Brevet FR2953530A1 — publié le 20110610

Procédé d'identification rapide des virus par spectrométrie de masse La présente invention concerne un nouveau procédé d'identification des virus par spectrométrie de masse, contribuant à réduire de façon significative les délais d'identification de ces microorganismes. L'identification et la détection des virus se fait classiquement par l'étude morphologique en microscopie électronique, par utilisation d'anticorps spécifiques et par l'amplification de gènes spécifiques. Avant la présente invention, la spectrométrie de masse n'avait été utilisée, notamment dans WO 98 09314, EP 1 253 622, que pour l'identification de bactéries et levures mais jamais pour les virus. Les publications suggéraient que dans les spectres obtenus, les pics caractéristiques de plus grandes intensité étaient associés à des protéines ribosomales alors que les virus ne comprennent pas ce type de protéine mais seulement des protéines de capside en quantités réduites par rapport aux protéines ribosomales de bactéries et levures. Les virus sont des organismes relativement simples avec des génomes de taille réduite codant ainsi pour peu de protéines dont in fine une faible quantité seulement se retrouve dans la particule virale. Les protéines les plus importantes quantitativement et donc celles potentiellement facilement détectable en spectrométrie de masse, sont les protéines structurales, notamment les protéines qui composent la capside. Les acides nucléiques des virus représentent ainsi une fraction importante des molécules ionisables dans les virus. En outre, les virus requièrent des cultures dans des organismes ou cellules hôtes, les milieux de culture et/ou organismes ou cellules hôtes pouvant contaminer l'échantillon analysé et rendre plus difficile la détermination des pics caractéristiques du virus. Toutefois, on a découvert selon la présente invention que l'identification par spectrométrie de masse était possible à partir de prélèvements cliniques car, lors d'infection virale, la charge en virus peut être très élevée avec des titres pouvant atteindre 109 particules par ml. Ainsi, on a découvert que bien que le virus se caractérise par un nombre réduit de protéines, il est possible, sous réserve d'une purification du virus , d'obtenir des spectres de spectrométrie de masse des virus purifiés avec des pics caractéristiques de grandes intensités et en moins grand nombre, vraisemblablement à cause des grandes quantités de copies pour chaque élément protéique ou nucléotidique détectable. La présente invention concerne un procédé d'identification de virus caractérisé en ce que l'on réalise l'analyse par spectrométrie de masse d'une suspension contenant un virus obtenu à partir d'une culture, notamment provenant d'un prélèvement clinique où il est en quantité suffisante, de préférence une préparation de virus purifié. On réalise un spectre par la spectrométrie de masse par Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation Time of Flight (MALDI TOF MS) sur des virus purifiés pour établir des spectres de référence de virus. De façon connue, cette analyse consiste à ioniser les molécules fixées sur une plaque métallique, à l'aide d'un faisceau laser, cette ionisation étant autorisée par l'ajout d'une solution dite matrice, notamment une solution d'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique. Les molécules ainsi ionisées vont, ensuite, migrer dans du vide et être détectées par une plaque, leur temps de vol dans le vide dépendant du rapport m/z (masse/charge). Pour identifier un virus, on recherche un ou plusieurs pics spécifiques du virus composant éventuellement un spectre dans un prélèvement clinique, un surnageant de culture ou, de préférence, une suspension de virus purifié. Cette méthode d'identification de virus est particulièrement avantageuse de par sa rapidité, puisque l'on gagne de 4 heures à plusieurs jours par rapport à une identification conventionnelle. De façon connue, un pic est défini par une paire de coordonnées, composée d'une masse (m) ou d'un rapport masse/charge (m/z) en tant que coordonnée x et d'une intensité absolue relative en tant que coordonnée y. Le composant viral détecté peut être une protéine, un peptide, un acide