Brevet FR2950075A1 — publié le 20110318

Test pharmaco diagnostic ciblant l'oncologie : cancers épidermoïdes DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la médecine et de la biologie. Elle concerne un nouveau test de dépistage et de suivi thérapeutique en oncologie. Plus particulièrement, elle se rapporte aux tests diagnostics et/ou thérapeutiques en oncologie. Le ciblage moléculaire par des vecteurs peptidiques ou des siRNA ouvre à une nouvelle conception de l'interdépendance qu'il y a entre outils diagnostiques et thérapeutiques qui maintenant vont de paire et ouvre la voie du pharmacodiagnostic. La compréhension des jeux d'équilibre éntre surexpression et sous expression des gènes suivant leur localisation dans un compartiment cellulaire ou un autre fonction de l'état de prolifération permet d'ouvrir des perspectives d'analyse différentielle plus fine et d'adapter une multithérapie ciblée à l'aide de siRNA et autres biomolécules par ciblage moléculaire. L'inventeur met en évidence les mécanismes d'interactions moléculaires impliquant les cations divalents et leurs rôles dans la formation des lésions. Il met également en évidence l'intérêt d'une multi thérapie additionnée d'adjuvants thérapeutiques pour ralentir la formation de ces lésions. ABREGE: La présente invention concerne . de nouvelles séquences polypeptidiques, ribonucléotidiques et nucléotidiques à intégrer à un nouveau test de dépistage de la réinduction du cycle cellulaire ciblant l'oncologie et l'utilisation de certaines de ces mêmes séquences fonctionnalisées comme traitement adjuvant par ciblage moléculaire. Il s'agit d'un perfectionnement majeur sans lequel le diagnostic et le test pharmaco diagnostique ne pourrait être que partiel. La conséquence en serait un traitement moins efficace et d'application moins large suivant l'hétérogénéité des cancers. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation du gènes ou des protéines du complexe LIV21 ainsi que leurs dérivés comme outils thérapeutiques et comme marqueurs diagnostics et pronostic des cancers. L' invention concerne la détection du gène ou de la protéine LIV21 avec un kit comprenant des anticorps ou des sondes spécifiques de LIV21 mais aussi l'invention est d'utiliser l'ensemble des marqueurs de proliférations et facteurs de transcription qui jouent un rôle dans le processus de cancérisation. L'invention réside dans l'utilisation de la RT PCR et de la PCR quantitative jumelée à la fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines des complexes protéiques associés suivant les phases du cycle cellulaire au complexe LIV21 c'est-à-dire sans restriction à celles là : peptides et anticorps de RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, crli2, Int2,cmd2, cycE/cdk2,cdkl, CREB1 et p300, Rb, p107, p130 de la familles des pockets protéines, NFkB , cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, BRCA1, TNFalpha , TGF beta. DESCRIPTION DE L'ETAT DE L'ART La révolution thérapeutique actuelle permet de trouver des moyens de traitements plus ciblés ayant une plus grande efficacité si on travaille avec des biomolécules ayant un nombre de récepteurs plus restreints, des artifices de ciblage moléculaire pourraient permettre une meilleure efficacité comme par exemple déjà on peut le voir avec les RNA interférence employer pour permettre un silencing d'une molécule ayant un rôle précis. Un jeu de marqueurs qui puisse donc révéler la prolifération cellulaire serait d'une grande utilité. Les maladies neurodégénératives liées à l'âge et les cancers impliquent tous les deux une modification du processus physiologique de la mort cellulaire programmée ou apoptose. La mort neuronale est anormalement accélérée au cours des maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer, Huntington, Parkinson etc... En revanche, le processus de cancérisation correspond à un blocage de l'apoptose conduisant à une multiplication incontrôlée des cellules. Le lien entre ces deux processus est actuellement devenu un champ d'investigation majeur de recherche sur le vieillissement.30 Le contrôle de l'équilibre entre division cellulaire (mitose), différenciation et mort cellulaire programmée (apoptose), est fondamental au cours de processus physiologiques normaux, comme le développement embryonnaire, la régénération des tissus et le vieillissement. Une altération de cet équilibre peut conduire à des situations pathologiques majeures comme la formation de tumeurs ou certaines maladies neurodégénératives. Le cancer est l'une des causes principales de mortalité à travers le monde. Alors que, au cours de la dernière génération, les pourcentages de décès reliés aux maladies cardiaques, cardiovasculaires et un bon nombre d'autres maladies sont à la baisse, le nombre de décès relié aux différentes formes de cancer est à la hausse. Malgré l'avancement rapide de notre compréhension des différentes formes de cancer, les faibles taux de survie sont généralement attribuables à un diagnostic et un traitement inadéquats. La plupart des tumeurs ne peuvent être détectées que lorsqu'elles atteignent une taille critique. Puisqu'il y a un laps de temps relativement court du développement continu d'une tumeur jusqu'à un stade devenant incompatible avec la survie, cela laisse peu de temps pour une intervention thérapeutique. Donc, le diagnostic précoce devient la clef du succès pour le traitement du cancer. Pour une multitude de raisons, le diagnostic précoce actuellement demeure illusoire pour la plupart des formes de cancer. Pour certaines formes de cancer, des marqueurs spécifiques de la maladie ne sont pas disponibles ou ne le sont seulement qu'à un stade avancé de la maladie, rendant le diagnostic difficile. Pour certaines autres formes de cancer, les marqueurs sont disponibles mais ne sont pas toujours spécifiques à la maladie ou ils peuvent être associés à sa forme bénigne. Dans d'autres cas encore, les techniques existent mais le coût prohibitif pour les appliquer à la population en général les rend inappropriées. Ces cancers ont un intérêt à être étudiés et diagnostiqués par biopuce incluant les biomarqueurs des pathways majeurs de régulation pour permettre un ajustement de la multithérapie fonction des résultats de sous expression et de surexpression des gènes du complexe Liv21. Ainsi le traitement par ciblage moléculaire type siRNA ou anticorps monoclonaux combiné ou non avec des actifs thérapeutiques chimiques est d'une plus grande efficacité. Le cancer de la peau par exemple est le cancer le plus répandu au Canada. En 1992 uniquement, 50 300 nouveaux cas de cancer de la peau ont été rapportés, comparés aux 10 19 300 cas de cancer du poumon, aux 16 200 cas de cancer colorectal et aux 15 700 cas de cancer du sein. En d'autres mots, le cancer de la peau est aussi fréquent que les 3 principaux types de cancers réunis. Son incidence continue de croître avec ses 64 200 nouveaux cas en 1997, soit une augmentation de 14 000 cas annuellement en 5 ans. En particulier, l'incidence du mélanome malin croît à un taux de 2% par année. Le 15 diagnostic précoce demeure la clef d'un traitement efficace. Une tumeur maligne est facilement accessible et peut être enlevée à l'aide d'une chirurgie mineure. En fait, la guérison est de 100% si le cancer de la peau est détecté assez tôt. Le diagnostic précoce du cancer de la peau demeure toutefois difficile. Celui-ci n'est pas qu'une seule maladie mais toute une gamme de conditions reliées les unes aux autres, qui apparaissent 20 similaires dans bien des cas à l'inspection visuelle. Un diagnostic basé sur une telle inspection est donc subjectif. Pour mieux comprendre cette subjectivité, considérons une croissance anormale de la peau. Cette croissance peut être pigmentée ou non-pigmentée. Si elle est non-pigmentée et maligne, il s'agit probablement alors d'un épithélioma basocellulaire ou un épithélioma spinocellulaire. Cependant, le 25 développement clinique de ces 2 formes de cancer est fort différent. Un épithélioma basocellulaire se répand de façon latérale sur la surface de la peau, sans pénétrer dans les couches plus profondes de la peau. Ainsi, bien que pouvant défigurer, un épithélioma basocellulaire développe rarement des métastases et est rarement mortel. Cependant, un épithélioma spinocellulaire provoque des métastases et est souvent 30 mortel. Il devient donc important d'être capable de distinguer ces 2 types de cancer de la peau. Un diagnostic définitif du cancer de la peau requiert une biopsie et une analyse histologique. Cependant, la décision d'envoyer une biopsie pour analyse (ou même si un patient doit être référé à un dermatologiste) devient très subjective. Il y a plusieurs biopsies qui ne sont pas prises alors qu'elles auraient dû l'être. Le cancer du colon est la troisième cause de mortalité reliée au cancer chez les hommes et les femmes en Amérique du Nord (16 200 cas par année). La détection précoce, menant à une intervention précoce, a démontré que l'on peut améliorer le succès du traitement et le taux de survie. Par exemple, le taux de survie sur 5 ans est de 92% pour 10 un patient dont la maladie a été détectée à un stade précoce, alors que le taux descend à environ 60% chez les patients avec un cancer localisé, et à environ 6% chez ceux présentant des métastases. Cependant, seulement le tiers des cancers du colon est détecté à un stade précoce. Une des raisons de ce délai dans le diagnostic est l'absence d'un test de dépistage sensible, peu dispendieux et non-invasif. 15 Le cancer du sein est un des plus communs chez la femme avec le cancer du colon. Le taux de mortalité est le plus élevé de tous les cancers affectant les femmes. Il y a très peu de marqueurs diagnostics capables de détecter le cancer du sein et ils ont 20 seulement une valeur prédictive de 20%. Il n'y a pas non plus de marqueurs qui puissent détecter ou déterminer l'invasivité et l'agressivité des cellules cancéreuses métastatiques ou qui permettent un suivi thérapeutique. Ces cancers ont un intérêt à être étudiés et diagnostiqués par biopuce incluant les biomarqueurs des pathways majeurs de régulation pour permettre un 25 ajustement de la multithérapie fonction des résultats de sous expression et de surexpression des gènes du complexe Liv21. Ainsi le traitement par ciblage moléculaire type siRNA ou anticorps monoclonaux combiné ou non avec des actifs thérapeutiques chimiques est d'une plus grande efficacité. Au cours des dernières années, des progrès considérables ont été faits dans la compréhension des moyens mis en oeuvre par les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs pour réguler la prolifération cellulaire et l'apoptose. L'une des cibles principales de ces régulateurs est la famille des facteurs de transcription de type E2F (E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 etc...) dans la voie de signalisation des protéines E2Fs et RB. Ces protéines jouent un rôle central dans le contrôle de la division cellulaire en couplant la régulation des gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire aux signaux extracellulaires (mitogènes, inhibiteurs de la prolifération). Elle se comporte comme un oncogène en stimulant la prolifération des cellules tumorales. Myc N et l'Aurora kinase A sont aussi des oncogenes impliqués dans la prolifération du neuroblastome. E2F3 module l'expression de l'ARN m d'Aurora pendant le cycle cellulaire. Par ailleurs certaines données suggèrent que les facteurs de transcription E2F sont critiques pour l'activation totale et la répression de myc N dans les tumeurs. La combinaison des dosages des gènes De Myc N et de la survivin par RTPCR est corrélée au stade d'évolution clinique du cancer. Parmi les gènes exprimés, on trouve : - La sur-expression du facteur de transcription E2F4 et l'oncogène c-myc qui induisent l'apoptose des cellules post mitotiques par accumulation de réactif oxygénés (Tanaka, 2002) et le N Myc qui est amplifié, le gène ALK, DDX1 et CRABP II aussi . HMGA1 et la survivine également. La répression d'HMGAl par RNA interference reduit la proliferation cellulaire. N myc induit l'expression de FAK. N myc down régule l'expression mRNA de nombreux gènes ayant un rôle dans l'architecture cellulaire. - le gène p53, appartenant à la famille des gènes suppresseurs de tumeur, bloque le cycle cellulaire en cas de lésion de l'ADN. Il est maintenant démontré que ce gène est aussi impliqué dans le déroulement de l'apoptose (Oren, 1994 ; Yonish-Rouach, 1996). - la cycline Dl, une des protéines constituant les sous-unités régulatrices des kinases du cycle cellulaire, indispensable à la progression du cycle cellulaire. Cette protéine est aussi exprimée au cours de l'apoptose dans divers types cellulaires (Han et al, 1996 ; Pardo et al, 1996). Un facteur de transcription Zinc finger peut interompre l'activité de la cycline Dl et bloquer le cycle. Des données suggèrent que les facteurs de transcription E2F sont critiques pour l'activation totale et la repression de MYCN. - chkl et 2, crb2, p21 et autres oncogènes et cytokines comme le TNF alpha etc.... Il serait souhaitable de disposer de nouvelles méthodes diagnostic qui détecterait la présence de cancer avec plus de spécificité et qui permettrait la distinction entre les cellules cancéreuses agressives ayant une tendance à métastaser par rapport à celles plus localisées qui ont une faible probabilité de métastaser. Un marqueur qui puisse donc révéler la prolifération cellulaire serait d'une grande utilité. Le complexe LIV21 sera étudié par RT PCR et par biopuce et ses marqueurs cytoplasmiques d'interêt et la proteine membranaire du complex Liv 21 aussi. 21 marqueurs supplémentaires et de nouvelles séquences du complexe LIV21 par rapport au premier et au deuxième brevet déposés vont permettre une amélioration notable et un perfectionnement des tests pharmaco diagnostiques que nous proposons. C'est grâce à ce perfectionnement que l'ajustement thérapeutique en multithérapie pourra permettre une plus grande efficacité de traitement et aussi c'est grâce à ce perfectionnement que le diagnostic des tumeurs gliales se fera plus précisément avec une connaissance plus approfondie sur le pronostic, le grade et l'évolution de ces tumeurs. Un autre perfectionnement a permis d'avoir une précision plus grande dans l'étude des niveaux d'expression des différents gènes importants pour le diagnostic de tumeur gliale, il s'agit de la mise au point d'une normalisation des prélèvements de tissus comme des ponctions. Ainsi les comparaisons de profils d'expression sont plus fiables et subissent moins de fluctuations dûes à des biais d'observation. Tous ces nouveaux paramètres qui n'augmentent pas le nombre de variables mais qui diminuent le bruit de fond améliorent grandement le diagnostic et les traitements des tumeurs gliales. RESUME DE L'INVENTION La présente invention concerne de nouvelles séquences polypeptidiques, ribonucléotidiques et nucléotidiques à intégrer à un nouveau test de dépistage de la réinduction du cycle cellulaire ciblant l'oncologie et l'utilisation de certaines de ces mêmes séquences fonctionnalisées comme traitement adjuvant par ciblage moléculaire. Il s'agit d'un perfectionnement majeur sans lequel le diagnostic et le test pharmaco diagnostique ne pourrait être que partiel. La conséquence en serait un traitement moins efficace et d'application moins large suivant l'hétérogénéité des cancers. Il s'agit donc d'un test diagnostic et d'un test pronostic pour différents cancers épidermoïdes. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation du gènes ou des protéines du complexe LIV21 ainsi que leurs dérivés comme outils thérapeutiques et comme marqueurs diagnostics et pronostic des cancers. L'invention concerne donc la détection du gène ou de la protéine LIV21 avec un kit comprenant des anticorps ou des sondes spécifiques de LIV21.mais aussi l'invention est d'utiliser l'ensemble des marqueurs de proliférations et facteurs de transcription qui jouent un rôle dans le processus de cancérisation et de neurodégénerescence pour certains. Donc l'invention réside dans l'utilisation de la RT PCR et de la PCR quantitative ( Q PCR) jumelée à la fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines des complexes protéiques associés suivant les phases du cycle cellulaire au complexe LIV21 c'est-à-dire sans restriction à celles là : peptides et anticorps de RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, crb2, Int2,cmd2, cycE/cdk2,cdkl, CREB1 et p300, Rb, p107, p130 de la familles des pockets proteines. Mais aussi NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, BRCAl, TNFalpha , TGF beta. Les séquences nouvelles sont les séquences polynucléotidiques et polypeptidiques de Liv2lF , Liv 21H etc... (liste additionnelle : SEQ N°171 à 185) ) et les séquences de gènes, protéines et anticorps correspondants nouvellement intégrés dans les biopuces pharmaco diagnostiques sont : Myc N, ALK, HMGA1, DDX1, GFAP, NF70, AD7cNTP, FAB3, Serin C2, Synemine, PDX1, HDAC6, TPX2, DKK1, DKK3, HUD, ID2, SKP2, TP531NP1, VEGF, NLRR1, 30 PAX3-FKHR, NDP kinase A, Aurora A, Survivine Les puces à protéines permettront d'étudier les interactions protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les phosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade différent des interactions protéiques et du métabolisme de la cellule saine. L'état d'expression et de silencing de certains gènes étant différent. Le taux d'expression de chaque biomolécule devant être observée distinctement dans chaque compartiment cellulaire pour pouvoir dans un second temps être régulé (sous exprimé ou sur exprimé par un traitement adjuvant type biomolécule ou siRNA ou peptides vectorisés. Les puces à séquences nucléotidiques permettront d'étudier dans des extraits cellulaires nucléaires et par ailleurs cytoplasmique ou membranaires les sous expressions ou les surexpressions des gènes et les ratio entre gènes comme entre protéines du complexe Liv21 et de ses partenaires associés, l'analyse des interactions au sein des complexes métaboliques est une clé du diagnostic et passe aussi par l'étude des domaines fonctionnels. Un premier objectif de la présente invention est de mettre en évidence une méthode de détection et de pronostic du cancer et de son potentiel métastatique qui permette d'ajuster une multithérapie ciblée. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers cérébraux, et plus particulièrement les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie, sans être limité à ceux-ci. Un aspect de la présente invention consiste en l'utilisation des nouvelles séquences du complexe LIV21 comme indicateur pronostic du cancer et dans son suivi thérapeutique. En effet, lorsque LIV21 F est localisé dans le cytoplasme, les cellules cancéreuses dans les tissus sont agressives. Inversement, lorsque le produit de l'expression du gène LIV21F est localisé préférentiellement dans le noyau cellulaire, ceci est un indicateur pronostic que les cellules du tissu sont différentiées et quiescentes et donc non invasives. On définit le complexe LIV21 par l'extrait de protéines et peptides étudiés en spectrométrie de masse type Maldi et ESI MSMS ou Maldi Tof Tof. Lequel extrait a été 10 obtenu par l'accrochage du complexe Liv2l à un de ces anticorps polyclonaux de LIV21 décrit dans le brevet (PCT/FR2006/000510). Le complexe Liv21 se définit aussi par son profil global de spectrométrie de masse (Fig 5) et le nombre et le Poids moléculaire des bandes d'extraits protéiques obtenus sur les gels d'acrylamide des figures IA et IB fonction de la température à laquelle est soumis l'échantillon et des conditions de migration décrites. En effet, lorsque par exemple le peptide LIV21F est localisé dans le cytoplasme et qu'on révèle directement par hybridation in situ par exemple ou par analyse de biopuce sa plus forte expression dans le cytoplasme, les cellules cancéreuses dans les tissus sont agressives. Inversement, lorsque le produit de l'expression du gène LIV21F ou l'expression d'un peptide comme LIV21F est localisé préférentiellement dans le noyau cellulaire, ceci est un indicateur pronostic que les cellules du tissu sont différentiées et quiescentes et donc non invasives. Cette observation associé' c.l'étude d'expression, de phosphorylation et de localisation des autres facteurs du complexe LIV21 et de ces partenaires d'interaction,. L'efficacité d'un traitement du cancer peut également être suivie par la traçabilité de ces nouvelles séquences et de ces protéines LIV21F et LIV21K, de son complexe LIV21, de ses dérivés et des ratios avec les protéines associées. Mais aussi par diagmicroarray et sensorchip contenant entre autre cette protéine et son complexe Liv21 associé (Exemples 7.1 et 7.2 û Figures 19 et 20) Par ailleurs, la détection de la protéine kinase C epsilon (PKCs) 'est également intéressante puisqu'il a été déterminé que PKCc phosphoryle la protéine LIV21 pour la maintenir dans le cytoplasme. Ainsi, une augmentation significative de PKCs est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, le rapport LIV21/ PKC6 augmente dans la fraction cytoplasmique de cellules cancéreuses. Il en est de même de la détection de HDAC1 qui a été montré comme LIV21 comme impliqué dans les complexes PMLJSUMO/Rb/HDAC-1 De façon plus générale la famille des HDACs joue un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes, quand elles sont surexprimées elles entraînent le silencing des gènes suppresseurs de tumeurs d'où l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs HDAC en thérapie associés à d'autres inhibiteurs régulant la cascade métabolique impliquant le complexe protéique qui contient LIV21. En outre, la détection des protéines E2F 1, E2F2, E2F3 et/ou E2F4 présente un intérêt. En effet, La protéine LIV21 forme un complexe avec E2F4 qui est capable d'inhiber l'expression du gène E2F1 dans le noyau, l'expression du gène E2F1 étant un signe de prolifération cellulaire. Ainsi, une diminution de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 est indicative de la présence de cellules cancéreuses. De même, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. En conséquence, la présente invention concerne une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique de tissu (par exemple, sein, ovaire, endomètre, vessie, mélanome, prostate, glioblastome etc....) de patients, cette méthode comprenant la détection des produits de l'expression des gènes du complexe LIV21 dans le noyau comparativement à ces mêmes produits dans le cytoplasme et les membranes des cellules dans l'échantillon biologique de tissu dudit patient, cette méthode comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21F dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique de tissu dudit patient, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21F dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21F dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses. De préférence, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21F dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques, les localisations des différents produits d'expressions des gènes du complexe LIV21 et de ses partenaires associés décrites dans les exemples de biopuces indiquent ou non la présence de cellules cancéreuses. Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCc), le gène E2F1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCs, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau séparément de préférence. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine. Le niveau d'expression de chaque enzyme ou polypeptide du complexe SUMO/Rb/HDAC ou pour certains types cellulaires du complexe PML/ SUMO/Rb/HDAC est un indicateur supplémentaire de l'état de prolifération de la cellule. Ces rapports d'expression ou de silencing peuvent être détectés via le niveau d'expression ou d'inhibition des protéines elles même dans des microarrays (biopuces) fabriqués selon les méthodes classiques décrites (Lubman David M,QIAO TIECHENG Alex,Mathew ABY J etc..) ou de nouveaux outils d'automatisation d'hybridation comme de lecture US2004152212 et Yu Xinglong US 2005019828 et de nouveaux supports accrochant les polypeptides ( brevets US 2008 213130 et US 2005/0157445 ou US 2006 17 09 25 ou WO 2005 016515 , Klages Claus Peter et exemple figure 20). Avant de redécrire le principe de ces biopuces qui sont bien connues de l'homme de métier, on redonnera les définitions suivantes : L'échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de tumeur, de moelle osseuse, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrits de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARN r issus d'autres gènes que le gène cible et de préférence les extraits à étudier seront analysés quand il s'agit de cultures cellulaires directement sur cultures fraîches avec ou sans traitement préalable aynt subies un prtocole d'extraction séparant les compartiments cellulaires. Ce type de kit connu de l'homme de métier permet par un jeu de tampon subtils d'extraire uniquement les membranes ou seulement ce qui est contenu dans le cytoplasme ou le noyau ou le cytosquelette et cela de façon différentielle. On peut utiliser le kit Proteo extract (ref 539790) de calbiochem par exemple. L'autre aspect de la présente invention est l'utilisation des gènes et des protéines citées ci dessus comme marqueurs de l'invasivité et de l'agressivité métastatique des cellules cancéreuses de cancers cancéreuses de cancers prostate, colon, de vessie, du mélanome, ovaire, endomètre, col et cancers. ou en ORL etc. En effet des tests pharmaco diagnostics successifs dans le suivi d'un traitement permettront d'observer par comparaison au fil du temps les variations des taux d'expression des gènes ou de leur silencing et ainsi de mieux évaluer l'efficacité des traitements, de réajuster ces traitements dans le cadre de multithérapie adaptée afin que l'équilibre physiologique des différents produits des gènes impliqués dans ces complexes métaboliques soient maintenus. . La plasticité de ces équilibres justifie qu'on utilise des biopuces diagnostiques et pour le suivi thérapeutique avec les gènes les plus pertinents des complexes métaboliques impliqués dans la physiologie de la prolifération anarchique dans le cas du cancer du sein qui est très hétérogène. Donc chaque individu ou chaque sous groupe phénotypique d'individus va montrer un profil de sous expressions et de sur expressions des gènes des complexes métaboliques impliqués qui lui est spécifique. Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm. L'ARNm peut être détecté par une analyse RT-PCR (cf exemples ci-joint). Il peut également être détecté par une analyse Northern blot ou par SPR si les ARNm et ADN sont fonctionnalisés à la surface de particules electrodéposées sur un support biopuce. (techniques décrites entre autre dans les brevets US 2008 213130 et US 2005/0157445 ou US 2006 17 09 25 ou WO 2005 016515). La technique MICAM qui utilise l'effet piezo électrique dans ses biopuces peut être aussi utilisée pour l'invention précitée de biopuce pharmaco diagnostiques dédiées aux cancers épidermoTdes et plus spécifiquement dédiés les cancers du sein, ovarien et de prostate. Dans un mode de réalisation alternatif, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine ou des peptides caractérisant le complexe Liv21 et ses partenaires d'interaction. De préférence, la protéine et / ou le complexe protéique LIV21 associé est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Par exemple, la protéine peut être détectée par une analyse Western blot et par SPR, par un système de biopuce utilisant une onde de propagation transversale (onde évanescente) de surface plasmon résonance (SPR). L'interaction peut se faire avec une surface électronique, la surface serai conductrice crée un exiton par luminescence ou par fluorescence. Dans un mode de réalisation préféré, elle est détectée par immun histochimie, immuno cytochimie, micro fluidique, radiographie ou par marquage à la peroxydase ou par tout autre moyen d'imagerie optique, sonique ou de spectroscopie. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCa, une augmentation significative de PKCs est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détennination du rapport LIV21/ PKCs dans le noyau et/ou, les membranes et le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Une augmentation du rapport LIV21/ PKCs dans la fraction cytoplasmique est indicative de cellules cancéreuses. Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association dans le noyau cellulaire étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F4 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F1 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détection d'un si RNA marqué afin de cibler la séquence spécifique qui le caractérise et ainsi signaler le lieu de l'expression de l'ARN messager du gène d'intérêt. Ainsi le si RNA spécifique peut être utilisé comme marqueur diagnostic comme le serait un anticorps et permettre de localiser dans un cas particulier comme sur des extemporanés ou tout type d'échantillon prélevé sur un patient par exemple échantillon de tissu cancéreux, la fluorescence pour tout autre marquage utilisé sur le si RNA et retrouvé dans un compartiment cellulaire sur l'échantillon, un si RNA du gène E2F1 et E24 et PKC epsilon permettrait un diagnostic complémentaire. La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement. Un deuxième aspect de l'invention concerne la protéine LIV21 humaine ainsi que les fragments de celle-ci. Plus particulièrement, la présente invention concerne une protéine LIV21 humaine isolée, purifiée ou recombinante comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 à 5 ou de façon plus générale parmi les séquences peptidiques le caractérisant obtenues par MALDI (Figure 3,4 et 5) et NanoLC-ESI-MS. Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide comprend les trois séquences peptidiques SEQ ID Nos 1 et 2 et 3. De préférence, la protéine LIV21 F et certaines proteines du complexe LIV21 comprennent un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à l'ADN (figure2), et une séquence de nucléarisation.). Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne des polypeptides dont la séquence consiste en une séquence peptidique caractérisée par les spectrogrammes des figures 3,4,5 des bandes de gels 1,2 et 3, sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2 et 3 et 4 et 5 et la vingtaine de séquences supplémentaires non ordonnées (cf. séquences listées en annexe), les autres séquences de la protéine étant à vérifier par rapport à leurs homologies avec des contaminants et à ordonner lors des spectrométries de masse MSMS sur les fragments unmatched repérés dans les analyses MALDI TOF (cf. figures 3,4,5), ces fragments unmatched correspondant à des masses M (H+) non étiquetées caractérisent en partie la protéine LIV21 et certains éléments de son complexe protéique. Un troisième aspect de l'invention concerne un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention. Plus particulièrement, l'anticorps peut se lier spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-120 et de préférence parmi SEQ ID N° 1 et 2 ou 3 et/ou 5 ou 51 ou une séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles ci. La présente invention concerne notamment un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal ou un humain avec un polypeptide selon la présente invention, notamment un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-120, de préférence parmi les séquences l à 5 et 51 ou une séquence présentant 70,80 ou 90% d'identité avec celles-ci. Un quatrième aspect de l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient, ce kit comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21F humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21 F selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21F ( sonde d'hybridation) et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LIV21F. Dans un mode particulier de l'invention, le kit comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'un gène ou une sonde oligonucléotidique spécifique de 1' ARNm des facteurs sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCc), le gène E2F1 et le gène E2F4. Mais aussi les anticorps sous forme de microarray d'anticorps de RBP2, SUMO,HDAC, TNFalpha , crb2, cycE/cdk2,cdkl, ,CREB1 et p300, Rb, p107, p130, NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki 67, CAFI, MYCN et microarray avec des peptides caractéristiques connus de l'homme de métier des protéines citées ci-dessus, leurs antigènes étant référencés. C'est la combinaison de ces différents peptides correspondant aux interactions spécifiques des complexes protéiques qui interviennent dans la dysrégulation du métabolisme qui engendre la prolifération anarchique spécifique du cancer ou la dégénerescence. L'invention concerne l'utilisation d'un anticorps spécifique de LIV2I humain pour le diagnostic du cancer et les anticorps de son complexe protéique mais aussi des anticorps spécifiques de RBP2, SUMO,HDAC, TNFalpha , crb2, cycE/cdk2,cdk1, ,CREB1 et p300, Rb, p107, p130, NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73. De même, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces ou d'une sonde spécifiques de LIV21 pour le diagnostic du cancer. De préférence, le diagnostic est effectué ex vivo sur des échantillons d'un patient. (ponction du liquide céphalorachidien, prise de sang, biopsie,_broyats cellulaires, aspirations bronchiques, puces à ADN, à Protéines, à anticorps, support hydrophobes, plasmioniques (SPR) ou à ions métalliques etc....) Méthode caractérisée en ce qu'en outre, elle met en oeuvre au moins l'une quelconque des sondes spécifiques des séquences dudit complexe Liv2 1 humain et de ses 25 partenaires associés Méthode est caractérisée en ce que ladite biopuce est: une biopuce à protéine, ou une biopuce à anticorps, ou 30 une biopuce à acide nucléotidiques, ou une biopuce à ARNm, ou une biopuce à siRNA. Méthode est caractérisée en ce que ladite étape de détection met en oeuvre tout moyen 5 d'imagerie optique, ou tout moyen sonique ou tout moyen de spectroscopie. Méthode est caractérisée en ce que ladite biopuce à protéine, ou ladite biopuce à anticorps, est constituée d'une biopuce de micro fluidique et pour laquelle ladite étape de détection consiste en une détection par SPR. Méthode est caractérisée en ce qu' elle comprend une étape d'amplification / rétro-transcription par RT-PCR d'au moins une séquence nucléotidique dudit complexe Liv2l humain selon la revendication 1 ou 2 ou dudit complexe Liv2l et de ses partenaires associés. 15 Méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend un test pharmaco-diagnostique pour le diagnostic du cancer ou le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire, ledit cancer étant préférentiellement choisit dans le groupe constitué par les cancers épidermoides,. 20 DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 A: gel monodimensionnel (gradient acrylamide 12%) révélant après trois heures trente de migration 11 bandes avec certains triplets et doublés de bandes et un gel bidimensionnel SDS Page d'extraits cellulaires totaux avec des spots entre 15 et 20 KD et à 29 û 32kD et 35 KD environ à PH basique et des spots à 190 û 180 et à 100kD 25 à PH acide. Des spots entre 49 et 51 KD et à 64 KD. En monodimensionnel : Des bandes à 180 kD environ (TOFC), 100 KD, 64 kD, 51 à 491d), 49 kD, 35 kD, 29 kD, 15 à17kD. Figure 1B : schéma des interactions des biomarqueurs du complexe LIV21 et des pathways métaboliques environnants. 18 10 Figure 2 : schéma des interactions protéiques nucléaires avec le domain DNA binding et conséquences sur l'étude de la thérapeutique ciblant le noyau et le cytoplasme cellulaire. Figure 3A: liste des pics monoisotopiques de la bande 1 à 50 kD et de la bande 2 a entre 49 et 50 KD Figure 3B :est le profil des protéines de LIV21 par Spectrométrie de masse (Maldi) M (H+) pour la bande de gel monodimensionnel correspondant à la bande 2 migrant à 49 - 50kD. les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant : Acetonitrile/eau (1/1)contenant 0,1% de TFA (acide trifluoro acétique). une solution saturée de la matrice acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique est faite dans le même solvant. On prélève un même volume des deux solutions, on melange et on depose 1 microlitre sur la plaque du Maldi pour analyse. La Figure 4 est un profil du spectrogramme de la bande 6 appelée 6FC L'analyse de novo MS MS Maldi TOF TOF permet de proposer les séquences : RYLVTPVNA, RYVPSSNLP, RYVLSPVK, RYVPSSNPL, RYLPSANPD Figure 4bis : analyse MSMS du pic monoisotopic 1032.58 : YRPGTVALR, RYVPSSNPL Le pic monoisotopique 944.6 est une sequence : FAVAFPVGR Le pic monoisotopique 1603.7 : KPSHPKPSTK Le pic 1328.69 : AHNLFKT , TFKNLC Les pics monoisotopiques communs entre le premier spectro 2004 (230304 imagenium 03_Hl 1_a 001 et le pic 6FC de 2008 sont : Les pics monoisotopiques suivants : 1135.563 ; 1151.545 ; 1167.604 ; 1206.589 ; 1324.634 ; 1336.658 ; 1507.735 ; 1604.710 ; 1800.940 ; 2087.034. La variation de protocole tient uniquement à trois étapes différentes : la premiere est la purification de l'anticorps utilisé, la seconde est la séparation des fractions cytoplasmiques et nucléaires, la troisième est le chauffage deux minutes à 100° de l'échantillon avant migration sur gel d'acrylamide. Figure 5 est le troisième spectrogramme correspondant à la bande de gel d'acrylamide 12% monodimensionnel migrant a 51- 52 KD et révélée par le bleu de coumassie et l'anticorps de LIV21. La figure 5bis est la liste des pics monoisotopiques du troisième spectrogramme 5 correspondant à la bande de gel d'acrylamide monodimensionnel migrand à 52 kD et révélée par le bleu de coumassie et l'anticorps de LIV21. Les pics monoisotopiques avec une valeur M H+. Les masses sont données avec trois chiffres derrière la virgule par les plateformes protéomiques car Ils estiment que c'est la limite de la précision d'acquisition des machines MALDI TOF. 10 Les figures 3-5 décrivent les analyses en MALDI donnant un jeu de séquences polypeptidiques assignables à LIV21. et son complexe et des contaminants parfois différents suivant les observateurs des différentes plateformes de protéomiques sous traitantes. . Figure 6: analyse sur les banques de données des listing de pics 15 monoisotopiques.Exemple de l'histatine 3. Les paramètres de recherche Mascot sont : enzyme trypsine, modifications variables : carbamethylation et oxydation des methionines, sans limite de masse moléculaire, sans restriction de point isoelectrique. Figure 7 : idem mais deuxième exemple : Type de masse : monoisotopique. Erreur de masse (MS) : suivant l'observateur 50 ppm ou 100ppm. Non coupure trypsique :1 Les 20 masses saisies sont M (H+)/ masses réelles. Pour le spectrogramme 1 les cystéines sont bloquées par iodoacétamide. La possibilité de digestion de la trypsine bovine Proméga peut être incomplète avec oubli de coupure. Séquences communes avec Gallus Gallus (gi 50732569), la Syntaxine de souris, Le variant d'histatin-3-2 (P15516-00-01-00), la ZN575-Human, la G6 P translocase, la 25 HSP60 chaperonine, la déaminase, ferredoxin-NADP(+) réductase, la polyribonucléotidyl transférase de pseudomonas,chlathrin, la déhydrolipoamide déshydrogénase. Figure 8 : pool d'ARN Figure 9 : PCR avec les gènes de ménage et Analyse des masses moléculaires 30 Figure 10 : PCR avec les amorces montrant une bande à 1400pb Figure 11 : Gel 2 avec analyse des masses moléculaires Figure 12 :Gel 3 à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 13 : Gel 4 à 45° et à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 14 : criblage ligature bande 400pb clones BI à B10 10 Figure 15 : criblage ligature bande 1400 pb clones Cl à c 10 Figure 16 : Gel 5 : ligature criblage sur les cinq nouveaux clones Figure 17 : Gel 6 Criblage des clones recombinants S55T et S55M et 15 analyses des masses moléculaires. Figure 18 : exemples de comparaison de séquences nucléotidiques entre les clones séquences. 20 Figure 19 : puce à protéines avec nommés les peptides des protéines des complexes d'intérêt étudié dans l'invention. Il s'agit de deux Biopuces type microfluidique de quatre puits x2 avec un contrôle et trois biomarqueurs. Figure 20 (inclus aussi la description de siRNA : « si RNA design ») : Trois si RNA en 25 haut, à gauche et repris aussi dans la description page 25 lignes 4 à 12. Figure 20 (suite): Biopuce à ARN permettant d'explorer les miniARN du complexe Liv2I et plus particulièrement ceux issus des gènes des polypeptides LIV21F et LIV21K additionnés aux Mir RNA, microARN connus pour être impliqués dans la pathologie. 30 [(miR (=MIR) MIR 15 et 16 et 29 et 107 et 223 pour les leucémies. MIR 10B et 21 .. .31.specifiquement cancer du sein mais aussi MIR 96 MIR 125A. 125B MIR 133. 135 ; 143 ; 145 ; 146 ; 155 ; . 183)).miR222 pour le cancer de la.thyroide Figure 22 (non publiée): Exemple de Biopuce de 20 spots avec 16 biomarqueurs ,d'intérêt fixés sur le sensorchip permettant dé voir par SPR la surexpression et la sous expression- de certains gènes du -complexe Liv2l et de ses partenaires d'interaction (pour l'exemple 7.2). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention est relative à l'identification d'antigènes dans des lysats cellulaires par immuno précipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées dans le complexe Liv2l comme E2F4 et E2F1 a été étudiée par coimmunoprécipitation de complexes protéiques. Cette analyse a permis de mettre en évidence de nouveaux marqueurs présentant une utilité diagnostique et pronostique pour le cancer. A partir de l'analyse monodimensionnelle et bidimensionnelle de gel d'electrophôrèse (Figure 1 A), les échantillons protéiques correspondant à la protéine putative et aux éléments du complexe ont été extraits des gels et digérés par de la trypsine (Proméga) afm d'être analysés par spectrométrie de masse type MALDI (Figures 3 à 5) et ESI MS/MS. Les résultats confrontés aux banques de données de protéomiques ont permis de mettre en évidence plusieurs séquences peptidigiües d'intérêts dont certaines données en exemple (Figure 4B et 4B suite), certaines étant retrouvées chez. l'humain avec des scores très significatifs ( splicing de l'histatine etc...Figure 6 et 7), ces séquences ont servies d'amorces (une fois retrotranscrites en cDNA) pour cribler une banque constituée à partir de cellules MCF7 spécifiques dés cancers mammaires (Figures 8 à 17). Le clonage a permis de mettre en évidence une vingtaine de clones sur les 150 clones obtenus dont-dix clones ont été séquéncës et caractérisent le nouveau gène LIV21 LIV2I F et le gène LIV21K (Figure 8 à Figure 17). A partir de ces séquences, des siRNA ont été déterminer afm de permettre une régulation type silencing au sein de ce complexe métabolique d'intérêt pour développer des applications thérapeutiques (Figure 20 et page 25 ligne 4 à 12). Chez les cellules post-mitotiques, l'apoptose pourrait correspondre à une tentative avortée de mitose. C'est dans ce contexte qu'a été développée l'application de LIV21. L'inventeur a identifié des séquences du gène LIV21. En utilisant l'anticorps LIV21 sur colonnes d'affinité il a pu extraire des peptides de la protéine LIV21, il a également utilisé une seconde approche par kit de coimmunoprécipitation (Pierce) pour avoir de plus grandes quantités de protéines (exemple 1) A partir de séquences peptidiques de la protéine LIV21 obtenues par spectrométrie de masse (exemple 2), une conception d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'ADNc a été réalisée (exemple 3). Après culture et amplification de cellules de lignées MCF7, extraction et purification des ARN, des RT PCR et le clonage en vecteur navette ont été réalisés puis un criblage des colonies résistantes et un séquençage ont permis de révéler des séquences caractérisant le gène LIV21F et LIV21K (exemples 4 et 5). Plus de vingt clones caractéristiques sur 150 clones ont été étudiés. . L'ADNc de ces clones a été utilisé pour cribler une banque préparée à partir de l'ARNm total de cellules MCF7. La séquence de ces nouveaux produits sont des nouveaux facteurs de transcription dont la translocation nucléaire pour certains changent leur rôle et leur fonction, celle-ci étant corrélée pour certains d'entre eux à l'établissement de la quiescence cellulaire comme par exemple LIV21F, E2F4. D'autre part, il forme des hétérodimères avec d'autres facteurs de transcription, et il se lie à l'ADN. L'inventeur a alors suivi, à l'aide de transferts de Northern Blot, l'expression de ce nouveau produit au cours du développement, du stade embryonnaire. Il a été observé que la quantité de la protéine LIV21 augmente au fur et à mesure du développement, c'est à dire au fur et à mesure de l'établissement d'un état cellulaire quiescent. Par la même stratégie, il a montré que le complexe LIV21/E2F4 était inhibiteur de l'expression de E2F1. Ce complexe pourrait correspondre à un nouveau point de contrôle dans l'arrêt de prolifération cellulaire. Le complexe LIV21 et ses complexes métaboliques associés : La présente invention concerne le complexe Liv2l et ses nouvelles séquences nucléotidiques SEQ ID N°171 à SEQ ID Ng1.731utilisables également pour une partie d'entre elles sous forme de siRNA pour les applications diagnostiques et thérapeutiques et aussi les polypeptides Liv2lF et LIV21K ainsi que ,des dérivés et des fragments et isoformes de celle-ci (SEQ ID N° 182 à SEQ ID N° 191; ). Complexe Liv21 humain, caractérisé en ce qu'il comprend : - les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 171 à 175, et - - une séquence siRNA dérivée de l'une des séquences d'ARN de SEQ ID N° 120 et SEQ ID N° 121, et 171 à 175. - une fraction protéique comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 et 181à 185ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et 181. Le complexe LIV21 humain, caractérisé en ce qu'il comprend : -les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 171, 172, et les fractions protéiques comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 ou 181 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 ou 181 et la séquence SEQ ID N° 183 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 183. Le complexe LIV21 humain, caractérisé en ce qu'il comprend également: -les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 123, 124 et 127, et les fractions protéiques comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et les séquences 181 à 185 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 181 à 185. Le complexe Liv21 humain est caractérisé en ce qu'il comprend en outre : L'une quelconque des séquences nucléotidiques ou ribonucléiques SEQ ID N° 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126 ou 127. ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 30 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N° 119 à 127, ou UUGGUAACGACCAUGCCAC, ou UUCACUUAGAAUAAUGUCC, ou UCUUUGUGAAUUUGACAAC, ou UCAAGGUCCAGGCUACAAC, ou - l'une quelconque des séquences siRNA suivantes : GUGGCAUGGUCGUUACCAA dTdT dTdT CACCGUACCAGCAAUGGUU GGACAUUAUUCUAAGUGAA dTdT dTdT CCUGUAAUAAGAUUCACUU GUUGUCAAAUUCACAAAGA dTdT dTdT CAACAGUUUAAGUGUUUCU GUUGUAGCCUGGACCUUGA dTdT dTdT CAACAUCGGACCUGGAACU ou la séquence nucléotidique suivante: CCGGCCGNNANNNNGGCCGCGGGAATTCGATTAAATATAAGCAATCCCAAC ACCTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATGGAGACC ATCCTGGCTAACACAGTGAAACCCTGTCTCTACTGAAAATACAAAAAAGTA GCCGGGCGTGGCGGCAGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGG CAGGAGAATGGCATGAACCCAGGAGGCAGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATT GTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCGAGACTCCATCTCAAAAAA AAAAAAAAATCACCCCAAAGCAATAAGGAGAACTAGAACAGGACATACAC TCCAACACTGGTGAAACTAGGAAAACATATGTAACCCCAAACCACAATATA TACACACAAAACTATACGAGATGTTGGGATTGCTTATATTTAAT. 