Brevet FR2949788A1 — publié le 20110311

La présente invention a comme objet de nouveaux marqueurs spécifiques et un procédé pour la détection et l'identification rapide du sérogroupe de bactérie Legionella pneumophila, en particulier du sérogroupe 1, notamment à partir d'échantillon d'eau ou d'air. L'invention comprend également des kits de diagnostic permettant de mettre en oeuvre ces procédés. Legionella est une bactérie de l'environnement responsable de la légionellose et de la fièvre de Pontiac. La légionellose est une maladie infectieuse à source environnementale due à l'inhalation de microgouttelettes contenant Legionella pneumophila (Lp) ou rarement une Legionella spp. Les données épidémiologiques indiquent que seuls certains isolats sont capables de provoquer des cas cliniques. L'espèce L. pneumophila semble avoir une virulence plus importante que les autres espèces, en étant responsable de 90 % des cas de légionellose. Au sein de cette espèce, parmi les 15 sérogroupes (Sg), les isolats de Sg 1 sont associés à 80 % des cas (9, 10, 17). La légionellose est aussi une maladie nosocomiale avec une centaine de cas identifiés en 2005 dans des établissements de soin ou des maisons de retraite (4). L'habitat naturel des légionelles est l'environnement hydrique. Elles sont présentes dans 90 % des prélèvements des eaux des lacs et des rivières et 70-80 % des eaux des circuits de distribution d'eau des villes (8). La maîtrise du risque légionelle repose sur la maîtrise de la qualité de l'eau des différentes sources environnementales possibles (réseaux d'eau chaude sanitaire, tours aéroréfrigérantes, spa, ...). De ce fait, la détection des légionelles dans les réseaux hydriques, en particulier les réseaux collectifs d'eau chaude et des systèmes de climatisation des hôtels, résidences et hôpitaux est extrêmement importante. Cette surveillance permet de définir le risque de légionellose en fonction du taux de contamination afin d'entreprendre des actions correctrices, mesures qui n'en seraient que mieux appréhendées et prises si l'espèce et le sérogroupe (Sg) étaient connus par une seule et même technique. A ce jour, aucun test rapide de surveillance des réseaux d'eau, et un seul test chez les patients, la détection des antigènes urinaires, permet l'identification des légionelles à l'échelle du Sg. De plus, le test urinaire employé en clinique ne met en évidence que le Sg 1, les autres Sg n'étant pas détectés. Les méthodes actuelles de typage du Sg nécessitent d'obtenir au préalable la souche bactérienne par culture. Vu la dominance du Lp Sg 1 dans les infections humaines, il est important de pouvoir identifier les espèces présentes dans les réseaux ainsi que de déterminer le Sg rapidement et de manière fiable. L'amélioration des procédures de typage peut donc être considérée comme une priorité en santé publique et pour l'industrie liée à l'eau. La surveillance de la qualité de l'eau repose actuellement sur la recherche et le dénombrement des légionelles par culture selon, en France, une norme AFNOR NF T90-431 �Recherche et dénombrement de Legionella spp et Lp, méthode par ensemencement direct et après concentration par filtration sur membrane ou centrifugation�. Cette technique est longue et fastidieuse (3 à 10 jours). Son rendement est très fluctuant d'un laboratoire à l'autre et d'un échantillon à l'autre (2). Elle utilise des milieux de culture (BCYE et GVPC) qui sont adaptés à la souche de Lp Philadelphia-1 isolée lors de la première épidémie de légionellose (9). Cependant, nos résultats récents montrent que des souches de Lp fraîchement isolées de l'environnement ou des prélèvements biologiques ont un taux de croissance sur ces milieux différent, souvent plus lent, de celui de la souche de Lp Philadelphia 1. D'autre part, les échantillons d'eau contiennent souvent plusieurs souches de Legionella (8). La technique d'identification par culture ne permet de typer que quelques colonies ce qui implique que des colonies de Lp Sg 1 peuvent échapper à cette technique de détection. Depuis quelques années des techniques de recherche des légionelles par PCR dans l'eau se sont développées (1, 15, 16). Cependant ces techniques moléculaires sont parfois difficilement reproductibles d'un laboratoire à l'autre (13). Les réactifs utilisés doivent être exempts d'ADN de légionelle ce qui est un problème spécifique de cette bactérie ubiquitaire dans l'eau (14). Ces différentes études montrent qu'il existe une corrélation entre la culture et la PCR mais que les résultats en unité génome sont souvent supérieurs aux résultats en UFC. Ils existent de nombreux échantillons positifs en PCR et négatifs en culture sans qu'il soit possible de savoir si cela est dû à des amplifications non spécifiques, à la présence dans l'échantillon d'ADN de bactéries mortes ou à la présence de bactéries viables mais non cultivable. Dans ce dernier cas, la PCR légionelle serait meilleure que la culture pour identifier un risque potentiel sanitaire. Des réactifs de PCR quantitative en temps réel ont été développés ces dernières années par plusieurs industriels (Biorad�, Applied biosystem�, Genesystem�, AES chemulex�, ...) permettant une standardisation selon une norme expérimentale AFNOR XP T90-471 élaborée en France. Cependant, aucune technique actuellement proposée ne permet d'identifier Lp de Sg 1 par PCR ou par hybridation in situ. Il reste donc à pouvoir disposer d'un marqueur spécifique de Legionella pneumophila du sérogroupe 1. L'identification de ces gènes marqueurs permettrait le développement de nouveaux outils pour le typage des souches de Legionella basés sur la PCR, ou la PCR en temps réel, ou encore directement par hybridation in situ à l'aide de sondes marquées afin de détecter et/ou d'identifier Lp Sg 1, notamment parmi d'autres légionelles, dans l'environnement, à l'hôpital ou chez le patient. Les caractéristiques nouvelles de ces outils de typage devront être : - Haut pouvoir de discrimination et de spécificité entre ce sérogroupe 1 de Legionella pneumophila et les autres espèces et sérogroupes de légionelles ; et - Rapidité et simplicité d'utilisation. Ceci est justement l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont pu mettre en évidence que la séquence du gène wzm de Legionella pneumophila, en particulier certains fragments de ce gène, était non seulement bien conservée au sein du sérogroupe 1 de Legionella pneumophila, mais permettait également de les distinguer au sein des légionelles et en particulier parmi les autres sérogroupes de bactéries de l'espèce Legionella pneumophila. Ainsi, les inventeurs ont pu démontrer qu'il était possible de détecter et d'identifier la présence spécifique de bactéries Legionella pneumophila du sérogroupe 1 dans un échantillon en utilisant comme marqueur spécifique la séquence de ce gène ou un de ses fragments. Lors de cette étude, les inventeurs ont également pu mettre en évidence la présence de marqueurs spécifiques d'autres sérogroupes de bactéries Legionella 25 pneumophila ainsi que de bactéries de l'espèce Legionella longbeachae. Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation de la séquence nucléique du gène wzm (ABC transporter of LPS 0-antigen) de Legionella pneumophila, sa séquence complémentaire ou inverse, ou l'un de leurs fragments, 30 comme marqueur spécifique pour la détection et/ou l'identification d'une bactérie appartenant à l'espèce Legionella pneumophila sérogroupe 1 (L. pneumophila Sgl). En particulier, il est préféré ici l'utilisation d'une séquence du gène wzm choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence du gène wzm de Legionella pneumophila, souche Paris (NCBI séquence référence : NC 006368.1 datée du 26 avril 2009, � locus tag 1pp0837 � de séquence SEQ ID NO: 1 ci-après) ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides, de préférence 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200 ou 250 nucléotides d'une séquence telle que définie en a) ; c) la séquence d'un variant du gène wzm, présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,25%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 99,4 %, 99,5 %, 99,6, 99, 7 %, 99,8 %ou 99,9 % avec la séquence SEQ ID NO: 1, la séquence de ce variant comprenant au moins la séquence conservée que l'on souhaite détecter et/ou identifier pour une bactérie L. pneumophila Sgl ou comprenant au moins une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 98 %, de préférence 98,25%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 99,4 %, 99,5 %, 99,6, 99, 7 %, 99,8 %ou 99,9 % avec ladite séquence conservée ; d) la séquence complémentaire ou inverse d'une séquence telle que définie en a), b) ou c). SEQ ID NO:l 1 atgacctcaa tatcctcaaa aactcagacg tttaaagaaa cagtagtcta tggagttgat 61 aagtttaggc ttttagctgt tttaagaaat atatgggatt accgcttgct tttatggatt 121 ttttgtaaac gagatctcaa agggcgttac agtcaaacca tcttgggatt gggttgggtt 181 attttaactc ctttgattac ggttggggtg tttgtcattg tttttggcat catgataaag 241 gtacctaccg atgggctgcc tactgtcatg ttctatttgg ttgcggttat accttggtat 301 tcctttttaa atgttctcaa cccttccata caaatgattg agggaaatgc ttcgttaata 361 acaaaggtct attttccaag agcgttgata ggcggtgcct atgctatggg agctgcggtt 421 gattttctga tggcttatgt gtttttgata accccctttg caatttatta tggcctttgg 481 tctatcaagt tattaattat tatgccattc ctgctgatat ctaccttaat gattggatta 541 ggtattggtt tggttttagc acctatcaat gcaaaatata gggatattaa acattttatg 601 cctctggctt tgcagttatt ttattactcc actccagcga tttaccctgt ttctgctgtg 661 cctgtgtggg ctaaaccatg gtatgctgtt aatccattat ctcttgttat caccagttat 721 cgagaggtgt taatggggca ttggccatca cctactataa taatgacatt atctggtatg 781 gcaattataa ctttccttgt ggggcttgtt gcatttcatc acatggagca taaggtagtt 841 gatattttat ga Par la séquence conservée du gène wzm que l'on souhaite détecter et/ou identifier pour une bactérie L. pneumophila Sgl ou l'un de ses variants naturels, on entend désigner ici une séquence consensus partielle du gène wzm commune à l'ensemble des bactéries du groupe L. pneumophila Sgl ou l'un de leurs variants. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 (L. pneumophila Sgl) dans un échantillon selon l'invention est caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étape de détection ou d'identification de la présence d'une séquence d'une région conservée du gène wzm pour les bactéries appartenant au sérogroupe 1 de l'espèce Legionella pneumophila, en particulier d'un fragment conservé de la séquence SEQ ID NO: 1, ou la séquence de l'un de ses variants. Parmi ces fragments conservés, on préfère encore : - un fragment d'au moins 20 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200 ou 250 nucléotides consécutifs, de la séquence nt 99-392 de la séquence SEQ ID NO: 1 ; - un fragment d'au moins 20 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 25, 30, 35, 40, 50 ou 75 nucléotides consécutifs, de la séquence nt 138-214 de la séquence SEQ 20 ID N0: 1. Selon un mode de réalisation préféré, dans le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl dans un échantillon selon l'invention, ledit échantillon est un échantillon liquide ou d'air susceptible d'être 25 contaminé par une bactérie du genre Legionella, notamment de l'espèce L. pneumophila, en particulier d'une bactérie appartenant au sérogroupe 1 (L. pneumophila Sgl). Dans un mode de réalisation préféré, dans le procédé de détection ou 30 d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon la présente invention, ledit échantillon analysé est un échantillon d'eau, notamment émanant de circuit de distribution d'eau, par exemple mais sans s'y limiter de l'eau des villes, de source, de rivière ou de lac, de circuit de refroidissement, comme par exemple mais sans s'y limiter de système de refroidissement par pulvérisation ou ruissellement d'eau pouvant générer des aérosols susceptibles d'être inhalés. On préfère aussi les procédés de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon l'invention caractérisés en ce que ledit échantillon est un échantillon d'air. Dans un autre mode de réalisation préféré, le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon la présente invention comprend une étape d'amplification d'un ADN isolé à partir dudit échantillon, cette étape mettant en oeuvre un couple d'amorces dont chacune des séquences est capable de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation standard avec ladite séquence d'une région conservée du gène wzm, avec sa séquence complémentaire ou l'un de leurs fragments d'au moins 15 nucléotides, de préférence d'au moins 17, 20, 22, 25 et 30 nucléotides de cette séquence conservée. En général, les séquences nucléiques utilisables ici comme amorces sont les amorces qui peuvent être déduites des séquences nucléotidiques conservées que l'on souhaite amplifier dans l'échantillon. Pour les séquences de sondes utilisables ici après amplification, ou dans des méthodes d'hybridation in situ, elles pourront être aussi déduites de la séquence conservée ou des produits PCR obtenus après amplification que l'on souhaite détecter et identifier, notamment des séquences, capables d'hybrider spécifiquement dans des conditions standards avec ces produits PCR ou avec ladite séquence conservée que l'on souhaite détecter et/ou identifier. Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de forte stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 �g/ml d'ADN de sperme de saumon. 1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05 M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine. Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989. De préférence, les conditions d'hybridation seront dites spécifiques dès lors que seules les séquences présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence complémentaire de la séquence ciblée pourront hybrider, de préférence celles présentant au moins 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 % avec cette séquence complémentaire de la séquence cible. Les sondes ou amorces utilisées dans les procédés selon l'invention, présenteront une taille minimale de 15 bases et on préférera des fragments d'au moins 20, 25, 30 ou 50 bases. Les techniques permettant de détecter, d'identifier et, le cas échéant de quantifier une séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et ne seront pas développées ici. On peut citer, sans s'y limiter : L'hybridation in situ (en particulier l'analyse FISH lorsque les marqueurs sont de type fluorescent) dans laquelle on procède : - à la mise en contact d'une sonde nucléique, le cas échéant marquée, avec l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, ce dernier ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, ceci dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN bactérien contenu dans l'échantillon biologique ; et - à la détection et, le cas échéant, au dosage de l'hybride formé entre la sonde nucléique et l'ADN de l'échantillon biologique ; et La PCR (réaction en chaîne par la polymérase), ou PCR apparentée, dans laquelle on réalise l'amplification spécifique de l'ADN ciblé à l'aide d'un couple d'amorces spécifiques, la détection du produit amplifié le cas échéant, suivie par une analyse quantitative des produits d'amplification (PCR quantitative). On peut également citer une autre méthode pour réaliser la quantification d'une séquence d'un ADN cible à partir d'un extrait d'ADN total de l'échantillon, le cas échéant enrichi en ADN, ladite méthode comprenant : - une première étape dans laquelle on met en contact une première sonde oligonucléotidique spécifique de l'ADN cible ou, le cas échéant, de ses produits d'amplification, immobilisée sur un support avec un extrait de l'ADN total de l'échantillon, ou, le cas échéant, avec les produits PCR obtenus à l'aide d'amorces spécifiques, dans des conditions permettant l'hybridation de la première sonde à l'ADN dudit échantillon ou, le cas échéant, auxdits produits PCR ; et - une deuxième étape dans laquelle on met en contact l'hybride formé entre ladite première sonde immobilisée sur un support et lesdits ADNs ou, le cas échéant, lesdits produits PCR, le cas échéant après élimination des acides nucléiques n'ayant pas hybridé avec la première sonde, avec une deuxième sonde oligonucléotidique, notamment marquée capable de s'hybrider à l'ADN cible ou, le cas échéant, à ses produits PCR, puis élimination des deuxièmes sondes n'ayant pas hybridé ; et - l'analyse quantitative des triplex ainsi formés. Par � PCR apparentée � on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général, il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification (par exemple les méthodes dites NASBA � Nucleic Acid Sequence Based Amplification �, TAS � Transcription based Amplification System �, LCR � Ligase Chain Reaction �, � Endo Run Amplification � (ERA), � Cycling Probe Reaction � (CPR), et SDA � Strand Displacement Amplification � bien connues de l'homme du métier). Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité connue et capable de s'hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible. Par � pourcentage d'identité � entre deux séquences d'acide nucléique au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée sur toute la longueur de la séquence de référence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme de similarité locale mais surtout au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P (disponibles en ligne sur le site de NCBI)). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale et est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, � BLAST 2 sequences � (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247- 250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorflbl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres � open gap penaltie �: 5, et � extension gap penaltie �: 2; la matrice choisie étant par exemple la matrice � BLOSUM 62 � proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. L'ensemble des sondes et amorces utilisées ici pourront être marquées par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable, notamment par des marqueurs fluorescents. De préférence encore, le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'amplification d'un ADN isolé à partir dudit échantillon en utilisant un couple d'amorces dont chacune des séquences est capable de s'hybrider dans des conditions d'hybridation standard avec ladite séquence d'une région conservée du gène wzm, ou avec sa séquence complémentaire ; b) la mise en contact de l'ADN amplifié avec une sonde nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation 10 standard avec ledit ADN amplifié ; et c) la détection de la formation d'un éventuel complexe d'hybridation et, le cas échéant, sa quantification. Par condition d'hybridation standard, on entend désigner ici des conditions de stringence qui permettent d'aboutir à une hybridation spécifique des amorces avec 15 l'ADN à amplifier et de la sonde avec ledit ADN amplifié. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon l'invention est caractérisé en ce qu'à l'étape a), ledit couple d'amorce est choisi parmi les couples d'amorces suivants : A) Pl : TTACCGCTTGCTTTTATGGA (SEQ ID NO: 2) et 20 P2 : CCTATCAACGCTCTTGGAAA (SEQ ID NO: 3) ; B) P65 : CAAAGGGCGTTACAGTCAAACC (SEQ ID NO: 4) et P66 : CAAACACCCCAACCGTAATCA (SEQ ID NO: 5). De préférence aussi, à l'étape b) du procédé de détection ou d'identification de 25 la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon l'invention, ladite sonde est la sonde de séquence TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT (SEQ ID NO: 6) lorsque le couple d'amorces utilisé à l'étape a) est le couple de séquences SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3. De préférence le couple d'amorces choisi est le couple d'amorce Pl et P2 de 30 séquence SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3, et la sonde est la sonde de séquence SEQ ID NO: 6, lorsque le procédé ne comporte pas à l'étape c) la quantification du complexe d'hybridation formé (PCR standard). Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon l'invention est caractérisé en ce qu'à l'étape a), ledit couple d'amorce est le couple d'amorce P65 et P66 de séquence SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5, et la sonde est la sonde de séquence SEQ ID NO: 6, lorsque le procédé comporte à l'étape c) la quantification du complexe d'hybridation formé (notamment par qPCR). Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une étape de filtration préalable de l'échantillon afin d'augmenter la concentration de bactéries présentes dans l'échantillon initial. Dans une autre variante, le procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en évidence de ladite séquence d'une région conservée du gène wzm, ou de sa séquence complémentaire, par hybridation in situ avec des sondes spécifiques marquées, en particulier par analyse FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) à l'aide de sondes marquées par fluorescence. Ainsi, l'invention a également pour objet un procédé de détection et/ou d'identification de la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'ADN génomique dudit échantillon avec une sonde nucléique marquée, capable de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation 25 standard avec ledit ADN génomique ; et b) la détection de la formation d'un éventuel complexe d'hybridation et, le cas échéant, sa quantification. De préférence ladite sonde marquée utilisée pour l'hybridation in situ, notamment pour l'analyse FISH, dans le procédé selon l'invention est une sonde choisie 30 parmi les séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID NO: 6, sa séquence complémentaire ou l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ; ou b) une séquence comprenant une séquence telle que définie en a) et capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence du gène wzm conservée ciblée. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé permettant de détecter ou d'identifier non seulement la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl mais également la présence de bactérie L. pneumophila appartenant à un autre des sérogroupes (2-14) à l'aide de marqueurs spécifiques de ces autres groupes. Ainsi l'invention a pour objet un procédé de détection ou d'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre : - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 par un procédé selon l'invention ; et - au moins une autre étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila d'un autre sérogroupe, en particulier choisi parmi les 15 sérogroupes 6 et 12, 13, et, 10 et 14. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet également un procédé permettant de détecter la présence de bactérie L. pneumophila appartenant à un autre des sérogroupes que le sérogroup 1 choisi parmi les sérogroupes 6 et 12, 13, ou, 10 et 14 à l'aide de marqueurs spécifiques de ces autres groupes tels que décrits ci-après. 20 Ainsi l'invention a pour objet un procédé de détection ou d'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre au moins une autre étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila d'au moins un sérogroupe choisi parmi les sérogroupes 6 et 12, 13, ou, 10 et 14. 25 Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de détection ou d'identification de la présence de Legionella pneumophila du sérogroupe 1 ou de la présence de Legionella pneumophila de sérogroupes 6 ou 12, 13, ou 10 ou 14 selon l'invention est caractérisé en ce que : 30 a) lorsque le procédé de détection ou d'identification comprend une étape d'amplification, le couple d'amorces utilisé pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe choisi parmi les sérogroupes 6 et 12, 13, et 10 et 14 est : - le couple d'amorces de séquences P87/P88 de séquences TGAAAATGGAGCCCTATTCTCTTAC (SEQ ID NO: 7) et TGGTTAAAAACTCTAAAGCCCATCTC (SEQ ID NO: 8) pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 6 ou 12; - le couple d'amorces de séquences P85/P86 de séquences AAATGAAGAATTATATCACTCCGATGAG (SEQ ID NO: 9) et AATTTCCCTTTTTTAACCCAATGAG (SEQ ID NO: 10) pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14 ; et - le couple d'amorces de séquences P91/P92 de séquences GCGAGATTAGAGTACGGCATTGA (SEQ ID NO: 11) et CATTACTTTCTACTACTAATAGATCAGCATTTCC (SEQ ID NO: 12) pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 13, et b) lorsque le procédé de détection ou d'identification est réalisé par une analyse par hybridation in situ, notamment par FISH, la sonde utilisée pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe choisi parmi les sérogroupes 6 et 12, 13, et, 10 et 14 est une sonde dont la séquence est choisie parmi les séquences suivantes : - la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences P87/P88 de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 6 ou 12, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences ; - la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences P85/P86 de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences ; et - la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences P91/P92 de séquences SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 13, sa séquence complémentaire l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences. La présente invention a pour objet les séquences nucléiques suivantes, l'utilisation de l'une au moins de ces séquences ou des kits de diagnostic comprenant l'une au moins de ces séquences suivantes comme composés spécifiques pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupes 6 et 12 ; 13 ; et, 10 et 14 : - le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la détection 15 ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 6 ou 12 ; et/ou - le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14 ; et/ou 20 - le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 13 ; et/ou - la sonde ayant pour séquence la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la détection ou 25 l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 6 ou 12, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences ; - la sonde ayant pour séquence la séquence du produit PCR obtenu par le couple 30 d'amorces de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences ; et - la sonde ayant pour séquence la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 13, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé permettant de détecter ou d'identifier non seulement la présence d'une bactérie L. pneumophila Sgl, de sérogroupes 6 et 12, 13, ou 10 et 14 mais également la présence de bactérie Legionella longbeachae à l'aide de marqueurs spécifiques de ces bactéries. Ainsi l'invention a pour objet un procédé de détection ou d'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila ou d'une bactérie Legionella longbeachae présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre : A) lorsque le procédé de détection ou d'identification comprend une étape d'amplification, - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella 20 pneumophila du sérogroupe 1 ou de sérogroupes 6 et 12, 13, ou, 10 et 14 par un procédé selon l'invention ; et - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une Legionella longbeachae comprenant l'amplification d'un ADN isolé dudit échantillon en utilisant un couple choisi parmi les couples d'amorces suivants ; 25 - le couple d'amorces de séquences P51/P52 de séquences CTTGCTGACTTCTTCCTTAATTT (SEQ ID NO: 13) et GATTTCTTCGGGGTAGGGAT (SEQ ID NO: 14) , - le couple d'amorces de séquences P69/P70 de séquences GCCATTTTCGTCGACATGCT (SEQ ID NO: 15) et 30 TCTTAATTATCTTGGCCGTTTCTTTT (SEQ ID NO: 16) ; et - le couple d'amorces de séquences P73/P74 de séquences CATGCTCATCATCTGGTTTACCTAA (SEQ ID NO: 17) et CCCGAGAGAAATACCCCGATA (SEQ ID NO: 18), - la mise en contact de l'ADN amplifié avec une sonde nucléique, le cas échéant 5 marquée, capable de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation standard avec ledit ADN amplifié, et, le cas échéant, - en ce que la sonde choisie est la sonde de séquence : - CGCATGCTCATCATCTGGTTTAC (SEQ ID NO: 19) (sonde Lgbl) lorsque le couple d'amorces choisi est le couple d'amorces de séquences P69/P70 ; et 10 - AAACGGCCAAGATAATTAAGAGTGTCCG (SEQ ID NO: 20) (sonde Lgb2) lorsque le couple d'amorces choisi est le couple d'amorces de séquences P73/P74, et B) lorsque le procédé de détection ou d'identification est réalisé par hybridation in situ, - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella 15 pneumophila du sérogroupe 1 ou de sérogroupes 6 ou 12, 13, ou 10 ou 14 par un procédé selon l'invention ; et - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une Legionella longbeachae par hybridation in situ et dont la sonde utilisée pour la détection ou l'identification de Legionella longbeachae est une sonde dont la séquence est choisie 20 parmi les séquences suivantes : - la séquence du produit PCR obtenu par un couple choisi parmi les couples d'amorces suivants ; - le couple d'amorces de séquences P51/P52 de séquences SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO:14 ; 25 - le couple d'amorces de séquences P69/P70 de séquences SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16 ; et - le couple d'amorces de séquences P73/P74 de séquences SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18, en particulier : - la sonde Lgbl de séquence SEQ ID NO: 19 lorsque le couple d'amorces choisi est le 30 couple d'amorces de séquences P69/P70, ou - la sonde Lgb2 de séquence SEQ ID NO: 20 lorsque le couple d'amorces choisi est le couple d'amorces de séquences P73/P74 ; et 17 la séquence complémentaire de ces sondes, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet les séquences nucléiques suivantes, l'utilisation de l'une au moins de ces séquences ou des kits de diagnostic comprenant l'une au moins de ces séquences suivantes comme composés spécifiques pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella longbeachae présente dans un échantillon : - le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO:14 ; - le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16 ; - le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18 ; - la sonde ayant pour séquence la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO:14, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences ; - la sonde ayant pour séquence la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO:16, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences ; - la sonde ayant pour séquence la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18, sa séquence complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15, de préférence, 20, 22, 25 ou 30 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant une de ces séquences ; - la sonde ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO: 19 (sonde Lgbl) ; et - la sonde ayant pour séquence la séquence SEQ ID NO: 20 (sonde Lgb2). Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé de détection ou d'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila, en particulier du sérogroupe 1, 6 ou 12, 13, ou, 10 ou 14, et, le cas échéant, d'une bactérie Legionella longbeachae présente dans un échantillon selon la présente invention, caractérisé en ce qu'à l'étape a), l'amplification de l'ADN isolé est réalisée par un procédé PCR multiplex dans lequel les différents couples d'amorces nécessaires à la détection des sérogroupes choisis de Legionella pneumophila, ou, le cas échéant, de la bactérie Legionella pneumophila, sont mis en contact simultanément avec ledit ADN isolé de l'échantillon. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un procédé de détection ou d'identification selon l'invention, caractérisé en ce que l'ADN amplifié, le cas échéant marqué, est mis en contact à l'étape b) avec un support solide sur lequel sont fixées les sondes nucléiques capables de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation standard avec ledit ADN amplifié. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé permettant de détecter ou d'identifier la présence d'une bactérie L. pneumophila d'au moins un des sérogroupes suivants Sgl, de sérogroupes 6 ou 12, 13, ou 10 ou 14 et, le cas échéant, de bactérie Legionella longbeachae à l'aide de marqueurs ou composés spécifiques de ces bactéries selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape dans laquelle on met en évidence la présence ou non du gène mip (macrophage infectivity potentiator) par PCR, ou par hybridation in situ (en particulier par FISH) selon la technique utilisée pour la mise en évidence des autres marqueurs. Ce marqueur mip étant associé aux autres marqueurs comme marqueur positif de la présence de bactéries de l'espèce L. pneumophila. Les procédés et outils moléculaires pour l'identification de la présence de L. pneumophila par identification de la présence du gène mip dans un échantillon biologique sont bien connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés ici (on peut citer par exemple mais sans s'y limiter la séquence du gène mip ou de son ARNm référencée dans Genbank sous le numéro NC 006368 issue de la souche Paris de Legionella pneumophila). Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila 30 du sérogroupe 1 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : a) - un acide nucléique ayant pour séquence la séquence d'une région conservée du gène wzm de séquence SEQ ID NO: 1, ou la séquence d'une région conservée de l'un de ses variants, cette séquence conservée étant de préférence choisie parmi les séquences du groupe constitué de : - la séquence d'un fragment d'au moins 25 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 50, 75, 100, 200 et 250 nucléotides consécutifs, de la séquence nt 99-392 de la 5 séquence SEQ ID NO: 1 ou d'un de ses variants ; - la séquence d'un fragment d'au moins 25 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 50 et 75 nucléotides consécutifs, de la séquence nt 138-214 de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'un de ses variants ; et - leur séquence complémentaire ou leur séquence inverse ; et, le cas échéant, 10 b) - un support solide sur lequel est fixée une de ces séquences telle que définie en a). De préférence le kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 dans un échantillon est caractérisé en ce qu'il comprend : - un couple d'amorce nucléique capable d'amplifier la séquence d'une région conservée 15 du gène wzm de séquence SEQ ID NO: 1 ou d'un de ses variants, de préférence choisie parmi les couples d'amorces du groupe constitué de : Pl (SEQ ID NO: 2) et P2 (SEQ ID NO: 3); et P65 (SEQ ID NO: 4) et P66 (SEQ ID NO: 5), et, le cas échéant, 20 - d'une sonde, éventuellement marquée, de séquence SEQ ID NO: 6. La présente invention concerne aussi un kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un kit selon l'invention permettant la détection et/ou l'identification de la présence 25 d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 dans un échantillon, et b) 1) au moins un couple d'amorces choisi parmi les couples d'amorces suivants : - le couple d'amorces de séquences P87/P88 de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 6 ou 12 ; 30 - le couple d'amorces de séquences P85/P86 de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14 ; et - le couple d'amorces de séquences P91/P92 de séquences SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 13, ou 2) au moins un acide nucléique dont la séquence est une séquence comprenant ou constituée d'un des produits PCR amplifiés par un couple d'amorces tel que défini dans b)l), sa séquence complémentaire ou inverse, un de ses fragments d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 20, 25, 50, 75, 100, 200 et 250 nucléotides consécutifs, et, le cas échéant, 3) un support solide sur lequel est fixée l'une de ces séquences telles que 10 définies en 2). La présente invention concerne enfin un kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila et/ou d'une bactérie Legionella longbeachae présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il 15 comprend : A) un kit tel que défini ci-avant selon l'invention, et B) 1) au moins un couple d'amorces choisi parmi les couples d'amorces suivants : - le couple d'amorces de séquences P51/P52 de séquences SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 ; 20 - le couple d'amorces de séquences P69/P70 de séquences SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16 ; et - le couple d'amorces de séquences P73/P74 de séquences SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18, ou 25 2) - au moins un acide nucléique dont la séquence est une séquence comprenant ou constituée d'un des produits PCR amplifiés par un couple d'amorces tel que défini dans B)l), sa séquence complémentaire ou inverse, un de leurs fragments d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 20, 25, 50, 75, 100, 200 et 250 nucléotides consécutifs ou une séquence comprenant l'une de ces séquences; ou de 30 manière plus préférée - au moins un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 19 (sonde Lgbl) ou SEQ ID NO: 20 (sonde Lgb2), sa séquence complémentaire ou inverse, et, le cas échéant, 3) un support solide sur lequel est fixée l'une des séquences telles que définies en B) 2). Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un kit pour détecter ou identifier la présence d'une bactérie L. pneumophila d'au moins un des sérogroupes suivants Sgl, de sérogroupes 6 ou 12, 13, ou 10 ou 14 et, le cas échéant, de bactérie Legionella longbeachae à l'aide du kit de l'invention comprenant les marqueurs spécifiques de ces bactéries selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend également un couple d'amorces et/ou une sonde, pouvant être marquée, spécifique du gène mip. Finalement, la présente invention a pour objet une amorce nucléique choisie parmi le groupe d'amorces de séquences SEQ ID NOs. 2 à 5 et SEQ ID Nos. 7 à 18. De préférence, l'invente a pour objet un couple d'amorces choisi parmi le groupe de couple d'amorces de séquences suivantes : a) SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3; b) SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5; c) SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8; d) SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10; e) SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12; f) SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14; g) SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16; et h) SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18. Font également partie de l'invention les sondes nucléiques choisies parmi le groupe de sondes de séquences SEQ ID NOs. 6, 19 et 20, le cas échéant marquées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples décrits ci-après. Exemple 1 : Matériel et Méthodes I) PCR � classique � 1) Réactifs utilisés Eau DNase-RNase Free 10X PCR Buffer II (Roche) MgC12 : Solution 25mM (Roche) dNTP Set 100 mM (Roche) : diluer les 4 dNTP ensemble à 10 mM AmpliTaq DNA Polymerase 5U/�l (Roche) 2) Amorces utilisées : (voir tableau 1) Pl- P2 pour L. pneumophila Sgl P51-P52 pour L. longbeachae 3) Mélange de réaction Pour une réaction de 50 �l : Tableau 2 : Concentration finale pour 50 �l Eau 32,2 gl - Tampon 10X 5 gl 1X MgC12 (25 mM) 4 gl 2 mM dNTP (10 mM) 1 gl 200 �M Taq 0,3 gl 1,5 U Amorce F (10 �M) 3 gl 600 nM Amorce R (10 �M) 3 gl 600 nM Distribuer 48,5 gl de mix par puits. Ajouter 1,5 gl d'ADN extrait. 4) Programme de PCR 94°C 1 min 94°C 30 sec 55°C 30 sec x 35 cycles 72°C 30 sec 72°C 4 min 4°C II) PCR quantitative 1) Réactifs utilisés Eau DNase-RNase Free Taqman universal PCR master mix 2X (Applied Biosystems) Exogenous Internal Positive Control (Applied Biosystems) Amorces et sondes utilisées P65-P66 pour L. pneumophila Sgl avec Sonde Sgl (FAM-BHQ1 - Eurogentec P69-70 pour L.longbeachae avec Sonde Lgbl (TET-BHQ1 û Eurogentec) (voir le tableau 1 � Amorces et sondes � pour les séquences) Tableau 1 : Séquences des amorces et sondes utilisées Nom Séquence Taille Gène Spécificité amplicon ciblé P1 TTACCGCTTGCTTTTATGGA 294 wzm Legionella P2 CCTATCAACGCTCTTGGAAA pneumophila Sgl P51 CTTGCTGACTTCTTCCTTAATTT 433 11o3177 Legionella longbeachae P52 GATTTCTTCGGGGTAGGGAT P65 CAAAGGGCGTTACAGTCAAACC Legionella P66 CAAACACCCCAACCGTAATCA 75 wzm pneumophila Sonde Sgl TCTTGGGATTGGGTTGGGTTATTTTAACTCCT Sg1 P69 GCCATTTTCGTCGACATGCT Legionella P70 TCTTAATTATCTTGGCCGTTTCTTTT 75 11o3177 longbeachae Sonde Lgbl CGCATGCTCATCATCTGGTTTAC P73 CATGCTCATCATCTGGTTTACCTAA Legionella P74 CCCGAGAGAAATACCCCGATA 75 11o3177 longbeachae Sonde Lgb2 AAACGGCCAAGATAATTAAGAGTGTCCG P95 TGTAATGCTGCTACGCGGTTT Legionella P96 GCATTCCCCGCTGCAA 75 cyoB pneumophila Sg1 souche sonde CAGATGCACTCTTAATGCGCTCTCAACAAG Paris Pari s2 P85 AAATGAAGAATTATATCACTCCGATGAG 84 cds013 sg 10 et sg 14 P86 AATTTCCCTTTTTTAACCCAATGAG P91 GCGAGATTAGAGTACGGCATTGA 85 cds012 sg 13 P92 CATTACTTTCTACTACTAATAGATCAGCATTTCC P87 TGAAAATGGAGCCCTATTCTCTTAC 74 cds024 sg 6 et sg 12 P88 TGGTTAAAAACTCTAAAGCCCATCTC 25 ) Mélange de réaction Pour une réaction de 20 gl : PrémixConcentration Finale dans 5,6 gl 10 Primer Forward (100 �M) 0,16 gl 2,86 �M Primer Reverse (100 �M) 0,16 gl 2,86 �M Sonde (20 �M) 0,20 gl 0,71 �M Eau 5,08 �l - Mix Concentration Finale dans 20 gl Taqman mix 2X 10 gl 1X IPC mix l0X 2�l 1X IPC DNA 50X 0,4 gl 1X Prémix 5,6 gl primers : 800 nM sonde : 200 nM Distribuer 18 gl de mix par puits. Ajouter 2 gl d'ADN extrait. Programme de PCR 50 °C 2 min 95 °C 10 min 95 °C 15 sec 60°C 1 min x 40 cycles III) Constructions de la matrice La puce de biodiversité Legionella a été conçue en se focalisant principalement sur les gènes qui sont variables parmi les trois souches. Pour l'ensemble de ces gènes, 15 nous avons conçu des sondes internes situées dans la plage de 151 à 600 pb. Les gènes inférieurs à 150 pb ont été ainsi exclus et une seule sonde a été conservée pour les gènes redondants et pour les différentes familles de séquences d'insertion. D'après ces critères, 1303 sondes ont été déposées en double sur la puce de biodiversité Legionella, y compris 324, 242 et 227 qui étaient respectivement spécifiques des souches Paris, 20 Lens et Philadelphie. 59 sondes sont communes aux souches Paris et Lens mais absentes dans la souche Philadelphie, 62 sont communes aux souches Paris et Philadelphie et 24 sont communes aux souches Lens et Philadelphie mais absentes dans la souche Paris. Finalement, il a été ajouté 142 sondes correspondant à des facteurs de virulence connus et possibles (par exemple, des gènes codant pour des systèmes de sécrétion de type I, II et IV et certains de leurs effecteurs, des gènes flagellaires, des gènes de type eucaryote, ...), 31 gènes formant un groupe requis pour la synthèse des lipopolysaccharides (Luneberg et al., 2000), 30 gènes constituant un élément génétique instable responsable de la variation des phases des lipopolysaccharides dans la souche Olda, 148 ORF spécifiques de L. longbeachae identifiés au cours d'un séquençage partiel et 14 gènes contrôles. Des fragments internes de PCR pour les gènes communs aux souches Paris et Lens ou communs aux souches Paris et Philadelphie ont été amplifiés avec l'ADN génomique de la souche Paris et ceux communs aux souches Lens et Philadelphie ont été amplifiés avec l'ADN génomique de la souche Lens. Des amorces ont été conçues en utilisant une version modifiée du logiciel Primer 3 (CAAT- box (Frangeul et al., 2004)) pour amplifier un fragment spécifique de 151 à 600 pb pour chaque gène (les températures de fusion ont été de 55 à 65°C) (Eurogentec). Trois réactions d'amplification ont été réalisées pour chaque sonde dans un volume réactionnel de 100 �l contenant 6 ng d'ADN chromosomique. La concentration et la taille de chaque produit de PCR ont été vérifiées sur des gels d'agarose. Pour la préparation des puces, des membranes de nylon (Qfilter ; Genetix) ont été trempées dans une solution de TE (10 mM de Tris, pH : 7, 1 mM d'EDTA, pH : 7,6). Les spots blots des produits de pCR et des contrôles ont été réalisés par un robot Qpix (Genetix). Après le dépôt des spots, les membranes ont été fixées pendant 15 min dans 0,5 M de NaOH-1,5 M de NaCl, lavées brièvement dans de