Brevet FR2948666A1 — publié le 20110204

Méthode de diagnostic d'un cancer et de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu Domaine de l'invention La présente invention concerne des méthodes et des outils utiles pour diagnostiquer un cancer et pour déterminer sa sévérité chez un individu. Arrière-plan technique Dans la lutte contre le cancer, le diagnostic précoce des cancers est un enjeu de taille dans la mesure où l'on estime en général que les chances de guérison d'un cancer sont d'autant plus importantes que celui-ci est pris en charge précocement. Ceci a conduit à la mise en place de programmes de dépistage systématique, comme pour le cancer du sein par exemple. Toutefois, la mise en oeuvre de tels programmes se heurte souvent à la difficulté technique ou au coût élevé du test de diagnostic à réaliser en routine. Dans ce cadre, il est particulièrement intéressant de disposer de marqueurs sérologiques des cancers. Ainsi, il est possible de citer le diagnostic du cancer de la prostate à l'aide de la PSA (Prostate Specific Antigen), dont la concentration sanguine augmente avec la taille de la prostate et est donc indicatrice d'un possible cancer de la prostate (voir par exemple Shariat et al. (2008) Gan. J. Urol. 15:4363-74). Toutefois, de tels marqueurs sont rares à l'heure actuelle et de nombreux cancers ne peuvent bénéficier de ce type d'approche. Le récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) est un régulateur de la coagulation sanguine dont la caractérisation et le clonage du gène sont notamment décrits dans les brevets US 5,695,993 et 5,852,171. EPCR est essentiellement exprimé par dans la membrane des cellules endothéliales à la surface des gros vaisseaux sanguins. Il se lie à la protéine C, ce qui favorise le passage de celle-ci à une forme anti-coagulante active. Ce récepteur peut également exister sous une forme soluble (sEPCR), décrite dans les brevets US 5,804,392 et 6,037,450, à laquelle il manque la partie transmembranaire et la queue cytoplasmique par rapport à la forme membranaire d'EPCR. Cette forme soluble conserve la propriété de se lier à la protéine C, notamment sous sa forme activée, ce qui l'empêche de jouer son rôle anti-coagulant. Il a été montré que la concentration sanguine de sEPCR est indicatrice du niveau d'activité de la thrombine (WO 02/066981) et que lorsque la concentration sanguine de sEPCR est élevée chez un individu, celui-ci présente un risque de thrombose veineuse accru. A ce titre, certains individus porteurs d'un haplotype particulier du gène EPCR, nommé haplotype A3, défini par les quatre nucléotides spécifiques 1651G, 3610T, 4216A et 6936G, présentent une concentration plus élevée que la normale en sEPCR. En particuliers, la présence du G en position 6936 du gène d'EPCR conduit à une substitution de la Sérine en position 219 par une Glycine, ce qui se traduit par un clivage accru de la forme membranaire d'EPCR. Les individus porteurs de l'haplotype A3 sont surreprésentés chez les patients thrombotiques. sEPCR a donc été suggéré comme un marqueur potentiel du risque thrombotique (Saposnik et al. (2004) Blood 103:1311-1318). Il a toutefois été également rapporté une absence d'association forte entre une concentration élevée en sEPCR et un risque accru de thrombose veineuse profonde et qu'une concentration faible en sEPCR semblait réduire le risque de thrombose veineuse profonde (Uitte de Willige et al. (2004) Thromb. Haemost. 2004 2:1305- 1310). Par ailleurs, une autre forme soluble d'EPCR (parfois nommée tEPCR) issue d'un épissage alternatif de l'ARNm d'EPCR qui modifie la partie C-terminale de sEPCR a également été mise en évidence récemment (Saposnik et al. (2008) Blood 111:3442-3451). Elle pourrait également avoir une implication, mais de manière moindre que sEPCR, dans l'augmentation du risque thrombotique. Description de l'invention La présente invention découle, notamment, de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que la concentration plasmatique de la forme soluble du récepteur endothélial de la protéine C (sEPCR), ou du d-dimère, était significativement plus élevée que la normale chez les individus atteints d'un cancer de l'ovaire, du sein ou d'une leucémie, et que cette concentration était corrélée à la masse tumorale, c'est-à-dire à la sévérité du cancer, et à la présence de thromboses. Ainsi, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de diagnostic d'un cancer et/ou de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode de l'invention, on détermine que l'individu n'est pas porteur de l'haplotype A3 du gène EPCR ou qu'il n'est pas atteint d'une vasculite. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode telle que définie ci-dessus comprend les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - mesurer la concentration d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation, tel que les D-dimères ou la fibrine soluble, dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer les concentrations mesurées avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité d'un cancer de l'individu. Par ailleurs, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de diagnostic d'un cancer et/ou de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration en D-dimères dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu. La présente invention concerne également l'utilisation d'EPCR tel que défini ci-dessus, et éventuellement d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation tel que défini ci-dessus, comme marqueur pour le diagnostic in vitro d'un cancer et/ou pour la détermination in vitro de la sévérité d'un cancer chez un individu. La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro d'un cancer, de détermination in vitro de la présence de métastases d'un cancer, ou de détermination du risque de thrombose chez un individu atteint d'un cancer, comprenant : - au moins un moyen de mesure de la concentration d'EPCR tel que défini ci-dessus dans un échantillon biologique, et - au moins un moyen de mesure de la concentration d'un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation tel que défini ci-dessus, dans un échantillon biologique. Ainsi, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de détermination du risque thrombotique chez un individu atteint d'un cancer, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu présente un risque de thrombose. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode telle que définie ci-dessus de détermination du risque thrombotique comprend les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - mesurer la concentration d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation, tel que les D-dimères ou la fibrine soluble, dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer les concentrations mesurées avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu présente un risque de thrombose. Par ailleurs, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, de détermination du risque thrombotique chez un individu atteint d'un cancer, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration en D-dimères dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu. La présente invention concerne également l'utilisation d'EPCR tel que défini ci-dessus, et éventuellement d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation tel que défini ci-dessus, comme marqueur de risque thrombotique chez un individu atteint d'un cancer. Par ailleurs, les inventeurs ont également identifié de nouveaux peptides dérivés d'EPCR utiles pour produire de nouveaux anticorps anti-EPCR permettant notamment de détecter les formes membranaires et solubles d'EPCR. Ainsi, la présente invention concerne également un peptide comprenant ou constitué d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO : 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO : 4), et TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5) et un anticorps anti-EPCR spécifiquement dirigé contre un peptide constitué d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO : 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO : 4), et TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5). En outre, les inventeurs ont pu montrer que l'anticorps spécifiquement dirigé contre le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5) présentait des propriétés d'inhibition de l'invasion d'une matrice extracellulaire artificielle par des cellules tumorales. En conséquence, la présente invention concerne également un ligand spécifique du peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), en particulier l'anticorps spécifiquement dirigé contre le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), ou un fragment de celui-ci, pour son utilisation à titre de médicament, notamment pour le traitement des cancers. En d'autres termes, l'invention concerne également une méthode pour le traitement du cancer chez un individu qui consiste