3. Complexe Liv2l humain, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins : - l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 123, SEQ ID N° 124 et 25 SEQ ID N° 127 à 149, ou - l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID N° 1 à 118 et SEQ ID N°150 à 170 et SEQ ID N°180 à 185, ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N°180 à 185 et SEQ ID 1,2et5. 30 Complexe Liv2l humain caractérisé en ce que ladite fraction protéique comprend en outre l'une quelconque des protéines suivantes : E2F1, E2F4, p130, p300, p107, Liv2l F, HDAC-1, PML, SUMO et pKCepsilon. Complexe Liv2l humain caractérisé en ce qu'il interagit avec au moins un de ses partenaires associés, ledit au moins un de ses partenaires associés étant choisit dans le groupe constitué de ; - l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, TNFalpha, crb2, cycE/cdk2, cdkl, CREB1, p300, p107, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73 MYC, NMYC, TGFbéta, Chlatrin, Aurora, AKT, BRCAl, FOXO4 ou cyclin A et Dl, CHUK, HMGA2, IKBKB - un anticorps de l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, E2F4 , E2F1, SUMO, HDAC-1, crb2, Int2,cmd2, cycE/cdk2, cdkl, ,CREB1 et p300, Rb, p 107, p 130 de la familles des pockets protéines NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73, la cycline A et Dl, CHUK, MYC, NMYC, TGFbéta, Chlatrin (2), Aurora, AKT, BRCA1, FOXO4, HMGA2. - en ce qu'il comprend un extrait de protéines et de peptides obtenus par accrochage à un anticorps polyclonal de la protéine Liv2l, et - en ce que son profil électrophorétique sur gel d'acrylamide comprend au moins les 20 trois bandes suivantes : la bande de 50 kD, la bande de 51 kD, et la bande de 52 kD. Complexe Liv2l humain est caractérisé aussi en ce qu'après digestion à la trypsine, le profil de spectrométrie de masse MALDI comprend au moins les pics mono isotopiques suivants: 25 1135.563 ; 1151.545 ; 1167.604 ; 1206.589 ; 1324.634 ; 1336.658 ; 1507.735 ; 1604.710 ; 1800.940 ; 2087.034. Méthode de détection du complexe Liv2l humain, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexes Liv2l selon la revendication 1 ou 2. Méthode de détection du complexe Liv2l humain, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mise en oeuvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexe Liv2l et de ses partenaires associés selon l'une quelconques des revendications 3 à 7. Méthode de détection du complexe LIV21 et de ses partenaires est en ce qu'elle 10 comprend au moins les étapes suivantes: - une étape d'extraction du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez un patient, - une étape de mise en contact dudit matériel biologique avec au moins ladite sonde spécifique de l'une quelconque des séquences dudit complexe 15 Liv2l humain ou dudit complexe Liv2l et de ses partenaires associés, et au moins un contrôle, et - une étape de détection de l'expression des produits d'expression des gènes dudit complexe Liv2l humain ou dudit complexe Liv2l et de ses partenaires associés, lesdits produits d'expression étant constitués par des ARN messagers, ou des peptides, ou des 20 protéines. Méthode de détection est également, caractérisée en ce qu'elle vise en outre à cribler un composé candidat, ledit composé candidat étant capable de moduler l'activité dudit complexe Liv2l humain, et en ce qu' elle comprend 25 en outre : une étape de mise en contact dudit matériel biologique avec ledit composé candidat, et une étape de sélection dudit composé candidat. Méthode est caractérisée en ce que ledit échantillon biologique est prélevé chez un patient atteint du cancer et chez un patient sain, et en ce que ledit matériel biologique comprend des extraits cellulaires nucléaires, et des extraits cellulaires cytoplasmiques, ou des extraits cellulaires membranaires, et en ce qu'elle comprend en outre une étape de détermination de la sous expression et de la surexpression des produits des gènes dudit complexes Liv2l humain ou dudit complexe Liv2l humain et de ses partenaires associés desdits extraits biologiques. Méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape de détermination des ratios desdites sous expression et surexpression desdits produits des gènes: des extraits cellulaires nucléaires, et des extraits cellulaires cytoplasmiques, ou des extraits cellulaires membranaires, et en ce qu'elle comprend en outre une étape d'analyse jumelée desdits ratios dudit matériel biologique prélevé chez un patient atteint du cancer et chez un patient sain. Méthode est caractérisée en ce que ladite sonde spécifique comprend une séquence siRNA marquée à la rhodamine. Méthode selon l'une quelconque des approches ci-dessus est, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une biopuce, sur laquelle est déposée au moins l'une quelconque des 25 sondes spécifiques des séquences dudit complexe Liv2l humain Méthode est caractérisée en ce qu'en outre, elle met en oeuvre au moins l'une quelconque des sondes spécifiques des séquences dudit complexe Liv2l humain et de ses partenaires associés 30 Méthode est caractérisée en ce que ladite biopuce est: une biopuce à protéine, ou une biopuce à anticorps, ou une biopuce à acide nucléotidiques, ou une biopuce à ARNm, ou une biopuce à siRNA. Méthode est caractérisée en ce que ladite étape de détection met en oeuvre tout moyen d'imagerie optique, ou tout moyen sonique ou tout moyen de spectroscopie. La figure 1 caractérisant le complexe protéique,Son PI et son PM sont fonction de la 15 température et des conditions de migration et de son observation dans des extraits totaux ou dans des extraits de compartiments cellulaires. Figure 1,2,3). Elle donne plus de 54 peptides suite à une digestion par la trypsine Proméga (Figure 7). Les caractéristiques de la protéine LIV21F sont également décrites dans les figures 1 ,2, 3 ,4. Vingt peptides particuliers de LIV21 sont décrits : LIV21 a 20 (SEQ ID No 1) et LIV21b (SEQ ID No 2) à la séquence 180. Le gène de cette protéine est caractérisé par deux séquences principales (cf.liste des séquences) et des séquences représentant un épissage alternatif. Liv2lK correspond a une séquence de forte homologie (plus de 60%)avec AD7cNTP, la neural thread proteine en N terminal (position 193 à 299)de (060448_Human). SEQ N° 25 SVAQAGVQWRNLGSLQALPPGFMPFSCLSLLSSWDYRRLPPRPATFLYFPRQGF TVLARMVSISPRDPPASASQSVGIAYISNFFFFEMESRSVAQAGVQWHNLGSLQ ALPPGFMPFSCLS LLS S WDYRRLPPRPATFLYFPR Avec des variantes au sein du peptide en position (cf : figure ...): La structure de Liv21K est comme celle de AD7C NTP c'est-à-dire des motifs répétés 30 qu'on peut aussi analyser en sous motifs qui correspondent à des domaines fonctionnels. 29 S VXQAGVQ WXNLGSLQXLPPGXXXFSCLSLXSS WDYXXLPPXPAXF OU UNE VARIANTE/ SVXQAGVQWXNLGSLQXLPPGFXXFSCXSLSSWDYRRXPPRXA Entre ces deux motifs répétés un peptide de 40 acides aminés avec un motif conservé aussi : ISPXDXPASASQSXGIXXXSX LE PEPTIDE LIV21I : FLYFPRQGFTVLARMVSISPRDPPASASQSVGIAYISN Avec des variantes en position : Par exemple pour LIV21I En position 31 un A au lieu du V et en position 34 un T au lieu de l'acide aminé A. Donc : l'extrêmité PASASQSAGIT mais aussi une variante ou le A devient T en position 25 :...DPPTSASQSVGI Idem pour LIV21F ou K : SEQ ID N° :FSCLSL L SSWDYRR L PPRPA T FLYF où l'acide aminé en position 7 ici devient une proline (P au lieu de L) et / ou en position 15 aussi (avec la possibilité d'une variante alanine ; parfois la position 14 change d'un R en H et /ou en position 21 un acide aminé T devient N. SEQ ID N° : FSCLSL P SSWDYRR P PPRPA N FLYF . Par ailleurs, deux autres peptides de LIV21 sont également décrits : le peptide LIV21 c (SEQ ID No 3) et le peptide LIV21d (SEQ ID No 4). Le peptide LIV21e (SEQ ID N° 5).KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR dont la partie terminale est homologue a une séquence de LIV21K. D'autres peptides particuliers de LIV 21 sont décrits dans LA LISTE ADDITIONNELLE. Une homologie avec un segment fonctionnel de la protéine zinc finger 575 (ZN575-Human) :score 13 à 48 et jusqu'à 91% de recouvrement Une homologie de la sequence 6 et 56 et avec le domaine MF MR qui est le domaine bzip d'un facteur de transcription contenant un signal de localisation nucleaire et une activité transregulatrice dans TAF1 Au sens de l'invention, une protéine préférée comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID Nos : 1-180 ou une séquence présentant 70% ; 80% ou, de préférence, 5 90% d'homologie avec celle-ci. Le complexe LIV21 a des protéines comprenant des structures 3D en hélice qui ont un rôle fonctionnel majeur pour ses interactions entre partenaires de ce complexe LIV21, La présente invention concerne un polypeptide humain isolé, purifié ou recombinant 10 présentant une séquence comprenant la séquence SEQ ID No 1 et/ou SEQ ID No 2 et/ou SEQ ID No 3 et/ou SEQ ID No 4 et/ou SEQ ID No 5. De préférence, le polypeptide LIV21F comprend les séquences SEQ ID Nos 1,2 et 5. Dans un mode de réalisation particulier, le complexe LIV21 comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences peptidiques le caractérisant obtenues par MALDI (Figure 3,4 et 5). 15 L'invention concerne également les trois peptides LIV21a (SEQ ID No 1) et LIV21b (SEQ ID No 2) et LIV21e (SEQ ID No 5). Elle concerne également des peptides comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs de LIV21 humain, de préférence au moins 20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de LIV21F (cf.liste des séquences 1- 185 en annexe). 20 La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour la protéine humaine LIV21, LIV21a et/ou LIV21b, plus généralement un polynucléotide codant pour un polypeptide selon la présente invention. Le polynucléotide codant pour LIV21F et celui codant pour LIV21K peuvent être un ARNm, un ADNc ou un ADN génomique. Les polynucléotides selon la présente invention peuvent être isolés à partir de cellules, 25 plus particulièrement de cellules humaines, ou à partir de banques d'ADNc humains. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou par synthèse chimique. Les sondes et amorces décrites dans la présente demande peuvent être utilisées pour isoler et/ou préparer un polynucléotide codant pour LIV21F. Elle concerne en outre un vecteur de clonage ou d'expression comprenant un tel polynucléotide. Un tel vecteur peut contenir les éléments nécessaires à l'expression (vecteur d'expression) et éventuellement à la sécrétion de la protéine dans une cellule hôte (peptide signal de sécrétion). Lesdits vecteurs comportent de préférence: un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Le vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un BAC, un phage, un virus ou autre. L'invention concerne également une cellule hôte ou un animal non-humain transgénique comprenant un vecteur ou un polynucléotide selon la présente invention. L'invention concerne en outre des dérivés d'intérêt de LIV21F ou LIV21K qui sont par exemple des protéines de fusion dans lesquelles LIV21 est fusionnée à des protéines marqueurs comme la GFP. Par ailleurs, la protéine LIV21F et LIV21K et tous les petides décrits (cf.patent in listing) peuvent être marqués par tout moyen connu de l'homme du métier. Les siRNA également. La présente invention concerne également un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention, de préférence LIV21 humaine, un fragment ou un dérivé de celle-ci. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps se lie spécifiquement à un peptide LIV21a ou LIV21b. ou les polypeptides LIV21F ou LIV21K. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCs, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine. Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm, l'ARNm pouvant être détecté par tout moyen bien connu de l'homme du métier. Ainsi, la méthode selon la présente invention concerne également la détection d'un polynucléotide codant pour la protéine LIV21 humaine ou un fragment de celle-ci, par exemple LIV21a et/ou LIV21b. Le polynucléotide codant pour LIV21 peut être un ARNm, un ADNc ou un ADN génomique. Les polynucléotides peuvent être isolés à partir de cellules de l'échantillon biologique. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou des ARN polyA. L'ARNm peut être détecté par une analyse RT-PCR. Pour cela, la méthode met en oeuvre une paire d'amorces spécifique du produit d'expression à détecter, notamment LIV21, PKCc, E2F1 ou E2F4. Par « paire d'amorces spécifique » est entendu qu'un moins une des amorces est spécifique du produit d'expression à détecter. C'est-à-dire que cette paire d'amorces permet d'amplifier spécifiquement un fragment de l'ARNm désiré. De préférence, l'analyse par RT-PCR est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Facultativement, l'analyse par RT-PCR peut être une analyse quatitative. Une paire d'amorces spécifiques de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la présente demande. Par exemple, la paire d'amorces peut comprendre les amorces décrites dans les séquences SEQ ID Nos 3 et 4.et séquences supplémentaires de la liste patent in donc numerotées de 119 à 149 et de 171 à 185 avec facultativement toutes les séquences nucléotidiques supplémentaires de la liste additionnelle. Les paires d'amorce spécifiques de PKCc, E2F1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier (Caroll JS 2000 ; Mundle SD 2003 ; Stevaux 0 2002 ;Cheng T 30 2002 ; Opalka B 2002). L'ARNm peut également être détecté par une analyse NoRthern blot. Pour cela, la méthode met en oeuvre une sonde spécifique du produit d'expression à détecter, notamment LIV21, PKCE, E2F1 ou E2F4. Une sonde spécifique de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la présente demande. Un exemple de sonde spécifique comprend la séquence SEQ ID No 5. De préférence, l'analyse Northern blot est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. La sonde nucléique est marquée. La technique de marquage des oligonucléotides est bien connue de l'homme du métier. Le marquage des sondes selon l'invention peut être réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, ou le 3H. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les sondes spécifiques de PKCs, E2F 1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier. Dans un mode de réalisation alternatif, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine. De préférence, la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Ainsi, la méthode comprend une étape de mise en contact des cellules de l'échantillon biologique avec un anticorps anti-LIV21 humaine. Les anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. L'anticorps anti-LIV21 peut par exemple être un sérum anti-LIV21. Lorsque le produit de l'expression d'un des gènes PKCE, E2F1 et E2F4 doit être détecté, la méthode peut utiliser des anticorps spécifiques des protéines PKCE, E2F 1 et E2F4, respectivement. Les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre PKCE, E2F1 et E2F4 sont disponibles commercialement. A titre d'exemple, on peut citer, pour PKCs, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-214), pour E2F1, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-860), et pour E2F4, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-866). De préférence, les anticorps sont marqués, directement ou par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire. Les techniques de marquage des anticorps sont bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine peut être détectée par une analyse d'immunobuvardage (Western blot). L'analyse Western blot peut être réalisée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Brièvement, les protéines sont mises à migrer dans un gel puis transférer sur une membrane. Ensuite, cette membrane est incubée en présence des anticorps et la fixation des anticorps est éventuellement révélée à l'aide d'anticorps secondaires marqués. Dans un autre mode de réalisation, la protéine est détectée par immunohistochimie, immunocytochimie ou immunoradiographie. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. L'analyse d'immunocytochimie peut être effectué sur des cellules entières provenant de l'échantillon ou étant dérivées de celui-ci, par exemple par culture cellulaire. Elle peut également être réalisée sur des noyaux isolés. L'analyse d'immunohistochimie peut être faite sur des coupes de tissu mammaire. A titre d'illustration, une analyse par immunocytochimie peut comprendre les étapes suivantes. Cependant, il est entendu que d'autres modes préparatoires peuvent être mis en oeuvre. Des cellules provenant de l'échantillon biologique sont cultivées, de préférence sur des lames (Lab Tek,Nunc, Allemagne), puis lavées avec du tampon et fixées avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Une étape de saturation est de préférence réalisée en incubant les cellules avec du tampon S (PBS-Triton X100 0,1% - SVF 10%). Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire et sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps secondaire fluorescent, si nécessaire. Les noyaux peuvent être marqués à l'iodure de propidium (Sigma). Les lames sont montées au moviol pour l'observation en microscopie à fluorescence. Par ailleurs, des noyaux isolées prélevés au cours d'une extraction nucléaire peuvent être fixés avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Les suspensions de noyaux sont déposées entre lame et lamelle et l'observation est faite en microscopie à fluorescence et en microscopie confocale. Les anticorps primaires sont par exemple des anticorps de lapin et les anticorps secondaires sont des anticorps marqués dirigés contre les IgG de lapin. Les échantillons biologiques proviennent d'un patient potentiellement atteint de cancer ou atteint de cancer de manière avérée. Par "échantillon biologique", on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide d'un prélèvement. La méthode selon la présente invention peut comprendre une étape de prélèvement d'un échantillon biologique du patient. L'étape de détection peut être effectuée directement sur une coupe de tissu de l'échantillon, sur une culture de cellules provenant de l'échantillon, sur des extraits cellulaires totaux, des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCE, une augmentation significative de PKCE est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Plus précisément, la quantité de PKCE dans des cellules saines est comparée à la quantité de PKCE dans les cellules de l'échantillon et l'augmentation significative est déterminée par cette comparaison. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux LIV21 / PKCE. Ce rapport LIV21 / PKCE augmente dans la fraction cytoplasmique des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines. Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. La détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 peut être réalisée par une détection concomitante de LIV21 et de E2F4. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F4 / LIV21. Ce rapport E2F4 / LIV21 diminue dans le noyau des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines. Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F1 / LIV21. Ce rapport E2F1 / LIV21 augmente dans la fraction nucléaire des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines. La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement et de déterminer le degré d'invasivité d'un cancer. La spécificité de la détection peut être liée aux croisements des informations obtenues par l'existence et la topographie de LIV21 par tous les moyens d'imagerie et de spectroscopie et obtenues par l'association aux autres indicateurs cancérologiques connus via des puces à protéines ou des microarrays. Ainsi, la détection basée sur LIV21 peut être associée à la détection d'autres marqueurs du cancer, en particulier du cancer du sein, connus de l'homme du métier. En effet, la présente invention concerne une méthode de suivi thérapeutique d'un traitement anti-cancéreux chez un patient souffrant d'un cancer comprenant, l'administration du traitement anti-cancéreux au dit patient et la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. Une diminution des cellules cancéreuses sera indicative de l'efficacité du traitement. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois au cours du traitement anti-cancéreux ou après le traitement anti- cancéreux. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité. Par ailleurs, la présente invention concerne également une méthode de détection des récidives suite à un traitement anti-cancéreux d'un cancer chez un patient comprenant, la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois après le traitement anti-cancéreux. La détection de cellules cancéreuses est indicative de récidives. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité. La présente invention décrit également un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21 humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21 selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LIV21. Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des anticorps qui se lient spécifiquement à LIV21 humaine. Dans un autre mode de réalisation préféré, le kit comprend une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21. Il peut également comprendre une sonde spécifique d'un gène « house-keeping ». Le kit selon la présente invention peut comprendre des réactifs permettant la détection d'un complexe LIV21-anticorps produit lors d'une réaction immunologique. Facultativement, le kit selon la présente invention comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCs), le gène E2F1 et le gène E2F4. Ces moyens de détection peuvent être des anticorps spécifiques de la protéine, des sondes oligonucléotidiques spécifiques de l'ARNm concerné et/ou une paire d'amorces spécifique de l'ARNm. La présente invention concerne également une composition diagnostique comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps selon la présente invention et un sérum selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de 1'ARNm de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LIV21. Le gène de LIV21F est localisé sur le chromosome lp3l dans la région 30130K et 30132K en position 30,081K et 30181K entre le gène TINAGL1 et LOC 284551 nommé pour cette partie exonique NW 001838577.2 en 2009 (anciennement référencé en Mars 2006 comme polypeptide issu de hsl 33153, NT 032977.8).Caractérisé par des domaines ring finger de type Zn Finger et un signal de transduction. Thérapie Anti-cancereuse Dans le contexte d'une thérapie anti-cancéreuses, on peut envisager d'augmenter la quantité de LIV21 présente dans le noyau. Pour cela, on pourrait augmenter l'expression de LIV21 dans le noyau des cellules cancéreuses. LIV21 étant capable de s'auto-nucléariser, la réalisation d'un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour LIV21 humaine pourrait être envisagée dans le but de faire surexprimer cette protéine dans le noyau des cellules dont on souhaite réguler la prolifération. Le vecteur d'expression codant LIV21 humain peut être administré in vivo au patient par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple, le vecteur d'expression peut être administré sous forme d'ADN nu (par exemple EP 465 529). Des techniques de microinjection, électroporation, précipitation au phosphate de calcium, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles. Le vecteur d'expression peut également être sous la forme d'un virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, un polynucléotide codant pour LIV21 humaine. Le vecteur viral peut être par exemple choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, ainsi qu'un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès (HSV), un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif. De préférence, le vecteur d'expression permet un ciblage cellulaire. Ainsi, ce vecteur pourrait cibler les cellules cancéreuses ou le type cellulaire particulier qui est affecté par le cancer. Le ciblage d'un type cellulaire particulier peut être réalisé en plaçant le polynucléotide codant LIV21 sous le contrôle d'un promoteur tissu-spécifique. Dans une autre alternative, le vecteur d'expression peut faire l'objet d'un ciblage, par exemple en l'associant à une molécule spécifique d'un tissu particulier ou des cellules cancéreuses, par exemple un anticorps spécifique d'une molécule exprimée spécifiquement par le tissu particulier ou les cellules cancéreuses. Par ailleurs, le choix du vecteur d'expression peut influencer également le ciblage. En effet, si le vecteur d'expression est un virus, le tropisme du virus naturel ou modifié peut également permettre un certain ciblage. La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, plus particulièrement un vecteur d'expression codant pour LIV21. Elle concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, en particulier un vecteur d'expression codant pour LIV21, comme médicament. De préférence, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide codant pour LIV21, en particulier un vecteur d'expression codant pour LIV21, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un cancer. La présente invention concerne enfin une méthode de traitement du cancer chez un patient comprenant l'administration aux cellules cancéreuses d'un polynucléotide codant pour LIV21, l'expression de LIV21 permettant de réduire ou d'abolir le phénotype cancéreux des cellules traitées. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, , sans être limité à ceux-ci. Par ailleurs, on pourrait également favoriser la localisation nucléaire de LIV21, par exemple en diminuant l'activité de PKCc dans les cellules cancéreuses et en utilisant les inhibiteurs d'HDAC. Dans un autre mode particulier de thérapie anti-cancéreuse, on peut envisager de diminuer l'activité de PKCE dans les cellules cancéreuses. Cette diminution d'activité peut être réalisée en diminuant l'activité de la protéine PKCE ou en diminuant son expression. Une diminution de l'activité de la protéine PKCE peut être obtenue en administrant aux cellules cancéreuses des inhibiteurs de la protéine PKCE. Les inhibiteurs de la protéine PKCE sont bien connus de l'homme du métier. Une diminution de l'expression de la protéine PKCc peut être obtenue en utilisant des antisens ou des siRNA spécifiques du gène PKCE. Des kits sont commercialement disponibles. Par ailleurs, les techniques concernant les inhibitions par anti-sens ou siRNA sont bien connues de l'homme du métier. (Arya R 2004, Lee W 2004, Sen A 2004, Platet N 1998, Hughes 1987). Les si RNA suivants peuvent aussi être utilisés : La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCE. Elle concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCE comme médicament, en particulier pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un cancer. Elle concerne enfin une méthode de traitement du cancer chez un patient comprenant l'administration aux cellules cancéreuses d'un inhibiteur de la protéine PKCc, l'inhibiteur de la protéine PKCE permettant de réduire ou d'abolir le phénotype cancéreux des cellules traitées. Dans un premier mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCc diminue l'activité de la protéine PKCE. Dans un deuxième mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCc diminue l'expression de la protéine PKCB. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci. Les inhibiteurs de PKC epsilon sont publiés et utilisés dans le commerce pour d'autres applications. Dans le contexte d'une thérapie d'une maladie neurodégénérative, on peut envisager de diminuer la quantité de LIV21 présente dans le noyau. Pour cela, on pourrait diminuer ou bloquer l'expression de LIV21 dans le noyau des cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Les cellules touchées par la maladie neurodégénérative sont généralement des neurones, des motoneurones, etc... L'inhibition ou le blocage de l'expression de LIV21 peut être réalisé par tout moyen connu de l'homme du métier. Notamment, à titre d'illustration, on peut citer la stratégie antisens, siRNA, et les ribozymes. Ainsi, un oligonucléotide antisens ou un vecteur d'expression codant pour cet oligonucléotide antisens pourrait être préparé et utilisé pour bloquer la traduction de l'ARNm codant LIV21 in vivo. Par ailleurs, un ribozyme peut être préparé pour couper et détruire in vivo l'ARNm codant LIV21. On peut également envisager une stratégie en triple hélice dans laquelle un oligonucléotide est conçu pour s'hybrider avec le gène codant LIV21 et bloquer ainsi la transcription de ce gène. Par ailleurs, Pour cela, on pourrait également défavoriser la localisation nucléaire de LIV21, par exemple en augmentant l'activité de PKCE dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Dans un autre mode particulier de thérapie contre une maladie neurodégénérative, on peut envisager d'augmenter l'activité de PKCc dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Cette augmentation d'activité peut être réalisée en augmentant l'activité de la protéine PKCE ou en augmentant son expression. Une augmentation de l'activité de la protéine PKCE peut être obtenue en administrant aux cellules touchées par la maladie neurodégénérative des activateurs de la protéine PKCE. Les activateurs de la protéine PKCE sont bien connus de l'homme du métier (Toma 0 (2004), Activation des PKC par DAG, AGPI : acide oléique, linoléique, arachidonique etc ... Activation et protéolyse des PKC dans les cellules gonadotropes :Communication 2004 de Macciano H, Junoy B, Mas JL Drouva SV UMR6544 Marseille). Une augmentation de l'expression de la protéine PKCE peut être obtenue en utilisant des vecteurs d'expression codant pour la protéine PKCE et permettant de la surexprimer dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un activateur de la protéine PKCE ou un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCE. Elle concerne en outre l'utilisation d'un activateur de la protéine PKCE ou d'un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCE pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neurodégénérative. Méthode de criblage L'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, basées sur la mesure de la localisation nucléaire versus cytoplasmique de LIV21, ou de la liaison de la protéine LIV21 à la protéine E2F4. Dans un premier mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination de la localisation nucléaire versus cytoplasmique du produit d'expression de LIV21. Une augmentation de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou abolir la prolifération cellulaire. Une diminution de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. Dans un deuxième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation 30 ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine PKCc. Une diminution de l'expression de PKCE indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de PKCc indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. Dans un troisième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau de complexe LIV21/E2F4. Une augmentation du niveau de complexe LIV21IE2F4 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une diminution du niveau de complexe LIV21/E2F4 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. Dans un quatrième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine E2F1. Une diminution de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative. L'invention a encore pour objet une méthode de criblage d'un composé capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec LIV21 caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact le composé candidat et LIV21 et, dans une deuxième étape, on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ledit composé candidat et LIV21. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'un composé 30 capable de moduler (activer ou inhiber) I'activité de la protéine LIV21, caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine LIV21 avec un composé candidat, dans une deuxième étape, on mesure par tout moyen approprié l'effet dudit composé candidat sur l'activité de ladite protéine LIV21, et dans une troisième étape on sélectionne des composés candidats capables de moduler ladite activité. L'activité de LIV21 peut par exemple être estimée par l'intermédiaire de l'évaluation de la capacité de la cellule à se diviser, par la mesure de l'expression du gène E2F1, ou par la localisation cytoplasmique et/ou nucléaire de LIV21. 