Brevet FR2961311A1 — publié le 20111216

Procédé d'identification de cellules eucaryotes par spectrométrie de masse MALDI-TOF La présente invention concerne un procédé d'identification de cellules eucaryotes dans un échantillon biologique. Le vivant se compose de trois mondes, le monde des cellules eucaryotes (cellules pourvues d'un noyau), le monde des bactéries et le monde des archae (cellules dépourvues d'un noyau). Le monde eucaryote comprend des êtres unicellulaires (protozoaires) et multicellulaires (métazoaires). De nombreux paramètres biologiques différencient les trois mondes du vivant tant sur le plan génomique que sur le plan protéique et fonctionnel. Les cellules eucaryotes ne possèdent pas de paroi alors que la membrane plasmique des bactéries est entourée d'une « paroi » osidique riche en lipopolysaccharide (LPS) pour les bactéries à Gram négatif, en peptidoglycane (PGN) pour les bactéries à Gram positif ou en lipoarabinomannane pour les mycobactéries. La membrane plasmique des cellules eucaryotes (qui permet d'établir une frontière entre milieu intérieur et milieu extérieur) est constituée d'une bicouche lipidique dans laquelle sont enchâssées de nombreuses protéines glycosylées ou non. Ce sont tout ou partie de ces protéines qui permettent l'adhésion homotypique (d'une cellule d'un type à une cellule du même type) ou hétérotypique des cellules eucaryotes (d'une cellule d'un type à une cellule d'un autre type), et donc la cohésion tissulaire. Il existe une exception notable à ce principe général d'organisation tissulaire, c'est le sang qui est un liquide dans lequel se trouvent des cellules individuelles qui n'adhèrent pas les unes aux autres, dites cellules circulantes. Les propriétés des protéines intracellulaires diffèrent également selon que ce sont des protéines bactériennes ou eucaryotes. A titre d'exemple, la phosphorylation sur tyrosine largement représentée dans le monde eucaryote est absente (ou faiblement présente) dans le monde bactérien. Enfin, un grand nombre de voies métaboliques sont spécifiques du monde eucaryote (cascades transductionnelles, messagers intracellulaires, molécules de la réponse immune telles que les cytokines etc...). En d'autres termes, la structure génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules eucaryotes est complètement différente de celle des bactéries et on ne peut donc inférer la structure des cellules eucaryotes de celle des bactéries. Les cellules sanguines sont constituées d'une part d'hématies, chargées de l'oxygénation de l'organisme et, d'autre part, de différents types de leucocytes impliqués dans la réponse immune naturelle et/ou spécifique. On distingue trois types majeurs de leucocytes circulants : les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires neutrophiles. Il est apparu au cours des 40 dernières années que les lymphocytes sont constitués de deux sous-populations majeures, les lymphocytes T et les lymphocytes B. Il est apparu plus récemment que les lymphocytes T sont eux-mêmes subdivisés en lymphocytes Ta[3 et Tyb, et qu'on peut distinguer au sein de la population de lymphocytes Ta[3 les lymphocytes qui expriment CD4 ou CD8 et qu'eux-mêmes peuvent regrouper plusieurs populations. En outre, chaque type de cellule immunitaire est sensible à l'activation par des agents exogènes (microorganismes, agents chimiques) ou endogènes (médiateurs du système immunitaire, hormones etc...). Ces différents types d'activation sont difficilement évaluables de façon globale et ne correspondent pas toujours à des états stables. Ainsi, des cytokines comme l'interleukine (IL)-4 d'un côté et l'interféron (IFN-y) de l'autre sont connues pour polariser les lymphocytes Ta[3 (Thi en réponse à l'IFN-y ou Th2 en réponse à l'IL-4). Par ailleurs, les monocytes circulants sont les précurseurs des macrophages tissulaires dont les fonctions microbicides et tumoricides sont contrôlées par le microenvironnement de ces macrophages. Les macrophages résultent de la différenciation des monocytes circulants lorsqu'ils atteignent les tissus. Ils sont au coeur de la réponse immunitaire : ils sont susceptibles de détruire les agents infectieux ou les cellules tumorales; ils influencent la réponse des lymphocytes qui, en retour, contrôlent leur activité. C'est ainsi que, par analogie à la dichotomie Thl-Th2, il a été proposé d'appeler M1 les macrophages pleinement microbicides et tumoricides (macrophages répondant à une cytokine telle que l'IFN-y) et macrophages M2 les macrophages qui répondent par une voie alterne (réponse à l'IL-4, à l'IL-10 ou au Transforming Growth Factor (TGF)-F3). Les propriétés fonctionnelles de ces macrophages sont assez diverses puisqu'ils peuvent être peu ou pas microbicides et qu'ils peuvent moduler la réponse immune de façon plus ou moins efficace. Les méthodes actuelles d'identification des cellules eucaryotes, de type cellules circulantes, comprennent principalement les méthodes a/ à c/ discutées ci-après. a/- Des méthodes basées sur les propriétés tinctoriales et cytochimiques des cellules circulantes. Ces méthodes sont basées sur la morphologie et les propriétés tinctoriales ou cytochimiques des cellules et permettent d'identifier aisément les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires neutrophiles. En revanche, les propriétés tinctoriales, cytochimiques et physiques des cellules circulantes ne permettent pas de reconnaître et d'isoler les sous-populations lymphocytaires et monocytaires et, a fortiori, les sous-populations faiblement représentées. Elles ne permettent pas en conséquence d'apprécier les états fonctionnels de ces cellules qui définissent des sous-populations fonctionnelles, voire des populations anormales présentant des altérations subtiles susceptibles d'apparaître au cours de processus pathologiques. b/- Méthodes biologiques de caractérisation des cellules circulantes par cytométrie en flux Le progrès décisif qui a permis la mise en évidence des sous- populations lymphocytaires a été l'utilisation des anticorps monoclonaux. Lorsque la population cellulaire à analyser peut être caractérisée par un marqueur spécifique et qu'on dispose de tels anticorps (à titre d'exemples, anticorps anti-CD4, anticorps anti-CD8), l'étude des populations de lymphocytes T CD4+ et de lymphocytes T CD8+ est réalisée aussi bien dans le milieu de la recherche qu'en routine hospitalière. La cytométrie en flux est une technique qui analyse en quelques minutes la fluorescence de cellules individuelles au sein de grands échantillons cellulaires. La contrainte de la cytométrie en flux est qu'il est nécessaire de disposer d'anticorps spécifiques que l'on rend fluorescents après marquage direct ou indirect (après fixation sur la molécule d'anticorps d'un anticorps spécifique d'espèce ou d'isotype, lui-même fluorescent). On peut ainsi détecter au sein d'une population cellulaire donnée la présence de tel ou tel type cellulaire. A titre d'exemple, on peut rechercher la présence de lymphocytes T au sein des cellules mononucléées (anticorps anti-CD3) ou de lymphocytes T CD4+ (anticorps anti-CD3 marqués avec un fluorochrome et anticorps anti-CD4 marqués avec un autre fluorochrome). La cytométrie en flux est une technique non seulement analytique mais également préparatoire. Des cytomètres dédiés permettent de séparer, juste après leur analyse, les cellules marquées par des anticorps spécifiques des cellules non marquées (ou marquées différemment). Il est ainsi possible de récolter les cellules possédant telle ou telle propriété antigénique. La cytométrie en flux présente cependant certaines limites comme technique analytique. Il n'existe pas le plus souvent de marqueur isolé qui soit spécifique d'une population cellulaire donnée. Seule une combinatoire de marqueurs permet de définir les diverses sous-populations lymphocytaires ou macrophagiques. Dans ce contexte, des cytomètres multi-couleur sont indispensables puisqu'il faut associer chaque marqueur à un fluorochrome donné. L'approche en cytométrie en flux connaît un degré de complexité supplémentaire quand les marqueurs sont des moléculaires intracellulaires, ce qui nécessite une perméabilisation préalable des cellules. Lorsque ces marqueurs sont des molécules inductibles susceptibles d'être sécrétées (souvent des cytokines), il est nécessaire d'inclure dans le schéma expérimental des inhibiteurs de l'exportation afin d'augmenter la concentration intracellulaire dudit marqueur et sa détection. Ces approches, plus délicates à mettre en oeuvre, sont habituellement réservées aux protocoles de recherche. C'est ainsi que la mise en évidence des cellules T régulatrices nécessite l'utilisation combinée de marqueurs membranaires (CD4 et CD25) et intracellulaires (Foxp3). La situation est encore plus complexe avec les cellules myéloïdes : les monocytes et les macrophages peuvent être sommairement différenciés les uns des autres par l'expression respective de CD14 et de CD68. Mais, il n'existe pas de marqueurs phénotypiques qui permettent de caractériser leurs réponses aux stimuli auxquels ils sont soumis. Tout au plus la molécule CD163 permettrait-elle de caractériser les macrophages activés par l'IL-4. Il apparaît ainsi que la cytométrie en flux ne permet pas de caractériser l'état fonctionnel des cellules myéloïdes (monocytes circulants et/ou macrophages). Limites de la cytométrie en flux comme technique préparatoire Malgré une commercialisation ancienne, cette technique demeure onéreuse, lourde à mettre en place et demande un personnel spécialisé. Elle reste restreinte à un petit nombre de laboratoires spécialisés. c/- Méthode des puces à ADN Très récemment, les techniques d'étude d'expression des gènes à haut débit comme les puces à ADN ("microarray") ont permis de caractériser différentes populations fonctionnelles de macrophages à partir de nombreux paramètres. Cette méthode présente certaines limites car elle nécessite d'avoir à disposition un type cellulaire donné (par exemple, des macrophages isolés par une méthode classique) que l'on compare alors à d'autres types cellulaires (tels que les lymphocytes T) ou que l'on active ex vivo afin d'obtenir des macrophages dits activés (voir ci-après). Il s'agit en outre d'une technique lourde nécessitant l'obtention d'ARN en grande quantité et de haute qualité. L'analyse des données en est délicate et demande des temps incompatibles (souvent, de nombreuses semaines) avec une recherche clinique utile au malade. Enfin, l'expression des gènes est très versatile et n'a pas la robustesse de l'expression protéique utilisée en cytométrie en flux pour identifier les populations cellulaires. Le but de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode d'identification d'un type donné de cellules eucaryotes dans un échantillon biologique à analyser, susceptible de contenir des cellules eucaryotes. Plus particulièrement, un autre but de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode d'identification de cellules eucaryotes, qui permette de caractériser un type cellulaire non ou mal caractérisable par des anticorps spécifiques. La spectrométrie de masse est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Elle permet en outre de caractériser la structure chimique des molécules en les fragmentant. Son utilisation, facile, rapide et peu coûteuse, s'est largement répandue dans de nombreux domaines scientifiques, y compris en biologie. C'est ainsi que, associée à d'autres approches, elle permet l'étude du protéome. Etendue récemment à la médecine, elle permet d'étudier le sérum des patients, un mélange complexe de protéines, ce qui peut être utile au diagnostic de différentes maladies. La spectrométrie de masse sous sa variante MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight) est récemment entrée dans les laboratoires de microbiologie. Elle permet en effet la détection des toxines bactériennes. Elle permet également d'identifier et de classifier différents types bactériens en utilisant des bactéries intactes. En effet, parmi les divers composants identifiés dans un spectre de spectrométrie de masse MALDI-TOF, certains semblent spécifiques d'une espèce bactérienne précise. C'est ainsi que la comparaison de leurs spectres a permis en 2007 d'identifier différentes espèces et sous-espèces de staphylocoques coagulase-. Les spectres diffèrent également selon que les souches de Staphylococcus aureus sont résistantes ou non à certains antibiotiques. Enfin, il a été possible d'identifier en 2008 un grand nombre d'espèces bactériennes dans des prélèvements cliniques en utilisant des banques de données fabriquées à partir de chacune de ces espèces. On a découvert, selon la présente invention, qu'il était possible d'identifier, c'est-à-dire de caractériser de manière spécifique, des types de cellules eucaryotes par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, puisque seules les protéines cytosoliques (de type intracellulaire) s'ionisent et sont détectées du fait de leur petite taille et de leur solubilité et non, comme dans la méthode de cytométrie de flux, les protéines de surface de la membrane cellulaire, lesquelles présentent des masses moléculaires beaucoup plus élevées allant de 30 à 100 kDa et nécessitent l'utilisation d'anticorps pour révéler leur présence. Les inventeurs formulent l'hypothèse que cette caractérisation spécifique résulte de ce que, lors d'une spectrométrie de masse du type MALDI-TOF, lesdites protéines intracellulaires sont en nombre suffisant et leur nature et leur proportion relative sont suffisamment distinctes et variables et donc spécifiques entre les différents types cellulaires eucaryotes pour permettre une caractérisation spécifique du type de cellules par une analyse du spectre de masse de cette combinaison de protéines. Les inventeurs ont donc mis en évidence des signatures spécifiques de différents types de cellules eucaryotes par analyse des spectres obtenus par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Plus précisément, la présente invention fournit un procédé d'identification d'un type donné de cellules eucaryotes dans un échantillon biologique, à analyser, susceptible de contenir des cellules eucaryotes, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes successives dans lesquelles : 1/ on établit au moins un spectre de référence par spectrométrie de masse, dite de type MALDI-TOF ("matrix-assisted-laser-desorption- ionisation-time-of-flight"), d'au moins un échantillon de référence, d'au moins un type donné de cellules eucaryotes, ledit échantillon de référence étant constitué de cellule eucaryotes entières purifiées contenant au moins 95% de cellules dudit type donné, et 2/ on réalise, si nécessaire, l'extraction des cellules eucaryotes contenues dans ledit échantillon biologique à analyser pour obtenir un extrait de cellules eucaryotes, et 3/ on réalise un spectre par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF d'un dit extrait de cellules eucaryotes obtenu à l'étape 2/, et 4/ on compare le spectre obtenu à l'étape 3/ avec : 4a/ un spectre de référence d'un extrait purifié dudit type donné de cellules eucaryotes préalablement réalisé à l'étape 1/, si l'on cherche seulement à identifier si ledit échantillon à analyser comprend un type de cellules eucaryotes dudit type donné de cellules eucaryotes, ou 4b/ une pluralité de spectres de référence réalisés à l'étape 1/ à partir d'une pluralité d'échantillons de référence d'une pluralité de différents types donnés de cellules eucaryotes, ladite pluralité de spectres de référence constituant une banque de spectres de référence desdits différents types donnés de cellules eucaryotes, si l'on cherche à identifier si ledit échantillon à analyser comprend un type de cellules eucaryotes choisi parmi différents types donnés de cellules eucaryotes dont les spectres sont inclus dans ladite banque de spectres de référence, et 5/- on identifie un type de cellules eucaryotes de l'extrait obtenu à l'étape 2/, provenant dudit échantillon à analyser, de l'une au moins des deux manières suivantes : 5a/ soit comme étant identique à un dit type donné de cellules eucaryotes, si, lors de l'étape 4/ ci-dessus, on retrouve dans le spectre obtenu à l'étape 3/ l'ensemble des pics caractéristiques d'un dit spectre de référence, 5b/ soit comme étant proche d'au moins un dit type donné de cellules eucaryotes, en caractérisant la proximité du spectre obtenu à l'étape 3/ par rapport à au moins un dit spectre de référence d'au moins un dit type donné de cellules eucaryotes par détermination du nombre de pics caractéristiques en commun entre le spectre obtenu et celui d'au moins un dit spectre de référence d'au moins un dit type donné de cellules eucaryotes. De préférence, de façon connue, la proximité entre un spectre 30 analysé et une pluralité de spectres de référence peut être déterminée par une analyse par classification hiérarchique, encore appelée "clustering" et représentée graphiquement sous forme de dendogramme en fonction du nombre de pics en commun qu'ils partagent entre eux, comme explicité dans les exemples ci-après. On entend ici par "échantillon biologique", aussi bien un échantillon sanguin que tout prélèvement clinique ou échantillon tissulaire provenant d'un patient. De même, selon la présente invention, on entend par "type de cellules", une cellule eucaryote d'une nature particulière donnée dans un état donné normal ou pathologique du tissu d'origine et/ou dans un état d'activation par un facteur d'activation donné desdites cellules le cas échéant. En particulier, dans le cas des macrophages, les cytokines sont des facteurs d'activation connus pour moduler la réponse des macrophages et induire des états d'activation caractéristiques, en particulier les cytokines choisies parmi l'IL-4, l'IL-10, l'IFN-y, le Tumor Necrosis Factor (TNF), le TGF-(31. Les macrophages sont également connus pour être stimulés par des facteurs d'activation tels que les lipopolysaccharides (LPS) ou les peptidoglycanes (PGN). A l'étape 1/, les échantillons de référence contiennent 