Brevet FR2950360A1 — publié le 20110325

Procédé d'imagerie cellulaire pour la visualisation de la biogenèse des microARNs dans les cellules La présente invention concerne un procédé de visualisation de la biogenèse d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARN, dans une cellule, grâce à la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour la protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8) ou l'un de ses dérivés, couplé à un marqueur, et la détection de ce marqueur ou de la protéine DGCR8. Les microARNs (miARNs) sont des ARN de courtes tailles (préférentiellement entre 15 à 30 nucléotides, et plus préférentiellement entre 19 et 23 nucléotides) capables de moduler négativement l'expression des gènes. Par leur capacité à réguler un grand nombre de gènes, ils sont impliqués dans de nombreux processus biologiques tels que le contrôle de l'apoptose, de la prolifération et de la différentiation cellulaire. La production des microARNs débute dans le noyau par le clivage d'un ARN précurseur : le pri-miARN. Ces clivages sont réalisés par un complexe spécifique : « le Microprocesseur » comprenant les protéines DGCR8 et Drosha, lesquels clivages libèrent un intermédiaire labile, le pré- -2 miARN, à partir duquel le microARN est généré suite à une seconde série de clivages catalysés par la protéine DICER. Des dérégulations de la production des microARNs aussi bien transcriptionelles que post-transcriptionelles sont fréquemment décrites dans des contextes pathologiques tels que les cancers, laissant présager que les microARNs puissent constituer des cibles thérapeutiques dans certaines pathologies. Ainsi il serait intéressant de disposer d'un outil de criblage permettant d'identifier les molécules ou facteurs cellulaires capables de moduler la production de microARNs. La présente invention porte sur l'utilisation d'un complexe rapporteur (concentration de la protéine de fusion DGCR8-marqueur en particulier à un site chromosomique riche en gènes de microARNs) pour la mise au point d'un procédé d'imagerie cellulaire permettant de suivre, dans des cellules vivantes, la dynamique et le recrutement du Microprocesseur (complexe Drosha-DGCR8) sur des transcrits naissants. L'exploitation d'un système cellulaire de type gène-rapporteur permet de cribler les molécules sur des cellules humaines vivantes avec comme objectif principal l'identification de drogues ou de facteurs cellulaires capables de moduler, positivement ou négativement, - 3 l'activité du Microprocesseur, et donc la production des microARNs. Les inventeurs ont mis en évidence un système permettant de suivre la dynamique et le mode d'action du microprocesseur dans les cellules, notamment les cellules vivantes humaines, plus particulièrement dans les cellules de la lignée de choriocarcinome humain JEG3 (ATCC HTB-36), et ceci avec - une très grande efficacité (plus de 90% des cellules transfectées sont analysables) ; - un excellent rapport signal spécifique/bruit de fond, et - un signal du marqueur, par exemple GFP, fort et localisé, donc parfaitement reconnaissable avec les outils bien connu de l'homme du métier, comme par exemple la vidéo- microscopie. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de visualisation de la biogenèse d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARN, dans une cellule caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes . i) la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour la protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8) ou l'un de ses dérivés, laquelle protéine DGCR8 ou dérivé est couplé à un marqueur, -4 ii) l'expression de ladite protéine DGCR8 ou dérivé couplée audit marqueur, et iii) la détection du marqueur. Cette étape (iii) permet la visualisation de la biogénèse dudit au moins un microARN, de préférence dudit groupe de microARNs, ladite protéine DGCR8 ou son dérivé se fixant sur les pri-miARN en en cours de formation au voisinage des sites de transcription. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite protéine DGCR8 ou son dérivé est choisie dans le groupe comprenant l'isoforme CRA_a d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02998 ou NP_073557, SEQ ID N°1), l'isoforme CRA_b d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02999, SEQ ID N°2), l'isoforme CRA_c d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX03000, SEQ ID N°3 ), l'isoforme CRA_a de Mus musculus (numéro d'accession EDK97512 (SEQ ID N°4), EDK97515 (SEQ ID N°5), NP_201581 (SEQ ID N°6),), l'isofome CRA_b de Mus musculus (numéro d'accession EDK97513, SEQ ID N°7), l'isoforme CRA_c de Mus musculus (numéro d'accession EDK97514, SEQ ID N°8), l'isoforme CRA_a de Rattus norvegicus (numéro d'accession EDL77930 (SEQ ID N°9), EDL77931 (SEQ ID N°10)), l'isofome CRA_b de Rattus norvegicus (numéro d'accession EDL77932, SEQ ID N°11) et leurs dérivés. -5 Par « dérivé », on entend toute protéine possédant un pourcentage d'identité avec la protéine DGCR8 d'au moins 70%, préférentiellement 80%, plus préférentiellement 90%, et encore plus préférentiellement 95%. Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fentre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut etre réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité -6 de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Par « transformation » on entend la modification du patrimoine génétique d'une cellule par introduction d'une information génétique étrangère. Cette transformation peut s'effectuer par électroporation, conjugaison, transfection, transduction, fusion de protoplastes, ou toute autre technique connue de l'homme du métier. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape de transformation est une étape de transfection, préférentiellement effectuée de manière transitoire selon une méthode chimique au phosphate de calcium ou via l'utilisation du transfectant lipofectamine 2000, invitrogen. Par "vecteur", on entend un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide codant pour la protéine DGCR8 ou l'un de ses dérivés, laquelle protéine étant couplée à un marqueur. -7 Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion de polynucléotides dans ces vecteurs sont connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans un organisme hôte et notamment afin d'induire l'expression d'une protéine peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en oeuvre. Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de la réplication du vecteur et de l'expression de la protéine DGCR8 couplé à un marqueur dans l'organisme hôte. De manière préférée, dans le cadre de cette invention, le vecteur codant pour la protéine DGCR8 et son marqueur est un plasmide. Par « marqueur », on entend tout moyen, biologique, chimique ou physique capable d'engendre un signal que l'on peut détecter et le cas échéant permettant la quantification de l'expression d'un gène cible dans une cellule. De tels marqueurs sont bien connus de l'homme du métier. Une liste non limitative de ces marqueurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la -8 peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 1251. Leur composition dépendra en particulier du gène cible et de la méthode de détection de l'expression dudit gène cible. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur fluorescent. Par "marqueur fluorescent", on entend toute substance colorée, naturelle, artificielle ou synthétique, absorbant de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et la restituant sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). Dans le cadre de l'invention on utilisera -9 préférentiellement la protéine fluorescente verte ou « Green Fluorescent Protein » (GFP), la protéine fluorescente jaune ou « Yellow Fluorescent Protein » (YFP), la protéine fluorescente cyan ou « Cyan Fluorescent Protein » (CFP), ou le cytochrome b5. Le cytochrome b5, de couleur rouge, possède un maximum d'absorption à 412 nm. La GFP est une petite protéine constituée de 238 acides aminés, organisés en 11 brins beta antiparallèles et une hélice alpha centrale. On parle d'une structure en «beta-can ». Les extrémités N-terminal et C-terminal sont accessibles pour la fusion avec d'autres protéines. La GFP non modifiée, dite sauvage (wild type : wGFP) a deux maxima d'excitation. Le premier se trouve avec une longueur d'onde de 395 nm (lumière UV), le deuxième à 475 nm (lumière bleue). La longueur d'onde d'émission maximale est à 504 nm. La CFP est une protéine produite à partir d'un mutant du gène codant la protéine fluorescente verte. Cette protéine émet de la fluorescence à une longueur d'onde de 480 nm lorsqu'elle reçoit une lumière de longueur d'onde de 458 nm.25 - 10 - La YFP est une protéine produite à partir d'un mutant du gène codant la protéine fluorescente verte. Cette protéine émet de la fluorescence à une longueur d'onde de 527 nm, lorsqu'elle est excitée par une lumière de longueur d'onde de 514 nm. De manière préférée, dans le cadre de cette invention, le marqueur fluorescent est la GFP (Green Fluorescent Protein). De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur protéique. 