ribonucléique ou un lipide. De façon connue, la comparaison est effectuée visuellement et/ou par ordinateur et le signal spécifique ou le spectre peut être comparé aux spectres de référence par intervention d'un coefficient additionnel ou multiplicateur de pondération permettant de rattraper un éventuel décalage de spectre. Dans EP 1 253 622, on décrit comment effectuer une réduction du nombre de signaux pour ne prendre en compte que les pics les plus caractéristiques du microorganisme. Plus précisément, la présente invention fournit un procédé d'identification d'un virus présent dans un échantillon biologique et/ou un prélèvement clinique de patient contenant un virus dans un organisme ou cellule hôte caractérisé en ce que l'on réalise les étapes successives dans lesquelles : 1/ On réalise une préparation contenant ledit virus à partir dudit échantillon biologique et/ou un prélèvement clinique, par extraction 25 dudit virus de son organisme ou cellule hôte, et 2/ on réalise au moins un spectre d'une préparation de virus purifié par spectrométrie de masse, de préférence par spectrométrie de masse dite MALDI TOF MS (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation Time of Flight), et 3/ On compare le spectre obtenu à l'étape 2/ avec : - au moins un spectre de référence dudit virus purifié, préalablement réalisé, si on recherche seulement à identifier un virus particulier connu, ou - une pluralité de spectres préalablement réalisés de différents virus de référence purifiés connus constituant une banque de spectres de référence de dits différents virus purifiés connus, si on cherche à identifier si le virus fait partie des virus de référence dont le spectre est inclus dans la banque de spectres de référence, et 4/ On identifie le virus extrait à l'étape 1/ ci-dessus comme étant un desdits virus de référence si on retrouve dans son spectre de l'étape 2/ ci-dessus, au moins le pic caractéristique de plus grande intensité, de préférence tous les pics caractéristiques, du spectre de référence d'un dit virus de référence connu de l'étape 3/ ci-dessus. On comprend que cette méthode permet d'identifier un virus, si celui-ci fait partie des virus de référence dont le spectre est inclus dans la banque de spectres de référence. De préférence, à l'étape 1/, on réalise une préparation de virus purifié d'au moins 107/ml, de préférence d'au moins 108/ml. La plupart des virus se cultivent sur des tapis ou des suspensions de cellules. Chaque espèce virale possède un ou plusieurs types de cellules susceptibles de soutenir leur croissance. La plupart des cellules sont des cellules de vertébrés, souvent de cellules humaines pour les virus infectant l'homme mais ça n'est pas obligatoire. La culture se fait tout simplement en inoculant une boite de culture contenant un tapis cellulaire ou des cellules en suspension, le tout dans un milieu de culture capable de permettre la croissance et/ou la survie des cellules. Le virus inoculé dans le milieu va entrer en contact dans les cellules et être internalisé, puis il va se multiplier dans les cellules. Pour certains virus, la multiplication du virus entraîne la lyse de la cellule et la libération de grandes quantités de virus dans le milieu, pour d'autres il n'y a pas lyse, il faut donc casser les cellules par des méthodes physiques ou chimiques pour libérer les grandes quantités de virus qui sont à l'intérieur. Les cellules hôtes peuvent se présenter sous forme d'organisme tel que les amibes, notamment pour cultiver des virus de grande taille. En pratique le protocole de purification peut varier avec le type de virus et sa densité. Mais, pour l'essentiel, on passe toujours par une étape de centrifugation à basse vitesse qui permet de culotter les gros débris alors que le virus reste dans ce surnageant. Ensuite on culotte et on rince le virus par des centrifugations à grande/très grande vitesse itératives. Pour bien séparer le virus en fonction de sa densité, on termine par une centrifugation à très grande vitesse dans un milieu qui va bien séparer les particules en fonction de leur densité, cela se fait notamment par des coussins ou des gradients de sucrose, de rénograffine ou de cesium. Selon une première variante de réalisation, si le virus