à administrer à l'individu une quantité thérapeutiquement efficace d'un ligand spécifique du peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5), en particulier de l'anticorps spécifiquement dirigé contre le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), ou d'un fragment de celui-ci. La présente invention concerne également le peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) pour son utilisation à titre de médicament, notamment pour le traitement, en particulier par vaccination, des cancers. En d'autres termes, l'invention concerne également une méthode pour le traitement du cancer chez individu qui consiste à administrer à l'individu une quantité thérapeutiquement efficace du peptide de séquence TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), ou d'un fragment de celui-ci. Les inventeurs ont également isolé de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour EPCR dans des cellules tumorales. Ainsi, la présente invention concerne également les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO : 6, 7, 8. Comme on l'entend ici, l'expression � sévérité d'un cancer � se rapporte préférentiellement à la masse tumorale totale dudit cancer. Cette masse tumorale totale comprend notamment, dans le cas de tumeurs solides, la ou les tumeur(s) principale(s) ainsi que les éventuelles métastases, et dans le cas des tumeurs non-solides, l'ensemble des cellules cancéreuses ou tumorales. Les cancers selon l'invention, qu'il s'agisse des cancers pour lesquels on souhaite établir un diagnostic ou en déterminer la sévérité, ou des cancers caractérisant un � individu atteint d'un cancer � tel que défini ci-dessus, peuvent désigner tout type de néoplasme, on préfère toutefois, qu'il s'agisse d'un adénocarcinome, d'une hémopathie maligne, d'un sarcome ou d'un cancer carcinoïde. Par ailleurs, on préfère tout particulièrement que le cancer soit sélectionné dans le groupe constitué d'une leucémie, d'un cancer du sein, d'un cancer de l'ovaire, d'un cancer du poumon, d'un cancer de la prostate, d'un cancer de la thyroïde, d'un cancer du pancréas, d'un cancer du rein, d'un cancer du foie, et d'un cancer de l'oesophage. Comme on l'entend ici, les expressions � risque de thrombose � et � risque thrombotique � sont synonymes et désignent notamment un risque accru de présenter une thrombose par rapport à un individu présentant un cancer de même type mais ayant une concentration d'EPCR en deçà de la ou des valeurs seuils. En particulier, la méthode de détermination du risque de thrombose telle que définie ci- dessus est une méthode de détermination du risque de survenue du syndrome de Trousseau chez un individu atteint d'un cancer. Le syndrome de Trousseau est bien connu de l'homme du métier et est en général associé à une thrombose veineuse et/ou à une hypercoagulation chez les patients atteints d'un cancer, notamment d'un adénocarcinome des poumons ou du pancréas. Le récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) ainsi que la façon de mesurer sa concentration, ou de le doser, sont bien connus de l'homme du métier. De préférence, on mesure la concentration d'une forme soluble d'EPCR (sEPCR). Les formes soluble d'EPCR sont bien connues de l'homme du métier et sont préférentiellement celles obtenues par clivage de la forme membranaire de sEPCR. Par ailleurs, on préfère que l'EPCR mesuré selon l'invention ne comprennent pas SEQ ID NO: 2. Ainsi, à titre d'exemple, un sEPCR dont on mesure préférentiellement la concentration selon l'invention est représenté par SEQ ID NO : 1. Les méthodes de dosage ou de détermination de la concentration d'EPCR, notamment de sEPCR, dans un échantillon biologique font notamment appel à un dosage de type ELISA, tel que celui-décrit par Esmon et al. (1999) Haematologica 84:363-368 ou Stearns-Kurosawa et al. (2002) Blood 99:526-530 .ou au kit ELISA sEPCR Asserachrom� (Diagnostica Stago, Asnières, France). De préférence, dans la méthode selon l'invention, on détermine si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité d'un cancer de l'individu, lorsque la concentration mesurée d'EPCR tel que défini ci-dessus est supérieure à une ou plusieurs valeurs seuils. La ou les valeurs seuils telles que définies ci-dessus peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier et peuvent notamment correspondre à la valeur normale d'EPCR dans une population d'individus sains. Lorsqu'on veut déterminer la sévérité d'un cancer, la ou les valeurs