Brevet FR2948664A1 — publié le 20110204

i DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la purification des protéines, et en particulier au domaine de la purification des protéines de la coagulation à domaine GLA. ETAT DE LA TECHNIQUE De manière générale, les protéines à domaine GLA forment une famille de protéines possédant une structure commune, le domaine GLA, qui consiste en une région localisée vers l'extrémité N-terminale de ces protéines et qui comprend une io pluralité de résidus glutamine qui sont normalement carboxylés en résidus d'acide carboxy-glutamique ou � GLA �. Les protéines à domaine GLA comprennent en général une partie N-terminale appelée propeptide qui est reconnue par une carboxylase dépendante de la vitamine K. Après carboxylation des résidus glutamine du domaine GLA, le propeptide est clivé par protéolyse et la protéine à 15 domaine GLA mature et active est libérée. Selon les protéines considérées, le domaine GLA est constitué d'environ 45 acides aminés comprenant de 9 à 12 résidus glutamine qui sont normalement carboxylés en Gla. Les protéines à domaine GLA consistent en des protéines dites � vitamine K-dépendantes �. Les protéines à domaine GLA englobent des facteurs de la 20 coagulation, des protéines du tissu osseux et des conopeptides. Les facteurs de la coagulation à domaine GLA englobent la prothrombine (Facteur Il), le Facteur VII, le Facteur IX, le Facteur X, la Protéine C et la Protéine S. Les protéines à domaine GLA, y compris les protéines de la coagulation vitamine K-dépendantes à domaine GLA, sont présentées notamment dans l'article de Furie et al. (1999, Blood, Vol. 93 : 25 1798-1808). Les protéines de la coagulation vitamine K-dépendantes à domaine GLA consistent en des protéines d'intérêt thérapeutique. Parmi celles-ci, le Facteur Il, le Facteur VII, le Facteur IX et le Facteur X, représentent des protéines d'un très grand intérêt thérapeutique qui sont administrés pour la prévention et le traitement de 30 nombreux troubles de l'hémostase. Les protéines humaines de la coagulation à domaine GLA peuvent être purifiées à partir des fluides humains naturels, en général à partir de plasma sanguin humain. Par ailleurs, de nombreux travaux ont été entrepris afin de mettre au point des procédés de production et de purification de protéines humaines recombinantes de la coagulation à domaine GLA. On peut citer par exemple le Facteur VII humain recombinant, qui est dores et déjà commercialisé en tant que médicament. Pour l'obtention de protéines à domaine GLA purifiées à partir de fluides biologiques dans lesquels ces protéines sont produites naturellement ou bien sous forme de protéines recombinantes, des procédés de purification adaptés sont déjà connus dans l'état de la technique. Ces procédés comprennent en général une succession d'étapes de séparation sélective basées sur des étapes de précipitation des protéines, de passage sur des supports de chromatographie suivi d'étapes d'élution séquentielle, d'étapes de filtration en profondeur, d'ultrafiltration, ou encore io d'étapes de concentration. Les procédés de purification de protéines de la coagulation à domaine GLA qui sont utilisés aujourd'hui pour produire des médicaments ne comprennent pas d'étape de chromatographie d'affinité. Une raison d'un tel choix technique réside dans les inconvénients engendrés par le détachement d'une partie des molécules ligand greffées sur le support d'affinité, qui 15 sont retrouvées associées à la protéine thérapeutique purifiée dans le volume de l'éluat de chromatographie. A titre illustratif, on peut citer le produit Mononine�, qui est une composition pharmaceutique à base de Facteur IX humain purifié, qui est obtenu par un procédé utilisant un support d'immuno-affinité sur lequel sont immobilisés des anticorps monoclonaux anti-FIX de souris. Toutefois, la 20 monographie du produit Mononine� spécifie la présence de traces d'anticorps monoclonaux murins anti-FIX humain dans le produit final, ce qui est de nature à entraîner des problèmes d'immunogénicité chez les patients traités car ils s'immunisent contre les � relargables � (anticorps et fragments d'anticorps murins). La monographie du produit Mononine� spécifie des contre-indications pour les 25 patients allergiques aux protéines murines. De manière générale, il existe un besoin dans l'état de la technique pour des procédés améliorés ou alternatifs de purification de protéines de la coagulation à domaine GLA vitamine K-dépendantes. Cela englobe un besoin pour des procédés alternatifs ou améliorés pour l'obtention de compositions comprenant une seule 30 protéine purifiée, comme par exemple le Facteur VII ou le Facteur IX, ainsi que les procédés alternatifs ou améliorés pour l'obtention de compositions comprenant une combinaison de protéines à domaine GLA, par exemple des compositions comprenant une combinaison de Facteur Il, de Facteur VII, de Facteur IX et de Facteur X. Cela englobe un besoin pour des procédés alternatifs ou améliorés pour la purification de protéines à domaine GLA non recombinantes et de protéines à domaine GLA recombinantes. RESUME DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé pour la purification de protéines de la coagulation à domaine GLA comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon contenant une ou plusieurs protéines de la coagulation à domaine GLA avec un support d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement aux protéines de la io coagulation à domaine GLA, afin de former des complexes entre (i) lesdits aptamères nucléiques et (ii) ladite ou lesdites protéine(s) de la coagulation à domaine GLA, b) libérer la ou les protéine(s) de la coagulation à domaine GLA à partir des complexes formés à l'étape a), et 15 c) récupérer ladite ou lesdites protéine(s) de la coagulation à domaine GLA sous une forme purifiée. Dans les procédés ci-dessus, lesdits aptamères sont préférentiellement des aptamères désoxyribonucléiques. Dans les procédés ci-dessus, ladite protéine à domaine GLA peut être un 20 facteur de la coagulation vitamine K dépendant, par exemple choisis parmi le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX et le facteur X. Dans certains modes de réalisation de ces procédés, lesdits aptamères nucléiques consistent en des aptamères de séquence SEQ ID N°4. 25 DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 est le cliché d'un gel d'électrophorèse SDS-PAGE des protéines contenues dans les fractions successives obtenues lors de la purification de facteur IX plasmatique par chromatographie avec un support d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères anti-GLA Mapt-1. Ligne 1 : matériel de départ ; ligne 2 : 30 fraction non retenue (NR) ; ligne 3 : fraction d'élution (El) ; ligne 4 : fraction de régénération (E2) ; ligne 5 : témoin de référence de Facteur IX purifié ; ligne 6 : protéines de référence de poids moléculaire connu. La Figure 2 illustre les courbes de liaison (i) respectivement du Facteur VII, du Facteur IX ou du Facteur X, présent dans différentes compositions à (ii) un 35 aptamère spécifique des protéines à domaine GLA immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes ; en ordonnées, le signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Courbe n° 1 : préparation de Facteur IX humain recombinant (BeneFIX�) ; Courbe n° 2 : préparation de Facteur VII humain plasmatique ; Courbe n°3 : préparation de Facteur X humain plasmatique ; Courbe n°4 : préparation de témoin négatif. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le demandeur s'est attaché à concevoir de nouveaux procédés pour purifier io des protéines de la coagulation à domaine GLA, c'est-à-dire de nouveaux procédés adaptés pour l'obtention de protéine(s) de la coagulation à domaine GLA purifiées à partir d'un échantillon de départ comprenant une protéine de la coagulation à domaine GLA ou une pluralité de protéines de la coagulation à domaine GLA. En d'autres termes, le demandeur a cherché à mettre au point des procédés 15 d'enrichissement ou de purification qui soit à la fois (i) sélectif pour les protéines de la coagulation à domaine GLA et (ii) non sélectif d'une protéine de la coagulation à domaine GLA spécifique. Afin de mettre au point ces procédés de purification, le demandeur à isolé et caractérisé de nouveaux ligands qui (i) possèdent l'aptitude à se lier spécifiquement 20 aux protéines de la coagulation à domaine GLA et (ii) qui ne sont pas spécifiques d'une protéine de la coagulation à domaine GLA en particulier. Ces nouveaux ligands, dont les caractéristiques sont détaillées plus loin dans la présente description, consistent en des acides nucléiques, aussi appelés � aptamères nucléiques �, se liant aux protéines de la coagulation à domaine GLA, 25 et qui ne sont pas spécifiques d'une protéine de la coagulation à domaine GLA particulière. La présente invention fournit des procédés de purification de protéines de la coagulation à domaine GLA, dans lesquels il est tiré bénéfice des propriétés de liaison de ces nouveaux ligands du type acide nucléique. 30 Le demandeur s'est aussi attaché à mettre au point des procédés permettant l'obtention d'aptamères nucléiques se liant spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA, dans l'objectif d'utiliser lesdits aptamères nucléiques dans des procédés de purification. Selon l'invention, on a obtenu des aptamères nucléiques se liant 35 spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA. Plus précisément, le demandeur a obtenu et caractérisé des aptamères nucléiques qui se lient exclusivement à une variété de protéines de la coagulation à domaine GLA, c'est à dire à une variété de protéines de la coagulation possédant un domaine GLA dont les résidus glutamine caractéristiques du domaine GLA peuvent être gamma- carboxylés. Comme cela est montré dans les exemples, un aptamère nucléique de l'invention, qui est spécifique des protéines de la coagulation à domaine GLA, est capable de se lier indifféremment à une variété de protéines de la coagulation vitamine K-dépendantes présentant une caractéristique commune conservée qui est io le domaine GLA. On a notamment montré dans les exemples qu'un aptamère spécifique des protéines de la coagulation à domaine GLA est capable de se lier à une pluralité de protéines comme le Facteur IX, le Facteur VII et le Facteur X. On connaît déjà dans l'état de la technique des aptamères nucléiques qui 15 reconnaissent spécifiquement et individuellement des protéines de la coagulation à domaine GLA tels que le Facteur Il, le Facteur VII, le Facteur IX ou le Facteur X, y compris des aptamères liant la thrombine (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19) : 7586-7593), des aptamères liant le Facteur IX/lXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95 : 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc 20 Biol, Vol. 27 : 722-727; Demande PCT n ° WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n° US 7,312,325), des aptamères liant le Facteur X/Xa ( Demande PCT n° WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n° US 7,312,325) ou encore des aptamères liant le facteur VII/Vlla humain (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5) : 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17 : 1-11). 