Brevet FR2956866A1 — publié le 20110902

Procédé de détection en milieu liquide de bactéries résistantes aux céphalosporines de troisième génération La présente invention concerne un procédé pour détecter, en milieu liquide, la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases, incluant les métallo-R-lactamases, la détection d'une telle enzyme étant indicatrice de la présence d'une bactérie résistante aux céphalosporines de troisième génération. Les R-lactamines représentent la famille d'antibiotiques la plus importante du fait du grand nombre de molécules qui en font partie et du fait de ses propriétés pharmacologiques et des spectres associés qui permettent de combattre la plupart des espèces bactériennes. Les R-lactamines sont à juste titre les antibiotiques les plus prescrits en médecine générale. Leur spectre d'activité est variable en fonction de leur classe (pénicillines ou céphalosporines) et parfois en fonction des molécules dans chaque classe. Ainsi, les pénicillines G et V sont plutôt actives sur les cocci à Gram positif et les bactéries anaérobies, tandis que le spectre des aminopénicillines s'étend à quelques bacilles à Gram négatif. L'adjonction d'un inhibiteur de R-lactamases permet en outre d'observer une activité sur certaines bactéries produisant ces R-lactamases. Les céphalosporines étendent encore le spectre d'activité vers les bacilles à Gram négatif mais sont un peu moins actives sur les cocci à Gram positif. Parmi les R-lactamines, les céphalosporines représentent la catégorie d'antibiotiques la plus souvent prescrite. L'usage courant des céphalosporines a entraîné la diffusion de souches résistantes vis-à-vis de ces molécules. Ces souches parviennent notamment à survivre à la pression de sélection des céphalosporines de part une activité R-lactamase. La détection des résistances combinées vis-à-vis des céphalosporines de lère 2ème et de Sème génération (C3G) chez les entérobactéries devient d'une importance thérapeutique majeure. En effet, la résistance des entérobactéries aux antibiotiques connaît une évolution mondiale préoccupante avec un impact croissant des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) qui diffusent notamment dans le secteur communautaire. En 2002, moins de 1 % des souches d'entérobactéries avaient une BLSE. En 2006, elles représentaient 1 à 5 % des souches. La résistance aux C3G, qu'elle soit due aux BLSE ou à d'autres R-lactamases (céphalosporinase ou carbapénémase) est donc en augmentation et est devenue significative, notamment pour Escherichia coli et Kiebsiella pneumoniae. L'émergence de ces enzymes a récemment été rapportée chez des bacilles à Gram négatif non fermentants tels que Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia. Il est donc de plus en plus important de pouvoir détecter des bactéries possédant une BLSE. La détection des BLSE chez les entérobactéries est simple à mettre en oeuvre dans la plupart des cas : elle est objectivée par une synergie entre le mélange [amoxicilline + acide clavulanique (AMC)] et une C3G (la ceftazidime est la plus sensible) ou l'aztréonam. Néanmoins l'obtention d'un résultat demande beaucoup de temps. Le test de synergie est réalisé en disposant les disques d'AMC et de la C3G choisie (ou de l'aztréonam) à 30 mm de distance, centre à centre. La détection des BLSE est en revanche plus difficile chez les souches également hyperproductrices de céphalosporinase (AmpC) comme Enterobacter. Dans ce dernier cas, il est plus aisé de visualiser la synergie entre AMC et céfépime ou cefpirome. Enfin, chez certaines espèces telles que Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Morgane/la morganii, Pro videncia stuartii et Pro videncia rettgeri, les BLSE s'expriment faiblement et sont donc encore plus difficiles à détecter. Dans ces cas, le test de synergie est optimisé en plaçant les disques à une distance de 40-45 mm, au lieu de 30 mm, selon les recommandations du CA-SFM (Comité de l'antibiogramme de la Société française de microbiologie) en 2007. Des automates de bactériologie pour identification et antibiogramme sont de plus en plus utilisés (Mini-Api®, commercialisé par bioMérieux Clinical Diagnostics, Phoenix® commercialisé par BD Diagnostics , MicroScan® commercialisé par Siemens, Vitek®, Vitek-2® et Vitek Compact® commercialisés par bioMérieux). D'une manière générale, ces automates détectent relativement bien les BLSE chez les souches qui n'hyperproduisent pas habituellement de céphalosporinases (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca). Pour les autres espèces (Enterobacter, Citrobacter, Serratia, etc.), leur sensibilité et surtout leur spécificité sont un peu moins bonnes que celles des méthodes manuelles. Des tests complémentaires s'avèrent alors nécessaires. La détection des souches résistantes aux C3G peut donc être aisée pour certaines résistances reliées à certaines espèces mais, d'une manière générale, aucune procédure ne possède 100 % de sensibilité ni ne permet d'obtenir un résultat rapide. De nouvelles techniques de détection, plus rapides, de ces microorganismes ont donc été recherchées. Parmi elles, certaines utilisent un substrat chromogène. Actuellement, la détection des microorganismes producteurs de 3-lactamases à spectre étendu (BLSE) utilisant un substrat chromogène repose sur le principe suivant : - la ou les colonies suspectes sont déposées sur un disque ou sur une bandelette pré-imprégné(e) d'un substrat chromogène, - on observe le changement de coloration. L'utilisation combinée du chromogène avec des inhibiteurs spécifiques des différents types de 13-lactamase permet de différencier les souches productrices de BLSE, de céphalosporinase, et/ou de métallo-13-lactamase. Il existe un test appelé Cica-Beta-Test (Kanto Chemical Co., Inc) qui permet la détection rapide des BLSE, des carbapénémases dont les métallo-[3-Iactamases et aussi des céphalosporinases, si elles sont exprimées, sur la base d'une dégradation du composé chromogène HMRZ-86. La détection est effectuée au bout d'une durée maximale de 15 minutes, par détection d'un changement de coloration du jaune vers le rouge. Dans ce type de test, il est fortement conseillé d'induire la résistance par la prise de colonies situées autour d'un disque portant une C3G. Cette étape d'induction implique alors une attente de 16-24 heures supplémentaires avant d'obtenir un résultat. Le composé HMRZ-86 ((7R)-7-[2-(aminothiazol-4-yl)-(z)-2-(1-carboxy-l- methylethoxyimino)acetam ido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacetate, isomère E) a notamment été décrit dans la demande de brevet EP1325923 et par Hanaki et al. (2004 Journal of Antimicrobial Chemotherapy 53:888-889). Dans ces deux documents, il est proposé d'utiliser le substrat chromogène sur un disque, qui est généralement un disque de cellulose de couleur blanche ou pâle. Les brevets US 5,338,843, US 5,583,217, et US 5,514,561 ont par ailleurs décrit des substrats chromogènes de 8-Iactamases et leur utilisation pour détecter la présence de 8-Iactamases par absorption sur une membrane de