Brevet FR2960645A1 — publié le 20111202

PROCEDE D'EVALUATION IN VITRO DE L'ETAT PHYSIOLOGIQUE D'UNE MUQUEUSE GASTRIQUE ET KIT POUR REALISER UNE TELLE EVALUATION DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne un procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique à partir de cellules exfoliées de la muqueuse gastrique d'un individu. Plus précisément, l'invention permet d'évaluer l'importance de la perte de cellules épithéliales de la muqueuse gastrique d'un individu en inférant sur le degré d'autophagie et le cycle circadien de la population de cellules exfoliées dudit individu. L'invention concerne également un kit comportant un ensemble d'anticorps susceptibles d'interagir avec des biomarqueurs protéiques spécifiques, afin d'évaluer l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu. L'invention trouve des applications dans le domaine médical, afin d'évaluer l'état de la muqueuse gastrique des enfants prématurés, pour notamment identifier et surveiller la mise en place d'un rythme circadien dans le renouvellement cellulaires de la muqueuse gastrique. L'invention trouve également des applications dans le domaine médical, pour évaluer l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un patient suite à un trouble physiologique ou une affection telle qu'un ulcère, ou suite à un traitement susceptible d'avoir des répercutions sur la muqueuse gastrique d'un patient. L'invention trouve également des applications dans le domaine médical, afin de déterminer le meilleur moment sur un cycle de 24h pour administrer un traitement par voie orale susceptible d'avoir des répercutions sur les cellules gastriques d'un patient, en fonction du rythme circadien de l'exfoliation des cellules gastriques dudit patient. ETAT DE LA TECHNIQUE ET PROBLEMES RENCONTRES L'épithélium gastrique est une structure complexe, constituée de glandes tubulaires et ramifiées. Les cellules souches épithéliales dans la région du collet sont responsables du renouvellement constant de l'épithélium par la production de multiples lignées de cellules gastriques qui peuplent les glandes. Certaines cellules progénitrices gastriques peuvent fonctionner comme des senseurs de dommages, ou des cellules de réserve, qui sont mobilisables pour colmater des microlésions. Ces cellules conservent un potentiel prolifératif élevé, permettant de régénérer des parties de la muqueuse gastrique après une blessure. L'exfoliation est un processus biochimique actif lié à l'homéostasie de l'épithélium. La perte de contact entre les cellules épithéliales et la matrice extracellulaire ou les cellules compagnes, telles que les fibroblastes, se traduit par l'activation d'une cascade enzymatique nommée anoïkis. Le détachement des cellules épithéliales déclenche à la fois des signaux pro et anti-apoptotiques, ce qui permettrait aux cellules de survivre quelque temps dans le milieu extérieur. Dans ce contexte, l'exfoliation aurait un rôle physiologique dans le maintien et l'évolution de l'architecture d'un épithélium, non seulement en permettant la formation d'une lumière glandulaire, mais aussi en offrant une souplesse suffisante pour préserver la continuité physique des épithéliums tout en permettant leur croissance. Chez un enfant prématuré, il est important de pouvoir contrôler la maturation de l'épithélium gastrique, afin notamment d'évaluer si l'enfant est à même ou non d'être alimenté autrement que par sonde gastrique. De même, suite à un traitement, l'épithélium gastrique d'un patient peut avoir été endommagé, et le contrôle du bon rétablissement du patient passe également par celui de l'état physiologique de son épithélium gastrique. Jusqu'à présent, il n'existe aucune méthode non invasive d'évaluation de la maturation de l'épithélium gastrique d'un individu. Or, chez des individus fragiles, tels que les enfants prématurés, il n'est pas concevable de procéder à de telles évaluations de manière récurrente. EXPOSE DE L'INVENTION Un but de l'invention est de proposer une méthode fiable et non invasive pour évaluer l'état physiologique d'un épithélium gastrique, qui puisse se faire de manière récurrente, et notamment plusieurs fois par 24h, sans risque de fragiliser le patient. Pour cela, l'invention propose avantageusement d'utiliser des cellules exfoliées de la muqueuse gastrique, récupérées par exemple dans le liquide gastrique du patient. La récupération de cellules exfoliées quiescentes est possible dans de nombreuses situations cliniques, notamment à partir d'aspirats de fluides gastriques, rinçage extensif à la fin d'une coloscopie de routine etc. Par exemple, en milieu hospitalier, les enfants prématurés sont maintenus sous sonde nasogastrique, notamment pour assurer la période transitoire entre nutrition parentérale totale et nutrition entérale totale. Lors des soins courants, le personnel soignant doit retirer toutes les trois heures, le contenu gastrique comportant du lait non-digéré et des fluides gastriques, qui est source de cellules exfoliées de la muqueuse gastrique de l'enfant. Les cellules exfoliées sont également récupérables sur des patients adultes équipés