25 On précise qu'aucun des aptamères ci-dessus n'est décrit pour son utilisation pour purifier la protéine cible sur laquelle il se lie. De plus, les aptamères ci-dessus se lient exclusivement à une seule protéine de la coagulation à domaine GLA, sans réaction croisée avec une autre protéine de la coagulation à domaine GLA. 30 Un tel type d'aptamère, spécifique d'une protéine de la coagulation à domaine GLA donnée, et qui ne présente pas la capacité de se lier à une autre protéine, y compris à une autre protéine de la coagulation à domaine GLA, est par exemple décrit par Layzer et al. (2007, Oligonucleotides, Vol. 17 : 1-11). Toutefois, à la connaissance du demandeur, un aptamère nucléique dont la 35 spécificité de liaison est le domaine GLA des protéines de la coagulation, et qui possède la capacité à se lier à une pluralité de protéines de la coagulation à domaine GLA distinctes, n'a jamais été décrit dans l'état de la technique. La disponibilité d'aptamères nucléiques se liant spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA a permis la mise au point de procédés de purification de ces protéines, notamment dans l'objectif d'obtenir un produit final purifié utilisable en tant que principe actif d'un médicament. La présente invention est relative à un procédé pour la purification de protéines de la coagulation à domaine GLA comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon contenant une ou plusieurs protéines de la io coagulation à domaine GLA avec un support d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA, afin de former des complexes entre (i) lesdits aptamères nucléiques et (ii) ladite ou lesdites protéine(s) de la coagulation à domaine GLA, 15 b) libérer la ou les protéine(s) de la coagulation à domaine GLA à partir des complexes formés à l'étape a), et c) récupérer ladite ou lesdites protéine(s) de la coagulation à domaine GLA sous une forme purifiée. Le terme � protéine de la coagulation à domaine GLA � englobe toute 20 protéine de la coagulation comprenant une région, désignée domaine GLA, comprenant une pluralité de résidus glutamine qui sont gamma-carboxylés au cours de la synthèse protéique. Les protéines de la coagulation à domaine GLA englobent les protéines de la coagulation possédant un domaine GLA vers l'extrémité N-terminale, ledit domaine GLA étant localisé généralement en aval, c'est-à-dire du 25 côté C-terminal, d'un propeptide qui est naturellement hydrolysé au cours de la synthèse. Les protéines de la coagulation à domaine GLA englobent les protéines de la coagulation dans lesquelles le domaine GLA consiste en une région d'environ 45 acides aminés comprenant de 9 à 12 résidus glutamine dont au moins une partie d'entre eux sont normalement carboxylés en résidus GLA lors du processus de 30 synthèse protéique dans les cellules. Les facteurs de la coagulation à domaine GLA, qui consistent en des protéines vitamine K-dépendantes, englobent la prothrombine (Facteur Il), le Facteur VII, le Facteur IX, le Facteur X, la Protéine C et la Protéine S. Les protéines de la coagulation à domaine GLA englobent les protéines non recombinantes provenant de sources naturelles, comme le plasma 35 sanguin, ainsi que les protéines recombinantes qui peuvent être produites in vitro par des cellules transfectées ou transformées avec un ADN codant ladite protéine de la coagulation ou qui peuvent être produites in vivo par des animaux dans lequel on a introduit un transgène codant ladite protéine de la coagulation. Les protéines de la coagulation à domaine GLA produites par des animaux transgéniques peuvent aussi être appelées � protéines transgéniques � dans la présente description. Par � aptamère nucléique �, on entend selon l'invention un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA, qui peut être aussi désigné dans la présente description par le terme � aptamère anti-GLA �. Les aptamères de l'invention englobent donc ceux pour lesquels on io peut détecter des complexes avec une variété de protéines de la coagulation à domaine GLA données, après une étape préalable de mise en contact des partenaires respectivement nucléique et protéique. La détection de complexes formés entre un aptamère anti-GLA selon l'invention et une protéine de la coagulation à domaine GLA peut être aisément 15 réalisée par l'homme du métier, par exemple en mettant en oeuvre une technique de détection par résonance plasmonique de surface, y compris la technique Biacore�, comme cela est illustré dans les exemples. L'homme du métier peut aussi aisément détecter la formation de complexes entre un aptamère anti-GLA selon l'invention et une protéine de la coagulation à domaine GLA par des techniques 20 classiques du type ELISA, comme cela est connu par l'homme du métier. On a montré dans les exemples qu'un aptamère anti-GLA selon l'invention est capable de se lier respectivement à une pluralité de protéines de la coagulation à domaine GLA distinctes, et en particulier à une pluralité de protéines humaines de la coagulation à domaine GLA. On a montré notamment qu'un aptamère anti-GLA 25 donné selon l'invention est capable de se lier respectivement au Facteur VII, au Facteur IX et au Facteur X humains. Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification ci-dessus est caractérisé en ce que ladite protéine de la coagulation à domaine GLA consiste en un facteur de la coagulation vitamine K dépendant. 30 Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification ci-dessus est caractérisé en ce que ladite protéine de la coagulation à domaine GLA est choisie parmi le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X, la protéine C et la protéine S. Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification ci-dessus est 35 adapté pour purifier simultanément au moins deux protéines de la coagulation à domaine GLA choisies parmi le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X, la protéine C et la protéine S. Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification ci-dessus est adapté pour purifier simultanément au moins trois protéines de la coagulation à domaine GLA choisies parmi le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X, la protéine C et la protéine S. Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification ci-dessus est adapté pour purifier simultanément le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X, la protéine C et la protéine S. io Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification ci-dessus est adapté pour purifier simultanément le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX et le facteur X. Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification ci-dessus est adapté pour purifier simultanément le facteur VII, le facteur IX et le facteur X. 15 La purification simultanée de plus d'une protéine de la coagulation à domaine GLA dépend notamment du type d'échantillon de départ qui est utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de purification. En particulier, le nombre et l'identité des protéines de la coagulation à domaine GLA qui sont obtenues sous forme purifiée à l'issue du procédé sont logiquement limités par le nombre et l'identité des 20 protéines de la coagulation à domaine GLA qui sont présentes initialement dans l'échantillon de départ. De manière générale, les aptamères anti-GLA peuvent consister en des molécules d'ADN (acide désoxyribonucléique) ou d'ARN (acide ribonucléique) et ont la capacité à se lier à une protéine à domaine GLA, supérieure à la capacité à se 25 lier à une protéine qui ne comprend pas de domaine GLA. Un aptamère anti-GLA peut être obtenu par des procédés qui ont été spécialement mis au point pour les besoins de l'invention, et qui sont détaillés plus loin dans la présente description. Préférentiellement, les aptamères anti-GLA selon l'invention possèdent 30 diverses caractéristiques structurelles communes, y inclus une séquence comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', successivement (i) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur, suivie de (ii) une séquence nucléotidique variable d'environ 40 à 50 nucléotides de longueur, suivie de (iii) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur. On précise que les séquences nucléotidiques variables (ii) peuvent posséder entre elles une très forte identité de séquence en nucléotides. Les procédés de sélection d'aptamères anti-GLA qui sont spécifiés dans la présente description sont du type permettant l'obtention d'une famille d'aptamères anti-GLA, aptes à reconnaître une pluralité de protéines de la coagulation à domaine GLA, en particulier de protéines humaines de la coagulation à domaine GLA. D'un point de vue structurel, chaque élément de la famille d'acides nucléiques, ou aptamères nucléiques, susceptibles d'être obtenus selon l'invention, Io qui se lient spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA, comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) suivante : 5'-[SEQ ID N°1]x-[SEQ ID N°X]-[SEQ ID N°2]y-3' (I), dans laquelle : 15 - � SEQ ID N°X � consiste en un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3, - � x � est un entier égal à 0 ou 1, et - � y � est un entier égal à 0 ou 1. Dans certains modes de réalisation, l'acide de séquence SEQ ID N°X a une longueur de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 20 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 nucléotides. Dans d'autres modes de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °X a une longueur de 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 nucléotides de longueur. Dans certains autres modes de réalisation préférés, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°X a une longueur de 43, 44 ou 45 nucléotides de longueur. [ 25 Comme déjà mentionné précédemment, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 15 nucléotides de longueur. Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 30 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ou 81 nucléotides de longueur, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées. Lorsque l'entier � x � est égal à 0 et l'entier � y � est égal à 1, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 2948664 Io nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-1) suivante 5' -[SEQ ID N°X]-[SEQ ID N°2] -3' (1-1) [ Lorsque l'entier � x � est égal à 1 et l'entier � y � est égal à 0, les aptamères 5 nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-2) suivante 5'-[SEQ ID N°1] -[SEQ ID N°X]-3' (1-2) Lorsque l'entier � x � est égal à 0 et l'entier � y � est égal à 0, les aptamères Io nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-3) suivante : 5'-[SEQ ID N°X]-3' (1-3) Les aptamères nucléiques ci-dessus englobent donc les acides nucléiques 15 comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3. De manière générale, un premier polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec un second polynucléotide ou acide nucléique 20 possède au moins 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 610/0, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 710/0, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 8-10/0, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 9-10/0, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit second 25 polynucléotide ou acide nucléique. Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N° X, ladite séquence SEQ ID N° X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence possédant au moins 40% d'identité en nucléotides avec 30 la séquence SEQ I D N°3. Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N° X, ladite séquence SEQ ID N° X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques possédant au moins 41%, 42%, 35 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 5-10/0, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 6-10/0, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, Il 710/0, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 810/0, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 9-10/0, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N° 3. Il résulte de ce qui précède que la présente invention englobe une famille d'acides nucléiques monobrin ayant au moins 15 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de formule (I) défini ci-dessus. Le � pourcentage d'identité � entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. io La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des � gaps �) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions 15 auxquelles une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles. 20 L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus. De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = � full � ; (3) 25 OUTPUT FORMAT = � aln w/numbers � ; (4) OUTPUT ORDER = � aligned � ; (5) COLOR ALIGNMENT = � no � ; (6) KTUP (word size) = � default � ; (7) WINDOW LENGTH = � default � ; (8) SCORE TYPE = � percent � ; (9) TOPDIAG = � default � ; (10) PAIRGAP = � default � ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = � none � ; (12) MATRIX = � default � ; (13) GAP OPEN = � default � ; (14) 30 END GAPS = � default � ; (15) GAP EXTENSION = � default � ; (16) GAP DISTANCES = � default � ; (17) TREE TYPE = � cladogram � et (18) TREE GRAP DISTANCES = � hide �. A titre illustratif et pour certains modes de réalisation d'un aptamère nucléique de l'invention, l'homme du métier peut aisément, sur la base de la 35 définition structurelle ci-dessus des aptamères nucléiques de formule (I), générer de manière automatique, par exemple à l'aide d'un calculateur numérique dont la mémoire est chargée avec un ensemble d'instructions approprié, l'ensemble des séquences SEQ ID N°X possibles. Le cas échéant, l'homme du métier peut ensuite déterminer automatiquement, à l'aide dudit calculateur numérique, respectivement (i) celles des séquences dont le modèle de structure dans l'espace est similaire ou identique à celle de l'aptamère nucléique anti-GLA de séquence SEQ ID N°4, et (ii) celles dont la structure de l'aptamère nucléique est distincte de celle de l'aptamère nucléique anti-GLA de séquence SEQ ID N°4. Les aptamères nucléiques ayant une structure dans l'espace similaire ou identique à celle de l'aptamère nucléique anti-GLA de séquence SEQ ID N° 4 englobent ceux qui comprennent un enchaînement de boucles et de tiges similaire ou identique à celui-ci. Pour déterminer la structure secondaire dans l'espace d'un acide nucléique de formule (I), l'homme du métier peut notamment, sur la base de la description de sa séquence en nucléotides, générer une modèlisation en utilisant le programme d'ordinateur mFold� décrit par Zuker (2003, Nucleic Acids Research, Vol. 231(13) 3406-3413), et qui peut aussi être utilisé à l'adresse Web suivante http:/Imfold.bioinfo.rpi.edu/. Préférentiellement, on utilise le programme d'ordinateur mFold , selon les paramètres suivants : (i) ADN à séquence linéaire, (ii) température de repliement 25°C, (iii) conditions ioniques : [Na+] : 150 mM; [Mg++] : 4 mM, (iv) type de correction : Oligomère, (v) nombre du pourcentage de � suboptimality � : 2, (vi) limite supérieure du nombre de repliements calculés : 50, (vii) distance maximale entre deux paires de bases : pas de limite, et (viii) utilisation des valeurs par défaut pour les autres paramètres. Puis, l'homme du métier réalise une étape de comparaison entre (i) le modèle de structure de l'aptamère et (ii) le modèle de structure de l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré, et il sélectionne positivement l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré si son modèle structurel est identique ou similaire à celui de l'aptamère anti-GLA de séquence SEQ ID N°4. Dans tous les cas, afin de confirmer la sélection positive de l'aptamère de formule (I) nouvellement généré, l'homme du métier peut vérifier ses propriétés de liaison à une protéine de la coagulation à domaine GLA, choisie parmi le Facteur VII/Vila humain, le Facteur IX/Ixa humain et le Facteur X/Xa humain, par exemple selon l'une des méthodes spécifiées dans la présente description, en particulier dans les exemples. Dans certains modes de réalisation préférés d'un aptamère nucléique anti-GLA de l'invention, ledit aptamère nucléique comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I), ce qui englobe les aptamères comprenant 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 910/0, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit acide nucléique de formule (I). Les aptamères nucléiques selon l'invention englobent l'aptamère nucléique de séquence SEQ ID N° 4. On rappelle que l'aptamère de séquence SEQ ID N°4 consiste en un aptamère de formule (I) dans laquelle la séquence SEQ ID N° X consiste en la séquence SEQ ID N° 3. On rappelle aussi qu'un aptamère de séquence SEQ ID N°3 consiste en un aptamère de formule (1-3) dans lequel les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 sont absentes. Le demandeur a montré que l'aptamère de séquence SEQ ID N° 3 possède une capacité à se lier sélectivement aux protéines de la coagulation à domaine GLA actives similaire à celle de l'aptamère de séquence SEQ ID N° 4. Ces résultats montrent le caractère essentiel de la présence de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 dans les propriétés de liaison spécifique de l'aptamère de séquence SEQ ID N° 4. De manière générale, ces résultats montrent le caractère essentiel de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X dans un aptamère de formule (1), l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X conférant à l'aptamère de formule (1) l'aptitude à se lier sélectivement aux protéines de la coagulation à domaine GLA actives. Les aptamères nucléiques de l'invention englobent donc aussi l'aptamère de séquence SEQ ID N° 3. On a montré dans les exemples que les aptamères anti-GLA de l'invention peuvent être utilisés avec succès pour la fabrication de supports de chromatographie d'affinité, utiles pour séparer les protéines de la coagulation à domaine GLA d'un échantillon des autres protéines. Pour la réalisation de supports de chromatographie d'affinité notamment, les aptamères nucléiques anti-GLA de l'invention sont préférentiellement inclus dans une structure chimique, aussi appelée � composé � dans la présente description, qui comprend notamment un moyen espaceur et, le cas échéant, un moyen d'immobilisation sur un support solide.- Dans certains modes de réalisation, l'aptamère nucléique est inclus dans la structure d'un composé de formule (Il) suivante : [IMM]X-[SPAC]ÿ [APT] (Il), dans laquelle : - [IMM] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, - [APT] signifie un aptamère anti-GLA tel que défini dans la présente description, - x est un entier égal à 0 ou 1, et -yestunentier égal à0ou 1. Dans certains modes de réalisation du composé de formule (Il), [APT] consiste en un acide désoxyribonucléique de séquence SEQ ID N° 4.ou de séquence SEQ ID N° 3. La � chaîne espaceur � désignée [SPAC] dans le composé de formule (Il) peut être de tout type connu. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique de la surface du support solide sur lequel ledit composé peut être immobilisé et de permettre une mobilité relative de l'acide nucléique par rapport à la surface du support solide sur lequel il peut être immobilisé. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide et de l'acide nucléique, gênent les évènements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules de protéine de la coagulation susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci. Dans le composé de formule (Il), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique aptamère. Avantageusement la chaîne espaceur est liée à la fois à une extrémité de l'aptamère et au support solide. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence la chaîne espaceur est un oligonucléotide non spécifique ou du Polyéthylène Glycol (PEG) ou autre chaine hydrocarbonée hydrophile. Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur. Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (Il) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur 20 englobe un polyéthylène glycol de type PEG(C18), commercialisé par exemple par la Société Sigma Aldrich. Pour immobiliser l'aptamère sur la chaîne espaceur, l'acide nucléique peut être modifié chimiquement avec différents groupements chimiques tels que des groupements permettant d'immobiliser ledit acide nucléique de façon covalente, tels que des thiols, des amines ou tout autre groupement capable de réagir avec des groupements chimiques présents sur le support solide. Dans le composé de formule (Il) le composé [IMM] consiste en un composé choisi parmi (i) un composé capable de former une ou plusieurs liaisons covalente(s) avec le matériau de support solide et (ii) un composé capable de se lier spécifiquement sur le support solide par l'intermédiaire de liaison faibles non covalentes, y compris des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques ou des forces de Van der Waals. Le premier type de composé [IMM] englobe les agents de couplage bifonctionnels, comme le glutaraldéhyde, le SIAB ou encore le SMCC. Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Academic Press, pp 239-242), est le composé de formule (A) suivante : (A) Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant 25 respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl. Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1) : 37-46), est le composé de formule (B) suivante : (B) Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl. Le second type de composé [IMM] englobe la biotine, qui est capable de se lier de manière spécifique non covalente à des molécules d'avidine ou de streptavidine présentes sur le support solide. Une fois immobilisé sur le support solide via I'espaceur, I'aptamère anti-GLA est avantageusement modifié à son extrémité libre (extrémité non liée à I'espaceur) grâce à, et sans s'y limiter, un nucléotide chimiquement modifié (tel que 2'omethyl ou 2'fluoropyrimidine, 2' ribopurine, phosphoramidite), un nucléotide inversé ou un groupement chimique (PEG, polycations, cholestérol). Ces modifications permettent de protéger I'aptamère anti-GLA des dégradations enzymatiques. Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de I'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester, une bille magnétique ou paramagnétique. La présente invention est également relative à un complexe entre : (i) un aptamère nucléique choisi parmi un acide nucléique de formule (I), et un composé de formule (II), et (ii) une protéine de la coagulation à domaine GLA, La présente invention a aussi pour objet un support pour l'immobilisation d'une protéine de la coagulation à domaine GLA, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffées une pluralité de molécules consistant chacune en, ou comprenant chacune, un aptamère nucléique, lesdites molécules étant choisies parmi (a) un acide nucléique de formule (I), et (b) un composé de formule (II). Le support ci-dessus peut être utilisé pratiquement dans toutes les applications pour lesquelles on cherche à immobiliser une protéine de la coagulation à domaine GLA, y compris une protéine de la coagulation à domaine GLA humaine, ce qui englobe les applications à des fins de purification de ladite protéine de la coagulation à domaine GLA et les applications à des fins de détection de ladite protéine de la coagulation à domaine GLA. La réalisation de supports sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques de l'invention se liant spécifiquement à une protéine de la coagulation à domaine GLA sont largement illustrés dans les exemples, dans lesquels les aptamères de l'invention sont utilisés notamment comme agents de capture, utilisables pour la purification ou pour la détection d'une protéine de la coagulation à domaine GLA, par exemple une protéine humaine de la coagulation à domaine GLA, dans des échantillons. io La présente invention concerne donc aussi un procédé pour l'immobilisation d'une protéine de la coagulation à domaine GLA sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant au moins une protéine de la coagulation à domaine GLA avec un support solide sur lequel a été préalablement immobilisée une substance choisie parmi un acide nucléique de 15 formule (I), et un composé de formule (Il). Ledit procédé peut comprendre, selon les objectifs techniques poursuivis, une étape additionnelle de récupération des