Brevet FR2950074A1 — publié le 20110318

L'invention se rapporte au domaine des produits de comblement, et à l'évaluation de leur activité. L'utilisation de produits de comblement (aussi appelés "fillers") s'est développé de façon importante au cours de ces dernières années. Ils représentent une solution alternative intéressante dans le traitement ou la diminution des signes du vieillissement. Les principaux signes cliniques du vieillissement cutané sont notamment l'apparition de ridules et/ou de rides, en augmentation avec l'âge. Ces rides peuvent être profondes, moyennes ou superficielles, et touchent en particulier les sillons nasogéniens, la zone périorbitaire, le contour des lèvres, le front (ride du lion); ces rides et ridules se traduisent par une dépression ou des sillons à la surface de la peau. De plus, on constate avec l'âge une perte de volume de la partie supérieure du visage, notamment au niveau des pommettes et des joues. Par ailleurs, il existe différentes situations où il est souhaitable de remédier à la perte de tissus et de combler des dépressions cutanées telles que des déplétions fibroblastiques, les blessures, l'ablation chirurgicale partielle de tissus (par exemple dans les cas de tumeur), y compris le comblement des « dépressions » cutanées secondaires à la prise d'un traitement entraînant une lipodystrophie qui se caractérise le plus souvent par une lipoatrophie faciale et pour favoriser la cicatrisation. Les produits de comblement sont injectés dans les tissus cutanés ou sous-cutanés, par voie sous-cutanée ou intradermique. Il s'agit ainsi d'implant dermique, c'est-à-dire des substances injectées directement dans la peau en vue de remédier aux désordres intervenant aux différents niveaux cutanés ou sous-cutanés (derme, hypoderme, etc.). Il peut s'agir d'une injection en un site unique, ou dans un nombre de points limité des tissus cutanés ou sous-cutanés. On réalise alors un nappage sous-cutané, sous- dermique et/ou intradermique de ladite composition, précisément au niveau de la zone corporelle à traiter. Ce comblement peut être réalisé par l'utilisation de produits non résorbables, tels que des gels de polyacrylamide ou des particules de polyméthylméthacrylate (PMMA) Néanmoins, ces composés peuvent entrainer des réactions d'intolérance du type inflammation ou hypersensibilité. On privilégie l'utilisation de composants résorbables, tels que les protéines, les graisses le collagène ou l'acide hyaluronique. Mais ces composés sont dégradés assez rapidement dans l'organisme, ce qui réduit leur efficacité. Pour y remédier il faut donc procéder à une réticulation plus ou moins poussée de ces composants.35 Il est donc souhaitable de pouvoir évaluer les propriétés physico-chimiques et/ou les modifications biologiques susceptibles d'être provoquées par l'injection des produits de comblement avant leur utilisation in vivo chez l'homme. Pour des raisons éthiques, il n'est pas souhaitable de tester ce type de produit chez l'animal. L'utilisation d'équivalent de peau à base de biomatériaux connus n'est pas satisfaisante car l'injection de produit de comblement à travers l'équivalent de peau provoque une rupture de l'épiderme et une désorganisation de la structure. En effet, la conception actuelle des équivalents de peau ne permet pas une épaisseur suffisante pour une évaluation d'une quantité moyenne de produit de comblement par la méthode d'injection. Le brevet US 4,481,001 décrit un modèle de peau pour tester l'injection intra-dermique d'un produit de comblement tel qu'un collagène réticulé, à base de matériaux synthétiques. Ce modèle comprend une couche élastomère mimant le tissu sous-cutané, un équivalent de derme constitué d'un gel de silicone élastomère et une couche d'élastomère à haut pouvoir tenseur mimant un épiderme. Ce modèle ne contient pas de cellules vivantes et ses constituants étant très différents de ceux de la peau, il ne peut permettre d'anticiper les réactions induites par l'injection de produit de comblement in vivo. Il existe donc un besoin de disposer d'un modèle tri-dimensionnel in vitro pouvant mimer la réalité cosmétique pour évaluer l'effet des matériaux de comblement aussi bien sur un plan biophysique, biomécanique ou biologique. De manière inattendue, il a été trouvé dans le cadre de la présente invention qu'il était possible d'obtenir un tel modèle en incorporant le produit de comblement au cours de la reconstruction de l'équivalent de peau. Plus particulièrement, il est désormais possible d'obtenir un modèle tridimensionnel contenant des cellules vivantes telles que des fibroblastes et permettant d'évaluer in vitro le comportement des produits de comblement lorsqu'ils seront injectés in vivo, en incorporant le produit de comblement dans la matrice extra-cellulaire avant la contraction des fibroblastes conduisant à la lattice. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un équivalent de peau in vitro comprenant au moins un équivalent de derme contenant des fibroblastes vivants et un équivalent de matrice extracellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une inclusion d'au moins un produit de comblement ne contenant pas de fibroblastes, la composition dudit produit de comblement étant au moins partiellement distincte de celle de l'équivalent de matrice extracellulaire et en ce que les fibroblastes sont contractés. L'équivalent de derme est constitué d'un gel continu comprenant au moins du collagène, au sein duquel sont répartis les fibroblastes vivants. Avantageusement, l'équivalent de derme comprend une matrice dite "libre", c'est-à dire dans laquelle les fibroblastes sont orientés selon des axes qui peuvent être différents les uns des autres; en particulier, dans un tel équivalent de derme, le pourcentage des fibroblastes orientés longitudinalement par rapport à la surface de l'équivalent de derme est inférieur à 50%. L'invention concerne également un procédé d'évaluation de produit de comblement, mettant en oeuvre un tel équivalent de peau in vitro. Par inclusion au sens de la présente invention on entend un volume dont la forme et les contours peuvent être variables, mais qui est délimité par rapport à la matrice environnante. Dans un plan parallèle à la surface de l'équivalent de derme, avant la contraction de la lattis, la plus petite dimension de l'inclusion est de préférence supérieure ou égale à 0,1 cm, en particulier supérieure ou égale à 0,5 cm, notamment supérieure ou égale à 1 cm, ces dimensions étant adaptées par l'homme du métier selon les caractéristiques recherchées, notamment selon le nombre d'inclusions. De préférence, la ou les inclusions sont disposées dans l'équivalent de derme de telle sorte qu'il existe au moins une couche continue de matrice extra-cellulaire contenant des fibroblastes à la surface et/ou à la base dudit équivalent de derme. selon une variante de l'invention, il n'existe pas de couche continue de matrice extracellulaire contenant les fibroblastes à la surface supérieure de l'inclusion. Les constituants de la matrice extra-cellulaire seront proches de ceux trouvés dans la peau, et seront adaptés par l'homme du métier. L'équivalent de derme comporte au moins une matrice de collagène de type I dans laquelle sont répartis les fibroblastes. Elle peut contenir en outre d'autres constituants de la matrice extracellulaire. Par `constituant de matrices extracellulaires', on désigne notamment des molécules telles que les collagènes en particulier le collagène IV, les laminines, l'entactine, la fibronectine, les protéoglycanes, les glycosaminoglycans, l'acide hyaluronique, l'élastine, la fibrilline. Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, l'équivalent de derme contient au moins du collagène IV et de la laminine; de préférence, il contient aussi de l'entactine. Les concentrations de ces différents constituants pourront être adaptées par l'homme du métier et seront par exemple pour la laminine comprises entre 1 et 15% du volume final, pour le collagène IV entre 0,3 et 4,5% du volume final et pour l'entactine entre 0,05 et 1% du volume final. Dans l'un des modes de réalisation, les constituants de la matrice extra-cellulaire comprennent au moins du collagène I, du collagène III ou leurs mlanges. Le collagène utilisé peut être du collagène d'origine bovine, de queue de rat ou de poisson ou toute autre source de collagène natif ou produit par génie ,génétique permettant une contraction en présence de fibroblastes. L'épaisseur de l'équivalent de derme pourra varier mais sera en général d'au moins 0,05 cm, notamment d'environ 0,05 à 2 cm mais pourra être augmenté sans inconvénient. De même, son diamètre sera adapté par l'homme du métier d'environ 3 mm à 20 cm ou plus. L'équivalent de derme peut contenir un mélange de fibroblastes papillaires et réticulaires, en toutes