Brevet FR2955111A1 — publié le 20110715

La présente invention concerne le domaine du diagnostic. En particulier, elle concerne un procédé de production de composés dendrimères polybiotinylés utiles pour l'amplification de signal, notamment lors de la détection d'un analyte dans un test diagnostique. Les sondes qui permettent la détection d'analytes tels que des protéines et des acides nucléiques sont largement utilisées et sont des outils de choix pour le diagnostic in vitro et in vivo. Toutefois, la détection de ces analytes peut être difficile car ils ne sont pas toujours présents en quantité suffisamment élevée. Un système d'amplification de la détection est donc nécessaire. Afin de permettre la détection d'analytes en quantité insuffisante, plusieurs techniques ont été mises au point. Ces techniques consistent soit à augmenter la quantité d'analyte, comme par exemple avec les techniques de PCR ou NASBA, soit à amplifier la détection, comme par exemple en utilisant des structures à multiples marqueurs. Ainsi, la demande de brevet EP0774119A décrit des conjugués à multiples marqueurs comprenant un support polymère ayant au maximum 100 unités monomères, qui contient 1 à 10 molécules d'haptène et 1 à 10 groupes marqueurs, ainsi que la préparation de ces conjugués par synthèse en phase solide (a) en introduisant, en des positions prédéterminées du support, des dérivés monomères qui sont couplés de manière covalente à des molécules d'haptène et/ou des groupes marqueurs et/ou (b) en couplant à des groupes réactifs du support, après la synthèse, des molécules d'haptène et/ou des groupes marqueurs. Les dendrimères sont des macromolécules bien définies qui présentent de multiples embranchements et qui se terminent par de multiples groupements fonctionnels périphériques. Un des avantages des dendrimères, dû au fait qu'ils possèdent de multiples groupements fonctionnels, consiste en ce qu'ils peuvent être utilisés comme agents de couplage stables, comme décrit dans la demande de brevet WO03/72546 déposée par la Demanderesse. Un autre avantage réside aussi en ce que ce sont des structures à multiples marqueurs car leurs groupements fonctionnels périphériques peuvent être utilisés pour lier de multiples marqueurs tels que la biotine, les fluorophores ou leur combinaison. Ainsi, la demande de brevet WO01/02861 décrit 2 des dendrimères liés d'une part à 1 à 1200 sondes et d'autre part à 1 à 1200 marqueurs. Ces dendrimères sont utilisés pour l'amplification de signal. D'autres dendrimères polybiotinylés ont également été décrits dans la demande de brevet W000/72802. Toutefois, les procédés conventionnels de préparation des dendrimères ont pour inconvénients que la synthèse des dendrimères est effectuée en phase liquide, ce qui est plus complexe et plus long qu'en phase solide. De plus, certains procédés produisent des dendrimères non neutres et non polarisés. La Demanderesse a maintenant mis au point de façon inattendue un nouveau procédé de préparation de composés dendrimères polybiotinylés permettant de pallier les inconvénients des procédés de l'art antérieur en ce sens qu'il permet de préparer de façon reproductible et contrôlée des composés polybiotinylés qui sont : - hydrosolubles bien qu'électriquement neutres, - polarisés grâce à une distribution séparée et précise dans l'espace de leurs 15 fonctions, dont la fonction biotine, et - synthétisés en phase solide. Ainsi, la présente invention a pour premier objet un procédé de préparation d'un composé de formule (I) : X (1) n0 Go 20 dans laquelle - X est la biotine ou AA2/(G2)n2 Y ( G2) n2 Y - Y est la biotine ou /`G3)n3 Z - AA3 \ (G3).3 Z - Z est la biotine ou - AA4 V V - V est la biotine ou / G5 n5 biotine - AA5 \ (G5)ns biotine - B est NH2 ou H, - AA est un dérivé de molécule trifonctionnelle quand B est NH2 ou de molécule difonctionnelle quand B est H, - AA1 à AA5 sont chacun indépendamment un dérivé de molécule trifonctionnelle, 10 - Go à G5 sont chacun indépendamment un bras comprenant au moins une unité (-CH2-CH2-O-), - no à n5 sont chacun indépendamment un nombre entier compris entre 1 et 8 et - T est un antiligand ou un groupement réactif pour la fixation à un antiligand, ledit antiligand étant susceptible de réagir avec un ligand, 15 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : (i) greffer no composés de formule W"o-Go-OH, dans laquelle W"o est un groupement protecteur des amines, no et Go étant tels que définis précédemment, à un composé de formule (II) : 4 dans laquelle R est une résine préfonctionnalisée, W et Wo sont différents l'un de l'autre et représentent un groupement protecteur des amines, W étant différent de W"o, et AA est tel que défini précédemment, pour obtenir un composé de formule (III) : W W"°-(Go' no R (III) 15 (ii) coupler un composé de formule (IV) : W WI-A412\\ OH (IV), dans laquelle W1 et W'1 sont des groupements protecteurs des amines identiques ou différents l'un de l'autre et des groupements Wo et W"o, mais différents de W, et AA1 est tel que défini précédemment, avec le composé de formule (III) pour obtenir un composé de formule (V) : AA1-( Go AA no W 1 R (v), (iii) greffer 2n1 composés de formule W"1-G1-OH, dans laquelle W"1 est un groupement protecteur des amines, identique ou différent l'un de l'autre et des autres groupements protecteurs utilisés dans ce procédé, mais différents de W, G1 et n1 étant tels que définis précédemment, au composé obtenu dans l'étape (ii) pour obtenir un composé de formule (VI) : W. 1 il (Gl)/ n o ni W W1 \ rG W \\ 1 R W" 1 (iv) quand X de la formule (I) est la biotine, passer directement à l'étape (v) ; sinon, quand X de la formule (I) n'est pas la biotine, répéter les étapes (ii) et (iii) avec 2p-' composés de formule (VII) : W p Wp AA OH (VII) et 2pnp fois le composé de formule W"p-Gp-OH , dans laquelle p est un nombre entier compris entre 2 et 5, et Wp, W'p, W"p sont des groupements protecteurs des amines identiques ou différents les uns des autres et des autres groupements protecteurs utilisés dans ce procédé, mais différents de W, et AAp est une molécule trifonctionnelle, selon la séquence suivante : - 1 fois quand Y est la biotine, p étant alors égal à 2 - 2 fois quand Y n'est pas la biotine et Z est la biotine, p étant alors égal à 2 puis à 3, - 3 fois quand Y et Z ne sont pas la biotine et V est la biotine, p étant alors égal à 2, 3 puis 4, et - 4 fois quand Y, Z et V ne sont pas la biotine, p étant alors égal à 2, 3, 4 puis 5, (v) déprotéger le composé ainsi obtenu au niveau du groupement W"1 ou W"p, p étant compris entre 2 et 5, et coupler avec de la biotine, (vi) déprotéger, au niveau du groupement W, le composé ainsi polybiotinylé et coupler avec un antiligand ou un groupement réactif pour la fixation à un antiligand (T) et (vii) couper le composé ainsi obtenu de la résine (R) pour obtenir un composé de formule (I). Un autre objet de l'invention concerne les composés de formule (I) dans laquelle : - X est la biotine ou AA2 /(G2).2 Y (G2).2 Y - Y est la biotine ou /`G3)n3 Z - AA3 \ (G3).3 Z - Z est la biotine ou - AA4 V V - V est la biotine ou / G5 n5 biotine - AA5 \ (G5)ns biotine - B est NH2 ou H, - AA est un dérivé de molécule trifonctionnelle quand B est NH2 ou un dérivé de molécule difonctionnelle quand B est H, - AA1 à AA4 sont chacun indépendamment un dérivé de molécule trifonctionnelle, - Go à G5 sont chacun indépendamment un bras comprenant une unité (-CHz-CHz-O-), - no à n5sont chacun indépendamment un nombre entier compris entre 1 et 8 et - T est un groupement maléimide, un groupement acide carboxylique ou un antiligand. L'invention concerne enfin l'utilisation des composés susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit ci-dessus, pour l'amplification de signal dans un test diagnostique. Le procédé de l'invention permet donc de préparer des composés polybiotinylés de façon reproductible et contrôlée. Par ailleurs, lesdits composés obtenus sont très solubles même sans charge électrique du fait de la présence des substituants Go à G5. Leur structure dendrimère