Brevet FR2960551A1 — publié le 20111202

PRODUCTION DE MOLECULES D'INTERET EN MILIEU SOLIDE La présente invention a pour objet un procédé de préparation de molécules d'intérêt par fermentation d'un substrat en phase solide et leurs utilisations. La biomasse représente une des ressources renouvelables les plus abondantes sur terre et certainement l'unes des moins coûteuses. Elle se définit comme étant « la fraction biodégradable des produits, déchets et résidus provenant de l'agriculture, y compris les substances végétales et animales, de la sylviculture et des industries connexes ainsi que la fraction biodégradable des déchets industriels et ménagés » (Article 29 de la loi 2005-781 du 13 juillet 2005). Les principales provenances de la biomasse sont, l'agriculture, la forêt, les milieux marins et aquatiques, les déchets verts, les industries et activités humaines traitant les matières d'origine vivante. Le développement de la valorisation de la biomasse constitue l'une des voies importantes pour participer à la maîtrise de la consommation des ressources non renouvelables et lutter contre les changements climatiques. Cette valorisation est croissante du fait de la multiplication et du renforcement, à l'échelle mondiale, des réglementations et des normes sanitaires et environnementales et du fait de la sensibilité de plus en plus forte des politiques et des citoyens au respect et à la préservation de l'environnement. Les filières de valorisation de la biomasse recouvrent trois grands secteurs, les biocarburants, les biocombustibles (chaleur, électricité) ainsi que celui des bioproduits ou biomatériaux. Parmi les technologies utilisées dans le cadre de la valorisation de la biomasse, la technologie de la fermentation en milieu solide (FMS) ouvre des perspectives prometteuses, notamment dans le secteur des biocarburants et des bioproduits. Une fermentation en milieu solide (FMS) se définit comme une culture aérobie qui a lieu en l'absence d'eau libre dans le milieu (Hesseltine, (1987), International Biodeterioration 23:79-89; Pandey et al, (2001) Solid State Fermentation in Biotechnology - Fundamentals and Applications. Asiatech Publishers Inc.). Plus précisément, Saucedo-Castafieda (Contrôle du métabolisme de Schwanniomyces castellii cultivé sur support solide. Thèse, 212 pagesl99l) propose la définition suivante : un procédé microbien où la culture se développe non seulement en surface mais aussi à l'intérieur d'une matrice poreuse solide et en l'absence d'écoulements de liquides. La matrice poreuse peut être constituée d'un substrat humide per se ou d'un support inerte capable d'absorber les nutriments qui se trouvent dissous en solution. Bien que l'eau ne s'écoule pas, une phase hydrique est considérée ; elle correspond au film hydrophile qui recouvre chaque particule de la matrice solide. Cette eau joue un rôle essentiel puisqu'elle est impliquée dans le développement de la biomasse microbienne, les réactions métaboliques, les activités enzymatiques et le transport des gaz. En FMS, la source de carbone est transformée de manière aérobie en biomasse microbienne, métabolites, CO2 et H2O. Ces transformations sont exothermiques ; elles donnent donc lieu à la libération de chaleur, dite chaleur métabolique. Une des caractéristiques d'une FMS est également son hétérogénéité microscopique. De nombreux microorganismes se développent naturellement sur des supports solides biodégradables, à condition que suffisamment d'eau soit présente. Cette capacité a été utilisée par l'homme pour de nombreuses applications. Les premières fermentations en milieu solide ont été mises en oeuvre dans la fabrication du pain, qui date de 2600 ans avant l'an 1. Un autre procédé ancestral est celui de la fabrication du koji qui semble quasiment aussi ancien alors que la fabrication du tempeh et les techniques fromagères d'ensemencement des croûtes avec des champignons filamenteux correspondent également à des FMS. La maîtrise de la fermentation en milieu solide a été essentiellement développée dans les pays d'Asie où cette technologie est à la base de nombreux produits alimentaires, comme la sauce soja, le tempeh ou encore le tofu. Depuis les années 80 une recherche active est menée également dans les pays occidentaux et porte notamment sur le contrôle de ce type de fermentation et sur la mise en évidence de son intérêt et de ses avantages pour diverses applications (Roussos et al, (1997), Proceedings of the 2nd International Symposium on Solid State Fermentation FMS-95, Montpellier, France