molécules de protéine(s) de la coagulation à domaine GLA immobilisées, complexées avec les molécules d'acides nucléiques de formule (I). L'étape additionnelle de récupération de la protéine de la coagulation à domaine GLA, ou 20 des protéines à domaine GLA, consiste préférentiellement en une étape de mise en contact des complexes de protéine(s) de la coagulation à domaine GLA avec les acides nucléiques de formule (I) avec un agent chélateur des cations métalliques, tel que I'EDTA. Pour la réalisation de procédés de purification de protéines par 25 chromatographie d'affinité en utilisant des supports solides sur lesquels sont immobilisés les aptamères d'intérêt, l'homme du métier peut se référer aux travaux décrits par Romig et al. (1999, J Chomatogr B Biomed Sci Api, Vol. 731(2) : 275-284) De plus, la fabrication d'un support d'affinité comprenant un aptamère 30 nucléique de l'invention et la réalisation d'un procédé de purification du Facteur IX humain avec ledit support d'affinité est illustré dans les exemples. De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les aptamères de l'invention englobe tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, de 35 support de silicium pour des puces, des membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, et des combinaisons de ceux-ci. Le support solide peut être revêtu avec un matériau facilitant l'attachement, la fixation, la formation de complexes, l'immobilisation ou l'interaction avec les io aptamères. Dans certains modes de réalisation, le support solide est une lame de verre dont la surface est revêtue d'une couche d'or, d'une couche ayant subi un traitement par carboxyméthylation, d'une couche de dextran, de collagène, d'avidine, de streptavidine, etc. 15 De cette manière, les aptamères selon l'invention peuvent être immobilisés sur le support solide par l'intermédiaire d'un revêtement d'attachement, comme par exemple décrit ci-dessus, soit par réaction chimique avec création de liaisons covalentes, soit par association par des liaisons non covalentes telles que des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques, des forces de Van der Waals, etc. 20 Les exemples décrivent des modes de réalisation de supports solides sur lesquels sont immobilisés, par des liaisons non covalentes, les aptamères de l'invention. Dans les exemples, on décrit notamment des supports solides consistant en une lame de verre revêtue d'une couche de molécules de streptavidine, et des 25 aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine. Dans les exemples, on décrit aussi des supports solides consistant en un matériau de polystyrène revêtu d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé 30 sur le support par association non covalente biotine/streptavidine. Dans certains modes de réalisation, les aptamères de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide adapté pour la chromatographie d'affinité, l'électrochromatographie et l'électrophorèse capillaire, comme décrit par exemple par Ravelet et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1) : 1-10), Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 111(2) : 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol. 25 (21-22) : 3730-3739) ou encore Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80(10) : 3915-3920). Un aptamère de formule (I) ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA, ou un composé de formule (Il), peut être aussi avantageusement utilisé comme agent de capture de protéine(s) de la coagulation à domaine GLA, dans des procédés et dispositifs de détection ou de diagnostic. Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence d'une ou plusieurs protéine(s) à domaine GLA dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact (i) un acide nucléique de formule (I), ou un composé de formule (Il) ou un support solide sur lequel sont immobilisés une pluralité de molécules dudit acide nucléique ou dudit composé, avec (ii) ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique de formule (I), ou ledit composé de formule (Il) ou ledit support et (ii) la ou les protéine(s) de la coagulation à domaine GLA. Les exemples de la présente demande de brevet fournissent divers modes de réalisation de procédés de détection du FIX/FIXa humain avec des aptamères de l'invention préalablement immobilisés sur un support solide. Pour la réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, le support solide utilisé peut être un support solide choisi parmi les supports solides décrits précédemment en relation avec le procédé de purification de protéines de la coagulation à domaine GLA. Pour la réalisation d'un procédé ou d'un dispositif de détection de protéines de la coagulation à domaine GLA, l'homme du métier peut se référer notamment aux techniques décrites dans la demande de brevet européen n° EP 1 972 693, la demande PCT n° WO 2008/038696, la demande PCT n° WO 2008/025830, ou encore la demande PCT n ° WO 2007/0322359. Dans certains modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) la ou les protéine(s) de la coagulation à domaine GLA peut être réalisé par mesure du signal de résonance plasmonique de surface, comme cela est décrit dans les exemples. Dans certains autres modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) la ou les protéine(s) de la coagulation à domaine GLA peut être réalisée par la mise en contact desdits complexes éventuellement formés avec un ligand spécifique d'une protéine de la coagulation à domaine GLA, ledit ligand étant détectable. Dans les exemples, on décrit ces modes de réalisation dans lesquels on utilise, comme ligand détectable d'une protéine de la coagulation à domaine GLA, des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-protéine de la coagulation à domaine GLA, marqués avec une enzyme, en l'occurrence la peroxydase de raifort, comme cela est conventionnellement utilisé dans les tests de type ELISA. Comme anticorps spécifiques de protéines de la coagulation à domaine GLA, on peut utiliser, selon les objectifs qui sont poursuivis, (i) soit des anticorps dirigés spécifiquement contre io une protéine de la coagulation à domaine GLA déterminée, par exemple des anticorps anti-FIl humain, anti-FVII humain, anti-FIX humain, anti-FX humain, antiprotéine C humaine ou anti-protéine S humaine (ii) soit des anticorps dirigés contre un domaine GLA de protéine de coagulation à domaine GLA, capables de reconnaître une pluralité de protéines de la coagulation à domaine GLA, comme 15 décrits par exemple dans le brevet américain N° US 7,439,025. De manière surprenante, il est montré selon l'invention que l'on peut fabriquer un support d'affinité tel que défini dans la présente description en utilisant, comme aptamères nucléiques anti-GLA, des aptamères ADN, pourtant considérés dans l'état de la technique comme des acides nucléiques ligands dont la mise en 20 oeuvre est malaisée, et dont la spécificité pour la protéine cible est moindre que la spécificité de la molécule d'ARN de séquence correspondante. Notamment, il est admis dans l'état de la technique que le ADN ligands ont une flexibilité moindre que l'ARN correspondant et qu'en conséquence sont moins aptes que les ARN ligands à subir des changements de conformation. On rappelle que lorsqu'un aptamère 25 nucléique se lie à la protéine cible, il se produit un changement de conformation. Il a aussi été décrit que plus le changement de conformation de l'aptamère nucléique est rapide et plus l'affinité dudit aptamère nucléique pour la protéine cible est élevée (Michaud et al., 2003, Anal Chem, Vol. 76 : 1015-1020 ; Brumbt et al., 2005, Anal Chem, Vol. 77 : 1993-1998). 30 Ainsi, dans certains modes de réalisation d'un support d'affinité selon l'invention, les aptamères anti-GLA consistent en des aptamères ADN. En conséquence, dans certains modes de réalisation d'un support d'affinité selon l'invention, lesdits acides nucléiques immobilisés, le cas échéant inclus dans la structure d'un composé de formule (I), consistent en des acides 35 désoxyribonucléiques. Dans certains autres modes de réalisation d'un support d'affinité selon l'invention, lesdits acides nucléiques consistent, pour une première partie d'entre eux, en des acides désoxyribonucléiques, et pour la partie restante en des acides ribonucléiques. Un autre avantage des aptamères nucléiques concerne leur facilité de fabrication, comparée aux difficultés de synthèse des aptamères ARN, ainsi que leur prix de revient qui est significativement plus réduit que le prix de revient d'un aptamère ARN. Ces modes de réalisation spécifiques sont illustrés dans les exemples. La présente invention a également pour objet un dispositif de chromatographie d'affinité pour la purification d'une protéine de la coagulation à domaine GLA, comprenant un conteneur dans lequel est disposé une quantité adaptée d'un support d'affinité tel que défini dans la présente description. Des formes variées de conteneurs pour supports de chromatographie sont connus dans l'état de la technique et sont englobés par la signification du terme � conteneur � ci-dessus. Les caractéristiques importantes d'un tel conteneur englobent la présence d'un moyen d'alimentation du dispositif de chromatographie d'affinité en échantillon de départ et d'un moyen de sortie du liquide après sa mise en contact avec le support d'affinité. La présente invention a aussi pour objet un procédé pour immobiliser une protéine de la coagulation sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon contenant ladite protéine de la coagulation avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus. Les échantillons de départ à partir desquels sont purifiées une ou plusieurs protéines de la coagulation à domaine GLA avec un support d'affinité selon l'invention, englobent tout type de solution liquide dans laquelle ladite ou lesdites protéines de la coagulation à domaine GLA est (sont) en suspension ou est (sont) solubilisée(s). Des modes de réalisation spécifiques de tels échantillons, en particulier en relation avec le procédé de purification décrit ci-après, seront définis ultérieurement dans la présente description. Dans certains modes de réalisation préférés, ledit échantillon contient une protéine de la coagulation à domaine GLA humaine. Avantageusement, dans ces modes de réalisation, l'échantillon contenant une protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt consiste en un échantillon liquide qui contient ladite protéine d'intérêt, y compris un échantillon liquide comprenant ladite protéine de la coagulation à domaine GLA et qui est susceptible de contenir aussi des molécules de la protéine de la coagulation à domaine GLA homologue d'un mammifère non humain. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique, tels qu'un fluide corporel, une cellule, un broyat cellulaire, un tissu, un broyat tissulaire, un organe ou un organisme entier. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique liquide provenant d'un animal tel que du sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait de mammifère ou un dérivé io du lait de mammifère. Ledit échantillon peut consister en du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés. Dans des modes de réalisation particulièrement préférés du procédé de purification ci-dessus, ledit échantillon provient d'un animal transgénique pour la protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt humaine. Avantageusement la 15 solution est du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère transgénique pour ladite protéine d'intérêt humaine. Au sens de l'invention, les animaux transgéniques englobent (i) les mammifères non humains tels que les vaches, les chèvres, les lapins, les porcs, les singes, les rats ou les souris, (ii) les oiseaux ou encore (iii) les insectes tels que les moustiques, les mouches ou les vers à soie. 20 Dans certains modes de réalisation préférés, l'animal transgénique pour la protéine d'intérêt humaine est un mammifère transgénique non humain, de manière tout à fait préférée une lapine transgénique pour ladite protéine d'intérêt humaine. Avantageusement, le mammifère transgénique produit ladite protéine d'intérêt humaine recombinante dans ses glandes mammaires, du fait de l'insertion dans son 25 génome d'une cassette d'expression comprenant acide nucléique codant ladite protéine d'intérêt qui est placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression de la protéine transgénique dans le lait dudit mammifère transgénique. Une méthode de production de ladite protéine de la coagulation à domaine 30 GLA humaine dans le lait d'un animal transgénique peut comprendre les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant la protéine d'intérêt, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée 35 dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors la protéine humaine recombinante d'intérêt. Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la io dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par micro-injection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à 15 partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radio-immunologiques spécifiques. D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y 20 limiter les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique). Le procédé de purification de l'invention est également parfaitement adapté à l'obtention d'une protéine de la coagulation à domaine GLA purifiée à partir d'un échantillon de plasma sanguin humain, ou d'une fraction de plasma sanguin 25 humain, par exemple la fraction cryoprécipitée de plasma sanguin humain. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, la protéine de la coagulation à domaine GLA cible est humaine. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'échantillon comprend au moins une protéine de la coagulation à domaine GLA 30 non-humaine. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, ladite protéine de la coagulation à domaine GLA humaine est homologue à ladite protéine de la coagulation à domaine GLA non-humaine. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, ladite protéine de la coagulation à domaine GLA humaine est l'homologue de ladite protéine de la coagulation à domaine GLA non-humaine Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'échantillon de départ peut consister en le matériel brut, soit I `échantillon de plasma sanguin humain, ou une fraction de celui-ci, soit le fluide corporel d'un mammifère non humain transgénique pour la protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt, et qui contient ladite protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt à purifier. Les fluides corporels d'un mammifère non humain transgénique englobent io le lait ou une fraction du lait, par exemple une fraction délipidée du lait ou bien encore une fraction appauvrie en micelles de caséine. Toutefois, le mode de réalisation ci-dessus n'est pas le mode de réalisation privilégié du procédé de purification de l'invention, notamment en raison du risque de colmatage du support d'affinité par les nombreuses protéines présentes dans 15 l'échantillon brut de départ. Dans des modes de réalisation préférés, ledit échantillon de départ consiste en une solution liquide contenant la protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt en suspension dans ladite solution, ladite solution liquide consistant en un produit intermédiaire généré au cours d'un procédé de purification multi-étapes 20 d'une protéine de la coagulation à domaine GLA, par exemple d'une protéine de la coagulation. A titre illustratif, pour un procédé de purification d'une protéine de la coagulation à domaine GLA à partir d'un fluide corporel d'un mammifère non humain transgénique pour ladite protéine, l'échantillon de départ peut consister en 25 un éluat d'une étape de chromatographie d'interaction hydrophobe, telle qu'une étape de chromatographie dans laquelle on utilise un support chromatographique du type MEP HyperCel�. Ce mode particulier de réalisation d'un procédé de purification selon l'invention est illustré dans les exemples. De la même manière, pour un procédé de purification de la protéine de la 30 coagulation à domaine GLA d'intérêt à partir de plasma humain, l'échantillon de départ peut consister en un filtrat d'une étape de filtration en profondeur pratiquée sur la fraction cryoprécipitée d'un échantillon de plasma humain. De manière générale, les conditions d'utilisation du support d'affinité pour réaliser le procédé de purification de l'invention sont très similaires aux conditions 35 d'utilisation conventionnelles d'un support de chromatographie classique, par exemple du type support d'immuno-affinité sur lequel sont immobilisé des anticorps ligands. L'homme du métier peut par exemple se référer à l'ouvrage de Bailon et al. (Pascal Bailon, George K. Ehrlich, Wen-Jian Fung and Wolfgang Berthold, An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press, 2000). Toutefois, comme cela sera détaillé dans la suite de la description, les conditions de l'étape c) d'élution du procédé de l'invention sont très avantageuses, pour la purification d'une protéine de la coagulation à domaine GLA. A l'étape a), un volume approprié de l'échantillon à purifier est mis en contact avec le support d'affinité. Des complexes sont formés entre (i) les aptamères anti-GLA immobilisés sur ledit support d'affinité et (ii) la protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt contenue dans l'échantillon à purifier. Dans des modes de réalisation préférés du procédé, on procède, à la fin de l'étape a), et préalablement à l'étape b) décrite en détail plus loin,à une ou plusieurs étapes de lavage du support d'affinité de manière à éliminer les substances qui ne 15 sont pas retenues de manière spécifique, par exemple les substances simplement adsorbées sur ledit support. On peut utiliser un tampon de lavage conventionnel, bien connu de l'homme du métier. Toutefois, dans certains modes de réalisation de la ou des étape(s) de lavage, on peut utiliser un tampon de lavage comprenant du NaCl (3 M.), et le cas 20 échéant de l'éthylène glycol (1,5 M). On a montré qu'un tel tampon de lavage entraîne des conditions drastiques d'élimination des substances qui ne sont pas retenues de manière spécifique sur les aptamères, tout en préservant la liaison spécifique des molécules de la ou des protéines de la coagulation à domaine GLA aux aptamères immobilisés sur le support d'affinité. On rappelle qu'un tel avantage 25 technique lié à l'élimination exclusive ou quasi-exclusive des substances non liées spécifiquement aux ligands immobilisés sur le support d'affinité ne peut être aisément réalisé avec un support d'affinité sur lequel sont immobilisés des anticorps. L'étape b) consiste en une étape d'élution des molécules de la protéine de la 30 coagulation à domaine GLA d'intérêt ayant formé des complexes avec les aptamères nucléiques anti-GLA au cours de l'étape a). Comme cela est illustré dans les exemples, un avantage spécifique du procédé de purification ci-dessus est la possibilité de réaliser l'étape d'élution par mise en contact des complexes formés entre (i) les aptamères nucléiques anti-GLA immobilisés sur ledit support d'affinité et (ii) ladite protéine de la coagulation à domaine GLA, avec un agent chélateur des ions divalents, comme l'EDTA. Cet avantage technique, qui est rendu possible, grâce aux caractéristiques du support d'affinité de l'invention, permet l'élution de la protéine de la coagulation à domaine GLA sans nécessiter un quelconque recours à l'utilisation de conditions drastiques d'élution, susceptibles de dénaturer, au moins partiellement, la protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt. Lesdites condition drastiques qui sont évitées englobent l'utilisation d'un pH acide pour l'étape d'élution, ce qui est couramment pratiqué pour les procédés de purification de protéines sur les supports d'affinité connus, et tout particulièrement sur les supports d'affinité comprenant des anticorps immobilisés. Ainsi, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l' E DTA. A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM. L'expression � au moins 1 mM � englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM. L'expression � au plus 30 mM � englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM. A l'étape c), on récupère la protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt est purifiée en collectant le liquide d'éluat obtenu à la fin de l'étape b). A la fin de l'étape c), on obtient une composition liquide purifiée de la protéine de la coagulation d'intérêt. Ladite composition liquide purifiée peut ensuite être traitée de manière appropriée, selon toute technique connue de conditionnement et de conservation des protéines, y compris par flaconnage direct ou après dilution avec une solution adaptée, ou encore par lyophilisation, préférentiellement dans des conditions stériles et apyrogènes, puis conservation dans des conditions appropriées, à température ambiante, à -4°C ou bien à basse température, selon le type de conditionnement choisi. Comme cela a déjà été mentionné précédemment dans la présente description, le support d'affinité de l'invention peut, avec les cycles successifs d'utilisation pour la purification d'une protéine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt, subir une réduction de sa capacité d'absorption, par exemple du fait que l'étape c) d'élution ne permet pas systématiquement de libérer la totalité des molécules de protéine de la coagulation, ce qui réduit le nombre de sites aptamères libres pour les cycles ultérieurs de purification. Comme pour la totalité des supports de chromatographie connus, il est donc nécessaire, à des moments appropriés, de réaliser une étape de régénération du support d'affinité, afin de libérer la totalité des molécules de protéine de la coagulation à domaine GLA dudit support, et d'éliminer toute substance pouvant être liée au matériau solide du support d'affinité, en général par fixation non spécifique. io Ainsi, dans certains modes de réalisation, le procédé de purification de l'invention comprend une étape additionnelle d) de régénération du support d'affinité, par mise en contact dudit support d'affinité avec une solution de régénération. Des tampons variés pour la régénération de support de chromatographie, en 15 particulier de supports de chromatographie d'affinité sont bien connus par l'homme du métier, qui peuvent être utilisés à l'étape d) du procédé. L'homme du métier peut se référer par exemple à l'ouvrage de Mohr et al. ( Affinity Chromatography: Practical and Theoretical Aspects, Peter Mohr, Klaus Pommerening, Edition: illustrated, CRC Press, 1985). 