Brevet FR2951459A1 — publié le 20110422

TEST DE DETECTION DE XANTHOMONAS AXONOPODIS PV. ALLII La présente invention se rapporte à de nouveaux outils de détection de Xanthomonas axonopodis pv. allii. Xanthomonas axonopodis pv. allii est l'agent causal du dépérissement bactérien de l'oignon, une des contraintes sanitaires majeures de la culture des alliacées. Cette maladie a été observée pour la première fois en 1971 à la Barbade (Antilles), puis en 1975 dans plusieurs îles de l'archipel d'Hawaii. Dans les années 1980 cette bactérie a été trouvée au Brésil, à Cuba et à l'île Maurice. De 1990 à 2000, elle a atteint les Etats-Unis, le Venezuela, l'Afrique du Sud et le Japon, provoquant des dégâts importants. Xanthomonas axonopodis pv. allii a été caractérisée pour la première fois a Hawaïi en 1978 (Alvarez et al., Physiopathology ; 68 : 1132-1136, 1978). Xanthomonas axonopodis pv. allii est pathogène des alliacées, notamment l'ail, le poireau, la ciboulette, l'échalotte et l'oignon (Roumagnac et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54 : 15-24, 2004), la maladie tendant à être plus sévère chez l'oignon. Cette bactérie s'est également révélée pathogène pour des espèces du genre Citrus lors d'infections expérimentales par infiltration (Gent et al., Phytopathology, 95(8) : 918-925, 2005) ; il n'y a cependant aucune preuve montrant que cette bactérie est pathogène au champ pour le genre Citrus. Xanthomonas axonopodis pv. allii provoque chez l'oignon des lésions sur les tissus aériens de la plante (feuilles et hampes florales), caractérisées par la présence de petites tâches aqueuses lenticulaires qui s'étendent et évoluent rapidement en chloroses puis nécroses. La maladie est favorisée par des températures élevées (supérieures à 27 °C) et des foyers importants apparaissent rapidement (7 à 10 jours) après une période de temps humide et pluvieux. A cause de la réduction du feuillage, les plantes se rabougrissent et les bulbes s'amoindrissent, ce qui entraîne des pertes de rendement important, de l'ordre de 10 à 50 2 Par exemple, aux Etats-Unis, des pertes de rendement de 20 % ou plus sont couramment observées dans les champs infectés. Il a été montré que la bactérie pouvait être présente dans les semences d'oignons (Roumagnac et al., Eur. J. Plant Pathol., 106 : 867-877, 2000), que la maladie pouvait se diffuser à large échelle, notamment par les échanges commerciaux de semences, et que 4 graines infectées sur 10000 suffisaient pour déclencher une épidémie (Roumagnac et al., Phytophatology, 94 : 138-146, 2004). Au sein des cultures, le vent et l'irrigation, en particulier l'irrigation par aspersion, peuvent assurer une plus grande dissémination de la maladie, comme c'est également le cas avec les orages et la grêle. En outre, la bactérie est capable de survivre sur des débris de cultures qui sont ensuite disséminés en adhérant aux vêtements des travailleurs et aux équipements. Du fait de l'importance des épidémies et de la faible proportion de graines contaminées nécessaire pour déclencher des épidémies conséquentes, cette bactérie a été mise sur la liste d'alerte de l'Organisation Européenne de la Protection des Plantes (OEPP) en 2006. Une procédure est en cours pour son inscription sur la liste Al des organismes de quarantaine OEPP. Des mesures de lutte contre le dépérissement bactérien de l'oignon sont disponibles, par exemple l'utilisation de semences saines, la destruction des repousses d'oignons, la destruction des débris végétaux, les rotations, la lutte chimique. En outre, les commercialisations et échanges internationaux de semences sont les agents principaux de la diffusion de cette maladie et représentent un risque d'introduction de l'agent pathogène dans des zones saines ou d'introduction de nouveaux génotypes dans des zones déjà contaminées. Il est donc nécessaire de pouvoir garantir la bonne qualité sanitaire de ces semences. Pour ce faire, des tests de diagnostic rapides, fiables et sensibles permettant la certification des lots de semences d'Allium en routine sont indispensables. A l'heure actuelle de tels outils 3 diagnostic n'existent pas. Les méthodes d'identification couramment utilisées sont basées sur l'isolement de la bactérie à partir du matériel végétal infecté et sa mise en culture sur un milieu approprié, notamment le milieu NCTM1 (Roumagnac et al., Eur. J. Plant Pathol., 106 : 867-877, 2000). L'isolement de la bactérie prend plusieurs jours, et l'identité de la bactérie doit ensuite être vérifiée par des méthodes biochimiques, des typages moléculaires et/ou tests de pathogénicité (Gent et al., Phytopathology, 94(2) : 184- 195, 2004 ; Picard et al., Phytopathology, 98(9) . 919-925, 2008). De plus, la présence d'autres bactéries dans les échantillons peut dans certains cas diminuer la sensibilité du test et provoquer la détection de faux-positifs. Un test d'identification par amplification PCR d'une séquence spécifique de Xanthomonas axonopodis pv. allii a été développé (Humeau et al., Phytopathology, 96(12) . 1345-1354, 2006 ; Picard et al., Phytopathology, 98(9) : 919-925, 2008). Ce test consiste à réaliser une PCR nichée en utilisant lors d'une première étape d'amplification les amorces PXaalU (SEQ ID NO : 1) / PXaa1L (SEQ ID NO : 2), puis dans une seconde étape les amorces NXaalU (SEQ ID NO : 3) / NXaalL (SEQ ID NO : 4). Cependant, bien que cette méthode soit sensible et fiable, elle ne permet pas la détection de toutes les souches, notamment celles provenant de la Barbade et du Brésil. Le défaut de détection de certaines souches s'expliquerait par la forte diversité génétique intra-pathovar chez Xanthomonas axonopodis pv. allii (Picard et al., Phytopathology, 98(9) : 919-925, 2008 ; Gent et al., Phytopathology, 94(2) . 