Brevet FR2952070A1 — publié le 20110506

i L'invention concerne un procédé pour l'expansion et/ou la conservation de cellules, un kit pour mettre en oeuvre ce procédé ainsi qu'un appareil dans lequel ledit kit est destiné à être utilisé. L'invention s'applique à l'expansion et/ou la conservation ex vivo de cellules, notamment des cellules utilisées en thérapie cellulaire. L'avènement des cultures in vitro de cellules directement transplantables chez l'homme est à l'origine du développement de différents types de bioréacteurs io pour le conditionnement desdites cultures. L'un des paramètres important pour la culture ou la conservation de ces cellules est l'apport en oxygène. Plusieurs méthodes ont été développées pour apporter de l'oxygène aux cellules. Par exemple, il a été envisagé dans le document EP 1 935 974 un récipient de culture de type clos réalisé avec un film ayant une grande perméabilité à l'oxygène et au dioxyde de carbone. 20 Dans le document US 2008/012894, le milieu de culture est oxygéné à l'aide d'un oxygénateur à membrane avant d'être introduit dans un bioréacteur. Dans ces deux documents, le transfert de l'oxygène est réalisé au travers d'un film ou d'une membrane, ce qui limite le taux de transfert de l'oxygène vers le 25 liquide. En variante, le document US 2005/0032208 propose d'alimenter le bioréacteur avec un milieu de culture qui a été aéré préalablement. L'aération est réalisée à l'aide d'une bouteille munie d'un tube d'entrée d'air plongeant dans le milieu et 30 d'un tube de sortie d'air pour évacuer l'air de la bouteille. Ce système d'aération présente l'inconvénient de générer des bulles dans le milieu de culture, provoquant la formation de mousse. En outre, la bouteille doit être connectée au reste du système au moment de l'utilisation, ce qui génère 15 À une perte de temps, ne facilite pas l'utilisation du système et est risque de contamination. II a également été proposé dans le document US 6 190 913 de placer le bioréacteur sur un agitateur pour améliorer le transfert de l'oxygène contenu dans le bioréacteur. Cependant, les cellules disposées dans ce bioréacteur subissent un stress qui peut engendrer des dommages aux cellules. L'invention vise à résoudre ces inconvénients en fournissant un système simple io pour l'oxygénation d'un milieu de culture, qui peut être pré-connecté de fabrication au récipient de culture afin de former un système clos. De plus, l'oxygénation est réalisée directement sur le milieu de culture, à l'extérieur du récipient de culture, de sorte à ne pas perturber les cellules. 15 A cet effet, l'invention propose un procédé pour l'expansion et/ou la conservation de cellules à l'intérieur d'un récipient de culture contenant un milieu de culture, ledit procédé prévoyant de renouveler ledit milieu de culture au moyen d'un flux de milieu de culture dont au moins une partie provient d'un volume de milieu de culture contenu dans un récipient d'enrichissement en gaz 20 dudit milieu de culture, ledit récipient d'enrichissement contenant en outre un volume de gaz qui est séparé du volume de milieu de culture par une interface libre, le volume de gaz étant renouvelé au moyen d'un flux de gaz qui est introduit dans le récipient d'enrichissement directement dans le volume de gaz, l'écoulement dudit flux étant agencé pour permettre un échange gazeux entre 25 ledit volume de milieu de culture et ledit volume de gaz au niveau de leur interface. Selon un second aspect, l'invention vise un kit pour la mise en oeuvre du procédé selon le premier aspect de l'invention, le kit comprenant un récipient de 30 culture destiné à contenir des cellules dans un milieu de culture et un récipient d'enrichissement en gaz du milieu de culture, ledit récipient d'enrichissement présentant un orifice d'alimentation en milieu de culture à enrichir et un orifice de retrait du milieu de culture enrichi, ledit orifice de retrait étant en communication fluidique avec un orifice d'alimentation du récipient de culture, ledit récipient d'enrichissement présentant en outre un orifice d'alimentation et un orifice de retrait de gaz, lesdits orifices du récipient d'enrichissement étant disposés de sorte que ledit récipient puisse contenir un volume de milieu de culture dans lequel débouchent les orifices d'alimentation et de retrait dudit milieu de culture et un volume de gaz dans lequel débouchent les orifices d'alimentation et de retrait de gaz. Un troisième aspect de l'invention concerne un appareil dans lequel un kit selon le deuxième aspect de l'invention est destiné à être utilisé comprenant : io des moyens d'accrochage du récipient d'enrichissement en disposant le volume de gaz au dessus du volume de milieu de culture ; des moyens de réception du récipient de culture, de l'éventuel récipient de recueil et de l'éventuelle source de milieu de culture ; un dispositif de mise en circulation du gaz contenu dans le récipient 15 d'enrichissement, ledit dispositif comprenant une pompe dont la sortie est mise en communication avec l'orifice d'alimentation en gaz du récipient d'enrichissement et l'entrée est en communication avec une source de gaz, ledit dispositif permettant l'introduction de gaz dans le récipient d'enrichissement avec un écoulement agencé pour permettre un échange gazeux entre ledit 20 volume de milieu de culture et ledit volume de gaz au niveau de leur interface ; - un dispositif de mise en circulation de flux de milieu de culture entre le récipient d'enrichissement, le récipient de culture, l'éventuel récipient de recueil et l'éventuelle source de milieu de culture. 