seuils peuvent être la concentration moyenne d'EPCR tel que défini ci-dessus chez des individus présentant un cancer à un stade déterminé ou en deçà d'un stade déterminé. Par ailleurs, lorsqu'on souhaite déterminer le risque thrombotique la ou les valeurs seuils peuvent être la concentration moyenne d'EPCR tel que défini ci-dessus chez des individus présentant un cancer du même type. En particulier, la ou les valeurs seuils peuvent être d'au moins 65 ng/ml, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL, ou 500 ng/mL. A ce titre, déterminer que l'individu n'est pas porteur de l'haplotype A3 du gène EPCR permet notamment de s'assurer que la concentration mesurée pour sEPCR n'est pas d'origine génétique. Cette détermination peut être aisément effectuée par l'homme du métier par les techniques de biologie moléculaire classique. Il peut notamment procéder comme cela est décrit dans Saposnik et al. (2004) Blood 103:1311-1318. Par ailleurs, il peut également être utile de déterminer que l'individu n'est pas atteint d'une vasculite, dans la mesure où cette maladie peut avoir pour conséquence une augmentation de la concentration de sEPCR. L'homme du métier sait comment diagnostiquer une vasculite. Comme on l'entend ici, � un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation � se réfère à tout composé mesurable dans un échantillon biologique ayant un rôle direct ou indirect dans la formation ou la destruction du caillot sanguin. Ainsi, lorsqu'un marqueur additionnel est utilisé dans la méthode selon l'invention celui-ci est de préférence sélectionné dans le groupe constitué des D-dimères et de la fibrine soluble. De manière particulièrement préférée, le marqueur additionnel est constitué des D-dimères. Les D-dimères ainsi que la façon de mesurer leur concentration, ou de les doser, sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans Mirshahi et al. (1986) Thromb. Res. 44:715-728. De préférence, on choisit une méthode de dosage impliquant l'action de l'activateur tissulaire du plasminogène (t- PA) dans des conditions telles que seule la fibrine (et non le fibrinogène) soit dégradée. La fibrine soluble, ainsi que la façon de mesurer sa concentration, ou de la doser, sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans la demande US 2003/175,839. Là encore, la ou les valeurs seuils pour le marqueur additionnel et pour les D-dimères, peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier, notamment comme cela a été indiqué ci-dessus pour EPCR. A titre d'exemple, la ou les valeurs seuils pour les D-dimères peuvent notamment être d'au moins 500 ng/mL ou 1000 ng/ml et la ou les valeurs seuils pour la fibrine soluble peuvent être d'au moins 300 ng/mL. Selon un mode de réalisation préférentiel de la méthode de l'invention, la concentration d'EPCR et la concentration du marqueur additionnel sont mesurées dans le même échantillon biologique. Par ailleurs, l'échantillon biologique tel que défini ci-dessus est de préférence sélectionné dans le groupe constitué d'un échantillon de sang, notamment de sang total, d'un échantillon de plasma, d'un échantillon de sérum, et d'un échantillon d'épanchement d'organe. Comme on l'entend ici, lorsque les peptides selon l'invention comprennent une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO: 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO: 4), et TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5), on comprendra que ces peptides sont tels qu'ils ne reconstituent pas une portion de la séquence d'EPCR englobant ces séquences. Comme on l'entend ici � un ligand spécifique d'un peptide � peut être de toute nature dans la mesure où il ne se lie essentiellement pas avec un peptide qui ne comprend pas ou qui n'est pas constitué dudit peptide cible. De préférence, le ligand est un anticorps, un fragment d'anticorps, un aptamère, ou un peptide obtenu par � phage display �. Par ailleurs, un anticorps est spécifique d'un peptide cible s'il ne se lie essentiellement pas avec un peptide qui ne comprend pas ou qui n'est pas constitué dudit peptide cible. Cela signifie également que l'épitope reconnu par l'anticorps est compris dans le peptide cible. En outre, il sera clair pour l'homme du métier que les fragments d'anticorps selon l'invention, sont tels qu'ils conservent la propriété de se lier spécifiquement au même peptide que l'anticorps dont ils dérivent, c'est-à-dire qu'ils comprennent la partie de liaison à l'antigène. De tels