n'est pas lytique vis-à-vis de la cellule ou organisme hôte, à l'étape 1/ ci-dessus, on réalise une préparation de virus purifié en réalisant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a) on réalise la culture dudit virus dans son organisme ou cellule hôte jusqu'à multiplication maximale, puis on réalise la lyse dudit organisme ou cellule hôte, et b) on élimine les organismes ou cellules hôtes non lysés et les débris ou éléments issus desdits organismes ou cellules hôtes lysés par centrifugation et/ou filtration sur membrane. Selon une autre variante préférée de réalisation, dans laquelle le virus est lytique vis-à-vis de la cellule ou organisme hôte, à l'étape 1/ ci-dessus, on réalise une préparation de virus purifié en réalisant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a) on réalise la culture dudit virus dans son organisme ou cellule hôte jusqu'à lyse dudit organisme ou cellule hôte par le virus, et b) on récupère le surnageant de culture virale à l'issue de l'étape a) et on en élimine les organismes ou cellules hôtes non lysés et les débris ou éléments issus desdits organismes ou cellules hôtes lysés par centrifugation et/ou filtration sur membrane. Plus particulièrement, dans les deux variantes de réalisation, à l'étape b), on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles : b-1) on élimine les organismes ou cellules hôtes non lysés par une première centrifugation qui est une centrifugation à basse vitesse, de préférence à 2 000 tr/min pendant 10 minutes, et b-2) on récupère le surnageant de centrifugation de l'étape b-1) et on en élimine les débris ou éléments issus desdits organismes ou cellules hôtes lysés par filtration sur membrane, de préférence une membrane retenant les débris ou éléments de taille supérieure à 8 dam, centrifugation et b-3) le filtrat de l'étape b-2) est soumis à au moins une deuxième centrifugation à haute vitesse du filtrat suivi, de préférence à 9 000 tr/min pendant 15 minutes, et b-4) le culot de virus de la deuxième centrifugation est repris à l'eau puis soumis à une ultracentrifugation, de préférence ultracentrifugation sur coussin de sucrose à 240 000 tr/min pendant une heure et on récupère la fraction contenant le virus, de préférence le culot de virus ainsi purifié. En général, un virus ne se définit pas par un seul pic mais par une combinaison de quelques pics principaux de plus grandes intensités, notamment les pics spécifiques présentent une intensité supérieure ou égale à 20% à celle du pic le plus élevé en intensité ce qui laisse entre 1 et 5 pics pour la plupart des virus. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend les caractéristiques selon lesquelles : - à l'étape 3/ de comparaison du spectre obtenu à l'étape 2/, on compare le spectre obtenu avec des spectres de référence d'une dite banque comprenant : • les spectres de différents virus de référence purifiés connus, et • des spectres de référence dudit organisme hôte ou de ladite cellule hôte non infectés par un virus, et, • de préférence, des spectres de référence du milieu de culture utilisé pour la culture dudit organisme hôte ou de ladite cellule hôte, et - à l'étape 4/, on identifie le virus extrait à l'étape 1/ comme étant un desdits virus de référence si on retrouve dans son spectre de l'étape 2/, au moins les pics caractéristiques de plus grandes intensités du spectre dudit virus de référence connu de l'étape 3/ ci-dessus, lesdits pics caractéristiques étant les pics que l'on ne retrouve pas dans les spectres de référence dudit organisme hôte ou de ladite cellule hôte non infectés par un virus. Avantageusement, on cherche à identifier un virus donné choisi parmi les virus pathogènes pour l'Homme, de préférence : le virus du SIDA, les virus de la grippe, les virus d'hépatites, notamment de l'hépatite C, le virus de la varicelle, de la rubéole, de la fièvre jaune, du Nil occidental, les virus de l' herpes tel que HSV, les Entérovirus, notamment Poliovirus, Coxsackie A virus , Coxsackie B virus et Echovirus, les Coronavirus, les Adenovirus, les Parvovirus, les Poxvirus tels que les virus de la vaccine, le cowpox virus, le virus de la variole, le virus Ebola EBV, le cytomégalovirus CMV et les virus de référence de ladite banque de