nitrocellulose. Les 13-Iactamases peuvent être extracellulaires dans le cas des bactéries à Gram positif, ou être périplasmiques dans le cas des bactéries à Gram négatif. Pour les bactéries à Gram négatif, de manière à améliorer la sensibilité de ces tests sur disque ou bandelette, l'utilisateur est souvent obligé d'étaler la colonie en insistant (grattage), pour rendre l'enzyme accessible au substrat et ainsi observer un éventuel changement de coloration au niveau de la zone d'étalement. Cette étape peut introduire un biais lié à l'utilisateur qui réduit la fiabilité et la reproductibilité de la méthode, l'utilisateur ne grattant pas nécessairement les colonies de manière constante. En outre, lorsque l'on travaille sur des colonies colorées (par exemple des colonies isolées à partir d'un milieu chromogène), la coloration de la colonie, surtout si elle est rose ou rouge, peut rendre difficile la détection du changement de couleur induit par le clivage du substrat chromogène qui vire du jaune au rouge en cas de positivité. La demande internationale WO 2009/051838 a décrit une méthode de détection de 13-lactamases dans un échantillon bactérien par mise en contact de l'échantillon bactérien avec des compositions comprenant une combinaison d'un substrat chromogène avec un ou plusieurs inhibiteur(s) de 8-lactamases, et détection de l'utilisation du substrat dans les compositions. La composition peut éventuellement comprendre, en outre, un agent de lyse et un agent additionnel améliorant la lyse bactérienne par l'agent de lyse. Les compositions utilisées pour la détection peuvent se présenter sous différentes formes : sous forme liquide, de boîte d'agar, de bandelette ou disque papier, de comprimé, sous formes sèches dans des tubes ou des puits. Les inventeurs proposent un procédé de détection de BLSE, céphalosporinases et carbapénémases, incluant les métallo-13-lactamases, mettant en oeuvre un réactif liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène et éventuellement un agent de lyse de la paroi bactérienne. Ce procédé évite les problèmes associés aux tests précédents en format disque ou bandelette, en particulier le Cica-Beta-Test, tels que le biais lié à la mise en oeuvre d'une étape d'écrasement des colonies bactériennes sur le disque ou la bandelette et l'interférence possible des colonies bactériennes colorées avec la détection du virage de coloration induit par le clivage du substrat chromogène. De plus, ce procédé ne nécessite pas d'étape d'induction de la résistance, assurant ainsi un gain de temps considérable par rapport aux tests existants. Procédé de détection d'une céphalosporinase, /3-lactamase à spectre étendu (BLSE) et carbapénémase L'invention concerne donc un procédé pour détecter la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu et des carbapénémases, ledit procédé comprenant les étapes consistant à: a) mettre en suspension des bactéries dans une composition liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter ; et b) détecter l'éventuelle libération du chromophore ou du fluorophore ; la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore à l'étape b) indiquant la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu et des carbapénémases.35 L'invention concerne également un procédé de détection in vitro de microorganismes résistants aux céphalosporines de Sème génération, mettant en oeuvre le procédé de détection de la présence d'enzyme défini ci-dessus. Par "13-lactamase", on entend ici une enzyme qui hydrolyse les R-lactamines avec ouverture du noyau R-lactame et production de dérivés inactifs. Les [3-lactamases sont généralement sécrétées dans le milieu extérieur chez les bactéries à Gram positif, et dans l'espace périplasmique chez les bactéries à Gram négatif. Elles regroupent entre autres les céphalosporinases, les [3-lactamases à spectre étendu et les carbapénémases. Les [3- lactamases sont classées selon deux classifications principales: - la classification de Bush, élaborée en 1989 et réactualisée en 1995 puis en 2009, classe les [3-lactamases en fonction de leur substrat préférentiel parmi la pénicilline, l'oxacilline, la carbénicilline, la céfaloridine, le céfotaxime et l'imipénème, et en fonction de leur sensibilité à l'acide clavulanique, un inhibiteur des [3-lactamases; - la classification de Ambler, proposée en 1980, est basée sur la séquence protéique des [3-lactamases. Elle se compose de quatre classes d'enzymes : A, B, C et D. Les [3-lactamases des classes A, C et D comportent une sérine au niveau du site actif, qui forme une liaison covalente transitoire avec la R-lactamine, entraînant l'ouverture du cycle [3-lactame. Ces [3-lactamases sont aussi appelées sérine [3-lactamases. La classe B regroupe quant à elle des métallo-enzymes nécessitant un ion zinc pour hydrolyser le cycle R-lactame. Les 13-lactamases sont nombreuses et diversifiées, en fonction de leurs propriétés. Elles sont responsables de la résistance aux 13-lactamines comme les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames, les céphamycines, et les carbapénèmes. Elles inactivent ces antibiotiques par hydrolyse du noyau R-lactame. Parmi les [3-lactamases, la R-lactamase TEM-1 est très largement répandue dans les différentes espèces bactériennes. Elle hydrolyse très efficacement les pénicillines, mais pas les céphalosporines de troisième génération, et elle est sensible à l'inhibition par l'acide clavulanique. Les bactéries produisant des [3-lactamases de cette catégorie sont donc facilement traitées par des céphalosporines de Sème génération (C3G). En revanche, les BLSE, certaines céphalosporinases et carbapénémases, lorsqu'elles sont produites par les bactéries, les rendent résistantes aux céphalosporines de Sème génération (C3GR). Les séquences en acides aminés des [3-lactamases sont très proches les unes des autres au sein d'une même famille. Il a ainsi suffi de la substitution d'un petit nombre d'acides aminés pour permettre aux [3-lactamases de type TEM-1, initialement inactives, 6 d'hydrolyser les céphalosporines (13-lactamases de type BLSE par exemple), ou de devenir résistantes aux inhibiteurs. Le tableau 1 décrit les propriétés des différents types de R-lactamases, en particulier des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu et des 5 carbapénémases. Tableau 1: Tableau synthétique et non exhaustif décrivant les propriétés des [3-lactamases majeures conférant (C3GR) ou non la résistance aux C3G. Exemples Inhibé par le Classe C3GR clavulanate par moléculaire (Ambler) R-lactamase à TEM-1, TEM-2, SHV-1 +++ A Non spectre large (pénicillinases) Famille OXA (OXA-1) + D Non R-lactamase à Familles TEM, SHV, CTX-M ++++ A Oui spectre étendu (BLSE) Famille OXA (OXA-11, -14,- + D Oui 15,-16,-17) céphalosporinases Chromosomiques 0 C Non ou AmpC Hyperproduites 0 C Oui Plasmidiques : ACC-1, famille CMY, DHA-1 carbapénémases Familles IMP, VIM (métallo- 0 B Oui R-lactamases) Famille KPC +++ A Oui Famille OXA (OXA 23-27, + D Oui OXA-40, OXA-48) 10 La libération du chromophore ou du fluorophore peut être détectée par un changement de