proportions. Selon des variantes de l'invention, l'équivalent de demie comprend essentiellement des fibroblastes papillaires, selon une autre variante l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes réticulaires. Selon l'un des modes de réalisation avantageux de l'invention, l'équivalent de peau comprend en outre au moins un équivalent d'épiderme contenant des kératinocytes. De préférence, l'équivalent d'épiderme est différencié stratifié, et comprend au moins une couche superficielle et au moins une couche basale. Avantageusement, les kératinocytes reproduisent les caractéristiques d'un épiderme in vivo, à savoir un épithélium multicouche stratifié avec une couche basale au contact de l'équivalent de derme et dont les strates supérieures témoignent d'une différenciation, reproduisant de la profondeur vers la périphérie une couche supra-basale (ou couche épineuse), une couche granuleuse (stratum granulosum) et une couche cornée (stratum corneum) d'un épiderme. Les kératinocytes utilisés dans l'équivalent d'épiderme peuvent être préparés selon toute méthode connue de l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple la culture à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique. Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale ou pathologique, en particulier selon la méthode décrite dans Asselineau et al. (Exp. Oeil Res., 159(2): 536-9, 1985). Par produit de comblement, on entend tout matériau naturel ou synthétique, solide ou liquide en mélange avec du solide (autre matériau), susceptible d'être injecté dans les tissus mous, en particulier cutané ou sous-cutané du visage ou du corps pour en modifier la forme ou les contours. Il peut s'agir de produits de comblement résorbables ou permanents. La durée totale de présence du produit en présence des cellules peut varier par exemple de 18 à 22 jours. De tels produits de comblement peuvent être choisis parmi les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques. A titre d'exemples de produits de comblement, on peut citer: - Biopolymères : • Acides hyaluroniques biotechnologiques ou aviaires, réticulés ou non (de 8 à 25 mg/ml, le plus souvent : 20mg/ml et le plus souvent à PM 3MDa ; commercialisés par exemple sous les marques Evenor®, Restylane® de Q- Med, Juvederm® de Cornéal) • Collagènes humains, bovins ou porcins ; réticulés ou non (ex: 35 ou 65 mg/ml ; ex2 : EvolenceTM, Cosmoplast®...) • Elastine (à partir de la tropoelastine humaine biotechnologique) - Polymères synthétiques et autres : • Polyacrylamide (ex: Aquamid®) • Acide polylactique (ex: Newfill®) • Acide polyvinylique • Hydroxyapatite de calcium ou triphosphate de Calcium (particules de 10 à 80pm, peut-être contenues dans de l'acide hyaluronique ou gel de polysaccharide ; ex : Atléan®, RadiesseTM) • Polyméthylmétacrylate (ex Artefill®, microsphères contenues dans du collagène bovin) • Alkylimides - Cellules ou transplants (autologues/allogenic) • Fibroblastes humains (ex: Isolagen TherapyTM, 10 millions de cellules autologues injectées) • Graisse ( injection de graisse autologue) Avantageusement, ils sont choisis parmi l'acide hyaluronique modifié ou non, le collagène, l'élastine, l'acide polylactique et leurs mélanges. L'acide hyaluronique est formé par la répétition d'une unité disaccharidique hydrophile, dans laquelle le D-glucuronate de sodium est relié à la N-acétyl-glucosamine par des liaisons R1-4 glycosidique. Sa structure chimique est simple, linéaire et uniforme, sans spécificité d'espèce. En condition physiologique, le polysaccharide se trouve non sous forme acide mais sous la forme d'un sel sodique, l'hyaluronate de sodium, molécule polyanionique. Par convention, on parle d'hyaluronane. Dans les tissus sains, son poids moléculaire varie de 4 à 10 millions de daltons (400D par unité), ce qui donne un produit final pouvant atteindre 1011m. Seule la longueur et la concentration d'hyaluronane varie dans la nature. La masse moléculaire de l' hyaluronane dermique est en moyenne de 2,5 millions de daltons. Son contenu varie en fonction de l'âge . Par acide hyaluronique (AH) on entend dans la présente description l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, en particulier ses sels de sodium, potassium, manganèse, magnésium , et calcium. Son poids moléculaire peut varier, et est généralement supérieur à 106 daltons. Au sens de l'invention, on entend également désigner par acide