spectre de référence comprennent au moins les spectres d'un dit virus donné. Avantageusement, on cherche à identifier un dit virus donné, pathogène pour l'homme, que l'on cultive dans des cellules ou lignées choisies parmi HEL, L929, Vero, MDCK. Plus particulièrement, on cherche à identifier un virus choisi parmi les cowpox virus et herpès simplex virus HSV, cultivés dans des cellules Vero. Avantageusement encore, on cherche à identifier un virus géant, de préférence un virus d'amibe, que l'on cultive dans des cellules supportant sa croissance, comme des macrophages ou des amibes, de préférence du genre Acanthamoeba ou Hartmane//a, de préférence encore un virus d'Acanthamoeba polyphaga. On entend ici par "virus géant", un virus de taille supérieure à 400 nm. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture des exemples qui vont suivre. La figure 1 représente un spectre de virus Acanthamoeba po/yphaga mimivirus (APM) purifié à partir d'un surnageant de culture. La figure 2 représente un spectre d'amibes Acanthamoeba po/yphaga non infecté par un virus. La figure 3 représente deux spectres de virus APM (Mimivirus : spectre du haut et Mamavirus : spectre du bas). Les figures 4 et 5 représentent des spectres de virus Marseillevirus souche T19. Les figures 6 et 7 représentent deux spectres de la de la souche 25 VA10 de Moumouvirus. Les figures 8 à 10 représentent trois spectres de la souche 8a de Moumouvirus, nouveau virus géant non encore caractérisé sur le plan génétique. La figure 11 représente un spectre de virus de cowpox virus (souche 51435). Les figures 12 et 13 représentent des spectres de cellules Vero non infectées. Les figures 14 et 15 représentent des spectres de souches 50374 (figure 14) et souche 50763 (figure 15) de cowpox virus. Les figures 16 et 17 représentent deux spectres de deux souches de virus de l'herpès HSV1 : souche 7415436-C17 (figure 16) et souche 7420313-e20 (figure 17). EXEMPLE 1 : Identification de virus géants Dans cet exemple, les inventeurs ont inoculé 4 boites moyennes d'Acanthamoeba polyphaga mimivirus (ci-après APM) avec 30 ml de milieu de culture PYG + 5 ml d'amibe Acanthamoeba po/yphaga + 1 ml de virus APM, à savoir la souche Mimivirus (Raoult et al., 2004). Les boites sont incubées à 30°C jusqu'à lyse totale des amibes par les virus. Ensuite, on élimine les amibes non lysées et les débris d'amibes lysés formant des kystes par une centrifugation à basse vitesse (2 000 tr/min pendant 10 minutes) et on récupère le surnageant qui est ensuite filtré sur membrane 0,8 pm afin d'éliminer les amibes et kystes résiduels. Le filtrat est ensuite centrifugé à haute vitesse (9 000 tr/min pendant 15 minutes pour culotter le virus et le rincer en eau distillée stérile à 3 reprises. Le virus ainsi préparé est ensuite purifié sur un coussin de sucrose 25% afin d'éliminer les débris d'amibes résiduels par une ultracentrifugation à 24 000 tr/min pendant 1 heure. On dépose ensuite 1 pl de virus ainsi purifié sur la plaque avec 1 pl de matrice à savoir une solution saturée d'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique dans de l'acétonitrile à 50%, et de l'acide tri-fluoracétique à 2,5%, solution de matrice qui permet l'ionisation des molécules après leur exposition au laser. La solution de matrice a été cristallisée à température ambiante pendant 5 minutes. Les analyses en spectrométrie de masse ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre Autoflex II (Bruker Daltonik) équipé d'un laser azote d'une longueur d'onde de 337 nm. Les spectres ont été enregistrés sur un mode linéaire (délai 170 ns, ion source 1 (IS1) voltage 20 kV; ion source 2 (IS2) voltage 18.5 kV; voltage lentille 7 kV; masse moléculaire entre 2 et 20 kDa). Chaque spectre a été obtenu après 675 tirs sur un mode automatique avec une puissance de laser variable et un temps d'acquisition de 30-60 secondes par dépôt. L'acquisition automatique des données a été faite par le logiciel AutoXecute acquisition control software. Pour chaque échantillon, les spectres obtenus ont été importés dans le logiciel BioTyper version 2.0 software (Bruker Daltonik GmbH) et analysés en utilisant les paramètres par défaut. On a entré les spectres obtenus par spectrométrie de masse pour