Brevet FR2960779A1 — publié le 20111209

L'invention porte sur l'utilisation de krypton gazeux pour fabriquer tout ou partie d'un médicament inhalable destiné à traiter ou à prévenir une déficience ou défaillance d'organe, notamment d'un organe choisi parmi le cerveau, les reins, le coeur, le foie et les poumons, que cette déficience soit isolée ou multiple. La déficience ou défaillance d'un organe se caractérise par une anomalie organique et/ou fonctionnelle de l'organe considéré, c'est-à-dire une incapacité ou une impossibilité de cet organe à présenter une fonctionnalité normale. Cette déficience ou défaillance peut être transitoire, c'est-à-dire durer de moins d'une heure à plusieurs jours ou semaines, ou définitive. La cause d'une déficience ou défaillance d'organe peut être en rapport notamment avec une anomalie/déficit de vascularisation, par exemple l'ischémie-reperfusion, ou d'oxygénation, à une infection localisée ou généralisée, une inflammation aiguë ou chronique localisée ou généralisée, des phénomènes d'auto-immunité primaires ou secondaires, à un traumatisme, à une organo-dégénérescence... La déficience ou défaillance peut toucher concomitamment plusieurs organes et on parle alors de déficience multi-organes. Il est connu de pouvoir traiter certaines déficiences ou défaillance affectant le cerveau à l'aide de gaz inhalés. Ainsi, le document EP-A-1158992 propose d'utiliser du xénon inhalé pour lutter contre les neuro-intoxications cérébrales, notamment ischémiques, qui se caractérisent par un dysfonctionnement cérébral d'un ou de plusieurs systèmes de neurotransmission. Par ailleurs, le document EP-A-1541156 propose quant à lui d'utiliser de l'argon inhalé pour lutter contre lesdites neuro-intoxications cérébrales. Le potentiel neuroprotecteur de l'argon gazeux, administré seul ou en mélange avec du protoxyde d'azote, sur le développement et l'expression de la sensibilisation à la D-amphétamine a également été évalué. Enfin, le document propose l'argon gazeux pour fabriquer tout ou partie d'un médicament inhalable destiné à traiter ou à prévenir une déficience Récemment, la capacité de neuroprotection de l'argon a été confirmée par Loetscher et al., Critical Care, 2009, 13 :R206, faisant suite aux travaux sur les cellules cochléaires en culture isolée, c'est-à-dire les cellules dites chevelues issues de l'organe de Corti du rat, comme décrit par Yarin et al., Hear Res 2005, 201:1-9. Ces cellules sont assimilables aux neurones cérébraux, pour lesquels d'autres gaz, notamment le xénon, ont été montrés comme pouvant présenter un effet neuroprotecteur, comme rappelé par Ma et al., Br J Anaesth,2002, vol 98: 739-46. En outre, le document EP-A-1651243 propose quant à lui d'utiliser des mélanges Xe/N2O inhalé à cette fin, alors que le document DE-A-19991033704 propose des formulations liquides contenant du xénon dissout pour traiter les hypoxies et les ischémies cérébrales. Comme on le voit, la plupart des traitements proposés visent à traiter des déficiences ou défaillance essentiellement cérébrales, c'est-à-dire qui affectent uniquement le cerveau. Cependant, protéger uniquement le cerveau n'est pas suffisant. En effet, il convient également de pouvoir protéger les organes périphériques de toute défaillance, en particulier les organes vitaux comme le coeur, le foie, les reins... Des études récentes ont montré que le xénon pouvait avoir une capacité à protéger des organes autres que le cerveau de conséquences de syndromes d'ischémie-reperfusion , par exemple à protéger le rein, comme décrit par Ma et al., J Am Soc Nephrol 2009, 20-4 :713-20, ou le coeur, comme enseigné par Schweibert et al., Eur J Anaesth 2010, Epub. L'argon a été récemment été montré efficace pour le cerveau, Loetscher et al, Crit.Care 2009, 13 :R206 Actuellement, il n'existe pas de médicament réellement efficace permettant de protéger un ou plusieurs organes périphériques, autres que le cerveau, contre une déficience se caractérisant par une anomalie organique ou fonctionnelle de l'organe considéré, c'est-à-dire une incapacité ou une impossibilité de cet organe à présenter une fonctionnalité normale. Le problème est donc de proposer un traitement préventif et/ou curatif d'une 20 déficience ou défaillance d'organe périphérique, en particulier rein, coeur, foie et poumons, et ce quelle qu'en soit la cause, à savoir La solution de l'invention est alors une composition gazeuse contenant une quantité efficace de krypton gazeux pour une utilisation par inhalation pour prévenir ou pour traiter une déficience ou défaillance d'au moins un organe périphérique chez un patient. 25 Selon le cas, la composition gazeuse ou médicament gazeux inhalable de l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - le patient est un être humain, en particulier un adulte ou un enfant. - elle contient entre 15 et 80% en volume de krypton. - elle contient au moins 30% en volume de krypton. 