184-195, 2004 ; Gent et al., Phytopathology, 95(8) : 918-925, 2005). En outre, une étude de diversité génétique a montré que le polymorphisme des souches était variable selon leur origine géographique : il existe des zones à forte diversité (notamment Etats-Unis, Afrique du Sud) et des zones à faible diversité (par exemple Venezuela, Hawaï, Barbade). Par conséquent, puisqu'aucun test n'est aujourd'hui disponible pour détecter l'ensemble des souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii, la mise au point d'un 4 outil diagnostic fiable, sensible et permettant la détection de toutes les souches, quelle que soit leur origine géographique, est indispensable pour optimiser la lutte contre les maladies provoquées par cette bactérie et améliorer la surveillance sanitaire lors des échanges internationaux. Les Inventeurs ont maintenant identifié deux séquences d'ADN cibles spécifiques de Xanthomonas axonopodis pv. allii. Ces séquences cibles, nommées « PIL » et « AVR », sont représentées dans le listage de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6, respectivement. Le marqueur PIL, mis en évidence par la technique d'amplification aléatoire d'ADN polymorphe, ou RAPD pour « Random Amplification of Polymorphic DNA », est présent dans environ 70% des souches de Xanthomonas axonopodis pv. a11ii. Il s'est avéré que les amorces PXaalU (SEQ ID NO : 1) / PXaa1L (SEQ ID NO : 2) et NXaalU (SEQ ID NO : 3) / NXaa1L (SEQ ID NO : 4) utilisées par Humeau et al. (Phytopathology, 96 : 1345-1354, 2006) s'hybridaient à cette séquence cible. Le marqueur « AVR », identifié par la méthode AFLP (pour Amplified Fragment Length Polymorphism), est au moins présent chez toutes les souches qui ne possèdent pas le marqueur « PIL ». Ainsi, du fait de la complémentarité de ces 25 marqueurs, leur recherche conjointe permet le diagnostic sélectif de l'ensemble des souches connues de Xanthomonas axonopodis pv. allii. La présente invention a donc pour objet un polynucléotide isolé susceptible d'être obtenu à partir de 30 Xanthomonas axonopodis pv. allii, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par : a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 6 ; b) un polynucléotide ayant 85 de préférence 90 et plus préférentiellement 95 % d'identité avec la 35 séquence SEQ ID NO : 6 ; c) tout fragment d'au moins 15 pb dudit polynucléotide ; d) tout polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides a) ou b) ; e) tout polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes avec l'un des 5 polynucléotides a), b), c) ou d). Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont déterminés sur un alignement global des séquences à comparer, en utilisant l'algorithme de NEEDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970). Cette comparaison de séquences peut être effectuée par exemple à l'aide du logiciel d'alignement « Geneious » (Drummond AJ, Ashton B, Cheung m, Heled J, Kearse M, Moir R, Stones-Havas S, Thierer T, Wilson A ; 2009, Geneious v4.7). Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire. La présente invention englobe notamment des polynucléotides utilisables comme amorces d'amplification pour l'obtention d'une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention, ou comme sondes d'acide nucléique pour la détection de ladite séquence. Elle englobe en particulier les couples d'amorces utilisables pour l'amplification d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 6, ou d'un fragment de celui-ci. A titre d'exemples non-limitatifs de couples d'amorces conformes à l'invention, on citera notamment : le couple d'amorces constitué par les polynucléotides PXaa2U (SEQ ID NO: 7) et PXaa2L, (SEQ ID NO: 6 8), qui permet l'amplification d'un fragment de 995 pb de la séquence SEQ ID NO: 6 : - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides NXaa2U (SEQ ID NO: 9) et NXaa2L, (SEQ ID NO: 10), qui permet l'amplification d'un fragment de 401 pb de la séquence SEQ ID NO: 6. La Figure 1 représente la séquence SEQ ID NO : 6. Les fragments de séquence en gras délimitent les amorces PXaa2U, PXaa2L, NXaa2U et NXaa2L. Un autre objet de la présente invention est l'utilisation de molécules d'acide nucléique conformes à l'invention pour le dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. ailii, et notamment les souches qui ne comprennent pas le marqueur « PIL ». La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. a11ii, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence d'ADN d'un échantillon biologique susceptible de contenir ladite bactérie avec un ou plusieurs polynucléotide(s) conforme(s) à l'invention, en conditions permettant une hybridation sélective entre ledit ou lesdits polynucléotide(s) et la séquence cible SEQ ID NO: 6, si celle-ci est présente dans ledit ADN ; - la détection de ladite hybridation. L'échantillon biologique utilisé peut être soit une culture de bactéries isolées à partir de la plante ou des graines d'alliacées sur lesquelles on souhaite opérer la détection, soit directement les graines d'alliacées potentiellement infectées, ou un échantillon de la plante potentiellement infectée. Avantageusement, la détection est réalisée sur les graines d'oignon. La détection de l'hybridation peut s'effectuer par tous moyens connus en eux-mêmes de l'homme de l'art. Lorsque l'on utilise un polynucléotide conforme à l'invention, préalablement marqué à l'aide d'un marqueur approprié, en tant que sonde d'acide nucléique, l'hybridation de la séquence cible avec la sonde marquée est détectée directement. 7 Lorsque l'on utilise deux polynucléotides, constituant un couple d'amorces conformes à l'invention, l'hybridation des amorces avec la séquence cible est mise en évidence par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (amplification PCR pour « Polymerase chain reaction »), puis par détection du produit d'amplification, notamment sur gel d'agarose. Dans ce cas, le procédé de dépistage conforme à l'invention comprend au moins les étapes suivantes i) la mise en présence de l'ADN d'un échantillon biologique à tester avec un couple d'amorces conformes à l'invention, en conditions permettant une hybridation sélective entre les amorces et la séquence cible SEQ ID NO: 6 ; ii) la réalisation d'une réaction d'amplification en chaîne par polymérase dans des conditions permettant l'amplification de la séquence cible SEQ ID NO: 6 ; iii) la détection du produit d'amplification. De manière préférée, la détection est réalisée par PCR « nichée » (ou nested PCR). Dans ce mode de mise en œuvre de l'invention, le procédé de dépistage conforme à l'invention comprend en outre une seconde étape d'amplification PCR (étape iv) réalisée à l'aide d'un second couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment interne du produit d'amplification de la première étape. A titre d'exemple, la première étape d'amplification (étape ii) du procédé conforme à ce mode de mise en œuvre peut être effectuée en utilisant le couple d'amorces constitué par les polynucléotides PXaa2U (SEQ ID NO: 7) et PXaa2L, (SEQ ID NO: 8), et la deuxième étape d'amplification (étape iv) en utilisant le couple d'amorces constitué par les polynucléotides NXaa2U (SEQ ID NO: 9) et NXaa2L (SEQ ID NO: 10). De manière à pouvoir détecter toutes les souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii, c'est-à-dire les souches qui contiennent les marqueurs « PIL » et « AVR », et celles qui ne contiennent qu'un de ces deux marqueurs, un autre mode de mise en œuvre particulièrement avantageux de la présente 8 méthode permet la détection de la séquence cible SEQ ID NO : 5 (marqueur « PIL ») outre celle de SEQ ID NO : 6 (marqueur « AVR »). Dans ce mode de mise en oeuvre particulier, on utilise un ou