coloration ou d'émission de fluorescence de la composition liquide dans laquelle les bactéries ont été mises en suspension. Les bactéries mises en suspension dans ladite composition liquide peuvent provenir d'une ou plusieurs colonies bactériennes. En particulier les colonies bactériennes 15 peuvent avoir été prélevées à partir d'un milieu gélosé, sélectif ou non, ensemencé directement avec un échantillon biologique, avec des bactéries préalablement cultivées issues d'un échantillon biologique ou avec toute souche bactérienne de collection. Dans le contexte de l'invention, un « échantillon biologique » fait référence à une substance d'origine biologique. L'échantillon biologique peut être un fluide (par exemple 20 sang, salive, pus, urine, sécrétions vaginales, sperme, selles, liquide céphalorachidien, liquide pleural, liquide amniotique), ou un tissu. Les bactéries peuvent être des bactéries à Gram positif et/ou à Gram négatif, de préférence des bactéries à Gram négatif. Plus spécifiquement, il peut s'agir d'une bactérie sélectionnée dans le groupe constitué - des Enterobacteriaceae telles que les souches du genre Klebsiella, en particulier Klebsiella pneumoniae et Klebsiella oxytoca; les souches du genre Escherichia, en particulier Escherichia coli; les souches du genre Enterobacter, en particulier Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae et Enterobacter aerogenes; les souches du genre Citrobacter, en particulier Citrobacter freundii et Citrobacter koseri; les souches du genre Proteus, en particulier Proteus mirabilis, Proteus vulgaris et Proteus rettgeri; les souches du genre Serratia, en particulier Serratia marcescens; les souches du genre Salmonella; les souches du genre Providencia; les souches du genre Shigella; les souches du genre Kluyvera; Morganella morganii et Hafnia alvei; - d'autres microorganismes à Gram négatif tels que les espèces du genre Acinetobacter, en particulier Acinetobacter baumannii; les espèces du genre Pseudomonas, en particulier Pseudomonas aeruginosa et celles des genres Stenotrophomonas, Burkholderia, Haemophilus, Bordetella, Neisseria spp et Bacteroides fragilis. La détection d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases est indicatrice de la présence d'une bactérie résistante aux céphalosporines de Sème génération dans l'échantillon biologique dont sont issues les bactéries mises en suspension dans ladite composition liquide. Les différents aspects du procédé selon l'invention sont détaillés ci-dessous, toutes les caractéristiques divulguées pouvant être combinées les unes aux autres, sauf indication contraire. Agent de lyse bactérien Avantageusement, en particulier lorsque les bactéries sont des bactéries à Gram négatif, ladite composition liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter peut comprendre en outre au moins un agent de lyse bactérien. De préférence, l'agent de lyse bactérien lyse ou dérègle la fonction protectrice de la paroi bactérienne sans hydrolyser le substrat chromogène ou fluorogène. Ledit au moins un agent de lyse bactérien peut être sélectionné dans le groupe constitué d'un détergent, d'une enzyme qui dégrade la paroi bactérienne, d'un agent causant la formation de pores dans la paroi bactérienne ou la membrane cellulaire, et de combinaisons de ceux-ci. Un « détergent » est un composé chimique doté de propriétés tensioactives qui peut être en particulier un détergent zwitterionique, un détergent non-ionique, ou un détergent ionique, anionique ou cationique. Des exemples de détergent sont bien connus de l'homme du métier et comprennent en particulier : acide chénodésoxycholique; sel de sodium d'acide chénodésoxycholique; acide cholique; acide déhydrocholique; acide désoxycholique; ester de méthyle d'acide désoxycholique; digitonine; digitoxigenine; oxyde de N,N- diméthyldodécylamine; docusate de sodium; sel de sodium d'acide glycochénodésoxycholique; hydrate d'acide glycocholique; sel de sodium d'hydrate d'acide glycocholique; monohydrate d'acide glycodésoxycholique; sel de sodium d'acide glycodésoxycholique; sel disodium 3-sulfate d'acide glycolithocholique; ester d'éhyle d'acide glycolithocholique; sarkosyl; sel de sodium de N-lauroylsarcosine; N- lauroylsarcosine; dodécyl sulfate de lithium; solution delugol; Niaproof 4, Type 4 (i.e., sel de sodium de 7-éthyl-2-méthyl-4-undécyl sulfate); sel de sodium d'acide 1-octanesulfonique; sodium 1-butanesulfonate; sodium 1-décanesulfonate; sodium 1-dodécanesulfonate; sodium 1-heptanesulfonate anhydre; sodium 1-nonanesulfonate; monohydrate de sodium 1-propanesulfonate; sodium 2-bromoéthanesulfonate; hydrate de sodium cholate; sodium choléate; sodium désoxycholate; monohydrate de sodium désoxycholate; sodium dodécyl sulfate; sodium hexanesulfonate anhydre; sodium octyl sulfate; sodium pentanesulfonate anhydre; sodium taurocholate; sodium taurodésoxycholate; sel de sodium d'acide saurochénodésoxycholique; monohydrate de sel de sodium d'acide taurodésoxycholique; hydrate de sel de sodium d'acide taurodésoxycholique; sel de disodium d'acide 3-sulfate taurolithocholique; sel de sodium d'acide tauroursodésoxycholique; Trizma® dodécyl sulfate (i.e., tris(hydroxyméthyl)aminométhane lauryl sulfate); acide ursodésoxycholique, bromure d'alkyl triméthylammonium; chlorure de benzalkonium; chlorure de benzyl diméthylhexadécylammonium; chlorure de benzyl diméthyltétradécylammonium; bromure de benzyl dodécyldiméthylammonium; tétrachloroiodate de benzyl triméthylammonium; bromure de cétyl triméthylammonium; bromure de diméthyl dioctadécylammonium; bromure de dodécyl éthyldiméthylammonium; bromure de dodécyl triméthylammonium; bromure d'éthyl hexadécyldiméthylammonium; réactif T de Girard; bromure d'hexadécyl triméthylammonium; N,N',N'-polyoxyéthylène(10)--N-tallow-1,3-diaminopropane; bromure de thonzonium; bromure de triméthyl(tétradécyl)ammonium, BigCHAP (N,N-bis[3-(D-gluconamido)propyl]cholamide); bis(polyéthylène glycol bis[imidazoyl carbonyl]); alcools polyoxyéthylèniques, comme par exemple Brij® 30 (polyoxyéthylène(4) lauryl ether), Brij®35 (polyoxyéthylène(23) lauryl éther), Brij® 35P, Brij® 52 (polyoxyéthylène 2 cétyl éther), Brij® 56 (polyoxyéthylène 10 cétyl éther), Brij® 58 (polyoxyéthylène 20 cétyl éther), Brij® 72 (polyoxyéthylène 2 stéaryl éther), Brij® 76 (polyoxyéthylène 10 stéaryl éther), Brij® 78 (polyoxyéthylène 20 stéaryl éther), Brij® 78P, Brij® 92 (polyoxyéthylène 2 oléyl éther); Brij® 92V (polyoxyéthylène 2 oléyl éther), Brij® 96V, Brij® 97 (polyoxyéthylène 10 oléyl éther), Brij® 98 (polyoxyéthylène(20) oléyl éther), Brij® 58P, and Brij® 700 (polyoxyéthylène(100) stéaryl éther); Cremophor® EL (polyoxyéthylenglycéroltriricinoléat 35; huile de castor polyoxyl 35); monododécyl éther de décaéthylène glycol; mono héxadécyl éther de décaéthylène glycol; mono tridécyl éther de décaéthylene glycol; N- décanoyl-N-méthylglucamine; n-décyl alpha-D-glucopyranoside; décyl beta-D-maltopyranoside; digitonine; n-dodécanoyl-N-méthylglucamide; n-dodécyl alpha-D-maltoside; n-dodécyl beta-D-maltoside; monodécyl éther d'heptaéthylène