Brevet FR2949156A1 — publié le 20110218

Méthode de détermination de la liaison d'un composé donné à un récepteur membranaire ETAT DE LA TECHNIQUE L'invention relève du domaine du criblage de composés capables de se lier à des récepteurs membranaires. La liaison de ligands extracellulaires à leurs récepteurs membranaires constitue la première étape de la transduction de signaux biochimiques de l'extérieur vers l'intérieur des cellules vivantes et est donc un élément essentiel dans la régulation de ces cellules. Les récepteurs membranaires constituent donc une cible de choix pour le criblage de nouvelles molécules capables de réguler les processus biologiques, en particulier pour le criblage de nouveaux médicaments. Il est établi que les récepteurs membranaires peuvent fonctionner non seulement seuls, mais également sous forme d'homodimères ou d'hétérodimères (S. R. George et aI, Nature drug discovery 1, 808-820 (2002) et G. Milligan, Biochimica et Biophysica Acta 1768 , 825-835). Certains récepteurs membranaires ne sont fonctionnels que sous forme de dimère, c'est le cas par exemple du récepteur de l'acide gamma aminobutyrique (GABAB), qui est constitué d'une sous unité GABAB1 et GABAB2. La plupart des récepteurs métabotropiques au glutamate fonctionnent sous forme d'homodimères. De nombreuses méthodes existent pour déterminer si un composé donné se lie ou non à un récepteur membranaire. La méthode la plus classique consiste à marquer le composé testé par un atome radioactif (tritium, Iode 125), à le mettre en contact avec les cellules exprimant le récepteur d'intérêt, et à compter la radioactivité fixée à la cellule après lavage. Il est également courant de marquer un ligand connu d'un récepteur, et de mesurer la capacité d'un composé à tester à rentrer en compétition avec ce ligand marqué pour le site de liaison au récepteur. Ces méthodes présentent plusieurs inconvénients : elles sont basées sur l'utilisation de composés radioactifs ce qui présente des problème de sécurité et de traitement des déchets, et elles peuvent difficilement être mises en oeuvre sur des plateformes à haut débit, c'est-à-dire lorsque l'on souhaite rapidement tester des milliers de composés. Elles ne permettent pas non plus d'obtenir d'information quant au récepteur auquel se lient les composés testés, en particulier il est impossible de déterminer si le composé testé se lie à un type de récepteur ou à plusieurs, à un récepteur monomérique ou à un récepteur dimérique. D'autres méthodes ont été décrites, notamment des méthodes basées sur l'utilisation de composés fluorescents. La spectroscopie de corrélation de fluorescence (� FCS �) permet par exemple de mesurer les fluctuations de fluorescence des molécules en diffusion dans un milieu exposé à un laser confocal. Le temps de diffusion de ces molécules étant dépendant du coefficient de diffusion, lui-même corrélé à la taille de ces molécules, les données recueillies par FCS permettent de différencier les molécules à diffusion rapide de celles à diffusion lente, et par conséquent les ligands liés à leur récepteur de ceux qui ne le sont pas. Cette technique a été appliquée par exemple à l'étude des récepteurs de la galanine, en utilisant de la galanine marquée par de la rhodamine (Pramanik, A. et al., 2001. Fluorescence correlation spectroscopy detects galanin receptor diversity on insulinoma cells. Biochemistry, 40(36), 10839-10845). Handl, H.L. et al., (2004. Lanthanide-based time-resolved fluorescence of in cyto ligandreceptor interactions. Analytical Biochemistry, 330(2), 242-250) ont décrit une alternative aux études de liaison par compétition avec des ligands radioactifs, basée sur la technique DELFIA (acronyme de l'expression anglaise � Diffusion enhanced lanthanide fluoroimmunoassay �). Selon cette technique, un ligand marqué par un chélate de lanthanide faiblement fluorescent est mis en contact avec une cellule exprimant les récepteurs étudiés. Après une étape de lavage destinée à éliminer le ligand non-lié, une solution destinée à amplifier la fluorescence du lanthanide est ajoutée au milieu de mesure. Cette approche a été utilisée par les auteurs dans des expériences de liaison d'un dérivé de l'a-MSH conjuguée à un chélate d'Europium, avec le récepteur de la mélanocortine MC4. La polarisation de fluorescence (FP) est une autre technique qui a été utilisée comme alternative à l'utilisation de ligands radiomarqués : Gagne, A et al par exemple ont décrit la préparation de ligands de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) marqués par un fluorophore connu sous le nom commercial de BodypyTM. En particulier, des ligands des récepteurs de l'hormone de mélano-concentration, de la bradykine et de la mélanocortine ont été marqués par ce fluorophore et leur liaison pour ces récepteurs a été étudiée en mesurant les variations de polarisation de la fluorescence émise par le milieu de mesure (2002. Use of fluorescence polarization detection for the measurement of fluopeptide binding to G protein-coupled receptors. Journal of Receptor and Signal Transduction Research, 22(1-4), 333-343). L'invention se propose de fournir une nouvelle méthode de criblage de composés capables de se lier à des récepteurs membranaires, en particulier pour déterminer si un composé se lie préférentiellement à des dimères de récepteurs, notamment des hétérodimères de GPCR. RESUME DE L'INVENTION L'invention concerne une méthode permettant de déterminer si un composé à tester se lie préférentiellement à un récepteur membranaire R1 ou à un récepteur membranaire R2, ces récepteurs étant connus pour être exprimés à la surface des cellules sous forme monomérique ou homodimérique, c'est-à-dire qu'ils sont présents à la surface des cellules sous forme de monomères R1 ou R2, ou encore sous forme d'homodimères R1R1 ou R2R2. Cette méthode permet également de déterminer si un composé à tester se lie indifféremment à ces récepteurs quel que soit leur état de dimérisation. Cette méthode peut également être mise en oeuvre avec des récepteurs formant des oligomères, en particulier avec des récepteurs formant des trimères, des tétramères ou des pentamères. La méthode selon l'invention permet également de déterminer si un composé à tester se lie aux hétérodimères R1R2, R1 et R2 représentant des récepteurs connus pour être exprimés à la surface des cellules sous forme monomérique, homodimérique ou hétérodimérique, c'est-à-dire qu'ils sont présents à la surface des cellules sous forme de monomères R1 ou R2, sous forme d'homodimères R1R1 ou R2R2, ou encore sous forme d'hétérodimères R1R2. Dans cet aspect de l'invention, il est possible non seulement de déterminer si le composé à tester se lie aux hétérodimères R1R2, mais également de préciser si le composé à tester se lie également aux monomères R2 et aux homodimères R2R2, ou encore s'il se lie spécifiquement aux monomères R2 ou aux homodimères R2R2 et pas aux hétérodimères R1R2. La méthode selon l'invention est basée sur l'utilisation de couples de partenaires de FRET dont l'un des membres est conjugué à un ligand de l'un ou des deux récepteurs étudiés, et l'autre est conjugué à un des récepteurs étudiés. Cette méthode met en oeuvre un ou deux couples de partenaires de FRET. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Les Figures 1 et 2 représentent un aspect de l'invention où les récepteurs R1 et R2 sont exprimés à la surface des cellules sous forme monomérique ou homodimérique. Les Figures 3 et 4 représentent un aspect de l'invention où les récepteurs R1 et R2 sont exprimés à la surface des cellules sous forme monomérique, homodimérique ou hétérodimérique. La figure 5 représente le plasmide FLAG-ST-V2R. DESCRIPTION DETAILLEE Selon un premier aspect, la méthode de l'invention est mise en oeuvre sur des récepteurs membranaires R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme monomérique, homodimérique, mais pas hétérodimérique, et permet de déterminer si un composé à tester se lie préférentiellement à l'un ou l'autre de ces récepteurs quel que soit leur état de dimérisation, ou encore de déterminer si ce composé se lie indifféremment à ces récepteurs quel que soit leur état de dimérisation. Selon un mode de réalisation de ce premier aspect (représenté à la Fig. 1), la méthode selon l'invention est une méthode de détermination de la liaison d'un composé à tester avec des récepteurs R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme homodimérique mais pas hétérodimérique, méthode qui comprend les étapes suivantes : (a) Marquage du récepteur R1 de manière covalente ou non-covalente par un premier composé donneur d'énergie Dl et du récepteur R2 de manière covalente ou non- covalente par un second composé donneur d'énergie D2, (b) Ajout au milieu de mesure d'un ligand connu capable de se lier aux récepteurs R1, R2 et aux homodimères R1R1 et R2R2, ce ligand étant marqué par un composé accepteur d'énergie A, et les couples (D1,A) et (D2,A) formant chacun des couples de partenaires de FRET, (c) Mesure de la luminescence totale Ltot émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A, (d) Ajout d'un composé extincteur du signal de FRET du couple (D1,A), (e) Mesure de la luminescence L2 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A, (f) Détermination de la luminescence L1 due au couple (D1,A) par la formule L1=Ltot- L2 la séquence des étapes (c) à (f) étant mise en oeuvre en présence et en l'absence du composé à tester. Selon ce mode de réalisation : une disparition de la luminescence L1 et un maintien de la luminescence L2 en présence du composé à tester sont représentatifs de la liaison du composé testé au récepteur R1 et à l'homodimère R1R1, une disparition de la luminescence L2 et un maintien de la luminescence L1 en présence du composé à tester sont représentatifs de la liaison du composé testé au récepteur R2 et à l'homodimère R2R2, une disparition de la luminescence L1 et une disparition de la luminescence L2 en présence du composé à tester sont représentatives d'un composé se liant à la fois aux récepteurs R1, R2, et aux homodimères R1R1 ou R2R2. Les composés extincteurs de FRET nécessaires à la mise en oeuvre de cette méthode sont décrits dans la demande internationale de brevet WO 2007/116069. De manière préférée, le composé donneur Dl est un complexe de lanthanide, en particulier un cryptate ou un chélate de lanthanide (tel qu'un cryptate ou un chélate de terbium ou d'europium) et le composé extincteur de FRET du couple (D1,A) est un composé comportant un domaine de liaison avec D1, en particulier un anticorps spécifique du complexe de lanthanide Dl. Selon un autre mode de réalisation du premier aspect (représenté à la Fig. 2), la méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre en marquant les récepteurs R1 et R2 par des composés accepteurs de FRET Al et A2 et le ligand avec un donneur Dl, ce qui correspond au format inverse de celui présenté dans le mode de réalisation précédent. Ainsi, selon ce mode de réalisation, les deux couples de partenaires de FRET utilisés sont (D,A1) et (D, A2). Ce second mode de réalisation concerne donc une méthode de détermination de la liaison d'un composé à tester avec des récepteurs membranaires R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme homodimérique mais pas hétérodimérique, méthode qui comprend les étapes suivantes : (a) Marquage du récepteur R1 de manière covalente ou non-covalente par un premier composé accepteur d'énergie Al et du récepteur R2 de manière covalente ou non- covalente par un second composé accepteur d'énergie A2, Al et A2 ayant des longueurs d'onde d'émission différentes, (b) Ajout au milieu de mesure d'un ligand connu capable de se lier aux récepteurs R1, R2 et aux homodimères R1R1 et R2R2, ce ligand étant marqué par un composé donneur d'énergie D, et les couples (D,Al) et (D,A2) formant chacun des couples de partenaires de FRET, (c) Mesure de la luminescence L1 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur Al d'une part, et de la luminescence L2 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A2 d'autre part, chacune en présence et en l'absence du composé à tester. Selon ce second mode de réalisation : une disparition de la luminescence L1 et un maintien de la luminescence L2 en présence du composé à tester sont représentatifs de la liaison du composé testé au récepteur R1 et à l'homodimère R1R1, une disparition de la luminescence L2 et un maintien de la luminescence Li en présence du composé à tester sont représentatifs de la liaison du composé testé au récepteur R2 et à l'homodimère R2R2, une disparition de la luminescence L1 et une disparition de la luminescence L2 en présence du composé à tester sont représentatives d'un composé se liant à la fois aux récepteurs R1, R2, et aux homodimères R1R1 ou R2R2. Selon un second aspect, la méthode de l'invention est mise en oeuvre sur des récepteurs membranaires R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme hétérodimérique, et éventuellement monomérique et /ou homodimérique, et permet de déterminer (i) si un composé à tester se lie aux hétérodimères R1R2, et (ii) si un composé à tester se lie spécifiquement aux hétérodimères R1R2, ou bien s'il se lie spécifiquement au récepteur R2 et à l'homodimère R2R2, ou encore s'il se lie à la fois à au récepteur R2, a l'homodimère R2R2 et à l'hétérodimère R1R2. Selon un mode de réalisation de ce second aspect (représenté à la Fig. 3), la méthode selon l'invention est une méthode de détermination de la liaison d'un composé à tester avec des récepteurs membranaires R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme hétérodimérique (éventuellement également sous forme monomérique ou homodimérique), méthode qui comprend les étapes suivantes : (a) Marquage du récepteur R1 de manière covalente ou non-covalente par le premier membre d'un couple de partenaires de FRET (D,A1), dans lequel D est le composé donneur et Al est le composé accepteur d'énergie, (b) Ajout au milieu de mesure d'un ligand connu de R2 capable de se lier à l'hétérodimère R1R2 mais ni au récepteur R1 ni à l'homodimère RiR1, ledit ligand étant marqué par le second membre dudit couple de partenaires de FRET, (c) Mesure de la luminescence Ll émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur Al, en présence et en l'absence du composé à tester. Selon ce mode de réalisation, une disparition de la luminescence L1 en présence du composé à tester est représentative de la liaison de ce composé à l'hétérodimère R1R2. Le premier membre du couple de partenaires de FRET, qui marque le récepteur R1, peut être un composé donneur d'énergie D et le second membre, qui est lié au ligand, peut être un composé accepteur Al. Le format inverse est également utilisable, à savoir, le premier membre du couple de partenaire de FRET, qui marque R1, peut être un composé accepteur d'énergie Al et le second membre de ce couple, lié au ligand, peut être un composé donneur d'énergie D. Selon un autre mode de réalisation du second aspect (représenté à la Fig. 4), le ligand est conjugué avec un composé donneur D, le récepteur R1 est marqué par un composé accepteur Al, et le récepteur R2 est marqué par un composé accepteur d'énergie A2. En l'absence de composé à tester, on peut mesurer la luminescence L1 ou L2 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur Al ou A2, respectivement. Dans ce mode de réalisation, le signal L1 provient du FRET émis par le couple (D,Al) qui marque l'hétérodimère R1R2, et le signal L2 provient des couples (D,A2) qui marquent le récepteur R2, l'homodimère R2R2, et l'hétérodimère R1R2. En fonction de la spécificité de liaison du composé testé, le signal L2 va donc être maintenu, supprimé ou encore diminué. Cet autre mode de réalisation permet donc avantageusement de préciser si le composé testé est spécifique de l'hétérodimère R1R2 ou bien s'il se lie également au récepteur R2 ou à l'homodimère R2R2, ou encore s'il est spécifique du récepteur R2 et de l'homodimère R2R2, dans l'hypothèse où ces espèces sont présentes dans le milieu de mesure. Selon cet autre mode de réalisation du second aspect de l'invention, l'étape (a) comprend également le marquage du récepteur R2 de manière covalente ou