Brevet FR2960552A1 — publié le 20111202

La présente invention concerne un procédé de typage automatisé et discriminant de Legionella pneumophila, Un autre but de la présente invention se rapporte à un kit pour la mise en oeuvre du procédé susmentionné. Legionella, bacille à Gram négatif, strictement aérobie, acapsulé et non sporulant, est l'agent étiologique de la Iégionellose, maladie respiratoire dont la forme la plus grave se traduit par une pneumopathie aigue parfois mortelle. Cette bactérie hydro-tellurique présente la particularité de coloniser aussi bien les eaux naturelles que les milieux hydriques artificiels comme les circuits des tours aéroréfrigérantes ou les réseaux d'eaux chaudes sanitaires. Bien que la bactérie soit souvent présente dans ce type d'écosystème, ce n'est qu'en 1977, suite à l'épidémie de Philadelphia de 1976, qu'elle a été caractérisée pour la première fois. Maladie à déclaration obligatoire depuis 1987 en France, la légionellose a été diagnostiquée chez 1244 patients en 2008, soit près de 5% des pneumopathies communautaires, avec un taux de létalité de 11%. La contamination a lieu par voie aérienne, suite à l'inhalation de fines particules d'eau contaminée aérosolisées et véhiculées par l'air. Les facteurs de risque sont liés à l'âge, au sexe (maladie plus fréquente chez les hommes), au tabagisme, à l'éthylisme, aux états d'immunodépression, à l'existence d'affections respiratoires chroniques ainsi qu'au mode de vie (séjours prolongés ou fréquents dans des lieux climatisés, dans des centres de soins...). Le genre Legionella compte 48 espèces mais l'espèce Legionella pneumophila est responsable à elle seule de plus de 98% des légionelloses. L'espèce L. pneumophila comprend trois sous-espèces (pneumophila, fraseri et pasculei) et quinze sérogroupes. Bien qu'aucun lien n'ait été démontré entre le sérogroupe et un historique génétique particulier, Legionella pneumophila subsp pneumophila sérogroupe 1 est incriminée dans plus de 95% des pneumopathies à Legionella. A l'inverse, d'autres espèces comme L. anisa, L. miedadei, L. dumoffii ou L. feeleii sont rarement pathogènes pour l'homme bien qu'elles soient fréquemment rencontrées dans les réseaux d'eau chaude. L'extraordinaire capacité d'adaptation développée par Legionella pneumophila ainsi que la multiplicité des milieux colonisés rendent difficile la compréhension d'apparition de foyers épidémiques de légionellose. Une enquête épidémiologique approfondie doit être entreprise afin d'identifier la source de la contamination et de suivre le pathogène incriminé. Pour répondre à ce besoin, il est nécessaire de savoir distinguer les différentes souches au sein de l'espèce considérée. ETAT DE LA TECHNIQUE L'utilisation récente de techniques de typage moléculaire faisant appel aux méthodes d'empreintes génétiques (DNA fingerprinting) a augmenté considérablement la puissance des méthodes de typage bactérien qui, traditionnellement, se fondaient sur l'utilisation de marqueurs phénotypiques peu discriminants et à la reproductibilité médiocre. Avant l'ère du séquençage en masse des génomes bactériens, les techniques moléculaires de génotypage reposaient sur la détection par hybridation de séquences d'insertion (IS-RFLP : polymorphisme de longueur des fragments de restriction de séquence d'insertion), d'amplification PCR (amplification en chaîne par polymérase) au hasard (RAPD : Amplification au hasard d'ADN polymorphe, AFLP : polymorphisme de longueur de fragments amplifiés) ou de différences à des sites de restriction (PFGE). La PFGE ou Electrophorèse sur gel en champ pulsé repose sur l'analyse des profils de macrorestriction de l'ADN total par électrophorèse en champ pulsé. Le résultat est un profil de restriction définissant un pulsotype caractérisant l'isolat bactérien étudié. La PFGE demeure la technique de typage standard pour de nombreuses espèces bactériennes dont L. pneumophila. En effet, cette méthode présente un pouvoir de discrimination élevé estimé à plus de 96% pour cette bactérie. Cependant, la PFGE est en cours d'abandon dans les laboratoires de biologie moléculaire en raison de ses nombreux inconvénients techniques et pratiques : la technique est longue, couteuse et difficile à mettre en oeuvre. L'inconvénient majeur reste le manque de reproductibilité inter-laboratoire et le défaut évident de standardisation des résultats obtenus. Au cours de la dernière décennie, la disponibilité croissante des séquences génomiques complètes de nombreuses bactéries pathogènes a permis de développer de nouvelles techniques. L'une d'entres elles, le SBT «typage à base de séquences» est préconisée comme technique de typage de référence pour L. pneumophila par le Groupe de Travail Européen sur les Infections à Legionella (EWGLI). Cette méthode est basée sur le polymorphisme de séquences de plusieurs loci indépendants (généralement six ou sept) qui présentent des variations intra-spécifiques. Chaque locus d'intérêt est séquencé puis l'allèle identifié est associé à un caractère numérique. Ainsi, pour chaque souche, le profil allèlique représentant le génotype ou «séquence type» est défini par un code numérique. Le typage par SBT permet donc facilement l'échange des données produites dans différents laboratoires. Ces échanges sont facilités par l'existence d'une base publique pour les données de typage de L. pneumophila par SBT mise en place par l'EWGLI. Dès 2005, Gaia et col. (J. Clin. Microbiol 2005, 43, pp 2047-2052) proposent un protocole de typage des isolats de Legionella pneumophila par SBT avec six loci. Cette technique s'avère reproductible et presque aussi discriminante que celles classiquement utilisées, notamment l'électrophorèse par champ pulsé. Cependant, l'indice de discrimination de ce protocole (0.926) reste en deçà des recommandations du groupe d'étude sur les marqueurs épidémiologiques (l'ESGEM) qui considère que, pour une technique de typage performante, testée sur une collection de référence, cet indice doit être supérieur à 0.95. Ainsi, en 2007, Ratzow et col. (J. Clin. Microbiol 2007,45, pp 1965-1968) préconisent l'ajout d'un septième locus au protocole initial afin de définir un protocole de typage par SBT à sept loci qui permet d'obtenir un indice de 0.961. Cependant, l'application en routine du typage par SBT dans les laboratoires de biologie moléculaire n'est pas encore envisageable. En effet, le typage d'un isolat comprend l'amplification et le séquençage de 7 fragments PCR (sens et anti-sens pour chaque locus étudié aboutissant à l'obtention de 14 séquences), cette méthode reste donc encore très couteuse, fastidieuse et longue (le résultat de typage SBT d'un isolat est assuré en 12 heures avec un séquenceur 4-capillaires). Récemment, un protocole MLVA ou « Analyse de plusieurs locus VNTR (Répétition en tandem polymorphe) » sur Legionella pneumophila décrivant l'analyse du polymorphisme de répétitions de huit loci VNTR a été publié (Pourcel et al., J. Clin. Microbiol.2003,41, pp 1819-1826 et Pourcel et al., J. Clin. Microbiol 2007, 45, pp 1190-1199). Les VNTRs sont des répétitions en tandem présentant un polymorphisme intra-espèce du nombre de répétitions justifiant ainsi