15 De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la protéine DGCR8 ou l'un de ses dérivés couplé à un marqueur protéique est une protéine de fusion, de préférence une protéine de fusion DGCR8-GFP et de manière particulièrement préférée la protéine de fusion 20 DGCR8-GFP présentant la séquence SEQ ID N°12 Par "protéine de fusion", on entend une construction qui renferme plusieurs protéines d'origine différente. Cette protéine de fusion est codée par un acide nucléique obtenu 25 par les technologies d'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier.10 -11- Dans la plupart des cas, une de ces protéines est celle que l'on veut étudier tandis que l'autre lui confère des propriétés qui la rendent facile à détecter. Dans le cadre de cette invention, la protéine de fusion est constituée d'une protéine et d'un marqueur Par « détection du marqueur », on entend la détection des signaux émis par le marqueur, par exemple la détection de la fluorescence dans le cas où le marqueur est un marqueur fluorescent. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape de détection de la fluorescence se fait par vidéo-microscopie, avantageusement à l'aide d'un microscope à fluorescence ou selon tout autre technique bien connue de l'homme du métier. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite cellule est une cellule de placenta, de préférence une cellule de placenta de primates, encore plus préférentiellement une cellule humaine de placenta. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite cellule de placenta est issue d'un choriocarcinome, de préférence ladite cellule est choisie dans le groupe comprenant les lignées de -12- choriocarcinome humains JEG 3 (ATCC HTB-36), JAR (ATCC HTB-144) et BeWo (ATCC CCL-98). De manière encore préférée, ladite cellule est issue de la lignée de choriocarcinome humain JEG 3 (ATCC HTB-36). Cette lignée immortalisée est facile à manipuler et cultivée dans du DMEM (4,5 g/ml de glucose, 5% serum de veau sous antibiotiques péniciline/streptomycine) et exprime de manière forte, constitutive et monoallélique le locus C19MC. Le locus chromosomique C19MC est un locus génique, positionné sur le chromosome 19 humain et contient 46 gènes de microARNs organisés en tandem et s'étalant sur environ 100kb. Les gènes de ces microlRN sont principalement voire exclusivement exprimés dans le placenta. Ainsi, de manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit au moins un microARN, de préférence ledit groupe de microARN, est codé par le locus chromosomique C19MC (chromosome 19 miRNA cluster), de préférence ledit miARN est choisi dans le groupe comprenant SEQ ID N° 13 à SEQ ID N°58. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est destiné à identifier des composés capables de moduler l'expression des microARNs et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : -13- 1) mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester, 2) mesure de l'expression dudit marqueur en présence et en l'absence dudit composé à tester, et 3) sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur. La méthode de criblage de molécule selon l'invention a pour objectif d'identifier des molécules ou des facteurs cellulaires capables de moduler l'action du Microprocesseur dans le nucléoplasme et donc l'expression des microARNs, en particulier en inhibant le recrutement de la protéine DGCR8. Des dérégulations de la production des microARNs étant impliquées dans des contextes pathologiques tels que le cancer, cette méthode de criblage selon l'invention permet en outre la mise en évidence de molécules ou facteurs cellulaires impliqués dans de tels contextes pathologiques. Les composés à tester selon la méthode de criblage selon l'invention peuvent être de nature lipidique, glucidique, protéique ou nucléiques (par exemple, une banque de siRNA pangénomique humaines). En particulier, les composés à tester pourront être décrits dans des chimiothèques artificielles ou naturelles. -14- Par mesure de l'expression, on entend la localisation et la mesure qualitative et/ou quantitative du marqueur utilisé, en particulier dans le cas d'un marqueur fluorescent de la mesure de la fluorescence, mise en oeuvre selon les techniques connues de l'homme du métier. Ainsi par exemple, dans le procédé selon la présente invention, il pourra être mesuré de manière qualitative par vidéo-microscopie automatisée la présence ou l'absence du marqueur