20 A titre illustratif, l'étape d) de régénération du support d'affinité peut être réalisée par mise en contact dudit support avec une solution tampon de Tris 20 mM, Polyéthylène Glycol 5%, NaCl 1M, par exemple à pH 7,5, comme cela est illustré dans les exemples. Le procédé de purification ci-dessus permet l'obtention d'une protéine de la 25 coagulation à domaine GLA à un très haut degré de pureté, éventuellement à une degré de pureté supérieur à 99,95% en poids, par rapport au poids total des protéines contenues dans le produit final purifié. Un autre avantage du procédé de purification ci-dessus, en particulier dans les modes de réalisation dans lesquels l'échantillon de départ consiste en un 30 échantillon comprenant la protéine humaine de la coagulation à domaine GLA d'intérêt sous forme recombinante en mélange avec des protéines produites naturellement par le mammifère transgénique non humain, est que la composition finale comprenant la protéine humaine recombinante d'intérêt à haut degré de pureté est sensiblement exempte de protéines provenant dudit mammifère 35 transgénique, et en particulier sensiblement exempte de protéines dudit mammifère, homologues de ladite protéine humaine de la coagulation à domaine GLA recombinante. Comme cela est illustré dans les exemples, on tire parti de l'aptitude des aptamères anti-GLA de l'invention à se lier à une diversité de protéines de la coagulation à domaine GLA, pour purifier simultanément une pluralité de protéines de la coagulation à domaine GLA susceptibles d'être contenues dans l'échantillon de départ, en utilisant un unique support de chromatographie d'affinité. Par exemple, on peut utiliser le procédé de purification d'une protéine de la coagulation à domaine GLA ci-dessus pour la purification simultanée de plusieurs facteurs de la io coagulation à domaine GLA contenus dans l'échantillon de départ, par exemple pour la purification simultanée des facteurs VII, IX et X contenus dans une fraction de cryoprécipité de plasma sanguin humain. La présente invention a aussi pour objet une composition purifiée d'une protéine de la coagulation à domaine GLA humaine recombinante comprenant au 15 moins 99,9% en poids de ladite protéine de la coagulation à domaine GLA humaine recombinante et qui est sensiblement exempte de protéines non humaines. La présente invention est aussi relative à une composition purifiée d'une protéine de la coagulation à domaine GLA humaine recombinante comprenant au moins 99,9% en poids de ladite protéine de la coagulation à domaine GLA humaine 20 recombinante et au plus 0,1 % en poids de protéines non humaines, les pourcentages en poids étant exprimés par rapport au poids total en protéines de ladite composition purifiée. Dans la composition purifiée ci-dessus, � au moins 99,9% � englobe au moins 99,91%, 99,92%, 99,93%, 99,94%, 99,95%, 99,96%, 99,97%, 99,98% et 25 99,99%. Dans la composition purifiée ci-dessus, � au plus 0,1% � englobe au plus 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02% et 0,01%. La présente invention est aussi relative à une composition purifiée telle que définie ci-dessus, utilisable comme médicament. 30 L'invention concerne encore une composition pharmaceutique comprenant une composition purifiée d'une protéine de la coagulation à domaine GLA humaine recombinante telle que définie ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. L'invention a aussi trait à une composition purifiée telle que définie ci-dessus 35 pour le traitement des troubles de la coagulation. L'invention est également relative à l'utilisation d'une composition purifiée telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation. Procédés d'obtention d'aptamères anti-GLA De manière générale, un aptamère anti-GLA selon l'invention peut être obtenu selon un procédé basé sur les principes généraux de la technique appelée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, qui a été initialement décrite notamment dans la demande PCT N° WO 1991/019813). Le io procédé SELEX de sélection des aptamères consiste à mettre en présence une protéine avec une librairie combinatoire d'acides nucléiques, ADN ou ARN (en général 1015 molécules), les acides nucléiques ne se liant pas à la cible sont éliminés, les acides nucléiques se liant à la cible sont isolés et amplifiés par PCR. Le procédé est répété jusqu'à ce que la solution soit suffisamment enrichie avec les 15 acides nucléiques ayant une bonne affinité pour la protéine d'intérêt (Tuerk et Gold, � Systematic evolution of ligands by exponential enrichment : RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase � (1990) Science, 249(4968) :505-10 et Ellington et Szostak, � In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands �, (1990) Nature Aug 30;346(6287):818-22). D'autres exemples de procédé 20 SELEX sont donnés dans les documents EP 0 786 469, EP 668 931, EP 1 695 978, EP 1 493 825 dont les enseignements peuvent être repris dans la réalisation du procédé de sélection d'un aptamère nucléique utilisé selon l'invention. Certaines variantes du procédé SELEX comprennent des étapes de contre-sélection d'aptamères précédemment sélectionnés par liaison à la protéine cible d'intérêt. La 25 ou les étapes de contre-sélection peuvent consister en une étape dans laquelle une collection d'aptamères, qui a été précédemment sélectionnée avec la protéine cible d'intérêt, est mise en contact avec des molécules non-cibles, de manière à éliminer de la collection d'aptamères de départ ceux qui se lient aux molécules non-cibles. La mise en oeuvre d'une telle étape de contre-sélection, dans un procédé 30 d'obtention d'aptamères nucléiques, est susceptible d'accroître la spécificité ou l'affinité des aptamères sélectionnés à la fin du procédé. Un premier procédé pour l'obtention d'un aptamère anti-GLA peut consister en un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un mélange d'acides nucléiques, aussi appelé � collection � d'acides 35 nucléiques de séquences distinctes, b) mettre en contact le mélange d'acides nucléiques fourni à l'étape a), ou le mélange d'acides nucléiques obtenu à la fin de l'étape d) lorsque l'étape b) est répétée, avec une première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, dans des conditions permettant la formation de complexes entre des acides nucléiques dudit mélange avec ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, c) réaliser une séparation entre (i) le ou les acides nucléiques ayant formé des complexes avec ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA et (ii) les acides nucléiques n'ayant pas formé de complexes avec ladite première Io protéine cible de la coagulation à domaine GLA, d) amplifier les acides nucléiques ayant formé des complexes avec ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, de manière à obtenir un mélange ou une collection d'acides nucléiques se liant à ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, 15 e) réitérer les étapes b) à d) un nombre de fois suffisant pour l'obtention d'une collection d'acides nucléiques ayant la capacité de liaison désirée à ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, f) mettre en contact le mélange d'acides nucléiques fourni à l'étape e), ou le mélange d'acides nucléiques obtenu à la fin de l'étape h) lorsque l'étape f) est 20 répétées, avec une seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, dans des conditions permettant la formation de complexes entre des acides nucléiques dudit mélange avec ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, g) réaliser une séparation entre (i) le ou les acides nucléiques ayant formé des 25 complexes avec ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA et (ii) les acides nucléiques n'ayant pas formé de complexes avec ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, h) amplifier les acides nucléiques ayant formé des complexes avec ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, de manière à obtenir 30 un mélange ou une collection d'acides nucléiques se liant à ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, i) réitérer les étapes f) à h) un nombre de fois suffisant pour l'obtention d'une collection d'acides nucléiques ayant la capacité de liaison désirée à ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, lesdits acides 35 nucléiques ayant la capacité à se lier à la fois à ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA et à la seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, j) facultativement, réitérer les étapes f) à i) avec une ou plusieurs autres protéines cibles de la coagulation à domaine GLA distinctes, de manière à obtenir, à la fin du procédé, un mélange ou une collection d'acides nucléiques dits � aptamères anti-GLA � ayant la capacité à se lier aux protéines de la coagulation à domaine GLA. De manière générale, les protocoles détaillés de mise en oeuvre des étapes du procédé ci-dessus peuvent être retrouvés par l'homme du métier dans les nombreuses publications relatives à la technique SELEX, y compris dans les références citées précédemment dans la présente description. Dans certains modes de réalisation du procédé d'obtention d'aptamères anti-GLA ci-dessus, on utilise successivement de 2 à 6 protéines cibles de la coagulation à domaine GLA pour sélectionner des aptamères anti-GLA, c'est-à-dire d'aptamères nucléiques spécifiques des protéines de la coagulation à domaine GLA, mais non-spécifiques d'une protéine de la coagulation à domaine GLA donnée. Dans la pratique, on a montré que l'utilisation, dans le procédé ci-dessus, successivement de deux protéines cibles de la coagulation à domaine GLA distinctes permettait l'obtention d'aptamères anti-GLA. Pour la mise en oeuvre du procédé d'obtention d'aptamères anti-GLA ci-dessus, les protéines cibles de la coagulation à domaine GLA peuvent être choisies dans le groupe constitué du Facteur Il, du Facteur VII, du Facteur IX, du Facteur X, de la protéine C et de la protéine S. L'ordre d'utilisation des protéines cibles n'est pas une caractéristique essentielle du procédé ci-dessus. Selon une alternative, les aptamères nucléiques anti-GLA peuvent être obtenus selon un second procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un mélange d'acides nucléiques, aussi appelé � collection � d'acides nucléiques de séquences distinctes, b) mettre en contact le mélange d'acides nucléiques fourni à l'étape a), ou le mélange d'acides nucléiques obtenu à la fin de l'étape d) lorsque l'étape b) est répétée, avec le domaine GLA d'une première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, dans des conditions permettant la formation de complexes entre des acides nucléiques dudit mélange avec le domaine GLA de ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, c) réaliser une séparation entre (i) le ou les acides nucléiques ayant formé des complexes avec le domaine GLA de ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA et (ii) les acides nucléiques n'ayant pas formé de complexes avec le domaine GLA de ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, d) amplifier les acides nucléiques ayant formé des complexes avec le domaine GLA de ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, de manière à obtenir un mélange ou une collection d'acides nucléiques se liant au domaine GLA de ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, Io e) réitérer les étapes b) à d) un nombre de fois suffisant pour l'obtention d'une collection d'acides nucléiques ayant la capacité de liaison désirée au domaine GLA de ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA, f) mettre en contact le mélange d'acides nucléiques fourni à l'étape e), ou le mélange d'acides nucléiques obtenu à la fin de l'étape h) lorsque l'étape f) est 15 répétée, avec le domaine GLA d'une seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, dans des conditions permettant la formation de complexes entre des acides nucléiques dudit mélange avec le domaine GLA de ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, g) réaliser une séparation entre (i) le ou les acides nucléiques ayant formé des 20 complexes avec le domaine GLA de ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA et (ii) les acides nucléiques n'ayant pas formé de complexes avec le domaine GLA de ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, h) amplifier les acides nucléiques ayant formé des complexes avec le domaine 25 GLA de ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, de manière à obtenir un mélange ou une collection d'acides nucléiques se liant au domaine GLA de ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, i) réitérer les étapes f) à h) un nombre de fois suffisant pour l'obtention d'une collection d'acides nucléiques ayant la capacité de liaison désirée au domaine 30 GLA de ladite seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, lesdits acides nucléiques ayant la capacité à se lier à la fois au domaine GLA de ladite première protéine cible de la coagulation à domaine GLA et au domaine GLA de la seconde protéine cible de la coagulation à domaine GLA, j) facultativement, réitérer les étapes f) à i) avec le domaine GLA d'une ou 35 plusieurs autres protéines cibles de la coagulation à domaine GLA distinctes, de manière à obtenir, à la fin du procédé, une mélange ou une collection d'acides nucléiques dits � aptamères anti-GLA � ayant la capacité à se lier aux protéines de la coagulation à domaine GLA. Dans certains modes de réalisation du second procédé d'obtention d'aptamères anti-GLA ci-dessus, on utilise successivement les domaines GLA provenant de 2 à 6 protéines cibles de la coagulation à domaine GLA pour sélectionner des aptamères anti-GLA.. Pour la mise en oeuvre du second procédé d'obtention d'aptamères anti-GLA ci-dessus, les protéines cibles de la coagulation à domaine GLA dont proviennent les io domaines GLA utilisés peuvent être choisies dans le groupe constitué du Facteur Il, du Facteur VII, du Facteur IX, du Facteur X, de la protéine C et de la protéine S. L'ordre d'utilisation des domaines GLA cibles n'est pas une caractéristique essentielle du procédé ci-dessus. La différence essentielle entre le second procédé d'obtention d'aptamères anti- 15 GLA ci-dessus et le premier procédé d'obtention d'aptamères anti-GLA précédemment décrit réside dans la cible, laquelle consiste en une succession de protéines cibles de la coagulation à domaine GLA dans le premier procédé et consiste en une succession de domaines GLA de protéines de la coagulation à domaine GLA dans le second procédé. 