100% de dites cellules, dans le cas de lignées de cellules, et au moins 95% de dites cellules eucaryotes dans le cas de cellules primaires. On entend ici par "cellules primaires", des cellules isolées d'un échantillon biologique. On entend ici par "pic caractéristique", un pic dont l'intensité relative, exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité, est supérieure à au moins 3 fois celle du bruit de fond. On entend ici par "pic en commun entre le spectre obtenu et un spectre de référence", un pic dont la masse moléculaire ne se différencie pas de plus de ±1 Da par rapport à la masse moléculaire du pic du spectre de référence et présentant une intensité relative ne s'écartant pas de ±20% de la valeur d'intensité relative dudit pic dans le spectre de référence exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité dans le spectre, comme explicité ci-après. La spectrométrie de masse MALDI-TOF permet de caractériser les cellules eucaryotes entières en absence de tout marquage préalable, ce qui constitue un progrès majeur par rapport aux techniques existantes, en particulier la cytométrie de flux. Cette approche est simple à mettre en oeuvre, reproductible, rapide et peu coûteuse. Elle est suffisamment résolutive pour permettre de caractériser différents états d'activation d'une population cellulaire donnée, notamment les états d'activation des macrophages humains. Une banque de données de spectres qui en résulte permet d'identifier toute population cellulaire inconnue comme appartenant ou pas aux populations cellulaires présentes dans la base de spectres. Cette banque de données peut donc, en outre, être utilisée pour caractériser différents types de cellules eucaryotes au cours de leur isolement à partir de tissus normaux ou pathologiques contenant plusieurs populations cellulaires. Dans un mode préféré de réalisation, à l'étape 2/ on réalise la séparation des différents types de cellules eucaryotes contenues dans ledit extrait de cellules eucaryotes, pour obtenir au moins un extrait purifié contenant au moins 95% d'un type de cellules eucaryotes. Les méthodes physiques de séparation de différents types cellulaires de cellules circulantes sont bien connues de l'homme de l'art. Elles reposent essentiellement sur l'observation des différences de densité des cellules circulantes. C'est ainsi que les hématies et les polynucléaires neutrophiles ont une densité supérieure à 1,077 et que les monocytes et les lymphocytes ont une densité inférieure à 1,077. Lorsqu'on dépose les cellules circulantes sur une barrière de densité égale à 1,077 et que l'on centrifuge les cellules, celles-ci se positionnent selon leur densité : les hématies et les polynucléaires neutrophiles se situent sous le liquide (solution de Ficoll) de densité 1,077 et les cellules mononucléées, monocytes et lymphocytes, se situent à la surface de cette solution de Ficoll. Il suffit donc de prélever les hématies et les polynucléaires, d'une part, et les cellules mononucléées, d'autre part. D'autres propriétés "physiques" ont permis d'extraire les polynucléaires neutrophiles du mélange hématies + polynucléaires neutrophiles. Une première méthode d'extraction consiste à effectuer un choc osmotique auquel les hématies sont particulièrement sensibles puisqu'elles sont lysées après 30 s de contact avec de l'eau. On récupère ainsi les polynucléaires neutrophiles dont les propriétés peuvent être cependant plus ou moins altérées. La seconde méthode d'extraction consiste à incuber le mélange hématies + polynucléaires neutrophiles avec du dextran T-500 à une concentration finale de 1,5%, ce qui provoque l'agglutination des hématies. Ces hématies agglutinées sédimentent bien plus rapidement que les polynucléaires neutrophiles et, après environ 30 min, on peut récupérer le surnageant fortement enrichi en polynucléaires neutrophiles. Enfin, les propriétés adhésives des monocytes sont mises à profit pour séparer monocytes et lymphocytes. C'est ainsi que, incubés dans un milieu contenant 10% de sérum de veau foetal, les monocytes adhèrent au plastique des boîtes de culture en 30 à 60 min, mais pas les lymphocytes. On peut ainsi récupérer dans le surnageant de culture les lymphocytes et les cellules adhérentes sont considérées comme des monocytes. D'autres méthodes préparatoires des cellules circulantes par sélection positive ou négative sont connues, telle qu'une méthode d'isolement d'un type cellulaire de plus en plus répandue, consistant à coupler à des billes magnétiques des anticorps spécifiques d'un type cellulaire et à placer ces billes magnétiques dans une colonne adossée à un aimant. Lorsque le mélange cellulaire est déposé sur la colonne, seules les cellules reconnues par l'anticorps présent à la surface des billes magnétiques sont retenues, les autres sont recueillies (sélection "négative" des cellules qui n'expriment pas le caractère phénotypique sélectionné). On peut ensuite éloigner l'aimant de la colonne, ce qui a pour effet de décrocher les cellules de cette colonne et on peut ainsi les récupérer (sélection "positive" des cellules qui expriment le caractère phénotypique sélectionné). On peut ainsi purifier les monocytes en utilisant des anticorps anti-CD14 ou les lymphocytes T avec des anticorps anti-CD3. On connaît également des méthodes de préparation de types cellulaires constituant un tissu autre que le tissu sanguin, tel que, par exemple, le placenta. Les méthodes pour isoler les différents types de cellules présents dans un tissu, comportent les étapes suivantes : - une étape de lavage et de découpage du tissu en petits fragments, - une étape de digestion enzymatique pour dissocier les cellules les unes des autres, - une ou des étapes de séparation des divers types cellulaires par méthode physique mettant à profit leurs propriétés physiques (différence de densité) ou par "méthode biologique" par sélection positive ou négative d'une population donnée. Les méthodes biologiques nécessitent l'utilisation d'anticorps dont la spécificité est connue (cytométrie en flux, colonnes d'affinité), - des méthodes de suivi de ces étapes de séparation afin de s'assurer de la qualité de la purification des différents types cellulaires. Avantageusement, un spectre d'un type donné de cellules est réalisé à partir d'un extrait cellulaire présentant une concentration cellulaire d'au moins 105 cellules/1 µl dudit type de cellules. Ce seuil de 105 cellules/µl doit être respecté pour réaliser les spectres de référence à l'étape 1/, ainsi que les spectres de l'échantillon à analyser à l'étape 3/. Plus particulièrement, aux étapes 1/ et 3/, on ne prend en compte lesdits spectres d'échantillons de référence et spectres d'échantillons à analyser que si lesdits spectres présentent un score de qualité supérieure à 2, ledit score de qualité étant constitué de l'addition des deux notes ni et n2 ayant chacune une valeur de 0 à 6 avec : - ni est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques dudit spectre n, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 2 ci-après, et - n2 est la note attribué en fonction de la valeur du rapport signal/bruit (Rmax) du pic de plus grande intensité dudit spectre, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 2 ci-après. Plus particulièrement encore, les pics desdits spectres sont définis par une paire de coordonnées composées d'une abscisse constituée du rapport masse/charge (m/z) de 2 000 à 15 000 Da, plus particulièrement de 3 000 à 7 000 Da, la coordonnée en ordonnée étant une intensité relative ou en unité arbitraire, et on retient de préférence dans le spectre au moins les 70 pics de plus grandes intensités. On entend ici par "intensité relative", une intensité exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité ou autrement exprimée par le rapport de (intensité du pic/ intensité du bruit de fond). Plus particulièrement encore, on cherche à identifier un type donné de cellules et on réalise desdits spectres de référence pour au moins un type donné de cellules choisi parmi les 22 types de cellules eucaryotes suivants : - monocytes humains - lymphocytes T humains - polynucléaires neutrophiles humains - hématies humaines - macrophages humains différenciés de monocytes - macrophages murins différenciés de moelle osseuse - lignée de cellule humaine myélomonocytaire THP-1 - lignée de cellule murine macrophage immature J774 - lignée de cellule canine macrophage DH82 - cellules dendritiques différenciées de monocytes - lignée de cellule humaine C8166 de lymphocytes exprimant CCR5 - lignée de cellule murine de type fibroblastique L929 - lignée de cellule humaine de type épithélial HeLA - lignée de cellule humaine de type épithélial 293T - lignée de cellule humaine de type trophoblastique JEG - lignée de cellule humaine de type trophoblastique BeWo - cellules placentaires de trophoblastes humains - lignée de cellule XTC-2 de Xenopus laevis - cellules d'amibe Acanthamoeba polyphaga - cellules d'amibe Acanthamoeba castelanii - cellules d'amibe Hartmanella vermiformis - cellules d'amibe Poteriochromonas melhamensis. Plus particulièrement encore, les spectres de référence des 22 types de cellules eucaryotes comprennent les 70 pics de plus grande intensité mentionnés dans les tableaux 1 à 22 suivants, dans lesquels les différents pics caractéristiques sont caractérisés par leurs coordonnées en abscisse m(Da)/z et leurs coordonnées en ordonnée d'intensité relative exprimées en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité (%). Dans les tableaux 1 à 29 ci-après : - les valeurs mentionnées sont des valeurs moyennes d'intensité relative et de masse moléculaire, - les valeurs d'intensité relative sont mentionnées dans les colonnes situées juste à droite des colonnes correspondantes de masse moléculaire m/z, - les valeurs des masses moléculaires m/z peuvent varier jusqu'à f 1 Da de la valeur moyenne mentionnée dans les tableaux, et - les valeurs d'intensité relative peuvent varier jusqu'à ±20%, plus généralement ±5%, de la valeur moyenne d'intensité relative mentionnée dans les tableaux, et - . Dans les tableaux 1 à 29 et dans les figures, on fait état de la valeur m/z, z représentant la charge électrique de l'espèce ionisée. Mais, en pratique, m/z peut être assimilé à la masse moléculaire m, avec z=1, car la quantité de protéines qui s'ionisent 2 fois (z=+2), voire 3 fois (z=+3), est négligeable, compte-tenu de la limite de sensibilité des techniques de mesures. Tableau 1 : Analyse du spectre des monocytes humains circulants intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3054 0,88 3519 1,23 4664 0,89 3136 0,90 3543 0,83 4892 1,08 3152 1,03 3560 0,78 4916 1,07 3168 0,83 3585 0,91 4933 19,50 3186 0,88 3609 1,30 4960 100,00 3205 0,87 3626 0,73 4981 9,30 3256 0,88 3694 0,75 4999 2,23 3275 0,70 3707 1,60 5022 1,35 3285 0,87 3767 1,00 5042 1,10 3306 0,97 3789 0,90 5413 9,28 3327 1,49 3815 0,89 5421 2,05 3336 0,77 3933 0,85 5629 0,80 3354 1,28 3952 0,79 5648 4,01 3369 22,75 4044 1,65 5670 1,90 3391 1,45 4062 0,94 5689 2,22 3408 1,14 4074 11,42 5710 1,18 3424 1,28 4115 0,74 6571 1,97 3428 1,15 4158 0,80 6882 2,47 3440 29,28 4205 1,01 6903 1,28 3454 2,44 4226 0,87 6997 2,07 3463 1,71 4287 0,86 7340 1,47 3475 1,89 4305 0,84 10825 8,63 3484 19,88 4418 0,87 3506 1,33 4627 1,83 Tableau 2 : Analyse du spectre des lymphocytes T humains circulants intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3090 0,77 4631 2,49 6860 2,30 3111 1,17 4669 1, 27 6889 10,89 3141 0,92 4703 0,79 6921 2,01 3187 1,51 4718 0,80 6949 2,42 3359 1,07 4790 0,85 6977 1,58 3371 6,01 4891 0,94 7003 4,77 3442 5,05 4904 0,86 7019 1,50 3456 1,43 4919 3,11 7091 0,81 3486 13,05 4936 20,09 7259 1,33 3502 1,28 4963 100,00 7420 0,90 3610 1,11 4984 10,90 8563 1, 55 3709 1,84 5001 3,14 9261 1,72 3738 1,11 5025 2,40 10833 1,43 3769 0,93 5064 0,84 10888 1,50 3816 1,54 5108 0,94 11130 0,97 3876 1,18 5134 0,86 11305 3,31 4122 1,32 5416 1,67 11346 1,41 4281 1,11 5444 0,75 13699 1,44 4314 0,85 5633 0,93 13719 2,16 4324 4,43 5652 5,06 13774 5,96 4381 1,06 5673 2,07 13825 1,63 4552 0,91 5992 0,85 14006 2,16 4569 6,12 6344 1,07 4592 3,11 6575 1,13 Tableau 3 : Analyse du spectre des polynucléaires neutrophiles humains intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3033 0,20 3614 1,93 4367 0,30 3046 0,47 3633 0,83 4385 4,60 3062 0,45 3653 0,15 4422 0,97 3088 0,20 3678 0,30 4440 0,77 3093 0,50 3712 3,77 4512 1,10 3114 1,63 3735 0,30 4559 0,73 3136 0,20 3758 0,17 4647 0,25 3190 0,37 3817 0,37 4668 0,45 3203 0,33 3885 0,47 4789 0,30 3259 0,50 3920 0,30 4923 0,65 3288 0,23 3935 0,60 4940 2,97 3330 0,83 3980 0,73 4967 71,93 3342 0,30 4003 2,67 4988 4,93 3359 0,85 4030 0,60 5137 0,15 3374 37,80 4052 0,40 5145 0,25 3431 2,35 4110 0,30 5225 0,40 3445 94,47 4171 0,20 5421 7,17 3467 4,80 4193 0,93 6349 0,47 3489 15,93 4232 0,53 6581 2,43 3510 0,90 4283 2,87 7770 0,20 3519 0,57 4295 0,50 10841 3,77 3564 0,53 4312 1,03 13163 0,20 3579 1,60 4328 40,53 3590 2,00 4349 0,93 Tableau 4 : Analyse du spectre des hématies humaines intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3038 1,39 5014 1,18 7655 4,33 3091 0,68 5032 5,02 7673 1,63 3284 0,74 5043 34,03 7711 0,81 3430 0,89 5075 2,60 7731 0,70 3588 0,71 5095 2,01 7852 0,65 3675 0,74 5107 2,29 7882 1,36 3772 1,01 5158 0,90 7902 1,58 3782 5,52 5252 0,69 7917 3,02 3797 0,97 5273 1,08 7936 14,83 3822 0,65 5290 4,81 7960 3,64 3911 0,69 5308 0,91 7981 1,53 3969 1,46 5358 0,75 8016 1,31 4024 0,97 5497 1,16 8292 2,42 4073 0,65 5553 2,41 8310 5,29 4123 0,90 6122 0,58 8330 0,98 4146 1,31 6838 0,89 8550 0,90 4154 2,59 7488 1,17 8567 2,90 4165 0,89 7504 2,42 8587 0,88 4250 0,65 7518 4,49 10089 0,93 4284 2,41 7547 22,24 14935 0,93 4295 0,74 7565 100,00 14957 1,39 4514 0,96 7610 8,45 14980 1,92 4896 0,78 7638 6,33 4999 0,71 7645 6,80 Tableau 5: Analyse du spectre des macrophages humains dérivés des monocytes intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3088 1,28 4746 18,67 6189 15,20 3094 2,66 4768 1,02 6330 0,84 3124 1,02 4803 6,70 6343 0,92 3142 1,48 4873 1,40 6634 0,96 3247 1,05 4908 9,65 6867 1,28 3442 1,08 4917 3,66 6888 5,07 3456 1,80 4936 15,49 6904 2,41 3790 1,56 4963 100,00 6921 1,17 3989 2,51 4981 14,46 7001 2,06 4099 1,10 5001 4,98 7035 0,87 4168 1,06 5024 2,80 7266 0,93 4225 3,57 5044 1,04 8448 1,32 4260 1,36 5066 1,25 8562 1,27 4282 1,56 5107 1,00 9587 1,00 4422 3,36 5188 1,06 9673 0,84 4455 1,15 5204 10,18 9744 1,79 4479 1,20 5223 0,82 9757 0,96 4572 1,33 5416 2,18 9849 0,99 4584 11,34 5651 2,98 9907 0,94 4605 1,24 5672 1,10 10005 1,27 4630 0,96 5825 1,32 10832 1,34 4641 3,20 6129 1,72 13773 1,56 4689 0,90 6157 2,25 4736 2,62 6173 5,70 Tableau 6 : Analyse du spectre des cellules dendritiques différenciées de monocytes humains intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3054 0,32 4631 0,50 6174 1,83 3086 0,37 4736 0,69 6190 0,80 3094 0,47 4747 0,93 6222 0,73 3110 0,68 4803 0,45 6275 0,96 3140 0,48 4848 0,40 6545 0,37 3227 0,50 4875 1,03 6647 1,11 3274 0,39 4892 2,18 6868 0,49 3303 0,38 4904 1,49 6888 1,58 3324 0,50 4920 3,98 6905 0,70 3417 0,47 4936 50,94 6977 0,32 3443 1,62 4963 100,00 7002 0,57 3457 2,80 4984 11,32 7850 0,47 3601 0,30 5001 5,44 8086 0,37 3773 0,41 5025 2,43 8212 0,43 3790 4,57 5043 0,85 8526 0,36 3813 0,36 5067 1,31 8550 1,04 3986 0,32 5081 0,53 8564 2,82 4045 0,32 5108 1,12 8582 0,58 4105 0,41 5134 0,73 9260 0,47 4226 0,82 5152 0,40 9745 0,56 4282 1,55 5205 0,85 11605 0,41 4308 0,81 5649 1,20 13771 0,64 4586 0,83 5802 0,39 4603 0,33 5824 0,39 Tableau 7 : Analyse du spectre des macrophages murins dérivés de moelle osseuse intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3028 2,09 4818 2,25 6225 17,62 3085 2,40 4848 1,68 6241 3,97 3113 2,29 4869 2,02 6254 1,48 3148 2,17 4923 9,61 6287 8,82 3178 1,38 4936 10,42 6433 4,39 3288 1,43 4963 100,00 6647 1,30 3457 2,81 4982 13,40 6892 6,55 3921 1,42 5002 3,93 6901 8,34 3990 1,88 5025 3,90 6961 3,33 4014 1,45 5653 5,26 7023 3,75 4169 3,04 5671 1,70 7045 2,30 4213 5,97 5706 2,91 7206 1,37 4226 6,43 5850 1,56 8449 3,49 4287 1,93 5906 1,30 8563 2,72 4437 2,95 5967 1,91 9530 3,12 4456 1,54 6020 4,05 9549 1,41 4472 1,50 6083 1,80 9697 4,20 4491 1,48 6098 1,40 9737 5,28 4585 1,85 6110 4,14 9864 1,57 4599 9,48 6135 2,33 9877 2,48 4656 1,42 6156 1,49 9908 2,39 4683 1,60 6170 22,90 13788 2,95 4735 2,09 6189 1,83 4762 9,75 6208 1,68 Tableau 8 : Analyse du spectre des cellules THP1 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3089 0,70 4902 0,66 6510 0,49 3112 0,57 4920 2,11 6545 0,63 3139 0,57 4937 12,54 6648 1,91 3273 0,50 4964 100,00 6867 0,79 3304 0,41 4985 12,56 6893 3,49 3324 0,71 5002 4,23 6900 2,43 3417 0,55 5026 4,33 6924 0,79 3442 0,61 5045 1,36 6950 0,55 3457 5,42 5066 0,69 6977 0,75 3478 0,44 5109 0,64 7003 1,11 3519 0,46 5135 0,67 8086 0,57 3564 0,47 5154 0,48 8401 0,59 3792 0,40 5264 0,47 8550 0,80 4044 0,48 5650 1,41 8564 2,27 4077 2,16 5674 0,50 9244 1,17 4123 0,63 5935 0,43 9262 3,93 4201 0,44 5993 0,99 9284 0,86 4211 0,81 6058 0,50 9955 0,45 4283 1,21 6134 0,61 11986 1,11 4597 0,73 6159 0,40 13729 0,98 4621 0,61 6174 2,47 13782 2,18 4631 3,34 6191 0,42 13823 0,98 4640 0,83 6224 1,13 4892 0,74 6276 1,58 Tableau 9 : Analyse du spectre des cellules J774 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3042 2,29 4358 2,95 6210 2,88 3097 1,95 4460 2,52 6224 2,88 3111 1,97 4592 1,73 6253 2,31 3139 1,80 4603 2,05 6276 9,09 3153 6,61 4733 1,87 6490 2,05 3275 1,86 4748 4,43 6546 3,46 3325 2,41 4920 2,51 6612 2,38 3425 2,73 4937 9,30 6634 1,63 3458 13,16 4964 100,00 6648 11,75 3602 2,10 4986 11,23 6901 2,63 3626 9,98 5003 5,51 6978 1,66 3708 1,98 5026 1,87 6993 2,86 3791 15,68 5122 1,66 8394 2,13 3911 3,37 5140 2,12 8424 2,93 3923 3,24 5189 3,22 8437 5,28 3945 1,69 5325 3,08 8450 14,88 3962 2,29 5405 1,84 8472 2,14 3975 2,16 5495 4,59 8531 2,21 3991 9,23 5643 2,01 8551 2,21 4050 2,07 5790 2,93 8565 13,49 4078 2,26 5821 2,35 8586 2,36 4214 1,77 6061 4,49 9404 1,54 4226 4,77 6078 2,45 4283 4,52 6170 1,88 Tableau 10 : Analyse du spectre des cellules DH82 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3069 5,40 4891 0,55 6189 2,63 