glycol; monododécyl éther d'heptaéthylène glycol; monotétradécyl éther d'heptaéthylène glycol; n-hexadécyl beta-D-maltoside; monododécyl éther d'hexaéthylène glycol; monohexadécyl éther d'hexaéthylène glycol; monooctadécyl éther d'hexaéthylène glycol; monotétradécyl éther d'hexaéthylène glycol; Igepal® CA-630 (nonylphényl-polyéthylenglycol, (octylphénoxy)polyéthoxyéthanol, octylphényl-polyéthylène glycol); méthyl-6-O-(N- heptylcarbamoyl)-alpha-D-glucopyranoside; monododécyl éther de nonaéthylène glycol; N-nonanoyl-N-méthylglucamine; monodécyl éther d'octaéthylène glycol; monododécyl éther d'octaéthylene glycol; monohexadécyl éther d'octaéthylène glycol; monooctadécyl éther d'octaethylène glycol; monotétradécyl éther d'octaéthylène glycol; octyl-beta-D-glucopyranoside; monodécyl éther de pentaéthylène glycol; monododécyl éther de pentaéthylène glycol; monohexadécyl éther de pentaéthylène glycol; monohexyl éther de pentaéthylène glycol; monooctadécyl éther de pentaéthylène glycol; monooctyl éther de pentaéthylène glycol; diglycidyl éther de polyéthylène glycol; éther de polyéthylène glycol W-1; polyoxyéthylène 10 tridécyl éther; polyoxyéthylène 100 stéarate; polyoxyéthylène 20 isohexadécyl éther; polyoxyéthylène 20 oléyl éther; polyoxyéthylène 40 stéarate; polyoxyéthylène 50 stéarate; polyoxyéthylène 8 stéarate; polyoxyéthylène bis(imidazolyl carbonyl); polyoxyéthylène 25 propylène glycol stéarate; saponine d'écorce de quillaja; esters d'acide gras sorbitan, par exemple Span® 20 (sorbitan monolaurate), Span® 40 (sorbitane monopalmitate), Span® 60 (sorbitane monostéarate), Span® 65 (sorbitane tristéarate), Span® 80 (sorbitane monooléate), et Span® 85 (sorbitane trioléate); différents alkyl éthers de polyéthylène glycols, comme par exemple Tergitol® Type 15-S- 12, Tergitol® Type 15-S-30, Tergitol® Type 15-S-5, Tergitol® Type 15-S-7, Tergitol® Type 15-S-9, Tergitol® Type NP-10 (nonylphénol éthoxylate), Tergitol® Type NP-4, Tergitol® Type NP-40, Tergitol® Type NP-7, Tergitol® Type NP-9 (nonylphénol polyéthylène glycol éther), Tergitol® MIN FOAM lx, Tergitol® MIN FOAM 2x, Tergitol® Type TMN-10 (polyéthylène glycol triméthylnonyl éther), Tergitor Type TMN-6 (polyéthylène glycol triméthylnonyl éther), Triton@ 770, Triton@ CF-10 (benzyl- polyéthylène glycol tert-octylphényl éther), Triton@ CF-21, Triton@ CF-32, Triton@ DF-12, Triton@ DF-16, Triton@ GR-5M, Triton@ N-42, Triton@ N-57, Triton@ N-60, Triton@ N-101 (polyéthylène glycol nonyl phényl éther; polyoxyéthylène ramifié nonyl phényl éther), Triton@ QS-15, Triton@ QS-44, Triton@ RW-75 (polyéthylène glycol 260 mono(hexadécyl/octadécyl) éther et 1-octadécanol), Triton@ SP-135, Triton@ SP-190, Triton@ W-30, Triton@ X-15, Triton@ X-45 (polyéthylène glycol 4-tert-octylphényl éther; 4- (1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol), Triton@ X-100 (toctylphénoxypolyéthoxyéthanol; polyéthylène glycol tert-octylphényl éther; 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol), Triton@ X-102, Triton@ X-114 (polyéthylène glycol tert-octylphényl éther; (1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol), Triton@ X-165, Triton@ X-305, Triton@ X-405 (polyoxyéthylène(40) isooctylcyclohéxyl éther; polyéthylène glycol tert-octylphényl éther), Triton@ X-705-70, Triton@ X-151, Triton@ X-200, Triton@ X-207, Triton@ X-301, Triton@ XL-80N, and Triton@ XQS-20; tétradécyl-beta-D-maltoside; tetraéthylène glycol monodécyl éther; tetraethylene glycol monododécyl éther; tétraéthylène glycol monotétradécyl éther; triéthylène glycol monodécyl éther; triéthylène glycol monododécyl éther; triéthylène glycol monohexadécyl éther; triéthylène glycol monooctyl éther; triéthylène glycol monotétradécyl éther; esters d'acide gras polyoxyéthylène sorbitan, par exemple TWEEN@ 20 (polyéthylène glycol sorbitan monolaurate), TWEEN@ 20 (polyoxyéthylène (20) sorbitan monolaurate), TWEEN@ 21 (polyoxyéthylène (4) sorbitan monolaurate), TWEEN@ 40 (polyoxyéthylène (20) sorbitan monopalmitate), TWEEN@ 60 (polyéthylène glycol sorbitan monostearate; polyoxyéthylène (20) sorbitan monostéarate), TWEEN@ 61 (polyoxyéthylène (4) sorbitan monostéarate), TWEEN@ 65 (polyoxyéthyl ène (20) sorbitan tristéarate), TWEEN@ 80 (polyéthylène glycol sorbitan monooléate; polyoxyéthylène (20) sorbitan monooléate), TWEEN@ 81 (polyoxyéthylène (5) sorbitan monooléate), and TWEEN@ 85 (polyoxyéthylène (20) sorbitan trioléate); tyloxapol; n-undécyl beta-D-glucopyranoside, CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate); CHAPSO (3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate); N-dodécylmaltoside; alpha-dodécyl-maltoside; beta-dodécyl-maltoside; le sel interne de 3- (décyldiméthylammonio)propanesulfonate (SB3-10 le sel interne de 3- (décyldiméthylammonio)propanesulfonate (SB3-10), le sel interne de 3- (dodecyldiméthylammonio)propanesulfonate (SB3-12), le sel interne de 3-(N,N- diméthylmyristylammonio)propanesulfonate (SB3-14), le sel interne de 3-(N,N-diméthylpalmitylammonio)propanesulfonate (SB3-16), le sel interne de 3-(N,N-diméthyloctadécylammonio)propanesulfonate (SB3-18); MEGA-8; MEGA-9; MEGA-10; méthylheptylcarbamoyl glucopyranoside; N-nonanoyl N-méthylglucamine; octylglucoside; octyl-glucopyranoside; octyl-thioglucopyranoside; octyl-beta-thioglucopyranoside; 3-[N,N-diméthyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate ou amidosulfobétaine-14 (ASB-14); amidosulfobétaine-16 (ASB-16) ; EMPIGEN® BB ; Cymal-1, Cymal-2, Cymal-5, Cymal-6, c7bzo (ou (3-(4-heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl) dimethylammoniopropanesulfonate) et acide désoxycholatique. De préférence, dans le procédé selon l'invention, ladite composition liquide comprend au moins un détergent sélectionné dans le groupe constitué du CHAPS, du Tween 20, du Tween 80, du c7bzo, de l'octylglucoside, de l'octylthioglucopyranoside, de l'ASB-14, du SB3-10, du sodium dodécyl sulfate, de la digitonine, du sarkosyl, du tergitol, ou de combinaisons de ceux-ci. L'agent de lyse bactérien peut également être une enzyme qui dégrade la paroi bactérienne telle que le lysozyme, la lysostaphine, l'achromonopeptidase, la mutanolysine, la labiase, la chitinase, la glucanase, la glucosaminidase, la muramidase et la transglycosylase lytique, l'amidase et l'endopeptidase. L'agent de lyse bactérien peut être un agent causant la formation de pores dans la paroi bactérienne ou la membrane cellulaire comme par exemple une polymyxine, en particulier une polymyxine A, B, C, D, E (ou colistine), F, K, M, P, S ou T. Les polymyxines sont des antibiotiques peptidiques cycliques qui agissent comme des détergents cationiques et s'insèrent parmi les phospholipides de la paroi bactérienne. Il peut s'agir également de R-Iactames, de glycopeptides, de fosfomycine, de cyclosérine, de bacitracine, d'acide fusidique et de néomycine. De préférence, ledit au moins un agent de lyse de la paroi bactérienne est sélectionné dans le groupe constitué du CHAPS et de la polymyxine B, ou d'une combinaison de ceux-ci. De manière préférée, l'agent de lyse est utilisé en combinaison avec un moyen de lyse mécanique, tel