plusieurs échantillons différents du virus. Un spectre obtenu est représenté sur la figure 1. Afin d'éliminer les éventuels pics non spécifiques par exemple liés à des organelles ou protéines de l'amibe Acanthamoeba polyphaga, on a testé de la même manière des amibes, mais non infectées cette fois. Un spectre obtenu est représenté sur la figure 2. On a ainsi pu identifier dans les spectres de la figure 1 les pics liés aux amibes. Dans le cas d'APM, seul le pic de masse à 7 400 (+/-2) est probablement d'origine amibe. Afin de valider la technique d'identification, on a ensuite préparé de la même façon la souche de Mamavirus, qui est une autre souche de d'Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APM) (La Scola et al., 2008), et on l'a testée de la même façon qu'APM mimivirus tel que décrit ci- dessus. Les spectres obtenus pour les 2 souches sont représentés sur la figure 3. Il est possible d'observer que ce sont les mêmes pics de masse qui sont identifiés pour les 2 souches (Mimivirus, spectre A du haut, Mamavirus, spectre B du bas). On a ensuite analysé, afin de vérifier la spécificité de la méthode, d'autres virus génétiquement différents des APM. L'un est Marseillevirus souche T19, pour lequel la séquence complète du génome a été réalisée, et il s'agit d'un virus très éloigné des APM. Pour les autres virus analysés, à savoir Moumouvirus souches VA10 et 8a, les séquences complètes des génomes n'ont pas été réalisées mais les tentatives d'amplification à partir de 9 amorces désignées à partir des génomes des 2 souches d'APM sont restées négatives alors qu'elles le sont avec les 2 souches VA10 et 8a. Couple d'amorce Gène cible Fonction L206 FIR L206 Hélicase Ill/ATPase R321 F/R R322 DNA polymérise L437 FIR L437 ATPase L396 FIR L396 Helicase II L425 FIR L425 Capside R596 FIR R596 Thio1 oxydoréductase R350 FIR R350 Hélicase Il R400 FIR R400 Ser/thr protéine kinase R450 FIR R450 Facteur de transcription Sur aucun des spectres de ces virus Marseillevirus souche T19 et Moumouvirus souches VA10 et 8a représentés sur les figures 4 et 5, on ne retrouve les pics spécifiques ou un profil comparable aux 2 APM, souches Mimivirus et Mamavirus de la figure 3. Deux Spectres de Marseillevirus souche T19 passés de façon indépendante sont représentés sur les figures 4 et 5. Deux spectres de la souche Moumouvirus souche VA10 réalisés de façon indépendante sont représentés sur les figures 6 et 7. Trois spectres indépendants de la souche 8a sont représentés sur les figures 8 à 10. Le tableau A ci-après récapitule les pics caractéristiques principaux des différents virus marqués d'une croix X. 12 Tableau A : virus sse 2370 2394 2413 2421 2431 2444 2487 2524 2565 2583 2624 2776 2789 2806 MIMI/MAMA X VA10 X X T19 X 8A X Amibe non X infectée virus sse 2826 2856 2866 2880 2903 2980 2994 3000 3054 3068 3079 3173 3282 3358 MIMI/MAMA X VA10 X X X T19 X 8A X Amibe non X X X X infectée 13 Tableau A (suite): virus sse 3424 3440 3493 3527 3542 3571 3578 3699 3705 3887 3988 4013 4031 4887 MIMI/MAMA VA10 X X X X X X X T19 X 8A X X Amibe non infectée virus sse 4998 5232 5245 5726 6134 6154 7217 8594 11388 12154 MIMI/MAMA X X VA10 X X X X T19 X X 8A X X X Amibe non X infectée EXEMPLE 2 : Identification de cowpox virus Dans cet exemple, les inventeurs ont inoculé 2 grandes boites de cellules Vero dans du milieu MEM avec 4% de sérum de veau foetal, 1% de L-glutamine et 1 ml de cowpox virus (souche 50435), souche isolée au cours d'une épidémie survenue en France en 2008 (Ninove et al., 2009). Les boites sont incubées à 37°C jusqu'à lyse totale des cellules par le virus. Ensuite, on élimine les cellules non lysées par une centrifugation à basse vitesse (2 000 tr/min pendant 10 minutes) et on récupère le surnageant qui est ensuite filtré sur membrane 0,8 pm afin d'éliminer les cellules ou débris de cellules résiduels. Le filtrat est ensuite centrifugé à haute vitesse (10 000 tr/min) pendant 15 minutes pour culotter le virus et le rincer en eau distillée stérile à 3 reprises. Le virus ainsi préparé est ensuite purifié sur un coussin de sucrose 25% afin d'éliminer les débris cellulaires résiduels par une ultracentrifugation à 24 000 tr/min pendant 1H30. On dépose ensuite 1 pl de virus ainsi purifié sur la plaque