plusieurs polynucléotide(s) conforme(s) à l'invention capables de s'hybrider sélectivement avec la séquence cible SEQ ID NO : 6, et un ou plusieurs polynucléotide(s) capable(s) de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec la séquence cible SEQ ID NO : 5. Dans le cas où le• procédé de détection selon l'invention comprend une étape d'amplification PCR, on utilise des couples d'amorces permettant l'amplification d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 5, ou d'un fragment de celui-ci, et des amorces conformes à l'invention permettant l'amplification d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 6, ou d'un fragment de celui-ci. Dans ce cas, à l'étape i) du procédé conforme à l'invention, l'ADN de l'échantillon est en outre mis en présence d'un ou plusieurs polynucléotide(s) capable(s) de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec la séquence cible SEQ ID NO : 5, et les conditions de l'étape ii) permettent, outre l'amplification de la séquence cible SEQ ID NO: 6, l'amplification de la séquence cible SEQ ID NO: 5. De préférence, les couples d'amorces utilisables pour l'amplification du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 5 sont : - le couple d'amorces PXaalU (SEQ ID NO: 1) et PXaalL, (SEQ ID NO: 2), qui permet l'amplification d'un fragment de 694 pb de la séquence SEQ ID NO: 5 ; et - le couple d'amorces NXaalU (SEQ ID NO: 3) et NXaalL, (SEQ ID NO: 4), qui permet l'amplification d'un fragment de 444 pb de la séquence SEQ ID NO: 5. La Figure 2 représente la séquence SEQ ID NO : 5. 35 Les fragments de séquence en gras délimitent les amorces PXaalU, PXaalL, NXaalU et NXaa1L. Lorsqu'il s'agit d'une méthode de détection selon l'invention comprenant deux étapes d'amplification 9 (mode de mise oeuvre « PCR nichée »), on utilise lors de la première étape d'amplification (étape ii)) un couple d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 5, outre le couple d'amorces selon l'invention permettant l'amplification de tout ou partie du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 6. Dans la seconde étape d'amplification PCR (étape iv), on utilise un couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment interne du produit d'amplification de la séquence SEQ ID NO : 5 obtenu à la première étape, outre les amorces selon l'invention permettant d'amplifier un fragment interne du produit d'amplification de la séquence SEQ ID NO : 6. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé selon l'invention, l'étape d'amplification ii) est réalisée avec le couple d'amorces PXaalU (SEQ ID NO: 1) et PXaa1L, (SEQ ID NO: 2) et le couple d'amorces PXaa2U (SEQ ID NO: 7) et PXaa2L, (SEQ ID NO: 8), l'étape d'amplification iv) est réalisée avec le couple d'amorces NXaalU (SEQ ID NO: 3) et NXaa1L, (SEQ ID NO: 4) et le couple d'amorces NXaa2U (SEQ ID NO: 9) et NXaa2L (SEQ ID NO: 10). Ce mode de réalisation a un seuil de sensibilité d'environ 1 graine contaminée sur 27 300 : il est donc particulièrement fiable pour évaluer l'état sanitaire d'un échantillon de graines, et est utilisable pour la certification de semences d'alliacées puisque le taux de contamination des semences rapporté pour les épidémies de dépérissement bactérien de l'oignon en milieu tropical est de 4,5/10 000. Les modes de mise en oeuvre du procédé selon l'invention ciblant à la fois les gènes cibles « PIL » et « AVR » ont l'avantage de pouvoir détecter l'ensemble des souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii, comme l'ont démontré les Inventeurs sur une « collection mondiale », répertoriée dans le Tableau I (cf. ci-après Exemple 2.1), constituée par 87 souches provenant de différentes régions du monde, alors que la plupart des souches de Xanthomonas différentes du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. allii ne sont pas détectées. Seules quelques souches classifiées dans les sous-groupes génétiques 9.1 et 9.2 de Xanthomonas axonopodis, non pathogènes pour l'oignon, sont également détectées. Cependant, ces dernières peuvent facilement être distinguées des souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii par une analysé du profil de restriction, par exemple en utilisant l'enzyme NheI qui clive uniquement le produit d'amplification des souches de Xanthomonas euvesicatoria (groupe 9.2), ou en utilisant l'enzyme CfrI qui clive uniquement le produit d'amplification de Xanthomonas axonopodis sous-groupe 9.1, notamment Xanthomonas axonopodis pv. begoniae. La présente invention a également pour objet un kit de détection de Xanthomonas axonopodis pv. a11ii comprenant un ou plusieurs polynucléotide(s) conforme(s) à l'invention capable(s) de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec la séquence cible SEQ ID NO: 6. De préférence, le kit de détection comprend également un ou plusieurs polynucléotide(s) capable(s) de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec la séquence cible SEQ ID NO: 5. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la mise en oeuvre de la présente invention pour la détection de Xanthomonas axonopodis pv. allii. EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DES MARQUEURS « PIL » ET « AVR ». 1.1. Identification du marqueur « PIL » Les souches utilisées lors de la présente étude ont été cultivées sur milieu YPGA (7 g.l 1 d'extrait de levure, 7 g.1 1 de peptone, 7 g.11 de glucose, 18 g.1' d'agar, pH 7,2) ou sur milieu de Wilbrink modifié (10 g.11 saccharose, 5 g.l 1 bacto-peptone, 5 g.1 1 d'extrait de levure, 0,5 g.l 1 de K2HPO4r 0,25 g.1 1 de MgSO4/7H2O, 0,05 g.1 1 de Na2SO3, 15 g. 1 1 d'agar, pH 6,9-7 ; Rott et al., Agron. Trop. ; 43 244-251, 1988) pour les souches présentant une croissance faible sur le milieu YPGA. L'amplification aléatoire d'ADN polymorphe, ou RAPD, a ensuite été réalisée. Pour cela, l'ADN total de vingt-deux souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii provenant de diverses zones géographiques (cf. plus bas, Tableau I, les souches marquées par « b ») et de six autres Xanthomonas (cf. plus bas, Tableau II, les souches marquées par « d ») a été extrait à partir de 2 ml de culture bactérienne en utilisant le kit « DNeasy blood and tissue » (Qiagen, Courtaboeuf, France) selon les instructions du fournisseur. Une amplification PCR a été effectuée sur les extraits d'ADN issus de chaque souche. Le milieu réactionnel de 2511l contient 25 ng d'ADN génomique bactérien, 3mM de MgC12, 0,4 pM d'amorces, 2,5 unité d'ADN polymérase Taq (Invitrogen, Merelbeke, Belgique), 100µM de chacun des dNTP (Roche Diagnotics, Meylan, France) en milieu tris-HC1 20mM et 50mM de tampon KC1 (pH 8,4). Une centaine d'amorces courtes de 10 nucléotides de séquence définie arbitrairement provenant des kits 80, 70 et 60% GC (Genome