l'eau distillée, fixées une seconde fois 1 min sous UV et stockées humides à -20°C jusqu'à utilisation. Pour la vérification de la spécificité et de la qualité de la macropuce, 70 % de tous les produits de PCR ont été choisis de manière aléatoire et séquencés. La totalité des 960 séquences correspondait aux produits de PCR attendus. Puis la membrane a été hybridée avec les ADN chromosomiques isolés des trois souches de Legionella utilisées pour amplifier les sondes (L. pneumophila Paris, L. pneumophila Lens et L. pneumophila Philadelphie) afin de tester la qualité et le dépôt correct des sondes. IV) Hybridation sur la matrice L'ADN génomique a été extrait en utilisant la technique au phénol/chloroforme et il a été radiomarqué en utilisant un kit de marquage d'ADN par amorçage aléatoire (Roche). Le marquage a été réalisé avec 200 ng d'ADN génomique et 50 �Ci de dCTP marqué au 33P (Amersham). L'ADN marqué a été purifié à l'aide de microcolonnes Qiaquick (Qiagen). Des puces de densité élevée ont été humidifiées dans du SSC 2X (le SSC 1X est constitué de 0,15 M de NaCl plus 0,015 M de citrate de sodium) et préhybridées pendant 1 h dans 10 ml d'une solution d'hybridation contenant du SSPE 5X (le SSPE 1X est constitué de 0,18 M de NaCl, 10 mM de NaH2PO4 et 1 mM d'EDTA, pH : 7,7), 2 % de dodécylsulfate de sodium, de la solution de Denhardt 1X (la solution de Denhardt 50X est constituée de 1 % de Ficoll, 1 % de polyvinylpyrrolidone et 1 % sérumalbumine bovine), et 1 mg d'ADN de sperme de saumon dénaturé. L'hybridation a été réalisée pendant une nuit à 60°C dans 5m1 de solution d'hybridation mélangée avec l'ADN marqué purifié. Les membranes ont été lavées deux fois à température ambiante et deux fois à 60°C dans 0,5 % de SSPE-0,2 % de dodécylsulfate de sodium. Les puces ont été ensuite scellées dans des sachets de polypropylène et exposées à un écran de phosphorimager (Molecular Dynamics) pendant 48 h. Pour la lecture, on a utilisé un imager modèle Typhoon 9400 (Amersham Biosciences). Les puces ont été ensuite déshybridées en utilisant du NaOH 0,5 N pendant 30 min pour une autre utilisation. V) Analyse de la matrice Le logiciel ArrayVision (Imaging Research) a été utilisé pour la quantification des intensités d'hybridation. La valeur de l'intensité d'hybridation de chaque dépôt a été normalisée en la divisant par la médiane de toutes les valeurs d'intensité significatives sur chaque filtre. Pour le calcul des rapports, on a utilisé une puce de référence, qui a été construite en combinant les moyennes des données normalisées issues de quatre répliques d'hybridation des ADN génomiques de L. pneumophila Paris, L. pneumophila Lens, L. pneumophila Philadelphia, L. longbeachae 99013058 et L. pneumophila Olda souche RC1 aux dépôts correspondants sur la puce. Afin de définir la valeur seuil du rapport pour la présence d'un gène, nous avons analysé les résultats pour les gènes de L. pneumophila Paris hybridés avec l'ADN chromosomique de L. pneumophila Lens et Philadelphie (et de la même manière, les gènes de L. pneumophila Lens hybridés avec l'ADN chromosomique de L. pneumophila Paris et Philadelphie ; les gènes de L. pneumophila Philadelphie hybridés avec l'ADN chromosomique de L. pneumophila Paris et Lens). Les données ont été ensuite converties en scores binaires (pour les rapports > 0,3, le score du gène était présent [1], et pour les rapports VI) Références des souches de Legionella testées n° espèce sq souche 1 L pneumophila 1 Paris 2 L pneumophila 1 Lens 3 L pneumophila 1 Philadelphia 4 L pneumophila 1 Corby 5 L longbeachae NSW150 6 L pneumophila 15 ATCC 35251 7 L pneumophila 1 Lorraine 8 L pneumophila 2 ATCC 33154 / CIP 103856 9 L pneumophila 3 ATCC 33155 / CIP 103857 10 L pneumophila 4 ATCC 33156 / CIP 103858 11 L pneumophila 5 ATCC 33216 / CIP 103859 12 L pneumophila 5 ATCC 33737 / CIP 105570 13 L pneumophila 6 ATCC 33215 / CIP 103860 14 L pneumophila 7 ATCC 33823 / CIP 103861 L pneumophila 8 ATCC 35096 / CIP 103862 16 L pneumophila 9 ATCC 35289 / CIP 103863 17 L pneumophila 10 ATCC 43283 / CIP 103864 18 L pneumophila 11 ATCC 43130 / CIP 103865 19 L pneumophila 12 ATCC 43290 / CIP 103866 L pneumophila 13 ATCC 43736 / CIP 103867 21 L pneumophila 14 ATCC 43703 / CIP 103869 22 L pneumophila 14 CIP 103868 23 L anisa ATCC 35292 / CIP 103870 24 L hackeliae ATCC 33250 L micdadei ATCC 33218 26 L sainthelensi ATCC 35248 / CIP 103885 27 L pneumophila 2 HL 0431 5028 29 28 L pneumophila 3 HL 0412 5002 29 L pneumophila 3 HL 0240 3022 30 L pneumophila 4 HL 0451 4011 31 L pneumophila 5 HL 0115 5003 32 L pneumophila 6 HL 0501 3047 33 L pneumophila 7 HL 0242 4004 34 L pneumophila 8 HL 0448 3060 35 L pneumophila 9 HL 0231 3045 36 L pneumophila 10 HL 0441 2051 37 L pneumophila 12 HL 0243 5007 38 L pneumophila 10-13 HL 0317 2047 39 L pneumophila 14 HL 0229 2025 40 L pneumophila 15 HL 0231 1002 41 L anisa HL 0403 3042 42 L parisiensis AWA 43 L bozemanii ABU 44 L longbeachae 0422 4010 45 L micdadei 93 011 936 46 L gormanii ATCC 33297 47 L jordanis ATCC 33623 48 L erythra ATCC 35303 49 L rubrilucens ATCC 35304 50 L quinlivanii ATCC 43830 51 L moravica ATCC 43877 52 L tusconensis HL 0239 1038 53 L dumoffii ATCC 33279 54 L taurinensis HL 0424 3060 55 L pneumophila Clin. 1 HL 0230 4015 / Paris 56 L pneumophila C 1 HL 0337 4008 57 L pneumophila C 1 HL 0229 5045 58 L pneumophila C 1 HL 0353 2056 59 L pneumophila Env. 1 HL 0229 2010 60 L pneumophila C 1 HL 0045 1020 / Paris 61 L pneumophila C 1 HL 0325 1041 62 L pneumophila C 1 Los Angeles 63 L pneumophila C 1 HL 0329 2037 64 L pneumophila C 1 HL 0334 2029 65 L pneumophila C 1 HL 0239 5039 66 L pneumophila C 1 HL 0228 2021 / Paris 67 L pneumophila C 1 HL 0213 2010 / Paris 68 L pneumophila C 1 94012433 / Paris 69 L pneumophila C 1 HL 0125 3028 70 L pneumophila C 1 HL 0143 5019 71 L pneumophila C 1 HL 0228 5003 72 L pneumophila C 1 HL 0229 2016 73 L pneumophila C 1 HL 0238 1036 74 L pneumophila C 1 HL 0351 1069 75 L pneumophila C 1 HL 0331 1030 76 L pneumophila C 1 HL 0334 3016 77 L pneumophila C 1 HL 0335 1001 78 L pneumophila C 1 HL 0335 2012 79 L pneumophila C 1 HL 0407 3054 30 80 L pneumophila C HL 0407 5055 81 L pneumophila C HL 0406 2033 82 L pneumophila C HL 0415 5001 83 L pneumophila C HL 0427 1029 84 L pneumophila C HL 0406 3005 85 L oakridgensis ATCC 33761 / CIP 103884 86 L jamestowniensis ATCC 35298 / CIP 103845 87 L lansingensis ATCC 49751 / CIP 103542 88 L gresilensis ATCC 700509 / CIP 106631 89 L cincinnatiensis ATCC 43753 / CIP 103875 90 L birgminghamensis ATCC 43702 / CIP 103871 91 L beliardensis ATCC 700512 / CIP 106632 92 L gratiana ATCC 49413 / CIP 105267 93 L longbeachae C4E7 94 L longbeachae 98073 95 L longbeachae 98072 96 L wadsworthii ATCC 33877 / CIP 103886 97 L longbeachae sgl Aust 0425018 98 L longbeachae sg2 Aust 04275008 99 L longbeachae ATCC 33462 100 L longbeachae 3472019 101 Serratia marcescens 504 102 Ser. marcescens 81 103 Ser. marcescens 296 104 Ser. odorifica 1073 105 Ser. fonticola 78 645 106 Ser. fonticola 3965 107 Ser. fonticola 5680 (22) 108 Ser. proteamaculans Ra 1403 109 Ser. proteamaculans C1C 3630 110 Ser. proteamaculans EB 3706 111 Ser. liquefaciens 27592 112 Ser. liquefaciens 866 113 Ser. liquefaciens 507 114 Ser. rubidea 288 115 Ser. entomophila Al 116 Ser. entomophila 222 117 Ser. entomophila A15 118 Ser. grimesi 390 119 Ser. grimesi 503 120 Ser. ficaria 4024 121 Ser. ficaria 5602 122 Ser. plymuthica 510 123 Acinetobacter Iwoffii 64 105 124 Pseudomonas putida 2066 type 125 L feeleii CIP 103877 126 T (ex L.) maceachernii CIP 103846 127 Sten. maltophila CIP 60.77 128 Alcali. faecalis CIP 60.80 129 Entero. aerogenes CIP 60.86 130 Aerom. hydrophila CIP 76.14 131 Buckhold. cepacia CIP 80.24 31 132 Klebsiella oxytoca CIP 103434 133 Proteus vulgaris CIP 104989 134 Xanthom. campestris CIP 100069 135 Pseudo. aeruginosa CIP 100720 136 Pseudo. fluorescens CIP 69.13 137 L pneumophila Hôpital Garches Légio418 1993 Rebillat 138 L pneumophila Hôpital Garches Légio467 1996 Gelin 139 L pneumophila Lp21 140 L pneumophila Lp22 141 L pneumophila Lp23 142 L pneumophila 205409997 143 L pneumophila L3415/03 144 L pneumophila Wien 43-2 145 L pneumophila Wien 47-14 146 L pneumophila USA 2735 147 L pneumophila USA 2733 148 L pneumophila LT40/04 149 L pneumophila L2546/04 150 L pneumophila L3386/03 151 L pneumophila L03-610 152 L pneumophila L00-549 153 L pneumophila NIIB80 154 L pneumophila NIIB83 155 L pneumophila NIIB121 156 L pneumophila NIIB122 157 L pneumophila NIIB124 158 L pneumophila NIIB182 159 L pneumophila NIIB217 160 L pneumophila NIIB223 161 L pneumophila NIIB224 162 L pneumophila NIIB225 163 L pneumophila NIIB226 164 L pneumophila NIIB228 165 L pneumophila HL 0232 4052 166 L pneumophila EUL 1 167 L pneumophila 0051 4008 168 L pneumophila HL 0036 4001 169 L pneumophila 0102 3035 170 L pneumophila 2001 n°5 171 L pneumophila 2001 n°7 172 L pneumophila 0230 4020 173 L pneumophila 0230 4017 174 L pneumophila 0230 4016 175 L pneumophila Albuquerque / ATCC 43111 176 L pneumophila Olda / ATCC 43109 177 L pneumophila San Francisco / ATCC 43111 178 L pneumophila HL 0141 1020 179 L pneumophila HL 0232 4052 180 L pneumophila HL 0337 3012 L pneumophila 1 HL 0703 4031 L pneumophila 1 HL 0707 3023 32 L pneumophila 1 HL 0710 3003 L pneumophila 1 LG 0713 5007 L pneumophila 1 LG 0714 4020 L pneumophila 1 LG 0714 4021 L pneumophila 1 LG 0715 2033 L pneumophila 1 LG 0715 5017 L pneumophila 1 LG 0717 5024 L pneumophila 1 LG 0721 5015 L pneumophila 1 LG 0727 5019 L pneumophila 1 LG 0728 2018 L pneumophila 1 LG 0728 5012 L pneumophila 1 LG 0729 5027 L pneumophila 1 LG 0730 3035 L pneumophila 1 LG 0730 4014 L pneumophila 1 LG 0730 5015 L pneumophila 1 LG 0730 5022 L pneumophila 1 LG 0737 5010 L pneumophila 1 LG 0739 3021 L pneumophila 1 LG 0739 3030 L pneumophila 1 LG 0740 3023 L pneumophila 1 LG 0740 3025 L pneumophila 1 LG 0740 3030 L pneumophila 1 LG 0740 3040 L pneumophila 1 LG 0740 4032 L pneumophila 1 LG 0741 3023 L pneumophila 1 LG 0741 4005 L pneumophila 1 LG 0743 5011 L pneumophila 1 LG 0745 2029 L pneumophila 1 LG 0746 3013 L pneumophila 1 LG 0750 4007 L pneumophila 1 LG 0801 5025 L pneumophila 1 LG 0802 3014 L pneumophila 1 LG 0807 2022 L pneumophila 1 LG 0807 5006 L pneumophila 1 LG 0809 2007 L pneumophila 1 LG 0809 3020 L pneumophila 1 LG 0809 4031 L pneumophila 1 LG 0811 1019 L pneumophila 2 LG 0729 1025 L pneumophila 2 LG 0742 5016 L pneumophila 2 LG 0746 1024 L pneumophila 2 LG 0802 1026 L pneumophila 2 LG 0811 3024 L pneumophila 3 HL 0707 5006 L pneumophila 3 HL 0709 2032 L pneumophila 3 LG 0716 5013 L pneumophila 3 LG 0725 2014 L pneumophila 3 LG 0738 3022 L pneumophila 3 LG 0745 4014 L pneumophila 3 LG 0747 3015 L pneumophila 3 LG 0750 4006 L pneumophila 3 LG 0805 3021 33 L pneumophila 3 LG 0808 2012 L pneumophila 3 LG 0809 4032 L pneumophila 4 HL 0707 5003 L pneumophila 4 LG 0725 4012 L pneumophila 4 LG 0727 5028 L pneumophila 4 LG 0730 5029 L pneumophila 4 LG 0731 5015 L pneumophila 4 LG 0745 2031 L pneumophila 5 LG 0711 4031 L pneumophila 5 LG 0723 3010 L pneumophila 5 LG 