particulière permet une polarisation de la molécule, dont l'encombrement stérique est contrôlé, ce qui permet une meilleure présentation des biotines et donc l'amplification du signal, notamment lorsqu'elle est utilisée dans une application diagnostique, du fait de la présence de 2 à 32 biotines. Les composés 7 obtenus sont alors particulièrement utiles lors de la détection d'un analyte en très faible quantité. La structure dendrimère des composés obtenus avec le procédé de l'invention est obtenue grâce à la mise en oeuvre de molécules trifonctionnelles ou 5 difonctionnelles. Par molécule difonctionnelle AA, on entend toute molécule comportant au moins un atome trivalent ou tétravalent portant deux fonctions leur permettant de réagir avec deux molécules. Dans ce cas, dans la formule (I), B est H. A titre d'exemple non limitatif de molécules difonctionnelles, on peut citer les diamines difonctionellles telles 10 que l'éthylène diamine et la 4,7,10-trioxatridécanediamine. Par molécule trifonctionnelle, on entend toute molécule comportant au moins un atome trivalent ou tétravalent portant trois fonctions leur permettant de réagir avec trois molécules. Dans ce cas, dans la formule (I), B est NH2. A titre d'exemple non limitatif de molécules trifonctionnelles, on peut citer la lysine, l'acide diaminobutanoïque, 15 l'acide diaminopropanoïque, la L-ornithine et leurs dérivés. Selon un mode de réalisation préféré, les composés dans le procédé de l'invention présentent l'une des caractéristiques suivantes : - les substituants AA1 et AA2, le cas échéant AA3, AA4 et AA5, sont identiques et sont de préférence un dérivé de lysine, 20 - le substituant AA est un dérivé de lysine et B est NH2. La solubilité des composés obtenus avec le procédé de l'invention provient de la nature des bras espaceurs Go à G5 utilisés car ils comprennent au moins une unité (-CH2-CH2-O-). De façon préférée, les composés de l'invention comprennent de une à six unités (-CHz-CHz-O-), de préférence encore de une à quatre unités (-CHz-CHz-O-). 25 A titre d'exemples non limitatifs de tels bras espaceurs, on peut citer le pentaoxaoctadécanoyle, le tétraoxapentadécanoyle, le trioxadodécanoyle, le trioxatridécanoyle, le dioxaoctanoyle, l'oxapentoyle et l'héxaoxahénéicosanoyle et leurs dérivés. Selon un mode de réalisation, les composés dans le procédé de l'invention 30 présentent l'une des caractéristiques suivantes : 8 - les substituants Go, G1, le cas échéant G2, G3, G4 et G5, sont identiques et sont de préférence de formule (-NH-CHz-CHz-O-CHz-CHz-O-CHz-CO-). - les nombres entiers no, ni, le cas échéant n2, n3, n4 et n5, sont identiques et sont de préférence égaux à 2 ou 3. Dans les composés préparés selon le procédé de l'invention, T est un antiligand ou un groupement réactif pour la fixation à un antiligand. Par antiligand, on entend toute molécule capable de se lier avec un ligand. Les exemples de couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Les groupements réactifs pour la fixation à un antiligand sont largement connus de l'homme du métier. Des exemples non limitatifs de tels groupements sont les groupements maléimide, acide carboxylique, thiol, amine, alcoxyamine, hydrazine, azido, alcyne, aldehyde. Les composés obtenus par le procédé de l'invention permettent l'amplification du signal de détection dans un test diagnostic du fait de la présence de plusieurs biotines, selon le tableau 1 suivant : Tableau 1 Nombre X Y Z V de biotines 2 biotine NA NA NA 4 (G2) Y biotine NA NA n2 !1112 (G2)n2 Y 8 / (G 2 n2 Y ( G3 ) z biotine NA 1~1~2 n3 \ (G2/n2 Y -AA3 \ (G3)n3 z 16 / (G2 În2 v (G3)n3 z (G4 v biotin A2 -E1E13 n4 e \ (G2)n2 Y \ (G3)n3 Z 1~1~4 ~G4~n4 V NA: non applicable Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, X est /(G2) Y AA2 \ (G2)n2 Y et Y est la biotine. Les étapes de greffage et de couplage du procédé de l'invention sont des étapes classiquement utilisées par l'homme du métier dans le domaine de la synthèse en phase solide de type synthèse peptidique. Ces étapes peuvent être mises en oeuvre de façon manuelle ou bien de façon automatisée sur les synthétiseurs du commerce tels que le synthétiseur ABI 431 A et ABI433A. Les réactifs utilisés lors de ces étapes sont connus de l'homme du métier et sont décrits par exemple dans Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides & Proteins, Paul Lloyd Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt, CRC Press. Ainsi, les composés de formule (II) dans laquelle R est une résine préfonctionnalisée et AA est un dérivé de molécule difonctionnelle sont disponibles 15 chez Novabiochem. A titre d'exemple, on peut citer : - le composé Universal NovaTag resin, référence 04-12-3910 de formule : Fmoc OCH3 O Mmt - le composé Universal PEG NovaTag resin, référence 04-12-3911 de formule : 10 Fmoc HN OCH3 Mmt o Lorsque AA est une molécule trifonctionnelle dans les composés de formule (II), ces derniers peuvent être obtenus en couplant un composé de formule (II') OH (II') dans laquelle Wo et W sont tels que définis précédemment, sur une phase solide aminée HN de formule (II") Wr R dans laquelle R est , et Mir est un groupement protecteur des amines identique ou différent de Wo et W. Un exemple de phase solide aminée comprend la résine RINK-amide-MHBA de Novabiochem (Référence 01-64-0037). Les étapes de déprotection et de séparation du composé polybiotinylé de la résine R sont largement connues de l'homme du métier et sont décrits par exemple dans Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides & Proteins (supra). Les groupements protecteurs des amines sont également largement connus de l'homme du métier et on peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, le t- butyloxycarbonyle (Boc), le benzyloxycarbonyle, le 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) ou le méthoxytrityle (Mmt). On peut mettre en oeuvre n'importe quel groupement protecteur dans le procédé de l'invention dans la mesure où W est différent des autres groupements protecteurs utilisés. Selon un mode de réalisation, les composés dans le procédé de l'invention 20 présentent l'une des caractéristiques suivantes : - le groupement W est le méthoxytrityle, - les groupements W1 et W' l sont identiques et, le cas échéant, W2 et W'2 sont identiques, W3 et W'3 sont identiques, W4 et W'4 sont identiques et W5 et W'5 sont identiques, - les groupements W1,W'1 et, le cas échéant, W2, W'2, W3, W'3,W4 et W'4,W5 et W'5 sont des groupements fluorénylméthoxycarbonyle. Le procédé de l'invention permet de préparer de nouveaux composés dendrimères polybiotinylés de formule (I) X G1 )n~ T AA1 (Go) n0 AA \ (Gi\ /n/l B lo dans laquelle - X est la biotine ou AA2 /(G2)n2 Y ( G2) n2 Y - Y est la biotine ou 15 - Z est la biotine ou - V est la biotine ou X (1) /(G3)n3 Z - AA3 \ ( G3)n3 Z - AA4 V V / l G5 n5 biotine AA5 \ (G5) ns biotine - B est NH2 ou H, - AA est un dérivé de molécule trifonctionnelle quand B est NH2 ou un dérivé de molécule difonctionnelle quand B est H, - AAi à AA4 sont chacun indépendamment un dérivé de molécule trifonctionnelle, - Go à G5 sont chacun indépendamment un bras comprenant une unité (-CHz-CHz-O-), - no à n5 sont chacun indépendamment un nombre entier compris entre 1 et 8 et - T est un groupement maléimide, un groupement acide carboxylique ou un antiligand. Selon un mode de réalisation particulier, les composés de l'invention comprennent l'une des caractéristiques suivantes : - les substituants AA1 et AA2, le cas échéant AA3, AA4 et AA5, sont identiques et sont de préférence un dérivé de lysine, - les substituants Go, G1, le cas échéant G2, G3, G4 et G5, sont identiques et sont de préférence de formule (-NH-CHz-CHz-O-CHz-CHz-O-CHz-CO-), - les nombres entiers no, ni, le cas échéant n2, n3, n4 et n5, sont identiques et sont de préférence égaux à 2 ou 3, - X est /(G2)n2 Y -AA2 \ 'G2' ) n2 Y - AA est un dérivé de lysine et B est NH2, - l'antiligand est un fragment Fab', - X est et Y est la biotine, Y AA2 (G2).2 YY est la biotine, AA, AA1 et AA2 sont un dérivé de lysine, Go, G1 et G2 sont de formule (-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-), no, ni et n2 sont égaux à 2, B est NH2 et T est un antiligand, de préférence un fragment Fab'. Les composés préparés par le procédé de l'invention sont particulièrement utiles pour l'amplification de signal dans les méthodes de diagnostic in vitro impliquant une reconnaissance d'un couple ligand/anti-ligand, la molécule à diagnostiquer constituant le ligand, ce qui constitue un autre objet de l'invention. En effet, les composés de l'invention possèdent directement un anti-ligand (substituant T) ou sont mis à réagir avec un antiligand qui se fixera au niveau dudit substituant T par des méthodes largement connues de l'homme du métier. Les exemples de couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Les méthodes diagnostic in vitro pouvant mettre en oeuvre les conjugués de l'invention sont notamment les tests immunologiques tels que les méthodes « sandwich » telles qu'ELISA, IRMA et RIA, les méthodes dites de compétition et les méthodes d' immuno détection directe comme 1' immunohisto chimie, l'immunocytochimie, le Western-blot et le Dot-blot. Toutes ces méthodes sont largement connues de l'homme du métier. Les méthodes de diagnostic mettant en oeuvre les composés préparés selon le procédé de l'invention sont utiles tant dans le diagnostic clinique de maladie que dans le diagnostic de produits préparés en Industrie (diagnostic industriel) tels que les produits destinés à l'agroalimentaire ou les produits destinés à la santé. Les maladies pouvant être diagnostiquées avec les composés de l'invention ne sont pas limitées et comprennent toutes maladies révélées par la présence d'un marqueur spécifique de la maladie, du type molécule d'intérêt biologique ou analyte ou 14 ligand, pour lequel il existe un partenaire de liaison. A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer les maladies virales telles les hépatites et le SIDA, et les cancers solides telles que le cancer du sein, du colon ou de la prostate. L'amplification de signal est mise en oeuvre par l'utilisation d'une molécule 5 marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs consiste en : • les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la (3-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, 10 • les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, • les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 1251, et • les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, étant entendu que ces marqueurs seront modifiés pour être lié à un partenaire de liaison à la biotine tel que la streptavidine. Ce type de modification est largement connu 15 de l'homme du métier. .Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants qui sont donnés à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 à 8, dans lesquelles : 20 - la figure 1 correspond à la formule développée d'un composé à 4 biotines selon un mode de réalisation, - la figure 2 est une représentation graphique donnant les résultats de DO d'un test ELISA direct d'un conjugué Fab' anti-Listeria monocytogenes monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de 25 l'invention), fixé au fond d'une microplaque, en fonction de sa concentration, - la figure 3 est une représentation graphique donnant les résultats de DO d'un test ELISA direct d'un conjugué Fab' anti-Salmonelle monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixés au fond d'une microplaque, en fonction de leur concentration, ainsi que d'un test 30 ELISA indirect avec ces mêmes conjugués, mais détectés par l'intermédiaire d'antigènes de Salmonelle, 15 - la figure 4 est une représentation graphique donnant les résultats de DO d'un test ELISA direct d'un conjugué Fab' anti-HIV monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond d'une microplaque, en fonction de sa concentration, - la figure 5 est une représentation graphique donnant les résultats de DO d'un test ELISA direct d'un conjugué Fab' anti-Kallikréine monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond d'une microplaque, en fonction de sa concentration, - la figure 6 est une représentation graphique donnant les résultats de DO d'un test ELISA direct d'un conjugué antigène gp160 réduit au DTT monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond d'une microplaque, en fonction de sa concentration, - la figure 7 est une représentation graphique donnant les résultats de DO d'un test ELISA direct de conjugués antigènes de surface de l'hépatite B monobiotinylés (par de la biotine NHs) ou tétrabiotinylés (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixés au fond d'une microplaque, en fonction de leur concentration, et - la figure 8 est une représentation graphique donnant les résultats de DO d'un test ELISA direct d'un conjugué anticorps anti-Salmonelle monobiotinylé (par de la biotine NHs) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond d'une microplaque, en fonction de sa concentration. Exemple 1 : Préparation d'un composé de formule (I) présentant 4 biotines (AA=AA1=AA2= dérivé de lysine ; B est NH2 ; Go=G1=G2= (-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-) = Ado; no=n1=n2= 2 T= maléimide AA2 /(G2)n2 Y \ 'G2' ) n2 Y X Y = biotine) On a disposé dans un réacteur du synthétiseur automatique 433A (Applied Biosystems) équipé d'un détecteur UV, environ 132 µmoles de la résine Fmoc-RINK- MBHA (Novabiochem). Par ailleurs, on a préparé les cartouches contenant chacun des synthons à raison de 1 mmole par cartouche : - Fmoc-Lys(Mmt)-OH, 640,8 mg (Novabiochem) - Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, 590,7 mg (Novabiochem) - Fmoc-Ado-OH, 385,4 mg (ou Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid, 10 Polypeptide) - N-maleoyl-Balanine, 169,1 mg (FLUKA) - Biotine, MW 244,3 (SIGMA) préalablement reprise en solution à 0,5 M dans le DMSO (ALDRICH), soit 2 ml de solution par cartouche On a utilisé les matières premières suivantes : 15 - N-méthyl-pyrrolidone ou NMP (Applied Biosystems) - Dichlorométhane ou DCM (Applied biosystems) - Pipéridine (ALDRICH) - Anhydride acétique (FLUKA) - Méthanol (MERCK) 20 - Solution de di-isopropyléthylamine ou DIEA (ALDRICH), 2 M dans la NMP ci-dessus - Solution de hexafluorophosphate benzotriazolyl tétraméthyluronium ou HBTU (Novabiochem) à l'équivalence avec du N-hydroxybenzotriazole (SENN) le tout en solution à environ 0,45 M dans du N,N-diméthylformamide ou DMF 25 (ALDRICH) - Solution à 1% d'acide trifluoroacétique ou TFA (ACROS) et à 2,5% de tri- isopropylsilane ou TIS (FLUKA) dans le même DCM que ci-dessus. Par défaut, on a prévu 2 cartouches de chaque synthon à incorporer de manière à travailler en mode « Conditional Double Coupling ». 30 La programmation du synthétiseur repose sur une succession de cycles, eux-mêmes divisés en modules, les modules sont une suite de fonctions primaires sur 16 17 l'automate. On a utilisé comme base les programmes du fournisseur qui ont été adaptés pour la réalisation de l'exemple suivant : Les modules utilisés sont les suivant : - A : reprise de la cartouche d'acide aminé en poudre - B : déprotection du groupement Fmoc N-terminal à la pipéridine - C : capping ou masquage à l'anhydride acétique des amines n'ayant pas réagi - D : rinçages de la résine à la NMP - E : activation et transfert de la solution d'acide aminé vers la résine - F : couplage sous agitation - G : déprotection du monométhoxytrityle de la chaîne latérale de la l ère lysine - I : agitation intermittente du réacteur pendant 30 minutes - a : module conditionnel de reprise de la cartouche, rinçage de la résine et activation / transfert vers le réacteur - b : module conditionnel de déprotections supplémentaires à la pipéridine 15 - c : rinçage de la résine au DCM - d : autre module de rinçage de la résine à la NMP - f : module conditionnel de couplage long sous agitation - i : module conditionnel d'éjection de cartouche non utilisée On a programmé le synthétiseur selon les cycles tels qu'indiqués dans le tableau 2 20 suivant : Tableau 2 Cycle AA Nom Modules 1 