leur utilisation comme marqueurs moléculaires. Les répétitions en tandem sont des séquences génomiques, présentes dans les régions codantes ou intergéniques, caractérisées par la répétition d'un motif nucléotidique élémentaire. Ces séquences sont également souvent appelées microsatellites lorsque le motif répété comprend moins de 9 paires de bases et minisatellite lorsque le motif répété comprend 9 paires de base et plus. Le génotypage par MLVA repose sur l'amplification par PCR de ces régions ciblées, dispersées sur le génome bactérien, à l'aide d'amorces spécifiques des régions flanquantes, et sur la détermination des tailles des amplicons par électrophorèse permettant d'évaluer le nombre de répétitions à un locus donné. Les motifs répétés peuvent compter de une à plus de cent paires de bases et la taille des amplicons varie de quelques dizaines à plus de mille nucléotides. La longueur des unités répétées étant connue, ces tailles reflètent le nombre de séquences répétées dans les régions amplifiées. Cette méthode d'empreintes génétiques augmente considérablement, pour certaines espèces, la puissance des méthodes de génotypage bactérien. Le résultat du typage est un code numérique incluant le nombre de motifs à chaque locus. Ce type de génotypes numériques, dont l'interprétation est facilitée, est parfaitement adapté aux études comparatives intra et inter laboratoire menées dans le cadre d'un suivi ou d'une enquête épidémiologique. Dans cette publication de Pourcel et coll. ( J. Clin. Microbiol 2007, 45, pp 1190-1199), le typage par MLVA est réalisé sur un panel d'une centaine de souches. La plupart des critères de performance relatifs à une excellente technique de typage ont été satisfaits : stabilité des marqueurs utilisés, typabilité excellente (supérieure à 98%), reproductibilité parfaite et pouvoir de discrimination élevé (similaire à celui du SBT à six loci). Dans cette étude, l'analyse des tailles des loci a été réalisée par électrophorèse sur gel d'agarose. Toutefois, il paraît difficile d'envisager d'entreprendre le typage systématique par MLVA des nouveaux isolats identifiés dans un contexte de suivi épidémiologique en utilisant le même support. En effet, le développement d'appareillages dédiés doit obligatoirement être envisagé pour ce procédé. La nécessité d'un développement d'une nouvelle méthode de typage moléculaire s'impose donc pour permettre la réalisation d'un typage bactérien de Legionella pneumophila discriminant à haut-débit, de routine et à moindre coût. RESUME DE L'INVENTION La présente invention a pour but un nouveau procédé de génotypage de l'espère Legionella pneumophila par qui évite tout ou partie des inconvénients précités, et notamment qui permette un typage automatique, rapide, au pouvoir de discrimination élevé, reproductible et à haut-débit de Legionella pneumophila dans le cadre d'une application en typage de routine. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de génotypage de l'espère Legionella pneumophila par MLVA comprenant les étapes consistant à : (i) réaliser une co-amplification d'au moins huit loci VNTRs par PCR multiplexe dans un milieu réactionnel comprenant un échantillon d'ADN de Legionella pneumophila afin de former plusieurs amplicons pour chacun des huit loci VNTRs, (ii) analyser lesdits amplicons par électrophorèse capillaire afin d'obtenir un profil électrophorétique dudit échantillon, et (iii) attribuer un code numérique MLVA audit profil électrophorétique. La présente invention repose sur la technique de typage MLVA combinée à une PCR multiplexe apte à co-amplifier au moins huit loci VNTRs en une seule fois, en une seule étape. En effet, la présente invention représente le premier procédé de typage du pathogène Legionella pneumophila par une seule réaction de PCR, et est le seul procédé ayant dépassé le multiplexage de plus de huit VNTRs pour un typage par MLVA. Jusqu'à présent, il était possible de co-amplifier maximum quatre loci VNTRs mais pas au moins huit. Le procédé selon l'invention représente donc une réelle avancée technologique. Par définition, le terme de "PCR multiplexe" désigne une mise au point de la technique PCR autorisant l'amplification, en une seule réaction, de plusieurs segments d'ADN distincts. Le premier avantage de cette adaptation technique est la réduction du coût et la diminution du temps de réalisation et d'analyse des résultats. La réalisation d'une PCR multiplexe s'opposant à de nombreuses contraintes techniques. Ainsi, un des intérêts du procédé de l'invention réside dans l'identification d'un produit PCR multiplexe, comme l'allèle de VNTRs connus. Il n'est pas judicieux d'analyser le résultat de la PCR multiplexe sous forme d'un profil de bandes, souvent peu reproductibles et dont la standardisation est hasardeuse. Le procédé selon l'invention a donc été conçu pour une application du typage avec analyse des fragments amplifiés par électrophorèse capillaire et validés sur les appareils de type Applied Biosystems Genetic Analyser 3100-Avant, 3130, 3130x1 et 3500. En outre, la technique MVLA employée avec la PCR multiplexe permet un typage précis de la souche identifiée et convient également parfaitement à des études comparatives fines entre souches bactériennes dans un délai très court (moins de quatre heures). Par conséquent, le présent demandeur a ainsi trouvé une méthode permettant un génotypage du pathogène Legionella pneumophila à un coût suffisamment réduit pour envisager sa large utilisation dans les laboratoires de microbiologie en test de premier rang. En particulier, le code numérique MLVA de l'étape (iii) est obtenu automatiquement par informatique. De préférence, le code numérique MLVA de l'étape (iii) est obtenu à partir de logiciel d'analyse de fragments ou de génotypage. Le profil électrophorétique obtenu peut être analysé avec plusieurs logiciels différents disponibles en libre accès (Peak Scanner, CLC Sequence Viewer®,...). Cependant, le traitement des données électrophorétiques ainsi que l'automatisation des résultats de typage sont possible par l'utilisation du logiciel Genemapper® (Applied Biosystems). En particulier, ce logiciel peut être associé à trois fichiers (figures 6 à 8) mis au point par le demandeur afin d'obtenir le code numérique MLVA automatiquement. Ces fichiers sont ainsi à importer sous GeneMapper®, qui décrivent les différents paramètres à ajuster et les données à interpréter afin qu'un utilisateur non initié puisse obtenir simplement le code MLVA de la souche typée avec pour chaque locus un indice indiquant le degré de confiance attribué à la valeur associée (nombre de motifs répétés pour le VNTR considéré). Ainsi, le fichier nommé «MLVA analysis.xml » (figure 6.1 à 6.5) permet le traitement des données analysées selon des critères définis et les fichiers nommés «MLVA management A.txt » (figure 7) et « MLVA management B.txt » (figure 8.1 à 8.2) compilent l'ensemble des données recueillies sur les différents allèles associés à chaque marqueur défini par une gamme de taille et de couleur. Ces fichiers sont décrits explicitement dans les figures 6.1 à 8.2. Par conséquent, le présent procédé présente l'avantage de permettre un typage