fragments sont notamment des fragments Fab, F(ab')2, et scFv Comme on l'entend ici, un � anticorps �, peut appartenir à n'importe quelle espèce, et est notamment un anticorps humain, de souris, de rat, de chèvre ou de Camelidae. L'anticorps peut également être un anticorps chimérique, c'est-à-dire un anticorps constitué de parties provenant de différentes espèces. Les anticorps chimériques préférés sont dits humanisés, dans lesquels les parties constantes (notamment CH et CL) sont d'origine humaine et les parties variables (VH et VL) ou les CDR des parties variables sont d'une autre espèce, la souris par exemple. L'anticorps peut être produit par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par immunisation d'un animal ou par de méthodes recombinantes ou chimiques. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal, notamment un anticorps polyclonal monospécifique, ou un anticorps monoclonal. Les "aptamères" sont bien connus de l'homme du métier. Ils peuvent être de nature nucléotidique comme décrit notamment par Ellington et al. (1990) Nature 346:818-22 et Bock et al. (1992) Nature 355:564-6, ou de nature peptidique, comme décrits, notamment, par Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78:426-30. La méthode dite du "phage display" est une méthode de sélection de ligands polypeptidiques exprimés sur la capside d'un bactériophage et codés par une séquence nucléotidique insérée dans le gène codant la capside. Cette méthode est bien connue de l'homme du métier et est notamment décrite par Scott & Smith (1990) Science 249:386-390, et Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597. De préférence, le polypeptide obtenu par phage display est un polypeptide du type scFv (pour � single-chain variable fragment �), comme cela est notamment décrit par Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. De préférence, dans le kit de diagnostic tel que défini ci-dessus, le moyen de mesure de la concentration d'EPCR est un ligand tel que défini ci-dessus. De même, dans la méthode selon l'invention, la concentration d'EPCR tel que défini ci-dessus dans un échantillon biologique de l'individu est mesurée à l'aide d'un ligand tel que défini ci-dessus. L'invention sera davantage explicitée à l'aide des figures et des exemples qui suivent. Description des figures Figure 1 : distribution de la concentration de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints d'adénocarcinomes mammaires non-métastasiques. La valeur plasmatique normale estimée à 100 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 2 : distribution de la concentration de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints d'adénocarcinomes mammaires métastasiques. La valeur plasmatique normale estimée à 100 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 3 : Distribution des concentrations plasmatiques de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints de différentes hémopathies malignes (leucémie aiguë lymphoïde (LAL), leucémie aiguë myéloïde (LAM), leucémie lymphoïde chronique (LLC), leucémie myéloïde chronique (LMC), lymphome et myélome multiple (MM), éventuellement en rémission (rem)). La valeur plasmatique normale estimée à 100 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 4 : Distribution des concentrations plasmatiques de D-dimères (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints de différentes hémopathies malignes (leucémie aiguë lymphoïde (LAL), leucémie aiguë myéloïde (LAM), leucémie lymphoïde chronique (LLC), leucémie myéloïde chronique (LMC), lymphome et myélome multiple (MM), éventuellement en rémission (rem)). La valeur plasmatique normale estimée à 500 ng/mL est représentée par un trait horizontal. Figure 5 : Distribution des concentrations plasmatiques de sEPCR (axe des ordonnées, en ng/mL) dans des échantillons de plasma de patients atteints d'hémopathies malignes (losanges) et dans des échantillons de plasma de patients atteints d'hémopathies malignes et de thrombose (croix). Les traits horizontaux marquent la moyenne. 11 Exemples Exemple 1 Dosage de sEPCR dans des plasmas de patients atteints de néoplasies malignes 5 Un protocole d'observation préliminaire a été effectué sur des patients atteints de néoplasies malignes. Plusieurs facteurs hémostatiques ont été dosés dans le plasma de ces patients et les résultats ont été analysés suivant leur pathologie et comparés à des volontaires sains. 