hyaluronique un mélange de molécules de différentes masses moléculaires, correspondant à des répétitions plus ou moins nombreuses de l'unité disaccharidique de base. Au niveau industriel, l'acide hyaluronique peut être obtenu par extraction des tissus (par exemple de crêtes de coq) ou par fermentation bactérienne (tel que Streptococcus equi) L'acide hyaluronique est soluble dans l'eau, sa vitesse de dissolution étant masse moléculaire dépendante (plus la masse moléculaire est élevée, plus lentement il sera soluble), le processus peut être accéléré par agitation. Du fait de sa courte demi vie, pour son utilisation dans le cadre du traitement des rides par comblement, le produit doit généralement subir une réticulation. La réticulation se fait, essentiellement, en milieu alcalin, utilisant les sites carboxyliques et hydroxyles de la molécule. Mais cette réticulation peut être réalisée en milieu acide, bien que les liaisons créées dans ce milieu soient nettement moins résistantes qu'en milieu alcalin. Le procédé de réticulation ne change pas le caractère polyanionique du polysaccharide, mais diminue sensiblement la miscibilité à l'eau du gel obtenu. Dans les procédés de réticulation, l'acide hyaluronique utilisé est de qualité pharmaceutique. La technique de réticulation classique comporte 3 étapes. Une étape de préparation d'une acide hyaluronique de qualité pharmaceutique, suivi d'un séchage , laissant l'hyaluronane sous forme de fibres. L'écheveau de fibre d'hyaluronane obtenu est remis en solution dans une solution tampon . Par exemple, l'acide hyaluronique de faible masse moléculaire est mélangé à un acide de forte masse moléculaire. A ce stade le réticulant est ajouté, en milieu alcalin pour donner une masse gélifiée. Les différents réticulants utilisés pour réaliser les gels disponibles en chirurgie esthétique sont : - divinyl sulfone, - 1,2,7,8 diépoxyoctane - 1,4 butanediol diglycidyl éther (BDDE) , pour un grand nombre de produits actuellement sur le marché Dans certains cas une 4ème étape soit par addition d'acide hyaluronique soit par une seconde étape de réticulation en milieu acide. Au sens de l'invention, on entend par dérivés de l'acide hyaluronique notamment les dérivés modifiés chimiquement et/ou réticulés (présentant des ponts intra ou inter chaînes). De préférence, le dérivé réticulé est choisi parmi les dérivés réticulés de poids moléculaire supérieur ou égal à 106 daltons et notamment supérieur ou égal à 2 millions de daltons. Toutefois, ce poids moléculaire est généralement inférieur ou égal à 15. 106 daltons. Le collagène peut être de diverses origines, par exemple : humain, bovin ou porcin. Le collagène peut-être libre ou réticulé et est utilisé de préférence à une concentration élevée à 35mg/ml. La réticulation conduisant éventuellement à des pontages entre les chaines de collagène, après réaction avec une fonction aldéhyde, peut-être réalisée de façon aléatoire (ex avec le réticulant Glutaraldéhyde ou sucre réducteur) ou de façon précise et spécifique. La réaction de réticulation est appelée réaction de glycation. Cette réaction si elle se fait de façon aléatoire peut conduire à des produits néfastes pour la biologie de la peau. Le collagène peut-être réticulé et/ou modifié de façon spécifique conduisant à la formation de produits de glycation bénéfiques pour la peau. Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, l'équivalent de derme contient une pluralité d'inclusions, notamment au moins deux, et en particulier au moins 5. A titre indicatif, les inclusions pourront notamment avoir une taille de 10 à 15pI. De préférence, le volume des inclusions de produit de comblement représentera au moins 1% par rapport au volume de l'équivalent de matrice extra-cellulaire avant contraction, et sera notamment compris entre 1:100 et 1:25, selon le type de produit de comblement utilisé. En fonction du degré de contraction de la matrice extra-cellulaire, le ratio (volumique produit de comblement / équivalent de matrice extracellulaire) dans l'équivalent de derme pourra varier par exemple de 1:2 à 1:50, notamment de 1:2 à 1:5. L'équivalent de peau utile dans le procédé selon l'invention peut aussi contenir des cellules endothéliales, des mélanocytes, des cellules de papilles dermiques, des cellules du système immunitaire, telles que des lymphocytes, des cellules dendritiques, des macrophages des monocytes ou des cellules de Langerhans, des adipocytes, des cellules nerveuses, et leurs mélanges. Le modèle permet ainsi d'étudier l'effet biologique d'un produit de comblement sur la signalisation inflammatoire et de donner des informations sur l'éventuelle composante inflammatoire d'un produit. La présence d'une structure et d'une composition de derme reproduisant la structure de la peau humaine est nécessaire pour évaluer l'ensemble des effets pouvant être induits par l'injection de produits de comblement. En particulier, il a été montré chez l'animal que l'injection d'acide hyaluronique réticulé stimule la production de collagène (Wang et al. arch. Dermatol. 