Brevet FR2956818A1 — publié le 20110902

-1- Domaine de l'invention La présente invention se situe dans le domaine cosmétique et pharmaceutique, et plus particulièrement dans le domaine de la dermatologie. L'invention concerne l'utilisation cosmétique d'un hydrolysat peptidique de lin (genre Linum), en tant qu'agent actif, dans une composition pour apaiser la peau. L'invention concerne également l'utilisation cosmétique d'un hydrolysat peptidique de lin (genre Linum), en tant qu'agent actif, dans une composition pour prévenir l'altération ou rétablir la fonction barrière de la peau. L'invention concerne encore l'utilisation cosmétique d'un hydrolysat peptidique de lin (genre Linum), dans une composition pour prévenir ou lutter contre les irritations cutanées. L'invention concerne encore l'utilisation cosmétique dans une composition apaisante, d'un hydrolysat peptidique de lin (genre Linum), en tant qu'agent actif activateur de la HMG-CoA réductase. L'invention concerne encore un procédé de traitement cosmétique destiné à diminuer ou supprimer l'effet secondaire irritant d'un composé présent dans une composition 15 cosmétique. L'invention concerne encore l'utilisation d'un hydrolysat peptidique de lin pour préparer une composition pharmaceutique anti-inflammatoire. De préférence, l'agent actif provient de l'hydrolyse de protéines de lin et contient principalement des peptides. Il peut être utilisé seul ou en association avec au moins un 20 autre agent actif. Arrière-clan de l'invention La fonction première de l'épiderme est de constituer une barrière entre l'environnement extérieur et le milieu intérieur. C'est la couche la plus externe de l'épiderme, le stratum corneum, qui assure cette fonction. Il est composé de kératinocytes 25 au stade ultime de leur différenciation, les cornéocytes, scellés les uns aux autres par un épais ciment lipidique intercellulaire, à la fois souple et imperméable. Ce ciment lipidique contient du cholestérol, un lipide neutre activement synthétisé par les kératinocytes des couches intermédiaires de l'épiderme. L'enzyme membranaire qui joue un rôle clé dans cette synthèse est la 3-hydroxy-3-methylglutaryl- Coenzyme A (HMG-CoA) -réductase 30 (E.C. 1.1.1.34), qui existe au moins sous deux isoformes dans la peau humaine (Luskey et al., J Biol Chem., 1985 260(18), p.10271-7). A la suite d'une altération brutale de la barrière cutanée, on observe une augmentation importante et rapide de la synthèse de cholestérol, associée à une 2956818 -2- augmentation de l'expression et de l'activité de la HMG-CoA réductase (Menon G.K. et al., J. Lipid, Res., 1985, (26), P. 418-427). D'autre part, l'inhibition médicamenteuse, par l'administration topique de statines, confirme l'importance du cholestérol dans la fonction barrière épidermique et le rôle central de l'HMG-CoA réductase (Proksch E. et al., British 5 J. Dermatol., 1993, (128), p. 473-482). La plupart des symptômes liés à la sensibilité de la peau résultent de processus irritatifs qui mettent en jeux des réactions cellulaires localisées aboutissant à la libération de médiateurs chimiques tels que les cytokines, la substance P ou les prostaglandines. L'irritation cutanée s'accompagne généralement d'une altération de la fonction barrière. 10 La présente invention a pour principal objectif de fournir un nouvel agent actif apaisant, capable d'apporter une solution à la sensibilité de la peau. Afin d'apaiser les sensations d'inconfort des peaux sensibles, il faut d'une part limiter les manifestations de l'irritation, comme les érythèmes et les picotements, en freinant la libération des médiateurs cellulaires de l'inflammation, et d'autre part prévenir l'altération ou rétablir la fonction barrière de l'épiderme. Dans ce domaine particulier, l'apport direct de substituts lipidiques, tels que les céramides (EP 1272148, US2007576937) ou certains dérivés du cholestérol (FR 2 789 312), a largement été décrit. Par ailleurs, l'utilisation de polyphénols pour limiter la libération de médiateurs de l'inflammation a également été décrite (WO/2004/058282). Toutefois, à ce jour, aucun document ne décrit ou ne suggère l'objet de l'invention ; c'est-à-dire qu'un hydrolysat peptidique de lin (genre Linum) peut avoir des propriétés intéressantes pour apaiser les peaux sensibles et pour prévenir ou lutter contre les irritations de la peau. Exposé de l'invention Le premier objet de la présente invention est l'utilisation cosmétique d'un hydrolysat 25 peptidique de lin (genre Linum), en tant qu'agent actif, dans une composition pour apaiser la peau. On entend par peau, l'ensemble des tissus de recouvrement constituant la peau et les muqueuses, y compris le cuir chevelu. Il est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général, et plus 30 particulièrement aux êtres humains. Les inventeurs ont en particulier mis en évidence que l'hydrolysat peptidique de lin a des propriétés apaisantes lorsqu'il est appliqué sur la peau. Ces propriétés ont été 2956818 -3- démontrées en appliquant une composition comprenant l'hydrolysat sur la peau et en soumettant la peau à divers agents irritants expérimentaux. L'agent actif selon l'invention peut être obtenu par extraction de protéines d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des composés de nature peptidique. 