non- covalente par un second composé accepteur d'énergie A2, Al et A2 ayant des longueurs d'onde d'émission différentes et (D,A2) formant un couple de partenaires de FRET, et l'étape (c) comprend également la mesure de la luminescence L2 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A2 , en présence et en l'absence du composé à tester. Selon cet autre mode de réalisation : une diminution de la luminescence L2 et une disparition de la luminescence L1 en présence du composé à tester sont représentatives de la liaison de ce composé à l'hétérodimère R1R2, une diminution de la luminescence L2 et un maintien de la luminescence L1 en présence du composé à tester sont représentatifs de la liaison de ce composé avec le récepteur R2 et l'homodimère R2R2 mais pas avec l'hétérodimère R1R2, et une disparition des signaux L1 et L2 en présence du composé à tester est représentative de la liaison de ce composé à la fois avec le récepteur R2, l'homodimère R2R2 et l'hétérodimère R1R2. COUPLE DE PARTENAIRES DE FRET Selon l'invention, les récepteurs membranaires R1 et/ou R2 ainsi que le ligand sont marqués par un membre d'un couple de partenaires de FRET, à savoir, un composé fluorescent donneur ou un composé fluorescent accepteur d'énergie. Avantageusement, le marquage des récepteurs R1 et R2 par les membres d'un couple de partenaires de FRET est un marquage direct par liaison covalente. Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis. Les composés fluorescents donneurs et accepteurs peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination � Bodipy �), les fluorophores connus sous la dénomination � Atto �, les fluorophores connus sous la dénomination � Dy �, les composés connus sous la dénomination � Alexa �, le nitrobenzoxadiazole, les complexes métalliques fluorescents, tels que les cryptates de terre rare, les chélates de terre rare (en particulier les chélates et cryptates d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium, de neodymium); les particules inorganiques luminescentes comme les nanocristaux (�quantum dots� en langue anglaise). Ces composés fluorescents peuvent être utilisés soit comme composés fluorescents donneurs soit comme composés fluorescents accepteurs dans un système de FRET. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole. Les expressions � les cyanines � et � les rhodamines � doivent être respectivement comprises comme � les dérivés de cyanine � et � les dérivés de rhodamine �. L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce. Les composés � Alexa � sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés � Atto � sont commercialisés par la société Attotec ; les composés � Dy � sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés � Cy � sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros. Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et 6 ms), en particulier les chélates ou cryptates de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET (en langue anglaise, � Time Resolved FRET �) en s'affranchissant d'une grande partie du bruit de fond émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention. Avantageusement, ces composés sont des complexes de lanthanides. Ces complexes (tels que chélates ou cryptates) sont particulièrement appropriés en tant que membre du couple de FRET donneur d'énergie. Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de neodymium (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les complexes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés. De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassay. Des exemples de chélates ou cryptates de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont : • Les cryptates de terres rares, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels 35 cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptates de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptates de terres rares sont commercialisés 5 par la société Cisbio Bioassay. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptates d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NHS) : CO2H C H Tris.lBiPv`•-Eu K-P -Bi1 4etraacide-Eu Le cryptate d'europium Py-BiPy-tétraacide-Eu est particulièrement adapté à la mise en oeuvre de l'invention en raison de ses propriétés de résistance à l'extinction de fluorescence dans les milieux biologiques. • Les chélates de terres rares décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Ces chélates de terres rares sont commercialisés par la société PerkinElmer. • Des complexes de terres rares constitués d'un agent chélatant tel que le tetraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO2009/10580. • Le cryptate de terbium Tb(KR) de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NHS) : NH -0 -Co2H KTris Bi -pentaaci de-Eu 12 o NùO NH NH NH NH Tb+ 3 10 NH NH NH NH 15 et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale W02008/063721 est l'un des cryptates de terbium les plus appropriés à la mise en oeuvre de l'invention. • Le cryptate de Terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassay. • Le � quantum dye � de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) 25 • Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Invitrogen de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821. 20 10 20 R En ce qui concerne les accepteurs, les dérivés de cyanine et de fluoréscéine sont préférés. 30 MARQUAGE DES PROTEINES R1 ET/OU R2 : Selon l'invention, les récepteurs membranaires R1 et/ou R2 sont marqués par un membre d'un couple de partenaires de FRET, à savoir, un composé fluorescent donneur ou un composé fluorescent accepteur d'énergie. Plusieurs techniques connues de 35 l'homme du métier permettent de coupler un récepteur membranaire avec des composés fluorescents : (a) Couplage du récepteur membranaire avec un donneur ou un accepteur de manière non covalente 40 Le donneur ou l'accepteur peut être couplé avec le récepteur membranaire par l'intermédiaire d'un couple de partenaires de liaison dont l'un au moins est de nature protéique. Dans cette approche, le récepteur membranaire est fusionné avec le partenaire de liaison de nature protéique par les techniques classiques de biologie moléculaire (construction d'un vecteur d'expression comprenant une séquence de 45 nucléotides codant pour le récepteur membranaire, fusionnée avec celle codant pour le partenaire de liaison protéique, et introduction du vecteur d'expression dans la cellule). Le donneur ou l'accepteur est conjugué de manière covalente à l'autre partenaire de liaison, que l'on appelle ici agent de couplage, qui sera ensuite ajouté au milieu 50 extracellulaire. La reconnaissance des partenaires de liaison permet le marquage indirect du récepteur membranaire par le donneur ou l'accepteur. A titre d'exemple non limitatif de ce type de partenaires de liaison, on peut citer : • le couple constitué de la séquence cystéine-cystéine-X-X-cystéine-cystéine (SEQ ID N°1) dans laquelle X est un acide aminé quelconque et d'un composé biarsenic. Ces composés bi-arsenic peuvent être facilement marqués avec une molécule organique du type fluorescéine ou rhodamine (voir B.A.Griffin et al. (1998) Science. 