25 L'invention sera comprise grâce à la description qui suit. La figure 1 représente un schéma de principe du procédé selon l'invention. La figure 2 représente de façon schématique un kit destiné à l'expansion et/ou la 30 conservation des cellules selon l'invention. La figure 3 représente de façon schématique une vue de face de l'appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention avec un récipient d'enrichissement. 5 Les figures 4 et 5 représentent de façon schématique une vue en perspective de l'appareil de la figure 3 avec le plateau supérieur en position haute et en position basse, respectivement. L'invention concerne l'expansion et/ou la conservation de cellules, notamment des cellules humaines à usage thérapeutique. Pour permettre le développement des cellules, c'est-à-dire leur survie mais io aussi leur prolifération et/ou leur différentiation, les cellules sont incubées dans un récipient contenant un milieu de culture dans des conditions standards. Les conditions standards des cellules humaines sont par exemple une température d'environ 37°C dans une atmosphère régulée à 5 % de CO2 à un pH voisin de 7. Ces conditions standards sont obtenues en plaçant le récipient de culture dans 15 un appareil de type incubateur. Le milieu de culture contient les différents éléments nécessaires à la croissance des cellules. Le milieu de culture comprend notamment un milieu de base disponible dans le commerce tel que le milieu Dulbecco's Modified Eagle's 20 Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), RPMI1640, DMEM/F-10 ou DMEM/F12. Ce milieu de base peut contenir d'autres éléments tels que des facteurs de croissance. Tous les types de cellules exigent en plus du milieu de culture de l'oxygène pour 25 se développer. Le procédé de l'invention permet d'enrichir le milieu de culture en gaz et notamment en oxygène afin de fournir aux cellules cet élément essentiel à leur développement. Selon un premier aspect et en relation avec la figure 1, l'invention propose un 30 procédé pour l'expansion et/ou la conservation de cellules à l'intérieur d'un récipient de culture 1 contenant un milieu de culture au moyen d'un flux de milieu de culture. Les cellules sont mises en développement dans un flux de milieu de culture, c'est-à-dire que le milieu de culture est renouvelé au moyen d'un flux de milieu de culture. Le flux est continu ou discontinu. Par exemple, le milieu de culture est renouvelé à intervalles réguliers ou irréguliers. Les cellules sont soit des 5 cellules adhérentes, c'est-à-dire qu'elles adhèrent au support de culture, soit des cellules non adhérentes. Dans ce dernier cas, les cellules sont en suspension dans le milieu de culture. Pour les cultiver sous condition de flux, elles doivent être suffisamment lourdes pour ne pas être entraînées dans le flux de milieu de culture et/ou le flux doit être agencé de manière à ne pas les entraîner. i0 Au moins une partie du milieu de culture dans le récipient de culture 1 provient d'un volume de milieu de culture contenu dans un récipient d'enrichissement 7 en gaz du milieu de culture. 15 L'enrichissement en gaz est réalisé dans le récipient d'enrichissement 7 qui comprend un volume de gaz et un volume de milieu de culture, le gaz et le milieu de culture étant séparés par une interface libre au niveau de laquelle un échange gazeux est réalisé. 20 Le gaz provient d'une source de gaz telle qu'une bouteille d'oxygène (02) ou un mélange oxygène / dioxyde de carbone. En variante, la source de gaz est l'air ambiant ou l'air d'un incubateur lorsque les cellules sont cultivées dans un incubateur. 25 Le milieu de culture et le gaz sont par conséquent en contact direct l'un avec l'autre. Notamment, le récipient d'enrichissement 7 ne comprend pas de membrane poreuse ou de film semi-perméable séparant le gaz et le milieu de culture. L'absence de barrière entre les deux volumes de gaz et de milieu de culture facilite les échanges gazeux entre lesdits volumes. 30 Selon l'invention, le volume de gaz est renouvelé dans le récipient d'enrichissement 7 au moyen d'un flux de gaz, c'est-à-dire que le gaz circule à l'intérieur du récipient d'enrichissement 7. Le volume de gaz se déplace au dessus du volume de milieu de culture. i0 20 6 Le flux de gaz est introduit dans le récipient d'enrichissement 7 directement dans le volume de gaz. Le gaz n'est pas introduit directement dans le volume de milieu de culture pour éviter la formation de bulles de gaz dans le milieu de culture. En effet, la présence de certaines substances dans le milieu de culture comme l'albumine a tendance à faire mousser le milieu de culture lorsqu'il est agité ou mis en barbotage. Le flux de gaz réalisé en dehors du milieu de culture évite donc la formation de mousse dans le milieu de culture lors de son enrichissement en gaz. L'échange de gaz est notamment réalisé par diffusion du gaz dans le milieu de is culture le long de l'interface libre entre le gaz et le milieu de culture. Selon l'invention, le flux de gaz est agencé pour améliorer l'échange gazeux entre le volume de milieu de culture et le volume de gaz, et notamment pour améliorer la diffusion de gaz dans le volume de milieu de culture. Pour ce faire le flux de gaz est agencé pour que la pression dans le récipient d'enrichissement 7 soit supérieure à la pression ambiante. Le flux de gaz est introduit de façon forcée et mis en circulation dans le récipient 25 d'enrichissement 7 le long d'un chemin d'écoulement, par exemple au moyen d'une pompe. Le gaz introduit est alors sous pression. L'échange gazeux est également amélioré en alimentant le récipient d'enrichissement 7 avec un flux de milieu de culture adapté, par exemple au 30 moyen d'une pompe. Cette pompe permet notamment d'isoler les cellules en culture de la pression présente dans le récipient d'enrichissement. Ainsi, les cellules demeurent à pression ambiante. 