3094 0,56 4902 0,60 6210 1,01 3113 0,59 4919 2,22 6227 9,22 3124 0,46 4936 10,77 6245 5,16 3139 0,64 4963 100,00 6280 5,36 3303 0,35 4984 9,68 6297 0,67 3324 0,63 5001 3,71 6544 0,51 3415 0,47 5024 1,26 6646 2,37 3441 0,53 5042 0,52 6887 0,97 3456 5,08 5064 0,47 8085 0,48 3808 0,41 5107 0,64 8416 0,87 3841 0,41 5134 0,57 8432 1,56 3921 0,52 5151 0,36 8447 5,56 4043 0,34 5183 0,64 8548 0,80 4225 2,50 5414 0,40 8563 2,26 4282 0,84 5649 1,07 8892 0,38 4415 0,36 5839 0,57 9245 0,85 4446 0,34 5934 0,49 9419 0,91 4591 0,36 5984 0,41 9887 0,64 4622 0,86 6061 2,55 11679 0,91 4710 0,77 6078 2,24 11966 0,37 4746 0,83 6099 2,47 12157 0,79 4859 0,35 6117 2,27 4876 0,47 6169 0,44 Tableau 11 : Analyse du spectre des lymphocytes T humains C8166 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3042 1,34 4921 2,39 6926 2,01 3057 1,10 4938 16,65 6979 1,34 3113 1,14 4965 100,00 7004 2,63 3140 1,11 4987 16,56 7500 0,94 3271 1,51 5004 5,34 8088 1,35 3310 2,15 5028 4,63 8532 1,20 3326 1,24 5049 1,45 8553 3,29 3444 2,52 5068 1,14 8567 9,95 3458 10,40 5654 2,31 8586 1,77 3479 1,25 5676 1,19 9264 2,52 3723 1,29 5803 1,14 10641 1,00 3792 1,14 5994 1,14 10893 1,05 4045 1,14 6052 1,14 11252 1,36 4078 7,82 6065 1,25 11308 1,77 4087 2,87 6083 6,64 11608 0,99 4136 1,07 6108 1,37 11989 1,22 4189 1,42 6226 2,85 13734 2,55 4210 2,98 6277 3,67 13773 5,93 4228 0,95 6547 1,55 13800 4,23 4284 3,88 6649 4,39 13824 2,68 4475 1,24 6712 1,10 13852 1,71 4591 2,14 6869 1,73 14009 1,61 4603 1,13 6889 7,37 4632 2,15 6903 4,44 Tableau 12 : Analyse du spectre des cellules L929 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3113 3,98 4957 8,55 7205 3,04 3138 3,18 4978 3,14 8071 5, 20 3271 2,97 5704 3,39 8522 3,84 3309 2,54 5768 2,61 8549 13,70 3323 5,51 5813 3,97 8563 26,71 3400 2,93 6043 7,25 8585 4,65 3416 4,87 6061 13,64 9263 3,46 3442 22,60 6083 5,37 9290 11,89 3458 86,43 6154 8,47 9402 3,54 3478 5,30 6169 11,67 9908 9,33 3787 6,08 6208 8,06 10585 3,05 3919 2,44 6224 26,12 10942 3,40 3988 2,38 6248 5,84 11541 4,58 4077 4,75 6274 14,42 11632 4,39 4208 2,93 6284 4,35 12126 7,56 4276 3,10 6542 6,33 12161 7,95 4282 9,32 6602 2,77 13712 4,76 4645 5,11 6621 7,09 13730 7,43 4699 2,77 6645 26,24 13756 10,77 4738 3,09 6813 4,52 13786 14,42 4760 6,14 6882 8,70 13821 5,07 4891 2,70 6894 12,97 13997 5,10 4923 17,71 6977 5,63 4937 66,44 7003 5,24 Tableau 13 : Analyse du spectre des cellules HeLa intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3144 3,97 4986 6,16 7259 3,79 3153 2,71 5184 4,33 7484 3,35 3229 6,84 5317 2,73 7508 7,30 3324 6,57 5476 2,69 7522 5,14 3458 31,07 5497 3,15 7768 3,26 3627 7,54 5624 5,96 7783 3,29 3725 9,52 5653 5,75 7885 3,36 3792 12,10 5994 5,39 8088 4,82 3818 8,80 6011 7,03 8436 4,36 3832 7,24 6027 20,22 8452 19,29 3911 3,39 6075 7,27 8531 3,38 4228 8,97 6176 5,63 8551 8,21 4284 11,50 6224 7,07 8567 29,32 4508 4,01 6242 5,23 9264 8,64 4593 5,33 6276 16,15 10641 4,41 4632 8,29 6288 22,92 10891 3,34 4712 2,96 6378 2,66 11309 5,38 4738 9,86 6547 6,07 11989 5,42 4749 4,25 6649 20,79 13731 7,55 4760 2,99 6865 4,27 13748 11,77 4894 3,19 6890 22,72 13777 19,46 4923 4,50 6979 4,87 14011 5,93 4938 100,00 7004 8,54 4965 79,93 7094 2,98 Tableau 14 : Analyse du spectre des cellules 293T intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3112 3,08 5224 2,25 8433 2,31 3139 2,95 5262 3,38 8451 8,28 3274 2,24 5306 1,81 8476 2,69 3325 3,79 5651 6,90 8502 5,21 3442 2,44 5803 2,96 8526 13,68 3457 31,08 5993 3,66 8550 34,95 3791 17,10 6061 1,86 8565 100,00 3991 1,79 6137 2,17 8603 6,83 4226 3,08 6174 3,43 8894 1,93 4262 2,60 6224 10,50 9245 5,39 4274 6,06 6276 13,94 9262 15,74 4283 35,23 6384 1,76 9418 2,22 4292 6,76 6545 8,28 9517 2,96 4333 1,68 6633 2,04 9955 1,96 4593 2,63 6648 15,66 10522 4,35 4632 10,43 6780 3,15 10639 2,98 4668 2,22 6889 13,78 10890 3,01 4709 1,97 6903 9,15 11307 4,80 4759 2,73 6977 6,28 11607 5,24 4921 2,16 7003 9,69 11987 4,95 4937 43,30 7093 2,13 13772 13,12 4964 15,48 7883 3,23 13993 4,56 4979 2,25 8086 3,08 5140 5,05 8213 2,34 Tableau 15 : Analyse du spectre des cellules BeWo intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3085 1,63 4282 4,12 6545 2,76 3099 1,74 4332 1,37 6647 9,16 3109 6,51 4419 5,03 6887 5,33 3117 6,99 4476 3,03 6903 2,51 3139 2,80 4589 1,62 6976 3,23 3273 3,16 4631 1,95 7001 2,21 3324 3,05 4675 1,98 8086 2,18 3360 1,55 4736 1,90 8212 6,64 3379 1,67 4750 1,68 8341 2,31 3416 1,63 4872 1,51 8407 3,41 3441 2,34 4892 2,45 8418 4,63 3457 26,94 4923 4,86 8435 8,29 3479 2,41 4937 84,89 8450 27,43 3750 2,51 4958 8,80 8468 6,05 3775 5,40 4977 2,58 8549 3,07 3790 99,08 5326 1,44 8564 10,42 3812 9,54 5366 1,35 8582 2,33 3831 2,22 5649 2,73 9261 2,08 3961 4,73 5772 4,21 9500 2,22 4041 6,19 5930 1,90 9955 1,43 4103 2,32 5994 1,55 13738 1,88 4147 1,45 6222 5,63 13776 3,46 4226 11,28 6275 8,82 4245 8,29 6478 1,88 Tableau 16 : Analyse du spectre des cellules JEG intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3043 2,87 4292 2,32 6223 6,48 3075 1,80 4377 1,84 6275 7,27 3086 1,65 4387 3,10 6545 2,02 3101 3,28 4403 4,07 6629 1,62 3118 44,80 4419 42,00 6647 9,27 3140 6,69 4441 4,27 6882 2,36 3191 3,74 4461 2,30 6901 2,28 3200 2,73 4499 3,10 6977 2,29 3273 3,32 4590 1,52 7001 2,60 3325 2,44 4631 2,54 8086 2,37 3361 10,37 4676 2,13 8402 3,02 3380 2,81 4840 4,55 8414 7,28 3399 1,93 4893 2,62 8436 1,93 3417 2,19 4907 2,14 8525 2,80 3442 3,95 4922 5,97 8549 7,81 3457 40,68 4937 100,00 8564 22,76 3479 4,82 4961 19,40 8582 5,79 3518 1,65 4983 3,82 8603 2,09 3791 5,67 5000 1,88 9261 3,78 4042 2,51 5649 2,38 10890 2,10 4077 4,93 5771 1,53 11986 1,97 4178 1,66 5915 1,87 13778 3,90 4209 4,71 5930 10,24 4283 6,68 6174 1,74 Tableau 17 : Analyse du spectre des trophoblastes placentaires intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3043 1,14 4283 0,54 5186 1,22 3139 0,60 4366 0,46 5617 1,01 3172 0,86 4457 0,57 5650 0,95 3188 0,50 4632 0,65 5763 0,53 3209 0,77 4710 0,56 5805 0,52 3295 0,54 4723 0,63 5912 1,29 3325 0,95 4738 6,38 5995 1,24 3416 0,75 4759 0,66 6055 1,41 3442 0,87 4863 0,62 6085 11,67 3458 6,05 4879 0,99 6107 1,68 3479 0,59 4894 2,90 6176 0,89 3520 0,92 4905 1,78 6226 1,05 3607 0,83 4923 5,74 6276 1,75 3640 0,67 4938 80,14 6547 0,80 3664 1,20 4965 100,00 6649 2,36 3711 0, 64 4987 15, 36 6889 1, 37 3791 0,56 5002 6,36 8088 0,52 3887 0,65 5027 5,25 8296 0,67 3927 0,51 5047 1,33 8436 1,14 3958 0,63 5067 0,97 8452 3,75 3974 0,55 5084 0,71 8471 0,72 4046 0,53 5109 1,11 9263 0,69 4148 0,52 5124 0,63 4227 3,42 5136 0,56 Tableau 18 : Analyse du spectre des cellules XTC-2 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3076 1,12 4781 1,09 6632 0,91 3112 1,04 4945 0,91 6646 6,69 3123 1,12 4962 2,16 6893 1,48 3267 0,93 4977 1,48 6954 2,17 3295 0,81 4992 6,11 7228 0,63 3324 1,40 5006 100,00 8072 2,01 3334 0,66 5028 13,71 8434 0,75 3415 0,98 5045 4,31 8450 1,20 3441 1,65 5067 1,35 8522 0,98 3456 19,83 5179 0,56 8547 3,38 3477 1,54 5580 1,92 8562 12,26 4037 0,86 5610 0,70 8580 2,38 4076 2,81 5764 2,64 8601 4,29 4207 1,19 5842 1,53 8620 0,87 4216 1,94 5856 5,83 8638 0,85 4226 0,66 5873 1,01 9356 1,68 4282 3,87 6000 1,82 9411 0,99 4301 1,01 6011 2,27 9430 2,80 4590 0,61 6159 0,79 9561 2,28 4677 1,69 6205 0,90 9711 1,29 4702 2,49 6222 4,44 11528 1,11 4716 37,50 6245 6,27 13784 1,04 4738 2,58 6526 1,13 4756 0,92 6557 0,70 Tableau 19 : Analyse du spectre de cellules d'Acanthamoeba polyphaga intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3060 8,07 4241 4,74 6137 8,45 3078 6,24 4249 11,96 6154 4,56 3085 6,41 4300 15,11 6169 10, 55 3121 4, 58 4310 4,15 6376 20,15 3188 7,11 4334 4,13 6480 9,99 3240 8,81 4429 5,38 6508 4,56 3273 3,94 4444 18,82 6770 4,76 3299 9,46 4678 6,64 6787 4,34 3333 6,67 4731 19,10 7162 4,82 3357 4,57 4815 4,18 7204 4,42 3385 6,91 4835 36,21 7474 10,09 3400 100,00 4859 5,46 7500 3,49 3422 5,72 4870 6,79 8018 11,16 3463 5,37 5091 3,53 8497 17,95 3547 5,08 5223 3,62 8584 6,58 3620 6,53 5321 4,29 8599 24,27 3676 3,97 5481 3,87 8857 5,61 3715 4,31 5552 17,23 9617 5,80 3737 11,26 5700 5,60 9653 16,72 3810 4,12 5746 3,56 9669 46,51 3944 4,39 5910 8,62 9719 4,97 4010 6,49 5930 26,42 9729 3,91 4157 4,32 6047 23,14 4191 4,40 6069 6,11 Tableau 20 : Analyse du spectre de cellules d'Acanthamoeba castellanii intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3068 3,41 5581 18,16 7462 6,37 3175 4,52 5699 3,03 7472 13,32 3239 3,07 5746 3,05 7498 2,77 3300 2,73 5929 15,53 7595 1,97 3359 5,60 5946 2,56 7909 2,38 3384 9,19 6001 1,95 8017 6,91 3400 100,00 6045 2,50 8465 3,41 3421 7,03 6061 5,41 8482 14,08 3462 5,78 6103 2,49 8546 3,83 3545 2,47 6123 4,09 8561 5,79 3737 7,31 6136 15,87 8582 10,14 4009 3,34 6150 4,93 8598 31,73 4024 5,54 6169 9,49 8617 7,57 4191 3,83 6193 2,36 8980 2,34 4241 7,36 6375 8,41 8992 2,23 4299 13,30 6452 4,04 9612 2,90 4310 3,20 6479 5,26 9632 4,89 4824 2,94 6581 3,16 9657 8,95 4841 15,73 6598 16,80 9682 23,03 4849 6,80 6618 4,68 9697 10,91 4923 4,72 7210 2,29 9740 2,28 5122 3,25 7340 3,52 11856 2,35 5253 1,95 7404 2,81 5479 3,39 7414 4,75 Tableau 21 : Analyse du spectre de cellules d'Hartmannella vermiformis intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3098 9,90 4117 4,14 5886 3,83 3108 4,21 4235 3,58 6096 4,85 3205 3,85 4261 3,94 6153 4,90 3232 4,26 4307 5,59 6179 6,38 3242 59,87 4319 34,06 6195 37,21 3255 4,57 4356 3,64 6407 11,44 3281 4,62 4526 5,47 6893 4,85 3334 4,22 4565 5,38 6908 25,43 3412 7,16 4705 3,54 7404 6,89 3432 5,68 4754 4,88 7696 4,21 3445 11,45 4763 3,65 7711 20,76 3455 99,08 4884 3,96 8029 8,23 3476 10,55 4980 3,36 8155 3,90 3490 6,06 5193 4,77 8460 7,95 3508 5,45 5205 11,25 8584 8,33 3526 7,17 5212 20,10 8601 13,95 3639 4,40 5401 13,53 8623 30,97 3731 11,34 5475 9,64 8638 89,16 3857 9,30 5526 4,50 8676 6,03 3888 3,84 5600 4,89 10384 4,48 4016 5,84 5624 3,87 10414 11,05 4077 3,72 5736 6,29 10424 17,11 4090 8,38 5812 3,74 4104 3,96 5866 4,20 Tableau 22 : Analyse du spectre de cellules Poteriochromonas melhamensis intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3062 98,39 3753 43,55 4888 16,48 3077 16, 70 3771 34, 70 4906 17, 28 3104 41,86 3785 15,16 5212 15,29 3122 35,84 3839 15,59 5229 15,01 3145 26,53 3867 26,29 5368 32,91 3229 23,89 3913 44,50 5391 24,56 3250 16,77 3932 36,08 5517 16,80 3259 15,84 4077 31,26 5716 15,70 3266 48,55 4094 29,13 5861 13,02 3284 39,80 4110 14,74 5878 24,90 3347 15,55 4125 34,57 5896 50,43 3428 39,06 4143 18,61 6109 33,73 3445 46,39 4239 25,10 6202 16,16 3456 17,13 4257 20,42 6364 15,40 3471 40,61 4289 15,49 6527 18,42 3501 28,85 4298 25,63 6689 15,20 3517 33,41 4306 16,02 6942 50,19 3532 59,21 4344 21,29 7062 26,05 3549 30,20 4401 22,44 7504 16,86 3565 21,08 4419 20,91 7733 34,44 3591 31,08 4563 23,42 7821 15,29 3609 31,14 4581 19,33 8595 18,30 3708 25,39 4726 18,00 3721 16,65 4743 19,48 Dans un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, on cherche à identifier un type donné de cellules eucaryotes choisi parmi les principaux types de cellules immunes circulantes consistant dans les monocytes, les lymphocytes T, les cellules polynucléaires neutrophiles et les hématies. Dans un autre mode de réalisation, on cherche également à identifier les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les cellules dites "natural killer".Selon d'autres caractéristiques particulières du procédé de l'invention : - à l'étape 5/, on cherche à identifier un état d'activation donné par un facteur d'activation donné d'un type donné de cellules eucaryotes, et - à l'étape 4/, on réalise l'une des deux étapes 4a/ et 4b/ suivantes, dans lesquelles - à l'étape 4a/, on établit une comparaison avec un spectre de référence dudit type donné de cellules eucaryotes dans un dit état d'activation donné par un dit facteur d'activation donné, ou - à l'étape 4b/, ladite banque de données de spectres de référence comprend des spectres réalisés à partir d'extraits purifiés de différents types donnés de cellules eucaryotes dans différents états donnés d'activation par différents facteurs d'activation donnés. Plus particulièrement encore, à l'étape 5b/, on identifie un état d'activation d'un type de cellules donné, en caractérisant sa proximité par rapport à différents états d'activation, de préférence par différents facteurs d'activation, d'un type donné de cellules eucaryotes, par caractérisation de la proximité du spectre obtenu à l'étape 3/ par rapport à différents spectres de référence correspondant, respectivement, aux différents états d'activation, de préférence par différents facteurs d'activation, dudit type donné de cellules, par détermination du nombre de pics en commun entre le spectre obtenu et celui d'au moins un dit spectre de référence. L'identification d'un type cellulaire donné d'un échantillon testé par analyse de la proximité du spectre de masse obtenu par rapport aux spectres de référence dans une dite représentation de type clustering, dendogramme ou 2D, est plus particulièrement utile pour caractériser un type de cellules eucaryotes donné dans un état d'activation donné par un facteur d'activation donné par rapport à différents états d'activation de référence par différents facteurs d'activation. Plus particulièrement encore, les différents états d'activation donnés par différents facteurs d'activation donnés de types donnés de cellules eucaryotes sont des états d'activation de macrophages ou cellules humaines circulantes, telles que des monocytes ou lymphocytes, activés par une cytokine choisie parmi IFN-y, TGF-(31, TNF, IL-4, IL-10 ou par un ligand bactérien tel qu'un lipopolysaccharide (LPS) ou peptidoglycane (PGN). Plus particulièrement encore, on cherche à identifier un état d'activation donné d'un macrophage humain par rapport à des états d'activation résultant de traitements pendant 18 heures avec des cytokines choisies parmi IFN-y, IL-4, TNF, IL-10, TGF-(31, du LPS et du PGN, par comparaison avec les spectres de référence comprenant les pics caractéristiques mentionnés dans les tableaux 23 à 29 suivants-, dans lesquels les différents pics caractéristiques sont caractérisés par leurs coordonnées en abscisse m/z (Da) et leurs coordonnées en ordonnées d'intensité relative exprimées en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité (%). Tableau 23 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 20 ng/ml d'IFN-y intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3021 2,13 3417 1,77 4007 2,50 3047 2,22 3426 1,43 4018 1,25 3061 1,90 3442 1,64 4029 2,00 3084 1,20 3516 2,50 4035 1,85 3094 2,39 3533 1,37 4061 2,73 3129 1,97 3545 1,66 4077 100,00 3136 1,90 3555 1,60 4099 3,87 3165 1,43 3584 1,81 4122 1,63 3193 1,69 3615 1,87 4135 3,59 3204 1,89 3638 1,53 4152 1,57 3217 1,74 3713 1,65 4166 1,53 3228 2,45 3747 1,79 4191 1,83 3234 1,84 3822 1,60 4208 24,76 3243 2,05 3834 1,47 4221 1,86 3252 1,92 3842 2,07 4247 1,50 3260 2,23 3856 2,20 4274 3,15 3271 1,53 3868 1,67 4314 1,65 3308 1,80 3873 1,37 4410 1,23 3327 2,37 3878 1,13 4489 1,34 3336 2,33 3886 2,54 4675 1,43 3364 1,76 3911 3,09 4937 1,60 3379 1,70 3922 1,38 4963 2,94 3395 1,40 3933 1,67 3406 1,53 3942 1,76 Tableau 24 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml d'IL-4 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3040 1, 53 3541 1, 28 4209 13,48 3056 1,74 3551 1,27 4228 3,58 3074 1, 57 3613 1, 54 4282 1, 68 3089 1,97 3636 1,60 4354 1,19 3095 2,45 3678 1,62 4392 1,49 3112 1,67 3710 1,28 4478 1,32 3126 1,56 3725 1,70 4490 1,49 3186 1,74 3762 1,59 4587 4,82 3227 2,00 3839 1,50 4643 1,84 3274 1,33 3844 1,94 4738 1,26 3289 1,41 3875 1, 53 4748 5,11 3318 1,77 3889 2,93 4806 2,39 3344 1,63 3913 2,80 4911 2,04 3354 1,58 3926 1,39 4938 27,09 3377 1, 78 3941 1, 63 4965 100, 00 3388 1,48 3971 1,59 4985 6,96 3400 1,70 3991 4,06 5005 1,91 3417 1,57 4008 1,51 5047 1,32 3430 1,41 4034 1, 50 5207 1,47 3444 8,25 4048 1,39 5592 2,11 3459 1, 69 4062 1, 74 5654 1, 78 3479 1,62 4078 46,97 6176 1,52 3489 1,59 4100 2,23 3498 1,51 4138 4,22 Tableau 25 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml de TNF intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3042 2,56 3650 2,85 4566 1,83 3046 1,27 3680 3,03 4587 9,38 3071 2,70 3716 2,33 4609 2,04 3081 4,40 3746 2,80 4643 3,75 3120 2,08 3780 3,40 4749 13,30 3143 3,10 3790 1,88 4771 2,82 3164 3,55 3800 2,00 4797 2,00 3184 2,24 3841 1,88 4806 6,53 3224 2,57 3890 3,77 4875 1,70 3243 2,85 3910 2,33 4910 5,78 3255 2,20 3937 1,78 4923 3,80 3341 2,06 3961 3,35 4938 20,20 3367 2,03 4019 2,33 4965 100,00 3399 2,80 4053 2,24 4987 37,42 3417 1,73 4080 4,80 5008 11,50 3427 2,15 4098 1,80 5030 5,28 3445 21,13 4123 1,23 5049 3,12 3460 3,25 4141 7,55 5096 2,65 3467 2,94 4210 3,15 5206 4,25 3490 2,14 4218 2,80 6175 3,83 3543 2,65 4229 3,92 9749 2,70 3562 1,70 4265 1,47 9847 2,60 3604 2,27 4310 2,65 3631 1,75 4532 1,20 Tableau 26 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml d'IL-10 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3053 2,87 3540 2,11 4048 2,41 3070 2,35 3561 2,21 4062 2,74 3093 3,60 3584 2,77 4077 96,78 3113 2,63 3595 2,82 4099 3,45 3123 2,27 3627 2,38 4120 2,42 3139 3,28 3654 3,01 4125 3,10 3152 2,71 3684 2,14 4135 4,67 3188 2,74 3709 2,33 4191 2,33 3214 2,94 3726 2,09 4208 24,80 3226 3,03 3745 2,24 4239 1,88 3243 2,50 3758 1,96 4275 3,40 3250 2,38 3768 2,77 4337 2,40 3270 2,38 3782 3,52 4394 1,90 3306 2,86 3804 2,01 4642 2,07 3317 3,24 3841 3,08 4668 2,13 3355 2,71 3853 2,32 4747 3,02 3393 2,25 3885 3,61 4803 2,37 3420 2,81 3898 2,49 4936 9,81 3443 5,70 3911 4,38 4954 4,02 3458 2,80 3947 2,09 4963 48,29 3470 3,12 3959 2,54 4984 3,68 3480 3,14 3990 4,55 5652 2,88 3493 3,17 4005 3,19 3518 2,92 4033 2,31 Tableau 27 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml de TGF-(31 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3030 7,50 3758 4,23 4585 22,80 3076 5,55 3803 3,50 4643 12,13 3096 3,58 3822 4,93 4747 27,95 3139 3,93 3849 4,98 4770 2,18 3157 1,70 3889 7,55 4787 3,17 3173 2,37 3911 8,50 4793 3,18 3211 2,77 3959 2,17 4805 19,97 3219 5,00 3984 5,75 4843 4,08 3234 2,93 3991 7,93 4873 4,75 3262 3,97 4053 4,25 4910 10,98 3278 2,82 4058 4,87 4919 5,47 3286 5,15 4078 12,45 4937 28,85 3291 2,75 4094 3,07 4964 100,00 3303 1,33 4100 2,78 4986 19,12 3323 4,08 4120 3,40 5002 15,48 