que des billes ou des ultrasons. Alternativement, l'agent de lyse est remplacé par un tel moyen de lyse mécanique. Substrat chromogène ou fluorogène Dans le contexte de l'invention, l'expression « substrat chromogène » fait référence à une molécule pouvant être clivée ou modifiée par une enzyme et qui comprend ou est couplé à un chromophore. Par « chromophore », on entend ici un groupement d'atomes au sein d'une molécule qui est responsable des propriétés d'absorption et/ou d'émission de lumière dans le domaine de l'ultraviolet, du visible ou de l'infrarouge de cette molécule. Ces propriétés résultent d'une capacité à absorber l'énergie de photons dans une gamme du spectre visible tandis que les autres longueurs d'onde sont transmises ou diffusées. Le substrat chromogène selon l'invention peut être coloré ou incolore. Ce substrat chromogène libère son chromophore sous l'action d'une enzyme spécifique. Dans le contexte de l'invention, l'expression « substrat fluorogène » fait référence à une molécule pouvant être clivée ou modifiée par une enzyme et qui comprend ou est couplé à un fluorophore. Ce substrat fluorogène libère son fluorophore sous l'action d'une enzyme spécifique. Par « fluorophore », on entend ici un groupement d'atomes au sein d'une molécule qui est responsable de la capacité de cette molécule à émettre de la lumière de fluorescence après excitation. Ce sont généralement des substances composées de plusieurs noyaux aromatiques conjugués ou encore des molécules planes et cycliques qui possèdent une ou plusieurs liaisons 17. Des chromophores ou fluorophores sont bien connus de l'homme du métier et couramment utilisés en laboratoire depuis de nombreuses années (voir par exemple Vinazzer, 1975 Haemostasis. 4:101-9 et Orenga et al., 2009 J Microbiol Methods. 79 :139-155). Le chromophore peut par exemple correspondre à un dérivé de l'indoxyle (par exemple le 3-indolyl-R, le 5-bromo-3-indolyl-R, le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl, le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl ou le 6-chloro-3-indoxyl), à un dérivé de l'indol (par exemple le 7-amido-5-bromoindole), au nitrophénol ou l'un de ses dérivés (par exemple le paranitrophénol, l'orthonitrophénol ou l'orthofluorophénol), au chlorophénol ou l'un de ses dérivés (par exemple le 4-amino-2,6-dichlorophénol), au naphthol ou l'un de ses dérivés (par exemple le 1-naphthol ou le 2-naphtylamide), au 5-(4-hydroxy-3- methoxyphenylmethylene)-2-thioxothiazolidin-4-one-3-ethanoate, la 3,4- cyclohexenoesculetine, la 2-alizarine ou la 7-amido-1-pentyl-phenoxazin-3-one. Le fluorophore peut par exemple correspondre à la coumarine ou l'un de ses dérivés (par exemple l'hydroxycoumarine, l'aminocoumarine, la 7-amido-4-méthylcoumarine, la méthoxycoumarine, l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique), la phycoérythrine, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés (par exemple la 5-dodecanoylaminofluorescéine), la 4-méthyl-umbelliféryle, la résofurine, la rhodamine, l'allophycocyanine, la 2-(5'-chloro-2'-hydroxyphényl)-6-chloro-4-(3H)-quinazolinone. Dans le contexte de l'invention, l'expression « substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter » fait référence à un substrat chromogène ou fluorogène tel que défini ci-dessus qui, lorsqu'il est mis en contact avec l'enzyme dont il est spécifique, libère le chromophore ou fluorophore qu'il comprend ou avec lequel il est couplé. La libération du chromophore ou fluorophore peut être due directement ou indirectement à l'hydrolyse du substrat par l'enzyme à détecter. Ainsi, l'enzyme à détecter peut hydrolyser la liaison couplant le substrat au chromophore ou fluorophore, libérant ainsi le chromophore ou fluorophore du substrat. Cette action directe de l'enzyme est typiquement observée avec les substrats couplés à un chromophore ou fluorophore. L'enzyme à détecter peut également hydrolyser un domaine du substrat n'impliquant pas le chromophore ou fluorophore. De préférence, la libération du chromophore ou du fluorophore entraîne un changement de couleur du substrat chromogène ou d'émission de fluorescence du substrat fluorogène. Par conséquent, la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore peut en particulier être mise en oeuvre en observant le changement de couleur du substrat chromogène ou d'émission de fluorescence du substrat fluorogène. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le substrat chromogène ou fluorogène comprend un noyau R-lactame. Par « noyau R-lactame », on entend ici une structure cyclique hétéroatomique, consistant en trois atomes de carbone et un d'azote. De préférence, le noyau R-lactame du substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est hydrolysé par l'enzyme à détecter. De manière davantage préférée, le substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est un dérivé de R-lactamine. Par « R-lactamine », on entend ici un antibiotique contenant un noyau 13-lactame dans sa structure moléculaire. Comme il est bien connu de l'homme du métier, les [3-lactamines englobent par exemple les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes. De manière encore préférée, le substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est un dérivé de céphalosporine. Par « dérivé de céphalosporine », on entend ici une molécule composée, d'une part, d'un groupement issu d'une céphalosporine, ou d'une partie de céphalosporine, capable d'être hydrolysé par une R-lactamase, et, d'autre part, d'un groupement chromophore ou un fluorophore. De préférence, le dérivé de céphalosporine selon l'invention est une céphalosporine, ou une partie de céphalosporine, modifiée de manière à contenir ou à être couplée à un chromophore. Dans le contexte de l'invention, le terme « céphalosporine » fait référence à une [3-lactamine constituée d'un noyau R-lactame et d'un noyau dihydrothiazine. On distingue à l'heure actuelle quatre générations de céphalosporines selon leurs spectres d'action. Cette classification est bien connue de l'homme du métier (voir par exemple Thompson (1987) Mayo. Clin. Proc. 62:821-34; Gustaferro et Steckelberg (1991) Mayo. Clin. Proc. 66:1064-73 et Barber et al. (2004) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 88:179-215). Des exemples de céphalosporines de 1 ère génération sont bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier la céfazoline, la céfalotine, la céfapirine, la céfaloridine, la céfalexine Keforal®, la céfradine Zeefra®, et la céfadroxil Oracéfal®. Des exemples de céphalosporines de 2ème génération sont également bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier la céfamandole, la céfuroxime Zinnat®, la céfonicide, la céforanide, la céfatrizine, le céfotiam, le cefprozil, le loracarbef, le céfotétan, la céfoxitine et le céfaclor Alfatil®. Des exemples de céphalosporines de Sème génération sont bien connus de l'homme du métier et incluent typiquement le céfotiam hexetil Texodil®, la ceftriaxone Rhocéphine®, la céfotaxime Claforan®, la ceftizoxime, la ceftazidime, la céfopérazone, la cefsulodin, le