30 - elle contient moins de 75% en volume de krypton. - la déficience d'organe résulte d'une anomalie organique et/ou fonctionnelle. - la déficience d'organe concerne plusieurs organes. - la déficience d'organe est transitoire, de préférence de moins d'une heure à plusieurs jours ou semaines, ou définitive 35 - l'organe est choisi parmi le foie, les reins, le coeur et les poumons. - elle contient en outre de l'oxygène, de préférence au moins 21% en volume d'oxygène. - elle contient en outre un composé additionnel choisi dans le groupe formé par N2O, Xe, Ar, He, Ne, NO, CO, H2S et N2. - le krypton est administré au patient, une ou plusieurs fois par jour pendant une durée d'inhalation de quelques minutes à une ou plusieurs heures. - elle est formée d'un mélange gazeux contenant, en outre, de l'oxygène, de l'azote ou leurs mélanges, en particulier de l'air. - elle est formée d'un mélange gazeux binaire constitué de krypton et d'oxygène pour le reste ou un mélange ternaire constitué de krypton, d'azote et d'oxygène, de préférence le médicament gazeux est prêt à l'emploi. - elle est conditionnée dans une bouteille de gaz. L'invention porte aussi sur une utilisation de krypton gazeux pour fabriquer une composition médicamenteuse inhalable selon l'invention destinée à prévenir ou à traiter une déficience ou défaillance d'un organe périphérique chez un patient. D'une façon générale, lors du traitement, l'administration de krypton au patient se fait par inhalation par exemple au moyen d'un ventilateur, d'un nébuliseur ou spontanément avec des bouteilles de gaz préconditionnées, raccordés à un masque facial ou nasal, ou des lunettes nasales. La durée d'administration est fonction de la durée de la déficience / défaillance, choisie au cas par cas, par exemple le krypton peut être administré pendant une durée d'administration de quelques minutes à quelques dizaines de minutes, voire d'heures, par exemple moins d'une heure, à une fréquence pouvant atteindre une à plusieurs fois par jour et sur une durée totale de traitement de un ou plusieurs jours, semaines, mois ou années, Le krypton ou mélange gazeux à base de krypton est préférentiellement conditionné en bouteille de gaz sous pression ou sous forme liquide, par exemple dans une bouteille d'un à plusieurs litres (contenant en eau) et à une pression comprise entre 2 et 300 bar. Le krypton ou mélange gazeux à base de krypton peut se présenter sous forme « prêt à l'emploi », par exemple en pré-mélange avec de l'oxygène, ou alors être mélangé sur site lors de son utilisation, notamment avec de l'oxygène et éventuellement un autre composé gazeux, par exemple de l'azote. Dans le cadre de l'invention, le patient est un être humain, c'est-à-dire un homme ou une femme, y compris les enfants, les adolescents ou tout autre groupe d'individus, par exemple les nouveaux-nés ou les personnes agées. Exemple Les essais suivants ont été réalisés pour démontrer que le krypton présente un effet 35 protecteur sur la conservation d'un organe périphérique. Dans cette étude, les effets du krypton gazeux ont été étudiés par la capacité à protéger du phénomène de la mort cellulaire ou apoptose, qui est la conséquence ultime du syndrome d'ischémie-reperfusion que l'on retrouve lors de l'arrêt de la circulation sanguine et au stade ultime celui de la greffe d'organes. Afin de réaliser une évaluation de l'efficacité de la protection engendrée par les différents gaz testés, on a examiné leurs capacités à protéger du phénomène de la mort cellulaire ou apoptose. Les conditions expérimentales mimaient les dégâts cellulaires liées à l'ischémiereperfusion, via les effets cytotoxiques et antiprolifératifs de la staurosporine qui est un inhibiteur global de la tyrosine kinase interrompant tous les signaux trophiques ; de la rotenone qui est un inhibiteur du complexe I de la chaine respiratoire; de l'antimycine A qui est un inhibiteur du complexe III de la chaine respiratoire; la ménadione qui est un agent redox inhibant la production d'espèces oxygène-réactives sur la chaine respiratoire ; et de la mitoxanthrone qui est une anthracycline générant des anomalies de l'ADN cellulaire. Les effets ont été évalués à des concentrations proches des doses demi-létales, puis à des doses de 1/10, 1/3, x 3 et x 10. Les cellules étaient maintenues dans différents milieux de conservation, type milieu seul, milieu sérum « free », milieu sérum et nutriment « free » (condition reproduisant la déplétion en nutriments et facteurs trophiques), milieu contenat de la rapamycine (contrôle positif de l'induction de l'autophagie) ou du nocodazole (contrôle positif de l'arrêt de la mitose cellulaire). Toutes les expériences ont été menées sous atmosphères gazeuses à base de krypton et autres gaz, tétrappliquées à des fins d'analyse statistique. Les mesures sont réalisées après 6 et 16 heures d'incubation. Les cellules U2OS sont testées et étudiées dans les conditions suivantes : - en présence de GFP-histone H2B qui est une protéine verte en fluorescence générée pour marquer la chromatine et permettre un suivi du cycle de la division cellulaire ainsi que