3345 3,53 4139 9,42 5024 5,82 3366 3,83 4227 6,08 5045 3,68 3378 5,25 4256 3,68 5069 6,32 3428 3,38 4283 3,78 5206 11,80 3444 17,45 4310 4,25 5309 5,80 3457 3,97 4398 4,13 6174 10,50 3466 1,83 4424 3,94 6190 3,70 3502 3,10 4432 4,63 3735 5,35 4529 3,50 Tableau 28 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 1 µg/ml de LPS intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3044 3,09 3563 2,04 4100 4,40 3057 2,74 3577 2,56 4105 3,40 3065 2,96 3606 2,35 4123 2,93 3074 3,60 3630 2,20 4136 4,75 3096 3,11 3644 2,34 4166 2,11 3103 2,64 3674 2,18 4192 2,73 3124 2,28 3693 2,40 4210 25,66 3139 3,61 3720 3,25 4223 2,50 3156 3,44 3780 2,43 4228 3,28 3165 2,33 3795 2,53 4276 3,12 3190 2,85 3822 3,03 4311 2,66 3228 2,77 3835 2,36 4440 1,90 3237 2,22 3842 3,33 4461 2,01 3253 2,44 3888 3,01 4490 2,20 3319 2,00 3898 1,80 4534 1,95 3357 2,81 3908 3,95 4589 3,05 3394 2,13 3913 4,55 4606 2,30 3400 2,48 3930 2,50 4748 1,82 3429 2,30 3939 2,15 4806 2,12 3444 4,77 3952 2,00 4938 4,99 3498 2,61 3976 1,97 4965 17,46 3520 2,45 3991 5,98 4986 3,33 3539 2,53 4063 3,52 3554 2,00 4079 100,00 Tableau 29 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml PGN intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3080 1,50 3790 2,37 4747 10,88 3094 1,95 3841 1,72 4769 2,16 3117 2,16 3888 2, 58 4789 0,98 3127 1,52 3911 1,00 4804 8,04 3139 2,60 3989 1,28 4826 1,18 3175 1,29 4048 1,12 4872 1,12 3231 1,10 4077 2,31 4894 1,05 3240 1,66 4097 0,92 4910 4,44 3269 1,63 4120 0,79 4921 2,50 3296 2,14 4137 1,65 4936 18,53 3305 1,43 4209 1,07 4964 100,00 3365 2,18 4227 3,12 4985 24,18 3415 1,47 4262 1,26 5002 11,23 3443 2,94 4281 1,45 5024 4,63 3457 2,41 4310 1,21 5045 2,65 3514 1,03 4322 0,88 5068 2,87 3518 0,90 4423 1,77 5107 1,04 3587 0,88 4454 0,88 5206 1,14 3603 1,19 4480 0,98 5651 1,18 3665 0,84 4585 7,77 6173 6,19 3681 0,98 4607 1,35 6189 2,40 3721 1,47 4625 1,38 9745 1,30 3744 0,90 4642 4,83 3769 1,60 4735 1,80 Le procédé d'identification selon l'invention permet, à l'étape 5/, d'assurer le suivi d'une activation donnée par un facteur d'activation donné d'un type donné de cellules eucaryotes, par comparaison de son spectre de masse avec des spectres de référence de différents états d'activation par au moins un dit facteur d'activation dudit type donné de cellules eucaryotes. Dans un mode de réalisation particulier et avantageux du procédé selon l'invention, à l'étape 5/, on cherche à identifier un type donné de cellules consistant dans des cellules trophoblastes de tissu placentaire humain. Plus particulièrement encore, à l'étape 5/, on contrôle la purification ou on assure le suivi de l'avancement de la purification d'une population d'un type donné de cellules eucaryotes en comparant le spectre obtenu à partir d'un extrait de type de cellules obtenu en cours de procédé de purification, avec un dit spectre de référence dudit type donné de cellules eucaryotes. Avantageusement encore, dans le procédé selon l'invention, lesdites cellules eucaryotes entières que l'on analyse pour en établir le spectre de masse, étaient congelées et ont été décongelées avant d'en établir ledit spectre de masse. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre, faits en référence aux figures 1 à 7, dans lesquels : - la figure 1 illustre la reproductibilité des spectres de différents échantillons de différents types cellulaires obtenus en spectrométrie de masse MALDI-TOF, selon une représentation bidimensionnelle, dite 2D, (A = lymphocytes T, B = monocytes et C = polynucléaires neutrophiles). Sur la figure 1, la position de chaque point correspond à une intensité relative, en pourcentage du pic de plus grande intensité, de deux pics du spectre obtenu par analyse d'un même échantillon, à savoir ici le pic n°2 à 2 320 Da (m/z= 2 320) en abscisses et le pic n°30 à 8 568 Da en ordonnées, lesquels sont des pics caractéristiques que l'on retrouve dans les trois types de spectres de chacun des types cellulaires respectifs concernés; - la figure 2 représente un graphique 1 de classification hiérarchique (dite "clustering") d'analyse de proximité des spectres des cellules suivantes : A = lymphocytes T, B = monocytes, C polynucléaires neutrophiles (PMNs) et D = hématies (RBCs). Une partie haute 2 correspond à une représentation dite en dendogramme du classement hiérarchique du graphique 1 des quatre types cellulaires visualisant la distance (inversement proportionnelle au taux de proximité) entre les différents types cellulaires. La partie 3 correspond aux masses moléculaires des pics présents dans l'un au moins des spectres; - la figure 3 est une représentation en dendogramme de la proximité des spectres de 22 types cellulaires résultant d'une analyse par classification hiérarchique, les valeurs d de 0 à 1 000 sur l'axe sont les niveaux de "distance" entre les types cellulaires concernés. Les distances (d) entre deux types cellulaires sont d'autant plus petites qu'ils sont proches, c'est-à-dire qu'ils ont d'autant plus de pics caractéristiques communs partagés dans leurs spectres (et vice et versa); - la figure 4 représente, en A, le spectre de monocytes de référence de la base de données et, en B, le spectre d'une nouvelle population cellulaire à comparer avec un spectre de référence A de la base de données. Sur la figure 4, les intensités sont exprimées en rapport de l'intensité du pic/intensité du pic de plus grande intensité. Une identité entre deux spectres est déterminée en fonction de la valeur d'un score, appelé score d'identification, tel que calculé par le logiciel Biotyper 2.0, fourni par le fabricant du spectromètre de masse MALDITOF, la société Bruker Daltonics. Dans le cas présent, le score d'identification de 2,65 indique que la population testée est, de façon certaine, constituée de monocytes; - la figure 5 représente une partie des spectres dans la région 2-7 kDa de macrophages dérivés de monocytes incubés pendant 18 heures en présence d'IFN-y, d'IL-4 et en l'absence d'activation ("NS" = macrophages non stimulés, "IFN-y" = macrophages stimulés par "IFN-y" et "IL-4" = macrophages stimulés par IL-4), l'intensité des pics étant exprimée en unité arbitraire (ua). La représentation des spectres sur la figure 5 est obtenue par le logiciel Flexcontrol qui est le logiciel de gestion du spectromètre de masse MALDI-TOF fourni par le fabricant Bruker Daltonics; - les figures 5A, 5B et 5C sont une comparaison des spectres obtenus de macrophages traités par IFN-y ("IFN-y") ou macrophages traités par IL4 ("IL-4") ou macrophages non activés ou encore dits quiescents ("NS"). Sur la figure 5A, on a représenté la reproductibilité des spectres de quatre échantillons de chacun des trois différents types d'activation de macrophages selon une représentation bidimensionnelle, dite en 2D, comme sur la figure 1, en rapportant les intensités relatives, en pourcentage du pic de plus grande intensité, des pics communs caractéristiques n°13 à 4 939 Da en abscisses et n°14 à 4 965 Da en ordonnées, pour chacun des différents types d'activation de macrophages. Sur la figure 5B, on a effectué une classification hiérarchique de proximité des spectres des différents échantillons des différents types d'activation de macrophages, sous forme de graphique 1 faisant apparaître les pics caractéristiques présents dans le spectre du type cellulaire concerné dans les zones hachurées, ledit graphique étant surmonté d'une représentation sous forme de dendogramme 2 visualisant la distance (inversement proportionnelle au taux de proximité) entre les différents types cellulaires, comme sur la figure 2. Au regard du graphique 1, la partie 3 correspond aux masses moléculaires des pics présents dans l'un au moins des spectres. Sur la figure 5C, on a représenté en dendogramme la proximité des spectres de macrophages traités par l'IFN-y et l'IL-4 à 9 heures, 18 heures, 36 heures et 48 heures. Sur les figures 5, 5A et 5B, les échantillons de macrophages étaient activités pendant 18 heures; - les figures 6A, 6B et 6C sont des comparaisons des macrophages stimulés par, respectivement, IFN-y, IL-10, TGF-(31, TNF, IL-4 et des macrophages non stimulés (NS). Les spectres obtenus sont comparés en utilisant différents logiciels pour obtenir une représentation bidimensionnelle, dite en 2D, sur la figure 6A pour vérifier la reproductibilité des spectres, comme sur la figure 1, puis en classification hiérarchique 1 et dendogramme 2 sur la figure 6B et sous forme uniquement de dendogramme sur la figure 6C Sur la figure 6A, les deux pics communs caractéristiques à l'ensemble des spectres de l'ensemble des types d'activation de macrophages testés étaient le pic n°17 à 4 939 Da en abscisses et pic n°10 à 4 209 Da en ordonnées. Sur la figure 6C, les macrophages sont incubés pendant 18 heures ou 36 heures en présence des différentes cytokines. Sur les figures 6A et 6B, les macrophages étaient incubés par les cytokines en cause durant 18 heures; - les figures 7A et 7B représentent des comparaisons des macrophages stimulés par le LPS et le PGN, avec les macrophages non stimulés (NS). Les macrophages sont incubés pendant 18 heures en présence de LPS ou PGN. La figure 7A est une représentation dite en 2D et la figure 7B est une représentation en classification hiérarchique sous forme de graphe 1 et de dendogramme 2, les pics étant classés dans un ordre explicité ci-après en référence à la figure 2. Sur la figure 7A, pour vérifier la reproductibilité des spectres des différents types d'activation de macrophages concernés, on a mesuré les intensités des pics communs caractéristiques n°6 à 4 209 Da en abscisses et pic n°9 à 4 748 Da en ordonnées des spectres desdits échantillons testés. Sur les figures 1, 5A, 6A et 7A, les intensités I des pics sont exprimées en intensités relatives, exprimées en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité. Les inventeurs ont mis en place un protocole expérimental afin d'identifier différents types cellulaires au sein d'échantillons hétérogènes en prenant pour premier exemple les cellules immunes circulantes et pour second exemple les cellules constituant un tissu solide complexe, le placenta. La spectrométrie de masse MALDI-TOF peut ainsi permettre d'étudier la présence de différentes populations au sein des tissus d'organismes supérieurs. Exemple 1 : Analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF des leucocytes circulants 1.1 - Isolement des leucocytes circulants Le sang de volontaires sains (Etablissement Français du Sang, Leukopacks) est dilué dans du NaCl à 0,9% et déposé sur une barrière de densité de Ficoll (MSL, Eurobio), ce qui permet, après centrifugation, d'obtenir d'une part la population cellulaire de densité inférieure à 1,077 c'est-à-dire les cellules mononucléées et d'autre part les cellules de densité supérieure à 1,077 constituées des polynucléaires neutrophiles et des hématies. Les cellules mononucléées constituées pour l'essentiel de monocytes et de lymphocytes T sont récupérées et suspendues dans du RPMI 1640 tamponné avec 20 mM d'Hepes (Invitrogen). Les monocytes et les lymphocytes T sont ensuite isolés par sélection positive en utilisant des billes magnétiques recouvertes d'anticorps dirigés contre les molécules CD14 (monocytes) et CD3 (lymphocytes T) (Miltenyi Biotec). La qualité des préparations de cellules CD14+ ou CD3+ est vérifiée en cytométrie en flux (en général, plus de 98%). Leur viabilité évaluée par exclusion du bleu trypan est supérieure à 95%. Les polynucléaires neutrophiles sont isolés des hématies après une incubation de 30 min dans du Dextran T-500 à 1,5%. 1.2 - Spectrométrie de masse MALDI-TOF sur cellules entières Après comptage des cellules, leur concentration est ajustée à 106/ml en tampon phosphate (PBS). Les tubes Eppendorf contenant 1 ml de cellules sont centrifugés à 300 x g pendant 5 min et le culot cellulaire est repris dans 10 µL de PBS stérile puis congelé à -80°C pendant 48 heures. L'analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF est effectuée en utilisant le spectromètre de masse AutoflexII et le logiciel FlexControl (Bruker Daltonics). Après décongélation douce des échantillons, 1 µL de la suspension cellulaire est déposé sur la cible MALDI sur laquelle 1 µL de la matrice constituée d'acide-a-cyano-4-hydroxy-cynnamique (HCCA) est ajouté. L'évaporation se fait à température ambiante et les molécules de la matrice contiennent celles de l'échantillon sous forme de cristaux. Dans la chambre d'ionisation, ces cristaux sont soumis à un rayonnement de 5 ns du laser réglé à 337 nm et les molécules ionisées libérés sont analysés grâce à leur temps de vol. Le logiciel FlexControl fourni par Bruker Daltonics permet essentiellement l'acquisition des spectres à partir des données brutes. 1.2.1 - Analyse du spectre des leucocytes Dans une première série d'expériences, les inventeurs ont analysé le spectre en spectrométrie de masse MALDI-TOF des leucocytes isolés à partir d'un donneur de sang et congelés. On observe un ensemble de pics dont on peut noter la localisation et l'intensité relative alors que, lorsque l'échantillon déposé ne contient pas de cellules, on n'observe aucun pic. La position et l'intensité relative des 70 pics les plus importants de chaque essai sont pris en compte pour créer une référence "type cellulaire" par le spectromètre de masse. Ce choix de 70 pics s'explique pour des raisons d'efficacité de la banque de données évolutive que les inventeurs ont mise en place. Pour différencier le type cellulaire A du type cellulaire B, il suffit en théorie de 2 pics bien choisis. Mais, pour différencier le type cellulaire C du type A (ou B), ces 2 pics ne suffisent pas : il faut donc leur adjoindre 1 troisième pic qui, à son tour, est insuffisant pour différencier C du type cellulaire D etc... En d'autres termes, on pourrait peut-être se contenter de 50, voire de 30 pics pour différencier les 22 types cellulaires présents dans la base actuelle de données mais ce serait limiter sa puissance de différenciation de nouveaux types cellulaires. Comme chaque spectre contient entre 80 et 100 pics, il a fallu que les inventeurs choisissent entre le nombre maximal de pics représentatifs d'un type cellulaire donné et un nombre trop important pour lequel ils ne disposeraient pas de données : 70 pics leur a paru un nombre raisonnable puisqu'il permet d'acquérir l'ensemble des données quel que soit le type cellulaire étudié et qu'il donne à la base de données sa puissance maximale. La valeur moyenne et l'intensité relative des pics représentifs des monocytes sont données dans le Tableau 1. On observe ainsi un pic majeur à 4960 Da (intensité arbitrairement ajustée à 100%) et de nombreux pics mineurs dont l'intensité relative est calculée en pourcentage de celle du pic de plus grande intensité à 4960 Da. Certains d'entre eux ont une intensité qui représente environ 20% de l'intensité du pic principal alors que d'autres représentent moins de 1% de cette intensité. Pour les autres populations cellulaires de cellules circulantes, les résultats sont rapportés dans les tableaux 2 (lymphocytes T), 3 (polynucléaires neutrophiles) et 4 (hématies). Les inventeurs ont vérifié si le conditionnement des cellules affecte leur profil en spectrométrie de masse MALDI-TOF. Il apparaît que la lyse et la sonication des cellules avant congélation altèrent profondément leur profil. Ils ont également étudié le profil en spectrométrie de masse MALDI-TOF des cellules non congelés. Celui-ci est, en revanche, en tout point comparable à celui obtenu sur cellules congelés, ce qui a deux implications : 1. les pics détectés en spectrométrie de masse MALDI-TOF sur cellules congelées correspondent à une réalité biologique puisqu'ils sont également caractéristiques des cellules vivantes ; 2. la congélation à -80°C pendant 48 heures constitue une méthode simple et reproductible d'analyse des populations cellulaires. Les inventeurs ont également déterminé la concentration des cellules nécessaire pour définir une signature reproductible, l'objectif à atteindre étant de diminuer cette concentration optimale afin de travailler sur des échantillons cliniques de petite taille. Une concentration de 5 x 105 à 106 cellules dans 10 µL de PBS permet d'obtenir une résolution optimale : une concentration de 5 x 106 cellules/10 µL augmente le bruit de fond sans révéler de nouveaux pics et une concentration de 105 cellules/10 µL ne permet pas de révéler l'ensemble des pics. C'est la raison pour laquelle les inventeurs ont adopté une concentration de 106 cellules dans 10 µL de PBS pour l'ensemble des expériences décrites ci-dessous. La localisation et l'intensité relative des pics obtenus sont spécifiques des populations cellulaires et demeurent constantes d'un échantillon à l'autre et d'un donneur de sang à l'autre (8 donneurs différents testés). 