1998, 281, 269-271 et S.A. Adams et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6063-6076 pour des détails sur la technologie). • Le peptide BTX (bungarotoxine), composé de 13 acides aminés qui est reconnu par la bungarotoxine (BTX), peut être couplé à une molécule fluorescente (voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952). • Le couple streptavidine (ou avidine) / biotine : la séquence de liaison de la Streptavidine (SBP-Tag) est une séquence formée par 38 acides aminés qui présente une haute affinité pour la biotine pouvant être préalablement marquée avec un donneur ou un accepteur (voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952). • La séquence de l'enzyme dihydrofolate réductase d'E. coli (eDHFR) qui lie spécifiquement et avec une haute affinité des ligands, tels que la triméthoprime sur lesquels peuvent être greffés le donneur ou l'accepteur selon la technologie dénommée � Ligand link Universal labelling technology � de la Société Active Motif. Les couples tags/antitags sont des partenaires de liaison fréquemment utilisés pour marquer des protéines. Le terme � tag � désigne une petite � étiquette � protéique constituée d'un séquences d'acides aminés, généralement mais pas obligatoirement assez courte (moins de 15 acides aminés), qui est fusionnée au récepteur membranaire ou bien est naturellement présente dans cette protéine. Le terme � antitag � désigne un anticorps se liant de manière spécifique audit � tag �. Dans cette mise en oeuvre, l'anticorps � antitag � est lié de manière covalente au donneur ou à l'accepteur. Lorsque l'anticorps ainsi marqué est ajouté au milieu extracellulaire, il se lie au � tag � conjugué au récepteur membranaire et l'interaction � tag/antitag � permet le marquage indirect de cette protéine par le donneur ou l'accepteur. A titre d'exemple non limitatif de couples � tags/antitags �, on peut citer les couples suivants dont les membres sont disponibles commercialement : GST/anticorps anti-GST dans lequel GST représente la glutathione S-transférase ou un de ses fragments ; 6HIS/anticorps anti-6HIS dans lequel 6HIS est un peptide constitué de 6 histidines ; Myc/anticorps anti-Myc dans lequel Myc est un peptide constitué des acides aminés 410-419 de la protéine Myc humaine ; FLAG/anticorps anti-FLAG dans lequel FLAG est un peptide ayant les 8 acides aminés DYKDDDDK (SEQ ID N°2) ; HA/anticorps anti HA dans lequel HA est un épitope de l'hémaglutinine d'Influenza, constitué des 9 acides aminés YPYDVPFYA (SEQ ID N°3). Il est clair que la nature exacte du tag n'est pas critique pour la mise en oeuvre de l'invention. (b) Couplage du récepteur membranaire avec un donneur ou un accepteur de manière covalente Dans cette approche, le donneur ou l'accepteur est couplé au récepteur membranaire par une liaison covalente ; plusieurs techniques ont été décrites et les réactifs nécessaires à leurs mises en oeuvre sont disponibles commercialement. Pour ce couplage, on pourra utiliser l'une des techniques ci-après : • formation d'une liaison covalente au niveau d'un groupe réactif présent sur le récepteur membranaire, en particulier au niveau d'un des groupes suivants : le groupe amino terminal, les groupes carboxylates des acides aspartiques et glutamiques, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. Ces groupes présents sur le récepteur membranaire peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par le donneur ou l'accepteur. Les groupes réactifs appropriés sont connus de l'homme du métier : un donneur ou l'accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines de la protéine. De même, un donneur/accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine du récepteur membranaire. Utilisation d'une enzyme suicide Par enzyme suicide on entend des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent la capacité de lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites � suicides � car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat. Ces enzymes constituent par conséquent un outil de choix pour marquer spécifiquement des récepteurs d'intérêt avec un rapport de une molécule fluorescente pour une protéine. Dans cette approche, 10 15 20 25 30 35 une enzyme suicide est fusionnée, par les techniques classiques de biologie moléculaire, avec le récepteur membranaire -de préférence dans sa partie N-terminale- et le substrat de l'enzyme lié de manière covalente à un donneur/accepteur est introduit dans le milieu extracellulaire. La réaction enzymatique a pour conséquence la liaison covalente du substrat marqué à l'enzyme, et donc le marquage du récepteur membranaire par le donneur ou l'accepteur. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les enzymes suivantes : - les mutants de l'O6-alkylguanine DNA alkyltransférase (AGT). Les enzymes SNAP-tag (Juillerat et al, Chemistry & biology, Vol.10, 313-317 Avril 2003) et CLIP-tag (Gautier et al, Chemistry et Biology, 15, 128-136, février 2008) commercialisées par la société NEB sont des mutants de l'AGT humaine dont les substrats sont respectivement, l'O6-benzylguanine (ci-après abrégée BG) et l'02-benzylcytosine (ci-après abrégée BC). L'enzyme N-AGT (Gronemeyer et al (Protein engineering, design & selection, vol. 19, no 7, pp 309-3016, 2006) est un autre mutant de cette enzyme dont la réactivité avec l'O6-benzylguanine est meilleure que celle de l'enzyme SNAP-tag. - les mutant d'une déhalogénase (telle que l'enzyme HaloTag commercialisée par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (voir WO2004/072232), dont certains des substrats sont des composés de la famille des chloroalcanes, en particulier les chloroalcanes comportant le motif -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-(CH2)6-Cl. Dans ce cas, le donneur/accepteur sera conjugué à ce type de motif. - La protéine ACP (� Acyl Carrier Protein �), protéine transporteur d'acyles, sur laquelle est transféré, en présence de phosphopantéthéine transférase, le résidu 4'-phosphopantéthéine du coenzyme A sur une sérine de l'ACP (N.George et al, Journal of the American Chemical society 126 (2004) p 8896-8897). Lorsque cette approche est utilisée pour marquer le récepteur membranaire par le donneur ou l'accepteur, il est nécessaire de rajouter au milieu réactionnel de la phosphopantéthéine transférase. La société NEB commercialise un fragment de l'ACP sous le nom commercial � ACP-Tag � pour le marquage de protéines. Lorsque cette approche est utilisée pour marquer le récepteur d'intérêt, les cellules sont transfectées avec un plasmide d'expression comportant l'ADN codant pour une protéine de fusion comprenant l'enzyme suicide et le récepteur d'intérêt. Ce plasmide peut également comprendre, en amont de l'ADN codant pour ces protéines, l'ADN codant pour une étiquette telle que par exemple l'épitope FLAG, l'épitope myc, ou encore celui de l'hémaglutinine de l'influenza (HA). Ces étiquettes ne sont pas essentielles mais facilitent la manipulation de la protéine de fusion à des fins de contrôle ou de purification. La transfection est opérée par les techniques classiques, telle que l'électropartition. Pour s'assurer que la protéine de fusion sera exprimée dans la membrane cellulaire, il peut être utile d'inclure dans le plasmide d'expression, en amont de la séquence codant pour le récepteur d'intérêt et de l'enzyme suicide, celle codant pour un peptide d'adressage membranaire, tels que le peptide signal T8 ou le peptide signal du récepteur mGIuR5, dont l'utilisation à cet effet est connue de l'homme du métier. Enfin, il peut également être souhaitable de s'assurer que la séquence codant pour le récepteur d'intérêt ne comporte pas de séquence d'adressage membranaire native qui pourrait faire l'objet d'un clivage post-traductionnel de la liaison entre le récepteur d'intérêt et l'enzyme suicide : si c'est le cas, il est préférable de ne pas introduire ce domaine dans le plasmide d'expression. Dans le cas ou l'on travaille sur des cellules intactes, et pour que la réaction enzymatique ait lieu avec le substrat de l'enzyme présent dans le milieu extracellulaire (tel qu'un conjugué BG-partenaire de FRET) , il est nécessaire que l'enzyme suicide soit exposée au milieu extracellulaire : lorsque la partie N-terminale du récepteur d'intérêt naturelle est exposée au milieu extra-cellulaire, ce qui est le cas pour les GPCR et les RTK, la protéine de fusion sera construite de telle sorte que l'enzyme suicide soit exprimée dans la partie N-terminale de la protéine de fusion, mais toujours en aval du peptide d'adressage membranaire s'il est présent. Finalement, lorsque une enzyme suicide est utilisée pour marquer le récepteur d'intérêt avec le partenaire de FRET, et que le récepteur d'intérêt est un GPCR ou un RTK, l'invention comprend une étape préliminaire de transfection des cellules par un vecteur d'expression comprenant la séquence d'ADN codant pour une protéine de fusion dont la partie N-terminale comprend une enzyme suicide et la partie C-terminale comprend le récepteur d'intérêt (R1 ou R2). L'introduction dans le milieu