5 On entend par « composés de nature peptidique », les fragments de protéines et les peptides présents dans l'hydrolysat peptidique selon l'invention. L'utilisation d'hydrolysats peptidiques, et en particulier d'hydrolysats peptidiques de bas poids moléculaires, présente de nombreux avantages en cosmétique. Outre le fait de générer des composés de nature peptidique qui ne préexistaient pas dans le mélange 10 protéique de départ, l'hydrolyse et la purification permettent d'obtenir des mélanges plus stables, plus facilement standardisables et ne provoquant pas de réactions allergiques en dermato-cosmétique. De très nombreuses protéines de plantes sont susceptibles de contenir des peptides bioactifs au sein de leur structure. L'hydrolyse ménagée permet de dégager ces composés 15 de nature peptidique. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les composés de nature peptidique ensuite. 20 Selon un mode de réalisation préférée, l'agent actif provient de l'hydrolyse d'une des nombreuses plantes de la famille des linacées, du genre Linum (lin). Préférentiellement selon l'invention, on utilise l'espèce cultivée Linum usitatissimum L. Préférentiellement, l'agent actif selon l'invention est obtenu par extraction des protéines de lin, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des composés de nature peptidique, selon le protocole décrit dans la demande de brevet FR 2 918893. L'hydrolysat peptidique obtenu selon le protocole décrit dans cette demande est caractérisé par une concentration en composés de nature peptidique, déterminée par la méthode de Lowry, comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/1. L'analyse physico-chimique de l'hydrolysat montre que son pH est compris entre 4 et 7, et préférentiellement, entre 5 et 6, l'extrait sec titre entre 1 à 8 g/1, et de manière préférée entre 2 et 5 g/l, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/1 et sa teneur en sucres de 0,5 à 2,5 g/1. 2956818 -4- D'autre part, l'analyse des composés de nature peptidique montre que l'hydrolysat comprend uniquement des peptides de bas poids moléculaires. L'analyse de ces peptides a montré que leur poids moléculaire est inférieur à 10 kDa. L'hydrolysat se présente sous une forme diluée dans un solvant physiologiquement 5 acceptable et classiquement utilisé par l'homme du métier, choisi parmi l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. Après cette étape de dilution, l'agent actif peut être encapsulé ou inclus dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique tels que les liposomes ou toute autre microcapsule utilisée 10 dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites. Selon un aspect particulier de l'invention, l'hydrolysat peptidique de lin est utilisé en tant qu'agent actif dans une composition pour prévenir l'altération ou rétablir la fonction 15 barrière de la peau. Selon un autre aspect de l'invention, l'hydrolysat peptidique de lin est utilisé avantageusement, en tant qu'agent actif, dans une composition cosmétique destinée à protéger la peau contre tous types d'agressions extérieures. On entend par l'expression « agressions extérieures », les agressions que peut 20 produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer des agressions telles que la pollution, les UV (rayonnements ultra-violets), les oxydants, ou encore les produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs, les parfums, ou certains principes actifs utilisés en dermato-cosmétologie, tels que les actifs kératolytiques, exfoliants, les alpha-hydroxy-acides (notamment acides lactique, glycolique, citrique), les 25 3-hydroxy-acides (notamment acides salicylique, n-octanoyl-5-salicylique) et les rétinoïdes (notamment rétinol et ses esters), les actifs anti-poux. On peut encore citer les agressions mécaniques, telles que les abrasions, le rasage ou l'épilation. Les conditions climatiques extrêmes sont également une cause importante d'agression cutanée. Ces agressions extérieures aboutissent à une altération de la fonction barrière qui se traduit par un 30 inconfort cutané, des phénomènes sensoriels désagréables, tels que des tiraillements ou des démangeaisons, voire des fragilités excessives et des rougeurs. En particulier, l'invention a pour objet l'utilisation de l'hydrolysat selon l'invention dans une composition cosmétique destinée à prévenir ou traiter les dommages causés à la peau par les rayonnements UV. 2956818 -5- En particulier, l'invention a pour objet l'utilisation de l'hydrolysat selon l'invention dans une composition cosmétique destinée à prévenir ou traiter les dommages causés à la peau par les oxydants. En particulier, l'invention a pour objet