2007; 143:155-163). Il est donc important de pouvoir évaluer ce type d'activité biologique, ce qui est possible avec le modèle selon l'invention. Les produits de comblement sont destinés, selon les indications du fabricant et leur composition, à être injectés soit dans la partie superficielle de la peau (derme papillaire) soit dans la partie moyenne à profonde de la peau (derme réticulaire). Les propriétés biologiques étant différentes entre les fibroblastes de la partie papillaire et ceux de la partie réticulaire, les effets d'un actif ou d'un produit peuvent donc être différents selon les cellules qui sont mises en contact. La mise en oeuvre d'équivalent de derme à teneur contrôlée en fibroblastes papillaires et/ou réticulaires selon la présente invention permet donc de tester spécifiquement l'effet du produit selon la profondeur à laquelle il est destiné ou inversement, permet de déterminer à quelle profondeur le produit aura l'effet le plus bénéfique. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un équivalent de peau permettant d'évaluer les effets biologiques, biophysiques, biomécaniques, physiques, modifications d'apparence visuelle, morphologie, relief, couleur, conforme à l'invention. Un tel procédé comprend les étapes suivantes: a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire et des fibroblastes, ledit mélange étant placé dans une enceinte, b) on met en contact le mélange obtenu à l'étape a avec au moins un volume fini d'au moins un produit de comblement, c) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et contenant des inclusions de produit de comblement qui constitue l'équivalent de derme. Avantageusement, à l'étape a) le mélange des constituant de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes est laissé en contact pour obtenir une gélification partielle avant de réaliser l'étape b). Ce temps de contact à l'étape a est généralement court, inférieur à 1 heure et de préférence inférieur ou égal à 15 minutes. Le temps de l'étape c peut varier de 3 à 6 jours, par exemple être d'environ 4 jours.... Avantageusement, après l'étape c, on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme. De telles conditions sont connues de l'homme du métier. En particulier, après ensemencement des kératinocytes sur le support, la culture peut être maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Rheinwald et Green, 1975, (Cell, 6, (3), 317-330) milieu qui permet la prolifération des kératinocytes (nommé par ailleurs dans le texte milieu 3F) . Après un temps d'incubation de 3 à 15 jours, préférentiellement de 7 à 9 jours, l'équivalent de peau est maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt sur une grille métallique. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que le précédent. L'incubation se poursuit ensuite jusqu'à obtention d'un équivalent de peau présentant les caractéristiques d'une peau, à savoir le support sur lequel se trouve un équivalent d'épiderme présentant les quatre types de couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours préférentiellement entre 7 et 10 jours. Selon l'un des modes de réalisation du procédé selon l'invention, on répartit le mélange précurseur de lattice (constituants de matrice extra-cellulaire et fibroblastes) dans une enceinte dans laquelle on a ménagé un volume par une empreinte ou tout moyen permettant de délimiter une zone dans laquelle le mélange précurseur de lattice ne pourra pas se répartir. Ledit mélange des constituants de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes est réparti dans l'enceinte à l'exception du volume v1, et on laisse un temps suffisant pour permettre au mélange de gélifier, lesdits moyens ou empreinte sont ensuite retirés en laissant subsister un volume v1 au sein du