in Kluwer Academic Publisher.). La fermentation en milieu solide s'ajoute aux autres techniques de cultures que sont la fermentation en milieu liquide non agitée, assimilée à une fermentation de surface, la fermentation un milieu liquide agitée, assimilée à une fermentation submergée, la fermentation en milieu semi solide, où sont présents à la fois de l'eau libre et un solide. La croissance de microorganismes sur milieux gélosés correspond à une fermentation en surface sur milieu solide ; elle présente quelques caractéristiques communes à une FMS, car elle a lieu en absence d'eau qui s'écoule, de manière aérobie et les microorganismes s'y développent de manière aérienne, mais contrairement à la FMS, le substrat n'est pas particulaire, ni poreux, ni aéré. Ces différents procédés de culture (liquide, semi-solide, surface, solide) ont permis le développement de l'utilisation de microorganismes, soit pour les produire en grande quantité (par exemple pour fournir les boulangers et brasseurs en levures), soit pour produire des métabolites microbiens qui trouvent des applications dans de très nombreux domaines (par exemple pour produire la pénicilline et autres antibiotiques, ou les enzymes qui servent d'auxiliaires technologiques à des industries variées). Bien que la fermentation en milieu submergé (milieu nutritif liquide, parfaitement agité) soit la technique qui a été la plus développée dans les pays occidentaux et qu'elle soit encore la plus utilisée aujourd'hui, la fermentation en milieu solide est de plus en plus privilégiée. La technologie de la FMS, par opposition à celle de la fermentation en milieu liquide (FML), présente des avantages économiques, technologiques et environnementaux, offrant de ce fait une alternative prometteuse quant à la production d'enzymes ainsi que de métabolites divers. (production d'exopectinases par Aspergillus piger az-Godinez et al, (2001) Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 26:271-275 ; production de phytases par Aspergillus piger Papagianni et al, (1999) Process Biochemistry, 35:397-402.; production de pectinases par Aspergillus piger Patil et Dayanand, (2006) Bioresource Technology, 97:2054-2058. ; production de protéase neutre par Aspergillus oryzae Sandhya et al, (2005) Process Biochemistry, 40:2689-2694; enzymes fongiques Viniegra-Gonzalez et al, (2003) Biochemical Engineering Journal, 13:157-167.). Les microorganismes (bactéries, levures, champignons) produisent un grand nombre d'enzymes. Ces enzymes, nécessaires à leur croissance, sont regroupées selon différentes familles (cellulases, hémicellulases, amylases, phosphatases, pectinases, protéases, lipases, etc.) et trouvent des applications dans de nombreux domaines industriels. Les amylases, enzymes impliquées dans la dégradation de l'amidon sont ainsi utilisées pour fabriquer du sirop de glucose ou encore du sirop de maltose. Les applications du sirop de glucose sont les confiseries (conserves de fruits, fruits confits, confitures, compotes), la brasserie, la fabrication de liqueurs, la fabrication de boissons non alcoolisées. Le sirop de maltose est utilisé plus précisément en brasserie, panification, fabrication des boissons, crèmes glacées et dans l'industrie pharmaceutique (surtout en remplacement du glucose pour les diabétiques). La fabrication de sirop de fructose est un autre débouché, qui s'est beaucoup développé grâce au pouvoir sucrant du fructose supérieur à celui du saccharose et celui du glucose. Les amylases sont également incorporées dans les détergents pour participer à l'élimination des tâches de couleur, pour la production des biocarburants de première génération. Les phosphatases, famille d'enzymes très variée qui catalysent l'hydrolyse des liaisons phosphomonoesters, sont elles utilisées en alimentation humaine et animale. Au sein des différentes classes de phosphatases, il existe des enzymes capables d'hydrolyser une ou plusieurs des liaisons phosphomonoesters de l'acide phytique (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate), entraînant ainsi la libération de phosphates inorganiques et de myo- inositol phosphates plus ou moins phosphatés. Cette activité est nommée activité phytase. L'ajout de phytases dans la formulation des rations alimentaires des animaux monogastriques d'élevage permet un double effet sur l'environnement : une diminution de l'ajout de phosphate inorganique d'une part et une diminution de la quantité de phytate rejeté dans l'environnement d'autre part. Elles sont utilisées en nutrition