Fmoc-Lys(Mmt)- Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd OH capping 2 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 3 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 4 Fmoc-Lys(Fmoc)- Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd OH capping 5 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFfliaflCd capping 6 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFfliaflCd capping 7 Fmoc-Lys(Fmoc)- Double couplage conditionnel long et BbADEFfliaflCd 5 OH capping 8 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel très long BbADEFf piaf I et capping Cd 9 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel très long BbADEFf piaf I et capping Cd 10 Biotine Double couplage conditionnel très long BbADEFf piaf I et capping Cd 11 N-maleoyl-Balanine Déprotection Lys(Mmt) double GcADEFIAdEFf couplage long et capping ICd 12 Aucun Lavages résine NMP et DCM Dcc Lors des déprotections du groupement Fmoc, l'appareil effectue un test. En fonction du résultat obtenu, le programme effectue un simple ou double couplage (utilise respectivement 1 seule ou bien les 2 cartouches prévues) 1.1. Couplage l ère lysine (AA) On déprotège la résine et on couple la Fmoc-Lys(Mmt)-OH (II') comme suit (cycle 1 : l'appareil utilise 1 seule ou les 2 cartouches de l'acide aminé Fmoc-Lys(Mmt)-OH en fonction du résultat du test conditionnel) : Fmoc H N I pipéridine 20% dans NMP Mmt H2N NH Fmoc-Lys(Mmt)-OH / HBTU / DIEA Fmoc N" C H H N ICI) (1) io (1) ou (II") : également représenté par Mmt 1 H Fmoc LysùN ~1 1.2. Construction du squelette : Il consiste en l'alternance de : greffage de bras espaceur hydrophile Ado2 b) couplage du synthon de ramification = Fmoc-Lys(Fmoc)-OH A partir de (1) ci-dessus i). greffage de bras espaceur hydrophile Ado? (étape a) (cycles 2 et 3 : l'appareil utilise 1 seule ou les 2 cartouches de l'acide aminé Fmoc-10 Ado-OH à chaque cycle en fonction du résultat des tests conditionnels) Mmt 1 H Fmoc LysùN 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Ado-OH / HBTU / DIEA Mmt Fmoc AdoùL I Nù0 (2) 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Ado-OH / HBTU / DIEA Mmt H Fmoc AdoùAdoùLysùN (3) ii) Ramification par Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (étape b) (cycle 4 : l'appareil utilise 1 seule ou les 2 cartouches de l'acide aminé Fmoc-15 Lys(Fmoc)-OH en fonction du résultat du test conditionnel) A partir de (3) (1) 1 Mmt Fmoc AdoùAdoùLysùNH (3) 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Lys(Fmoc)-OH / HBTU / DIEA Fmoc Mmt Fmoc LYsùAdoù AdoùLYy H sùN -0 iii) Répétition des étapes a), b) puis a pour terminer le squelette - cycles 5 et 6 : l'appareil utilise 1 seule ou les 2 cartouches à chaque acide aminé Fmoc-Ado-OH en fonction du résultat des tests conditionnels : Fmoc Mmt H Fmoc LYsùAdoùAdoùLYysùN I 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Ado-OH / HBTU / DIEA Fmoc Ado Mmt H (5) Fmoc ùNù0 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Ado-OH / HBTU / DIEA Fmoc Ado Ado Mmt H (6) Fmoc AdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùN (4) (4) 5 - cycle 7 : l'appareil utilise 1 seule ou les 2 cartouches de l'acide aminé Fmoc-Lys(Fmoc)-OH en fonction du résultat du test conditionnel : Fmoc Ado Ado Mmt Fmoc AdoùAdoùLYsùAdoùAdoùLYl H sùN (6) I 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Lys(Fmoc)-OH / HBTU / DIEA Fmoc Fmoc Lys Ado Ado Mmt H Fmoc LysùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùN Fmoc - cycles 8 et 9 : l'appareil utilise 1 seule ou les 2 cartouches de l'acide aminé Fmoc-Ado-OH en fonction du résultat des tests conditionnels : (7) I 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Ado-OH / HBTU / DIEA Fmoc Ado Fmoc AdoùLys Ado Ado Mmt H Fmoc AdoùLysùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùN Ado Fmoc 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Fmoc-Ado-OH / HBTU / DIEA Fmoc Ado Ado Fmoc AdoùAdoùLys Ado Ado Mmt H Fmoc Adoù AdoùLysùAdoùAdo ùLys ùAdo ùAdo ùLys ùN Ado Ado Fmoc 1 (8) (9) 1.3. Couplage d'une biotine à chaque extrémité des 4 branches : (cycle 10 : l'appareil utilise 1 seule ou les 2 cartouches de biotine selon le résultat du test conditionnel (9) I 1) pipéridine 20% dans NMP 2) Biotine (dans DMSO) / HBTU / DIEA Biotine Ado Ado Biotine AdoùAdoùLys do (10) A Ado Mmt H Biotine AdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùN Ado Ado Biotine 1.4. Déprotection du Mmt et greffage du maléimide : (cycle 11 : cette fois, le programme utilise les 2 cartouches de N-maleoyl-13alanine - Pas de test conditionnel). Le groupe protecteur Mmt est coupé sélectivement par action répétée d'une solution de DCM (dichlorométhane) à 1.5% de TFA (acide trifluoroacétique) et 1.5% de TIS (tri-isopropylsilane). L'amine de la chaîne latérale de la lysine insérée à l'étape 1) est ainsi libérée pour son couplage avec une forme acide de maléimide, N-maleoyl-13-alanine. soit : 25 (10) TFA 1.5% - TIS 1.5% dans DCM Biotine Ado Ado Biotine AdoùAdoùLys Ado Ado I NH2 H Biotine AdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùN Ado Ado Biotine N-maleoyl-R-alanine / HBTU / DIEA Biotine Ado Ado Biotine AdoùAdoùLys Ado Ado Maleimide H Biotine AdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùN Ado Ado Biotine 1 (12) 26 1.5. Clivage Après synthèse, la résine est séchée sous courant d'azote. Elle est transférée dans une seringue plastique de 20 ml comportant un fritté et mise en contact avec 10 ml d'une solution de TFA/eau (95/5) sous agitation pendant 1h30 à température ambiante. Après quoi la solution de clivage est collectée par filtration (via le fritté de la seringue) dans un ballon en verre. La résine est rincée par environ 5 ml de TFA, puis par 3 fois environ 5 ml de DCM. Tous ces volumes sont rajoutés au ballon. Le mélange brut de clivage est évaporé sous pression réduite avec un évaporateur rotatif dont le bain est à température ambiante pendant quelques dizaines de minutes. On obtient au final un résidu huileux de couleur orangée. Ce produit est repris dans quelques millilitres d'eau déminéralisée pour analyses et purification. Une aliquote rediluée dans l'eau déminéralisée est analysée par HPLC et spectrométrie de masse couplée à 1'HPLC. HPLC analytique BECKMAN avec colonne de chromatographie phase inverse C18 VYDAC de 5,4 mm de diamètre par 250 mm de long, avec les éluants A = eau à 0,1% de TFA et B = mélange acétonitrile ou ACN avec eau (respectivement 95/5) à 0,1% de TFA. Le débit est de 1 ml/min. A partir de l'injection de l'échantillon, on procède à un gradient de 0 à 80% d'acétonitrile en 30 minutes. Dans ces conditions, après le pic de volume mort vers 3 minutes, la molécule tétrabiotinylée/maléimide sort vers 15 minutes. L'analyse LC/MS (HPLC et détecteur de masse THERMO ELECTRON) permet d'identifier le composé attendu avec un poids moléculaire recalculé à 3617,7 g/mole (théorique 3618.26) Le reste du brut est purifié en au moins 3 volumes équivalents par injection en HPLC semi-préparative BECKMAN sur une colonne phase inverse C18 VYDAC de 20 mm de diamètre par 250 mm de long, au débit de 22 ml/min. Les éluants A et B sont identiques à ceux utilisés en HPLC analytique. Programme typique de purification : après injection on reste 10 minutes à 5% d'éluant B ; puis passage de 5 à 23 % d'éluant B en 1 minute ; puis gradient de purification de 23 à 31% de B en 30 minutes. Dans ces conditions, les fractions de purification sont prélevées à l'arrivée du massif du produit recherché, à partir d'environ 21 minutes, à raison de 0,33 minute par tube, jusqu'à 27 environ 30 minutes (soit de l'ordre de 25 tubes). Une aliquote de chaque tube est analysée en mode isocratique en HPLC analytique (mêmes conditions que ci-dessus sauf isocratique de 26% d'éluant B pendant 10 minutes). Les fractions les plus pures sont rassemblées dans un ballon en verre puis cette solution est lyophilisée. Après lyophilisation et pesée, on reprend le lyophilisat dans l'eau déminéralisée à 1 mg/ml en fonction de la pesée. Cette solution mère est répartie dans des flacons en verre brun à raison de 1 à quelques millilitres par