mélange gélifié. A l'étape b, on introduit le volume fini de produit de comblement au moins en partie dans le volume v1 ainsi délimité. Avantageusement, on recouvre l'ensemble par un mélange précurseur de lattice similaire à celui mis en oeuvre à l'étape a. Le volume v1 pourra être délimité par tout moyen approprié tel que pointeau, anneau, noyau, s'opposant à la diffusion du mélange précurseur de lattice, soit des moyens au moins partiellement étanches. Le modèle obtenu de par ce mode de réalisation se rapproche d'une injection finale de type implant, à savoir dans la pratique le comblement de la ride du visage par injection continue du produit (serial") dans la peau. Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, le mélange précurseur de lattice est coulé dans une enceinte et laissé en repos pendant un temps suffisant pour lui permettre de gélifier. L'étape b est ensuite effectué en introduisant plusieurs volumes finis de produit de comblement dans le mélange gélifié, par exemple par injection ou tout moyen équivalent. Le modèle ainsi obtenu est à rapprocher d'une injection finale de type imiant en serial puncture dans la pratique (multiponcture: comblement d'une ride par plusieurs injections rapprochées et ensuite zone du visage massée pour répartir le produit). Le temps permettant au mélange précurseur de lattice de gélifier variera selon le type de composants et sera adapté par l'homme du métier mais pourra varier de quelques minutes à quelques heures, notamment de 5 à 50 minutes, par exemple de 6 minutes à 15 minutes, notamment d'environ 10 minutes. La matrice ainsi obtenue est sous forme de gle et ne doit pas être solide. L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation d'un produit de comblement caractérisé en ce qu'on prépare un équivalent de peau selon le procédé tel que décrit dans ce qui précède, et en ce qu'on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de I"équivalent de peau contenant ledit produit de comblement. Le procédé d'évaluation pourra également être utile pour comparer plusieurs produits de comblement et par exemple les classer selon leur structure et établir une corrélation avec leurs effets biologiques. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un équivalent de peau tel que défini dans ce qui précède pour l'évaluation d'au moins un produit susceptible d'être formulé sous forme d'inclusion dans un équivalent de matrice extracellulaire et notamment de produit de comblement tel que défini dans ce qui précède, ou de leurs mélanges en toutes proportions. L'invention sera illustrée plus en détail par les exemples qui suivent Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes: Figure 1: coupe schématique d'un modèle à inclusion unique Figure 2: coupe schématique d'un modèle d'injection en série Exemple 1: préparation d'un modèle inclusion Les milieux et tampons utilisés sont décrits dans Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274- 1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7). Stérilement, on prépare la `solution finale lattis' dans un tube Falcon. Pour la réalisation d'une lattis, on mélange 4,6m1 de MEM 1,76X, 0,9m1 de sérum de veau foetal (SVF), 0,5m1 de NaOH à 0,1N, 0,28m1 de MEM Hépès à 10%SVF. A cette solution, ajouter 1,42 millions de fibroblastes à partir de la solution initiale de fibroblastes concentrés à 2 millions par ml dans du MEM Hépès à 10% SVF, soit 0,71 ml. Les fibroblastes issus de plastie mammaires ont été préalablement isolés et amplifiés selon la méthode décrite par Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7). A cette solution, ajouter 3m1 de solution de collagène bovin (Ci=Smg/ml soluble dans 0.017N d'acide acétique), on dénommera le mélange ainsi crée solution lattis. Réalisation technique 1 : Déposer dans une boite de pétri (60mm de diamètre) un anneau de clonage (ensemencement bactériologique) diamètre externe 0.8 cm. Couler 7 ml de solution lattis autour de l'anneau. Attendre 10 minutes à 37°C, 5% CO2 pour avoir gélification de la solution et retirer l'anneau. Dans cette dépression crée par l'anneau, déposer directement 100p1 d'acide hyaluronique à l'aide de la seringue montée avec une aiguille. Recouvrir ensuite la totalité de cette première couche ainsi formée par 3ml de solution lattis. L'inclusion du produit de comblement ainsi est bien concentrée au même endroit. Réalisation technique 2 : Déposer 9ml de solution