10 Le dosage a été réalisé avec le kit ASSERACHROM� sEPCR (Dagnostica Stago, Asnière, France) en suivant le protocole du fournisseur. Cette étude a permis de montrer que quelle que soit l'atteinte néoplasique, la concentration plasmatique de sEPCR est augmentée chez 57% des patients (n=64). De plus, principalement pour les cancers du sein, la quantité d'EPCR soluble semble 15 augmenter avec la sévérité de la maladie ; les concentrations plasmatiques de sEPCR des patients atteints de métastases étant plus conséquentes que celles de patients non métastasés (Ficiures 1 et 2). Par ailleurs, 2 autres marqueurs de thrombose liés à la production de fibrine (fibrine soluble) et à la fibrinolyse secondaire à la formation de fibrine (D-dimères) ont 20 été dosés en parallèle. On observe que les valeurs de D-dimères sont très souvent augmentées chez les patients cancéreux car ils sont souvent le reflet de la dégradation péri-tumorale de la fibrine, tandis que les concentrations élevées plasmatiques de fibrine soluble sont le témoin d'une thrombose chez ces malades.. 25 Exemple 2 Dosage de sEPCR dans des plasmas de patients atteints d'hémopathies malignes Les plasmas de 167 patients de l'Hôtel Dieu (Paris, France) atteints ou en rémission (rem) de leucémie aigue lymphoïde (LAL), de leucémie aigue myéloïde 30 (LAM), de leucémie lymphoïde chronique (LLC), de leucémie myéloïde chronique (LMC), de lymphome et de myélome multiple (MM) ont été collectés et les valeur de D-dimères et de sEPCR ont été évaluées par dosage ELISA. Le dosage de sEPCR a été réalisé comme indiqué dans l'Exemple 1, le dosage des D-dimères a été réalisé en utilisant le système semi-automatique 12 StaliaD-Di (Diagnostica Stago, Asnieres, France), conformément aux recommandations du fournisseur. Sur 167 patients dosés, 117 (70%) présentent une concentration d'EPCRs 5 supérieure à la norme plasmatique estimée à 100 ng/mL et 34 (20,4%) ont une concentration d'EPCRs supérieure à 200 ng/mL (Figure 3). Le dosage de d-dimère a été réalisé sur les prélèvements médullaires de 80 patients. 77 (96,3%) patients présentent une concentration de D-dimères supérieure à la norme plasmatique de 500 ng/mL et 47 (58,8%) ont une concentration 10 supérieure à 1000 ng/mL (Figure 4) Par ailleurs, le dosage de sEPCR et des D-dimères dans les plasmas de patients atteints d'hémopathies malignes, confirme que les concentrations de ces marqueurs sont plus élevées que la norme chez ces individus et indique également que les concentrations de ces marqueurs sont encore plus élevées dans une sous- 15 population de ces patients constituée des patients thrombophiles (Figure 5, Tableau 1). sEPCR Patients analysés Patients thrombophiles Total 127 15 [sEPCR] 200 ng/ml 24 (19%) 5 (33%) [sEPCR] moyenne 167,9 ng/ml 244,6 ng/ml D-dimères Total 63 6 [D-dimères] 1000 ng/ml 36 (57%) 4 (67%) [D-dimères] moyenne 1051,7 ng/ml 1004,2 ng/ml Tableau 1 : concentrations plasmatique et médullaire en sEPCR et en D-dimères dans une population d'individus atteints d'hémopathies malignes (population totale et sous-population thrombophile) Il est à noter que la concentration moyenne plasmatique de sEPCR chez des individus sains a été déterminée comme étant inférieure à 65 ng/mI. Par raison de commodité la valeur normale a toutefois été estimée à 100 ng/ml dans le cadre de la présente étude. 20 Exemple 3 Préparation d'anticorps anti-EPCR Production des anticorps spécifiques de ces peptides. Les peptides suivants ont été synthétisés par AGRO-BIO (La Ferté St Aubin, France) : GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO : 3) IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO : 4) TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5) Ces peptides ont été ensuite couplés à une protéine carrier (KLH) et injectés à 5 reprise, toutes les deux semaines, en présence d'adjuvant de Freund à des lapins blancs de Nouvelle Zélande (150 à 300 pg par injection). La cinquième injection des antigènes a eu lieu le 56ème jour et les sérums de lapins ont été prélevés le 77ème jour, aliquotés puis conservés à -20°C. Test des anticorps spécifiques des peptides. Des examens immunocytochimiques visant à détecter la présence d'EPCR sur différente lignées cellulaires ont été réalisés : à cet effet, les cellules étalées sur des lames ont été fixées à l'aide de formol à 4% pendant 5 min puis incubées avec l'anticorps dirigé contre EPCR pendant 1 h. les frottis cellulaires ont ensuite été lavées et la fixation de l'anticorps a été détectée à l'aide