10 Le composé candidat peut être une protéine, un peptide, un acide nucléique (ADN ou ARN), un lipide, un composé organique ou inorganique. Notamment, le composé candidat pourrait être un anticorps, un anti-sens, un ribozyme ou un siRNA. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples et 15 les figures qui suivent, donnés à titre non limitatif. EXEMPLES EXEMPLE 1 Extraction des protéines du complexe LIV21 20 La lignée des cellules MCF-7 La lignée MCF-7 est une lignée humaine non clonale de cellules d'adénocarcinome du sein. Lors de leur différenciation induite par des facteurs exogènes, ces cellules développent une hypertrophie, des protrusions membranaires et une tendance à se dissocier les unes des autres. Elles acquièrent un phénotype sécrétoire se caractérisant 25 par l'apparition de nombreux granules et de canalicules sécrétoires. In vivo, ces cellules sont peu métastasiques et cette invasivité réduite serait due à une faible activité constitutive des protéines kinases C (PKCs) et à un taux peu élevé de l'expression de la protéine kinase C alpha. 30 Cette lignée est utilisée dans de nombreuses études sur la prolifération, la différenciation et l'apoptose. Ces études utilisent des drogues appropriées comme le TNF pour l'induction de l'apoptose, ou le TPA (12 -0 -tetradecanoyl phorbol-13 û SUMOate) pour l'induction de la différenciation et donc pour l'étude de la sortie du cycle cellulaire. Extraction des protéines du complexe LIV21 Après culture de cellules MCF7 ( ATCC passage 15) et extraction cellulaire, 5 mg de protéines sont centrifugées après homogénéisation dans 10 ml de tampon RIPA additionné d'antiprotéase. Ces extraits protéiques sont passés en boucle pendant 7 heures à la pompe péristaltique sur une colonne d'affinité ( HITRAP NHS ACTIV HP 1x5 ml : article et catalogue 17071701) où a été fixé l'anticorps LIV 21. Lavages 3 fois 10 ml dans du tampon RIPA puis élution d'une quinzaine de fractions de 500 nl dans du tampon glycine PH2/ HCL, puis contrôle sur gel SDS Page 10% (dépôt de 25 nl de la fraction) suivi d'un immunobuvardage (western blot) de vérification. Révélation d'une bande sur gel à 51 kD encadrée par deux autres bandes à 50 et 52 kD respectivement et trace d'une bande à 80 et 100kD plus faibles en gel monodimensionnel fig 1A). Par ailleurs révélation de 12 spots entre 50 kD et 70kD en gel bidimensionnel (fig 1B et 2 ) EXEMPLE 2 : Spectrométrie de masse Une spectrométrie de masse (MALDI) a été réalisée pour la protéine LIV21 et son complexe. La protéine LIV21 (poly nucléotide LIV21F) a été digérée par la trypsine. Les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant : acétonitrile/eau (1/1) contenant 0,1 % TFA (acide trifluoro acétique). Une solution saturée de la matrice alpha cyano-4-hydroxycinnamique a été préparée dans le même solvant. On a prélevé un même volume des deux solutions, on a mélangé et déposé 1 µl sur la plaque de MALDI pour analyse. La spectrométrie de masse a montré que la protéine LIV21 et son complexe digérés par la trypsine met en évidence une centaine de peptides suivant la bande de gel extraite entre 49 et 54 KD et étudiée(c£ Figure 3 à 5). La protéine LIV21 a été caractérisée par un poids moléculaire de 50 kD, mise en évidence par Western Blot et par gel bidimensionnel SDS PAGE (Figure 2). Mais on trouve un produit de 100kD à 130 kD qui pourrait être un dimère de LIV21. Lorsqu'elle change de compartiment cellulaire et qu'elle est sumoylée, elle a un poids moléculaire de 6OkD environ. Lorsqu'elle est phosphorylée dans le cytoplasme, elle 10 présente deux formes différant de quelques kilobases. On observe alors un doublon. EXEMPLE 3 : Analyse des séquences dans les bases de données de protéomique Plusieurs peptides listés dans la demande de brevet la caractérisent : PeptideLlV21b FVFALILALMLSMCG SEQ ID No 51 15 PeptideLlV21b KFFVFALILALMLSMCGADSHAKR SEQ ID No 5 Par exemple, l'inventeur a obtenu un score très significatif de 81, espéré :0,0012 pour un variant de l'histatine 3-2 avec 52% de recouvrement de séquences entre l'échantillon testé et l'histatine, cette séquence SEQ ID No 5 est commune à LIV21 et à HIS3-HUMAN (Figure 6 et 7). En Utilisant une banque différente et un ppm qui diffère de 20 20 à 50 ppm on obtient la séquence identique pour leur partie commune : SEQ ID No 51 EXEMPLE 4 : Transcriptions réverses : Après décongélation de cellules MCF7 (ATCC passage 15) et culture des cellules jusqu'à 200 Millions, les cellules ont été trypsinées et congelées à ù 80°C. Les ARN ont 25 été extraits à partir de deux pools de 50 millions de cellules avec le kit Nucleospin RNA L (Macherey Nagel) ref. 740.962.20 aboutissant à un pool 1 de 318 µg et un deuxième de 182 µg. Les ARN poly A+ ont été extraits à partir de 313 µg d'ARN totaux du pool 1 à l'aide du kit oligo Tex m RNA Midi kit (Qiagen) ref. 70042. 30 I Retrotranscription : Les ARN ont été rétro transcrits avec la Revert Aid H minus M-MuLV Reverse Transcriptase Fermentas Ref. EPO451 lot 1124 avec 3,64 µg d'ARN totaux et 0,45µg ARNm selon les conditions du fournisseur avec une amorce oligo dT. Réactions réalisées à 2 températures différentes à 45°C et 55°C de façon à éliminer les structures des ARN pouvant gêner la rétrotranscription. II PCR Les PCR ont été effectuées avec les transcriptions réverses comme matrices avec les amorces Al + oligo dT dans un premier temps. Des nested PCR ont été ensuite réalisées sur ces premières PCR avec les amorces Al + Splicing, Al + GDBR1, ou ATG + Splicing, ATG + GDBR1. Amplification par PCR avec les amorces spécifiques des gènes à détecter à partir des ADNc obtenus après RT oligo dT. Enzyme polymérase Taq DNA polymerase Fermentas. Thermocycler : Bio-Rad 15 iCycler. La qualité des ADNc a été testée par une amplification de gènes de ménage GAPDH, bactine et Histone H3.3 TABLEAU 1 Amorces Référence Séquence 5'-3'Taille fragment amplifié J Histone N 5'-GTG GTA AAG CAC CCA GGA A-3' 347 pb Histone I (réverse) 5'-GCT AGC TGG ATG TCT TTT GC-3' Hum GAPDH sens 5'-TGA AGG TCG GAG TCA ACG G-3' 983 pb Hum GAPDH antisens 5'-CAT GTG GGC CAT GAG GTC-3' Hum b-actin sens 5'-GGA CTT CGA GCA AGA GATGG-3' 234 pb Hum b-actin antisens 5'-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3' LIV21 (Al) 5'-TCCTATGCTTGAC-3' ] LIV21 (A2) 5'-CCTGACATCCCTA-3' odT 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' ATG galgal 5'-ATGTATATTATA-3' Splicing sens 5'-TGTTGGGATTGCTTATTTA-3' Splicing reverse 5'-AAATATAAGCAATTATATA-3' Référence Séquence 5'-3' Taille fragment amplifié G reverse 5'-CTTTATTATTTTTAATGA-3' TABLEAU 2 Mix PCR Tampon Mg++25 mM dNTP Amorce forward Amorce reverse Taq (µl) ADNc H2O 10X (1,5mMfinal) 10 mM 10 µM (µl) 1 10 µM (µl) 5U/µl (µl) 18,3 2,5 1,5 0,5 0,5 0,5 0,2 1 Cycles PCR 94°C 2 minutes 35 cycles Dénaturation : 94°C 30 secondes Dénaturation : 52-55°C 1 minute Annealing : Elongation : 72°C 1'30 minute Elongation finale : 72°C 7 minutes Conservation : 4°C III Contrôles 15 Les produits PCR ont été contrôlés sur gel d'agarose et analysés avec le logiciel Biocapt 11,01 de Vilber Lourma. Gel 1 cf. Figure 7 : contrôle des ARN sur gel d'agarose Figure 8 : PCR avec les gènes de ménage Figure 9 : Analyse des masses moléculaires 20 Figure 10 : PCR avec les amorces montrant une bande à 1400pb Figure 11 : Gel 2 avec analyse des masses moléculaires Figure 12 :Gel 3 à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 13 : Gel 4 à 45° et à 55° et analyse des masses moléculaires Figure 14 : criblage ligature bande 400pb clones B1 à B10 25 Figure 15 : criblage ligature bande 1400 pb clones Cl à c 10 Figure 16 : Gel 5 : ligature criblage sur les cinq nouveaux clones Figure 17 : Gel 6 Criblage des clones recombinants S55T et S55M et analyses des masses moléculaires. Gel 2: PCR réalisées à partir de matrices PCR effectuées avec les amorces Al + oligo dT sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont Al + G ou Al + Splicing reverse). . Sur les RT effectuées à partir des ARN totaux, il y a une amplification d'une bande de 1178-1253 pb avec les amorces Al + G et Al + Splicing reverse. Les ARN poly A ont été utilisés pour réaliser la RT et sont faiblement observés à la taille (figure 10) de 1400 pb pour une amplification avec les amorces A1+ G et de 415 pb avec les amorces Al + Splicing reverse. Dans le produit PCR Al + splicing il y a d'autres bandes de 860 et 233 pb (figure 11). Gel 3 PCR réalisées à partir de matrices PCR effectuées avec les amorces Al + oligo dT sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont Al + GDBR1 ou Al + Splicing reverse).Figure 12 Pour les PCR réalisées à partir de RT faites à 55°C on retrouve globalement le même pattern de bandes que celui obtenu à partir des RT faites à 45 °C. On n'observe pas d'amplification spécifique lorsque les ARN poly A ont été utilisés pour réaliser la RT. Sur les RT effectuées à partir des ARN totaux, on trouve une bande majeure de 1554-1609 pb avec les amorces Al + GDBR1 et Al + Splicing reverse. Nous attendons une bande à la taille théorique de 1455 pb pour une amplification avec les amorces Al+ GDBR1 et de 415 pb avec les amorces Al + Splicing reverse. Dans les 2 profils on trouve des bandes très nettes de 1900-2100 pb et de 1000-1300 pb mais d'intensité inférieure à celle de la bande de 1500-1600 pb. Dans le produit PCR Al + splicing reverse il y a une autre bande majeure de 263 pb. Gel 4: Nested PCR réalisées à partir des matrices PCR effectuées avec les amorces Al + GDBR1 ou Al + Splicing reverse) sur les RT réalisées à 45°C sur les ARN totaux et poly A+ (messagers). Les amorces utilisées pour ces PCR sont ATG + GDBR1 ou ATG + Splicing reverse). Figure 13 Les nested PCR réalisées avec les amorces ATG + GDBR1 donnent des bandes à 1213 pb (RT 45°C) et 1559 + 1315 pb (RT à 55°C) la taille théorique attendue est de 1455 pb. Les PCR effectuées avec les amorces ATG + Splice reverse donnent des profils de bandes plus variés. Ces PCR réalisées à partir d'autres PCR faites avec les amorces Al + GDBR1 ou Al + Splicing reverse. On note la présence d'une bande de 400 pb dans les profils obtenus à partir d'ARN messagers (la bande obtenue à partir de la transcription réverse réalisée à 55°C est de plus forte intensité). Les profils des PCR ATG + Splice reverse réalisées avec au départ des ARN totaux donnent une bande de 424-437 pb d'intensité très forte. On y trouve également de bandes de 614 et 783 pb de très forte intensité dans le profil de la RT 45 et des bandes plus nombreuses mais d'intensité moindre dans le profil de la RT 55 bandes à 1118, 936 et 749 pb. On a cloné et séquencé les produits de ces différentes PCR. EXEMPLE 5 : Les produits PCR des pistes 2, 4, 6, 7 et 8 ont été ligaturés avec le plasmide pGEMT Easy Promega et criblage des clones recombinants.Figure 16 Piste 2 : ligatures G45T Piste 4 : ligatures S45T Piste 6 : ligatures G55T Piste 7 : ligatures S55M Piste 8 : ligatures S55T Les clones recombinants obtenus ont été criblés (après extraction de l'ADN plasmidique) par restriction avec l'enzyme Eco RI dont les sites encadrent le site d'insertion des produits PCR dans le vecteur pGEMT Easy. Criblages des clones recombinants : Les premières expériences avaient été faites à partir des dix clones B et des dix clones C 30 Figure 14 et 15 et les résultats des séquences du clone B2 et C8 sont donnés dans l'exemple suivant et ont par comparaison de séquences entre clones une grande homologie avec les clones de la deuxième serie d'expériences. Gels : criblage des clones recombinants S45 Tet G45 T Analyse des masses moléculaires Le criblage des clones par Eco RI montre que sur les 9 clones S45T, 3 possèdent des inserts de 100pb, 216 pb et 410 pb. Sur les clones G45T, sur les 6 clones testés, 3 possèdent des inserts de 57, 71 et 148 pb. Figure 17 : Criblage des clones recombinants S55T et S55M Analyse des masses moléculaires Le criblage par Eco RI montre que sur les 13 clones criblés, 7 possèdent des inserts de tailles comprises entre 239 et 637 pb. Les clones G45T5 (148 pb), S45T9 (410 pb), S45T3 (100 pb), S55M1 (491 pb), S55T6 (251 pb) et S55T9 (637 pb) ont été extraits pour être séquencés. Amorces utilisées pour trouver les Séquences des différents clones sont décrites dans le patent in listing: ATG galgal 5'-atgtatattatatatctaa-3' INV COMP ttagatatataatatacat Splicing reverse 5'- -3' et Splicing reverse 5'- -3' inv comp GDBR1 reverse 5'- -3' et GDBR1 reverse 5'- -3' inv comp Bilan : Le clone B2, la bande qui fait 400 pb environ est le même fragment que S55M1 qui lui même est le même fragment que S45T9 ces fragments font entre 400 et 450 pb environ. Cela n'est pas surprenant car ils ont été obtenus après une PCR nested réalisées avec l'amorce spiicing reverse et l'amorces Al (pour le fragment B2) et l'amorce ATG galgal pour les fragments S45T9 etS55 Ml. Ces fragments ont été obtenus avec des RT faites à différentes températures. Par contre le fragment S55T9, présente quand même environ 600 pb dont une partie (300 pb) présente une identité assez forte avec les autres fragments clonés. Le test des biomarqueurs sur des extraits de neuroblastomes et de cultures cellulaires SH5Y révèle par RT PCR le jeu de sous expression et de sur expression suivant dans cet exemple d'analyse : Exemple de 16 biomarqueurs d'intérêt analysés par RT PCR qui recoupe les résultats obtenus par biopuce sur le sensorchip permettant de voir par SPR la surexpression et la sousexpression de certains gènes du complexe Liv2l et de ses partenaires d'interaction pour exemple. On observe une sous expression de DKK1, SKP2,DKK3, ID2, p21, SKP2,TP53INP1, 10 ID2,P73 alors qu'on observe une sur expression de MYCN, ALK, NLRR1 (le neuronal leucine rich repeat est transactivé), CRABPII, DDX1, LIV21K, AURORA kinase A. EXEMPLE 6 : A partir du clonage du gène LIV21 décrit ci-dessus, les séquences nouvelles sont étudiées pour dessiner les si RNA (cf. listing des si RNA et figure 19) les 15 plus spécifiques et efficaces pour créer le « silencing » du gène c'est-à-dire inhiber son expression. Sachant que l'efficacité de l'inhibition à chaque injection de siRNA reste courte c'est-à-dire le plus souvent moins d'une heure. L'inventeur a développé des produits diagnostiques et des produits thérapeutiques à partir de ce même outil qu'est le siRNA. 20 EXEMPLE 6.1 : L'inventeur utilise des si RNA marqués à la rhodamine ou fluoresceine ou tout autre marqueur pouvant être révélé et suivi par observation optique, par un microscope afin de localiser l'endroit dans les cellules, tissus ou échantillon marqué où va se diriger le si RNA marqué afin de s'accrocher à la séquence spécifique qui le caractérise et ainsi signaler le lieu de l'expression de l'ARN messager du gène d'intérêt. 