avec 1 pl de matrice à savoir une solution saturée d'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique dans de l'acétonitrile à 50%, et de l'acide tri-fluoracétique à 2,5%. La solution de matrice a été cristallisée à température ambiante pendant 5 minutes. Les analyses en spectrométrie de masse ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre Autoflex II (Bruker Daltonik) équipé d'un laser azote d'une longueur d'onde de 337 nm. Les spectres ont été enregistrés sur un mode linéaire (délai 170 ns, ion source 1 (IS1) voltage 20 kV; ion source 2 (IS2) voltage 18,5 kV; voltage lentille 7 kV; masse moléculaire entre 2 et 20 kDa). Chaque spectre a été obtenu après 675 tirs sur un mode automatique avec une puissance de laser variable et un temps d'acquisition de 30-60 secondes par dépôt. L'acquisition automatique des données a été faite par le logiciel AutoXecute acquisition control software. Pour chaque échantillon, les quatre spectres obtenus ont été importés dans le logiciel BioTyper version 2.0 software (Bruker Daltonik GmbH) et analysés en utilisant les paramètres par défaut. On a entré le spectre obtenu par spectrométrie de masse pour plusieurs échantillons différents du virus. On peut voir qu'il existe un pic extrêmement important à 2424.Le résultat obtenu est visible sur la figure 11. Afin d'éliminer les éventuels pics non spécifiques, par exemple liés à des organelles, telles que mitochondries, reticulum endosplasmique, ribosomes, ou protéines des cellules Vero utilisées pour la culture, On a testé de la même manière des cellules Vero, mais non infectées cette fois, dont deux spectres indépendants sont représentés sur les figures 12 et 13. On a identifié, dans les spectres, les pics liés aux cellules Vero et il n'apparaît pas y avoir de pics communs avec le spectre de la souche 51435 de la figure 11 et, notamment, aucun pic à 2424. Afin de valider la technique d'identification, on a ensuite préparé de la même façon 2 autres souches de Cowpox isolées lors de la même épidémie, souches 50374 et souche 50763 dont les spectres sont représentés sur les figures 14 et 15. Même s'il existe un décalage des pics, on peut voir la spécificité du pic à 2424 (+/-2) pour les cowpox virus. Le tableau B ci-après identifie les pics principaux des virus des poxvirus 50374, 50763 et 51435 et des cellules Vero. 16 Tableau B : virus asse 3409 2424 3414 3456 3773 4280 4601 4964 5652 6172 6884 6892 8564 8575 10085 11307 11320 13781 pox50374 X X X X X X pox50763 X X X X X X pox51435 X X X X X X X X X VERO X X X X X X X X X X EXEMPLE 3 : Identification des Herpes virus 1 Dans cet exemple, les inventeurs ont inoculé 2 grandes boites de cellules Vero dans du milieu MEM avec 4% de sérum de veau foetal, 1% de L-glutamine et 1 ml de HSV1 isolées dans le laboratoire. Les boites sont incubées à 37°C jusqu'à lyse totale. Ensuite on élimine les cellules non lysées par une centrifugation à basse vitesse (2 000 tr/min pendant 10 minutes) et on récupère le surnageant qui est ensuite filtré sur membrane 0,45 pm afin d'éliminer les cellules résiduelles. Le filtrat est ensuite centrifugé à haute vitesse (28 000 tr/min) pendant 2 heures pour culotter le virus et le rincer en eau distillée stérile à 3 reprises. Le virus ainsi préparé est ensuite purifié sur un coussin de sucrose 25% afin d'éliminer les débris cellulaires résiduels par une ultracentrifugation à 28 000 tr/min pendant 2 heures. On dépose ensuite 1 pl de virus ainsi purifié sur la plaque avec 1 pl de matrice à savoir une solution saturée d'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique dans de l'acétonitrile à 50%, et de l'acide tri-fluoracétique à 2,5%. La solution de matrice a été cristallisée à température ambiante pendant 5 minutes. Les analyses en spectrométrie de masse ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre Autoflex II (Bruker Daltonik) équipé d'un laser azote d'une longueur d'onde de 337-nm. Les spectres ont été enregistrés sur un mode linéaire (délai 170 ns, ion source 1 (IS1) voltage 20 kV; ion source 2 (IS2) voltage 18.5 kV; voltage lentille 7 kV; masse moléculaire entre 2 et 20 kDa). Chaque spectre a été obtenu après 675 tirs sur un mode automatique avec une puissance de laser variable et un temps