d'une sonde nasogastrique. De plus, la multiplicité et la fréquence de ces gestes du soin courant pratiqués dans toutes les unités de soins intensifs rend possible la collecte d'une seringue de contenu gastrique et leur utilisation immédiate (ou différée après stockage par exemple à -70°C) pour extraire et détecter les cellules gastriques exfoliées. L'exfoliation des cellules épithéliales gastriques est induite par l'arrivée constante de lait dans la lumière de l'estomac et/ou par un éventuel frottement de la sonde sur la muqueuse gastrique. Ces cellules épithéliales sont dans un état physiologique particulier, nommé anoïkis, qui correspond à l'activation d'un processus d'autophagie Il a été récemment découvert que l'autophagie regroupe un ensemble de mécanismes cataboliques aboutissant à la dégradation de constituants cellulaires par le lysosome. L'autophagie peut être décrite comme un mécanisme de survie cellulaire. Ce dernier a lieu en cas de stress, notamment en cas de carences nutritionnelles, accumulation d'agrégats protéiques etc., et agit en recyclant des nutriments, notamment les acides aminés. Dans la cellule, l'autophagie débute par la formation d'une vacuole, l'autophagosome, qui séquestre de façon non sélective les constituants du cytoplasme. L'autophagosome est délimité par plusieurs feuillets lipidiques dont l'origine est encore mal connue. Bien que l'importance de l'autophagie chez l'homme soit incontestée, son analyse n'est pas évidente du fait du manque de bons marqueurs. Jusqu'à présent, la protéine LC3, homologue chez l'homme, le rat et la souris de Atg8, est le seul marqueur fiable de la présence d'autophagosomes dans les cellules. Le dépistage de la conversion de LC3-I en LC3-II est ainsi un indicatif de l'activité autophagique des cellules. On connaît également, une protéine responsable de l'inhibition de l'autophagie, la SURVIVINE. Plus précisément, la SURVIVINE inhibe la réaction de conversion de LC3-I à LC3-II. Les inventeurs ont découvert que la détection et l'analyse de marqueurs de l'autophagie sur les cellules exfoliées quiescentes de la muqueuse gastrique, en parallèle de la détection et de l'analyse de marqueurs de l'horloge sur lesdites cellules, permet d'évaluer de manière fiable l'état physiologique de la muqueuse gastrique. L'invention propose donc d'évaluer in vitro l'état physiologique de cellules exfoliées de la muqueuse gastrique d'un individu, en utilisant des anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques de l'autophagie et des marqueurs protéiques de l'horloge. Il est ainsi possible, selon l'invention, de suivre et de contrôler l'évolution en cinétique sur un ou plusieurs jours des cellules de la muqueuse gastrique, pour évaluer le rythme circadien de l'exfoliation et l'effet d'un stress nutritionnel. Notamment, l'invention peut permettre d'assurer un suivi en chrononutrition, en contrôlant les perturbations sur le taux d'exfoliation et le niveau d'autophagie de bolus d'acides aminés essentiels (pris par la bouche, seuls ou en cocktails), comme le L-Tryptophane par exemple. De même, l'invention peut permettre d'assurer un suivi en chronopharmacologie, notamment pour la détection des effets de doses de médicaments, tels que l'ibuprofène, sur l'épithélium gastrique. Par ailleurs, le suivi et le contrôle sur ces cellules de la muqueuse gastrique, sur plusieurs semaines, par prélèvements hebdomadaires, peuvent permettre d'évaluer la maturation de l'épithélium. Ainsi, chez les nourrissons prématurés, la possibilité de déterminer la cinétique cellulaire permettant la maturation et la croissance de l'épithélium gastrique normal permet de suivre l'évolution clinicopathologique du patient. Par exemple, un indice de pleine maturité de l'épithélium gastrique du patient pourrait consister en un équilibre délicat entre la prolifération cellulaire et la perte cellulaire, qui pourrait être révélé indirectement par les différents taux d'exfoliation observés durant le séjour en hôpital. D'une manière générale, l'analyse et le suivi simultané des marqueurs de l'autophagie et de l'horloge selon l'invention permettent d'évaluer dans le temps l'état physiologique de l'épithélium gastrique d'un patient, et par la suite de pouvoir poser le diagnostic adéquat et/ou prendre les décisions qui s'imposent pour le suivi dudit patient. L'invention a donc pour objet un procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique à partir de cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique, tel que du liquide gastrique, d'un individu animal, humain ou non humain, selon lequel : a) on soumet des cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique dudit individu, récupéré à un instant T, à un ensemble d'anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques, parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge. Préférentiellement, les anticorps sont des anticorps monoclonaux. Il est également possible d'utiliser des nano-ligands spécifiques des marqueurs protéiques cibles. Selon l'invention, il est possible de déposer des préparations protéiques sur un support, après la lyse des cellules