extracellulaire du substrat de l'enzyme conjugué à un partenaire de FRET aura pour conséquence le marquage du récepteur d'intérêt par ce partenaire de FRET. Avantageusement, chacun des récepteurs R1 et R2 est exprimé sous forme de protéine de fusion avec une enzyme suicide, leurs marquages étant effectués par addition dans le milieu de mesure des membres des couples de partenaires de FRET, l'un et l'autre étant chacun lié de manière covalente au substrat de ladite enzyme suicide. Dans ce cas les enzymes suicides utilisées pour chaque récepteur peuvent être différentes ou identiques. Dans ce mode de réalisation, les vecteurs d'expression codant pour une protéine de fusion choisie parmi les protéines de fusion suivantes peuvent être utilisés : enzyme suicide - récepteur d'intérêt, ou étiquette - enzyme suicide - récepteur d'intérêt, ou peptide d'adressage membranaire - enzyme suicide - récepteur d'intérêt, ou peptide d'adressage membranaire - étiquette - enzyme suicide - récepteur d'intérêt. A titre d'illustration de l'utilisation de cette approche, on peut citer les travaux de Maurel et al qui ont décrit la préparation de plasmides codant pour une protéine de fusion comprenant une enzyme suicide (Snaptag) dans la partie N-terminale du récepteur membranaire (GABAB B1, GABAB B2, mGlul) et leur transfection dans des cellules (Nature Methods, 2008, Supplementary methods). LIGAND MARQUE La méthode selon l'invention nécessite l'utilisation de ligands des récepteurs membranaires étudiés, marqués par un membre d'un couple de partenaires de FRET, c'est-à-dire un composé donneur ou un composé accepteur d'énergie. Le ligand utilisé peut être un agoniste, un antagoniste, ou encore un modulateur allostérique connu des récepteurs membranaires étudiés. De très nombreux ligands de GPCR notamment ont été décrits : une base de donnée a été mise à la disposition du public et fournit des informations sur les GPCR et leurs ligands (Okuno, Y. et al., 2008. GLIDA: GPCR ligand database for chemical genomics drug discovery database and tools update. Nuci. Acids Res., 36(suppl_1), D907-912). L'homme du métier a donc accès à un nombre très important de composés se liant à des GPCR et susceptibles d'être utilisés dans la méthode selon l'invention. Le marquage d'un ligand par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme � fonctionnalisée �, c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, le ligand. Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous : Groupe électrophile Groupe nucléophile Type de liaison acrylamides thiols thioéthers halogénures d'acyle amines/anilines carboxamides aldéhydes amines/anilines imines aldéhydes ou cétones hydrazines hydrazones aldéhydes ou cétones hydroxylamines oximes alkyl sulfonates thiols thioéthers anhydrides amines/anilines carboxamides halogénure d'aryle thiols thiophénols halogénure d'aryle amines aryl amines aziridines thiols thioéthers carbodiimides acides carboxyliques N-acylurées ou anhydrides esters activés* amines/anilines carboxamides haloacétamides thiols thioéthers halotriazines amines/anilines aminotriazines imido esters amines/anilines amidines isocyanates amines/anilines urées isothiocyanates amines/anilines thiourées maléimides thiols thioéthers sulfonate esters amines/anilines alkyl amines halogénures de sulfonyle amines/anilines sulfonamides * : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est : • un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-OC4H4NO2), sulfo succinimidyloxy (-OC4H3NO2-SO3H) ; • un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ; • un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride -OCORa ou -OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyles en C1-C6, perfluoroalkyles en C1-C6, alkoxy en C1-C6, cyclohexyle ; • le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle. Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement ; il est donc particulièrement avantageux d'utiliser des ligands contenant une fonction amine ou thiol. Lorsque le ligand est de nature protéique, il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les protéines: le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartiques et glutamiques, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. Si le ligand ne comporte pas de groupe fonctionnel à l'état naturel, de tels groupes peuvent être introduits. Des méthodes d'introduction de groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd edition, L.J. Kricka (1995), Ed. Academic press Ltd., Londres, p. 66-72. Une autre approche pour le marquage d'un ligand par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans le ligand, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Il est important de vérifier que le ligand marqué conserve une affinité suffisante pour son récepteur ; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant: de calculer la constante d'affinité du ligand marqué pour le récepteur. Plusieurs auteurs ont décrit le marquage de ligands connus de GPCR par des composés fluorescents et l'homme du métier est à même de choisir les ligands appropriés selon les GPCR étudiés. On peut citer en particulier les publications suivantes: 15 Middleton, R.J. & Kellam, B., ont publié un article de revue décrivant de nombreux ligands fluorescents (2005. Fluorophore-tagged GPCR ligands. Current Opinion in Chemical Biology, 9(5), 517-525). Beaudet, A. et al. ont présenté les principes essentiels à la préparation de ligands fluorescents (1998. Fluorescent ligands for studying neuropeptide receptors by 20 confocal microscopy. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 31(11), 1479-1489). Thierry Durroux et al. ("Fluorescent Pseudo-Peptide Linear Vasopressine Antagonists: Design, Synthesis, and Applications " Journal of Medicinal Chemistry 42, no. 7 Avril 1, 1999: 1312-1319), ont décrit des ligands du récepteur V1a, marqués à la 25 fluorescéine. La demande internationale de brevet W000/12544 décrit un procédé pour marquer diverses chimiokines, qui sont les ligands des récepteurs aux chimiokines. La demande internationale de brevet W02004/088312 décrit la synthèse d'agonistes et d'antagonistes des récepteurs 132-adrénergiques, marqués par un dérivé du boron- 30 dipyrrométhène (� Bodipy �). L Hein et al. ("Intracellular trafficking of angiotensine II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand," Molecular Endocrinology (Baltimore, Md.) 11, no. 9 (Août 1997): 1266-1277), ont synthétisé un conjugué angiotensine-fluoréscéine. 35 Le brevet US4767718 décrit la synthèse de ligands fluorescent des récepteurs opioïdes, en particulier des antagonistes de ces récepteurs dérivés de la naloxone et de la naltrexone. 10 Heather L Handl et al. ("Lanthanide-based time-resolved fluorescence of in cyto ligand-receptor interactions," Analytical Biochemistry 330, no. 2 (Juillet 15, 2004): 242-250) présentent la fabrication d'un analogue de l'a-MSH, qui est un ligand des récepteurs de la mélacortine, marqué par un chélate d'europium. Bakthavachalam, V. et al. ont décrit le marquage de ligands des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 par de la fluorescéine ou du NBD, en particulier du NAPS (antagoniste D2), du PPHT (agoniste Dl), de SKF83566 (antagoniste Dl), et du SKF38393 (agoniste D1) (1991. Fluorescent probes for dopamine receptors: synthesis and characterization of fluorescein and 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl conjugates of D-1 and D-2 receptor ligands. Journal of Medicinal Chemistry, 34(11), 3235-3241). Par ailleurs, certains ligands fluorescents sont disponibles dans le commerce : c'est le cas par exemple de la naloxone-fluorescéine (antagoniste opioïde) qui est commercialisée par Molecular Probe. A titre d'exemple non limitatif de ligand utilisable dans les méthodes selon l'invention, on peut citer les ligands suivants : EDA9 (antagoniste du récepteur V2, dont la synthèse est décrit par Manning, M. et al., 1992. Potent V2/Vla vasopressin antagonists with C-terminal ethylenediamine-linked retro-amino acids. Journal of Medicinal Chemistry, 35(21), 3895-3904), NAPS (antagoniste du récepteur D2), RS544 (antagoniste du récepteur Via), SDF1 (agoniste de CXCR4 et CXCR7), Propanolol (antagoniste des récepteurs beta2-adrénergiques), VIP (agoniste de VPAC1 et de VPAC2), NDPaIphaMSH ( agoniste des récepteurs MC3 et MC4), MlPlalpha (protéine inflammatoire des macrophages = CCL3 , agoniste de CCR1 et CCR5), RANTES (= CCL5, agoniste de CCR5), MDC (= CCL22, agoniste de CCR4), Angiotensine II (agoniste du récepteur de l'AT1), Substance P (agoniste du récepteur NK1), Neurokinine A (agoniste du récepteur NK2). Ces ligands sont utilisables lorsque R1 et/ou R2 sont l'un des récepteurs membranaires auxquels se lient ces ligands. Ainsi l'EDA9 conjugué à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec les hétérodimères Vla-V2, V2-OT ou l'homodimère V2-V2. Le NAPS conjugué à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec les hétérodimères D2-A1, D2-A2A, D2-SSTR5, D2-D3, D2-SSTRIB, et les homodimères D2-D2. Le RS544 conjugué à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec les hétérodimères Via-V2, V1a-OT, et les homodimères Via-Via. La naltrexazone conjuguée à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec les hétérodimères p-opioïde-SSTRIA, K-opioïde-b-opioïde, p-opioïde-bopioïde, b-opioïde-a2aAR, i5-opioïde-SSTR2A, ô-opioïde-NK1-P, b-opioïde-[32AR, et les homodimères p-opioïde- p-opioïde et ô-opioïde-b-opioïde. La substance P conjuguée à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec l'hétérodimère NK1- b-opioïde. L'angiotensine II conjuguée à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec les hétérodimères AT2-32AR, AT2-B2, AT2-AT1. RANTES conjugué à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention 10 avec les hétérodimères CCR5-CCR2 et les homodimères de CCR5. Le propanolol conjugué à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec les hétérodimères 32AR-AT2, 32AR-b-opioïde, [32AR- K-opioïde, 32AR-Y1, [32AR- H2, [32AR-M3, [32AR-5HT2B, [32AR-5HT2C, 32AR-H3, 32AR-EP1, [32AR-(33AR, 32ARa2aAR, (32AR-M71, et les homodimères 32AR-32AR. 15 Le SDF1 conjugué à un composé fluorescent est utile pour mettre en oeuvre l'invention avec les hétérodimères CXCR4-CCR2, CXCR4-CCRA32, CXCR4-CXCR2B et les homodimères CXCR4CXCR4. PROTEINE MEMBRANAIRE MONOMERES, DIMERES, HOMODIMERES ET 20 HETERODIMERES L'invention peut être mise en oeuvre avec divers récepteurs membranaires mais de manière préférée, les récepteurs membranaires R1 et R2 sont des GPCR. Les récepteurs membranaires sont exprimés dans les membranes cellulaires de manière 25 naturelle, ou bien sont exprimés en utilisant les techniques classiques de biologie moléculaire, en particulier des vecteurs d'expression introduits dans les cellules de manière stable ou transitoire. Les réactifs destinés à l'introduction d'ADN hétérologue dans des cellules, de manière stable ou transitoire, sont disponibles dans le commerce et les séquences d'ADN codant pour les récepteurs d'intérêts, en particulier celles codant 30 pour les GPCR, sont disponibles dans les bases de données telles que Genbank. Lorsque les récepteurs d'intérêt sont exprimés par les cellules de manière stable, des phénomènes de cytotoxicité peuvent être observés en raison de la présence d'un trop grand nombre de GPCR; dans ces cas là, il peut être intéressant d'utiliser un système d'expression inductible pour limiter l'expression des GPCR. 35 Ainsi, la méthode selon l'invention peut comprendre une étape préliminaire de transfection de cellules avec un vecteur d'expression codant pour les récepteur membranaires R1 et / ou R2. Comme décrit plus bas, ce / ces vecteurs peuvent également contenir les séquences codant pour des enzymes suicides permettant le marquage covalent des récepteurs membranaires avec un partenaire de FRET. En particulier, la transfection des cellules s'effectue au moyen d'un vecteur d'expression comprenant la séquence d'ADN codant pour le récepteur R1 d'une part, et par un vecteur d'expression comprenant la séquence d'ADN codant pour le récepteur R2 d'autre part. De manière préférée les récepteurs R1 et R2 sont chacun exprimés par un vecteur d'expression introduit dans la cellule de manière stable ou transitoire. L'invention est particulièrement adaptée à l'étude de la pharmacologie des GPCR. Une liste des GPCR connus a été publiée et les séquences d'ADN codant pour ces récepteurs sont également accessibles (Harmar AJ et al (2009) IUPHAR-DB: the IUPHAR database of G protein-coupled receptors and ion channels. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue): D680-D685). Cette liste, résumée dans la table 1, mentionne également les ligands naturels connus de ces récepteurs. Table 1 - GPCR Famille Ligand naturel Nom officiel IUPHAR Récepteurs de la 5- 5-hydroxytryptamine 5-HT1A hydroxytryptamine 5-h drox r .taurine 5-HT1B 5-h drox •tamine 5-HT1 D 5-h drox r •tamine 5-htle 5-h drox r •tamine 5-HT1F 5-h drox r •tamine 5-HT2A 5-h drox r •tamine 5-HT2B 5-h drox r •tamine 5-HT2C 5-h drox r •tamine 5-HT4 5-h drox r tamine 5-ht5a 5-h drox r •tamine 5-HT6 5-h drox r tamine 5-HT7 Récepteurs de acétylcholine M1 l'acetylcholine (muscariniques) acétylcholine M2 acétylcholine M3 acétylcholine M4 acétylcholine M5 Récepteurs de adénosine Al l'adénosine adénosine A2A adénosine A2B adénosine A3 Récepteurs noradrénaline al A-adrenoceptor adrénergiques adrénaline al B-adrenoceptor adrénaline al D-adrenoceptor adrénaline a2A-adrenoceptor adrénaline a2B-adrenoceptor adrénaline a2C-adrenoceptor noradrénaline (31-adrenoceptor adrénaline (32-adrenoceptor adrénaline R3-adrenoceptor Récepteurs de anaphylatoxine C5a, C5L2 l'anaphylatoxine C5a des Arg74 anaphylatoxine C5a C5a anaphylatoxine C3a C3a Récepteurs de angiotensine AT1 l'angiotensine angiotensine AT2 Récepteurs de apéline APJ l'apéline Récepteurs des Acides biliaires GPBA acides biliaires Récepteurs de la neuromédine B BB1 bombésine gastrine-releasing BB2 peptide BB3 Récepteurs de la Bradykinine B1 Bradykinine Bradykinine B2 Récepteurs des cannabinoïides CB1 cannabinoïdes cannabinoïdes CB2 Récepteurs des CXCL8 CXCR1 chimiokines CXCL1 -3, CXCL5-8, CXCR2 macrophage derived lectine CXCL9-11 CXCR3 CXCL12 CXCR4 CXCL13 CXCR5 CCL3, CCL5, CCL7, CCR1 CCL8, CCL13-16, CCL23 CCL2, CCL7, CCL8, CCR2 CCL13 CCL11 (eotaxin); CCL5, CCR3 CCL7, CCL8, CCL13, CCL15, CCL24, CCL26 CCL17, CCL22 CCR4 CCL3, CCL4, CCL5, CCR5 CCL8, CCL14 CCL20 CCR6 CCL19, CCL21 CCR7 CCL1, CCL4, CCL17 CCR8 CCL25 CCR9 CCL26-28 CCR10 CX3CL1 CX3CR1 XCL1, XCL2 XCR1 CXCL16 CXCR6 Récepteurs de la cholécystokinine CCK1 cholécystokinine cholecystokinin, qastrine CCK2 Récepteurs de la dopamine Dl dopamine dopamine D2 dopamine D3 dopamine D4 dopamine D5 Récepteurs de endothéline 1, ETA I'endothéline endothéline 2 endothélines 1, 2 and 3 ETB Récepteurs de GPER l'estrogène (couplé aux protéines G) Récepteurs des FPR2/ALX formylpeptides FPR3 FPR1 Récepteurs des Acides carboxyliques à FFA1 acides gras libres longue chaine FFA3 FFA2 GPR42 Récepteurs de la galanine GAL1 galanine galanine GAL2 galanine GALS Récepteurs de la ghréline ghrelin ghréline Récepteurs des follicle-stim ulating FSH hormones hormone glycoprotéiques luteinizing hormone, LH chorionic gonadotropin thyroid-stimulating TSH hormone Récepteurs de la gonadolibérine GnRH gonadolibérine gonadolibérine GnRH2 Récepteurs de histamine H1 l'histamine histamine H2 histamine H3 histamine H4 Récepteurs du KiSS1 peptide dérivé de KiSS1 Récepteurs des leukotriène B4 BLT2 leucotriènes FPR2/ALX 5-oxo-ETE OXE leucotriène B4 BLT1 leucotriene D4 CysLT1 leucotriene C4 CysLT2 Récepteurs des acide LPA1 lysophospholipides lysophosphatidique acide LPA2 lysophosphatidique acide LPA3 lysophosphatidique sphingosine 1- S1 P1 phosphate sphingosine 1- S1 P2 phosphate sphingosine 1- S1 P3 phosphate sphingosine 1- S1 P4 phosphate sphingosine 1- S1 P5 phosphate Récepteurs de MCH1 l'hormone de mélano- concentration MCH2 Récepteurs de melanocyte stimulating MC1 la mélanocortine hormone adrenocorticotropic MC2 hormone y melanocyte stimulating MC3 hormone 8-melanocyte MC4 stimulating hormone a-melanocyte MC5 stimulating hormone Récepteurs de la mélatonine MT1 mélatonine mélatonine MT2 Récepteur de la