7 Selon une variante, le flux de gaz présente un sens d'écoulement qui est opposé à celui du flux de milieu de culture. Sous certaines conditions, ces flux opposés ou contraires permettent une meilleure diffusion de gaz dans le milieu de culture. La pression du gaz à l'intérieur du récipient d'enrichissement 7 est supérieure à la pression ambiante. Cette pression est provoquée par exemple par l'introduction sous pression du gaz à l'intérieur du récipient d'enrichissement 7 et la création d'une perte de charge à la sortie dudit récipient. i0 La perte de charge à la sortie du récipient d'enrichissement 7 est créée par le passage du gaz dans un obstacle tel qu'un rétrécissement et/ou une restriction de section tel qu'un filtre poreux F. 15 Le flux de gaz s'écoule dans le récipient d'enrichissement 7 dans un chemin d'écoulement présentant une partie d'alimentation en gaz du récipient et une partie de retrait en gaz du récipient. Pour mettre en pression le volume de gaz dans le récipient d'enrichissement 7, 20 le gaz est introduit sous pression à l'intérieur du récipient 7 par ladite partie d'alimentation, et la partie de retrait présente une perte de charge qui est agencée pour maintenir une pression supérieure à la pression ambiante dans le récipient d'enrichissement 7. 25 La perte de charge de la partie de retrait doit être suffisamment importante et dépend de la pression voulue dans le récipient d'enrichissement. Par exemple, un rétrécissement important de la section au niveau de la partie de retrait permet d'imposer une pression de gaz dans le récipient d'enrichissement 7 supérieure à la pression de gaz ambiante. Pour ce faire, la pression de gaz au 30 niveau de la partie d'alimentation doit être suffisamment importante. De façon plus concise, plus la perte de charge est importante, plus la pression dans le récipient d'enrichissement 7 est importante, dans la limite de pression de la pompe et de non explosion dudit récipient.5 8 Selon une réalisation, le flux de milieu de culture alimentant le récipient d'enrichissement 7 provient au moins en partie du récipient de culture 1. Dans cette réalisation, le milieu de culture du récipient de culture 1, dont l'oxygène a été utilisé par les cellules en développement, est recyclé dans le récipient d'enrichissement 7 pour être à nouveau enrichi en gaz. Cette étape de remise en circulation permet de réduire la consommation de milieu de culture. Selon une autre réalisation, le flux de milieu de culture provient au moins en io partie d'une source de milieu de culture frais 20, c'est-à-dire d'un milieu de culture qui n'a pas encore été utilisé. Ces deux réalisations peuvent être combinées pour alimenter le récipient d'enrichissement 7 en partie de milieu de culture provenant du récipient de 15 culture 1 et en partie de milieu de culture frais. Les cellules du récipient de culture 1 sont alors mises en expansion et/ou conservées dans un milieu partiellement frais et enrichi en gaz et partiellement recyclé leur fournissant les éléments nutritifs et l'oxygène suffisants pour leur développement, tout en réduisant les déchets produits par les cellules et la consommation de milieu 20 frais. Lorsque le flux de milieu de culture n'est pas recyclé, il est retiré du récipient de culture pour être stocké, notamment dans un récipient de recueil 23 destiné à être jeté. Le récipient de culture 1 est destiné à contenir des cellules dans un milieu de culture. II peut être solide ou rigide, en particulier sous forme d'une poche formée par exemple par assemblage de deux feuilles souples soudées sur leur périphérie de sorte à former un volume intérieur variable. Le récipient de culture 1 illustré sur la figure 2 présente un orifice 2 d'alimentation en milieu de culture et un orifice 3 de retrait du milieu de culture. 25 30 9 Les orifices 2,3 d'alimentation et de retrait du récipient de culture 1 sont par exemple des portions de tubulures. Pour améliorer la circulation du milieu de culture dans le récipient de culture 1, le récipient comprend au moins un déflecteur 4 disposé sur le chemin d'écoulement direct entre l'orifice 2 d'alimentation et l'orifice 3 de retrait du milieu de culture dudit récipient de culture. Sur la figure 2, le récipient de culture 1, nommée ci-après poche de culture, io contient un déflecteur 4 réalisé par une soudure s'étendant à partir d'un bord 5 de la poche jusqu'à proximité du bord opposé 6, laissant un passage pour la circulation du milieu de culture. Le bord 5 à partir duquel la soudure s'étend comprend les orifices 2,3 d'alimentation et de retrait du milieu de culture, la soudure étant disposée entre les deux orifices. La soudure est substantiellement 15 parallèle aux deux autres bords de la poche. En particulier, les soudures périphériques de la poche de culture 1 sont arrondies de sorte à faciliter l'écoulement du milieu dans la poche sans créer de turbulences. 20 Le récipient d'enrichissement 7 peut être sous forme rigide ou semi-rigide. Selon la figure 2, il se présente sous la forme d'une enveloppe souple délimitant un volume variable. Cette enveloppe, ci après nommée poche d'enrichissement 7, est formée par l'assemblage par exemple sur leur périphérie de deux feuilles 25 souples de sorte à former un volume intérieur variable. Lorsque, selon le procédé de l'invention, la pression à l'intérieur de la poche d'enrichissement 7 est supérieure à la pression ambiante, la poche se gonfle. Le récipient d'enrichissement 7 présente un orifice 8 d'alimentation en milieu de 30 culture à enrichir et un orifice 9 de retrait de milieu de culture enrichi. Le récipient 7 comprend en outre un orifice 10 d'alimentation et un orifice 11 de retrait de gaz. Lesdits orifices 8,9,10,11 du récipient d'enrichissement 7 sont disposés de sorte que ledit