ceftibuten, la céfixime Oroken®, le céfatamet, la latamoxef et la cefpodoxime proxetil Orelox®. Des exemples de céphalosporines de 4ème génération sont bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier la céfépime et la cefpirome. De manière préférée entre toutes, le substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est un dérivé de céphalosporine de Sème génération. Par « dérivé de céphalosporine de Sème génération », on entend ici une molécule composée d'une partie de céphalosporine capable d'être hydrolysée par les mêmes enzymes que les céphalosporines de Sème génération. De préférence, un dérivé de céphalosporine de Sème génération selon l'invention est une céphalosporine de Sème génération, ou une partie de céphalosporine de Sème génération, modifiée de manière à contenir ou à être couplée à un chromophore ou un fluorophore. De manière davantage préférée, le dérivé de céphalosporine de Sème génération selon l'invention est une céphalosporine de Sème génération, ou une partie de céphalosporine de Sème génération, modifiée de manière à contenir ou à être couplée à un chromophore. La céphalosporine de troisième génération à partir de laquelle le substrat chromogène selon l'invention est produit peut être sélectionnée dans le groupe constitué des composés dont les dénominations anglaises sont les suivantes : Cefcapene (Référence CAS: 135889-00-8), Cefcapene Pivoxil (Référence CAS: 105889-45-0), Cefcapene Pivoxil Hydrochloride (Référence CAS: 147816-23-7), Cefcapene Pivoxil Hydrochloride Monohydrate (Référence CAS: 147816-24-8), Cefdaloxime (Référence CAS: 80195-36-4), Cefdaloxime Pivoxil, Cefdinir (Référence CAS: 91832-40-5), Cefditoren (Référence CAS : 104146-53-4), Cefditoren Sodium (Référence CAS: 104146-53-4), Cefditoren Pivoxil (Référence CAS: 117467-28-4), Cefetamet Pivoxil Hydrochloride, Cefetamet Pivoxyl (Référence CAS: 65243-33-6), Cefetamet (Référence CAS: 65052-63-3), Cefixime (Référence CAS: 79350-37-1), Cefixime Trihydrate, Cefmenoxime Hydrochloride (Référence CAS: 75738-58-8), Cefmenoxime (Référence CAS: 65085-01-0), Cefodizime Sodium (Référence CAS: 86329-79-5), Cefodizime (Référence CAS: 69739-16-8), Cefoperazone Sodium (Référence CAS: 62893-20-3), Cefoperazone A, Cefoperazone (Référence CAS: 62893-19-0), Cefotaxime Sodium (Référence CAS: 64485-93-4), Cefotaxime S-oxide, Cefotaxime (Référence CAS: 63527-52-6), Benzathine Cefotaxime, Desacetylcefotaxime, Cefpimizole Sodium, Cefpimizole, Cefpiramide Sodium (Référence CAS: 74849-93-7), Cefpiramide (Référence CAS: 70797-11-4), Cefpodoxime Proxetil (Référence CAS: 87239-81-4), Cefpodoxime (Référence CAS: 80210-62-4), Cefpodoxime Hydrate, Cefsulodin Sodium, Cefsulodin, Ceftazidime Pentahydrate (Référence CAS: 78439-06-2), Ceftazidime (Référence CAS: 72558-82-8), Cefteram, Cefteram Pivaloyloxymethyl Ester, Ceftibuten, Trans-ceftibuten, Ceftiofur, Ceftiofur Sodium (Référence CAS: 80370-57-6), Ceftiofur Hydrochloride, Ceftiofur Sodium, Desfuroylceftiofur, Ceftiolene, Ceftizoxime Alapivoxil, Ceftizoxime Sodium, Ceftizoxime, Ceftriaxone Disodium (Référence CAS: 74578-69-1), Ceftriaxone Sodium, Ceftriaxone (Référence CAS: 73384-59-5) et les sels de ces composés. La structure et la dénomination IUPAC de ces composés peut par exemple être trouvée sur le site chemicalland2l.com. Dans un mode de réalisation particulier, la céphalosporine de Sème génération est choisie parmi le ceftriaxone (Rhocéphine®), le céfotaxime (Claforan®), le ceftazidime (Fortum®), le céfixime (Oroken®), le cefpodoxime proxetil (Orelox®), le céfotiam ou le céfotiam hexetil (Takétiam®), le Cefpirome (Cefrom®), le Céfépime (Axépim®), le Cefsulodine (Pyocéfal®), le céfatamet, le ceftizoxime, le céfopérazone, le ceftibuten et les sels de ces composés. Dans un mode de réalisation de l'invention, le dérivé de céphalosporine de Sème génération contenant ou étant couplé à un chromophore est l'un des composés décrits dans la demande de brevet européen EP1325923. Ces composés sont représentés par la formule (I) : O ' CùCùNH X N r ÔR3 ON CH=CH où : COOH (I) R, et R2 peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement nitro ou cyano ; R3 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C6i éventuellement substitué par un groupement carboxyle; R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement amino ; X représente ùS- ou ùSO- ; et R, et R2 ne peuvent pas simultanément représenter un atome d'hydrogène, ou un sel de ceux-ci. Ainsi, le dérivé de céphalosporine de Sème génération contenant ou étant couplé à un chromophore peut par exemple être le composé : - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,4-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,6-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1-methylethoxy-imino)acetamido]-3- (2,4-dicyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(1-carboxy-l-methylethoxyimino)-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2, 4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 1 -oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-( 1 -carboxy-l-methylethoxyimino)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(4-nitrostyryl)-3- cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,6-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-am inothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,6- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(4- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dicyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(4- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(2- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-carboxymethoxyimino-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3- cephem-4-carboxylique ; ou - acide 1-oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2, 4-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique , ou un sel de ceux-ci, tels que décrits dans la demande de brevet européen n° EP1325923. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le substrat chromogène est le composé HMRZ-86 ((7R)-7-[2-(aminothiazol-4-yl)-(z)-2-(1-carboxy-1 - méthyléthoxyimino)acétamido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacétate, isomère E). Ce composé est représenté par la formule (Il) suivante : NO2 (II). O CO2H 1 H H2N~S O O CO2H30 Les composés de formule (I) ci-dessus sont préférentiellement utilisés pour détecter une R-Iactamase conférant une résistance aux C3G aux microorganismes qui la produisent. Les composés de formule (I) ci-dessus sont plus préférentiellement utilisés pour détecter une BLSE, céphalosporinase ou carbapénémase. Avantageusement, lorsque le substrat chromogène est un composé de formule (I), ladite composition liquide comprend en outre du CHAPS et/ou de la polymyxine B. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé vise à détecter une BLSE à l'aide d'une composition liquide comprenant le substrat chromogène HMRZ-86 ainsi que du CHAPS et/ou de la polymyxine B. L'invention sera illustrée plus en détail au vu des exemples suivants. EXEMPLES Exemple 1 : Comparaison test sur bandelette et test en milieu liquide Les performances du substrat ont été évaluées à partir du Cica-beta-test sur 120 souches bactériennes caractérisées par des antibiogrammes. 