automatique, rapide, au pouvoir de discrimination élevé, reproductible et à haut-débit de Legionella pneumophila dans le cadre d'une application en typage de routine. Or, au vu de l'état de la technique actuel, il n'était pas évident pour un homme du métier de mettre au point une technique permettant l'obtention de l'ensemble de ces avantages. Avantageusement, le milieu réactionnel de l'étape (i) comprend : au moins huit amorces sens marquées et au moins huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces senslanti-sens pour chacun desquels corresponde un locus VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en amont de son locus respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son locus respectif. Par définition les amorces sens et anti-sens sont des séquences oligonucléotidiques capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, respectivement sur le brin d'ADN anti-sens i.e. le brin non codant transcrit et sur le brin d'ADN sens i.e. le brin codant non transcrit. Selon une caractéristique de l'invention, les au moins huit amorces sens sont marquées par un fluorophore en 5'. Préférentiellement, le fluorophore est choisi parmi : 6-FAMTM, NEDTM, 10 PETTM ou VICTM (Applied Biosystems). Chacune des amorces sens est donc marquée avec un fluorophore défini par un spectre d'excitation unique et permet alors d'associer un VNTR donné à une gamme de couleur ou de motifs lors de la visualisation des profils électrophorétiques. De plus, les amorces sens et anti-sens ont été élaborées de telle sorte que 15 chaque VNTR soit associé à une gamme de taille connue. Ainsi, un plan de multiplexage calibré par les deux dimensions spectrale, assurée par le marquage des amplicons, et spatiale, garanti par le choix pertinent des amorces, permet d'identifier d'une manière unique chaque VNTR (voir le plan de multiplexage Figure 1). De manière préférée, le milieu réactionnel comprend en outre huit amorces 20 sens supplémentaires non marquées. En particulier, le ratio : amorces sens non marquées sur amorces anti-sens est de l'ordre de 2/3 et le ratio : amorces sens marquées sur amorces anti-sens est de l'ordre de 1/3. De manière avantageuse, les au moins huit couples d'amorces respectivement 25 anti-sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis parmi : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ 30 SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24. Selon un mode de réalisation préféré, est réalisée à l'étape (i), une coamplification de dix loci VNTRs par PCR multiplexe. Dans ce mode de réalisation, le milieu réactionnel comprend les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24 La présente invention se rapporte également à un kit de génotypage de Legionella pneumophila pour la mise en oeuvre du procédé de génotypage décrit ci-10 dessus, comprenant : - un milieu réactionnel comportant au moins huit amorces sens marquées et au moins huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces sens/antisens pour chacun desquels corresponde un locus VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en 15 amont de son locus respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son locus respectif, - un mix d'amplification, comme celui fourni par Qiagen (multiplex mix PCR), - éventuellement un témoin positif comme l'ADN de la souche dite de 20 Philadelphie dont le génotype MLVA est connu et un faux témoin négatif comme l'ADN d'un isolat de l'espèce Legionella anisa, de manière à valider le résultat et s'affranchir de faux-positifs ou de faux-négatifs. De preference, les au moins huit couples d'amorces respectivement anti-sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis parmi : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ 25 ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :111 SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24 30 Selon un mode de réalisation du kit, celui-ci comprend un premier milieu réactionnel comprenant les couples d'amorces respectivement anti-sens/sens suivants : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :111 SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24 Les amorces utilisées présentent ainsi la triple particularité i) de garantir l'unicité d'un VNTR sur un profil électrophorétique par la caractérisation du vecteur taille/couleur, ii) de permettre leur association dans une seule réaction de PCR (la formation de structures en dimères ou hairpin entre les amorces a été recherchée) et iii) de s'hybrider au niveau de zones conservées chez l'espèce Legionella pneumophila. DESCRIPTION DETAILLEE : L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de tests expérimentaux, en référence aux figures annexées dans lesquelles : - la Figure 1 représente le plan de multiplexage mis au point par le présent demandeur ; - la Figure 2.1-2.2 (2 pages) représente un dendrogramme réalisé selon l'UPGMA (méthode de groupe de paires hiérarchiques non pondérées avec l'agrégation (cluster) de l'analyse de la moyenne arithmétique) présentant l'agrégation des isolats de la collection EWGLI (98 isolats) par le protocole de typage selon l'invention (12 loci VNTRs) ; - la Figure 3.1-3.2 (2 pages) représente un dendrogramme réalisé selon l'UPGMA présentant l'agrégation des isolats de la collection EWGLI (98 isolats) par le protocole de typage selon Pourcel et col. (8 loci VNTRs par MVLA et sans PCR multiplexe) ; - les Figures 4a (2 pages) et 4b (2 pages) représentent les dendrogrammes réalisés selon I'UPGMA présentant l'agrégation des isolats de la collection EWGLI (98 isolats) par les protocoles de typage respectivement SBT6 et SBT7 (technique de l'art antérieure) ; - la Figure 5 représente trois Tableaux 9a, 9b et 9c correspondant aux résultats pour une analyse de reproductibilité ; - la Figure 6.1 à 6.5 (cette figure comporte 5 pages) représente le fichier d'analyse mis au point par le présent demandeur pour obtenir le code MVLA automatiquement, il s'agit d'un programme d'ordinateur qui permet le traitement des données analysées; - les figures 7 et 8.1 à 8.2 (2pages) sont des fichiers également mis au point par le présent demandeur qui compilent l'ensemble des données recueillies sur les différents allèles associés à chaque marqueur défini par une gamme de taille et de couleur. A) Détails expérimentaux La section suivante décrit les matériels et méthodes utilisés pour le génotypage de Legionella pneumophila par le procédé de la présente invention. Elle 10 sera décomposée en quatre parties : 1) Choix et sélection des VNTRs, 2) Elaboration des amorces et construction du plan de multiplexage, 3) PCR multiplexe et analyse des fragments et 4) Obtention du code MLVA. 1) Choix et sélection des VNTRs 15 Trois génomes séquencés de Legionella pneumophila (Legionella pneumophila str. Lens, Legionella pneumophila str. Paris et Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1) ont été comparés afin de mettre en évidence les séquences répétées présentant un polymorphisme de répétitions. Pour effectuer une recherche de VNTRs pour l'espèce L. pneumophila, la 20 procédure suivante a été utilisée : sur le site http:/Iwww.hpabionum.org.uk/VNTRUK/ le lien «intra-genus » de la section Polymomhic TRs pour Legionella a été activé. Les critères de sélection doivent être choisis de manière pertinente et peuvent être modulés après avoir coché la case « more criteria ». Les paramètres imposés sont la présence du VNTR pour les trois souches (locus number : 25 3), l'exclusion des microsatellites dont le motif répété est inférieur ou égal à 6pb (pattern size : >6) et la conservation des motifs répétés (match% : >70). Cette requête fait apparaître 55 résultats dont 8 doublons, 1 triplet et 1 sextuplet ; ce sont donc 40 VNTRs identifiés par cette requête. Le présent demandeur a procédé à la validation exhaustive des 30 loci restants en évaluant leur présence et leur polymorphisme sur 30 la collection EWGLI. La présente invention a donc fait l'objet au préalable de la recherche exhaustive de tous les VNTRs présents chez L. pneumophila. Un couple d'amorces a été élaboré pour l'amplification de chacune des 30 séquences répétées en utilisant le logiciel Primera. Finalement, le présent demandeur a conservé 8 VNTRs et 4 autres VNTRs supplémentaires de type microsatellite. 