récipient d'enrichissement puisse contenir un volume de milieu de culture dans lequel débouchent les orifices 8,9 d'alimentation et de 2952070 i0 retrait du milieu de culture et un volume de gaz dans lequel débouchent les orifices 10,11 d'alimentation et de retrait de gaz. Les orifices 8,9,10,11 de la poche d'enrichissement 7 se présentent notamment 5 sous la forme de portion de tubulures qui débouchent dans le volume intérieur variable de ladite poche. Sur la figure 2, les orifices 8,10 d'alimentation en milieu de culture et en gaz sont disposés sur un côté 12 du récipient d'enrichissement et les orifices de retrait io 9,11 du milieu et du gaz sont disposés sur le côté opposé 13 dudit récipient 7. En outre, les orifices 10,11 d'alimentation et de retrait en gaz sont disposés au dessus des orifices 8,9 d'alimentation et de retrait du milieu de culture. 15 Cette disposition particulière permet de créer un flux de gaz et un flux de milieu de culture qui s'écoule dans le même sens. En outre, le récipient d'enrichissement 7 est équipé d'un moyen de suspension permettant la disposition dudit récipient avec le volume de gaz au dessus du 20 volume de milieu de culture. Selon la figure 2, la poche 7 est munie de deux trous 14,15 sur le côté 16 perpendiculaire aux côtés 12,13 contenant les orifices 8,9,10,11 et situé à proximité des orifices 10,11 d'alimentation et de retrait en gaz. Ces trous 25 permettent de la suspendre dans le plan vertical, par exemple à l'aide de crochets. Une fois suspendue dans le plan vertical, les orifices 10,11 d'alimentation et de retrait en gaz sont placés au dessus des orifices 8,9 d'alimentation et de retrait en milieu de culture. Avec la poche d'enrichissement 7 dans cette position, le risque de voir le milieu de culture s'échapper par un des 30 orifices 10,11 de gaz est réduit. Les récipients 1,7 de culture et d'enrichissement sont notamment réalisés en éthylène acétate de vinyle. Ils sont stérilisables par exemple par rayonnement bêta ou gamma. 11 Selon l'invention et comme illustré sur la figure 2, le kit 17 comprend un récipient de culture 1 et un récipient d'enrichissement 7 dont l'orifice 9 de retrait en milieu enrichi est en communication fluidique avec l'orifice 2 d'alimentation en milieu de s culture du récipient de culture 1. Notamment, l'orifice 9 de retrait du milieu du récipient d'enrichissement est relié à l'orifice 2 d'alimentation du milieu du récipient de culture par l'intermédiaire d'une première tubulure 18. En outre, le kit 17 comprend un moyen de mise en communication fluidique de l'orifice 8 d'alimentation en milieu de culture du récipient d'enrichissement 7 avec une source de milieu de culture frais 20. La source de milieu frais 20 peut être un flacon ou une poche de milieu de culture. 15 Notamment, l'orifice 8 d'alimentation en milieu de culture du récipient d'enrichissement 7 est en communication fluidique avec une source de milieu frais 20 par l'intermédiaire d'une deuxième tubulure 19 connectée directement à une source de milieu frais ou destinée à être connectée à une source de milieu 20 frais. Dans ce dernier cas, le moyen de mise en communication fluidique du récipient d'enrichissement 7 avec la source de milieu frais 20 comprend un moyen de connexion à la source tel qu'un perforateur 21. Par exemple, l'extrémité de la deuxième tubulure 19 est pourvue d'un perforateur 21 destiné à s'engager dans l'orifice d'entrée 22 d'une poche 20 contenant un milieu frais. La connexion est réalisée sous hotte aspirante pour éviter toute contamination. L'orifice de retrait 3 du récipient de culture 1 est en communication fluidique avec l'orifice d'alimentation d'un récipient de recueil 23 destiné à recueillir le milieu usagé provenant du récipient de culture 3, notamment par l'intermédiaire d'une troisième tubulure 24. i0 25 30 15 12 Avantageusement, le récipient de recueil 23 est sous forme d'une poche de recueil formée par exemple par assemblage de deux feuilles souples définissant un volume variable. Le récipient de recueil 23 est munie d'au moins un orifice d'alimentation. Pour permettre la recirculation ou le recyclage du milieu de culture au travers du récipient d'enrichissement 7 en gaz, l'orifice 3 de retrait du milieu de culture du récipient de culture 1 est en communication fluidique avec l'orifice 8 d'alimentation en milieu de culture du récipient d'enrichissement 7. Selon la figure 2, une quatrième tubulure 25 est branchée entre la deuxième et la troisième tubulure 19,24 par l'intermédiaire de deux connecteurs 26,27 trois voies de type Y ou T. Ainsi, la communication fluidique entre les récipients 1,7,23,20 est réalisée au moyen de tubulures 18,19,24,25 connectées aux orifices des différents récipients et connectées entre elles. 20 Selon une réalisation particulière, les tubulures comportent des portions de tubulures destinées à être disposées dans une tête de pompe d'une pompe péristaltique. En particulier, la dureté de ces portions destinées à être placées dans la tête de pompe est inférieure à celle des autres portions de la tubulure, par exemple une dureté comprise entre 60 et 70 shore A, notamment 65 shore 25 A. Sur la figure 2, la première tubulure 18 entre la poche de culture 1 et la poche d'enrichissement 7, la deuxième tubulure 19 entre la poche d'enrichissement 7 et un connecteur 27 avec la quatrième tubulure 25, la troisième tubulure 24 30 entre la poche de culture 1 et l'autre connecteur 26 avec la quatrième tubulure 25 et entre la poche de recueil 23 et cet autre connecteur 26 comprennent des portions de tubulures destinées à être insérées dans une tête de pompe. 