à étudier. Autrement, il est possible de capturer les protéines par des anticorps immobilisés sur un support. Par exemple, on peut utiliser un système ELISA, en procédant dans un premier temps à une capture des marqueurs protéiques par une première série d'anticorps et dans un second temps à une révélation par une seconde série d'anticorps dirigés contre un autre épitope des marqueurs protéiques cibles. On peut également utiliser une puce à protéines ou à capture par anticorps. De même, on peut utiliser un système d'imagerie microscopique de fluorescence à haut débit et multiples signatures biologiques permettant de compter et caractériser les cellules individuellement et d'intégrer leurs caractéristiques. Dans tous les cas, l'analyse selon l'invention permet de détecter et de caractériser les cellules exfoliées, évaluer leur quantité et qualité, ainsi que d'aider au diagnostic d'un phénomène de maturation. Chez le nourrisson nourrit par sonde, les cellules sont par exemple isolées à partir du contenu gastrique, l'arrivée de lait dans la lumière de l'estomac induisant une forte exfoliation cellulaire. Chez l'adulte suivi pour un ulcère, notamment, le contenu gastrique et les selles peuvent présenter de nombreuses cellules épithéliales, qui participent à la cicatrisation, utile pour l'analyse de l'état physiologique de la muqueuse gastrique. Par marqueur protéique, on entend une protéine susceptible de renseigner, de par sa présence/absence/quantité etc. sur un état pathologique particulier. Par marqueur de l'autophagie, on entend une protéine susceptible de renseigner sur l'état autophagique d'une cellule, c'est-à-dire si la cellule est en autophagie ou non. Notamment, selon l'invention, on peut utiliser des anticorps anti- SURVIVINE et/ou des anticorps anti-LC3, la protéine SURVIVINE et la protéine LC3 étant de bons marqueurs de l'autophagie. Par ailleurs, la présence de LC3, en plus d'être associée directement à la présence de l'autophagosome dans la cellule, est également un marqueur de cellule souche. Par marqueur de l'horloge, on entend les gènes directement impliqués dans la régulation circadienne de la physiologie cellulaire. Notamment selon l'invention, on peut utiliser des anticorps anti-PERIOD1 et/ou des anticorps anti-CLOCK, la protéine PERIOD1 et la protéine anti-CLOCK étant de bons marqueurs de l'horloge. En effet, les gènes codant les protéines CLOCK et PERIOD1 font partie d'une douzaine de gènes actuellement reconnus comme impliqués dans la régulation circadienne de la physiologie cellulaire. Ainsi, la protéine CLOCK est cruciale pour la détermination du dimère central de l'horloge (CLOCK:BMAL1). De même, la protéine PERIOD1 est la seule protéine directement corrélée à un stress cellulaire. Avantageusement, l'ensemble d'anti-corps de l'étape a) comporte également des anti-corps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité, afin d'évaluer avec certitude que la perte de cellules épithéliales gastriques provient bien de la personne étudiée. De plus cela permet de comparer entre plusieurs personnes le taux de cellules épithéliales gastriques qui expriment ledit marqueur d'identité. La mobilisation de cellules pariétales exprimant des marqueurs d'identité est indicative du renouvellement de l'épithélium gastrique. Ainsi, par exemple, une différence entre les profils d'exfoliation des marqueurs de l'identité de deux personnes peut indiquer une différence de sensibilité à un traitement nutritionnel, médicamenteux ou autre. Avantageusement, les marqueurs de l'identité utilisés sont H+/K+ ATPase et/ou Pouf5/Oct-4. Avantageusement, on répète l'étape a) sur un nouveau lot de cellules exfoliées et isolées dudit individu, récupérées à un instant T+n après la première analyse, de manière à pouvoir comparer les résultats et suivre l'évolution de l'état physiologique de la muqueuse gastrique dudit individu. Selon l'invention, en fonction de la périodicité des contrôles, il est possible d'évaluer différents paramètres liés à l'état de la muqueuse gastrique du patient, et ainsi poser différents diagnostics. Généralement, une périodicité d'au moins 12 heures est suffisantes. L'étape a) est ainsi répétée à chaque fois sur un lot de cellules de l'individu fraîchement récupérées, les cellules analysées ayant été pour la plus part exfoliées à un instant T+n, n étant préférentiellement au moins égale à 12 heures, par rapport à l'analyse précédente. Par exemple, l'invention propose de répéter l'étape a) au moins toutes les 12 heures pendant au moins 24h, de manière à évaluer la mise en place d'un rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues. Cela est particulièrement intéressant pour les enfants prématurés, car cela permet de déterminer à partir de quand l'épithélium gastrique de l'enfant est mature, et donc quand la sonde gastrique peut être retirée, pour que l'enfant puisse s'alimenter sans assistance médicale. De plus, d'une manière générale, cela permet de déterminer chez un animal (humain ou non humain) le rythme d'exfoliation cellulaire, qui lui est propre. . Selon une autre mise en oeuvre du procédé de l'invention, on