59 souches étaient résistantes aux céphalosporines de troisième génération (souches « C3GR ») et 61 souches étaient sensibles aux céphalosporines de troisième génération (souches « C3GS »). Pour ce faire, une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (Mueller-Hinton agar). Les colonies ont alors été grattées sur la bandelette après y avoir déposé une goutte (environ 20 µL) du réactif du Cica-beta-test soit une solution de HMRZ-86 à 0,3 g/L. Une lecture de la coloration a été réalisée après un temps maximal d'incubation de 15 min, les bandelettes étant laissées à température ambiante. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2 : performances du Cica-Beta-test Souches C3GR Souches C3GS Cica-beta-test positif 54 10 Cica-beta-test négatif 5 51 Sensibilité (Ss)/ Spécificité (Sp) Ss = 54/59 = 91,5% Sp = 51/61 = 83,6% Les résultats montrés dans le Tableau 2 indiquent que la spécificité du test est à améliorer. En outre, des intensités de coloration faibles ont été observées pour certaines souches C3GR pour lesquelles les résultats sont donc douteux. Les données obtenues à l'aide du Cica-beta-test ont ensuite été comparées à celles obtenues avec une méthode de détection en microplaque permettant la croissance bactérienne (le temps nécessaire pour la mise en oeuvre de la méthode est alors d'environ 5 h). Le test a été effectué sur un panel de 44 souches dites « difficiles », c'est à dire 32 souches C3GR faiblement positives ou négatives avec le Cica-beta-test, et 12 souches C3GS dont 10 donnant un résultat « faux positif » avec le Cica-beta-test. Pour ce faire, des colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (Mieller-Hinton agar) afin d'obtenir un inoculum équivalent à 0,5 McFarland. 20 µL de la suspension bactérienne ont été ajoutés à 180 µL d'une solution d'HMRZ-86 diluée avec du bouillon Trypto-Casein-Soja tamponné. La microplaque a été 20 placée en incubateur à 35-37°C, des lectures étant réalisées toutes les heures pendant 5 h. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. Tableau 3 : performances comparées du substrat au format bandelette avec une 5 méthode de détection en microplaque N=44 Cica-beta test sur bandelette Test en microplaque Spécificité (%) 16,7 66,7 Sensibilité (%) 84,4 90,6 Les résultats montrés dans le Tableau 3 indiquent que le Cica-beta test peut être amélioré en termes de spécificité et de sensibilité. En particulier, le test en format liquide conduit à une amélioration très significative de la spécificité. 10 En outre, le format liquide permet d'obtenir de meilleures intensités de coloration. En revanche, la durée de la méthode sous format liquide en microplaque est trop longue pour une mise en oeuvre de routine. Exemple 2 : Comparaison d'un test sur disque optimisé et de tests en milieu 15 liquide Les inventeurs ont tout d'abord démontré qu'ils obtenaient des résultats équivalents lorsqu'ils utilisaient un test sur disque optimisé (ou disque « home-made optimisé ») et un Cica-beta-test sur bandelette. En particulier, les mêmes problèmes de reproductibilité ont été observés avec les deux tests. 20 Ils ont ensuite comparé le format disque « home-made optimisé » avec le format en milieu liquide ET sans « agent(s) de lyse » en test rapide. La comparaison des résultats obtenus avec le format disque « home-made optimisé » contenant 0,6 g/L d'HMRZ-86 et le format liquide avec billes de verre 25 contenant 0,8 g/L d'HMRZ-86, a été effectuée sur 75 souches (47 « C3GR » et 28 « C3GS »). Pour ce faire, une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (TCS agar). Les colonies ont été dispersées dans un tube contenant 20 µL du substrat HMRZ-86 à 0,8 g/L et environ 30 µg de billes de verre (200 30 µm). En parallèle, une même quantité de colonies a été déposée et frottée sur un disque coton (type disque antibiotique) préalablement imprégné de 15 µL de solution d'HMRZ-86 à 0,6 g/L. 21 Après une agitation au vortex, le tube est placé à 37°C, une lecture étant réalisée après 10 min. Le disque est pour sa part laissé à température ambiante, la lecture étant réalisée après 15 min. Les résultats sont présentés dans le tableau 4. Tableau 4 : performances comparées du test en format disque optimisé avec un test en format liquide et billes de verre Disque Liquide (billes de verre) C3GR (n=47) 36 / 76,6% 33 / 70,2% souches correctement identifiées / sensibilité C3GS (n=28) 19 / 67,9% 21 / 75% souches correctement identifiées / spécificité L'utilisation de billes de verre, qui permettent une lyse mécanique des bactéries, dans le test en format liquide, permet de réduire la durée du test par rapport à la méthode précédemment décrite en microplaque, qui dure environ 5 h. Le test est en effet réalisé ici en 10 min. Les inventeurs ont ensuite comparé le format disque « home-made optimisé » avec le format en milieu liquide ET avec « agent(s) de lyse » en test rapide. Une comparaison a été effectuée sur 21 souches (11 C3GR et 10 C3GS) en utilisant le test en format disque optimisé ou en format liquide à l'aide d'un agent de lyse (CHAPS 5 ou 10 g/L et combinaison de CHAPS 5 g/L et polymyxine B (« PB ») 50 mg/L). Pour ce faire, une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (TCS agar). Les colonies ont été dispersées dans un tube contenant 20 µL du substrat HMRZ-86 et 20 µL de solution CHAPS et/ou PB. En parallèle, une même quantité de colonies a été déposée et frottée sur un disque de coton (type disque antibiotique) préalablement imprégné de 12 µL de solution CHAPS et/ou PB, séché puis ré-imprégné de 15 µL de solution d'HMRZ-86 à 0,6 g/L. Le tube et le disque ont été placés à température ambiante, une lecture étant 25 réalisée au bout de 10 min pour le tube, et au bout de 15 min pour le disque. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. Tableau 5 : performances comparées du test en format disque optimisé avec un test en format liquide et agent de lyse 30 C3GR détectées (n=11) C3GS inhibées (n=10) Réaction positive Absence de réaction positive Disque Liquide Disque Liquide Sans CHAPS ni PB 11 ND 3 ND CHAPS 5 g/L 11 10 3 6 CHAPS 10 q/L 11 11 3 7 PB 50 mg/1_ 11 ND 5 ND CHAPS 5 g/L + PB 50 11 10 4 3 mg/L Les résultats du Tableau 5 montrent que, pour le test sur disque, l'utilisation d'agent(s) de lyse tels que la polymyxine B (PB) conduit à une augmentation de la spécificité du test. Pour le test sous forme liquide, l'augmentation de la concentration en CHAPS utilisée permet non seulement d'accroître la sensibilité mais aussi la spécificité. En outre l'utilisation d'agent(s) de lyse est aussi associée à une augmentation de l'intensité de coloration pour certaines souches C3GR. Le test le plus performant apparaît comme étant le test en format liquide utilisant du CHAPS à 10 g/L. Par rapport au test en format disque, le test en format liquide donne un meilleur contraste de colorations (gradation de couleurs avec trois couleurs bien déterminées : jaune, orange et rouge, alors