d'acquisition de 30-60 secondes par dépôt. L'acquisition automatique des données a été faite par le logiciel AutoXecute acquisition control software. Pour chaque échantillon, les quatre spectres obtenus ont été importés dans le logiciel BioTyper version 2.0 software (Bruker Daltonik GmbH) et analysés en utilisant les paramètres par défaut. On a entré le spectre obtenu par spectrométrie de masse pour plusieurs échantillons différents du virus. Pour les virus HSV1, deux souches différentes ont été testées (Souche 7415436-C17 et souche 7420313-e20). On voit qu'il existe des pics communs absents chez les cellules Vero à 3765 (+/-2), 4590 (+/-2), 11296 (+/-2) et 13767. Les spectres des 2 souches sont présentés sur les figures 16 et 17, à savoir : - souche 7415436-C17 : figure 16, - souche 7420313-e20 : figure 17. Le tableau C ci-après reprend les pics caractéristiques principaux des virus HSV1 7415436-C17 et 7420313-e20. Tableau C virus asse 3765 4590 7663 7668 11296 12165 13767 HSV1 7420313 X X X X X HSV1 7415436 X X X X X X Références citées La Scola, B., Audic, S., Robert, C., Jungang, L., de, L., X, Drancourt, M., Birtles, R., Claverie, J. M., and Raoult, D. 2003. A giant virus in amoebae. Science299(5615): 2033. La Scola, S. B., Desnues, C., Pagnier, I., Robert, C., Barrassi, L., Fournous, G., Merchat, M., Suzan-Monti, M., Forterre, P., Koonin, E., and Raoult, D. 2008. The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus. Nature455(7209): 100-104. Ninove, L., Domart, Y., Vervel, C., Voinot, C., Salez, N., Raoult, D., Meyer, H., Capek, I., Zandotti, C., and Charrel, R. N. 2009. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, France. Emerg. Infect. Dis.15(5): 781-784. Raoult, D., Audic, S., Robert, C., Abergel, C., Renesto, P., Ogata, H., La Scola, B., Suzan, M., and Claverie, J. M. 2004. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science306(5700): 1344-1350. Renesto-Audiffren, P., Abergel, C., Decloquement, P., Moinier, D., Azza, S., Ogata, H., Fourquet, P., Gorvel, J. P., Claverie, J. M., and Raoult, D. 2006. Mimivirus giant particles incorporated a large fraction of anonymous and unique gene products. J VirolSubmitted.20 Revendications1. Procédé d'identification d'un virus présent dans un échantillon biologique et/ou un prélèvement clinique de patient contenant un virus dans un organisme ou cellule hôte caractérisé en ce que l'on réalise les étapes successives dans lesquelles : 1/ On réalise une préparation contenant ledit virus à partir dudit échantillon biologique et/ou un prélèvement clinique, par extraction dudit virus de son organisme ou cellule hôte, et 2/ on réalise au moins un spectre d'une préparation de virus purifié par spectrométrie de masse, de préférence par spectrométrie de masse dite MALDI TOF MS (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation Time of Flight), et 3/ On compare le spectre obtenu à l'étape 2/ avec : - au moins un spectre de référence dudit virus purifié, préalablement réalisé, si on recherche seulement à identifier un virus particulier connu, ou - une pluralité de spectres préalablement réalisés de différents virus de référence purifiés connus constituant une banque de spectres de référence de dits différents virus purifiés connus, si on cherche à identifier si le virus fait partie des virus de référence dont le spectre est inclus dans la banque de spectres de référence, et 4/ On identifie le virus extrait à l'étape 1/ ci-dessus comme étant un desdits virus de référence si on retrouve dans son spectre de l'étape 2/ ci-dessus, au moins le pic caractéristique de plus grande intensité, de préférence tous les pics caractéristiques, du spectre de référence d'un dit virus de référence connu de l'étape 3/ ci-dessus. 2. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape 1/, on réalise une préparation de virus purifié d'au moins 107/ml, de préférence d'au moins 108/ml. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, à l'étape 1/, on réalise une préparation de virus purifié en réalisant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a) on réalise la culture dudit virus dans son organisme ou cellule hôte jusqu'à multiplication maximale puis on réalise la lyse dudit organisme ou cellule hôte, et b) on élimine les organismes ou cellules hôtes non lysés et les débris ou éléments issus desdits organismes ou cellules hôtes lysés par centrifugation et/ou filtration sur membrane. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, à l'étape 1/, on réalise une préparation de virus purifié en réalisant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a) on réalise la culture dudit virus dans son organisme ou cellule hôte jusqu'à lyse dudit organisme ou cellule hôte par le virus, et b) on récupère le surnageant de culture virale à l'issue de l'étape a) et on en élimine les organismes ou cellules hôtes non lysés et les débris ou éléments issus desdits organismes ou cellules hôtes lysés par centrifugation et/ou filtration sur membrane. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que, à l'étape b), on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles : b-1) on en élimine les organismes ou cellules hôtes non lysés par une première centrifugation qui est une centrifugation à basse vitesse, de préférence à 2000 tr/min pendant 10 minutes, etb-2) on récupère le surnageant de centrifugation de l'étape b-1) et on en élimine les débris ou éléments issus desdits organismes ou cellules hôtes lysés par filtration sur membrane, de préférence une membrane retenant les débris ou éléments de taille supérieure à 8 pm, centrifugation et b-3) le filtrat de l'étape b-2) est soumis à au moins une deuxième centrifugation à haute vitesse du filtrat suivi, de préférence à 9 000 tr/min pendant 15 minutes, et b-4) le culot de virus de la deuxième centrifugation est repris à l'eau puis soumis à une ultracentrifugation, de préférence ultracentrifugation sur coussin de sucrose à 240 000 tr/min pendant une heure et on récupère la fraction contenant le virus, de préférence le culot de virus ainsi purifié. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que - à l'étape 3/ de comparaison du spectre obtenu à l'étape 2/, on compare le spectre obtenu avec des spectres de référence d'une dite banque comprenant : • les spectres de différents virus de référence purifiés connus, et • des spectres de référence dudit organisme hôte ou de ladite cellule hôte non infectés par un virus, et, • de préférence, des spectres de référence du milieu de culture utilisé pour la culture dudit organisme hôte ou de ladite cellule hôte, et - à l'étape 4/, on identifie le virus extrait à l'étape 1/ comme étant un desdits virus de référence si on retrouve dans son spectre de l'étape 2/, au moins les pics caractéristiques de plus grandes intensités du spectre dudit virus de référence connu de l'étape 3/ ci-dessus,lesdits pics caractéristiques étant les pics que l'on ne retrouve pas dans les spectres de référence dudit organisme hôte ou de ladite cellule hôte non infectés par un virus. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on cherche à identifier un virus donné choisi parmi les virus pathogènes pour l'homme, de préférence : le virus du SIDA, les virus de la grippe, les virus d'hépatites, notamment de l'hépatite C, le virus de la varicelle, de la rubéole, de la fièvre jaune, du Nil occidental, les virus de l'herpes tel que HSV, les Entérovirus, notamment Poliovirus, Coxsackie A virus , Coxsackie B virus et Echovirus, les Coronavirus, les Adenovirus, les Parvovirus, les Poxvirus tels que les virus de la vaccine, le cowpox virus et virus de la variole, le virus Ebola EBV, le cytomégalovirus CMV et les virus de référence de ladite banque de spectre de référence comprennent au moins les spectres d'un dit virus donné. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on cherche à identifier un dit virus donné, pathogène pour l'homme, que l'on cultive dans des cellules ou lignées choisies parmi HEL, L929, Vero et MDCK. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on cherche à identifier un virus choisi parmi les cowpox virus et herpès simplex virus HSV, cultivés dans des cellules Vero. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on cherche à identifier un virus géant, de préférence un virus d'amibe, que l'on cultive dans des cellules supportant sa croissance, comme des macrophages ou des amibes, de préférence du genre Acanthamoeba ou Hartmanella, de préférence encore un virus d'Acanthamoeba po/yphaga.