flacon. Puis les flacons sont à nouveau lyophilisés et bouchés sous une atmosphère inerte de 700 millibars d'argon. l0 Une aliquote est utilisée pour procéder aux analyses finales en HPLC (BECKMAN, conditions identiques à la lère analyse en gradient ci-dessus), LC/MS (conditions idem ci-dessus) et analyse d'acides aminés selon le mode opératoire du fournisseur sur le système Agilent 1100 series avec détection par fluorescence. Biotine Ado Ado Biotine AdoùAdoùLys Ado Ado Maleimide Biotine AdoùAdoùLysùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùLys Ado Ado Liaison acidosensible mélange TFA 95% H2O 5% Biotine Ado Ado Biotine AdoùAdoùLys Ado Ado Maleimide Biotine AdoùAdoùLYsùAdoùAdoùLYsùAdoùAdoùLYIsùNH i Ado Ado TAG FINI (13) Biotine Amide C-terminale Le composé tétrabiotinylé (13) ainsi obtenu présente la formule développée (12) Biotine 1 telle que décrite sur la figure 1. Exemple 2 : Préparation d'un composé de formule (I) présentant 4 biotines (AA=AA1=AA2= dérivé de lysine ; B est NH2 ; Go=G1=G2= (-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-) = Ado ; no=nl=n2= 3 T= maléimide AAZ /(G2)n2 Y \ 'G2' ) n2 Y Io Y = biotine) Dans cet exemple, on a utilisé les mêmes réactifs que ceux décrits dans l'exemple 1 à l'exception de la résine : on a disposé dans le réacteur du synthétiseur ABI433A environ 148 micromoles de résine H-RINK-ChemMatrix (MATRIX 15 Innovation) qui est sous forme amine libre exempte de groupement Fmoc. 2.1 Couplage lère lysine (AA) : A la différence de l'exemple 1, la Fmoc-Lys(Mmt)-OH a été couplée manuellement. La résine est déjà sous forme amine et ne nécessite pas de déprotection. 20 Puis, 137 micromoles de Fmoc-Lys(Mmt)-OH repris en solution dans la NMP ont été envoyés manuellement dans le réacteur avec 1 équivalent de l'agent de couplage HBTU/HOBt. Au final, les réactifs se trouvent dans un volume d'environ 6 ml. Enfin, la réaction de couplage est démarrée par envoi dans le réacteur de 0,5 ml de la même solution de DIEA 2 M / NMP. La résine est en léger excès. On laisse alors réagir 2 25 heures à température du laboratoire avec vortex intermittent. Après quoi, on reprend la synthèse en mode totalement automatisée selon le programme indiqué dans le tableau 3 suivant : 29 X= Tableau 3 Cycle AA Nom Modules 1 Fmoc-Lys(Mmt)- Fin couplage et masquage des amines IIDCCDD OH résiduelles de la résine 2 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 3 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 4 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping Fmoc-Lys(Fmoc)- Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd OH capping 6 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I capping Cd 7 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I capping Cd 8 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I capping Cd 9 Fmoc-Lys(Fmoc)- Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I OH capping Cd 9 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel très long BbADEFfIIIliafl et capping IIICd Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel très long BbADEFfIIIliafl et capping IIICd 11 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel très long BbADEFfIIIliafl et capping IIICd 12 Biotine Double couplage conditionnel très long BbADEFfIIIliafl et capping IIICd 13 N-maleoyl-Balanine Déprotection Lys(Mmt) double GcADEFIAdEFf couplage long et capping ICd 14 Aucun Lavages résine NMP et DCM Dcc Après le premier cycle de ce programme, on obtient le même type de structure que le composé (1) de l'exemple 1. 5 2.2 Construction du squelette On a répété le mode opératoire décrit dans le paragraphe 1.2 étape i), à ceci près que cette étape i) est répétée 3 fois et par conséquent 3 Fmoc-Ado-OH (et non plus 2) sont couplés successivement pour aboutir à la structure suivante (étape 2.2.i)) : 30 Mmt H Fmoc AdoùAdoùAdoùLysùN (14) Puis on a procédé à la ramification à l'identique de l'étape 1.2 ii) en couplant Fmoc-Lys(Fmoc)-OH pour obtenir (étape 2.2.ii)) : Fmoc Mmt H Fmoc LysùAdoùAdoùAdoùLysùN (15) On a ensuite répété à l'identique les étapes 2.2 i) et 2.2 ii) ci-dessus pour aboutir à la molécule suivante à deux ramifications : Fmoc\ /Fmoc Lys Ado Ado (16) Fmoc Ado Mmt H Fmoc Nù0 On a de nouveau répété à l'identique les étapes 2.2 i) et 2.2 ii) ci dessus pour aboutir à la molécule intermédiaire à quatre ramifications protégées par des « Fmoc » : Fmoc \ Ad /Fmoc Ado Ado \Ado Ado Ad \ Fmoc Lys (17) Ado Ado Ado Ado Ado Ado Mmt H Fmoc AdoùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùAdoùLysùN Puis on a procédé comme indiqué aux paragraphes 1.3, 1.4 pour aboutir à la molécule tétrabiotinylée avec maléimide : Biotine Biotine \Ado Ado \Ado Ad o Ado Ad Biotine Lys Ado Ado Ado Ado (18) Ado Ado Maleimide IH Bioti neùAdoùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùAdoùLysùAdoùAdoùAdoùLysùN On a effectué le clivage de la molécule de son support, l'analyse et la purification, dans des conditions similaires à celles de l'exemple 1. On a observé la sortie en HPLC analytique (conditions expérimentales identiques) de la molécule tétrabiotinylée / maléimide avec des bras de « 3 Ado » vers 15 minutes. L'analyse LC/MS (conditions identiques) confirme la présence du composé attendu avec un poids moléculaire recalculé à 4634 g/mole (théorique 4634.37). La purification de cette molécule est effectuée dans les conditions identiques à l'exemple 1, à ceci près que le gradient de purification consiste cette fois en un passage de 22 à 32 % de l'éluant B toujours en 30 minutes. Comme dans l'exemple 1, les fractions les plus pures sont rassemblées et ce mélange est lyophilisé. Après quoi, le lyophilisat est pesé et repris dans l'eau (soluble) et réparti en fractions de 1 à quelques millilitres, à leur tour lyophilisés puis bouchés sous atmosphère inerte de 700 millibars d'argon. Comme dans l'exemple 1, une aliquote est utilisée pour procéder aux analyses lo finales identiques. Biotine Biotine \Ado Ad Ado Ad Ado Ad o Biotine Lys TAG FINI (19) Ado Ado Ado Ado Ado Ado Maleimide Bioti neùAdo ùAdo ùAdo ùLysùAdoùAdo ùAdo ùLys ùAdo ùAdo ùAdoùLysùN H2 amide C-terminale Exemple 3 : Préparation d'un composé de formule (I) présentant 8 biotines (AA=AA1=AA2= AA3= dérivé de lysine ; 15 B est NH2 ; Go=G1=G2= G3=(-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-) = Ado; no=n1=n2= 3 T= maléimide AA2 /(G2) n2 Y \ 'G2' ) n2 Y Z = biotine Pour obtenir cette structure à huit ramifications, on répète la méthode utilisée 5 dans l'exemple 1, à quelques différences près. Le programme utilisé sur le synthétiseur ABI433A est tel qu'indiqué dans le tableau 4 suivant : Tableau 4 Cycle AA Nom Modules 1 Fmoc-Lys(Mmt)- Couplage simple en faible BbDgFfIIIIIICC OH stoechiométrie et masquage des amines d résiduelles de la résine 2 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 3 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 4 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping Fmoc-Lys(Fmoc)- Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd OH capping 6 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 7 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 8 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd capping 9 Fmoc-Lys(Fmoc)- Double couplage conditionnel et BbADEFfiafCd OH capping 9 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I capping Cd Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I capping Cd 11 Fmoc-Ado-OH Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I capping Cd 12 Fmoc-Lys(Fmoc)- Double couplage conditionnel long et BbADEFf piaf I OH capping Cd 13 Fmoc-Ado-OH Double couplage systématique long et BbADEFf IIAdE capping FfIIICd Y= 14 Fmoc-Ado-OH Double couplage systématique long et BbADEFf IIAdE capping Ff llCd 15 Fmoc-Ado-OH Double couplage systématique long et BbADEFf IIAdE capping Ff llCd 16 Biotine Double couplage systématique long et BbADEFf IIAdE capping Ff llCd 17 N-maleoyl-Balanine Déprotection Lys(Mmt) double GcADEFIAdEFf couplage long et capping ICd 18 Aucun Lavages résine NMP et DCM Dcc Le chargement de 448 micromoles