que, pour le format disque, la gradation de couleurs va du jaune pour le négatif au rouge plus ou moins intense sans passer par l'orange). En outre, la lecture dans le tube est plus aisée que sur le disque. Exemple 3 : Comparaison d'un test sur disque optimisé et de tests en milieu liquide pour des colonies colorées Les inventeurs ont comparé le format disque « home-made optimisé » avec le format en milieu liquide avec CHAPS comme « agent de lyse » par des tests rapides à partir de colonies colorées. Une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur chacun des milieux de culture gélosé Drigalski, Mac Conkey cristal violet, UriSelect4 (Bio-Rad). Les colonies ont été dispersées dans un tube contenant 20 µL du substrat HMRZ-86 à 0,8 g/L et 20 µL de solution CHAPS. En parallèle, une même quantité de colonies a été déposée et frottée sur un disque de coton (type disque antibiotique) préalablement imprégné de 15 µL de solution CHAPS + HMRZ-86. Le tube et le disque ont été placés à température ambiante, une lecture étant réalisée après 15 min. Il a été observé que lors de la réalisation du test sur disque à partir de colonies colorées, dans certains cas (selon la souche et/ou le milieu d'isolement), la coloration des colonies pouvait interférer avec la lecture du résultat puisque le dépôt d'une colonie colorée sur le disque peut entraîner une coloration non spécifique. Dans le cas de test utilisant le HMRZ-86, ce problème est le plus gênant lorsque les colonies sont roses ou rouges (par exemple, ce peut être le cas de souches de E. coli isolées sur géloses UriSelect4, ou de souches lactose+ isolées sur géloses Mac Conkey). En effet, une fois écrasées sur le disque, la coloration de ces colonies peut interférer avec la coloration rose-rouge qui symbolise la positivité du test utilisant le HMRZ-86. De façon étonnante, la mise en oeuvre d'un test en format liquide permet, en partie, de lever ce problème puisqu'il est possible, par exemple à partir de gélose Mac Conkey au cristal violet, de tester des colonies colorées isolées, contrairement au format disque avec lequel toutes les entérobactéries, qu'elles soient C3GS ou C3GR, apparaissent positives. Les tableaux 6 et 7 montrent les résultats d'essais réalisés pour deux souches C3GS à partir du substrat chromogène HMRZ-86 à 0,4 g/L et à l'aide de CHAPS 10 g/L en solution dans du tampon phosphate 0,1 M pH 6. Tableau 6 : Essai avec une souche K. pneumoniae C3GS. Souche C3GS Milieu de culture K. pneumoniae ATCC 13883 TCS* Drigalski Mac Conkey Uriselect 4 aspect des colonies blanc jaune rose fuschia bleu Disque HMRZ + blanc marron clair rose bleu CHAPS Résultat Disque négatif douteux faux positif négatif Liquide HMRZ + jaune jaune orange jaune/reflet CHAPS vert Résultat Liquide négatif négatif douteux négatif * milieu gélosé trypto-caséine-soja25 Tableau 7 : Essai avec une souche E. coli C3GS. Souche C3GS Milieu de culture E. coli ATCC 25922 TCS Drigalski Mac Conkey Uriselect 4 Aspect des colonies blanc jaune rose fuschia rose Disque HMRZ + CHAPS blanc jaune/marron rose gris clair Résultat Disque négatif douteux faux positif négatif Liquide HMRZ + CHAPS jaune jaune/orange orange jaune clair Résultat Liquide négatif négatif douteux négatif REVENDICATIONS1. Procédé pour détecter la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en suspension des bactéries dans une composition liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter ; et b) détecter l'éventuelle libération du chromophore ou du fluorophore ; la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore à l'étape b) indiquant la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite composition liquide comprend en outre au moins un agent de lyse bactérien. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel ledit au moins un agent de lyse bactérien est sélectionné dans le groupe constitué d'un détergent, d'une enzyme qui dégrade la paroi bactérienne, d'une polymyxine, et de combinaisons de ceux-ci. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le chromophore est sélectionné dans le groupe constitué d'un dérivé de l'indoxyle, du nitrophénol, d'un dérivé de nitrophénol, du chlorophénol, d'un dérivé de chlorophénol, du naphthol, d'un dérivé du naphthol, du 5-(4-hydroxy-3-methoxyphenylmethylene)-2- thioxothiazolidin-4-one-3-ethanoate, de la 3,4-cyclohexenoesculetine, de la 2-alizarine ou de la 7-amido-1-pentyl-phenoxazin-3-one. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le substrat chromogène ou fluorogène comprend un noyau R-lactame. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le substrat chromogène est un composé de formule (I)30CH=CH (I) COOH où : R, et R2 peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement nitro ou cyano ; R3 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C6i éventuellement substitué par un groupement carboxyle; R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement amino ; X représente ûS- ou ûSO- ; et R, et R2 ne peuvent pas simultanément représenter un atome d'hydrogène, ou un sel de ceux-ci. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le substrat chromogène est un composé sélectionné dans le groupe constitué de : - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1-methylethoxy-imino)acetamido]-3- (2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,6-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1-methylethoxy-imino)acetamido]-3- (2-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(1-carboxy-1 -methylethoxyimino)-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; acide 1 -oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-( 1 -carboxy-l-methylethoxyimino)acetam ido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ;- acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,6-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-am inothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2-cyanostyryl)-3- cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,6- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(4- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dicyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(4- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(2- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-carboxymethoxyimino-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; et - acide 1-oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2, 4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique, ou un sel de ceux-ci. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel le substrat chromogène est le composé HMRZ-86 ((7R)-7-[2-(aminothiazol-4-yl)-(z)-2-(1-carboxy-l- méthyléthoxyimino)acétam ido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacétate, isomère E) ou un sel de celui-ci. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel ladite composition liquide comprend en outre du CHAPS et/ou de la polymyxine B. 10. Procédé de détection in vitro de microorganismes résistants aux céphalosporines de Sème génération, mettant en oeuvre le procédé tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 9.