Brevet FR2955013A1 — publié le 20110715

-1- La présente invention concerne une méthode pour accroître la taille d'une plante ou partie de plante par inhibition d'une protéine de régulation du cycle cellulaire dont l'inactivation entraîne une endoréduplication des cellules végétales. L'invention vise également une plante ou partie de plante génétiquement modifiée et la méthode de production de plantes correspondantes. L'endoréduplication est un type de cycle cellulaire ne comportant pas de division cellulaire. Chez les eucaryotes, un cycle cellulaire classique est divisé en deux grandes périodes et subdivisé en quatre phases : l'interphase regroupant les phases G1, S et G2 et la mitose correspondant à la phase M. Durant l'interphase, l'ADN chromosomique contenu dans le noyau subit une réplication (phase S). Après la réplication de l'ADN chromosomique, la cellule se prépare à entrer en mitose. Dans une première étape de transition G2/M, appelée prophase, l'ADN chromosomique, présent dans le noyau sous forme de chromatine (ADN + histones), se condense en structures appelées chromosomes. L'ADN ayant été dupliqué avant le début de la mitose, il y a deux copies identiques de l'ADN dans la cellule, réparties dans deux chromatides par chromosome. La prophase se caractérise également par une réorganisation du cytosquelette de la cellule constitué de microtubules et de microfilaments d'actine. Cette réorganisation se réalise selon des mécanismes variables en fonction des espèces concernées (champignons / plantes / animaux), mais aboutissant tous à la formation d'un fuseau mitotique bipolaire. La prométaphase commence au moment de la rupture de l'enveloppe nucléaire et correspond à la mise en place de liaisons entre les microtubules du fuseau et chacune des deux chromatides des chromosomes. La phase suivante, appelée métaphase, correspond au rassemblement des chromosomes sur le plan équatorial de la cellule. Les chromatides se séparent durant l'anaphase, migrent vers les pôles opposés de la cellule, ce qui permet une répartition équilibrée du génome précédemment dupliqué (caryocinèse). Enfin, lors de la télophase, les chromatides commencent à se décondenser et l'ADN redevient diffus. Dans le même temps, l'enveloppe nucléaire se reconstitue et des microtubules localisés à l'équateur contribuent avec des filaments d'actine à la séparation des cytoplasmes de chaque cellule fille (cytocinèse). Chaque noyau-fils est alors bien localisé dans une cellule fille qui est à nouveau composé d'un exemplaire du patrimoine génétique initial (phase G1). Contrairement au cycle cellulaire classique, l'endoréduplication est un cycle cellulaire dans lequel l'ADN chromosomique se réplique durant l'interphase qui n'est pas suivie d'une phase mitotique. Il s'agit ainsi d'une succession répétée de phases G1/S/G2. 2955013 -2- Ce phénomène conduit à des cellules à noyau unique contenant beaucoup de copies de l'ADN génomique. Si le phénomène d'endoréduplication se répète, la cellule devient polyploïde, c'est-à-dire que la quantité d'ADN généralement comprise dans une cellule, soit 2C pour une 5 cellule diploïde, passe à 4C, 8C ou largement plus. Si l'on constate des phénomènes d'endoréduplication chez certains insectes ou mammifères, ce phénomène reste cependant caractéristique des organismes végétaux. Il est connu que le volume nucléaire et la taille d'une cellule augmentent lorsque la quantité d'ADN chromosomique est multipliée dans le noyau cellulaire. Par conséquent, 10 l'endoréduplication a pour effet d'accroître la taille d'un organisme ou d'une partie d'un organisme (par exemple, un tissu) et tout particulièrement celle d'une plante ou d'une partie de plante. Cette propriété peut donc être avantageusement mise à profit dans le domaine agronomique de façon à améliorer la quantité et/ou la qualité de fruits, de racines et/ou de graines (enrichissement en pulpe ou en produit de réserve). 15 Les travaux des inventeurs les ont conduit à identifier des protéines appelées « GIPs » pour «GCP3 Interacting Proteins ». La protéine GCP3, qui est un composant conservé au cours de l'évolution, fait partie du complexe de nucléation des microtubules (MTOCs) (voir figure 1). Ce complexe est essentiel à l'assemblage in vivo des microtubules et à la formation du fuseau mitotique lors de la mitose. Ces protéines GIPs 20 présentent donc également un lien avec les MTOCs. Les protéines GIPs sont conservées dans l'ensemble des eucaryotes et sont impliquées dans les mécanismes régulant le cycle cellulaire. En particulier, il a été mis en évidence que l'inhibition de la fonction d'au moins une protéine GIP chez une plante permettait de provoquer une endoréduplication des cellules de ladite plante et donc 25 d'accroître la taille des cellules de cette plante. La présente invention est donc relative à une plante génétiquement modifiée caractérisée en ce que la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v) est inhibée : (i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1 (ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°2 30 (iii) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence comprenant au moins 50 % d'homologie et au moins 40 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°1 (iv) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence comprenant au moins 50 % d'homologie et au moins 35 40 % d'identité avec la séquence SEQ ID N°2 2955013 -3- (v) une protéine interagissant avec la protéine GCP3 de ladite plante de type sauvage. Les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 correspondent respectivement aux séquences en acides aminés des protéines AtGIP1 et AtGIP2 qui interagissent avec la 5 protéine AtGIP3, l'un des composants des MTOCs d'Arabidopsis thaliana. L'identification de ces protéines AtGIP1 et AtGIP2 d'Arabidopsis thaliana est plus amplement décrite dans l'exemple 1 ci-après. Une recherche d'homologues faite par BLAST parmi un grand nombre d'espèces de la lignée verte (Chlorophytes) a permis d'identifier au moins une protéine pour chaque 10 végétal, homologue à la protéine AtGIP1 et/ou AtGIP2. Ces résultats sont présentés dans le tableau 1 de l'exemple 2 ci-après. On notera que les séquences sont généralement courtes (entre 60 et 100 acides aminés) et très conservées (fort pourcentage d'homologie). En outre, elles correspondaient à des protéines de fonction encore inconnue. 15 Par pourcentage d'homologie, on vise le pourcentage de résidus identiques ou similaires entre deux séquences. Par pourcentage d'identité, on vise le pourcentage de résidus identiques entre deux séquences. De préférence, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 65 % et plus 20 préférentiellement d'au moins 70 % et le pourcentage d'identité sera d'au moins 50 % et plus préférentiellement d'au moins 60 %. Ces pourcentages préférés concernent plus particulièrement les plantes dicotylédones. En effet, Arabidopsis thaliana étant une plante dicotylédone, de plus fortes homologie et identité sont recensées chez ce type de plantes. Comme indiqué dans le tableau 1 de l'exemple 2, certaines plantes, et plus 25 particulièrement les plantes terrestres, peuvent comporter au moins deux protéines GIPs, homologues à AtGIP1 et/ou AtGIP2. Les inventeurs ont mis en évidence que, de manière surprenante, si l'inhibition d'une seule protéine GIP avait une influence très relative sur l'endoréduplication et par conséquent sur la taille de ces plantes ou de la partie de ces plantes dans laquelle l'endocycle remplace le cycle cellulaire normal, l'inhibition combinée 30 d'au moins deux protéines GIPs détectées chez ces plantes, favorisait notablement l'endoréduplication. Ceci se traduisait par un phénotype très marqué dans lequel un fort accroissement de la taille des cellules de la plante était mis en évidence, par exemple un épaississement de la racine (voir par exemple les figuresl4 C et D), Par conséquent, l'invention concerne plus particulièrement une plante 35 génétiquement modifiée, de préférence une plante terrestre, dans laquelle la fonction de deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (v) est inhibée. 2955013 -4- La terminologie « plante terrestre » se définit par opposition aux plantes aquatiques `par exemple, une algue). L'inhibition de la fonction de la protéine peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier. L'inhibition peut en particulier résulter d'un mécanisme empêchant 5 la protéine de fonctionner ou d'un mécanisme bloquant la synthèse de cette protéine. Cette inhibition sera ciblée préférentiellement dans la partie de plante jugée d'intérêt. A titre d'exemple de mécanisme empêchant la protéine de fonctionner, on citera les mécanismes dans lesquels la fonction peut être bloquée par une interaction de type antigène-anticorps ou protéine-inhibiteur. Dans le premier cas, il s'agit d'induire 10 l'expression d'une seconde protéine possédant les caractéristiques de reconnaissance spécifiques d'épitopes de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (v). Dans le deuxième cas, il s'agit d'induire une interaction de la protéine choisies parmi les protéines (i) à (v) avec une molécule affine (peptidique ou chimique) bloquant ses capacités naturelles d'interaction avec GCP3 ou d'autres protéines des voies signalétiques, dans 15 lesquelles ladite protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) agit. L'expression des transgènes sera avantageusement ciblée dans des cellules ou tissus particuliers par usage d'un promoteur adéquat placé en amont de la séquence codante. Les mécanismes bloquant la synthèse de la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) comprennent plus particulièrement toute modification génétique visant l'inhibition de 20 l'expression du gène codant pour ladite protéine, telle qu'une mutation dudit gène. Avantageusement et en particulier lorsqu'il s'agit de plantes terrestres, la plante sera modifiée par inhibition de l'expression d'au moins deux gènes codant pour au moins deux protéines choisies parmi les protéines (i) à (v). Par inhibition