l'utilisation de l'hydrolysat selon l'invention 5 dans une composition cosmétique destinée à prévenir ou traiter les dommages causés à la peau par des agressions extérieures de la peau choisies parmi les traitements mécaniques tels que le rasage ou l'épilation, les décapages trop intenses par les détergents, les conditions climatiques extrêmes ou les variations brutales de température et d'hygrométrie. L'invention concerne encore l'utilisation cosmétique d'un hydrolysat peptidique de lin 10 dans une composition pour prévenir ou lutter contre les irritations cutanées. Ainsi, il a été démontré par les inventeurs que l'agent actif est capable de diminuer voire de supprimer un effet irritant cutané expérimental lors de tests cliniques sur des volontaires sains soumis à un stress irritant. 15 L'invention concerne encore l'utilisation cosmétique dans une composition apaisante, d'un hydrolysat peptidique de lin (genre Linum), en tant qu'agent actif activateur de la HMG-CoA réductase. L'activité biologique caractéristique selon l'invention est définie in vitro par la capacité du peptide à activer l'HMG-CoA réductase, soit par l'augmentation de la synthèse 20 protéique de la HMG-CoA réductase (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique de la HMG-CoA réductase), soit par l'augmentation de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase, soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine HMG-CoA réductase ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager. 25 On entend par « application topique », le fait d'appliquer ou d'étaler l'agent actif selon l'invention, ou une composition le contenant, à la surface de la peau ou d'une muqueuse. On entend par « physiologiquement acceptable », que l'hydrolysat peptidique selon l'invention, ou une composition le contenant, est approprié pour entrer en contact avec la peau ou une muqueuse sans provoquer de réactions de toxicité ou d'intolérance. 30 Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'agent actif selon l'invention est présent dans les compositions de l'invention en quantité efficace, soit à une concentration comprise entre 0,0001 % et 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % environ par rapport au poids total de la composition finale. 2956818 -6- La composition utilisable selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, parentérale ou topique, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier, en particulier pour des compositions cosmétiques ou dermatologiques. Avantageusement, les compositions selon l'invention sont destinées à une 5 administration par voie topique. Ces compositions doivent donc contenir un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques. Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions 10 multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être 15 appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau. L'ensemble de ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des anti-oxydants, des 20 colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, d'autres principes actifs cosmétiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc. Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs 25 proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à des concentrations allant de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la 30 composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition. 2956818 -7- Il est bien entendu que l'agent actif selon l'invention peut être utilisé seul ou bien en association avec d'autres principes actifs. Avantageusement, les compositions utilisables selon l'invention contiennent, en outre, divers principes actifs destinés à favoriser l'action de l'agent actif selon l'invention. On 5 peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : d'autres agents actifs peptidiques, des extraits de végétaux, des agents cicatrisants, anti-âge, antirides, apaisants, anti-radicalaires, anti-UV, des agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique, des agents hydratants, antibactériens, antifongiques, anti-inflammatoires, anesthésiques, des agents modulant la différenciation, 10 la pigmentation ou la dépigmentation cutanée, des agents stimulant la pousse des ongles ou des cheveux. Préférentiellement, on utilisera un agent anti-radicalaire ou antioxydant. L'invention a pour deuxième objet un procédé de traitement cosmétique destiné à diminuer ou supprimer l'effet secondaire irritant d'un agent actif présent dans une 15 composition cosmétique, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau à traiter une composition comprenant un hydrolysat peptidique de lin selon l'invention. Ainsi selon cet aspect de l'invention, les compositions peuvent comprendre en outre des agents actifs à effet secondaire irritant et donc susceptibles de provoquer une irritation cutanée spécialement chez les personnes à peau sensible. Comme principes actifs 20 susceptibles d'avoir un effet secondaire irritant, on peut citer par