de résine (Fmoc-RINK-MBHA) est effectué automatiquement mais par seulement 80 micromoles de Fmoc-Lys(Mmt)-OH pour aboutir au composé sur résine (1) de l'exemple 1. L'excès d'amine sur la résine est masqué par acétylation. Puis la synthèse continue à l'identique de l'exemple 2, jusqu'à l'étape permettant d'obtenir la structure (17). A partir de là, on effectue la répétition à l'identique des étapes 2.2 i) et 2.2 ii) de l'exemple 2, pour aboutir à la molécule intermédiaire à huit ramifications protégées par l0 des groupements « Fmoc » : Fmoc Ado /°n Ado c Ado Ado Ado Lys Ado Ad o \Ado Ad \Ado Ado \L/ 1 Ado Ado Fmoc Ado Ado LysùAdoùAdoùAdoùLys \Ado \Ado \Ad\ Mmt Lys \NH Puis on procède comme pour l'exemple 1, aux étapes identiques aux paragraphes 1.3, 1.4 de l'exemple 1, pour aboutir à a molécule octobiotinylée avec maléimide : 36 Fmoc Fmoc Ado Ado / ,Ado--Ado.LYs Ado Ad Fmoc \ \ Ado Ado \ Ado \ Ado \ Lys Ado \Ado Ado Adô \Ado Fmoc Ado Ado Ad Ado (20) 37 Biotine Ado Ad Biotine Biotine Ado \ Ado \ Ado \ Biotine Ado Ado / ,Ado--Ado.LYs Ado Ado Ado Lys Ado Ad o \Ado Ad \Ado Ado \L/ \ Ado Biotine \ Ad Ado 1 Ado Ado Adô Ado Ado Adô \Ado Biotine Ado Ado LysùAdoùAdoùAdoùLys \Ado \Ado Ad\ /laléimide Lys NH Le clivage de la molécule de son support est effectué dans des conditions similaires à l'exemple 1.5, ainsi que l'analyse et la purification. En HPLC analytique (conditions expérimentales identiques), la molécule octobiotinylée/maléimide avec des bras de 3 Ado sort sous forme de pic large vers 16 minutes. L'analyse LC/MS (conditions identiques) confirme la présence du composé attendu avec un poids moléculaire recalculé à 9535 g/mole (théorique 9536,06). La purification de cette molécule est effectuée dans les conditions identiques à l'exemple 1, à ceci près que le Biotine Ado Ado Ad Ado Ado Ado Ado Ado Ado Biotine (21) 38 gradient de purification consiste en un passage de 25 à 35 % de l'éluant B en 30 minutes. Comme dans l'exemple 1, les fractions les plus pures sont rassemblées et ce mélange est lyophilisé. Après quoi, le lyophilisat est pesé et repris dans l'eau (soluble) et réparti en fractions de 1 à quelques millilitres, à leur tour lyophilisés puis bouchés sous atmosphère inerte de 700 millibars d'argon. Comme dans l'exemple 1, une aliquote est utilisée pour procéder aux analyses finales identiques. La molécule octobiotinylée/maléimide avec bras de « 3 Ado » obtenue est la 10 molécule (22) suivante : Biotine --Ados Ado.L Lys /Lys y \Ado Ado Ado Ad o/ \Ado Ado \L/ 1 Ado Ad Adô Lys \Ado \ Ado Adô Ado Biotine Ado Ado LysùAdoùAdoùAdoùLys \Ado \Ado \Ad\ Maléimide Lys \NH2 amide C-terminale Exemple 4 : Couplage de protéines-SH avec un composé de formule (I) 4.1. Contexte Le couplage à la biotine sur des protéines-SH (par exemple fragments Fab', antigènes réduits au DTT et protéines modifiées par le réactif de Traut) est réalisé traditionnellement en utilisant de la biotine BMCC (Pierce ref 21900 : 1-Biotinamido- 4 {4'-(maléimidomethyl)cyclohexanecarboxamido] butane) qui se fixe sur les fonctions 39 Biotine Ado Ado Ado Ad Biotine \ Ado Biotine \ Ad Ado Ado Ado Ado Biotine Ado \ Ado \ Ado \ Biotine Ad/ Ado Ado Ado Ado Ad o Lys Ado Ad Ad Biotine (22) 40 sulfhydryle libres des protéines SH. Toutefois, la faible quantité de fonctions sulfhydryle libres ne permet pas de fixer un nombre important de biotine, de sorte que quand le conjugué biotine/protéine-SH est utilisé en diagnostic, le signal de détection est faible, représentatif que de la présence d'une biotine par conjugué. Il convient donc d'augmenter le signal. Les composés de l'invention permettent de lier de 2 à 32 biotines et la Demanderesse a montré que, contre toute attente, ils conservaient un signal proportionnel au nombre de biotines présents, après couplage aux radicaux sulfhydryle libres des protéines-SH, et ce malgré leur encombrement stérique du fait du grand nombre de biotines liées. Le protocole de couplage est détaillé dans les paragraphes suivants. 4.2. Réactifs Les réactifs du commerce utilisés sont indiqués dans le tableau 5. Tableau 5 Noms Fournisseurs Références Pepsine agarose Sigma P0609-50KU 2 f3 mercapto ethanol Thermo scientific 35602 Biotine BMCC Thermo scientific 21900 DMSO Merck 1.02950.0500 Iodoacétamide Sigma 16125 Réactif de TRAUT Thermo scientific 26101 N-Ethylmaleimide Sigma E-3 876 DTT Sigma D0632 Biotine NHs Roche 11003933 Par ailleurs, les protéines-SH utilisées, obtenues de bioMérieux, France, sont les suivantes : - Fragments Fab' : fragment Fab' anti-Listeria monocytogenes, anti-antigène de paroi de Salmonelle, anti-p24 de HIV clone A et clone B et anti-Kallikréine 20 humaine 2 ; - Antigènes utilisés : gp160 de HIV, HBs Ad du HBV, HBs Ay du HBV - Anticorps : anticorps anti-antigène de paroi de Salmonelle. Les antigènes utilisés pour le dosage ELISA indirect des fragments Fab' de Salmonelle ont été obtenus après culture des souches de Salmonella bergedorf, 41 typhimurium et enteritidis en milieu peptonée pendant 24h à 37°C, puis chauffage pendant 15 min à 100°C. Enfin, on a utilisé le composé de formule (I) préparé selon l'exemple 1. 4.3. Couplage à la biotine BMCC et au composé de l'exemple 1 sur des Fab' 5 On a obtenu les conjugués par couplage comme suit : - obtention du fragment Fab' par digestion pepsique, puis réduction au 213ME, ajusté à 2 mg/ml après purification sur Superdex 200 prep grade, en tampon PO4 50mM + NaCl 150 mM + EDTA(4Na) 5mM pH=6.8, - préparation d'une solution extemporanée de biotine BMCC (533,69 g/mole) à 8.5 mM 10 (4.54 g/1) en DMSO, - préparation d'une solution extemporanée de composé de l'exemple 1 (3618,26 g/mole) à 2.5 mg/ml en eau déminéralisée, - couplage au Fab' à raison de 5 moles biotine BMCC ou composé de l'exemple 1 par mole de Fab' (46 000 Daltons), 15 - incubation 2 heures à température du laboratoire avec agitation rotative en flacon verre brun, - blocage par addition de iodoacétamide équimolaire à la biotine BMCC ou au composé de l'exemple 1, - utilisation d'une solution extemporanée de iodoacétamide 10 mM en tampon PBS, 20 - incubation 1H à température du laboratoire avec agitation rotative, - dialyse contre tampon PBS + azide, - sortie de dialyse et détermination de la concentration des conjugués par mesure de la DO à 280nm (a = 1,48) 4.4. Couplage du composé de l'exemple 1 sur des anticorps modifiés par le 25 Traut On a obtenu les conjugués par couplage comme suit : - modification de l'anticorps par addition de 20 moles de Traut pour 1 mole d'anticorps, puis dialyse en tampon PO4 50mM + NaCl 150 mM + EDTA(4Na) 5mM pH=6.8, 30 - préparation d'une solution extemporanée de composé de l'exemple 1 (3618,26 g/mole) à 2.5 mg/ml en eau déminéralisée, 42 - couplage à l'anticorps modifié à raison de 20 moles composé de l'exemple 1 par mole d'anticorps (160 000 Daltons), - incubation 2 heures à température du laboratoire avec agitation rotative en flacon verre brun, - blocage par addition de iodoacétamide équimolaire au composé de l'exemple 1, - utilisation d'une solution extemporanée de iodoacétamide en PBS, - incubation 1H à température du laboratoire avec agitation rotative, - dialyse contre tampon PBS + azide, - sortie de dialyse et détermination de la concentration du conjugué par mesure de la 10 DO à 280nm (a = 1,4) 4.5. Couplage du composé de l'exemple 1 sur des antigènes modifiés par le Traut On a obtenu les conjugués par couplage comme suit : - modification de l'antigène par addition de 4 moles de Traut pour 1 mole d'antigène, 15 puis dialyse en tampon PO4 50mM + NaCl 150 mM + EDTA(4Na) 5mM pH=6,8, - préparation d'une solution extemporanée de composé de l'exemple (3618,26 g/mole) à 1 mg/ml en eau déminéralisée, - couplage à l'antigène modifié à raison de 1 moles de composé de l'exemple 1 par mole d'antigène (PM = 25 000 Daltons), 20 - incubation 2 heures à température du laboratoire avec agitation rotative en flacon verre brun, - blocage par addition de iodoacétamide équimolaire au composé de l'exemple 1, - utilisation d'une solution extemporanée de iodoacétamide en PBS, - incubation 1H à