de l'expression d'un gène, on vise tout mécanisme permettant 25 d'empêcher le gène de s'exprimer. A titre d'exemple, les méthodes suivantes peuvent être employées: a) l'induction de l'expression d'une séquence complémentaire (siRNA) exogène à un fragment d'ARN messager transcrit endogène du gène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) conduit à l'hybridation des deux séquences. Ceci bloque la 30 traduction des ARNs messagers dudit gène en protéine par mise en place d'une signalisation de dégradation enzymatique desdits ARNs. b) la mutation du gène endogène codant pour la protéine choisie parmi les protéines (i) à (v) par insertion d'une séquence (ADN de transfert; transposon) ou par délétion de séquence (ponctuelle, partielle ou totale) permet de produire l'expression de protéines 35 tronquées ou inactives ou dans le cas extrême, aucune expression de protéine. Ce dernier cas arrive lorsque la séquence codante est totalement délétée, ou que la mutation 2955013 -5- génère un codon stop en N-terminal ou encore que la mutation ait induit un décallage de la phase de lecture de l'ADN aboutissant à une séquence d'amino-acides non conforme à la séquence native de la protéine active. Dans l'exemple 3, par croisement de deux simple mutants d'insertion d'ADN-T 5 concernant respectivement les gènes At4g09550 (SEQ ID N°3) et At1g73790 (SEQ ID N°4) d'Arabidopsis thaliana, un descendant double mutant d'insertion a été créé. L'invention couvre également une partie de plante génétiquement modifiée selon l'invention et plus particulièrement un organe de la plante tel que le fruit, le pétale, la fleur, la feuille, la graine, la racine, la tige, un tissu végétal, une cellule ou toute autre partie 10 d'une plante. Les plantes génétiquement modifiées selon l'invention sont avantageusement des crucifères telles que les choux, le colza, la moutarde, le navet, la roquette, les giroflées ou le radis. Toutefois, ces modifications génétiques peuvent aussi être réalisées sur toutes plantes d'intérêt agronomique ou horticole qui possèdent également des gènes 15 homologues à AtGIP1 et AtGIP2, tel que les céréales, les arbres fruitiers ou décoratifs, les plantes fruitières, potagères ou décoratives et plus particulièrement, le riz, le poivron, la papaye, l'oranger, le caféier, le melon, le fraisier, le gerbera, le soja, la réglisse, l'arbre à coton, le tournesol, le houblon, la laitue, le lotus, le pommier, le manioc, la luzerne, les pins, les pois, le tremble, l'abricotier, la canne à sucre, le sésame, l'aubergine, la pomme 20 de terre, le sorgho,le maïs, le blé, la vigne, le peuplier ou le tabac. Les plantes génétiquement modifiées selon l'invention sont produites à l'aide d'une méthode comportant l'inhibition de la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v). Avantageusement, cette méthode de production comportera l'inhibition de la fonction de deux protéines parmi les protéines (i) à (v). Cette inhibition pourra par exemple s'effectuer 25 par inhibition de l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (v) ou par suppression du gène codant pour les protéines (i) à (v). L'invention vise enfin une méthode pour accroître la taille d'une plante ou d'une partie de la plante dans laquelle on modifie la plante ou la partie de la plante de manière à inhiber la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (v). Avantageusement, la fonction de deux protéines parmi 30 les protéines (i) à (v) est inhibée. L'invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent, avec références au figures : - La figure 1 présente les différentes GCPs (« Gamma-tubulin Complex Proteins ») et en particulier les GCP3, leur implication dans les complexes 35 de nucléation des microtubules (Microtubule Organizing Centres ou MTOCs) -6- et leurs homologues dans différentes espèces, identifiées par leur nom ou leur masse moléculaire en kilo Daltons. - Les figures 2 et 3 décrivent les séquences d'ADN génomique d'AtGIP1 (Fig. 2A) et de la protéine correspondante (Fig. 2B) ainsi que celles d'AtGIP2 (Fig. 3A et 3B). Sur les figures 2A et 3A, sont indiqués les exons, les introns et la séquence codante est repérée par les deux codons d'initiation et de terminaison (ATG et TGA/TAA). Sur les figures 2B et 3B, sont indiqués les prédictions de sites de phosphorylation (S) et celui qui est conservé chez toutes les séquences GIP des eucaryotes (). - La figure 4 présente la comparaison des séquences protéiques d'AtGIP1 et AtGIP2 (Fig. 4A) et la structure tridimentionnelle des GIPs (Fig. 4B). - La figure 5 présente les structures des gènes AT4G09550 de AtGIP1 (Fig. 5A) et AT1G7379 de AtGIP2 (Fig. 5B) obtenues à partir des sites suivants : http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/genes/view/AT4G09550 http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/genes/view/ATlG73790 - La figure 6 décrit la région promotrice d'AtGIP1. - La figure 7 est un arbre évolutif des GIPs. - La figure 8 compare 115 séquences d'amino acides correspondant à des protéines