exemple : les agents kératolytiques tels que les a-hydroxy-acides comme les acides glycolique, lactique, malique, citrique, tartrique, mandélique, et leurs dérivés ; les ss-hydroxy-acides comme l'acide salicylique et ses dérivés ; les a-céto-acides comme l'acide ascorbique ou vitamine C et ses dérivés ; les rétinoïdes comme le rétinol et ses esters, le rétinal, l'acide rétinoïque 25 et ses dérivés ; le minoxidil et ses dérivés ; les sels de lithium ; les teintures ou colorants capillaires comme la para-phénylène diamine (p- PDA) et certains de ses dérivés tels que la N-phenyl p-PDA et le toluène 2,5- diamine sulfate ; la méta-phénylène diamine (m-PDA) et certains de ses dérivés tels que la toluène 3,4-diamine ; l'ortho-phénylène diamine (o-PDA) ; les solutions alcooliques parfumantes (parfums, eaux de toilette, après-rasage, 30 déodorants) ; les agents anti-transpirants (certains sels d'aluminium) ; les actifs dépilatoires ou de permanentes (thiois, ammoniaque) ; les dépigmentants (hydroquinone) ; les actifs anti-poux ; les agents détergents (ioniques et non ioniques) ; et leurs mélanges. 2956818 -8- L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'un hydrolysat peptidique selon l'invention pour préparer une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou traiter les inflammations cutanées, telles que les érythèmes, en particulier dus aux ultraviolets, le prurit, l'urticaire, les piqûres d'insectes, les allergies, ou encore l'alopécie dans ses phases 5 inflammatoires. Selon cette forme de l'invention, les compositions seront appropriées à une administration orale pour un usage pharmaceutique. Ainsi les compositions pourront notamment se présenter sous forme de comprimés, capsules, gélules, pâtes à mâcher, poudres à consommer telles quelles ou à mélanger extemporanément avec un liquide, 10 sirop, gel, et toute autre forme connue de l'homme du métier. Ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des conservateurs, d'autres principes actifs pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, etc. 15 Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. 20 Exemple 1 : Préparation d'agent actif à partir de lin (Linum usitatissimum L.) L'agent actif est obtenu à partir de plantes de l'espèce Linum usitatissimum L. Bien entendu l'extrait peut être préparé à partir de plantes d'au moins l'une quelconque des nombreuses variétés et espèces appartenant au genre Linum. Dans une première étape, 1 kg de graines de lin décortiquées sont broyées dans un 25 broyeur à céréales. La farine obtenue est délipidée par l'action d'un solvant organique, l'hexane. Après filtration et séchage sous vide, la poudre obtenue est mise en suspension clans une solution aqueuse alcaline (dilution au 1/10) pH 10 contenant 1 % de polyvinylpolypyrrolidone (Polyclar V ISP). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant un temps suffisamment long pour permettre la solubilisation des fractions 30 solubles. La température d'extraction est variable (comprise entre 4 et 80°C) ; préférentiellement l'opération sera réalisée à froid. Après cette phase d'extraction, le milieu est clarifié par centrifugation puis filtré sur filtre à plaque. Ce filtrat, qui contient les fractions solubles du lin, est ensuite soumis à une précipitation des protéines en faisant varier la force ionique en milieu neutre ou acide, ce qui permet d'éliminer les composants 2956818 -9- glucidiques solubles, les lipides et les acides nucléiques. Le milieu est amené à pH 3,5. Le surnageant est éliminé et le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol, puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. A ce stade, on obtient environ 50 grammes de poudre de couleur jaune clair d'extrait 5 protéique brut contenant : Protéines : 75 % - Glucides : 20 % - Lipides : 5 % 10 Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant. L'extrait protéique brut est alors soumis à une série d'hydrolyses ménagées et sélectives consistant en des hydrolyses chimiques et enzymatiques en présence de 0,5 % de PVPP (Polyclar V) et d'endopeptidases à cystéine (papaïne, ficine). Après réaction l'hydrolysat est filtré sur plaque puis sur cartouche stérilisante (0,2 µm). 15 On obtient alors un hydrolysat de couleur claire, titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec. On procède ensuite à une ultrafiltration de la solution sur une cartouche de filtration Millipore Helicon (seuil de coupure ; 1 kDa). Les hauts poids moléculaires contenus dans le retentât sont écartés, le filtrat est conservé. L'analyse montre que les peptides du filtrat ont un poids moléculaire inférieur à 10 kDa. 20 Le filtrat est alors dilué de telle sorte que la concentration en composés de nature peptidique, déterminée par la méthode de Lowry, soit comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/1. L'analyse physico-chimique de 1'hydrolysat végétal, qui constitue l'agent actif, montre que son pH est compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6, l'extrait sec titre de 1 à 8 g/1 et de manière préférée entre 2 25 et 5 g/l, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5g/1, et préférentiellement, entre 0,5 à 2 g/l et sa teneur en sucres entre 0,5 et 2,5 g/l. Une variante du protocole consiste à effectuer une purification de l'hydrolysat obtenu par chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne TSK gel (TosoHaas) avec un tampon phosphate pH 7. 