répète l'étape a) au moins toutes les 12 heures pendant au moins 72h, de manière à analyser le rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues. Ainsi, on peut vérifier la mise en place et le maintien du rythme circadien de l'exfoliation chez l'enfant prématuré, ou la remise en place chez l'adulte d'un tel rythme, par exemple après traitement d'un ulcère. De même, la connaissance exacte, à un moment donné, pour un individu donné, du rythme circadien de l'exfoliation cellulaire de sa muqueuse gastrique, qui lui est propre et peut être modifié de manière ponctuelle, pour différentes raisons, permet d'optimiser la prise d'un traitement particulier. Cela peut notamment être très avantageux dans le cas d'un traitement anti- cancéreux. De même, en répétant l'étape a) au moins une fois par semaine pendant au moins deux semaines, on peut suivre l'évolution de la maturation de la muqueuse gastrique de l'individu dont les cellules sont issues. Il est ainsi possible de vérifier la rémission durable de la muqueuse gastrique du patient, les effets à long terme d'un traitement etc. Bien entendu, l'homme du métier est tout à fait à même d'adapter la périodicité et la durée de l'analyse, en fonction du patient, des informations spécifiques souhaitées, du diagnostic à poser etc. Par exemple, il est possible de construire, chez une catégorie d'individus donnée (notamment d'une classe d'âge donnée), des courbes de référence, en compilant les données obtenues pour plusieurs individus de ladite catégorie, sur une période donnée, depuis une journée jusqu'à plusieurs semaines (voir notamment ci-dessous la première et la troisième expérimentations). Il est également possible de dériver des abaques ou autres tables constituées des acrophases, périodes, ou amplitudes des rythmes de tout ou partie des biomarqueurs. Cela peut notamment être utile pour des diagnostics prédictifs, et pour affiner le suivi et le pronostic d'un nouvel individu, par rapport aux autres individus de sa catégorie. D'une manière générale, la compilation d'un certain nombre de données pour une catégorie d'individus donnée permet selon l'invention de construire un système expert pour ladite catégorie d'individus. L'invention concerne également, un kit pour l'évaluation de l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu animal, humain ou non humain, destiné à être appliqué in vitro à des cellules gastriques exfoliées dudit individu, caractérisé en ce qu'il comporte un ensemble d'anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge. Le kit selon l'invention est particulièrement adapté à la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Préférentiellement, les anticorps utilisés sont des anticorps monoclonaux. Selon un exemple de kit de l'invention, l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi la protéine SURVIVINE et la protéine LC3, en tant que marqueur de l'autophagie. De même, l'ensemble d'anticorps peut comporter des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi la protéine PERIOD1 et la protéine CLOCK, en tant que marqueur de l'horloge. De plus l'ensemble d'anticorps peut comporter des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité et notamment H+/K+ ATPase. Selon l'invention, le kit peut comporter des solutions nécessaires pour permettre l'extraction des cellules exfoliées, tel que du tampon phosphate salin sans ion calcium ni ion magnésium (PBSO) contenant 3 mM EDTA et 0.05 mM DTT. De même, il peut comporter du tampon carbonate bicarbonate pH 9.6 pour la saturation sur les plaques ELISA si cette solution est retenue. Il est également possible de prévoir du tampon de rinçage des cellules comme le PSBO, ou autre tampon salin tamponné, contenant Tween-20 à 0.05% pour le rinçage ELISA ou 0.2% BSA pour les incubations. Bien entendu, tout autre formule de tampon pour rincer et incuber peut être envisagée. Avantageusement, on peut prévoir de l'eau distillée pour resuspendre le lysat de cellules obtenu après des cycles de congélation/décongélation, ou tout autre formule de tampon lyse adaptée. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Figures 1A à 1 D : Détection de marqueurs protéiques exprimés par des cellules gastriques exfoliées, dans une série temporelle d'aspirats de fluides gastriques d'un enfant prématuré, pendant 24 heures, sur des échantillons prélevés toutes les trois heures. Figures 2A à 2E : Détection de marqueurs protéiques exprimés par des cellules gastriques exfoliées, dans une série temporelle d'aspirats de fluides gastriques de cinq enfants prélevés selon un rythme hebdomadaire entre le troisième jour de vie et le retrait de la sonde gastrique. Figures 3A à 3F : Morphologie de cellules épithéliales gastriques fraîchement isolées (Figures 3 A à 3C) ou mises en culture (Figures 3D à 3F), avec co-expression des marqueurs de cellules souches et de cellules de la lignée pariétale. Figure 4 : Évolution des taux d'expression de deux marqueurs d'autophagie sur des cellules exfoliées buccales d'un individu sain. Figure 5 : Effet exacerbant sur l'exfoliation gastrique d'une exposition par voie orale à une dose d'Ibuprofène ou de L-Tryptophane chez le raton de douze jours lors d'un cycle diète/réalimentation qui induit le phénomène d'exfoliation. Figure 6 : Détection de marqueurs protéiques exprimés par des cellules gastriques exfoliées, dans une série temporelle d'aspirats de fluides gastriques d'un enfant prématuré sur 24 heures, sur des prélèvements effectués toutes les trois heures. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION I- MATERIEL ET METHODES 1- Récupération et préparation des cellules exfoliées de muqueuse qastrique On récolte du résidu gastrique ou des selles d'un individu en container stérile. L'échantillon est traité immédiatement. Autrement, l'échantillon peut être stocké préférentiellement à -80°C, ou à -20°C jusqu'à utilisation. Dans le cas où l'échantillon devait attendre sur la paillasse, il est conseillé de le laisser à température ambiante, à l'obscurité pour minimiser la lyse cellulaire. Dans tous les cas, il est recommandé de ne pas stocker les cellules dans un réfrigérateur, soit à +4°C, ce qui pourrait endommager de manière irrévocable les cellules et les rendre inutilisables ensuite. On procède ensuite à une re-suspension de l'échantillon dans un tampon phosphate salin sans ions calcium ni magnésium contenant 3 mM EDTA et 0,05 mM DTT. Puis on récupère des cellules dans un culot hétérogène par simple centrifugation à 2000 tpm durant 3 min à température ambiante. Le surnageant est jeté et le culot peut être stocké en l'état jusqu'à re-suspension en tampon de lyse ou être utilisé comme suit. Ce culot cellulaire peut être extrait par un tampon de lyse pour immunodétection quantitative ou utilisé en l'état ou après mise en culture pour réaliser des analyses directes par imagerie microscopique en utilisant un système d'immunofluorescence. 2- Échantillons : Lot n°1 : Échantillons (issus de la biocollection Prémathèque) prélevés toutes les trois heures pendant 24 heures, à partir d'aspirats de fluides gastriques d'un enfant prématuré (figure 1). Lot N°2 : Échantillons (issus de la biocollection Prémathèque) prélevés de manière hebdomadaire, à partir d'aspirats de fluides gastriques de cinq enfants prématurés (2A à 2E), avec ou sans mise en culture des cellules (figure 2). Lot N°3 : Échantillons de cellules de la muqueuse interne de la joue d'un volontaire adulte sain, exfoliées par frottements doux ont été récupérées, pour servir de témoin négatif (figure 4). Lot N°4 : Échantillons de cellules exfoliées de muqueuse gastrique de ratons de douze jours, soumis à un cycle diète/réalimentation pendant cinq heures, et ayant reçu une dose de sérum physiologique (NaCl 9 pour mille), ou une dose d'Ibuprofène (10 mg/kg poids vif, dose utilisée en médecine pédiatrique) ou une dose de L-Tryptophane ou rien. Les ratons ont été ensuite remis avec leur mère pour une heure de tétée puis sacrifiés, pour un sous lot à 13H00 et pour un second sous lot à 01 H00 (figure 5). 3- Procédure de lyse : Chaque lot de cellules a subi une lyse de manière à pouvoir être utilisé pour un test ELISA. On utilise à chaque fois 20 pl de culot cellulaire. La lyse est réalisée par trois cycles de congélation/décongélation : passage dans un premier temps de -70°C à +37 °C, puis trois fois de suite,de -20°C pendant 10-15 min à +37°C, en vérifiant à chaque fois la congélation - décongélation de la gouttelette de 20 pl au fond du tube. Une aliquote de la solution est re-suspendue dans de l'eau ou du tampon de saturation (100 pL par échantillon) et mise à saturer sur les puits ELISA. Tampon de saturation : 0,5 M Na2CO3 / NaHCO3, pH 9,6 ; Pour un litre : Na2CO3 : 1,59 g et NaHCO3 : 2,93 g compléter par de l'eau distillée ; Tampon de post-saturation et d'incubation : PBSO + 0,2% BSA Tampon de rinçage : PBSO + 0,05% Tween-20 (25 pl dans 50 ml) Plaques ELISA : Greiner, spéciale ELISA, 96 puits Spectrophotomètre : Bio-Tek Instruments Inc, ELX800-UV, filtre 405 5 nm 4- Protéines cibles Selon l'invention, on utilise avantageusement sur ces échantillons cellulaires des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques, telles que 10 celles répertoriées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1. Liste de marqueurs protéiques pouvant être utilisés pour l'évaluation de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique. Marqueurs protéiques Référence Protéine / Fonction PubMed H+/K+ ATPase (sous-unité ATP4B Cellule Pariétale de l'enfant béta, gastrique) Poufs/Oct-4 ABF29403 Cellule Souche SURVIVINE 015392 Autophagie / Cellule souche LC-3 N P_004849.2 Autophagie APG8 autophagy 8-like CLOCK NP_004889 Homéostasie / Horloge - facteur transcription central Period-1 BAA94085 Homéostasie / Horloge - régulateur Par ailleurs, il est possible d'envisager d'utiliser l'ADN cellulaire comme biomarqueur supplémentaire, pour permettre un sexage de l'échantillon. Autrement, il est possible d'utiliser un fluorochrome, tel que Hoechst 33258. 