35 Ainsi, 26 VNTRs ont été exclus du protocole de typage en raison de leur faible5 polymorphisme (seulement deux allèles identifiés sur les 96 isolats testés). Dans la suite de la description, les tests ont été réalisés pour les 12 loci VNTRs, bien que le procédé de génotypage à partir de la co-amplication d'au moins 8 loci VNTRs, est également performant (voir Tableau 1 ci-dessous). En effet, huit loci VNTRs (les huit premiers dans le Tableau 1 ci-dessous) suffisent pour garantir des résultats satisfaisants. Taille du Taille Position théorique Nom Nombre de sur le Type de séquences motif répété de simplifié (Pb) répétitions l'amplicon génome présentant le VNTR (Pb) (kb) Lp323 1 45 8 494 3231 ORF hypothetical protein Lp3144 96 8 942 3144 ORF : interaptin Lp 1644 24 11 793 1644 ORF : coiled-coil protein Lp0913 21 4 128 913 Intergénique Lp2990 45 17 1043 2990 ORF hypothetical protein Lp2578 125 1 317 2578 ORF : dehydrogenase Lp2661 125 1 265 2661 ORF : endopeptidase Lp1428 18 3 205 1428 ORF : Tfp pilas protein Lp0857 8 3 264 857 ORF : biotine synthétase Lp3219 6 6 79 3219 ORF hypothetical protein Lp0029 6 4 198 29 ORF : méthyltransférase Lp2195 6 9 173 2195 ORF : hypothetical protein Tableau 1 : Caractéristiques des VNTRs utilisés dans la présente invention (Les caractéristiques associées à chaque VNTR sont propres à la souche Legionella 10 pneumophila str Philadelphia) 2) Elaboration des amorces et construction du plan de multiplexage Une fois les loci d'intérêt choisis, l'originalité développée par la présente invention résidait dans la capacité à co-amplifier les 12 VNTRs par PCR multiplexe. 15 Pour cela, la pertinence dans le choix des amorces est primordiale. Comme évoqué précédemment dans la description de l'invention, le choix de la séquence des amorces utilisées a été réalisé pour remplir trois objectifs : i) les amorces doivent assurer l'unicité d'identification d'un amplicon, issu de la 12-plex (multiplexe de 12 produits PCR), par la visualisation d'un plan de multiplexage. ii) les amorces doivent permettre la co-amplification efficace des 12 VNTRs iii) les amorces doivent être choisies au niveau de séquences conservées de diverses souches de l'espèce Legionella pneumophila afin que le protocole de typage présente une typabilité proche de 100%. Aucune hiérarchie ou chronologie n'est établie entre ces objectifs pour effectuer le choix des amorces. L'ensemble de ces paramètres est à prendre en compte et les trois critères de décision s'imbriquent. Cependant, par souci de clarté, chacun d'entre eux sera détaillé indépendamment. i) Le typage de la collection EWGLI, représentative de la diversité des souches cliniques, et de plus de 200 isolats issus de l'environnement donne une estimation de la gamme d'allèle pour chaque VNTR. Il est ainsi raisonnable de disposer et d'arranger les gammes d'allèles afin d'établir un plan de multiplexage. Ce plan, illustré par un schéma en 2D (spatiale et spectrale), représente l'agencement des différents amplicons issus du 12-plex. La première dimension est imposée par l'attribution d'un des 4 fluorophores suivant: 6-FAMTM, NEDTM, PETTM, VICTM. La présente invention étant développée sur les plateformes d'analyse Applied Biosystems Genetic Analyser 3100-Avant, 3130, 3130x1 et 3500, les fluorophores sont choisis chez Applied Biosystems. La seconde dimension est définie par une gamme de taille propre à chaque VNTR. Le croisement de ces deux dimensions permet d'attribuer une position spectrale et spatiale unique pour chaque VNTR. Pour une couleur donnée, chaque gamme de taille est séparée par au moins la taille d'une unité répétée. De plus, les amorces des VNTRs de type microsatellite sont systématiquement choisies de telle sorte que les amplicons soient de petite taille. Après avoir considéré l'ensemble de ces paramètres, un plan de multiplexage a été construit comme illustré par la Figure L ii) Une fois la configuration spatiale des VNTRs connue, des zones génomiques au sein desquelles les amorces peuvent être élaborées sont définies. CIassiquement, les séquences des amorces doivent répondre à plusieurs critères : séquence comprise entre 18pb et 25pb, %GC compris entre 40 et 60, ne comprenant pas plus de 4 répétitions mononucléotidiques. Ensuite, d'autres exigences sont spécifiques à la réalisation de la PCR multiplexe. Ainsi, afin que les 12 produits puissent être coamplifiés, de manière efficace et homogène, en utilisant un même protocole PCR et a fortiori une même température d'hybridation, les amorces doivent présenter une température de désappariement (Tm) semblable. Le présent demandeur a empiriquement imposé une différence maximale de 8°C entre les différents Tm. De plus, la co-amplification exigeant le rassemblement de tous les réactifs dans une seule réaction, il est primordial que les amorces restent neutres entre elles i.e. qu'elles ne donnent pas d'hybridation croisée. La probabilité de formation de structures en dimères par les amorces a été testée par le logiciel Autodimer. Après importation d'un fichier fasta comprenant l'ensemble des séquences à valider, ce logiciel indique si des couples sont susceptibles de se former. Enfin, une queue nucléotidique de 7pb est ajoutée en position 5' de chaque amorce anti-sens afin de faciliter l'adénylation des produits PCR. En effet, l'ajout partiel d'une adénine en 3' des amplicons par la Taq polymérase entraine une difficulté d'analyse des profils électrophorétiques ; on appelle cet artefact le «pic +A ». L'étape finale du choix des amorces est la démonstration de leur spécificité. Chaque séquence est donc soumise à l'algorithme BLAST et recherchée dans tous les génomes séquencés. iii) Une des caractéristiques principales d'une bonne technique de typage est la typabilité i.e. la capacité à attribuer un génotype à tous les isolats typés. Autrement dit, l'amplification des 12 VNTRs doit être possible pour l'ensemble de l'espèce Legionella pneumophila et un code MLVA complet (composé de 12 valeurs) doit être attribué. Classiquement une technique de typage dont la typabilité est supérieure à 97% est considérée comme