fluorescent utilisé (par exemple GFP) dans ladite cellule au niveau du site de transcription. Légende des figures Figure 1: Représentation schématique du locus chromatinien C19MC (-100 kb). Cette figure représente l'organisation génique des miARN en faisant apparaître le caractère répété de ce locus: la majorité des gènes des miARN est contenue dans des introns eux même localisés au sein d'une séquence non-codante (400-700 nt) répétée en tandem direct. La tige boucle représente un gène de miARN (le pre-miARN) et les sondes oligonucléotidiques utilisées pour les expériences d'hybridation fluorescente in situ (ARN FISH) sont symbolisés par des rectangles gris. -15- Figure 2 : Visualisation par ARN FISH des pri-miARN naissants dans les choriocarcinomes JEG3. Les cellules JEG3 sont hybridées avec des sondes oligonucléotidiques couplées au Cy3 (a et d) ou Alexa fluor 488 (b et e) qui révèlent des séquences introniques ou exoniques du pri-miARN comme indiqué. Dans la majorité des noyaux, on observe un seul signal ARN après superposition de ces signaux (c et f) qui, dans 50% des cas, présente une forme caractéristique en doublets ou en haltères: ce sont les pri-miARN non maturés au voisinage du site de transcription (cf ci-dessous Fig.1D). Figure 3 : Les histogrammes montrent la proportion de noyaux avec 0, 1, 2, ou 3 signaux pri-miARN (plus de 300 noyaux analysés). Figure 4: Drosha et DGCR8 se concentrent au locus C19MC par immunofluorescence. Les cellules JEG3 sont hybridées avec des sondes révélant le pri-miARN avant d'être immuno- marquées avec des anticorps dirigés contre les protéines endogènes Drosha (haut) et DGCR8 (bas). Figure 5 : Effet de la perte de fonction de Dgcr8 sur le recrutement de Drosha. Les cellules JEG3 sont transfectées par un siARN contre DGCR8 (ou un siARN contrôle) puis sont hybridées avec une sonde oligo détectant le pri-miARN (b et - 16 - e) avant d'être immuno-marquées avec un anticorps contre Drosha (a et d). La superposition des signaux DGCR8 et primiRNA sont montrés (c et f). Figure 6 : Les histogrammes indiquent la proportion de noyaux avec un signal Drosha (gauche) ou Dgcr8 (droite) dans les cellules transfectées par des siARN contre les ARNm de Dgcr8 ou Drosha. La valeur observée dans les cellules contrôles est ramenée à 100. Figure 7 : Visualisation du recrutement de GFP-DGCR8 au locus C19MC sur cellules fixées. Un vecteur eucaryote exprimant une fusion GFP-DGCR8 (GFP-DGCR8) est transfectée de manière transitoire dans les JEG3 qui sont par la suite hybridées avec des oligos qui révèlent les pri-miARN (primiARN). En haut : représentation schématique de la fusion GFP-DGCR8 avec notamment les domaines protéiques fonctionnels de DGCR8. -17- Exemples Exemple 1 : La biogénèse des microARNs Pour mettre en lumière l'organisation de la biogénèse de microARNs (ou miARNs), les inventeurs ont mis en oeuvre une approche d'imagerie cellulaire leur permettant de suivre le devenir intranucléaire des transcrits de pri-miARNs dans des cellules en culture fixées ou vivantes. Pour ce faire, les inventeurs ont utilisé le locus chromosomique positionné sur le chromosome 19 (domaine chromosomique 19q13) qui contient 46 gènes de micro ARNs : c'est le locus C19MC. La plupart des gènes de pre-miARNs de C19MC sont intégrés dans des séquences hautement répétées d'une longueur de 400 à 700 nucléotides (Figure 1). 20 Les inventeurs ont exploité la nature répétitive de C19MC-HG (C19MC Hast Gene) pour effectuer une in situ en fluorescence (méthode dite « ARN FISH») à l'aide de sondes oligonucléotidiques capable de s'hybrider avec les séquences introniques et exoniques répétitives de C19MC-HG 25 (Figure 2).15 -18- En utilisant une lignée cellulaire de choriocarcinome de type JEG3 ainsi que deux différentes sondes ADN, s'hybridant respectivement avec les séquences en amont et en aval des pre-miARNs, les inventeurs ont mis en évidence d'important signaux correspondant aux pri-miARN nucléaires, et ceci, dans la majorité des cellules (données non montrées). Les inventeurs ont constaté qu'environ 50% de ces signaux pri-ARN sont visualisés sous forme de doublet (Figure 2 a,b,c) ou sous une forme plus complexe encore pouvant s'étendre sur plusieurs }gym en longueur et occuper une place importante dans le noyau (non montré). Ces signaux ARN correspondent aux transcrits pri-miRNA non-épissés (ou partiellement épissés), et non pas aux introns épissés détachés du pri-miARN puisqu'ils sont aussi révélés avec des sondes exoniques (Figure 2, d,e,f). Ces signaux