lattis dans une boite de pétri (60mm de diamètre). Attendre 10 minutes la gélification de la solution à 37°C, 5% CO2. Injecter les 100p1 d'acide hyaluronique, directement en une seule fois, à l'aide de la seringue montée sur aiguille dans cette pré-lattis. La recouvrir de l ml de solution lattis. La préparation ainsi réalisée est placée à l'incubateur 37°C, 5% CO2 pendant 4 jours, temps au bout duquel la lattis s'est contractée à 90%. Pendant ce laps de temps, contrôler que la lattis n'adhère pas au fond de la boîte de Pétri. La lattis est `collée' au fond d'une boîte Corning (60mm de diamètre) traitée pour la culture cellulaire à l'aide du mélange suivant : 0.46 ml MEM 1.76 X, 0.09 ml FCS, 0.05 ml NaOH, 0.1N, 0.1 ml MEM Hépes 10% FCS. Placer la boîte et la lattis contenue, sans milieu de culture, à l'incubateur pendant 20 min pour permettre au mélange de `colle' de se figer et fixer ainsi la lattis au fond de la boîte. Déposer un anneau en métal sur la lattis et ensemencer dans l'anneau 0,5m1 de suspension de kératinocytes concentrée initialement à 100 000 cellules/ml dans du milieu de culture MEM10%SVF+3 F. Dans le reste de la boîte, ajouter du milieu de culture MEM10%SVF+3F. Placer le tout dans l'incubateur 37°C, 5% CO2 pendant2 heures. A l'issu de ce temps, retirer l'anneau. La prolifération des kératinocytes sur l'équivalent de derme est permise pendant au moins 7 jours. La culture est alors placée à interface air/liquide à l'aide d'une grille de métal dans une boîte de Pétri dans du milieu de culture MEM10%SVF+3F. La culture est prolongée pendant au moins une semaine, temps au bout duquel la différenciation de l'épiderme peut être accomplie (présence des couches épidermiques : basale, suprabasale, granuleuse et cornée). La figure 1 représente une coupe schématique du modèle ainsi obtenu Exemple 2: préparation d'un modèle injection en série35 Les milieux et tampons sont préparés comme décrit dans l'exemple 1. On coule 9ml de solution lattis dans une boite de pétri (60mm de diamètre). Attendre 10 minutes la gélification de la solution à 37°C, 5% CO2. 100p1 d'acide hyaluronique sont délivrés par dose de 10-15p1, à l'aide de la seringue montée sur aiguille dans toute la pré- lattis. Recouvrir de l ml de solution lattis. La préparation ainsi réalisée est placée à l'incubateur 37°C, 5% CO2 pendant 4 jours, temps au bout duquel la lattis s'est contractée à 90%. Pendant ce laps de temps, contrôler que la lattis n'adhère pas au fond de la boîte de Pétri. La lattis est `collée' au fond d'une boîte Corning (60mm de diamètre) traitée pour la culture cellulaire à l'aide du mélange suivant : 0.46 ml MEM 1.76 X, 0.09 ml FCS, 0.05 ml NaOH, 0.1N, 0.1 ml MEM Hépes 10% FCS. Placer la boîte et la lattis contenue, sans milieu de culture, à l'incubateur pendant 20 min pour permettre au mélange de `colle' de se figer et fixer ainsi la lattis au fond de la boîte. Déposer un anneau en métal sur la lattis et ensemencer dans l'anneau 0,5m1 de suspension de kératinocytes concentrée initialement à 100 000 cellules/m1 dans du milieu de culture MEM10%SVF+3 F. Dans le reste de la boîte, ajouter du milieu de culture MEM10%SVF+3F. Placer le tout dans l'incubateur 37°C, 5% CO2 pendant2 heures. A l'issu de ce temps, retirer l'anneau. La prolifération des kératinocytes sur l'équivalent de derme est permise pendant au moins 7 jours. La culture est alors placée à interface air/liquide à l'aide d'une grille de métal dans une boîte de Pétri dans du milieu de culture MEM10%SVF+3F. La culture est prolongée pendant au moins une semaine, temps au bout duquel la différenciation de l'épiderme peut être accomplie (présence des couches épidermiques : basale, suprabasale, granuleuse et cornée). La figure 2 représente une coupe schématique du modèle ainsi obtenu. Exemple 3: stimulation de la production de collagène Des coupes de tissus congelés d'une peau reconstruite témoin (aucun produit/pas d'inclusion) et d'une peau reconstruite `inclusion' préparée comme décrit à l'exemple 1 (produit acide hyaluronique réticulé avec BDDE, 20mg/ml) sont réalisées pour une épaisseur de 5pm au cryostat. Ces coupes, rincées au PBS, sont incubées pendant 2 heures avec une protéine BHABP, (couplée à une biotine) qui reconnait l'acide hyaluronique (Seigakagu Ref.400763-1A) à TA. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps secondaire streptavidine (couplé à un Alexa fluor 555) qui reconnait la biotine (Invitrogen Ref.S32355) à TA pendant 45 min. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps primaire antiprocollagène I humain fait chez le rat (Chemicon Ref.MAB1912) pendant 30min à TA. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps secondaire anti-rat fait chez la chèvre et couplé à un FITC (Jackson Immunoresearch Ref.112095068) pendant 30min à TA. Les coupes sont rincées au PBS et contre-colorées avec du Hoechst pendant 5", rincées à nouveau et monter dans milieu de montage sous lamelle. L'observation est réalisée au microscope à fluorescence (modèle DMDR, Leica Microsystems). Le résultat est représenté sur la figure 3 On observe que le modèle inclusion met en évidence une augmentation du procollagène I (précurseur du collagène qui est néosynthètisé) directement ou à proximité au-dessus de l'inclusion d'acide hyaluronique. Les résultats sont à rapprocher de résultats in-vivo publiés, observés avec un autre acide hyaluronique réticulé.15 Revendications1- Equivalent de peau in vitro comprenant au moins un équivalent de derme contenant des fibroblastes vivants et un équivalent de matrice extracellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une inclusion d'au moins un produit de comblement ne contenant pas de fibroblastes, la composition dudit produit de comblement étant au moins partiellement distincte de celle de l'équivalent de matrice extracellulaire et en ce que les fibroblastes sont contractés. 2- Equivalent de peau in vitro selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un équivalent d'épiderme contenant des kératinocytes. 3- Equivalent de peau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'inclusion contient un produit de comblement choisi parmi l'acide hyaluronique modifié ou non, le collagène, l'élastine, l'acide polylactique les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques et leurs mélanges. 4- Equivalent de peau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes papillaires. 5- Equivalent de peau selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes réticulaires. 6- Equivalent de peau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité d'inclusions. 7- Equivalent de peau selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les constituants de la matrice extra-cellulaire comprennent au moins du collagène I, du collagène III ou leurs mélanges. 8- Procédé de préparation d'un équivalent de peau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire et des fibroblastes, ledit mélange étant placé dans une enceinte, b) on met en contact le mélange obtenu à l'étape a avec au moins un volume fini d'au moins un produit de comblement, c) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et contenant des inclusions de produit de comblement qui constitue l'équivalent de derme. 9- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'après l'étape c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme. 10-Procédé de préparation selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'à l'étape a) (i)on délimite un volume v1 dans une enceinte par des moyens au moins partiellement étanches, puis on répartit le mélange des constituants de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes dans l'enceinte à l'exception du volume v1, et on laisse un temps suffisant pour permettre au mélange de gélifier, et (ii) on retire les moyens au moins partiellement étanches, et en ce qu'à l'étape b), (i) on introduit le volume fini de produit de comblement dans le volume v1 délimité à l'étape a) et (ii) on recouvre l'ensemble par un mélange de constituants de matrice extra-cellulaire et de fibroblastes similaire à celui mis en oeuvre à l'étape a). 11-Procédé de préparation selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'à l'étape a, on laisse le mélange pendant un temps suffisant pour lui permettre de gélifier, et en ce qu'à l'étape b on introduit plusieurs volumes finis de produit de comblement dans le mélange gélifié. 12- Procédé d'évaluation d'un produit de comblement caractérisé en ce qu'on prépare un équivalent de peau selon le procédé de l'une au moins des revendications 8 à 11, et en ce qu'on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de I"équivalent de peau contenant ledit produit de comblement. 13-Utilisation d'un équivalent de peau tel que défini dans l'une au moins des revendications 1 à 7 pour l'évaluation d'un produit de comblement.25