excellente. Deux raisons peuvent provoquer l'absence d'amplification : l'absence du VNTR et la non hybridation des amorces. Concernant la présence des VNTRs pour l'ensemble des souches séquencées, celle-ci est imposée par la modification d'un critère (locus number) dans la base de données « VNTR locus database » (cf 2)i)). Seuls 4 génomes de Legionella pneumophila sont séquencés ; il est donc impossible de prédire la conservation d'une séquence génétique pour l'ensemble de l'espèce. Cependant, la comparaison de ces génomes permet d'identifier des zones conservées et de designer les amorces au niveau de celles-ci. Les amorces utilisées pour la présente invention répondant aux trois critères et iii) sont décrites dans le Tableau 2 ci-après. Nom SEQ ID NO Type d'amorce Séquence simplifié (Le fluorophore utilisé du VN1 R est indiqué entre amplifié parenthèses) Lp3231 SEQ ID NO: 1 Anti-sens non marquée GCATATGACAAAGCCTTGGC SEQ ID NO: 2 Sens non marquée TGAATTTCTCCCTCTTGCTTG SEQ ID NO: 2 Sens marquée (NED) NED-TGAA'ITTCTCCCTCTTGCT'TG Lp3144 SEQ ID NO: 3 Anti-sens non marquée TGATGGTCTCAATGGTTCCG SEQ ID NO: 4 Sens non marquée GGACAAACAACCAATGAAGC SEQ ID NO: 4 Sens marquée (VIC) V1C-GGACAAACAACCAATGAAGC Lp1644 SEQ ID NO: 5 Anti-sens non marquée GCATCGGACTGAGCAAAGTA SEQ ID NO: 6 Sens non marquée CTCACCAGGATGCTTTGTCG SEQ ID NO: 6 Sens marquée (NED) NED-CTCACCAGGATGCTTTGTCG Lp0913 SEQ ID NO: 7 Anti-sens non marquée TCCAGAGGCTCTGGATTATC SEQ ID NO: 8 Sens non marquée GAACTATCAGAAGGAGGCGA SEQ ID NO: 8 Sens marquée (VIC) VIC-GAACTATCAGAAGGAGGCGA Lp2990 SEQ ID NO: 9 Anti-sens non marquée ATCGCCTAATTGCCGCCTA SEQ ID NO: 10 Sens non marquée CCTCGCAAGCCTATGTGG SEQ ID NO: 10 Sens marquée (6FAM) FAM-CCTCGCAAGCCTATGTGG Lp2578 SEQ ID NO: I l Anti-sens non marquée CGAGGAAATCTTCTTCAGCC SEQ ID NO: 12 Sens non marquée GACACCACAGCAGTTTGAAC SEQ ID NO: 12 Sens marquée (VIC) VIC-GACACCACAGCAGTTTGAAC Lp2661 SEQ ID NO: 13 Anti-sens non marquée ATGCAGGATGTTTGCGCATG SEQ ID NO: 14 Sens non marquée AAGGAATAAGGCGCAGCAC SEQ ID NO: 14 Sens marquée (6FAM) FAM-AAGGAATAAGGCGCAGCAC LpI428 SEQ ID NO: 15 Anti-sens non marquée TATCAACCTCATCATCCCTG SEQ ID NO: 16 Sens non marquée GAATCTGAAACAGTTGAGGATG SEQ ID NO: 16 Sens marquée (PET) PET-GAATCTGAAACAGTTGAGGATG Lp0857 SEQ ID NO: 17 Anti-sens non marquée GGATTGCCTTGGGCATTAAT SEQ ID NO: 18 Sens non marquée CCTATCAACAGATGACGCTT SEQ ID NO: 18 Sens marquée (NED) NED-CCTATCAACAGATGACGCTT Lp3219 SEQ ID NO: 19 Anti-sens non marquée CCAACTCCTCAACGCAACAA SEQ ID NO: 20 Sens non marquée CTTGACGAAGTAGGTGTGGG SEQ ID NO: 20 Sens marquée (PET) PET-CTTGACGAAGTAGGTGTGGG I.p0029 SEQ ID NO: 21 Anti-sens non marquée TTACCCAAGCCCTTATTGCG SEQ ID NO: 22 Sens non marquée TAGATCTCTTGCCGAGCTTC SEQ ID NO: 22 Sens marquée (6FAM) FAM-TAGATCTCTTGCCGAGCTTC Lp2195 SEQ ID NO: 23 Anti-sens non marquée TTATGCGAGAGTTTCATGA SEQ ID NO: 24 Sens non marquée GCTACTGCAGCAACATCC SEQ ID NO: 24 Sens marquée (NED) NED-GCTACTGCAGCAACATCC Tableau 2 : Caractéristiques des amorces utilisées dans la présente invention 3) PCR multiplexe et analyse des fragments Une seule réaction de PCR permet le typage d'un isolat de Legionella pneumophila. Deux constituants participent à cette réaction : un rnix d'amplification et un mix d'amorces. Le mix d'amplification utilisé est le QIAGEN Multiplex PCR 2X Kit fourni par Qiagen. Le mix d'amorces est constitué d'oligonucléotides marqués et non marqués obtenus chez Applied Biosystems et d'eau PPi. L'amplification d'un VNTR nécessite la combinaison de 3 amorces : une amorce anti-sens, une amorce sens et une amorce sens marquée par un fluorophore (les séquences des amorces sens marquées et non-marquées sont identiques). L'équimolarité entre les amorces sens et anti-sens est assurée par l'établissement d'un ratio entre la concentration des amorces sens et de celle de l'amorce anti-sens. Dans la présente invention, les ratios imposés sont : [amorces sens non marquées] 1 [amorces anti-sens] est de l'ordre de 2/3 et le ratio : [amorces sens marquées] / [amorces anti-sens] est de l'ordre de 113, d'où [amorce anti-sens] = [amorce sens marquée] + [amorce sens non marquée]. Chacun des 12 triplets d'amorces utilisés pour l'amplification du VNTR associé est élaboré selon les ratios précédents lors de ce mode de réalisation. Les concentrations finales nécessaires de chaque triplet ont été ajustées afin de permettre l'homogénéité d'intensité des pics lors de l'analyse des profils électrophorétiques. La concentration finale de l'amorce anti-sens, suffisante pour connaître les concentrations finales, est indiquée dans le Tableau 3 ci-dessous. Nom simplifié du VNTR Concentration finale en amorce anti-sens (en ItM) amplifié Lp1428, Lp3231 0.6 Lp0029, Lp0857 0.4 Lp0913, Lp1644, Lp2195, 0 2 Lp2990,Lp3144 Lp2578, Lp2661, Lp3219 0.1 Tableau 3 : Concentration finale utilisée en amorce anti-sens A titre d'exemple, un mix d'amorces pour 100 réactions, i.e. 100 typages, 25 respectant les conditions ci dessus est décrit dans le Tableau 4 ci-dessous. 16 Tableau 4 : Constitution d'un mix d'amorces pour 100 réactions de tvpage Un volume d'eau de 685 µL doit être ajouté Nom du VNTR Nom de l'amorce Volume d'amorce (à 20µM) à prélever (en µL) Lp1428R, Lp3231R 45 Lp1428,Lp3231 Lp1428F,Lp3231F 30 Lp1428F-PET, Lp3231F-NED 15 Lp0029R, Lp0857R 30 Lp0029, Lp0857 Lp0029F,Lp0857F 20 Lp0029F-FAM, Lp0857F-NED 10 Lp0913R,Lp1644R,Lp2195R,Lp2990R,Lp3144R 15 Lp0913, Lp1644, Lp2195, Lp2990, LpO913F, Lp1644F, Lp2195F, Lp2990F, Lp3144F 10 Lp3144 Lp0913F-VIC, Lp 1644F-NED, Lp2195F-NED 5 Lp2990E-FAM, Lp3144F-VIC Lp2578, Lp2661, Lp2578R, Lp2661R, Lp3219R 7.5 Lp3219 Lp2578F,Lp2661F,Lp3219F 5 Lp2578F-VIC, Lp2661F-FAM, Lp3219F-PET 2,5 Le volume réactionnel est de 15µL dont 5.5µL de mix d'amorces, 7.5µL du mix QIAGEN Multiplex PCR 2X et 2 µL d'ADN bactérien (concentré à 2ng/µL). L'utilisation du kit d'extraction DNeasy Blood & Tissue de Qiagen convient pour la mise en oeuvre du procédé. 10 Le mélange réactionnel est ensuite soumis à une réaction de PCR dont le protocole original est indiqué sur le Tableau 5 ci-dessous. Puis, 7.5µL du produit PCR est purifié sur colonnes selon la technologie DyeEx de Qiagen. Enfin, la préparation d'un mélange constitué de 21,tL de produit PCR purifié, de 7.75µL d'HiDi formamide (Applied Biosystems) et de 0.25µL de GS1200LIZ (Applied 15 Biosystems) permet l'analyse des fragments par électrophorèse capillaire sur les plateformes Applied Biosystems Genetic Analyser 3100-Avant, 3130, 3130x1 et 3500. Le protocole d'électrophorèse capillaire est décrit sur le Tableau 6 ci-dessous. Etape Etape 2 Etape 3 Etape 1 15 cycles 15 fois 4 1 fois 1 fois Temps 15 min 30 sec 60 sec 70 30 sec 60 sec 70 sec 10 min sec (+5 sec/cycle) Tempé 95 °C 95°C 82°C 72°C 95°C 64°C 72°C 72°C rature (-1.2°C/cycle) Tableau 5 : Caractéristiques du protocole PCR utilisé Caractéristiques Valeurs utilisées Run température 60°C Polymer fill volume 5020 Current stability 5µA Pre mn voltage 15kV Pre mn time 180sec Injection voltage 1.6kV Injection time 10sec Number of steps 40 Voltage step interval 15sec Data delay time 80sec Run voltage 12kV Run time 6200sec Tableau 6 : Caractéristiques du protocole d'électrophorèse capillaire utilisé (°C : degré