20 Selon l'invention, des aptamères anti-GLA peuvent être obtenus selon un troisième procédé, dont les principes sont identiques au premier et au second procédés décrits ci-dessus, mais dans lequel les substances cibles sont alternativement des protéines de la coagulation à domaine GLA et des domaines GLA de protéines de la coagulation à domaine GLA. L'ordre d'utilisation des 25 protéines de la coagulation à domaine GLA et des domaines GLA de protéines de la coagulation à domaine GLA est aisément déterminé par l'homme du métier, selon en particulier les substances cibles auxquelles cet homme du métier à accès. Les domaines GLA cibles qui sont utilisés dans chacun des second et troisième procédés ci-dessus peuvent être aisément obtenus par l'homme du 30 métier, en particulier dans les situations dans lesquelles la séquence en acides aminés de la protéine de la coagulation à domaine GLA parente, et donc aussi la séquence en acides aminés du domaine GLA considéré, sont connues. Selon certains modes de réalisation, un domaine GLA est obtenu à partir de la protéine de la coagulation à domaine GLA parente, par protéolyse de ladite protéine de la coagulation à domaine GLA, en utilisant une ou plusieurs enzymes protéolytiques adaptées, de spécificité de coupure connue. Selon d'autres modes de réalisation, un domaine GLA est obtenu par des techniques de synthèse peptidique connues en elles-mêmes, sur la base de leur séquence connue en acides aminés, puis par gamma-carboxylation des résidus de glutamine du domaine GLA, à l'aide d'une carboxylase, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, un peptide comprenant le domaine GLA d'une protéine de la coagulation à domaine GLA peut être synthétisé avec un appareil synthétiseur de peptides du type Milligen� 9050 Plus (Perkin Elmer, io Stockholm, Suède, par exemple en utilisant des acides aminés DPfp Fmoc commercialisés par la Société PerSeptive Biosystems� (Framingham, Massachusets, Etats-Unis). Pour l'étape de gamma-carboxylation enzymatique du domaine GLA néo-synthétisé, on peut par exemple utiliser une carboxylase semipurifiée comme décrit par Soute et al. (1987, Thromb Haemostasis, Vol. 57 : 77-81), 15 selon la technique décrite par Wu et al. (1990, J Biol Chem, Vol. 265(22) : 13124-13129). La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants. EXEMPLES 20 Exemple 1 : préparation d'un support d'affinité Le support d'affinité a été réalisé à partir d'un matériau de support solide consistant en une matrice sur laquelle on a greffé de la streptavidine (streptavidinagarose û Novagen�). On a introduit un volume de 1 ml de gel dans une conteneur consistant en 25 une colonne (i.d. 11 mm). On a lavé le gel avec de l'eau purifiée, pour éliminer le solvant de stockage Les caractéristiques du ciel sont : - Capacité d'adsorption de biotine : > 85 nanomole / ml de gel 30 - Test fonctionnel : Capture >99% de thrombine biotinylée en 30 minutes à TA - Autres tests : Protease-free , endo/exonucléase-free, RNase-free. - Conservateur : 100 mM sodium phosphate pH7,5 + NaN3 0,02 La sortie de la colonne conditionnée (� packée �) (Hauteur de lit de gel = 35 1cm) est connectée à un détecteur d'absorbance UV à 254 nm et d'un enregistreur. Les aptamères nucléiques anti-GLA biotinylés de séquence SEQ ID N° 4, aussi appelés aptamères � Mapt-1 � dans la présente description, sont solubilisés dans de l'eau purifiée à la concentration finale de 0,5 mg/0,187 ml, soit une concentration molaire finale de 0,1 mM. La solution d'aptamères nucléiques a été activée à 95°C selon le cycle standard, pour l'immobilisation des aptamères sur le matériau support solide. La solution d'aptamères nucléiques a été préalablement diluée par 4,8 ml d'eau purifiée puis 1,5 ml de tampon concentré de façon à obtenir la formulation suivante : 50mM Tris, 50mM NaCl, MgCl2 4mM, CaCl2 10mM pH= 7,5 Le détecteur d'absorbance est ajusté à 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) et on enregistre la DO à 254 nm de cette solution à 0,575 UA254. La solution d'aptamères nucléiques biotinylés est injectée sur le gel streptavidin-agarose pré-conditionnée (� prépackée �) et mise en recirculation avec une pompe péristaltique à un débit de 2,5 ml/minute, soit un temps de contact sur le gel de 24 secondes (entrée/sortie E/S). Dans ces conditions, la DO à 254 nm se stabilise rapidement à 0,05 UA254, soit une valeur de 91% de couplage théorique, c'est-à-dire 0,455 mg d'aptamères nucléiques par millilitre de gel. Un lavage avec un tampon NaCl 2M est réalisé, afin d'éliminer les aptamères nucléiques qui ne sont pas fixées spécifiquement aux molécules de streptavidine greffées sur le matériau de support solide. Exemple 2 : Purification d'une protéine de la coagulation à domaine GLA Plasmatique (Facteur IX humain plasmatique) On a utilisé un support d'affinité du type décrit à l'exemple 1 pour purifier du Facteur IX humain plasmatique. A. Procédé de chromatographie A.1. - Caractéristiques de la matière première (MP) Facteur IX :C : 204 IU/ml Protéines totales : 0,5 g/I A.2. - Préparation de la matière de départ (MD) - 0,920m1 MP dilué dans 5ml de tampon d'équilibration / - Facteur IX :C : 37,5 IU/ml 15 20 25 - Protéines totales : 0,092 g/I - pH : 7,43 - Osmolalité : H2O 231 mOsmol/Kg A.3. ù Chargement - 1 UI de FIX = 4,4 iig. - Volume injecté ù 2 g - Chargement FIX en UI par ml de gel : 75 Ul/ml de gel 10 - Chargement FIX en pg par ml de gel : 300 pg/ml de gel A.4. - Caractéristiques des tampons de chromatographie - Tampon d'Equilibration : 50mM Tris, 50mM NaCl, 10mM CaCl2, 4mM MgCl2, pH 7,5, 218 mOsmol/kg - Tampon Elution 1 : 20mM Tris, 10mMEDTA, pH 7,5, 47 mOsmol/kg - Tampon Elution 2 (Régénération) : 20mM Tris, 1M NaCl, 50% Propylène glycol , pH 7,5 A.5. - Suivi des étapes de chromatographie Tampons Fractions Débit Poids Pic pH Osmolalité MI/min g AU mOsmol/Kg Equilibration MD 0,1 2 NA 7,43 231 Equilibration NR 0,1 6,04 0,01 7,40 222 Elution 1 El 0,5 4,17 0,02 6,02 120 Elution 2 E2 0,5 3,61 0,01 7,38 NA B. Caractérisation des produits purifiés B.1. Electrophorèse SDS-PAGE 36 5 15 Les résultats d'un essai d'électrophorèse sur gel SDS-PAGE sont illustrés sur la Figure 1. Sur la ligne 3, on observe que la fraction d'élution (El) contient une seule bande de Facteur IX humain plasmatique purifié. B. 2 - Bilan en protéines totales, en FIX :C, FIX :Ag et FIX :Am Les dosages des protéines totales ont été réalisés par le laboratoire Tébu Bio. Les déterminations du taux de FIX :C ont été réalisées par le LBA et ceux de FIX :Ag et FIX :Am par le LIB. Coag Protéine Purification Etapes [ FIX Q R [Protéine] Q R AS Pureté Gain :C] FIX FIX:C (g / I) Protéine Protéine (UI/mg) de (UI / :C (%) (g) (%) pureté ml) (UI) MD 26,8 53,6 100,0 0,125 0,3 100,0 214 94 / NR 1,6 9,7 18,0 0,024 0,1 58,0 67 29 0,3 E1 5,6 23,4 43,6 0,019 0,1 31,7 295 130 1,4 Am Ag Ratio Etapes [ FIX Q FIX R [ FIX Q FIX R [C]/[Ag] [Am]/[Ag] [C]/[ :Am] :Am FIX:Am :Ag] :Ag FIX:Ag Am] (UI / (UI) (%) (UI / (UI) (%) ml) ml) MD 32,3 64,6 100 24,0 48 100 1,1 1,3 0,8 NR 1,1 6,5 10 1,6 10 20 1,0 0,7 1,5 E1 8,3 34,8 54 4,8 20 42 1,2 1,7 0,7 B.3 - Conclusions Cet essai de chromatographie d'affinité sur Aptamère Mapt-1 (SEQ ID N° 4) a été réalisé pour vérifier l'intégrité du support d'affinité et la capacité du ligand à fixer le facteur IX. Il s'agit du second essai réalisé dans les mêmes conditions chromatographiques à partir d'un échantillon de facteur IX pré-purifié sur Superdex 75. Le ratio du taux de facteur IX :C / Ag de l'éluat est de l'ordre de 1, les conditions opératoires appliquées lors de la chromatographie n'ont pas occasionné de 5 dégradation de la molécule de FIX. Une quantité de 20% du facteur IX est récupéré dans la fraction non adsorbée du gel ce qui indique probablement une saturation du gel et l'utilité de réduire la quantité d'échantillon de départ pour le chargement du support d'affinité. L'élution avec 20mM de Tris et 10mM EDTA donne un rendement de 44% de FIX 10 avec un gain de pureté de l'ordre de 1,4 par rapport à la matière de départ. Dans d'autres essais, on a obtenu un rendement de 71% (résultats non présentés). Exemple 3 : Purification d'une protéine de la coagulation à domaine GLA 15 recombinante (Facteur IX humain transgénique) On a utilisé un support d'affinité du type décrit à l'exemple 1 pour purifier du Facteur IX humain recombinant produit dans le lait de porcs transgéniques pour le Facteur IX humain. 20 A. Protocole de purification par chromatographie d'affinité Les caractéristiques de mise en oeuvre de l'étape de chromatographie d'affinité de l'échantillon de départ sur un support d'affinité sur lequel sont immobilisés les aptamères anti-GLA Mapt-1 sont décrites dans les tableaux ci-dessous. 