ont été détectés à proximité d'un des trois signaux ADN révélées par ADN FISH (données non montrées), ce qui indique qu'ils représentent des transcrits fraichement obtenus au voisinage des sites de transcription (note : les JEG3 sont triploides) A l'aide des sondes introniques et exoniques, les inventeurs ont également mis en évidence de nombreux -19- signaux sous forme de points entourant globalement les signaux d'ARN introniques, notamment dans le voisinage du site de transcription (données non montrées) Ces signaux correspondent aux pri-miARNs, qui quittent leur site de transcription et traversent le nucléoplasme. Ces hybridations par ARN FISH montrent également que le locus chromosomique C19MC est préférentiellement, voire exclusivement, exprimé de manière mono-allélique par la lignée de choriocarcinome humain JEG3 (données non montrées et figure 3). EXEMPLE 2 : le Microprocesseur s'associe avec les primiARNs Pour déterminer si le Microprocesseur peut être visualisé sur les pri-miARNs du locus C19MC fraichement synthétisé, les inventeurs ont combiné des expériences d'ARN FISH avec des expériences de détection de protéines par immunofluorescence, selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Les inventeurs ont ainsi pu détecter les protéines Drosha ou DGCR8 endogènes (Figure 4). Les inventeurs ont observé une co-localisation d'intenses signaux d'immunofluorescence pour Drosha et DGCR8 avec les signaux -20- des pri-miARNs indiquant que le Microprocesseur s'associe avec les pri-miARNs non épissés au voisinage du site de transcription. Cette accumulation nucléaire importante du Microprocesseur a également été démontrée dans deux autres lignées cellulaires de choriocarcinome, JAR et BeWO, qui expriment les gènes du locus C19MC. Par contre, les cellules HeLA et HEK293 qui n'expriment pas les gènes localisés sur le locus C19MC ne montrent que de très faibles signaux liés au Microprocesseur (données non montrées). Le recrutement dépend de la transcription et survient vraisemblablement via l'interaction avec les ARNs, puisqu'il n'y a pas de détection dans les cellules traitées par l'Actinomycine, dans lesquelles C19MC-HG n'est pas détecté au environ du site de transcription du C19MC (données non montrées). Exemple 3 : DGCR8 a un rôle dans le recrutement et/ou la stabilisation de Drosha au niveau des pri-miARNs Afin de déterminer si le recrutement de Drosha et DGCR8 sur les transcrits de C19MC est interdépendant, l'expression de ces deux protéines a été diminuée à l'aide d'ARNi (selon les techniques bien connues de « knocking- -21- clown »), et l'impact de la déficience en DGCR8 sur la distribution intra-nucléaire de Drosha (et vice-versa) a été évalué. Les inventeurs ont ainsi validé le test de déficience de gènes en montrant que seulement 20% des cellules issues de la lignée de choriocarcinome de type JEG3, transformées avec des siRNA (petits ARN interférents) dirigés contre des ARNm codant pour DGCR8 ou Drosha, présentent des signaux d'immunofluorescence détectables des protéines cibles au locus C19MC (données non motrées). La proportion de noyaux présentant un signal Drosha au niveau du locus C19MC est fortement réduite dans les cellules déficientes en DGCR8 (Figures 5 et 6 (gauche)), ce qui corrobore l'hypothèse selon laquelle DGCR8 a un rôle dans le recrutement et/ou la stabilisation de Drosha au niveau des pri-miARNs. La déficience en Drosha a également un impact quant au recrutement de DGCR8, même si une fraction importante du noyau présente toujours des protéines DGCR8 au niveau du locus C19MC (données non montrées et Figure 6 (droite)). Les inventeurs ont également constaté qu'en absence de Drosha, DGCR8 est redistribuée dans le noyau, ainsi que dans le nucléole.25 -22- EXEMPLE 4: Visualisation du recrutement de GFP-DGCR8 dans les cellules vivantes Afin d'élucider le mécanisme par lequel le Microprocesseur est dirigé vers les transcrits du locus C19MC, les cellules JEG3 ont été transfectées par le plasmide codant pour la protéine DGCR8, couplée à GFP selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Les inventeurs ont montré que la protéine DGCR8 couplée à la GFP se concentre au niveau du locus C19MC (Figure 7). Des signaux en forme de doublet au niveau de C19MC sont également visibles sur des cellules vivantes, ce qui indique que ces signaux ne sont pas des artefacts liés aux étapes de fixation et/ou d'hybridation. En outre, les signaux détectés liés au marqueur GFP sont co-localisés avec les signaux d'ARN autour