Celsius, , uA : micro ampère, kV : kilo volt, sec : seconde) 4) Obtention du code MLVA L'analyse du profil électrophorétique s'effectue par le logiciel GeneMapper® qui interprète les données brutes et attribue une taille à chaque amplicon marqué par un fluorophore. Le présent demandeur a développé trois fichiers, issus de GeneMappere, nécessaires à l'attribution du code MLVA. Le fichier nommé « MLVA analysis » permet le traitement des données analysées selon des critères définis. Les fichiers nommés « MLVA management A» et « MLVA management B» rassemblent l'ensemble des données recueillies sur les différents allèles associés à chaque marqueur défini par une gamme de taille et de couleur. Ces fichiers sont illustrés en Figure 6. L'export du « Report manager » sous forme d'un fichier .txt donne l'attribution d'une valeur numérique, reflet du nombre de répétitions, pour chaque marqueur VNTR. Cette valeur est associée à un indice de qualité indiquant le degré de confiance que l'utilisateur peut attribuer à ce résultat. Arbitrairement, un indice supérieur à 0.5 est considéré comme valide. EXEMPLES Exemple 1 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp3231 avec les 10 amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 25) 5' TGAATTTCTCCCTCTTGCTTGTCATTTTTTTTATTTTGAACTTTATTCTGTT 15 GTGCCTTATTTTGCTTGTCCTGATTTTGCTGATCCTGGTTCTGCTGATCTTT GTTTTGCTTGTCCTGATTTTGCTGATCCTGGTTCTGTTGATCTTTGTTTTGC TTGTCCTGATTTTGTTGATCCTGGTTCTGCTGATTTTTGTTCTGCTTGTCCT GATTTTGCTTGTCCTGGTTCTGTTGATCTTTGTTTTGCTTGTCCTGATTTTG CTGATCCTGGTTCCGTTGATCTTTGTTTTGCTTGTCCTGATTTTGCTGATCC 20 TGGTTCTGTTGATCTTTGTTTTGCTTGTCCTGATTTTGTTGATCCTGGTTCT GTTGATCCTTATCCTGCTGATTCTGGCTTTTTTTCTTTTCTTTATCTTTCTTC AACAATTCACTGATTAATTTTCGATTATATAAAGCATCCTGATTATTTGGA TTAAATGCCAAGGCTTTGTCATATGC 3'5 Exemple 2 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp3144 avec les amorces SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 26) 5' GGACAAACAACCAATGAAGCAAAAGCACTTATTGAGCAATTACGTTTAA TTTCAAATCAACCACTAAAGAACGAAGACATAAACTCTATTAAAGAAGA TTTATCTACTCTTGCCAATCAAATCCAATCCCTTGTGTCTGAATTAAATCA ATTACCTTTGCCTAATCTGTCCGGTGAAAAAATTGATCCTCCATTGGAAA AACAGGAAATAGCAGTAGATAAAACAATCCCTCTTACTGTGGAATTGAT GCACCCTGCCCAAGTAATTCAGATAGGCAATGATTCTCCCATAGAAAAAC AGCAGCTAGACAATGAGGAAGAAACGCCGGTTGTTCTGGAATCATTACG CCCCCGTCCAGTCATTCATAAGGAATCTGAATCTATCACCCAAAAACTGC AAGTAGACAATGGACAAGAAATGCCGGTTGTTCTGGATTCAACATGCAC TCCTCAAGCCATTCATAAGGAACTTGAATCTACCACTGAAAAACTGCAAG TAGACAATGGACACGAAATACCGGTTGTTCTCGAGTCAACACGCTCTCCT CAAATCATTCATACTGAGTCTGAATCTGTTGGTAAAAAACAGCATGTAGA AGTAGAGCAAGAGATACCAGTCACACTGGAATTAATACGACCCTCTTCTA TGGTTGAAAAGGATTCCGTGGCTACTGTAGAAAAACAGCAAGTAACTGA GAGACAGGAAACACCAATCGTCCTTGAATCAACACGACTCTCTCCTATGG TTCAGAAAGACACTGGGCTTTCTGGCGAAAAGCAACATAAAGAGATAGA ACAAGAAATATCTGTCGTTACGGAATTAACACCCCACACCCAAGTGGTTC GGCAAGGCTCTGAGTCCAGTTTAGAACAACAAGTACCCAACGGACAAGA AACACTGGCTGTTGTCAAATCAAGCCCATCGGAACCATTGAGACCATCA 3' Exemple 3 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp1644 avec les 30 amorces SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 27) 5' CTCACCAGGATGCTTTGTCGTTTGCAACTTTTTTTGGCGCTGAGTATTTTG 35 CTAAAACTTTTGCTACACAAGAACTTATACCTGTAATTAAAGAGGCAATT CAGCATCAAAATCAAGATTTGCTTACATCTGTTATTGAAAATCATATAGA AAAACAACATCTCAATGACTATCCTAAGACTCCCGATGGCATTAAAAAA CTATTGAAGTCGTTTCAAGGGATTGTCTATAAACCATTGGTTATGGAATT CTCAGGCCCAAGTGCCGTCTCATCATCTTGGGTGGAAGCTATATCTGGAA GATCCATCCCGAGAAATTTTGAATATTTAGCTGAACCTATGTCTCAACCA TTACGAGTTTTACAGCATTATGCCTGTGTATCTGGAAAAGCTAATTTTTCT TCTGATAACATTCCTAAATGGTGTGAACTTCAGTCTGACGTAGAAAAACG ACAACAACAAAGAGAAGATGGACTTTCCTGGCTTCCTGATGCTCAAGAG AAGCTTAAGAGGGAAGGGCAGCAAGCCAAACTTGAGGAAGAGCAACGA ATCAAACTTGAGGAAGAGCAACGAATCAAACTTGAGGAAGAGCAACGA ATCAAACTTGAGGAAGAGCAACGAATCAAACTTGAGGAAGAACAACGA ATCAAACTTGAGGAAGAACAACGAATCAAACTTGAGGAAGAACAACGA ATCAAACTTGAGGAAGAACAACGAATCAAACTTGAGGAAGAGCAACGA ATCAAACTTGAGGAAGAGCACAAAAGCAAAAAATACTTTGCTCAGTCCG ATGC 3' Exemple 4 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp0913 avec les amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila sir. Philadelphia I (SEQ ID NO: 28) 5' GAACTATCAGAAGGAGGCGATACTTTGAATACAACTGAAATACCAGAAC AGCCAATTGAGTATCCAGAGGAGCCATCAGAGTACCCTGAACAACCTTT GGAGTACCCTGATAATCCAGAGCCTCTGGA 3' Exemple 5 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp2990 avec les amorces SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 29) 5' CCTCGCAAGCCTATGTGGACAGCAAGGTATCTGAACTAAAAAATGAATT AACCAACAAAATCAACAGTATCCCCTCTGGACCTCAAGGACCTCAAGGA CCTAGAGGAGATAAAGGCGAGGCTGGCCCTAAAGGAGACCAAGGAGAG GCAGGGCCGCAGGGATTACCCGGACCTAAAGGAGACCGAGGGGAAGCA GGGCCGCAGGGATTACCCGGACCTAAAGGAGACCAAGGGGAGGCAGGA CCGCAGGGATTATCAGGCCCTAAAGGAGACCAAGGGGAAGCAGGACCGC AGGGATTACCCGGACCTAAAGGAGACCAAGGGGAAGCAGGACCGCAGG GATTACCCGGACCTAAAGGAGACCAAGGGGAGGCAGGACCGCAGGGATT ACCCGGACCTAAAGGAGACCAAGGGGAGGCAGGACCGCAGGGATTACC AGGCCCTAAAGGAGACCGAGGGGAAGCAGGACCGCAGGGATTACCTGGT CCAAAAGGTGACAGAGGAGAGGCAGGACCTCAGGGATTACCTGGTCCAA AAGGTGACAGAGGAGAGGCAGGACCTCAGGGATTACCCGGACCGAAAG GAGACAAAGGGGAGGCAGGACCTCAGGGATTACCTGGTCCAAAAGGTGA CAGAGGAGAGGCAGGACCTCAGGGATTACCTGGACCGAAAGGAGACAA AGGGGAGGCAGGACCTCAGGGATTACCCGGACCGAAAGGAGACCGAGG GGAGGCAGGACCGCAGGGATTACCAGGCCCTAAAGGAGACCGAGGGGA AGCAGGATCTCAGGGATTACCTGGTCCAAAAGGTGACAAAGGAGAAGCA GGGCCGCAGGGATTACCAGGCCCTAAAGGAGACAAAGGAGAAACAGGA GCAGTAGGTCCACAAGGTATGCCAGGACCTAAAGGCGAAGCAGGAGATG ACGGCCAAGGTGTGCCTGCAGGTGGTGAAACGGGTCAAGTCCTTGCCAA ATCAAATGACCTCGATTTCAATACCATGTGGGTTGATCCGGCAAATTCCG GCATTAGGCGGCAATTAGGCGAT 3' Exemple 6 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp2578 avec les amorces SEQ ID NO: I l et SEQ ID NO: 12 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila sir. Philadelphie 1 (SEQ ID NO: 30) 5' GACACCACAGCAGTTTGAACATAATCACTCTAAAACAAATCCTATACGGC ATTGCCTGCAAACAGTCGGATTTGAGTACAGGTTGAGAAAATAAACAGA GTAAAAAAGCGGCGTGTACATTAAAGTACATGAGCATTTTTTAGAATGTT TTTTTCTCAAGATGCGCCAAATACGGCCGTTTGCTAAGAATTACATTGAT TTAATTGACGAATAGATCTATAACTTCTTCCAAAATTATTGCAAGAGGAG CTTAAAAATGATGTCTGTTGACAATATTAAAAATGATAACCAGGTTTTGG CTGAAGAAGATTTCCTCG 3' Exemple 7 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp2661 avec les 35 amorces SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila str, Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 31) 5'AAGGAATAAGGCGCAGCACCTATTAATGCACAAGCAAAGATGCGCCGA AGTCACCTACCCTTGAACGCCCATATTCGAGTGCAAATTGCCAGATCATT GCGACTAAAAAAGCGGAGTGTATAGATGAGTACATGAGCATTTTTTAGA GCAATGATCTGGCAAGATGCGCCGAAGACGGGCGTTCAAGCGAGGGGCC AACGAGGTTTGACTATAACCCCCAACCCCCCATCAATCTCCCCCCGCATC ATGCGCAAACATCCTGCAT 3' Exemple 8 : Cet exemple illustre 1'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp1428 avec les amorces SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16 pour la souche Legionella pneurophila subsp. pneumophlia sir. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 32) 5' GAATCTGAAACAGTTGAGGATGTGACATATCTTGGAAGTACAGAACAGT TAAGAGCAAAAGAATATACAGAATTAGAATCAGAAGTTCAGACTAAACC AGAGGCCCAGGCTGAGCCAGAAGTTCAGGCTGGAGAAAATCAAATTATG TTTGAGCCCGTTATGGAACCTGAGCAATTCGATGTTAACAGGGATGATGA GGTTGATA 3'20 Exemple 9 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp0857 avec les amorces SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 1$ pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila sir. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 33) 5' CCTATCAACAGATGACGCTTTATTAGATTGAAAAATGAACATTAACCTTG ATTTTGTACATGTTGCGTGAAAAGCGATTATAGAATAAAGTGAAGTTATT AAAATATTAGATTTGAAATTTTACTCTAAAACTTCCTTTTTG FAAAAACC CTATTCAAAATTACTTAGGGCAAGTGATGTATCACCCGAAGAGAGTTCAT GCTTATTTCCAAATTCATCTTCCAGAATCAGTTGGCCAAACGAATTAATG CCCAAGGCAATCC 3' Exemple 10 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp3219 avec les amorces SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila sir. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 34) 5' CTTGACGAAGTAGGTGTGGGGGTAGTACTACTAGAACTGGAACTCGAAC TGG AATTGGATTGTTGCGTTGAGGAGTTGG 3' Exemple I 1 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp0029 avec les 25 amorces SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 22 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 35) 5' TAGATCTCTTGCCGAGCTTCCCTTTCATAAGCGTGAAGCTCGACTCTCTTT 30 AAGATTTGGATTTTGTTTTGGTTTTGCTTATTTCTTCAGTATTTACTTCTTC GTTCCCGTAAATTTGTTCTCTCAGGGAATTCATTAGTCCTGCCATAAAGA ACAATTCCGCTGTTAAATACAAAGGCGCAATAAGGGCTTGGGTAA 3' Exemple 12 : Cet exemple illustre l'amplicon obtenu par amplification du VNTR Lp2195 avec les amorces SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 24 pour la souche Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 (SEQ ID NO: 36) 5' GCTACTGCAGCAACATCCATAATAGTGCGTAAATATTGAGCTCGAATAGG TCCCCCAACCCAAACAAAATGTATTTTGGATGGTAGCGTACGGAGCTCAT ATTCAGATTTAGAATCGCTATCAGATTCAGAATCACTTTCATATTCAGAA TCGCTCATGAAACTCTCGCATAA 3' B) Test de génotypage Le groupe d'étude sur les marqueurs épidémiologiques (l'ESGEM) a défini plusieurs critères permettant de définir la performance d'une méthode de typage. Une méthode fiable doit reposer sur des marqueurs stables et identifiables sur les isolats typés. L'analyse des résultats de typage doit permettre une bonne discrimination entre les isolats tout en conservant une signification épidémiologique dans un contexte donné. Enfin, et de manière inhérente aux aspects expérimentaux, la technique considérée doit être reproductible afin d'envisager une future standardisation et automatisation. Cette méthode de typage doit être validée sur un panel de souches dont les caractéristiques doivent être connues. Ces souches doivent avoir été typées par d'autres méthodes afin de démontrer l'amélioration technologique. Les critères de performance établis ont été validés pour la technique de typage décrite par la présente invention. Cette validation a été réalisée sur une collection de référence établie par l'EWGLI. Cette collection de 98 isolats, typés par SBT et par anticorps monoclonaux, est composée de trois panels. Le panel dit de discrimination comprend 74 isolats cliniques non reliés épidémiologiquement. Le panel dit de concordance épidémiologique comprend 16 isolats dont le lien épidémiologique a été démontré. Enfin, le panel dit de stabilité est représenté par cinq variants de la même souche obtenus par repiquage successifs.35 1) Diversité des souches et indice de discrimination Le traitement des résultats antérieurs de typage par MLVA (selon Pourcel et al.) et SBT (autre technique de l'art antérieur) a été réalisé par import des données numériques issues respectivement de Pourcel et al. et Ratzow et al. dans le logiciel bionumerics v.6.0 (Applied Maths). Les résultats de typage développé dans la présente invention sont traités par le logiciel bionumerics v.6.0 (Applied Maths) à partir des données exportées de GeneMapper® v.4.1 (Applied Biosystems). L'agrégation ou clustering a été obtenu par la méthode l'UPGMA selon le coefficient « categorical » (Figures 2, 3 et 4). Les motifs ont été imposés par un seuil « cut-off » de 60% sur l'agrégation ou « clustering » des données issues du typage décrit par la présente invention (appelée dans la suite de la description MLVAl2_DS). Ces mêmes motifs ont été conservés pour les agrégations des données SBT à 7 loci (SBT7), à 6 loci (SBT6) et pour le MLVA décrit par Pourcel et col. (appelé ci-après MLVA8_CP) afin de visualiser la corrélation entre les différents protocoles. Cette concordance entre les différents résultats de comparaison peut mathématiquement être évaluée par un indice dit de congruence calculé selon le coefficient de corrélation de Pearson. Les protocoles MLVAl2_DS et MLVA8_CP sont très congruents (conservation des motifs) (Figure 3) et l'indice de congruence élevé (83.8%). Il est intéressant de remarquer qu'un gain de congruence a été réalisé avec le SBT7 entre le MLVAl2 DS et le MLVA8CP respectivement de 46.5% à 64.3%. Cependant, pour la collection testée, la comparaison entre les protocoles de typage par MLVA et par SBT montrent quelques anomalies phylogénétiques révélées par une répartition désordonnée des motifs (Figure 4) et un indice de congruence médiocre (64.3%). En effet, bien que certains grands groupes soient bien conservés d'autres ne sont pas ancrés phylogénétiquement. Ces différences peuvent s'expliquer par une différence d'évolution des marqueurs MLVA et SBT et par l'impact des transferts horizontaux de gènes. Le calcul des indices de discrimination (D) a été déterminé, selon l'indice de Simpson, sur les 74 isolats appartenant au panel de discrimination. Les indices de discrimination de MLVAl2_DS, MLVA8_CP, SBT7 et SBT6 sont respectivement de 0.959, 0.920, 0.961 et 0.926 (Tableau 7 ci-dessous). Seuls les protocoles MLVAl2_DS et SBT7, dont les pouvoirs discriminant sont sensiblement les mêmes, satisfont aux recommandations de l'ESGEM (D>0.95). Il est intéressant de remarquer que les 12 VNTRs utilisés présentent des indices de discrimination très différents (Tableau 7). Certains marqueurs comme Lp0029, Lp0857 ou Lp0913 sont faiblement discriminant permettant ainsi d'enraciner l'arbre et de consolider certains groupes phylogénétiques ; d'autres comme Lp1428, Lp1644 ou Lp2990 sont davantage discriminants et assurent la distinction génotypique d'isolats appartenant à de grandes familles. Nom du VNTR Nombre Indice de Intervalle de confiance d'allèles discrimination de D à 95% (D) Lp0029 2 0.5054 [0.4928,0.5179] Lp0857 4 0.2710 [0.1389,0.4031 ] Lp0913 2 0.2936 [0.1788,0.4084] Lp 1428 18 0.8845 [0.8439,0.9251 ] Lp 1644 10 0.7790 [0.7152,0.8428] Lp2195 6 0.5391 [0.4512,0.6269] Lp2578 6 0.7020 [0.6196,0.7844] Lp2661 4 0.6649 [0.6203,0.7096] Lp2990 13 0.8430 [0.7851,0.9009] Lp3144 2 0.5054 [0.4928,0.5179] Lp3219 11 0.8275 [0.7683,0.8867] Lp3231 6 0.6501 [0.5821,0.7181] Protocole de Nombre de Indice de Intervalle de confiance typage génotypes discrimination de D à 95% MLVAl2_DS 41 0.9585 [0.9315,0.9856] Tableau 7 : Diversité du panel de discrimination (74 isolats) et indices de discrimination du protocole MLVAl2_DS et des VNTRs utilisés 2) Concordance épidémiologique Le panel de concordance épidémiologique comprend 16 souches réparties en 6 groupes composés d'isolats dont le lien épidémiologique a été établi. Chacun de ces groupes contient des isolats qui présentent le même profil génotypique unique selon le protocole décrit dans la présente invention (Figure 2). La technologie développée montre le degré maximal de concordance épidémiologique permettant son utilisation dans des contextes épidémiques précis. 