30 Exemple 2 : Etude de l'effet protecteur de l'hydrolysat selon l'exemple 1 sur les cellules cutanées soumises à un stress oxydatif Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur de 1'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 % vis-à-vis de kératinocytes humains normaux soumis à un stress 2956818 -10- oxydatif, provoqué par de l'eau oxygénée (H2O2) à 2 mM. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par la technique au MTT. Protocole : Les kératinocytes humains normaux sont traités avec de l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 %, pendant 24 heures, soumis à un stress oxydatif provoqué par de 5 l'H2O2 à 2 mM pendant 30 minutes, puis cultivés encore 24 heures en présence de la même concentration d'hydrolysat selon l'exemple 1. Des contrôles non traités par le peptide sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont incubées dans une solution contenant 0,1 mg/ml de MTT (3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium, bromure). Ce composé est absorbé par les cellules vivantes puis 10 métabolisé par les enzymes mitochondriales en un composé bleu violet, le formazan, qui sera dosé par spectrophotométrie à 540 nm. La densité optique (D.O.) est alors directement proportionnelle à l'activité enzymatique mitochondriale ainsi qu'au nombre de cellules vivantes. Résultats : L'évaluation de la viabilité cellulaire par la technique du MTT montre que 15 l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 % augmente sensiblement la viabilité cellulaire des kératinocytes humains normaux. Conclusion : L'hydrolysat selon l'exemple 1 protège efficacement les cellules cutanées contre les effets cytotoxiques d'un stress oxydatif. Exemple 3 : Etude de l'effet protecteur de l'hydrolysat selon l'exemple 1 sur les 20 cellules cutanées agressées par un détergent Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur de l'hydrolysat selon l'exemple 1 vis-à-vis de kératinocytes humains normaux agressés par un détergent, en particulier le SDS. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par la technique au MTT. 25 Protocole : Les kératinocytes humains normaux sont traités avec de l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5%, pendant 24 heures, soumis à un contact avec du SDS à 15 pg/ml pendant 24 heures, en présence de la même concentration d'hydrolysat selon l'exemple 1. Des contrôles non traités par le peptide sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont incubées dans une solution contenant 0,1 mg/ml de 30 MTT (3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium, bromure), selon le protocole décrit selon l'exemple 6. 2956818 -11- Résultats : L'évaluation de la viabilité cellulaire par la technique du MTT montre que 1'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 % augmente sensiblement la viabilité cellulaire des kératinocytes humains normaux. Conclusion : L'hydrolysat selon l'exemple 1, protège efficacement les cellules cutanées contre l'agression par un détergent de type SDS. Exemple 4 : Etude ex vivo de l'effet de l'hydrolysat selon l'exemple 1 sur la sécrétion d'interleukine-I (IL-1 alpha) par des biopsies de peaux humaines Le but de cette étude est de déterminer l'effet ex vivo de l'hydrolysat selon l'exemple 1 sur la production du médiateur cellulaire de l'inflammation IL-1 alpha, par des biopsies de 10 peaux humaines cultivées en conditions standards ou soumises à un stress par des rayonnements UVB ou du SDS. Protocole : Des biopsies de peau humaine de 5 mm de diamètre sont maintenues en culture à l'interface air-liquide, en présence de milieu de culture standard. Les échantillons sont traités avec de l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5%, pendant 24 heures, puis irradiés 15 par des UVB (200 mJ/cm2) et remis en culture 24 heures, ou soumis à un contact avec du SDS à 2,5 % pendant 24 heures, en présence de la même concentration d'hydrolysat selon l'exemple 1. Des contrôles non traités par le peptide sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, la quantité d'interleukine-1 alpha relarguée dans le milieu de culture est dosée par technique ELISA. 20 Résultats : La quantité d'IL-1 alpha relarguée par les biopsies de peaux après un stress UVB ou SDS est diminuée, si les échantillons ont été traités par l'hydrolysat selon l'exemple 1 Conclusion : L'hydrolysat selon l'exemple 1 diminue sensiblement l'inflammation induite par les UBV ou le détergent SDS. 25 Exemple 5 : Etude de l'effet protecteur de l'hydrolvsat selon l'exemple 1 sur les cellules cutanées soumises à des rayonnements ultraviolet (UVB) Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur de 1'hydrolysat selon l'exemple 1 vis-à-vis de kératinocytes humains normaux soumis à un stress par des rayonnements UVB. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par la 30 technique au MTT. 2956818 -12- Protocole : Les kératinocytes humains normaux sont traités avec l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 %, pendant 24 heures, irradiés par des UVB (50 mJ/cm2) puis cultivés encore 24 heures en présence de la même concentration d'hydrolysat selon l'exemple 1. Des contrôles non traités et irradiés sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont incubées dans une solution contenant 0,1 mg/ml de MTT (3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium, bromure), et le MTT est dosé selon le protocole décrit dans l'exemple 6. Résultats : L'évaluation de la viabilité cellulaire par la technique du MTT montre que l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 %, augmente sensiblement la viabilité cellulaire après 10 irradiation par les UVB. Conclusion : L'hydrolysat selon l'exemple 1 augmente la viabilité cellulaire et protège efficacement les cellules cutanées contre les effets cytotoxiques des rayonnements UVB. Exemple 6 : Etude de l'expression de la HMG-CoA réductase dans des biopsies de veaux, en présence de l'hydrolysat selon l'exemple 1 15 Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 1% sur l'expression de la HMG-CoA réductase. Protocole : Des échantillons de peaux humaines sont mis en culture à l'interface air/liquide. L'hydrolysat selon l'exemple 1 à 1 % est appliqué topiquement, puis les échantillons sont incubés durant 24 heures ou 48 heures. 20 Ces échantillons de peaux sont ensuite fixés avec du formaldéhyde puis inclus dans la paraffine. Des coupes de 2 à 3 µm sont alors réalisées. L'immunomarquage est effectué après démasquage des sites spécifiques par traitement micro-onde puis incubation dans de la trypsine. L'immunomarquage est réalisé à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique de la HMG-CoA réductase (Millipore, Upstate), puis d'un anticorps secondaire, 25 couplé à un marqueur fluorescent. Les coupes de peau sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope). Résultats : Les observations microscopiques montrent une fluorescence plus forte dans les couches supérieures de l'épiderme des peaux traitées par l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 1 %, par rapport au contrôle non traité. 30 Conclusion : L'hydrolysat selon l'exemple 1 stimule l'expression de la HMG-CoA réductase, dans les couches supérieures de l'épiderme. 2956818 -13- Exemple 7 : Etude de l'expression de la HMG-CoA réductase dans les kératinocytes humains normaux. en présence de l'hydrolvsat selon l'exemple 1 Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'hydrolysat selon l'exemple 1 sur l'expression de la HMG-CoA réductase dans les kératinocytes humains normaux. 5 Protocole : Des kératinocytes humains normaux en culture sont traités avec l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 % pendant 24 ou 48 heures (le milieu contenant l'actif est changé toutes les 24 heures). Les cellules sont ensuite lavées, fixées au méthanol froid pendant 4 minutes à 4°C. Les cellules sont incubées en présence d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique de la HMG-CoA réductase (Millipore, Upstate), puis d'un anticorps secondaire, 10 couplé à un marqueur fluorescent. Les cellules sont alors examinées au microscope à Epifluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope). Résultats : Les observations microscopiques montrent une fluorescence cytoplasmique plus intense dans les cellules traitées par l'hydrolysat selon l'exemple 1 à 0,5 %. Conclusion : L'hydrolysat selon l'exemple 1 stimule l'expression de la HMG-CoA 15 réductase, dans les kératinocytes humains normaux. Exemple 8: Etude clinique de l'effet de l'hydrolysat selon l'exemple 1 sur l'amélioration de la fonction barrière du Stratum corneum et la réduction des dommages de la peau. Le but de cette étude est d'évaluer cliniquement l'effet protecteur sur la peau de 20 l'hydrolysat selon l'exemple 1 vis-à-vis d'agressions extérieures. Le modèle d'agressiosn choisi est un stress par du SDS (sodium dodecyl sulfate). Protocole : Le test a été réalisé en double aveugle. 12 volontaires ont appliqué 2 fois par jour la crème formulée à 1.5% d'hydrolysat selon 25 l'exemple 1 pendant 21 jours sur les avant bras. A D21 les volontaires ont subi un stress léger, par application d'un patch de SDS (de 0.25% à 2% selon les volontaires) sur la zone traitée. La concentration de SDS appliquée a été choisie pour provoquer une rougeur modérée de score 2 chez tous les volontaires, selon le système d'évaluation de l'érythème basé sur l'évaluation de Frosch et Kligman : 30 0 = Pas d'érythème 1 = Rougeur légère, par petits points ou diffuse 2956818 -14- 2 = Rougeur modérée 3 = Rougeur intense 4 = Rougeur inflammatoire et oedème Le patch de SDS a été maintenu pendant 24 heures sous occlusion. 