Brevet FR2958753A1 — publié le 20111014

Construction antigénique et ses applications pour le dépistage de trypanosomoses chez l'homme et l'animal L'invention a pour objet une construction antigénique et son utilisation pour élaborer 5 un kit et mettre en oeuvre une méthode de dépistage de trypanosomoses chez l'homme et l'animal. La trypanosomose africaine humaine (THA) et la trypanosomose animale (TAA) affectent principalement les communautés rurales pauvres et sont bien souvent des maladies négligées, qui posent un grave problème de santé publique et un frein au développement 10 économique de nombreux pays. La plus grande difficulté pour le contrôle de ces maladies résulte de la grande variabilité de la symptomatologie clinique associée au manque de sensibilité et de spécificité ou à la lourdeur de réalisation des tests de dépistage disponibles. Un criblage actif de la population à risque est donc essentiel pour identifier précocement les individus infectés et réduire la transmission en diminuant le réservoir de 15 parasites. De plus, un dépistage de THA doit inclure un diagnostic de stade 1 (lymphaticosanguin) ou 2 (neurologique), car les patients en stade 2 sont traités au mélarsoprol dont les effets secondaires toxiques sont importants (mortalité globale de 5-10%). Le diagnostic de stade dépend encore aujourd'hui de l'examen du liquide céphalo-rachidien après ponction lombaire et le seuil de positivité de la cytorachie fait toujours débat (5, 10 ou 20 cellules/µl). 20 Actuellement, le CATT (Card Agglutination Test For Trypanosomiasis)/T. b. gambiense correspond au test sérologique le plus couramment utilisé. Le test comporte des trypanosomes fixés du variant LiTat 1.3. Une variante du CATT se compose d'antigènes semi-purifiés (LiTat 1.3, 1.5 et 1.6) couplés à des billes de latex. Le principal problème lié au CATT est un manque de spécificité car les antigènes utilisés sont responsables de nombreuses 25 réactions croisées et donc de faux-positifs De plus, le sang, le sang dilué ou le plasma ont des titres anticorps variables contre ces antigènes. C'est ainsi que des patients parasitologiquement positifs peuvent être négatifs au CATT. Enfin, le CATT ne permet pas le diagnostic de stade et un suivi sérologique satisfaisant des patients après traitement en particulier à cause des réactions croisées avec d'autres infections. 30 On mesure donc l'intérêt de disposer de nouveaux antigènes pour améliorer le dépistage, la détermination des stades et le suivi des THA et des TAA. Bien que quelques antigènes se soient révélés intéressants d'un aspect pathophysiologique, leur manipulation en conditions de terrain (Semballa et al., 2004 (réf. 1)) s'est avérée difficile. Les épitopes tryptophane (WE) qui représentent des antigènes constants du trypanosome induisent les anticorps spécifiques chez l'hôte (homme ou animal). Ces épitopes comprennent l'acide aminé L-tryptophane et sont situés dans des domaines constants de la partie C-terminale des glycoprotéines variables de surface (VSG). Des titres élevés d'anticorps anti-WE d'isotype IgM ont été mesurés par ELISA dans le sérum des patients atteints de trypanosomose humaine africaine (THA), et des titres accrus ont été trouvés chez les patients en stade 2 (Okomo-Assoumou et al., 1995(réf. 2)). Ces résultats pionniers avaient été obtenus par le laboratoire des inventeurs grâce à des épitopes synthétiques proposés pour étudier leur reconnaisance par des anticorps anti- WE, notamment des constructions WE-glutaraldéhyde- BSA. Dans ces constructions, le glutaraldéhyde joue le rôle de fixateur entre l'antigène synthétique WE et la protéine porteuse (ici l'albumine bovine BSA). Ces constructions ont permis de démontrer le potentiel de l'épitope WE comme cible diagnostique. Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont montré un effet inattendu du glutaraldéhyde portant sur l'orientation optimale qu'il confère à l'antigène synthétique. En effet, il est apparu que le glutaraldéhyde sert de bras espaceur et orientateur de l'antigène synthétique WE lorsque celui-ci est couplé à un support inerte tel que des billes de latex ou des plaques ELISA. La construction antigénique de l'invention constitue un mimotope de l'antigène naturel, lorsqu'il est couplé uniquement à ce dernier, ce qui permet une meilleure reconnaissance par des anticorps anti-WE. L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle construction antigénique. Elle vise également la mise à profit des propriétés de cette construction dans un kit et une méthode de dépistage des trypanosomoses humaines et animales. La construction antigénique de l'invention repose sur le couplage d'un épitope d'intérêt à du glutaraldéhyde et leur fixation sur un support inerte. L'invention vise ainsi une construction antigénique renfermant un épitope trytophane, caractérisée en ce qu'elle est formée d'un motif tryptophane W, ou d'un peptide de 3 ou 4 acides aminés comportant un motif W, couplé à du glutaraldéhyde. De préférence ledit peptide répond à la séquence SEQ ID N°l C-x-W-y, dans laquelle « x » représente K, A, S, V, T, R, I, E, D, N ou G, et « y » représente D, S, T, E, N, K, G, Q, R ou I, l'un ou l'autre de « x » ou de « y » pouvant être absent . Une séquence représentative, SEQ ID N°2, est du type CKWD. Selon une disposition avantageuse, ledit produit de couplage est greffé à des billes de latex. Cette formulation permet de développer une technique rapide d'agglutination sur les sérums de patients ou d'animaux atteints, respectivement, de THA ou de TAA. Selon une autre disposition, utilisée avantageusement avec la précédente, le produit de couplage est greffé sur des plaques ELISA, permettant de développer une technique quantitative des taux d'anticorps « anti-trypanosomes » chez les patients ou animaux atteints de THA ou TAA. L'invention vise également un kit de dépistage de THA ou de TAA, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins une construction antigénique telle que définie ci-dessus, avec éventuellement un ou plusieurs réactifs pour la réaction antigène/anticorps et/ou des solutions tampons et/ou des réactifs pour la détection, la quantification ou la visualisation des complexes antigènes/anticorps lorsqu'ils sont présents. Le kit ci-dessus comprend avantageusement, selon une disposition supplémentaire de l'invention, les réactifs pour réaliser un test de révélation immuno-enzymatique, notamment un test ELISA indirect ou un test ELISA d'inhibition, faisant entrer en compétition un anticorps monoclonal anti-WE avec les anticorps anti-WE des sérums d'hôtes infectés. Dans une variante de réalisation, la construction antigénique est fixée à un support. L'invention vise en outre une méthode de dépistage de THA ou de TAA, caractérisée en ce qu'elle comprend . la mise en contact d'un échantillon de sérum d'un patient ou d'un animal avec une construction antigénique telle que définie ci-dessus, avantageusement en utilisant un kit tel que décrit ci-dessus, . la révélation d'une réaction immunologique du type antigène-anticorps. Dans la variante où la construction antigénique est fixée à des billes de latex, la mise en contact avec l'échantillon de sérum conduit à une agglutination du sérum si le patient ou l'animal est respectivement atteint de THA ou de TAA. Cette méthode diagnostique sérologique permet d'effectuer un dépistage de masse, la détermination du stade et le suivi des THA et des TAA. Elle présente l'avantage d'une grande sensibilité et d'une forte spécificité en évitant les réactions croisées avec d'autres infections (faux positifs) et de faux négatifs (séronégatifs au CATT en parasitologie). Ce nouveau test diagnostique sérologique, bon marché, stable et facile à manipuler, associé le cas échéant à un test ELISA indirect ou ELISA d'inhibition basé sur les anticorps anti-WE et qui a prouvé son efficacité, pourra être employé pour un diagnostic de masse et de stade (détermination des titres anticorps des patients aux stades 1 et 2) de la THA ou de la TAA sur le terrain, avec une grande spécificité. Ce test est particulièrement approprié pour un dépistage spécifique de la trypanosomose africaine humaine ou animale. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés à titre illustratif dans les exemples qui suivent de réalisation de l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent, respectivement, - les Figures 1 et 2, les résultats de test diagnostique, respectivement, sur sérum humain et sang, et - la Figure 3, les taux d'anticorps anti-W dans le sérum de malades atteints de THA (stades 1 et 2). Exemple 1 : synthèse de produits de couplage Wûglutaraldéhyde ou C-x-W-y-glutaraldéhyde Fabrication des billes de latex couplées A 100 µl d'haptène (tryptophane ou peptide) à la concentration de 5 mg/ml dans un tampon acétate 1,5 M pH 8,3, on ajoute sous vortex pendant 10 secondes environ 100 µl de 20 glutaraldéhyde 5 %. Sans attendre, on ajoute 50 µl de billes de latex aminés (Sigma) et on laisse réagir pendant au moins 10 mn sous agitation lente. La réaction est arrêtée par addition de 100 µl de NaBH4 1M et laisser le mélange pendant 10 mn encore sous agitation lente. 