la condensation nucléaire du processus d'apoptose; et de Red-centrin qui est une protéine rouge en fluorescence marquant les centrosomes, afin de mesurer la prolifération et l'apoptose en culture cellulaire. - en présence de GFP-HMGB1 qui est une protéine relarguée par le noyau des cellules nécrotiques, et de DAPI qui permet un marquage de la chromatine pour évaluer simultanément la nécrose, à savoir le relarguage de GFP-HMGB1, et l'apoptose qui est définit par le niveau de condensation de la chromatine, qui peut être primaire, c'est-à-dire sans relarguage de GFP-HMGB1, ou secondaire, c'est-à-dire avec relarguage de GFPHMGB1. - en présence de GFP-LC3 qui est une protéine capable de se redistribuer : de diffus à des amas localisés punctiformes dénommés autophagosomes, quand l'autophagie est induite, afin de mesurer l'autophagie. - en présence de GFP-G3B qui est une protéine capable de se redistribuer : de diffus à des amas localisés punctiformes dénommés granules de stress, quand le stress endoplasmique (ER) est induit, afin de mesurer le stress endoplasmique (ER). - en présence de 5-ethyl-2'deoxyuridine qui est une base thymidine analogue qui s'incorpore dans l'ADN de cellules en prolifération, révélée par Click-IT-Alexa-Fluor azide qui est une sonde moléculaire permettant de rendre fluorescent le 5-éthyl-2'doxyuridine, et DAPI afin d'étudier le contenu de l'ADN. Les cellules sont ensuite analysées dans un automate de type BD Pathway Fluorescence Microscope afin de déterminer les paramètres suivants : - apoptose définite par GFP-H2B ou DAPI-condensation chromatine mesurable), - autophagie définie par GFP-LC3 puncta, - nécrose définie par l'exsudation de HMGB1 du noyau, - aberrations mitotiques définies par GFP-H2B et Red-Centrin, - niveau de stress ER défini par GFP-G3B puncta, - cycle cellulaire défini par l'incorporation de 5-éthyl-2'doxyuridine dans les cellules en phase S, ainsi que par analyse de l'ADN. En outre, les cellules U20S ont été marquées avec plusieurs fluorochromes déterminant l'état fonctionnel des mitochondries, en particulier l'ester de tetramethyl rhodamin, cation lipophilique mesurant le potentiel transmembranaire interne de la mitochondrie, la génération d'espèces oxygène réactive, c'est-à-dire du dehydroethidium, qui oxydé génère le produit fluorescent appelé éthidium, ou le contenu en glutathion, c'est-à-dire thiol-reactive fluorochrome monochlorobiman. Les résultats obtenus montrent que les cellules conservées sous krypton conformément à l'invention conservent leurs capacités fonctionnelles ainsi que leur intégrité physiques puisque le krypton diminue les signes d'apoptose cellulaire, c'est-à-dire les conséquences lésionnelles lors d'une ischémie-reperfusion. Le mécanisme d'action par lequel le krypton est capable de protéger ces organes, notamment rein, coeur, foie, poumons lors d'une déficience aiguë ou chronique, isolée ou multiple, caractérisée par une anomalie organique et/ou fonctionnelle, transitoire ou définitive n'est pas encore établi avec certitude. Malgré cela, les résultats obtenus lors de ces essais montrent clairement que le krypton peut être utilisé en tant que médicament inhalable pour prévenir ou traiter une déficience ou défaillance d'un ou plusieurs organes périphériques chez un patient, en particulier le foie, les reins, les poumons ou le coeur, que la défaillance d'organe soit due à une infection localisée ou généralisée, une inflammation aiguë ou chronique localisée ou généralisée, des phénomènes d'auto-immunité primaires ou secondaires, à un traumatisme, à une organo-dégénérescence ou une autre cause. REVENDICATIONS1. Composition gazeuse contenant une quantité efficace de krypton gazeux pour une utilisation par inhalation pour prévenir ou pour traiter une déficience ou défaillance 5 d'au moins un organe périphérique chez un patient. 2. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle contient entre 15 et 80% en volume de krypton. 10 3. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient au moins 30% en volume de krypton. 4. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient moins de 75% en volume de krypton. 5. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la déficience ou défaillance d'organe résulte d'une anomalie organique et/ou fonctionnelle. 20 6. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la déficience ou défaillance d'organe concerne plusieurs organes. 7. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la déficience ou défaillance d'organe est transitoire, de préférence de moins d'une heure 25 à plusieurs jours ou semaines, ou définitive 8. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'organe est choisi parmi le foie, les reins, le coeur et les poumons. 30 9. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient en outre de l'oxygène, de préférence au moins 21% en volume d'oxygène. 10. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un composé additionnel choisi dans le groupe formé par N2O, Xe, 35 Ar, He, Ne, NO, CO, H2S et N2. 15