5 Après le stress, les volontaires ont continué à appliquer la crème pendant 1 semaine. Les mesures ont été faites à T0, T21 jours (avant le stress) puis à T24H après le stress, à T48H et T 1 semaine et T 2 semaines après le stress. Les analyses de la peau ont été faites au VivaScope®, et l'étude a porté sur le stratum corneum et sur l'épiderme non corné. 10 Appareillage : Le Vivascope de Lucid (Rochester) est un imageur confocal permettant d'acquérir des images de la peau « couche par couche », in vivo, de façon non invasive avec une résolution cellulaire. Résultats: Résultats sur le stratum corneum après 21 jours de traitement : 15 Chez 90% des volontaires on observe une diminution hautement significative (p=0.00195) de l'épaisseur du stratum corneum dans la zone traitée par rapport à la zone contrôle traitée par le placebo. L'observation montre une meilleure organisation des cellules, un compactage plus important des cornéocytes, ce qui est le signe d'une amélioration de la fonction barrière du stratum corneum. 20 Résultats sur le stratum corneum à 24H, 48H, et 1 semaine après le stress SDS : Le stress SDS provoque à l'échelle microscopique la dégradation par dissolution des lipides du stratum corneum, conduisant à une diminution de l'épaisseur du stratum corneum, à l'apparition d'une parakératose (persistance des noyaux dans le stratum corneum) et à l'apparition de cornéocytes isolés. (Astner S et al., Non-invasive evaluation 25 of the kinetics of allergic and irritant contact dermatitis.J Invest Dermatol. 2005 Feb;124(2):351-9 ; Astner S et al., Noninvasive evaluation of allergie and irritant contact dermatitis by in vivo reflectance confocal microscopy. Dermatitis. 2006 Dec;17(4):182-91.). En accord avec les résultats de la littérature, à 24H, 48H et 1 semaine après le stress, 30 l'observation montre une diminution de l'épaisseur du stratum corneum, ainsi qu'une parakératose dans les zones contrôle traitées par le placebo. 2956818 -15- Au contraire, dans les zones traitées avec l'hydrolysat selon l'exemple 1, il n'y a pas de changement de l'épaisseur du stratum corneum, les cellules n'ont pas changé de morphologie et on ne note pas de parakératose. Résultats sur l'épiderme après 21 jours de traitement : 5 L'observation montre une diminution de l'épaisseur de l'épiderme, due à un plus grand compactage et une meilleure organisation des différentes couches de cellules non cornéifiées, ce qui est un signe de bonne santé de l'épiderme. Après le stress au SDS, on peut noter que la diminution de l'épaisseur de l'épiderme dans la zone contrôle, traité par le placébo, est plus importante que dans la zone traitée par 10 l'hydrolysat selon l'exemple 1. Dans la zone traitée, les granulocytes présentent une morphologie homogène, les cellules sont cohésives et plus petites que dans la zone placebo, signe d'un renouvellement cellulaire plus élevé, et signe d'une meilleure santé de la peau, que dans la zone contrôle. Les mesures de l'épaisseur de l'épiderme conduites à 24H, 48H et 1 semaine après le 15 stress montrent que l'épaisseur de l'épiderme se reconstitue plus rapidement dans la zone traitée. Conclusions : Cette étude démontre l'effet protecteur vis-à-vis d'un stress au SDS. La peau traitée par 1'hydrolysat selon l'exemple 1 apparait mieux préparée au stress, grâce à un renforcement 20 de la barrière cutanée et une meilleure cohésion des cornéocytes. D'autre part, l'hydrolysat selon l'exemple 1 a permis à l'épiderme entier de garder son intégrité et de mieux réaliser sa fonction de barrière vis-à-vis des agressions extérieures. Exemple 9 : Préparation de compositions 1 - Crème protection solaire: Noms commerciaux I Noms INCI I % massique PHASE A Eau déminéralisée Aqua (Water) qsp Pemulen TRI Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate 0,40 Crosspolymer Glycerine Glycerin 3,00 Nipastat Sodium Sodium Methylparaben (and) Sodium 0,15 Ethylparaben (and) Sodium Butyl paraben (and) Sodium Propylparaben (and) Sodium Isobutylparaben 2956818 -16- Noms commerciaux ( Noms INCI j % massique PHASE B Parsol MCX Ethylhexyl Methoxycinnamate 7,50 Eusolex 4360 Benzophenone-3 3,00 Parsol 1789 Butyl Methoxydibenzoylmethane 2,00 Myritol 318 Caprylic/Capric Triglyceride 4,00 Emulgade SEV Hydrogenated Palm Glycerides (and) 5,00 Ceteareth-20 (and) Ceteareth-12 (and) Cetearyl Alcohol Propylparaben Propylparaben 0,15 Nacol 16-98 Cetyl Alcohol 1,00 PHASE C TEA 1 Triethanolamine 0,20 PHASE D Hydrolysat selon l'exemple 1 0,5 % Parfum Parfum (Fragrance) qsp Colorant qsp Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés séparément entre 70°C et 75°C. La phase B est émulsionnée dans la phase A sous agitation. La phase C est ajoutée, à 45°C, en augmentant l'agitation. La phase D est ensuite additionnée lorsque la température 5 se situe en dessous de 40°C. Le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25°C sous vive agitation. 2 ûLait après-soleil : Noms commerciaux Noms INCI % massique PHASE A Montanov L C 14-22 Alcohols (and) C 12-20 3,00 Alkyl Glucoside Waglinol 2559 Cetearyl Isononanoate 4,00 Tegosoft TN C12-15 Alkyl Benzoate 3,00 Huile de Noyaux d'Abricot Prunus Armeniaca (Apricot) Kernel 2,00 Oil 2956818 -17- Noms commerciaux Noms 1NCI % massique Huile d'Avocat Persea Gratissima (Avocado) Oil 1,00 Abil 350 Dimethicone 1,00 PHASE B Eau déminéralisée Aqua (Water) qsp PHASE C Simulgel EG Sodium Acrylate/Acryloyldimethyl 0,4 Taurate Copolymer (and) Isohexadecane (and) Polysorbate 80 Copolymer (and) Polysorbate 80 PHASE D Phenonip Phenoxyethanol (and) 0,30 Methylparaben (and) Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben Ethylparaben and Propylparaben and Buthylparaben Germall 115 Imidazolidinyl Urea 0,20 PHASE E Hydrolysat peptidique selon 0,1 % exemple 1 Préparer la phase A sous agitation. Incorporer la gomme xanthane progressivement, sous agitation défloculeuse. Les phases C et D seront incorporées une fois le gel terminé. La phase E, préparée préalablement jusqu'à parfaite dissolution de la DHA, sera rajoutée 5 ensuite. Ajuster le pH si nécessaire à 4 - 4,5. Colorer et parfumer. ûCrème protectrice de jour : Noms commerciaux Noms INCI % massique Phase A Emulium Delta Cetyl alcohol (and) Glyceryl Stearate (and) PEG- 4,00 75 Stearate (and) Ceteth-20 (and) Steareth-20 Lanette O Cetearyl Alcohol 1,50 D C 200 Fluid/100cs Dimethicone 1,00 DUB 810C Coco Caprylate/Caprate 1,00 DPPG Propylene Glycol Dipelargonate 3,00 DUB DPHCC Dipentaerythrityl Hexacaprylate/Hexacaprate 1,50 Cegesoft PS6 Vegetable Oil 1,00 Vitamine E Tocopherol 0,30 Phenonip Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and) 0,70 Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben Phase B Eau déminéralisée Aqua qsp 100 Glycerine Glycerin 2,00 Carbopol EDT 2020 Acrylates/C10-30Alkyl Acrylate Crosspolymer 0,15 Keltrol BT Xanthan Gum 0,30 Phase C Sodium Hydroxide (sol.à Sodium Hydroxide 0,30 10%) Phase D Eau déminéralisée Aqua 5,00 Stay-C 50 Sodium Ascorbyl Phosphate 0,50 Phase E -18- 2956818 -19- Butylene Glycol Butylene Glycol 2,00 Dekaben CP Chlorphenesin 0,20 Phase F GP4G Water (and) Artemia Extract 1,00 Hydrolysat selon l'exemple 1 2 % Préparer la phase A et chauffer à 75°C sous agitation. Préparer la phase B en dispersant le carbopol, puis la gomme xanthane sous agitation. Laisser reposer. Chauffer à 75°C. A température, émulsionner A dans B sous agitation rotor-stator. Neutraliser avec la phase C sous agitation rapide. Après refroidissement à 40°C, additionner la phase D, puis la phase E. Le refroidissement est poursuivi sous agitation légère et la phase F rajoutée. REVENDICATIONS1. Utilisation cosmétique d'un hydrolysat peptidique de lin (genre Linum), en tant qu'agent actif, dans une composition pour apaiser la peau. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent actif provient de l'hydrolyse de graines de lin de l'espèce Linum usitatissimum L. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'agent actif 10 contient entre 0,1 et 5 g/1, et préférentiellement entre 0,5 à 2 g/1 de composés de nature peptidique. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'agent actif est dilué dans un solvant choisi parmi l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le 15 butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. 5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes dans une composition pour prévenir l'altération ou rétablir la fonction barrière de la peau. 6. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition cosmétique est destinée à protéger la peau contre les agressions extérieures. 25 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que les agressions extérieures sont les rayonnements UV. 8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que les agressions extérieures sont causées par les oxydants. 9. Utilisation selon l'une des revendications précédentes dans une composition pour prévenir ou lutter contre les irritations cutanées. 20 30 2956818 -21- 10. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'hydrolysat peptidique de lin tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3 est un activateur de la HMG-CoA réductase. 5 1 1. Procédé de traitement cosmétique destiné à diminuer ou supprimer l'effet secondaire irritant d'un agent actif présent dans une composition cosmétique, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau à traiter une composition comprenant l'hydrolysat peptidique de lin tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3. 1 0 12. Utilisation d'un hydrolysat peptidique de lin tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3 pour préparer une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les inflammations cutanées telles que les érythèmes, en particulier les érythèmes dus aux ultraviolets (UV), ou le prurit, l'urticaire, les piqûres d'insectes, les allergies, ou encore l'alopécie dans ses phases inflammatoires. 15