13 Le kit 17 comprend en outre un ou plusieurs moyens de contrôle sélectif d'ouverture / fermeture de l'écoulement des fluides dans les tubulures tels que des clamps 28. Pour permettre l'établissement d'un flux de gaz dans le récipient d'enrichissement 7 en gaz, l'orifice 10 d'alimentation en gaz est en communication fluidique ou destiné à être en communication fluidique avec une source de gaz sous pression par l'intermédiaire d'une cinquième tubulure 29. La source de gaz sous pression est par exemple l'air ambiant pompé ou une bouteille de gaz pressurisée. Le gaz peut être l'oxygène pur ou un mélange de gaz tel qu'un mélange d'oxygène et de dioxyde de carbone. Plus précisément, l'une des extrémités de la cinquième tubulure 29 est connectée à l'orifice 10 d'alimentation en gaz du récipient d'enrichissement et l'autre extrémité est connectée ou destinée à être connecté à une source de gaz sous pression. Par exemple, cette autre extrémité comprend un connecteur Luer 30. Notamment, le connecteur lueur 30 est destiné à être connecté à l'orifice de sortie d'une pompe à membrane afin d'introduire du gaz sous pression à l'intérieur du récipient d'enrichissement 7. Eventuellement, un moyen de filtration du flux de gaz tel qu'un filtre poreux F est arrangé à la sortie de ladite pompe de sorte à filtrer le gaz entrant dans le kit. Ce filtre est avantageusement un filtre stérilisant comprenant une membrane de porosité inférieure à 2 pm, notamment 1,2 pm, et plus particulièrement 0,22 pm. Dans ce cas, l'autre extrémité de la cinquième tubulure 29 est connectée ou destinée à être connectée à la sortie du filtre F. L'orifice 11 de retrait en gaz du récipient d'enrichissement 7 est connecté à l'extrémité d'une sixième tubulure 31. Cette sixième tubulure débouche dans l'air ambiant ou dans un récipient de recueil du gaz et son extrémité libre est connectée ou destinée à être connectée à un moyen de filtration F du flux de gaz tel qu'un filtre ou un évent poreux 32. Par exemple, l'extrémité de la sixième tubulure 31 est pourvue d'un filtre F. Notamment, le filtre est un filtre stérilisant 14 ayant une porosité inférieure à 2 pm, en particulier d'environ 1,2 pm. Il peut être réalisé en nylon. Ce filtre 32 possède une double fonction. D'abord, il empêche les contaminants d'entrer dans le kit, ensuite il constitue un moyen de créer une perte de charge à la sortie du récipient d'enrichissement 7. Selon une réalisation, le kit 17 comprend en outre des moyens d'accès à l'intérieur du kit. Notamment, le kit comprend un premier robinet trois voies 33 à proximité de l'orifice 2 d'alimentation en milieu du récipient de culture 1 destiné à introduire les cellules dans ledit récipient de culture. Le kit comprend en outre un deuxième robinet trois voies 34 à proximité de l'orifice 3 de retrait de milieu du récipient de culture 1 destiné à retirer les 15 cellules du récipient de culture. Ces robinets trois voies 33,34 comprennent en particulier un moyen de connexion à une seringue. 20 Le kit peut comprendre d'autres moyens d'accès pour effectuer par exemple un échantillonnage en cours de culture. Le kit est avantageusement à usage unique. Destiné à un usage clinique, il doit être stérilisé. En exemple, le kit est stérilisé et emballé dans un emballage 25 stérile. Dans un exemple particulier, l'emballage stérile comprend le kit constitué de la poche d'enrichissement 7, de la poche de culture 1 et éventuellement de la poche de recueil 23, ces poches étant pré-connectées entre elles au moyen de 30 tubulures. Dans un autre exemple, le kit emballé comprend en outre un évent placé à l'extrémité de la sixième tubulure 31. 20 15 Le kit est destiné à être utilisé sur un appareil mettant en oeuvre le procédé selon l'invention. Pour cela et en relation avec les figures 3 à 5, l'appareil 35 comprend des moyens d'accrochage du récipient d'enrichissement 7 en disposant le volume de gaz au dessus du volume de milieu de culture. Le volume de milieu est aussi maintenu en dessous des orifices d'alimentation 10 et de retrait 11 en gaz. Ces moyens se présentent par exemple sous la forme d'un ou plusieurs to crochets de suspension 36 sur lesquels on vient suspendre la poche d'enrichissement 7 par l'intermédiaire des trous 14, 15 prévus à cet effet. La poche d'enrichissement 7 est alors placée dans le plan vertical, les orifices 8,9 d'alimentation et de retrait du milieu de culture disposé sur des côtés opposés débouchent dans le volume de milieu de culture, et les orifices 10,11 15 d'alimentation et de retrait en gaz débouchent dans le volume de gaz. L'appareil comprend en outre des moyens de réception du récipient de culture 1, de l'éventuel récipient de recueil 23 et de l'éventuelle source de milieu de culture 20. Notamment, les moyens de réception comprennent un plateau inférieur 37 et un plateau supérieur 38. Le plateau inférieur 37 est destiné à recevoir le récipient de culture 1 et le plateau supérieur 38 la source de milieu de culture 20 et le récipient de recueil 23. 