1.2.2- Reproductibilité et spécificité des spectres des différents types cellulaires (figure 1) Les inventeurs ont vérifié cette reproductibilité par une représentation bidimensionnelle, dite 2D, obtenue avec le logiciel ClinProTools (version 2.2) à partir de spectres de 8 échantillons de donneurs de sang différents. Ils ont constaté que les signatures en spectrométrie de masse MALDI-TOF, pour deux pics arbitrairement sélectionnés par le spectromètre de masse, sont remarquablement homogènes au sein de chaque type leucocytaire, comme le montre la figure 1. Plus précisément, sur la figure 1, les lymphocytes T (A), les monocytes (B) et les polynucléaires neutrophiles (C) (105 cellules de chaque type cellulaire par dépôt d'1 µl) isolés provenaient de 8 donneurs de sang différents, dont les échantillons de sang étaient congelés dans 10 µl de PBS avant d'être décongelés. Puis 1 µl est déposé sur la cible du spectromètre de masse MALDI-TOF. Le logiciel analyse seulement deux pics caractéristiques communs considérés comme les plus importants (c'est-à-dire les mieux séparés et d'intensité relative la plus élevée possible pour au moins un des pics considérés) que l'on retrouve dans les différents spectres des différents échantillons des différents types cellulaires étudiés. Les deux pics sont choisis en vérifiant également que l'on retrouve le même écart avec le pic qui le précède et le pic qui le suit dans les différents spectres des échantillons testés des différents types cellulaires. En pratique, celui-ci est positionné à l'identique dans les différents spectres à ± 1 Da. Le fait que les écarts d'intensité relative pour ces deux pics restent dans la limite de variation autour d'une valeur moyenne constatée de ± 20% entre les différents spectres d'un même type cellulaire démontre la reproductibilité significative des spectres. Sur la figure 1, les spectres obtenus sont analysés avec le logiciel ClinProTool (version 2.2) qui sélectionne automatiquement 2 pics dont la position est représentée sous forme 2D (un pic sur l'axe x et l'autre pic sur l'axe y) en leur attribuant un numéro (le n° 1 étant attribué au pic de la plus faible masse moléculaire et ainsi de suite) avec la masse moléculaire correspondante. Il s'agit ici du pic 2 de 2320 Da (axe des abscisses) et du pic 30 de 8568 Da (axe des y). La position de chaque point du graphe correspond ainsi à l'intensité relative des 2 pics de chaque échantillon. Un point en bas et à gauche signifie donc que les 2 pics qui caractérisent l'échantillon sont absents ou faiblement présents (ici, les monocytes). Un point en bas et à droite signifie que le pic n° 2 est présent et intense mais le pic n° 30 est peu intense (ici, les neutrophiles). Un point en haut et à gauche signifie que le pic n° 30 est présent et intense mais le pic n° 2 est peu intense (ici, les lymphocytes T). La proximité des échantillons entre eux suggère qu'ils sont susceptibles d'appartenir (seuls 2 pics sont analysés et non l'ensemble des 70 pics) au même type cellulaire alors que leur éloignement montre qu'ils appartiennent à différents types cellulaires. On peut déduire de la figure 1 que les spectres issus de divers échantillons d'un type cellulaire donné sont proches les uns des autres et que les spectres des lymphocytes T (A), des monocytes (B) et des polynucléaires neutrophiles (C) présentent des caractéristiques différentes. 1.2.3 - Spécificité du profil des leucocytes en spectrométrie de masse MALDI-TOF Les inventeurs ont voulu établir si le profil des leucocytes en spectrométrie de masse MALDI-TOF est étroitement spécifique ou représentatif d'une catégorie de cellules circulantes. Pour cela, ils ont comparé le profil en spectrométrie de masse MALDI-TOF des monocytes avec ceux de trois autres populations de cellules circulantes, les lymphocytes T (Tableau 2), les polynucléaires neutrophiles (Tableau 3) et les hématies (Tableau 4). Certains pics présents dans les monocytes sont absents des lymphocytes T, d'autres ne sont présents que dans les lymphocytes T et certains sont communs aux deux. Enfin, l'intensité relative d'un pic peut être différente dans les monocytes et les lymphocytes T. La même observation s'applique aux polynucléaires neutrophiles. Ces derniers se caractérisent par des pics distincts de ceux des lymphocytes et des monocytes même si certains pics sont exprimés par les trois types cellulaires. Enfin, on peut constater que le spectre des hématies est largement différent de celui des trois populations leucocytaires (voir figures 2 et 3). 1.2.3.1- Classement hiérarchique Les inventeurs ont analysé les distances ou proximités entre les différents spectres par regroupement ou classification hiérarchique, dit "clustering", en adaptant le logiciel MultiExperiment Viewer (MeV) 4.3. Ce logiciel gratuit et d'accès libre est accessible, entre autres, à l'adresse http://www.tm4.org/mev/. Il est classiquement utilisé pour analyser les données transcriptomiques en "microarray" (puces à ADN). Sur la figure 2, cette analyse révèle des différences importantes entre les principaux types de cellules circulantes (lymphocytes T, monocytes, polynucléaires neutrophiles et hématies) et donne une représentation de ces différences sous forme de dendogramme (figure 2). Plus précisément, sur la figure 2, les lymphocytes T (A), les monocytes (B), les polynucléaires neutrophiles (C) et les hématies (D) provenaient de 8 donneurs de sang différents, dont les échantillons de sang étaient congelés, puis décongelés et déposés sur la cible du spectromètre de masse MALDI-TOF (105 cellules par dépôt d'1 µl). Les valeurs des masses moléculaires des différents pics sont recensées manuellement sur une feuille Excel et enregistrées sous format texte (.txt). Les valeurs +1 (zone hachurée) ou -1 (zone vide) leur sont affectées selon que le pic est présent (+1) ou absent (-1) sur le spectre. Ces données sont chargées dans le logiciel. Les données de chacun des 4 types cellulaires sont automatiquement comparées par le logiciel MeV 4.3, ce qui permet d'établir une classification hiérarchique entre les 4 types cellulaires. Sur le graphe 1 de la figure 2, sur la colonne de droite 3, les pics sont classés dans un désordre apparent, en ce qui concerne leur masse moléculaire. Les pics présents sont regroupés dans une zone hachurée pour chaque type cellulaire de la façon suivante. Les pics sont classés par groupes successifs: le logiciel inclut pour un type cellulaire donné les pics successifs et les regroupe tant que ces pics sont spécifiques de ce type cellulaire. Ainsi, pour le type cellulaire C, les pics de 2 138 à 13 164 Da sont regroupés. Lorsque des pics sont communs entre les types cellulaires C et B, pour notre exemple, il les place en continuité pour C et contigus pour B. Ces pics sont de nouveau rangés de la masse moléculaire la plus basse à la plus haute, notamment ici, de 5 418 à 10 838 Da. Comme le logiciel trouve des pics spécifiques de B, il les place en continuité des pics de 5 418 à 10 838 Da, ce qui va de 2 537 à 14 697 Da. C'est ainsi qu'il repart également, pour D, de 4 284 à 15 873 Da ou pour A de 2 162 à 15 885 Da. On voit donc que les chevauchements gouvernent la présentation graphique 5 avec le respect autant que faire se peut de l'ordre croissant des masses moléculaires. 1.2.3.2- Dendogramme (figure 2) Le logiciel Mev 4.3 est classiquement utilisé pour l'analyse des proximités ou distances des données transcriptomiques par dendogramme. Le "clustering" met en évidence les signatures spécifiques des différents types cellulaires et la représentation en dendogramme qui en résulte permet de mieux visualiser la "distance" relative entre plusieurs types cellulaires. La partie haute 4 de la figure 2 correspond à une représentation en dendogramme des quatre types cellulaires. Dans un dendogramme, les traits horizontaux indiquent que les types cellulaires reliés présentent un certain pourcentage de pics en commun, ce pourcentage étant d'autant plus grand que les traits verticaux, dessous le trait horizontal qui relie ces types cellulaires, sont petits. En l'espèce, les deux types cellulaires les plus proches, c'est-à-dire présentant le plus grand nombre de pics en commun, sont les monocytes (B) et les polynucléaires neutrophiles (C). L'éloignement d'un trait horizontal, c'est-à-dire la hauteur des traits verticaux délimitant le trait horizontal, rend compte de la "distance" entre les types cellulaires concernés, étant inversement proportionnelle au nombre de pics en commun. On voit ainsi que les hématies (D) sont plus éloignées des neutrophiles (C) que du groupe monocytes (B)-lymphocytes T (A). La représentation en dendogramme qui s'affranchit de la représentation en classification hiérarchique est directement issue des données de la classification hiérarchique. La méthode, classique, de détermination d'un "clustering" hiérarchique est explicitée sur le site Internet http://asi.insarouen.fr/enseignement/siteUV/dm/Cours/clustering.pdf et dans l'ouvrage de Husson F., Lê S, Pagès J. Pratique de la statistique, 2009, pages 169-202, chapitre 4 : Classification, aux éditions des Presses Universitaires de Rennes. En l'espèce, la totalité des pics présents dans l'un quelconque des 4 spectres est comptabilisée. Ils seraient au nombre de 280 si les 4 spectres ne possédaient aucun pic en commun. Le nombre de pics communs entre les différents spectres est alors calculé et rapporté au nombre total de pics des 4 types de spectres des 4 types cellulaires. Les deux spectres qui possèdent le pourcentage le plus important de pics communs sont considérés comme les plus "proches", à savoir ici B et C. Le "clustering" hiérarchique consiste en une classification hiérarchique ascendante pour laquelle chaque "cluster" est progressivement "absorbé" par le "cluster" le plus proche pour constituer un cluster d'ancrage destiné à être comparé avec les autres types cellulaires. Ainsi, le spectre A et le spectre D sont comparés avec le cluster d'ancrage B + C. On observe que le spectre A est plus "proche" de l'ensemble B + C que le spectre D. L'ensemble B + C est donc relié par une barre verticale à une barre horizontale reliant A à B+C. La hauteur séparant la barre horizontale reliant A à l'ensemble B + C est plus importante que celle de la barre horizontale reliant B et C. L'ensemble A + B + C qui en résulte est comparé à D et l'on voit que la barre verticale qui lie D à l'ensemble A + B + C a une hauteur plus importante que les autres, ce qui signifie que le spectre D est le moins "proche" des spectres A, B et C. Cette représentation par fusions successives constitue un dendogramme. Deux "clusters" réputés "proches" dans le dendogramme montrent qu'ils partagent le maximum de pics en commun lorsqu'on les compare aux autres "clusters". Leur éloignement progressif signifie qu'ils partagent de moins en moins de pics en commun avec les autres clusters. Ici, les spectres B et C sont donc considérés comme les plus "proches", le spectre A étant plus "éloigné" de B et C et le spectre D étant celui qui partage le moins de pics en commun avec les spectres A, B et C. Exemple 2 : Réalisation d'une banque de données concernant 22 types cellulaires 2.1 - Obtention de la banque de données Le fait que les spectres obtenus sur cellules circulantes sont hautement reproductibles et spécifiques d'un type cellulaire donné a permis aux inventeurs d'étendre leur étude à un plus grand nombre de types de cellules eucaryotes. Les inventeurs ont ainsi choisi de différencier les monocytes humains en macrophages (tableau 5) par une culture de 7 jours en milieu contenant du sérum humain AB ou en cellules dendritiques (tableau 6) en les cultivant pendant 5 jours dans un milieu contenant du Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor et de l'interleukine (IL)-4. Ils ont aussi utilisé des macrophages de souris (tableau 7) différenciés à partir de leurs précurseurs présents dans la moelle osseuse par culture en présence d'un milieu riche en Macrophage Stimulating Factor ainsi que des lignées établies de cellules macrophage-like telles que la lignée humaine THP-1 (ATCC N° TIB-202, tableau 8), la lignée murine J774 (ATCC N° TIB-67, tableau 9) et la lignée canine DH82 (ATCC N° CRL-10389, tableau 10). Ils ont également utilisé la lignée de lymphocytes T humains C8166 qui exprime de façon stable le récepteur CCR5 tableau 11), la lignée fibroblastique de souris L929 (ATCC N° CCL-1, tableau 12), les lignées de cellules épithéliales d'origine humaine HeLa (ATCC N° CCL-2, tableau 13) et 293T (ATCC N° CRL-1573, tableau 14), les lignées trophoblastiques humaines BeWo (ATCC N° CCL-98, tableau 15) et JEG (ATCC N° HTB-36, tableau 16) qu'ils ont comparées aux trophoblastes placentaires humains (tableau 17). Ils ont enfin utilisé des cellules non-mammifères telles que la lignée XTC-2 dérivée de Xenopus laevis (tableau 18) précédemment décrite (Drancourt M, Jarlier V, Raoult D. The environmental pathogen Mycobacterium ulcerans grows in amphibian cells at low temperatures. Appl Environ Microbiol 2002, 68:6403-6404) et différents types d'amibes tels que Acanthamoeba polyphaga (ATCC N° 30461, tableau 19), Acanthamoeba castellanii (ATCC N° 30234, Tableau 20), Hartmannella vermiformis (ATCC N° 50237, tableau 21) and Poteriochromonas melhamensis (ATCC N° 11532, tableau 22). Les 22 types cellulaires entrés dans la base de données représentent un échantillon important de cellules eucaryotes comprenant ainsi des cellules mammifères et non-mammifères, des cellules primaires et des cellules en lignée. Leurs caractéristiques, correspondant aux différents types cellulaires dont les pics caractéristiques sont décrits dans les tableaux 1 à 22, sont résumées dans le tableau A suivant : Type cellulaire/tableau Nature Caractéristiques de pics Monocytes Cellules primaires Cellules circulantes humains/tableau 1 Lymphocytes T Cellules primaires Cellules circulantes humains/tableau 2 Polynucléaires Cellules primaires Cellules circulantes neutrophiles humains/tableau 3 Hématies Cellules primaires Cellules circulantes humaines/tableau 4 Macrophages Cellules primaires différenciés de humains/tableau 5 monocytes Macrophages Cellules primaires différenciés de moelle murins/tableau 7 osseuse THP-1/tableau 8 Lignée humaine myélomonocytaire J774/tableau 9 Lignée murine Macrophage immature DH82/tableau 10 Lignée canine Macrophage Cellules Cellules primaires différenciées de dendritiques/tableau 6 monocytes Lymphocytes T humains Lignée humaine Lymphocytes C8166/tableau 11 exprimant CCR5 L929/tableau 12 Lignée murine Type fibroblastique HeLA/tableau 13 Lignée humaine Type épithélial 293T/tableau 14 Lignée humaine Type épithélial JEG/tableau 16 Lignée humaine Type trophoblastique BeWo/tableau 15 Lignée humaine Type trophoblastique Trophoblastes Cellules primaires Cellules placentaires humains/tableau 17 XTC-2/tableau 18 Lignée non Xenopus laevis mammifère Acanthamoeba Organisme non Amibe polyphaga/tableau 19 mammifère Acanthamoeba Organisme non Amibe castelanii/tableau 20 mammifère Hartmanella Organisme non Amibe vermiformis/tableau 21 mammifère Poteriochromonas Organisme non Amibe melhamensis/tableau 22 mammifère Pour réaliser une banque de données à partir de ces 22 types cellulaires, les inventeurs ont de nouveau utilisé le logiciel BioTyper version 2.0. Pour chaque type cellulaire, au moins 20 spectres individuels ont été effectués, ce qui a permis de créer automatiquement un spectre moyen contenant 70 pics pour les 22 types cellulaires ci- dessus, tel quel décrit précédemment dans les tableaux 1 à 22. L'analyse par classification hiérarchique (non représentée) montre qu'il existe des différences importantes entre les 22 types cellulaires utilisés mais la représentation qui en résulte est difficile à lire et à interpréter. En revanche, la représentation en dendogramme des mêmes données (figure 3) est beaucoup plus explicite et révèle des différences importantes entre les 22 types cellulaires entrés dans la banque de données. Les 22 types cellulaires (106 cellules dans 10 pl de PBS) étaient congelés, puis décongelés et 1 pl a été déposé sur la cible du spectromètre de masse MALDI-TOF la figure 3 est une représentation en dendogramme de la proximité des spectres de 22 types cellulaires résultant d'une analyse par classification hiérarchique, les valeurs d de 0 à 1 000 sur l'axe sont les niveaux de distance entre les types cellulaires concernés., Deux "clusters" tels que les cellules JEG et Bewo sont "proches" l'un de l'autre (sur une échelle de 0 à 1 000). Leur fusion conduit en un "cluster" d'ancrage qui permet de le comparer au "cluster" constitué des cellules HeLa et 293T, qui lui est donc relativement proche. Le nouveau "cluster" d'ancrage montre que celui-ci est un petit peu plus éloigné du "cluster" cellules L929. L'analyse se poursuit et montre que le "cluster d'ancrage" constitué des polynucléaires neutrophiles, des monocytes et des lymphocytes T est éloigné du "cluster d'ancrage" des cellules J774 à 293T. La figure 3 confirme ainsi que : a. chaque type cellulaire testé possède une signature en spectrométrie de masse MALDI-TOF qui lui est propre, b. il sera possible d'intégrer de nouveaux types cellulaires dans la base de données. 2.2 - Pouvoir résolutif de la banque de données 2.2.1 - Principe L'intérêt d'une banque de données est de pouvoir comparer une nouvelle donnée (ici, le spectre d'un nouvel échantillon cellulaire) avec les spectres représentatifs de chaque type cellulaire présent dans la base de données. Les inventeurs ont comparé un nouveau spectre avec les spectres moyens contenus dans la base de données grâce au logiciel Biotyper 2.0 développé par le fabricant du spectromètre de masse MALDI-TOF (Bruker Daltonics). Il en résulte des scores de validation qui représentent l'addition de 2 notes ni + n2 (ni étant fonction du nombre de pics et n2 fonction du rapport signal/bruit de fond). - ni est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques du spectre n, avec .n1=0pour n8 n1=1pour 8 L'ensemble des scores obtenus est exprimé en échelle logarithmique. Les scores obtenus pour identifier et classifier les microorganismes 54 (Fournier PE, Couderc C, Buffet S, Flaudrops C, Raoult D. Rapid and cost-effective identification of Bartonella species using mass spectrometry. J Med Microbiol. 