humaine pour éviter les déficiences minérales dues à l'acide phytique dans les zones où les céréales sont la principale nourriture des populations. Les protéases qui constituent l'un des trois plus grands groupes d'enzymes industriels trouvent des applications dans l'industrie des détergents, du textile, du cuir, de l'alimentaire ou dans l'industrie pharmaceutique. Les protéases sont, par exemple, intégrées dans les lessives afin d'éliminer les taches à base de protéines. Dans l'industrie textile, les protéases sont utilisées pour modifier la surface des fibres de laine et de soie dans le but d'améliorer le lustrage et la douceur des tissus. Dans l'industrie du cuir, le processus d'épilation des peaux fait aussi intervenir l'activité biologique des protéases. Les lipases font partie de la famille des hydrolases qui agissent sur les liaisons esters carboxyliques. Le rôle physiologique des lipases est d'hydrolyser les triglycérides en diglycérides, monoglycérides, acides gras et de glycérol. Cette famille d'enzyme constitue un des groupes de biocatalyseurs qui trouve de nombreuses applications biotechnologiques dans des domaines aussi variés que ceux de l'industrie de l'alimentation, des détergents, pharmaceutique, du cuir, du textile, du papier ou de la cosmétique. Les enzymes qui interviennent dans la dégradation complète de la cellulose sont : l'endo- (3-1,4-D-glucanase, l'exo-13-1,4-D-glucanase (encore appelée cellobiohydrolase) et la 13-glucosidase ; les enzymes qui hydrolysent les pectines sont les pectate lyases, les pectinases, les pectines estérases, les polygalacturonases ; toutes ces enzymes capables de dégrader les polymères des parois végétales trouvent de multiples applications dans des secteurs variés. Par exemple, les pectinases sont utilisées dans les industries des jus de fruits, pour les clarifier et faciliter leur filtration. Les glucanases (cellulases et hemicellulases) présentent des marchés diversifiés. Elles sont utilisées dans l'industrie du textile pour l'attendrissement du coton ou pour la finition du denim, dans le domaine des détergents pour fabriquer des poudres de lavages qui respectent les couleurs, facilitent le nettoyage et évitent les phénomènes de redéposition des salissures. Dans l'industrie de la pulpe de papier, les xylanases sont utilisées pour réduire l'utilisation de chlore lors de l'étape de blanchiment. Les hémicellulases sont aussi utilisées dans le domaine de la panification où elles offrent de nombreux avantages tels que l'augmentation des volumes spécifiques des pains ou du gain de tolérance à la fermentation. Des cellulases pour ruminants, permettant d'améliorer la digestibilité de leur ration en fourrage, pourraient présenter un intérêt. Les cellullases sont également utilisées dans le secteur de l'énergie pour la conversion des déchets cellulosiques en éthanol. Toutes ces molécules d'intérêts (enzymes et métabolites) sont individuellement disponibles dans le commerce sous forme purifiée, mais ont l'inconvénient d'être relativement onéreuses. Il existe donc un besoin de disposer d'un procédé permettant de produire ces diverses molécules d'intérêt, en cocktail ou purifiée, à coût réduit et avec un bon rendement. La présente invention vise à satisfaire ce besoin. La présente invention concerne un procédé de préparation de molécules d'intérêt par fermentation d'un substrat en phase solide comprenant les étapes suivantes : a) prendre un substrat, b) réduire éventuellement la taille dudit substrat de manière à obtenir des particules dont 100 % ont un diamètre moyen inférieur à 1 mm, 15 c) stériliser le substrat à sec, d) inoculer sous agitation le substrat obtenu à l'étape c) avec un microorganisme en suspension à raison de 1 x 105 à 1 x 10' spores/gramme de substrat, avantageusement 2,5 xl05 spores/gramme de substrat, et de manière à avoir un aW compris entre 0,950 et 0,999, avantageusement compris entre 0,980 20 et 0,995, e) laisser fermenter à l'état solide dans un réacteur sans agitation pendant 2 à 8 jours, avantageusement 3 à 6 jours, à une température comprise entre 18 et 30 °C sous pression atmosphérique, f) stériliser le substrat fermenté obtenu à l'étape e), 25 g) reprendre le substrat obtenu à l'étape f) par un volume d'eau représentant 0,5 à 5 fois la masse de substrat, h) recueillir le liquide de lavage et i) extraire les molécules d'intérêt à partir du liquide recueilli à l'étape h). 