température du laboratoire avec agitation rotative, 25 - dialyse contre tampon PBS + azide + SDS (sodium dodécylsulfate), - sortie de dialyse et détermination de la concentration des conjugués par mesure de la DO à 280nm. 4.6. Couplage de la biotine NHs sur des antigènes ou des anticorps On a obtenu les conjugués par couplage comme suit : 30 - dialyse des anticorps ou des antigènes en tampon NaHCO3 0,1M pH=8,3 - préparation d'une solution extemporanée de biotine NHs à 11,36 g/1 en DMSO pour le 43 couplage des anticorps et d'une solution à 2,0 g/1 en DMSO pour le couplage des antigènes - couplage à l'anticorps à raison de 20 moles biotine NHs par mole d'anticorps (160 000 Daltons), et couplage à l'antigène à raison de 1 mole biotine NHs par mole antigène 5 (25 000 daltons) - incubation 1 heure à température ambiante avec agitation rotative en flacon verre brun, - blocage par addition de lysine 1M pH=8,0 équimolaire à la biotine NHs, - incubation 1h à température ambiante avec agitation rotative, 10 - dialyse contre tampon PBS + azide pour les anticorps et en PBS + azide + SDS pour les antigènes, - sortie de dialyse et détermination de la concentration du conjugué par mesure de la DO à 280nm. 4.7. Couplage du composé de l'exemple 1 et de la biotine BMCC sur des 15 antigènes réduits au DTT On a obtenu les conjugués par couplage comme suit : - réduction de l'antigène par addition de 800 moles de DTT par mole d'antigène et agitation pendant 30 min à température du laboratoire, - dessalage de l'antigène réduit sur gel G25 Sephadex en tampon PBS + EDTA pH=7,5, 20 - préparation d'une solution extemporanée de biotine BMCC (533,69 g/mole) à 4,35 mM (2,32 g/1) en DMSO, - préparation d'une solution extemporanée du composé de l'exemple 1 (3618.26 g/mole) à 2.5 mg/ml en eau déminéralisée, - couplage à l'antigène réduit à raison de 20 moles de biotine BMCC ou de composé de 25 l'exemple 1 par mole d'antigène (160 000 Daltons), - incubation 2 heures à température du laboratoire avec agitation sur vortex en flacon verre brun, - blocage par addition de 20 moles de NEM par mole d'antigène, - utilisation d'une solution extemporanée l OmM de NEM en tampon PBS, 30 - dialyse des conjugués en PBS + MIT, - sortie de dialyse. 44 Exemple 5 : Application en tests de détection directe et indirecte ELISA 5.1. Contrôle ELISA direct L'activité des conjugués présentant un composé de l'invention tétrabiotinylée ou une seule biotine est comparée avec un test ELISA direct, en fixant les conjugués sur microplaque et en révélant le signal par l'intermédiaire de la streptavidine couplée à la peroxydase. Cet essai permet de comparer le "niveau de couplage" des composés polybiotinylés, selon un mode de réalisation de l'invention, avec des composés monobiotinylés. l0 Protocole : Utilisation des barrettes Maxisorp (pour dépôt de fragments d'anticorps et anticorps entiers) ou Polysorp (pour dépôt des antigènes). Dilution des conjugués monobiotinylés ou tétrabiotinylés entre 0,05 µg/ml et 0.5 µg/ml en tampon CO3 50 mM pH=9.6, puis dilutions de 2 en 2. 15 Dépôt 100 µl/puits de chaque dilution Incubation 1 nuit à température du laboratoire 3 lavages en PBS tween Dépôt 100 µl/puits de streptavidine-peroxydase diluée au 1/6000° en PBS Incubation 15 min à l'étuve à 37°C 20 3 lavages en PBS tween Dépôt 100 µl/puits OPD Incubation 30 min à l'obscurité à température du laboratoire Blocage avec 100 µl/puits H2SO4 1.8N Lecture de la DO à 492 nm 25 5.2. Contrôle ELISA indirect avec un conjugué Fab' anti-Salmonelle/composé tétrabiotinvlé ou monobiotinvlé Pour ce faire, les antigènes issus de la culture des 3 souches de Salmonelle ont été coatés sur des microplaques Polysorp. Puis on a réalisé les étapes suivantes : - passivation 1H à l'étuve à 37°C avec de la BSA 1 g/1 en PBS, 30 - 3 lavages PBStween, puis 45 - incubation des conjugués dilués de 2 en 2 en PBS pendant 30 min à 37°C, 3 lavages PBS tween. On a ensuite procédé comme pour l'ELISA direct à partir du dépôt de streptavidine. L'ELISA indirect permet à la fois de tester le "niveau de couplage" et la réaction biologique entre le conjugué et l'antigène ou l'anticorps. 5.3 Résultats Les Résultats sont reportés sur les Figures 2 à 8 comme suit : - la figure 2 est la représentation graphique donnant les résultats de DO du test ELISA direct du conjugué Fab' anti-Listeria monocytogenes (LMO) monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond de la microplaque, en fonction de sa concentration, la figure 3 est la représentation graphique donnant les résultats de DO du test ELISA direct du conjugué Fab' anti-Salmonelle monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixés au fond de la microplaque, en fonction de leur concentration, ainsi que du test ELISA indirect de ces mêmes conjugués, mais détectés par l'intermédiaire d'antigènes de Salmonelles, - la figure 4 est la représentation graphique donnant les résultats de DO du test ELISA direct de deux conjugués Fab' anti-HIV monobiotinylés (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylés (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixés au fond de la microplaque, en fonction de leur concentration, - la figure 5 est la représentation graphique donnant les résultats de DO du test ELISA direct du conjugué Fab' anti-Kallikréine monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond de la microplaque, en fonction de sa concentration, - la figure 6 est la représentation graphique donnant les résultats de DO du test ELISA direct du conjugué antigène gp160 réduit au DTT monobiotinylé (par de la biotine BMCC) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond d'une microplaque, en fonction de sa concentration, 46 - la figure 7 est la représentation graphique donnant les résultats de DO du test ELISA direct des conjugués antigènes de surface de l'hépatite B monobiotinylés (par de la biotine NHs) ou tétrabiotinylés (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixés au fond de la microplaque, en fonction de leur concentration, et - la figure 8 est la représentation graphique donnant les résultats de DO du test ELISA direct du conjugué anticorps anti-Salmonelle monobiotinylé (par de la biotine NHs) ou tétrabiotinylé (par un composé selon un mode de réalisation de l'invention), fixé au fond de la microplaque, en fonction de sa concentration. Les résultats mettent en évidence une nette amélioration du signal en utilisant la lo molécule polybiotinylée selon l'invention, malgré son encombrement. En particulier, pour une DO de 1,8, on peut observer les gains tels qu'indiqués dans le tableau 6 suivant : Tableau 6 Biotine Biotine Tétrabiotine Gain signal BMCC nNHs LMO 46 ng/ml NA 6 ng/ml x 8 Essai 1 LMO 6.0 ng/ml NA 0.4 ng/ml x 15 Essai 2 HIV 0.078 µg/ml NA x 10 Anticorps A DO = 1.895 HIV 0.08 µg/ml NA x 10 Anticorps B DO = 2.021 Kallikréine 0.287 µg/ml NA x 124 DO = 2.226 Salmonelle 0.012 µg/ml NA x 30 Fab' ELISA DO = 2.825 direct Salmonelle 0.226 µg/ml NA 0.101 µg/ml x 2.2 Fab' ELISA indirect Antigène x 2.5 DO = 2.813 au DTT Antigène Traut (1/4) Tétrabiotine NA 5µg/ml DO = 1.320 Les souches de Listeria innocua, Listeria ivanovii et Listeria welshimerii sont utilisées pures. Ces souches permettent de tester la spécificité puisqu'elles ne sont pas reconnues par l'anticorps couplé. Les quatre souches de Listeria monocytogenes sont testées en dilution et ont fait l'objet d'un dénombrement. Ces souches permettent de tester la sensibilité du test. Les 2 conjugués ont été ajustés à la concentration de 0,36µg/ml de Fab'. Pour utiliser le kit de la barrette LMO2, le conjugué initial a été retiré du puits X5. Ce puits a été rincé avec 600µ1 d'eau physiologique. Puis, après avoir retiré l'eau physiologique, 400µ1 soit du conjugué monobiotinylé, soit du conjugué tétrabiotinylé à tester ont été ajoutés. 