0730 3031 L pneumophila 5 LG 0732 1015 L pneumophila 5 LG 0736 4010 L pneumophila 5 LG 0740 3022 L pneumophila 6 HL 0615 1027 L pneumophila 6 HL 0616 5016 L pneumophila 6 HL 0623 5029 L pneumophila 6 HL 0625 1032 L pneumophila 6 HL 0626 2016 L pneumophila 6 HL 0626 2016 L pneumophila 6 HL 0626 3024 L pneumophila 6 HL 0628 4026 L pneumophila 6 HL 0635 5002 L pneumophila 6 HL 0637 5020 L pneumophila 6 HL 0639 5022 L pneumophila 6 HL 0642 5016 L pneumophila 6 HL 0643 1025 L pneumophila 6 HL 0646 5013 L pneumophila 6 HL 0647 3004 L pneumophila 6 HL 0648 1013 L pneumophila 6 HL 0650 3003 L pneumophila 6 HL 0705 1028 L pneumophila 6 HL 0706 2011 L pneumophila 6 HL 0707 1017 L pneumophila 6 HL 0707 5047 L pneumophila 6 LG 0725 2016 L pneumophila 6 LG 0729 1030 L pneumophila 6 LG 0729 5019 L pneumophila 6 LG 0733 4011 L pneumophila 6 LG 0736 4008 L pneumophila 6 LG 0737 5022 L pneumophila 6 LG 0740 3021 L pneumophila 6 LG 0748 1030 L pneumophila 6 LG 0750 2011 L pneumophila 6 LG 0806 2019 L pneumophila 6 LG 0807 5012 L pneumophila 6 LG 0808 3025 L pneumophila 6 LG 0810 5014 L pneumophila 7 HL 0605 4003 L pneumophila 7 HL 0611 1002 L pneumophila 7 HL 0615 4008 L pneumophila 8 HL 0703 1023 L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila 8 HL 0703 1024 8 LG 0712 2030 8 LG 0714 5048 8 LG 0747 4021 9 HL 0707 5019 10 LG 0727 5026 10 LG 0740 4034 10 LG 0745 2028 12 LG 0721 2021 12 LG 0723 1018 12 LG 0740 4025 12 LG 0807 2016 14 LG 0739 2049 14 LG 0745 3016 LG 0738 2088 Souches EWGLI LE 1 - EUL 31 LE 2 - EUL 56 LE 3 - EUL 22 LE 4 - EUL 66 LE 5 - EUL 61 LE 6 - EUL 75 LE 7 - EUL 26 LE 9 - EUL 18 LE 12 - EUL 13 LE 13 LE 14 LE 16 LE 20 - EUL 30 LE 22 LE 24-EUL47 LE 25 - EUL 51 LE 27 - EUL 17 LE 28 - EUL 27 LE 30 LE 31 - EUL 7 LE 33 LE 36 - EUL 14 LE 37 - EUL 78 LE 38 - EUL 106 LE 39 - EUL 74 LE 40 LE 42 - EUL 79 LE 43 - EUL 121 LE 44-EUL71 LE 45 - EUL 72 LE 47 - EUL 73 LE 48 - EUL 16 LE 49 - EUL 67 LE 50 LE 51 - EUL 25 LE 52 - EUL 62 L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila L pneumophila LE 53 - EUL 6 LE 54 - EUL 64 LE 55 - EUL 95 LE 56 - EUL 54 LE 57 LE 58 - EUL 1 LE 59 - EUL 55 LE 60 LE 64 LE 65 LE 66 - EUL 29 LE 68 - EUL 50 LE 69 - EUL 63 ILE70-EUL32 LE 72 - EUL 52 LE 73 - EUL 53 LE 75-EUL4 LE 77 - EUL 77 LE 78 - EUL 69 LE 80 - EUL 3 LE 81 - EUL 46 LE 82 - EUL 76 LE 83 - EUL 68 LE 84 - EUL 44 LE 85 - EUL 2 LE 87 - EUL 94 LE 88 - EUL 57 LE 89 - EUL 58 LE 90 LE 91 LE 92 LE 93 LE 94 LE 95 - EUL 45 LE 98 LE 99 - EUL 70 LE 100 - EUL 28 LE 101 - EUL 108 NC1 NC2 NC3 NC4 NC5 NC6 NC7 NC8 NC9 NC10 NC11 NC12 NC13 36 14 L pneumophila 1 NC14 15 L pneumophila 1 NC15 16 L pneumophila 1 NC16 17 L pneumophila 1 NC17 18 L pneumophila 1 NC18 19 L pneumophila 1 NC19 20 L pneumophila 1 NC20 21 L pneumophila 1 NC21 22 L pneumophila 1 NC22 23 L pneumophila 1 NC23 24 L pneumophila 1 NC24 25 L pneumophila 1 NC25 26 L pneumophila 1 NC26 27 L pneumophila 1 NC27 28 L pneumophila 1 NC28 29 L pneumophila 1 NC29 30 L pneumophila 1 NC30 31 L pneumophila 1 NC31 32 L pneumophila 1 NC32 33 L pneumophila 1 NC33 34 L pneumophila 1 NC34 35 L pneumophila 1 NC35 36 L pneumophila 1 NC36 37 L pneumophila 1 NC37 38 L pneumophila 1 NC38 39 L pneumophila 1 NC39 40 L pneumophila 1 NC40 41 L pneumophila 1 NC41 42 L pneumophila 1 NC42 43 L pneumophila 1 NC43 44 L pneumophila 1 NC44 45 L pneumophila 1 NC45 46 L pneumophila 1 NC46 47 L pneumophila 1 NC47 48 L pneumophila 1 NC48 49 L pneumophila 1 NC49 50 L pneumophila 2-14 NC50 51 L pneumophila 2-14 NC51 52 L pneumophila 2-14 NC52 53 L pneumophila 2-14 NC53 54 L pneumophila 2-14 NC54 55 L pneumophila 2-14 NC55 56 L pneumophila 2-14 NC56 57 L pneumophila 2-14 NC57 58 L pneumophila 2-14 NC58 59 L pneumophila 2-14 NC59 60 L pneumophila 2-14 NC60 61 L pneumophila 2-14 NC61 62 L pneumophila 2-14 NC62 63 L pneumophila 2-14 NC63 64 L pneumophila 2-14 NC64 65 L pneumophila 2-14 NC65 37 66 L pneumophila 2-14 NC66 67 L pneumophila 2-14 NC67 68 L pneumophila 2-14 NC68 69 L pneumophila 2-14 NC69 70 L pneumophila 2-14 NC70 71 L pneumophila 2-14 NC71 72 L pneumophila 2-14 NC72 73 Legionella spp. NC72 74 Legionella spp. NC73 75 Legionella spp. NC74 Exemple 2 : Identification d'un gène spécifique à l'ensemble des souches de sérogroupe 1 de Legionella pneumophila Les inventeurs ont entrepris une étude de la biodiversité du genre Legionella en déterminant et comparant quatre séquences complètes. Trois de Lp Sg 1 [souche Paris, Lens et Philadelphia-1 (5, 6)] et une séquence partielle d'un isolat de L. longbeachae en cours de séquençage. Sur la base de ces quatre séquences, une puce à ADN a été conçue et construite portant 1303 sondes. Cette puce a été hybridée avec l'ADN génomique de 248 souches du genre Legionella : 152 Lp Sgl, 64 Lp Sg2-15, 32 Legionella sp. (14 espèces du genre Legionella). Les résultats de cette étude montrent que les gènes codant les protéines impliquées dans la biosynthèse du lipopolysaccharide (LPS) sont les seules qui ont le pouvoir de discriminer les différents Sg de Lp. Parmi eux, nous avons identifié 3 gènes présents dans toutes les souches de Sgl et spécifiques à celles-ci (wzm, wzt, lppO831). De plus, trois autres gènes (lppO836, lppO843, lppO827) sont également présents dans toutes les souches de Sgl alors qu'ils ne sont présents que dans une à trois souches non Sgl parmi 248 souches testées. Finalement le gène 1pp0832 est spécifique des souches de Sgl et semble manquer que dans deux souches de Sgl. De plus nous avons identifié plusieurs gènes spécifiques à la souche Paris, une souche retrouvée dans le monde entier dans les cas de légionellose humaine. La région portant les gènes lpp0068-lpp0080 est spécifique à souche Paris. Il a été montré ici que l'opéron cyoABC (lppO291-lppO297), la région 1pp2111-1pp2125 et lppO779 codant un auto transporteur sont spécifiques des souches de Sgl Paris avec une seule exception (Cazalet et al., 2008, Genome Res. 2008). Les inventeurs ont donc défini des jeux d'amorces et testé leur efficacité (sensibilité) et spécificité par une étude de concordance entre PCR et méthode de référence (culture et sérotypage). Par comparaison des séquences des trois gènes spécifiques du Sgl (wzm, wzt, lpp0831) dans les 4 souches de Lp Sg 1 entièrement séquencées (Paris, Lens, Philadelphia-1 ; Corby en cours ; IP et équipes allemandes) nous avons pu définir les régions le plus conservées. Nous avons testé 4 paires d'amorces pour chaque gène et nous les avons testées pour leur spécificité et efficacité sur une collection des 464 souches. 424 souches appartenant aux genres Legionella et 40 présentes habituellement dans l'eau (espèces choisies selon la Norme AFNOR XP T90-471). Le test de chaque jeu d'amorces était réalisé et comme contrôle positif, une amplification spécifique du gène mip (spécifique du genre Legionella) était utilisée. Ceci nous a permis de choisir des amorces spécifiques pour Sgl. Des études menées au laboratoire en ce moment portant sur le séquençage du cluster spécifique de LPS dans les différents sérogroupes de L. pneumophila vise à définir des gènes spécifiques à chaque sérogroupe permettant ainsi de développer des tests PCR pour l'identification de chaque sérogroupe. A ce jour nous avons séquencé les régions portant les gènes codant les protéines impliquées dans la biosynthèse du LPS des Sg 6, 10, 12, 13 et 14. Le séquençage de cette région dans la souche du Sg 3 (le troisième Sg impliqué dans la maladie humaine) est en cours. Ainsi, la détermination des amorces spécifiques de ces autres Sg était faite et leur spécificité a été testée de la même façon que pour le Sgl. Nous avons séquencé également le génome d'une souche de L. longbeachae, deuxième cause de légionellose humaine dans le monde, particulièrement en Océanie. Les analyses montrent que les gènes codant le LPS de L. longbeachae sont très différents de celui de Lp. Nous avons donc aussi défini des amorces spécifiques et nous les avons testés, afin de mettre au point un test universel regroupant les principales légionelles pathogènes. Exemple 3 : PCR Quantitative avec les amorces P65-P66 (spécifique Sgl) Résultats Quantité Quantité ADN testé théorique Ct Ct moyen estimée (UG) (UG) Estimation de la limite de détection y=-2,8117392x+35,852413 ; r2=0,998 25 000 23,56 25 000 23,45 23,48 25 135 25 000 23,43 2 500 26,15 2 500 25,83 26,05 3 064 2 500 26,17 250 29,18 250 29,52 29,39 199 250 29,46 25 32,63 L.pneumophila 25 32,67 32,72 13 Sgl Philadelphia 25 32,86 15 32,80 15 33,30 33,25 8 15 33,66 35,09 5 34,11 34,87 2 5 35,42 2,5 35,85 2,5 36,26 36,06 1 2,5 ND Blanc 0,0 ND ND Premier résultat négatif pour 2,5UG : limite de détection entre 2,5 et 5 UG Estimation de la limite de quantification y=-3,3054514x+38,245598 ; r2=0,999 25 33,15 25 34,10 25 33,61 25 33,52 25 35,41 33,62 25 25 33,65 25 33,30 25 33,19 25 34,33 25 35,03 34,95 35,26 8 L.pneumophila Sgl Philadelphia 40 10 35,23 10 33,82 10 35,06 10 36,90 10 34,77 10 34,77 10 36,91 10 35,63 10 34,55 Blanc 0,0 ND ND Résultats sur différentes souches de s s 1 y=-3,188165x+42,18248 ; r2=0,993 L.pneumophila Sgi 25 000 28,11 souche Paris 25 000 27,80 27,95 29 188 25 000 27,93 L. pneumophila Sgi 25 000 27,47 environnementale 25 000 27,55 27,51 39 914 n°59 (HL02292010) 25 000 27,52 Blanc 0 ND ND y=-3,0301416x+41,322914 ; r2=0,986 2 500 30,99 2 500 31,12 31,02 2 506 L.pneumophila Sgi 2 500 30,96 souche Paris 25 36,52 25 38,48 37,67 16 25 38,01 2 500 30,91 2 500 30,78 30,85 2 859 L.pneumophila Sgi 2 500 30,86 souche Lens 25 38,38 25 36,68 37,08 25 25 36,18 2 500 32,05 2 500 31,94 31,97 1 218 L.pneumophila Sgi 2 500 31,93 souche Corby 25 39,29 25 37,97 38,38 9 25 37,87 L.pneumophila Sgi 2 500 29,49 CNR1-A1 2 500 29,85 29,74 6 629 (HL07073023) 2 500 29,89 L.pneumophila Sgi 2 500 28,97 CNR1-B1 2 500 29,09 29,05 11 256 (HL07034031) 2 500 29,08 L.pneumophila Sgi 2 500 27,15 CNR1-C1 2 500 27,36 27,25 43 975 (HL07103003) 2 500 27,25 41 L.pneumophila Sgi 2 500 29,50 CNR1-D1 2 500 29,88 29,72 6 748 (LGO8015025) 2 500 29,78 L.pneumophila Sgi 2 500 28,74 CNR1-G1 2 500 28,70 28,75 14 138 (LG08075006) 2 500 28,80 L.pneumophila Sgi 2 500 27,80 CNR1-C2 2 500 28,13 28,02 24 496 (LG08111019) 2 500 28,14 L.pneumophila Sgi 2 500 29,11 CNR1-E3 2 500 29,16 29,16 10 301 (LG07285012) 2 500 29,22 ND Blanc 0 ND y=-2,1367867x+33,91827 ; r2=0,964 L.pneumophila Sgi 2 500 25,96 CNR1-B1 après purif. 25,82 6 165 Avant purif. : 11 256 (HL07034031) 2 500 25,68 L.pneumophila Sgi 2 500 26,18 CNR1-C1 après purif. 26,23 3 963 Avant purif. : 43 975 (HL07103003) 2 500 26,28 L.pneumophila Sgi 2 500 25,30 CNR1-G1 après purif. 25,26 11 333 Avant purif. : 14 138 (LG08075006) 2 500 25,21 L.pneumophila Sgi 2 500 25,51 CNR1-C2 après purif. 25,64 7 525 Avant purif. : 24 496 (LG08111019) 2 500 25,76 L.pneumophila Sgi 2 500 25,99 CNR1-E3 après purif. 