5- Batterie d'anticorps primaires 15 20 Dans les expérimentations décrites ici, une batterie d'anti-corps a été utilisée, comportant tout ou partie des anti-corps répertoriés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Batterie d'anti-corps monoclonaux Cible Origine Espèce ELISA Intérêt H+/K+ ATPase (2G11) Abcam [2G-11], ab- Souris 1/400 Spécifique enfant 2866 POUF5F1-OCT4 Sigma - P0873 Lapin 1/50 Souche SURVIVINE (FL-142) Santa-Cruz, sc- Lapin 1/50 Survie, souche, 10811 autophagie MAP LC3beta (H-50) Santa-Cruz, sc- Lapin 1/50 Autophagie 28266 CLOCK (KAT13D) Abcam Lapin 1/50 Horloge (facteur ab3517 transcription) CLOCK (H-276) Santa-Cruz, sc- Lapin 1/50 Horloge (facteur 25361 transcription) PERIOD1 Santa-Cruz Lapin 1/50 Horloge (régulateur) sc L'évolution de la protéine CLOCK a été suivie par 2 anticorps (KAT13D et H-276) provenant de deux fournisseurs. Seul le signal de plus 10 forte amplitude, obtenu avec KAT13D (Abcam), a été présenté. 6- Coniuqués Le tableau ci-dessous 3 ci-dessous reprend les anticorps secondaires biotinylés utilisés pour amplifier la réaction. Tableau 3 : Conjugués Cible Origine Espèce 15 7- Détection et analyse Révélateur de fixation d'anticorps : Extravidin-horse-radish peroxydase (Sigma, E-2886, 1/1000), ABTS (en tablettes, Sigma A-9941 5 dont tampon citrate pH 3) et eau oxygénée. Lecture sur Bio-Tek : Les densités optiques ont été lues à 405 nm après 20 min d'incubation à 37°C. Aucune variation significative des densités optiques n'a été obtenue en incubant sur 40 min. Traitement des densités optiques : Les valeurs sont exprimés par un 10 indice relatif l'indice relatif se calcule par : IR = (DO échantillon - DO Bruit Fond) / DO Bruit Fond. La détection du niveau d'actine par un anticorps a montré une faible différence entre échantillon, aucune normalisation n'a donc été appliquée. 15 II- RESULTATS 1- Expérimentations sur lot N°1 1.1- Première expérimentation 20 Lors d'une première expérimentation sur le lot N°1, on a cherché à étudier la variation sur 24 h de la perte cellulaire au niveau de la muqueuse gastrique d'un enfant prématuré, en suivant la cinétique d'expression de marqueurs circadiens dans ces cellules. L'ensemble des six biomarqueurs du tableau 1 ont été détectés, au 25 moyen des sept anti-corps du tableau 2. Les graphes des figures 1A à 1 D montrent le profil circadien d'exfoliation cellulaire de l'enfant, avec tous les marqueurs (figure 1A), avec les marqueurs de phénotype uniquement (figure 1B), avec les marqueurs d'autophagie uniquement (figure 1C), et avec les marqueurs de l'horloge 30 uniquement (figure 1 D). Goat-anti-rabbit- biotin Vector-lab, BA-1000 Chèvre (1/1000) Goat Anti-mouse- biotin Sigma, B-0529 Chèvre (1/1000) Ce profil correspond à une série d'échantillons positifs de volume minimum 500 pl. L'aspect blanc laiteux observé indique que l'échantillon comportait une fraction de lait non digéré. Ainsi, on observe que l'exfoliation des cellules de la muqueuse gastrique de cet enfant prématuré suit un rythme circadien, qu'illustrent et contrôlent les marqueurs de l'horloge. Sur cette base, il est possible de vérifier l'acquisition d'un rythme par l'enfant selon l'âge et calculer une amplitude, une période et une phase. Par exemple, la figure 1A illustre l'estimation chronobiométrique d'une fonction cosinus à partir des données mesurées sur les cellules exfoliées du lot N°1. La fonction théorique est représentée par un symbole « cercle noir » en parallèle des valeurs obtenues par le test ELISA également représentées sur la figure 1A. La flèche blanche indique l'heure (hh:mm) de l'acrophase. Plus précisément, dans le cas présent, les calculs ont été réalisés par Time Series Analysis Seriel Cosinor, version 6.3, ExpertSoft Technologies. L'équation proposée par le logiciel est : 0,3671 * Cos ((2 pi t/24.000)-1,426) + 0,6555. L'existence d'un rythme circadien est testée vraie par analyse de variance et divers tests chronobiométriques au seuil 5%. A titre d'exemple, l'acrophase de l'exfoliation (pic de l'oscillation) pour cet enfant est : 05 h 26 min en heure de la journée (flèche blanche portée sur la figure 1A qui correspond au temps 29,44 h). Un décalage dans le pic d'un jour sur l'autre indique une altération de l'équilibre liée soit à un stress nutritionnel soit à une maturation gastrique. 1.2- Deuxième expérimentation Lors d'une seconde expérimentation sur des cellules du lot N°1, on a voulu montrer que la détection des biomarqueurs de l'autophagie, de l'horloge et/ou de l'identité selon l'invention peuvent être détectés directement au microscope. Pour cela, les cellules ont été isolées et fixées pour observation microscopique immédiate, ou mises en culture durant 15 jours dans un milieu de croissance classique (Dulbecco's Minimum Essential Medium supplémenté avec 2 mM L-Glutamine, 10% sérum fetal calf, amphotéricine-B -pénicilline- streptomycine et gentamycine en doses antimicrobiennes classiques). Les colonies ayant poussées ont été fixées pour observation microscopique. Les observations d'immunomarques ont été obtenues sur un microscope à épifluorescence Nikon Eclipse 400. L'isolement des cellules quiescentes utiles pour une immunodétection a été observé uniquement à partir du troisième jour de vie. Les cellules isolées d'aspirats de fluides gastriques antérieurs (jour de naissance jusqu'au second jour de