par rapport à l'axe optique, et la différence est effectuée sur les signaux intégrés dans les deux demi-espaces. 26. Méthode selon la revendication 24, dans laquelle la détection du signal optique non linéaire est faite par détection point à point du signal optique non linéaire dans des directions symétriques par rapport à l'axe optique, la différence étant effectuée pour chaque couple de signaux ainsi détectés. 27. Méthode selon l'une des revendications 20 à 23, dans laquelle l'analyse de la déviation angulaire du signal optique non linéaire comprend : la détection d'un signal optique modulé résultant de l'occultation partielle dudit signal optique non linéaire au moyen d'un masque (130) en rotation autour de l'axe optique à une fréquence (v) donnée, la détermination de l'amplitude de la composante fréquentielle du signal détecté modulé à ladite fréquence de rotation du masque, l'amplitude étant caractéristique d'une résonance vibrationnelle ou électronique du milieu résonant. 28. Méthode selon la revendication 27, comprenant en outre la détermination de la phase de la composante fréquentielle du signal détecté modulé, la phase étant caractéristique de la position relative des milieux résonant et non résonant. 29. Méthode selon l'une des revendications 20 à 28, dans laquelle le ou les faisceaux d'excitation subissent un balayage angulaire pour intercepter l'échantillon à différentes positions de l'interface entre le milieu résonant et non résonant. 30. Méthode selon l'une des revendications 20 à 29, dans laquelle l'un au moins des 24658/003FR1 faisceaux d'excitation présente une longueur d'onde d'émission variable, permettant d'obtenir un spectre des résonances vibrationnelles ou électroniques du milieu résonant. 25