GIP complètes identifiées dans 72 espèces différentes de plantes. - La figure 9 présente les résultats d'un test in vitro (GST pull-down) entre les GCP 1, 2 et 3 et les GIP1 et 2 d'A. thaliana. Les essais ont été réalisés entre les protéines de fusion à la GST (GST-gamma-tubuline, GST-AtGCP2, GSTAtGCP3, GST-AtGIP1, GST-AtGIP2) et les deux protéines radiomarquées AtGIP1 et AtGIP2. La GST seule a été utilisée comme témoin négatif. - La figure 10 présente les résultats d'un test d'interaction in vivo en système double hybride de levure. - La figure 11 présente les taux comparatifs d'expression des GIPs d'A. thaliana. - La figure 12 présente les résultats de spécificité des anticorps testée par Immunoblotting. - La figure 13 illustre la localisation des GIPs endogènes dans des cellules de tabac BY-2 (A-C) et d'Arabidopsis (D) en division par immunomarquage. - La figure 14 présente des illustrations des phénotypes obtenus avec ces double mutants gip1 gip2. - La figure 15 présente les séquences des simple mutants gip1 et gip2 (avec les sites d'insertion des ADN-T) et les résultats d'une analyse par RT-PCR 2955013 -7- de l'expression des gènes GIP1 et GIP2 chez les plantes double mutantes issues du croisement des simple mutants. - La figure 16 illustre les phases de développement (à 7, 21 et 45 JAG) obtenues avec les plantes double mutantes. Exemple 1 : Caractérisation des protéines GIPs 1. Identification de la protéine GIP1 La protéine GIP1 a été identifiée par criblage double hybride de levure d'une 10 banque d'ADNc d'Arabidopsis thaliana (plantules de 3 semaines, Clontech®) en utilisant comme appât la protéine AtGCP3, un des composants essentiels du complexe de nucléation des microtubules. Le gène ainsi révélé est At4g09550 (SEQ ID N°3) dont la séquence est indiquée figure 2. 15 Ce gène code pour une protéine de fonction inconnue, nommée « AtGCP3 Interacting Protein 1 » (AtGIP1). 2. Recherche in silico d'homologues de GIP1 L'analyse des banques de données (http://www.arabidopsis.org/Blast/), a permis 20 d'identifier un gène homologue At1g73790 (SEQ ID N°4) (Figure 3). La figure 4A présente la comparaison des séquences protéiques d'AtGIP1 et AtGIP2. Sur cette figure, sont indiqués les motifs consensuels (X ), le site potentiel de phosphorylation (S) conservés chez les eucaryotes. Les pseudo leucine-zipper et « D box » sont indiquées par les flèches. 25 Le gène homologue At1g73790 montre donc une forte homologie avec GIP1 et a été ainsi nommé GIP2. Une structure tridimensionnelle théorique des protéines GIP a été obtenue après analyse bioinformatique (Voir figure 4B). Le domaine N-terminal flottant (en haut à droite de la photo de la figure 4B) est suivi de trois hélices alpha et la région la plus conservée 30 entre espèces est la partie C-terminale (en bas à gauche). L'organisation structurale des gènes AtGIP1 et AtGIP2 a été comparée (Figure 5) et montre des variations importantes dans la partie promotrice suggérant une régulation différentielle. Des cis-éléments régulateurs liés à une activité cycle cellulaireûdépendante sont trouvés dans la région promotrice d'AtGIP1 (Figure 6). 35 D'autres membres de la famille des GIPs ont été identifiés chez les eucaryotes en général et l'Homme en particulier et un arbre phylogénétique a été ainsi réalisé en 5 -8- appliquant la méthode "Neighbor joining" (Figure 7). Il a été trouvé que ces protéines étaient généralement codées par un gène unique par organisme, sauf pour les plantes terrestres où ces protéines sont généralement codées par au moins deux gènes (voir exemple 2). Elles sont fortement homologues entre-elles (Figure 8) avec une moyenne de d'homologie de 79%. Les acides aminés conservés (ou identiques) et similaires sont surlignés respectivement de gris foncé et gris clair. Ceci suggère une conservation de leur(s) fonction(s) et des propriétés maintenues tout au long de l'évolution. Elles présentent dans leurs séquences certains motifs proches d'une "D box", un pseudo "leucine zipper" et des sites de phosphorylation potentiels (Figure 4). 3. Vérification de l'interaction AtGCP3-AtGIP1 par GST pull-down Les ADNc d'AtGCP1 ou y-tubuline, AtGCP2, AtGCP3, et AtGIP1 et AtGIP2 ont été clonés dans le vecteur pGEX-2TK et les bactéries E. coli souche Rosetta ont été sélectionnées après transformation. L'expression des protéines de fusion ou de la GST seule a été faite dans cette souche bactérienne. Les protéines solubles de l'extrait ont été fixées sur billes de gluthathion Sépharose 4B. D'autre part, AtGIP1 et AtGIP2 marquées à la méthionine[35S] ont été produites par traduction in vitro dans un lysat de réticulocytes de lapin. Des tests de GST pull-down ont ainsi été menés. Les résultats ont été que seule AtCGP3 interagit avec AtGIP1 (Janski et al., 1997) et AtGIP2, confirmant les résultats obtenus précédemment en système double hybride. 