vie, correspondant au premier contenu gastrique) sont en sénescence et impropres pour une utilisation en immunodétection. Il est alors possible de suivre de manière fiable les phénotypes cellulaires via un système d'analyse quantitative d'images microscopiques. Ainsi, les figures 3A, 3B et 3C montrent la co-expression des marqueurs de cellules-souches et de cellules de la lignée pariétale (POUF5/Oct4) dans des cellules exfoliées fraichement isolées de la muqueuse gastrique d'un enfant prématuré, respectivement sur Hoechst (figure 3A), Alexa 438 (figure 3B) et fond clair+Hoechst (figure 3C). Les figures 3C, 3D et 3E, elles, montrent la co-expression des marqueurs de cellules-souches et de cellules de la lignée pariétale (POUF5/Oct4) dans des cellules exfoliées isolées de la muqueuse gastrique d'un enfant prématuré, et mises en culture, respectivement sur fond clair et lumière UV (figure 3D), Alexa 438 (figure 3E) et Hoechst (figure 3F). On observe que ces cellules épithéliales quiescentes peuvent être cultivées après exfoliation, ce qui suggère que l'autophagie, induite par un détachement des cellules, contribue à préserver la viabilité de ces cellules. 1.3- Troisième expérimentation Lors de cette troisième expérimentation, on a voulu montrer qu'il était possible, avec les anti-corps selon l'invention, d'exclure rapidement et aisément des séries d'échantillons non-conformes à une charte de qualité donnée. Pour cela, il suffit de procéder à la détection des biomarqueurs exprimés par les cellules gastriques exfoliées. Il convient de pouvoir comparer ces résultats avec une courbe de référence, spécifique par exemple d'une tranche d'âge et/ou d'une pathologie et/ou d'un traitement donné etc., pour lesdits marqueurs. Le profil représenté dans le graphe de la figure 6 montre une série « négative ». Les échantillons sont tous de volume inférieur à 500 pl (compris entre 50 pl et 300 pl), un échantillon étant par ailleurs manquant. Dans le cas présent, l'aspect des échantillons était marron sale indiquant une série non-conforme. Ces allégations visuelles ont été confirmées lors de l'analyse des biomarqueurs. Comparativement au profil représenté sur les graphes de la figure 1, on observe en effet une discordance dans les taux d'expression des marqueurs de l'autophagie et de l'horloge. 2- Expérimentation sur le lot N°2 Lors de l'expérimentation sur le second lot de cellules, on a cherché à suivre l'évolution de la maturation de l'épithélium gastrique, sur cinq enfants prématurés différents, à partir d'échantillons prélevés une fois par semaine, entre le troisième jour de vie et le retrait de la sonde gastrique, soit environ vers le quarantième jour de vie. On a, selon les cas, détecté un ou les deux biomarqueurs de l'identité présentés dans le tableau 1, un ou les deux biomarqueurs de l'autophagie présentés dans le tableau 1 et un ou les deux biomarqueurs de l'horloge présentés dans le tableau 1, en utilisant les anti-corps correspondants présentés dans le tableau 2. Les différences de profil entre les enfants (figures 2A à 2E) sont indicatives et leur interprétation pour partie liées à l'âge gestationnel des enfants et à leur historique clinique. Ainsi, l'expression soudainement élevée de PERIOD1 sur les profils des enfants 3 (figure 2C) et 5 (figure 2E), sans évolution notable des niveaux des autres biomarqueurs, suggère une réponse à un stress nutritionnel ou médicamenteux récent à surveiller ou à retrouver dans le dossier de suivi du patient. L'expression du facteur transcriptionnel CLOCK ne permet pas à elle seule d'interprétation nette sans courbes de référence pour chaque âge. Par contre, en lien avec les autres biomarqueurs, elle permet de moduler l'interprétation. Ainsi, les profils d'exfoliation des enfants 1 (figure 2A), 2 (figure 2B) et 4 (figure 2D) illustrent une maturation progressive de l'épithélium gastrique. Cette expérimentation permet de montrer qu'il est possible, grâce à l'invention, de suivre des enfants d'âges gestationnels différents pendant la durée de leur hospitalisation. 3- Expérimentation sur le lot N°3 On a voulut ici suivre l'évolution en parallèle des marqueurs d'autophagie sur des cellules humaines exfoliées mécaniquement, et maintenues en survie pendant 3 heures dans un tampon salin phosphate à température ambiante sans source énergétique, afin de reproduire des conditions similaires à un échantillon oublié sur la paillasse. La figure 4 montre ainsi l'augmentation du taux d'expression de la SURVIVINE et de LC-3-b sur 3 heures sur des cellules buccales exfoliées d'un individu humain adulte. Plus précisément, les cellules exfoliées voient leur taux de biomarqueurs de l'autophagie augmenter de manière significative au cours de la première heure, pour atteindre un palier à une densité optique mesurée à 405 nm de 2,250 et s'y maintenir au cours des heures suivantes. 