Express, Meylan, France) a été testée. L'amplification a été conduite dans les conditions suivantes . - dénaturation initiale à 94°C pendant 7 min, - 40 cycles d'amplification comprenant chacun 3 phases : 94°C pendant 1 min (dénaturation), 35°C pendant 1 min (hybridation des amorces sur l'ADN) et 72°C pendant 2 min (polymérisation), - extension à 72°C pendant 5 min. Les produits d'amplification ont été soumis à électrophorèse en gel d'agarose NuSieve 2% et révélés par fluorescence après coloration au bromure d'éthidium. Il s'est avéré qu'aucun des fragments n'était présent dans l'ensemble des souches Xanthomonas axonopodis pv. allii testées et absent des autres pathovars. Parmi les fragments amplifiés retrouvés dans la plupart des souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii et absents des autres souches, le fragment amplifié par l'amorce nommée 80-21 (SEQ ID NO : 11 ; 5'ACGOOCCAGG 3'), d'environ 940 pb, est présent dans 70% des souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii testées. Ce fragment d'intérêt a été excisé du gel d'agarose pour les souches Xanthomonas axonopodis pv. allii CFBP6364, CFBP6366, CFBP6369 et CFBP6379, extrait en utilisant le kit d'extraction « QlAquick gel Extraction » (Qiagen, Courtaboeuf, France), puis cloné par ligation dans le vecteur pGEM-T Easy selon les instructions du fournisseur (Promega, Madison, USA). La séquence a ensuite été déterminée par séquençage en utilisant les amorces T7 et SP6 qui s'hybrident aux régions bordant l'insert cloné dans le vecteur pGEM-T Easy. Ce fragment est identique à 99% entre ces quatre souches, et une recherche dans la base de données GenBank révèle qu'il partage 97% d'identité avec deux portions contiguës (respectivement de 828 et 102 pb) appartenant aux gènes PILW et PILX de Xanthomonas euvesicatoria, gènes qui codent pour des protéines d'assemblage du pilus. Il est à noter qu'aucun des autres fragments 20 identifiés par RAPD n'était présent chez les souches dont le génome n'était pas amplifié par l'amorce 80-21. 1.2. Identification du marqueur « AVR » Les souches Xanthomonas axonopodis pv. allii CFBP6369, CFBP6380, CFBP6384, JX36-1, CFBP6386 et CFBP6382, 25 représentatives des souches non amplifiées par l'amorce 80-21 ont été analysées par la technique AFLP. Une souche de Xanthomonas citri pv. citri (IAPAR 306) et de Xanthomonas campestris pv. campestris (CFBP 5251) ont été utilisées comme contrôle. 30 L'analyse AFLP a été réalisée comme décrit par Ah-You et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59 : 306-318 , 2009). L'ADN bactérien, extrait comme indiqué précédemment, a été digéré conjointement par SacI et MspI, 35 puis la ligation avec les adapateurs SacI et Mspl a été réalisée durant 3 heures à 37°C en ajoutant 2,5 de produit de digestion à 22,5 µl d'un mélange de ligation contenant 2 µM de l'adaptateur MspI, 0,2 µM de l'adaptateur SacI (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) et 2 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs Ozyme) dans du tampon de ligation 1X. Une pré-amplification PCR est réalisée dans 15 µl de mélange réactionnel constitué de 5 µl du mélange de ligation dilué au dixième, 2,5 mM de MgC12, 0,23 µM de chacune des amorces PSAC (SEQ ID NO : 12) et PMSP (SEQ ID NO : 13), 0,45 µM de chaque dNTP, 0,5 unité d'ADN polymérase Taq (Goldstar Red, Eurogentec, Seraing, Belgique) dans un tampon 1X Goldstar. L'amplification a eu lieu dans les conditions suivantes : - extension initiale à 72°C pendant 2 min, - dénaturation initiale à 92°C pendant 2 min, - 25 cycles d'amplification comprenant chacun 3 phases : 94°C pendant 30 sec (dénaturation), 56°C pendant 30 sec (hybridation des amorces sur l'ADN) et 72°C pendant 2 min (polymérisation), - extension à 72°C pendant 10 min. Les produits d'amplification sont ensuite dilués 10 fois dans de l'eau HPLC avant l'amplification sélective. L'amplification sélective est réalisée à l'aide des paires d'amorces non marquées MspI (SEQ ID NO : 14) + A, T, G ou C et SacI + C (SEQ ID NO : 15), ou MspI (SEQ ID NO : 14) + A, T, G ou C et SacI + CT (SEQ ID NO : 16). Les conditions d'amplification sont les mêmes que celles décrites pour la pré-amplification, à l'exception de la concentration des amorces SacI + C et SacI + CT qui est de 0,12 µM. Les produits d'amplification ont ensuite été analysés sur gel d'acrylamide 5% (Risterucci et al., Theor. Appl. Genet.; 101 : 948-955, 2000) puis l'ADN visualisé par coloration à l'argent (Qu et al., Electrophoresis ; 26 : 99- 101, 2005). Du fait de la complexité des profils AFLP obtenus en utilisant deux bases sélectives dans l'étape d'amplification, seuls les profils obtenus avec trois bases sélectives ont été exploités pour récupérer les fragments d'intérêt. Deux fragments présents dans la majorité des souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii, dont les souches qui ne sont pas amplifiées par l'amorce 80-21, ont été visualisés. Afin d'identifier ces fragments, l'ADN a été extrait du gel d'acrylamide dans 50 µl de tampon. 5 µl ont ensuite été soumis à une amplification sélective, comme décrit par Ah-You et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59 : 306-318, 2009), en utilisant les paires d'amorces MspI (SEQ ID NO : 14) + A ou T et SacI + CT (SEQ ID NO : 16). Les conditions d'amplification sont les mêmes que celles décrites pour la pré-amplification, à l'exception de la concentration de l'amorce SacI + CT qui est de 0,12 µM. Les fragments amplifiés ont alors été introduits par ligation dans le vecteur pGEM-T Easy comme décrit ci-dessus, puis des bactéries E. coli ont été transformées par les vecteurs contenant les inserts. Malgré les conditions plus stringentes d'amplification avec trois bases sélectives, le séquençage des clones obtenus a révélé que les ADN avaient une composition hétérogène, ce qui s'explique sans doute par une co-migration de produits d'amplification de taille similaire ou une contamination lors de l'étape d'excision. Néanmoins, en utilisant l'amplification avec trois nucléotides sélectifs, un clone intéressant a été obtenu à partir des fragments AFLP provenant de la souche CFBP 6382. Le séquençage de l'insert de ce clone suivi d'une recherche dans la base de données GenBank ont révélé la présence d'une séquence de 270 pb possèdant 90% d'identité avec une portion du gène d'avirulence avrRxv de Xanthomonas euvesicatoria (numéro d'accession GenBank L20423). A partir de cette séquence, les amorces F1154 (SEQ ID NO : 17) et R1391 (SEQ ID NO : 18) ont été générées puis une PCR a été réalisée à l'aide de ces amorces sur les souches CFBP6366, CFBP6380, CFBP6384, JX36-1, CFBP 6386, CFBP6357 et CFBP6382. L'amplification PCR a été réalisée dans 25 pl de mélange réactionnel constitué