2009, 58:1154-1159) sont ceux que les inventeurs ont utilisés pour identifier et classifier les cellules eucaryotes. Ainsi, un score d'identification compris entre 0 et 1,699 permet d'exclure la nouvelle population comme appartenant au type cellulaire présent dans la base de données. Un score d'identification compris entre 1,700 et 1,999 suggère que la nouvelle population appartient au type cellulaire présent dans la base de données et un score d'identification supérieur à 2,0 permet une identification certaine de la nouvelle population comme appartenant au type cellulaire présent dans la base de données. A l'avenir, l'extension de la base de données à un plus grand nombre de types cellulaires pourrait amener à adopter un seuil d'identification plus élevé. Le logiciel BioTyper 2.0 identifie des spectres inconnus par comparaison avec des spectres de référence stockés dans une base de données. Les résultats d'identification sont donnés sous forme de représentation graphique, comme sur la figure 4, avec un score d'identification calculé comme ci-après explicité. Dans un premier temps, les spectres de deux échantillons considérés comme identiques sont alignés. On assigne une erreur acceptable pour la masse des pics de chaque spectre (±1 Da) et le logiciel repositionne les deux spectres (autrement dit, si l'écart entre les pics du même spectre et entre les pics de l'autre spectre est trop différent, le logiciel ne pourra pas aligner les spectres). Dans un second temps, la comparaison d'un spectre inconnu avec le spectre de référence (à savoir ici, le spectre moyen présent dans la base de données) est évaluée en utilisant des scores d'identification dédiés. Les algorithmes, qui permettent de calculer ces scores, sont décrits dans le manuel fourni par Bruker Daltonics qui donne un exemple succinct de la méthode employée dans son manuel "Software for microorganism identification and classification". Pour cela, les informations issues de l'analyse du spectre de référence sont converties en une valeur appelée score maximum accessible ("maximum score ou Max. Sc.") calculée de la façon suivante : chaque pic présent avec une fréquence de 100% obtient 100 points; les pics présents avec une moindre fréquence obtiennent un nombre de points équivalent à leur fréquence (par exemple, un petit pic présent dans seulement 8 spectres présents dans la base de données qui en contient 20 obtient un score de 8/20=40). L'addition de tous les points donne le score maximum accessible. Ainsi, par exemple, un spectre de référence qui contient 10 pics avec 100% de fréquence, 5 pics avec une fréquence de 50% et 3 pics avec une fréquence de 10% atteint un score maximum accessible de (10x100)+(5x50)+(3x10)=1 280. Une fois établi ce score concernant les spectres de référence, chaque pic du spectre à analyser est comparé au même pic des spectres de référence. Pour cela, deux fenêtres de masses ajustables ("adjustable mass windows") sont créées. La fenêtre "inner mass window" correspond à des pics parfaitement ajustés, ce qui leur donne un score plein et la fenêtre "outer mass window" correspond à des pics non parfaitement alignés : la valeur du score attribué est proportionnelle à la distance avec le pic "correspondant" du spectre de référence. (si la figure 4 était en couleur, on pourrait voir en vert les pics parfaitement ajustés entre les pics de référence et les pics de l'échantillon testé, en jaune les pics partiellement ajustés et en rouge les pics non ajustés). Il en résulte un score cumulatif pour l'échantillon à comparer au spectre de référence. La comparaison de ce score cumulé ("actual score ou Act. Sc.") avec le score maximum accessible ("Max. Sc.") conduit à un score relatif ("Rel. Sc.") ou Rel. Sc.=Act. Sc./Max. Sc. (avec un maximum de 1 pour une parfaite identité). Sont pris également en compte dans le score final ("overall score") le nombre de pics parfaitement ajustés (PN k), le nombre de pics partiellement ajustés (PN b) et le nombre total de pics (PN m) présents dans le spectre sous la forme d'un nombre de pics relatif ("Rel. P-Num.") qui est calculé de la façon suivante : Rel. P-Num. = (PN k)+(0,5xPN b)/(PN m). Enfin, un calcul de corrélation ("Effective I-correlation value" ou I-Corr.) est effectué. Le score final est calculé comme suit : Rel. Sc. x Rel. P-Num. x I-Corr. x 1000 (avec un maximum de 1000) puis exprimé en Log (l'échelle va donc de 1 = aucune homologie à 3 = identité parfaite). C'est ainsi que l'on obtient des scores à 2,0. 2.2.2 - Applications aux cellules circulantes Les inventeurs ont ainsi comparé un nouvel échantillon de monocytes purifiés avec la référence "monocyte" de la banque de données : le score de 2,65 authentifie la population testée comme étant des monocytes (figure 4). Ils ont ensuite testé le pouvoir discriminant de la banque de données de trois manières différentes. - Ils ont mélangé à part égale des lymphocytes T et des monocytes (5 x 105 lymphocytes T + 5 x 105 monocytes repris dans 10 µL de PBS) afin d'analyser le spectre qui en résulte. Ils ont identifié de façon certaine, grâce à la comparaison du spectre obtenu avec les références présentes dans la base de données, aussi bien les monocytes que les lymphocytes T (score de 2,25 dans les deux cas). - Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs), obtenues directement après gradient de Ficoll, sont constituées pour l'essentiel de monocytes et de lymphocytes T dans une proportion de 1 pour 7. La comparaison du spectre de ces cellules mononucléées (106 PBMCs repris dans 10 µL de PBS) avec les spectres présents dans la base de données permet d'identifier aussi bien les monocytes (avec un score d'identification de 2,08) que les lymphocytes T (avec un score d'identification de 2,02). - L'efficacité de la banque de données a également été étudiée sur sang total contenant tous les éléments figurés. La présence d'hématies masque l'identification des autres types cellulaires. Les inventeurs ont donc soumis un échantillon de sang à un bref choc hypotonique qui permet de conserver les leucocytes, mais pas les hématies. Dans ces conditions, ils n'ont identifié avec certitude que les polynucléaires neutrophiles (avec un score d'identification de 2,049). Conclusion D'un point de vue pratique, ces résultats montrent que, pour la gestion des prélèvements sanguins, la spectrométrie de masse MALDITOF permet d'identifier les lymphocytes T et les monocytes circulants une fois qu'ils sont purifiés sous forme de cellules mononucléées. Les polynucléaires neutrophiles peuvent être, eux, étudiés directement à partir du sang total après une phase de lyse osmotique. Exemple 3 : Identification des profils d'activation des macrophages 3.1 - Notion d'activation des macrophages Les macrophages résultent de la différenciation des monocytes circulants lorsqu'ils atteignent les tissus. Ils sont au coeur de la réponse immunitaire : ils sont susceptibles de détruire les agents infectieux ou les cellules tumorales ; ils influencent la réponse des lymphocytes qui, en retour, contrôlent leur activité. Les fonctions microbicides et tumoricides des macrophages sont contrôlées par leur microenvironnement. Il a été proposé d'appeler M1 les macrophages pleinement microbicides et tumoricides (macrophages répondant à une cytokine telle que l'interféron (IFN)-13) et macrophages M2 les macrophages qui répondent par une voie alterne (réponse à l'interleukine (IL)-4, à l'IL-10 ou au Transforming Growth Factor (TGF)- R. Les propriétés fonctionnelles de ces macrophages sont assez diverses puisqu'ils peuvent être peu ou pas microbicides et qu'ils peuvent moduler la réponse immune de façon plus ou moins efficace. On considère qu'il n'existe pas véritablement d'état M2 mais qu'il s'agit d'un continuum d'états. On comprend ainsi que leur déficience ou leur hyperactivité les place au coeur des pathologies infectieuses, tumorales ou inflammatoires. C'est dire également que la caractérisation de l'état d'activation des macrophages est importante pour mieux classer les pathologies, apprécier la réponse aux traitements et avoir une démarche pronostique. 3.2 - Etude de l'activation des macrophages Il n'existe pas de marqueurs spécifiques d'un état donné d'activation des macrophages. La classification MI/M2 conduit à identifier des macrophages MI ou M2 selon l'expression d'un ensemble de marqueurs détectables en cytométrie en flux, technique ELISA, voire en RT-PCR ou "microarray". Aucun de ces marqueurs ne permet cependant une identification absolue. Face à la difficulté d'identification des différents états d'activation des macrophages et de l'importance de ces états d'activation en pathologie humaine, les inventeurs, au vu des résultats obtenus en spectrométrie de masse MALDI-TOF sur les cellules circulantes, se sont demandés si une telle approche permet la caractérisation des profils d'activation des macrophages, voire leur classification en macrophages MI ou M2. Ils ont pour cela étudié les profils d'activation des macrophages en réponse à divers stimuli. 3.3 - Protocole d'activation des macrophages Les monocytes (106 cellules dans une plaque à 6 puits) sont incubés 4 jours dans 3 ml de RPMI 1640 contenant 20 mM HEPES, 2 mM de L-glutamine et 10% de sérum humain AB puis 3 jours supplémentaires en milieu contenant 10% de SVF. La pureté des macrophages (> 90%) est vérifiée par cytométrie en flux en utilisant CD68 comme marqueur spécifique. Les macrophages sont alors stimulés par différentes cytokines telles que l'IFN-y (TebuBio) à 20 ng/ml, l'IL-4, l'IL-10, le TGF-(31 (10 ng/ml, R&D Systems) ou le Tumor Necrosis Factor (TNF, 10 ng/ml, Euromedex). Dans certaines expériences, les macrophages sont stimulés avec 1 11g/ml lipopolysaccharide (LPS) préparé à partir de Escherichia coli ou 10 ng/ml peptidoglycane (PGN) préparé à partir de Bacillus subtilis (Sigma-Aldrich). 3.4 - Analyse des spectres des macrophages selon leur état d'activation 3.4.1 - Analyse des spectres des macrophages humains dérivés de monocytes - Les inventeurs ont dans un premier temps analysé le spectre des macrophages obtenus après 7 jours de culture. On observe de nombreux pics dans la gamme des masses moléculaires de 2 à 20 kDa (cf. tableau 5). Le spectre des macrophages quiescents est hautement reproductible puisque les spectres de macrophages différenciés à partir de 5 donneurs de sang sont parfaitement superposables. - Dans un second temps, ils ont étudié la stabilité des spectres au cours du temps. Pour cela, ils ont incubé les macrophages différenciés après 7 jours pendant 9, 18, 36 et 48 heures supplémentaires afin de permettre la comparaison avec des macrophages activés par l'IFN-y ou l'IL-4. Les spectres obtenus sont identiques quel que soit le temps d'incubation supplémentaire des macrophages, ce qui autorise la comparaison des différents modes d'activation des macrophages. 3.4.2 - Analyse des spectres des macrophages activés par l'IFN-y ou l'IL-4 - Les inventeurs ont activé pendant 18 heures les macrophages avec d'une part de l'IFN-y (Tableau 23) connu pour induire un profil M1 et d'autre part de l'IL-4 (Tableau 24) connue, elle, pour induire une polarisation M2. Les doses d'IFN-y et d'IL-4 sont celles qui ont été utilisées dans le laboratoire pour étudier le profil transcriptionnel des macrophages M1 et des macrophages M2. Lorsqu'on compare les spectres des macrophages incubés en présence d'IFN-y ou d'IL-4 pendant 18 heures avec celui des macrophages quiescents (cf. tableau 5), on observe d'importantes différences qui concernent leur masse moléculaire et/ou leur abondance relative. - Les inventeurs ont ensuite évalué la reproductibilité et la spécificité des spectres en utilisant le logiciel ClinProTools 2.2 comme utilisé dans l'exemple 1. Pour cela, ils ont créé pour quatre spectres représentatifs de chaque état des macrophages une représentation bidimensionnelle. On observe que les spectres sont caractéristiques d'un état donné d'activation des macrophages puisqu'ils sont homogènes au sein d'un même état d'activation et qu'ils sont spécifiques de chacun de ces états (figure 5A). En outre, les macrophages activés par l'IL-4 sont à l'opposé des macrophages activés par l'IFN-y comparés aux macrophages quiescents, ce qui laisse supposer que la spectrométrie de masse MALDI-TOF pourrait être utile à la comparaison des macrophages MI/M2. Cette signature spécifique est confirmée par une classification "clustering" hiérarchique créé grâce à l'utilisation du logiciel MeV 4.3 selon la même procédure utilisée dans l'exemple 1 (figure 5B). Cette classification hiérarchique permet d'une part de mettre en évidence la différence entre les trois types de macrophages et d'autre part que les macrophages quiescents sont plus proches des macrophages activés par l'IL-4 qu'ils ne le sont des macrophages activés par l'IFN-y. Ces signatures spécifiques ont enfin permis aux inventeurs d'établir un dendogramme selon la même procédure utilisée dans l'exemple 1 (Figure 5C). La "divergence" des macrophages traités par l'IFN-y ou l'IL-4 a été étudiée au cours du temps (figure 5C, voir également la figure 6C). Le dendogramme contient deux branches spécifiques qui regroupent l'activation par l'IFN-y d'une part et par l'IL-4 d'autre part. L'activation à 18 heures montre des différences sensibles, est optimale à 36 heures et diminue ensuite. C'est la raison pour laquelle les inventeurs n'ont considéré que les deux temps de 18 et 36 heures dans les études suivantes. Ces résultats montrent donc que la polarisation des macrophages en macrophages M1 ou M2 peut être étudiée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. 3.4.3 - Analyse des spectres des macrophages activés par différentes cytokines Les inventeurs se sont demandés si des cytokines connues pour moduler la réponse des macrophages, telles que le TNF, l'IL-10 et le TGF-(31, induisent un profil en spectrométrie de masse MALDI-TOF spécifique et si ce profil correspond aux profils M1 et M2 induits respectivement par l'IFN-y et l'IL-4. La localisation et l'intensité relative des pics induites par le TNF, l'IL-10 et le TGF-(31 sont données dans respectivement les tableaux 25, 26 et 27. La représentation 2D de l'analyse spectrale montre que l'IL-10 induit une signature relativement proche de celles des macrophages quiescents ou activés par l'IFN-y (figure 6A). Le TNF et le TGF-(31 induisent des signatures proches l'une de l'autre et qui ne sont pas très éloignées de la signature induite par l'IL-4. La représentation en classification hiérarchique confirme cette impression visuelle (figure 6B). On ne trouve qu'un seul pic spécifique de l'activation par l'IL-10 (à 8396 Da) bien que le profil général de la réponse à l'IL-10 soit, lui, très spécifique. Deux pics sont spécifiques du TGF-(31 (à 2 886 et 2 318 Da) alors que d'autres pics forment la signature spécifique du TNF. Le dendogramme qui résulte de la comparaison des différents inducteurs de la réponse macrophagique comporte deux branches majeures (figure 6C). La première classe ("cluster") regroupe l'IL-10 et l'IFN-y. On peut noter que la "distance" entre l'IFN-y et l'IL-10 semble dépendre essentiellement du temps d'incubation de 18 ou 36 heures. La seconde classe regroupe l'IL-4, le TGF-(31 et le TNF. De nouveau, la "distance" entre le TGF-(31 et le TNF semble dépendre du temps d'incubation. Ces résultats montrent que les macrophages stimulés par des cytokines qui modulent la réponse des macrophages ont des profils différents et des signatures spécifiques en spectrométrie de masse MALDI-TOF et qu'ils peuvent être classés en profil M1 ou M2. 3.4.4 - Analyse des spectres des macrophages activés par différents ligands bactériens, LPS (lipopolysaccharides) et PGN (peptidoglycanes) Les inventeurs se sont enfin demandés si l'interaction entre certains ligands bactériens et les macrophages détermine un profil spectral spécifique et si ces profils sont en relation avec les réponses M1 ou M2. Ils ont ainsi analysé la réponse des macrophages au LPS, présent à la surface des bactéries à gram négatif (tableau 28) et au PGN présent, lui, à la surface des bactéries à gram positif (tableau 29). L'analyse des spectres montre que certains pics sont spécifiques de la réponse des macrophages au PGN alors que d'autres pics sont spécifiques de la réponse des macrophages au LPS. La représentation 2D de l'analyse spectrale montre que le LPS induit une signature relativement proche de celles des macrophages quiescents alors que le PGN induit une signature bien plus éloignée (figure 7A). Ces signatures sont également reproductibles d'un donneur de sang à l'autre (ici, 4 donneurs différents). La représentation en classification hiérarchique (figure 7B) révèle que la réponse des macrophages au LPS est localisée sur la même branche que la réponse à l'IFN-y (profil de type Ml) et que la réponse des macrophages au PGN se trouve "proche" de leur réponse à l'IL-4 (profil de type M2). Ces résultats montrent que la spectrométrie de masse MALDI-TOF permet d'identifier différents états d'activation des macrophages. Il est donc possible par une approche simple, reproductible, peu coûteuse en matériel et aisée à mettre en oeuvre de connaître l'état fonctionnel des cellules présentes dans un tissu normal ou pathologique. Cette connaissance peut constituer une aide précieuse au diagnostic et/ou au pronostic des maladies humaines, en particulier infectieuses. Exemple 4 : Suivi de procédés d'isolement des trophoblastes placentaires Le placenta est un tissu complexe en perpétuelle évolution. Il est constitué essentiellement de trophoblastes et, à un moindre degré, de macrophages et de cellules dendritiques dont le rôle précis n'est pas connu. Le trophoblaste correspond à la couche cellulaire continue formée de fibroblastes qui limite l'oeuf, devenu blastocyte au 6° jour après la fécondation. Au cours de l'implantation, le trophoblaste se différencie en deux couches, le syncytiotrophoblaste et le cytotrophoblaste. Les macrophages placentaires sont des macrophages foetaux qui résident dans le mésenchyme du placenta. 