25 Ainsi le si RNA spécifique peut être utilisé comme marqueur diagnostic comme le serait un anticorps et permettre de localiser dans un cas particulier comme sur des extemporanés ou tout type d'échantillon prélevé sur un patient par exemple échantillon 54 de tissu cancéreux, la fluorescence pou tout autre marquage utilisé sur le si RNA et retrouvé dans un compartiment cellulaire sur l'échantillon. Ainsi un si RNA marqué de LIV21 (figure 19) se trouvant dans les noyaux cellulaires sous microscope à la périphérie d'une exérèse chirurgicale signerait un diagnostic d'exérèse totale du tissu cancéreux, en revanche, ce même marqueur retrouvé dans le cytoplasme ou les membranes de ce même échantillon obligerait le chirurgien à faire une exérèse élargie dans l'immédiat si ce test peut être pratiqué en salle d'opération en direct ce qui serait le meilleur cas pour retirer toutes les cellules cancéreuses visibles seulement à cette échelle moléculaire et cellulaire grâce à ce marqueur siRNA. Ce pourrait être une alternative plus rapide d'exécution que l'autre application que l'inventeur a développée avec l'anticorps ou le peptide LIV21 qui peut être utilisé de la même manière. EXEMPLE 6.2: pour les produits thérapeutiques qui découlent directement des observations faites grâce aux résultats d'expression des biomarqueurs sur les biopuces , 15 l'intérêt est bien illustré par l'exemple du TGF Béta et de p27 La publication de Mr. Lecanda J et Gold Li de Mars 2009 est riche d'enseignement et illustre très bien tout l'intérêt des biopuces pharmaco diagnostiques telles que décrites ci-dessus. TGFBéta inhibe la prolifération cellulaire en augmentant le niveau de p27 via 20 l'activation des facteurs de transcription smad 2/3. Le TGFbéta augmente le niveau total de translocation de p27 dans le noyau donc accumule p27dans le noyau cellulaire a travers l'activation de smad 2 et smad 3. Tous ces événements sont bloqués par un inhibiteur de TGFbeta RI: serine kinase SD208 nouvel axe thérapeutique ciblée pour les porteurs 25 TGFBeta diminue le niveau des composants skp2 par rapport à la protéine mais pas le niveau de mRNA. TGFbeta peut médier la dégradation de p27 dans le protéasome donc au niveau protéique car il le maintient dans le noyau mais en revanche l'inhibition de la transcription de p27 avec un siRNA spécifique bloque TGF beta. TGFBeta previent la dégradation proteasomale de la kinase cycle dépendante inhibiteur de p27. (Alvarez Rodriguez R Pon S J celle sci 2009 Mars 1-122). L'expression du gène proneural codant pour Mash 1 supprime MYCN (activité mitotique). (2009 Liu W Wuz Guan M, Lu Y.) L'inventeur utilise les si RNA du complexe LIV21 marqués dans un premier temps pour objectiver leur présence attendue dans le compartiment cellulaire et les visualiser puis les si RNA LIV21 non marqués dans un deuxième temps pour leur action purement thérapeutique, dans un cas particulier une injection de si RNA (fig 19) dans un tissu en neurodégenerescence ou par une voie d'abord qui permette au si RNA d'atteindre le tissu en neurodégénerescence (ex oreille, oeil etc..) et d'agir en permettant la prolifération jusqu'à l'apoptose et donc la mort de la cellule en neurodégénerescence. Une expérience sur cultures cellulaires humaines puis sur modèles animaux ayant une rétinopathie engendrant une dégénerescence vitréorétinienne (injection du siRNA directe dans l'oeil) permet d'illustrer cette méthode. Les siRNA sont aussi transfectés dans les cellules selon le protocole Invitrogen utilisant la lipofectamine 2000. L'étude du rôle spécifique des PKC epsilon sur la translocation nucléaire de Liv 21F peut utiliser un peptide qui inhibe la fonction PKC epsilon et la translocation comme précédemment décrit mais aussi selon le protocole de référence des Si RNA de PKC epsilon. Le profil d'expression observé correspond à un doublet de bandes dans le cytoplasme à environ 51 KD (et à une bande de 64 kD suivant les siRNA utilisés) alors qu'il ne correspond qu'à une simple bande à 50kD dans la fraction nucléaire. Les molécules de siRNA issues des séquences nucléotidiques du complexe Liv2l peuvent être choisies dans le groupe constitué des molécules de siRNA comprenant l'une quelconque des séquences SEQ ID N°119 à 126 et 171 à 175, et SEQ ID N° - l'utilisation d'une multithérapie basée sur la combinaison de plusieurs de ces siRNA pour le traitement de la pathologie cancéreuse ou neurodégénérative. Ces siRNA et la combinaison utile déduite des résultats de sur expression et de sous expression des biopuces et des RT PCR constituent un traitement adjuvant de la pathologie et peuvent être combinés à de petites doses de molécules chimiques ayant déjà fait leurs preuves dans le traitement de la pathologie. EXEMPLE 7 : test phannaco diagnostique A partir des observations qui suivent en annexe à la fm de la description de l'exemple sur les propriétés du complexe LN21, un design de test phannaco-diagnostic applicable en clinique a été conçu par l'inventeur avec des moyens techniques connus qui peuvent être déclinés différemment suivant les utilisateurs et correspondre pour chaque mode a un produit nouveau. L'invention réside dans la fabrication de puces diagnostiques à ADN, protéines et à anticorps comprenant les anticorps connus des différentes protéines du complexe associé suivant les phases du cycle cellulaire à LN21 c'est-à-dire les anticorps,peptides ou séquences nucléotidiques des gènes : de RBP2, E2F4, E2FI,SUMO, INT2, CRB2, HDAC1, TGFbeta, integrine_alpha5 beta2,Myob, MyoD, cycE/cdk2,cdk1, chkl , chk2, TNFalpha,CREB1 et p300, Rb, p107, p130 de la familles des pockets proteines. Mais aussi NFkB , cdc2A, mdm2, p21, p53, p65,p 73 RAS,Ki67, CAF1. Les puces à protéines (figure 20) permettront d'étudier les surexpressions ou sous expressions des produits des gènes, les interactions protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les phosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade différent des interactions protéiques et du métabolisme de la cellule saine. L'état d'expression et de silencing de certains gènes étant différent. Exemple 7.1 : puce phannaco diagnostic (Figure 20) conçue à partir de séquences nucléotidiques ou peptidiques fixées sur les supports classiques et selon les techniques connues type Agilent ou Affymetrix ou Caliper sans restriction à celles-ci et correspondant aux séquences connues des gènes suivant et listés par ailleurs dans le brevet en utilisant de préférence les séquences qui en analyse 3D présentent une structure 3D de préférence type loop (100pb) ou helix loop helix ou loop basique (environ 400pb) ou doigt de zinc ou encore une conformation 3D similaire à une hélice correspondant le plus souvent à des sites fonctionnels, ou encore des séquences nucléotidiques correspondant à une zone de méthylation d'une cytosine, méthylation de la région promotrice du gène entraînant un potentiel silencing (cf bibliographie générale) ainsi qu'aux séquences nouvelles des gènes de LIV21F et LIV21K listées dans la description et en annexe mais aussi des séquences communes à certains oncogènes et à certains virus qu'on pense impliqués en particulier dans le cancer du sein des populations chinoises : Mdm2 et HIV 1 : GAVTSSNIAA ; DLDQSV ; EGF et HPV16 ; EWWRLD ; KNSLD ; MHIESLDS Qui pourront aussi être testées en microfluidique fixés sur la lame d'or pour étudier les interactions protéiques avec les extraits cellulaires de la patiente. Mais qui peuvent aussi être étudiées par une technique MICAM appliquée à des biopuces qui maintiennent sur leur surface (cavités) les biomarqueurs par effet piezo électrique et non pas par fixation physico chimique. Exemple 7.2 : test en microfluidique, par exemple type Biacore, utilisant la technique S.P.R. (surface plasmonique resonance) connue de l'homme de métier à base d'un support fixé avec une pellicule d'or permettant une fois le faisceau lumineux envoyé vers l'interface d'obtenir une énergie absorbée fonction de la présence et de la taille des complexes protéiques (si interaction protéine protéine ou protéine anticorps) ou des complexes protéiques ADN (si interaction protéine ADN), ou ARN ou protéine ou peptide, et une onde évanescente perpendiculaire à l'axe de l'interface (utilisation d'un prisme). L'inventeur fixe les séquences choisies peptide ou ADN sur les particules d'or et calcule pour chaque complexe d'interaction étudié, le nombre de rU fonction de la taille des molécules citées dans ce brevet. En microfluidique le liquide passant sur ces puces à lame d'or peut être aussi bien un extrait cellulaire (voir sélectif c'est-à-dire uniquement noyaux cellulaires ou uniquement cytoplasmes cellulaires ou uniquement protéines du cytosquelette etc... suivant des techniques d'extraction et de séparation de fractionnement type Calbiochem :subcellular proteom extraction ou bien des extraits tissulaires ou cellulaires sans préparation autre que des anti protéases ou bien encore du liquide céphalo rachidien ou du sérum issu d'un prélèvement d'un patient pour étudier 59 2950075 le marqueur circulant(cf. liste des séquences nucléotidiques ou peptidiques décrite et / ou séquences connues des gènes impliqués dans le cycle de prolifération listés).. La figure 19 illustre la présence et la quantification de certains biomarqueurs présents dans les échantillons de patients testés en interaction avec les anticorps fixés sur les biochips. 5 La Figure 19:-puce à protéines avec nommés- les peptides des. protéines des complexes d'intérêtétu4dié dans l'invention. - 19 Deux B" : tylïee microfluidiqué de,quatre puits x2 avec un contrôle et - *t 0 biomarqueurs. .. . Qn.obse ve uoe mon de DDX1, MY(N et CRABPII alors qu'on observe en 10 testàiit le deuxième sensorc hip une sous expression de HUD, TP53 INP1 et ime sous expression-majeure de p21 On observe une sons expression de DKKI, SKP2,DKK3, ID2, p21, SKP2,TP531NP1, ID2,P73- alors qu'on observe' une sur expression de MYCN, ALK, NLRRI (le neuronal 1.5 leucine rich repeat est transactivé), CRABPII; DDXI, LIV21K, AURORA kinase A. EXEMPLE 8: Biopucé d'ARN des séquences SEQ ID N° 119 à 127 et 180 à combinés aux séquences de microRNA d'intérêt dans le cancer étudié : mir 21, mir 34a etc...sans que la biopuce soit limités à ceux là. La technique de fixation des ARN sur les supports diffère suivant le type de support, de révélation et de biopuce utilisée. Par 20 exemple on utilise les séquences ARN citées en solution biothynilées puis fixées sur des sensorchips à la streptavidine, si on teste leurs interactions avec les extraits cellulaires ou plasmatiques ou du . liquide céphalo rachidien passant dans les ' canaux (microfluidique) d'un A 100 ou T116. On peut utiliser aussi comme décrit dans le brevet US 2008 045418 Al des ARN bloqués en extrémité 3' et ajouter une ligue T4 RNA et 25 un « labeled nucleic acid adaptor » ayant un résidu 5' phosphate. EXEMPLE 9 : Etude de l'expression de LIV21 dans les biopsies de cancer du sein. Pour déterminer si les observations obtenues précédemment sont applicables aux tissus humains, un grand nombre de biopsies de cancer obtenues de patients ont été étudié par réaction d'immunohistochimie avec des anticorps spécifiques du complexe LIV21. La 30 détermination immunohistochimique de l'expression des protéines du complexe LIV21 a porté sur plusieurs biopsies de patients. Par ailleurs quelques lames paraffinées de patients atteints de cancer de sein ont. aussi étaient étudiées. Le perfectionnement de l'invention tient au fait de normaliser les biopsies ou les ponctions par une technique de prélèvement standardisée et qualibrée afin de permettre ensuite des comparaisons fiables entre extraits cellulaires de patients et de témoins ou entre fractions cytoplasmiques et nucléaires et membranaires. Cette même standardisation appliquée aux prélèvements permettant de comparer les résultats de surexpression ou de sous expressions des biomarqueurs par RTPCR est indispensable .pour obtenir des résultats fiables et comparables. Protocole d'analyse par Immunocytochimie : 1) Déparaffiner les lames, Réhydrater les tissus. 2) Saturer les sites non• spécifiques et perméabiliser les membranes. 3) Ajouter l'anticorps en chambre humide, Révéler l'anticorps. Déparaffmer les lames sous hotte Deux bains successifs de toluène (rectapur Prolabo) 2x30' ou 2x20min ; puis 15 déshydrater lés tissus du rectapur alcool à 100% 15 min ; puis rectapur éthanol à 95% pendant 10 min ; puis rectapur 70% pendant encore 10mn. Décongeler l'anticorps pendant le même temps, Réhydrater les tissus doucement dans du PBS additionné de 10% de sérum de veau foetal et 0,1% de Triton. Saturer les sites non spécifiques (par exemple avec de l'ovalbumine) et perméabiliser les membranes., 20 Réhydrater pendant une heure. Déposer un ml de ce « PBS » par coupe afin de recouvrir la lame sans qu'elle sèche à aucun moment (quand il s'agit de lame avec des cellules et non pas des tissus, une demi heure suffit). Mettre la vitre et le couvercle en inox et de l'eau en contrebas pour créer une chambre humide. Ajouter l'anticorps en chambre humide. Diluer au 200èine le sérum du lapin dans 4 ml de PBS triton pour continuer à 25 perméabiliser les membranes et SVF. Mettre 1ml sur chaque lame et éviter la lumière et l'évaporation. Laisser toute la nuit ou au minimum trois heures.Puis rincer au PBS normal 1X PH 7, faire deux lavages de 5 à 1 Q mn pour qu'il ne reste aucune trace du premier anticorps. Pendant qu'on prépare la sonde Alexa 488 verte (au froid à 4° à l'abri de la lumière) au 250` donc 10 µlitre dans 2,5m1 de PBS avec toujours 10%SVF 30 et 0 ,1% Triton, Reposer les lames sur la plaque. Recouvrir la coupe avec 2,5m1 pour garder une chambre humide pendant une heure puis lavage au PBS 1X PH 7. Lavage au Iodure de Propidium à 0,5 microgramme par microlitre à diluer à 20 microgramme par ml puis encore au 50` mais cette fois, dilué dans du PBS seul 1 X (50 microlitre pour 2,5 ml de PBS). Egoutter en les sortant du PBS puis 2,5 ml de iodure de propidium reparti sur les quatre lames• pendant une minute puis deux rincage au PBS simple. Montage des lames au Moviol avant lecture. Pour un immun marquage à la peroxydase il est indispensable de masquer les sites antigèniques par une étape au bain marie de 20 minutes afm d'avoir des résultats intéressants quand on travaille sur des lames paraffinées. Ces résultats montrent que • la localisation cytoplasmique de LIV21 est un indicateur de l'agressivité et du potentiel métastatique du cancer. La détection de l'expression de LIV21 indique la présence de cellules cancéreuses invasives, agressives et métastatiques. Ces résultats montrent également que la localisation nucléaire de LIV21 est un indicateur de cellules quiescentes saines soit de tissus bien différentiés. Annexe : Etude de la translocation nucléaire de LIV21 dans les cellules MCF-7 L'étude de la distribution sub-cellulaire de LIV21 dans différentes lignées tumorales d'origines diverses a montré une localisation exclusivement cytoplasmique de cette protéine. La présence de sites putatifs de phosphorylation par les Protéines Kinases C (PKCs) dans la séquence de LIV21 traduit une implication de ces protéines sur sa translocation nucléaire. La lignée MCF-7 traitée par le TPA, module les PKCs et est utilisée ici. L'effet du TPA sur la lignée MCF-7 Le TPA est un activateur connu des PKCs. Il active la croissance des cellules normales du sein, ne modifie pas la prolifération des cellules de tumeurs bénignes de ce même tissu, mais il inhibe de manière drastique la prolifération des cellules de lignées de tumeurs mammaires humaines telles que la lignée MCF-7. Il réduit la croissance cellulaire de cette lignée en contrôlant positivement le récepteur c-erb-2 et en contrôlant négativement le, récepteura de l'acide rétinoïque, qui sont tous deux exprimés de manière particulièrement importante dans ces cellules. Le TPA inhibe fortement et rapidement l'expression et la fonction des récepteurs aux oestrogènes (ER) et il induit la translocation, temps- et dose-dépendante, des protéines kinase C (PKCs) du cytosol vers les membranes.D'autre part, le TPA augmente la capacité de migration des cellules MCF-7 in vitro et un court traitement de ces cellules par le TPA induit une expansion cellulaire et une organisation des microtubules caractéristiques de leur différenciation. Expression de LIV21 dans les cellules MCF-7 Dans un premier temps, l'inventeur a vérifié l'expression de LIV21 dans ces cellules, au 10 niveau transcriptionnel et au niveau protéique. L'expression de l'ARNm de LIV21 a été mis en évidence par RT-PCR (amorce sens : CCTGACATCCCTACA (SEQ ID No 3) et amorce antisens : TCCTATGCTTGA (SEQ ID No 4)) dans ces cellules comparativement aux cellules des tissus mammaires (figure 15 2A). Un ARNm de même taille que l'ARNm détecté dans les tissus mammaires et spécifique de LIV21 a été détecté. Cependant, le niveau d'expression de LIV21 dans les cellules MCF-7 est plus faible que dans les tissus mammaires. Ce premier résultat montre que la lignée MCF-7 exprime l'ARNm LIV21. 