25 Etape 1 : Clarification Clarification au citrate pour d'obtenir du lait clarifié à pH 7,5 à 0,25M final de tampon citrate 30 Etape 2 : MEP hypercel MD : lait clarifé (IBF 25 ù 10mI de gel) Chargement en FIX : 243 UI/ml de gel Tampon équilibration : 0,25M Citrate pH7,5 Tampon élution : eau 35 Etape 3 : Dialyse MD : Eluat MEP Tampon de dialyse : 50 mM Tris û 50 mM NaCl pH 7,5 Etape 4 : MAPT-1 (3 run) MD : Eluat MEPdialysé (IBF1,1 û 1 ml de gel) Chargement en FIX : 230 Ul/ml de gel Tampon équilibration : 50 mM tris û 50 mM NaCl û 4 mM MgCl2 û 10 mM CaCl2 pH 7,5 Tampon élution : 20 mM Tris û 10 mM EDTA pH 7,5 Tampon régénération : 20 mM tris û 1 M NaCl û 5% PG pH 7,5 B. Caractéristique de la matière première (MP) La matière première mise en oeuvre consiste en un lait brut de cochon transgénique pour le Facteur IX humain. C. Suivi du process C.1. Etape 1 : Clarification C.1.1. - Suivi de la clarification - Décongélation de EO à 37°C - Mélange d'un aspect très laiteux : 45g (2/3) Lait de porc + 25g (1/3) de tampon citrate concentré à 0,75M - Agitation douce de 30 min à température ambiante - Centrifugation 30 min, 15°C, 5 000g _ Culot : petit et blanc contenant les poils de porc et les impuretés Surnageant : deux phases, la phase supérieure solide crémeuse et blanche constituant les corps gras et la phase jaunâtre qui représente le lait clarifié(E1). - Récupération à la pompe du lait clarifié - Filtration profondeur du lait clarifié avec un filtre Cuno BioCap 25 Filter - Congélation à -80°C du lait filtré clarifié (E2) C.1.2 - Bilan en protéines totales, en FIX :C, FIX :Aq et FIX :Am Les résultats sont présentés dans les tableaux 4 et 5 ci-dessous.35 Tableau 4 Coagulation Protéines totales Purification Etape Code Poids [ Q R [Prot] Q R AS Pureté Gain (g) FIX FIX FIX:C (g 1) Prot. Prot. (UUmg) de :C] :C (%) les (%) pureté (UI (UI) (g) / ml) Lait brut EO 45,0 57,2 2574 100,0 103,2 644 100,0 0,6 0,2 Lait El 65,3 36,0 2350 91,3 37,5 2451 52,8 1,0 0,4 1,7 clarifié avant filtration Lait E2 63,8 38,2 2438 94,7 34,7 2214 47,7 1,1 0,5 2,0 clarifié Tableau 5 Amidolytique Antigénique Ratio Code [FIX Q R [ FIX Q FIX R [C]/[Ag] [Am]/[Ag] :Am] FIX FIX: Am :Ag] :Ag FIX: Ag (UI/ :Am (%) (UI/ (UI) (%) ml) ml) (UI) EO 40 1798 100 147 6 100,0 0,4 0,3 615,0 El 23 1 510 84 114 7 443,1 112,5 0,3 0,2 E2 22 1426 79 95 6 91,6 0,4 0,2 062,0 C.2. Etape 2 : MEP hypercel lo C.2.1. - Caractéristiques du support de chromatographie - Colonne : IBF 25, 2,5 cm de hauteur - Gel : MEP 10mI de gel, lot 200920/G206-04 - Nb d'utilisation : 2ème utilisation - Régénération du gel avant l'utilisation : 1VC NaOH 1M ; 2VC NaCl 2M ; 4VC eau 15 C.3.2 - Préparation de la matière de départ (MD) - Décongélation de E2 à 37°C 5 - Référence : 1 UI de FIX = 4pg/ml - Volume injecté (g) : 63,81 - Chargement FIX en UI par ml de gel (Ul/ml gel) : 243 Ul/ml de gel - Chargement FIX en pg par ml de gel (pg/ml gel) : 972 pg/ml de gel C.2.3 - Caractéristiques des tampons de chromatoqraphie - Tampon d'équilibration : 0,25M Citrate, pH 7,5, 612 mOsmol/kg, 31,9 mS/cm Tampon d'élution MEP : eau lo C.2.4 - Suivi des étapes de chromatoqraphie Tableau 6 Code Etape Débit Poids Pic pH Osmolarité Conducti. Observations ml/min g AU mosmol/Kg mS/cm E2 MD 0,85 63,81 NA 7,43 231 31,9 NA E3 NR 0,85 139,61 2 7,45 719 32 Saturation E4 E MEP 1 51,68 2 7,81 121 7,11 Saturation 15 Régénération du gel avant l'utilisation : 10VC NaOH 1M ; 4VC NaCl 2M ; 10VC eau ; 10VC éthanol 20%. C.2.5. Bilan en protéines totales 20 Tableau 7 Coagulation Protéines totales Purification Etapes Code Poids [FIX :C Q R [Prot] Q R AS Pureté Gain (g) ] FIX :C FIX :C (g / 1) Prot. Prot (UUm de (UI/ml) (%) (%) (g) .(%) g) pureté Lait E2 63,8 38,2 2 438 100,0 34,7 214 2 100, 1,1 0,5 / clarifié 0 Non E3 139,6 3,1 433 17,8 8,4 1 53,1 0,4 0,2 0,3 adsorbé 175,4 Elution E4 51,7 20,3 1049 43,0 3,6 186,6 8,4 5,6 2,5 5,1 MEP Eluat MEP E5 51,1 14,5 741 30,4 3,3 169,1 7,6 4,4 1,9 4,0 10 dialysé Tableau 8 Amidolytique Antigénique Ratio Code [ FIX Q R [ FIX Q R [C]/[Ag] [Am]/[Ag] :Am] FIX FIX: Am :Ag] FIX FIX: Ag (UI/ :Am (%) (UI/ :Ag (%) ml) (UI) ml) (UI) E2 22 1 426 100 95 6 100,0 0,4 0,2 062,0 E3 1 148 10 ND ND ND ND ND E4 9 484 34 47 2 40,1 0,4 0,2 429,0 E5 9 455 32 45 2 37,9 0,3 0,2 1,6 298,6 C.3. Etape 3 : Dialyse Dialyse d'E4 (50 g) dans 2 bains de 1 L, toute la nuit sous agitation à 4°C Tableau 9 Echantillons Fractions Poids pH Osmolarité Conductivité g mosmol/Kg mS/cm E4 Avant dialyse 49,18 7,81 121 7,11 E5 Après dialyse 51,08 7,81 149 7,18 Tampon dialyse 7,50 157 7,52 50 mM Tris ù 50 rnM NaCl C.4.: Chromatographie sur support d'affinité avec aptamères anti-GLA (Mapt-1) Trois essais indépendants de purification de Facteur IX humain transgénique pré-purifié comme décrit ci-dessus ont été réalisés. Les conditions opératoires et les 15 résultats de chacun des essais sont détaillés ci-après. 25 30 C.4.1 - Caractéristiques du support de chromatoqraphie - Colonne : IBF 1,1 , 0,9 cm de hauteur - Gel : MAPT-1, 1 ml de gel - Nb d'utilisation 2ème utilisation C.4.2 - Préparation de la matière de départ (MD) - Ajustement en pH et ajout de 4mM MgCl2 et 10mMCaCl2 final dans E5 - Répartition de E5 (48,17g) répartie en 3*16g dont deux sont mis à -80°C pour les lo essais suivants - Référence : 1 UI de FIX = 4pg/ml - Volume injecté (g) : 16,14 - Chargement FIX en UI par ml de gel (Ul/ml gel) : 234 Ul/ml de gel - Chargement FIX en pg par ml de gel (pg/ml gel) : 936 pg/ml de gel 15 C.4.3. Caractéristiques des tampons de chromatoqraphie - Tampon d'équilibration : 50mM Tris, 50mM NaCl, 10mM CaCl2, 4mM MgCl2, pH 7,51, 218 mOsmol/kg, 10,77 mS/cm - Tampon d'élution 1 : 20mM Tris, 10mMEDTA, pH 7,53, 56 mOsmol/kg, 2,64 20 mS/Cm - Tampon d'élution 2 (tampon de régénération) : 20mM Tris, 1M NaCl, 50% Propylène glycol, pH 7,52, 18,27 mS/cm. C.4.4. Suivi des étapes de chromatoqraphie Essai 1 - Colonne équilibrée à pH 7,34 et 211 mOsm/Kg - Chargement en FIX 234 Ul/ml de gel, Tableau 10 Echantillons Fractions Débit Poids Pic pH Osmolarité Conducti. Observations ml/min g AU mosmol/Kg mS/cm E5 MD 0,6 16,14 na 7,51 181 8,18 na E6 NR 0,6 29,56 0,5 7,44 193 9,03 Saturation E7 El 0,6 6,68 0,02 6,40 99 na Diminution MAPT-1 de pH 5 15 E8 E2 0,6 6,66 0,1 7,41 na na na MAPT-1 Essai 2 - Colonne équilibrée à pH 7,39 et 220mOsm/Kg, Sème utilisation du gel - Chargement en FIX 236 Ul/ml de gel Tableau 11 Fractions Débit Poids Pic pH Osmolarité Observations 315 256 ml/min g AU mosmol/Kg MD 0,1 13,50 na 7,42 179 Na NR 0,1 20,29 0,5 7,36 197 Saturation El MAPT- 0,1 2,84 0,02 7,06 187 Diminution 1 de pH E2 MAPT- 0,1 3,77 0,1 6,39 na Diminution 1 de pH 10 Essai 3 - Colonne équilibré à pH 7,45 et 219mOsm/Kg, 5ème utilisation du gel - Chargement en FIX 210 Ul/ml de gel Tableau 12 Fractions Débit Poids Pic pH Osmolarité Observations 315 258 ml/min g AU mosmol/Kg MD 0,6 12,71 na 7,47 180 na NR 0,6 23,79 0,5 7,46 206 Saturation El MAPT- 0,6 2,67 0,02 6,94 168 Diminution 1 de pH E2 MAPT- 0,6 4,20 0,1 7,36 na na 1 20 C.4.5. Bilan en protéines totales, en FIX :C, FIX :Aq et FIX :Am 10 15 Les dosages des protéines totales ont été réalisés par le laboratoire Tébu Bio. Les déterminations du taux de FIX :C ont été réalisées par le LBA et ceux de FIX :Ag et FIX :Am par le LIB. C.4.5.1 Résultats chromatographie d'affinité de l'Essai 1 Tableau 13 Coag Protéine Purification Etape Code Poids [ Q R [Prot. Q R AS Pureté Gain (g) FIX FIX FIX:C Totales] Prot.totales Prot. (UUmg) de :C] :C (%) totales pureté (UI / ml) (%) Injection E5 16,1 14,5 234 100,0 3,310 53,4 100,0 4,4 1,9 / Non adsorbé E6 29,6 8,9 263 112,4 1,360 40,2 75,3 6,5 2,9 1,5 Elution 1 E7 6,7 0,50 3,3 1,4 0,015 0,1 0,2 33,3 14,7 7,6 Tableau 14 Am Ag Ratio Code [FIX Q FIX R [FIX Q FIX R [C]I[Ag] [Am]I[Ag] :Am] :Am F1X:Am :Ag] (UI :Ag F1X:Ag (UI / ml) (UI) / ml) (UI) (%) (%) E5 9 143,6 100,0 45 726,3 100,0 0,3 0,2 E6 2,7 78,6 54,7 26 768,6 105,8 0,3 0,1 E7 0,2 1,1 0,7 0,238 1,6 0,2 2,1 0,7 C.4.5.2. Résultats chromatographie d'affinité de l'Essai 2 Tableau 15 Coag Protéine Purification Etape Code Poids [ F1X Q R [Prot. Q R AS Pureté Gain (g) :C] FIX FIX:C Totales] Prot.totales Prot. (UUmg) de (UI / :C (%) totales pureté ml) (%) Injection MD 13,5 17,5 236 100,0 3,110 42,0 100,0 5,6 2,5 / Non adsorbé NR 20,3 8,7 177 74,7 1,940 39,4 93,8 4,5 2,0 0,8 5 IO Elution 1 El 2,8 0,32 0,91 0,4 0,007 0,0 0,0 45,7 20,1 8,1 Tableau 16 Am Ag Ratio Code [ F1X : An)] Q FIX R [ F1X Q FIX R [C]/[Ag] [Am]/[Ag] (UI / ml) :Am F1X:Am :Ag] (UI :Ag FIX: Ag (UI) / ml) (UI) (%) (%) MD 9,4 127,4 100,0 45,0 607,5 100,0 0,4 0,2 NR 5 100,4 78,8 25,0 507,3 83,5 0,3 0,2 El 0,1 0,4 0,3 0,2 0,6 0,1 1,6 0,7 C.4.5.3. Résultats chromatographie d'affinité de l'Essai 3 Tableau 17 Coag Protéine Purification Etape Code Poids [ Q R [Prot. Q R Prot. AS Pureté Gain (g) F1X F1X F1X:C Totales] Prot.totales totales (UlImg) de :C] :C (%) (%) pureté (UI/ ml) Injection MD 12,7 16,5 210 100,0 4,430 56,3 100,0 3,7 1,6 / Non adsorbé NR 23,8 8,0 190 90,8 2,130 50,7 90,0 3,8 1,7 1,0 Elution 1 El 2,7 1,8 4,8 2,3 0,011 0,0 0,1 163,6 72,1 43,9 Tableau 18 Am Ag Ratio Code [FIX Q FIX R [FIX Q FIX R [C]/[Ag] [Am]/[Ag] [C]/[ :Am] :Am FIX:Am :Ag] (UI :Ag F1X:Ag Am] (UI / ml) (UI) (%) / ml) (UI) (%) MD 9,4 119,1 100,0 47 597,4 100,0 0,4 0,2 1,8 NR 4,4 105,6 88,7 23 547,2 91,6 0,3 0,2 1,8 El 0,5 1,4 1,2 0,80 2,1 0,4 2,3 0,7 3,3 Exemple 4: Purification de diverses protéines à domaine GLA avec un support d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères anti-GLA Dans l'exemple 4, on a montré qu'un support d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères anti-GLA est utilisé avec succès pour la purification d'une variété de protéines de la coagulation à domaine GLA. Plus précisément on montre dans l'exemple 4 qu'un support d'affinité sur io lequel sont immobilisés des aptamères anti-GLA Mapt-1 retient sélectivement le Facteur VII, le Facteur IX et le Facteur X. 5.1.1. Conditions expérimentales Mesure de Binding :Appareil Biacore T100 15 - Puce : Mapt-1 immobilisé sur surface streptavidine (Chip SA, GE) à 3596 RU sur la flow cell active n°2 (FC2). Tampon de course et de dilution des échantillons : Tris 50mM / NaCl 50mM /CaCl2 10mM/ MgCl2 4mM/ pH = 7,4 - Flux : 30�I/min injection pendant 60sc, dissociation pendant 120 sc - Signal : Signal sur Fc2 avec soustraction du signal de la Flow cell n° 1 restée 20 vierge - Régénération : EDTA 10mM dans Tris 50mM pH= 7,4 5.1.2. Résultats Les résultats sont représentés sur la Figure 2 . 25 La Figure 6 montre que le support d'affinité Mapt-1 retient sélectivement une variété de protéines à domaine GLA, en l'occurrence une variété de protéines humaines de la coagulation à domaine GLA comme le Facteur VII, le Facteur IX et le Facteur X. REVENDICATIONS1. Procédé pour la purification de protéines de la coagulation à domaine GLA comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon contenant une ou plusieurs protéines de la coagulation à domaine GLA avec un support d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques se liant spécifiquement aux protéines de la coagulation à domaine GLA, afin de former des complexes entre (i) lesdits aptamères nucléiques et (ii) ladite ou lesdites protéine(s) de la coagulation à domaine GLA, b) libérer la ou les protéine(s) de la coagulation à domaine GLA à partir des complexes formés à l'étape a), et c) récupérer ladite ou lesdites protéine(s) de la coagulation à domaine GLA sous une forme purifiée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits aptamères nucléiques consistent en des aptamères désoxyribonucléiques. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que lesdits aptamères nucléiques sont inclus dans la structure d'un composé de formule (I) suivante : [IMM]X-[SPAC]ÿ [APT] (I), dans laquelle : - [IMM] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, - [APT] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à une protéine à domaine GLA, - x est un entier égal à 0 ou 1, et - y est un entier égale à 0 ou 1. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite protéine de la coagulation à domaine GLA est un facteur de la coagulation vitamine K dépendant. 15 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite protéine de la coagulation à domaine GLA est choisie parmi le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X, la protéine C et la protéine S. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, pour purifier simultanément au moins deux protéines de la coagulation à domaine GLA choisies parmi le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X, la protéine C et la protéine S. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, pour purifier simultanément au 10 moins trois protéines de la coagulation à domaine GLA choisies parmi le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X, la protéine C et la protéine S. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, pour purifier simultanément le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX et le facteur X. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que lesdits aptamères nucléiques consistent en des aptamères de séquence SEQ ID N° 4 ou de séquence SEQ ID N° 3. 20 10. Aptamère nucléique se liant spécifiquement aux protéines à domaine GLA, comprenant l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 4 ou l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 3. 11. Aptamère nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste 25 en un aptamère désoxyribonucléique. 12. Support d'affinité sur lequel est immobilisé un aptamère nucléique selon l'une des revendications 10 et 11.