30 Au sens de la présente invention on entend par «molécules d'intérêt », tout produit issu du métabolisme microbien, en particulier, - des enzymes, notamment choisies dans le groupe comprenant les cellulases, les xylanases, les a-amylases, les arabinoxylanases, les a-et f3- glucosidases, les fucosidases, les protéases, les phytases, les phosphohydrolases, les phosphatases, les estérases, les glucosaminidases, les a-et 13-galactosidases, les a-mannosidases et les lipases, - des vitamines, - des substances à activité thérapeutiques comme par exemple les antibiotiques, - des pigments, - des polysaccharides - des lipides. Au sens de la présente invention on entend par « substrat » la biomasse végétale, les matières premières agricoles, les sous-produits de l'industrie alimentaire et les boues d'épuration, notamment, - les céréales comme par exemple le maïs, le blé, l'orge et le riz, - le son de blé, - la paille, - les rafles de maïs, - le bois de résineux ou de feuillu, - les déchets végétaux, notamment les herbes et les feuilles, - les déchets d'amidonnerie, - la pulpe de betterave, - le papier, - la bagasse de canne à sucre, - les résidus de papeterie (notamment les boues). 25 Au sens de la présente invention on entend par « microorganismes », les bactéries, et les champignons filamenteux ou non, en particulier les levures. A titre d'exemple de bactérie, on peut citer notamment Bacillus et Escherichia coli et à titre d'exemple de champignons Fusarium, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium et Rhizopus, en particulier Fusarium venenatum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium tricinctum, Fusarium 30 sambucinum, Phoma exigua, Alternaria alternats, Epicoccum nigrum, Sclerotinia sclerotiorum, obtenus à partir de plants de houblon en dépérissement et isolés sur milieu PDA selon la technique décrite par Hatsch et al, (2002), (Development of a bipartite method for Fusarium identification based on cellobiohydrolase-C : CAPS and Western blot analysis Fems Microbiology letters 213 :245-249), Trichoderma harzianum (déposé sous le no DSM 20 63059 à la Collection allemande de microorganismes), Penicillium camembertii prélevé sur du camembert, , Saccharomyces cerevisiae. Dans le cadre de la présente invention la stérilisation aux étapes c) et f) peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par traitement thermique (notamment avec plaques électriques, autoclave...) ou par irradiation avec un rayonnement alpha, béta (électron), gamma ou X. L'irradiation du substrat à l'étape c) induit l'ionisation de la biomasse dans le but de la préparer à la croissance d'un champignon. Son utilisation à l'étape f) pour le post traitement de la biomasse fermentée permet de détruire, par des rayonnements ionisants, le champignon et ses spores tout en conservant l'intégrité des molécules d'intérêt. Les conditions d'irradiation seront adaptées à chaque substrat et ces adaptations sont à la portée de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'une au moins des étapes c) et f) est réalisée par irradiation, avantageusement les deux étapes sont réalisées par irradiation. L'étape e) peut être réalisée dans tout type de réacteur connu de l'homme du métier. L'extraction des molécules à l'étape i) peut également être réalisée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier, notamment par pressage du liquide, filtration et lyophilisation. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étape d) est réalisée en milieu aqueux, en présence ou non d'un tampon ; à titre d'exemple le milieu peut-être de l'eau à pH 6, la quantité d'eau représentant de 0,1 à 2 fois la masse du substrat, avantageusement 1 fois. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le microorganisme utilisé est Fusarium venenatum déposé le 5 septembre 2001 sous le no : ID 386918 à CABI GRC (CAB International Genetic Resource Collection Nosworthy Way Wallingford Oxfordshire OX10 8DE Grande-Bretagne) et identifié le 24 octobre 2001. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention les molécules d'intérêts obtenues sont choisies dans le groupe comprenant les cellulases, les xylanases, les a-amylases, les arabinoxylanases, les a-et (3-glucosidases, les fucosidases, les protéases, les phytases, les phosphohydrolases, les phosphatases, les estérases, les glucosaminidases, les a-et (3-galactosidases, les a-mannosidases et les lipases. Dans encore un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le substrat est le son de blé, le microorganisme est Fusarium venenatum déposé sous le no : ID 386918 à CABI GRC (CAB International Genetic Resource Collection Nosworthy Way Wallingford Oxfordshire OX10 8DE Grande-Bretagne). Conformément à l'invention, les molécules d'intérêts obtenus par le procédé selon l'invention peuvent être utilisées pour l'alimentation humaine et l'alimentation animale, dans l'industrie du papier, l'industrie des détergents et l'industrie des textiles, pour le traitement et la valorisation des déchets végétaux, en particulier la production du bioéthanol et pour la bio protection des cultures Exemple 1 MATERIEL ET METHODES 1.1 Matériels 1.1.1 Substrats de fermentation en milieu solide (FMS) Les substrats utilisés sont choisis parmi : maïs, blé, orge, riz, son de blé, paille, bois (résineux et feuillus), déchets végétaux (herbes et feuilles...), pulpe de betterave, papier, bagasse de canne à sucre, boues de papeterie. 1.1.1.1 Caractérisation de la matière première Activité de l'eau L'activité de l'eau des préparations de substrats est déterminée en utilisant un appareil de mesure (awmétre) de chez Fast-Lab (GBX) placé dans une pièce climatisée à 23°C. L'échantillon est introduit dans une coupelle sèche et immédiatement placé dans la chambre de mesure. L'équipement est préalablement étalonné avec une solution saline de NaCl. Matière sèche La masse sèche des substrats solides est déterminée après séchage dans une étuve à 130°C pendant deux jours (suivi d'un retour à température ambiante dans un dessiccateur). Leur teneur en eau est déterminée selon la formule. Teneur en eau = 100*((masse humide - masse sèche)/ masse humide) Flore initiale ou résiduelle En routine, les vérifications de la flore présente dans le milieu sont effectuées de la manière suivante. Un fragment de substrat est inoculé sous hotte, à l'aide d'une spatule préalablement stérilisée : ^ d'une part dans du LB (Lennox Broth) liquide autoclavé (10 g/L de tryptone ; 5 g/L d'extrait de levure ; 5 g/L de chlorure de sodium), ^ d'autre part sur du PDA (Potato Dextrose Agar : 4 g/L extrait de pomme de terre ; 20 g/L de dextrose ; 15 g/L d'agar). Le milieu LB est mis à incuber à 37°C sous agitation (300 rpm) et l'absence de trouble est vérifiée après 24 et 48h. En cas de trouble, un étalement est observé au microscope et/ou un prélèvement étalé sur du LB agar. Ce test est pratiqué sur les substrats initiaux et sur les matrices fermentées. Le milieu PDA est mis à incuber à 24°C pour vérifier l'absence ou la présence de développement fongique. Ce test est mené sur les substrats initiaux uniquement. 1.1.2 Matériel microbiologique 1.1.2.1 Origine des souches Le Tableau 1 synthétise la provenance des souches employées dans les exemples. Tableau 1 : Origine des souches utilisées. Souche Provenance Fusarium venenatum Fusarium graminearum Fusarium avenaceum Fusarium tricinctum Fusarium sambucinum Phoma exigua Alternaria alternats Epicoccum nigrum Sclerotinia sclerotiorum Trichoderma harzianum .......................................................................... ................................................. Penicillium camembertü Escherichia coli Obtenues à partir de plants de houblon en dépérissement et isolés sur milieu PDA (Hatsch et al, 2002) DSM (Deutsche Sammlung fur Microorganisms) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prélevée sur du camembert Souches utilisées en biologie moléculaire au laboratoire (Invitrogen SARL) 1.1.2.2 Milieux pour la production de biomasse et de conservation des souches Le milieu PDA est utilisé pour la croissance des champignons en culture de surface et leur conservation. Le milieu LB Agar (milieu LB avec 15 g/L d'agar) est utilisé pour la croissance des bactéries. Le milieu YPG (10 g/L d'extrait de levures ; 20 g/L de peptone ; 20 g/L de glucose) est utilisé pour la croissance des levures et des champignons en phase liquide. 1.1.2.3 Milieu standard de sporulation de Fusarium Le milieu SNA (Synthetischer Nàhrstoffârmer Agar, Tableau 2) est utilisé pour la sporulation de Fusarium (selon Stack, (1989), A Comparaison of the Inoculum Potential of 15 Ascospores and Conidia of Giberella zeae. Canadian Journal of Plant Pathology, 11 :137-142). Le milieu est inoculé avec un fragment de mycélium et incubé à 24°C. Pour récolter les spores produites sur SNA, la surface de la culture est aspergée délicatement d'eau ultrapure (Millipore®) stérile avec une pipette de l OmL. La boîte est doucement remuée. Puis le liquide chargé en spores est aspiré. 