de 20 ng d'ADN total, 3mM de MgC12, 0,2 µM d'amorces, 1,25 unité de polymérase Dap Goldstar (Eurogentec, Seraing, Belgique), 100µM de chacun des dNTP (Roche Diagnotics, Meylan, France). Les conditions d'amplification suivantes ont été utilisées: - extension initiale à 72°C pendant 2 min, - dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min, - 40 cycles d'amplification comprenant chacun 3 phases : 95°C pendant 1 min (dénaturation), 60°C pendant 1 min (hybridation des amorces sur l'ADN) et 72°C pendant 2 min (polymérisation), - extension à 72°C pendant 5 min. Un amplicon de 238 pb a été obtenu pour chacune des souches testées : suivant les souches, le fragment de 238 pb partageait 90 à 99% du gène d'avirulence avrRxv de Xanthomonas euvesicatoria (numéro d'accession GenBank L20423). Afin d'obtenir des fragments d'ADN plus grands afin de concevoir des amorces PCR spécifiques de Xanthomonas axonopodis pv. allii, des amplifications ont été réalisées en utilisant les paires d'amorces F202 (SEQ ID NO : 19), correspondant aux nucléotides 202-219 du gène d'avirulence avrRxv de Xanthomonas euvesicatoria (numéro d'accession GenBank L20423) et R1391 (SEQ ID NO : 18) choisie dans l'amplicon de 238 pb, ainsi que les paires d'amorces F1154 (SEQ ID NO : 17) et R2149 correspondant aux nucléotides 2131- 2149 (SEQ ID NO : 20) du gène d'avirulence avrRxv de Xanthomonas euvesicatoria (numéro d'accession GenBank L20423). Un fragment de 1948 pb a été amplifié pour les souches CFBP6366, CFBP6386, CFBP6357 et CFBP6382, un fragment de 1950 pb pour les souches CFBP 6384 et JX36-1 et une séquence partielle de 1504 pb pour la souche CFBP 6380. Toutes ces séquences présentent entre 87 et 98% d'identité avec le gène avrRxv de Xanthomonas euvesicatoria. EXEMPLE 2 : DETECTION SPECIFIQUE DE XANTHOMONAS AXONOPODIS PV. ALLII. 2.1. Spécificité de la détection par PCR nichée multiplex A partir des marqueurs « PIL » (SEQ ID NO : 5) et « AVR » (SEQ ID NO : 6), des paires d'amorces ont été conçues en sélectionnant les régions les plus conservées de ces deux marqueurs parmi les souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii. Pour le marqueur « PIL », les deux couples d'amorces choisis sont le couple d'amorces PXaalU (SEQ ID NO: 1) et PXaalL (SEQ ID NO: 2) et le couple d'amorces NXaalU (SEQ ID NO: 3) et NXaa1L, (SEQ ID NO: 4). Pour le marqueur « AVR », les deux couples d'amorces choisis sont le couple d'amorces PXaa2U (SEQ ID NO: 5 7) et PXaa2L, (SEQ ID NO: 8), et le couple d'amorces NXaa2U (SEQ ID NO: 9) et NXaa2L, (SEQ ID NO: 10). Une analyse par PCR nichée multiplex a alors été réalisée à l'aide de ces quatre couples d'amorces sur 87 souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii (cf. Tableau I 10 ci-après), 101 souches bactériennes phytopathogènes (autres pathovars et espèces de Xanthomonas, autres genres bactériens), et 18 bactéries saprophytes de l'oignon (cf. Tableau II ci-après). Différents types d'échantillons ont été testés, 15 notamment de l'ADN génomique bactérien purifié, des suspensions bactériennes et des graines mélangées avec une souche bactérienne. La première étape de l'analyse par PCR nichée multiplex a été effectuée dans un mélange réactionnel de 25 20 µl constitué de 0,5 à 5 µl d'échantillon à tester (selon le type d'échantillon), 3 mM de MgC12, 0,2 E.tM de chacune des amorces constituant les couples d'amorces PXaa2U (SEQ ID NO: 7) / PXaa2L, (SEQ ID NO: 8) et PXaalU (SEQ ID NO: 1) / PXaalL (SEQ ID NO: 2), 100 µM de chaque dNTP, 1,25 unité d'ADN 25 polymérase Taq (Goldstar Red, Eurogentec, Seraing, Belgique), dans un tampon 75 mM tris-HC1, 20mM (NH4)2SO4 et 0,01% Tween 20 (pH 8,8). Les conditions d'amplification utilisées étaient les suivantes . - dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min, - 40 cycles d'amplification comprenant chacun 3 phases : 95°C pendant 1 min (dénaturation), 63°C pendant 1 min (hybridation des amorces sur l'ADN) et 72°C pendant 2 min (polymérisation), - extension à 72°C pendant 5 min. La seconde étape de la PCR nichée multiplex a été réalisée avec 1 à 5 µl des amplicons obtenus à la première 30 35 étape d'amplification dans des conditions analogues à celles décrites pour la première étape d'amplification, à l'exception des couple d'amorces qui sont les suivant : NXaa2U (SEQ ID NO: 9) / NXaa2L, (SEQ ID NO: 10) et NXaa1U (SEQ ID NO: 3) / NXaa1L (SEQ ID NO: 4) ont été utilisées. Le programme d'amplification était le suivant : - dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min, - 30 cycles d'amplification comprenant chacun 3 phases : 94°C pendant 30 sec (dénaturation), 57°C pendant 30 sec (hybridation des amorces sur l'ADN) et 72°C pendant 40 sec (polymérisation), - extension à 72°C pendant 5 min. Les produits d'amplification ont ensuite été analysés sur gel d'agarose 1% (amplicon provenant de la première étape d'amplification) ou 3% (amplicon provenant de la seconde étape d'amplification). Parmi les 87 souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii testées, trois types de résultats sont obtenus lors de la première étape d'amplification : i) deux amplicons présentant les tailles attendues, 694 pb (une portion du marqueur « PIL ») et 995 pb (une portion du marqueur « AVR ») ont amplifiés à partir de toutes les souches du Brésil, de Cuba, du Japon, de l'Ile Maurice, de l'Ile de la Réunion et de Hawaii. ii) un seul amplicon de 694 pb (une portion du marqueur « PIL ») a été amplifié à partir de toutes les souches provenant de Géorgie du Venezuela, de quatre souches du Colorado et de deux souches provenant de l'Afrique du Sud. iii) un seul amplicon de 995 pb (une portion du marqueur « AVR ») a été amplifié à partir de toutes les souches provenant de la Barbade, du Texas, trois souches provenant de l'Afrique du Sud et une provenant du Colorado. Lors de la seconde étape d'amplification, les fragments suivant, issus de l'amplification interne des produits d'amplification de la première étape, ont été observés : deux fragments de 444 pb (une portion interne de l'amplicon « PIL ») et 401 pb (une portion interne de l'amplicon « AVR ») ont été obtenus pour le groupe présentant le profil i), un unique amplicon de 444 et 401 pb pour les groupes ii) et iii) respectivement. Les résultats obtenus pour les 87 souches de Xanthomonas axonopodis pv. allii testées sont résumés dans le 5 Tableau I ci-dessous. Souches$ origine Hôte Réponse en Multiplex nested-PCR 694 bpi 444 bp 995 bpi` 401 bp amplicons annplicons (marqueur PIL) (marqueur AVR) CFBP 6384beeh. JX36-1deh'.. CFBP South Africa A.cepa L -1- +, + 63 S 66ae'hi South Africa A.cepa L + / + - CFBP 63S5be. JX36-2i Barbados A.cepa L -1 - - CFBP 6367bh. JR5121. JR513u. 3R` 14, Brazil A.cepa L + . 