25 Les deux plateaux 37,38 sont superposés pour un gain de place maximum, l'appareil étant destiné à être placé dans un incubateur. Selon une réalisation particulière, le plateau supérieur 38 comprend deux 30 compartiments 39,40 pour chacun des récipients de recueil 23 et de milieu de culture 20. Afin de faciliter la mise en place du kit sur l'appareil et pour des raisons ergonomiques, le plateau supérieur 38 est déplaçable par rapport au plateau 16 inférieur 37 entre une position haute et une position basse, comme illustré sur les figures 4 et 5 respectivement. Par exemple, l'appareil est muni de deux ressorts pneumatiques 41,42 reliés aux plateaux 37,38 pour permettre le déplacement du plateau supérieur 38 à une altitude inférieure. Selon l'invention, l'appareil 35 comprend en outre un dispositif de mise en circulation de gaz dans le récipient d'enrichissement 7. Ledit dispositif comprend une pompe (non représentée) dont la sortie 44 est mise en communication fluidique avec l'orifice d'alimentation 10 en gaz du récipient d'enrichissement 7 et l'entrée 43 est en communication fluidique avec une source de gaz. La sortie 44 de la pompe est mise en communication par l'intermédiaire de la cinquième tubulure 29 avec l'orifice d'alimentation 10 en gaz du récipient d'enrichissement 7. Le dispositif de mise en circulation de gaz permet l'introduction de gaz dans le récipient d'enrichissement 7 avec un écoulement agencé pour permettre un échange gazeux entre let volume de milieu de culture et le volume de gaz au niveau de leur interface libre. En particulier, la pompe est une pompe à membrane. La pompe à membrane présente l'avantage d'adapter le débit de gaz à la pression interne de la poche d'enrichissement 7. En effet, pour ces pompes le débit est inversement proportionnel à la pression. Ainsi, lorsque la pression à l'intérieur de la poche d'enrichissement 7 dépasse un certain seuil, la pompe ne débite plus et protège donc le système d'une surpression. En outre, la quantité de gaz ou d'oxygène dissous dans le milieu dépend directement de la pression exercée sur l'interface libre de contact entre gaz et milieu de culture dans le récipient d'enrichissement 7. Le choix du ratio débit/pression de la pompe, du ratio volume de gaz/volume de milieu et des 17 pertes de charge en sortie du récipient d'enrichissement 7 permet de régler la quantité de gaz dissous dans le milieu de culture pour un kit donné. Selon une réalisation particulière, la sortie 44 de la pompe est munie d'un moyen de filtration F du flux de gaz. Avantageusement, le moyen de filtration F est un filtre 46 stérilisant ayant une porosité inférieure à 2 pm, notamment d'environ 1,2 pm. Ce filtre permet d'éviter l'introduction de contaminants dans le kit . En outre, ce filtre stérilisant de sortie sécurise l'opérateur. io L'entrée 43 de la pompe est reliée à une source de gaz telle qu'une bouteille de gaz. De façon avantageuse, la source de gaz est l'air ambiant et l'entrée 43 de la pompe est munie d'un moyen de filtration F du flux de gaz permettant d'éviter l'introduction de particules dans la pompe puis dans le kit. Par exemple, le moyen de filtration est un filtre 45 stérilisant de porosité inférieure à 2 pm, 15 notamment d'environ 1,2 pm. Ainsi, la pompe met sous pression le gaz et l'introduit par la cinquième tubulure 29 dans le récipient d'enrichissement 7 via l'orifice d'alimentation 10 en gaz subissant une première perte de charge. Le flux de gaz traverse le récipient 20 d'enrichissement 7 et sort du récipient par l'orifice de retrait 11 de gaz. Le gaz s'écoule ensuite le long de la sixième tubulure 31 terminée par un filtre poreux 32 qui provoque un rétrécissement soudain et une deuxième perte de charge. Par cette dernière perte de charge, le volume de gaz à l'intérieur du récipient d'enrichissement 7 est mis en surpression. 25 L'appareil 35 comprend en outre un dispositif de mise en circulation de flux de milieu de culture entre le récipient d'enrichissement 7, le récipient de culture 1, l'éventuel récipient de recueil 23 et l'éventuelle source de milieu de culture 20. 30 Ce dispositif de mise en circulation comprend un ensemble de quatre pompes 47,48,49,50 telles que des pompes péristaltiques comprenant chacune une tête de pompe destinée à recevoir une portion de première 18 et de la deuxième 19 tubulure et deux portions de la troisième tubulure 24, en amont et en aval du branchement 26 avec la quatrième tubulure 25, respectivement. 18 L'appareil comprend en outre une unité de contrôle et/ou de régulation du dispositif de mise en circulation du gaz et du dispositif de mise en circulation de flux de milieu de culture. L'unité de contrôle et/ou de régulation utilise des mesures pour adapter les commandes des pompes. Des pesons sont utilisés pour déterminer le poids d'au moins un récipient. io Notamment, chaque moyen de réception et le moyen d'accrochage sont pourvus d'un peson de sorte que le poids de chaque récipient peut être déterminé à chaque instant. Alternativement, des moyens de mesure des débits sont utilisés pour mesurer 15 les débits d'alimentation en milieu et de retrait en milieu. En variante, des moyens de détection de niveau et/ou pression sont utilisés pour mesurer la quantité de milieu présente dans les récipients d'enrichissement 7 et de culture 1. 20 Ces mesures peuvent permettre de détecter la présence d'éventuelles fuites de milieu par l'intermédiaire de l'unité de contrôle et/ou de régulation via un algorithme de surveillance du bilan de matière entre les récipients. Un algorithme de régulation asservit le volume présent dans les récipients et 25 notamment adapte le débit des quatre pompes d'échange de milieu pour conserver un volume et un échange constant. En outre, cette unité de contrôle et/ou de régulation, associée à la disposition dans le plan vertical du récipient d'enrichissement, permet d'éviter la sortie du 30 milieu de culture par un des orifices d'alimentation 10 et de retrait 11 en gaz du récipient d'enrichissement 7.5 19 Un dispositif de refroidissement de l'appareil, par exemple avec circulation d'un fluide caloriporteur, peut être prévu pour éviter de perturber l'environnement thermique des cellules. s L'appareil est prévu pour pouvoir être placé dans un incubateur permettant de réguler la température et la concentration en oxygène et en dioxyde de carbone de l'environnement du kit. En variante, l'appareil comprend en outre des moyens internes de régulation de 10 la température et des concentrations en gaz. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire de placer l'appareil dans un incubateur. L'appareil est prévu pour fonctionner sans l'aide et la surveillance d'un opérateur. Une interface entre l'opérateur et le logiciel embarqué dans l'appareil 1s est prévue. Cette interface peut être intégrée à l'appareil ou préférentiellement désolidarisée de l'appareil de manière à pouvoir le contrôler depuis l'extérieur de l'incubateur et/ou de la zone de culture cellulaire. De manière avantageuse, cette interface peut être un superviseur capable de fonctions de haut niveau telles que l'affichage de données, la constitution d'un dossier de traçabilité ou 20 des fonctions liées à la maintenance de l'appareil. L'appareil est prévu pour être en mesure d'alerter en cas de défaillance. Cette alerte peut être émise sur un réseau adapté, par exemple par l'intermédiaire d'un contact sec. On décrit maintenant un exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention à l'aide du kit de la figure 2 et de l'appareil tel que décrit ci-dessus. L'appareil est mis en route et connecté à un ordinateur faisant office de 30 superviseur. Le kit de la figure 2 est désemballé de son emballage stérile sous une hotte aspirante afin de maintenir la stérilité du système. Tous les clamps et les robinets trois voies sont fermés. Une poche de milieu frais 20 est connectée au 25 20 kit via le perforateur 21. Puis les cellules à cultiver sont insérées avec un peu de milieu de culture dans la poche de culture 1 par l'intermédiaire d'une seringue grâce au robinet trois voies 33 placé à proximité de l'orifice d'alimentation 2 en milieu de la poche de culture 1. On referme le robinet 33. On connecte ensuite le filtre à air sur le luer mâle 30 au niveau de l'orifice d'alimentation 10 en gaz de la poche d'enrichissement 7. Toutes ces étapes sont réalisées sous hotte aspirante. Le kit constitue maintenant un système clos et il peut être sorti de la hotte sans risquer de io contaminer les cellules. Le kit est disposé sur l'appareil en commençant par la poche de milieu frais 20 sur le plateau supérieur 38 et la poche de culture 1 sur le plateau inférieur 37. On positionne enfin la poche de recueil 23 sur le plateau supérieur 38 et on 15 suspend la poche d'enrichissement 7 en insérant les crochets 36 de l'appareil dans les trous 14,15 de la poche. Les première, deuxième, et troisième tubulures 18,19,24 sont insérées dans les têtes de pompe correspondantes des quatre pompes péristaltiques 47,48,49,50 afin d'assurer la circulation du milieu dans le kit. 20 Pour la circulation de l'air, on positionne le filtre 46 sur l'appareil afin de le relier à la pompe à membrane intégrée dans l'appareil. Tous les clamps sont ouverts et la circulation de milieu de culture peut 25 commencer. L'appareil est déconnecté de l'ordinateur et est placé dans un incubateur. Il fonctionne maintenant de façon autonome selon quatre modes principaux : Mode remplissage 30 Dans le mode remplissage, la poche de culture 1 est remplie à un volume nominal, par exemple d'environ 200 ml, de milieu de culture et la poche d'enrichissement 7 remplie à un volume nominal, par exemple d'environ 100 ml, de milieu de culture. Lorsque les poches 1, 7 ont atteint le volume prédéterminé, l'appareil passe alors en mode alimentation. 21 Mode alimentation Dans ce mode, le récipient de culture 1 est alimenté en milieu frais provenant de la poche de milieu frais 20 via la poche d'enrichissement 7. Ce mode continue jusqu'à ce que le volume de milieu frais soit insuffisant ou si on passe manuellement au mode suivant. Le milieu de culture, après passage dans la poche de culture 1, est envoyé dans la poche de recueil 23. Les cellules dans la poche de cultures 1 sont soit adhérentes, soit en suspension. Dans ce cas, elles doivent être suffisamment lourdes pour être maintenues dans le récipient et ne pas être entraînées par la circulation du milieu de culture. Le débit du milieu de culture est fixé de sorte, par exemple, à alimenter la poche de culture 1 en milieu frais pendant par exemple environ 24 heures. Notamment il est inférieur à 1 ml/min. Ce débit est fixé de sorte à garantir la bonne conservation / expansion des cellules et à maintenir un coût en milieu de culture correct. Mode recyclage Dans ce mode, le milieu usagé, c'est-à-dire provenant de la poche de culture 1, est recyclé via la poche d'enrichissement 7. La recirculation ou le recyclage est réalisé pendant par exemple 72 heures. Dans ce mode, le débit de milieu peut être supérieur à 1 ml/min, par exemple de l'ordre de 6 ml/min. Pour effectuer un échantillonnage en cours de culture, l'appareil est muni d'un 25 bouton pause. En faisant varier les débits des pompes, il est possible de combiner le mode alimentation et le mode recyclage. Les volumes de milieu rebuté et de milieu frais sont alors régulés afin de maintenir le système stable. Mode vidange. Dans ce mode, la poche de milieu de culture 1 est vidée par exemple de 120 ml de milieu. Les cellules sont récupérées à l'aide d'une seringue connectée au robinet trois voies 34 situé à proximité de l'orifice de retrait 3 du milieu de la 30 22 poche de culture 1. Pour ce faire, la poche de culture 1 est détachée du reste de kit en soudant en dessous des robinets trois voies 34 et les cellules sont récupérées sous hotte aspirante. L'appareil est programmé pour passer automatiquement d'un mode à un autre sans intervention de l'utilisateur. L'appareil est donc totalement autonome. Il est évident qu'à tout moment, l'utilisateur peut intervenir pour changer manuellement de mode. REVENDICATIONS1. Procédé pour l'expansion et/ou la conservation de cellules à l'intérieur d'un récipient de culture (1) contenant un milieu de culture, ledit procédé prévoyant s de renouveler ledit milieu de culture au moyen d'un flux de milieu de culture dont au moins une partie provient d'un volume de milieu de culture contenu dans un récipient d'enrichissement (7) en gaz dudit milieu de culture, ledit récipient d'enrichissement (7) contenant en outre un volume de gaz qui est séparé du volume de milieu de culture par une interface libre, ledit procédé étant io caractérisé en ce que le volume de gaz est renouvelé au moyen d'un flux de gaz qui est introduit dans le récipient d'enrichissement (7) directement dans le volume de gaz, l'écoulement dudit flux étant agencé pour permettre un échange gazeux entre ledit volume de milieu de culture et ledit volume de gaz au niveau de leur interface. 