4.1 - Isolement de différents types de trophoblastes placentaires Les placentas frais sont recueillis après délivrance vaginale ou à partir de sections césariennes à partir de grossesses non pathologiques et après obtention du consentement des patientes. Les échantillons sont placés sur une surface stérile en plaçant le cordon ombilical vers le bas et la face basale vers le haut. La partie basale qui correspond à la décidua est enlevée du placenta villeux. De grandes coupes d'environ 30 grammes sont pratiquées dans le placenta villeux, placées dans des tubes stériles de 50 ml après différents bains de lavage avec du PBS stérile et pesées. Le tissu est ensuite abondamment rincé avec du PBS afin d'éliminer le maximum de sang possible puis découpé en fragments d'environ 1 mm3. Les fragments de placenta sont incubés dans une solution de digestion (solution saline tamponnée de Hank's contenant 2,5% trypsine/EDTA, DNAse I (100 U/ml), 4,2 mM MgSO4 et 25 mM HEPES) sur un agitateur rotatif pendant 45 min à 37°C. Les cellules dissociées sont récupérées et les fragments tissulaires restants sont incubés à deux nouvelles reprises dans une solution de digestion pendant 30 min à 37°C. L'ensemble des cellules dissociées est collecté, centrifugé, dénombré et déposée sur un gradient discontinu de Percoll (25 et 60%) puis centrifugé pendant 20 minutes à 1200 x g. L'anneau cellulaire obtenu à l'interface des deux phases, enrichi en trophoblastes, est récupéré et lavé en PBS. Les trophoblastes sont ensuite sélectionnés en utilisant des billes magnétiques couplées à un anticorps anti- immunoglobulines de souris (Miltenyi Biotec) puis recouvertes d'anticorps de souris dirigés contre la molécule EGF-R ("epidermal growth factor receptor"), un récepteur exprimé à la surface des trophoblastes. Une partie des cellules obtenues après passage sur gradient de Percoll, sélection par anticorps anti-EGF-R est conservée, congelée (106 cellules dans 10 µL PBS) puis testée en spectrométrie de masse MALDI-TOF. 4.2 - Suivi des étapes de purification des trophoblastes placentaires par spectrométrie de masse MALDI-TOF Le principe général en est donné dans le paragraphe "Pouvoir résolutif de la banque de données" à l'exemple 2, paragraphe 2.1. Les inventeurs ont comparé un échantillon de cellules récupérées après passage sur gradient de Percoll avec le spectre moyen de trophoblastes primaires (cf Tableau 17). Le score de validation calculé en utilisant le logiciel Biotyper 2.0 est de 2,14, ce qui montre qu'il est possible de détecter le type "trophoblaste" dans un échantillon hétérogène. La spectrométrie de masse MALDI-TOF montre ainsi qu'elle peut être utile à la caractérisation d'un type cellulaire au cours de son isolement hors de tout marquage préalable.20 REVENDICATIONS1. Procédé d'identification d'un type donné de cellules eucaryotes dans un échantillon biologique à analyser, susceptible de contenir des cellules eucaryotes, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes successives dans lesquelles : 1/ on établit au moins un spectre de référence par spectrométrie de masse, dite de type MALDI-TOF ("matrix-assisted-laser-desorptionionisation-time-of-flight"), d'au moins un échantillon de référence, d'au moins un type donné de cellules eucaryotes, ledit échantillon de référence étant constitué de cellule eucaryotes entières purifiées contenant au moins 95% de cellules dudit type donné, et 2/ on réalise, si nécessaire, l'extraction des cellules eucaryotes contenues dans ledit échantillon biologique à analyser pour obtenir un extrait de cellules eucaryotes, et 3/ on réalise un spectre par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF d'un dit extrait de cellules eucaryotes obtenu à l'étape 2/, et 4/ on compare le spectre obtenu à l'étape 3/ avec : 4a/ un spectre de référence d'un extrait purifié dudit type donné de cellules eucaryotes préalablement réalisé à l'étape 1/, si l'on cherche seulement à identifier si ledit échantillon à analyser comprend un type de cellules eucaryotes dudit type donné de cellules eucaryotes, ou 4b/ une pluralité de spectres de référence réalisés à l'étape 1/ à partir d'une pluralité d'échantillons de référence d'une pluralité de différents types donnés de cellules eucaryotes, ladite pluralité de spectres de référence constituant une banque de spectres de référence desdits différents types donnés de cellules eucaryotes, si l'on cherche à identifier si ledit échantillon à analyser comprend un type de cellules eucaryotes choisi parmi différents types donnés de cellules eucaryotesdont les spectres sont inclus dans ladite banque de spectres de référence, et 5/- on identifie un type de cellules eucaryotes de l'extrait obtenu à l'étape 2/, provenant dudit échantillon à analyser, de l'une au moins des deux manières suivantes : 5a/ soit comme étant identique à un dit type donné de cellules eucaryotes, si, lors de l'étape 4/ ci-dessus, on retrouve dans le spectre obtenu à l'étape 3/ l'ensemble des pics caractéristiques d'un dit spectre de référence, 5b/ soit comme étant proche d'au moins un dit type donné de cellules eucaryotes, en caractérisant la proximité du spectre obtenu à l'étape 3/ par rapport à au moins un dit spectre de référence d'au moins un dit type donné de cellules eucaryotes, par détermination du nombre de pics caractéristiques en commun entre le spectre obtenu et celui d'au moins un dit spectre de référence d'au moins un dit type donné de cellules eucaryotes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape 2/ on réalise la séparation des différents types de cellules eucaryotes contenues dans ledit extrait de cellules eucaryotes, pour obtenir au moins un extrait purifié contenant au moins 95% d'un type de cellules eucaryotes. 3. Procédé d'identification selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'un spectre d'un type donné de cellules est réalisé à partir d'un extrait cellulaire présentant une concentration cellulaire d'au moins 105 cellules/1 µl dudit type de cellules. 4. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, aux étapes 1/ et 3/, on ne prend en compte lesdits spectres d'échantillons de référence et spectres d'échantillons à analyser que si lesdits spectres présentent un score de qualité 5 10 15 20supérieure à 2, ledit score de qualité étant constitué de l'addition des deux notes ni et n2 ayant chacune une valeur de 0 à 6 avec : - ni est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques dudit spectre n, avec n1=0pour n 5. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les pics desdits spectres sont définis par une paire de coordonnées composées d'une abscisse constituée du rapportmasse/charge (m/z) de 2 000 à 15 000 Da, plus particulièrement de 3 000 à 7 000 Da, la coordonnée en ordonnée étant une intensité relative en unité arbitraire, et on retient de préférence dans le spectre au moins les 70 pics de plus grandes intensités. 6. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on cherche à identifier un type donné de cellules et on réalise desdits spectres de référence pour au moins un type donné de cellules choisi parmi les 22 types de cellules eucaryotes suivants : - monocytes humains - lymphocytes T humains - polynucléaires neutrophiles humains - hématies humaines - macrophages humains différenciés de monocytes - macrophages murins différenciés de moelle osseuse - lignée de cellule humaine myélomonocytaire THP-1 - lignée de cellule murine macrophage immature J774 - lignée de cellule canine macrophage DH82 - cellules dendritiques différenciées de monocytes - lignée de cellule humaine C8166de lymphocytes exprimant CCR5 - lignée de cellule murine de type fibroblastique L929 - lignée de cellule humaine de type épithélial HeLA - lignée de cellule humaine de type épithélial 293T - lignée de cellule humaine de type trophoblastique JEG- lignée de cellule humaine de type trophoblastique BeWo - cellules placentaires de trophoblastes humains - lignée de cellule XTC-2 de Xenopus laevis - cellules d'amibe Acanthamoeba polyphaga - cellules d'amibe Acanthamoeba castelanii - cellules d'amibe Hartmanella vermiformis - cellules d'amibe Poteriochromonas melhamensis 7. Procédé d'identification selon la revendication 6, caractérisé en ce que les spectres de référence des 22 types de cellules eucaryotes comprennent les pics caractéristiques mentionnés dans les tableaux 1 à 22 suivants, dans lesquels les différents pics caractéristiques sont caractérisés par leurs coordonnées en abscisse m/z (Da) et leurs coordonnées en ordonnée d'intensité relative exprimées en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité (%), les valeurs des masses moléculaires m/z pouvant varier jusqu'à ±1 Da de la valeur moyenne mentionnée dans lesdits tableaux, et les valeurs d'intensité relative pouvant varier jusqu'à ±20%, plus généralement ±5%, de la valeur moyenne d'intensité relative mentionnée dans lesdits tableaux : Tableau 1 : Analyse du spectre des monocytes humains circulants intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3054 0,88 3519 1,23 4664 0,89 3136 0,90 3543 0,83 4892 1,08 3152 1,03 3560 0,78 4916 1,07 3168 0,83 3585 0,91 4933 19,50 3186 0,88 3609 1,30 4960 100,00 3205 0,87 3626 0,73 4981 9,30 3256 0,88 3694 0,75 4999 2,23 3275 0,70 3707 1,60 5022 1,35 3285 0,87 3767 1,00 5042 1,10 3306 0,97 3789 0,90 5413 9,28 3327 1,49 3815 0,89 5421 2,05 3336 0,77 3933 0,85 5629 0,803354 1,28 3952 0,79 5648 4,01 3369 22,75 4044 1,65 5670 1,90 3391 1,45 4062 0,94 5689 2,22 3408 1,14 4074 11,42 5710 1,18 3424 1,28 4115 0,74 6571 1,97 3428 1,15 4158 0,80 6882 2,47 3440 29,28 4205 1,01 6903 1,28 3454 2,44 4226 0,87 6997 2,07 3463 1,71 4287 0,86 7340 1,47 3475 1,89 4305 0,84 10825 8,63 3484 19,88 4418 0,87 3506 1,33 4627 1,83 Tableau 2 : Analyse du spectre des lymphocytes T humains circulants intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3090 0,77 4631 2,49 6860 2,30 3111 1,17 4669 1,27 6889 10,89 3141 0,92 4703 0,79 6921 2,01 3187 1,51 4718 0,80 6949 2,42 3359 1,07 4790 0,85 6977 1,58 3371 6,01 4891 0,94 7003 4,77 3442 5,05 4904 0,86 7019 1,50 3456 1,43 4919 3,11 7091 0,81 3486 13,05 4936 20,09 7259 1,33 3502 1,28 4963 100,00 7420 0,90 3610 1,11 4984 10,90 8563 1,55 3709 1,84 5001 3,14 9261 1,72 3738 1,11 5025 2,40 10833 1,43 3769 0,93 5064 0,84 10888 1,50 3816 1,54 5108 0,94 11130 0,97 3876 1,18 5134 0,86 11305 3,31 4122 1,32 5416 1,67 11346 1,41 4281 1,11 5444 0,75 13699 1,44 4314 0,85 5633 0,93 13719 2,16 4324 4,43 5652 5,06 13774 5,96 4381 1,06 5673 2,07 13825 1,63 4552 0,91 5992 0,85 14006 2,16 4569 6,12 6344 1,07 4592 3,11 6575 1,13 Tableau 3 : Analyse du spectre des polynucléaires neutrophiles humains intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3033 0,20 3614 1,93 4367 0,303046 0,47 3633 0,83 4385 4,60 3062 0,45 3653 0,15 4422 0,97 3088 0,20 3678 0,30 4440 0,77 3093 0,50 3712 3,77 4512 1,10 3114 1,63 3735 0,30 4559 0,73 3136 0,20 3758 0,17 4647 0,25 3190 0,37 3817 0,37 4668 0,45 3203 0,33 3885 0,47 4789 0,30 3259 0,50 3920 0,30 4923 0,65 3288 0,23 3935 0,60 4940 2,97 3330 0,83 3980 0,73 4967 71,93 3342 0,30 4003 2,67 4988 4,93 3359 0,85 4030 0,60 5137 0,15 3374 37,80 4052 0,40 5145 0,25 3431 2,35 4110 0,30 5225 0,40 3445 94,47 4171 0,20 5421 7,17 3467 4,80 4193 0,93 6349 0,47 3489 15,93 4232 0,53 6581 2,43 3510 0,90 4283 2,87 7770 0,20 3519 0,57 4295 0,50 10841 3,77 3564 0,53 4312 1,03 13163 0,20 3579 1,60 4328 40,53 3590 2,00 4349 0,93 Tableau 4 : Analyse du spectre des hématies humaines intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3038 1,39 5014 1,18 7655 4,33 3091 0,68 5032 5,02 7673 1,63 3284 0,74 5043 34,03 7711 0,81 3430 0,89 5075 2,60 7731 0,70 3588 0,71 5095 2,01 7852 0,65 3675 0,74 5107 2,29 7882 1,36 3772 1,01 5158 0,90 7902 1,58 3782 5,52 5252 0,69 7917 3,02 3797 0,97 5273 1,08 7936 14,83 3822 0,65 5290 4,81 7960 3,64 3911 0,69 5308 0,91 7981 1,53 3969 1,46 5358 0,75 8016 1,31 4024 0,97 5497 1,16 8292 2,42 4073 0,65 5553 2,41 8310 5,29 4123 0,90 6122 0,58 8330 0,98 4146 1,31 6838 0,89 8550 0,90 4154 2,59 7488 1,17 8567 2,90 4165 0,89 7504 2,42 8587 0,88 4250 0,65 7518 4,49 10089 0,93 4284 2,41 7547 22,24 14935 0,93 4295 0,74 7565 100,00 14957 1,394514 0,96 7610 8,45 14980 1,92 4896 0,78 7638 6,33 4999 0,71 7645 6,80 Tableau 5 : Analyse du spectre des macrophages humains dérivés des monocytes intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3088 1,28 4746 18,67 6189 15,20 3094 2,66 4768 1,02 6330 0,84 3124 1,02 4803 6,70 6343 0,92 3142 1,48 4873 1,40 6634 0,96 3247 1,05 4908 9,65 6867 1,28 3442 1,08 4917 3,66 6888 5,07 3456 1,80 4936 15,49 6904 2,41 3790 1,56 4963 100,00 6921 1,17 3989 2,51 4981 14,46 7001 2,06 4099 1,10 5001 4,98 7035 0,87 4168 1,06 5024 2,80 7266 0,93 4225 3,57 5044 1,04 8448 1,32 4260 1,36 5066 1,25 8562 1,27 4282 1,56 5107 1,00 9587 1,00 4422 3,36 5188 1,06 9673 0,84 4455 1,15 5204 10,18 9744 1,79 4479 1,20 5223 0,82 9757 0,96 4572 1,33 5416 2,18 9849 0,99 4584 11,34 5651 2,98 9907 0,94 4605 1,24 5672 1,10 10005 1,27 4630 0,96 5825 1,32 10832 1,34 4641 3,20 6129 1,72 13773 1,56 4689 0,90 6157 2,25 4736 2,62 6173 5,70 Tableau 6 : Analyse du spectre des cellules dendritiques différenciées de monocytes humains intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3054 0,32 4631 0,50 6174 1,83 3086 0,37 4736 0,69 6190 0,80 3094 0,47 4747 0,93 6222 0,73 3110 0,68 4803 0,45 6275 0,96 3140 0,48 4848 0,40 6545 0,37 3227 0,50 4875 1,03 6647 1,11 3274 0,39 4892 2,18 6868 0,49 3303 0,38 4904 1,49 6888 1,58 3324 0,50 4920 3,98 6905 0,70 3417 0,47 4936 50,94 6977 0,323443 1,62 4963 100,00 7002 0,57 3457 2,80 4984 11,32 7850 0,47 3601 0,30 5001 5,44 8086 0,37 3773 0,41 5025 2,43 8212 0,43 3790 4,57 5043 0,85 8526 0,36 3813 0,36 5067 1,31 8550 1,04 3986 0,32 5081 0,53 8564 2,82 4045 0,32 5108 1,12 8582 0,58 4105 0,41 5134 0,73 9260 0,47 4226 0,82 5152 0,40 9745 0,56 4282 1,55 5205 0,85 11605 0,41 4308 0,81 5649 1,20 13771 0,64 4586 0,83 5802 0,39 4603 0,33 5824 0,39 Tableau 7 : Analyse du spectre des macrophages murins dérivés de moelle osseuse intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3028 2,09 4818 2,25 6225 17,62 3085 2,40 4848 1,68 6241 3,97 3113 2,29 4869 2,02 6254 1,48 3148 2,17 4923 9,61 6287 8,82 3178 1,38 4936 10,42 6433 4,39 3288 1,43 4963 100,00 6647 1,30 3457 2,81 4982 13,40 6892 6,55 3921 1,42 5002 3,93 6901 8,34 3990 1,88 5025 3,90 6961 3,33 4014 1,45 5653 5,26 7023 3,75 4169 3,04 5671 1,70 7045 2,30 4213 5,97 5706 2,91 7206 1,37 4226 6,43 5850 1,56 8449 3,49 4287 1,93 5906 1,30 8563 2,72 4437 2,95 5967 1,91 9530 3,12 4456 1,54 6020 4,05 9549 1,41 4472 1,50 6083 1,80 9697 4,20 4491 1,48 6098 1,40 9737 5,28 4585 1,85 6110 4,14 9864 1,57 4599 9,48 6135 2,33 9877 2,48 4656 1,42 6156 1,49 9908 2,39 4683 1,60 6170 22,90 13788 2,95 4735 2,09 6189 1,83 4762 9,75 6208 1,68Tableau 8. Analyse du spectre des cellules THP1 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3089 0,70 4902 0,66 6510 0,49 3112 0,57 4920 2,11 6545 0,63 3139 0,57 4937 12,54 6648 1,91 3273 0,50 4964 100,00 6867 0,79 3304 0,41 4985 12,56 6893 3,49 3324 0,71 5002 4,23 6900 2,43 3417 0,55 5026 4,33 6924 0,79 3442 0,61 5045 1,36 6950 0,55 3457 5,42 5066 0,69 6977 0,75 3478 0,44 5109 0,64 7003 1,11 3519 0,46 5135 0,67 8086 0,57 3564 0,47 5154 0,48 8401 0,59 3792 0,40 5264 0,47 8550 0,80 4044 0,48 5650 1,41 8564 2,27 4077 2,16 5674 0,50 9244 1,17 4123 0,63 5935 0,43 9262 3,93 4201 0,44 5993 0,99 9284 0,86 4211 0,81 6058 0,50 9955 0,45 4283 1,21 6134 0,61 11986 1,11 4597 0,73 6159 0,40 13729 0,98 4621 0,61 6174 2,47 13782 2,18 4631 3,34 6191 0,42 13823 0,98 4640 0,83 6224 1,13 4892 0,74 6276 1,58 Tableau 9 : Analyse du spectre des cellules J774 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3042 2,29 4358 2,95 6210 2,88 3097 1,95 4460 2,52 6224 2,88 3111 1,97 4592 1,73 6253 2,31 3139 1,80 4603 2,05 6276 9,09 3153 6,61 4733 1,87 6490 2,05 3275 1,86 4748 4,43 6546 3,46 3325 2,41 4920 2,51 6612 2,38 3425 2,73 4937 9,30 6634 1,63 3458 13,16 4964 100,00 6648 11,75 3602 2,10 4986 11,23 6901 2,63 3626 9,98 5003 5,51 6978 1,66 3708 1,98 5026 1,87 6993 2,86 3791 15,68 5122 1,66 8394 2,13 3911 3,37 5140 2,12 8424 2,93 3923 3,24 5189 3,22 8437 5,28 3945 1,69 5325 3,08 8450 14,883962 2,29 5405 1,84 8472 2,14 3975 2,16 5495 4,59 8531 2,21 3991 9,23 5643 2,01 8551 2,21 4050 2,07 5790 2,93 8565 13,49 4078 2,26 5821 2,35 8586 2,36 4214 1,77 6061 4,49 9404 1,54 4226 4,77 6078 2,45 4283 4,52 6170 1,88 Tableau 10 : Analyse du spectre des cellules DH82 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3069 5,40 4891 0,55 6189 2,63 3094 0,56 4902 0,60 6210 1,01 3113 0,59 4919 2,22 6227 9,22 3124 0,46 4936 10,77 6245 5,16 3139 0,64 4963 100,00 6280 5,36 3303 0,35 4984 9,68 6297 0,67 3324 0,63 5001 3,71 6544 0,51 3415 0,47 5024 1,26 6646 2,37 3441 0,53 5042 0,52 6887 0,97 3456 5,08 5064 0,47 8085 0,48 3808 0,41 5107 0,64 8416 0,87 3841 0,41 5134 0,57 8432 1,56 3921 0,52 5151 0,36 8447 5,56 4043 0,34 5183 0,64 8548 0,80 4225 2,50 5414 0,40 8563 2,26 4282 0,84 5649 1,07 8892 0,38 4415 0,36 5839 0,57 9245 0,85 4446 0,34 5934 0,49 9419 0,91 4591 0,36 5984 0,41 9887 0,64 4622 0,86 6061 2,55 11679 0,91 4710 0,77 6078 2,24 11966 0,37 4746 0,83 6099 2,47 12157 0,79 4859 0,35 6117 2,27 4876 0,47 6169 0,44 Tableau 11 : Analyse du spectre des lymphocytes T humains C8166 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3042 1,34 4921 2,39 6926 2,01 3057 1,10 4938 16,65 6979 1,34 3113 1,14 4965 100,00 7004 2,63 3140 1,11 4987 16, 56 7500 0,94 3271 1,51 5004 5,34 8088 1,35 3310 2,15 5028 4,63 8532 1,203326 1,24 5049 1,45 8553 3,29 3444 2,52 5068 1,14 8567 9,95 3458 10,40 5654 2,31 8586 1,77 3479 1,25 5676 1,19 9264 2,52 3723 1,29 5803 1,14 10641 1,00 3792 1,14 5994 1,14 10893 1,05 4045 1,14 6052 1,14 11252 1,36 4078 7,82 6065 1,25 11308 1,77 4087 2,87 6083 6,64 11608 0,99 4136 1,07 6108 1,37 11989 1,22 4189 1,42 6226 2,85 13734 2,55 4210 2,98 6277 3,67 13773 5,93 4228 0,95 6547 1,55 13800 4,23 4284 3,88 6649 4,39 13824 2,68 4475 1,24 6712 1,10 13852 1,71 4591 2,14 6869 1, 73 14009 1, 61 4603 1,13 6889 7,37 4632 2,15 6903 4,44 Tableau 12 : Analyse du spectre des cellules L929 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3113 3,98 4957 8,55 7205 3,04 3138 3,18 4978 3,14 8071 5,20 3271 2,97 5704 3,39 8522 3,84 3309 2,54 5768 2,61 8549 13,70 3323 5,51 5813 3,97 8563 26,71 3400 2,93 6043 7,25 8585 4,65 3416 4,87 6061 13,64 9263 3,46 3442 22,60 6083 5,37 9290 11,89 3458 86,43 6154 8,47 9402 3,54 3478 5,30 6169 11,67 9908 9,33 3787 6,08 6208 8,06 10585 3,05 3919 2,44 6224 26,12 10942 3,40 3988 2,38 6248 5,84 11541 4,58 4077 4,75 6274 14,42 11632 4,39 4208 2,93 6284 4,35 12126 7,56 4276 3,10 6542 6,33 12161 7,95 4282 9,32 6602 2,77 13712 4,76 4645 5,11 6621 7,09 13730 7,43 4699 2,77 6645 26,24 13756 10,77 4738 3,09 6813 4,52 13786 14,42 4760 6,14 6882 8,70 13821 5,07 4891 2,70 6894 12,97 13997 5,10 4923 17,71 6977 5,63 4937 66,44 7003 5,24 Tableau 13 : Analyse du spectre des cellules HeLa intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3144 3,97 4986 6,16 7259 3,79 3153 2,71 5184 4,33 7484 3,35 3229 