20 Tableau 2 : Ingrédients du milieu SNA et quantités pour 1L de culture. composé quantité KH2PO4 1 g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0,5 g KC1 0,5 g Glucose 0,2 g Saccharose 0,2 g Agar 15 g Na2B4O7.10H2O 0,04 mg MnSO4.H2O 0,8 mg Saccharomyces cerevisiae 10 Les spores de Fusarium graminearum utilisées dans ces travaux proviennent de récoltes issues de ce milieu, ainsi que les premières spores de F. venenatum employées. Puis le milieu développé dans ces travaux à base de son de blé a été utilisé comme source de nouvelles spores, qu'il permet d'obtenir en plus grande quantité (voir paragraphe 1.1.2.4). 1.1.2.4 Récolte de spores produites par FMS Pour récolter les spores produites par FMS, la matrice fermentée est mise en suspension dans de l'eau ultrapure. Après une vive agitation, la suspension est mise à infuser 10 à 4°C sous agitation pendant une heure. Le surnageant est pipeté stérilement et introduit dans un Falcon, pour être centrifugé à 10000g. Les spores culottées sont lavées plusieurs fois à l'eau ultrapure puis réunies dans un faible volume. Ce lot est nommé stock FMS. Les spores sont dénombrées au microscope en utilisant une cellule de Neubauer. Les spores sont conservées à -20°C en aliquotes de concentration connue, dans de l'eau ou de 15 l'eau glycérolée à 20%. 1.1.2.5 Evaluation de la biomasse 1.1.2.5.1 Mesures directes 20 Mesure de matière sèche de mycélium Le mycélium total d'une fermentation en milieu liquide est récupéré sous forme de culot suite à la centrifugation du milieu de culture à 10000g pendant 10 minutes à 10°C. Alternativement, le mycélium est récupéré sur le filtre d'une unité de filtration à vide sur 25 0,221..tm (Stericup®, Millipore). Le mycélium est ensuite déposé sur un filtre en microfibres de verre sec pré taré et mis à sécher dans une étuve à 90°C pendant 48 heures. Le mycélium sec sur filtre est pesé et la quantité de mycélium sec produite est déduite. Elle est ensuite rapportée à une masse de mycélium sec par litre de milieu de culture. 30 Mesure de surface de colonisation du mycélium Suite à une inoculation par spot d'une goutte de suspension de spores ou d'un fragment de mycélium sur le substrat-support de culture solide, le champignon se développe (après germination des spores, le cas échéant) en émettant des hyphes dans toutes les directions. Les hyphes se ramifient et une croissance exponentielle est obtenue. Ce 35 développement dans toutes les directions aboutit à une croissance globalement concentrique,5 visible à l'oeil nu, qui peut se caractériser par un diamètre moyen à un temps donné. Ce diamètre moyen correspond à la moyenne de trois mesures de la taille de la colonie, prises en passant par son centre. La taille du mycélium est ensuite déterminée en l'assimilant à un disque, dont la surface, dite surface de colonisation, se calcule de la manière suivante : surface de colonisation = it x (diamètre moyen/2)2. Le suivi de l'évolution de la taille du mycélium qui se développe à la surface du milieu de culture permet de calculer ensuite la vitesse de colonisation du milieu par le champignon. Dénombrement des spores Pour dénombrer les spores d'une matrice solide, une masse connue (m) de celle-ci est reprise dans un tampon. Après agitation, un prélèvement de la suspension est dénombré avec la cellule de Neubauer selon l'exemple 1.1.2.3). L'indice de sporulation (quantité de spores/ g de poids sec de la matrice fermentée) est calculé selon : [spores/µL] x volume de l'extraction / masse de matrice sèche. 1.1.2.5.2 Mesures indirectes L'évaluation de la croissance fongique est pratiquée dans les expériences de FMS en se basant sur l'évolution de la concentration en protéines (mesurées au Bradford), la présence 20 de NADH oxydase et l'évolution de la quantité de N-acétyl-D-glucosamine libre. Des dosages immunologiques d'un constituant fongique pratiqués par ELISA et des suivis par immuno dot blot sont employés pour participer à des évaluations indirectes de la biomasse fongique. 25 1.2 Méthodes 1.2.1 Préparation des milieux 30 1.2.1.1 Réduction de taille La taille réduction de la taille des substrats se fait à l'aide d'un broyeur à marteaux Retsch SK100 Confort, avec une grille de trous coniques de lmm. Un broyeur à marteaux est constitué d'une chambre à l'intérieur de laquelle trois marteaux formant un Y tournent et percutent les substrats qui sont introduits dans cette chambre via une trémie. L'espace entre les marteaux et les parois de la chambre est étroit, ainsi ces chocs provoquent la rupture des substrats, et la réduction des particules formées. 1.2.1.2 Traitements des substrats par autoclavage ou irradiation Autoclavage L'autoclave des substrats est effectué en bouteille en Pyrex®. Le barème du traitement autoclave est 121°C pendant 20 minutes, en cycle liquide. 