3R515. CFBP 6363 Brazil A. cepa L + I + , . CFBP 6362b~h. CFBP 6363e TV'Y93e. Cuba A, satirwn L + + ± ! + CFBP 6.377 Japan A. fistuiosum L + J' + + i + CFBP 63 8e Mauritius A. cepa L ± / + + r' + CFBP 6 364b`e. CFBP 6365e Reunion Island A.cepa L + r' + - / - CFBP 6107ee. CFBP 610Strei Reunion Island A. sativuin L - - - JR649. JR650. JR651. CFBP 6374e, Reunion Island A. pomtm L +1+ . , . ,T-R653, JR654-1. CFBP 6374, JR653. Colorado (USA) A. cepa L +.'+ - JR654-1. JR655, CFBP 6376. Colorado (USA) A.cepa L + i + 15959, JS960. JS961. TS962 Georaia (USA) A.cepa L JQ740-1, LMG 16528bg, CFBP Hawaii (USA) A.cepa L 6366b''ehl. CFBP 6369b`3e'. CFBP Texas Si.. (U} 6357'e, JQ759. JR520-1. JR523-1. Venezuela CFBP 6371e, CFBP 6372. CFBP 6373. CFBP 6375 CFBP 6358e, LA_61-18.3X_366-2 JX-3 73-2. LB239-1 S JY317e, CFBP 6379h , JY319e 1Y3205 CFBP 6380bdd" JY2 4. JY275, J 6ba LMG 577, LMG 578. LMG 579;. CFBP 6359bgh. LMG 943. LMG 9487. LMG 9488. LMG 9489. CFBP 6360`. L1IG 9491. LMG 9492, CFBP 6361he, LMG 9494 J~1' 200. CFBP 6381bh' Jx`2.02. CFBP 6382h". JW204. 5W205. CFBP 6383 CFBP 6387b . JX7221. 1X724 1X725. 3X726. CFBP 6388b'. 3X728 CFBP. Collection Française de Bactéries Phytopathogénes. Station de Pathologie Végétale.. Angers. France. BCC MTM/L±BIG, Bacteria collection. Laboratorinuin voor Microbiologie. Universiteit Gent. Belgium; Les autres souches appartiennent à notre collection de laboratoire (3P. Réunion. France). Toutes les souches listées dans ce tableau sont pathogènes de l'oignon. b Souches utilisées pour évaluer les marqueurs RAPD (22 souches). Souches pour lesquelles le marqueur RAPD 80-21 a été cloné et sequençé (4 souches). d Souches utilisées pour évaluer les marqueurs :FFLP (6 souches) . souches) souches). Souches pour lesquelles le fragment AFLP de 238 pb a été cloné et séquence' ( fragment de taille attendue amplifié: -, pas d'amplicon détectable. a Souches pour lesquelles l'ADN a été amplifié par les amorces PXaalU et PXaaIL et séquence h Souches pour lesquelles l'ADN a été amplifié par les amorces PXaa2U and PXaa2L primers et sequençé (28 souches). ' Souches utilisées pour l'analyse de restriction avec CfrI (8 souches). Souches utilisées pour l'analyse de restriction avec \heI (10 souches) ' Souche Pathotvpe TABLEAU I 20 Un exemple de résultat de PCR nichée multiplex est illustré à la Figure 3. La piste 11 représente le contrôle PCR négatif, les pistes 1 à 10 représentent les résultats obtenus pour les souches CFBP 6384, CFBP 6385, CFBP 6380, CFBP 6379, CFBP 6369, CFBP 6107, JY 276, CFBP 6387, CFBP 6368 et CFBP 6381. La piste M correspond aux marqueurs de taille moléculaire. Lors des tests de PCR nichée multiplex réalisés sur les souches saprophytes de l'oignon et sur des souches appartenant à d'autres genres bactériens, aucun produit d'amplification n'a été observé. De même, la majorité des souches de Xanthomonas ne sont pas amplifiées par PCR nichée multiplex. Cependant, il s'est avéré que quelques souches de Xanthomonas axonopodis classifiées dans le sous-groupe génétique 9.2 sensu Rademaker étaient également détectées. En fonction du pathovar, les amplicons du marqueur « PIL » et/ou celui du marqueur « AVR » sont mis en évidence. En outre, les amplicons du marqueur « AVR » sont également détectés pour les souches de Xanthomonas axonopodis pv. begoniae (sous- groupe génétique 9.1 sensu Rademaker). Les résultats obtenus pour les souches saprophytes de l'oignon et les souches appartenant à d'autres genres bactériens testées sont résumés dans le Tableau II ci-dessous. Réponse à la Multiplex nested-PCR Souches' Taxon 694 bpi 444 bp 995 bpi 401 bp ainplicons ampliccms (marqueur PIL) (marqueur Ait R) Sous-groupe génétique 9.2 LMG 667beeh. LMG 668el. LMG 905h. Xanthomonas envesteatona +'+ + + LMG 909, LMG 9101e '. LMG 913beh. LMG 914h_ LMG 922'01. LMG 926e. LMG927'. LMG 929el. LMG 930'f. LMG 931eih. LMG 932e°. LMG 933enl. CFBP 5600"']' JJ23 8-2o. JJ23 8-26. JJ238-2 7. 11235 2Xanthomonas a-tonopoills pv. ottrwneio _YTanihontonas axonopodis pv. aifaifite Xanthmnonas axonopodis pv. rassie-te Xanthomonas axonopodis pv, cassavae Xanthomonas axonopodis pv. ricin/ Xantliomona.s axonopodis pv. coracanae Xanthomonas axonopodis pv. cymnopsidis Xanthomonas axonopodis pv. (lemme/ Xanthomonas axonopodis px-. desmodiigangetici Xanthomonas axonopodis pv. desmodiiromndifohi Xanthomonas axonopodis pc. etythrinae Xanthomonas axonopodts pv. pamlit Xanthomonas axonopodis pv, phyllanthi Xanthomonas axonopochs pv. pomseriirola Xanthomonas axonopoclis pv. tamarmch .Xanthonionas axonopodis pv. lespedelae Xanthoanonas axonopodis pv. begoniae Xanthomonas axonopodis pv. axonopodis .Ka ltiiontonas axonopodis pv. l'a 5 ai'mn Xanthomonas axonopodis 1w. phaseoli - / - + + - / - +i± - / - + : + CFBP 2910hf Xanthomonas axonopodis pv. dtrwneio +/+ LMG 497e. LMG 8019 .LMG 67.5e LMG LMG 861e LMG 686* LMG 691 e LMG 6921'r LMG 693he LMG 694* LMG 698e LMG 811* LMG 84ee LMG 849* LMG 955*' NCPPB 93 ef Sous-groupe génétique 9.1 LMG 551r, LMG 7303bl:e, CFBP 252e Sous-groupe génétique 9.3 LMG 98f. LMG 539 LNIG 901*. LMG 8285 Sous-groupe génétique 9.4 LMG 8014. JR518-3 Réponse à la Multiplex nested-PCR Tacon 694 bp444 bp 995 bpf 401 bp amplicons amplicons (ma queur PIL) (marqueur AVR) .laritftonionas axonopodis pv. {rianifiotis Xanthomonas axorlopoclis pv. a'ieffenbachiae Xanthomonas axonopodis pv. Xanthomonas axonopodis pv_ bauhiniae Xanthomonas coonopodi.s pv. copia . ctntfio{nona' axonopod7s'pv. {tiltngiJ trneindicae Xanthomotias axonopodis p1'. triait'aceW'n/n u antlion'ionas a. onapodis pv. et lani Xanthomonas al:o{opodi.s pv. vigaicola Xanthamon7s honora pv. hederae tanthoanoteas resicatoria Xanthomonas kvacinrht Xanthmnonas broini X inthonlonas fmgartae . antironlonas caa{pesti'is p1'. camp mals Xanthomonas arboricola »glanais' Xanthomonas or :ae pi'. on'zae Xanthomonas cucarbime intf{omo{Tas vas Kola pi'. iocicola ana/ramonas cl-narae Xanthomonas sacahari _Yi nt'roinonu.s cassai'ae Xanthomonas nie;,onis Àaiitiioinonas Xanthomonas Colla Xanthomonas iheicoia kanthonionas aibifineans .Vanthonionas oi7'lae st?1'. on1'- icoia . cuir iomoii Le taux de contamination du lot a été déterminé d'une part par culture sur milieu NCTM1 des macéras purs ou dilués au dixième, et d'autre part par au moins deux analyses des macéras par PCR nichées multiplex après extraction alcaline réalisée comme décrit ci-dessus. Des contrôles négatifs dans lesquels l'échantillon a été remplacé par de l'eau ont été inclus dans les expériences. Dans une autre série d'expériences, le même lot de graines a été mélangé avec des graines d'oignons saines dans une proportion 1 : 1, 1, 1 : 2 et 1 : 12, 8, puis le taux de contamination de deux, deux et trois échantillons indépendants des ces mélanges ont été analysés respectivement par