des sites de transcription, mais aussi avec les signaux observés dans l'ensemble du noyau. Ceci suggère que les pri-miARNs peuvent se trouver à des localisations autres que leurs sites de transcription. EXEMPLE 5 : Les protéines associées au Microprocesseur DGCR8 et Drosha sont nécessaire et suffisant pour permettre la maturation des pri-miARNs. Cependant, une analyse protéomique a mis en évidence d'autre protéine associées au Microprocesseur comme par exemple des -23- hélicases à ARN, des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRP) et d'autre protéines présentant un motifs de liaison ARN. Les techniques mises en oeuvre pour visualiser la biogénèse des pri-miARNs au niveau du locus C19MC ont permis aux inventeurs de déterminer la présence d'autres protéines liant l'ARN. Les inventeurs ont ainsi montré que la présence de hnRNP C1/C2, EWS, ILF3/NFAR/NF90 et RNA hélicase A (RHA) au niveau du locus C19MC (figure 7), ce qui indique que ces protéines jouent vraisemblablement un rôle dans la synthèse, l'organisation intra nucléaire et la maturation des pri-miARNs codés par le locus C19MC. Le recrutement des hnRNP C1/C2 est spécifique puisque les hnRNP Al et d'autres hnRNP analysés, tels que les hnRNP M1M2, U et A2/B1, ne se retrouvent pas concentrés au niveau du locus C19MC. Les inventeurs ont également montré que la nucléoline, les hnRNP Al, les hélicases à ARN p68 et 672, ou encore les exosomes (PSsclOO), ne se retrouvent pas concentrés de manière significative au niveau du locus C19MC. REVENDICATIONS1. Procédé de visualisation de la biogenèse d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARN, dans une cellule, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes . - la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour la protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8) ou l'un de ses dérivés, laquelle protéine DGCR8 ou dérivé est couplé à un marqueur ; - l'expression de ladite protéine DGCR8 ou dérivé couplée audit marqueur ; et - la détection dudit marqueur 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite protéine DGCR8 ou son dérivé est choisie dans le groupe comprenant l'isoforme CRA_a d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02998 ou NP_073557), l'isofome CRA_b d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02999), l'isofome CRA_c d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX03000), l'isofome CRA_a de Mus musculus (numéro d'accession EDK97512, EDK97515, NP_201581), l'isofome CRA_b de Mus musculus (numéro d'accession EDK97513), l'isofome CRA_c de Mus musculus (numéro d'accession EDK97514), l'isofome CRA_a de Rattus norvegicus (numéro d'accession EDL77930, EDL77931),-25- l'isofome CRA_b de Rattus norvegicus (numéro d'accession EDL77932) et leurs dérivés. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur fluorescent, de préférence ledit marqueur fluorescent est la GFP (Green Fluorescent Protein). 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur protéique. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisée en ce que la protéine DGCR8 ou l'un de ses dérivés couplé à un marqueur protéique est une protéine de fusion, de préférence une protéine de fusion DGCR8-GFP et de manière particulièrement préférée la protéine de fusion DGCR8-GFP présentant la séquence SEQ ID N°12. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'étape de détection de la fluorescence se fait par vidéo-microscopie. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite cellule est une-26- cellule de placenta, de préférence une cellule humaine de placenta. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite cellule de placenta est une cellule issue d'un choriocarcinome, de préférence ladite cellule est choisie dans le groupe comprenant les lignées de choriocarcinome humains JEG 3 (ATCC HTB-36), JAR (ATCC HTB-144) et BeWo (ATCC CCL-98). 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit microARN est codé par le locus chromosomique C19MC (chromosome 19 miRNA cluster), de préférence ledit miARN est choisi dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N°13 à 58. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est destiné à identifier des composés capables de moduler l'expression des microARNs et en ce qu'il comprend en outre les étapes de . 1) mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester ; 2) mesure de l'expression dudit marqueur en présence et en l'absence dudit composé à tester ; et-27- 3) sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur.