Brevet FR2956122A1 — publié le 20110812

UTILISATION D'UN REPRESSEUR D'UN GENE CODANT UNE ENZYME POSSEDANT UNE ACTIVITE GLYCOSYLTRANSFERASE La présente invention concerne la modulation de l'expression d'un gène codant pour une en- zyme à activité glycosyltransférase, en particulier l'utilisation d'un répresseur de la transcription pour la production d'anticorps monoclonaux. Les anticorps monoclonaux appartiennent à une classe importante de produits biothérapeutiques et représentent un marché considérable. La production des anticorps monoclonaux est aujourd'hui réalisée dans des lignées cellulaires, principalement la lignée de hamster CHO, qui est devenue depuis les années 1980 un standard de production. Une partie non négligeable des anticorps monoclonaux actuellement sur le marché ou en cours de développement est destinée au traitement des cancers ou de certaines maladies anti-inflammatoires et agissent via un mécanisme de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendant des anticorps (Antibody dependent cell cytotoxicity - ADCC). L'activité biologique de certaines immunoglobulines G est dépendante de la structure des oligosaccharides présents sur la molécule, et notamment sur sa partie Fc. Ainsi, les molécules IgG de toutes les sous-classes humaines et murines possèdent un N-glycanne fixé au domaine CH2 de chaque chaîne lourde (par exemple sur le résidu Asn 297 pour les IgG humaines). L'influence de cette chaîne glycannique sur la capacité de l'anticorps à interagir avec des molécules effectrices (récepteurs Fc et complément) a été démontrée par des travaux antérieurs (pour revue: Jefferis R. Nat Rev Drug Discov 2009, 8:226-34). Notamment, il a été montré que la quantité de fucose lié en a1,6 sur le premier résidu de N- acétylglucosamine du point d'attache des glycannes présent sur les anticorps est inversement proportionnelle à l'activité ADCC de ces mêmes anticorps (Shields RL, et al. J Biol Chem 2002, 277:26733-26740; Shinkawa T, et al. J Biol Chem 2003, 278:3466-3473; Niwa et al., Clin Cancer Res 2004, 10:6248-6255). Aussi, il convient de fournir des méthodes permettant de réduire cette fucosylation en a1,6 afin de produire des anticorps plus actifs, donc des thérapies plus efficaces. Plusieurs tentatives de diminution de l'activité fucosyltransférase cellulaire ont été décrites dans l'art antérieur. La demande internationale WO 09/009086 décrit des cellules comportant une séquence nucléotidique comprenant un gène codant pour une protéine de fusion constituée d'un domaine protéique à doigt de zinc (« Zinc Finger ») de liaison à l'ADN, capable de se lier à un site du gène fut8 codant l'al,6-fucosyltransférase, et d'un domaine de clivage permettant de cliver le gène fut8, le rendant ainsi inactif. Cependant, cette méthode visant à cliver l'ADN codant le gène de cette fucosyltransférase risque d'induire une instabilité génomique des cellules, et in fine conduire à la mort cellulaire. Les demandes internationales WO 08/145138, WO 09/012173, WO 08/077547, WO 06/133148, WO 06/013964 et WO 05/035778 décrivent la production d'anticorps par des lignées cellulaires dans lesquelles l'activité enzymatique de l'al,6-fucosyltransférase est inhibée par des petits ARN interférants (small inhibiting RNA û siRNA). D'autres exemples, tels que les demandes internationales WO 05/035778, WO 06/013964 et WO 08/112092, décrivent l'introduction d'ARN interférents dans des cellules produisant des anticorps, afin de diminuer l'activité enzymatique de l'al,6-fucosyltransférase. Cependant, ces techniques d'inhibition utilisant des ARNs ne sont pas facilement manipulables, et présentent des inconvénients quant à la stabilité de la diminution de l'activité fucosyltransférase au cours du temps. Aussi, il est nécessaire de trouver des moyens efficaces, ne présentant pas les inconvénients précités, pour inhiber l'expression et/ou l'activité de l'al,6-fucosyltransférase cellulaire lors de la production d'anticorps. L'un des buts de l'invention est donc de fournir un moyen efficace de réduction ou d'inhibition de l'activité de l'al,6-fucosyltransférase des cellules, tout en conservant une stabilité génétique. Un autre but de l'invention est de fournir des moyens permettant de contrôler la diminution de l'activité de 1' al,6-fucosyltransférase cellulaire. Un autre but de l'invention est de fournir des cellules possédant, de manière stable au cours des divisions, une activité de l'al,6-fucosyltransférase diminuée et/ou contrôlée. Enfin, un autre but de l'invention est de fournir un procédé de production d'anticorps possédant une activité ADCC augmentée. L'invention concerne l'utilisation • d'un facteur protéique • ou d'un un acide nucléique codant ledit facteur protéique pour la répression de l'expression d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme à activi- té a1,6 fucosyltransférase, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80 % avec ledit facteur de transcription KLF15, et conservant les propriétés de modulation de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de modulation de la transcription dudit facteur de transcription KLF15. L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que le facteur de transcription KLF15 est capable de moduler l'expression, et notamment d'inhiber 20 l'expression, d'un ou plusieurs gènes codant des enzymes possédant une activité a1,6 fucosyl- transférase. Le facteur de transcription KLF15 est un facteur de transcription possédant des propriétés à la fois d'activateur de la transcription de gènes, notamment le gène Glut4 (Gray S, et al., J Biol Chem 2002, 277:34322-34328), mais également de répresseur de la transcription notamment 25 le gène de l'adrénomodulline (Nagare T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2009, 379:98-103). A ce jour, aucun lien n'a été fait entre les gènes codant des protéines à activité fucosyltransférase et la régulation par le facteur KLF15. Le principe sur lequel repose l'invention est donc d'augmenter la quantité de facteur KLF15 30 afin d'augmenter son effet modulateur sur l'expression des gènes codant des a1,6 fucosyltransférases, et notamment d'augmenter la quantité de facteur KLF15 pour réprimer l'expression desdits gènes. 15 KLF15, également appelé KKLF, est un membre de la famille des facteurs de transcription de la famille KLF (Krüppel Like Factors) comprenant un motif (ou domaine) en doigt de zinc typique de la famille : 3 doigts de zinc très conservés. Ce motif en 3 doigts de zincs est responsable de la liaison à l'ADN du facteur. La caractérisation de la formation du complexe entre l'ADN de fut8 et du facteur KLF15, ou d'un de ses variants, ou encore d'un de ses fragments comprenant au moins le domaine à doigts de zinc, se fait aisément par des techniques connues de l'homme de métier telles que la protection à la DNase (DNase Protection Assay - DPA), le retard sur gel (ElectroMobility Shift Assay - EMSA), les immunoprécipitations de chromatine (Chromatine ImmunoPrecipi- tation - ChIP), et d'autres. Dans l'invention le terme «réprimer l'expression » signifie diminuer ou réprimer la transcription, c'est-à-dire diminuer ou réprimer le taux de transcription du gène. Une telle diminution de l'expression d'un gène peut être aisément mesurée par des techniques quantitatives comme la technique Northern-blot, ou la transcription inverse couplée à la PCR quantitative (quanti- tative Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction - qRT-PCR). Par taux de transcription, l'homme de métier comprend qu'il s'agit du nombre de molécules d'ARN messager, sous contrôle de la machinerie de transcription, produit par un gène déterminé. Quand on parle de l'ADN de fut8 et du facteur KLF15, les termes « liaison », « fixation » et 20 « formation d'un complexe » sont équivalents. Par « d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme à activité a1,6 fucosyltransférase », on en-tend dans l'invention le ou les gènes codant des enzymes capables de transférer un résidu de fucose, en position a1,6 du premier résidu de N-acétylglucosamine du noyau (core) pentasaccharidique des N-glycannes lié sur le résidu d'Asn de la chaîne polypeptidique. 25 Les fucosyltransférases sont codées par les gènes de la famille fut : fut] à fut13. Par convention dans l'invention, les gènes codant les fucosyltransférases seront indiqués en italique (fut), et les protéines produites de ces gènes seront notées en majuscule (FUT). La protéine FUT8 de vertébrés est une al,6-fucosyltransférase qui transfère un résidu de fucose en position a1,6 du premier résidu de N-acétyl-glucosamine du noyau (core) pentasac- 30 charidique des N-glycannes lié sur le résidu d'Asn de la chaîne polypeptidique. Le facteur KLF15 selon l'invention concerne un facteur KLF15 issu de n'importe laquelle des espèces animales l'exprimant, et notamment de mammifère d'oiseau, de batracien ou de pois-son. KLF15 peut être utilisé sous forme de protéine recombinante produite in vitro, dans une bactérie, une cellule de mammifère ou une cellule d'insecte, ou encore par synthèse chimique, ou synthèse biologique in vitro, tels que les lysats de réticulocytes de lapin ou des lysats de germe de blé. KLF15 peut être utilisé sous forme de protéine peut bien évidemment être fusionné à une étiquette de purification courrament utilisée par l'homme de métier, notamment les étiquettes HA, Myc, 6His-Tag ou GST. Ces exemples sont bien entendu illustratifs et ne sauraient être pris en compte comme des limitations. KLF15 peut également être utilisé sous forme d'un acide nucléique contenant la séquence 10 codante dudit facteur KLF15, sous contrôle des éléments permettant son expression. Ce mode de réalisation sera détaillé ci-après. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation précédemment définie, où ledit facteur protéique réprime l'expression d'un ou plusieurs gènes codant 15 une enzyme à activité a1,6 fucosyltransférase en se liant à une séquence d'acide nucléique, en particulier une séquence d'acide nucléique intervenant dans la régulation du ou desdits gènes, ladite séquence d'acide nucléique étant plus particulièrement localisée en 5' du ou desdits gènes. 20 Selon l'invention, le facteur de transcription KLF15 est capable de réprimer l'expression des gènes codant des enzymes possédant une activité a1,6 fucosyltransférase en se fixant sur une séquence d'ADN déterminée, appelée séquence cible ou séquence de liaison, qui peut être comprise : - soit dans la partie promotrice du gène, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 1000 bases 25 en 5' du site d'initiation de la transcription, - soit dans des régions régulatrices qui peuvent se situer dans les introns, ou dans des séquences très éloignées sur le génome du gène à réguler. Ces régions éloignées sont appelées enhancer ou silencer en fonction de leur capacité à augmenter ou diminuer l'expression des gènes. 30 La présente invention concerne plus particulièrement une régulation, en particulier une inhibition, impliquant la fixation de KLF15 sur une séquence cible située dans le promoteur des gènes codant des enzymes possédant une activité a1,6 fucosyltransférase. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation selon la définition précédente, où ladite séquence d'acide nucléique comprend ou consiste en l'une quel-conque des séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO 10. La séquence de fixation de KLF15 peut être constituée d'un motif consensus de séquence 5'-CNCCNCCCC-3' SEQ ID NO 1 ou de son complémentaire 5'- GGGGNGGNG -3' SEQ ID NO 2. Les séquences susmentionnées correspondent, ou sont constituées de, aux séquences suivan-10 tes : - la séquence consensus 5'-CNCCNCCCC-3' SEQ ID NO 1 ou de son complémentaire 5'-GGGGNGGNG -3' SEQ ID NO 2, où N représente un A, un T, un G ou un C, - la séquence 5'-CACCC-3' SEQ ID NO : 3 et son complémentaire 5'- GGGTG -3' SEQ ID NO 4, 15 - la séquence 5'-cgggagGGGGcggcggg-3' SEQ ID NO 5 et son complémentaire 5'-ggtgctGGGGtggagga-3' SEQ ID NO 6, - la séquence 5'-gtgggaGGGGtgctggg-3' SEQ ID NO 7 et son complémentaire 5'-cccgccgccccctcccg-3' SEQ ID NO 8, - la séquence 5'-tcctccaccccagcacc-3' SEQ ID NO 9 et son complémentaire 20 5'-cccagcacccctcccac-3' SEQ ID NO 10. Chacune des séquences nucléotidiques susmentionnées est capable, notamment sous forme double brin, de lier le facteur KLF15 : il s'agit des séquences cibles de KLF15. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne l'utilisation définie précé-25 demment, où ladite enzyme à activité a1,6- est codée par le gène fut8. Plus particulièrement, l'invention concerne la répression de l'expression du gène fut8 par la fixation du facteur KLF15 sur sa séquence cible, ladite séquence cible étant notamment con-tenue dans le promoteur dudit gène fut8. 30 Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation mentionnée ci-dessus, où ledit facteur de transcription KLF15 comprend ou consiste en une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17, et notamment la séquence SEQ ID NO : 11. Les facteurs de transcription KLF15 objets de la présente invention sont les facteurs KLF15 humain (SEQ IDNO 11), - de rat (SEQ ID NO 12), de souris (SEQ ID NO 13), de chien (SEQ IDNO 14), aviaire, notamment de poule (SEQ ID NO 15), de xénope (SEQ ID NO 16), et - de poisson zèbre (SEQ ID NO 17). Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation définie précédemment, où ledit gène codant une enzyme à activité fucosyltransférase est contenu dans une cellule, ou une cellule d'une lignée cellulaire, notamment une cellule de mammifère ou de lignée cellulaire de mammifère, ledit gène étant en particulier contenu dans le génome de la-dite cellule ou cellule de lignée cellulaire. Le facteur KLF15, sous forme de protéine recombinante tel que défini ci-dessus, peut être introduit dans les cellules par les techniques connues de l'homme de métier : électroporation, utilisation de liposomes, de microsphères, de protéines de fusion avec un domaine de trans- duction des protéines (protein transduction domain û PTD) et des protéines d'origine virale, notamment la protéine TAT du VIH-1. Ces exemples sont bien connus de l'homme de métier et sont bien entendu non limitatifs. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le facteur KLF15 est introduit dans une cellule sous la forme d'un acide nucléique qui est transcrit et traduit et permet la synthèse 25 dudit facteur KLF15. Cet acide nucléique peut être notamment contenu dans un vecteur permettant son expression, peut être sous contrôle d'éléments de régulation non régulables, ou constitutifs, tels que les promoteurs forts du cytomégalovirus (CMV), le promoteur du gène EFla (EF1a), le promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur de l'Ubiquitine (Ub) ou tout autre 30 promoteur fort connu de l'homme de métier. Une alternative est l'utilisation de promoteurs régulables tels que les promoteurs régulés par la tétracycline (Tet ON ou Tet OFF), ou tout autre promoteur régulable connu de l'homme de métier. Bien évidemment ledit vecteur contient toutes les séquences permettant une bonne transcription de l'acide nucléique, tel que des terminateurs de la transcription ou autres séquences bien connues de l'homme de métier Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le facteur KLF15, sous contrôle de son promo- teur fort, peut être intégré dans le génome de la cellule dans laquelle il a été introduit, de telle sorte qu'au cours des divisions cellulaires de ladite cellule, l'acide nucléique soit transmis de manière stable aux générations de cellules filles. Une alternative est un vecteur contenant l'acide nucléique codant le facteur KLF15, les sé- quences permettant son expression, et des séquences permettant la réplication dudit vecteur, afin de permettre une réplication autonome dudit vecteur, indépendamment de la réplication du génome de la cellule hôte. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne l'utilisation précédente où ladite cellule, ou cellule de lignée cellulaire est choisie parmi, les cellules CHO, les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0, des lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NSO ou SP2/0-Ag14, les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, les cellules HEK293, les cellules BHK, des hybridomes, des cellules Jurkat, des cellules NIH3T3, des cellules COS, ou des cellules Hela ou des cellules aviaires, notamment les cellules EB66. Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, où ledit facteur protéique est présent en une quantité au moins environ égale, notamment au moins environ supérieure à celle du facteur protéique exprimé de manière endogène par ladite cellule, ou cellule de lignée cellulaire, préférentiellement en une quantité au moins une fois supé- rieure, plus préférentiellement environ au moins deux fois supérieure, à celle du facteur de facteur protéique exprimé de manière endogène par ladite cellule, ou cellule de lignée cellulaire. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, lorsque ladite cellule ou cellule de lignée exprime le facteur KLF15 naturellement, le facteur KLF15 exogène est ajouté dans une quantité au moins environ égale à la quantité initialement présente dans la ladite cellule ou cellule de lignée. B De plus, lorsque ladite cellule ou cellule de lignée n'exprime pas naturellement de facteur KLF15 endogène, la simple introduction dudit facteur a un effet sur la régulation de l'expression du gène fut8. Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation défi-nie précédemment, pour la production d'anticorps monoclonaux, lesdits anticorps monoclonaux présentant un taux de fucosylation inférieur au taux de fucosylation des anticorps pro-duits par ladite cellule ou cellule de lignée cellulaire exprimant une quantité endogène de facteur protéique. Le facteur de transcription KLF15 est capable d'inhiber l'expression du gène fut8 codant un enzyme possédant une activité 1,6 fucosyltransférase. Ainsi, la quantité de protéine FUT8 et l'activité globale a1,6 fucosyltransférase de la cellule seront diminuées. Il est donc intéressant d'utiliser le facteur KLF15 dans des cellules produisant des anticorps afin de réduire leur fucosylation par l'enzyme FUT8, et ainsi augmenter leur capacité à lier les récepteur Fcyl11, et donc leur ADCC. Un autre aspect de l'invention concerne une cellule transgénique transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, lesdites cellules exprimant des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux. Dans l'invention, l'expression « cellules exprimant des anticorps » signifie que ladite cellule exprime au moins un anticorps, mais peu exprimer plusieurs anticorps différents. Ces cellules transgéniques sont appelées «cellules transformées par KLF15 ». Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule transformée par KLF15 où ladite cellule transgénique est issue de la transformation par un acide nucléique codant un facteur protéique d'une cellule choisie parmi les cellules suivantes : • les cellules CHO, • les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0 • les lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NS0 ou SP2/0-Ag14, • des hybridomes, produisant des anticorps, • les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, • les cellules HEK293, et • les cellules BHK • les cellules aviaires, notamment les cellules EB66 Toutes les cellules susmentionnées expriment, en plus du facteur KLF15 transgénique, au moins un anticorps, notamment un anticorps monoclonal, et éventuellement expriment des anticorps. Par « expriment des anticorps », on entend dans l'invention que les cellules sont capables de synthétiser et éventuellement de sécréter dans le milieu de culture au moins un anticorps, c'est-à-dire un dimère de chaînes légères et chaînes lourdes bien connu de l'homme de métier. Comme mentionné précédemment, lesdites cellules peuvent le cas échéant exprimer plusieurs anticorps différents. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la cellule transgénique transformée par KLF15, notamment choisie parmi les cellules CHO, les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0, les lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NSO ou SP2/0-Ag14, les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, les cellules HEK293, et les cel- Iules BHK, est également transformée par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps monoclonal. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule transgénique issue de la lignée YB2/0, transformée par un facteur de transcription KLF15, notamment de 30 mammifère, et exprimant des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux. L'invention concerne également une cellule transgénique YB2/0 transformée par un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère. La cellule transgénique selon l'invention est une cellule YB2/0 transformée par un facteur de transcription KLF15 issu de vertébré, notamment de mammifère, notamment choisi parmi, l'homme, le rat, la souris, le chien, la poule, le Xénope et le poisson Zèbre, respectivement correspondant aux séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 17. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une cellule transgénique définie précédemment, ladite cellule transgénique étant avantageusement issue de la lignée YB2/0. La lignée cellulaire avantageuse de l'invention est la lignée YB2/0 disponible à 1'ATCC sous le numéro n° CRL 1662. L'invention a également pour objet un animal transgénique constitué d'au moins une cellule transgénique, transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, ladite cellule transgénique produisant éventuellement en plus des anticorps monoclonaux. Selon l'invention, ledit animal est capable de produire des anticorps monoclonaux dont le taux de fucosylation est inférieur comparativement à celui des anticorps produits par l'animal dont l'animal transgénique est issu. Les techniques de transgénèse animale sont bien connues de l'homme de métier. Pour ce faire, chez la souris notamment, il suffit par exemple, d'introduire dans une cellule embryonnaire ES de souris un acide nucléique codant le facteur KLF15 sous contrôle d'un promoteur permettant son expression de manière tissu-spécifique : par exemple un promoteur permettant son expression dans les cellules lymphocytaires B , un promoteur tel que le pro-moteur de la (3-caséine permettant une expression dans le lait des animaux femelles ou tout promoteur permettant une expression cellule ou tissus spécifique. Ces exemples ne sont pas limitatifs. Les techniques susmentionnées sont bien connues de l'homme de métier. Les cellules ES modifiées sont transférées directement dans la cavité d'un blastocyste ce qui donne un organisme chimère dont certaines cellules sont modifiées et pas d'autres. Cependant la répartition des cellules ES (migration) se faisant dans tous les types de tissus au cours du développement embryonnaire, l'ensemble des tissus de l'animal parait transgénique. Les souris transgéniques chimères sont croisées avec des souris sauvages afin de d'obtenir des souris hétérozygotes. Les croisements successifs entre hétérozygotes permettront d'obtenir une lignée pure de souris homozygote. Un autre aspect de l'invention concerne une composition comprenant un milieu de culture comprenant : • une ou plusieurs cellules transgéniques définies précédemment, et • des anticorps présentant un taux de fucosylation inférieur à celui des anticorps produits par la cellule dont est issue ladite cellule transgénique. En d'autres termes, l'invention concerne également un milieu de culture comprenant : - une ou plusieurs cellules transgéniques exprimant le facteur de transcription KLF15, après que celui-ci a été introduit dans ladite cellule, ladite cellule transgénique produisant également des anticorps, de telle sorte que, - lesdits anticorps sont sécrétés dans le milieu de culture. Comme la cellule transgénique exprime le facteur de transcription KLF15, ce dernier réprime l'expression du gène fut8, et donc diminue l'activité a1,6 fucosyltransférase de la cellule. Ainsi, les anticorps produits auront un taux de fucosylation inférieur à celui d'anticorps pro-duits par la cellule dont est issue la cellule transgénique. L'invention concerne également un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux comprenant une étape de transformation d'une cellule transgénique par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, ladite cellule transgénique étant transformée par un acide nucléique codant un facteur protéi- que, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15. Ainsi l'invention concerne un procédé de production d'anticorps monoclonaux comprenant l'utilisation d'une cellule transgénique selon l'invention. Par exemple, et sans être limitatif, le procédé selon l'invention peut-être le suivant : Des cellules transgéniques, notamment YB2/0, exprimant de manière stable une protéine KLF15 exogène, selon l'invention, sont transfectées par un ou plusieurs acides nucléiques permettant l'expression d'anticorps monoclonaux. Par «un ou plusieurs acides nucléiques permettant l'expression d'anticorps monoclonaux », on entend dans l'invention, par exemple : - un acide nucléique comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne lé-gère d'un anticorps, sous contrôle d'un premier promoteur, et sur le même acide nucléique, une seconde séquence comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne lourde d'un anticorps, sous contrôle d'un second promoteur préférentiellement différent du premier promoteur, ou - un premier acide nucléique comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne légère d'un anticorps, sous contrôle d'un premier promoteur et un second acide nucléique comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne lourde d'un anticorps, sous contrôle d'un second promoteur préférentiellement différent du premier promoteur, le premier et le second acide nucléique étant deux molécules distinc- tes. Le ou les acides nucléiques permettant l'expression des anticorps monoclonaux sont introduits dans les cellules selon l'invention par des techniques classiques de transfection telles que l'électroporation, la nucléofection, l'utilisation de composés liposomiques, ou éventuellement des constructions virales. Ces exemples sont bien entendus non limitatifs. Le ou les acides nucléiques permettant l'expression des anticorps monoclonaux comportent en outre un ou plusieurs gènes de sélection permettant de rendre les cellules hôtes contenant lesdits acides nucléiques sensibles ou résistants à des produits chimiques ou des antibiotiques. Le ou les acides nucléiques permettant l'expression des anticorps monoclonaux peuvent être introduits de manière transitoire dans les cellules hôtes, ou de manière stable, c'est-à-dire intégrés dans le génome de la cellule hôte. Les méthodes d'amplification des cellules hôtes utilisées pour le procédé selon l'invention, ainsi que la purification des anticorps monoclonaux produits sont bien connues de l'homme de métier. 10 Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne également un procédé défini précédemment, où ladite cellule transgénique est une cellule YB2/0 transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15. 15 Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne également un procédé défini précédemment, comprenant en outre une étape de sélection des cellules transformées par ledit acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, notamment monoclonal L'invention concerne également un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux compre- 20 nant une étape de transformation d'une cellule, ou d'une cellule d'une lignée cellulaire, notamment la lignée YB2/0, par un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15. L'invention concerne, dans un mode de réalisation avantageux, un procédé décrit précédem- 25 ment, ledit procédé comprenant une étape supplémentaire de transformation de ladite cellule transformée par un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, notamment monoclonal. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précé- 30 demment, ledit procédé comprenant simultanément à l'étape de transformation de ladite cellule un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique, la transformation de ladite cellule par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps.5 Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précédemment, comprenant • une étape de transformation d'une cellule ou d'une cellule de lignée cellulaire par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15, • une étape de sélection des cellules transformées à l'étape précédente, et • une étape de transformation des cellules sélectionnées à l'étape précédente par un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps. L'étape de sélection correspond à l'étape permettant de n'isoler que les cellules ayant été 10 transformées par le facteur KLF15. La sélection peut être faite selon les méthodes susmentionnées. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précédemment, comprenant 15 • une étape de transformation d'une cellule ou d'une cellule de lignée cellulaire par un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, • une étape de sélection des cellules transformées à l'étape précédente, et • une étape de transformation des cellules sélectionnées à l'étape précédente par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le 20 facteur de transcription KLF15. L'étape de sélection correspond à l'étape permettant de n'isoler que les cellules ayant été transformées par les anticorps monoclonaux. La sélection peut être faite selon les méthodes susmentionnées. 25 Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précédemment, comprenant en outre • une étape de purification des anticorps, et • éventuellement, une étape de quantification du taux de fucose desdits anticorps. 30 Dans un autre aspect, il est également décrit une partie promoteur du gène fut8 de rat nouvellement caractérisé par les Inventeurs. Ce promoteur consiste en la séquence SEQ ID NO : 18. La présente invention est illustrée par les figures et les exemples suivants. Les exemples illustrent, sans pour autant s'y limiter, les modes de réalisation préférés de l'invention décrite précédemment. Brève description des figures : La figure 1 représente l'analyse par la technique 5'RACE des extrémités 5' des transcrits gène fut8 de rat exprimés par la lignée YB2/0. Les produits de PCR nichée sont visualisés après migration sur gel d'agarose à 1,2 %. La piste 1 représente la migration d'un marqueur de poids moléculaire, la piste 2 représente un produit de PCR négatif, la piste 3 représente un contrôle négatif de PCR et la piste 4 représente la migration des produits de PCR nichée. La figure 2 correspond à une représentation schématique de la région 5' non traduite du gène fut8 de rat et des trois transcrits (Ti, T2 et T3) identifiés par l'analyse 5'-RACE. La taille en pb des introns est indiquée en pb en italique. La figure 3 correspond à un graphique représentant la quantification relative des transcrits T1 et T2 dans les lignées YB2/0 et Rat2 par l'analyse TagmanTM Q-PCR. Les données sont normalisées par rapport à l'expression du gène HPRT. La quantification a été réalisée selon la méthode du 2-°°cT (Livak et Schmittgen, 2001). La figure 4 représente les résultats obtenus lors de l'analyse de la région promotrice du transcrit Ti par tests luciférase réalisés dans les cellules Rat2. En (A) est présenté la région d'ADN génomique comprise entre les exons E-2 et E-3 ainsi que la localisation des sites de restriction utilisés pour les délétions. La numérotation a été effectuée à partir la position du site d'initiation de la transcription. (B) Sur la partie gauche sont représentées les différentes constructions testées. Les boîtes grises correspondent aux différentes régions tronquées de la zone comprise entre les exons E-3 et E-2, les boîtes noires représentent la partie 5' de l'exon -E2, et la boîte blanche représente la séquence codante de la luciférase De luciole (Firefly). Sur la partie droite, sont représentés les résultats du test luciférase correspondant à chaque construction La figure 5 représente les résultats obtenus pour l'analyse de la région promotrice du transcrit T2 lors du test luciférase réalisés dans les cellules Rat2. En (A) est présenté la région d'ADN génomique en amont de l'exon E-3 et le positionnement des sites de restriction utilisés pour réaliser les délétions. (B) Sur la partie gauche sont représentées les différentes constructions testées. Les boîtes grises correspondent aux différentes régions tronquées de la zone d'environ lkpb située en amont de l'exon E-3, les boîtes noires représentent la partie 5' de l'exon -E3, et la boîte blanche représente la séquence codante de la luciférase Firefly. Sur la partie droite, sont représentés les résultats du test luciférase correspondant à chaque construction. La figure 6 représente la séquence de la région promotrice minimale permettant l'expression du transcrit Ti. Les sites de liaison potentiels des facteurs de transcription qui s'y fixent sont indiqués. Les figures 7A à 7D représentent les tests luciférases réalisés avec les facteurs de transcrip- tion indiqués. L'axe des abscisses représente la quantité de vecteur utilisée en ng/mL comme indiquée sur la figure. La figure 7A représente les résultats obtenus avec le facteur RMD 1. Les résultats ont représente sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 7B représente les résultats obtenus avec le facteur IRF3. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 7C représente les résultats obtenus avec le facteur PaxS. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 7D représente les résultats obtenus avec le facteur MZF1. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 7E représente les résultats obtenus avec le facteur KLF15. Les résultats sont repré- sentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 8 A représente l'immunodétection de KLF15 dans les fractions cytoplasmiques (C) et nucléaires (N) de cellules non transfectées (contrôle ou « mock ») ou de cellules transfectées avec des doses croissantes de KLF15. La figure 8 B représente l'activité luciférase correspondant aux quantités de facteur KLF15 indiquées. L'axe des abscisses représente la quantité de vecteur pcDNA3.1-hKLF15 transfectée en ng/mL comme indiqué sur le graphique. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. EXEMPLES : Matériels et Méthodes Cultures cellulaires La lignée de cellules de rat YB2/0 a été obtenue de la collection nationale de culture de cellules des USA (ATCC) (Manassas, VA, http://www.atcc.org; catalogue n° CRL-1662) et cultivée dans un milieu EMS (milieu de culture propriété du LFB) supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé à la chaleur (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) à 37°C sous 5% de CO2. Les lignées cellulaires Rat2 (ATCC n° CRL-1764) et COS-7 (ATCC n° CRL-1651) ont été cultivées en DMEM, (BioWittaker, Lonza, Belgique) supplémenté avec 10% de SVF inactivé à la chaleur et 2mM de L-glutamine (Lonza, Belgique) à 37°C sous 5% CO2. Purification des ARN et synthèse des ADNc Les cellules YB2/0 ont été utilisées comme source d'ARN. Les ARN totaux sont extraits en utilisant le kit Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne) selon le protocole fourni par le fabricant. Les ADNc ont été obtenus à partir des ARN totaux (2 µg) par transcription inverse en utilisant le kit de synthèse ADNc premier brin (Amersham Biosciences, Freiburg, Allemagne). Clonage moléculaire de l'ADNc de l'a 1,6-fucosyltransférase de rat. Le cadre ouvert de lecture isolé de l'op, 1,6-fucosyltransférase de rat n'était pas connu jusqu'à présent. La séquence codante a été amplifiée à partir de 1 tl de ADNc de cellules YB2/0 avec le couple d'amorces 5F8r2: 5'-agtcgccacaggattacc-3' (SEQ ID NO: 23) et 3F8r2: 5'-atctgcttagccgagatg-3' (SEQ ID NO : 24) à 94°C durant 2 minutes, suivi par 30 cycles (94°C, durant 30 secondes ; 50°C durant 45 secondes ; 68°C durant 2 minutes et 10 secondes) et une étape d'extension de 10 minutes à 68°C. Le produit de PCR a été cloné dans le vecteur pCR II-Blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et séquencée. La séquence codante a ensuite été isolée par digestion du vecteur en utilisant les sites de restriction Hind III et Xba I. Le fragment purifié a été sous-cloné dans un vecteur pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) digéré par Hind III et Xba I. Le plasmide résultant est nommé pcDNA-Fut8. Des cellules COS-7 ont été transfectées de manière transitoire avec pcDNA-Fut8 ou le plasmide vide en utilisant la lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. Les cellules ont été récoltées 48 heures après transfection. Préparation du substrat asialo-agalacto-apotransferrine comme accepteur Après dialyse contre une solution tampon d'acétate de sodium (50 mM, pH 7,5), 5 mg d' apotransferrine humaine (Sigma-Aldrich, Lyon, France) ont été incubés avec 120 mU de neuraminidase d'Arthrobacter ureafasciens (Sigma-Aldrich, Lyon, France) et 50 mU de 13-galactosidase d'Escherichia Coli (Sigma-Aldrich, Lyon, France) à 37°C durant 24 heures dans un volume final de 10 mL. Après 4 heures de dialyse contre de l'eau, l'asialo-agalactoapotransferrine a été lyophilisée. L'absence de résidus galactose et d'acide sialique a été contrôlée par GC-MS. Dosage de l'a 1,6-fucosyltransférase Les cellules COS-7, transfectées transitoirement avec pcDNA-Fut8 ou le plasmide vide, ont été récoltées par grattage dans une solution d'EDTA 4mM, culottées par centrifugation à vitesse réduite et re-suspendues dans un tampon de lyse (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HC1, pH 7.5, 1 % Triton X-100), contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Roche, Bale, Suisse). Après centrifugation, la concentration en protéines du surnageant de lyse cellulaire a été déterminée avec le kit de dosage de protéine Micro BCArlm (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA). Les dosages d'enzymes ont été réalisés avec 20 µL de surnageant de lyse cellulaire (140 µg/mL), 70 mM de tampon cacodylate (pH 7,2) 10 mM de L-fucose, 6 µM GDP-[14C]-L- fucose (299 mCi/mmol, Amersham Biosciences, Pantin, France), 10 mM GDP-fucose et 100 µg d'asialo-agalacto-apotransferrine humaine comme substrat accepteur, dans un volume final de 50 µL. Après 4 heures d'incubation à 30 °C, la réaction a été arrêtée par addition 150 µL d'eau à température ambiante puis le produit de réaction a été précipitée avec 1 mL d'acide phosphotungstique à 5 %, et analysé par comptage à scintillation. Le transfert de [14C]-fucose est exprimé en cpm. Amplification de l'extrémité 5' des ADNc par la technique 5' RACE Les amplifications 5'RACE ont été réalisées en utilisant un kit GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. La transcription inverse initiale a été réalisée avec l'amorce oligo-dT en utilisant 5 µg d'ARN total. Après synthèse du premier brin d'ADNc, des PCR ont été réalisées avec l'amorce GeneRacer5' du kit, et une amorce spécifique du gène 3F8Race3 5'-cttcccgtagccgtcccctggtcaa-3' (SEQ ID NO : 25) à 94°C durant 2 minutes, puis 38 cycles (94°C, durant 45 secondes ; 57°C durant 45 secondes ; 68°C durant 1 minute et 45 secondes) et une étape d'extension de 10 minutes à 68°C. Des PCR nichées ont été réalisées en utilisant l'amorce nichée GeneRacer5' fournie avec le kit et une amorce spécifique du gène 3F8Race4 5'-actcagccattcgcctcaagtcttc-3' (SEQ ID NO : 26), en utilisant 2 µL de la première amplification par PCR et les mêmes conditions que la première PCR. Les amplifications par PCR ont été réalisées avec Taq AccuPrime (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. Les produits de PCR nichées ont été séparés par taille par électrophorèse sur un gel d'agarose par électrophorèse, sous clonés dans un vecteur pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et séquencés par Genoscreen (Lille, France). Transcription inverse et PCR quantitative (RT-QPCR) L'expression des transcrits Ti et T2 a été analysée par PCR quantitative en temps réel. Les ADNc ont été obtenus par transcription inverse à partir de 2µg d'ARN total avec des oligonu- cléotides poly-T en utilisant le kit de synthèse d'ADNc Affinity script QPCR (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. Des réactions parallèles, sans SuperScript ont été réalisées pour vérifier la non contamination de la réaction par de l'ADN génomique. Les Q-PCR Duplex TagmanTM et leurs analyses ont été réalisées en utilisant l'appareil de PCR-Q Mx-4000 et son logiciel d'analyse (Stratagene, Amsterdam, Pays-Bas). Les amorces et les sondes ont été conçues en utilisant le logiciel Primer Express (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Les sondes sont des sondes TagmanTM MGB synthétisées par Applied Biosystems. Les sondes spécifiques des transcrits1 (Ti) ou 2 (T2) sont marquées avec FAMTM et la sonde spécifique du gène de référence HPRT a été marquée avec VIC®. Les réactions de PCR ont été réalisées avec 12,5 µL du kit Quantitect Multiplex PCR kit (Qiagen, Courtaboeuf, France), 0,4 µM de chaque amorce, 0,2 µM de sonde HPRT TagmanTM, 0,2 µM de sonde Ti et T2 TagmanTM et 2 µL d'ADNc dans un volume final de 25µL. Après 15 minu- tes à 95°C, 40 cycles de PCR ont été réalisés comme suit : 95°C durant 1 minute, 60°C durant 1 minute. La réaction de PCR en temps réel a été répétée au moins trois fois pour chaque échantillon. Les quantités relatives de chaque transcrit ont été évaluées grâce à une courbe d'étalonnage préparée à partir d'une série de dilutions d'ADNc contrôle issu de cellules YB2/0. Construction de plasmide rapporteur pour dosage par la luciférase L'ADN génomique des cellules YB2/0 a été extrait grâce au kit Nucleospin Extract II (Macherey Nagel, Düren, Allemagne) selon le protocole fourni par le fabricant. Pour analyser la région promotrice du transcrit Ti, la séquence génomique située entre les positions -1438 pb et -411 pb en amont de l'ATG a été amplifiée par PCR en utilisant la paire d'amorces: FP1.8 : 5'-cgtggcaagcttccctaacgcccccttacccg-3' (SEQ ID NO: 19) et FP1.7 : 5'-ctccctggtacctccgtactcaataaacttccgcc-3' (SEQ ID NO : 20) introduisant respectivement les sites de restriction Hind III et Kpn I (soulignés dans la séquence de nucléotides). Le produit de PCR a été cloné dans un vecteur pGL3-basic (Promega, Madison, USA) en amont du gène de la luciférase De luciole (Firefly) au site Hind III / Kpn I. Le plasmide résultant est nommé pGL3-1438/-411. Ce fragment de PCR a été soumis à une série de délétions en 5' et en 3' en utilisant les enzymes des sites de restriction naturellement présents dans la séquence, puis, les sous-fragments ainsi obtenus ont été clonés dans un vecteur PGL3-basique pour générer des vecteurs variés. Pour analyser la région promotrice du transcrit T2, la séquence génomique de 1000 pb située en amont de l'exon E-3 a été amplifiée à partir de l'ADN génomique de cellules YB2/0 en utilisant les amorces FKO11 5'-ccgggctagcacattccacccctgactcctaa-3' (SEQ ID NO : 21) et FKO12 5'-ccggctcgaggtttcctacccgctcgcactcg-3' (SEQ ID NO : 22) introduisant les sites de restriction Nhe I et Xho I respectivement (soulignés dans la séquence de nucléotides). Le fragment amplifié a été cloné dans un vecteur pGL3-basic. Le plasmide obtenu a été appelé pGL31uc-1399/-404. Suivant la même stratégie, les fragments de PCR nichée ont été clonés dans un vecteur pGL3-basique en amont du gène de luciférase De luciole (Firefly), aux sites Nhe I / Xho I. Les différentes constructions ont été séquencées pour s'assurer de l'absence de mutations. Transfections transitoires et dosage à la luciférase Des cellules Rat2 ont été transfectées transitoirement en milieu OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en utilisant la lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant, en utilisant 1 µg/mL de vecteur pGL3 varié et 10 ng/mL de plas- mide de contrôle de luciférase Renilla dans un milieu OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Après 6 heures, le milieu est remplacé par un milieu de culture neuf et les cellules sont incubées durant 48 heures à 37°C sous 5% CO2. Les cellules ont ensuite été lavées une fois au PBS et lysées dans 150 µL d'un tampon de lyse passive (PLB, Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega, Madison, USA). 20 µL de lysat ont été utilisés pour le test de lecture de la luciférase. La luminescence est mesurée avec un luminomètre Centro (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne). Les cellules YB2/0 ont été transfectées transitoirement avec le « Cell fine nucleofector kitV» (Amaxa Lonza, Verviers, Belgique) selon le protocole fourni par le fabricant. Des culots de 2x106 cellules ont été remis en suspension dans 100 µL de la une solution V du kit Nucleofec- tor°. La suspension cellulaire a ensuite été mélangée avec 2 µg de vecteur pGL3-varié et 20 ng de plasmide de luciférase Renilla qui sert de normalisateur. Les mélanges ont été transférés dans une cuve Amaxa et soumis à un choc électrique, en utilisant le programme T-020. Les cellules ont ensuite été transférées dans un puits de plaques six puits contenant 2 mL de mi-lieu de culture et incubées durant 24 heures à 37°C sous 5% de CO2. Les cellules ont finale- ment été centrifugées 5 minutes à 500 g, lavées une fois avec du PBS et utilisées dans un do-sage luciférase (LuciferaseReporter Assay) tel que décrit pour Rat2. Le vecteur d'expression pcDNA3.1 contenant la séquence codante du facteur de transcription humain KLF15 (pcDNA3.1-h KLF15) a été fourni par le Dr. Otteson (College of Optometry, University of Houston, USA). Pour la transfection des cellules Rat2, de 25 à 500 ng/mL de vecteur pcDNA3.1-h KLF15 ont été ajoutés au mélange de lipofection. Extraction des protéines nucléaires et cytoplasmiques, analyses par immunodétection 48 heures après la transfection avec le vecteur KLF15, les cellules Rat2 ont été lysées sur de la glace dans un tampon hypotonique (Hepes 10 mM, MgC12 1,5 mM, KC1 10 mM, pH 7,9) supplémenté avec du NP40 à 0,125% et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche, Meylan, France). Le lysat a été centrifugé 5 minutes à 10000 g et la fraction cytosolique a été récupérée dans le surnageant. Le culot correspondant à la fraction nucléaire est lysé avec un tampon hypertonique (Hepes 20 mM, MgC12 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, NaCl 0,5 M, glycérol 25 %, pH 7,9) supplémenté avec un cocktail d'inhibiteurs de protéases, sur de la glace durant 2 heures. La concentration en protéines des deux fractions a été déterminée avec le kit de do-sage de protéines Micro BCATm (Pierce, Rockford, IL, USA). 20 µg de protéines totales ont été bouillis pendant 10 minutes dans du tampon de Laemmli (reducing Laemmli sample buf- fer) et séparés par SDS-PAGE sur mini-gel 8 % (Bio-Rad, Richmond, USA). Après transfert sur une membrane de nitrocellulose (80 mA, une nuit), une étape de saturation a été réalisée par une incubation en TBS (Tampon Tris Salin) contenant 0,05 % de Tween 20 et 5 % (p/v) de lait écrémé lyophilisé, une heure à température ambiante (TA). Puis la membrane de nitro-cellulose est incubée pendant 1 heure à température ambiante avec 2,5 µg/mL d'anti-KLF15 mAb (AbCam, Cambridge, Royaume-Uni) ou 0,04 µg/mL d'anti-actine mAb (Santa Cruz Biotechnology Inc., Europe) diluées dans du TBS, 0,05 % Tween 20 et 5 % de lait. Après lavage, la membrane est incubée une heure à température ambiante avec une anti- IgG de chèvre couplée à la peroxydase pour le KLF15, ou d'une anti- IgG de lapin pour l'actine, diluée à 1/15000 en tampon de dilution. Les membranes ont ensuite été lavées trois fois durant 10 minutes dans du TBS, Tween 20 0,05% et la détection a été réalisée en utilisant le kit de détection ECL +® (advanceWestern blotting detection reagents, Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buks, Royaume-Uni). Exemple 1 : Clonage du gène Fut8 de rat. Afin de cloner le gène fut8 de rat, les Inventeurs ont utilisé les données bioinformatiques disponibles, et notamment les EST CB548120.1, CB 730213.1 et CB730572.1 correspondant à la région 5' du gène fut8 et les séquences FM069692.1, DV727207.1 et CB742993.1 correspondant à la région 3' non traduite. Une amplification spécifique des l'ADNc synthétisés à partir d'ARN totaux de cellules YB2/0, a permis le clonage et le séquençage d'une séquence de 1942 paires de bases (pb). La séquence amplifiée contient un cadre ouverte de lecture de 1725 pb. La position du codon initiateur a été localisée par analyse de la position de la séquence consensus de Kozak. Afin de confirmer que cette séquence code bien une al,6-fucosyltransférase fonctionnelle, ladite séquence a été clonée dans un vecteur d'expression pCDNA3.1, et la protéine a été pro-duite par transfection des cellules COS-7. Les lysats des cellules transfectées ont ensuite été testés en mesurant l'activité fucosyltransférase sur le substrat asialo-agalacto- apotransferrine. Les lysats des cellules transfectées pré- sentaient une activité al,6-fucosyltransférase 4 fois supérieure à celle des cellules non transfectées démontrant que la séquence clonée code bien pour une enzyme active à activité a1,6 fucosyltransférase. Exemple 2 : Identification des sites d'initiation de la transcription du gène fut8. Afin d'identifier les sites d'initiation de la transcription du gène fut8 de rat, les extrémités 5'non traduites des ARN messagers de fut8 ont été amplifiées par la technique 5'RACE. Cette approche permet de sélectionner uniquement les ARN messagers coiffés, supposés correspondre aux transcrits complets entraits de la lignée YB2/0. Pour cela, les ARN totaux de YB2/0 ont été traités à la phosphatase alcaline pour déphosphoryler les ARN non-coiffés, puis décoiffés par action de la pyrophosphatase acide de tabac. Un oligonucléotide ARN (gene-RACER RNA) a alors été greffé sur l'extrémité 5' des ARN préalablement décoiffés. Les ARN hybrides formés ont ainsi été retrotranscrits puis amplifiés par PCR en utilisant comme couple d'amorce des oligonucléotides complémentaires d'une séquence dans l'exon 2 (antisens) et de la séquence geneRACER (sens). Comme le montre la figure 1, au moins 4 produits d'amplification indépendants d'environ 250, 450, 600 et 750 pb ont été obtenus. Les bandes majoritaires ont été sous clonées et séquencées, et seulement 3 transcrits différents ont été identifiés, signifiant l'existence de 3 isoformes d'expression du gène fut8. Le transcrit de 600 pb (Ti) contient une extension de 508 pb en 5' de l'ATG, constituée de 4 exons, respectivement dans le sens 3' vers 5' El, E0, E-1 et E-2. Le transcrit de 750 pb (T2) contient une extension de 508 pb en 5' de l'ATG, constituée de 4 exons, respectivement dans le sens 3' vers 5' El, E0, E-1 et un exon différent du premier transcrit, l'exon E-3. Le transcrit de 200 pb (T3) ne contient que l'exon 1, en 5' du codon ATG. Les représentations schématiques de chacun des trois transcrits sont présentées dans la figure 2. Les transcrits Ti et T2 ont également été retrouvés dans des banques d'ADNc de cellules Rat2. Exemple 3 : Etude de l'expression des transcrits du gène fut8 de rat. L'expression relative des transcrits spécifiques de fut8 de rat a été mesurée par la technique du Q-PCR TagmanTM en duplex en utilisant le gène HPRT comme gène normalisateur. Pour le transcrit Ti, un oligonucléotide sens hybridant avec la jonction exon-exon E-1/E-2 et un oligonucléotide en antisens en 5' de l'Exon E-2 ont été utilisés. Pour le transcrit T2, un oligonucléotide sens hybridant avec l'exon E-3 et un oligonucléotide en antisens en 5' de l'Exon E-1 ont été utilisés. Les sondes Taqman ont été conçues dans les exons E-1 et E-3, respectivement. Pour le gène HPRT des oligonucléotides ont été conçus pour s'hybrider sur les exons 7 et 8. L'expression relative a été mesurée pour les lignées cellulaires YB2/0 et Rat2. Comme le montre la figure 3, l'expression du transcrit T2 est 1,6 fois plus élevée que celle du transcrit Ti. La quantification directe du transcrit T3 n'est pas possible car la totalité de la région 5'UTR est commune aux séquences des transcrits Ti et T2. Cependant, il semble que l'expression de ce transcrit soit minoritaire. Exemple 4 : Activité des promoteurs des transcrits Tl et T2 du gène fut8 de rat. Afin de déterminer la région minimale promotrice du transcrit Ti, la région génomique de 1 kb (1000 pb) comprise entre les exons E-3 et E-2 a été clonée dans le vecteur pGL3 en amont d'un gène rapporteur, le gène de la luciférase De luciole (Firefly). Cette région a été tronquée en 5' et en 3' et les différents vecteurs obtenus sont les suivants : pGL3-1418/-598, pGL3-1418/-451, pGL3-598/-411, pGL3-892/-411, pGL3-892/-451, pGL3-892/-598, pGL3-1004/-411 et pGL3-1205/-411. Les vecteurs ont été transfectés dans des cellules YB2/0 et Rat2 pour effectuer des dosages d'activité de la luciférase. Les résultats obtenus avec les cellules Rat2 sont présentés dans la figure 4. Les résultats montrent que l'activité luciférase pour la région pleine longueur est 13 fois supérieure à celle sans insert, alors qu'elle est de 30 à 38 fois supérieure pour les régions -1418/-451 et -1205/-411, respectivement. De plus, l'activité luciférase des régions -892/-411 et -598/-411 est de 3 à 4 fois supérieure à celle sans insert. Ces résultats montrent l'existence d'un promoteur minimal P1 dans la région -892 /-451 et l'existence de séquences inhibitrices dans les régions -451 /-411 et -1438 /-1205. La région de 1 kb en 5' de l'exon E-3 a également été étudiée, afin de déterminer les éléments minimaux de régulation du transcrit T2. La région a été amplifiée et sous clonée dans le vec- teur pGL3 en amont d'un gène rapporteur : le gène luciférase (pGL3b-1399/-404). Cette région a été tronquée en 5' et en 3' et les différents vecteurs ont été obtenus (pGL3b-1399/-537, pGL3b-998/-537 et pGL3b-720/-537). Les vecteurs ont été transfectés dans des cellules YB2/0 et Rat2 pour effectuer des dosages d'activité de la luciférase. Les résultats obtenus avec les cellules Rat2 sont présentés dans la figure 5. Les résultats montrent l'existence d'un promoteur minimal dans la région -720/-537 contrôlant l'expression de T2. Exemple 5 : Analyse des promoteurs minimaux Pl et P2 du gène fut8 de rat. Les promoteurs minimaux en amont (5') des exons ûE2 et ûE3 ont été étudiés avec le logiciel Matinspector 2.2 (www.genomatix.de) en utilisant TRANSAC matrices 4.0 (Quandt et al., 1995). Des filtres spécifiques pour isoler les facteurs spécifiques des cellules lymphoïdes et myéloïdes ont été utilisés. Les résultats obtenus pour le promoteur minimal P1 sont représentés dans la figure 6. Aucune séquence CAAT ou TATA n'a été identifiée, mais plusieurs sites putatifs de liaison à des facteurs de transcription possédant une activité répressive ont été identifiés. La région -892 /-451 contrôlant l'expression du transcrit Ti contient des sites putatifs pour les facteurs suivants : MZF1 (Myeloid Zinc Finger 1), PAX5 (Paired Box 5), KLF15 (Krüppellike Factor 15), IRF3 (Interferon Regulatory Factor 3) et PRDM1 (Positive Regulatory Do-main containing 1). Exemple 6 : Effet de la surexpression de KLF15 sur l'expression du transcrit Ti du gène fut8 de rat. Afin de déterminer si les sites putatifs décrits précédemment jouent un rôle dans la régulation du transcrit Ti, des cellules Rat2 ont été transfectées avec chacun des facteurs MZF1, PAX5, KLF15, IRF3 ou PRDM1 avec le vecteur pGL3b-892/-451 contenant le promoteur minimal pour Ti en amont de la luciférase. 