10 Irradiation (ionisation). L'ionisation est un procédé qui utilise les rayonnements corpusculaires (faisceaux d'électrons) pour préserver ou stériliser un produit, ou encore améliorer ou modifier ses caractéristiques. Les substrats ensachés sont irradiés dans les conditions suivantes : 15 - sous air - à la dose de 100 kGy - par faisceaux d'électron de 2,2 meV d'énergie - à un débit d dose de 1,5 kGy/s 20 - à température ambiante 1.2.1.3 Formulation des milieux 25 L'humidification des substrats a lieu après le traitement par autoclavage ou par irradiation de ceux-ci. Le tampon stérile utilisé est le Tris-Hcl 100 mM, pH=10.5 L'humidification des substrats est appliquée en visant un rapport volume de solution/masse de substrat broyé prédéterminé à l'aide d'un appareil de mesure a,mètre (a,=0.99). Les milieux sont dans chaque cas préparés de telle sorte que toute la solution d'humidification soit 30 absorbée, afin qu'il n'y ait pas d'eau libre.5 1.2.1.4 Conditions de culture de la FMS Les substrats sont introduits dans le fermenteur après avoir été humidifiés à l'aide du tampon Tris-Hcl 100 mM pH=10,5 et ensemencés à 2,5x105 spores/gramme de substrat. La FMS est réalisée sous pression atmosphérique, la température du fermenteur est maintenue à 23°C, l'humidité à 99% et l'oxygène est renouvelé en continu. Le processus de fermentation se fait sur une durée de 4 jours sans agitation. Le temps zéro des cultures correspond au moment où les spores sont inoculées sur le substrat solide. 1.2.1.5 Extraction et formulation des molécules issues du processus de FMS Les matrices fermentées sont extraites du fermenteur après 4 jours d'incubation. Elles sont reprises dans un volume d'eau équivalent à 5 fois leur poids. Après homogénéisation, les matrices sont pressées à l'aide d'un pressoir mécanique. Les jus récupérés, contenant les molécules d'intérêt sont alors lyophilisés. Les molécules d'intérêt présentes dans les poudres issues de la lyophilisation sont testées selon des protocoles standards connus de l'homme du métier. Exemple 2 : Cas du son de blé et de Fusarium venenatum : production de xylanases Le substrat utilisé est du son de blé en provenance de moulins. L'activité de l'eau du son de blé est déterminée en utilisant un appareil de mesure (a,mètre) de chez Fast-Lab (GBX) placé dans une pièce climatisée à 23°C. La valeur de l'Aw obtenu sur ledit substrat est de 0,385. La teneur en humidité obtenue par la détermination de la masse sèche du substrat est de 8%. Le microorganisme utilisé est Fusarium venenatum, souche déposé le 5 septembre 2001 sous le no : ID 386918 à CABI GRC (CAB International Genetic Resource Collection Nosworthy Way Wallingford Oxfordshire OX10 8DE Grande-Bretagne) et identifié le 24 octobre 2001. Les spores du champignon nécessaire à la réalisation de la FMS ont été produites selon la procédure décrite dans l'exemple 2 (1.1.2.3, 1.1.2.4).35 1 kg de son de blé ensachés ont été irradiés selon les conditions suivantes : - sous air - à la dose de 100 kGy - par faisceaux d'électron de 2,2 meV d'énergie - à un débit d dose de 1,5 kGy/s - à température ambiante Le son de blé prétraité est alors extrait du sachet, humidifié à l'aide de 1.2 litre de tampon Tris-Hcl 100 mM pH=10 et ensemencés à 2,5x105 spores/gramme de substrat. Le substrat humidifié et inoculé est alors introduit dans le fermenteur. La FMS est réalisée sous pression atmosphérique, la température du fermenteur est maintenue à 23°C, l'humidité à 99% et l'oxygène est renouvelé en continu. Le processus de fermentation se fait sur une durée de 4 jours sans agitation. Le temps zéro des cultures correspond au moment où les spores sont inoculées sur le substrat solide. La matrice fermentée est extraite du fermenteur après 4 jours d'incubation et reprise dans 5 litres d'eau. Après homogénéisation, la matrice est pressée à l'aide d'un pressoir mécanique. Le jus récupéré contenant la molécule d'intérêt est filtré puis lyophilisé. Les xylanases présentes dans la poudre issue de la lyophilisation sont testées selon le protocole décrit ci-dessous. 100 mg de poudre issue de la lyophilisation est dissous dans 10 ml d'eau (échantillon A). L'activité xylanolytique présente dans la poudre est déterminée par la méthode décrite par Bailey et al. (Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity Journal of Biotechnology, Volume 23, Issue 3, Pages 257-270). Une solution 1% (p/v) de xylan de bouleau (Sigma USA) préparée dans du tampon phosphate 100 mM, pH 6 est utilisée comme substrat. 