motiline motiline motiline Récepteurs de la neuromédine U NMU1 neuromédine U neuromédine U NMU2 Récepteurs du NPFF1 neuropeptide FF/neuropeptide AF NPFF2 Récepteur du NPS neuropeptide S Récepteurs du NPBW1 neuropeptide W/neuropeptide B NPBW2 Récepteurs du neuropeptide Y Y1 neuropeptide Y neuropeptide Y Y2 pancreatic polypeptide Y4 neuropeptide Y Y5 Récepteurs de la neurotensine NTS1 neurotensine neurotensine NTS2 Récepteurs de nicotinic acid (low GPR109B (temporary name) l'acide nicotinique affinity) nicotinic acid (high GPR109A (temporary name) affinity) lactate GPR81 (temporary name) Non-signalling 7TM FY chimiokine-binding proteins CCPB2 CCRL1 Récepteurs des 13-endorphine N opioïdes 13-endorphine b dynorphine A K nociceptine/orphanine NOP FQ Récepteurs des orexine A, orexine B OX1 orexines orexine A, orexine B OX2 Récepteurs P2Y ADP P2Y1 UTP, ATP P2Y2 UTP P2Y4 UDP P2Y6 ATP P2Y11 ADP P2Y12 UDP-glucose P2Y14 ADP P2Y13 Récepteur du RF-amide P518 gene QRFP peptide P518 product Récepteur du platelet-activating factor PAF facteur activateur des plaquettes Récepteurs de la PKR1 prokinéticine PKR2 Récepteurs de la PRRP prolactolibérine Récepteurs des prostaglandine D2 DP1 prostanoïdes prostaglandine E2 EP1 prostaglandine E2 EP2 prostaglandine E2 EP3 prostaglandine E2 EP4 prostaglandine F2a FP prostacycline IP1 thromboxane A2 TP 11-déshydro- DP2 thromboxane B2 Récepteurs activés thrombine PARI par les protéases serine protéase PAR2 thrombine PAR3 serine protéase PAR4 Récepteurs des RXFP1 peptides de la famille de la relaxine RXFP2 RXFP3 RXFP4 Récepteurs de la somatostatine sst2 Somatostatine somatostatine sst5 somatostatine sst3 somatostatine sstl somatostatine sst4 Récepteurs de la substance P NK1 tachykinine neurokinine A NK2 neurokinine B NK3 Récepteur de la thyrotropine-releasing TRH1 thyréolibérine hormone Récepteur des TA1 amines à l'état de trace (� Trace Amines �) Récepteur de urotensine Il UT l'urotensine Récepteurs de la Vasopressine V1 A Vasopressine et de l'ocytocine Vasopressine V2 Vasopressine V1 B ocytocine OT Récepteurs Olfactifs Famille Ligand naturel Nom officiel IUPHAR Récepteurs de la amylin, CGRP CT calcitonine AMY1 AMY2 AMY3 adrenomedulline, CGRP CALCRL CGRP AMI AM2 Récepteurs de la CRF1 corticolibérine CRF2 Récepteurs du glucagon glucagon glucagon GLP-1 GLP-2 GIP sécrétine sécrétine GHRH Récepteurs de hormone PTH1 l'hormone parathyroïdienne parathyroïdienne TIP-39 PTH2 Récepteurs du VIP PACAP PAC1 et du PACAP VIP, PACAP VPAC1 VIP, PACAP VPAC2 Famille Ligand naturel Nom officiel IUPHAR Récepteurs Calcium CaS sensibles au calcium GPRC6 Récepteurs du GABAB GABAB1 GABAB GABAB2 GABAB Récepteurs GPRC5 RAIG1 RAIG2 RAIG3 RAIG4 Récepteurs Glutamate mGlul métabotropiques du glutamate Glutamate mGlu2 Glutamate mGlu3 Glutamate mGlu4 Glutamate mGlu5 Glutamate mGlu6 Glutamate mGlu7 Glutamate mGlu8 Récepteurs du goût T1 R1 Ti R2 Ti R3 Famille Ligand naturel Nom officiel IUPHAR Récepteurs Wnt3A, Wnt3, Wntl, FZD1 "Frizzled" Wnt2 Wnt FZD2 Wnt FZD3 Wnt FZD4 Wnt FZD5 Wnt FZD6 Wnt FZD7 Wnt FZD8 Wnt FZD9 Wnt FZD10 consitutif SMO La table 2 donne des exemples d'hétérodimères de GPCR constitués d'un premier récepteur R1 et d'un second récepteur R2. Ces hétérodimères peuvent être utilisés dans 5 les méthodes selon l'invention. Table 2 R1 est un GPCR R2 est un GPCR classe type classe type MgluR2 C metabo Glu MgluR3 C metabo Glu MgIuR2 C metabo Glu MgluR4 C metabo Glu MgluR2 C metabo Glu MgIuR8 C metabo Glu MgluR3 C metabo Glu MgluR4 C metabo Glu MgluR3 C metabo Glu MgIuR8 C metabo Glu MgluR4 C metabo Glu MgluR8 C metabo Glu MgIuR1 C metabo Glu CaS C calcium sensing MgluRl C metabo Glu Al A adenosine MgluR2 C metabo Glu 5-HT2A A serotonine MgluR5 C metabo Glu A2A A adenosine GABAB1 C GABAB GABAB2 C GABAB 5-HT1 B A sérotonine 5-HT1 D A sérotonine Al A adénosine Dl A Dopamine Al A adénosine D2 A Dopamine Al A adénosine P2Y1 A Purinergique A2A A adénosine D2 A Dopamine A2A A adénosine D3 A Dopamine AT1 A angiotensine AT2 A angiotensine AT1 A angiotensine B2 A Bradykinine AT2 A angiotensine 132AR A B2-adrenoceptor AT2 A angiotensine B2 A Bradykinine M2 A muscaranic Achl M3 A muscaranic Achl MT1 A mélatonine MT2 A mélatonine SSTR2A A somatostatine SSTR1 B A somatostatine D2 A dopamine SSTR5 A somatostatine D2 A dopamine D3 A dopamine D1 A dopamine D2 A Dopamine CCR2 A chimiokine CCR5 A chimiokine SSTR1A A somatostatine N- A opioïde opioïde SSTR1A A somatostatine SSTR1C A somatostatine SSTR1 A somatostatine SSTR5 A somatostatine SSTR1 B A somatostatine D2 A dopamine SSTR2 A somatostatine SSTR3 A somatostatine T1 R1 C goût T1 R3 C goût T1 R2 C goût T1 R3 C goût b- A opioïde K - A opioïde opioïde opioïde p- A opioïde b- A opioïde opioïde opioïde b- A opioïde a2aAR A A2-adrenoceptor opioïde b- A opioïde SSTR2A A somatostatine opioïde b- A opioïde NK1-P A tachykinine opioïde b- A opioïde (32AR A B2-adrenoceptor opioïde b- A opioïde SNSR-4 A opioïde K- A opioïde (32AR A B2-adrenoceptor opioïde Orexin1 A Orexin CB1 A Cannabinoid MT1 A mélatonine GPR50 ? Orph MrgE ? Orph MrgD ? Orph ETA A endothéline ETB A endothéline V1 a A Vasopressine V2 A Vasopressine V1 a A Vasopressine OT A Ocytocine V2 A Vasopressine OT A Ocytocine a1aAR A A1-adrenoceptor albAR A A1-adrenoceptor a1bAR A A1-adrenoceptor H1 A Histamine a 1 dAR A A1-adrenoceptor al bAR A A1-adrenoceptor [31AR A B1-adrenoceptor a2aAR A A2-adrenoceptor 131AR A B1-adrenoceptor [32AR A B2-adrenoceptor (32AR A B2-adrenoceptor M71 A olfactory receptor (32AR A B2-adrenoceptor a2aAR A A2-adrenoceptor 132AR A B2-adrenoceptor B3AR A B3-adrenoceptor f32AR A B2-adrenoceptor EP1 A [32AR A B2-adrenoceptor H3 A Histamine [32AR A B2-adrenoceptor 5HT2C A sérotonine [32AR A B2-adrenoceptor 5HT2B A sérotonine [32AR A B2-adrenoceptor M3 A muscaranic Achl [32AR A B2-adrenoceptor H2 A Histamine B2AR A B2-adrenoceptor Y1 A neuropeptide Y 5HT2C A sérotonine [33AR A B3-adrenoceptor 5HT2C A sérotonine Y5 A neuropeptide Y 5HT2C A sérotonine M1 A muscaranic Achl CXCR1 A chimiokine CXCR2 A chimiokine CXCR4 A chimiokine CXCR2B A chimiokine CXCR4 A chimiokine CCRA32 A chimiokine CXCR4 A chimiokine CCR2 A chimiokine CCR2 A chimiokine CCR5 A chimiokine Les GPCR de la table 3 peuvent former des homodimères. Table 3, GPCR classe type CaSR C calciumSensinq MgIuR1 C metabo Glu MgluR2 C metabo Glu MgluR3 C metabo Glu MgluR4 C metabo Glu MgluR5 C metabo Glu MgluR6 C metabo Glu MgluR7 C metabo Glu MgIuR8 C metabo Glu 5-HT2C A serotonine 5-HT1 B A serotonine 5-HT1 C A serotonine (31AR A B1-adrenoceptor (32AR A B2-adrenoceptor Via A Vasopressine V2 A Vasopressine Ô-opioïde A opioïde p-opioïde A opioïde k-opioïde A opioïde D1 A dopamine D2 A dopamine D3 A dopamine H2 A Histamine H4 A Histamine a2aAR A A2-adrenoceptor B4 A Bradykinine B2 A Bradykinine CCR2 A chimiokine CCR5 A chimiokine CXCR4 A chimiokine CXCR2 A chimiokine CXCR1 A chimiokine CCK A cholecystokinin LTB1 A leukotriene MT1 A mélatonine MT2 A mélatonine M2 A muscarinic Achl M3 A muscarinic Achl OT A Ocytocine SSTR5 A somatostatine SSTRIA A somatostatine SSTR1B A somatostatine SSTR1C A somatostatine SSTR2A A somatostatine GnRH A gonadotrophin TRH B thyrotropin GHSR1 A ghréline IgGhepta B Al A adénosine PACAP B PARI A thrombine AT1 A angiotensine Rhodopsin A Frizzled4 MC1 A mélacortine EXEMPLES Exemple 1, : Préparation de cellules exprimant des monomères et des homodimères de récepteurs V2, fusionnés avec une enzyme suicide SNAPtag (ST) ou CLIPtag (CT) Réactifs et matériels utilisés : OptiMEM (Invitrogen (51985-026)) Krebs-glucose : Tampon Krebs + glucose 0,5g/I Plasmide FLAG-ST-V2 : plasmide comportant la séquence codant pour une protéine de fusion comprenant un peptide signal d'adressage membranaire T8, l'épitope FLAG, l'enzyme SNAPTAG et le récepteur V2. La séquence de ce plasmide est la SEQ ID n°4. Plasmide FLAG-CT-V2 : plasmide comportant la séquence codant pour une protéine de fusion comprenant un peptide signal d'adressage membranaire T8, l'épitope FLAG, l'enzyme CLIPTAG et le récepteur V2. La séquence de ce plasmide est identique à celle du plasmide FLAG-ST-V2 à l'exception de la séquence codant pour SNAPtag qui a été remplacée par celle codant pour CLIPtag. Un vecteur comportant l'enzyme CLIP-tag est commercialisé par la société New England biolabbs (NEB), qui fournit également sa séquence. Traitement des plaques 50 pl de solution de poly-L-Ornithine (solution 0,01°h, poids moléculaire 30,000- 70,000 (SIGMA P4957)) ont été distribués dans chaque puits d'une plaque de 96 puits (Cellstar, noire à fond noir) afin de favoriser l'adhérence des cellules au fond du puits, et les plaques ont été mises à incuber pendant 30 min à 37° C. Transfection Le mélange de transfection suivant a ensuite été distribué dans chaque puits : - 0,16pg de plasmide FLAG-ST-V2 + 0,16pg de plasmide FLAG-CT-V2 - 0,8 pl de Lipofectamine 2000 - 50 pl de milieu OptiMEM Après 30 minutes d'incubation, 100 pl d'une suspension contenant 100 000 cellules COS7 ont été ajoutées dans chaque puits, puis incubées pendant 24 heures à 37°C en présence de 5% de CO2. Exemple 2 :, Préparation de cellules exprimant des monomères de récepteurs mGlu3, mGlu2, et des hétérodimères de récepteurs mGlu2-mGlu3 Le même protocole que celui de l'exemple 1 a été utilisé pour l'expression d'hétérodimères mGIuR2-mGIuR3, en utilisant les même plasmides que dans cet exemple mais en remplaçant la séquence du récepteur V2 par celle du récepteur mGlu2 ou mGlu3. Ainsi, les plasmide FLAG-ST-mGIuR2 et FLAG-ST-mGIuR3 ont été utilisés pour l'expression des dimères mGluR2-mGluR3, dans lesquels mGluR2 est fusionné à SNAPtag et mGluR3 est fusionné à CLIPtag.5 REVENDICATIONS1. Méthode de détermination de la liaison d'un composé à tester avec des récepteurs membranaires R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme hétérodimérique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : (a) Marquage du récepteur R1 de manière covalente ou non-covalente par le premier membre d'un couple de partenaires de FRET (D,A1), dans lequel D est le composé donneur et Al est le composé accepteur d'énergie, (b) Ajout au milieu de mesure d'un ligand connu de R2 capable de se lier à l'hétérodimère R1R2 mais ni au récepteur R1 ni à l'homodimère R1R1, ledit ligand étant marqué par le second membre dudit couple de partenaires de FRET, (c) Mesure de la luminescence L1 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A1, en présence et en l'absence du composé à tester. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le premier membre dudit couple de partenaires de FRET, utilisé pour marquer le récepteur R1, est le composé donneur d'énergie D, et en ce que le second membre de ce couple, lié au ligand, est le composé accepteur Al. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le premier membre dudit couple de partenaires de FRET, utilisé pour marquer le récepteur R1, est le composé accepteur d'énergie Al, et en ce que le second membre de ce couple, lié au ligand, est le composé donneur D. 25 4. Méthode selon la revendication, 3 caractérisée en ce que - l'étape (a) comprend également le marquage du récepteur R2 de manière covalente ou non-covalente par un second composé accepteur d'énergie A2, Al et A2 ayant des longueurs d'onde d'émission différentes et (D,A2) formant un couple de partenaires 30 de FRET, et - l'étape (c) comprend également la mesure de la luminescence L2 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A2, en présence et en l'absence du composé à tester. 35 5. Méthode de détermination de la liaison d'un composé à tester avec des récepteurs R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme homodimérique mais pas hétérodimérique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :20 (a) Marquage du récepteur R1 de manière covalente ou non-covalente par un premier composé donneur d'énergie D1 et du récepteur R2 de manière covalente ou non-covalente par un second composé donneur d'énergie D2, (b) Ajout au milieu de mesure d'un ligand connu capable de se lier aux récepteurs R1, R2 et aux homodimères R1R1 et R2R2, ce ligand étant marqué par un composé accepteur d'énergie A, et les couples (D1,A) et (D2,A) formant chacun des couples de partenaires de FRET, (c) Mesure de la luminescence totale Ltot émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A, (d) Ajout d'un composé extincteur du signal de FRET du couple (D1,A), (e) Mesure de la luminescence L2 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A, (f) Détermination de la luminescence L1 due au couple (D1,A) par la formule L1=Ltot L2, la séquence des étapes (c) à (f) étant mise en oeuvre en présence et en l'absence du composé à tester. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le composé donneur d'énergie D1 est un complexe de lanthanide et le composé extincteur du FRET du couple (D1,A) est un composé comportant un domaine de liaison avec Dl. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que D1 est un cryptate de lanthanide et en ce que le composé extincteur du FRET du couple (D1,A) est un anticorps spécifique de Dl. 8. Méthode de détermination de la liaison d'un composé à tester avec des récepteurs membranaires R1 et R2 exprimés dans les membranes cellulaires, ces récepteurs étant connus pour être présents sous forme homodimérique mais pas hétérodimérique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : (a) Marquage du récepteur R1 de manière covalente ou non-covalente par un premier composé accepteur d'énergie Al et du récepteur R2 de manière covalente ou non-covalente par un second composé accepteur d'énergie A2, Al et A2 ayant des longueurs d'onde d'émission différentes, (b) Ajout au milieu de mesure d'un ligand connu capable de se lier aux récepteurs R1, R2 et aux homodimères R1R1 et R2R2, ce ligand étant marqué par un composé donneur d'énergie D, et les couples (D,Al) et (D,A2) formant chacun des couples de partenaires de FRET, (c) Mesure de la luminescence L1 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur Al d'une part, et de la luminescence L2 émise à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur A2 d'autre part, chacune en présence et en l'absence du composé à tester. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que R1 et R2 sont des récepteurs couplés aux protéines G. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les 10 composés donneurs d'énergie sont des complexes de lanthanides fluorescents. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que les complexes de lanthanides sont des complexes de terbium fluorescents ou des complexes d'europium fluorescents. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le marquage des récepteurs R1 et R2 par les membres d'un couple de partenaires de FRET est un marquage direct par liaison covalente. 13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que les récepteurs R1 et R2 20 sont chacun exprimés sous forme d'une protéine de fusion avec une enzyme suicide, et en ce que leurs marquages sont effectués par addition dans le milieu de mesure des membres des couples de partenaires de FRET, l'un et l'autre étant chacun lié de manière covalente au substrat de ladite enzyme suicide. 25 14. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que les récepteurs R1 et R2 sont chacun exprimés sous forme d'une protéine de fusion avec une enzyme suicide différente. 15. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce les récepteurs R1 et R2 sont 30 chacun exprimés sous forme d'une protéine de fusion avec la même enzyme suicide. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape préliminaire de transfection des cellules par un vecteur d'expression comprenant la séquence d'ADN codant pour le récepteur Ri d'une part, et par un vecteur 35 d'expression comprenant la séquence d'ADN codant pour le récepteur R2 d'autre part. 17. Méthode selon la revendication 16, caractérisée en ce que les vecteur d'expression comprennent chacun la séquence d'ADN codant pour une protéine de fusion dont la 15partie N-terminale comprend une enzyme suicide et la partie C-terminale comprend le récepteur R1 ou R2. 18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape de comparaison des valeurs de luminescence L1 et/ou L2 mesurées en l'absence et en présence du composé à tester.