4. Interactants des protéines GIPs d'Arabidopsis thaliana La recherche d'interactants a été réalisée par GST pull down (Figure 9) et par système double hybride (Figure 10). Sur la figure 9A, est présenté un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie de la fraction liée aux billes de glutathion-sépharose. Les protéines de fusion de taille attendue sont les bandes majoritaires, indiquées par les têtes de flèche claire. Sur la figure 9B , est présenté une autoradiographie du gel, où les protéines radiomarquées (*) de la fraction liée aux billes sont révélées. Aucun marquage n'est retrouvé dans les pistes des témoins négatifs, alors que dans le test de pull-down, AtGIP1 et AtGIP2 ont co-précipité avec la GST-AtGCP3. L'ensemble des autres pistes ne révèle aucune interaction. Il a été démontré (Figure 10) qu'AtGIP2, comme AtGIP1 interagissent précisément avec les 200 premiers acides aminés de la région N-terminale d'AtGCP3. De plus, par système double hybride, une interaction positive supplémentaire a aussi été montrée entre les GIPs elles-mêmes (GIP1-GIP1 et GIP1-GIP2). En effet, sur la figure 10, on 2955013 -9- constate que non seulement AtGIP1 et AtGIP2 interagissent avec AtGCP3 et entre elles mais également que les GIPs interagissent avec le domaine N-terminal de GCP3 (ri). Ceci suggère que ces protéines puissent former des oligomères in vivo. 5 5. Données bioinformatiques sur l'expression des GIPs L'outil "genevestigator" a été utilisé (http://www.genevestigator.ethz.ch/) Les GIPs s'expriment nettement plus dans les tissus jeunes d'Arabidopsis (feuilles) ou méristématiques (apex racinaires et jeunes fleurs) que dans des tissus différenciés. Ceci renforce le lien entre l'expression des protéines GIPs et la division cellulaire en 10 général. Une étude comparative d'expression entre AtGIP1 et AtGIP2 suggère que GIP2 joue un rôle prépondérant lors de la gamétogenèse (Figure 11). 6. Obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre les GIPs 15 Afin de permettre l'étude de ces protéines, des anticorps polyclonaux ont été produits dans des lapins. Deux d'entre eux ont été dirigés contre le peptide d'AtGIP1 suivant DEEASRTARESLEL-(C) (SEQ ID N°5) et ont été commandés à la société Sigma. Quatre autres sérums ont été obtenus par injection d'une protéine de fusion AtGIP1-6His à des lapins des animaleries de l'Esplanade (CNRS-UdS) (Strasbourg, FRANCE) et de 20 l'IGBMC (Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire, Illkirch, FRANCE ). En testant les sérums sur différents extraits cellulaires, un marquage spécifique des GIPs d'Arabidopsis a été révélé en Western blot, à la fois par un sérum anti-peptide et un serum anti-GIP1 complète, sur la protéine endogène présente dans des extraits totaux de cellules d'Arabidopsis thaliana (Figure 12A). Une confirmation de reconnaissance 25 antigénique a été obtenue sur extraits de plantes transgéniques exprimant les fusions GIP1:E-tag:eGFP (Figure 12B). 7. Localisation intracellulaire par immunomarquage La localisation des GIPs endogènes a été analysée sur cellules de tabac BY-2 30 (Nagata et al., 1992 , Int. Rev. Cytol., 132, 1-30) en culture au cours du cycle cellulaire. Sur la figure 13, sont présentés : en première ligne (A)/ colonne (B, D), le marquage anti-GIP, en deuxième colonne (B, D) celui des microtubules, en deuxième ligne (A)/ troisième colonne (B, D) l'ADN. En interphase, GIP entre dans le noyau en G2 puis est exporté en 2 croissants pôlaires. Un marquage diffus est également visible au niveau du 35 fuseau bipolaire, plus intense au niveau des fibres kinétochoriennes en anaphase-télophase. Une mesure d'intensité des marqueurs fluorescents (analyse d'image par 2955013 -10- logiciel LSM510) dans une cellule en télophase montre que GIP est localisé aux extrémités polaires des deux cellules filles. Les cellules BY-2 en interphase révèlent une augmentation de densité du marquage aux pôles nucléaires en fin de phase G2 (croissants nucléaires) correspondant aux sites 5 d'initiation de la formation du fuseau mitotique. En mitose, le marquage des régions polaires du fuseau reste fort. L'intensité du marquage n'est pas augmentée au niveau du phragmoplaste par rapport au bruit de fond. Un marquage moins intense du nucléoplasme est aussi observé. Ces résultats montrent une localisation des GIPs aux centres organisateurs des 10 microtubules (surface du noyau), suggérant un rôle dans la régulation de l'activité de nucléation. La présence de GIP dans le noyau suggère qu'elle puisse jouer un autre rôle, notamment comme facteur régulateur du cycle cellulaire. 15 Exemple 2 : Homoloques d'AtGIP1 et d'AtGIP2 chez les plantes Des analyses bioinformatiques ont été menées et la recherche d'homologues a été faites parmi les plantes en utilisant principalement l'outil d'alignement BLAST. Les résultats de ces recherches sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Y sont indiqués 20 les numéros d'accession des séquences répertoriées dans NCBI, ainsi que la dénomination utilisée pour la construction de l'arbre pylogénétique (fig. 7). Les degrés d'homologie et d'identité entre AtGIP1 et toutes les autres séquences sont indiquées en colonne 5 et 6 de ce tableau. 25 Tableau 1 : Comparaison des GIPs de plantes Nom Nom commun Ref. Database taille Homologie Identité Scientifique Amborella gbiFD440559.1 74 75% 58% trichopoda Antirrhinum Gueule de loup emb1AJ799576.1 69 86% 63%... majus ........................................ ............................................ .............................................. ............................................................ ................................. Arabidopsis Arabette des At4g09550.1 71 100% 100% thaliana dames : : : Arabidopsis Arabette des At1g73790 67 87% 76% thaliana dames ; ; : Brassica napus Colza gblEE437549.1 64 85% 74% Brassica napus Colza gblEE480929.1 68 84% 73% Brassica napus Colza gbiEL625962.1 69 82% 71% Brassica napus Colza gblEE558825.1 69 87% 78% -11- Brassica Moutarde gblEE535651.1 69 82% oleracea q,~o~~xa.nype ...... sauvage Nave8 q!_ ................................... ---------------------- --------- ---'82Y6---'---'/1 % .. '69 ---' ~ Bruguiera dbjlBPO42562.1 73 85% 72% gymnorrhiza ---------------------- ~ ............... Capsicum ~!---~ 73 80% 64% Poivron gblGO000037.1 annuum `- - - - - - - - - - ~~ap~a~ Papaye gblEX277998.1 68 85% 73% ~~a~om Papaye 83m a~ap~a~ Canca papaya Papaye gblEX279448.1 72 80% 69% Canca papaya Papaye gblEX272788.1 71 67% 56% Catharanthus Pervenche de gblEG559135.1 83 75% 62% roseus Madagascar gb!(~F053581.1 73 82% 73% (~~nm (~~nm~nmn~o Oranger doux (~~nm~nmn~o Oranger doux gb!(~F053278.1 72 70% 61% (~~nm . ~ .~ ~~ ~ ~ .............. Coffea arabica Caféier d'Arabie gb!GT010802.1 80 79% 62% Coffea Caféier robusta gblOV0023551 80 83% 67% o~m~w~ ' emb~N714745.2 71 88% 73% Coffea Melon o~m~w~ Cuouo,~me~'-- Cuouo,~me~'-- Melon -------------------------------------- 72 ' ' 69% emb~N735130.2 85% ' Cyamopsis ! ~ '~ '~ Guar gb!EG0701731 73 86% 73% tetragonoloba . .-. ' Diospyros .~"~ dbj!00587004. 1 75 8496 68% Plaqueminier ~ ................. .... . Euphorbia ^~x/~. Euphorbeéou!e gblOV1570201 60 85% 71% !---~ ---~ Fétuque gblOTU873311 92 Festuca ' ---'~ ' 60% 46% arundinacea ------- --------------------- ' ................ Fmotuoa Fétuque b!OT7053271 92 59% 45% arundinacea ............... ~ ~ F~Aa/~wpmm Fraisier des bois gblDV439268.1 72 81% Gerbera hybrida Gerbera emb!AJ704484.1 69 87% 76% -~ ----------- 87% ~ ~ ' c,0/mnmnnax Soja Glycyrrhiza Réglisse dbjlFS278006.1 74 86% 78% uralensis ' --~' - ----' G Gossypium Arbre a coton gb!~Fo.u_0~5Cono1V.2 73 84% O v096 . arboreum - - - - . - - ' - - - - ' - - - .- - - ' - - - ' - - - ' ----' Gossypium 'man - .VV51~~«~ '73 73 84% O v096 ~ i- g~!.(~° ^~.1- Cohmnmexi- h~nu~unr ------------------ .............. ~~ / Gu~wba Niger gb!GE5005801 69 85% 71% a~o~~ --------------------- ------- Helianthus Tournesol gb!O8544551 69 90% 76% ~ annuus Tournesol gblGE516206.1 69 89% 74% Hehanthus annmm Helianthus exilis Tournesol 'gb!EFUUO24].1-'---'UQ---~ ---'0096---'---'7696---' serpentine Humulus '~---' ùpuùm Houblon gblEG052400.1 67 83% 64% - - - KaduagblCB084509.1 73 centranthoides Laitue vireuse gb!OVV1730501 75 8796 7896 Laotuoavirnoa '--- Lw~uo/apwn~uo Lotus gbk3O020820~1 74 87% 78% ~ ~ Macrotyloma Gahat gblOR9801621 73 86% 73% uniflorum ----------- --------------------- Maluox Pommier gb!CNO205501 72 91% 78% domestica ~ Maùmx Pommier gb!OR000583.1 72 94% 78% domestica ' ' ` ' Manihot Manioc 75% esculenta Manioc dbj!OB042000.1 75 76% 62% Manihot esculenta --------------------------------------------- --------------------- Marchantia dbj1BJ847813.1 70 65% 53% polymorpha --------------------- Medicago Luzerne tronquée gblGT138663.1 71 83% 69% trunculata ' ----------- ------------- Medicago Luzerne tronquée gblEY477452.1 71 83% trunculata 82% ./~w~~n~ lanAadmrffii Tabac emblAM824392.1 74 82% Nicotiana tabacum --------- ----------- Nicotiana Tabac b!FG0280531 71 92% 78% tabacum ~ Tabac '96---' /Yicmtiana tabacum ~ ~ ~ .............. Nicotiana Tabac gb!FG040118.1 82 71% 59% tabacum --- ---' ---' ---' . ' ~osaoa~/~--- Riz gb!(~Fo. ~0"8Q~o~4o.1-' ---' {}. ' ' --'].---' ' oo ~096 4596 95 "o -° Oryzasati/a---~ Riz =rb! 3Q..-~---'QQ---~ ---'U096---'---'4896---' .Panicum ' Panic `-'r ~---' '---' '---' érigé gb! .FL024017.1 74 76% 58% virgatum Panic érigé gblFE597824.1 95 61% 45% Panicum v~a~m --------------------- ----------- Panicum Panic érigé qb!FL8388831 95 61% 45% virgatum ' --------- ---------------------- Pmtun~ax0a~s Pétunia b!FN015871 1 75 81% 65% _ __ _ ______ Physcomitrella dbjlDC931782.1 68 73% 61% patens gblFC379761.1 68 57% Physcomitrella patens ' ' Picea glauca Epinette blanche gblEX355173.1 69 ' ' Picea glauca Epinette blanche gblEX398197.1 69 ' ' Picea glauca 68% 53% ' ' FYomaoitohmnois Epinette de G 74% 59% 82% 68% 82% 68% 83% 69% Populus Peuplier de 1 deltoides Virginie ....... ................... Populus Peuplier de gbKCX1748201 70 81% 69% deltoides Virginie dbjlDB891109.1 70 81% 69% Populus nigra Peuplier noir . ---'82Y6---' Populus o~nn/~".-Tremble ........................................................... o~nn/~". ---'~0Y6---' ~ ....... ~ Populus Peuplier de blCV2465451 74 85% 66% trichocarpa l'Ouest gblDT494575.1 70 81% 69% Populus Peuplier de trichocarpa l'Ouest gblCVO46837.1 '96---' 72 ' .pn/nu~ .--Abricot armeniaca Ravenelle gblEX759388.1 68 86% 74% Raphanus raphanistrum ' ' .u~n/h~~/- ' Ronce àfeuille gb!FF084130.1 7-1- 67% Rubuouhn~~~uo 88% ----~ d'orme ~~och~run, Canne $ 'ouona---. --.! ' ----' Q@---~ ---..56%... --'4196---' g~.C*2uo/11.1 50Y6---' ou n officinarum Saccharum Canne a sucre gblCA241809.1 98 65% wfficinarum . ~ _ ______ Saccharum Canne à sucre blCA2765601 06 58% 4196 wfficinarum 8augeoo!aree dbjlAB402074.1 70 88% 67% Salvia oolanoa turkestanica ' .}6 ---' Sepa,nuo, ~ indicum /~1-'---'7'---' ---' 85% Sésame ~ ~b!3L~pn335~ ~ n~K, g.uunnuo^°rv - Sm6anun, ~ ~-- g. o ~!D~~Q@`ouo2Q2.1----'7o ~---' 85% ---'--'~8Y6 - --' n chacoense Solanum Aubergine dbjlFS086566.1 73 84% 68% mmelongena Solanum Pomme de terre gblCX162769.1 76 85% 68% tubenmum .~m6anun, .-Pomme de terre gblCV496214.1 76 ' '96---' tubenmum Swrghumbicolor~ -Sorgho gblCX608909.1 95 56% 43% ~ -' ' ~ ~ ~ Tanyxaounrkwk- Pissenlit de gblDR402985.1 72 84% 75% saghyz Russie 7~max~o.u~/----. . ---. . -' ---'84Y6 ---' Pissenlit gblDY839988.1 69% officinale /iYbcunr Blé tendre gblCO881387.1 95 57% 44% aestivum ' ' ` ' Triticum Petit épeautre gblBQ802467.1 95 60% 46% monococcum 96---' 7riti,un/ Petit monococcum gb!FG000208.1 73 85% 73% Vigna unguiculata ' ~!---. Vigna gbFF382270.1 73 84% 72% unguiculata 56% ........................... ............................. 96 56% ........................... ................................. 96 57% Zea mays Maïs gblFL065041.1 98 Zostera marina Zostère marine emb1AM771477.1 86 : moyennes 75,576576 79% 65% 58 On notera que les 115 séquences sont généralement courtes et très conservées. En outre, elles correspondent à des protéines de fonction encore inconnue. Les séquences possèdent entre 64 et 98 acides aminés et présentent un fort pourcentage d'identité et d'homologie. La méthode de calcul des pourcentages a été générée par rapport à AtGIP1 (ClustalW avec matrice de Gonnet contre AtGIP1 et AtGIP2 simultanément). Il a été constaté que la présence de plus d'un gène GIP se généralise pour les plantes terrestres et s'est donc produit par duplication au cours du Silurien/Dévonien (ère primaire). Cette duplication s'est conservée jusqu'aux plantes les plus évoluées analysées (Angiospermes) dont on connaît le génome complet. Exemple 3 : Mutants d'insertion d'ADN-T 1. Origine et caractérisation génétique Une lignée d'Arabidopsis thaliana provenant de la collection GABI-Kat (http://www.GABI-Kat.de) (Bielefeld, Allemagne) et correspondant au mutant 213D01-014134 a un ADN-T inséré dans l'intron en amont de la séquence codante du gène GIP1. Le mutant gip2 provient de l'INRA (Versailles, France) (364E06 ou 615G11) et l'insertion est située en partie 5'UTR de l'exon. Les plantes homozygotes gip1 comme gip2 ne présentent pas de phénotype très significatif au cours du développement comparées à des plantes sauvages. En revanche des doubles homozygotes gip1 gip2 présentent un phénotype très fortement affecté dans le développement et la croissance. En effet, la figure 14 présente des illustrations des phénotypes obtenus avec ces double mutants gip1 gip2 : -14- Vitis vinifera Vigne gblCD802262.1 73 81% 72% Vitis vinifera Vigne gblCA817836.1 73 80% 71% Vitis vinifera Vigne gblEC992233.1 73 79% 67% Vitis vinifera Vigne gblEC991719.1 73 85% 67% Welwitschia gblCK767759.1 72 73% 58% mirabilis Zea mays Maïs gblFL065038.1 Zea mays Maïs gblFL152568.1 : Zea mays Maïs gblCF631456.1 : 2955013 -15- A. Plantules 6 jours après germination. Le mutant présente un retard de germination par rapport au témoin à cotylédons déployés. B. Plantules WT (gauche) et mutantes (droite) après 6 jours de germination à l'obscurité. L'allongement de cellules de l'hypocotyle est marqué chez les 2 types de plantules. 5 C, D. Pointes de racine WT et mutées marquées au dapi. E, F. Racines de mutants présentant des vrilles et des anomalies de l'épiderme à différenciation précoce. G. Coloration de l'amidon au lugol. H. Coloration des parois à l'iodure de propidium. Le méristème et la coiffe sont affectés 10 Des analyses géniques ont confirmé la présence des ADN-T dans les allèles de GIP 1 et GIP2. La figure 15 présente les résultats d'une analyse par RT-PCR de l'expression des gènes GIP1 et GIP2 chez les plantes double mutantes : A. Position de l'insertion d'ADN-T dans les séquences de gipl et gip2. 15 B. Présence des ARNm de GIP1 et GIP2 chez ColO (ligne 2) et d'ARNm de GIP1 dans les plantes gipl/+ gip2/gip2 (ligne 3) et l'ARNm de GIP2 chez les plantes gipl/gip1 gip2/+ (ligne 4). Absence des transcrit de ces gènes dans les plantes double mutantes gipl/gipl gip2/gip2 (ligne 6). Cependant, la présence d'une faible quantité de transcrits de GIP1 chez les plantes gipl/gipl gip2/+ (ligne 4) et gipl/gipl gip2/gip2 (ligne 5) a été observée. 