culture sur milieu NCTM1 et PCR nichée multiplex dans les conditions indiquées précédemment. La méthode d'amplification par PCR nichée étant connue pour produire des faux positifs, seuls les échantillons à partir desquels les fragments d'ADN attendus ont été détectés au moins deux fois sont considérés comme positifs. En outre, le taux de contamination déterminé à partir du comptage des boîtes ensemencées et des analyses par PCR nichée multiplex a été calculé selon la méthode décrite par Masmoudi et al. (Seed Sci. Technol. ; 22 : 407-414, 1994). La corrélation entre les taux de contamination déterminés par culture ou par PCR nichée multiplex et le ratio des dilutions graines infectées / graines saines a été calculée en appliquant le coefficient de corrélation de Pearson r (Pearson, K., Biometrika ; 18 : 105-117, 1926). Les résultats de ces études sont reportés dans le Tableau III ci-dessous. TABLEAU III Les deux méthodes d'analyses ont permis la détection de Xanthomonas axonopodis pv. : six et neuf échantillons positifs ont respectivement été mis en évidence par PCR nichée multiplex, ce qui correspond à un taux de contamination moyen de 0,01%, alors que la culture sur milieu NCTM1 n'a permis de détecter que trois et quatre échantillons positifs, ce qui correspond à un taux de contamination de 0,0031%. La série d'expériences réalisées avec le lot de graines mélangé avec des graines d'oignons saines dans une proportion 1 : 1,1, 1 : 2 et 1 : 12,8, correspondant respectivement à des taux de contamination théoriques de 1/21 000, 1/30 000 et 1/138 000, montre que la méthode par PCR nichée multiplex estime de façon précise les taux de contamination : en effet, la corrélation positive r entre le taux de contamination théorique et le taux de contamination déterminé expérimentalement par PCR nichée multiplex est Détection par Isolement sur milieu Nombre de lots MulipplexNested PCR semi-selectif détectés par les 2 méthodes Nbre TC Nbre de TC`, litre de d'éch. de lots lots graines positifs positifs 35 0.00007675 6 0.00004953 4 3 35 0.0001213 9 0.00001183 1 1 0.00010 0,00003068 35 0.00003658 3 0 0 0 35 0.00004953 4 0.00002402 0 0.000043055 0.00001201 Lot de graines P2 Essai 1 35 0.00003658 3 0 0 0 mélangé avec des gram es Essai '2 35 0.00003658 3 0.00001183 1 0 saines (1:2) 1/30000 4 moyenne 0.00003658 0.000005915 Essai 1 35 0 0 0.00001183 1 0 Essai 2 35 0 0 0 0 0 Essai 3 35 0.00003658 3 0.00001183 1 0 moyenne 1.21933E-05 0.0000079 Lot de graines P2 Essai 1 Essai 2 moyenne 1;10ä000' Lot de graines P2 Essai 1 mélangé avec des graines Essai saines (1:1.1) 1/21.0004 moyenne Lot de graines P2 mélangé avec des graines saines (1:12.8) 1./ 138,001) 4 ' Taux de contamination des graines dérivés des analyses par multiplex Nested-PCR b Taux de contamination des graines théoriques obtenus en diluant le lot de graine P2 avec des graines saines Graines saines Essai 2 Essai 1 35 0 Essai 2 35 0 0 0 0 0 0 0 de 0,90. A l'inverse, une telle corrélation n'a pas été observée lorsque l'analyse a été réalisée par culture sur milieu NCTM1. A un taux de contamination déterminé expérimentalement de 1/27 300, la PCR nichée multiplex est positive à chaque essai. Pour les dilutions supérieures, notamment 1/82 000, uniquement un essai sur trois est positif. Le niveau de contamination rapporté pour les épidémies de dépérissement bactérien de l'oignon en milieu tropical étant de 4,5/10 000, la détection par PCR nichée multiplex, avec un seuil de sensibilité de la méthode étant d'environ 1/27 300, est fiable et particulièrement bien adaptée pour certifier les lots de graines d'alliacées. REVENDICATIONS1) Polynucléotide isolé susceptible d'être obtenu à partir de Xanthomonas axonopodis pv. allii, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par : a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 6 ; b) un polynucléotide ayant 85 de préférence 90 et plus préférentiellement 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 ; c) tout fragment d'au moins 15 pb dudit 10 polynucléotide ; d) tout polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides a) ou b) ; e) tout polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes avec l'un des 15 polynucléotides a), b), c) ou d). 2) Couple d'amorces d'amplification utilisables pour l'amplification d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 6, ou d'un fragment de celui-ci. 3) Couple d'amorces selon la revendication 2, 20 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides PXaa2U (SEQ ID NO: 7) ét PXaa2L, (SEQ ID NO: 8) ; le couple d'amorces constitué par les 25 polynucléotides NXaa2U (SEQ ID NO: 9) et NXaa2L, (SEQ ID NO: 10). 4) Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 1, et/ou d'un couple d'amorces selon une quelconque des revendications 2 ou 3, pour la détection de 30 Xanthomonas axonopodis pv. a11ii. 5) Procédé de dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. allii, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence d'ADN d'un échantillon biologique susceptible de contenir ladite bactérie avec un ou 35 plusieurs polynucléotide(s) conforme(s) à l'invention, en conditions permettant une hybridation sélective entre ledit ou lesdits polynucléotide(s) et la séquence cible SEQ ID NO: 6, si celle-ci est présente dans ledit ADN ; - la détection de ladite hybridation. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) la mise en présence de l'ADN d'un échantillon biologique à tester avec un couple d'amorces conformes à l'invention, en conditions permettant une hybridation sélective entre les amorces et la séquence cible SEQ ID NO: 6 ; ii) la réalisation d'une réaction d'amplification en chaîne par polymérase dans des conditions permettant l'amplification de la séquence cible SEQ ID NO: 6 ; iii) la détection du produit d'amplification. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape iv) qui est une amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un second couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment interne du produit d'amplification de l'étape ii). 8) Procédé selon une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'ADN de l'échantillon est en outre mis en présence d'au moins un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec la séquence cible SEQ ID NO : 5. 9) Procédé selon une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que à l'étape i) l'ADN de l'échantillon est en outre mis en présence d'un ou plusieurs polynucléotide(s) capable(s) de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec la séquence cible SEQ ID NO : 5, et en ce que les conditions de l'étape ii) permettent, outre l'amplification de la séquence cible SEQ ID NO: 6, l'amplification de la séquence cible SEQ ID NO: 5. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape d'amplification iv) est réalisée en outre en présence d'un couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment interne du produit d'amplification de la première étape d'amplification du polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 5. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape d'amplification ii) est réalisée avec le couple d'amorces PXaa1U (SEQ ID NO: 1) et PXaalL, (SEQ ID NO: 2) et le couple d'amorces PXaa2U (SEQ ID NO: 7) et PXaa2L, (SEQ ID NO: 8), et en ce que l'étape d'amplification iv) est réalisée avec le couple d'amorces NXaalU (SEQ ID NO: 3) et NXaa1L, (SEQ ID NO: 4) et le couple d'amorces NXaa2U (SEQ ID NO: 9) et NXaa2L (SEQ ID NO: 10). 12) Procédé selon une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est une graine d'alliacée. 13) Kit de détection de Xanthomonas axonopodis pv. allii caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs polynculéotide(s) tel (s) que défini (s) aux revendications 1 à 3./5 1 ATTATCCGCG CATTGTCGAC GGCGTGCATG CCGAAACGAA GTGCAGATGC GCTAGCCAAG TAATAGGCGC GTAACAGCTG CCGCACGTAC GGCTTTGCTT CACGTCTACG CGATCGGTTC 61 CATAGCGCTC CATGGCACCG CCAAGCGCCA GTGCAAACAA CCGGTATGTC GACCCGAGGT GTATCGCGAG GTACCGTGGC GGTTCGCCGT CACGTTTGTT GGCCATACAG CTGGGCTCCA 121 GTGCTGCGTC CAATGCGACT AATCCACGGC CGTGGCCCGG CTTTTTTGGG GTCGGTTAGT CACGACGCAG GTTACGCTGA TTAGGTGCCG GCACCGGGCC GAAAAAACCC CAGCCAATCA 181 CACCGAACAT CAGTTGCGCA GATCACTCTT CAGTGTGAAT TAGTGTCGCT TATCTGTAGT GTGGCTTGTA GTCAACGCGT CTAGTGAGAA GTCACACTTA ATCACAGCGA ATAGACATCA 241 GCTTCGTTCA GGGTTTTTCA GCTTTTCGCA TTATTGCCTA GATCTTCGCG CAACGAAACC CGAAGCAAGT CCCAAAAAGT CGAAAAGCGT AATAACGGAT CTAGAAGCGC GTTGCTTTGG 301 GAGTTCTTCG ATTAGCGCGA TCTAATATAT GTGCGACTCC ATAAGAGTGC AATTCAGATC CTCAAGAAGC TAATCGCGCT AGATTATATA CACGCTGAGG TATTCTCACG TTAAGTCTAG 361 CATACAAAAA ATGGTGGTAA AAAATGAAGA AATTTTTCAG ATCATTAGGA GTGGGCGGCT GTATGTTTTT TACCACCATT TTTTACTTCT TTAAAAAGTC TAGTAATCCT CACCCGCCGA PXaa2L7 421 CAAGCAGCAG TCGTTTTCAA CATCATATTC CGGAGGCTGA CTCAGCACCC AGCAGTAAGG GTTCGTCGTC AGCAAAAGTT GTAGTATAAG GCCTCCGACT GAGTCGTGGG TCGTCATTCC 481 CGTCTACGCC TCCGGCCTCT CCGCCGCCGG ATTCCCCGCC CAGTAACTCT GCTTTTTCCG GCAGATGCGG AGGCCGGAGA GGCGGCGGCC TAAGGGGCGG GTCATTGAGA CGAAAAAGGC 541 CTCTCCCGAC AAGGCCTCGC AAGAAGGCCG AGGCCTTGTC GGATGCGGTG GAGTCGCGCG GAGAGGGCTG TTCCGGAGCG TTCTTCCGGC TCCGGAACAG CCTACGCCAC CTCAGCGCGC 601 GACATTTAGC CCCGCCAAGC CTGGTCTCCT ATGCCAACGC AACCCTTGAT CAACTGAGGC CTGTAAATCG GGGCGGTTCG GACCAGAGGA TACGGTTGCG TTGGGAACTA GTTGACTCCG 661 GAAATGAACC CATCAGCGAG TCACTTCGGC TGATGGACAT TGAAAATCTC CCCCATCTGG CTTTACTTGG GTAGTCGCTC AGTGAAGCCG ACTACCTGTA ACTTTTAGAG GGGGTAGACC 721 TCCGCTCCTA CGACAATAGA TTGAATAATC TAAACCTGCG CAGCTTCGAC ACTCCGGGGC AGGCGAGGAT GCTGTTATCT AACTTATTAG ATTTGGACGC GTCGAAGCTG TGAGGCCCCG 781 AGTTTTTACA TGACCTGAGT CGCTGGCATA AAACAGGATT GCCATTAAGA GCGGTAGTGC TCAAAAATGT ACTGGACTCA GCGACCGTAT TTTGTCCTAA CGGTAATTCT CGCCATCACG 841 GGCTGGATGA AGACCCTAGG AGATGGCATC GCGTCGCGTT CGACGTGCGC AACCACGAGA CCGACCTACT TCTGGGATCC TCTACCGTAG CGCAGCGCAA GCTGCACGCG TTGGTGCTCT Figure la/5 901 GTGGACACAC GACGATTATC GCATTGGAGC CTGCGTCTGC TTACAATCCG GACCATATGC CACCTGTGTG CTGCTAATAG CGTAACCTCG GACGCAGACG AATGTTAGGC CTGGTATACG NXaa2U 961 CTGGTTTCGT GAAAATGAGA GAAAATCTCA CGTCTCAGTT CGGTAGGAAA ATTTCGTTTG GACCAAAGCA CTTTTACTCT CTTTTAGAGT GCAGAGTCAA GCCATCCTTT TAAAGCAAAC 1021 CTGTGATTGA GGCGGAAGCA CTTAAGTCAA TCGGTGGGTG TGTCATATTT TCTCTTGATT GACACTAACT CCGCCTTCGT GAATTCAGTT AGCCACCCAC ACAGTATAAA AGAGAACTAA 1081 ATGCCCTGGC GGCATACCAG GAAAGAAGCA CCTTTGACCA ATGGCATAAA GATCTTCGAA TACGGGACCG CCGTATGGTC CTTTCTTCGT GGAAACTGGT TACCGTATTT CTAGAAGCTT 1141 AGAAAGGAAA TATCAAGGGG ATGACTCCCG AAAGTCAGCA CCTTAACGAG CTTGGCGTCT TCTTTCCTTT ATAGTTCCCC TACTGAGGGC TTTCAGTCGT GGAATTGCTC GAACCGCAGA 1201 ATTTGCTTAA AGGAACCAGG TTGCTGCCGG CAAACTTCTA CAAGCATGCG CATTCCAGGC TAAACGAATT TCCTTGGTCC AACGACGGCC GTTTGAAGAT GTTCGTACGC GTAAGGTCCG 1261 GCACCATCGA CGAGCTCGAG GCAGATCAGC CTGGCGCGTC GGGTACCGAC GTGAGGTCAG CGTGGTAGCT GCTCGAGCTC CGTCTAGTCG GACCGCGCAG CCCATGGCTG CACTCCAGTC NXaa2L 1321 GCAGAGCCGC TGTCTACAAG GAGTCGCTGA GCCGTAGACT GGAGGAGTTC CAGGTCCAGC CGTCTCGGCG ACAGATGTTC CTCAGCGACT CGGCATCTGA CCTCCTCAAG GTCCAGGTCG PXaa2L 1381 GCGATAAGAC CTACAGCATG TCAATCGAAG CATCCAGAGC TCGAAAGATC CGTCACGCCT CGCTATTCTG GATGTCGTAC AGTTAGCTTC GTAGGTCTCG AGCTTTCTAG GCAGTGCGGA 1441 TAGAATCCTG AGACAATTAC CAAATATTAT TTACTTTCCT TACCTTCACA GGCCCGCTTC ATCTTAGGAC TCTGTTAATG GTTTATAATA AATGAAAGGA ATGGAAGTGT CCGGGCGAAG 1501 CCAGCGGGCT TTTTTTCGGT ATGTAATAAG GCGACCCTGA TGGAAAGCGC AACGGCAGGC GGTCGCCCGA AAAAAAGCCA TACATTATTC CGCTGGGACT ACCTTTCGCG TTGCCGTCCG 1561 TTGTCGAATG AGGTTTGCTG TGTCTGAAGG GCTTGTCGCT ACGCCAGGCA GGATCATCCA AACAGCTTAC TCGAAACGAC ACAGACTTCC CGAACAGCGA TGCGGTCCGT CCTAGTAGGT 1621 GTGGCAGCAG CTGCCGGCGC ATCGTGACAG ATACGAGAGC GCAAGCGACG TCAGCACTGG CACCGTCGTC GACGGCCGCG TAGCACTGTC TATGCTCTCG CGTTCGCTGC AGTCGTGACC 1681 CGCCGTGTTC TTGGCCATGC CGCGAATCTG AACTTGGTGC AACCAACCTG ACGCTTGATC GCGGCACAAG AACCGGTACG GCGCTTAGAC TTGAACCACG TTGGTTGGAC TGCGAACTAG 1741 GAGGTTCCTT AGCACACCGC AACATTGCGC GGCTGCGGGC GCCGCTGACG TGGGAAATCA CTCCAAGGAA TCGTGTGGCG TTGTAACGCG CCGACGCCCG CTGCGACTGC ACCCTTTAGT Figure lb 2951459 3/5 1801 TCCGCTGCAC TGCGCTCGTT CACCTGGCAC ACGCGCGCAT CTGCGTCTAC CAGCGTTCGC AGGCGACGTG ACGCGAGCAA GTGGACCGTG TGCGCGCGTA GACGCAGATG GTCGCAAGCG 1861 GGTTGCTGCC GGGGCGTTTT CCAGCCTGCG CGGCGAGCCG GCAAGCTCGC CGCGCAGTGT CCAACGACGG CCCCGCAAAA GGTCGGACGC GCCGCTCGGC CGTTCGAGCG GCGCGTCACA 1921 TCAGTTGGCC AACGCCAGAT CCGTCAAC AGTCAACCGG TTGCGGTCTA GGCAGTTG Figure 1c FIGURE 1/5 1 ACGCGCCAGG TACTTCGCCA GGGCAAACGG TAACAGTTGG GGCAACCGCA GGTTCGATTA TGCGCGGTCC ATGAAGCGGT CCCGTTTGCC ATTGTCAACC CCGTTGGCGT CCAAGCTAAT 61 CCGGGCTGCC TGCTGCGATC CAGAACCTGA GCCCGGCGCC GCGGGCTGGG AGCGACATCA GGCCCGACGG ACGACGCTAG GTCTTGGACT CGGGCCGCGG CGCCCGACCC TCGCTGTAGT r 121 TCGTCTTACG GTTTCTTTCC GCTGAGGGGG TTCCTGCCAC GGGCATTGCG GCGGCGGGCT AGCAGAATGC CAAAGAAAGG CGACTCCCCC AAGGACGGTG CCCGTAACGC CGCCGCCCGA PXaa1U 181 CTAATACGAC GTTGACGATG GACGCTACCC GCTGGGCGAG GTTGACGGAT GATGGCGTCG GATTATGCTG CAACTGCTAC CTGCGATGGG CGACCCGCTC CAACTGCCTA CTACCGCAGC 241 CAGCACCGAC GCTGTTCGGA ATCGCGGACT GCGCGCACGC CGATGTGTTT GCAGGCACGA GTCGTGGCTG CGACAAGCCT TAGCGCCTGA CGCGCGTGCG GCTACACAAA CGTCCGTGCT 301 CCACTGCTGG AACAGTGGTG GCCTCAGGAG TAAACCTTGC CGGTCGATAT GTTGTACAGC GGTGACGACC TTGTCACCAC CGGAGTCCTC ATTTGGAACG GCCAGCTATA CAACATGTCG I NXaa1U 361 CCACTGGCCA GACCATGGTG TATCGCGCCG AATCGCTTGT GTATTACGTC GCAAACAATC GGTGACCGGT CTGGTACCAC ATAGCGCGGC TTAGCGAACA CATAATGCAG CGTTTGTTAG 421 CAGATACAGG GGAACCCGCA TTGCGGCGTG CCAGAGCAGG AGGTAACGGC CAGTACACCA GTCTATGTCC CCTTGGGCGT AACGCCGCAC GGTCTCGTCC TCCATTGCCG GTCATGTGGT 481 GCGAGGAACT GGTAGAGGGC ATCGAAAGCC 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ACTAGTAGGA CCGCGCA FIGURE 2/5 444 bp 401 bp FIGURE 3