48h après la transfection, les résultats (figures 7A-E) ont montré que seul KLF15 est capable de réduire l'activité du promoteur Ti de 50%, pour chacune des concentrations en facteur testées. Les résultats sont montrés dans la figure 7E. Ces résultats sont statistiquement significatifs (p La surexpression de KLF15 a été étudiée par immunodétection dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques. La figure 8A montre deux bandes d'environ 55 kDa correspondant à KLF15, en accord avec la taille observée par SDS-PAGE (Uchida et al., 2000). KLF15 endogène est majoritairement présent dans la fraction cytosolique, comme l'indique la 15 piste 1 de la figure 8, alors que la quantité de KLF15 augmente dans les deux fractions en fonction de la quantité de KLF15 exprimée de manière exogène. A faible concentration, KLF15 est principalement surexprimé dans la fraction nucléaire. La concentration en facteur ne change pas le niveau de répression de la luciférase (figure 8B), indiquant qu'une faible quantité de facteur KLF15 suffit pour efficacement exercer son effet 20 répresseur. Revendications1. Utilisation • d'un facteur protéique • ou d'un un acide nucléique codant ledit facteur protéique, pour la répression de l'expression d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme à activité a1,6 fucosyltransférase, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80 % avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de modulation de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit frag- ment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de modulation de la transcription dudit facteur de transcription KLF15. 2. Utilisation selon la revendication 1, où ledit facteur protéique réprime l'expression d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme à activité a1,6 fucosyltransférase en se liant à une séquence d'acide nucléique, en particulier une séquence d'acide nucléique intervenant dans la régulation du ou desdits gènes, ladite séquence d'acide nucléique étant plus particulièrement localisée en 5' du ou desdits gènes. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, où ladite séquence d'acide nucléique comprend ou consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO :10. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où ladite enzyme à activité al,6-fucosyltransférase est codée par le gène fut8. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où ledit facteur de transcription KLF15 comprend ou consiste en une séquence d'acides aminés choisie parmi les sé-quences suivantes : SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où ledit gène codant une enzyme à activité fucosyltransférase est contenu dans une cellule, ou une cellule d'une lignée cellulaire, notamment une cellule de mammifère ou de lignée cellulaire de mammifère, ledit gène étant en particulier contenu dans le génome de ladite cellule ou cellule de lignée cellulaire. 7. Utilisation selon la revendication 6, où ladite cellule, ou cellule de lignée cellulaire est choisie parmi les cellules CHO, les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0, des lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NSO ou SP2/0-Ag14, les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, les cellules HEK293, les cellules BHK, des hybridomes, des cellules Jurkat, des cellules NIH3T3, des cellules COS, ou des cellules Hela ou des cellules aviaires, notamment les cellules EB66. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la production d'anticorps monoclonaux, lesdits anticorps monoclonaux présentant un taux de fucosylation inférieur au taux de fucosylation des anticorps produits par ladite cellule ou cellule de lignée cellulaire exprimant une quantité endogène de facteur protéique. 9. Cellule transgénique transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit frag- ment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15 lesdites cellules exprimant des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux. 10. Cellule transgénique selon la revendication 9, où ladite cellule transgénique est issue de la transformation par un acide nucléique codant un facteur protéique d'une cellule choisie parmi les cellules suivantes : • les cellules CHO, • les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0 • les lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NSO ou SP2/0-Ag14, • des hybridomes, produisant des anticorps, • les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, • les cellules HEK293, et • les cellules BHK • les cellules aviaires, notamment les cellules EB66 11. Cellule transgénique selon la revendication 9 ou la revendication 10, ladite cellule étant également transformée par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps monoclonal. 12. Cellule transgénique selon la revendication 10, ladite cellule transgénique étant issue de la lignée YB2/0. 13. Cellule transgénique YB2/0 transformée par un facteur de transcription KLF 15. 14. Composition comprenant un milieu de culture comprenant : • une ou plusieurs cellules transgéniques selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, et • des anticorps présentant un taux de fucosylation inférieur à celui des anticorps produits par la cellule dont est issue ladite cellule transgénique. 15. Composition comprenant un milieu de culture comprenant : • une ou plusieurs cellules transgéniques selon la revendication 12, et • des anticorps présentant un taux de fucosylation inférieur à celui des anticorps produits par la cellule dont est issue ladite cellule transgénique. 16. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux comprenant une étape de transformation d'une cellule transgénique par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, ladite cellule transgénique étant transformée par un acide nucléique codant un facteur protéi- que, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit fac- teur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15. 17. Procédé selon la revendication 16, où ladite cellule transgénique est une cellule YB2/0 transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15. 18. Procédé selon la revendication 16 ou la revendication 17, comprenant en outre une étape de sélection des cellules transformées par ledit acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps. 19. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux comprenant une étape de transfor- mation d'une cellule, ou d'une cellule d'une lignée cellulaire, notamment la lignée YB2/0, par un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15. 20. Procédé selon la revendication 19, ledit procédé comprenant une étape supplémentaire de transformation de ladite cellule transformée par un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps. 21. Procédé selon la revendication 19, ledit procédé comprenant simultanément à l'étape de transformation de ladite cellule un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique, la transformation de ladite cellule par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps. 22. Procédé selon la revendication 19 comprenant : • une étape de transformation d'une cellule ou d'une cellule de lignée cellulaire par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15, • une étape de sélection des cellules transformées à l'étape précédente, et • une étape de transformation des cellules sélectionnées à l'étape précédente par un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps. 23. Procédé selon la revendication 19 comprenant : • une étape de transformation d'une cellule ou d'une cellule de lignée cellulaire par un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, • une étape de sélection des cellules transformées à l'étape précédente, et • une étape de transformation des cellules sélectionnées à l'étape précédente par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15. 24.Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, comprenant en outre • une étape de purification des anticorps, et • éventuellement, une étape de quantification du taux de fucose desdits anti25 corps.