50 µl de la solution A est introduit dans une cuvette contenant 950 µl de substrat. Le mélange substrat échantillon A est incubé à 37 °C pendant 60 minutes. Et un prélèvement de 100µ1 est effectué toutes les 10 minutes. La réaction d'hydrolyse est stoppée par addition de 800 µl de DNS (dinitrosalicylic acid). Le mélange est chauffé pendant 10 minutes à 100°C et l'absorbance résultant de la réaction d'hydrolyse est mesurée à 550 nm. L'activité est évaluée en dosant les sucres réducteurs libérés par rapport à une courbe étalon réalisée avec une solution standard de xylose. Une unité de xylanase est définie comme le nombre de µmol d'extrémités réductrices libérées par min et par ml d'échantillon A. L'activité xylanolytique présente dans l'échantillon A obtenue par notre procédé de fabrication est égale à 62 U/ ml d'échantillon A, soit 1798 U/ g de poudre. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de molécules d'intérêt par fermentation d'un substrat en phase solide comprenant les étapes suivantes : a) prendre un substrat, b) réduire éventuellement la taille dudit substrat de manière à obtenir des particules dont 100 % ont un diamètre moyen inférieur à 1 mm, c) stériliser le substrat à sec, d) incuber sous agitation le substrat obtenu à l'étape c) avec un microorganisme en suspension à raison de 1x105 à 1x10' spores/gramme de substrat, avantageusement 2,5x105 spores/gramme de substrat de manière à avoir un aW compris entre 0,950 et 0,999, avantageusement compris entre 0,980 et 0,995, e) laisser fermenter à l'état solide dans un réacteur sans agitation pendant 2 à 8 jours, avantageusement 3 à 6 jours, à une température comprise entre 18 et 30 °C sous pression atmosphérique f) stériliser le substrat fermenté obtenu à l'étape e), g) reprendre le substrat obtenu à l'étape f) par un volume d'eau représentant 0,5 à 5 fois la masse de substrat, h) recueillir le liquide de lavage et i) extraire les molécules d'intérêt à partir du liquide recueilli à l'étape h). 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape c) et/ou l'étape f) est réalisée par irradiation. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'étape d) est réalisée en milieu aqueux. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce 30 que le substrat est choisi dans le groupe comprenant la biomasse végétale, les matières premières agricoles, les sous-produits de l'industrie alimentaire et les boues d'épuration.25 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le substrat est choisi dans le groupe comprenant les céréales comme par exemple le maïs, le blé, l'orge et le riz, le son de blé, la paille, les rafles de maïs, le bois de résineux ou de feuillu, les déchets végétaux, notamment les herbes et les feuilles, les déchets d'amidonnerie, la pulpe de betterave, le papier, la bagasse de canne à sucre, les résidus de papeterie. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le microorganisme est choisi dans le groupe comprenant les bactéries, les champignons filamenteux ou non, en particulier les levures. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est Fusarium venenatum déposé le 5 septembre 2001 sous le no : ID 386918 à CABI GRC (CAB International Genetic Resource Collection Nosworthy Way Wallingford Oxfordshire OX10 8DE Grande-Bretagne). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les molécules d'intérêts obtenues sont choisies dans le groupe comprenant les cellulases, les xylanases, les a-amylases, les arabinoxylanases, les a-et f3- glucosidases, les fucosidases, les protéases, les phytases, les phosphohydrolases, les phosphatases, les estérases, les glucosaminidases, les a-et f3-galactosidases, les a-mannosidases et les lipases. 9. Procédé de préparation selon la revendication 1 caractérisé en ce que le substrat est le son de blé, le microorganisme est Fusarium venenatum déposé 5 septembre 2001 sous le no : ID 386918 à CABI GRC (CAB International Genetic Resource Collection Nosworthy Way Wallingford Oxfordshire OX10 8DE Grande-Bretagne) et les molécules d'intérêts celles de la revendication 8. 10. Utilisation des molécules d'intérêts obtenus par un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour l'alimentation humaine et l'alimentation animale, dans l'industrie du papier, l'industrie des détergents et l'industrie des textiles, pour le traitement et la valorisation des déchets végétaux, en particulier la production du bioéthanol et pour la bio protection des cultures.