20 L'inventeur a abordé l'étude de l'expression de la protéine LIV21 par la technique du western blot, avec un anticorps anti-LIV21, dans les cellules MCF-7 par rapport aux tissus mammaires. Les anticorps anti-LIV21 ont été obtenues par la méthode décrite . Dans cette lignée, LIV21 s'exprime aussi bien dans les tissus mammaires que dans les cellules MCF-7, sous la forme d'un doublet migrant à un poids moléculaire apparent de 25 51 kDa . Production du sérum purifié anti-LIV21 Les séquences peptidiques spécifiques sont les séquences n°1 et n°2 et N° 180 Ces peptides ont été injectés aux lapins (NZ W ESD 75 femelle 2,3kg au jour 0) 30 En accord avec les procédures d'immunisation standard, L'effet des inhibiteurs sur dans les cellules MCF7 Etude de l'influence des PKC sur la translocation nucléaire de LIV21 Effet du TPA sur l'expression de PKCe Etude en Western Blot : Etant donné que la séquence protéique de LIV21 possède des sites putatifs de phosphorylation par les PKCs dont deux spécifiques de la PKCc , l'inventeur a testé la variation de l'expression de cette PKC en fonction de la durée de traitement par le TPA. Il a été observé que le TPA agit très rapidement sur l'expression de PKCs, qui diminue dès 30 min . L'expression de la PKCzeta (PKCE) est utilisée en tant que contrôle interne car elle n'est pas sensible au TPA. Immunocytochimie : Parallèlement, des expériences d'immunofluorescence sur des cultures traitées ou non ont permis de mettre en évidence cette diminution de la PKCs concomitante à la translocation nucléaire de LIV21 . On peut observer que PKCs disparait du cytoplasme lorsque les cellules sont traitées au TPA et que LIV21 est détectée dans le noyau. Pour conclure, il est intéressant de noter que la PKCs est faiblement exprimée à 12h, temps où on observe le moins de cellules en phase S et le maximum de translocation nucléaire de LIV21. Etude du rôle spécifique de PKCs sur la translocation nucléaire de LIV21 à l'aide d'un peptide inhibiteur de la fonction et de la translocation de PKCE . Pour déterminer l'action spécifique de PKCs sur la translocation de LIV21, les cultures ont été traitées avec un peptide, antagoniste sélectif de la fonction et de la translocation de cette PKC (EAVSLKPT (SEQ ID No 6), et les résultats ont été comparés avec ceux obtenus par traitement au TPA. Ce peptide est reconnu par l'enzyme et se lie en tant que substrat modifié au niveau de son site catalytique. Non phosphorylable, il agit en tant qu'inhibiteur spécifique de l'activité de PKCs. L'effet de l'inhibition sélective de l'activité de la PKCs sur la translocation nucléaire de LIV21 a été étudié par immunocytochimie. Ces expériences ont été réalisées sur des cultures traitées ou non pendant 12h, avec du TPA à 25 nM ou avec le peptide à deux concentrations différentes, 1 et 211M (. Le peptide utilisé à la concentration de 2.µM a un effet identique à celui du TPA sur la translocation nucléaire de LIV21. Ces résultats ont été confortés par des expériences de fractionnement cellulaire sur des cultures traitées par le peptide inhibiteur de PKCs à 2 µM comparées à des cultures traitées par le TPA (. Le même profil d'expression de LIV21 a été observé sous la forme d'un doublet dans le cytoplasme et d'une bande unique dans la fraction nucléaire. L'inhibition spécifique de la PKCs induit une translocation nucléaire de LIV21, ce qui suggère que LIV21 pourrait être la cible de la PKCc, qui le maintiendrait dans le cytoplasme sous une forme phosphorylée. EXEMPLE : Analyse par Western Blot Cet exemple décrit les conditions utilisées pour une analyse par Western Blot de cellules cancéreuses de cerveau. 20 Les extraits protéiques sont chauffés 5 minutes à 80°C dans le tampon Laemmli (pH 7.4, Tris 0,06M, SDS 3%, glycerol 10%, PMSF 1mM, (3-mercaptoéthanol). La migration est effectuée en SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophorèsis). 10 à 20 µg de protéines migrent dans un gel de polyacrylamide 12% pendant 1h dans des conditions dénaturantes (Tampon de migration : Tris base 25mM, 25 glycine 192mM, SDS 1%, pH 8.3). Les protéines sont ensuite transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell) pendant une heure en transfert liquide, dans un tampon de transfert (Tris 25mM, glycine 192mM, méthanol 20%, pH 8.3). Les membranes, saturées dans du PBS-Tween 0,1% -Triton X100 0,1%-lait écrémé 5% pendant une heure sont mises en contact avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS- 30 Tween 0,1% -Triton X100 0,1%-lait 1% à température ambiante sous agitation douce15 pendant une heure à deux heures. Après lavage, l'anticorps secondaire couplé à la péroxydase est incubé 1h avec les membranes. La révélation se fait par une réaction de chimioluminescence grâce au kit ECL selon le protocole du fournisseur (Amersham). Les anticorps primaires utilisés sont : Le sérum anti-LIV21 qui a été fabriqué en utilisant des peptides synthétiques basés sur la séquence de LIV21F et des PeptideLlV21a (SEQ ID No 1 et le peptide LIV21b (SEQ ID No 2 et/ou peptide LIV21e (SEQ ID N°51). Les peptides ont été couplés à l'hémocyanine avant d'être injectés à des lapins pour l'immunisation. L'anticorps polyclonal a été obtenu à partir de deux de ces peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum préimmun (afin d'être sûr que cet anticorps n'existait pas déjà chez ce lapin). L'anticorps polyclonal anti-CDK2 de lapin (Santa-Cruz technology sc-163) dilué au 1/200. L'anticorps monoclonal anti-p21 de Souris ( DAKO, M7202) dilué au 1/150. L'anticorps monoclonal anti-p27 de souris (Santa-Cruz technology sc-1641) dilué au 1/100. Il a été démontré auparavant que la protéine LIV21 est associée aux corps PML et que, lors de la sumoylation, LIV21 passe d'un poids moléculaire de 50kd à 60kd. Par immunoprécipitation, l'inventeur a montré une co-localisation de LIV21 avec SUMO dans le complexe PML - SUMO/LIV21. (Figure 12) Rôle antitumoral des corps PML : Au stade de prolifération, il y a dans les corps PML des modifications visualisées car ces corps PML se dissocient et se dégradent :(speekles), des protéines se mettent alors à disposition dans le noyau pour assurer la transcription, la prolifération, les réactions immunitaires et tout ce qui nécessite la transcription de gènes. Il a été démontré que PML s'associe à SUMO et à HDAC-1 (histone déacétylase 1) et que son complexe agit sur l'expression d'E2F1 et PML agit ainsi sur l'arrêt de la prolifération en bloquant E2F1. Ainsi le complexe PML/ HDAC-1 régule négativement l'expression d'E2F1. PML associé à Rb (p130) se fixe aux histones désacétylases et bloque E2F1 en se fixant sur la chromatine. Dans les leucémies promyélocytaires aigües, PML est tronquée et devient une protéine de fusion avec le récepteur de l'acide rétinoïque. Cette protéine de fusion (PMLRARalpha) est dûe à une translocation chromosomique 15/17. Il a été rapporté dans la littérature un nouveau traitement de cette maladie par association d'arsenic et d'acide rétinoique pour induire les cellules cancéreuses en apoptose. La protéine PML régulerait la prolifération dans les cancers et les lymphomes. L'inventeur a montré par immunoprécipitation l'association SUMO-PML dans lequel est localisé LIV21. Il a été montré auparavant que LIV21 est phosphorylée par PKCs et que le TPA est un inhibiteur des PKC. Les lignées MCF7 traitées par TPA montrent une inhibition de la prolifération cancéreuse et une différentiation cellulaire et LIV21 est transloquée dans le noyau. Si on a utilisé un peptide inhibiteur spécifique de PKCs, c'est l'activité et non pas l'expression de PKCs qui a été inhibée. Lors de ce traitement lorsque l'on a étudié E2F4, p130 et LIV21 (fluorescence verte) dans les noyaux marqués (ADN) au iodure de propidium (fluorescence rouge) , on a observé :Au bout de 12h des signaux de fluorescence verte intranucléaire de même pattern pour E2F4, p130 et LIV21 ; Au bout de 48 h quand la prolifération commence, E2F4 a une localisation comparable ; mais à 72 h, il disparaît du noyau (au profit d'E2F1). En observant la co-localisation par double marquage de PML et de LIV21 à 24 h de traitement par PKC (cf. merge : fluorescence jaune), on a observé qu'ils sont colocalisés dans les noyaux. A 48h, la co-localisation est aussi constatée entre LIV21 et SUMO (cf. . L'hypothèse est que SUMO, qui se fixe sur LIV21, adresse en fait LIV21 dans les corps PML et que LIV21 est impliqué dans les complexes PML/SUMO/Rb/HDAC-1. LIV21 est physiquement associé à PML et SUMO dans les corps nucléaires, par immunoprécipitation et par co-localisation en immunocytochimie ((Rb, p130 et p 107 sont des protéines poches (pocket proteins) qui ont le même site de fixation). Les protéines Rb répriment la croissance cellulaire (Fabbro, Regazzi R Bioch BiophysResComm 1986 Feb 2 ;135 (1) :65-73). Interaction physique de LIV21 avec les protéines de la famille E2F Des expériences de co-immunoprécipitations réalisées à l'aide d'anticorps anti-LIV21, anti-E2F1 et anti-E2F4 ont permis de mettre en évidence que LIV21 s'associe à E2F4. Il a été démontré que BRCA1 rentrait aussi en interaction avec les membres de la famille E2F et donc le complexe LIV21. En effet E2F1 interagit avec BRCA1 et Brcal interagit avec MYC, ESRI, CHEK1 et MAP3K3. Les membres de la famille E2F sont des facteurs de transcription dont le rôle a largement été décrit dans la littérature comme étant des molécules-clés dans le contrôle positif ou négatif du cycle cellulaire (Slansky JE et Fareham PJ 1996 ; Helin K 1998 et Yamasaki L. 1998), de par leur association avec la protéine pRb (WuCL, Zukerberg LR, Lees JA 1995) ou les protéines poches. E2F1, contrôle positivement le cycle cellulaire en transactivant le promoteur des gènes responsables de la prolifération cellulaire (ADN polymérase alpha, thymidine kinase, DHFR, etc.), tandis qu'E2F4 est décrit comme un des membres de la famille des EFs contrôlant négativement le cycle. De plus, il a été montré une forte expression d'E2F1 dans les tissus mammaires embryonnaires (Espanel X, Gillet G 1998), tandis qu'elle n'est plus exprimée dans les tissus mammaires post-mitotiques au profit d'une forte augmentation de l'expression d'E2F4 (Kastner A Brun G 1998).L'identification d'antigènes a été faites dans des lysats cellulaires par immunoprécipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées à E2F4 et E2F1 a été mise en évidence par co-immunoprécipitation de complexes protéiques. L'étude du complexe par µ MACS PROTEIN à MICROBEADS ( MILTENYIBIOTEC). Par ajout de lysats de S Aureus, les protéines A interagissent avec la partie Fc des anticorps spécifiques et les immuns complexes deviennent insolubles, on les récupère donc par centrifugation. Après rupture des liaisons (chauffage) entre AG AC et membranes riches en protéines A, on a réalisé un western blot. Ces résultats suggèrent que le complexe L1V21/E2F4 semble jouer un rôle important dans l'établissement de la quiescence des cellules. Une étude de co immunoprécipitation est menée aussi avec les profound mammalian kit PIERCE. Interaction fonctionnelle de LIV21 avec les protéines de la famille E2F. Il a été mis en évidence que le blocage de l'expression de la protéine LIV21 était corrélé à une diminution de l'expression d'E2F4 et à une augmentation de l'expression d'E2F1. Parallèlement, l'aspect fonctionnel de l'augmentation d'E2F1 a été vérifié par l'étude de la transcription de deux de ses gènes cibles, la DHFR et la ADN polymérase a. En conclusion, ces résultats suggèrent que le complexe LIV21/E2F4 agit comme un complexe inhibiteur de l'expression du gène E2F 1. Ce complexe pourrait correspondre à un nouveau point de contrôle dans l'arrêt de prolifération cellulaire. REFERENCES Arya R, Kedar V, Hwang JR, McDonough H, Li HH, Taylor J, Patterson C. 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Les nouvelles séquences du Complexe Liv2l humain, caractérisé en ce qu'il comprend : - les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 171 à 175, et - une séquence siRNA dérivée_ de l'une des sécmences d'ARN de SEQ ID N° 120 et SEQ ID N° 121; - une fraction protéique comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 et 181ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et 18 let la séquence SEQ II) N° 183 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 183. 2. Complexe Liv2l humain selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend 15 en outre : -les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 123, 124 et 127, et les fractions protéiques comprenant au moins la séquence SEQ ID N° 1 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 1 et les séquences 178 à 185 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90% d'identité avec ladite SEQ ID N° 178 à 185 ; 20 Le complexe Liv21 humain est caractérisé en ce qu'il comprend en outre : L'une quelconque des séquences nucléotidiques ou ribonucléiques SEQ ID N° 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126 ou 127. ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID Na 119 à 127, ou 25 UUGGUAACGACCAUGCCAC, ou UUCACUUAGAAUAAUGUCC, ou UCUUUGUGAAUUUGACAAC, ou UCAAGGUCCAGGCUACAAC, ou - l'une quelconque des séquences siRNA suivantes : GUGGCAUGGUCGUUACCAA dTdT dTdT CACCGUACCAGCAAUGGUU 3.0 GGACAUUAUUCUAAGUGAA dTdTdTdT CCUGUAAUAAGAUUCACUU GUI i -UCAAAUUCACAAAGA dTdT dTdT CAACAGUUUAAGUGUUUCU GUUGUAGCCUGGACCUUGA dTdT dTdT CAACAUCGGACCUGGAACU - ou la séquence nucléotidique suivante: CCGGCCGNNANNNNGGCCGCGGGAATFCGATTAAATATAAGCAATCCCAAC ACCTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATGGAGACC ATCCTGGCTAACACAGTGAAACCCTGTCTCTACTGAAAATACAAAAAAGTA GCCGGGCGTGGCGGCAGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGG CAGGAGAATGGCATGAACCCAGGAGGCAGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATT GTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCGAGACTCCATCTCAAAAAA AAAAAAAAATCACCCCAAAGCAATAAGGAGAACTAGAACAGGACATACAC TCCAACACTGGTGAAACTAGGAAAACATATGTAACCCCAAACCACAATATA TACACACAAAACTATACGAGATGTTGGGATTGCTTATATTTAAT. 3. Complexe Liv2l humain selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins : - l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 123, SEQ ID N° 124 et 20 SEQ ID N° 127 à 149, ou - l'une quelconque des séquences d'acides aminés SEQ ID N° 1 à 118 et SEQ ID N°150 à 170 et 178 à 185, ou une séquence présentant 90%, et préférentiellement 80%, et plus préférentiellement 70% d'identité avec lesdites séquences SEQ ID N° 1 à 185. 25 4. Complexe Liv21 humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il interagit avec au moins un de ses partenaires associés, ledit au moins un de ses partenaires associés étant choisit dans le groupe constitué de ; - l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, TNFalpha, crb2, cycE/cdk2, cdkl, 30 CREB1, p300, p107, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, p73 ou- un anticorps de l'une quelconque des protéines suivantes : RBP2, E2F4 , E2F1, SUMO, HDAC-1, crb2, Int2,cmd2, cycElcdk2, cdld, ,CREBI et p300, Rb, p 107, pi 30 de la familles des pockets protéines NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, CAF1, la cycline A et Dl, CHU& 5. Méthode de détection du complexe Liv2l humain, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexes Liv21 selon la revendication 1 ou 2. 10 6. Méthode de détection du complexe Liv2l humain selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mise en oeuvre d'au moins une sonde spécifique d'au moins une séquence dudit complexe Liv2l et de ses partenaires associés selon l'une quelconques des revendications 3 à 4. 15 7. Méthode de détection selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes: - une étape d'extraction du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez un patient, - une étape de mise en contact dudit matériel biologique avec 20 au moins ladite sonde spécifique de l'une quelconque des séquences dudit complexe Liv2l humain ou dudit complexe Liv21 et de ses partenaires associés, et au moins un contrôle, et - une étape de détection de l'expression des produits d'expression des gènes dudit complexe Liv2l humain ou dudit complexe Liv2l et de ses partenaires associés, lesdits 25 produits d'expression étant constitués par des ARN messagers, ou des peptides, ou des protéines.5