6,84 5317 2,73 7508 7,30 3324 6,57 5476 2,69 7522 5,14 3458 31,07 5497 3,15 7768 3,26 3627 7,54 5624 5,96 7783 3,29 3725 9,52 5653 5,75 7885 3,36 3792 12,10 5994 5,39 8088 4,82 3818 8,80 6011 7,03 8436 4,36 3832 7,24 6027 20,22 8452 19,29 3911 3,39 6075 7,27 8531 3,38 4228 8,97 6176 5,63 8551 8,21 4284 11,50 6224 7,07 8567 29,32 4508 4,01 6242 5,23 9264 8,64 4593 5,33 6276 16,15 10641 4,41 4632 8,29 6288 22,92 10891 3,34 4712 2,96 6378 2,66 11309 5,38 4738 9,86 6547 6,07 11989 5,42 4749 4,25 6649 20,79 13731 7,55 4760 2,99 6865 4,27 13748 11,77 4894 3,19 6890 22,72 13777 19,46 4923 4,50 6979 4,87 14011 5,93 4938 100,00 7004 8,54 4965 79,93 7094 2,98 Tableau 14 : Analyse du spectre des cellules 293T intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3112 3,08 5224 2,25 8433 2,31 3139 2,95 5262 3,38 8451 8,28 3274 2,24 5306 1,81 8476 2,69 3325 3,79 5651 6,90 8502 5,21 3442 2,44 5803 2,96 8526 13,68 3457 31,08 5993 3,66 8550 34,95 3791 17,10 6061 1,86 8565 100,00 3991 1,79 6137 2,17 8603 6,83 4226 3,08 6174 3,43 8894 1,93 4262 2,60 6224 10,50 9245 5,39 4274 6,06 6276 13,94 9262 15,74 4283 35,23 6384 1,76 9418 2,22 4292 6,76 6545 8,28 9517 2,96 4333 1,68 6633 2,04 9955 1,96 4593 2,63 6648 15,66 10522 4,35 4632 10,43 6780 3,15 10639 2,98 4668 2,22 6889 13,78 10890 3,01 4709 1,97 6903 9,15 11307 4,804759 2,73 6977 6,28 11607 5,24 4921 2,16 7003 9,69 11987 4,95 4937 43,30 7093 2,13 13772 13,12 4964 15,48 7883 3,23 13993 4,56 4979 2,25 8086 3,08 5140 5,05 8213 2,34 Tableau 15 : Analyse du spectre des cellules BeWo intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3085 1,63 4282 4,12 6545 2,76 3099 1,74 4332 1,37 6647 9,16 3109 6,51 4419 5,03 6887 5,33 3117 6,99 4476 3,03 6903 2,51 3139 2,80 4589 1,62 6976 3,23 3273 3,16 4631 1,95 7001 2,21 3324 3,05 4675 1,98 8086 2,18 3360 1,55 4736 1,90 8212 6,64 3379 1,67 4750 1,68 8341 2,31 3416 1,63 4872 1,51 8407 3,41 3441 2,34 4892 2,45 8418 4,63 3457 26,94 4923 4,86 8435 8,29 3479 2,41 4937 84,89 8450 27,43 3750 2,51 4958 8,80 8468 6,05 3775 5,40 4977 2,58 8549 3,07 3790 99,08 5326 1,44 8564 10,42 3812 9,54 5366 1,35 8582 2,33 3831 2,22 5649 2,73 9261 2,08 3961 4,73 5772 4,21 9500 2,22 4041 6,19 5930 1,90 9955 1,43 4103 2,32 5994 1,55 13738 1,88 4147 1,45 6222 5,63 13776 3,46 4226 11,28 6275 8,82 4245 8,29 6478 1,88 Tableau 16 : Analyse du spectre des cellules JEG intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3043 2,87 4292 2,32 6223 6,48 3075 1,80 4377 1,84 6275 7,27 3086 1,65 4387 3,10 6545 2,02 3101 3,28 4403 4,07 6629 1,62 3118 44,80 4419 42,00 6647 9,27 3140 6,69 4441 4,27 6882 2,36 3191 3,74 4461 2,30 6901 2,28 3200 2,73 4499 3,10 6977 2,29 3273 3,32 4590 1,52 7001 2,60 3325 2,44 4631 2,54 8086 2,373361 10,37 4676 2,13 8402 3,02 3380 2,81 4840 4,55 8414 7,28 3399 1,93 4893 2,62 8436 1,93 3417 2,19 4907 2,14 8525 2,80 3442 3,95 4922 5,97 8549 7,81 3457 40,68 4937 100,00 8564 22,76 3479 4,82 4961 19,40 8582 5,79 3518 1,65 4983 3,82 8603 2,09 3791 5,67 5000 1,88 9261 3,78 4042 2,51 5649 2,38 10890 2,10 4077 4,93 5771 1, 53 11986 1,97 4178 1,66 5915 1,87 13778 3,90 4209 4,71 5930 10,24 4283 6,68 6174 1,74 Tableau 17 : Analyse du spectre des trophoblastes placentaires humains intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3043 1,14 4283 0,54 5186 1,22 3139 0,60 4366 0,46 5617 1,01 3172 0,86 4457 0,57 5650 0,95 3188 0,50 4632 0,65 5763 0,53 3209 0,77 4710 0,56 5805 0,52 3295 0,54 4723 0,63 5912 1,29 3325 0,95 4738 6,38 5995 1,24 3416 0,75 4759 0,66 6055 1,41 3442 0,87 4863 0,62 6085 11,67 3458 6,05 4879 0,99 6107 1,68 3479 0,59 4894 2,90 6176 0,89 3520 0,92 4905 1,78 6226 1,05 3607 0,83 4923 5,74 6276 1,75 3640 0,67 4938 80,14 6547 0,80 3664 1,20 4965 100,00 6649 2,36 3711 0,64 4987 15,36 6889 1,37 3791 0,56 5002 6,36 8088 0,52 3887 0,65 5027 5,25 8296 0,67 3927 0,51 5047 1,33 8436 1,14 3958 0,63 5067 0,97 8452 3,75 3974 0,55 5084 0,71 8471 0,72 4046 0,53 5109 1,11 9263 0,69 4148 0,52 5124 0,63 4227 3,42 5136 0,56Tableau 18 : Analyse du spectre des cellules XTC-2 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3076 1,12 4781 1,09 6632 0,91 3112 1,04 4945 0,91 6646 6,69 3123 1,12 4962 2,16 6893 1,48 3267 0,93 4977 1,48 6954 2,17 3295 0,81 4992 6,11 7228 0,63 3324 1,40 5006 100,00 8072 2,01 3334 0,66 5028 13,71 8434 0,75 3415 0,98 5045 4,31 8450 1,20 3441 1,65 5067 1,35 8522 0,98 3456 19,83 5179 0,56 8547 3,38 3477 1,54 5580 1,92 8562 12,26 4037 0,86 5610 0,70 8580 2,38 4076 2,81 5764 2,64 8601 4,29 4207 1,19 5842 1,53 8620 0,87 4216 1,94 5856 5,83 8638 0,85 4226 0,66 5873 1,01 9356 1,68 4282 3,87 6000 1,82 9411 0,99 4301 1,01 6011 2,27 9430 2,80 4590 0,61 6159 0,79 9561 2,28 4677 1,69 6205 0,90 9711 1,29 4702 2,49 6222 4,44 11528 1,11 4716 37,50 6245 6,27 13784 1,04 4738 2,58 6526 1,13 4756 0,92 6557 0,70 Tableau 19 : Analyse du spectre de cellules d'Acanthamoeba polyphaga intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3060 8,07 4241 4,74 6137 8,45 3078 6,24 4249 11,96 6154 4,56 3085 6,41 4300 15,11 6169 10, 55 3121 4, 58 4310 4,15 6376 20,15 3188 7,11 4334 4,13 6480 9,99 3240 8,81 4429 5,38 6508 4,56 3273 3,94 4444 18,82 6770 4,76 3299 9,46 4678 6,64 6787 4,34 3333 6,67 4731 19,10 7162 4,82 3357 4,57 4815 4,18 7204 4,42 3385 6,91 4835 36,21 7474 10,09 3400 100,00 4859 5,46 7500 3,49 3422 5,72 4870 6,79 8018 11,16 3463 5,37 5091 3,53 8497 17,953547 5,08 5223 3,62 8584 6,58 3620 6,53 5321 4,29 8599 24,27 3676 3,97 5481 3,87 8857 5,61 3715 4,31 5552 17,23 9617 5,80 3737 11,26 5700 5,60 9653 16,72 3810 4,12 5746 3,56 9669 46,51 3944 4,39 5910 8,62 9719 4,97 4010 6,49 5930 26,42 9729 3,91 4157 4,32 6047 23,14 4191 4,40 6069 6,11 Tableau 20 : Analyse du spectre de cellules d'Acanthamoeba castellanii intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3068 3,41 5581 18,16 7462 6,37 3175 4,52 5699 3,03 7472 13,32 3239 3,07 5746 3,05 7498 2,77 3300 2,73 5929 15,53 7595 1,97 3359 5,60 5946 2,56 7909 2,38 3384 9,19 6001 1,95 8017 6,91 3400 100,00 6045 2,50 8465 3,41 3421 7,03 6061 5,41 8482 14,08 3462 5,78 6103 2,49 8546 3,83 3545 2,47 6123 4,09 8561 5,79 3737 7,31 6136 15,87 8582 10,14 4009 3,34 6150 4,93 8598 31,73 4024 5,54 6169 9,49 8617 7,57 4191 3,83 6193 2,36 8980 2,34 4241 7,36 6375 8,41 8992 2,23 4299 13,30 6452 4,04 9612 2,90 4310 3,20 6479 5,26 9632 4,89 4824 2,94 6581 3,16 9657 8,95 4841 15,73 6598 16,80 9682 23,03 4849 6,80 6618 4,68 9697 10,91 4923 4,72 7210 2,29 9740 2,28 5122 3,25 7340 3,52 11856 2,35 5253 1,95 7404 2,81 5479 3,39 7414 4,75 Tableau 21 : Analyse du spectre de cellules d'Hartmannella vermiformis intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3098 9,90 4117 4,14 5886 3,83 3108 4,21 4235 3,58 6096 4,85 3205 3,85 4261 3,94 6153 4,903232 4,26 4307 5,59 6179 6,38 3242 59,87 4319 34,06 6195 37,21 3255 4,57 4356 3,64 6407 11,44 3281 4,62 4526 5,47 6893 4,85 3334 4,22 4565 5,38 6908 25,43 3412 7,16 4705 3,54 7404 6,89 3432 5,68 4754 4,88 7696 4,21 3445 11,45 4763 3,65 7711 20,76 3455 99,08 4884 3,96 8029 8,23 3476 10,55 4980 3,36 8155 3,90 3490 6,06 5193 4,77 8460 7,95 3508 5,45 5205 11,25 8584 8,33 3526 7,17 5212 20,10 8601 13,95 3639 4,40 5401 13,53 8623 30,97 3731 11,34 5475 9,64 8638 89,16 3857 9,30 5526 4,50 8676 6,03 3888 3,84 5600 4,89 10384 4,48 4016 5,84 5624 3,87 10414 11,05 4077 3,72 5736 6,29 10424 17,11 4090 8,38 5812 3,74 4104 3,96 5866 4,20 Tableau 22 : Analyse du spectre de cellules Poteriochromonas melhamensis intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3062 98,39 3753 43,55 4888 16,48 3077 16,70 3771 34,70 4906 17,28 3104 41,86 3785 15,16 5212 15,29 3122 35,84 3839 15,59 5229 15,01 3145 26,53 3867 26,29 5368 32,91 3229 23,89 3913 44,50 5391 24,56 3250 16,77 3932 36,08 5517 16,80 3259 15,84 4077 31,26 5716 15,70 3266 48,55 4094 29,13 5861 13,02 3284 39,80 4110 14,74 5878 24,90 3347 15,55 4125 34,57 5896 50,43 3428 39,06 4143 18,61 6109 33,73 3445 46,39 4239 25,10 6202 16,16 3456 17,13 4257 20,42 6364 15,40 3471 40,61 4289 15,49 6527 18,42 3501 28,85 4298 25,63 6689 15,20 3517 33,41 4306 16,02 6942 50,19 3532 59,21 4344 21,29 7062 26,05 3549 30,20 4401 22,44 7504 16,86 3565 21,08 4419 20,91 7733 34,44 3591 31,08 4563 23,42 7821 15,293609 31,14 4581 19,33 8595 18,30 3708 25,39 4726 18,00 3721 16,65 4743 19,48 8. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on identifie un type donné de cellules eucaryotes choisi parmi les différents types de cellules immunes circulantes consistant dans les monocytes, lymphocytes T, cellules polynucléaires neutrophiles et hématies. 9. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que, à l'étape 5/, on identifie un type donné de cellules consistant dans des cellules trophoblastes de tissu placentaire. 10. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que, à l'étape 5/, on contrôle la purification ou on assure le suivi de l'avancement de la purification d'une population d'un type donné de cellules eucaryotes en comparant le spectre obtenu à partir d'un extrait de type de cellules obtenu en cours de procédé de purification, avec un dit spectre de référence dudit type donné de cellules eucaryotes. 11. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que : - à l'étape 5/, on cherche à identifier un état d'activation donné par un facteur d'activation donné d'un type donné de cellules eucaryotes, et - à l'étape 4/, on réalise l'une des deux étapes 4a/ et 4b/ suivantes, dans lesquelles - à l'étape 4a/, on établit une comparaison avec un spectre de référence dudit type donné de cellules eucaryotes dans un dit état d'activation donné par un dit facteur d'activation donné, ou - à l'étape 4b/, ladite banque de données de spectres de référence comprend des spectres réalisés à partir d'extraits purifiés dedifférents types donnés de cellules eucaryotes dans différents états donnés d'activation par différents facteurs d'activation donnés. 12. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que, à l'étape 5b/, on identifie un état d'activation d'un type de cellules donné, en caractérisant sa proximité par rapport à différents états d'activation, de préférence par différents facteurs d'activation, d'un type donné de cellules eucaryotes, par caractérisation de la proximité du spectre obtenu à l'étape 3/ par rapport à différents spectres de référence correspondant, respectivement, aux différents états d'activation, de préférence par différents facteurs d'activation, dudit type donné de cellules, par détermination du nombre de pics en commun entre le spectre obtenu et celui d'au moins un dit spectre de référence. 13. Procédé d'identification selon l'une des revendications 10 ou 12, caractérisé en ce que les différents états d'activation donnés par différents facteurs d'activation donnés de types donnés de cellules eucaryotes sont des états d'activation de macrophages ou cellules humaines circulantes, telles que des monocytes ou lymphocytes, activés par une cytokine choisie parmi IFN-y, TGF-13, TNF, IL-4, IL-10 ou par un ligand bactérien tel qu'un lipopolysaccharide (LPS) ou peptidoglycane (PGN). 14. Procédé d'identification selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on cherche à identifier un état d'activation donné d'un macrophage humain par rapport à des états d'activation résultant de traitements pendant 18 heures avec des cytokines choisies parmi IFN-y, IL-4, TNF, IL-10, TGF-(31, et les ligands bactériens LPS et PGN, par comparaison avec les spectres de référence comprenant les pics mentionnés dans les tableaux 23 à 29 suivants, dans lesquels les différents pics sont caractérisés par leurs coordonnées en abscisse m/z (Da) et leurs coordonnées en ordonnées exprimées en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité, les valeurs des masses moléculaires m/z pouvant varier jusqu'à ±1 Da de la valeur moyennementionnée dans lesdits tableaux, et les valeurs d'intensité relative pouvant varier jusqu'à ±20%, plus généralement ±5%, de la valeur moyenne d'intensité relative mentionnée dans lesdits tableaux : Tableau 23 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures 5 avec 20 ng/ml d'IFN-y intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3021 2,13 3417 1,77 4007 2,50 3047 2,22 3426 1,43 4018 1,25 3061 1,90 3442 1,64 4029 2,00 3084 1,20 3516 2,50 4035 1,85 3094 2,39 3533 1,37 4061 2,73 3129 1,97 3545 1,66 4077 100,00 3136 1,90 3555 1,60 4099 3,87 3165 1,43 3584 1,81 4122 1,63 3193 1,69 3615 1,87 4135 3,59 3204 1,89 3638 1,53 4152 1,57 3217 1,74 3713 1,65 4166 1,53 3228 2,45 3747 1,79 4191 1,83 3234 1,84 3822 1,60 4208 24,76 3243 2,05 3834 1,47 4221 1,86 3252 1,92 3842 2,07 4247 1,50 3260 2,23 3856 2,20 4274 3,15 3271 1,53 3868 1,67 4314 1,65 3308 1,80 3873 1,37 4410 1,23 3327 2,37 3878 1,13 4489 1,34 3336 2,33 3886 2,54 4675 1,43 3364 1,76 3911 3,09 4937 1,60 3379 1,70 3922 1,38 4963 2,94 3395 1,40 3933 1,67 3406 1,53 3942 1,76 Tableau 24 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml d'IL-4 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3040 1, 53 3541 1, 28 4209 13,48 3056 1,74 3551 1,27 4228 3,58 3074 1, 57 3613 1, 54 4282 1, 68 3089 1,97 3636 1,60 4354 1,19 3095 2,45 3678 1,62 4392 1,49 3112 1,67 3710 1,28 4478 1,32 3126 1,56 3725 1,70 4490 1,49 3186 1,74 3762 1,59 4587 4,823227 2,00 3839 1,50 4643 1,84 3274 1,33 3844 1,94 4738 1,26 3289 1,41 3875 1, 53 4748 5,11 3318 1,77 3889 2,93 4806 2,39 3344 1,63 3913 2,80 4911 2,04 3354 1,58 3926 1,39 4938 27,09 3377 1, 78 3941 1, 63 4965 100, 00 3388 1,48 3971 1,59 4985 6,96 3400 1,70 3991 4,06 5005 1,91 3417 1,57 4008 1,51 5047 1,32 3430 1,41 4034 1, 50 5207 1,47 3444 8,25 4048 1,39 5592 2,11 3459 1, 69 4062 1, 74 5654 1, 78 3479 1,62 4078 46,97 6176 1,52 3489 1,59 4100 2,23 3498 1,51 4138 4,22 Tableau 25 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml de TNF intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3042 2,56 3650 2,85 4566 1,83 3046 1,27 3680 3,03 4587 9,38 3071 2,70 3716 2,33 4609 2,04 3081 4,40 3746 2,80 4643 3,75 3120 2,08 3780 3,40 4749 13,30 3143 3,10 3790 1,88 4771 2,82 3164 3,55 3800 2,00 4797 2,00 3184 2,24 3841 1,88 4806 6,53 3224 2,57 3890 3,77 4875 1,70 3243 2,85 3910 2,33 4910 5,78 3255 2,20 3937 1,78 4923 3,80 3341 2,06 3961 3,35 4938 20,20 3367 2,03 4019 2,33 4965 100,00 3399 2,80 4053 2,24 4987 37,42 3417 1,73 4080 4,80 5008 11,50 3427 2,15 4098 1,80 5030 5,28 3445 21,13 4123 1,23 5049 3,12 3460 3,25 4141 7,55 5096 2,65 3467 2,94 4210 3,15 5206 4,25 3490 2,14 4218 2,80 6175 3,83 3543 2,65 4229 3,92 9749 2,70 3562 1,70 4265 1,47 9847 2,60 3604 2,27 4310 2,65 3631 1,75 4532 1,20Tableau 26. Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml d'IL-10 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3053 2,87 3540 2,11 4048 2,41 3070 2,35 3561 2,21 4062 2,74 3093 3,60 3584 2,77 4077 96,78 3113 2,63 3595 2,82 4099 3,45 3123 2,27 3627 2,38 4120 2,42 3139 3,28 3654 3,01 4125 3,10 3152 2,71 3684 2,14 4135 4,67 3188 2,74 3709 2,33 4191 2,33 3214 2,94 3726 2,09 4208 24,80 3226 3,03 3745 2,24 4239 1,88 3243 2,50 3758 1,96 4275 3,40 3250 2,38 3768 2,77 4337 2,40 3270 2,38 3782 3,52 4394 1,90 3306 2,86 3804 2,01 4642 2,07 3317 3,24 3841 3,08 4668 2,13 3355 2,71 3853 2,32 4747 3,02 3393 2,25 3885 3,61 4803 2,37 3420 2,81 3898 2,49 4936 9,81 3443 5,70 3911 4,38 4954 4,02 3458 2,80 3947 2,09 4963 48,29 3470 3,12 3959 2,54 4984 3,68 3480 3,14 3990 4,55 5652 2,88 3493 3,17 4005 3,19 3518 2,92 4033 2,31 Tableau 27 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml de TGF-(31 intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3030 7,50 3758 4,23 4585 22,80 3076 5,55 3803 3,50 4643 12,13 3096 3,58 3822 4,93 4747 27,95 3139 3,93 3849 4,98 4770 2,18 3157 1,70 3889 7,55 4787 3,17 3173 2,37 3911 8,50 4793 3,18 3211 2,77 3959 2,17 4805 19,97 3219 5,00 3984 5,75 4843 4,08 3234 2,93 3991 7,93 4873 4,75 3262 3,97 4053 4,25 4910 10,98 3278 2,82 4058 4,87 4919 5,47 3286 5,15 4078 12,45 4937 28,85 3291 2,75 4094 3,07 4964 100,00 3303 1,33 4100 2,78 4986 19,123323 4,08 4120 3,40 5002 15,48 3345 3,53 4139 9,42 5024 5,82 3366 3,83 4227 6,08 5045 3,68 3378 5,25 4256 3,68 5069 6,32 3428 3,38 4283 3,78 5206 11,80 3444 17,45 4310 4,25 5309 5,80 3457 3,97 4398 4,13 6174 10,50 3466 1,83 4424 3,94 6190 3,70 3502 3,10 4432 4,63 3735 5,35 4529 3,50 Tableau 28 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 1 µg/ml de LPS intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3044 3,09 3563 2,04 4100 4,40 3057 2,74 3577 2,56 4105 3,40 3065 2,96 3606 2,35 4123 2,93 3074 3,60 3630 2,20 4136 4,75 3096 3,11 3644 2,34 4166 2,11 3103 2,64 3674 2,18 4192 2,73 3124 2,28 3693 2,40 4210 25,66 3139 3,61 3720 3,25 4223 2,50 3156 3,44 3780 2,43 4228 3,28 3165 2,33 3795 2,53 4276 3,12 3190 2,85 3822 3,03 4311 2,66 3228 2,77 3835 2,36 4440 1,90 3237 2,22 3842 3,33 4461 2,01 3253 2,44 3888 3,01 4490 2,20 3319 2,00 3898 1,80 4534 1,95 3357 2,81 3908 3,95 4589 3,05 3394 2,13 3913 4,55 4606 2,30 3400 2,48 3930 2,50 4748 1,82 3429 2,30 3939 2,15 4806 2,12 3444 4,77 3952 2,00 4938 4,99 3498 2,61 3976 1,97 4965 17,46 3520 2,45 3991 5,98 4986 3,33 3539 2,53 4063 3,52 3554 2,00 4079 100,00 Tableau 29 : Spectre des macrophages traités pendant 18 heures avec 10 ng/ml PGN intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) intensité m/z (Da) (%) (%) (%) 3080 1,50 3790 2,37 4747 10,88 3094 1,95 3841 1,72 4769 2,16 3117 2,16 3888 2,58 4789 0,983127 1,52 3911 1,00 4804 8,04 3139 2,60 3989 1,28 4826 1,18 3175 1,29 4048 1,12 4872 1,12 3231 1,10 4077 2,31 4894 1,05 3240 1,66 4097 0,92 4910 4,44 3269 1,63 4120 0,79 4921 2,50 3296 2,14 4137 1,65 4936 18,53 3305 1,43 4209 1,07 4964 100,00 3365 2,18 4227 3,12 4985 24,18 3415 1,47 4262 1,26 5002 11,23 3443 2,94 4281 1,45 5024 4,63 3457 2,41 4310 1,21 5045 2,65 3514 1,03 4322 0,88 5068 2,87 3518 0,90 4423 1,77 5107 1,04 3587 0,88 4454 0,88 5206 1,14 3603 1,19 4480 0,98 5651 1,18 3665 0,84 4585 7,77 6173 6,19 3681 0,98 4607 1,35 6189 2,40 3721 1,47 4625 1,38 9745 1,30 3744 0,90 4642 4,83 3769 1,60 4735 1,80 15. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que lesdites cellules eucaryotes entières que l'on analyse pour en établir le spectre de masse, étaient congelées et ont été décongelées avant d'en établir ledit spectre de masse.5