4- Expérimentation sur le lot N°4 Lors de cette expérimentation, on a voulu suivre les effets inducteurs de l'exfoliation lorsqu'une préparation médicamenteuse ou nutritionnelle est prise par la bouche. Pour des raisons éthiques, cette expérimentation a été conduite sur des cellules de ratons. Le graphe de la figure 5 montre l'effet exacerbant sur l'exfoliation des cellules de la muqueuse gastrique, d'une exposition par voie orale à une dose d'Ibuprofène ou de L-Tryptophane, comparativement à une dose de sérum physiologique représentant le témoin négatif, chez le raton de douze jours lors d'un cycle diète/réalimentation qui induit le phénomène d'exfoliation des cellules de la muqueuse gastrique. La dose d'ibuprofène administrée aux ratons est en corrélation avec celle donnée à un enfant prématuré (10 mg / kg de poids vif). La dose de L-Tryptophane administrée correspond à celle classiquement donnée à un rat adulte lors d'étude sur cet acide aminé (50 mg / kg de poids vif). Chez le raton de 12 jours, le rythme de vie, qui consiste à manger la nuit et à dormir le jour, commence à se mettre en place (bien que la mère allaite encore le raton de 12 jours de jour comme de nuit). L'exfoliation est donc circadienne avec une forte sensibilité à "midi" et une faible sensibilité aux perturbations par un bolus alimentaire à "minuit". Ainsi, dans le cas présent, donner un bolus par la bouche à "minuit" (ici 01 H00) perturbe peu l'épithélium gastrique. Selon l'invention, il est possible de déterminer aisément le meilleur moment de la journée chez un individu donné, ou sur un groupe d'individus, pour la prise d'un traitement, et de savoir si il est préférable ou non de l'associer à la prise d'aliments, pour minimiser des effets nocifs ulcérant sur l'estomac. Ainsi chez l'humain, pour l'Ibuprofène, il faut avantageusement administrer la dose orale à certaines heures correspondant à la zone "active", c'est à dire le jour en association avec un aliment. BIBLIOGRAPHIE - Aoyama F, Sawaguchi A, Ide S, Kitamura K, Suganuma T. (2008). Exfoliation of gastric pit-parietal cells into the gastric lumen associated with a stimulation of isolated rat gastric mucosa in vitro: a morphological study by the application of cryotechniques. Histochem. Oeil Biol. 129: 785-793. - Bell-Pedersen D, Cassone VM, Earnest DJ, Golden SS, Hardin PE, 10 Thomas TL, and Zoran MJ. (2005) Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. 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Oncogene 24: 6482-6491. 20 REVENDICATIONS1- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique à partir de cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique d'un individu animal, humain ou non humain, selon lequel : a) on soumet des cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique dudit individu à un instant T, à un ensemble d'anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques, parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge. 2- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on répète l'étape a) sur des cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique dudit individu à un instant T+n. 3- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'ensemble d'anti-corps de l'étape a) comporte au moins des anticorps anti-SURVIVINE et/ou des anticorps anti-LC3, en tant que marqueurs de l'autophagie. 4- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps de l'étape a) comporte au moins des anticorps anti-PERIOD1 et/ou des anticorps anti-CLOCK, en tant que marqueurs de l'horloge. 5- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'ensemble d'anti-corps de l'étape a) comporte également des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité cellulaire. 6- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on répète l'étape a) au moins toutes les 12 heures pendant au moins 24h, de manière évaluer la mise en place d'un rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues. 7- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en cequ'on répète l'étape a) au moins toutes les 12 heures pendant au moins 72h, de manière à analyser le rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues. 8- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on répète l'étape a) au moins une fois par semaine pendant au moins deux semaines, pour suivre l'évolution de la maturation de la muqueuse gastrique de l'individu dont les cellules sont issues. 8- Kit pour l'évaluation de l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu animal, humain ou non humain, destiné à être appliqué in vitro à des cellules gastriques exfoliées dudit individu, caractérisé en ce qu'il comporte un ensemble d'anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge. 9- Kit pour l'évaluation de l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu animal, humain ou non humain, selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi la SURVIVINE et la LC3, en tant que marqueur de l'autophagie. 10- Kit pour l'évaluation de l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu animal, humain ou non humain, selon l'une des revendications 8 à 9, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi PERIOD1 et CLOCK, en tant que marqueur de l'horloge. 11- Kit pour l'évaluation de l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu animal, humain ou non humain, selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité cellulaire.30