d'un anticorps anti-Ig de lapin marqué à la peroxydase. Après lavage du frottis, la révélation est effectuée à l'aide d'une solution de tétra-méthyl-benzidine (TMB) et d'H2O2. Les examens immunocytochimiques ont été réalisés sur plusieurs types cellulaires (cellules endothéliales et épithéliales), notamment sur la lignée d'adénocarcinome mammaire MDA-MB231, et montrent que les anticorps obtenus se fixent sur les cellules exprimant l'EPCR. Des résultats similaires ont pu être été obtenu avec 2 anticorps commerciaux spécifique d'EPCR : AF2245 de R&D system et 552500 de BD pharmingen. Par ailleurs, les cellules MDA-MB231 ont été cultivées sur MatrigelTM (BD Biosciences), une matrice extracellulaire artificielle qui recrée le milieu naturel des 14 cellules, essentiellement comme décrit par Kleinman et al. (1982) Biochemistry 21:6188 On observe que les cellules MDA-MB231 s'organisent naturellement en réseaux pseudo-tubulaires. La densité de ces réseaux (nombre d'interconnection cellulaire) est significativement augmentée par une incubation avec la Protéine C Activée (PCA). Ces effets pro-invasifs induit par la PCA sont abolis par la présence, dans le milieu de culture (sérum dilué au 1/1000), de l'anticorps dirigé contre le peptide TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO: 5) qui présente donc une activité neutralisante. Par comparaison, aucune activité neutralisante n'a pu être démontrée pour les anticorps dirigés contre les deux autres peptides (les résultats obtenus sont similaires à ceux observés avec un anticorps neutralisant l'activation de PAR-1). Exemple 4 Identification de séquences nucléotidiques codant EPCR spécifiques de cellules cancéreuses Le gène codant EPCR ainsi que ses transcrits provenant de lignées de cellules de cancers du sein, de l'ovaire, du colon, du poumon et de leucémie promyéolicytaire ont été séquencés. Les résultats indiquent que ces séquences sont hautement conservées par rapport aux séquences de référence d'origine endothéliale. En particulier, les polymorphismes d'un nucléotide décrits dans la séquence de référence sont retrouvés dans les cellules néoplasiques, ce qui permet de caractériser l'haplotype EPCR de ces cellules (Tableaux 2 et 3). On observe ainsi que la fréquence de l'haplotype A3, corrélé à une solubilisation accrue du récepteur, est nettement plus élevée que celle observée dans la population générale. De plus, des polymorphismes supplémentaires, non décrits dans la séquence de référence, sont spécifiquement détectés dans les régions non transcrites des gènes provenant des cellules de carcinomes mammaire (MDA-MB231) et ovarien (OVCAR), et de leucémie aiguë promyélocytaire (HL60), ce qui peut permettre d'identifier ces cellules cancéreuses. Les séquences génomiques correspondantes sont respectivement représentées par SEQ ID NO : 6, 7 et 8. Ainsi, une insertion d'un T est retrouvée dans la partie 5' UTR en position 260 pour MDA-MB231, OVCAR et HL60 ; une délétion d'un A est retrouvée dans la partie 5' UTR en position 840 pour MDA-MB231 et HL60 ; une amplification de T dans la région non codante de l'exon IV en position 7650 ; le remplacement de G en position 7965 par C et le remplacement de T en position 8153 par C dans la partie 3' UTR. SNPs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Locus(pb) 1651 3610 3787 3877 4216 4868 5230 5760 6333 6936 7014 7968 7999 MDA- C C/T C/T A/G x C/T A/G x C/T A/G x A/G A/G M B231 OVCAR C C/T C G x T G T T A/G G A G HL60 C T C/T A/G x C/T A/G C/T C/T A C/G A/G A/G Haplotype Al C T T A C C A C C A C G A A2 C T C G G T G T T A G A G A3 G C C G A T G T T G G A G Tableau 2 : localisation des SNPs dans la séquence génomique du gène EPCR pour les lignées cellulaires indiquées. Les haplotypes Al, A2 et A3 sont indiqués pour référence. X indique un incertitude sur le nucléotide. SNPs 10 11 Haplotype Locus (pb) 738 816 MDA-MB231 A/G X Al /A3 OVCAR A/G G A2/A3 A549 G G A3/A3 HCT-8 A G A2/A2 HT-29 A G A2/A2 H L60 A C/G Al/A2 Al A C A2 A G A3 G G 10 Tableau 3 : localisation des SNPs dans la séquence exonique du gène EPCR pour les lignées cellulaires indiquées. Les haplotypes A1, A2 et A3 sont indiqués pour référence5 Revendications1. Méthode in vitro de diagnostic d'un cancer et/ou de détermination de la sévérité d'un cancer chez un individu, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer la concentration mesurée avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité du cancer de l'individu. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle on mesure la concentration d'une forme soluble d'EPCR (sEPCR). 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la séquence de l'EPCR de l'individu ne comprend pas la séquence représentée par SEQ ID NO: 2. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle on détermine que l'individu n'est pas porteur de l'haplotype A3 du gène EPCR ou qu'il n'est pas atteint d'une vasculite. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle le cancer est un adénocarcinome, une hémopathie maligne, un sarcome, ou un cancer carcinoïde. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le cancer est 25 sélectionné dans le groupe constitué d'une leucémie, d'un cancer du sein, d'un cancer de l'ovaire, d'un cancer du poumon, d'un cancer de la prostate, d'un cancer de la thyroïde, d'un cancer du pancréas, d'un cancer du rein, d'un cancer du foie, et d'un cancer de l'oesophage. 30 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle on détermine si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité d'un cancer de l'individu lorsque la concentration mesurée est supérieure à une ou plusieurs valeurs seuils.20 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle la valeur seuil pour déterminer si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité d'un cancer chez un individu est d'au moins 100 ng/ml. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, comprenant les étapes suivantes : - mesurer la concentration du récepteur endothélial de la protéine C (EPCR) dans un échantillon biologique de l'individu ; - mesurer la concentration d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation dans un échantillon biologique de l'individu ; - comparer les concentrations mesurées avec une ou plusieurs valeurs seuils ; - déterminer, à partir de la comparaison effectuée à l'étape précédente, si l'individu souffre d'un cancer et/ou la sévérité d'un cancer de l'individu. 10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle le marqueur additionnel est sélectionné dans le groupe constitué des D-dimères et de la fibrine soluble 11. Méthode selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle le marqueur additionnel est le d-dimère. 12. Méthode selon l'une des revendications 9 à 11, dans laquelle la concentration d'EPCR et la concentration du marqueur additionnel sont mesurées dans le même échantillon biologique. 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, dans laquelle échantillon biologique est sélectionné dans le groupe constitué d'un échantillon de sang, d'un échantillon de plasma, d'un échantillon de sérum, et d'un échantillon d'épanchement d'organe. 14. Utilisation d'EPCR tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3, comme marqueur pour le diagnostic in vitro d'un cancer et/ou pour la détermination in vitro de la sévérité d'un cancer chez un individu. 15. Utilisation selon la revendication 14 d'EPCR tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3 et d'au moins un marqueur additionnel de fibrinolyse ou decoagulation tel que défini dans les revendications 9 à 11, comme marqueurs pour le diagnostic in vitro d'un cancer et/ou pour la détermination in vitro de la sévérité d'un cancer chez un individu. 16. Peptide ayant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de GGHLTHVLEGPDTNTTIIQL (SEQ ID NO : 3), IQLQPLQEPESWARTQSGLQ (SEQ ID NO : 4), et TSGVVTFTLQQLNAYNRTRY (SEQ ID NO : 5). 17. Anticorps anti-EPCR spécifiquement dirigé contre un peptide tel que défini dans la revendication 16, ou un fragment de celui-ci. 18. Kit de diagnostic in vitro d'un cancer ou de détermination in vitro de la présence de métastases d'un cancer, comprenant : - au moins un moyen de mesure de la concentration d'EPCR tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3, dans un échantillon biologique, et - au moins un moyen de mesure de la concentration d'un marqueur additionnel de fibrinolyse ou de coagulation tel que défini dans les revendications 9 à 11, dans un échantillon biologique. 19. Kit de diagnostic selon la revendication 18, dans lequel le moyen de mesure de la concentration d'EPCR est un anticorps tel que défini dans la revendication 17, ou un fragment de celui-ci. 20. Méthode selon l'une des revendications 1 à 13, dans laquelle la concentration d'EPCR dans un échantillon biologique de l'individu est mesurée à l'aide d'un anticorps tel que défini dans la revendication 17, ou un fragment de celui-ci.