3) Stabilité Le panel de stabilité est constitué de 5 variants de la souche Corby. Ces variants ont le même génotype par le MLVAI2_DS prouvant ainsi la stabilité de cette méthode (Figure 2a). Ce panel prouve également que les structures génomiques de type VNTRs, de par leur stabilité, sont d'excellents marqueurs épidémiologiques. 4) Typabilité Le typage a été réalisé sur 98 isolats avec 12 VNTRs, 1176 données devraient donc avoir été produites. Or, 18 données n'ont pas pu être obtenues et sont indiquées par un 0 dans l'arbre (Figure 2). Le MLVAI2 DS présente donc une typabilité de 98.5%, valeur très satisfaisante pour une méthode de typage (Tableau 8a ci-dessous). Cependant, 3 isolats (Eu1060, Eu1040, Eu1047) concentrent la majorité de ces données manquantes ; si on exclut ces 3 isolats, le typabilité du MLVA 12_DS est de 99.6% (Tableau 8b ci-dessous). Nom du Nombre de Typabilité VNTR données (en%) manquantes Lp0029 2 98 Lp0857 0 100 Lp0913 0 100 Lp1428 0 100 Lp1644 3 97 Lp2195 1 99 Lp2578 1 99 Lp2661 4 96 Lp2990 5 95 Lp3144 2 98 Lp3219 0 100 Lp3231 0 100 Protocole de Nombre de Typabilité typage données °) (en%) MLVAl2_DS 18 98.5 Tableau 8a : Typabilité du protocole MLVAl2 DS et des VNTRs utilisés sur la collection EWGLI (98 isolats) Nom du Nombre de Typabilité VNTR données °} manquantes (en~O Lp0029 0 100 Lp0857 0 100 Lp0913 0 100 Lp1428 0 100 Lp1644 0 100 Lp2195 1 99 Lp2578 1 99 Lp2661 0 100 Lp2990 3 97 Lp3144 0 100 Lp3219 0 100 Lp3231 0 100 Protocole de Nombre de Typabilité typage données (en% } manquantes MLVAl2_DS 5 99.6 Tableau 8b : Typabilité du protocole MLVAI2 DS et des VNTRs utilisés sur la collection EWGLI sauf Eu1040, Eul047 et Eu1060 (95 isolats) 5) Reproductibilité Les 98 isolats ont été typés deux fois et ont montré un même profil génotypique. Afin de valider cette reproductibilité, un plan expérimental précis a été mis en place. Ainsi, les trois souches de référence Lens (Eul 160), Paris (Eul 146) et Philadelphie (NCTC11192) ont été typées huit fois de manière indépendante. Les tailles observées de chaque locus pour les huit essais sont recensées sur les Tableaux 9a, 9b et 9c représentés en Figure 5. Un intervalle de confiance à 95% a été calculé selon un test de Student avec le coefficient de Student t(0.95 ; 8). Toutes les valeurs sont comprises dans leur intervalle de confiance respectif ; le typage décrit dans la présente invention est donc reproductible. Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention. REVENDICATIONS1. Procédé de génotypage de l'espèce Legionella pneumophila par MLVA comprenant les étapes consistant à : (i) réaliser une co-amplification d'au moins huit loci VNTRs par PCR multiplexe dans un milieu réactionnel comprenant un échantillon d'ADN de Legionella pneumophila afin de former plusieurs amplicons pour chacun des huit loci VNTRs, (ii) analyser lesdits amplicons par électrophorèse capillaire afin d'obtenir un profil électrophorétique dudit échantillon, et (iii) attribuer un code numérique MLVA audit profil électrophorétique. 2. Procédé de génotypage selon la revendication 1, dans lequel le code numérique MLVA de l'étape (iii) est obtenu automatiquement par informatique, de préférence à partir de logiciel d'analyse de fragments ou de génotypage. 3. Procédé de génotypage selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le milieu réactionnel de l'étape (i) comprend : au moins huit amorces sens marquées et au moins huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces sens/anti-sens pour chacun desquels correspond un locus VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en amont de son locus respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son locus respectif. 4. Procédé de génotypage selon la revendication 3, dans lequel les au moins huit amorces sens sont marquées par un fluorophore en 5'. 5. Procédé de génotypage selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les au moins huit couples d'amorces respectivement anti-sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis parmi : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :5/ SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :11/ SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :131 SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :15/ SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 191 SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 21/ SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 23/ SEQ ID NO : 24 6. Procédé de génotypage selon l'une des revendications précédentes, dans lequel est réalisée à l'étape (i), une co-amplification de douze loci VNTRs par PCR multiplexe. 7. Procédé de génotypage selon la revendication 6, dans lequel le milieu réactionnel comprend les couples d'amorces respectivement antisens/sens suivants : SEQ ID NO :1 ISEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :51 SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :91 SEQ ID NO :IO ; SEQ ID NO :III SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :151 SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 171 SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 191 SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 211 SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 231 SEQ ID NO : 24 8. Kit de génotypage de Legionella pneumophila pour la mise en oeuvre du procédé de génotypage selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant : - un milieu réactionnel comportant au moins huit amorces sens marquées et au moins huit amorces anti-sens, formant au moins huit couples d'amorces senslantisens pour chacun desquels correspond un locus VNTR spécifique et différent pour chacun des huit couples d'amorces, chacune des huit amorces sens s'hybridant en amont de son locus respectif et chacune des huit amorces anti-sens s'hybridant en aval de son locus respectif, - un mix d'amplification, - éventuellement un témoin positif et un faux témoin négatif, de manière à valider le résultat et s'affranchir de faux-positifs ou de faux-négatifs. 9. Kit de génotypage selon la revendication 8, dans lequel les au moins huit couples d'amorces respectivement anti-sens /sens des huit loci VNTRs sont choisis parmi : SEQ ID NO :1 /SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3/ SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :51 SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :7/ SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :111 SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :13/ SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :151 SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ ID NO :18; SEQ ID NO : 19/ SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 211 SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 231 SEQ ID NO : 24. 10, Kit de génotypage selon l'une des revendications 8 à 9, comprenant un milieu réactionnel qui comprend les couples d'amorces respectivement anti- sens/sens suivants : SEQ ID NO :1 1SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :31 SEQ ID NO :4 ; SEQ ID NO :51 SEQ ID NO :6 ; SEQ ID NO :71 SEQ ID NO :8 ; SEQ ID NO :9/ SEQ ID NO :10 ; SEQ ID NO :III SEQ ID NO :12 ; SEQ ID NO :131 SEQ ID NO :14 ; SEQ ID NO :151 SEQ ID NO :16; SEQ ID NO : 17/ SEQ IDNO :18; SEQ ID NO : 191 SEQ ID NO :20; SEQ ID NO : 211 SEQ ID NO : 22; SEQ ID NO : 231 SEQ ID NO : 24.