20 Par conséquent, des ARNm de GIP1 ont été parfois détectés en faible quantité par PCR semi-quantitative, suggérant la présence résiduelle possible de protéines GIP1 chez certains double mutants. Ceci peut être à l'origine de la variété de stades développementaux observés. En effet, la germination des graines semble être stoppée au cours de son développement selon la persistance ou non de l'expression de protéine 25 GIP1. Ainsi, soit la germination est totalement inhibée (létalité du double mutant knock out), soit elle est perturbée à des niveaux variables (double mutants knock down). 2. Anomalies cellulaires et tissulaires des mutants gip Le phénotype observé révèle des anomalies dans l'organisation des méristèmes racinaires (Figure 14) et caulinaires. Un grand nombre de cellules présente des anomalies de ploïdie, suggérant de l'endoréduplication (Figure 14 D). La figure 16 illustre le développement des plantes double mutantes (C, D) en comparaison avec les plantes témoins (A, B) à 7, 21 et 45 JAG (jours après germination). La figure 16E présente la hampe florale du mutant (droite) comparée au témoin (gauche). Les fleurs de plantes sont illustrées en F : témoin, G : hétérozygote GIP1+/- gip2-/- et H,l : homozygotes gipl gip2. En figure 16J, sont présentés les organes floraux après 2955013 -16- éclaircissement de Hoyer. En figure 16K, est présenté un diagramme de mesures de ploïdie des boutons floraux. Enfin, les figures 16 L-P présentent le détail d'une étamine avec stomates, rares microspores et cellules lignifiées (L-O) et illustre l'arrêt précoce du développement des ovules (P). 5 Parmi les plantules développant une hampe florale, des anomalies de croissance et différenciation restent importantes. Une analyse comparée de la morphologie des fleurs double mutantes gip1 gip2 et sauvages montre que le développement des verticilles floraux et la gamétogenèse sont perturbés, rendant ces plantes stériles. Une analyse de la ploïdie des boutons floraux par FACS confirme un accroissement de ploïdie de 2C 10 jusqu'à 32C (Figure 16K). Le cytosquelette microtubulaire des double mutants gip1 gip2 est modifié par rapport à celui de plantules témoins. Les cellules résultant d'endoréduplication, de taille très largement supérieures à la moyenne présentent des microtubules corticaux entrecroisés, indiquant une perte de polarité de croissance. Les figures de division 15 observées montrent des fuseaux bipolaires massifs souvent obliques, conduisant à une perte de l'organisation des cellules en files régulières. L'ensemble de ces résultats montre que les protéines GIPs joue un rôle d'une part dans la formation et/ou l'organisation du cytosquelette et d'autre part dans la régulation du cycle cellulaire et la maintenance du génome, éléments essentiels au développement des 20 plantes et des êtres vivants en général. REVENDICATIONS1. Plante génétiquement modifiée caractérisée en ce que la fonction d'une protéine GIP choisie parmi l'une quelconque des protéines (i) à (iv) est inhibée : (i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1 (ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°2 (iii) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1 (iv) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. 2. Plante génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la fonction de deux protéines parmi les protéines (i) à (iv) est inhibée. 3. Plante génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la protéine (iii) et/ou (iv) présente un pourcentage d'homologie d'au moins 65%, de préférence d'au moins 70% et un pourcentage d'identité d'au moins 50%, de préférence d'au moins 60%. 4. Plante génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (iv) est inhibée. 5. Plante génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le gène codant pour l'une des protéines (i) à (iv) est muté. 6. Partie d'une plante génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Graine d'une plante génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8. Méthode de production d'une plante génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle comporte l'inhibition de la fonction de l'une quelconque des protéines (i) à (iv) : (i) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°1 (ii) une protéine comprenant la séquence SEQ ID N°2 (iii) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°1 2955013 -18- (iv) une protéine comprenant une séquence de 60 à 100 acides aminés, ladite séquence présentant au moins 50% d'homologie et au moins 40% d'identité avec la séquence SEQ ID N°2. 9. Méthode de production selon la revendication 8, dans laquelle la fonction de deux protéines parmi les protéines (i) à (iv) est inhibée. 10. Méthode de production selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle l'expression du gène codant pour l'une des protéines (i) à (iv) est inhibée. 11. Méthode de production selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle le gène codant pour l'une des protéines (i) à (iv) est muté. 12. Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, pour accroître la taille d'une plante ou d'une partie de plante.