500µl d'échantillon ( dilution de souches) ont été déposés dans le puits X0 et le test Vidas LMO2 a été lancé. Le test dure environ 80 minutes. Résultats Les résultats sont donnés dans le tableau 7 ci-dessous. Tableau 7 Souches et dénombrement Solutions mères Tétrabiotinylée I Monobiotinylée RFV* L.mono 4b ATCC 19 115 9957 9817 1.5.105 L.mono 4b ATCC 19 115 4350 2285 1.5.104 L.mono 4b ATCC 19 115 199 233 1.5.103 L.mono 3a ATCC 51 782 8517 6958 1.6.105 L.mono 3a ATCC 51 782 1612 829 1.6.104 L.mono 3a ATCC 51 782 160 78 1.6.103 L.mono 1/2c 83 09 024 9806 8779 2.1.105 L.mono 1/2c 83 09 024 2880 1472 2.1.104 L.mono 1/2c 83 09 024 309 151 2.1.103 L.mono 4c 83 09 031 2413 1427 8.4.104 L.mono 4c 83 09 031 143 82 8.4.103 L.mono 4c 83 09 031 19 10 8.4.102 L innocua 6a 83 09 035 7 9 L ivanovii 91 01 014 7 3 L welshimerii 94 09 074 10 6 * Relative Fluorescent Value 50 Les résultats dans le tableau ci-dessus montrent que l'utilisation d'un conjugué présentant un composé tétrabiotinylé selon un mode de réalisation de l'invention permet de doubler le signal, et donc d'augmenter la sensibilité du test. Parallèlement, son utilisation n'altère pas la spécificité puisque, dans ce cas, les signaux sont identiques. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) : X (G1/ AA1 ( Go n0 (1) dans laquelle - X est la biotine ou /(G2)n2 Y AA2 - Y est la biotine ou (G2)n2 Y /(G3)n3 Z AA3 ( G3)n3 Z - Z est la biotine ou G4) V n4 V AA4 biotine \ (G4)n4 - V est la biotine ou G5 / l n5 AA5 \'G5)n5 biotine - B est NH2 ou H, 52 - AA est un dérivé de molécule trifonctionnelle quand B est NH2 ou un dérivé de molécule difonctionnelle quand B est H, - AA1 à AA5 sont chacun indépendamment un dérivé de molécule trifonctionnelle, - Go à G5 sont chacun indépendamment un bras comprenant au moins une unité (-CH2-5 CH2-O), - no à n5 sont chacun indépendamment un nombre entier compris entre 1 et 8 et - T est un antiligand ou un groupement réactif pour la fixation à un antiligand, ledit antiligand étant susceptible de réagir avec un ligand, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : 10 (i) greffer no composés de formule W"o-Go-OH, dans laquelle W"o est un groupement protecteur des amines, no et Go étant tels que définis précédemment, à un composé de formule (II) : R (II) dans laquelle R est une résine préfonctionnalisée, W et Wo sont différents l'un de 15 l'autre et représentent un groupement protecteur des amines, W étant différent de W"o, et AA est tel que défini précédemment, pour obtenir un composé de formule (III) : W W"o-(Go' no (ii) coupler un composé de formule (IV) : W WI-A412\\ 20 OH (Iv) dans laquelle W1 et W'1 sont des groupements protecteurs des amines identiques ou différents l'un de l'autre et des groupements Wo et W"o, mais différents de W, et AA1 est tel que défini précédemment, avec le composé de formule (III) pour obtenir un composé de formule (V) : R (III)5AA1-( Go AA no W 1 R (V), (iii) greffer 2ni composés de formule W"1-Gi-OH, dans laquelle W"i est un groupement protecteur des amines, identique ou différent l'un de l'autre et des autres groupements protecteurs utilisés dans ce procédé, mais différents de W, G1 et ni étant tels que définis précédemment, au composé obtenu dans l'étape (ii) pour obtenir un composé de formule (VI) : W 1 rG W \\ 1 \AA1-( Go) AA (G 1 no l ni W 1 (iv) quand X de la formule (I) est la biotine, passer directement à l'étape (v) ; sinon, quand X de la formule (I) n'est pas la biotine, répéter les étapes (ii) et (iii) avec 2p-1 10 composés de formule (VII) : W p Wp AAp \OH et 2pnp fois le composé de formule W"p-Gp-OH , dans laquelle p est un nombre entier compris entre 2 et 5, et Wp, W'p, W"p sont des groupements protecteurs des amines identiques ou différents les uns des autres et des autres groupements protecteurs utilisés 15 dans ce procédé, mais différents de W, et AAp est une molécule trifonctionnelle, selon la séquence suivante : - 1 fois quand Y est la biotine, p étant alors égal à 2 - 2 fois quand Y n'est pas la biotine et Z est la biotine, p étant alors égal à 2 puis à 3, 20 - 3 fois quand Y et Z ne sont pas la biotine et V est la biotine, p étant alors égal à 2, 3 puis 4, et W W1 \ R 54 - 4 fois quand Y, Z et V ne sont pas la biotine, p étant alors égal à 2, 3, 4 puis 5, (v) déprotéger le composé ainsi obtenu au niveau du groupement W"1 ou W"p, p étant compris entre 2 et 5, et coupler avec de la biotine, (vi) déprotéger, au niveau du groupement W, le composé ainsi polybiotinylé et coupler avec un antiligand ou un groupement réactif pour la fixation à un antiligand (T) et (vii) couper le composé ainsi obtenu de la résine (R) pour obtenir un composé de formule (I). l0 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les substituants AA1 et AA2, le cas échéant AA3, AA4 et AA5, sont identiques et sont de préférence un dérivé de lysine. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les 15 substituants Go, G1, le cas échéant G2, G3, G4 et G5 sont identiques et sont de préférence de formule (-NH-CHz-CHz-O-CHz-CHz-O-CHz-CO-). 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les nombres entiers no, n1, le cas échéant n2, n3, n4 et n5, sont identiques et sont de 20 préférence égaux à 2 ou 3. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupement W est le méthoxytrityle. 25 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que W 1 et W' l sont identiques et, le cas échéant, W2 et W'2 sont identiques, W3 et W'3 sont identiques, W4 et W'4 sont identiques et W5 et W'5 sont identiques. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les groupements protecteurs 30 d'amine W1,W'1 et, le cas échéant, W2, W'2, W3, W'3,W4 et W'4,W5 et W'5 sont des groupements fluorénylméthoxycarbonyle. 8. Procédé l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substituant AA est un dérivé de lysine et B est NH2. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que X est ~(G2)n2 Y - AA2 \ (G2) n2 Y et Y est la biotine. 10. Composé de formule (I) : X ( G1 )n~ T /AA1 ` GD ) n0 AA \ G1 ) B nl dans laquelle - X est la biotine ou X (1) - AA2 Y Y - Y est la biotine ou - AA3 /(G3)n3 Z \G3/n3 Z - Z est la biotine ouAA4 V V 15 - V est la biotine ou / G5 n5 biotine AA5 \ (G5)ns biotine - B est NH2 ou H, - AA est un dérivé de molécule trifonctionnelle quand B est NH2 ou un dérivé de molécule difonctionnelle quand B est H, - AA1 à AA4 sont chacun indépendamment un dérivé de molécule trifonctionnelle, - Go à G5 sont chacun indépendamment un bras comprenant une unité (-CHz-CHz-O-), - no à n5sont chacun indépendamment un nombre entier compris entre 1 et 8 et - T est un groupement maléimide, un groupement acide carboxylique ou un antiligand. 11. Composé de formule (I) selon la revendication 10, caractérisé en ce que les substituants AA1 et AA2, le cas échéant AA3, AA4 et AA5, sont identiques et sont de préférence un dérivé de lysine. 12. Composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que les substituants Go, G1, le cas échéant G2, G3, G4 et G5, sont identiques et sont de préférence de formule (-NH-CHz-CHz-O-CHz-CHz-O-CHz-CO-). 20 13. Composé de formule (I) selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que les nombres entiers no, n1, le cas échéant n2, n3, n4 et n5, sont identiques et sont de préférence égaux à 2 ou 3. 14. Composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, 25 caractérisé en ce que X estAA2 /(G2)n2 Y \ (et Y est la biotine. 15. Composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, 5 caractérisé en ce que AA est un dérivé de lysine et B est NH2. 16. Composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, caractérisé en ce que l'antiligand est un fragment Fab'. 10 17. Composé de formule (I) selon la revendication 10, caractérisé en ce que : - X est AA2 /(G2)n2 Y \ (G2) n2 Y - Y est la biotine, - AA, AA1 et AA2 sont un dérivé de lysine, 15 - Go, Gi et G2 sont de formule û(NH-CHz-CHz-O-CHz-CHz-O-CHz-CO)-, - no, ni et n2 sont égaux à 2, - B est NH2 et - T est un antiligand, de préférence un fragment Fab'. 20 18. Utilisation des composés obtenus par le procédé tel que décrit dans les revendications 1 à 9 pour l'amplification de signal dans un test diagnostique. 19. Utilisation des composés tels que décrits dans les revendications 10 à 17 pour l'amplification de signal dans un test diagnostique. 57 25