25 Le mélange est dialysé contre de l'eau distillée additionnée de NaBH4 (lspatule/51) toute la journée en changeant l'eau de dialyse 2 à 3 fois, puis environ 14h (toute la nuit) avec de l'eau seilement, pour éliminer l'excès de NaBH4. Fabrication des plaques ELISA Par puits de plaque ELISA (Nunc, PolySorp ou MaxiSorp), on ajoute 200 µl d'un mélange de 100µl d'haptène (tryptophane ou peptide, 5 mg/ml dans un tampon acétate 1,5 M pH 8,3) et de 100 µl de glutaraldéhyde 5 % ajouté sous vortex pendant 10 secondes environ. On laisse réagir pendant au moins 30 mn sous agitation lente. 30 On arrête la réaction par addition de 100 µl de NaBH4 1M et on laisse le mélange pendant 10 mn encore sous agitation lente. Les plaques sont lavées (5 fois 1 heure) avec de l'eau distillée additionnée de NaBH4 (1spatule/51), puis environ 14 heures (toute la nuit) avec de l'eau seulement, pour éliminer 5 l'excès de NaBH4. Exemple 2 : test diagnostique sur sérum humain (ou animal) avec billes de latex Pour le dépistage rapide, 20 gl de billes de latex conjugués sont mélangés avec 20 gl 10 de sérums dilués ou non ou 20 gl de sang total. Au bout de 5 à 10 mn, comme illustré sur les Figures 1 (avec sérum) et 2 (avec sang), on observe un anneau caractéristique de la positivité de la réaction. A défaut la réaction est considérée comme négative. Exemple 3 : test diagnostique associant un test ELISA pour le diagnostique de stade Les résultats obtenus sont illustrés par la Figure 3. L'utilisation des plaques ELISA avec des sérums de patients atteints de THA montre une augmentation des taux d'anticorps anti-WE lors du passage en stade 2 (atteinte 20 neurologique). 15 Références bibliographiques (1) û Semballa et al, experimental Parasitology 115 (2007) 173-180 (2) û Okomo-Assoumou et al, Ann. J. Trop. Med. Hyg., 1995, pp 461-467 REVENDICATIONS1 - Construction antigénique renfermant un épitope trytophane, caractérisée en ce qu'elle est formée d'un motif tryptophane W, ou d'un peptide de 3 ou 4 acides aminés comportant un motif W, couplé à du glutaraldéhyde. 2 - Construction antigénique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide répond à la séquence SEQ ID N°l C-x-W(-y), dans laquelle « x » représente K, A, S, V, T, R, I, E, D, N ou G, et « y » représente D, S, T, E, N, K, G, Q, R ou I , l'un de « x » ou « y » pouvant être absent . 3 ù Construction antigénique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit 10 peptide répond à la séquence SEQ ID N°2 CKWD. 4 ù Construction antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit produit de couplage est greffé à des billes de latex. 5 - Construction antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit produit de couplage est greffé sur des plaques ELISA. 15 6 - Kit de dépistage de la trypanosomose humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins une construction antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, avec éventuellement un ou plusieurs réactifs pour la réaction antigène/anticorps et/ou des solutions tampons 20 et/ou des réactifs pour la détection, la quantification ou la visualisation des complexes antigènes/anticorps lorsqu'ils sont présents. 7 ù Kit selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les réactifs pour réaliser un test de révélation immuno-enzymatique, notamment un test ELISA indirect ou un test ELISA d'inhibition, faisant entrer en compétition un anticorps monoclonal anti- 25 WE avec les anticorps anti-WE des sérums d'hôtes infectés. 8 ù Kit selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que la construction antigénique est fixée sur un support. 9- Kit selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'il est utilisé pour le dépistage de la trypanosomose africaine humaine ou animale. 30 10 - Méthode de dépistage de THA ou de TAA, caractérisée en ce qu'elle comprend . la mise en contact d'un échantillon de sérum d'un patient ou d'un animal avec une construction antigénique telle que définie ci-dessus, avantageusement en utilisant un kit selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, . la révélation d'une réaction immunologique du type antigène-anticorps.