15 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'écoulement du flux de gaz est agencé pour que la pression du volume de gaz soit supérieure à la pression ambiante. 20 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le flux de gaz s'écoule dans un chemin présentant une partie d'alimentation en gaz du récipient (7) et une partie de retrait de gaz dudit récipient, le gaz étant introduit sous pression à l'intérieur du récipient (7) par ladite partie d'alimentation, et la partie de retrait présentant une perte de charge qui est agencée pour maintenir 25 une pression supérieure à la pression ambiante dans le récipient d'enrichissement (7). 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le flux de gaz est mis en circulation dans la partie d'alimentation au moyen d'au moins une pompe 30 ou d'un réservoir sous pression. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le récipient d'enrichissement (7) est alimenté avec un flux de milieu de culture. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le flux de milieu de culture alimentant le récipient d'enrichissement (7) provient au moins en partie du récipient de culture et/ou d'une source de milieu de culture frais. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'un flux de milieu de culture est retiré du récipient de culture (1) pour être stocké. io 8. Kit (17) pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant un récipient de culture (1) destiné à contenir des cellules dans un milieu de culture et un récipient d'enrichissement (7) en gaz du milieu de culture, ledit récipient d'enrichissement (7) présentant un orifice (8) d'alimentation en milieu de culture à enrichir et un orifice (9) de retrait du 15 milieu de culture enrichi, ledit orifice (9) de retrait étant en communication fluidique avec un orifice (2) d'alimentation du récipient de culture (1), ledit récipient d'enrichissement (7) présentant en outre un orifice (10) d'alimentation et un orifice (11) de retrait de gaz, lesdits orifices (8,9,10,11) du récipient d'enrichissement (7) étant disposés de sorte que ledit récipient (7) puisse 20 contenir un volume de milieu de culture dans lequel débouchent les orifices (8,9) d'alimentation et de retrait dudit milieu de culture et un volume de gaz dans lequel débouchent les orifices (10,11) d'alimentation et de retrait de gaz. 9. Kit selon la revendication 8, caractérisé en ce que le récipient 25 d'enrichissement (7) comprend une enveloppe souple délimitant un volume intérieur variable dans lequel débouchent les orifices (8,9,10,11). 10. Kit selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que le récipient d'enrichissement (7) est équipé d'un moyen de suspension (14,15) permettant la 30 disposition dudit récipient avec le volume de gaz au dessus du volume de milieu de culture. 11. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que les orifices d'alimentation (8) en milieu de culture et de retrait (11) de gaz sont5 25 disposés sur un côté (12) du récipient d'enrichissement, les orifices d'alimentation (10) en gaz et de retrait (9) du milieu de culture étant disposés sur le côté (13) opposé dudit récipient d'enrichissement (7). 12. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que le récipient de culture (1) comprend au moins un déflecteur (4) disposé sur le chemin d'écoulement direct entre l'orifice (2) d'alimentation et un orifice (3) de retrait du milieu de culture dudit récipient de culture. io 13. Appareil (35) dans lequel un kit (17) selon l'une quelconque des revendications 8 à 12 est destiné à être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant : - des moyens d'accrochage (36) du récipient d'enrichissement (7) en disposant le volume de gaz au dessus du volume de milieu de culture ; 15 des moyens de réception (37,38) du récipient de culture (1), de l'éventuel récipient de recueil (23) et de l'éventuelle source de milieu de culture (33) ; un dispositif de mise en circulation du gaz contenu dans le récipient d'enrichissement (7), ledit dispositif comprenant une pompe dont la sortie 20 (44) est mise en communication avec l'orifice (10) d'alimentation en gaz du récipient d'enrichissement (7) et l'entrée (43) est en communication avec une source de gaz, ledit dispositif permettant l'introduction de gaz dans le récipient d'enrichissement (7) avec un écoulement agencé pour permettre un échange gazeux entre ledit volume de milieu de culture et 25 ledit volume de gaz au niveau de leur interface ; un dispositif de mise en circulation de flux de milieu de culture entre le récipient d'enrichissement (7), le récipient de culture (1), l'éventuel récipient de recueil (23) et l'éventuelle source de milieu de culture (20). 30 14. Appareil selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une unité de contrôle et/ou de régulation du dispositif de mise en circulation du gaz et du dispositif de mise en circulation de flux de milieu de culture.26 15. Appareil selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'unité de contrôle et/ou de régulation comprend des pesons pour déterminer le poids d'au moins un récipient.