25,94 5 417 Avant purif. : 10 301 (LG07285012) 2 500 25,89 ND Blanc 0 ND y=-2,8159485x+39,023796 ; r2=0,998 2 500 28,40 2 500 28,49 28,46 5 626 L.pneumophila Sgi 2 500 28,50 n°165 25 34,03 (HL02324052) 25 33,43 34,08 57 25 34,77 2 500 27,53 2 500 27,14 27,34 14 136 L.pneumophila Sgi 2 500 27,34 n°166 (EUL1) 25 31,77 25 32,24 32,11 285 25 32,32 L.pneumophila Sgi 2 500 26,08 26,07 39 934 n°167 (00514008) 2 500 26,08 2 500 26,04 25 30,44 25 30,31 30,35 1 203 25 30,30 Blanc 0 0 ND - Résultats sur des mélanges d'ADN sgl et non-se y=-3,3251033x+38,06712 ; r2=0,996 L.pneumophila Sgi 2 500 27,82 Philadelphia 2 500 27,98 27,83 1 199 + eau 2 500 27,69 L.pneumophila Sgi 2 500 27,79 Philadelphia 2 500 27,71 27,77 1 247 + 25 000 UG Lp sg6 2 500 27,82 L.pneumophila Sgi 2 500 27,84 Philadelphia + 25 2 500 27,40 27,80 1 227 000 UG L.longb. 2 500 28,15 Blanc 0 37,38 37,38 1,6 Résultats sur des ADN non-sgl y=-3,3251033x+38,06712 ; r2=0,996 25 000 ND L.pneumophila sg6 000 ND 35,55 5,7 25 n°13(CIP103860) 25 000 35,55 25 000 36,73 L.longbeachae n°5 000 ND 36,73 2,5 25 (NSW150) 25 000 ND 25 000 34,76 L.pneumophila sg2 000 36,96 35,86 4,6 25 n°8 (CIP103856) 25 000 ND Blanc 0 37,38 37,38 1,6 La présence d'ADN non-sgl n'a pas influencé la quantification de l'ADN sgl. y=-3,0301416x+41,322914 ; r2=0,986 L.pneumophila sg2 2 500 ND CNR1-E10 2 500 ND ND (LG07291025) 2 500 ND Blanc 0 ND ND y=-3,188165x+42,18248 ; r2=0,993 L.pneumophila sg7 25 000 ND 25 000 ND ND n°14 (CIP103861) 25 000 ND Blanc 0 ND ND y=-2,8117392x+35,852413 ; r2=0,998 Serratia 250 000 ND marcescens n°102 250 000 ND ND 250 000 ND Serratia plymuthica 250 000 ND 250 000 ND ND n°122 250 000 ND Acinetobacter Iwoffii 250 000 ND 250 000 ND ND n°123 250 000 ND Enterobacter 250 000 ND aerogenes n°129 250 000 ND ND 250 000 ND Blanc 0 ND ND Exemple 4: PCR Quantitative avec les amorces P69-P70 (spécifique L. longbeachae) Gamme étalon Faite à partir d'ADN L. longbeachae ATCC33462 (extrait par le kit Quiagen) Quantité en UG calculé par dosage au nanodrop, sachant que 1 UG de L. pneumophila = 4,3 fg d'ADN soit 250.000 UG = 1 ng d'ADN (2 �l à 0,5 ng/�l par réaction de qPCR) Résultats ADN testé Quantité théorique (UG) Ct Ct moyen Quantité estimée (UG) Estimation des limites de détection et quantification y=-3,78788x+44,52163 ; r2=0,996 250 000 250 000 250 000 25 000 25 000 Legionella 2 500 longbeachae 2 500 ATCC33462 250 250 250 25 25 25 Blanc 0,0 24,15 23,77 24,01 260 057 24,11 27,98 27,81 25 815 27,64 31,21 31,27 3 151 31,33 35,70 34,24 35,60 227 36,85 ND ND ND - ND ND ND - Résultats sur différentes ADN L.longbeachae y=-3,78788x+44,52163 ; r2=0,996 Legionella 25 000 29,36 longbeachae n°93 25 000 29,65 29,43 9 642 (C4E7) 25 000 29,28 Legionella 25 000 28,38 longbeachae n°94 25 000 28,70 28,53 16 631 (98073) 25 000 28,52 Legionella 25 000 29,40 longbeachae n°95 25 000 29,30 29,19 11 157 (98072) 25 000 28,87 Blanc 0,0 ND ND - y=-2,4527311x+40,17975 ; r2=0,967 Legionella 2 500 28,89 28,94 38 422 longbeachae n°5 2 500 28,98 (NSW150) Legionella 2 500 30,77 30,52 8 718 longbeachae n°97 2 500 30,26 (NSW150) Legionella 2 500 29,80 30,23 11 446 longbeachae n°98 2 500 30,65 (NSW150) Legionella 2 500 28,46 28,86 41 225 longbeachae n°100 2 500 29,26 (NSW150) Blanc 0,0 ND ND - Résultats sur des ADN non-L.longbeachae y=-3,78788x+44,52163 ; r2=0,996 Legionella 2 500 ND pneumophila sgl 2 500 ND ND Philadelphia 2 500 ND Exemple 5 : PCR Quantitative en multiplex avec les amorces P65-P66/P69-P70 (spécifique L. longbeachae) Gammes étalons P65-P66 : Faite à partir d'ADN L. pneumophila sgl souche Philadelphia (extrait par le kit Quiagen) P69-P70 : Faite à partir d'ADN L. longbeachae ATCC33462 (extrait par le kit Quiagen) Les deux gammes étalons ont été faites séparément (pas en multiplex). Résultats Quantité ADN testé théorique Ct (UG) Quantité Ct moyen estimée (UG) Remarques P65-P66 : y=-3,3054514x+38,245598 ; r2=0,999 P69-P70 : y=-3,78788+44,52163 ; r2=0,996 L.pneumophila Sgi 2 500 27,02 Philadelphia 2 500 27,09 27,17 2 242 2 500 27,40 Legionella 2 500 32,09 longbeachae 2 500 31,54 31,47 2 785 On obtient de bonnes ATCC33462 2 500 30,79 quantifications en multiplex, avec des gammes étalons L.pneumophila Sgi 250 30,17 30,55 2 242 réalisées en simplex. Philadelphia 250 30,93 La présence des 4 Legionella 2 500 30,58 primers et 2 sondes longbeachae 2 500 32,20 31,77 2 326 dans la même réaction ATCC33462 2 500 32,53 n'influence donc pas la quantification. Les 2 500 27,15 primers et sondes ne L.pneumophila Sgi 2 638 semblent pas intéragir Philadelphia 2 500 26,92 26,94 ensemble. 2 500 26,74 Legionella 250 35,90 longbeachae 250 34,67 35,38 260 ATCC33462 250 35,56 REVENDICATIONS1. Utilisation de la séquence nucléique du gène wzm (ABC transporter of LPS 0-antigen) de Legionella pneumophila, sa séquence complémentaire ou inverse, ou l'un de leurs fragments, comme marqueur spécifique pour la détection et/ou l'identification d'une bactérie appartenant à l'espèce Legionella pneumophila sérogroupe 1 (L. pneumophila Sgl). 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence nucléique utilisée est une séquence choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence du gène wzm de Legionella pneumophila, souche Paris (NCBI séquence référence : NC 006368.1 datée du 26 avril 2009, �locus tag 1pp0837 � de séquence SEQ ID NO: 1 ci-après) ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides d'une séquence telle que définie en a) ; c) la séquence d'un variant du gène wzm, présentant au moins 80 % avec la séquence SEQ ID NO: 1, la séquence de ce variant comprenant au moins la séquence conservée que l'on souhaite détecter et/ou identifier pour une bactérie L. pneumophila Sgl ou comprenant au moins une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 95 %, avec ladite séquence conservée ; d) la séquence complémentaire ou inverse d'une séquence telle que définie en a), b) ou c), Séquence SEQ ID NO: 1 1 atgacctcaa tatcctcaaa aactcagacg tttaaagaaa cagtagtcta tggagttgat 61 aagtttaggc ttttagctgt tttaagaaat atatgggatt accgcttgct tttatggatt 121 ttttgtaaac gagatctcaa agggcgttac agtcaaacca tcttgggatt gggttgggtt 181 attttaactc ctttgattac ggttggggtg tttgtcattg tttttggcat catgataaag 241 gtacctaccg atgggctgcc tactgtcatg ttctatttgg ttgcggttat accttggtat 301 tcctttttaa atgttctcaa cccttccata caaatgattg agggaaatgc ttcgttaata 361 acaaaggtct attttccaag agcgttgata ggcggtgcct atgctatggg agctgcggtt 421 gattttctga tggcttatgt gtttttgata accccctttg caatttatta tggcctttgg 481 tctatcaagt tattaattat tatgccattc ctgctgatat ctaccttaat gattggatta 541 ggtattggtt tggttttagc acctatcaat gcaaaatata gggatattaa acattttatg 601 cctctggctt tgcagttatt ttattactcc actccagcga tttaccctgt ttctgctgtg 661 cctgtgtggg ctaaaccatg gtatgctgtt aatccattat ctcttgttat caccagttat 721 cgagaggtgt taatggggca ttggccatca cctactataa taatgacatt atctggtatg 781 gcaattataa ctttccttgt ggggcttgtt gcatttcatc acatggagca taaggtagtt 841 gatattttat ga. 3. Procédé de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 (L. pneumophila Sgl) dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étape de détection ou d'identification de la présence d'une séquence d'une région conservée du gène wzm pour les bactéries appartenant au sérogroupe 1 de l'espèce Legionella pneumophila. 4. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite séquence de la région conservée du gène wzm pour les bactéries L. pneumophila Sgl est la séquence d'un fragment conservé de la séquence SEQ ID NO: 1, ou la séquence de l'un de ses variants ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1, leur séquence complémentaire, ou leur séquence inverse. 5. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit fragment conservé de la séquence SEQ ID NO: 1 est un fragment d'au moins 25 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 50, 75, 100, 200 et 250 nucléotides consécutifs, de la séquence nt 99-392 de la séquence SEQ ID NO: 1. 6. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit fragment conservé de la séquence SEQ ID NO: 1 est un fragment d'au moins 25 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 50 et 75 nucléotides consécutifs, de la séquence nt 138-214 de la séquence SEQ ID NO: 1. 7. Procédé de détection ou d'identification selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que ledit échantillon est un échantillon liquide ou d'air susceptible d'être contaminé par une bactérie de l'espèce L. pneumophila, en particulier d'une bactérie appartenant au sérogroupe 1 (L. pneumophila Sgl). 8. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit échantillon est un échantillon d'eau, notamment émanant de circuit de distribution d'eau ou de circuit de refroidissement. 9. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit échantillon est un échantillon d'air. 48 10. Procédé de détection ou d'identification selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification d'un ADN isolé à partir dudit échantillon en utilisant un couple d'amorces dont chacune des séquences est capable de s'hybrider dans des conditions d'hybridation standard avec ladite séquence d'une région conservée du gène wzm, ou avec sa séquence complémentaire. 11. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'amplification d'un ADN isolé à partir dudit échantillon en utilisant un couple d'amorces dont chacune des séquences est capable de s'hybrider dans des conditions d'hybridation standard avec ladite séquence d'une région conservée du gène wzm, ou avec sa séquence complémentaire ; b) la mise en contact de l'ADN amplifié avec une sonde nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation standard avec ledit ADN amplifié ; et c) la détection de la formation d'un éventuel complexe d'hybridation et, le cas échéant, sa quantification. 12. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'à l'étape a), ledit couple d'amorces est choisi parmi les couples d'amorces suivants : A) Pl : (SEQ ID NO: 2) et P2 : (SEQ ID NO: 3) ; B) P65 : (SEQ ID NO: 4) et P66 : (SEQ ID NO: 5). 13. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 10 ou 11, caractérisé : A) en ce qu'à l'étape b), ladite sonde est la sonde de séquence (SEQ ID NO: 6) lorsque le couple d'amorces utilisé à l'étape a) est le couple de séquences SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3, de préférence lorsque le procédé ne comporte pas à l'étape c) la quantification du complexe d'hybridation formé ; ou B) en ce qu'à l'étape a), ledit couple d'amorce est le couple d'amorce P65 et P66 de séquence SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5, et la sonde est la sonde de séquence SEQ ID NO: 6, lorsque le procédé comporte à l'étape c) la quantification du complexe d'hybridation formé, de préférence par qPCR. 14. Procédé de détection ou d'identification selon l'une des revendications 3 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de filtration préalable de l'échantillon afin d'augmenter la concentration de bactéries présentes dans l'échantillon initial. 15. Procédé de détection ou d'identification selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en évidence de ladite séquence d'une région conservée du gène wzm, ou avec sa séquence complémentaire, par analyse FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). 16. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'ADN génomique dudit échantillon avec une sonde nucléique marquée, capable de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation standard avec ledit ADN génomique ; et c) la détection de la formation d'un éventuel complexe d'hybridation et, le cas échéant, sa quantification. 17. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ladite sonde marquée utilisée pour l'analyse FISH est une sonde choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID NO: 6, sa séquence complémentaire ou l'un de leurs fragments ayant au moins 15 nucléotides consécutifs ; ou b) une séquence comprenant une séquence telle que définie en a) ou en b). 18. Procédé de détection ou d'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre : - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 par un procédé selon l'une des revendications 3 à 17 ; et - au moins une autre étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila d'un autre sérogroupe, en particulier choisi parmi les sérogroupes 6 et 10, 12, ou,13 et 14. 19. Procédé de détection ou d'identification selon la revendication 18, 30 caractérisé en ce que : a) lorsque le procédé de détection ou d'identification comprend une étape d'amplification, le couple d'amorces utilisé pour la détection ou l'identification de laprésence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe choisi parmi les sérogroupes 6, 10, 12, 13 ou 14 est : - le couple d'amorces de séquences P87/P88 de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella 5 pneumophila de sérogroupe 6 ou 12 ; - le couple d'amorces de séquences P85/P86 de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14 ; et - le couple d'amorces de séquences P91/P92 de séquences SEQ ID NO: 11 et SEQ ID 10 NO: 12 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 13, et b) lorsque le procédé de détection ou d'identification est réalisé par une analyse FISH, la sonde utilisée pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie 15 Legionella pneumophila de sérogroupe choisi parmi les sérogroupes 6 et 12, 13, ou 10 ou 14 est une sonde dont la séquence est choisie parmi les séquences suivantes : - la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences P87/P88 de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 6 ou 12, sa séquence 20 complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15 nucléotides consécutifs, une ou une séquence comprenant une de ces séquences ; - la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences P85/P86 de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14, sa séquence 25 complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15 nucléotides consécutifs, ou une séquence comprenant une de ces séquences ; et - la séquence du produit PCR obtenu par le couple d'amorces de séquences P91/P92 de séquences SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 13, sa séquence 30 complémentaire, l'un de leurs fragments ayant au moins 15 nucléotides consécutifs, ou une séquence comprenant une de ces séquences. 20. Procédé de détection ou d'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila ou d'une bactérie Legionella longbeachae présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre : A) lorsque le procédé de détection ou d'identification comprend une étape d'amplification, - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 ou de sérogroupes 6 et 12, 13, ou, 10 et 14 par un procédé selon l'une des revendications 3 à 14, 18 et 19 ; et - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une Legionella 10 longbeachae comprenant l'amplification d'un ADN isolé dudit échantillon en utilisant un couple d'amorces choisi parmi les couples d'amorces suivants ; - le couple d'amorces de séquences P51/P52 de séquences SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO:14 ; - le couple d'amorces de séquences P69/P70 de séquences SEQ ID NO: 15 et SEQ ID 15 NO: 16 ; et - le couple d'amorces de séquences P73/P74 de séquences SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18, - la mise en contact de l'ADN amplifié avec une sonde nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation 20 standard avec ledit ADN amplifié, et, le cas échéant, - en ce que la sonde choisie est la sonde de séquence : - SEQ ID NO: 19 (sonde Lgbl) lorsque le couple d'amorces choisi est le couple d'amorces de séquences P69/P70 ; et - SEQ ID NO: 20 (sonde Lgb2) lorsque le couple d'amorces choisi est le couple 25 d'amorces de séquences P73/P74, et B) lorsque le procédé de détection ou d'identification est réalisé par hybridation in situ par exemple une analyse FISH, - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 ou de sérogroupes 6 et 12, 13, ou 10 et 14 par un procédé 30 selon l'une des revendications 15 à 19 ; et - une étape de détection ou d'identification de la présence d'une Legionella longbeachae par hybridation in situ, par exemple par une analyse FISH et dont la sondeutilisée pour la détection ou l'identification de Legionella longbeachae est une sonde dont la séquence est choisie parmi les séquences de produit PCR obtenu par un couple d'amorces choisi parmi les couples d'amorces suivants ; - le couple d'amorces de séquences P51/P52 de séquences SEQ ID NO: 13 et SEQ ID 5 NO:14 ; - le couple d'amorces de séquences P69/P70 de séquences SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16 ; et - le couple d'amorces de séquences P73/P74 de séquences SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18, en particulier : 10 - la sonde Lgbl de séquence SEQ ID NO: 19 lorsque le couple d'amorces choisi est le couple d'amorces de séquences P69/P70 ou - la sonde Lgb2 de séquence SEQ ID NO: 20 lorsque le couple d'amorces choisi est le couple d'amorces de séquences P73/P74 ; et la séquence complémentaire de ces sondes, l'un de leurs fragments ayant au moins 15 15 nucléotides consécutifs, leur séquence complémentaire ou fragments d'au moins de 15 nucléotides ou une séquence comprenant une de ces séquences. 21. Procédé de détection ou d'identification selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'à l'étape a), l'amplification de l'ADN isolé est réalisée par un procédé PCR multiplex dans lequel les différents couples d'amorces sont mis en contact 20 simultanément avec ledit ADN isolé de l'échantillon. 22. Procédé de détection ou d'identification selon l'une des revendications 3 à 14 et 18 à 21, caractérisé en ce que l'ADN amplifié, le cas échéant marqué, est mis en contact à l'étape b) avec un support solide sur lequel sont fixées les sondes nucléiques capables de s'hybrider spécifiquement dans des conditions d'hybridation standard avec 25 ledit ADN amplifié. 23. Kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : a) - un acide nucléique isolé ayant pour séquence la séquence d'une région conservée du 30 gène wzm de séquence SEQ ID NO: 1, ou d'un de ses variants, notamment une séquence ayant au moins 80 % avec cette séquence, de préférence choisie parmi les séquences du groupe constitué de : - la séquence d'un fragment d'au moins 25 nucléotides consécutifs, de la séquence nt 99-392 de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'un de ses variants ; - la séquence d'un fragment d'au moins 25 nucléotides consécutifs de la séquence nt 138-214 de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'un de ses variants ; et - leur séquence complémentaire ou leur séquence inverse ; ou b) un support solide sur lequel est fixée une des séquences telles que définies en a). 24. Kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila du sérogroupe 1 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : - un couple d'amorces nucléique capable d'amplifier la séquence d'une région conservée du gène wzm de séquence SEQ ID NO: 1 ou d'un de ses variants, de préférence choisie parmi les couples d'amorces du groupe constitué de : Pl (SEQ ID NO: 2) et P2 (SEQ ID NO: 3); et P65 (SEQ ID NO: 4) et P66 (SEQ ID NO: 5), et, le cas échéant, - d'une sonde, éventuellement marquée, de séquence SEQ ID NO: 6. 25. Kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un kit tel que défini dans l'une des revendications 23 ou 24, et b) 1) au moins un couple d'amorces choisi parmi les couples d'amorces suivants : - le couple d'amorces de séquences P87/P88 de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 6 ou 12 ; - le couple d'amorces de séquences P85/P86 de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella pneumophila de sérogroupe 10 ou 14 ; et - le couple d'amorces de séquences P91/P92 de séquences SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12 pour la détection ou l'identification de la présence d'une bactérie Legionella 30 pneumophila de sérogroupe 13, ou 2) au moins un acide nucléique dont la séquence est une séquence comprenant ou constituée d'un des produits PCR amplifiés par un couple d'amorces tel que défini dans b)l), sa séquence complémentaire ou inverse, un de ses fragments d'au moins 15 nucléotides consécutifs ; ou 3) un support solide sur lequel est fixée l'une des séquences telles que définies en 2). 26). Kit de diagnostic pour la détection et/ou l'identification du sérogroupe d'une bactérie Legionella pneumophila ou d'une bactérie Legionella longbeachae présente dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : A) un kit tel que défini dans l'une des revendications 23 à 25 et B) 1) au moins un couple d'amorces choisi parmi les couples d'amorces suivants : 10 - le couple d'amorces de séquences P51/P52 de séquences SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 ; - le couple d'amorces de séquences P69/P70 de séquences SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16 ; et - le couple d'amorces de séquences P73/P74 de séquences SEQ ID NO: 17 et SEQ ID 15 NO: 18, ou 2) au moins un acide nucléique dont la séquence est une séquence comprenant ou constituée d'un des produits PCR amplifiés par un couple d'amorces tel que défini dans B)1), sa séquence complémentaire ou inverse, un de ses fragments d'au moins 15 20 nucléotides consécutifs ou un support solide sur lequel est fixée l'une de ces séquences, de préférence : un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 19 (sonde Lgbl) ou SEQ ID NO: 20 (sonde Lgb2), sa séquence complémentaire ou inverse ; ou 3) un support solide sur lequel est fixée l'une des séquences telles que définies 25 en 2). 27. Amorce choisie parmi le groupe d'amorces de séquences SEQ ID NOs. 2 à 5 et SEQ ID Nos. 7 à 18. 28. Couple d'amorces choisi parmi le groupe de couple d'amorces de séquences suivantes : 30 a) SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3; b) SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5; c) SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8; d) SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10; e) SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12; f) SEQIDNO: 13 etSEQIDNO: 14; g) SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16; et h) SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18. 29. Sonde choisie parmi le groupe de sondes de séquences SEQ ID NOs. 6, 19 et 20.